CN115803438A - 用于cd3+细胞体外和体内表达基因治疗产物的启动子序列 - Google Patents

用于cd3+细胞体外和体内表达基因治疗产物的启动子序列 Download PDF

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Abstract

提供了用于在CD3+细胞中表达转基因的启动子序列。启动子序列可以插入到载体的转基因近端的5'非翻译区中。启动子在CD3+细胞中选择性表达，并包含CD3+中发现的转录因子的结合位点。这些启动子可以整合到载体(包括聚合物封装的慢病毒载体纳米粒)中，以转导用于基因免疫治疗的T细胞来治疗癌症和传染病。启动子的T细胞选择性提高了病毒载体用于体内外免疫治疗的安全系数。

Description

用于CD3+细胞体外和体内表达基因治疗产物的启动子序列
背景技术
通过将引入细胞的外源基因进行靶向表达来修饰特定类别的免疫细胞的活性，这一能力的开发引起了人们极大的兴趣。可采用不同的方法将编码所需转基因的DNA引入特定细胞类型，例如CD3+T细胞，包括质粒和病毒载体，这些质粒和病毒载体通常被包装到靶向纳米颗粒等递送工具中。然而，即使转基因能够成功且特异地传递到所需的细胞中，仍需要在适合于在目标细胞中充分表达的环境中呈现转基因。为此，需要开发启动子序列，以驱动特定细胞群体(如CD3+细胞)中所需水平的转基因表达，从而成功实施免疫治疗和其他治疗模式。
发明内容
本技术提供了几种适用于驱动CD3+T细胞中转基因表达的启动子序列。当将启动子序列置于拟在CD3+T细胞中表达的转基因的开放阅读框5′处时，该启动子序列可用于载体，例如病毒载体。优选地，由本技术启动子支持的表达对CD3+T细胞具有选择性。例如，启动子优选地支持转基因在CD3+细胞(例如CD3+T细胞)中的表达水平高于CD3-细胞(例如，CD19+、CD3-B细胞)中的表达水平约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、或甚至50倍或100倍。
本技术的启动子包括核酸序列，例如DNA或RNA寡核苷酸序列，所述序列包含SEQID NO：2-16或19-29中任一个的核苷酸序列或由它们组成，或包含与SEQ ID NO：2-16或19-29中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、，或至少99％同一性的序列变体，或由它们组成。
本技术的其他启动子可包含SEQ ID NO：2-16或19-29中任一个的一个或多个片段或由它们组成，或以任何顺序组装的此类片段的组合，可选地包括片段之间的接头序列。此类片段可以是SEQ ID NO：2-16或19-29中任意一个的10或更多、15或更多、20或更多、25或更多、30或更多、40或更多、50或更多、100或更多、150或更多、200或更多、250或更多、300或更多、350或更多、400或更多、500或更多、600或更多，或700或更多个连续核苷酸。所述片段可以从SEQ ID NO：2-15或19-29的5′端或3′端选择。所述片段可以包括从SEQ ID NO：1-16和19-29的3′端开始并向5′端移动的100、200、300、400、500、600或700个连续核苷酸，或由它们组成。片段也可以包含从SEQ ID NO：1-10、12-16和19-29的任一个的3′端开始并向5′端移动的500、1000或1500个连续核苷酸，或由它们组成。所述片段还可以包含如在SEQ IDNO：2-16和19-29中所鉴定的转录因子(例如NF-κB、AP-1、STAT、GATA-3和NFAT)的任何结合位点，或由它们组成，所述转录因子可以与SEQ ID NO：2-16或19-29或其片段或变体组合或插入其中。优选地，本技术的启动子包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18或20个转录因子结合位点，所述转录因子结合位点选自针对NF-κB、AP-1、STAT、GATA-3和NFAT的一个或多个结合位点，或其与SEQ ID NO：2-16和19-29的转录因子结合位点中任何一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％，或99％同一性的变体。转录因子结合位点可以定位在启动子序列中序列中的任何所需位置和任何顺序。其他转录因子的结合位点也可以包括在本技术的启动子中。首选的启动子序列是ICOS(SEQ ID NO：13)和CTLA4(SEQ IDNO：7)。其他优选的启动子序列是CD3+特异性启动子LAIR2(SEQ ID NO：2)、TNFS8(SEQ ID NO：3)、TCR(SEQ ID NO：11)和LTK(SEQ ID NO：14)；每个启动子包含少于2个NFκB位点、少于8个NFAT盒和少于8个NFκB+AP1位点。
本技术可进一步总结在以下功能列表中。
1.一种用于表达CD3+细胞中受启动子序列控制的转基因的启动子序列，所述启动子序列包含SEQ ID NO：2-10或12-16的任何核苷酸1501-2000，或其与所述序列具有至少90％的同一性的变体。
2.特征1所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含SEQ ID NO：2-10或12-16中任意一个的核苷酸1001-2000或其与所述序列具有至少90％同一性的变体。
3.根据特征2所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含SEQ ID NO：2-10或12-16中任意一个的核苷酸501-2000或其与所述序列具有至少90％同一性的变体。
4.根据特征3所述的启动子序列，其中启动子序列包括SEQ ID NO：2-16中任何一个的核苷酸序列或其与所述序列具有至少90％同一性的变体。
5.根据特征1-4中任一项所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含针对一个或多个转录因子的结合序列，所述转录因子选自NF-κB、AP-1、STAT、GATA-3和NFAT组成的组。
6.根据特征1-5中任一项所述的启动子序列，其中所述启动子能够在CD3+细胞中以高于CD3-细胞的水平表达转基因。
7.根据特征6所述的启动子序列，其中CD3+细胞和CD3-细胞中的表达比率至少为2：1。
8.一种启动子序列，用于在CD3+细胞中启动子序列的控制下表达转基因，所述启动子序列包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13。
9.包含特征1-8中任一项所述启动子序列的载体、质粒或核酸分子。
10.根据特征9所述的载体，其是病毒载体。
11.根据特征10所述的病毒载体，其为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒。
12.根据特征9-11中任一项所述的病毒载体，其整合进纳米颗粒。
13.根据特征9-11中任一项所述的病毒载体，其未整合进纳米颗粒。
