WO2023090361A1 - 改変ｄ領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有する哺乳動物人工染色体ベクター、及びそのベクターを保持する細胞又は非ヒト動物 - Google Patents

改変ｄ領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有する哺乳動物人工染色体ベクター、及びそのベクターを保持する細胞又は非ヒト動物 Download PDF

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康宏 香月
一磨 冨塚
愛海 宇野
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国立大学法人鳥取大学
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    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
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    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Definitions

  • the present invention relates to mammalian artificial chromosome vectors comprising human immunoglobulin heavy chain loci and human immunoglobulin light chain loci with altered human immunoglobulin heavy chain D regions.
  • the present invention also relates to mammalian cells or non-human animals comprising said mammalian artificial chromosome vector.
  • the present invention further relates to a method for modifying the D region in the production of the mammalian artificial chromosome vector.
  • Human antibodies are used as therapeutic agents for tumors and autoimmune diseases because they are not recognized as foreign substances by the human body. Such antibodies can be produced by using phage display technology or human antibody-producing mice.
  • Human antibody-producing mice are Trans-chromosomic (TC) mice carrying mouse artificial chromosome vectors containing full-length human immunoglobulin heavy chain and light chain loci (Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 3 discloses a platform for achieving further expanded human antibody diversity.
  • An object of the present invention is to provide means for achieving expansion of human antibody diversity in human antibody-producing non-human animals.
  • the present inventors focused on the finding that cattle efficiently produce broadly neutralizing antibodies against HIV (MJ Burke et al., Viruses 2020, 12, 473; doi : 10.3390/v12040473), found a way to expand the diversity of human antibodies and/or emerge human antibodies with longer than normal antibody heavy chain CDR3s.
  • the present invention includes the features shown below.
  • the human-derived genomic sequence from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region has the following (1) and (2), or (1) and (3), a mammalian artificial chromosome vector characterized in that it is replaced with a modified sequence of the D region consisting of a combination of the D region
  • the modified sequence is (1) the human-derived genomic sequence between the open reading frames (ORF) from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, or the ORF except between D3-9 and D3-10
  • the human-derived genomic sequence between comprises a sequence truncated to a length of 49 bp or more from each VDJ recombination sequence end of the inter-ORF region flanked by the VDJ recombination sequences, and (2) instead of the ORF sequences from D1-1 to D1-26 of
  • the ORF sequence from B1-1 to B9-4 of the bovine-derived immunoglobulin heavy chain locus D region has a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 127 to 149 or has 90% or more identity with the nucleotide sequence.
  • the ORF sequence from 1S5 to 1S35 of the monkey-derived immunoglobulin heavy chain locus D region comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 150 to 175 or a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence.
  • a non-human comprising the mammalian artificial chromosome vector according to any one of [1] to [10] and having disrupted endogenous immunoglobulin heavy chain, ⁇ light chain and ⁇ light chain genes or loci Mammal.
  • a non-human animal comprising human immunoglobulin heavy chain and light chain loci, wherein the human-derived genomic sequence from D1-1 to D1-26 of the D region of the human immunoglobulin heavy chain locus is: (1) and (2), or (1) and (3), is replaced with a modified sequence of the D region, wherein the modified sequence of the D region is (1) the human-derived genomic sequence between the open reading frames (ORF) from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, or the ORF except between D3-9 and D3-10
  • the human-derived genomic sequence between comprises a sequence truncated to a length of 49 bp or more from each VDJ recombination sequence end of the inter-ORF region flanked by the VDJ recombination sequences, and (2) instead of the ORF sequences from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, from B1-1 to B9-4 of the bovine-derived immunoglobulin heavy chain locus D region
  • the non-human animal according to any one of [14] to [17] is immunized with a target antigen, and spleen cells, lymph node cells or B cells from the non-human animal producing an antibody that binds to the target antigen , fusing the spleen cells, lymph node cells or B cells with myeloma cells to form hybridomas, culturing the hybridomas to obtain monoclonal antibodies that bind to the target antigen, How to make.
  • a mammalian artificial chromosome vector comprising a first site-specific recombinase recognition site, a promoter and a second site-specific recombinase recognition site.
  • the mammalian artificial chromosome vector according to [23] wherein the deleted D region is a region from D1-1 to D1-26.
  • the human-derived genomic sequence of the D region of the human immunoglobulin heavy chain locus or its human minimalization i.e., the inter-open reading frame (ORF) region.
  • Antibody diversity by replacing the ORF (gene) sequence of the D region sequence with an ORF sequence of a D region derived from an animal such as a bovine or a monkey, or a modified ORF sequence of a human D region sequence can be extended and human antibodies can be generated that preferably contain a CDRH3 of 15 to 50 or more amino acids in length.
  • FIG. 2 is a diagram relating to Example 1;
  • FIG. 2A shows CHO cells (cell clone TF7-B10) in which one copy of Ig-NAC ( ⁇ DH) is maintained independently of the host mouse chromosome.
  • Ig-NAC( ⁇ DH) arrowheads represent human chromosomal regions (red) and arrows represent artificial chromosomal regions (green).
  • FIG. 2B shows that Ig-NAC ( ⁇ DH) contains human immunoglobulin (Ig) heavy chains (arrowheads or green) and kappa light chains (arrowheads or red).
  • FIG. 2 shows the results of Example 1; This figure shows restriction enzyme AfiIII in plasmid pRP[Exp]-CAG>mCherry (synthesized by Vector Builder) having CAGP (CAG promoter; conjugate of cytomegalovirus enhancer and chicken ⁇ -actin promoter).
  • FIG. 10 is a diagram related to Example 2;
  • plasmid CAG- ⁇ C31-HRB-Fcy::fur was cleaved with restriction enzymes NotI (NEB) and SpeI (NEB), and a plasmid HRA-derived fragment ("A") was inserted upstream of CAGP to produce HDR. It indicates that the vector was obtained.
  • BsdR represents the blasticidin resistance gene
  • CAGP the CAG promoter
  • R4 attB, Bxb1 attB and Bxb1 attP the recombinase recognition site
  • AmpR the ampicillin resistance gene
  • pUCori the pUC replication origin.
  • FIG. 10 is a diagram related to Example 2; This figure shows that the HDR vector was inserted near the DH region deletion site ( ⁇ DH) of Ig-NAC ( ⁇ DH) in CHO cells by genome editing (Cas9/gRNA).
  • FIG. 10 is a diagram related to Example 2; This figure shows removal of the blasticidin resistance gene from the HDR vector by site-specific recombination by introducing Bxb1 recombinase into cells.
  • FIG. 10 is a diagram relating to Example 3; This figure shows that each genomic sequence between ORFs D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain gene D region is shortened to a size of approximately 200 bp, minimizing the D region.
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 6; This figure shows the procedure for generating a human minimalized IgHD vector from human miniA, human miniB and human miniC.
  • human miniA is from R4 attP and downstream of HRA to D fragment 3-10
  • human miniB is from D fragment 3-10 to 3-22
  • human miniC is from D fragment 3-22 to HRB.
  • ⁇ C31 attP and blasticidin resistance gene (BSDR) respectively.
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 6; This figure shows that site-specific recombination between ⁇ C31 attB in the HDR vector with the blasticidin resistance gene removed shown in FIG. Generation of HDR vector with IgHD inserted.
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 6; This figure shows that site-specific recombination between ⁇ C31 attB in the HDR vector with the blasticidin resistance gene removed shown in FIG. Generation of HDR vector with IgHD inserted.
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 6; This figure shows removal of unnecessary sequences such as the CAG promoter and the blasticidin resistance gene from the human minimalized IgHD-inserted HDR vector generated in FIG. 9 by introducing R4 recombinase into the cells. .
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 6; This figure shows human minimalized IgHD (a total of 23 pieces from D2-2 to D5-24 in the figure) in a vector (Fig. 8) containing the human minimalized immunoglobulin heavy chain locus D region, and bovine human IgHD. (A total of 23 from B1-1 to B9-4 in the figure) are used to construct vectors.
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 9; This figure shows the procedure for constructing a bovinized human IgHD vector carrying bovine miniA, B, and C.
  • bovine human IgHD was divided into three parts in the same manner as in Example 5, and bovine miniA, bovine miniB, and bovine miniC, which were the three-part plasmid DNAs, were chemically synthesized (the synthesis was entrusted to Eurofins Genomics).
  • FIG. 9 shows the procedure for constructing a bovinized human IgHD vector carrying bovine miniA, B, and C.
  • bovine human IgHD was divided into three parts in the same manner as in Example 5, and bovine miniA, bovine miniB, and bovine miniC, which were the three-part plasmid DNAs, were chemically synthesized (the synthesis was entrusted to Eurofins Genomics).
  • FIG. 11 is a diagram relating to Example 9; This figure shows the procedure for constructing a bovinized human IgHD
  • Ig immunoglobulin
  • Example 14 shows the results of Example 14;
  • This figure shows antigen (SARS -Using a 96-well plate on which the CoV2 spike protein S1 receptor binding site (RBD) was immobilized and an anti-human IgG Fc antibody, the indicated 1/1,000 to 1/1,000,000-fold dilution of the anti-
  • the results of ELISA performed on serum are shown. At this time, it was confirmed that an immune response was generated by continuous booster immunization, and the antibody titer against RBD (vertical axis, OD at 450 nm) increased.
  • b1-b5 represent boosters 1-5.
  • Example 11 shows the results of Example 18; This figure shows the structure of the simianized human IgHD region obtained by replacing the human minimalized IgHD region (approximately 43 kb) with the cynomolgus monkey D fragment (approximately 44 kb).
  • FIG. 20 is a diagram relating to Example 19; This figure shows 26 modified long DH sequences to replace D fragments 1-1 to 1-26 of the human long minimalized IgHD region.
  • FIG. 29 is a diagram relating to Example 29;
  • the present invention in a first aspect, in a mammalian artificial chromosome vector comprising human immunoglobulin heavy chain and light chain loci, D1-1 to D1 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region A mammal characterized in that the human-derived genomic sequence up to -26 is replaced with a modified sequence of the D region consisting of a combination of (1) and (2) or (1) and (3) below
  • An animal artificial chromosome vector wherein the modified sequence of the D region is (1) human-derived genomic sequence between ORFs from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, or human-derived genome between the above ORFs excluding between D3-9 and D3-10 the sequence comprises a truncated sequence of 49 bp or more from each VDJ recombination sequence end of the inter-ORF region flanked by the VDJ recombination sequences; and (2) instead of the OR
  • Human immunoglobulin heavy chain locus D region herein refers to all ORFs (also referred to as “genes” (or polypeptide-encoding regions) or “D fragments”), VDJ recombination sequences, and all It refers to the entirety including the inter-ORF (ie, between genes) regions of the .
  • VDJ recombination sequences are sequences flanking the upstream and downstream of the V, D and J regions of human immunoglobulin heavy and light chain loci, the heavy chain, light chain kappa and light chain lambda genes It contains conserved sequences of 7, 23, 9 and/or 12 bases in different locations depending on the locus.
  • the recombinant sequence contains 28 bp (ie, 9 bp, 12 bp (spacer), 7 bp) of bases.
  • Mammalian artificial chromosome vectors are, but not limited to, artificial chromosome vectors made from mammalian chromosomes such as humans, rodents (e.g., mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), more specifically in the genomic sequence from the long arm and short arm (if any) comprising the centromere and telomere from said animal and having, for example, 99.5% to 100%, preferably 100%, of the genes removed
  • rodents e.g., mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.
  • an artificially engineered chromosomal vector containing a human immunoglobulin heavy chain locus comprising an altered antibody heavy chain D region and, optionally, a human immunoglobulin light chain locus.
  • telomeres in the present specification are natural telomeres of the same or different species, or artificial telomeres.
  • homologous means an animal of the same species as the mammal from which the chromosome fragment of the artificial chromosome vector is derived, while “heterologous” means a mammal other than the animal (which includes humans).
  • An artificial telomere sequence refers to an artificially produced sequence having a telomere function, such as the (TTAGGG)n sequence (n means repeat).
  • telomere sequence into an artificial chromosome can be performed by a method including telomere truncation (cleavage by artificially inserting a telomere sequence) as described in, for example, International Publication WO00/10383. Telomere truncation can be used for chromosome shortening in the creation of artificial chromosomes of the present invention.
  • a human antibody heavy chain variable region consists of framework (FR) 1, CDRH1, FR2, CDRH2, FR3, CDRH3, FR4, and part of the constant region from the N-terminal side.
  • FR1, CDRH1, FR2, CDRH2 and FR3 are encoded primarily by V region nucleotide sequences of the VDJ sequence formed by recombination (or rearrangement) of the human immunoglobulin heavy chain locus.
  • CDRH3 and FR4 are mainly encoded by the D region nucleotide sequence and J region nucleotide sequence of the above VDJ sequence, respectively.
  • the D region is modified in order to produce a human antibody containing an antibody heavy chain CDR3 with a length of 18 or more amino acids.
  • the human antibody light chain variable region consists of FR1, CDRL1, FR2, CDRL2, FR3, CDRL3, FR4, and part of the constant region, and FR1, CDRL1, FR2, CDRL2, FR3 and CDRL3 (part) It is encoded mainly by the V region nucleotide sequence of the VJ sequence formed by recombination (or rearrangement) of the human immunoglobulin light chain locus, and CDRH3 (part) and FR4 are mainly encoded by the VJ sequence is encoded by the J region nucleotide sequence of
  • the present invention expands the diversity of human antibodies, preferably The D region genomic sequence of the human antibody heavy chain locus is modified so that an antibody containing a longer (eg, 18 or more) amino acid length of CDRH3 than usual in a human antibody can be obtained.
  • modified sequences of the human D region are described below.
  • An example of a modified sequence is that the genomic sequence of the inter-ORF (also referred to as "inter-genic") region of the human immunoglobulin heavy chain locus D region is flanked by VDJ recombination sequences at the ends of each VDJ recombination sequence of the inter-ORF region.
  • a modified D region genomic sequence comprising a sequence truncated to a length of 49 bp or more from the be.
  • the D region (also referred to as the “IgHD” region) of the human immunoglobulin heavy chain locus is present on human chromosome 14 (14q32.33) and is 5′ ⁇ 3′ in order, for example, D1-1 (position 23599). Accession No. X97051), D2-2 (Positions 35049-37615; Accession No. J00232), D3-3 (Positions 37616-39425; Accession No. X13972), D4-4 (Positions 39426-40474; Accession No. X13972), D5-5 (Positions 40475-41880; Accession No. X13972), D6-6 (Positions 41881-43056; Accession No.
  • X13972 D1-7 (Positions 43057-44649; Accession No. X13972), D2-8 (Positions 44650-47262) Accession No. X13972), D3-9 (Positions 47263-48619; Accession No. X13972), D3-10 (Positions 48620-49158; Accession No. X13972), D4-11 (Positions 49159-50078; Accession No.
  • the ORF sequences D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain (IgH) D region are, for example, the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 101-126 below. Also, an example of the size between ORFs after shortening is shown between each sequence.
  • SEQ ID NO: 101 (IGHD1-1): ggtacaactggaacgac (Size between ORFs of D1-1 and D2-2 + VDJ recombination sequence (28bp ⁇ 2): 256bp)
  • SEQ ID NO: 102 (IGHD2-2): aggatatgtagtagtaccagctgctatgcc (Size between ORFs of D2-2 and D3-3 + VDJ recombination sequence (28bp x 2): 256bp)
  • SEQ ID NO: 103 (IGHD3-3): gtattacgatttttggagtggttattatacc (Size between ORFs of D3-3 and D4-4 + VDJ recombination sequence (28bp x 2): 256bp)
  • SEQ ID NO: 104 (IGHD4-4): tgactacagtaactac (Size between ORFs of D4-4 and D5-5 +
  • the modified sequence contains the modified ORF of the human IgHD region, and each human-derived genomic sequence of the inter-ORF region (that is, intergenic region) is flanked by the VDJ-recombined sequence. to a length of 49 bp or more, such as from about 100 bp to about 500 bp, from about 150 bp to about 300 bp, or from about 200 bp to about 250 bp.
  • the length of the modified human IgHD region after minimization is preferably about 10 kb or less so that it can be inserted into a (conventional) plasmid vector. For example, when shortening to about 200 bp, it is minimized to a length of about 8 kb.
  • the above shortening (or minimization) method is not particularly limited. can be deleted.
  • D1-1 to D1-26 of the human D region is divided into several (eg, 3 to 5) segments, and each segment is minimized. They can be ligated side by side to create the human minimalized D region of interest ( Figure 8).
  • the nucleotide sequence of the D region which includes the ORF sequences from D1-1 to D1-26 of the human minimalized D region, the VDJ recombination sequence (28 bp ⁇ 2) and the sequence between the minimalized ORFs, is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 below.
  • nucleotide sequence containing an addition.
  • a human minimalized D region sequence such as SEQ ID NO: 1 can be used when replacing the human IgHD region ORF with a heterologous ORF.
  • Another modified sequence includes the genomic sequence of the immunoglobulin heavy chain locus D region derived from a non-human animal capable of producing an antibody with an antibody heavy chain CDR3 amino acid length of 18 or more, or a modified sequence thereof.
  • Such non-human animals are, for example, animals such as cows, monkeys (eg, cynomolgus monkeys), sheep, horses, rabbits, birds, sharks (eg, bull sharks, reef sharks, and white sharks).
  • Information retrieval from, for example, the International ImmunoGeneTics information system (IMGT) can confirm that at least the above animal species are species with D segments longer than the longest D segment in humans (37 base pairs).
  • the bovine immunoglobulin heavy chain locus D region (21q24), for example, IGHD B1-1, B2-1, B3-1, B4-1, B9-1, B1-2, B2-2, B5-2, B8-2, B6-2, B1-3, B2-3, B3-3, B7-3, B5-3, B6-3, B1-4, B2-4, B3- 4, B7-4, B5-4, B6-4 and B9-4.
  • the ORF sequence from B1-1 to B9-4 of the bovine immunoglobulin heavy chain locus D region can be replaced to include
  • the nucleotide sequence of the bovine human minimalized D region thus obtained is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 below, or 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or It includes nucleotide sequences that have 99% or more identity, or nucleotide sequences that contain deletions, substitutions or additions of one or several nucleotides (or bases) in the nucleotide sequence.
  • the ORF sequences from B1-1 to B9-4 of the bovine IgHD region are, for example, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 127-149 below.
  • Cynomolgus monkey immunoglobulin heavy chain locus D region (Chr7q; G.-Y. Yu et al., Immunogenetics 2016; 68: 417-428) is 5′ ⁇ 3′ in order, for example, IGHD 1S5, 2S11, 3S6 , 4S24,5S8,6S4,1S10,2S17,3S18,2S34,5S14,5S31,6S3,1S27,2S22,4S36,4S30,5S37,6S20,1S33,2S28,6S32,3S12,6S38,6S26, and 1S39 about 44kb ( Figure 15).
  • the ORF sequences from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region are replaced with the ORF sequences from 1S5 to 1S35 of the monkey immunoglobulin heavy chain locus D region.
  • the ORF sequences from 1S5 to 1S35 of the cynomolgus monkey D region are, for example, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 150-175 below.
  • SEQ ID NO: 150 (1S5): ggtataactggaactac SEQ ID NO: 151 (2S11): agaatattgtagtagtacttactgctcctcc SEQ ID NO: 152 (3S6): gtattacgaggatgattacggttactattacacccacagcgt SEQ ID NO: 153 (4S24): tgactacggtagcagctac SEQ ID NO: 154 (5S8): gtggatacagctacagttac SEQ ID NO: 155 (6S4): gggtatagcagcggctggtac SEQ ID NO: 156 (1S10): ggtatagctggaacgac SEQ ID NO: 157 (2S17
  • another modified sequence is created based on a human antibody heavy chain CDR3 sequence of 18 amino acids or more in place of the ORFs from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, It contains 26 modified ORF sequences from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region.
  • Such a modified D region ORF is, for example, a nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 75 to 100 as shown in FIG.
  • a nucleotide sequence having an identity of 99% or more, or a nucleotide sequence containing deletion, substitution or addition of one or several nucleotides (or bases) in the nucleotide sequence, D1-1 of the human IgHD region to D1-26 can be replaced with the corresponding 26 modified ORF sequences described above.
  • the nucleotide sequence of the human minimalized D region so replaced is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of said nucleotide sequence. It includes nucleotide sequences with identity or nucleotide sequences containing deletions, substitutions or additions of one or several nucleotides (or bases) in said nucleotide sequences.
  • a method for determining a modified ORF sequence based on a human antibody heavy chain CDR3 sequence can include, for example, the steps shown below.
  • the upstream from the sequence "WG" on the N-terminal side of VH is defined as CDR3 (M. Chiu et al. ., Antibodies 2019;8(4):55; doi.org/10.3390/antib8040055).
  • CDR3 M. Chiu et al. ., Antibodies 2019;8(4):55; doi.org/10.3390/antib8040055.
  • known sequences with CDR3 of 18 amino acids or more are searched.
  • the nucleotide sequence of CDR3 is extracted.
  • synonymous (no amino acid changes) substitution mutations are introduced into the somatic mutation hotspot sequence to the extent possible.
  • Identity in the present specification can be determined using a protein or gene search system such as BLAST or FASTA with or without introducing gaps (Zheng Zhang et al., J. Comput.Biol.2000;7:203-214;Altschul, SF et al., Journal of Molecular Biology1990;215:403-410;Pearson, WR et al., Proc.Natl.Acad Sci USA, 1988;85:2444-2448).
  • the D region of the human immunoglobulin heavy chain locus can be modified, for example, by methods comprising the following steps.
  • a mammalian artificial chromosome vector [Ig-NAC]) containing human immunoglobulin heavy and light chain loci is provided.
  • Ig-NAC has a structure that includes a human immunoglobulin heavy chain locus and a human immunoglobulin light chain ⁇ (or ⁇ ) locus from the telomere side to the centromere side (eg, Japanese Patent No. 6868250).
  • Ig-NAC is capable of stable replication and distribution as a chromosome independent of the original chromosome of the cell to be introduced.
  • examples of this vector are rodent artificial chromosome vectors (eg mouse or rat artificial chromosome vectors). Production of rodent artificial chromosome vectors is described, for example, in Japanese Patent No. 6775224 and Japanese Patent No. 6868250 by the present applicant.
  • a mammalian artificial chromosome vector may be produced, for example, by telomere truncation of a mammalian chromosome, comprising the centromere of the animal, a long arm segment near the centromere and, if present in the animal, a short arm segment, and a telomere .
  • the mouse-derived chromosome fragment is any chromosome of mouse 1 to 19, X and Y chromosomes, preferably any fragment of chromosome 1 to 19 (at least the number of all endogenous genes in the long arm 99.5%, preferably nearly 100% deleted long arm fragment), the fragment includes a long arm fragment in which the long arm distal is deleted from the mouse chromosome long arm site near the centromere .
  • Mouse chromosome sequence information is available from DDBJ/EMBL/GenBank, Santa Cruz Biotechnology, Inc.; Available from Chromosome Databases such as.
  • the long arm fragment is non-limiting, for example, AC121307, AC161799 etc.
  • the long arm region distal to the position is deleted consists of fragments.
  • the long arm fragment consists of, but not limited to, a long arm fragment in which a region distal to Gm35974 has been deleted.
  • it consists of a mouse chromosome 10-derived long arm fragment obtained by deleting the distal long arm from the gene Gm8155, which is the chromosomal region of the mouse chromosome 10 long arm.
  • mouse artificial chromosome vectors include mouse artificial chromosomes contained in deposited cell line DT40 (10MAC) T5-26 (international deposit number NITE BP-02656), or deposited cell line DT40 (16MAC) T1-14 (international deposit number NITE BP-02657) includes mouse artificial chromosomes.
  • the mammalian artificial chromosome vector of the present invention is, for example, the following steps (a) to (c): (a) obtaining cells that retain mammalian chromosomes; (b) deleting the mouse chromosome long-arm distal so that it does not contain the majority (99.5%-100%, preferably 100%) of the endogenous gene(s), and (c) long-arm proximal can be made by a method comprising the step of inserting one or more DNA sequence insertion sites into
  • the order of steps (b) and (c) may be reversed.
  • a mammalian artificial chromosome vector of the present invention To produce a mammalian artificial chromosome vector of the present invention, first, cells that retain mammalian chromosomes are produced. For example, mammalian fibroblasts carrying mammalian chromosomes labeled with drug resistance genes (e.g., blasticidin S resistance gene (BSr)) and mouse A9 cells (ATCC VA20110-2209 ) by cell fusion and transferring the chromosome from a mouse A9 hybrid cell carrying a mammalian chromosome labeled with a drug resistance gene into a cell with a high rate of homologous recombination.
  • mammalian fibroblasts can be obtained based on the method described in the literature.
  • mouse fibroblasts can be established from C57B6 mice available from CLEA Japan.
  • Chicken DT40 cells Dieken et al., Nature Genetics, 12:174-182, 1996), for example, can be used as cells with a high homologous recombination rate.
  • the transfer can be performed by a known chromosomal transfer method, for example, the micronuclear cell fusion method (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res., 80:413-418, 1973).
  • ⁇ Step (1b)> In cells that retain a single chromosome from a mammal, the long arm distal of the mammalian chromosome and, if present in the animal, the short arm distal are deleted. At this time, the important thing is to delete (or remove or delete) most of the endogenous genes present on the long and short arms and construct an artificial chromosome that retains the mammalian centromere. This is at least 99.5%, preferably at least 99.7%, more preferably at least 99.8%, most preferably 99.9-100% of the total endogenous gene(s) present on the long and short arms Most preferably, the cutting position is determined so as to delete (or remove or delete) 100%.
  • telomere truncation Specifically, in cells that retain mammalian chromosomes, a targeting vector that retains the telomere sequence is constructed, and a clone in which an artificial or natural telomere sequence is inserted at a desired position on the chromosome by homologous recombination is obtained. gives deletion mutants by telomere truncation.
  • the desired position is the cutting position of the distal long arm to be deleted, and the telomere sequence is substituted and inserted at this position by homologous recombination to delete the distal long arm.
  • Such positions can be appropriately set by designing the target sequence when constructing the targeting vector.
  • a target sequence is designed based on the DNA sequence of the long arm of a mammalian chromosome, and set so that telomere truncation occurs on the telomere side of the target sequence. This results in a mammalian chromosomal fragment in which most of the endogenous gene has been deleted. Telomere truncation can be similarly performed for other chromosomes. The same is true for amputation of the distal short arm.
  • a recognition site for a site-specific recombination enzyme can preferably be inserted. That is, certain enzymes are known to recognize a specific recognition site and specifically cause recombination of DNA at the recognition site, and in the mammalian artificial chromosome vector in the present invention, such an enzyme and its A system of recognition sites for enzymes can be used to insert and load the desired human immunoglobulin heavy chain or locus and/or human immunoglobulin light chain gene or locus sequences.
  • a Cre enzyme derived from bacteriophage P1 and a loxP sequence system as its recognition site Cre/loxP system; B.
  • a known method such as a homologous recombination method can be used to insert the recognition site for such a site-specific recombination enzyme, and the insertion position and number are appropriately set within the proximal long arm and proximal short arm. can do.
  • One type of recognition site or different types of recognition sites can be inserted into the mammalian artificial chromosome vector. Insertion of the target gene or locus by setting the recognition site, that is, the human immunoglobulin heavy chain gene or locus, the human immunoglobulin light chain ⁇ gene or locus, or the human immunoglobulin light chain ⁇ gene or locus Since the position can be specified, the insertion position is constant and free from unintended position effects.
  • a reporter gene may preferably be inserted into the mammalian artificial chromosome vector, in addition to the sequence of the above gene or locus of interest.
  • reporter genes include, but are not limited to, fluorescent protein (e.g., green fluorescent protein (GFP or EGFP), yellow fluorescent protein (YFP), etc.) gene, tag protein-encoding DNA, ⁇ -galactosidase gene, luciferase gene and the like.
  • the mammalian artificial chromosome vector may further contain a selectable marker gene.
  • Selectable markers are useful in selecting cells transformed with the vector.
  • selectable marker genes include positive selectable marker genes and negative selectable marker genes, or both.
  • Positive selectable marker genes include drug resistance genes such as neomycin resistance gene, ampicillin resistance gene, blasticidin S (BS) resistance gene, puromycin resistance gene, geneticin (G418) resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.
  • Negative selectable marker genes include, for example, herpes simplex thymidine kinase (HSV-TK) gene, diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene and the like. HSV-TK is commonly used in combination with ganciclovir or acyclovir.
  • human immunoglobulin gene or locus means a human immunoglobulin heavy chain gene or locus from human chromosome 14, a human immunoglobulin light chain from human chromosome 2, unless otherwise specified. It refers to the kappa gene or locus and/or the human immunoglobulin light chain lambda gene or locus from human chromosome 22.
  • the human immunoglobulin gene or locus is, for example, human chromosome 14 immunoglobulin heavy locus (human) NC — 000014.9 ((base number 105586437..106879844) or (base number 105264221..107043718)), human immunoglobulin kappa locus (human) NC — 000002.12 ((base number 88857361..90235368) or (base number 88560086..90265666)) of chromosome 2, and immunoglobulin lambda locus of human chromosome 22 (human) NC_000022.11 (( (base numbers 22026076..22922913) or (base numbers 21620362..23823654)).
  • the human immunoglobulin heavy chain gene or locus is about 1.3 Mb base length, the human immunoglobulin light chain ⁇ gene or locus is about 1.4 Mb base length, and the human immunoglobulin light chain ⁇ gene. Alternatively, the locus is about 0.9 Mb base long.
  • the mouse antibody heavy chain gene or locus is on mouse chromosome 12
  • the mouse antibody light chain ⁇ gene or locus is on mouse chromosome 6,
  • the mouse antibody light chain ⁇ gene or The locus is on mouse chromosome 16.
  • the mouse antibody heavy chain gene or locus is Chromosome 12, NC_000078.6 (113258768..116009954, complement)
  • the mouse antibody light chain ⁇ gene or locus is Chromosome 6, NC_000072.6 (67555636 ..70726754)
  • the mouse antibody light chain ⁇ gene or locus is represented by the base sequence described in Chromosome 16, NC — 000082.6 (19026858..19260844, complement).
  • the rat antibody heavy chain gene or locus is on rat chromosome 6
  • the rat antibody light chain ⁇ gene or locus is on rat chromosome 4
  • the rat antibody light chain ⁇ gene or locus is on rat chromosome 4.
  • the locus is on rat chromosome 11.
  • the nucleotide sequences of these genes or loci are available from NCBI in the United States (GenBank, etc.), published literature, and the like.
  • ⁇ Second step> In a mammalian artificial chromosome vector (Ig-NAC) containing the human immunoglobulin (heavy chain and / or light chain) locus prepared in the first step, from the human immunoglobulin heavy chain locus, for example, genome editing (J M. Chylinski et al., Science 2012;337:816-821) and site-specific recombination techniques (e.g., use of site-specific recombination enzymes) to combine the V and J regions of the human heavy chain locus.
  • the D region present between is deleted to create 'Ig-NAC( ⁇ DH)'.
  • Genome editing in this specification is a technology for editing and genetically modifying genomic DNA using artificial cleavage enzymes such as TALEN (TALE nuclease), CRISPR-Cas system, etc. Any technique of genome editing can be used in the method of the invention, but preferably the CRISPR-Cas system is used.
  • TALEN TALE nuclease
  • CRISPR-Cas system CRISPR-Cas system
  • the CRISPR/Cas9 system was discovered from the adaptive immune system against viruses and plasmids of bacteria and archaea, but the vector construction is relatively simple and it is possible to modify multiple genes at the same time (Jineket et al. al., Science, 17, 337(6096): 816-821, 2012; Sander et al., Nature biotechnology, 32(4): 347-355, 2014).
  • This system includes a Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) with an approximately 20 base pair target sequence.
  • the gRNA recognizes the PAM sequence near the target sequence and specifically binds to the target genomic DNA, and the Cas9 protein induces a double-strand break upstream of the 5' side of the PAM sequence. do.
  • the site of the human immunoglobulin heavy chain locus targeted by the guide RNA is, but not limited to, the 5' upstream site of the human D1-1 fragment, and the target sequence of the guide RNA is, for example, the 5' -AGATCCTCCATGCGTGCTGTGGG-3' (SEQ ID NO: 4).
  • Site-specific recombination enzymes in this specification are enzymes that specifically recombine with the target DNA sequence at the recognition sites of these enzymes. Site-specific recombination can be performed by using such a recombination enzyme and its recognition site.
  • site-specific recombinases are Cre integrase (also called Cre recombinase), Flp recombinase, ⁇ C31 integrase, R4 integrase, TP901-1 integrase, Bxb1 integrase, and the like.
  • the recognition sites of the enzyme include, for example, loxP (Cre recombinase recognition site), FRT (Flp recombinase recognition site), ⁇ C31attB and ⁇ C31attP ( ⁇ C31 recombinase recognition site), R4attB and R4attP (R4 recombinase recognition site), TP901-1attB and TP901-1attP (TP901-1 recombinase recognition site), or Bxb1attB and Bxb1attP (Bxb1 recombinase recognition site).
  • acceptor site for introducing a synthetic D region polynucleotide is inserted into the site from which the D region of the human immunoglobulin heavy chain locus has been deleted.
  • acceptor sites are cassettes containing recognition sites for site-specific recombination enzymes.
  • An example of the method for inserting the acceptor site is described in ⁇ Third Step> below.
  • the site-specific recombination enzymes and their recognition sites are, for example, the above Cre recombinase and loxP system, Flp recombinase and FRT system, ⁇ C31 recombinase and ⁇ C31attB and ⁇ C31attP systems, and the like.
  • a site-specific recombinase eg, Cre
  • Cre can catalyze site-specific recombination reactions between recognition site sequences (eg, between loxPs).
  • ⁇ Third step> A synthetic D region polynucleotide is inserted into the acceptor site by a method such as site-specific recombination technology or genome editing technology.
  • the synthetic D region polynucleotide is a human-derived genomic sequence from D1-1 to D1-26 of the D region of the human immunoglobulin heavy chain locus, as described in Section 1 above, which includes (1) and ( 2), or a modified D region substituted with a modified sequence of the D region consisting of a combination of (1) and (3), wherein the modified sequence is (1) human-derived genomic sequence between the open reading frames (ORF) from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, or the ORF except between D3-9 and D3-10
  • the human-derived genomic sequence between comprises a sequence truncated to a length of 49 bp or more from each VDJ recombination sequence end of the inter-ORF region flanked by the VDJ recombination sequences, and (2) Instead of the ORF sequence from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, the bovine-derived immunoglobulin heavy chain locus D region from B1-1
  • the method of replacing the human immunoglobulin heavy chain D region in the production of the mammalian artificial chromosome vector with its modified sequence comprises the following steps: can include (1′) providing a mammalian artificial chromosome vector containing human immunoglobulin heavy and light chain loci; (2 ') step (1 ') to delete the human immunoglobulin heavy chain D region from the mammalian artificial chromosome vector, (3') a cassette containing a first site-specific recombination enzyme recognition site, a promoter and a second site-specific recombination enzyme recognition site at the deletion site of the D region of the vector obtained in step (2'); insert, (4') modification of the human immunoglobulin heavy chain D region using a second site-specific recombinase at the second site-specific recombinase recognition site of the cassette inserted in step (3') inserting a cassette comprising a
  • the modified sequence of the human immunoglobulin heavy chain D region, the first site-specific recombinant enzyme recognition site, the second site-specific recombinant enzyme recognition site, the first site-specific recombinant enzyme, and the second Site-specific recombination enzymes are not limited, but for example those described above can be used.
  • the promoter is not limited, but for example, the CAG promoter can be used.
  • step (2 ') in order to delete the human immunoglobulin heavy chain D region from the mammalian artificial chromosome vector of step (1 '), for example, the above genome editing, using techniques such as site-specific recombination can be done.