14.根据特征9-11中任一项所述的病毒载体，其包膜缺乏融合蛋白。
15.根据特征9-14中任一项所述的载体，其中所述载体包含转基因，所述转基因编码的产品选自嵌合抗原受体(CAR)、检查点抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗体和抗原结合片段及其变体、酶、结构蛋白和报告基因。
16.根据特征9所述的核酸分子，其是RNA分子。
17.包含特征9-16所述载体、质粒或核酸分子的细胞。
18.根据特征17所述的细胞，其中所述细胞包含基因组整合的病毒载体。
19.根据特征17所述的细胞，其中所述细胞包括载体的游离形式。
20.一种包含特征9-15中任一项所述载体的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒能够将载体输送到CD3+细胞中。
21.根据特征20所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含促进纳米颗粒选择性进入CD3+细胞的靶向部分。
22.根据特征20或21所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还能够将载体传递到CD3-细胞中。
23.特征20-22中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含聚合物。
24.特征23所述的纳米颗粒，其中所述聚合物是聚(β-氨基酯)。
25.一种在CD3+细胞中表达转基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供特征9-15中任一项所述的载体或特征20-24中任一项所述的纳米颗粒，以及CD3+细胞，其中所述载体包含所述转基因；
(b)用所述载体转导或转染细胞；和
(c)允许转基因在转导或转染的细胞中表达。
26.根据特征25所述的方法，其中该载体是慢病毒载体。
27.根据特征25所述的方法，其中CD3+细胞是CD4+、CD4-、CD8+或CD8-。
28.根据特征25所述的方法，其中步骤(b)包括将载体与CD3+和CD3-细胞的混合物接触，并且其中CD3+细胞被选择性转导。
29.根据特征25-28中任一项所述的方法，其中步骤(b)在体外进行。
30.根据特征25-28中任一项所述的方法，其中步骤(b)在体内执行，并且包括通过静脉注射、瘤内注射、髓内注射或腹腔注射施用所述载体。
31.一种制备特征9-15中任一项所述载体的方法，所述方法包括将特征1-8中的任一项所述的启动子序列添加到载体中，以用于转导CD3+细胞。
32.根据特征31所述的方法，其中所述启动子序列不支持转基因在用于制造载体的包装细胞或生产细胞中的表达。
附图说明
图1A、图1B和图1C示出了在不同人T细胞特异性启动子的控制下，使用编码绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体(LV)获得的体外结果。流式细胞仪分析HEK293T细胞(图1A)、Ramos细胞(图1B)和Jurkat细胞(图1C)转导72小时后，每个受试启动子的转导效率。对照细胞未转导(NT)，但在整个实验过程中一直保持在培养基中，通过携带常见CMV启动子的LV转导的细胞获得阳性对照，以驱动GFP的表达。对于每个启动子，评估了3种不同的感染复数(MOI)。
图2A、图2B和图2C示出了在不同人T细胞特异性启动子的控制下，用编码GFP的慢病毒载体(LV)转导人PBMC后获得的体外结果。在转导72小时后，通过流式细胞仪检测每个受试启动子的转导效率，包括CD45+细胞(图2A)、CD19+细胞(图2B)或CD3+细胞(图2C)总数。对照细胞(NT)未转导，但在整个实验过程中被激活并保存在培养基中。
图3A示出了使用包装质粒(pARA-pack)和前病毒质粒(pARA-hUBC-CAR-CD19)转染LV293产生细胞72小时后CD19 CAR的表达水平。用流式细胞术检测CD19 CAR的表达，用CARCD19检测试剂和抗生物素二级抗体(α生物素)。对照细胞未转染2种质粒，仅用抗生物素抗体评估背景染色。
图3B示出了分别在常见启动子CMV和hUBC控制下编码GFP或CD19的、用PBAE封装的CAR VSV-G-(“无刺突型(Bald)”)LV或非封装的VSV-G-(“无刺突型”)LV转导PBMC后，不同转基因(GFP和CD19 CAR)的表达水平。
具体实施方式
本技术提供了用于在CD3+细胞中表达任何所需转基因的启动子序列。每个启动子序列都可以插入到载体中，以便在转基因序列的上游、最靠近转基因的5′非翻译区域表达转基因。启动子对CD3+细胞中的表达具有特异性，这在将转基因用于基因转移或免疫治疗时，尤其是用于将载体导入患者体内的体内治疗时，增加了安全性和特异性。
本技术的一个方面是用于在CD3+细胞中表达转基因的启动子序列。启动子序列包括SEQ ID NO：2-10或12-16中任一个的至少核苷酸1501-2000或其变体。或者，启动子序列可以包括SEQ ID NO：2-10或12-16中任一个的核苷酸1001-2000，SEQ ID NO：2-10或者12-16中任意一个的核苷酸501-2000，或者SEQ ID NO：2-10和12-16中任何一个的核苷酸1-2000，或者其中任一个的序列的变体。通过包括一个或多个从序列的3′端开始并沿5′方向延伸的核苷酸区块，可以从SEQ ID NO：2-16中的任何一个或其变体衍生出进一步的启动子序列；这样的核苷酸区块可以包含200、300、400、500、600、700或更多个的核苷酸，并且最大可以延伸到序列5′端的第一个核苷酸。例如，参见实施例8中描述的SEQ ID NO：19-29。如上所述的序列变体与所述序列或其互补序列可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
本技术启动子序列的另一方面是，它可以包含一个或多个转录因子的结合序列，所述转录因子选自NF-κB、AP-1、STAT、GATA-3和NFAT，或其他转录因子。转录因子结合位点可以在启动子序列中以任何组合、任何位置和任何顺序出现。在启动子序列或推定启动子序列中识别转录因子结合位点的在线工具为：
http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB＝TF_8.3。
本技术启动子序列的另一个方面是，与CD3-细胞相比，它能够选择性地促进CD3+细胞中转基因的体外或体内表达。例如，CD3+细胞与CD3-细胞的表达比率可以至少为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1，或甚至50∶1或100∶1，或更高。该启动子序列可以促进CD4+或CD4-的CD3+细胞、CD8+或CD8-的CD3+细胞或CD4+CD8+或者CD4-CD8-的CD3+细胞中转基因的表达。