  • the polynucleotide and a site-specific recombination enzyme recognition site at its 5′ end A vector containing a containing cassette (for example, the sequence of ⁇ C31-BsdR-oriC-R4) is prepared, and a site-specific recombination reaction is performed between the vector and the Ig-NAC ( ⁇ DH) to generate Ig-NAC ( ⁇ DH ) can be inserted into the human heavy chain D region cleavage site (FIGS. 5, 6, 9 and 10).
  • Ig-NAC human immunoglobulin heavy chain V region partial sequence and human immunoglobulin heavy chain J region (and optionally , C region) to create a vector containing a site-specific recombination enzyme recognition site between the partial sequence, genome editing (Cas9 / gRNA) between this vector and Ig-NAC ( ⁇ DH)
  • Ig-NAC Insert the site-specific recombinase recognition site into the human heavy chain D region cleavage site of ( ⁇ DH), act another site-specific recombinase, and human heavy chain D region of the Ig-NAC ( ⁇ DH)
  • An Ig-NAC is generated that contains a site-specific recombinase recognition site at the cleavage site.
  • a vector containing the polynucleotide and a site-specific recombination enzyme recognition site at its 5' end is prepared, and a site-specific recombination enzyme (for example, ⁇ C31 recombinase) is acted on, and another site-specific recombinase (eg, Bxb1 recombinase or R4 recombinase) is acted on to the human heavy chain D region cleavage site of the above Ig-NAC ( ⁇ DH) synthetic D region polynucleotide
  • ⁇ DH human heavy chain D region cleavage site of the above Ig-NAC
  • the invention still further provides, in another aspect, a mammalian artificial chromosome vector comprising human immunoglobulin heavy and light chain loci, wherein said human immunoglobulin heavy chain loci lack a D region,
  • a mammalian artificial chromosome vector comprising a first site-specific recombinase recognition site, a promoter and a second site-specific recombinase recognition site in place of the deleted D region.
  • the above vector may further contain a third site-specific recombination enzyme recognition site.
  • mammalian artificial chromosome vector is the vector produced in the above step (3') (e.g., Fig. 9).
  • the deleted D region is the region from D1-1 to D1-26, or the region from D1-1 to D7-27.
  • the first site-specific recombination enzyme recognition site and the second site-specific recombination enzyme recognition site are not limited, but those described above, for example, can be used.
  • the promoter is not limited, but for example, the CAG promoter can be used.
  • the invention provides a mammalian cell comprising the mammalian artificial chromosome vector described in Section 1 above.
  • Mammalian cells By introducing a human immunoglobulin locus in which the antibody heavy chain D region has been modified ("modified Ig-NAC" in Section 1) into mammalian-derived cells via the mammalian artificial chromosome vector of the present invention, Mammalian cells can be engineered that are capable of producing human antibodies.
  • modified Ig-NAC modified immunoglobulin locus in which the antibody heavy chain D region has been modified
  • the mammalian artificial chromosome vector of the present invention can be transferred or introduced into any mammalian cell.
  • Techniques therefor include, for example, the micronucleus cell fusion method, lipofection, calcium phosphate method, microinjection, electroporation and the like, and the preferred method is the micronucleus cell fusion method.
  • micronucleus cell fusion method cells having the ability to form micronuclei containing the mammalian artificial chromosome vector of the present invention (e.g., mouse A9 cells) are combined with other desired cells by micronucleus fusion. It is a method of transfecting into cells.
  • Cells having the ability to form micronuclei are treated with a polyploid-inducing agent (e.g., colcemid, colchicine, etc.) to form micronucleated multinucleated cells, and treated with cytochalasin to form micronuclei. can perform cell fusion with cells of a polyploid-inducing agent (e.g., colcemid, colchicine, etc.) to form micronucleated multinucleated cells, and treated with cytochalasin to form micronuclei. can perform cell fusion with cells of
  • the above-mentioned vector-introducible cells are mammalian cells such as rodent cells and human cells. It includes cells, stem cells such as somatic stem cells, somatic cells, fetal cells, adult cells, normal cells, primary cultured cells, passaged cells, established cells, and the like.
  • Stem cells include, for example, embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, nuclear transfer cloned embryo-derived embryonic stem ( ntES) cells and the like.
  • Preferred cells are e.g. rodents such as mice, rats, hamsters (e.g.
  • Chinese hamsters guinea pigs, primates such as humans, monkeys, chimpanzees, ungulates such as cows, pigs, sheep, goats, horses and camels.
  • somatic cells stem cells, progenitor cells, and non-human germline cells from mammals such as mammals.
  • the vectors are more stably retained in rodent cells or tissues into which the vectors of the present invention have been introduced.
  • Non-limiting examples of somatic cells include hepatocytes, enterocytes, kidney cells, splenocytes, lung cells, heart cells, skeletal muscle cells, brain cells, skin cells, bone marrow cells, fibroblasts, and the like.
  • ES cells are stem cells with pluripotency and semi-permanent proliferative ability established from the inner cell mass of the blastocyst of a fertilized egg derived from mammals (MJ Evans and MH Kaufman (1981) Nature 292: 154-156; JA Thomson et al. (1999) Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. 7844-7848; JA Thomson et al. (1996) Biol.Reprod.55:254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998) Curr. -165).
  • Rat ES cells as well as mouse ES cells (MJ Evans and MH Kaufman, Nature 1981; 292(5819): 154-156), can be obtained from rat blastocyst stage embryos or 8-cell stage embryos. It is a cell line with pluripotency and self-renewal ability, which is established from the inner cell mass of the embryo.
  • rat blastocysts with lysed zona pellucida are cultured on mouse embryonic fibroblast (MEFF) feeders with medium containing leukemia inhibitory factor (LIF) and 7-10 days later, blastocysts
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the outgrowth formed from the cells is dispersed, transferred onto a MEF feeder and cultured, and after about 7 days, ES cells emerge.
  • rat ES cells see, for example, K.K. Kawaharada et al. , World J Stem Cells 2015;7(7):1054-1063.
  • iPS cells are formed by introducing a specific reprogramming factor (DNA or protein) into somatic cells (including somatic stem cells), culturing them in an appropriate medium, and subculturing them to form colonies in about 3 to 5 weeks. can be generated.
  • Reprogramming factors are, for example, the combination consisting of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc; the combination consisting of Oct3/4, Sox2 and Klf4; the combination consisting of Oct4, Sox2, Nanog and Lin28; , Klf4, c-Myc, Nanog and Lin28 are known (K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell 126: 663-676 (2006); WO2007/069666; M.
  • mitomycin C-treated mouse fetal fibroblast cell lines eg, STO
  • vector-introduced somatic cells eg, about 10 4 to 10 5 cells
  • Feeder cells are not necessarily required (Takahashi, K. et al., Cell 131:861-872 (2007)).
  • the basal medium is, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham's F-12 medium, mixed medium thereof, or the like, and the ES cell medium is mouse ES cell medium, primate ES cell medium (Reprocell), or the like. can be used.
  • Non-human animal in the third aspect of the present invention, a non-human animal comprising human immunoglobulin heavy chain and light chain loci, the D region of the human immunoglobulin heavy chain locus from D1-1 to D1- Up to 26 human-derived genomic sequences are replaced with a modified sequence of the D region consisting of a combination of (1) and (2) or (1) and (3) below, and the modified sequence of the D region but, (1) human-derived genomic sequence between D1-1 to D1-26 open reading frames (ORF) of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, or the ORF except between D3-9 and D3-10
  • the human-derived genomic sequence between comprises a sequence truncated to a length of 49 bp or more from each VDJ recombination sequence end of the inter-ORF region flanked by the VDJ recombination sequences, and (2) Instead of the ORF sequence from D1-1 to D1-26 of the human immunoglobulin heavy chain locus D region, the bovine-derived immunoglobulin heavy
  • the invention comprises a mammalian artificial chromosome vector as described in Section 1 above, and wherein the endogenous immunoglobulin heavy chain, kappa light chain and lambda light chain genes or loci are disrupted.
  • non-human animals refers to animals other than humans, including primates such as monkeys and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, cattle, pigs, sheep, goats, horses and camels. including, but not limited to, mammals such as ungulates such as hoofed animals.
  • Non-human animals For example, by techniques such as mammalian artificial chromosome vector-mediated technology, gene targeting technology, genome editing technology, and / or microinjection technology, pluripotent cells such as the above ES cells and iPS cells, or germ cells, eggs Human immunoglobulins can be produced by introducing a human immunoglobulin locus (“modified Ig-NAC”) in which the human immunoglobulin heavy chain D region is modified into totipotent cells such as mother cells and spermatogonia. Non-human animals can be produced that do.
  • modified Ig-NAC human immunoglobulin locus
  • Non-human animals can be produced that do.
  • the endogenous loci corresponding to the human immunoglobulin heavy and light chain kappa, lambda loci are disrupted (or knocked out) and, if desired, the non-human animal
  • the human immunoglobulin light chain ⁇ locus from human chromosome 22 can be inserted (or knocked in). Techniques such as gene targeting, genome editing, etc. can be used for the method of disruption.
  • a targeting vector is constructed to disrupt the endogenous locus, or to replace/insert (or knock-in) the exogenous DNA in place of the endogenous locus.
  • a vector for disrupting an endogenous locus and inserting foreign DNA comprises a 5′ upstream sequence (about 2.5 kb or more) and a 3′ downstream sequence (about 2.5 kb or more) of the endogenous locus, Between these sequences can be included, for example, an exogenous drug resistance gene sequence, or an exogenous DNA sequence as described above to replace the endogenous locus to be disrupted.
  • Drug resistance genes include, for example, neomycin resistance genes and ampicillin resistance genes.
  • the CRISPR / Cas9 system uses Cas9 protein and a guide RNA (gRNA) having a target sequence of about 20 base pairs to co-express them in cells, so that gRNA is near the target sequence and binds specifically to target genomic DNA, Cas9 protein can induce double-strand breaks 5′ upstream of the PAM sequence.
  • gRNA guide RNA
  • the antibody heavy chain and light chain loci of non-human animals can be cleaved and removed, or the human immunoglobulin heavy chain D region derived from human chromosome 14 can be added to the cleaved site.
  • a vector containing foreign DNA corresponding to a modified human immunoglobulin heavy chain locus, a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 2, and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 22 can be used to insert (or knock-in) the foreign DNA.
  • a vector containing the foreign DNA of interest is introduced into ES cells or iPS cells derived from a non-human animal to disrupt the endogenous locus derived from the animal, and the DNA sequence of interest is inserted into the genome. be able to.
  • the insertion of the foreign DNA of interest can be confirmed by identifying the amplified product by PCR using forward and reverse primers prepared based on the inserted sequence.
  • a chimeric non-human animal can be produced by microinjecting ES cells or iPS cells into which the foreign DNA sequence has been inserted into an early embryo of a foster parent non-human animal.
  • the non-human animal in which the endogenous gene locus has been disrupted is, for example, a chimeric non-human animal containing a human immunoglobulin locus in which the human immunoglobulin heavy chain D region has been modified or its progeny animal, and a cluster of the corresponding endogenous gene. It can be produced by mating animals in which the endogenous gene is heterozygously deleted, which are obtained by mating chimeric animals or progeny animals in which the entire gene is deleted, and further mating the animals.
  • non-human animals of the present invention include a human immunoglobulin heavy chain locus with a modified human immunoglobulin heavy chain D region derived from human chromosome 14 and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 2.
  • a non-human animal comprising a chromosome-derived human immunoglobulin light chain ⁇ locus and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 22, or a non-human animal comprising the artificial chromosome vector.
  • Non-human animals are preferably rodents such as mice and rats containing the mouse artificial chromosome vector.
  • Animal cells e.g., chicken B cell line DT40
  • a human immunoglobulin light chain kappa locus from human chromosome 2 modified by introduction of site-specific recombinase recognition sites (e.g., loxP or FRT), and sites
  • site-specific recombinase recognition sites e.g., loxP or FRT
  • Each animal cell e.g., DT40
  • a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 22 modified by introducing a specific recombination enzyme recognition site e.g., loxP or FRT
  • MAC mouse artificial chromosome
  • CHO Chinese hamster ovary cells
  • a site-specific recombination enzyme e.g., Cre or Flp
  • human Rodent cells containing a MAC vector containing a kappa immunoglobulin light chain locus as well as rodent cells containing a MAC vector containing a human immunoglobulin light chain lambda locus can be generated.
  • human immunoglobulin Animal cells containing a human immunoglobulin heavy chain locus in which the heavy chain D region is modified are fused with rodent cells (e.g., CHO) containing a MAC vector by a cell fusion method to generate a human immunoglobulin heavy chain D region.
  • rodent cells e.g., CHO
  • Rodent cells can be generated that contain MAC vectors containing modified human immunoglobulin heavy chain loci ("modified Ig-NAC" above).
  • a rodent cell containing a MAC vector comprising a human immunoglobulin heavy chain locus in which the human immunoglobulin heavy chain D region is modified and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus, and the human immunoglobulin heavy chain D region
  • Each of the rodent cells containing the MAC vector containing the modified human immunoglobulin heavy chain locus and the human immunoglobulin light chain ⁇ gene or locus derived from human chromosome 22, by the micronuclear cell fusion method A human immunoglobulin heavy chain locus in which the human immunoglobulin heavy chain D region derived from human chromosome 14 is fused with a human animal (e.g., mouse or rat) pluripotent stem cell (e.g., ES cell or iPS cell) and a non-human animal (e.g., mouse or rat) pluripotent stem cell containing a MAC vector containing a human immunoglobulin light chain kappa locus from human chromosome 2, and
  • Generating a non-human animal (e.g., mouse or rat) pluripotent stem cell containing a MAC vector containing a human immunoglobulin heavy chain locus and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 22. can be done.
  • Non-human animal comprising a MAC vector comprising a human immunoglobulin heavy chain locus and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 2, wherein the human immunoglobulin heavy chain D region derived from human chromosome 14 above is modified (e.g., mouse or rat) pluripotent stem cells, and a human immunoglobulin heavy chain locus with an altered human immunoglobulin heavy chain D region from human chromosome 14 and a human immunoglobulin light chain ⁇ from human chromosome 22
  • Each non-human animal (e.g., mouse or rat) pluripotent stem cell containing a MAC vector containing the gene locus is transformed into an early embryo (e.g., 8-cell stage embryo or blastocyst stage) of a non-human animal that is B cell-deficient or non-deficient.
  • the chimeric animal When the chimeric animal retains endogenous B cells, the chimeric animal is further an allogeneic non-human animal lacking mouse antibody heavy chain, light chain ⁇ and light chain ⁇ loci (or lacking B cells). (eg mice or rats).
  • the human immunoglobulin heavy chain locus in which the human immunoglobulin heavy chain D region derived from human chromosome 14 is modified and the human immunoglobulin light chain ⁇ derived from human chromosome 2 A MAC vector containing the locus, or a human immunoglobulin heavy chain locus with a modified human immunoglobulin heavy chain D region derived from human chromosome 14 and a human immunoglobulin light chain ⁇ locus derived from human chromosome 22.
  • Non-human animals can be generated that contain each of the above MAC vectors.
  • Non-human animals eg, mice or rats
  • mice or rats can be generated that contain MAC vectors containing the light chain ⁇ locus.
  • all endogenous antibody genes or loci corresponding to human immunoglobulin heavy chain genes or loci and human immunoglobulin light chain ⁇ and ⁇ genes or loci are disrupted. or preferably knocked out, thereby allowing only human antibodies to be produced in said non-human animal.
  • the present invention further provides for producing human antibodies using the non-human animals described in Section 3 comprising a mammalian artificial chromosome vector comprising human immunoglobulin heavy and light chain loci, and producing the human antibodies.
  • a method for producing a human antibody is provided, comprising recovering.
  • a "human antibody” as used herein may be any class or subclass of human immunoglobulin (Ig).
  • Such classes include IgG, IgA, IgM, IgD and IgE, and subclasses include IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • IgG chains are called ⁇ chains, ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 and ⁇ 4 chains corresponding to IgG1-IgG4, IgA, IgM, IgD and IgE are referred to as ⁇ -chains ( ⁇ 1 and ⁇ 2), ⁇ -chains, ⁇ -chains and ⁇ -chains respectively.
  • All antibody light chains have ⁇ and ⁇ chains, and it is known that ⁇ chain gene rearrangement occurs when ⁇ chain gene rearrangement is unsuccessful in the process of immunoglobulin gene rearrangement.
  • the human immunoglobulin heavy chain locus is VH1, VH2 . .
  • V variable region genes including VHm (where m is, for example, 38 to 46), DH1, DH2, . . D (diversity) region genes including DHn (where n is 23), JH1, JH2. .
  • the D region gene of the human immunoglobulin heavy chain locus is a synthetic D region described as a modified sequence consisting of a combination of (1) and (2) or (1) and (3) in Section 1 above Including substitutions by nucleotide sequence.
  • the antibody produced through the rearrangement of the human immunoglobulin gene is difficult to consistently produce with conventional human antibodies, such as 18 to 50 amino acids or longer Human antibodies can be produced that contain ultralong CDRH3. Human antibodies containing such ultra-long-chain CDRH3 are difficult to produce by conventional monoclonal antibody-producing methods, since they occur at a low frequency in humans.
  • a human antibody molecule consists of two human antibody heavy chains and two human antibody light chains, each heavy chain and each light chain being linked by two disulfide bonds, and two heavy chains (C) It has a structure linked by two disulfide bonds in the region.
  • each of the variable (V) regions of the heavy and light chains of an antibody molecule has three regions with particularly large mutations (hypervariable regions), which are called complementarity determining regions (CDRs).
  • the hypervariable regions of the heavy chain variable region are called CDRH1, CDRH2 and CDRH3 from the N-terminal side, while the hypervariable regions of the light chain variable region are called CDRL1, CDRL2 and CDRL3 from the N-terminal side.
  • the present invention expands the diversity of human antibodies by rearranging the human immunoglobulin genes.
  • the human antibody containing ultralong CDRH3 produced by the non-human animal of the present invention has a structure consisting of a long ( ⁇ -ribbon) Stalk and a Knob, and the Knob has a loop and multiple disulfide bonds.
  • Antibodies that can be obtained by the method of the present invention are ultralong antibodies with a length of 18 or more, 20 or more, 25 or more, 30 or more, 40 or more, or 50 or more amino acids in the antibody heavy chain CDR3. Since it is a human antibody containing CDRH3, it can be used against pathogenic viruses such as human immunodeficiency virus (HIV), influenza virus, coronaviruses (eg, SARS-CoV, MERS-CoV), RS (Respiratory syncytial) virus, and other pathogens ( For example, it is considered to be effective for diseases including infections caused by malaria parasites, trypanosoma parasites).
  • the human antibodies are therapeutically useful because they allow a "hook" type interaction that binds to the receptor cavity of the virus or pathogen at the protruding CDRH3 region.
  • the antibodies of the present invention can be made into cocktails of multiple types of antibodies, and can be used not only for treatment but also for enhancing preventive effects.
  • Specific antibody production methods include the following methods.
  • the human antibody-producing non-human animal (eg, mouse or rat) of the present invention can be immunized with a target antigen such as an HIV envelope protein to produce a polyclonal antibody that specifically binds to the target antigen.
  • a target antigen such as an HIV envelope protein
  • the above animal is immunized with a target antigen
  • the B lymphocytes of the animal individual with an increased antigen-specific antibody titer are used to fuse with myeloma cells to produce hybridomas (immortalized B cells), and the human in the hybridoma supernatant is Broadly neutralizing human monoclonal antibodies can be selected by screening monoclonal antibodies by ELISA analysis for evaluation of antigen-binding ability and, if necessary, evaluation of infection with HIV or the like.
  • the present invention provides, in a fourth aspect, the production of an antibody, comprising immunizing the non-human animal according to Section 3 above with a target antigen and obtaining an antibody that binds to the target antigen from the blood of the non-human animal.
  • a fabrication method is provided.
  • the invention further comprises immunizing a non-human animal according to Section 3 above with a target antigen, and extracting spleen cells or lymph node cells from said non-human animal producing antibodies that bind to said target antigen. obtaining, fusing the spleen cells or lymph node cells with myeloma cells to form hybridomas, culturing the hybridomas, and obtaining monoclonal antibodies that bind to the target antigen. do.
  • the invention further comprises immunizing a non-human animal according to Section 3 above with a target antigen and obtaining B cells from said non-human animal producing antibodies that bind to said target antigen;
  • a nucleic acid encoding a protein consisting of an antibody heavy chain and light chain, or a variable region thereof, is obtained from the B cell, and an antibody that binds to the target antigen by DNA recombination technology or phage display technology using the nucleic acid (e.g., , recombinant antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies (scFv), etc.).
  • the above nucleic acids include DNA (including cDNA) or RNA (including mRNA).
  • the above scFv is a recombinant antibody fragment produced by binding an antibody heavy chain variable region polypeptide and an antibody light chain variable region polypeptide via a linker.
  • variable regions of human antibodies are expressed on the surface of phages as, for example, single-chain antibodies (scFv) or Fabs, and phages that bind to antigens are selected (Nature Biotechnology, 2005; 23(9): 1105- 1116).
  • scFv single-chain antibodies
  • Fabs Fabs
  • phages that bind to antigens are selected (Nature Biotechnology, 2005; 23(9): 1105- 1116).
  • a human antibody can be obtained by constructing an expression vector having the sequence and introducing it into an appropriate host for expression (WO92/01047, WO92/ 20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu.Rev.Immunol, 1994;12:433-455, Nature Biotechnology, 2005; 05-1116) .
  • Antibodies prepared by the above method are prepared by filling blood (antiserum) or cell supernatant containing the antibody with a carrier bound to an antigenic substance or an immunoglobulin G-binding carrier (e.g., agarose gel, silica gel, etc.). It can be applied to a column and then recovered and purified by a technique such as affinity chromatography, which involves eluting the human antibody bound to the carrier from the carrier.
  • a carrier bound to an antigenic substance or an immunoglobulin G-binding carrier e.g., agarose gel, silica gel, etc.
  • Ig-NAC ( ⁇ DH) construction with deleted human IgHD region In order to construct Ig-NAC ( ⁇ DH) with deleted human IgHD region, CRISPR / Cas9 gRNA was designed, evaluated, selected, DH region removal was performed by two-site cleavage in CHO cells retaining Ig-NAC, and Ig-NAC ( ⁇ DH) retaining CHO cells were obtained by screening.
  • Plasmids expressing candidate gRNAs designed based on Cas9 and gRNA-expressing all-in-one vector eSpCas9 (1.1) were constructed.
  • CHO cells bearing Ig-NAC were transfected with the all-in-one vector with Lipofectamine LTX (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol.
  • DNA was extracted from the transfected cells using the PureGene kit (Qiagen), the cleavage activity was confirmed with the Cel-1 assay kit (IDT), and vectors with the following gRNA sequences exhibiting high activity were selected.
  • gRNA Up3 5'-AGATCCTCCATGCGTGCTGT (GGG)-3' (SEQ ID NO: 4) (Here, the gRNA sequence is a sequence of 20 bases excluding the PAM sequence (GGG).)
  • gRNA Down4 5'-CTGCGGCATGAACCCAATGC(AGG)-3' (SEQ ID NO: 5) (Here, the gRNA sequence is a sequence of 20 bases excluding the PAM sequence (AGG).)
  • the DH region was deleted in each combination of gRNA Up3 (“5′guide3” in the figure) and Down4 (“5′guide4” in the figure) (FIG. 1).
  • the all-in-one vector for each gRNA and the CMV-tdTomato expression vector were introduced into Ig-NAC-retaining CHO cells (Patent No. 6868250) using Lipofectamine LTX (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Cells were obtained by sorting.
  • the EGFP signal indicates retention of Ig-NAC, and the tdTomato signal indicates lipofection.
  • the co-positive cells were further cultured, and EGFP-positive and tdTomato-negative cells were collected in a 384-well plate by single-cell sorting 8 days after the first sorting.
  • the grown clones were further scaled up and screened as described below.
  • junction primer F1 5'-TCCCACGGCCCAAGGAAGACAAGACACA-3' (SEQ ID NO: 6)
  • Junction primer R1 5'-TCGAACACGCTCCTAGCATTGCACAGCC-3' (SEQ ID NO: 7)
  • Deletion confirmation primer F1 5'-ACACCTGTCTCCCGGGTTGTG-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Deletion confirmation primer R1 5'-AAGAAACGCAGGACGGTGGA-3' (SEQ ID NO: 9)
  • Defect confirmation primer F2 5'-CAGCAGCCACTCTGATCCCA-3' (SEQ ID NO: 10)
  • Deletion confirmation primer R2 5'-CTGGTGGACTCTACGGCGAA-3' (SEQ ID NO: 11)
  • Deletion confirmation primer F3 5'-
  • KOD FX (TOYOBO) was used as the enzyme, and the reaction conditions were 35 cycles of 98°C for 15 seconds, 60°C for 30 seconds, and 68°C for 90 seconds. Out of 381 clones obtained from all combinations, removal of the D region was confirmed in 35 clones. After that, PCR for confirming the presence of antibody gene regions other than DH on Ig-NAC was performed by the method described in Japanese Patent No. 6868250) to select candidate Ig-NAC ( ⁇ DH) clones.
  • Ig-NAC ( ⁇ DH) is maintained independently without being integrated into the host chromosome, in order to confirm that it maintains the expected structure, in Japanese Patent No. 6868250
  • FISH analysis FISH analysis by the described method
  • CHO cells in which one copy of Ig-NAC ( ⁇ DH) was retained independently of the host chromosome were obtained (FIG. 2), and the cell clone was TF7-B10. named.
  • Example 2 Insertion of acceptor site for introducing synthetic D region into Ig-NAC ( ⁇ DH) Genome editing and homologous recombination were performed on the DH region deleted in Ig-NAC ( ⁇ DH) prepared in Example 1. This allows introduction of a chemically synthesized DH region by inserting an acceptor site. Therefore, the sequences before and after the DH region deletion site of Ig-NAC ( ⁇ DH) (V region side: HRA, J fragment side: HRB) and Bxb1 attB, Bxb1 attP, ⁇ C31 attB, R4 attB (Patent No.
  • Bxb1 attB (SEQ ID NO: 18) TGGCCGTGGCCGTGCTCGTCCTCGTCGGCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCCGGGGCCAC
  • Bxb1 attP (SEQ ID NO: 19) TATGGCCGTGATGACCTGTGTCTTCGTGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACCCA
  • ⁇ C31 attB (SEQ ID NO: 20) GATGTAGGTCACGGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGTCCATCATGATGAACGGGTCGAGGTGGCGGTAGTTGATCCCGGCGAACGCGCGCGCGGCGCACCGGGAAGCCCTCGCCCTCGAAACCGCTGGGCGCGGTGGTCACGGTGAGCACGGGACGTGCGACGGCGTCGGCGGGTGCGGATACGGGGCAGCGTCAGCGGGTT CTCGACGGTCACGGCGGGCAT
  • R4 attB (SEQ ID NO:21) GCGCCCAAGTTGCCCATGACCATGCCGAAGCAGTGGTAGAAGGGCACCGGCAGACAC
  • Fcy fur gene into CAG promoter-carrying vector
  • Insertion of HDR vector into Ig-NAC ( ⁇ DH)-carrying CHO cells selectively kills cells in which insertion by random integration other than the desired homologous recombination has occurred
  • a negative selectable marker, the Fcy::fur gene was inserted to allow The Fcy::fur gene was obtained by PCR amplification from pSelect-zeo-Fcy::fur plasmid (Invivogen) DNA using the following primers and conditions.
  • Fcy-fur-F1 5'-CATGAATCTAGAAGTGCAGGTGCCAGAACATT-3' (SEQ ID NO: 22)
  • fur-BspH1-R1 5'-CATGAATCATGACCCCCTGAACCTGAAACATA-3' (SEQ ID NO: 23)
  • Taq DNA polymerase uses KODone (TOYOBO), reaction conditions: 98° C., 10 seconds; 60° C., 5 seconds; 35 cycles of PCR were performed at °C for 13 seconds.
  • the DNA fragment of the Fcy::fur gene was purified by agarose gel electrophoresis, and both ends were cleaved with restriction enzymes BspHI (NEB) and XbaI (NEB). Plasmid DNA containing CAG promoter pRP[Exp]-CAG>mCherry (synthesized by Vector Builder), inserting the above Fcy::fur gene into restriction enzymes AfiIII (NEB) and XbaI (NEB) cleavage sites to create a plasmid CAG-Fcy::fur was obtained (Fig. 3).
  • Plasmid CAG-Fcy::fur was cleaved with restriction enzyme XbaI, and a pHRB-derived fragment cleaved at both ends with XbaI was inserted between the CAG promoter and Fcy::fur gene to obtain plasmid CAG- ⁇ C31-HRB-Fcy::fur. was obtained (Fig. 3).
  • HDR vector plasmid 2 Preparation of HDR vector plasmid 2 above. Plasmid DNA for introducing HRA and site-specific recombination enzyme site R4 attB, Bxb1 attB, Bxb1 attP, blasticidin resistance gene into plasmid CAG- ⁇ C31-HRB-Fcy::fur prepared in , pHRA is Eurofin Synthesized by Genomics. This plasmid was cleaved with restriction enzyme NotI and restriction enzyme SpeI.
  • CRISPR/Cas9 allows efficient homologous recombination by causing two DNA double strand breaks at the target site.
  • Guide RNAs, gRNA-A1 and gRNA-B1 were designed at two locations (targets) near the DH region deletion site on Ig-NAC ( ⁇ DH).
  • gRNA-A1 GGGCCCAGGCGCCGTTTAAT AGG (SEQ ID NO: 24) (Here, the gRNA sequence is a sequence of 20 bases excluding the PAM sequence (AGG).)
  • gRNA-B1 TGCCGCAGAGTGCCAGGTGCAGG (SEQ ID NO: 25) (Here, the gRNA sequence is a sequence of 20 bases excluding the PAM sequence (AGG).)
  • NGG recognized by Cas9 was removed, and oligo DNAs added with a restriction enzyme BbsI recognition sequence were synthesized (Eurofins Genomics). Further, after annealing these oligo DNAs, the plasmid DNA cleaved with the restriction enzyme BbsI (NEB) was cloned into the Cas9 expression vector (px330, addgene Plasmid #42230) cleaved with the restriction enzyme BbsI. The presence or absence of insertion of oligo DNA was confirmed by performing PCR on the resulting E. coli colonies using the following primers and conditions. U6F was used as the forward primer.
  • BbsI restriction enzyme
  • gRNA-A1R was used to confirm gRNA-A1
  • gRNA-B1R was used to confirm gRNA-B1.
  • U6F GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC (SEQ ID NO: 26)
  • gRNA-A1F CACCGGGGCCCAGGGCGCCGTTTAAT (SEQ ID NO: 27)
  • gRNA-A1R AAACATTAAACGGCGCCTGGGCCCC (SEQ ID NO: 28)
  • gRNA-B1F CACCGTGCCGCAGAGTGCCAGGGTGC (SEQ ID NO: 29)
  • gRNA-B1R AAACGCACCTGGCACTCTGCGGCAC (SEQ ID NO: 30)
  • Taq DNA polymerase uses (EmeraldAmp PCR Master Mix, Takara Bio), reaction conditions: 98°C, 2 minutes, once ⁇ 98°C, 10 seconds; 60°C, seconds; 68°C, 13 seconds, 35 cycles of PCR did
  • the target band was obtained around 330 bp by 2% agarose gel electrophoresis. Colonies were cultured in liquid LB medium and ampicillin 100 ⁇ L/mL, and plasmid DNA (Nucleospin Plasmid Transfection-grade, Takara Bio) was used. Cas9-gRNA expression vector A1, B1) was obtained.
  • HDR Vector Insertion into Ig-NAC( ⁇ DH) By genome editing using Cas9/gRNA, the HDR vector was inserted near the DH region deletion site of Ig-NAC( ⁇ DH) in CHO cells (FIG. 5).
  • the HDR vector and the Cas9-gRNA expression vector A1, B1 were introduced by electroporation using the CHO cell clone TF7B10 carrying the Ig-NAC ( ⁇ DH) prepared in Example 1.
  • CHO cells TF7B10 were trypsinized, suspended in OptiMEM (Thermo Fisher Scientific) to 1 ⁇ 10 7 cells/mL, and then 5 ⁇ g of HDR vector, 2.5 ⁇ g of gRNA-A1, 2.5 ⁇ g of gRNA- Electroporation was performed at 150 V for 7.5 ms using NEPA21 (Nepagene) in the presence of B1.
  • Cells were seeded in three 96-well plates after electroporation, and after 48 to 72 hours, 800 ⁇ g / mL G418 (Fuji Film Wako Pure Chemical) and 1600 ⁇ g / mL blasticidin (Fuji Film Wako Pure Chemical), 10% FBS ( SIGMA), cultured in F12 medium containing 1600 ⁇ g / mL blasticidin, 200 ⁇ M 5FC (Tokyo Kasei Kogyo), 10% FBS after 84 to 96 hours from the start of culture, and cultured by replacing the medium with F12 medium containing drug resistant clones. obtained.
  • PCR analysis Cultivate the isolated drug-resistant clones, extract genomic DNA from the cells using Cellysis (Qiagen), use this genomic DNA as a template, three primers specific for homologous recombination (below), and Ig-NAC One strain (TF7B10-74) was selected from which a band specific for homologous recombination was obtained by PCR analysis using 12 types of Ig-NAC-specific primers prepared above (Japanese Patent No. 6868250). Approximately 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used for PCR amplification.
  • Taq polymerase uses KODone (TOYOBO), performs one cycle of 98 ° C. for 2 minutes, denatures at 98 ° C.
  • HRAprimerF1 5'-GAACTGACCGTCTGCTCCA-3' (SEQ ID NO: 31)
  • Bxb1attBF1 5'-TGCCGAAGCAGTGGTAGAAG-3' (SEQ ID NO: 32)
  • ⁇ C31F1 5′-GGGCAACGTGCTGGTTATTG-3′
  • HRAprimerR1 5'-GTGCCCTTCTACCACTGCTTC-3'
  • Bxb1attPR1 5'-AGAGTGAAGCAGAACGTGGG-3'
  • HRBR1 5'-TGCTTTTTCGCAACCATGGG-3' (SEQ ID NO: 36)
  • the horizontal column indicates the clone name
  • the vertical column indicates the primers and elongation time used in PCR. ⁇ indicates positive.
  • Example 3 Removal of blasticidin-resistant gene by site-specific recombination using Bxb1 recombinase
  • Bxb1 recombinase In order to determine the presence or absence of cydin resistance, it is necessary to remove the blasticidin resistance gene inserted by homologous recombination.
  • the blasticidin resistance gene As shown in the HDR vector, the blasticidin resistance gene is located between Bxb1 attB and Bxb1 attP, and introduction of Bxb1 recombinase into the cell causes site-specific recombination between Bxb1 attB-attP, Ablation of the blasticidin resistance gene is possible (Fig. 6).
  • Bxb1 recombinase gene transfer to remove blasticidin-resistant gene The Bxb1 recombinase gene expression vector (Japanese Patent No. 6868250) is obtained in Example 2, and the acceptor site-inserted Ig-NAC ( ⁇ DH) is retained. It was introduced into CHO cells TF7B10-74, which are living in the same region, by electroporation. TF7B10-74 cells were trypsinized, suspended in Opti MEM to 2 ⁇ 10 6 cells/mL, added with 10 ⁇ g of Bxb1 recombinase gene expression vector, and incubated with NEPA21 (Neppagene) at 150 V, 7.5 ms. electroporation was performed.
  • NEPA21 Neppagene
  • Cells were seeded in one 10 cm dish after electroporation. After 5 days, the cells were trypsinized and seeded at 150 cells per 384-well plate. After seeding on a 384-well plate, the cells were cultured in F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418 and 10% FBS for 9 days, and single clones were picked up.