本技术的另一个方面是包含任何上述启动子序列的载体。例如，所述载体可以是病毒载体，例如慢病毒载体(LV)。该载体也可以是“无刺突型”LV或其他病毒载体，其在载体颗粒表面缺乏病毒融合蛋白，如WO 2019/145796A2中所述，其通过引用并入本文中。其他病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和用作基因传递载体的单纯疱疹病毒，可以包含上述启动子序列。所述载体可以存在于细胞中，包括用于免疫治疗或用于生产重组蛋白的细胞。本技术的启动子还可以包装成质粒或核酸分子，例如RNA分子，包括mRNA分子，以及在其控制下的一个或多个转基因，以输送到细胞。载体、质粒或核酸分子可以封装在纳米颗粒中，例如包含纳米颗粒的聚合物，包括包含聚合物封装载体或由其组成的纳米颗粒。这种纳米颗粒的聚合物可以是聚(β-氨基酯)(PBAE)，包括含有寡肽端帽的PBAE聚合物。所述载体包含一个在目标细胞中表达的转基因。转基因可以是任何基因，包括用于增强T细胞或T细胞亚群(包括CD4+细胞、CD8+细胞、NK细胞、Th细胞或Treg细胞)活性的免疫治疗的基因。
虽然本技术的启动子可用于促进任何转基因的表达，但转基因可编码例如抗检查点蛋白或多肽，例如CTLA-4、PD1、PDL1、LAG-3、TIM 3、B7-H3、ICOS、IDO、4-1BB或CD47的抑制剂。转基因可替代地编码对任何所需抗原具有结合特异性的嵌合抗原受体(CAR)，例如肿瘤抗原或病原体(如细菌、病毒、酵母或寄生虫)表面的抗原。CAR可以是通用CAR，其结合到具有CAR结合域的适配体分子以及适合结合到抗原(例如肿瘤抗原)或病原体(例如细菌、病毒、酵母或寄生虫)表面上的抗原的抗原结合域。所述转基因可以是一种蛋白质或蛋白质的组合，能够引起免疫反应并作为疫苗。被激发的免疫反应可以是预防性的或治疗性的，并且可以刺激对细菌、病毒、其他微生物病原体、癌细胞或在受试者体内发现的其他不需要的细胞类型的免疫反应。
本技术的另一个方面是在CD3+细胞中表达转基因的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供如上所述的载体或纳米颗粒和CD3+细胞；(b)用载体或纳米颗粒在体外或体内转染细胞；以及(c)允许转基因在转基因细胞中表达。载体或纳米颗粒包含上述转基因和位于基因近端的5′非翻译区域启动子。
本技术的另一个方面是制备上述载体的方法。该方法包括将上述任何启动子序列添加到载体中，以用于转染CD3+细胞。
实施例
实例1.在T细胞启动子控制下产生含转基因的慢病毒载体。
制备不同批次的慢病毒载体(LV)，并进行体外试验，以研究转基因表达。LV使用以下材料和方法制成。
T细胞启动子的选择
T淋巴细胞代表多种CD3阳性免疫细胞群，主要类型为细胞毒性T细胞(CD8+，Tc细胞)、辅助T细胞(CD4+，Th细胞)和调节性T细胞(Treg)。表达CD3受体的造血谱系还包括处于不同分化阶段的未成熟群体(CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+)和起源于自然杀伤细胞(NK细胞)的固有淋巴细胞。
采用正交法设计CD3阳性细胞特异表达的启动子。选择了一组15个启动子在CD3+细胞中过度表达(SEQ ID NO：2-16)；表1列出了这些启动子。在这一组中，有3个启动子(SEQID NO：8、12和15)在文献中被描述为在Treg和B细胞中受到部分抑制。
T细胞启动子的分子克隆
启动子序列为合成基因，两侧有MluI和BamHI限制性位点，亚克隆到编码绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框(ORF)上游的转移载体质粒pARA CMV GFP中。CMV启动子(SEQ IDNO：1)被选为对照，因为它以常见的方式驱动转基因的高水平表达。对于SEQ ID NO：3、4和5，由于启动子区域内存在BamHI位点，因此选择MluI和BglII位点作为侧翼位点。
采用同样的策略，在编码人CD19抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)的ORF上游的第二个转移载体质粒pARA-hUBC-CAR-CD19中，将具有T细胞特异性活性的启动子亚克隆到细胞检测中。
Figure BDA0003926681880000091
Figure BDA0003926681880000101
材料
转移载体质粒为pARA-XXX-GFP和pARA-XXX-CAR-CD19。卡那霉素抗性质粒(来自HIV-1株NL4-3的非致病性和非复制性重组前病毒DNA)编码前病毒，所述质粒中克隆了编码GFP或CAR CD19的表达盒。插入物包含转基因、转基因表达的启动子和为增加转基因表达添加的序列，并允许慢病毒载体转导包括非有丝分裂细胞在内的所有细胞类型。启动子是人T细胞启动子或CMV启动子，没有任何增强子序列。非编码序列和表达信号与长末端重复序列(LTR)相对应，其中5’LTR(U3-R-U5)具有整个顺式作用元件，3’LTR缺少整个的顺式作用元件，因此缺乏启动子区域(ΔU3-R-U5)。在转录和整合实验中，添加了封装序列(SD和5′Gag)、载体核转位的中心多嘌呤区/中心终止位点以及BGH多聚腺苷酸化位点。
包装质粒为pARA-Pack。卡那霉素抗性质粒编码慢病毒结构蛋白(GAG、POL、TAT和REV)，用于慢病毒前病毒的封装。编码序列对应于多顺反子基因gag-pol-tat-rev，编码结构蛋白(基质MA、衣壳CA和核糖体NC)、酶蛋白(蛋白酶PR、整合酶IN和逆转录酶RT)和调节蛋白(tat和rev)。非编码序列和表达信号对应于用于转录起始的CMV的最小启动子CMV、用于转录终止的胰岛素基因的多聚腺苷酸化信号、以及用于包装RNA核输出参与的HIV-1 Rev响应元件(RRE)。
使用时，包膜质粒为pENV1。这种卡那霉素抗性质粒编码来自水泡性口炎病毒(VSV-G)印第安纳株的糖蛋白G，用于对一些慢病毒载体进行假型化。对VSV-G基因进行密码子优化，以便在人类细胞中表达，并将该基因克隆到pVAX1质粒(Invitrogen)中。编码序列对应于密码子优化的VSV-G基因，非编码序列和表达信号对应于用于转录起始的CMV的最小启动子，以及用于稳定RNA的BGH多聚腺苷化位点。
VSV-G-(“无刺突型”)慢病毒载体颗粒的产生
将LV293细胞以5×105细胞/mL接种于2×3000mL锥形烧瓶(Corning)和1000mL LVMax Production培养基(Gibco Invitrogen)中。将两个锥形瓶(Erlenmeyer)在37℃、65rpm、加湿的8％CO2的条件下培养。接种后第二天，进行瞬时转染。PEIPro转染试剂(PolyPlus Transfection，Illkirch，法国)与转移载体质粒(pARA-CMV-GFP或pARA-XXX-GFP或pARA-XXX-CAR-CD19)和包装质粒(pARA-Pack)混合。在室温下培养后，将PEIPro/质粒混合物逐滴添加到细胞系中，并在37℃、65rpm、加湿8％CO2的条件下培养。第3天，用最终浓度为5mM的丁酸钠刺激慢病毒载体的产生。将成批混合物在37℃、65rpm、增湿的8％CO2条件下培养24小时。在5μm和0.5μm深度过滤澄清后(Pall Corporation)，在室温下培养澄清的成批混合物1小时，以进行DNA酶处理。