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, two specific primers after Bxb1 site-specific recombination, and on Ig-NAC PCR analysis was performed using 12 kinds of Ig-NAC-specific primers (Japanese Patent No. 6868250) prepared in 1998. Among the two primers specific for Bxb1 site-specific recombination, primerHRAF1-Bxb1attPR2 shifts the band from around 2800 bp to around 1500 bp after site-specific recombination. Two strains (clone D1, J23) were selected that gave specific bands after Bxb1 site-specific recombination.
  • Taq polymerase uses KODone (TOYOBO), performs one cycle of 98 ° C. for 2 minutes, denatures at 98 ° C. for 10 seconds, anneals at 60 ° C. for 5 seconds, extends at 68 ° C., 5 seconds if the length of the amplified fragment is 500 bp or less , 35 cycles of 100 sec/kb for ⁇ 500 bp.
  • HRAprimerF1 5'-GAACTGACCGTCTGCTCCA-3' (SEQ ID NO: 31)
  • Bxb1attPR2 5'-GGGGCGTACTTGGCATATGA-3' (SEQ ID NO: 37)
  • Fluorescence in situ hybridization (FISH) FISH analysis was performed according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250) using a human gene-specific probe human cot1 (invitrogen) and a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen).
  • Table 2 shows the results of the above PCR analysis, blasticidin resistance confirmation, and FISH analysis.
  • the rows indicate the clone names, and the columns indicate the primers and extension times used in PCR.
  • ⁇ indicates positive for Bxb1 recombination, and x indicates negative for Bxb1 recombination.
  • Example 4 Introduction of Ig-NAC ( ⁇ DH/Bsr-) into CHO cell line HPRT(-) by micronucleation method (MMCT) Ig whose blasticidin resistance gene removal by Bxb1 recombinase was confirmed in Example 3
  • the TF7B10-74-D1 clone carrying -NAC ( ⁇ DH/Bsr-) was found to be tetraploid while independently carrying Ig-NAC by FISH analysis (Table 2). Since this cell is important as a platform cell for introducing chemically synthesized DNA, Ig-NAC ( ⁇ DH/Bsr-) was transfected into the normal diploid CHO cell line HPRT(-) by MMCT.
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, PCR was performed using the same primers as in the PCR analysis performed in Example 2. . The band of interest could be confirmed in 14 of the 24 cell clones picked up.
  • FISH analysis 6 cells were arbitrarily selected from 14 cell clones in which the band of interest was confirmed by PCR analysis, and FISH analysis was performed. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250). Table 3 shows the results of PCR analysis and FISH analysis for the 6 cell clones subjected to FISH analysis. In Table 3, the rows indicate the clone names, and the columns indicate the primers and extension times used in PCR. ⁇ indicates positive for Bxb1 recombination. In the table, Ig-NACx1 indicates that 1 copy of Ig-NAC is detected per cell, and Ig-NACx2 indicates that 2 copies of Ig-NAC are detected per cell.
  • Example 5 Insertion of chemically synthesized DNA containing human minimalized IgHD by site-specific recombination using ⁇ C31 recombinase
  • the human IgHD region is as large as approximately 40.2 kb, most of which is composed of fragments other than the D fragment encoding the antibody. is an array. For example, there is about 2500 bp of non-antibody coding region between the first and second D fragments. On the other hand, the length between the 9th D fragment and the 10th D fragment is as short as about 100 bp.
  • plasmid DNA human miniA, human miniB, and human miniC were chemically synthesized by dividing the vector sequence into three (Eurofins Genomics).
  • human miniA is R4 attP and downstream from HRA to D fragment 3-10
  • human miniB is D fragment 4-11 to 3-22
  • human miniC is D fragment 4-23 to HRB and ⁇ C31 attP , which has a blasticidin-resistant gene.
  • the human minimalized IgHD vector carrying this human miniA, B, and C is described in 1 below. and 2. (FIG. 8).
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, ⁇ C31 site-specific recombination followed by one specific primer and human minimalized IgHD PCR analysis was performed using 2 types of primers prepared inside and 12 types of Ig-NAC-specific primers prepared on Ig-NAC. Approximately 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used for PCR amplification.
  • Taq polymerase uses KODone (TOYOBO), performs one cycle of 98 ° C. for 2 minutes, denatures at 98 ° C. for 10 seconds, anneals at 60 ° C.
  • BsdR1 5'-ATGCAGATCGAGAAGCACCT-3' (SEQ ID NO: 38) 2-8to3-9F: 5'-AACGCACCAGACCAGCAGAC-3' (SEQ ID NO: 39) 4-11to5-12R: 5'-GACGTGGGCCTAGAGGCT-3' (SEQ ID NO: 40) 3-22to4-23F: 5'-CAGGCGGGGAAGATTCAGAA-3' (SEQ ID NO: 41) 4-23to5-24R: 5'-TAGAGAGCCTGGGCCTAGAG-3' (SEQ ID NO: 42)
  • FISH analysis FISH analysis was performed on 3 clones for which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250). Table 4 shows the results of PCR analysis and FISH analysis for the three cell clones subjected to FISH analysis.
  • Ig-NACx1 indicates that 1 copy of Ig-NAC is detected per cell
  • Ig-NACx2 indicates that 2 copies of Ig-NAC are detected per cell.
  • Example 6 Partial sequence removal by site-specific recombination using R4 recombinase Among the sequences introduced on Ig-NAC ( ⁇ DH), the CAG promoter and the blasticidin resistance gene are not necessary for antibody gene expression. is an array of These sequences are flanked by R4 attB and attP and can be removed by site-specific recombination between R4 attB-attP by introducing R4 recombinase into cells (Fig. 10).
  • R4 recombinase gene expression vector introduction R4 recombinase gene expression vector (Patent No. 6868250) is confirmed to be inserted into a human minimalized IgHD vector, and CHO cells 1-10 with a high retention rate of one Ig-NAC It was introduced into pEFI-8 (Example 5) by electroporation. 1-10 pEFI-8 cells were trypsinized, suspended in Opti MEM to 3 ⁇ 10 6 cells/mL, added with 10 ⁇ g of R4 recombinase gene expression vector, and incubated at 150 V, 7 using NEPA21 (Nepagene). Electroporation was performed for 0.5 ms.
  • Cells were seeded in one 10 cm dish after pulsing. After 24-48 hours, the cells were trypsinized and seeded at 150 cells per 384-well plate. Two weeks after seeding on a 384-well plate, the cells were cultured in F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418 and 10% FBS, and 24 single clones were picked up.
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, one specific primer after R4 site-specific recombination, and human minimalized IgHD PCR analysis was performed using 2 types of primers prepared inside and 12 types of Ig-NAC-specific primers prepared on Ig-NAC. PCR was performed using primers specific for the R4 site-specific recombination, and 6 strains were selected that gave specific bands after the R4 site-specific recombination. Approximately 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used for PCR amplification. Taq polymerase uses KODone (TOYOBO), performs one cycle of 98 ° C.
  • R4attLF2 5'-CCCTCAAGGTGTGAACAGGG-3' (SEQ ID NO: 43)
  • R4attLR2 5'-CTGGAGGGAGGCATGTTCTG-3' (SEQ ID NO: 44)
  • FISH analysis was performed on 6 cell clones in which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250). Table 5 shows the results of PCR analysis and FISH analysis for 6 cell clones subjected to FISH analysis.
  • the horizontal column indicates the clone name, and the vertical column indicates the primers and extension time used in PCR. ⁇ indicates positive.
  • Ig-NACx1 indicates that Ig-NAC is detected at 1 copy per cell.
  • Example 7 Introduction of human minimalized IgHD-loaded Ig-NAC by micronucleation method (MMCT) into mouse ES cell line
  • MMCT micronucleation method
  • mouse ES cells HKD31 6TG- in which both alleles of the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci have been disrupted 9 strain (XO) (Patent No. 4082740) was used.
  • the HKD31 6TG-9 strain was cultured using mitomycin C-treated fetal mouse fibroblast cell lines as feeder cells, and 15% FBS and 1% nucleoside, penicillin streptomycin, penicillin streptomycin, and 1% ES cell culture medium were placed on the feeder cell layer.
  • the cells were cultured at 37 degrees using Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing Non-Essential Amino Acids, L-glutamine solution, 2-mercaptoethanol and LIF.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • 400 nM paclitaxel and 500 nM reversine were added to approximately 4 ⁇ 10 7 1-10 pEF1-K5 and 1-10 pEF1-M24 to prepare micronuclei.
  • the total amount of micronuclei obtained was suspended in 5 mL of DMEM and centrifuged to precipitate.
  • Mouse ES cells HKD31 6TG-9 strain of 5 ⁇ 10 6 to 4 ⁇ 10 6 were dispersed with trypsin, washed 3 times with DMEM, and added to 5 mL. After being suspended in DMEM, it was added onto the precipitate of micronuclei. The supernatant was removed by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes.
  • the precipitate was loosened well by tapping, and 0.5 mL of PEG solution (2.5 g PEG 1000 ⁇ Fuji Film Wako Pure Chemical>, 3 mL DMEM ⁇ Fuji Film Wako Pure Chemical>, 0.5 mL DMSO ⁇ Fuji Film Wako Pure Chemical>) was added. In addition, it was shaken in a water bath at 37°C, and after 90 seconds, 13 mL of DMEM was slowly added, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, the precipitate was suspended in 30 mL of ES cell medium, and feeder cells were seeded in advance. Three 10 cm dishes were seeded. After 48 hours, the medium was replaced with an ES cell medium supplemented with 350 ⁇ g/mL G418, and then the medium was replaced with the same composition once every two days. 14 drug-resistant colonies that emerged after 1 week to 10 days were picked up.
  • PEG solution 2.5 g PEG 1000 ⁇ Fu
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, PCR was performed using the same primers as in the PCR analysis performed in Example 5. . The target band could be confirmed in 5 of the 14 picked up.
  • Example 8 Preparation of chimeric mice from mouse ES cell lines containing human minimalized IgHD-containing Ig-NAC Chimeric mice were prepared from human minimalized IgHD-containing Ig-NAC mouse ES cells in order to confirm human antibody production. .
  • mice are produced according to the method of Gene Targeting, Experimental Medicine, 1995.
  • the host is MCH (ICR) (white, purchased from Clea Japan), or HKLD mice exhibiting antibody gene deficiency (Igh/Ig ⁇ KO) or low expression (Igl1 low).
  • Cell stage embryos were used. It is possible to determine whether or not the pups born as a result of transplanting the injected embryos into foster mothers are chimeras based on their coat color. By transplanting the embryos into foster mothers, chimeric mice (having a dark brown coat color) can be obtained.
  • a total of 211 ICR embryos were injected with 4 clones of mouse ES cell lines harboring human minimalized Ig-NAC and transplanted into 6 foster mothers. As a result, a total of 5 GFP-positive chimeric mice were obtained. As a result of judging the chimera rate by coat color, the chimera rate was 10 to 40% for 5 chimeric mice.
  • Mouse ES cell line 2 clones were injected into 465 HKLD embryos and transplanted into 27 foster mothers, resulting in 14 GFP-positive individuals. As a result of judging the chimera rate by coat color, the chimera rate was 5 to 50% for 14 chimeric mice.
  • bovine D fragment 8-2 the position of human D fragment 3-10 was replaced with bovine D fragment 8-2.
  • the order of the bovine D fragment was not changed. Since bovine has fewer D fragments than humans, the three human D fragments that were not replaced were deleted along with 100 bp before and after. Thus, bovinized human IgHD was designed as shown in (Fig. 11).
  • bovine human IgHD was divided into three parts in the same manner as in Example 5, and the plasmid DNA bovine miniA (HRA) and the bovine D fragments B1-1 to B8 corresponding to the regions of human D fragments 1-1 to 3-10 were obtained.
  • bovine miniB including bovine D fragments B6-2 to B5-4 corresponding to the regions of human D fragments 4-11 to 3-22
  • bovine miniC human D fragments 4-23 to 1- A bovine D fragment B6-4 to B9-4 corresponding to the region of 26, containing HRB, ⁇ C31 attP, and the blasticidin resistance gene
  • the bovinized human minimalized IgHD vector carrying bovine miniA, B, and C was prepared by the following procedure 1. 2. (Fig. 12).
  • bovine miniC fragment into R4 attP-HRA/1-1_3-22 Human miniC was cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI.
  • a bovinized human IgHD vector was constructed by inserting the fragment human miniC into R4 attP-HRA/1-1 — 3-22 which was similarly cut with restriction enzymes EcoRI and SalI.
  • Bovinized Human IgHD Vector by ⁇ C31 Recombinase It was carried out in the same manner as in Example 5. 1-10 cells (Example 4) were trypsinized and suspended in Opti MEM to 3 ⁇ 10 6 cells/mL, then 1 ⁇ g of ⁇ C31 recombinase gene expression vector ⁇ C31pEF1 (Patent No. 6868250) and 3 ⁇ g of A bovine human IgHD vector was added and electroporation was performed at 150 V for 7.5 ms using NEPA21 (Nepagene). Two 384-well plates were seeded after pulsing. After 48 to 72 hours, the cells were cultured by replacing the medium with F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418, 800 ⁇ g/mL blasticidin and 10% FBS. After 13 days, 16 plants resistant to blasticidin were picked up.
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and PCR analysis was performed using this genomic DNA as a template and the same primers as in Example 5.
  • FISH analysis was performed on 4 clones arbitrarily selected from 16 cell clones in which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250).
  • Table 7 shows the results of PCR analysis and FISH analysis for the four cell clones subjected to FISH analysis.
  • the rows indicate the clone names, and the columns indicate the primers and extension times used in PCR. ⁇ indicates positive.
  • Ig-NACx1 indicates that 1 copy of Ig-NAC is detected per cell
  • Ig-NACx2 indicates that 2 copies of Ig-NAC are detected per cell.
  • Example 10 Removal of partial sequence by site-specific recombination using R4 recombinase 1.
  • Introduction of R4 Recombinase Gene Expression Vector It was carried out in the same manner as in Example 6.
  • 1-10 C4 cells (Example 9) in which introduction of the bovine human IgHD vector was confirmed were trypsinized, suspended in Opti MEM at 3 ⁇ 10 6 cells/mL, and then subjected to 10 ⁇ g of R4 recombinase gene expression. The vector was added and electroporation was performed at 150 V, 7.5 ms using NEPA21 (Nepagene). Cells were seeded in one 10 cm dish after pulsing.
  • the cells were trypsinized and seeded at 150 cells per 384-well plate. After seeding in a 384-well plate, the cells were cultured in F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418 and 10% FBS for 17 days, and 22 single clones were picked up.
  • PCR analysis The isolated cells are cultured, genomic DNA is extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, one specific primer after R4 site-specific recombination as in Example 6 , and 2 primers made in human minimalized IgHD and 12 Ig-NAC specific primers made on Ig-NAC. PCR was performed using primers specific for the R4 site-specific recombination, and 3 clones were selected which gave specific bands after the R4 site-specific recombination.
  • FISH analysis FISH analysis was performed on 3 clones for which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250). Table 8 shows the results of PCR analysis and FISH analysis for the three cell clones subjected to FISH analysis. In Table 8, the rows indicate the clone names, and the columns indicate the primers and extension times used in PCR. ⁇ indicates positive. In the table, Ig-NACx1 indicates that Ig-NAC is detected at 1 copy per cell.
  • bovine minimalized IgHD bovine human minimalized IgHD
  • MMCT micronucleation method
  • Mouse ES cell line HKD31 6TG-9 (XO) in which both alleles of the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci have been disrupted was used as the chromosome recipient cell (Japanese Patent No. 4082740). Micronuclei were formed in the same manner as in Example 7, fused with mouse ES cell HKD31 6TG-9 strain (XO), and the cells were seeded on three 10 cm dishes. After 48 hours, the medium was replaced with an ES cell medium supplemented with 350 ⁇ g/mL G418, and then the medium was replaced with the same composition once every two days. Twenty-three drug-resistant colonies that appeared after 1 week to 10 days were picked up.
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, PCR was performed using the same primers as in the PCR analysis performed in Example 6. . The desired band could be confirmed in 14 of the 23 picked up.
  • Example 12 Production of chimeric mice from mouse ES cell lines containing Ig-NAC containing minimalized bovine IgHD In order to confirm human antibody production, chimeric mice were produced from mouse ES cells containing Ig-NAC containing minimalized bovine IgHD.
  • mice are produced according to the method of Gene Targeting, Experimental Medicine, 1995.
  • the host is MCH (ICR) (white, purchased from Clea Japan), or HKLD mice exhibiting antibody gene deficiency (Igh/Ig ⁇ KO) or low expression (Igl1 low).
  • Cell stage embryos were used. It is possible to determine whether or not the pups born as a result of transplanting the injected embryos into foster mothers are chimeras based on their coat color. By transplanting the embryos into foster mothers, chimeric mice (having a dark brown coat color) can be obtained.
  • mice harboring Ig-NAC containing bovine minimalized IgHD Eight clones of mouse ES cells harboring Ig-NAC containing bovine minimalized IgHD were injected into a total of 591 ICR embryos and transplanted into 32 foster mothers. As a result, 18 GFP-positive individuals were obtained. As a result, the chimera rate was 5-60% for 18 chimeric mice. In addition, 5 clones were injected into a total of 380 HKLD embryos and transplanted into 21 foster mothers, resulting in 13 GFP-positive individuals. As a result of judging the chimera rate by coat color, the chimera rate was 5 to 80% for 13 chimeric mice.
  • Example 13 Human minimalized chimeric mouse analysis (B cell analysis, ELISA, cDNA preparation) B cell differentiation analysis, plasma antibody concentration measurement ELISA analysis, and gene sequence analysis by cDNA recovery from spleen can be performed to evaluate whether human antibodies are being produced from human minimalized chimeric mice.
  • B-cell differentiation analysis If cells positive for both EGFP and B220, which is a B-cell marker, can be detected, B-cell differentiation due to the contribution of antibody production is indicated, and this is an indirect evaluation of the functional expression of the antibody.
  • Peripheral blood samples obtained from chimeric mice were subjected to flow cytometry analysis of B220 by the method described in Japanese Patent No. 6868250. As a result, not only GFP-positive cell populations but also GFP and B220 co-positive populations were confirmed. Therefore, it was shown that a functional antibody was expressed. The highest GFP positive rate per individual was obtained in 28.12% of individuals, and the highest GFP and B220 copositive rate per individual was 2.30%.
  • RNA derived from human antibody-producing mouse spleen is synthesized from RNA derived from human antibody-producing mouse spleen, and human antibody gene variable region cloning and base sequencing are performed. Analysis and evaluation were carried out in the same manner as in Japanese Patent No. 6868250. After collection, the spleens were stored overnight at 4°C in RNAlater (Ambion), then removed from the solution and stored at -80°C. 1 mL of ISOGEN (Nippon Gene) is added to the pressure tube containing the zirconia beads, and 50 mg of tissue is added.
  • ISOGEN Natural Gene
  • Bovine minimalized chimeric mouse analysis B cell analysis, ELISA, cDNA preparation
  • B cell differentiation analysis, plasma antibody concentration measurement ELISA analysis, and gene sequence analysis by cDNA recovery from spleen can be performed as an evaluation of whether human antibodies are being produced from bovine minimalized chimeric mice.
  • B-cell differentiation analysis If cells positive for both EGFP and B220, which is a B-cell marker, can be detected, B-cell differentiation due to the contribution of antibody production will be indicated, and this will be an indirect evaluation of the functional expression of the antibody.
  • Peripheral blood samples obtained from chimeric mice were subjected to flow cytometry analysis of B220 by the method described in Japanese Patent No. 6868250. As a result, not only GFP-positive cell populations but also GFP and B220 co-positive populations were confirmed. Therefore, it was shown that a functional antibody was expressed. The highest GFP positive rate per individual was obtained in 40.38% of individuals, and the highest GFP and B220 copositive rate per individual was 3.23%.
  • RNA derived from human antibody-producing mouse spleen is synthesized from RNA derived from human antibody-producing mouse spleen, and human antibody gene variable region cloning and base sequencing are performed. Analysis and evaluation were performed in the same manner as in Japanese Patent No. 6868250. After collection, the spleens were stored overnight at 4°C in RNAlater (Ambion), then removed from the solution and stored at -80°C. 1 mL of ISOGEN (Nippon Gene) is added to the pressure tube containing the zirconia beads, and 50 mg of tissue is added.
  • ISOGEN Natural Gene
  • Human minimalized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse repertoire analysis 1. Human antibody gene heavy chain region cloning and base sequencing from human minimalized ( ⁇ IgH / ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse spleen cDNA cDNA derived from chimeric mouse spleen retaining human minimalized IgHD was subjected to PCR using the following primers, and human antibody The gene heavy chain variable region was amplified. As a negative control, spleen-derived cDNA obtained from non-chimeric mouse ICR was used.
  • HIGMEX1-2 5'-CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 45)
  • VH1/5BACK 5'-CAGGTTGCAGCTGCAGCAGTCTGG-3'
  • VH4BACK 5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3'
  • VH3BACK 5'- GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3' (SEQ ID NO: 48)
  • PCR was performed under the conditions of 35 cycles of 98°C for 10 seconds, 59°C for 5 seconds, and 68°C for 5 seconds using a combination of constant region x variable region (three types). All amplified products were detected by ethidium bromide staining after 1.5% agarose gel electrophoresis. As a result, an amplification product was detected around the expected 470 bp in all combinations. On the other hand, no specific amplification product was detected at the same position in all of the negative controls. These amplified products were extracted from an agarose gel and treated with restriction enzymes using HindIII and PstI. This was cloned into the HindIII, PstI sites of the pUC119 (TAKARA) vector.
  • the VH1 family-derived clones, the VH4 family-derived clones, and the VH3 family-derived clones were sequenced to determine the nucleotide sequences of the amplified products.
  • Example 16 Repertoire analysis of bovine minimalized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mice Using cDNA derived from bovine minimalized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse spleen, PCR was performed by the method shown in Example 15, A human antibody gene heavy chain variable region was amplified. As a negative control, spleen-derived cDNA obtained from non-chimeric mouse ICR was used. The results demonstrate the use of the bovine D fragment in the chimeric mouse spleen Ig ⁇ -cDNA.
  • bovine D fragment-specific primers were designed and used.
  • cowF1 5'-ATTATCTGCAGAAGTCTGACCCGCACACAGG-3' (SEQ ID NO: 49)
  • cowF2 5'-ATTATCTGCAGTGTGGAGCTGGCCAATGCAT-3' (SEQ ID NO: 50)
  • cowF3 5'-ATTATCTGCAGATGGTTATGGTTATGGTTATGGTTATGG-3' (SEQ ID NO: 51)
  • cowR1 5'-GTCGGAAGCTTATAACCACAACCATAACCAT-3' (SEQ ID NO: 52)
  • the expected length (forward primer and HIGMEX1-2 prepared in the fragment: around 250 bp, reverse primer prepared in the fragment and the variable region primer used in Example 15: around 400 bp) amplified product. was detected.
  • no specific amplification product was detected at the same position in all of the negative controls.
  • These amplified products were extracted from an agarose gel and treated with restriction enzymes using HindIII and PstI. This was cloned into the HindIII, PstI sites of the pUC119 (TAKARA) vector. The plasmid into which the amplified product was inserted was sequenced to determine the base sequence.
  • clone 1 D fragment (bovine D1-3): TGTGGAGCTGGCCA (SEQ ID NO: 53) J fragment (human J3): ATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAG (SEQ ID NO: 54) clone 2 D fragment (bovine 6-3 or 6-4): ATGGTTATGGTTATGGTTATGGTTGTGGTTATGGTTATGGTTATAC (SEQ ID NO: 55) J fragment (human J1): CTTCCAGCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG (SEQ ID NO: 56) clone 3 V fragment (human V3-23): GGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCC
  • the amino acid sequence derived from the clone 2 cDNA sequence is the following sequence: It was confirmed that the length of CDRH3 was 18 amino acids or more (underlined number of amino acids) or longer chain CDR3.
  • Example 17 Human minimalized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse immune response An antigen protein was administered to human minimalized chimeric mice, and enzyme-linked immunosorbent assay (Enzyme) was performed using serum or plasma samples collected after administration. - Linked Immuno Sorbent Assay (hereinafter referred to as ELISA) can be performed to evaluate whether immune responses and antigen-specific antibodies are induced.
  • Enzyme enzyme-linked immunosorbent assay
  • ELISA Linked Immuno Sorbent Assay
  • Antiserum ELISA Plasma is prepared from peripheral blood 3 days after each immunization. In order to evaluate the titer of antigen-specific IgG in plasma, antiserum ELISA is performed using a 96-well plate on which the antigen is immobilized and an anti-human IgG Fc antibody.
  • Bovine minimalized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse immune response Receptor binding domain (hereinafter referred to as RBD) of SARS-CoV2 spike protein S1 was administered to bovine minimized chimeric mice as an antigen and administered.
  • ELISA was performed using serum or plasma samples collected later to assess the induction of immune responses and antigen-specific antibodies.
  • Antiserum ELISA Plasma was prepared from peripheral blood 3 days after each immunization. In order to evaluate the titer of antigen-specific IgG in plasma, antiserum ELISA was performed using a 96-well plate on which the antigen was immobilized and an anti-human IgG Fc antibody. As a result, it was confirmed that continuous booster immunization resulted in an immune response and an increase in the antibody titer against RBD (Fig. 14).
  • OGAB Organic Gene Assembly in Bacillus subtilis
  • simian IgHD vector by ⁇ C31 recombinase It was carried out in the same manner as in Example 5. 1-10 cells were trypsinized and suspended in Opti MEM to 3 ⁇ 10 6 cells/mL, then 1 ⁇ g of ⁇ C31 recombinase gene expression vector ⁇ C31pEF1 (Patent No. 6868250) and 3 ⁇ g of simian IgHD vector were added. In addition, electroporation was performed at 150 V for 7.5 ms using NEPA21 (Nepagene). Cells were seeded in two 384-well plates after pulsing. After 48 hours, the medium was replaced with F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418, 800 ⁇ g/mL blasticidin and 10% FBS, and cultured. After 12 days, 17 plants resistant to blasticidin were picked up.
  • PCR analysis The isolated cells were cultured, and genomic DNA was extracted from the cells using Cellysis (Qiagen). In addition to 12 types of Ig-NAC-specific primers prepared on Ig-NAC, PCR analysis was performed using one type of simian IgHD-specific primer shown below. Approximately 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used for PCR amplification. Taq polymerase uses KODone (TOYOBO), performs one cycle of 98 ° C. for 2 minutes, denatures at 98 ° C. for 10 seconds, anneals at 60 ° C.
  • KODone TOYOBO
  • the following five types of primers were prepared and long PCR was performed. Approximately 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used for PCR amplification.
  • Taq polymerase was PrimeSTAR TM GXL Premix Fast (Takara Bio Inc.) and the following PCR was performed by a step-down method.
  • PACF1 5'- CGGTGTGCGGTTGTATGCCTGCTGT-3' (SEQ ID NO: 64) 3-3to4-4R: 5'-GGCCAGGCAGGATGATGGACTCCCA-3' (SEQ ID NO: 65) 3-3F: 5'- CGGTTACTATTACACCCCACAGCGTC-3' (SEQ ID NO: 66) 3-10F2: 5'-TTGTAGTGGTGGTGTCTGCTACACC-3' (SEQ ID NO: 67) 3-16R: 5'-GTAGTTACTGTATTCACACAGTGAC-3' (SEQ ID NO: 68) F37: 5'-CTGCAGGCCCTGTCCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 69) 4-23R: 5'- ATAGTAATACCACTGTGGGAGGGCC-3' (SEQ ID NO: 70)
  • FISH analysis was performed on one cell clone in which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250).
  • Table X shows the results of PCR analysis and FISH analysis in one cell clone subjected to FISH analysis.
  • the rows indicate the clone names, and the columns indicate the primers and extension times used in PCR. ⁇ indicates positive.
  • Ig-NACx1 indicates that Ig-NAC is detected at 1 copy per cell.
  • Example 20 Partial sequence removal (simianization) by site-specific recombination using R4 recombinase 1.
  • Introduction of R4 Recombinase Gene Expression Vector It was carried out in the same manner as in Example 6.
  • a cell clone in which introduction of the simianized human IgHD vector was confirmed (Example 19) was treated with trypsin, suspended in OptiMEM to a concentration of 3 ⁇ 10 6 cells/mL, and then 10 ⁇ g of the R4 recombinase gene expression vector was added.
  • NEPA21 Nappagene was used to perform electroporation at 150 V for 7.5 ms.
  • One 10 cm dish was seeded after pulsing.
  • the cells were trypsinized and seeded at 150 cells per 384-well plate. Seventeen days after seeding on the 384-well plate, the medium was replaced with F12 medium containing 800 ⁇ g/mL G418 and 10% FBS, cultured, and single clones were picked up.
  • PCR analysis Culturing the isolated cells, extracting genomic DNA from the cells using Cellysis (Qiagen), using this genomic DNA as a template, one specific primer after R4 site-specific recombination as in Example 6 , and 2 primers prepared in simian IgHD, and 12 Ig-NAC-specific primers prepared on Ig-NAC were used for PCR analysis. PCR was performed using specific primers after R4 site-specific recombination, and clones (1-10 M9-I9) were selected that gave a specific band after R4 site-specific recombination.
  • FISH analysis was performed on the clone (1-10 M9-I9) for which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250).
  • Example 21 Introduction of simian IgHD-loaded Ig-NAC into mouse ES cell line by micronucleation method (MMCT) 1. Transfer of Ig-NAC loaded with simian IgHD into mouse ES cells using MMCT method Clones in which R4 site-specific recombination was confirmed by PCR and FISH analysis in Example 10 are used as chromosome donor cells. Mouse ES cell line HKD31 6TG-9 (XO) in which both alleles of the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci are disrupted is used as the chromosome recipient cell (Patent No. 4082740).
  • XO XO
  • Micronuclei are formed in the same manner as in Example 7, fused with mouse ES cell HKD31 6TG-9 strain (XO), and seeded on three 10 cm dishes. After 48 hours, the medium is replaced with an ES cell medium supplemented with 350 ⁇ g/mL G418, and then the medium is replaced with the same composition once every two days. Pick up drug-resistant colonies that appear after 1 week to 10 days.
  • PCR analysis The isolated cells are cultured, genomic DNA is extracted from the cells using Cellysis (Qiagen), and using this genomic DNA as a template, PCR is performed using the same primers as in the PCR analysis performed in Example 6. .
  • mice were generated from mouse ES cell lines containing simian IgHD-containing Ig-NAC. make. Chimeric mice are produced according to the procedure of Gene Targeting, Experimental Medicine, 1995, using mouse ES cells retaining Ig-NAC containing simian IgHD.
  • the host is MCH (ICR) (white, purchased from Clea Japan) or HKLD mice exhibiting antibody gene deficiency (Igh/Ig ⁇ KO) or low expression (Igl1 low). Morula and 8 cells obtained by mating. Stage embryos are used.
  • Example 23 Monkey IgHD chimeric mouse analysis (B cell analysis, ELISA, cDNA preparation) B cell differentiation analysis, plasma antibody concentration measurement ELISA analysis, and gene sequence analysis by recovering cDNA from spleen can be performed to evaluate whether monkey IgHD chimeric mice produce monkey IgHD human antibodies.
  • B-cell differentiation analysis If cells positive for both EGFP and B220, which is a B-cell marker, can be detected, B-cell differentiation due to the contribution of antibody production will be indicated, and this will be an indirect evaluation of the functional expression of the antibody.
  • Peripheral blood samples obtained from chimeric mice were subjected to flow cytometry analysis of B220 by the method described in Japanese Patent No. 6868250. As a result, not only GFP-positive cell populations but also GFP and B220 co-positive populations were confirmed. This indicates that a functional antibody is expressed.
  • RNA derived from human antibody-producing mouse spleen is synthesized from RNA derived from human antibody-producing mouse spleen, and human antibody gene variable region cloning and base sequencing are performed. Analysis and evaluation are performed in the same manner as in Japanese Patent No. 6868250. After collection, the spleens were stored overnight at 4°C in RNAlater (Ambion), then removed from the solution and stored at -80°C. 1 mL of ISOGEN (Nippon Gene) is added to the pressure tube containing the zirconia beads, and 50 mg of tissue is added.
  • ISOGEN Natural Gene
  • RNA After crushing with the device (about 30 to 45 seconds) and confirming that the tissue was crushed, after spin down, 1 mL of supernatant was collected, 200 ⁇ L of chloroform was added, and RNeasy Mini kit was used according to the manufacturer's protocol. Extract the RNA.
  • Example 24 Monkeyized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse repertoire analysis 1.
  • Human antibody gene heavy chain region cloning and base sequencing from simian ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse spleen cDNA cDNA derived from chimeric mouse spleen retaining simian IgHD was subjected to PCR using the following primers to determine the human antibody gene weight. Amplify the chain variable region. Spleen-derived cDNA obtained from non-chimeric mouse ICR is used as a negative control.
  • Constant region HIGMEX1-2: 5'-CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 71)
  • VH1/5BACK 5'-CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG-3'
  • VH4BACK 5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3'
  • VH3BACK 5'-GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3' (SEQ ID NO: 74)
  • PCR is performed under the conditions of 35 cycles of 98°C for 10 seconds, 59°C for 5 seconds, and 68°C for 5 seconds using a combination of constant region x variable region (three types). All amplified products are detected by ethidium bromide staining after 1.5% agarose gel electrophoresis. After the amplified product is extracted from an agarose gel, it is treated with restriction enzymes using HindIII and PstI. This is cloned into the HindIII, PstI sites of the pUC119 (TAKARA) vector. The plasmid into which the amplification product has been inserted is sequenced to determine the base sequence of the amplification product.
  • Example 25 Monkeyized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mouse immune response An antigen protein was administered to monkeyized ( ⁇ IgH/ ⁇ Ig ⁇ -ES) chimeric mice, and enzyme-linked immunosorbent assay (Enzyme) was performed using serum or plasma samples.
  • enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter referred to as ELISA) can be performed to evaluate whether immune responses and antigen-specific antibodies are induced.
  • an antigen protein solution of 1 mg/mg was prepared with PBS containing 0.4 M arginine, Freund's Complete adjuvant (Sigma F5881) was used for initial immunization, and Sigma Adjuvant System TM (SAS TM ) (Sigma S6322) was used for booster immunization. ) to prepare the challenge solution. 200 ⁇ L for initial immunization (100 ⁇ g antigen, intraperitoneal), 100 ⁇ L for booster (50 ⁇ g antigen, intraperitoneal, every 2 weeks), and 100 ⁇ L for final immunization (50 ⁇ g antigen, 1 mg/mg antigen protein solution, intravenous injection) to 6-week-old chimeric mice. ).
  • Antiserum ELISA Plasma is prepared from peripheral blood 3 days after each immunization. In order to evaluate the titer of antigen-specific IgG in plasma, antiserum ELISA is performed using a 96-well plate on which the antigen is immobilized and an anti-human IgG Fc antibody.
  • Example 26 Establishment of a mouse strain that retains human minimalized IgHD-loaded Ig-NAC and has disrupted endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci.
  • mouse ES cells retaining Ig-NAC loaded with human minimalized IgHD produced as a chimeric mouse produced as shown in Example 8, the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain were disrupted mouse strain
  • a mouse strain harboring Ig-NAC loaded with human minimalized IgHD and in which the endogenous immunoglobulin heavy and kappa chain loci were disrupted was established by crossing with .
  • Example 27 Establishment of a mouse strain that retains bovine minimalized IgHD-loaded Ig-NAC and in which the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci are disrupted
  • mouse ES cell TT2F XO
  • mouse ES cells that retain bovine minimalized IgHD-loaded Ig-NAC prepared as wild-type mice or chimeric mice prepared as shown in Example 12 endogenous immunoglobulin heavy chains and ⁇ chains are destroyed.
  • a mouse strain was established in which the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci were disrupted while retaining the bovine minimalized IgHD-loaded Ig-NAC.
  • the resulting mouse individual (#241) which retains the bovine minimalized IgHD-loaded Ig-NAC and has the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci disrupted, was subjected to flow cytometry by the method described in Example 13. A metric analysis was performed. As a result, the GFP positive rate of peripheral blood mononuclear cells was 99.09%, and the GFP and B220 co-positive rate of peripheral blood mononuclear cells was 6.26%. It was comparable to mouse individuals that retained wild-type Ig-NAC and had the endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci disrupted (Japanese Patent No. 6868250).
  • Example 28 Establishment of a mouse strain that retains simian IgHD-loaded Ig-NAC and has disrupted endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci
  • a mouse strain that retains simian IgHD-loaded Ig-NAC and has disrupted endogenous immunoglobulin heavy chain and ⁇ chain loci
  • monkeys A mouse strain can be established that carries an IgHD-loaded Ig-NAC with disruption of the endogenous immunoglobulin heavy and kappa chain loci.
  • Example 29 Insertion of chemically synthesized DNA containing human long chain minimalized IgHD by site-specific recombination using ⁇ C31 recombinase D fragments 1-1 to 1-26 of human minimalized IgHD designed in Example 5
  • Human long-chain minimalized IgHD vectors substituted with 26 modified long-chain DH sequences shown in FIG. and 2. It was prepared by the procedure of.
  • Human long DH sequences were designed based on long (18 amino acids or more) CDR3 sequences found in human antibody cDNA sequences registered with NCBI.
  • Human long-chain miniA, human long-chain miniB, and human long-chain miniC vectors were synthesized by Eurofins Genomics in the same manner as in Example 5.
  • Human long chain miniA Fragment into Human Long Chain MiniB Human long chain miniA was cleaved with restriction enzymes XhoI and NotI.
  • human long chain miniA/B vector was constructed by inserting long chain miniA into human long chain miniB cleaved with restriction enzymes XhoI and NotI.
  • Human long chain miniC was cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI.
  • a human long chain minimalized IgHD vector was constructed by inserting a human long chain miniC fragment into a human long chain miniA/B vector cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI.
  • PCR analysis In the same manner as in Example 5, 1 primer specific after ⁇ C31 site-specific recombination, and 2 primers generated in human long chain minimalized IgHD, Ig-NAC specific generated on Ig-NAC 3. using 12 different primers; PCR analysis of the clones obtained in . Approximately 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used for PCR amplification.
  • Taq polymerase uses KODone (TOYOBO), performs one cycle of 98 ° C. for 2 minutes, denatures at 98 ° C. for 10 seconds, anneals at 60 ° C. for 5 seconds, elongation at 68 ° C., 5 seconds if the length of the amplified fragment is 500 bp or less , 35 cycles of 100 sec/length (bp) for ⁇ 500 bp.
  • FISH analysis was performed on the clone (1-10 HL15) for which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250).
  • Example 30 Partial sequence removal by site-specific recombination using R4 recombinase Among the sequences introduced onto Ig-NAC ( ⁇ DH), the CAG promoter and the blasticidin resistance gene are not necessary for antibody gene expression. is an array of These sequences are flanked by R4 attB and R4 attP and can be removed by site-specific recombination between R4 attB-attP by introducing R4 recombinase into cells.
  • R4 recombinase gene expression vector introduction As in Example 6, the R4 recombinase gene expression vector (Patent No. 6868250) was confirmed to contain a human long-chain minimalized IgHD vector, and one Ig-NAC was retained. A high percentage CHO cell clone (1-10 HL15) was transfected by electroporation. The resulting G418-resistant clones were picked.
  • PCR analysis As in Example 6, 1. PCR analysis was performed using the genomic DNA of the G418-resistant clone obtained in 2. above as a template, and clones (1-10 HL15-28, 1-10 HL15-43) that gave specific bands after R4 site-specific recombination were selected.
  • FISH analysis was performed on cell clones (1-10 HL15-28, 1-10 HL15-43) in which the band of interest was confirmed by PCR analysis. FISH analysis was performed using a mouse gene-specific probe mouse cot1 (invitrogen) according to the method described in (Japanese Patent No. 6868250).
  • Example 31 Introduction of human long-chain minimalized IgHD-loaded Ig-NAC into mouse ES cell line by micronucleation method (MMCT) In Example 30, PCR and FISH analysis confirmed that R4 site-specific recombination occurred Using the obtained clones as chromosome donor cells, human long-chain minimalized IgHD-containing Ig-NAC transfer is performed into mouse ES cells using the MMCT method.
  • MMCT micronucleation method
  • PCR Analysis Similar to Example 7, the isolated cells are cultured and genomic DNA is extracted from the cells using Celllysis (Qiagen). PCR is performed using this genomic DNA as a template, and clones from which the band of interest is detected are selected.
  • Example 32 Generation of chimeric mice from mouse ES cell lines harboring human long-chain minimalized IgHD-containing Ig-NAC Chimeric mice are generated from minimized IgHD-containing Ig-NAC mouse ES cells.
  • Mouse ES cell line clones harboring human long-chain minimalized HD-containing Ig-NAC are injected into ICR embryos and implanted into foster mothers.
  • GFP-positive chimeric mice are obtained.
  • the obtained chimeric mice are analyzed by the methods described in Examples 13, 14, 15 and the like. The results demonstrate the use of the long human D fragment in the chimeric mouse spleen Ig ⁇ -cDNA.
  • Example 33 Construction of synthetic D region-introduced acceptor-bearing Ig-NAC with deletion of human IgHD7-27 26 fragments have been deleted and 7-27, which lies far from the D region and near the J region, has not been deleted.
  • design evaluate and select CRISPR / Cas9 gRNA at two locations before and after D fragment 7-27.
  • human IgHD7-27 is deleted by cleaving the Ig-NAC-holding CHO cells 1-10 (Example 4) equipped with the introduction platform of chemically synthesized DNA by genome editing using the above gRNA and Cas9.
  • the synthesized D region-introduced acceptor-retaining Ig-NAC is obtained.
  • the present invention expands the diversity of human antibodies. Preferably, it enables the production of human antibodies comprising CDRH3 of 18 to 50 or more amino acids.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of human minimalized D region
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of human minimalized D region replaced with bovine ORF737. . B1-1 to replace 767 D2-2 1024. . B2-1 to replace 1039 D3-3 1296. . B3-1 to replace 1331 D4-4 1588. . B4-1 to replace 1630 D5-5 1887. . B9-1 to replace 1900 D6-6 2157. . B1-2 to replace 2187 D1-7 2444. . B2-2 to replace 2459 D2-8 2715. . B5-2 to replace 2756 D3-9 2910. . B8-2 to replace 3057 D3-10 3374. . B6-2 to replace 3431 D4-11 3688. .
  • SEQ ID NOS: 26-52 Primers SEQ ID NO: 61: Amino Acid Sequences of Peptides Containing Long CDRH3
  • SEQ ID NOS: 62-74 Primers SEQ ID NOS: 75: Substituted for Nucleotide Sequences of Human DH Numbers 1-1 Modified Long DH Sequence
  • SEQ ID NO:76 Modified Long DH Sequence Substituted for the Nucleotide Sequence of Human DH Numbers 2-2
  • SEQ ID NO:78 Modified Long DH Sequence Substituted for the Nucleotide Sequence of Human DH Numbers 4-4
  • SEQ ID NO:79 Modified Long DH Substituted for the Nucleotide Sequence of Human DH Numbers 5-5
  • SEQ ID NO:80 modified long DH sequence substitute

Abstract

ヒト抗体産生非ヒト動物において、ヒト抗体多様性の拡張を達成するための手段を提供することである。　ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座及びヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクター、この哺乳動物人工染色体ベクターを含む哺乳動物細胞又は非ヒト動物、並びに、この人工染色体ベクターの製造においてヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域をその改変配列で置換する方法。

Description

改変Ｄ領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有する哺乳動物人工染色体ベクター、及びそのベクターを保持する細胞又は非ヒト動物
　本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座及びヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターに関する。
　本発明はまた、上記哺乳動物人工染色体ベクターを含む哺乳動物細胞又は非ヒト動物に関する。
　本発明はさらに、上記哺乳動物人工染色体ベクターの製造における上記Ｄ領域の改変方法に関する。
　ヒト抗体は、人体では異物として認識されないため腫瘍や自己免疫疾患などの治療薬として使用されている。このような抗体は、ファージディスプレイ技術やヒト抗体産生マウスの使用によって作製可能である。ヒト抗体産生マウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座全長を含むマウス人工染色体ベクターを保持するＴｒａｎｓ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ（ＴＣ）マウスである（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。
　例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザウイルスなどのウイルスによる感染症の受動免疫のためにヒト抗体を使用するとき、ウイルス標的抗原のマスキング、或いはウイルス標的抗原が迅速に変異を起こすなどの理由のために中和抗体はしばしば有効性を欠くことがよく知られている。変異に対しては、防御可能な新たな抗体の作製が必要になるため、感染症対策には多大の時間と費用が必要となる。また、病原性ウイルスの標的抗原のマスキングに対しては、免疫系を活性化するための手法や、抗ウイルス剤などの治療剤の開発などを対策として講ずる必要があるため、迅速に感染症を抑制することは難しいと思われる。
　このような状況において、ヒトにおいて抗体ができにくい標的抗原に対してはヒト抗体産生マウスの利用価値は限定的であるため、例えばヒト抗体多様性（ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を拡張して当該標的抗原に対する抗体取得を容易にする技術の開発が望まれているし、また、さらに拡張されたヒト抗体多様性を達成するためのプラットフォームの構築が提案されている（非特許文献３）。
特許第４３１８７３６号公報 特許第６８６８２５０号公報
Ｋ．Ｔｏｍｉｚｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００；９７（２）：９２２－９２７ Ｍ．Ａ．Ａｌｆａｌｅｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０；１１：Ａｒｔｉｃｌｅ　１９８６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２０．０１９８６ Ａ．Ｒ．Ｒｅｅｓ，ＭＡＢＳ　２０２０，１２（１），ｅ１７２９６８３
　本発明の課題は、ヒト抗体産生非ヒト動物において、ヒト抗体多様性の拡張を達成するための手段を提供することである。
　この関連でＹ．Ｄｉら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ａｕｇｕｓｔ　２０２１；００：１－１４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｍ．１３４０７）は、ゲノム編集を用いてウシＤＨ遺伝子領域をマウスゲノム上のＤＨ遺伝子領域と組み換えたＢ－ＤＨマウスを作製し、抗原（ＯＶＡ，ＢＳＡ，ＥＷＬ，ＫＬＨ）で免疫し、超長鎖（ｕｌｔｒａｌｏｎｇ）ＣＤＲＨ３を含む抗体の産生を調べたが、超長鎖ＣＤＲＨ３はかなり低率で観察されたにすぎなかったと報告している。
　本発明者らは、上記課題を解決するためにウシがＨＩＶに対する広域中和抗体を効率的に産生するという知見に注目し（Ｍ．Ｊ．Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ　２０２０，１２，４７３；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１２０４０４７３）、ヒト抗体の多様性を拡張するための手法、及び／又は、抗体重鎖ＣＤＲ３が通常より長いヒト抗体を出現する手法を見出した。
　すなわち、本発明は、以下に示す特徴を包含する。
[１]　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターにおいて、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されていることを特徴とする哺乳動物人工染色体ベクターであって、前記Ｄ領域の改変配列が、
　（１）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く前記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列がＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
　（２）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
　（３）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
前記哺乳動物人工染色体ベクター。
[２]　前記（１）のヒト動物免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列が１００～５００ｂｐの長さに短縮された配列を含む、[１]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[３]　前記ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列が、配列番号１２７～１４９のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[１]又は[２]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[４]　前記サル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列が、配列番号１５０～１７５のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[１]又は[２]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[５]　前記（３）の２６種の改変ＯＲＦ配列が、配列番号７５～１００のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[１]又は[２]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[６]　前記Ｄ領域の改変配列が、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列、或いは該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[１]～[５]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[７]　前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域がさらにＤ７－２７を欠失している、[１]～[６]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[８]　前記ベクターが、齧歯類人工染色体ベクターである、[１]～[７]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[９]　前記齧歯類人工染色体ベクターが、マウス人工染色体ベクターである、[８]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[１０]　前記軽鎖遺伝子座が、κ軽鎖遺伝子座及び／又はλ軽鎖遺伝子座である、[１]～[９]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[１１]　[１]～[１０]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを含む哺乳動物細胞。
[１２]　前記細胞が、齧歯類細胞又はヒト細胞である、[１１]に記載の哺乳動物細胞。
[１３]　前記細胞が、哺乳動物由来のｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞からなる群から選択される分化多能性幹細胞である、[１１]に記載の哺乳動物細胞。
[１４]　[１]～[１０]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを含み、かつ内在性免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子若しくは遺伝子座が破壊されている非ヒト哺乳動物。
[１５]　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されており、前記Ｄ領域の改変配列が、
　（１）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く前記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列がＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
　（２）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
　（３）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
ことを特徴とし、かつ内在性免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子若しくは遺伝子座が破壊されている、前記非ヒト動物。
[１６]　前記動物が、齧歯類である、[１４]又は[１５]に記載の非ヒト動物。
[１７]　前記齧歯類が、マウス又はラットである、[１６]に記載の非ヒト動物。
[１８]　[１４]～[１７]のいずれかに記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該非ヒト動物の血液から該標的抗原と結合する抗体を取得することを含む、抗体の作製方法。
[１９]　[１４]～[１７]のいずれかに記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該標的抗原と結合する抗体を産生する前記非ヒト動物から脾臓細胞、リンパ節細胞又はＢ細胞を取得し、前記脾臓細胞、リンパ節細胞又はＢ細胞とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマを形成し、該ハイブリドーマを培養して、前記標的抗原と結合するモノクローナル抗体を取得することを含む、抗体の作製方法。
[２０]　[１４]～[１７]のいずれかに記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該標的抗原と結合する抗体を産生する前記非ヒト動物からＢ細胞を取得し、前記Ｂ細胞から抗体重鎖及び軽鎖、或いはそれらの可変領域、からなるタンパク質をコードする核酸を取得し、該核酸を用いてＤＮＡ組み換え技術又はファージディスプレイ技術によって前記標的抗原と結合する抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
[２１]　[１]～[１０]のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターの製造において、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域をその改変配列で置換する方法であって、
　（１’）ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターを準備する、
　（２’）工程（１’）の前記哺乳動物人工染色体ベクターからヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を削除する、
　（３’）工程（２’）で得られたベクターの前記Ｄ領域の削除部位に、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、プロモーター及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットを挿入する、
　（４’）工程（３’）で挿入された前記カセットの第２の部位特異的組み換え酵素認識部位に、第２の部位特異的組み換え酵素を用いて、前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、選択マーカー及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットを挿入する、並びに、
　（５’）第１の部位特異的組み換え酵素を用いる部位特異的組み換えによって、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットが前記Ｄ領域の削除部位に挿入された前記人工染色体ベクターを得る、
ことを含む前記方法。
[２２]　前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の削除が、ゲノム編集によって行われる、[２１]に記載の方法。
[２３]　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターであって、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座がＤ領域を欠失しており、該欠失されたＤ領域に代えて、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、プロモーター及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含む、哺乳動物人工染色体ベクター。
[２４]　前記欠失されたＤ領域が、Ｄ１－１からＤ１－２６までの領域である、[２３]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
[２５]　前記欠失されたＤ領域が、Ｄ１－１からＤ７－２７までの領域である、[２３]に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-186124号の開示内容を包含する。
　本発明によって、ヒト抗体産生非ヒト動物（例えば、齧歯類）において、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域のヒト由来ゲノム配列又はそのヒトミニマル化（すなわち、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間領域の短縮化を含む）Ｄ領域配列のＯＲＦ（遺伝子）配列を、例えばウシやサルなどの動物由来のＤ領域のＯＲＦ配列又はヒトＤ領域配列の改変ＯＲＦ配列と置換することにより、抗体の多様性を拡張することができるし、また好ましくは１５～５０若しくはそれ以上のアミノ酸長のＣＤＲＨ３を含むヒト抗体を出現することが可能である。
この図は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域配列（Ｄ１－１～Ｄ１－２６を含む領域）をヒトｇＲＮＡ　Ｕｐ３とＤｏｗｎ４の組み合わせで削除することを示す。重鎖Ｄ領域が削除されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座をＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）と称する。実施例１に関する図である。 図２Ａは、宿主であるマウス染色体とは独立して、１コピーのＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）が保持されたＣＨＯ細胞（細胞クローンＴＦ７－Ｂ１０）を示す。Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）において、矢頭はヒト染色体領域（赤）を、矢印は人工染色体領域（緑）を表す。また、図２Ｂは、Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖（矢印又は緑）、及びκ軽鎖（矢頭又は赤）が含まれていることを示す。実施例１の結果を示す図である。 この図は、ＣＡＧＰ（ＣＡＧプロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターの結合体）を有するプラスミドｐＲＰ［Ｅｘｐ］－ＣＡＧ＞ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ社にて合成された。）中の制限酵素ＡｆｉＩＩＩ（ＮＥＢ）及びＸｂａＩ（ＮＥＢ）切断部位にＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子を挿入してプラスミドＣＡＧ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを得たのち、このプラスミドを制限酵素ＸｂａＩで切断し、ＣＡＧＰとＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子間に、ＸｂａＩで両端を切断したプラスミドＨＲＢ由来断片（「Ｂ」）を挿入してプラスミドＣＡＧ－ΦＣ３１－ＨＲＢ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを得たことを示す。実施例２に関する図である。 この図は、プラスミドＣＡＧ－ΦＣ３１－ＨＲＢ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）及びＳｐｅＩ（ＮＥＢ）で切断し、ＣＡＧＰの上流側にプラスミドＨＲＡ由来断片（「Ａ」）を挿入してＨＤＲベクターを得たことを示す。図中、ＢｓｄＲはブラストサイジン耐性遺伝子を、ＣＡＧＰはＣＡＧプロモーターを、Ｒ４　ａｔｔＢ、Ｂｘｂ１　ａｔｔＢ及びＢｘｂ１　ａｔｔＰはリコンビナーゼ認識部位を、ＡｍｐＲはアンピシリン耐性遺伝子を、ｐＵＣｏｒｉはｐＵＣの複製起点をそれぞれ表す。実施例２に関する図である。 この図は、ゲノム編集（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）により、ＨＤＲベクターをＣＨＯ細胞中のＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のＤＨ領域削除部位（ΔＤＨ）付近に挿入したことを示す。実施例２に関する図である。 この図は、Ｂｘｂ１リコンビナーゼを細胞に導入することによってＨＤＲベクターからブラストサイジン耐性遺伝子を部位特異的組み換え反応により除去することを示す。実施例３に関する図である。 この図は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ間の各ゲノム配列を約２００ｂｐのサイズに短縮し、Ｄ領域をミニマル化することを示す。実施例６に関する図である。 この図は、ヒトｍｉｎｉＡ、ヒトｍｉｎｉＢ及びヒトｍｉｎｉＣからヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターを作製する手順を示す。図中、ヒトｍｉｎｉＡは、Ｒ４　ａｔｔＰ及びＨＲＡより下流からＤ断片３－１０までを、ヒトｍｉｎｉＢは、Ｄ断片３－１０より３－２２までを、ヒトｍｉｎｉＣは、Ｄ断片３－２２よりＨＲＢまで及びΦＣ３１　ａｔｔＰとブラストサイジン耐性遺伝子（ＢＳＤＲ）を、それぞれ有する。実施例６に関する図である。 この図は、図６に示したブラストサイジン耐性遺伝子が除去されたＨＤＲベクターのΦＣ３１　ａｔｔＢと、ヒトミニマル化ＩｇＨＤベクター上にあるΦＣ３１　ａｔｔＰとの間で部位特異的組み換えを起こして、ヒトミニマル化ＩｇＨＤが挿入されたＨＤＲベクターの作製を示す。実施例６に関する図である。 この図は、図９で作製されたヒトミニマル化ＩｇＨＤが挿入されたＨＤＲベクターから、Ｒ４リコンビナーゼを細胞に導入することによってＣＡＧプロモーター及びブラストサイジン耐性遺伝子などの不要な配列を除去することを示す。実施例６に関する図である。 この図は、ヒトミニマル化免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域を含むベクター（図８）中のヒトミニマル化ＩｇＨＤ（図中のＤ２－２からＤ５－２４の計２３個）を、ウシ化ヒトＩｇＨＤ（図中Ｂ１－１からＢ９－４の計２３個）で置換したベクターの作製を示す。ここで、ウシのＤ断片数（２３個）はヒト（２６個）よりも少ないため、置き換えなかった３つのヒトＤ断片（Ｄ１－１，Ｄ６－２５，Ｄ１－２６）は前後１００ｂｐと共に削除した。実施例９に関する図である。 この図は、ウシｍｉｎｉＡ，Ｂ，Ｃを保持するウシ化ヒトＩｇＨＤベクターの作製手順を示す。図中、ウシ化ヒトＩｇＨＤを実施例５と同様に３分割し、３分割したプラスミドＤＮＡであるウシｍｉｎｉＡ、ウシｍｉｎｉＢ、ウシｍｉｎｉＣは化学合成された（合成をユーロフィンジェノミクスに依頼した。）。実施例９に関する図である。 この図は、ヒト重鎖Ｄ領域がヒトミニマル化Ｄ領域と置換されたヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターを保持するキメラマウスの脾臓細胞での、Ｉｇμ－ｃＤＮＡにおけるＤ領域の使用頻度を示す。●は使用されたＤ領域を示す。図は、ヒトミニマル型でｎ＝２７（●の合計数）であるのに対し、野生型でｎ＝１５（●の合計数）である。実施例１４の結果を示す図である。 この図は、ウシ化ヒトＩｇＨＤで改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む改変Ｉｇ－ＮＡＣを保持するＴＣマウスにおいて、血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価を評価するため、抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質Ｓ１の受容体結合部位；ＲＢＤ）を固相化した９６穴プレートと抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ抗体を用いて、表示の１／１，０００～１／１，０００，０００倍希釈の抗血清についてＥＬＩＳＡを行った結果を示す。このとき継続的な追加免疫により免疫応答し、ＲＢＤに対する抗体力価（縦軸、４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．）が上昇することが確認された。図中、ｂ１～ｂ５は、ブースター１～５を表す。実施例１８の結果を示す図である。 この図は、ヒトミニマル化ＩｇＨＤ領域（約４３ｋｂ）をカニクイザルＤ断片（約４４ｋｂ）と置換して得られるサル化ヒトＩｇＨＤ領域の構造を示す。実施例１９に関する図である。 この図は、ヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ領域のＤ断片１－１から１－２６を置換するための２６種の改変長鎖ＤＨ配列を示す。実施例２９に関する図である。
　本発明をさらに詳細に説明する。
１．哺乳動物人工染色体ベクター
　本発明は、第一の態様において、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターにおいて、上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されていることを特徴とする哺乳動物人工染色体ベクターであって、前記Ｄ領域の改変配列が、
　（１）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く上記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列が、ＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
　（２）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
　（３）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
前記哺乳動物人工染色体ベクターを提供する。
　本明細書中の「ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域」は、全てのＯＲＦ（「遺伝子」（若しくはポリペプチドをコードする領域）又は「Ｄ断片」とも称する。）、ＶＤＪ組み換え配列、及び全てのＯＲＦ間（すなわち、遺伝子と遺伝子の間の）領域を含む全体を指す。
　本明細書中「ＶＤＪ組み換え配列」は、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座のＶ、Ｄ及びＪ領域の上流及び下流に隣接する配列であり、重鎖、軽鎖κ及び軽鎖λ遺伝子座に応じて異なる配置で７、２３、９及び／又は１２塩基からなる保存された配列を含む。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域の場合、組み換え配列は２８ｂｐ（すなわち、９ｂｐ、１２ｂｐ（スペーサー）、７ｂｐ）の塩基を含む。
　哺乳動物人工染色体ベクターは、非限定的に、例えばヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）などの哺乳動物の染色体から作製された人工染色体ベクターであり、より具体的には、該動物由来のセントロメア、及びテロメアを含み、かつ遺伝子類の例えば９９．５％～１００％、好ましくは１００％、が除去された長腕及び（もしあれば）短腕由来のゲノム配列中に、改変された抗体重鎖Ｄ領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び、場合により、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、人工的に作製された染色体ベクターである。
　本明細書中の「テロメア」は、同種又は異種の天然テロメア、或いは、人工テロメアである。ここで、同種とは、人工染色体ベクターの染色体断片が由来する哺乳動物と同種の動物を意味し、一方、異種とは、該動物以外の哺乳動物（これには、ヒトを含む）を意味する。また、人工テロメアの配列は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列（ｎは、繰り返しを意味する。）などの人工的に作製されたテロメア機能を有する配列を指す。人工染色体へのテロメア配列の導入は、例えば国際公開ＷＯ００／１０３８３に記載されるようなテロメアトランケーション（テロメア配列を人工的に挿入することにより切断を行う。）を含む方法によって行うことができる。テロメアトランケーションは、本発明の人工染色体の作製において染色体の短縮のために使用することができる。
[ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域の改変]
　以下に、上記（１）と、上記（２）又は（３）の組み合わせからなる改変配列について説明する。
　本発明の人工染色体ベクターに含まれるヒト免疫グロブリン（単に「ヒト抗体」とも称する。）重鎖遺伝子座は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域及びＣ領域においてＤ領域のゲノム配列のみが改変されている。ここで、Ｄ領域のヒト由来ゲノム配列の改変は、ヒトＤ領域のＯＲＦ（若しくは、遺伝子）配列の改変又はＯＲＦ間領域の短縮化（「ミニマル化」とも称する。）を含み、さらに、上記ヒトＤ領域のヒト由来ゲノム配列、又はヒトＤ領域のミニマル化配列、中のＯＲＦ配列を別の動物種由来のＤ領域ＯＲＦ配列、或いは１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列、と置換する。
　一般に、ヒト抗体重鎖可変領域は、Ｎ末端側からフレームワーク（ＦＲ）１、ＣＤＲＨ１、ＦＲ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲ３、ＣＤＲＨ３、ＦＲ４、及び定常領域の一部からなる。ＦＲ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲ２、ＣＤＲＨ２及びＦＲ３は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の組み換え（又は、再編成）によって形成されるＶＤＪ配列の主にＶ領域ヌクレオチド配列によってコードされている。また、ＣＤＲＨ３及びＦＲ４はそれぞれ、主に上記ＶＤＪ配列のＤ領域ヌクレオチド配列及びＪ領域ヌクレオチド配列によってコードされている。本発明ではアミノ酸長１８以上の抗体重鎖ＣＤＲ３を含むヒト抗体を産生するために、Ｄ領域の改変が行われる。
　一方、ヒト抗体軽鎖可変領域は、ＦＲ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲ４、及び定常領域の一部からなり、ＦＲ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲ３及びＣＤＲＬ３（一部）は、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の組み換え（又は、再編成）によって形成されるＶＪ配列の主にＶ領域ヌクレオチド配列によってコードされており、また、ＣＤＲＨ３（一部）及びＦＲ４は、主に上記ＶＪ配列のＪ領域ヌクレオチド配列によってコードされている。
　また、一般に、標的抗原が特異的に結合する抗体領域は、抗体重鎖超可変領域のＣＤＲＨ３ドメインであることが知られているため、本発明では、ヒト抗体の多様性を拡張し、好ましくはヒト抗体において通常より長い（例えば、１８以上の）アミノ酸長のＣＤＲＨ３を含む抗体を得ることができるように、上記ヒト抗体重鎖遺伝子座のＤ領域ゲノム配列を改変する。
　以下では、ヒトＤ領域の改変配列について説明する。
　改変配列の例は、上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ間（又は「遺伝子間」とも称する。）領域のゲノム配列が、ＶＤＪ組み換え配列が隣接するＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上に短縮された配列を含む、例えば約１００～約５００ｂｐ、約１５０ｂｐ～約３００ｂｐ、又は約２００ｂｐ～約２５０ｂｐなどの長さに短縮された配列を含む、改変されたＤ領域ゲノム配列である。
　ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域（「ＩｇＨＤ」領域ともいう。）は、ヒト１４番染色体（１４ｑ３２．３３）に存在し、５’→３’の順に、例えば、Ｄ１－１（位置２３５９９－３５０４８；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ２－２（位置３５０４９－３７６１５；アクッセション番号Ｊ００２３２）、Ｄ３－３（位置３７６１６－３９４２５；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ４－４（位置３９４２６－４０４７４；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ５－５（位置４０４７５－４１８８０；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ６－６（位置４１８８１－４３０５６；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ１－７（位置４３０５７－４４６４９；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ２－８（位置４４６５０－４７２６２；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ３－９（位置４７２６３－４８６１９；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ３－１０（位置４８６２０－４９１５８；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ４－１１（位置４９１５９－５００７８；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ５－１２（位置５００７９－５１３１６；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ６－１３（位置５１３１７－５２３２４；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ１－１４（位置５２３２５－５３９０９；アクッセション番号Ｘ１３９７２）、Ｄ２－１５（位置５３９１０－５６４０８；アクッセション番号Ｊ００２３４）、Ｄ３－１６（位置５６４０－５８１４３；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ４－１７（位置５８１４４－５９１８７；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ５－１８（位置５９１８８－６０５９１；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ６－１９（位置６０５９２－６１７６９；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、ＩＧＨＤ１－２０（位置６１７７０；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ２－２１（位置６１７７０－６５９１６；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ３－２２（位置６５９１７－６７７６２；アクッセション番号Ｘ９３６１６）、Ｄ４－２３（位置６７７６３－６８８２６；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ５－２４（位置６８８２７－７０４９２；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、Ｄ６－２５（位置７０４９３－７１９２６；アクッセション番号Ｘ９７０５１）、及びＤ１－２６（位置７１９２６７－７９７６５；アクッセション番号Ｘ９７０５１）の約４０ｋｂを超えるヌクレオチド配列、並びにその他の配列（Ｄ７－２７）を含む（Ｍ．Ｒｕｉｚ　ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１６，１７３－１８４（１９９９））。或いは、ヒト天然ＩｇＨＤ領域の配列は、ＮＧ＿００１０１９．６（ヌクレオチド番号（位置）：９６０１８１～１０００６２２（４０４４２ｂｐ））にも開示されている。