在Q mustang膜(Pall Corporation)上通过色谱进行慢病毒载体纯化，并用氯化钠梯度洗脱。在100kDa HYDROSORT膜(Sartorius)上进行切向流过滤，以减少体积，并在pH为7的特定缓冲液中配制，确保至少2年的稳定性。在0.22μm(Millipore)无菌过滤后，将成批药品装入2mL玻璃小瓶中，小瓶的等分含量小于1mL，然后贴上标签，冷冻并储存在＜-70℃的温度下。
用物理效价定量法(p24 ELISA和qRT-PCR)评估无刺突型LV数。仅通过检测和定量慢病毒相关HIV-1p24核心蛋白来进行p24 ELISA(Cell Biolabs Inc.)。样品的预处理可以区分游离p24和被破坏的慢病毒载体。qRT-PCR是通过使用Nucleospin RNA病毒试剂盒(Macherey Nagel)纯化慢病毒RNA并使用Lenti-X qRT PCR滴定试剂盒(Takara)定量来进行的。对于每个LV批次，通过纳米颗粒跟踪分析仪和动态光散射(分别为Viewsizer 3000和NanoPartica SZ-100V2仪，美国Horiba仪器公司)测量物理滴度、粒径和粒径分布。在配方缓冲液中稀释LV(DLS为10倍，NTA为300倍)后，在室温下进行分析，但不过滤，不会影响样品的生物物理性质。使用设备的控制Horiba软件确定结果。
VSV-G+(“假型”)慢病毒载体粒子的产生
除了PEIPro转染试剂(Polyplus，115-010)与转移载体质粒(pARA-CMV-GFP或pARA-XXX-GFP或p Ara-XXX-CAR-CD19)、包装质粒(pARA Pack)和包膜质粒(pENV1)混合外，使用了上述相同的方法。在HEK293T细胞(8×105细胞/孔)转导三天后，通过定量PCR对假型慢病毒进行滴定，并在生物生产过程中获得澄清原液。
如表2所示，尽管这些启动子区域明显更长，但生产产量通常与使用CMV启动子获得的产量一样有效。对于所有构建物，滴度至少在107TU/mL范围内，并且在不同的生产过程中是一致的。使用基于SEQ ID NO：4和8的启动子可获得最低滴度。产量是选择启动子的标准，因为产量低意味着未来工业化的困难。无论如何，没有发现会影响工业生物生产的问题。
表2：在通过生物信息学方法鉴定的14个人启动子的控制下，编码在CD3阳性细胞中表达的GFP的假型LV产量汇总。
Figure BDA0003926681880000131
实例2.在T细胞启动子控制下，含转基因的慢病毒载体对HEK293T细胞、Ramos细胞 和Jurkat细胞的转导。
为了研究通过生物信息学工具鉴定的15个启动子的CD3特异性活性，我们使用在给定启动子控制下携带绿色荧光蛋白(GFP)转基因的假型慢病毒载体来转导不同的人细胞类型并分析GFP表达。这些研究是在CD3阳性的Jurkat(急性T细胞白血病人类细胞系-ATCCTIB-152)、CD3阴性的Ramos(Burkitt淋巴瘤人类细胞系-ATCC CRL-1596)和非淋巴细胞HEK293T(人类胚胎肾细胞系-ACCC CRL-1573)上进行的。
将HEKT293细胞接种在24孔板中，密度为8×104个细胞/孔，置于补充有10％FBS(Gibco Invitrogen)、1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(Gibco-Invitrogen)中，培养4小时后贴壁。然后用培养基或培养基(NT对照)中的300μL慢病毒载体替换培养基(MOI为1、5或10)转导细胞，然后在37℃、5％CO2下培养2小时。贴壁后，向每个孔中添加1mL完整培养基。在转导后72小时，将细胞进行胰蛋白酶化并重新悬浮在200μL Cellfix 1X中，并使用Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)使用BL1通道测定表达GFP的细胞百分比。
Jurkat和Ramos细胞接种在24孔板中，密度为每孔8×104个细胞，接种在添加10％FBS(Gibco Invitrogen)、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基(Gibco-Invitrogen)中。然后，在培养基或单独培养基(NT对照)中，用300μL慢病毒载体(感染倍数(MOI)为10、30或50)替换培养基，从而转导细胞。在37℃、5％CO2下培养2小时后，向每个孔中添加500μL新鲜完全培养基。转导72小时后，用Attune NxT流式细胞仪利用BL1通道测定表达GFP转基因的细胞百分比。
活细胞和GFP阳性细胞的百分比通过对排除碎片/活细胞/单个细胞的门控来确定。图形数据表示代表性实验的三次重复的平均值。
图1A(HEK293T细胞)、图1B(Ramos CD3-细胞)和图1C(Jurkat CD3+细胞)所示结果表明，对于所有细胞类型，启动子之间的表达模式存在差异。尽管低于常见的CMV启动子的水平，但在三个测试的MOI下，带有启动子ZAP70(SEQ ID NO：5)、BCL11B(SEQ ID NO：6)、TCF7(SEQ ID NO：8)、TIGIT(SEQ ID NO：9)、GIMAP7(SEQ ID NO：10)和EOMES(SEQ ID NO：12)的人CD3阴性淋巴细胞(Ramos细胞)和非淋巴细胞(HEK293T细胞)检测到了显著的GFP表达(高于10％)，排除了CD3阳性细胞的任何特异性。
在CD3阳性Jurkat细胞中，启动子TNFS8(SEQ ID NO：3)、UBASH3(SEQ ID NO：4)、CTLA4(SEQ ID NO：7)、ICOS(SEQ ID NO：13)和LCK(SEQ ID NO：14)在与CMV启动子水平相当的水平上驱动了GFP的最高表达(MOI 10时高于40％)。然而，在具有这些启动子的CD3阴性细胞中检测到背景GFP表达(5-10％GFP阳性细胞)。用启动子LAIR2(SEQ ID NO：2)、TCR(SEQID NO：11)和ITK(SEQ ID NO：15)实现了严格限制CD3阳性Jurkat细胞GFP表达的剂量依赖性。最后三个启动子的CD3特异性活性导致GFP表达减弱，在MOI为50时达到最大值45％。
值得注意的是，没有一种受试启动子对转导细胞的活性有影响(数据未示出)。
实施例3.使用包含在T细胞启动子控制下的转基因的慢病毒载体转导人PBMC。
人PBMC的纯化
人外周血单个核细胞(PBMC)是从健康献血者(Etablissement
Figure BDA0003926681880000151
du Sang，Division
Figure BDA0003926681880000152
-Alpes)获得的血沉棕黄层中分离出来的。用DPBS稀释血液后，通过FICOLL密度梯度(GE Healthcare)分离PBMC，并用DPBS冲洗两次。然后，在ACK裂解缓冲液(Gibco)中培养PBMC 5分钟并进行额外的DPBS洗涤期间，对残余红细胞进行裂解。将PBMC以20×106细胞/mL的密度冷冻在10％DMSO(Sigma)、90％FBS(Gibco)中，并在-150℃下保存，直至使用。
用VSV-G与(“假型”)慢病毒载体激活和转导PBMC
用在具有在给定启动子控制下携带GFP转基因的LV在人休眠细胞中评估实施例2中筛选的六个启动子的CD3特异性活性，以转导先前冷冻的人PBMC。解冻的人PBMC以每孔1×106个细胞的密度接种在含有10％FBS(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco-)的RPMI培养基中的24孔板中，在CD3-CD28 Dynabeads(Gibco/)存在下激活，并在37℃和5％CO2下培养72小时。然后将激活的PMBC合并并用培养基中封装的假型LV(MOI为20、50或100)仅24孔板中的培养基中(NT对照)转导，密度为1×105细胞。在37℃下培养2小时后，向每个微孔中添加5％CO2和500μL新鲜培养基(Gibco Invitrogen)，并培养72小时。转导72小时后，用Attune NxT流式细胞仪测定表达GFP的细胞百分比。表达GFP转基因的转导细胞的表型通过流式细胞术染色确定，其抗体针对以下细胞类型，符合制造商的说明(Biolegend)：CD3-AF700、CD14-PE-Cy7、CD16-BV711、CD19-BV605、CD45-BV510、CD56-BV421和Zombie NIR，用于存活/死亡鉴别。在4℃下培养30分钟后，细胞在500×g下离心2分钟，并用CellFix溶液(BD Biosciences)固定。通过流式细胞术(AttunNext；Invitrogen，Inc.)在BL1(GFP)、RL2(AF700染料)、RL3(Zombie NIR)、VL1(BV421染料)、VL2(BV510染料)、VL3(BV605染料)、VL4(BV711染料)和YL4(PE-Cy7染料)通道上计数荧光阳性细胞。CD45+、活细胞和单细胞的细胞表型定义如下：T淋巴细胞(CD3pos-CD19neg)、B淋巴细胞(CD3neg-CD19pos)、NK细胞(CD3neg-CD19neg-CD56pos)、单核细胞(CD14pos)和粒细胞(SSCHigh-CD16pos)。
如图2A(整个CD45+PBMC)、图2B(PBMC中的CD19+细胞)和图2C(PBMC中的CD3+细胞)所示结果显示了用测试启动子获得的GFP表达模式的差异。GFP的最高表达(高于40％)在总CD45+PBMC和门控CD3+T细胞中检测到，在2个带有启动子CTLA4(SEQ ID NO：7)和ICOS(SEQID-NO：13)的受试MOI中。然而，对于LAIR2(SEQ ID NO：2)、LCK(SEQ ID-NO：14)、TCR(SEQ IDNO：11)和TNFS8(SEQ ID NO：3)(低于20％)，CD3+原代细胞中的GFP表达弱于CD3+细胞系。此外，只有MOI 100的LCK(SEQ ID NO：：14)能诱导CD19+细胞中GFP的表达，其水平与CMV相同。其他选择的启动子导致GFP表达比CMV弱，这证实了它们对细胞系和原代样本的CD3+选择性。最后，没有一种受试启动子对转导的原代细胞的活性有影响(数据未显示)。
实施例4.使用PBAE封装的VSV-G-(“无刺突型”)LV对初级淋巴细胞和PBMC的转导。
在人休眠细胞中评估实施例2和3中筛选的启动子的CD3特异性活性，其中PBAE封装的无刺突型LV携带GFP转基因，在给定启动子的控制下转导人PBMC。PBMC是从健康捐献者(Etablissement
Figure BDA0003926681880000161
du Sang，Division
Figure BDA0003926681880000162
-Alpes)或淋巴瘤患者的血液样本中分离出来的，这些样本是Lonza和CALYM网络(Centre Hospitalier Lyon-Sud，法国)生物库提供的纯化和冷冻细胞。
人PBMC的纯化
用DPBS稀释新鲜血液后，用FICOLL密度梯度(GE Healthcare)分离PBMC，并用DPBS洗涤两次。然后，在ACK裂解缓冲液(Gibco)中对PBMC进行5分钟孵育，并进行额外的DPBS洗涤，以溶解残余红细胞。PBMC在10％DMSO(Sigma)、90％FBS(Gibco)中以20×106细胞/mL的密度冷冻，并在-150℃下保存，直至使用。
PBAE封装的VSV-G-(“无刺突型”)慢病毒载体转染
由于非分裂细胞通常很难用LV转染(无细胞因子和CD3-CD28活化)，因此寡肽修饰的聚(β-氨基酯)(OM-PBAE)聚合物用作转染剂。OM-PBAE已被描述为形成聚合物封装载体的转染剂，能够将遗传物质(质粒或其他核酸分子)传递到真核细胞(US2016/0145348A1，Mangraviti等人，2015，Anderson等人，2004，WO2016/116887)。OM-PBAE已成功用于包被转导缺陷型慢病毒载体，并将人细胞工程化以稳定表达各种转基因，包括报告基因(绿色荧光蛋白-GFP和mCherry)和CAR(见WO2019/145796)。以下封装实验中使用的聚合物是与带电肽偶联的聚(β-氨基酯)(PBAE)。聚合物PBAE-CR3是指与肽CRRR(SEQ ID NO：17)偶联的PBAE(两端的肽相同)。PBAE-CH3聚合物是指与肽CHHH(SEQ ID NO：18)偶联的PBAE。这些OM-PBAE的混合物以60/40摩尔比进行测试。
在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中，以每孔1×105个细胞的密度将人PBMC接种在24孔板中。然后，用100至300μL封装的假型LV替换培养基或仅用培养基(NT对照)转导细胞。在37℃下培养2小时后，向每个孔中添加5％CO2和600μL新鲜完整培养基。表达GFP的细胞百分比在转导72小时后用Attune N×T流式细胞仪使用BL1通道测定。表达GFP转基因的转导细胞的表型通过流式细胞术染色确定，其抗体针对以下细胞类型：CD3-AF700、CD14-PE-Cy7、CD16-BV711、CD19-BV605、CD45-BV510、CD56-BV421和Zombie NIR，用于活/死鉴别。在4℃下培养30分钟后，细胞在500×g下离心2分钟，并用CellFix溶液(BDBiosciences)固定。通过流式细胞术(AttunNext；Invitrogen，Inc.)在BL1(GFP)、RL2(AF700染料)、RL3(Zombie NIR)、VL1(BV421染料)、VL2(BV510染料)、VL3(BV605染料)、VL4(BV711染料)和YL4(PE-Cy7染料)通道上计数荧光阳性细胞。CD45+、活细胞和单细胞的细胞表型定义如下：T淋巴细胞(CD3pos-CD19neg)、B淋巴细胞(CD3 neg-CD19pos)、NK细胞(CD3neg-CD19 neg-CD56 pos)，单核细胞(CD14pos)和粒细胞(SSHigh CD16pos)。