　ヒト免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列は、例えば、以下の配列番号１０１～１２６のヌクレオチド配列である。また、短縮化後のＯＲＦ間のサイズの例を各配列間に示した。
　　　　　　　配列番号１０１（ＩＧＨＤ１－１）：
　　　　　　　ggtacaactggaacgac
　　　　　　　(D1-1とD2-2のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列(28bp×2):256bp)
　　　　　　　配列番号１０２（ＩＧＨＤ２－２）：
　　　　　　　aggatattgtagtagtaccagctgctatgcc
　　　　　　　(D2-2とD3-3のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１０３（ＩＧＨＤ３－３）：
　　　　　　　gtattacgatttttggagtggttattatacc
　　　　　　　(D3-3とD4-4のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１０４（ＩＧＨＤ４－４）：
　　　　　　　tgactacagtaactac
　　　　　　　(D4-4とD5-5のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１０５（ＩＧＨＤ５－５）：
　　　　　　　gtggatacagctatggttac
　　　　　　　(D5-5とD6-6のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１０６（ＩＧＨＤ６－６）：
　　　　　　　gagtatagcagctcgtcc
　　　　　　　(D6-6とD1-7のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１０７（ＩＧＨＤ１－７）：
　　　　　　　ggtataactggaactac
　　　　　　　(D1-7とD2-8のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１０８（ＩＧＨＤ２－８）：
　　　　　　　aggatattgtactaatggtgtatgctatacc
　　　　　　　(D2-8とD3-9のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：255bp)
　　　　　　　配列番号１０９（ＩＧＨＤ３－９）：
　　　　　　　gtattacgatattttgactggttattataac
　　　　　　　(D3-9とD3-10のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：153bp)
　　　　　　　配列番号１１０（ＩＧＨＤ３－１０）：
　　　　　　　gtattactatggttcggggagttattataac
　　　　　　　(D3-10とD4-11のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：316bp)
　　　　　　　配列番号１１１（ＩＧＨＤ４－１１）：
　　　　　　　tgactacagtaactac
　　　　　　　(D4-11とD5-12のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１２（ＩＧＨＤ５－１２）：
　　　　　　　gtggatatagtggctacgattac
　　　　　　　(D5-12とD6-13のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１３（ＩＧＨＤ６－１３）：
　　　　　　　gggtatagcagcagctggtac
　　　　　　　(D6-13とD1-14のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：259bp)
　　　　　　　配列番号１１４（ＩＧＨＤ１－１４）：
　　　　　　　ggtataaccggaaccac
　　　　　　　(D1-14とD2-15のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１５（ＩＧＨＤ２－１５）：
　　　　　　　aggatattgtagtggtggtagctgctactcc
　　　　　　　(D2-15とD3-16のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１６（ＩＧＨＤ３－１６）：
　　　　　　　gtattatgattacgtttgggggagttatgcttatacc
　　　　　　　(D3-16とD4-17のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１７（ＩＧＨＤ４－１７）：
　　　　　　　tgactacggtgactac
　　　　　　　(D4-17とD5-18のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１８（ＩＧＨＤ５－１８）：
　　　　　　　gtggatacagctatggttac
　　　　　　　(D5-18とD6-19のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１１９（ＩＧＨＤ６－１９）：
　　　　　　　gggtatagcagtggctggtac
　　　　　　　(D6-19とD1-20のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１２０（ＩＧＨＤ１－２０）：
　　　　　　　ggtataactggaacgac
　　　　　　　(D1-20とD2-21のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１２１（ＩＧＨＤ２－２１）：
　　　　　　　agcatattgtggtggtgattgctattcc
　　　　　　　(D2-21とD3-22のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１２２（ＩＧＨＤ３－２２）：
　　　　　　　gtattactatgatagtagtggttattactac
　　　　　　　(D3-22とD4-23のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：316bp)
　　　　　　　配列番号１２３（ＩＧＨＤ４－２３）：
　　　　　　　tgactacggtggtaactcc
　　　　　　　(D4-23とD5-24のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１２４（ＩＧＨＤ５－２４）：
　　　　　　　gtagagatggctacaattac
　　　　　　　(D5-24とD6-25のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１２５（ＩＧＨＤ６－２５）：
　　　　　　　gggtatagcagcggctac
　　　　　　　(D6-25とD1-26のORF間のサイズ＋VDJ組み換え配列（28bp×2）：256bp)
　　　　　　　配列番号１２６（ＩＧＨＤ１－２６）：
　　　　　　　ggtatagtgggagctactac
　上記改変配列は、上記ヒトＩｇＨＤ領域の改変ＯＲＦを含み、かつ、ＯＲＦ間領域（即ち、遺伝子間領域）の各ヒト由来ゲノム配列を、ＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上、例えば、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１５０ｂｐ～約３００ｂｐ、又は約２００ｂｐ～約２５０ｂｐ、の長さになるように短縮（若しくは、ミニマル化）することを含む。ミニマル化後の改変されたヒトＩｇＨＤ領域の長さは、（通常の）プラスミドベクターに挿入可能なように約１０ｋｂ以下であることが好ましい。例えば約２００ｂｐに短縮するときには、約８ｋｂの長さにミニマル化される。
　上記の短縮（若しくは、ミニマル化）の方法は、特に制限はないが、例えば、ＯＲＦ間領域中、各ＯＲＦに隣接するＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上は残し、ＯＲＦ間領域の配列中央部から均等に削除してもよい。また、ミニマル化は、例えばヒトＤ領域のＤ１－１～Ｄ１－２６を数個（例えば３～５個）のセグメントに分け、各セグメントのミニマル化を行い、得られたミニマル化セグメントを５’側から順番に連結して目的のヒトミニマル化Ｄ領域を作製することができる（図８）。ヒトミニマル化Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列、ＶＤＪ組み換え配列（２８ｂｐ×２）及びミニマル化ＯＲＦ間配列を含むＤ領域のヌクレオチド配列は、例えば下記の配列番号１のヌクレオチド配列、又は該配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の同一性、又は該ヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチド（若しくは塩基）の欠失、置換若しくは付加を含むヌクレオチド配列を有するものである。
配列番号１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　本明細書中で使用する「数個」とは、２～１０の整数をいう。
　配列番号１のようなヒトミニマル化Ｄ領域の配列は、ヒトＩｇＨＤ領域ＯＲＦを異種のＯＲＦと置換するときに使用することができる。
　本発明に関わる上記ヒトＤ領域のミニマル化によって、例えばキメラマウス脾臓Ｉｇμ－ｃＤＮＡにおけるヒトミニマル化Ｄ断片の使用頻度はｎ＝２７（野生型の場合ｎ＝１５）に高まる（図１３）。このことは、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域のＯＲＦ間領域を短縮化しても、抗体の多様性に影響がないことを示している。
　別の改変配列は、抗体重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸長が１８以上となる抗体を産生することができる非ヒト動物由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のゲノム配列又はその改変配列を含む。
　このような非ヒト動物は、例えばウシ、サル（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ、サメ（例えばオオメジロザメ、メジロザメ及びコモリザメ）などの動物である。例えばｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）からの情報検索により、少なくとも上記の動物種が、ヒトで最長のＤ断片（３７塩基対）より長いＤ断片をもつ種であることを確認することができる。以下では、ウシとサルについて具体的に説明するが、同様の手法によって、他の動物種についても上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて他の動物種由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含むように置換することができる。
　ウシ免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域（２１ｑ２４）は、５’→３’の順に、例えば、ＩＧＨＤのＢ１－１、Ｂ２－１、Ｂ３－１、Ｂ４－１、Ｂ９－１、Ｂ１－２、Ｂ２－２、Ｂ５－２、Ｂ８－２、Ｂ６－２、Ｂ１－３、Ｂ２－３、Ｂ３－３、Ｂ７－３、Ｂ５－３、Ｂ６－３、Ｂ１－４、Ｂ２－４、Ｂ３－４、Ｂ７－４、Ｂ５－４、Ｂ６－４及びＢ９－４のヌクレオチド配列を含む。
　上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列を含むように置換することができる。このようにして得られるウシ化ヒトミニマル化Ｄ領域のヌクレオチド配列は、例えば、下記の配列番号２のヌクレオチド配列、又は該配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の同一性、又は該ヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチド（若しくは塩基）の欠失、置換若しくは付加を含むヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
配列番号２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　上記ウシＩｇＨＤ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列は、例えば以下の配列番号１２７～１４９のヌクレオチド配列である。
　　　　　　　配列番号１２７（Ｂ１－１）：
　　　　　　　agaataccgtgatgatggttactgctacacc 
　　　　　　　配列番号１２８（Ｂ１－２）：
　　　　　　　agaatatcgtgatgatggttactgctacacc 
配列番号１２９（Ｂ１－３）：
agactatcgtgatgatggttactgctacacccacagtgactcaggccctgacataaagtctgacccgcacacaggtgtggagctggccaatgcatccccaggggcactgggctcccaag 
　　　　　　　配列番号１３０（Ｂ１－４）：
　　　　　　　agaatatcgtgatgatggttactgctacacc 
　　　　　　　配列番号１３１（Ｂ２－１）：
　　　　　　　ttactatagtgaccac 
　　　　　　　配列番号１３２（Ｂ２－２）：
　　　　　　　ttactatagtgaccac
　　　　　　　配列番号１３３（Ｂ２－３）：
　　　　　　　ttactatagtgaccac
　　　　　　　配列番号１３４（Ｂ２－４）：
　　　　　　　ttactatagtgaccac 
　　　　　　　配列番号１３５（Ｂ３－１）：
　　　　　　　gtattgtggtagctattgtggtagttattatggtac
　　　　　　　配列番号１３６（Ｂ３－３）：
　　　　　　　gtattgtggtagctattgtggtagttattatggtac
　　　　　　　配列番号１３７（Ｂ３－４）：
　　　　　　　gtattgtggtagctattgtggtagttattatggtac
　　　　　　　配列番号１３８（Ｂ４－１）：
　　　　　　　gtagttatagtggttatggttatggttatagttatggttatac
　　　　　　　配列番号１３９（Ｂ５－２）：
　　　　　　　atgatacgataggtgtggttgtagttattgtagtgttgctac
　　　　　　　配列番号１４０（Ｂ５－３）：
　　　　　　　atgatacgataggtgtggttttagttattgtagtgttgctac
　　　　　　　配列番号１４１（Ｂ５－４）：
　　　　　　　atgatacgataggtgtggttttagttattgtagtgttgctac
　　　　　　　配列番号１４２（Ｂ６－２）：
　　　　　　　gtagttgttatagtggttatggttatggttgtggttatggttatggttatgattatac
　　　　　　　配列番号１４３（Ｂ６－３）：
　　　　　　　gtagttgttatagtggttatggttatggttatggttgtggttatggttatggttatac
　　　　　　　配列番号１４４（Ｂ６－４）：
　　　　　　　gtagttgttatagtggttatggttatggttatggttgtggttatggttatggttatac
配列番号１４５（Ｂ７－３）：
gtagttatggtggttatggttatggtggttatggttgttatggttatggttatggttatggttatac
配列番号１４６（Ｂ７－４）：
gtagttatggtggttatggttatggtggttatggttgttatggttatggttatggttatggttatggttatac
配列番号１４７（Ｂ８－２）：
gtagttgtcctgatggttatagttatggttatggttgtggttatggttatggttgtagtggttatgattgttatggttatggtggttatggtggttatggtggttatggttatagtagttatagttatagttatacttacgaatatac
　　　　　　　配列番号１４８（Ｂ９－１）：
　　　　　　　gaactcggtggggc
　　　　　　　配列番号１４９（Ｂ９－４）：
　　　　　　　gaactcggtggggc
　カニクイザル免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域（Ｃｈｒ７ｑ；Ｇ．－Ｙ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２０１６；６８：４１７－４２８）は、５’→３’の順に、例えば、ＩＧＨＤの１Ｓ５，２Ｓ１１，３Ｓ６，４Ｓ２４，５Ｓ８，６Ｓ４，１Ｓ１０，２Ｓ１７，３Ｓ１８，２Ｓ３４，５Ｓ１４，５Ｓ３１，６Ｓ３，１Ｓ２７，２Ｓ２２，４Ｓ３６，４Ｓ３０，５Ｓ３７，６Ｓ２０，１Ｓ３３，２Ｓ２８，６Ｓ３２，３Ｓ１２，６Ｓ３８，６Ｓ２６，及び１Ｓ３９の約４４ｋｂのヌクレオチド配列を含む（図１５）。
　上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、サル免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列を含むように置換する。
　カニクイザルＤ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列は、例えば以下の配列番号１５０～１７５のヌクレオチド配列である。
　　　　　　　配列番号１５０（１Ｓ５）：
　　　　　　　ggtataactggaactac
　　　　　　　配列番号１５１（２Ｓ１１）：
　　　　　　　agaatattgtagtagtacttactgctcctcc
　　　　　　　配列番号１５２（３Ｓ６）：
　　　　　　　gtattacgaggatgattacggttactattacacccacagcgt
　　　　　　　配列番号１５３（４Ｓ２４）：
　　　　　　　tgactacggtagcagctac
　　　　　　　配列番号１５４（５Ｓ８）：
　　　　　　　gtggatacagctacagttac
　　　　　　　配列番号１５５（６Ｓ４）：
　　　　　　　gggtatagcagcggctggtac
　　　　　　　配列番号１５６（１Ｓ１０）：
　　　　　　　ggtatagctggaacgac
　　　　　　　配列番号１５７（２Ｓ１７）：
　　　　　　　agaatactgtactggtagtggttgctatgcc
　　　　　　　配列番号１５８（３Ｓ１８）：
　　　　　　　gtactggggtgattattatgac
　　　　　　　配列番号１５９（２Ｓ３４）：
　　　　　　　agcatattgtagtggtggtgtctgctacacc
　　　　　　　配列番号１６０（５Ｓ１４）：
　　　　　　　gtggatacagctacagttaccacagttttgccacc
　　　　　　　配列番号１６１（５Ｓ３１）：
　　　　　　　gtggatatagctacggttac
　　　　　　　配列番号１６２（６Ｓ９）：
　　　　　　　gggtatagcagctggtcc
　　　　　　　配列番号１６３（１Ｓ２７）：
　　　　　　　ggtataactggaatgac
　　　　　　　配列番号１６４（２Ｓ２２）：
　　　　　　　agaatattgtagtggtatttactgctatgcc
　　　　　　　配列番号１６５（４Ｓ３６）：
　　　　　　　tgaatacagtaactac
　　　　　　　配列番号１６６（４Ｓ３０）：
　　　　　　　tgactacggtaactac
　　　　　　　配列番号１６７（５Ｓ３７）：
　　　　　　　ggggatacagtgggtacagttac
　　　　　　　配列番号１６８（６Ｓ２０）：
　　　　　　　gggtatagcggcagctggaac
　　　　　　　配列番号１６９（１Ｓ３３）：
　　　　　　　ggaacacctggaacgac
　　　　　　　配列番号１７０（２Ｓ２８）：
　　　　　　　agcacactgtagtgatagtggctgctcctcc
　　　　　　　配列番号１７１（６Ｓ３２）：
　　　　　　　gggtatagcggtggctggtcc
　　　　　　　配列番号１７２（３Ｓ１２）：
　　　　　　　gtattactatagtggtagttattactaccacagtgt
　　　　　　　配列番号１７３（６Ｓ３８）：
　　　　　　　gggtatagcagcagcta
　　　　　　　配列番号１７４（６Ｓ２６）：
　　　　　　　gggtatagcagcggctggtcc
　　　　　　　配列番号１７５（１Ｓ３９）：
　　　　　　　ggtatagtgggaactacaac
　或いは、別の改変配列は、上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦに代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む。
　ヒト抗体のなかには頻度は低いが長鎖ＣＤＲＨ３配列の存在が知られている（Ｌ．Ｙｕ　ａｎｄ　Ｙ．Ｇｕａｎ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，２４，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００２５０）。
　このような改変Ｄ領域ＯＲＦは、例えば図１６に示されるような配列番号７５～１００に示されるヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチド（若しくは塩基）の欠失、置換若しくは付加を含むヌクレオチド配列を含むものであり、ヒトＩｇＨＤ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦを、対応する２６種類の上記改変ＯＲＦ配列と置換することができる。そのように置換したヒトミニマル化Ｄ領域のヌクレオチド配列は、例えば、配列番号３のヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列において１若しくは数個のヌクレオチド（若しくは塩基）の欠失、置換若しくは付加を含むヌクレオチド配列を含むものである。
配列番号３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　ヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて改変ＯＲＦ配列を決定する方法は、例えば以下に示すような工程を含むことができる。
　この例では、ヒト抗体重鎖アミノ酸配列のＶＨのＣ末端側の配列「ＣＡＲ」／「ＣＡＫ」以降、ＶＨのＮ末端側の配列「ＷＧ」より上流をＣＤＲ３と定義する（Ｍ．Ｃｈｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　２０１９；８（４）：５５；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ａｎｔｉｂ８０４００５５）。
　第１工程では、ＣＤＲ３が１８アミノ酸以上となる公知の配列を検索する。
　第２工程では、ＣＤＲ３の塩基配列を抽出する。
　第３工程では、体細胞突然変異ホットスポット配列に、同義（アミノ酸が変わらない）置換変異を可能な範囲で導入する。
　本明細書中の「同一性」は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２０００；７：２０３－２１４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ１９９０；２１５：４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８；８５：２４４４－２４４８）。
[ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域の改変方法]
　ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域は、例えば次のような工程を含む方法によって改変することができる。
＜第１工程＞
　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳類人工染色体ベクター（[Ｉｇ－ＮＡＣ]）を準備する。
　Ｉｇ－ＮＡＣは、テロメア側からセントロメア側に向かってヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖κ（若しくはλ）遺伝子座を含む構造を有する（例えば特許第６８６８２５０号公報）。
　Ｉｇ－ＮＡＣは、導入すべき細胞本来の染色体から独立した染色体として安定に複製及び分配が可能である。このベクターの例は、齧歯類人工染色体ベクター（例えば、マウス又はラット人工染色体ベクター）である。齧歯類人工染色体ベクターの作製は、例えば、本出願人による特許第６７７５２２４号公報、特許第６８６８２５０号公報などに記載されている。
　具体的な作製法は以下の通りである。
　哺乳動物人工染色体ベクターは、例えば哺乳動物染色体のテロメアトランケーションによって作製されてもよい、該動物のセントロメア、セントロメア近傍の長腕断片及び、もしその動物に存在すれば、短腕断片、及びテロメアを含む。例えば、マウス由来の染色体断片は、マウスの１～１９番、Ｘ及びＹ染色体のうちの任意の染色体、好ましくは１番～１９番染色体のいずれかの断片（長腕の全内在遺伝子数の少なくとも９９．５％、好ましくはほぼ１００％が削除された長腕断片）であり、該断片には、セントロメア近傍のマウス染色体長腕の部位から長腕遠位が削除された長腕断片が含まれる。マウスの染色体の配列情報は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．などのＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅｓから入手可能である。より具体的には、例えばマウス１５番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合、上記長腕断片は、非限定的に例えば、ＡＣ１２１３０７、ＡＣ１６１７９９などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１６番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合、前記長腕断片は、非限定的に例えばＧｍ３５９７４より遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１０番染色体長腕の染色体部位である遺伝子Ｇｍ８１５５から長腕遠位を削除したマウス１０番染色体由来の長腕断片からなる。
　マウス人工染色体ベクターの例は、寄託細胞株ＤＴ４０（１０ＭＡＣ）Ｔ５－２６（国際寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６５６）に含まれるマウス人工染色体、或いは、寄託細胞株ＤＴ４０（１６ＭＡＣ）Ｔ１－１４（国際寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６５７）に含まれるマウス人工染色体を包含する。
　本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、例えば以下の工程（ａ）～（ｃ）：
（ａ）哺乳動物染色体を保持する細胞を得る工程、
（ｂ）内在遺伝子（数）の大部分（９９．５％～１００％、好ましくは１００％）を含まないようにマウス染色体の長腕遠位を削除する工程、及び
（ｃ）長腕近位に１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を挿入する工程
を含む方法によって作製することができる。ここで、工程（ｂ）及び（ｃ）の順序は逆であってもよい。
　以下、各工程について説明する。
＜工程（１ａ）＞
　本発明の哺乳動物人工染色体ベクターを作製するには、まず、哺乳動物染色体を保持する細胞を作製する。例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ　Ｓ　ｒｅｇｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ（ＢＳｒ））で標識された哺乳動物染色体を保持する哺乳動物線維芽細胞とＧ４１８耐性遺伝子であるｎｅｏ遺伝子を導入したマウスＡ９細胞（ＡＴＣＣ　ＶＡ２０１１０－２２０９）とを細胞融合し、薬剤耐性遺伝子で標識された哺乳動物染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞から、その染色体を相同組み換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。哺乳動物線維芽細胞は、文献記載の方法に基づいて入手することが可能であり、例えば、マウス線維芽細胞は日本クレアより入手可能なＣ５７Ｂ６系統のマウスより樹立可能である。相同組み換え率の高い細胞としては、例えば、ニワトリＤＴ４０細胞（Ｄｉｅｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１７４－１８２，１９９６）を利用できる。さらにまた、上記移入は、公知の染色体移入法、例えば、微小核細胞融合法（Ｋｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，８０：４１３－４１８，１９７３）によって行うことができる。
＜工程（１ｂ）＞
　哺乳動物由来の単一の染色体を保持する細胞において、該哺乳動物染色体の長腕遠位及び、もし動物に存在すれば、短腕遠位を削除する。このとき、重要なことは、長腕及び短腕上に存在する内在遺伝子の大部分を削除（又は、除去若しくは欠失）し、哺乳動物セントロメアを保持する人工染色体を構築することである。これは長腕及び短腕上に存在する全内在遺伝子（数）の少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、最も好ましくは９９．９～１００％、さらに最も好ましくは１００％を削除（又は、除去若しくは欠失）するように切断位置を決定することである。そうすることによって、人工染色体が導入された、哺乳動物由来の、好ましくはマウス、ラットなどのげっ歯類由来の、細胞、組織又は個体において安定かつ高保持率で保持される。上記内在遺伝子の削除は、例えば、テロメアトランケーションにより行うことができる。具体的には、哺乳動物染色体を保持する細胞において、テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組み換えにより染色体上の所望の位置に人工若しくは天然テロメア配列が挿入されたクローンを取得し、これによってテロメアトランケーションにより欠失変異体が得られる。例えば、所望の位置（又は、部位）が削除すべき長腕遠位の切断位置であり、この位置にテロメア配列が相同組み換えにより置換、挿入されて長腕遠位が削除される。このような位置は、ターゲティングベクターを構築する際の標的配列の設計により、適宜設定できる。例えば、哺乳動物染色体長腕のＤＮＡ配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側でテロメアトランケーションが起こるように設定される。これにより、内在遺伝子の大部分が削除された哺乳動物染色体断片が得られる。他の染色体の場合にも同様にテロメアトランケーションを実施できる。短腕遠位の切断の場合も同様である。
＜工程（１ｃ）＞
　ＤＮＡ配列挿入部位として、好ましくは部位特異的組み換え酵素の認識部位を挿入することができる。すなわち、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組み換えを起こす現象が知られており、本発明における哺乳動物人工染色体ベクターでは、このような酵素とその酵素の認識部位からなる系を利用して、目的とするヒト免疫グロブリン重鎖若しくは遺伝子座、及び／又は、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子又は遺伝子座の配列を挿入、搭載できる。このような系として、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ酵素と、その認識部位であるｌｏｘＰ配列の系（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系；Ｂ．Ｓａｕｅｒ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；１９９３，２２５：８９０－９００）や、出芽酵母由来のＦｌｐ酵素と、その認識部位であるＦＲＴ（Ｆｌｐ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）配列の系（Ｆｌｐ／ＦＲＴ系）や、ストレプトミセスファージ由来のφＣ３１インテグレースと、その認識部位であるφＣ３１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｒ４インテグレースと、その認識部位であるＲ４ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、ＴＰ９０１－１インテグレースと、その認識部位であるＴＰ９０１－１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｂｘｂ１インテグレースと、その認識部位であるＢｘｂ１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、などを挙げることができるが、ＤＮＡ配列挿入部位として機能しうるのであれば、上記の系に限定されないものとする。
　このような部位特異的組み換え酵素の認識部位の挿入のためには、公知の方法、例えば、相同組み換え法が利用でき、挿入位置及び数は、長腕近位及び短腕近位内に適宜設定することができる。
　哺乳動物人工染色体ベクターには、１つの種類の認識部位又は異なる種類の認識部位を挿入することができる。認識部位の設定により、目的とする遺伝子若しくは遺伝子座、すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子若しくは遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子若しくは遺伝子座、又はヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座の挿入位置を特定することができるので、挿入位置が一定となり、想定外の位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）を受けることもなくなる。
　哺乳動物人工染色体ベクターには、好ましくは、目的とする上記遺伝子又は遺伝子座の配列の他に、レポーター遺伝子を挿入してもよい。レポーター遺伝子としては、特に限定するものではないが、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ又はＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、など）遺伝子、タグタンパク質コードＤＮＡ、β－ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
　哺乳動物人工染色体ベクターにはさらに、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択マーカーは、該ベクターで形質転換された細胞を選別する際に有効である。選択マーカー遺伝子としては、ポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子のいずれか、又はその両方が例示される。ポジティブ選択マーカー遺伝子には、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ（ＢＳ）耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが含まれる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子には、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡ断片（ＤＴ－Ａ）遺伝子などが包含される。一般に、ＨＳＶ－ＴＫは、ガンシクロビル又はアシクロビルと組み合わせて使用される。
　本明細書中で使用する「ヒト免疫グロブリン遺伝子若しくは遺伝子座」は、特に断らない限り、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子若しくは遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子若しくは遺伝子座、及び／又はヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座を指す。具体的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子若しくは遺伝子座は、例えばヒト１４番染色体のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｌｏｃｕｓ（ｈｕｍａｎ）ＮＣ＿００００１４．９（（塩基番号１０５５８６４３７．．１０６８７９８４４）或いは（塩基番号１０５２６４２２１．．１０７０４３７１８））、ヒト２番染色体のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｋａｐｐａ　ｌｏｃｕｓ　（ｈｕｍａｎ）ＮＣ＿０００００２．１２（（塩基番号８８８５７３６１．．９０２３５３６８）或いは（塩基番号８８５６００８６．．９０２６５６６６））、及びヒト２２番染色体のｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｌａｍｂｄａ　ｌｏｃｕｓ（ｈｕｍａｎ）ＮＣ＿００００２２．１１（（塩基番号２２０２６０７６．．２２９２２９１３）或いは（塩基番号２１６２０３６２．．２３８２３６５４））に記載される塩基配列よって表される。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子若しくは遺伝子座は、約１，３Ｍｂの塩基長であり、ヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子若しくは遺伝子座は、約１．４Ｍｂの塩基長であり、ヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座は、約０．９Ｍｂの塩基長である。
　因みに、マウスの抗体重鎖遺伝子若しくは遺伝子座は、マウス第１２番染色体上にあり、マウスの抗体軽鎖κ遺伝子若しくは遺伝子座は、マウス第６番染色体上にあり、マウス抗体軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座は、マウス第１６番染色体上にある。具体的には、マウス抗体重鎖遺伝子若しくは遺伝子座は、例えばＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１２，ＮＣ＿００００７８．６（１１３２５８７６８．．１１６００９９５４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、マウス抗体軽鎖κ遺伝子若しくは遺伝子座は、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　６，ＮＣ＿００００７２．６（６７５５５６３６．．７０７２６７５４）、マウス抗体軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座は、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１６，ＮＣ＿００００８２．６（１９０２６８５８．．１９２６０８４４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に記載される塩基配列よって表される。
　また、ラットの抗体重鎖遺伝子若しくは遺伝子座は、ラット第６番染色体上にあり、ラットの抗体軽鎖κ遺伝子若しくは遺伝子座は、ラット第４番染色体上にあり、ラット抗体軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座は、ラット第１１番染色体上にある。同様に、これらの遺伝子若しくは遺伝子座の塩基配列は、米国ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋなど）、公知文献などから入手可能である。
＜第２工程＞
　上記第１工程で作製されたヒト免疫グロブリン（重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクター（Ｉｇ－ＮＡＣ）において、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座から、例えばゲノム編集（Ｊ．Ｍ．Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１２；３３７：８１６－８２１）や部位特異的組み換え技術（例えば、部位特異的組み換え酵素の使用）などの方法により、ヒト重鎖遺伝子座のＶ領域とＪ領域の間に存在するＤ領域を削除して「Ｉｇ－ＮＡＣ(ΔＤＨ)」を作製する。
　本明細書中の「ゲノム編集」は、例えばＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）などの人工切断酵素、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどを使用してゲノムＤＮＡの編集や遺伝子改変を行う技術である。本発明の方法では、ゲノム編集の任意の技術を使用することができるが、好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用である。
　特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌のウイルスやプラスミドに対する適応免疫機構から発見されたが、ベクターの構築が比較的簡便であり、複数の遺伝子を同時に改変することが可能である（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７，３３７（６０９６）：８１６－８２１，２０１２；Ｓａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５，２０１４）。このシステムは、Ｃａｓ９タンパク質と約２０塩基対標的配列をもつガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ；ｇＲＮＡ）を含む。細胞内でこれらを共発現させることにより、ｇＲＮＡが標的配列近傍のＰＡＭ配列を認識して標的ゲノムＤＮＡと特異的に結合し、Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列の５’側上流で二本鎖切断を誘導する。現在最も使用されているＣａｓ９タンパク質はＳｐＣａｓ９型であり、ＰＡＭ配列がＮＧＧ（Ｎ＝Ｃ，Ｇ，Ａ若しくはＴ）であることから変異導入位置の制約が少ない。本発明では、ガイドＲＮＡが標的とするヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の部位は、非限定的に、例えばヒトＤ１－１断片の５’上流部位であり、ガイドＲＮＡの標的配列は、例えば5’-AGATCCTCCATGCGTGCTGTGGG-3’（配列番号４）である。
　本明細書中の「部位特異的組み換え酵素」とは、これら酵素の認識部位で特異的に目的のＤＮＡ配列と組み換えを起こすための酵素である。このような組み換え酵素とその認識部位とを利用することによって部位特異的組み換えを行うことができる。部位特異的組み換え酵素の例は、Ｃｒｅインテグラーゼ（Ｃｒｅリコンビナーゼとも称する。）、Ｆｌｐリコンビナーゼ、φＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ＴＰ９０１－１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼなどである。また、該酵素の認識部位には、例えばｌｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位）、ＦＲＴ（Ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位）、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ（φＣ３１リコンビナーゼ認識部位）、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ（Ｒ４リコンビナーゼ認識部位）、ＴＰ９０１－１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１－１ａｔｔＰ（ＴＰ９０１－１リコンビナーゼ認識部位）、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位）などが含まれる。
　ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域を削除した部位に、合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを導入するためのアクセプター部位を挿入する。アクセプター部位の例は、部位特異的組み換え酵素の認識部位を含むカセットである。該アクセプター部位の挿入方法の例は、下記の＜第３工程＞に記載されている。
　ここで、部位特異的組み換え酵素とその認識部位は、例えば上記のＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘＰの系、ＦｌｐリコンビナーゼとＦＲＴの系、φＣ３１リコンビナーゼとφＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰの系などである。部位特異的組み換え酵素（例えばＣｒｅ）は、認識部位配列間（例えばｌｏｘＰ間）で部位特異的組み換え反応を触媒することができる。
＜第３工程＞
　部位特異的組み換え技術、ゲノム編集技術などの方法によって、上記アクセプター部位に合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを挿入する。
　合成Ｄ領域ポリヌクレオチドは、上記セクション１に記載したような、上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されている改変Ｄ領域であり、上記改変配列が、
　（１）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く上記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列がＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
　（２）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメなどの脊椎動物由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
　（３）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
ように改変された配列である。
　一実施形態において、上記の哺乳動物人工染色体ベクターの製造においてヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域をその改変配列（上記「合成Ｄ領域ポリヌクレオチド」と同義である。）で置換する方法は、下記の工程を含むことができる。
　（１’）ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターを準備する、
　（２’）工程（１’）の前記哺乳動物人工染色体ベクターからヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を削除する、
　（３’）工程（２’）で得られたベクターの前記Ｄ領域の削除部位に、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、プロモーター及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットを挿入する、
　（４’）工程（３’）で挿入された前記カセットの第２の部位特異的組み換え酵素認識部位に、第２の部位特異的組み換え酵素を用いて、前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、選択マーカー及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットを挿入する、並びに、
　（５’）第１の部位特異的組み換え酵素を用いる部位特異的組み換えによって、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットが前記Ｄ領域の削除部位に挿入された前記人工染色体ベクターを得る。
　上記工程における、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、第２の部位特異的組み換え酵素認識部位、第１の部位特異的組み換え酵素、及び第２の部位特異的組み換え酵素は、制限はないが、例えば上に説明したものを使用できる。また、プロモーターも制限はないが、例えばＣＡＧプロモーターなどを使用できる。
　工程（２’）において、工程（１’）の哺乳動物人工染色体ベクターからヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を削除するために、例えば、上記のゲノム編集、部位特異的組み換えなどの技術を使用することができる。
　具体的には、上記Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のヒト重鎖Ｄ領域切断部位に上記合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを挿入するために、該ポリヌクレオチドと、その５’末端に部位特異的組み換え酵素認識部位含有カセット（例えば、φＣ３１－ＢｓｄＲ－ｏｒｉＣ－Ｒ４の配列）とを含むベクターを作製し、該ベクターと上記Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）との間で部位特異的組み換え反応を行ってＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のヒト重鎖Ｄ領域切断部位に合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを挿入することができる（図５、６、９及び１０）。
　或いは、Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のヒト重鎖Ｄ領域切断部位に合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを挿入するために、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ領域部分配列とヒト免疫グロブリン重鎖Ｊ領域（及び、場合により、Ｃ領域）の部分配列との間に部位特異的組み換え酵素認識部位を含むベクターを作製し、このベクターとＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）の間でゲノム編集（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）を行ってＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のヒト重鎖Ｄ領域切断部位に上記部位特異的組み換え酵素認識部位を挿入し、さらに別の部位特異的組み換え酵素を作用して、上記Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のヒト重鎖Ｄ領域切断部位に部位特異的組み換え酵素認識部位を含むＩｇ－ＮＡＣを作製する。さらに、このＩｇ－ＮＡＣに上記合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを挿入するために、該ポリヌクレオチドと、その５’末端に部位特異的組み換え酵素認識部位とを含むベクターを作製し、部位特異的組み換え酵素（例えばφＣ３１リコンビナーゼ）を作用し、さらに別の部位特異的組み換え酵素（例えばＢｘｂ１リコンビナーゼ又はＲ４リコンビナーゼ）を作用して、上記Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のヒト重鎖Ｄ領域切断部位に合成Ｄ領域ポリヌクレオチドを含む目的の改変Ｉｇ－ＮＡＣを作製することができる（図１０）。