最后，这组实验是用启动子进行的，这些启动子对细胞内GFP的表达具有最严格的CD3特异性活性，但在淋巴细胞表面表达转基因的情况下，无VSV-G包膜的、并在特定启动子控制下携带抗CD19 CAR的LV被用于转导来自健康献血者和淋巴瘤患者的PBMC。根据制造商使用BL1通道的说明，在转导后72小时用人CD19检测试剂(Miltenyi)和抗生物素BB515抗体(Miltenyi)通过流式细胞术测定表达CAR CD19的细胞百分比。
实施例5.用封装在OM-PBAE中的VSV-G-(“无刺突型”)慢病毒载体颗粒在体内转导 外周血单核细胞。
在移植有来自健康供体的人PBMC或来自淋巴瘤患者的PBMC的免疫缺陷NSG小鼠体内评估实施例4中确认的2种可触发淋巴细胞中GFP表达的最佳启动子的CD3特异性活性。另一种可以使用的小鼠模型是移植了人CD34阳性造血干细胞的NSG小鼠，这些细胞表现出人免疫细胞群的多系移植。将实施例4中所述的包含在LV(所述LV在给定启动子的控制下携带GFP转基因)中的纳米颗粒(与或不与CD3靶向剂共价连接的PBAE形成配方)，通过静脉反复注射进之前注射了PBMC或CD34阳性造血干细胞的小鼠中。对照动物注射缺乏VSV-G包膜且未被PBAE聚合物封装的载体或转导缺型陷慢病毒载体。
使用购自Biolegend的特定抗体组合(CD3-AF700、CD11b-APC、CD11c-PE、CD14-PE-Cy7、CD16-BV711、CD19-BV605、CD45-BV510、CD56-BV421、CD66b-PerCP-Cy5.5、HLA-DR PE-Dazzle594和Zombie NIR)和T细胞组合(CD3-AF700、CD4-PerCP-Cy5.5、CD8-BV605、CD25-PE、CD45-BV510、CD45RA-BV711、CD69-PE-Dazzle594、CD127-APC、TCRg/d-PE-Cy7、CCR7(CD197)-BV421和Zombie NIR)，通过流式细胞术染色每周24至90天在全血细胞上评估表达的GFP转基因的体内生物分布。
在处死时，GFP表达细胞的表型由采集的脾和骨髓制备的血细胞和细胞悬浮液确定。通过对处死时采集的血液和器官中提取的基因组DNA进行双重定量PCR，分析基因组整合慢病毒载体的组织生物分布。通过测定治疗前和每周治疗后间隔采集的血样中的血细胞计数(如实施例2中所述的流式细胞术)、ALT/AST肝酶(酶活性试剂盒)和细胞因子水平(Th1/Th2细胞测定珠阵列)来评估治疗毒性。每周记录动物行为、体重、水和食物消耗3次，作为治疗安全性和耐受性的额外读数。
最后，利用实施例4中选择的启动子，但在淋巴细胞表面表达的抗CD19 CAR转基因的背景下，进行这组动物实验。与上述动物程序的唯一区别在于评估CD19 CAR表达细胞的表型，该表型是根据实施例4中已经描述的制造商说明，使用人CD19检测试剂(Miltenyi)和抗生物素BB515抗体(Miltenii)通过流式细胞术测定的。
实施例6.用封装在OM-PBAE中的VSV-G-(“无刺突型”)慢病毒载体颗粒在体内转导 外周血单核细胞的效力。
在携带经修饰以组成性表达荧光素酶报告基因的Ramos癌细胞的免疫缺陷NSG小鼠体内评估实施例4中筛选的2个触发淋巴细胞中CARCD19表达的最佳启动子的CD3特异性活性。使用不同的NSG小鼠模型：NSG小鼠移植健康供体的人PBMC或淋巴瘤患者的PBMC，最后NSG小鼠移植人CD34阳性造血干细胞，该干细胞显示人免疫细胞群的多系移植。
将实施例4中所述的由LV(所述LV在给定启动子的控制下携带GFP转基因)组成的纳米颗粒(与或不与CD3靶向剂共价连接的PBAE形成配方)，重复静脉注射进之前注射过Ramos Luc细胞的小鼠中。对照动物注射缺乏VSV-G包膜且未被PBAE聚合物封装的载体或转导缺陷型LV。
通过活体动物生物发光成像每周24至90天评估体内疗效，以测定治疗组与对照组的肿瘤生长和与循环Ramos-Luc细胞相关的速率以及存活率。通过测定治疗前和每周治疗后间隔采集的血样中的血细胞计数(如实施例5中所述的流式细胞术)、ALT/AST肝酶(酶活性试剂盒)和细胞因子水平(细胞测定珠阵列)来评估治疗毒性。每周记录动物行为、体重、水和食物消耗3次，作为治疗安全性和耐受性的额外读数。
实施例7.T细胞特异性嵌合启动子的设计
上述启动子序列包含一些转录因子结合位点，包括NFκB；AP1、Stats、GATA和NFAT。表3总结了每个启动子序列中存在的这些结合序列。转录因子结合位点也在序列中描述。
表3：启动子序列与T细胞特异转录因子结合位点的映射。斜体表示驱动转基因非特异表达的启动子(根据图1中描述的实验)。
Figure BDA0003926681880000191
Figure BDA0003926681880000201
CD3+特异性启动子(LAIR2、TNFS8、TCR和ITK)存在少于2个NFκB位点、少于8个NFAT盒和少于8个NFκB+AP1位点。
实施例8.启动子序列的优化和缩短
为了定义诱导基因表达和提高转基因表达水平5，6，7的重要区域，通过缩短2kb启动子设计了5′缺失构建体。
T细胞启动子的缩短和分子克隆
在这组15个启动子中，CTLA4(SEQ ID NO：7)和ICOS(SEQ ID-NO：13)在CD3表达细胞系和原代细胞中过度表达，在非CD3表达的细胞中低表达或无表达。以合成基因为模板和Phusion HF高保真DNA聚合酶(Thermofisher)，通过PCR将启动子从5′到3′缩短。含有MluI限制位点的正向引物对CTLA4和ICOS的5′区域具有特异性，而含有BglII位点(对于SEQ IDNO：24-25)或BamHI位点(对于SEQ ID NO：19-23，26-29)的反向引物对CTLA4或ICOS的3′端具有特异性。然后将PCR片段亚克隆到编码GFP的开放阅读框(ORF)上游的转移载体质粒pARA-CMV-GFP中，而不是CMV启动子。
采用同样的策略，在编码人CD19抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)的ORF上游的第二个转移载体质粒pARA-hUBC-CAR-CD19中亚克隆截断的启动子。Sanger测序证实了截断启动子和转基因上游框内插入序列的一致性。优化后的启动子序列如表4所示。
表4：缩短的CTLA4和ICOS启动子。
Figure BDA0003926681880000211
LV产生和人细胞系和原代细胞转导
使用编码GFP和CD19靶向CAR的转染质粒来产生LV和转导如实施例3和4所述的细胞系及原代细胞。通过流式细胞术测定GFP或CD19CAR转基因表达。
实施例9：具有CAR的慢病毒载体的“假型化”
实施例3和4的实验表明，封装(例如通过OM-PBAE封装)成纳米颗粒的无刺突型LV具有转导PBMC(包括T淋巴细胞)和引导转基因表达的能力。由于CAR T细胞治疗的目的是将CAR引入T细胞，并在这些T细胞的表面表达CAR，因此出现了一个问题，即用于产生CAR T淋巴细胞的LV表面存在任何表达的CAR，是否可以用于将LV假型化，并可能指示LV转导拟被CAR T细胞核攻击的细胞。下面描述的实验是为了解决这个问题而设计的。
CD19 CAR慢病毒载体粒子编码的产生