　本発明はさらに、別の態様において、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターであって、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座がＤ領域を欠失しており、該欠失されたＤ領域に代えて、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、プロモーター及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含む、哺乳動物人工染色体ベクターを提供する。
　上記ベクターにはさらに、第３の部位特異的組み換え酵素認識部位を含んでもよい。
　上記哺乳動物人工染色体ベクターの例は、上記工程（３’）で作製されるベクターである（例えば図９）。
　上記欠失されたＤ領域が、Ｄ１－１からＤ１－２６までの領域であるか、或いは、Ｄ１－１からＤ７－２７までの領域である。
　上記ベクターにおいて、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位は、制限はないが、例えば上に説明したものを使用できる。また、プロモーターも制限はないが、例えばＣＡＧプロモーターなどを使用できる。
２．哺乳動物細胞
　本発明は、第二の態様において、上記セクション１に記載した哺乳動物人工染色体ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。
　本発明の哺乳動物人工染色体ベクターを介して哺乳動物由来の細胞類に、抗体重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン遺伝子座（セクション１の「改変Ｉｇ－ＮＡＣ」）を導入することによって、ヒト抗体を産生可能にする哺乳動物細胞を作製することができる。
　本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、任意の哺乳動物細胞に移入又は導入することができる。そのための手法には、例えば、微小核細胞融合法、リポフェクション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれるが、好ましい手法は微小核細胞融合法である。
　微小核細胞融合法は、本発明の哺乳動物人工染色体ベクターを含有する微小核形成能を有する細胞（例えばマウスＡ９細胞）と、所望の他の細胞との微小核融合によって上記ベクターを上記他の細胞に移入する方法である。微小核形成能を有する細胞は、倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理して微小核多核細胞を形成し、サイトカラシン処理により微小核体を形成する処理を行ったのちに、所望の細胞との細胞融合を行うことができる。
　上記のベクター導入可能な細胞は、齧歯類細胞、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり、例えば卵母細胞、精子細胞などの生殖系列細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、精子幹（ＧＳ）細胞、体性幹細胞などの幹細胞、体細胞、胎児細胞、成体細胞、正常細胞、初代培養細胞、継代細胞、株化細胞などを包含する。幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、間葉系幹細胞などの体性幹細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、核移植クローン胚由来胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞などが含まれる。好ましい細胞は、例えばマウス、ラット、ハムスター（例えば、チャイニーズハムスター）、モルモットなどの齧歯類、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダなどの有蹄類などの哺乳動物由来の体細胞、幹細胞、前駆細胞、及び非ヒト生殖系列細胞からなる群から選択される。細胞が齧歯類由来の細胞である場合、本発明のベクターが導入された齧歯類の細胞や組織において、ベクターがより安定に保持される。
　体細胞の例は、非限定的に、肝細胞、腸細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、脳細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、線維芽細胞などである。
　ＥＳ細胞は、哺乳動物由来の受精卵の胚盤胞の内部細胞塊から樹立された分化多能性と半永久的増殖能とを備えた幹細胞である（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４－１５６；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５－１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：７８４４－７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４－２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３－１６５）。
　ラットのＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞の場合と同様に（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ　１９８１；２９２（５８１９）：１５４－１５６）、ラット胚盤胞期胚又は８細胞期胚の内部細胞塊から樹立される、多分化能と自己複製能をもつ細胞株である。例えば、卵透明帯を溶解したラット胚盤胞を、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含有する培地を用いてマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦＦ）フィーダー上で培養し、７～１０日後に胚盤胞から形成されるアウトグロウス（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を分散し、これをＭＥＦフィーダー上に移して培養し、約７日後、ＥＳ細胞が出現する。ラットＥＳ細胞の作製については、例えばＫ．Ｋａｗａｈａｒａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２０１５；７（７）：１０５４－１０６３に記載されている。
　ｉＰＳ細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む）に、ある特定のリプログラミング因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３～５週間でコロニーを生成することができる。リプログラミング因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；或いは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ　１２６：６６３－６７６（２００６）；ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８：１９１７－１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１８，６００－６０３（２００８））。培養例は、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（例えば約１０４～１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３１：８６１－８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ－１２培地、それらの混合培地などであり、ＥＳ細胞用培地は、マウスＥＳ細胞用培地、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）などを使用することができる。
３．非ヒト動物
　本発明は、第三の態様において、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されており、上記Ｄ領域の改変配列が、
　（１）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く前記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列がＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
　（２）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメなどの脊椎動物由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
　（３）上記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
ことを特徴とし、かつ内在性免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子若しくは遺伝子座が破壊されている、非ヒト動物を提供する。
　本発明は、上記非ヒト動物の別の態様において、上記セクション１に記載した哺乳動物人工染色体ベクターを含み、かつ内在性免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子若しくは遺伝子座が破壊されている非ヒト動物を提供する。
　本明細書中の「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除く、サル、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ科動物などの有蹄類などの哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
[非ヒト動物の作製]
　例えば哺乳動物人工染色体ベクターを介する技術、ジーンターゲティング技術、ゲノム編集技術、及び／又は顕微注入技術などの手法によって、上記ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの分化多能性細胞に、或いは、生殖細胞、卵母細胞、精原細胞などの全能性細胞に、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン遺伝子座（「改変Ｉｇ－ＮＡＣ」）を導入することによって、ヒト免疫グロブリンを産生可能にする非ヒト動物を作製することができる。
　そのような非ヒト動物では、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖κ、λ遺伝子座に対応する内在遺伝子座が破壊（若しくは、ノックアウト）されていること、並びに、必要に応じて、非ヒト動物のゲノム上の破壊された内在遺伝子座に、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座、及びヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座に相当する各外来ＤＮＡを挿入（若しくは、ノックイン）することができる。破壊の方法には、例えばジーンターゲティング法、ゲノム編集などの技術を使用することができる。
　ジーンターゲティング法では、上記内在遺伝子座を破壊するための、或いは、さらに上記内在遺伝子座に代えて上記外来ＤＮＡを置換／挿入（若しくは、ノックイン）するための、ターゲティングベクターを構築する。内在遺伝子座を破壊する、及び外来ＤＮＡを挿入するためのベクターは、内在遺伝子座の５’側上流配列（約２．５ｋｂ以上）及び３’側下流配列（約２．５ｋｂ以上）を含み、これらの配列間に例えば外来性薬剤耐性遺伝子配列、又は、破壊すべき内在遺伝子座を置換するための上記外来ＤＮＡ配列を含むことができる。薬剤耐性遺伝子は、例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などである。
　ゲノム編集では、上記の通り、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質と約２０塩基対標的配列をもつガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて細胞内でこれらを共発現させることにより、ｇＲＮＡが標的配列近傍のＰＡＭ配列を認識して標的ゲノムＤＮＡと特異的に結合し、Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列の５’側上流で二本鎖切断を誘導することができる。この技術を用いることによって、非ヒト動物の抗体重鎖及び軽鎖遺伝子座を切断除去することができるし、或いは、さらに上記切断部位に、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座、及びヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座に相当する各外来ＤＮＡを含むベクターを用いて該外来ＤＮＡを挿入（若しくは、ノックイン）することができる。
　上記の目的の外来ＤＮＡを含むベクターを、非ヒト動物由来のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に導入し、該動物由来の上記内在遺伝子座を破壊し、並びに、目的の上記ＤＮＡ配列をゲノム上に挿入することができる。目的の外来ＤＮＡが挿入されたことの確認は、挿入配列に基づいて作製されたフォワード及びリバースプライマーを使用するＰＣＲ法による増幅産物の同定によって行うことができる。上記外来ＤＮＡ配列が挿入されたＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を仮親非ヒト動物の初期胚に顕微注入し、キメラ非ヒト動物を作製することができる。
　上記内在遺伝子座が破壊された非ヒト動物は、例えば、上記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むキメラ非ヒト動物若しくはその子孫動物と、対応する内在遺伝子をクラスターごと欠失させたキメラ動物若しくは子孫動物とを交配させて得られた該内在遺伝子がヘテロに欠失した動物同士をさらに交配させることによって作出することができる。
　本発明の非ヒト動物の例は、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座を含む非ヒト動物又は上記人工染色体ベクターを含む非ヒト動物、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含む非ヒト動物又は上記人工染色体ベクターを含む非ヒト動物、或いは、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座、及びヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含む非ヒト動物又は上記人工染色体ベクターを含む非ヒト動物である。
　非ヒト動物は、好ましくは、上記マウス人工染色体ベクターを含む、マウスやラットなどの齧歯類である。
　以下において、マウス人工染色体（ＭＡＣ）ベクターを利用する非ヒト動物の作製例について説明する。
　部位特異的組み換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰ又はＦＲＴ）を導入して改変されたヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座を含む動物細胞（例えばニワトリＢ細胞株ＤＴ４０）、及び部位特異的組み換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰ又はＦＲＴ）を導入して改変されたヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含む動物細胞（例えばＤＴ４０）のそれぞれを、細胞融合法によりマウス人工染色体（ＭＡＣ）ベクターを含む齧歯類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））に移入したのち、部位特異的組み換え酵素（例えばＣｒｅ又はＦｌｐ）の作用又は該酵素の発現誘導により、ヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む齧歯類細胞、並びにヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む齧歯類細胞を作製することができる。
　一方、動物細胞（例えばＤＴ４０）に保持されるヒト１４番染色体上のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の近傍に部位特異的組み換え酵素の認識部位（例えばｌｏｘＰ又はＦＲＴ）を導入したのち、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む動物細胞を、細胞融合法によりＭＡＣベクターを含む齧歯類細胞（例えばＣＨＯ）と融合して、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むＭＡＣベクター（上記の「改変Ｉｇ－ＮＡＣ」）を含む齧歯類細胞を作製することができる。
　上記のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝座を含むＭＡＣベクターを含む齧歯類細胞、並びに上記のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子若しくは遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む齧歯類細胞のそれぞれを、微小核細胞融合法により、非ヒト動物（例えばマウス又はラット）分化多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞）と融合して、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む非ヒト動物（例えばマウス又はラット）分化多能性幹細胞、並びにヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む非ヒト動物（例えばマウス又はラット）分化多能性幹細胞を作製することができる。
　上記のヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む非ヒト動物（例えばマウス又はラット）分化多能性幹細胞、並びにヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む非ヒト動物（例えばマウス又はラット）分化多能性幹細胞のそれぞれを、Ｂ細胞欠損又は非欠損の非ヒト動物の初期胚（例えば８細胞期胚又は胚盤胞期胚）に移植して、上記ＭＡＣベクターのそれぞれを含むキメラ動物を作製する。該キメラ動物が内在性Ｂ細胞を保持する場合には、さらにキメラ動物を、マウス抗体重鎖、軽鎖κ及び軽鎖λ遺伝子座を欠損する（或いは、Ｂ細胞を欠損する）同種非ヒト動物（例えばマウス又はラット）と交配する。その後、目的の非ヒト動物を選別することにより、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座を含むＭＡＣベクター、或いは、ヒト１４番染色体由来のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座とヒト２２番染色体由来のヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含む上記ＭＡＣベクターのそれぞれを含む非ヒト動物を作製することができる。
　或いはさらに、上記の２種の異なる子孫動物同士の交配により、上記のヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域が改変されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ヒト免疫グロブリン軽鎖κ遺伝子座、及びヒト免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座を含むＭＡＣベクターを含む非ヒト動物（例えばマウス又はラット）を作製することができる。
　上記の方法によって作製される非ヒト動物においては、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子若しくは遺伝子座、並びに、ヒト免疫グロブリン軽鎖κ及びλ遺伝子若しくは遺伝子座に対応する全ての内在抗体遺伝子若しくは遺伝子座が破壊若しくはノックアウトされていることが好ましく、これによって該非ヒト動物においてヒト抗体のみを産生可能となる。
４．ヒト抗体の作製方法
　本発明はさらに、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターを含むセクション３に記載の非ヒト動物を用いてヒト抗体を産生し、該ヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体の製造方法を提供する。
　本明細書における「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のいずれのクラス及びサブクラスでもよい。そのようなクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥが含まれ、サブクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれる。これらのクラス及びサブクラスは、重鎖の違いによって分けることが可能であり、ＩｇＧ鎖は、γ鎖と称し、ＩｇＧ１～ＩｇＧ４に対応してγ１、γ２、γ３及びγ４鎖と称し、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥはそれぞれα鎖（α１及びα２）、μ鎖、δ鎖、ε鎖と称する。いずれの抗体の軽鎖にもκ鎖とλ鎖があり、免疫グロブリン遺伝子の再編成の過程でκ鎖遺伝子の再編成が不成功に終わるとλ鎖遺伝子の再編成が起こることが知られている。
　また、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、５’から３’に向けて、ＶＨ１，ＶＨ２．．ＶＨｍ（ここで、ｍは、例えば３８～４６である。）を含むＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ）領域遺伝子、ＤＨ１，ＤＨ２．．ＤＨｎ（ここで、ｎは、２３である。）を含むＤ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）領域遺伝子、ＪＨ１，ＪＨ２．．ＪＨｒ（ここで、ｒは、６である。）を含むＪ（ｊｏｉｎｉｎｇ）領域遺伝子、Ｃμ，Ｃδ，Ｃγ３，Ｃγ１，Ｃα１，Ｃγ２，Ｃγ４，Ｃε，Ｃα２を含むＣ（ｃｏｎｓｔａｎｔ）領域遺伝子を含むが、本発明では、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域遺伝子は、上記セクション１の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）の組み合わせからなる改変配列として記載の合成Ｄ領域ヌクレオチド配列による置換を含む。
　上記非ヒト動物では、上記のヒト免疫グロブリン遺伝子の再編成を介して産生される抗体が、従来のヒト抗体では定常的に作製が困難であった例えばアミノ酸数１８～５０若しくはそれ以上の超長鎖（ｕｌｔｒａｌｏｎｇ）ＣＤＲＨ３を含むヒト抗体が産生されうる。このような超長鎖ＣＤＲＨ３を含むヒト抗体はヒトでの出現頻度が低いため、通常のモノクローナル抗体作製法では作製困難である。
　ヒト抗体分子は、２本のヒト抗体重鎖と２本のヒト抗体軽鎖からなり、各重鎖と各軽鎖は２つのジスルフィド結合によって結合されており、並びに、２本の重鎖は定常（Ｃ）領域で２つのジスルフィド結合によって結合された構造を有する。また、抗体分子の重鎖及び軽鎖の可変（Ｖ）領域にはそれぞれ、とりわけ変異の大きい部分が３箇所（超可変領域）あり、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ））と呼ばれており、重鎖可変領域の超可変領域はＮ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と呼ばれ、一方、軽鎖可変領域の超可変領域はＮ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と呼ばれている。このＣＤＲ領域の配列の違いにより抗体の抗原に対する結合特性が変化する。本発明により、ヒト免疫グロブリン遺伝子類の再編成によるヒト抗体の多様性が拡張される。
　本発明の非ヒト動物が産生する超長鎖（ｕｌｔｒａｌｏｎｇ）ＣＤＲＨ３を含むヒト抗体は、長い（β－ｒｉｂｂｏｎ）ＳｔａｌｋとＫｎｏｂからなる構造を有しており、Ｋｎｏｂにはループと複数のジスルフィド結合が存在する（Ｊ．Ｄｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１９；１０：Ａｒｔｉｃｌｅ　５５８；Ｊ．Ｋ．Ｈａａｋｅｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２０１８；９：Ａｒｔｉｃｌｅ１　２６２）。
　本発明の方法によって得ることが可能である抗体は、抗体重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸長が１８以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上、又は５０以上となるような超長鎖（ｕｌｔｒａｌｏｎｇ）ＣＤＲＨ３を含むヒト抗体であるため、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスなどの病原性ウイルスや他の病原体（例えばマラリア原虫、トリパノソーマ原虫）を原因とする感染症を含む疾病に有効であると考えられる。上記ヒト抗体は、突出したＣＤＲＨ３領域で上記ウイルスや病原体の受容体のくぼみに結合する「カギ」型の相互作用を可能とするため治療上有用である。
　本発明の抗体は、複数種の抗体カクテルとすることも可能であり、治療だけでなく予防効果を増強するために使用することもできる。
　具体的な抗体作製法は、以下の方法を包含する。
　例えば、本発明の上記ヒト抗体産生非ヒト動物（例えばマウス又はラット）にＨＩＶエンベロープタンパク質などの標的抗原を免疫して該標的抗原と特異的に結合するポリクローナル抗体を作製することができる。
　或いは、上記動物に標的抗原を免疫し、抗原特異的抗体価が上昇した動物個体のＢリンパ球を用いてミエローマ細胞と融合しハイブリドーマ（不死化Ｂ細胞）を作製し、ハイブリドーマ上清中のヒトモノクローナル抗体について、抗原結合能評価のためのＥＬＩＳＡ解析、必要であればＨＩＶなどの感染評価により選抜を行い、広域中和抗体ヒトモノクローナル抗体を選択することができる。
　すなわち、本発明は、第四の態様において、上記セクション３に記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該非ヒト動物の血液から該標的抗原と結合する抗体を取得することを含む、抗体の作製方法を提供する。
　或いは、別の態様において、本発明はさらに、上記セクション３に記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該標的抗原と結合する抗体を産生する前記非ヒト動物から脾臓細胞又はリンパ節細胞を取得し、前記脾臓細胞又はリンパ節細胞とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマを形成し、該ハイブリドーマを培養して、前記標的抗原と結合するモノクローナル抗体を取得することを含む、抗体の作製方法を提供する。
　或いは、さらに別の態様において、本発明はさらに、上記セクション３に記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該標的抗原と結合する抗体を産生する前記非ヒト動物からＢ細胞を取得し、前記Ｂ細胞から抗体重鎖及び軽鎖、或いはそれらの可変領域、からなるタンパク質をコードする核酸を取得し、該核酸を用いてＤＮＡ組み換え技術又はファージディスプレイ技術によって前記標的抗原と結合する抗体（例えば、組み換え抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）など）を作製することを含む、抗体の作製方法を提供する。
　上記核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）又はＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）を含む。
　また、上記ｓｃＦｖは、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとをリンカーを介して結合して作製された組み換え抗体フラグメントである。
　ファージディスプレイ法では、ヒト抗体の可変領域を例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）又はＦａｂとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択する（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５；２３（９）：１１０５－１１１６）。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４；１２：４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５；２３（９）：１１０５－１１１６）。
　上記方法によって作製される抗体は、該抗体を含む血液（抗血清）や細胞上清などを、抗原物質を結合した担体や免疫グロブリンＧ結合性担体（例えばアガロースゲル、シリカゲル、など）を充填したカラムにアプライし、ついで、該担体に結合したヒト抗体を担体から溶出することを含むアフィニティクロマトグラフィーなどの手法によって回収、精製することができる。
　下記の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが本発明の技術的範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］ヒトＩｇＨＤ領域を削除したＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）構築
　ヒトＩｇＨＤ領域を削除したＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）を構築するために、ＤＨ領域を挟む２カ所（上流、下流）にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡを設計、評価、選定し、Ｉｇ－ＮＡＣを保持するＣＨＯ細胞内での２ヵ所切断によりＤＨ領域除去を実施、スクリーニングによりＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）保持ＣＨＯ細胞を取得した。
１．ｇＲＮＡ発現ベクターの構築及び活性評価による選定
　Ｃａｓ９とｇＲＮＡを発現するオールインワンベクターｅＳｐＣａｓ９（１．１）（Ａｄｄｇｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　＃７１８１４）をベースとして設計した候補ｇＲＮＡを発現するプラスミドを構築した。Ｉｇ－ＮＡＣを保持するＣＨＯ細胞に、メーカーのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でオールインワンベクターを導入した。導入した細胞からＰｕｒｅＧｅｎｅ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出しＣｅｌ－１　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＩＤＴ）で切断活性を確認し、活性の高かった以下のｇＲＮＡ配列のベクターを選択した。
　　gRNA Up3：5’-AGATCCTCCATGCGTGCTGT (GGG)-3’（配列番号４）
　　（ここでｇＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列（ＧＧＧ）を除く２０塩基の配列である。）
　　gRNA Down4：5’-CTGCGGCATGAACCCAATGC (AGG)-3’（配列番号５）
　　（ここでｇＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列（ＡＧＧ）を除く２０塩基の配列である。）
２．ＤＨ領域を削除したクローンの取得
　ｇＲＮＡ　Ｕｐ３（図中、「５’ｇｕｉｄｅ３」）とＤｏｗｎ４（図中、「５’ｇｕｉｄｅ４」）の各組み合わせでＤＨ領域の削除を実施した（図１）。各ｇＲＮＡのオールインワンベクター及びＣＭＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現ベクターを、メーカーのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、Ｉｇ－ＮＡＣ保持ＣＨＯ細胞（特許第６８６８２５０号公報）へ導入し、３日後にＥＧＦＰ／ｔｄＴｏｍａｔｏ共陽性の細胞をソーティングにより取得した。なお、ＥＧＦＰのシグナルはＩｇ－ＮＡＣを保持していることを示し、ｔｄＴｏｍａｔｏのシグナルはリポフェクションを受けたことを示す。共陽性細胞をさらに培養し、一回目のソーティングから８日後にＥＧＦＰ陽性かつｔｄＴｏｍａｔｏ陰性の細胞をシングルセルソーティングにより３８４ウェルプレートに回収した。増殖してきたクローンについてさらにスケールアップを行い、以下に示すようにスクリーニングを行った。
３．ＤＨ領域を削除したクローンのスクリーニング
　上記で取得した細胞について、ＰｕｒｅＧｅｎｅ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出したＤＮＡを鋳型に、以下のジャンクション確認、ＤＨ領域削除確認プライマーにてＰＣＲスクリーニングを行った。
　　JunctionプライマーF1：5’-TCCCACGGCCCAAGGAAGACAAGACACA-3’（配列番号６）
　　JunctionプライマーR1：5’-TCGAACACGCTCCTAGCATTGCACAGCC-3’（配列番号７）
　　欠損確認プライマーF1：5’-ACACCTGTCTCCGGGTTGTG-3’（配列番号８）
　　欠損確認プライマーR1：5’-AAGAAACGCAGGACGGTGGA-3’（配列番号９）
　　欠損確認プライマーF2：5’-CAGCAGCCACTCTGATCCCA-3’（配列番号１０）
　　欠損確認プライマーR2：5’-CTGGTGGACTCTACGGCGAA-3’（配列番号１１）
　　欠損確認プライマーF3：5’-GGGACCCTCAAGGTGTGAAC-3’（配列番号１２）
　　欠損確認プライマーR3：5’-AGGGTGCTTGGGTCCTGTTA-3’（配列番号１３）
　　欠損確認プライマーF4：5’-ACAAGCCAGGGAGCTGTTTC-3’（配列番号１４）
　　欠損確認プライマーR4：5’-TCAAGAAATCCGAGGCGACA-3’（配列番号１５）
　酵素はＫＯＤ　ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、反応条件は９８℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃９０秒を３５サイクル行った。全ての組み合わせで得られたクローン計３８１クローンのうち、３５クローンでＤ領域の除去を確認した。その後Ｉｇ－ＮＡＣ上のＤＨ以外の抗体遺伝子領域の存在確認ＰＣＲについては、特許第６８６８２５０号公報）に記載の方法で行い、候補Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）クローンを選定した。
４．Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）の構造確認
　Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）が宿主染色体に組み込まれず独立して維持されていること、期待された構造を保っていることを確認するために特許第６８６８２５０号公報に記載の方法でＦＩＳＨ解析を行った結果、宿主染色体とは独立して１コピーのＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）が保持されたＣＨＯ細胞の取得を確認し（図２）、この細胞クローンをＴＦ７－Ｂ１０と名付けた。
[実施例２]Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）に合成Ｄ領域を導入するためのアクセプター部位の挿入
　実施例１で作製したＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）において削除されたＤＨ領域に、ゲノム編集及び相同組み換えを利用して、アクセプター部位を挿入することにより、化学合成したＤＨ領域を導入することを可能とする。そのために、Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のＤＨ領域削除部位の前後の配列（Ｖ領域側：ＨＲＡ、Ｊ断片側：ＨＲＢ）及び、Ｂｘｂ１　ａｔｔＢ、Ｂｘｂ１　ａｔｔＰ、ΦＣ３１　ａｔｔＢ、Ｒ４　ａｔｔＢ（特許第６８６８２５０号公報）（それぞれの配列は下記の通り）、ＣＡＧプロモーター（ｐＲＰ[Ｅｘｐ]－ＣＡＧ＞ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ社にて合成）、ブラストサイジン耐性遺伝子（富士フィルム和光純薬）、Ｆｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子（ｐＳＥＬＥＣＴ－ｚｅｏ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）が図４の通り配置されたＨＤＲベクターを以下に示す手順で作製した。
　　ＨＲＡ：（配列番号１６）
GACCTGAGAGCCGCTCCCTGAAGTGTCCCCATTGGGAAGGATGGGGCCTGTGTCTCCAGGCTCTGGGAGGACAGAATCCTGACCTCAACAGTGGCCGGCACGGACACAACTGGCCCCATCCCGGGGACGCTGACCAGCGCTGGGCAACTTTTCCCTTCCCCGACGACTGAGCCCCGAGCACCCTCCCTGCTCCCCTACCACCTCCCTTTACAAGGCTGTGGCCTCTGCACAGATGATAATGGAGCTTGGCTCATTCCCCTAGAGTCGGTAGGGAGTTAAGGACAAAACTCAGTTTCCTCCACCTGAACTCAAGTCTGCCTATGTTTACCTAATCACACCTGGTGGACAGTTTGGACAAACTTGCACACTCAGAGACACAGACACTTCTAGAAATCATTATCTCCCTGCCCCGGGGACCCCACTCCAGCAGAAGTCTGCTAGGCACTGGCCTGGGCCCTCCTGCTGTCCTAGGAGGCTGCTGACCTCCTGCCTGGCTCCTGTCCCCAGGTCCAGAGTCAGAGCAGACTCCAGGGACGCTGCAGGCTAGGAAGCCGCCCCCTCCAGGCGAGGGTCTAGTGCAGGTGCCCAGGACAAGAAAGATTGTGAATGCAGGAATGACTGGGCCACACCCCTCCCGTGCACGCCCCCTCCTGCCCTGCACCCCACAGCCCAGCCCCCCGTGCTGGATGCCCCCCCACAGCAGAGGTGCTGTTCTGTGATCCCCTGGGAAAGACGCCCTCAACCTCCACCCTGTCCCACGGCCCAAGGAAGACAAGACACAGGCCCTCTCCTCACAGTCTCCCCACCTGGCTCCTGCTGGGACCCTCAAGGTGTGAACAGGGAGGATGGTTGTCTGGGTGGCCCCTAGGAGCCCAGATCTTCACTCCACAGACCCCAACCCAAGCACCCCCTTCTGCAGGGCCCAGCTCATCCCCCTCCTCCTCCCTCTGCTCTCCTCT
　　ＨＲＢ：（配列番号１７）
CTCACTGAAGGCAGCCTCAGGGTGCCCAGGGGCAGGCAGGGTGGGGGTGAGGCTTCCAGCTCCAACCGCTCCACTAGCCGAGACTAAGGAAGTGAGAGGCAGCCAGAAATCCAGACCATTCCATAGCAAATGGATTTCATTAAAGTTACCAGACTTCAGTGTAAGTAACATGAGCCCCATGCACAACAATCCCTTATGAAGGGGAAGTCAGTGTCGCCTCGGATTTCTTGAAAAACACAAAAACTTATCAATGCCTGTAAAAGTCTGTTGGAAAGAAAATATGATTCAAGAATGTTATGCCCAACAAAGCTGGCATATTTTCTACCCGGACACACTCAGGGAATGTGGTCCCTTGAGTGCTTCTCTCACTGCGTAAATCCTACGTGGTGTTTAAGCATATTCATAAATGTGTATGTCTATTTTTATGTGTAAGATGGTTCATTTTTATTTTATTTATTCAATATGTACAATAAAGAATATTGACAAATAGGCTGGACATGGTGGCTCCCACCTGTAATCCCAGCCCTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCAGATCACCTGAGGTCTGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGATGAAAACCCATCTCTACTAAAAATACAAAGATTAGCCAGGCATGGTGGTGCATGCCTGTAATCCCAGCCACTCAGGAGGCTGAGACAGGAGAAATGCGTGAACCCGGAAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCACTCCAGCCTGGCGACAGAGCAAGATTCCATCTCAAAAAAAAAAAGACAAAGAAATTTGTTTTTTTGAATAAAGACAAATTTCATCACACGAAGATAAAGATGCAAAGCTCCAGACAGGAAGGCACGGACAGCACAGTGAAGCCCGGAGCGGGCGCTGGGGGGCCAGGGGCATGGCGGGGGTGCCAGCGTCTCTCGGTGCCTACCATGGCCACTCCAGCCTGTGTTCTCACGAGGATGGCTGTGT
　　Ｂｘｂ１　ａｔｔＢ：（配列番号１８）
TGGCCGTGGCCGTGCTCGTCCTCGTCGGCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCCGGGCCAC
　　Ｂｘｂ１　ａｔｔＰ：（配列番号１９）
TATGGCCGTGATGACCTGTGTCTTCGTGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACCCA
　　ΦＣ３１　ａｔｔＢ：（配列番号２０）
GATGTAGGTCACGGTCTCGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCTCACCCATCTGGTCCATCATGATGAACGGGTCGAGGTGGCGGTAGTTGATCCCGGCGAACGCGCGGCGCACCGGGAAGCCCTCGCCCTCGAAACCGCTGGGCGCGGTGGTCACGGTGAGCACGGGACGTGCGACGGCGTCGGCGGGTGCGGATACGCGGGGCAGCGTCAGCGGGTTCTCGACGGTCACGGCGGGCAT
　　Ｒ４　ａｔｔＢ：（配列番号２１）
GCGCCCAAGTTGCCCATGACCATGCCGAAGCAGTGGTAGAAGGGCACCGGCAGACAC
１．ＣＡＧプロモーター保持ベクターへのＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子の挿入
　ＨＤＲベクターをＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）保持ＣＨＯ細胞へ挿入した際に、目的の相同組み換え以外のランダムインテグレーションによる挿入が起きた細胞を選択的に死滅させるために、ネガティブ選択マーカーであるＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子を挿入した。ｐＳｅｌｅｃｔ－ｚｅｏ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）ＤＮＡから下記プライマー、及び条件を用いてＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子をＰＣＲ増幅して得た。
　　Fcy-fur-F1：5’-CATGAATCTAGAAGTGCAGGTGCCAGAACATT-3’（配列番号２２）
　　fur-BspH1-R1：5’-CATGAATCATGACCCCCTGAACCTGAAACATA-3’（配列番号２３）
　１００ｎｇ／μＬのｐＳｅｌｅｃｔ－ｚｅｏ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒプラスミドＤＮＡ（０．１μＬ）をテンプレートとして、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、反応条件：９８℃，１０秒；６０℃，５秒；６８℃，１３秒で３５サイクルのＰＣＲを行った。
　ＰＣＲ後Ｆｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子をアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を精製したのち、制限酵素ＢｓｐＨＩ（ＮＥＢ）及びＸｂａＩ（ＮＥＢ）で両端を切断した。ＣＡＧプロモーターが入ったプラスミドＤＮＡ　ｐＲＰ［Ｅｘｐ］－ＣＡＧ＞ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ社にて合成）中の制限酵素ＡｆｉＩＩＩ（ＮＥＢ）及びＸｂａＩ（ＮＥＢ）切断部位へ上記Ｆｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子を挿入してプラスミドＣＡＧ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを得た（図３）。
２．ＣＡＧプロモーターとＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子間にΦＣ３１ａｔｔＢ及びＨＲＢを挿入したベクタープラスミドＣＡＧ－ΦＣ３１－ＨＲＢ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒの作製
　上記１．で作製したプラスミドＣＡＧ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒに化学合成ＤＮＡを導入する際に使用する、ΦＣ３１　ａｔｔＢ及びＨＲＢが入ったプラスミドＤＮＡ、ｐＨＲＢはユーロフィンジェノミクス株式会社にて合成した。このプラスミドを制限酵素ＸｂａＩで切断した。プラスミドＣＡＧ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを制限酵素ＸｂａＩで切断し、ＣＡＧプロモーターとＦｃｙ：：ｆｕｒ遺伝子間に、ＸｂａＩで両端を切断したｐＨＲＢ由来断片を挿入してプラスミドＣＡＧ－ΦＣ３１－ＨＲＢ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを得た（図３）。
３．ＨＤＲベクタープラスミドの作製
　上記２．で作製したプラスミドＣＡＧ－ΦＣ３１－ＨＲＢ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒに、ＨＲＡ及び部位特異的組み換え酵素サイトＲ４　ａｔｔＢ、Ｂｘｂ１　ａｔｔＢ、Ｂｘｂ１　ａｔｔＰ、ブラストサイジン耐性遺伝子を導入するためのプラスミドＤＮＡ、ｐＨＲＡはユーロフィンジェノミクス社にて合成した。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＳｐｅＩで切断した。プラスミドＣＡＧ－ΦＣ３１－ＨＲＢ－Ｆｃｙ：：ｆｕｒを制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＳｐｅＩで切断し、ＣＡＧの上流側にプラスミドＨＲＡ由来の２４３７ｂｐ断片を挿入してＨＤＲベクターを得た（図４）。
４．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）の切断
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により、標的部位において２箇所のＤＮＡ二重鎖切断を起こすことで、効率的な相同組み換えが可能となる。Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）上のＤＨ領域削除部位付近の２箇所（標的）にガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ａ１及びｇＲＮＡ－Ｂ１を設計した。
　　gRNA-A1：GGGCCCAGGCGCCGTTTAAT AGG　（配列番号２４）
　　（ここでｇＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列（ＡＧＧ）を除く２０塩基の配列である。）
　　gRNA-B1：TGCCGCAGAGTGCCAGGTGC AGG　（配列番号２５）
　　（ここでｇＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列（ＡＧＧ）を除く２０塩基の配列である。）
　これらのｇＲＮＡからＣａｓ９が認識するＮＧＧを除き、制限酵素ＢｂｓＩ認識配列を付加したオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。さらにこれらのオリゴＤＮＡをアニーリング後、制限酵素ＢｂｓＩ（ＮＥＢ）で切断したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢｂｓＩで切断したＣａｓ９発現ベクター（ｐｘ３３０、ａｄｄｇｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ ＃４２２３０）にクローニングした。得られた大腸菌コロニーを下記プライマー、及び条件を用いてＰＣＲすることにより、オリゴＤＮＡの挿入の有無を確認した。フォワードプライマーはＵ６Ｆを使用した。リバースプライマーはｇＲＮＡ－Ａ１確認用としてｇＲＮＡ－Ａ１Ｒ、ｇＲＮＡ－Ｂ１確認用としてｇＲＮＡ－Ｂ１Ｒを使用した。
　　U6F：GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC　（配列番号２６）
　　gRNA-A1F：CACCGGGGCCCAGGCGCCGTTTAAT　（配列番号２７）
　　gRNA-A1R：AAACATTAAACGGCGCCTGGGCCCC　（配列番号２８）
　　gRNA-B1F：CACCGTGCCGCAGAGTGCCAGGTGC　（配列番号２９）
　　gRNA-B1R：AAACGCACCTGGCACTCTGCGGCAC　（配列番号３０）
　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、タカラバイオ）を使用し、反応条件：９８℃，２分，１回→９８℃，１０秒；６０℃，秒；６８℃，１３秒で３５回サイクルのＰＣＲを行った。
　ＰＣＲ後２％アガロースゲル電気泳動により、３３０ｂｐ付近に目的のバンドが得られたコロニーを液体ＬＢ培地及びアンピシリン１００μＬ／ｍＬで培養し、（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅ、タカラバイオ）を用いてプラスミドＤＮＡ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ発現ベクターＡ１、Ｂ１）を得た。
５．Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）へのＨＤＲベクター挿入
　Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを使用するゲノム編集により、ＨＤＲベクターをＣＨＯ細胞中のＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）のＤＨ領域削除部位付近に挿入した（図５）。ＨＤＲベクターとＣａｓ９－ｇＲＮＡ発現ベクターＡ１、Ｂ１を、実施例１で作製したＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）を保持するＣＨＯ細胞クローンＴＦ７Ｂ１０を用いてエレクトロポレーション法を実施して導入した。ＣＨＯ細胞ＴＦ７Ｂ１０をトリプシン処理し、１×１０７個／ｍＬになるようにＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で懸濁してから、５μｇ　のＨＤＲベクター、２．５μｇ　のｇＲＮＡ－Ａ１、２．５μｇのｇＲＮＡ－Ｂ１存在下でＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。細胞をエレクトロポレーション後９６穴プレート３枚へ播種し、４８～７２時間後に８００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（富士フィルム和光純薬）と１６００μｇ／ｍＬブラストサイジン（富士フィルム和光純薬）、１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ）を含むＦ１２培地で培養し、培養開始８４～９６時間後に１６００μｇ／ｍＬブラストサイジン、２００μＭ　５ＦＣ（東京化成工業）、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養し、薬剤耐性クローンを取得した。