如实施例1所述进行无刺突型LV颗粒的产生。简言之，LV293细胞在接种后第二天瞬时转染。PEIPro转染试剂(PolyPlus Transfection，Illkirch，France)与转移载体质粒pARA-hUBC-CAR-CD19和包装质粒pARA Pack混合。如实施例3所述制备封装在OM-PBAE中的无刺突型LV颗粒，并用于转导LV293细胞或人PBMC。
CD19 CAR检测
在DPBS洗涤步骤后，根据制造商说明，用人CD19检测试剂(Miltenyi)和抗生物素BB515抗体(Miltenye)对细胞(LV293转染和未转染或LV转染的PBMC)进行染色，如实施例4中所述。
图3A中呈现的结果示出了用于产生LV的LV293细胞(转染有pARA-hUBC-CAR-CD19和pARA-Pack质粒)表面上的CD19 CAR表达。未转染细胞作为对照。转染后，仅在LV293产生细胞的表面检测到CD19 CAR的强表达。
此外，图3B中呈现的结果显示，在hUBC启动子或GFP控制下CMV启动子控制下用VSV-G-(“无刺突型”)LV编码CD19 CAR转导的人PBMC上获得的表达。虽然在暴露于无刺突型LV的PBMC中未观察到GFP的表达，但它们被OM-PBAE聚合物封装后恢复了其转导效率。当使用编码CD19 CAR的VSV-G-(“无刺突型”)LV转导PBMC时，在存在或不存在MO-PBAE聚合物的情况下观察到嵌合受体的类似表达水平。
总之，这些结果表明，使用常见的启动子来控制CD19-CAR的表达会导致LV293细胞系表面嵌合受体的表达，产生以膜蛋白修饰的LV(无刺突型或假型)。CD19-CAR的这种假型化必须足以使无刺突型载体与细胞结合并产生人工CD19-CAR信号，因为无刺突型LV本质上缺乏转导，即使CD19-CAR不是一种有效的假型蛋白，因为它不允许LV的内体逃逸(endosomal escape))。这种“假型化”可能会导致安全问题，因为常规LV(VSV-G)将在体内外直接靶向CD19+B淋巴细胞。此处获得的结果表明，如本文所述使用T细胞特异性启动子将消除LV293表面CD19 CAR的表达，并且不会观察到LV的假型化。这将增加为生产CAR T细胞而设计的LV的安全裕度。
序列
转录因子结合位点在每个启动子序列中描述如下：NFkB(粗体)、AP-1(下划线)、STATS(斜体)、GATA-3(双下划线)和NFAT(方框)。值得注意的是，一些结合位点是重叠的。
SEQ ID NO：1
Figure BDA0003926681880000231
SEQ ID NO：2
Figure BDA0003926681880000232
Figure BDA0003926681880000241
Figure BDA0003926681880000251
SEQ ID NO：3
Figure BDA0003926681880000252
Figure BDA0003926681880000261
Figure BDA0003926681880000271
SEQ ID NO：4
Figure BDA0003926681880000272
Figure BDA0003926681880000281
Figure BDA0003926681880000291
SEQ ID NO：5
Figure BDA0003926681880000292
Figure BDA0003926681880000301
Figure BDA0003926681880000311
SEQ ID NO：6
Figure BDA0003926681880000312
Figure BDA0003926681880000321
Figure BDA0003926681880000331
SEQ ID NO：7
Figure BDA0003926681880000332
Figure BDA0003926681880000341
Figure BDA0003926681880000351
SEQ ID NO：8
Figure BDA0003926681880000352
Figure BDA0003926681880000361
Figure BDA0003926681880000371
SEQ ID NO：9
Figure BDA0003926681880000372
Figure BDA0003926681880000381
Figure BDA0003926681880000391
SEQ ID NO：10
Figure BDA0003926681880000392
Figure BDA0003926681880000401
Figure BDA0003926681880000411
SEQ ID NO：11
Figure BDA0003926681880000412
SEQ ID NO：12
Figure BDA0003926681880000421
Figure BDA0003926681880000431
SEQ ID NO：13
Figure BDA0003926681880000432
Figure BDA0003926681880000441
Figure BDA0003926681880000451
SEQ ID NO：14
Figure BDA0003926681880000452
Figure BDA0003926681880000461
Figure BDA0003926681880000471
SEQ ID NO：15
Figure BDA0003926681880000472
Figure BDA0003926681880000481
Figure BDA0003926681880000491
SEQ ID NO：16
Figure BDA0003926681880000492
Figure BDA0003926681880000501
Figure BDA0003926681880000511
SEQ ID NO：17
Cys-Arg-Arg-Arg
SEQ ID NO：18
Cys-His-His-His
SEQ ID NO：19
Figure BDA0003926681880000512
Figure BDA0003926681880000521
Figure BDA0003926681880000531
SEQ ID NO：20
Figure BDA0003926681880000532
Figure BDA0003926681880000541
SEQ ID NO：21
Figure BDA0003926681880000542
Figure BDA0003926681880000551
SEQ ID NO：22
Figure BDA0003926681880000552
Figure BDA0003926681880000561
SEQ ID NO：23
Figure BDA0003926681880000562
SEQ ID NO：24
Figure BDA0003926681880000571
Figure BDA0003926681880000581
SEQ ID NO：25
Figure BDA0003926681880000582
Figure BDA0003926681880000591