６．ＰＣＲ解析
　単離した薬剤耐性クローンを培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、相同組み換え特異的なプライマー３種（下記）、及びＩｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種（特許第６８６８２５０号公報）を用いてＰＣＲ解析により、相同組み換え特異的なバンドが得られた１株（ＴＦ７Ｂ１０－７４）を選定した。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃２分を１サイクル行ったのち、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長は６８℃で、増幅断片の長さ５００ｂｐ以下の場合５秒、５００ｂｐ以上の場合１００秒／ｋｂのサイクルを３５サイクル行った。
　　HRAprimerF1：5’-GAACTGACCGTCTGCTCCA-3’（配列番号３１）
　　Bxb1attBF1：5’-TGCCGAAGCAGTGGTAGAAG-3’（配列番号３２）
　　ΦC31F1：5’-GGGCAACGTGCTGGTTATTG-3’（配列番号３３）
　　HRAprimerR1：5’-GTGCCCTTCTACCACTGCTTC-3’（配列番号３４）
　　Bxb1attPR1：5’-AGAGTGAAGCAGAACGTGGG-3’（配列番号３５）
　　HRBR1：5’-TGCTTTTTCGCAACCATGGG-3’（配列番号３６）
　表１において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実施例３］Ｂｘｂ１リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによるブラストサイジン耐性遺伝子の除去
　化学合成ＤＮＡをＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）上に導入する際に、目的部位で導入されているか否かをブラストサイジン耐性の有無で判断するため、相同組み換えによって挿入したブラストサイジン耐性遺伝子を除去する必要がある。ＨＤＲベクターに示している通り、ブラストサイジン耐性遺伝子はＢｘｂ１　ａｔｔＢ及びＢｘｂ１　ａｔｔＰの間に位置しており、Ｂｘｂ１リコンビナーゼを細胞に導入することによってＢｘｂ１　ａｔｔＢ－ａｔｔＰ間で部位特異的組み換え反応が起こり、ブラストサイジン耐性遺伝子の除去が可能である（図６）。
１．Ｂｘｂ１リコンビナーゼ遺伝子導入によるブラストサイジン耐性遺伝子の除去
　方法は、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター（特許第６８６８２５０号公報）を実施例２で取得されたアクセプター部位挿入済みのＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）を保持しているＣＨＯ細胞ＴＦ７Ｂ１０－７４にエレクトロポレーション法により導入した。ＴＦ７Ｂ１０－７４細胞をトリプシン処理し、２×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１０μｇのＢｘｂ１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。細胞はエレクトロポレーション後１０ｃｍディッシュ１枚に播種した。５日後に細胞をトリプシン処理し、３８４穴プレート１枚あたり１５０個になるように細胞を播種した。３８４穴プレート播種後９日間８００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培養し、シングルクローンをピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｂｘｂ１部位特異的組み換え後特異的なプライマー２種、及びＩｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種（特許第６８６８２５０号公報）を用いてＰＣＲ解析を行った。Ｂｘｂ１部位特異的組み換え後特異的なプライマー２種のうち、ｐｒｉｍｅｒＨＲＡＦ１－Ｂｘｂ１ａｔｔＰＲ２では、部位特異的組み換え後２８００ｂｐ付近から１５００ｂｐ付近にバンドがシフトする。Ｂｘｂ１部位特異的組み換え後特異的なバンドが得られた２株（クローンＤ１、Ｊ２３）を選定した。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃２分を１サイクル行ったのち、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長は６８℃で、増幅断片の長さ５００ｂｐ以下の場合５秒、５００ｂｐ以上の場合１００秒／ｋｂのサイクルを３５サイクル行った。
　　HRAprimerF1：5’-GAACTGACCGTCTGCTCCA-3’（配列番号３１）
　　Bxb1attPR2：5’-GGGGCGTACTTGGCATATGA-3’（配列番号３７）
３．ブラストサイジン耐性確認
　Ｂｘｂ１部位特異的組み換え後特異的なバンドが得られた２株（クローンＤ１、Ｊ２３）に対して、８００μｇ／ｍＬＧ４１８と１６００μｇ／ｍＬブラストサイジン、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培養し、ブラストサイジン耐性の有無を確認した。２株中１株（クローンＤ１：ＴＦ７Ｂ１０－７４－Ｄ１）がブラストサイジン存在下で死滅した。
４．フルオレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、ヒト遺伝子特異的プローブｈｕｍａｎ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びマウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
　上述のＰＣＲ解析、ブラストサイジン耐性確認、ＦＩＳＨ解析の結果を表２に示した。表２において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○はＢｘｂ１組み換え陽性を、×はＢｘｂ１組み換え陰性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［実施例４］ＣＨＯ細胞ＨＰＲＴ（－）株への微小核形成法（ＭＭＣＴ）によるＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ／Ｂｓｒ－）導入
　実施例３でＢｘｂ１リコンビナーゼによるブラストサイジン耐性遺伝子除去が確認されたＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ／Ｂｓｒ－）を保持するＴＦ７Ｂ１０－７４－Ｄ１クローンは、ＦＩＳＨ解析によりＩｇ－ＮＡＣが独立保持されている一方で４倍体であることが分かった（表２）。この細胞は、化学合成ＤＮＡの導入プラットフォーム細胞として重要であるため、ＭＭＣＴによって、正常な２倍体であるＣＨＯ細胞ＨＰＲＴ（－）株にＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ／Ｂｓｒ－）を移入した。
１．ＭＭＣＴによるＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ／Ｂｓｒ－）のＣＨＯ細胞ＨＰＲＴ（－）株への移入
　４００ｎＭのパクリタクセル及び５００ｎＭのリバーシンを約２×１０８個のＴＦ７Ｂ１０－７４－Ｄ１から微小核を調製した。得られた微小核を４ｍＬの１×フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）－Ｐ（富士フィルム和光純薬）で懸濁した。約２×１０７個のレシピエントであるＣＨＯ細胞ＨＰＲＴ（－）株をトリプシン処理後ＤＭＥＭで３回洗浄後、微小核／ｐＨＡＰ懸濁液で置換し、３７℃１５分静置した。上清を除去し、ＰＥＧ溶液（２．５ｇ　ＰＥＧ１０００＜富士フィルム和光純薬＞、３ｍＬのＤＭＥＭ＜富士フィルム和光純薬＞、０．５ｍＬのＤＭＳＯ＜富士フィルム和光純薬＞）を２ｍＬ加えて室温で１分３０秒静置後、１０ｍＬのＤＭＥＭをゆっくり加えた。この後ＤＭＥＭで３回洗浄し、３７℃で温めた１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地１０ｍＬで懸濁し、１０ｃｍディッシュで培養した。細胞は、２４時間後にパッセージを行い、４８時間後に９６穴プレート４８枚に８００μｇ／ｍＬＧ４１８、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養した。約２週間後に出現した薬剤耐性コロニー２４個をピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例２で行ったＰＣＲ解析と同じプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ピックアップした２４個中１４個の細胞クローンで目的のバンドを確認することができた。
３．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認された１４個の細胞クローンから任意に６個選択し、ＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記載された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＦＩＳＨ解析を行った６個の細胞クローンにおけるＰＣＲ解析、ＦＩＳＨ解析の結果を表３に示した。表３において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○はＢｘｂ１組み換え陽性を示した。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出、Ｉｇ－ＮＡＣｘ２はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり２コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［実施例５］ΦＣ３１リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによるヒトミニマル化ＩｇＨＤを含む化学合成ＤＮＡの挿入
　ヒトＩｇＨＤ領域は、約４０．２ｋｂと大きいが、そのほとんどは抗体をコードするＤ断片以外の配列である。例えばＤ断片の１個目及び２個目の間には非抗体コード領域が約２５００ｂｐある。一方で９個目のＤ断片と１０個目の間は約１００ｂｐと短い。今回デザインしたヒトミニマル化ＩｇＨＤではＤ断片１－１から６－２６の前後にある非抗体コード領域１００ｂｐのみを残し、約７．８ｋｂと大幅にＤＮＡサイズを小さくした。ただし、断片間が１００ｂｐよりも短い場合は削除や付加を行っていない。また、Ｄ領域のみの改変を行うために実施例１で削除したＤ領域の削除部位に塩基の重複や削除なくＤ領域が隙間なく繋がるように合成ＤＮＡのデザインを行った（図７）。つまり、ＨＲＡより下流からＤ断片１－１までと、Ｄ断片６－２６からＨＲＢまでの配列はミニマル化せずに保持した。さらにΦＣ３１　ａｔｔＰを保持する化学合成ＤＮＡを作製することにより、実施例２で導入したアクセプター部位にあるΦＣ３１　ａｔｔＢとの間で部位特異的組み換えを起こすことが可能である。
　以下、化学合成ＤＮＡ組み換え部位であるΦＣ３１　ａｔｔＰ及びＲ４　ａｔｔＰ、ベクター導入の有無を確認するためのブラストサイジン耐性遺伝子、ヒトミニマル化ＩｇＨＤを保持するベクターの作製について記す。まずベクター配列を３分割したプラスミドＤＮＡヒト　ｍｉｎｉＡ、ヒトｍｉｎｉＢ、ヒトｍｉｎｉＣをそれぞれ化学合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。ここで、ヒトｍｉｎｉＡはＲ４　ａｔｔＰ及びＨＲＡより下流からＤ断片３－１０までを、ヒトｍｉｎｉＢはＤ断片４－１１より３－２２までを、ヒトｍｉｎｉＣはＤ断片４－２３よりＨＲＢまで及びΦＣ３１　ａｔｔＰ、ブラストサイジン耐性遺伝子をもつ。このヒトｍｉｎｉＡ，Ｂ，Ｃを保持するヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターを以下１．及び２．の手順（図８）で作製した。
１．ヒトｍｉｎｉＢへのヒトｍｉｎｉＡ断片の挿入
　ヒトｍｉｎｉＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断した。同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したヒトｍｉｎｉＢにｍｉｎｉＡを挿入することにより、Ｒ４　ａｔｔＰ－ＨＲＡ／１－１＿３－２２を得た。
２．Ｒ４　ａｔｔＰ－ＨＲＡ／１－１＿３－２２へのヒトｍｉｎｉＣ断片の挿入
　ヒトｍｉｎｉＣを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断した。同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断したＲ４　ａｔｔＰ－ＨＲＡ／１－１＿３－２２にヒトｍｉｎｉＣ断片を挿入することにより、ヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターを構築した。
３．ΦＣ３１リコンビナーゼによるヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターの導入
　実施例４で構築した化学合成ＤＮＡの導入プラットフォーム細胞にあるΦＣ３１　ａｔｔＢとヒトミニマル化ＩｇＨＤベクター上にあるΦＣ３１　ａｔｔＰとの間で部位特異的組み換えを起こすことが可能である（図９）。方法としては、ΦＣ３１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター（特許第６８６８２５０号公報）及びヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターを、化学合成ＤＮＡの導入プラットフォーム搭載Ｉｇ－ＮＡＣ保持ＣＨＯ細胞１－１０（実施例４）にエレクトロポレーション法により導入した。１－１０細胞をトリプシン処理し、３×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１μｇのΦＣ３１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターΦＣ３１ｐＥＦ１（特許第６８６８２５０号公報）及び３μｇのヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。パルス後３８４穴プレート２枚に播種した。細胞は４８～７２時間後に８００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８、８００μｇ／ｍＬブラストサイジン、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養した。１１日後にブラストサイジン耐性があった２４クローンをピックアップした。
４．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、ΦＣ３１部位特異的組み換え後特異的なプライマー１種、及びヒトミニマル化ＩｇＨＤ内に作製したプライマー２種、Ｉｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種を用いてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃２分を１サイクル行ったのち、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長は６８℃で、増幅断片の長さ５００ｂｐ以下の場合５秒、５００ｂｐ以上の場合１００秒／ｋｂのサイクルを３５サイクル行った。
　　BsdR1：5’ - ATGCAGATCGAGAAGCACCT - 3’（配列番号３８）
　　2-8to3-9F：5’ - AACGCACCAGACCAGCAGAC - 3’（配列番号３９）
　　4-11to5-12R：5’ -GACGTGGGGCCTAGAGGCT - 3’（配列番号４０）
　　3-22to4-23F：5’ - CAGGCGGGGAAGATTCAGAA- 3’（配列番号４１）
　　4-23to5-24R：5’ - TAGAGAGCCTGGGCCTAGAG- 3’（配列番号４２）
５．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認された３クローンに対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＦＩＳＨ解析を行った３個の細胞クローンにおけるＰＣＲ解析、ＦＩＳＨ解析の結果を表４に記した。
　表４において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出、Ｉｇ－ＮＡＣｘ２はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり２コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
［実施例６］Ｒ４リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによる一部配列除去
　Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）上に導入した配列の内、ＣＡＧプロモーターやブラストサイジン耐性遺伝子などは抗体遺伝子の発現に不要となる配列である。これらの配列は、Ｒ４　ａｔｔＢ及びａｔｔＰに挟まれており、Ｒ４リコンビナーゼを細胞に導入することによってＲ４　ａｔｔＢ－ａｔｔＰ間で部位特異的組み換え反応が起こり、除去することが可能である（図１０）。
１．Ｒ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター導入
　Ｒ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター（特許第６８６８２５０号公報）を、ヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターの挿入が確認されており、かつ１本のＩｇ－ＮＡＣ保持率が高かったＣＨＯ細胞１－１０　ｐＥＦＩ－８（実施例５）にエレクトロポレーション法により導入した。１－１０　ｐＥＦＩ－８細胞をトリプシン処理し、３×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１０μｇのＲ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。細胞はパルス後１０ｃｍディッシュ１枚に播種した。２４～４８時間後に細胞をトリプシン処理し、３８４穴プレート１枚あたり１５０個になるように細胞を播種した。３８４穴プレート播種後２週間８００μｇ／ｍＬＧ４１８、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培養し、シングルクローンを２４個ピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なプライマー１種、及びヒトミニマル化ＩｇＨＤ内に作製したプライマー２種、Ｉｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種を用いてＰＣＲ解析を行った。Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なプライマーを用いてＰＣＲしたところ、Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なバンドが得られた６株を選定した。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃２分を１サイクル行ったのち、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長は６８℃で、増幅断片の長さ５００ｂｐ以下の場合５秒、５００ｂｐ以上の場合１００秒／ｋｂのサイクルを３５サイクル行った。
　　R4attLF2：5’ -CCCTCAAGGTGTGAACAGGG- 3’（配列番号４３）
　　R4attLR2：5’ -CTGGAGGGAGGCATGTTCTG- 3’（配列番号４４）
３．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認された６個の細胞クローンに対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＦＩＳＨ解析を行った６個の細胞クローンにおけるＰＣＲ解析、ＦＩＳＨ解析の結果を表５に示した。
　表５において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
［実施例７］マウスＥＳ細胞株への微小核形成法（ＭＭＣＴ）によるヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ導入
　実施例６でＰＣＲ及びＦＩＳＨ解析によりＲ４部位特異的組み換えが起きたことが確認された６クローンから任意に選択した２クローン：Ｋ５（１－１０　ｐＥＦ１－Ｋ５）及びＭ２４（１－１０　ｐＥＦ１－Ｍ２４）を染色体供与細胞として用い、ＭＭＣＴ法を用いてマウスＥＳ細胞へのヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ移入を行った。
１．ＭＭＣＴ法を用いたマウスＥＳ細胞へのヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ移入
　染色体受容細胞としては、内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖遺伝子座の両アレルが破壊されているマウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株（ＸＯ）（特許第４０８２７４０号）を用いた。ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株の培養法はマイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地である１５％のＦＢＳ及び１％のヌクレオサイド、ペニシリンストレプトマイシン、Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ、Ｌ－グルタミンソリューション、２－メルカプトエタノール、ＬＩＦを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて３７度で培養した。まず、４００ｎＭのパクリタクセル及び５００ｎＭのリバーシンを約４×１０７個の１－１０　ｐＥＦ１－Ｋ５及び１－１０　ｐＥＦ１－Ｍ２４に加え、微小核を調製した。得られた微小核全量を５ｍＬのＤＭＥＭに懸濁、遠心により沈殿にした。５×１０６～４×１０６個（ＭＭＣＴ２日前に１０ｃｍディッシュ１／２を１０ｃｍｘ１に播種）のマウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株をトリプシンで分散させた後、ＤＭＥＭで３回洗浄し、５ｍＬのＤＭＥＭに懸濁したのち、微小核の沈澱上に加えた。１２００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を除いた。沈殿をタッピングによりよくほぐし、ＰＥＧ溶液（２．５ｇ　ＰＥＧ１０００＜富士フィルム和光純薬＞、３ｍＬのＤＭＥＭ＜富士フィルム和光純薬＞、０．５ｍＬのＤＭＳＯ＜富士フィルム和光純薬＞）０．５ｍＬを加えて３７度のウォーターバスで振り、９０秒後に１３ｍＬのＤＭＥＭをゆっくりと加え、１２００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を除き、沈殿を３０ｍＬのＥＳ細胞用培地に懸濁し、予めフィーダー細胞を播いた１０ｃｍディッシュ３枚に播種した。４８時間後から３５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えたＥＳ細胞用培地と交換し、この後、２日に１回同じ組成で培地交換を行った。１週間～１０日後に出現した薬剤耐性コロニー１４個をピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例５で行ったＰＣＲ解析と同じプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ピックアップした１４個中５個で目的のバンドを確認することができた。
３．核型解析
　６ｗｅｌｌで培養したＰＣＲ陽性クローンに関して０．０５μｇ／ｍＬのＭＡＳ（フナコシ）を加えて１時間３０分後トリプシン処理を行う。１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心後、０．０７４Ｍの塩化カリウム５ｍＬで懸濁し、２０分間静置した。カルノア処理を行った後に、標本を作成した。この標本に５０μＬの封入剤（ＳｌｏｗｆａｄｅＴＭ　Ｇｏｌｄ　ａｎｔｉｆａｄｅ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ）でＤＡＰＩ染色した。その後、マウス染色体の核型異常がないか確認した。このＰＣＲ解析、核型解析の結果を表６に記した。
　表６において、クローンごとのＰＣＲ及び核型解析の結果を示す。横列にクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
［実施例８］ヒトミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作製
　ヒト抗体産生を確認するためにヒトミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣマウスＥＳ細胞からキメラマウスを作製した。
　実施例７で得られたヒトミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を用いて、ジーンターゲティング、実験医学、１９９５の手法に従い、キメラマウスを作製する。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）、若しくは抗体遺伝子の欠損（Ｉｇｈ／Ｉｇκ　ＫＯ）若しくは低発現（Ｉｇｌ１　ｌｏｗ）を呈するＨＫＬＤマウスの雌雄交配により得られる桑実胚及び８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。胚を仮親に移植することで、キメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が得られる。
　ヒトミニマル化含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株４クローンを計２１１のＩＣＲ胚にインジェクションし、仮親６匹に移植した。その結果計５匹のＧＦＰ陽性キメラマウスが得られた。毛色によるキメラ率判定の結果、キメラ率は、５匹のキメラマウスについて１０～４０％であった。マウスＥＳ細胞株２クローンについては４６５個のＨＫＬＤ胚にインジェクションを実施し２７匹の仮親に移植した結果、１４匹のＧＦＰ陽性個体が得られた。毛色によるキメラ率判定の結果、キメラ率は、１４匹のキメラマウスについて５～５０％であった。
［実施例９］ΦＣ３１リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによるウシ化ヒトＩｇＨＤを含む化学合成ＤＮＡの挿入
　ウシにおいては、４０～７０アミノ酸長と非常に長いＣＤＲＨ３をもつ抗体が約１０％の頻度で観察される（Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ、１５３：１３７９－９３、２０１３）。長いＣＤＲＨ３は抗体分子表面から突き出た形を取り、タンパク質の折り畳みで隠されていたエピトープなど、通常の抗体の結合が困難な部位にも結合できる。この特徴をヒト抗体に取り入れるため、ヒトミニマル化ＤＨにおいて抗体のコード領域であるヒトＤ断片配列をウシＤ断片配列に置換することを行った。この時、ヒトＤ断片３－１０の位置にウシＤ断片８－２が該当するように置換した。ただし、ウシＤ断片の順序は変えていない。ウシのＤ断片数はヒトよりも少ないため、置き換えなかった３つのヒトＤ断片は前後１００ｂｐと共に削除した。このようにして（図１１）のようにウシ化ヒトＩｇＨＤをデザインした。
　このウシ化ヒトＩｇＨＤを実施例５と同様に３分割し、３分割したプラスミドＤＮＡウシｍｉｎｉＡ（ＨＲＡ、及びヒトＤ断片１－１から３－１０の領域に対応するウシＤ断片Ｂ１－１からＢ８－２を含む）、ウシｍｉｎｉＢ（ヒトＤ断片４－１１から３－２２の領域に対応するウシＤ断片Ｂ６－２からＢ５－４を含む）、ウシｍｉｎｉＣ（ヒトＤ断片４－２３から１－２６の領域に対応するウシＤ断片Ｂ６－４からＢ９－４、ＨＲＢ、ΦＣ３１　ａｔｔＰ、及びブラストサイジン耐性遺伝子を含む）を化学合成した（ユーロフィンジェノミクス）。このウシｍｉｎｉＡ，Ｂ，Ｃを保持するウシ化ヒトミニマル化ＩｇＨＤベクターを以下の手順１．、２．の通りで作製した（図１２）。
１．ウシｍｉｎｉＢへのウシｍｉｎｉＡ断片の挿入
　ウシｍｉｎｉＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断した。同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したウシｍｉｎｉＢにｍｉｎｉＡを挿入することにより、Ｒ４　ａｔｔＰ－ＨＲＡ／１－１＿３－２２（ＨＲＡ、及びウシＤ断片Ｂ１－１からＢ５－４を含む）を得た。
２．Ｒ４　ａｔｔＰ－ＨＲＡ／１－１＿３－２２へのウシｍｉｎｉＣ断片の挿入
　ヒトｍｉｎｉＣを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断した。同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断したＲ４　ａｔｔＰ－ＨＲＡ／１－１＿３－２２に断片ヒトｍｉｎｉＣを挿入することにより、ウシ化ヒトＩｇＨＤベクターを構築した。
３．ΦＣ３１リコンビナーゼによるウシ化ヒトＩｇＨＤベクターの導入
　実施例５の方法と同様に実施した。１－１０細胞（実施例４）をトリプシン処理し、３×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１μｇのΦＣ３１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターΦＣ３１ｐＥＦ１（特許第６８６８２５０号公報）及び３μｇのウシ化ヒトＩｇＨＤベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。パルス後３８４穴プレート２枚に播種した。細胞は４８～７２時間後に８００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８、８００μｇ／ｍＬブラストサイジン、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養した。１３日後にブラストサイジン耐性があった１６個ピックアップした。
４．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例５と同じプライマーを用いてＰＣＲ解析を実施した。
５．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認された１６個の細胞クローンから任意に選択した４クローンに対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
　ＦＩＳＨ解析を行った４個の細胞クローンにおけるＰＣＲ解析、ＦＩＳＨ解析の結果を表７に記した。
　表７において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出、Ｉｇ－ＮＡＣｘ２はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり２コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
［実施例１０］Ｒ４　リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによる一部配列除去
１．Ｒ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター導入
　実施例６と同様の方法で実施した。ウシ化ヒトＩｇＨＤベクターの導入が確認された１－１０　Ｃ４細胞（実施例９）をトリプシン処理し、３×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１０μｇのＲ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。細胞は、パルス後１０ｃｍディッシュ１枚に播種した。２４～４８時間後に細胞をトリプシン処理し、３８４穴プレート１枚あたり１５０個になるように細胞を播種した。３８４穴プレート播種後１７日間８００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培養し、シングルクローンを２２個ピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例６と同様のＲ４部位特異的組み換え後特異的なプライマー１種、及びヒトミニマル化ＩｇＨＤ内に作製したプライマー２種、Ｉｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種を用いてＰＣＲ解析を行った。Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なプライマーを用いてＰＣＲしたところ、Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なバンドが得られた３クローンを選定した。
３．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認された３クローンに対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＦＩＳＨ解析を行った３個の細胞クローンにおけるＰＣＲ解析、ＦＩＳＨ解析の結果を表８に示した。表８において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
［実施例１１］マウスＥＳ細胞株への微小核形成法（ＭＭＣＴ）によるウシミニマル化ＩｇＨＤ（ウシ化ヒトミニマル化ＩｇＨＤ）含有Ｉｇ－ＮＡＣ導入
１．ＭＭＣＴ法を用いたマウスＥＳ細胞へのウシミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ移入
　実施例１０でＰＣＲ及びＦＩＳＨ解析によりＲ４部位特異的組み換えが起きたことが確認された３クローンから任意に選択した２クローン：Ｇ１１（１－１０　Ｃ４－Ｇ１１）及びＬ２（１－１０　Ｃ４－Ｌ２）を染色体供与細胞として用いた。染色体受容細胞としては、内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖遺伝子座の両アレルが破壊されているマウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株（ＸＯ）（特許第４０８２７４０号公報）を用いた。実施例７と同様の方法で微小核を形成し、マウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株（ＸＯ）と融合し、細胞を１０ｃｍディッシュ３枚に播種した。４８時間後から３５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えたＥＳ細胞用培地と交換し、この後、２日に１回同じ組成で培地交換を行った。１週間～１０日後に出現した薬剤耐性コロニー２３個をピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例６で行ったＰＣＲ解析と同じプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ピックアップした２３個中１４個で目的のバンドを確認することができた。
３．核型解析
　実施例７と同様の方法を用いて、マウス染色体の核型異常がないか確認した。このＰＣＲ解析、核型解析の結果を表９に記した。核型解析をしたもののうち、マウス染色体が３９本かつＩｇ－ＮＡＣｘ１の保持率が高く、転座がない９クローンが得られた。表９において、クローンごとのＰＣＲ及び核型解析の結果を示す。横列にクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。表中、「転」はロバートソン転座が見られるものである。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［実施例１２］ウシミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作製
　ヒト抗体産生を確認するためにウシミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣ保持マウスＥＳ細胞からキメラマウスを作製した。
　得られたウシミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を用いて、ジーンターゲティング、実験医学、１９９５の手法に従い、キメラマウスを作製する。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）、若しくは抗体遺伝子の欠損（Ｉｇｈ／Ｉｇκ　ＫＯ）若しくは低発現（Ｉｇｌ１　ｌｏｗ）を呈するＨＫＬＤマウスの雌雄交配により得られる桑実胚及び８細胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。胚を仮親に移植することで、キメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が得られる。
　ウシミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞８クローンを計５９１個のＩＣＲ胚にインジェクションし、３２匹の仮親へ移植した結果、１８匹のＧＦＰ陽性個体が得られ、毛色によるキメラ率判定の結果、キメラ率は、１８匹のキメラマウスについて５～６０％であった。また、５クローンを計３８０個のＨＫＬＤ胚にインジェクションを実施し、２１匹の仮親に移植した結果、１３匹のＧＦＰ陽性個体が得られた。毛色によるキメラ率の判定の結果、キメラ率は、１３匹のキメラマウスについて５～８０％であった。
[実施例１３]ヒトミニマル化キメラマウス解析（Ｂ細胞解析、ＥＬＩＳＡ、ｃＤＮＡ調製）
　ヒトミニマル化キメラマウスからヒト抗体が産生されているかの評価として、Ｂ細胞分化解析、血漿中抗体濃度測定ＥＬＩＳＡ解析、脾臓からのｃＤＮＡ回収による遺伝子配列解析を行うことができる。
１．Ｂ細胞分化解析
　ＥＧＦＰ及びＢ細胞マーカーであるＢ２２０が共に陽性である細胞が検出できれば、抗体産生寄与によるＢ細胞分化が示され、抗体の機能性発現の間接的評価になる。キメラマウスから取得した末梢血をサンプルとして特許第６８６８２５０号公報に記載の方法でＢ２２０のフローサイトメトリー解析を行った結果、ＧＦＰ陽性の細胞集団のみならず、ＧＦＰ及びＢ２２０共陽性の集団が確認されたため、機能性抗体が発現していることが示された。個体ごとのＧＦＰ陽性率は最高で２８．１２％の個体が得られ、個体ごとのＧＦＰ及びＢ２２０共陽性率は２．３０％が最高であった。
２．ＥＬＩＳＡによる抗体発現解析
　キメラマウスから得られた血漿を用いて特許第６８６８２５０号公報に記載の方法で、マウスの抗体発現の有無確認も含め、マウス抗体（ｍγ、ｍμ、ｍκ、ｍλ）、ヒト抗体（ｈγ、ｈμ、ｈκ、ｈλ、ｈγ１、ｈγ２、ｈγ３、ｈγ４、ｈα、ｈε、ｈδ）の血漿中の濃度を測定する。
３．ヒト抗体の発現解析及び配列同定
　ヒト抗体産生マウス脾臓由来ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。特許第６８６８２５０号公報と同様に実施することで解析、評価した。脾臓は回収後ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で一晩４℃保存した後、溶液から取り出し－８０℃で保管した。ジルコニアビーズの入った耐圧チューブに１ｍＬのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を添加し、組織５０ｍｇを加える。装置で破砕（３０～４５秒程度）、組織が破砕されたことを確認した後、スピンダウン後、１ｍＬの上清を分取し、２００μＬのクロロフォルムを加え、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔを用いメーカープロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。
[実施例１４]ウシミニマル化キメラマウス解析（Ｂ細胞解析、ＥＬＩＳＡ、ｃＤＮＡ調製）
　ウシミニマル化キメラマウスからヒト抗体が産生されているかの評価として、Ｂ細胞分化解析、血漿中抗体濃度測定ＥＬＩＳＡ解析、脾臓からのｃＤＮＡ回収による遺伝子配列解析を行うことができる。
１．Ｂ細胞分化解析
　ＥＧＦＰ及びＢ細胞マーカーであるＢ２２０が共に陽性である細胞が検出できれば、抗体産生寄与によるＢ細胞分化が示され、抗体の機能性発現の間接的評価になる。キメラマウスから取得した末梢血をサンプルとして特許第６８６８２５０号公報に記載の方法でＢ２２０のフローサイトメトリー解析を行った結果、ＧＦＰ陽性の細胞集団のみならず、ＧＦＰ及びＢ２２０共陽性の集団が確認されたため、機能性抗体が発現していることが示された。個体ごとのＧＦＰ陽性率は最高で４０．３８％の個体が得られ、個体ごとのＧＦＰ及びＢ２２０共陽性率は３．２３％が最高であった。
２．ＥＬＩＳＡによる抗体発現解析
　キメラマウスから得られた血漿を用いて特許第６８６８２５０号公報に記載の方法で、マウスの抗体発現の有無確認も含め、マウス抗体（ｍγ、ｍμ、ｍκ、ｍλ）、ヒト抗体（ｈγ、ｈμ、ｈκ、ｈλ、ｈγ１、ｈγ２、ｈγ３、ｈγ４、ｈα、ｈε、ｈδ）の血漿中の濃度を測定する。
３．ヒト抗体の発現解析及び配列同定
　ヒト抗体産生マウス脾臓由来ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。特許第６８６８２５０号公報と同様に実施することで解析、評価した。脾臓は回収後ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で一晩４℃保存した後、溶液から取り出し－８０℃で保管した。ジルコニアビーズの入った耐圧チューブに１ｍＬのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を添加し、組織５０ｍｇを加える。装置で破砕（３０～４５秒程度）、組織が破砕されたことを確認した後、スピンダウン後、１ｍＬの上清を分取し、２００μＬのクロロフォルムを加え、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔを用いメーカープロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。
[実施例１５]ヒトミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウスレパトワ解析
１．ヒトミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡからのヒト抗体遺伝子重鎖領域クローニングと塩基配列決定
　ヒトミニマル化ＩｇＨＤを保持するキメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡについて下記プライマーによりＰＣＲを行い、ヒト抗体遺伝子重鎖可変領域を増幅した。陰性コントロールとして非キメラマウスＩＣＲより取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いた。
　定常領域用：
　　HIGMEX1-2：5’ - CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC - 3’（配列番号４５）
　可変領域用：
　　VH1/5BACK：5’ - CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG - 3’（配列番号４６）
　　VH4BACK：5’ - CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG - 3’（配列番号４７）
　　VH3BACK：5’ - GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG - 3’（配列番号４８）
　ＰＣＲは、定常領域用×可変領域用（３種）の組み合わせで９８℃１０秒、５９℃５秒、６８℃５秒を３５サイクルの条件で行った。全ての増幅産物は１．５％アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウム染色することにより検出した。その結果、全て組み合わせにおいて、期待される４７０ｂｐ付近に増幅産物が検出された。一方、陰性コントロールでは全てにおいて同じ位置に特異的増幅産物は検出されなかった。これらの増幅産物は、アガロースゲルより抽出した後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩを用いた制限酵素処理を行った。これをｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ部位にクローニングした。増幅産物の挿入されたプラスミドのうちＶＨ１ファミリー由来クローン、ＶＨ４ファミリー由来クローン、ＶＨ３ファミリー由来クローンに対してそれぞれシーケンスを実施し、増幅産物の塩基配列を決定した。
２．ヒトミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡからのヒト抗体遺伝子重鎖可変領域塩基配列の解析
　上記１．において決定した塩基配列について、各クローンにおいて使用されている既知の生殖系列Ｖ遺伝子（「Ｖ断片」という）、Ｄ遺伝子（「Ｄ断片」という）、Ｊ遺伝子（「Ｊ断片」という）の特定を行った。そのうち由来するＤ断片を特定できた２７クローンの結果を表１０に示す。また野生型Ｉｇ－ＮＡＣを保持するヒト抗体産生マウス（特許第６８６８２５０号公報）より取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いて同様の解析を行った１５クローンの結果を表１１に示す。
　その結果、キメラマウス脾臓Ｉｇμ－ｃＤＮＡにおけるＤ断片の使用は、ヒトミニマル型の２７クローンにおいて１３種のＤ断片が使用されているのに対して、野生型ヒト抗体産生マウスの１５クローンにおいては６種であり、またそのうちＤ断片３－１０を使用しているクローンが７クローンと偏りが観察された（図１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
［実施例１６］ウシミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウスレパトワ解析
　ウシミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡを用いて、実施例１５に示された方法でＰＣＲを行い、ヒト抗体遺伝子重鎖可変領域を増幅した。陰性コントロールとして非キメラマウスＩＣＲより取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いた。その結果、キメラマウス脾臓Ｉｇμ－ｃＤＮＡにおけるウシＤ断片の使用が示される。
　またウシＤ断片の使用を確認するため、以下に示すウシＤ断片特異的なプライマーを設計し用いた。陰性コントロールとして非キメラマウスＩＣＲより取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いた。
　　cowF1：5’-ATTATCTGCAGAAGTCTGACCCGCACACAGG - 3’（配列番号４９）
　　cowF2：5’-ATTATCTGCAGTGTGGAGCTGGCCAATGCAT - 3’（配列番号５０）
　　cowF3：5’-ATTATCTGCAGATGGTTATGGTTATGGTTATGG - 3’（配列番号５１）
　　cowR1：5’-GTCGGAAGCTTATAACCACAACCATAACCAT - 3’（配列番号５２）
　断片内に作製したフォワードプライマー（ｃｏｗＦ１、ｃｏｗＦ２、ｃｏｗＦ３、）と実施例１５で用いたＨＩＧＭＥＸ１－２（定常領域用のプライマー）、断片内に作製したリバースプライマー（ｃｏｗＲ１）と実施例１５で用いた可変領域用プライマー（ＶＨ１／５ＢＡＣＫ、ＶＨ４ＢＡＣＫ、ＶＨ３ＢＡＣＫ）の組み合わせで９８℃１０秒、５９℃５秒、６８℃５秒を３５サイクルの条件で行った。全ての増幅産物は１．５％アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウム染色することにより検出した。その結果、期待される長さ（断片内に作製したフォワードプライマーとＨＩＧＭＥＸ１－２：２５０ｂｐ付近、断片内に作製したリバースプライマーと実施例１５で用いた可変領域用プライマー：４００ｂｐ付近）の増幅産物が検出された。一方、陰性コントロールでは全てにおいて同じ位置に特異的増幅産物は検出されなかった。これらの増幅産物は、アガロースゲルより抽出した後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩを用いた制限酵素処理を行った。これをｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ部位にクローニングした。増幅産物の挿入されたプラスミドのシーケンスを実施し、塩基配列を決定した。
　上記において決定した塩基配列について、各クローンにおいて使用されている既知の生殖系列Ｄ断片、及びＶ断片或いはＪ断片の特定を行った。そのうち由来するウシＤ断片が特定された４クローンの塩基配列を以下に示す。
　クローン１
　　Ｄ断片（ウシＤ１－３）：
TGTGGAGCTGGCCA（配列番号５３）
　　Ｊ断片（ヒトＪ３）：
ATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAG（配列番号５４）
　クローン２
　　Ｄ断片（ウシ６－３或いは６－４）：
ATGGTTATGGTTATGGTTATGGTTGTGGTTATGGTTATGGTTATAC（配列番号５５）
　　Ｊ断片（ヒトＪ１）：
CTTCCAGCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG（配列番号５６）
　クローン３
　　Ｖ断片（ヒトＶ３－２３）：
GGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGA（配列番号５７）
　　Ｄ断片（ウシ６－３或いは６－４）：
TAGTTGTTATAGTGGTTATGGTTATGGTTATGGTTGTGGTTAT（配列番号５８）
　クローン４
　　Ｖ断片（ヒトＶ２－５）：
AGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTGACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGCACTAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCATTCATTTATTGGGATGATGATAAGCGCTACAGCCCATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCACCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCACACAG（配列番号５９）
　　Ｄ断片（ウシ６－３或いは６－４）：
TTGTTATAGTGGTTATGGTTATGGTTATGGTTGTGGTTAT（配列番号６０）
　以上の結果、キメラマウス脾臓においてウシＤ断片と、ヒトＶ断片或いはＪ断片が連結したｃＤＮＡが検出された。例えばクローン２のｃＤＮＡ配列より導き出されるアミノ酸配列は、下記の配列：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
の通りであり、ＣＤＲＨ３の長さは１８アミノ酸（下線部のアミノ酸数）以上の長鎖ＣＤＲ３であることが確認された。
[実施例１７]ヒトミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス免疫応答
　ヒトミニマル化キメラマウスに抗原タンパク質を投与し、投与後に採取した血清或いは血漿サンプルを用いて酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ：以下、ＥＬＩＳＡ）を行うことで、免疫応答及び抗原特異的抗体が誘導されるか評価することができる。
１．抗原の投与
　０．４Ｍアルギニンを含むＰＢＳにより１ｍｇ／ｍｇの抗原タンパク質溶液を調製し、初回免疫ではＦｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ　Ｆ５８８１）と、追加免疫ではＳｉｇｍａ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　ＳｙｓｔｅｍＴＭ（ＳＡＳＴＭ）（Ｓｉｇｍａ　Ｓ６３２２）と１：１で混合することで抗原投与液を準備する。６週齢のキメラマウスに初回免疫では２００μＬ（抗原１００μｇ、腹腔）、追加免疫では１００μＬ（抗原５０μｇ、腹腔、２週間ごと）、最終免疫では１００μＬ（抗原５０μｇ、１ｍｇ／ｍｇ抗原タンパク質溶液、静注）を投与する。
２．抗血清ＥＬＩＳＡ
　各免疫投与３日後に末梢血から血漿を調製する。血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価を評価するため、抗原を固相化した９６穴プレートと抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ抗体を用いて抗血清ＥＬＩＳＡを行う。
[実施例１８]ウシミニマル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス免疫応答
　ウシミニマル化キメラマウスにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質Ｓ１の受容体結合部位（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｄｏｍａｉｎ：以下、ＲＢＤ）を抗原として投与し、投与後に採取した血清或いは血漿サンプルを用いてＥＬＩＳＡを行うことで、免疫応答及び抗原特異的抗体が誘導されるか評価した。
１．抗原の投与
　０．４Ｍアルギニンを含むＰＢＳにより１ｍｇ／ｍｇの抗原タンパク質溶液を調製し、初回免疫ではＦｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ　Ｆ５８８１）と、追加免疫ではＳｉｇｍａ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　ＳｙｓｔｅｍＴＭ（ＳＡＳＴＭ）（Ｓｉｇｍａ　Ｓ６３２２）と１：１で混合することで抗原投与液を準備する。６週齢のキメラマウスに初回免疫では２００μＬ（抗原１００μｇ、腹腔）、追加免疫では１００μＬ（抗原５０μｇ、腹腔、２週間ごと５回）を投与した。
２．抗血清ＥＬＩＳＡ
　各免疫投与３日後に末梢血から血漿を調製した。血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価を評価するため、抗原を固相化した９６穴プレートと抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ抗体を用いて抗血清ＥＬＩＳＡを行った。その結果、継続的な追加免疫により免疫応答し、ＲＢＤに対する抗体力価が上昇することが確認された（図１４）。
[実施例１９]ΦＣ３１リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによるサル化ＩｇＨＤを含む化学合成ＤＮＡ（シンプロジェン）の挿入
　ヒトと進化的に近縁であり、抗体遺伝子配列が解明されているカニクイザルＤ断片（各Ｄ断片の塩基配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／に記載されている。）をヒトＤ断片と置換し、Ｄ断片以外の領域は全てヒト抗体Ｄ領域遺伝子配列を維持した約４０ｋｂｐのサル化ヒトＩｇＨＤをデザインした（図１５）。
１．サル化ＩｇＨＤを含む化学合成ＤＮＡの作製
　置換するヒトのＤ断片数は２６、一方でカニクイザルのＤ断片数は４０であるため、カニクイザルのＤ断片同士で相互に類似している配列を除外し、ヒトＩｇＨＤと比較し変化の大きいものを優先して、以下の表１２に示す２６種に絞り込んだ。また、４つのヒトＤ断片（Ｄ４－１１、Ｄ１－１４、Ｄ４－２３、Ｄ５－２４）の前後に存在するＶＤＪ組み換え配列の変異を正常型に変換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　この２６種のカニクイザルＤ断片を保持するサル化ＩｇＨＤに加え、化学合成ＤＮＡ組み換え部位であるΦＣ３１　ａｔｔＰ及びＲ４　ａｔｔＰ、ベクター導入の有無を確認するためのブラストサイジン耐性遺伝子をもつベクターをシンプロジェン株式会社の枯草菌を用いたＯＧＡＢ（Ｏｒｄｅｒｅｄ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）法により化学合成した。
２．ΦＣ３１リコンビナーゼによるサル化ＩｇＨＤベクターの導入
　実施例５の方法と同様に実施した。１－１０細胞をトリプシン処理し、３×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１μｇのΦＣ３１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターΦＣ３１ｐＥＦ１（特許第６８６８２５０号公報）及び３μｇのサル化ＩｇＨＤベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。細胞はパルス後に３８４穴プレート２枚に播種した。４８時間後に８００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８、８００μｇ／ｍＬブラストサイジン、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養した。１２日後にブラストサイジン耐性があった１７個ピックアップした。
３．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例５と同じΦＣ３１部位特異的組み換え後特異的なプライマー１種及びＩｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種に加えて、以下に示すサル化ＩｇＨＤ特異的なプライマー１種を用いてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃２分を１サイクル行ったのち、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長は６８℃で、増幅断片の長さ５００ｂｐ以下の場合５秒、５００ｂｐ以上の場合１００秒／ｋｂのサイクルを３５サイクル行った。
　　3-10monkeyF：5’-CACCCACAGTGTCACAGAGT- 3’（配列番号６２）
　　4-11monkeyR：5’-TCACTGTGGGTGGCAAAACT- 3’（配列番号６３）
　さらに、サル化ＩｇＨＤ全体がクローンに保持されているか否かを確認するために、以下に示す５種のプライマーを作製し、ロングＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ　ＧＸＬ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｆａｓｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてステップダウン方式により以下のようなＰＣＲを行った。
　９８℃２分１サイクル→変性９８℃１０秒、アニーリング及び伸長は７２℃で、増幅断片の長さ１０ｋｂｐ以下の場合、５秒／長さ（ｋｂ）、１０ｋｂを超える場合、１０秒／ｋｂ　５サイクル→変性９８℃１０秒、アニーリング及び伸長は７０℃で、増幅断片の長さ１０ｋｂｐ以下の場合、５秒／長さ（ｋｂ）、１０ｋｂを超える場合、１０秒／ｋｂ　５サイクル→変性９８℃１０秒、アニーリング及び伸長は６８℃で、増幅断片の長さ１０ｋｂｐ以下の場合、５秒／長さｋｂ、１０ｋｂを超える場合、１０秒／ｋｂのサイクルを３０サイクル行った。
　　PACF1：5’- CGGTGTGCGGTTGTATGCCTGCTGT - 3’（配列番号６４）
　　3-3to4-4R：5’- GGCCAGGCAGGATGATGGACTCCCA - 3’（配列番号６５）
　　3-3F：5’- CGGTTACTATTACACCCACAGCGTC - 3’（配列番号６６）
　　3-10F2：5’- TTGTAGTGGTGGTGTCTGCTACACC - 3’（配列番号６７）
　　3-16R：5’- GTAGTTACTGTATTCACACAGTGAC - 3’（配列番号６８）
　　F37：5’- CTGCAGGCCCTGTCCTCTTC - 3’（配列番号６９）
　　4-23R：5’- ATAGTAATACCACTGTGGGAGGGCC - 3’（配列番号７０）
４．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認された１個の細胞クローンに対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
　ＦＩＳＨ解析を行った１個の細胞クローンにおけるＰＣＲ解析、ＦＩＳＨ解析の結果を表Ｘに記した。
　表１３において、横列がクローン名、縦列にＰＣＲで使用したプライマー及び伸長時間を示す。○は陽性を示した。表中、Ｉｇ－ＮＡＣｘ１はＩｇ－ＮＡＣが細胞あたり１コピー検出されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
［実施例２０］Ｒ４リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによる一部配列除去（サル化）
１．Ｒ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター導入
　実施例６と同様の方法で実施した。サル化ヒトＩｇＨＤベクターの導入が確認された細胞クローン（実施例１９）をトリプシン処理し、３×１０６個／ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１０μｇのＲ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ，７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。パルス後１０ｃｍディッシュ１枚に播種した。２４～４８時間後に細胞をトリプシン処理し、３８４穴プレート１枚あたり１５０個になるように細胞を播種した。３８４穴プレート播種後１７日後に、８００μｇ／ｍＬＧ４１８、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養し、シングルクローンをピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例６と同様のＲ４部位特異的組み換え後特異的なプライマー１種、及びサル化ＩｇＨＤ内に作製したプライマー２種、Ｉｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種を用いてＰＣＲ解析を行った。Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施し、Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なバンドが得られるクローン（１－１０　Ｍ９－Ｉ９）を選定した。
３．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認されたクローン（１－１０　Ｍ９－Ｉ９）に対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
[実施例２１]マウスＥＳ細胞株への微小核形成法（ＭＭＣＴ）によるサル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ導入
１．ＭＭＣＴ法を用いたマウスＥＳ細胞へのサル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ移入
　実施例１０でＰＣＲ及びＦＩＳＨ解析によりＲ４部位特異的組み換えが起きたことが確認されたクローンを染色体供与細胞として用いる。染色体受容細胞としては、内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖遺伝子座の両アレルが破壊されているマウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株（ＸＯ）（特許第４０８２７４０号）を用いる。実施例７と同様の方法で微小核を形成し、マウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株（ＸＯ）と融合し、１０ｃｍｄｉｓｈ３枚に播種する。４８時間後から３５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えたＥＳ細胞用培地と交換し、この後、２日に１回同じ組成で培地交換を行う。１週間～１０日後に出現する薬剤耐性コロニーをピックアップする。
２．ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｙｓｉｓ　（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例６で行ったＰＣＲ解析と同じプライマーを用いてＰＣＲを実施する。
３．核型解析
　実施例７と同様の方法を用いて、マウス染色体の核型異常がないか確認する。核型解析をしたもののうち、マウス染色体が３９本かつＩｇ－ＮＡＣｘ１の保持率が高く、転座がないクローンを選抜する。
[実施例２２]サル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作製
　ヒト抗体産生を確認するためにサル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株からキメラマウスを作製する。得られるサル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を用いて、ジーンターゲティング、実験医学、１９９５の手法に従い、キメラマウスを作製する。宿主としてはＭＣＨ（ＩＣＲ）（白色、日本クレア社より購入）若しくは抗体遺伝子の欠損（Ｉｇｈ／Ｉｇκ　ＫＯ）若しくは低発現（Ｉｇｌ１　ｌｏｗ）を呈するＨＫＬＤマウスの雌雄交配により得られる桑実胚及び８細胞期胚を用いる。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。胚を仮親に移植することで、キメラマウス（毛色に濃茶色の部分の認められる）が得られる。
[実施例２３]サル化ＩｇＨＤキメラマウス解析（Ｂ細胞解析、ＥＬＩＳＡ、ｃＤＮＡ調製）
　サル化ＩｇＨＤキメラマウスからサル化ＩｇＨＤヒト抗体が産生産生されているかの評価として、Ｂ細胞分化解析、血漿中抗体濃度測定ＥＬＩＳＡ解析、脾臓からのｃＤＮＡ回収による遺伝子配列解析を行うことができる。
１．Ｂ細胞分化解析
　ＥＧＦＰ及びＢ細胞マーカーであるＢ２２０が共に陽性である細胞が検出できれば、抗体産生寄与によるＢ細胞分化が示され、抗体の機能性発現の間接的評価になる。キメラマウスから取得した末梢血をサンプルとして特許第６８６８２５０号公報に記載の方法でＢ２２０のフローサイトメトリー解析を行った結果、ＧＦＰ陽性の細胞集団のみならず、ＧＦＰ及びＢ２２０共陽性の集団が確認されれば、機能性抗体が発現していることが示される。
２．ＥＬＩＳＡによる抗体発現解析
　キメラマウスから得られた血漿を用いて特許第６８６８２５０号公報に記載の方法で、マウスの抗体発現の有無確認も含め、マウス抗体（ｍγ、ｍμ、ｍκ、ｍλ）、ヒト抗体（ｈγ、ｈμ、ｈκ、ｈλ、ｈγ１、ｈγ２、ｈγ３、ｈγ４、ｈα、ｈε、ｈδ）の血漿中の濃度を測定する。
３．ヒト抗体の発現解析及び配列同定
　ヒト抗体産生マウス脾臓由来ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定を行う。特許第６８６８２５０号公報と同様に実施することで解析、評価する。脾臓は回収後ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で一晩４℃保存した後、溶液から取り出し－８０℃で保管した。ジルコニアビーズの入った耐圧チューブに１ｍＬのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を添加し、組織５０ｍｇを加える。装置で破砕（３０～４５秒程度）し、組織が破砕されたことを確認した後、スピンダウン後、１ｍＬの上清を分取し、２００μＬのクロロフォルムを加え、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔを用いメーカープロトコルに従ってＲＮＡを抽出する。
[実施例２４]サル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウスレパトワ解析
１．サル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡからのヒト抗体遺伝子重鎖領域クローニングと塩基配列決定
　サル化ＩｇＨＤを保持するキメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡについて下記プライマーによりＰＣＲを行い、ヒト抗体遺伝子重鎖可変領域を増幅する。陰性コントロールとして非キメラマウスＩＣＲより取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いる。
　定常領域：
　　HIGMEX1-2：5’-CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3’（配列番号７１）
　可変領域用：
　　VH1/5BACK：5’-CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG-3’（配列番号７２）
　　VH4BACK：5’-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3’（配列番号７３）
　　VH3BACK：5’-GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’（配列番号７４）
　ＰＣＲは定常領域用×可変領域用（３種）の組み合わせで９８℃１０秒、５９℃５秒、６８℃５秒を３５サイクルの条件で行う。全ての増幅産物は１．５％アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウム染色することにより検出する。増幅産物は、アガロースゲルより抽出した後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩを用いた制限酵素処理を行う。これをｐＵＣ１１９（ＴＡＫＡＲＡ）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ部位にクローニングする。増幅産物の挿入されたプラスミドに対してシーケンスを実施し、増幅産物の塩基配列を決定する。
２．サル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡからのヒト抗体　遺伝子重鎖可変領域塩基配列の解析
１．において決定した塩基配列について、各クローンにおいて使用されている既知の生殖系列Ｖ遺伝子断片、Ｄ断片、Ｊ断片の特定を行う。その結果、ＶＤＪ組み換えによりサルＤＨ配列を含むヒト抗体遺伝子重鎖可変領域ｃＤＮＡの存在が確認される。
[実施例２５]サル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウス免疫応答
　サル化（ΔＩｇＨ／ΔＩｇκ－ＥＳ）キメラマウスに抗原タンパク質を投与し血清或いは血漿サンプルを用いて酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ：以下、ＥＬＩＳＡ）を行うことで、免疫応答及び抗原特異的抗体が誘導されるか評価することができる。
１．抗原の投与
　０．４Ｍアルギニンを含むＰＢＳにより１ｍｇ／ｍｇの抗原タンパク質溶液を調製し、初回免疫ではＦｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ　Ｆ５８８１）、追加免疫では、Ｓｉｇｍａ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　ＳｙｓｔｅｍＴＭ（ＳＡＳＴＭ）（Ｓｉｇｍａ　Ｓ６３２２）と１：１で混合することで抗原投与液を準備する。６週齢のキメラマウスに初回免疫では２００μＬ（抗原１００μｇ、腹腔）、追加免疫では１００μＬ（抗原５０μｇ、腹腔、２週間ごと）、最終免疫では１００μＬ（抗原５０μｇ、１ｍｇ／ｍｇ抗原タンパク質溶液、静注）を投与する。
２．抗血清ＥＬＩＳＡ
　各免疫投与３日後に末梢血から血漿を調製する。血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価を評価するため、抗原を固相化した９６穴プレートと抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ抗体を用いて抗血清ＥＬＩＳＡを行う。
[実施例２６]ヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス系統の樹立
　実施例７でマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（ＸＯ）を受容細胞として作製されたヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を用いて、実施例８で示した通りに作製されたキメラマウスを内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖を破壊したマウス系統と交配することで、ヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス系統を樹立した。得られた、ヒトミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス個体（＃２００）について、実施例１３で示した通りの方法でフローサイトメトリー解析を行った。その結果、末梢血単核球細胞のＧＦＰ陽性率は９６．９７％、末梢血単核球細胞のＧＦＰ及びＢ２２０共陽性率は１８．７８％であり、この値は、ヒトミニマル化ＩｇＨＤの代わりに野生型Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス個体（特許第６８６８２５０号公報）と同等であった。
[実施例２７]ウシミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、かつ内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス系統の樹立
　実施例１１でマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（ＸＯ）を受容細胞として作製されたウシミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞を用いて、実施例１２で示した通りに作製されたキメラマウスを野生型マウス或いは内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖を破壊したマウス系統と交配することで、ウシミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス系統を樹立した。得られた、ウシミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス個体（＃２４１）について、実施例１３で示した通りの方法でフローサイトメトリー解析を行った。その結果、末梢血単核球細胞のＧＦＰ陽性率は９９．０９％、末梢血単核球細胞のＧＦＰ及びＢ２２０共陽性率は６．２６％であり、この値は、ウシミニマル化ＩｇＨＤの代わりに野生型Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス個体（特許第６８６８２５０号公報）と同等であった。
[実施例２８]サル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス系統の樹立
　実施例２２で作製されるキメラマウス、或いは実施例２１でマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆ（ＸＯ）を受容細胞として実施例２２で示した通りに作製されるキメラマウスを野生型マウス或いは内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖を破壊したマウス系統と交配することで、サル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣを保持し、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ鎖遺伝子座が破壊されたマウス系統を樹立できる。
[実施例２９]ΦＣ３１リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによるヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤを含む化学合成ＤＮＡの挿入
　実施例５で設計したヒトミニマル化ＩｇＨＤのＤ断片１－１から１－２６を、図１６に示す２６種の改変長鎖ＤＨ配列と置換したヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤベクターを実施例５と同様に以下の１．及び２．の手順で作製した。ヒト長鎖ＤＨ配列は、ＮＣＢＩに登録されているヒト抗体ｃＤＮＡ配列の中に見出される、長い（１８アミノ酸以上）ＣＤＲ３配列にもとづき設計した。ヒト長鎖ｍｉｎｉＡ、ヒト長鎖ｍｉｎｉＢ、ヒト長鎖ｍｉｎｉＣの各ベクターは実施例５同様に、ユーロフィンジェノミクス社にて合成されたものを用いた。
１．ヒト長鎖ｍｉｎｉＢへのヒト長鎖ｍｉｎｉＡ断片の挿入
　ヒト長鎖ｍｉｎｉＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断した。同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したヒト長鎖ｍｉｎｉＢに長鎖ｍｉｎｉＡを挿入することにより、ヒト長鎖ｍｉｎｉＡ／Ｂベクターを構築した。
２．ヒト長鎖ｍｉｎｉＡ／Ｂベクターへのヒト長鎖ｍｉｎｉＣ断片の挿入
　ヒト長鎖ｍｉｎｉＣを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断した。同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断したヒト長鎖ｍｉｎｉＡ／Ｂベクターにヒト長鎖ｍｉｎｉＣ断片を挿入することにより、ヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤベクターを構築した。
３．ΦＣ３１リコンビナーゼによるヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤベクターの導入
　実施例５と同様の方法で、ΦＣ３１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター（特許第６８６８２５０号公報）及びヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤベクターを、化学合成ＤＮＡの導入プラットフォーム搭載Ｉｇ－ＮＡＣ保持ＣＨＯ細胞１－１０（実施例４）にエレクトロポレーション法により導入した。１－１０細胞をトリプシン処理し、３×１０６個/ｍＬとなるようにＯｐｔｉ　ＭＥＭに懸濁してから１μgのΦＣ３１リコンビナーゼ遺伝子発現ベクターΦＣ３１ｐＥＦ１（特許第６８６８２５０号公報）及び３μgのヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤベクターを加え、ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン）を用いて１５０Ｖ、７．５ｍｓでエレクトロポレーションを行った。細胞はパルス後に３８４穴プレート２枚に播種した。４８～７２時間後に８００μｇ／ｍＬのＧ４１８、８００μｇ／ｍＬのブラストサイジン、１０％ＦＢＳを含むＦ１２培地で培地交換して培養した。１１日後にブラストサイジン耐性があったクローンをピックアップした。
４．ＰＣＲ解析
　実施例５と同様の方法で、ΦＣ３１部位特異的組み換え後特異的なプライマー１種、及びヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ内に作製したプライマー２種、Ｉｇ－ＮＡＣ上に作製したＩｇ－ＮＡＣ特異的なプライマー１２種を用いて３．で得られたクローンのＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲ増幅には約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用した。ＴａｑポリメラーゼはＫＯＤｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９８℃２分を１サイクル行ったのち、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長は６８℃で、増幅断片の長さ５００ｂｐ以下の場合５秒、５００ｂｐ以上の場合１００秒／長さ（ｂｐ）のサイクルを３５サイクル行った。
５．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認されたクローン（１－１０　ＨＬ１５）に対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
[実施例３０]Ｒ４リコンビナーゼを用いた部位特異的組み換えによる一部配列除去
　Ｉｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）上に導入した配列の内、ＣＡＧプロモーターやブラストサイジン耐性遺伝子などは抗体遺伝子の発現に不要となる配列である。これらの配列は、Ｒ４　ａｔｔＢ及びＲ４　ａｔｔＰに挟まれており、Ｒ４リコンビナーゼを細胞に導入することによってＲ４　ａｔｔＢ－ａｔｔＰ間で部位特異的組み換え反応が起こり、除去することが可能である。
１．Ｒ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター導入
　実施例６と同様に、Ｒ４リコンビナーゼ遺伝子発現ベクター（特許第６８６８２５０号公報）を、ヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤベクターの挿入が確認されており、かつ１本のＩｇ－ＮＡＣ保持率が高いＣＨＯ細胞クローン（１－１０　ＨＬ１５）に、エレクトロポレーション法により導入した。得られるＧ４１８耐性クローンをピックアップした。
２．ＰＣＲ解析
　実施例６と同様に、１．で得られるＧ４１８耐性クローンのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ解析を行い、Ｒ４部位特異的組み換え後特異的なバンドが得られるクローン（１－１０　ＨＬ１５－２８、１－１０　ＨＬ１５－４３）を選定した。
３．ＦＩＳＨ解析
　ＰＣＲ解析で目的のバンドが確認される細胞クローン（１－１０　ＨＬ１５－２８、１－１０　ＨＬ１５－４３）に対してＦＩＳＨ解析を実施した。ＦＩＳＨ解析は（特許第６８６８２５０号公報）に記された方法に従い、マウス遺伝子特異的プローブｍｏｕｓｅ　ｃｏｔ１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
[実施例３１]マウスＥＳ細胞株への微小核形成法（ＭＭＣＴ）によるヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ搭載Ｉｇ－ＮＡＣ導入
　実施例３０でＰＣＲ及びＦＩＳＨ解析によりＲ４部位特異的組み換えが起きたことが確認されたクローンを染色体供与細胞として用い、ＭＭＣＴ法を用いてマウスＥＳ細胞へのヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣ移入を行う。
１．ＭＭＣＴ法を用いたマウスＥＳ細胞へのヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣの移入
　実施例７と同様に、染色体受容細胞としては、内因性免疫グロブリン重鎖、κ鎖遺伝子座の両アレルが破壊されているマウスＥＳ細胞ＨＫＤ３１　６ＴＧ－９株（ＸＯ）（特許第４０８２７４０号公報）を用いて微小核形成法（ＭＭＣＴ）によるヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣ導入を行い、出現した薬剤耐性コロニーをピックアップする。
２．ＰＣＲ解析
　実施例７と同様に、単離した細胞を培養し、細胞からＣｅｌｌｌｙｓｉｓ（キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。このゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、目的のバンドが検出されるクローンを選択する。
３．核型解析
　実施例７と同様に染色体標本を作成した。この標本をＤＡＰＩ染色し、マウス染色体の核型異常がないクローンを選択する。
[実施例３２]ヒト長鎖ミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作製
　実施例８と同様に、ヒト抗体産生を確認するために実施例３１で得られたヒトミニマル化ＩｇＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣマウスＥＳ細胞からキメラマウスを作製する。
　ヒト長鎖ミニマル化ＨＤ含有Ｉｇ－ＮＡＣを保持するマウスＥＳ細胞株クローンをＩＣＲ胚にインジェクションを実施し、仮親に移植する。その結果ＧＦＰ陽性キメラマウスが得られる。
　得られたキメラマウスを実施例１３、実施例１４、実施例１５などに記載された方法により解析する。その結果、キメラマウス脾臓Ｉｇμ－ｃＤＮＡにおける、長鎖ヒトＤ断片の使用が示される。
[実施例３３]ヒトＩｇＨＤ７－２７を削除した合成Ｄ領域導入アクセプター保持Ｉｇ－ＮＡＣの構築
　ヒトＩｇＨＤ領域を削除したＩｇ－ＮＡＣ（ΔＤＨ）では、ヒトＤ断片１－１から１－２６までの合計２６断片を削除しており、Ｄ領域から離れて存在しＪ領域の近くにある７－２７は削除していない。Ｄ断片７－２７が残存していることへの影響をなくすため、Ｄ断片７－２７の前後２カ所にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡを設計、評価、選定する。その後、化学合成ＤＮＡの導入プラットフォーム搭載Ｉｇ－ＮＡＣ保持ＣＨＯ細胞１－１０（実施例４）に対して、上記ｇＲＮＡ及びＣａｓ９を用いたゲノム編集によって２ヵ所切断することにより、ヒトＩｇＨＤ７－２７を削除した合成Ｄ領域導入アクセプター保持Ｉｇ－ＮＡＣを取得する。
　本発明により、ヒト抗体の多様性が拡張される。好ましくは１８～５０若しくはそれ以上のアミノ酸数のＣＤＲＨ３を含むヒト抗体を作製することを可能にする。
配列番号１：ヒトミニマル化Ｄ領域のヌクレオチド
配列番号２：ウシＯＲＦで置換されたヒトミニマル化Ｄ領域のヌクレオチド配列
　　　　　　　７３７．．７６７　　　Ｄ２－２に代わるＢ１－１
　　　　　　　１０２４．．１０３９　Ｄ３－３に代わるＢ２－１
　　　　　　　１２９６．．１３３１　Ｄ４－４に代わるＢ３－１
　　　　　　　１５８８．．１６３０　Ｄ５－５に代わるＢ４－１
　　　　　　　１８８７．．１９００　Ｄ６－６に代わるＢ９－１
　　　　　　　２１５７．．２１８７　Ｄ１－７に代わるＢ１－２
　　　　　　　２４４４．．２４５９　Ｄ２－８に代わるＢ２－２
　　　　　　　２７１５．．２７５６　Ｄ３－９に代わるＢ５－２
　　　　　　　２９１０．．３０５７　Ｄ３－１０に代わるＢ８－２
　　　　　　　３３７４．．３４３１　Ｄ４－１１に代わるＢ６－２
　　　　　　　３６８８．．３８０６　Ｄ５－１２に代わるＢ１－３
　　　　　　　４０６３．．４０７８　Ｄ６－１３に代わるＢ２－３
　　　　　　　４３３８．．４３７３　Ｄ１－１４に代わるＢ３－３
　　　　　　　４６３０．．４６９６　Ｄ２－１５に代わるＢ７－３
　　　　　　　４９５３．．４９９４　Ｄ３－１６に代わるＢ５－３
　　　　　　　５２５１．．５３０８　Ｄ４－１７に代わるＢ６－３
　　　　　　　５５６５．．５５９５　Ｄ５－１８に代わるＢ１－４
　　　　　　　５８５２．．５８６７　Ｄ６－１９に代わるＢ２－４
　　　　　　　６１２４．．６１５９　Ｄ１－２０に代わるＢ３－４
　　　　　　　６４１６．．６４８８　Ｄ１－２１に代わるＢ７－４
　　　　　　　６７４５．．６７８５　Ｄ３－２２に代わるＢ５－４
　　　　　　　７１０３．．７１６０　Ｄ４－２３に代わるＢ６－４
　　　　　　　７４１７．．７４３０　Ｄ５－２４に代わるＢ９－４
配列番号３：改変ＯＲＦで置換されたヒトミニマル化Ｄ領域のヌクレオチド配列
　　　　　　　６４７．．６９０　　　改変Ｄ１－１
　　　　　　　９４７．．９９０　　　改変Ｄ２－２
　　　　　　　１２４７．．１２９０　改変Ｄ３－３
　　　　　　　１５４７．．１５９０　改変Ｄ４－４
　　　　　　　１８４７．．１８９０　改変Ｄ５－５
　　　　　　　２１４７．．２１９０　改変Ｄ６－６
　　　　　　　２４４７．．２５０８　改変Ｄ１－７
　　　　　　　２７６５．．２８０８　改変ＤＬ２－８
　　　　　　　３０６４．．３１４９　改変Ｄ３－９
　　　　　　　３３０３．．３３８５　改変Ｄ３－１０
　　　　　　　３７０２．．３７６０　改変Ｄ４－１１
　　　　　　　４０１７．．４０７８　改変Ｄ５－１２
　　　　　　　４３３５．．４３８４　改変Ｄ６－１３
　　　　　　　４６４４．．４７１１　改変Ｄ１－１４
　　　　　　　４９６８．．５０３５　改変Ｄ２－１５
　　　　　　　５２９２．．５３６５　改変Ｄ３－１６
　　　　　　　５６２２．．５６９５　改変Ｄ４－１７
　　　　　　　５９５２．．６０１６　改変Ｄ５－１８
　　　　　　　６２７３．．６３３４　改変Ｄ６－１９
　　　　　　　６５９１．．６６５２　改変Ｄ１－２０
　　　　　　　６９０９．．６９６１　改変Ｄ２－２１
　　　　　　　７２１８．．７２６４　改変Ｄ３－２２
　　　　　　　７５８１．．７６４２　改変Ｄ４－２３
　　　　　　　７８９９．．７９６０　改変Ｄ５－２４
　　　　　　　８２１７．．８２６３　改変Ｄ６－２５
　　　　　　　８５２０．．８５７８　改変Ｄ１－２６
配列番号４：ガイドＲＮＡであるｇＲＮＡ　Ｕｐ３の標的ヌクレオチド配列
　　　　　　２１．．２３：　ＰＡＭ配列
配列番号５：ガイドＲＮＡであるｇＲＮＡ　Ｄｏｗｎ４の標的ヌクレオチド配列
　　　　　　２１．．２３：　ＰＡＭ配列
配列番号６～１５：プライマー
配列番号１８：Ｂｘｂ１　ａｔｔＢのヌクレオチド配列
配列番号１９：Ｂｘｂ１　ａｔｔＰのヌクレオチド配列
配列番号２０：ΦＣ３１　ａｔｔＢのヌクレオチド配列
配列番号２１：Ｒ４　ａｔｔＢのヌクレオチド配列
配列番号２２～２３：プライマー
配列番号２４：ガイドＲＮＡであるｇＲＮＡ－Ａ１の標的ヌクレオチド配列
　　　　　　　２１．．２３：　ＰＡＭ配列
配列番号２５：ガイドＲＮＡであるｇＲＮＡ－Ｂ１の標的ヌクレオチド配列
　　　　　　　２１．．２３：　ＰＡＭ配列
配列番号２６～５２：プライマー
配列番号６１：長鎖ＣＤＲＨ３を含むペプチドのアミノ酸配列
配列番号６２～７４：プライマー
配列番号７５：ヒトＤＨ番号１－１のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号７６：ヒトＤＨ番号２－２のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号７７：ヒトＤＨ番号３－３のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号７８：ヒトＤＨ番号４－４のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号７９：ヒトＤＨ番号５－５のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８０：ヒトＤＨ番号６－６のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８１：ヒトＤＨ番号１－７のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８２：ヒトＤＨ番号２－８のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８３：ヒトＤＨ番号３－９のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８４：ヒトＤＨ番号３－１０のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８５：ヒトＤＨ番号４－１１のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８６：ヒトＤＨ番号５－１２のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８７：ヒトＤＨ番号６－１３のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８８：ヒトＤＨ番号１－１４のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号８９：ヒトＤＨ番号２－１５のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９０：ヒトＤＨ番号３－１６のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９１：ヒトＤＨ番号４－１７のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９２：ヒトＤＨ番号５－１８のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９３：ヒトＤＨ番号６－１９のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９４：ヒトＤＨ番号１－２０のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９５：ヒトＤＨ番号２－２１のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９６：ヒトＤＨ番号３－２２のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９７：ヒトＤＨ番号４－２３のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９８：ヒトＤＨ番号５－２４のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号９９：ヒトＤＨ番号６－２５のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
配列番号１００：ヒトＤＨ番号１－２６のヌクレオチド配列に代えて置換された改変長鎖ＤＨ配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (25)

  1. 　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターにおいて、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されていることを特徴とする哺乳動物人工染色体ベクターであって、前記Ｄ領域の改変配列が、
    　（１）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く前記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列がＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
    　（２）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
    　（３）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
    前記哺乳動物人工染色体ベクター。
  2. 　前記（１）のヒト動物免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列が１００～５００ｂｐの長さに短縮された配列を含む、請求項１に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  3. 　前記ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列が、配列番号１２７～１４９のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  4. 　前記サル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列が、配列番号１５０～１７５のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  5. 　前記（３）の２６種の改変ＯＲＦ配列が、配列番号７５～１００のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  6. 　前記Ｄ領域の改変配列が、配列番号２又は配列番号３のヌクレオチド配列、或いは該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  7. 　前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ領域がさらにＤ７－２７を欠失している、請求項１～６のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  8. 　前記ベクターが、齧歯類人工染色体ベクターである、請求項１～７のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  9. 　前記齧歯類人工染色体ベクターが、マウス人工染色体ベクターである、請求項８に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  10. 　前記軽鎖遺伝子座が、κ軽鎖遺伝子座及び／又はλ軽鎖遺伝子座である、請求項１～９のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを含む哺乳動物細胞。
  12. 　前記細胞が、齧歯類細胞又はヒト細胞である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
  13. 　前記細胞が、哺乳動物由来のｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞からなる群から選択される分化多能性幹細胞である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
  14. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを含み、かつ内在性免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子若しくは遺伝子座が破壊されている非ヒト哺乳動物。
  15. 　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのヒト由来ゲノム配列が、下記の（１）及び（２）、又は（１）及び（３）、の組み合わせからなる該Ｄ領域の改変配列と置換されており、前記Ｄ領域の改変配列が、
    　（１）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間のヒト由来ゲノム配列、又は、Ｄ３－９とＤ３－１０間を除く前記ＯＲＦ間のヒト由来ゲノム配列がＶＤＪ組み換え配列が隣接したＯＲＦ間領域の各ＶＤＪ組み換え配列末端から４９ｂｐ以上の長さに短縮された配列を含み、並びに、
    　（２）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、ウシ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＢ１－１からＢ９－４までのＯＲＦ配列、又はサル由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域の１Ｓ５から１Ｓ３５までのＯＲＦ配列、又はヒツジ、ウマ、ウサギ、トリ若しくはサメ由来の免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＯＲＦ配列を含む、或いは、
    　（３）前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までのＯＲＦ配列に代えて、１８アミノ酸以上のヒト抗体重鎖ＣＤＲ３配列に基づいて作製された、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｄ領域のＤ１－１からＤ１－２６までの２６種の改変ＯＲＦ配列を含む、
    ことを特徴とし、かつ内在性免疫グロブリン重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖遺伝子若しくは遺伝子座が破壊されている、前記非ヒト動物。
  16. 　前記動物が、齧歯類である、請求項１４又は１５に記載の非ヒト動物。
  17. 　前記齧歯類が、マウス又はラットである、請求項１６に記載の非ヒト動物。
  18. 　請求項１４～１７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該非ヒト動物の血液から該標的抗原と結合する抗体を取得することを含む、抗体の作製方法。
  19. 　請求項１４～１７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該標的抗原と結合する抗体を産生する前記非ヒト動物から脾臓細胞、リンパ節細胞又はＢ細胞を取得し、前記脾臓細胞、リンパ節細胞又はＢ細胞とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマを形成し、該ハイブリドーマを培養して、前記標的抗原と結合するモノクローナル抗体を取得することを含む、抗体の作製方法。
  20. 　請求項１４～１７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に標的抗原を免疫し、該標的抗原と結合する抗体を産生する前記非ヒト動物からＢ細胞を取得し、前記Ｂ細胞から抗体重鎖及び軽鎖、或いはそれらの可変領域、からなるタンパク質をコードする核酸を取得し、該核酸を用いてＤＮＡ組み換え技術又はファージディスプレイ技術によって前記標的抗原と結合する抗体を作製することを含む、抗体の作製方法。
  21. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターの製造において、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域をその改変配列で置換する方法であって、
    　（１’）ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターを準備する、
    　（２’）工程（１’）の前記哺乳動物人工染色体ベクターからヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を削除する、
    　（３’）工程（２’）で得られたベクターの前記Ｄ領域の削除部位に、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、プロモーター及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットを挿入する、
    　（４’）工程（３’）で挿入された前記カセットの第２の部位特異的組み換え酵素認識部位に、第２の部位特異的組み換え酵素を用いて、前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、選択マーカー及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットを挿入する、並びに、
    　（５’）第１の部位特異的組み換え酵素を用いる部位特異的組み換えによって、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の改変配列及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含むカセットが前記Ｄ領域の削除部位に挿入された前記人工染色体ベクターを得る、
    ことを含む前記方法。
  22. 　前記ヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ領域の削除が、ゲノム編集によって行われる、請求項２１に記載の方法。
  23. 　ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む哺乳動物人工染色体ベクターであって、前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座がＤ領域を欠失しており、該欠失されたＤ領域に代えて、第１の部位特異的組み換え酵素認識部位、プロモーター及び第２の部位特異的組み換え酵素認識部位を含む、哺乳動物人工染色体ベクター。
  24. 　前記欠失されたＤ領域が、Ｄ１－１からＤ１－２６までの領域である、請求項２３に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
  25. 　前記欠失されたＤ領域が、Ｄ１－１からＤ７－２７までの領域である、請求項２３に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
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