Figure BDA0003926681880000601
SEQ ID NO：26
Figure BDA0003926681880000602
Figure BDA0003926681880000611
SEQ ID NO：27
Figure BDA0003926681880000612
Figure BDA0003926681880000621
SEQ ID NO：28
Figure BDA0003926681880000622
Figure BDA0003926681880000631
SEQ ID NO：29
Figure BDA0003926681880000632
序列
如本文所用，“基本上由......组成”允许包含不会实质性影响权利要求的基础和新颖特征的材料或步骤。本文中对术语“包含”的任何叙述，特别是在组合物的组件描述或装置的组件描述中，可以与“基本上由...组成”或“由组成”的替代表达进行互换。
虽然本发明已结合某些优选实施例进行了描述，但普通技术人员在阅读上述说明书后，将能够对本文所述的组合物和方法进行各种更改、等效物的替换和其他更改。
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Claims (32)

1.一种启动子序列，用于表达CD3+细胞中受所述启动子序列控制的转基因，所述启动子序列包含SEQ ID NO:2-10或12-16任何的核苷酸1501-2000，或其与所述序列具有至少90％同一性的变体。
2.根据权利要求1所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含SEQ ID NO：2-10或12-16中任意一个的核苷酸1001-2000，或与所述序列具有至少90％的同一性的变体。
3.根据权利要求2所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含SEQ ID NO：2-10或12-16中任意一个的核苷酸501-2000，或与所述序列具有至少90％同一性的变体。
4.根据权利要求3所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含SEQ ID NO：2-16中任意一个的核苷酸序列，或与所述序列具有至少90％同一性的变体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的启动子序列，其中所述启动子序列包含选自针对NF-κB、AP-1、STAT、GATA-3及NFAT的一个或多个转录因子的结合序列。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的启动子序列，其中所述启动子能够在CD3+细胞中以高于CD3-细胞的水平表达转基因。
7.权利要求6所述的启动子序列，其中CD3+细胞与CD3-细胞中的表达比率至少为2:1。
8.一种启动子序列，用于在CD3+细胞中启动子序列的控制下表达转基因，所述启动子序列包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13。
9.包含权利要求1-8中任一项所述启动子序列的载体、质粒或核酸分子。
10.根据权利要求9所述的载体，所述载体是病毒载体。
11.根据权利要求10所述的病毒载体，所述病毒载体为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的病毒载体，其被整合进纳米颗粒中。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的病毒载体，其未被整合进纳米颗粒中。
14.根据权利要求9-11中任一项权利要求所述的病毒载体，其包膜缺少融合蛋白。
15.根据权利要求9-14中任一项权利要求所述的载体，其中所述载体包含一种转基因，所述转基因编码的产品选自嵌合抗原受体(CAR)、检查点抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗体和抗原结合片段及其变体、酶、结构蛋白和报告基因。
16.根据权利要求9所述的核酸分子，所述核酸分子是RNA分子。
17.一种包含根据权利要求9-16中任一项所述的载体、质粒或核酸分子的细胞。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述细胞包含基因组整合病毒载体。
19.根据权利要求17所述的细胞，其中所述细胞包含载体的游离形式。
20.一种包含根据权利要求9-15中任一项所述的载体的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒能够将该载体传递至CD3+细胞。
21.根据权利要求20所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含促进纳米颗粒选择性进入CD3+细胞的靶向部分。
22.根据权利要求20或21所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒还能够将载体传递到CD3-细胞中。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的纳米颗粒，其中该纳米颗粒包含聚合物。
24.根据权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述聚合物是聚(β-氨基酯)。
25.一种在CD3+细胞中表达转基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求9-15中任一项所述的载体或根据权利要求20-24中任一项所述的纳米颗粒，以及CD3+细胞，其中所述载体包含所述转基因；
(b)用载体转导或转染细胞；以及
(c)允许转基因在被转导或被转染的细胞中表达。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述CD3+细胞是CD4+、CD4-、CD8+或CD8-。
28.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(b)包括将载体与CD3+和CD3-细胞的混合物接触，并且其中CD3+细胞被选择性转导。
29.根据权利要求25-28中任一项权利要求所述的方法，其中步骤(b)是在体外进行的。
30.根据权利要求25-28中任一项权利要求所述的方法，其中步骤(b)在体内执行，并且包括通过静脉注射、瘤内注射、髓内注射或腹腔注射施用载体。
31.一种制备根据权利要求9-15中任一项所述载体的方法，所述方法包括将根据权利要求1-8中任一项的启动子序列添加至载体以用于转导CD3+细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述启动子序列不支持转基因在用于制备载体的包装细胞或生产细胞中的表达。
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