JP6641379B2 - トランスジェニックマウス - Google Patents
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Description
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子
を含むベクターに関する。
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子
を含むベクターに関する。
a)実質的に天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメント;
d)CH1エキソンを欠損しているマウスCγ1遺伝子、及び
e)エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む、マウス3'エンハンサー遺伝子
を含むベクターに関する。
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメント;
d)CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子、並びに
e)マウス3'エンハンサーエレメント
を含む、YAC又は他のベクターで形質転換されたトランスジェニックマウスに関する。
a)実質的に天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメント;
d)CH1エキソンを欠損しているマウスCγ1遺伝子、並びに
e)エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含むマウス3'エンハンサーエレメント
を含む、YACで形質転換されたトランスジェニックマウス又はマウス宿主細胞に関する。
・ 選択マーカー:任意の組み合わせで使用することができるBsd、Zeo、Puro、Hyg
・ ネガティブ選択可能マーカー:チミジンキナーゼ(TK)。ネガティブ選択は、1つ又は複数の選択マーカーと組み合わせて使用することができる
・ マーカー及び/又はベクター配列は、loxP、変異体loxP、Frt又は変異体Frt部位と隣接していてもよい。部位の対は同一であっても、異なっていてもよい。更に3つ以上の部位を使用することができる。
・ 配列を欠失、逆位又は置き換えるためのレコンビナーゼ(Cre、Flp)の使用
・ 例えば、以下のものを介する、定義した配列でのゲノム二本鎖切断の作製:
〇 ジンクフィンガー
〇 TALENs
〇 CRISPR
〇 メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼ)
(i)本発明のベクター、例えばYACを導入する工程と;
(ii)機能性CH1ドメインを欠損しているHCAb又は抗原結合分子をマウスにおいて形成させる工程と;
(iii)マウス血清からHCAb又は抗原結合分子を得る工程と
を含む、マウスから、HCAb又はそのフラグメント、例えばVHドメインを得る方法も提供する。
a)トランスジェニックマウスにおいて本発明のベクターを発現させる工程と、
b)HCAbを発現する細胞又は組織を単離する工程と、
c)単離された細胞又は組織由来のmRNAから得たVHドメインをコードしている配列をクローニングする工程と、
d)クローニングした転写産物からライブラリーを構築する工程と、
e)VHドメインを単離する工程と
を含む。
a)トランスジェニックマウスにおいて本発明のベクターを発現させる工程と、
b)HCAbを発現する細胞又は組織を単離する工程と、
c)ハイブリドーマを前記細胞から産生させる工程と、
d)VHドメインを単離する工程と
を含む、可溶性VHドメインを産生する方法に関する。
YACの構築
1.1 材料
ベクター:
pYAC3 (Bruschi, ICGEB, Yeast Molecular Genetics Group, Trieste, ITALYから入手)
pYNOT (URA3をLEU2マーカーで置き換えることによりpYAC3から誘導したもの。Bruschi, ICGEB, Yeast Molecular Genetics Group, Trieste, ITALYから入手)
pHTK (LEU2をHIS3マーカーで置き換えることによりpYNOTから誘導したもの)
pHKT-Hy (pHKTに挿入されたハイグロマイシン(Hy)耐性遺伝子)
pYES1L (Invitrogen社)
BAC(円形状の細菌人工染色体)は、約150kbp〜350kbpのサイズのDNAセグメントの操作(例えば、配列決定及びクローニング)を促進する、当技術分野で周知の手段である(Methods in Molecular Biology, 54巻及び349巻)。ヒト又はマウスの重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来するDNAを含有するBACは多数存在し、当技術分野で周知である。このようなBACの例(図1及び図2にも記載)としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる:
ヒト:
・ RP11-1065N8
・ RP11-659B19
・ RP11-141I7
・ RP11-72N10
・ RP11-683L4
・ RP11-12F16
マウス:
・ RP23-354L16
・ RP24-72M1
BAC変換及びYAC操作は、栄養要求性マーカー、酵母選択、培地、酵母形質転換、YACスクリーニング、YAC移入、YAC改変及び増幅に関する処方及び方法が詳細に記載されている、例えば、YACプロトコル(Methods in Molecular Biology, 54巻及び349巻)において当技術分野で開示されており、十分に確立されている技術である。
カナマイシン耐性遺伝子KANRカセットを、それぞれの末端にFRT部位と結合用の2つのYAC末端に特異的なYAC相同配列の65bpフラグメントを付加することにより構築した(図5)。このカセットを、連結しようとする2つのYACを含有する酵母に形質転換した。更に、カナマイシン耐性クローンはPCR及びサザンブロットによって特性決定し、連結が成功したことを確認した。次いで、KANR遺伝子を、FLPレコンビナーゼを使用してポップアウトした。連結領域のDNAを配列決定し、連結部位のFRT配列を含有するDNA「scar」の存在を確認した。YAC操作のそれぞれの工程では、PFGEを適用してYACのサイズを確認した。元のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの隣接配列を含むYACの逐次連結を使用して、それぞれ、ヒトC-遺伝子、D-遺伝子及びJ-遺伝子、並びに数が増え続けるV-遺伝子を有する多数のYAC構築物を作製した。
YAC構築物から作動される免疫応答の効率を強化するため、その後、それらをそれぞれ、ヒトC領域遺伝子をマウス重鎖定常領域エレメントで置き換えるよう改変した。
酵母形質転換用のDNAフラグメントの調製
マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント
フォワードプライマー:GACATTCTGCCATTGTGATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAAT(配列番号1)。このプライマーの最初の69bpは、ヒトJ6由来のものである(ID: J00256、http://www.imgt.org/IMGTlect/?query=201+J00256)。このプライマーの最後の24bpは、マウス配列3'からJ4に相補的である。リバースプライマー:TTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAGAGAAATG (配列番号2)、このプライマーは、領域5'からマウスIGHμ CH1に相補的なリバースである(図6)。テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用する2つのプライマーによるPCRを行い、マウスμエンハンサー及びヒトJ6領域に相同な一末端を有するμスイッチ領域をカバーする5.8kbのフラグメントを作製した。
フォワードプライマー:AGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTC (配列番号3);リバースプライマー:AACACCTTCAGCGATGCAGAC (配列番号4)。テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用するこれらの2つのプライマーを含む7.8kbのPCR産物は、CH1エキソン以外のマウスCγ1転写領域全体をカバーする(図7)。
Eμ及びCγ1フラグメントに対するリンカー1:TCATGCCCCTAGAGTTGGCTGAAGGGCCAGATCCACCTACTCTAGAGGCATCTCTCCCTGTCTGTGAAGGCTTCCAAAGTCACGTTCCTGTGGCTAGAAGGCAGCTCCATAGCCCTGCTGCAGTTTCGTCCTGTATACCAGGTTCACCTACTACCATATCTAGCCCTGCCTGCCTTAAGAGTAGCAACAAGGAAATAGCAGGGTGTAGAGGGATCTCCTGTCTGACAGGAGGCAAGAAGACAGATTCTTACCCCTCCATTTCTCTTTTATCCCTCTCTGGTCCTCAGAAGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTCACTAGAGGTGAGGCTCAAGCCATTAGCCTGCCTAAACCAACCAGGCTGGACAGCCATCACCAGGAAATGGATCTCAGCCCAGAAGATCGAAAGTTGTTCTTCTCCCTTCTGGAGATTTCTATGTCCTTTACACTCATTGGTTAATATCCTGGGTTGGATTCCCACACATCTTGACAAACAGAGACAATTGAGTATCACCAGCCAAAAGTCATACCCAAAAACAGCCTGGCAT(配列番号5)。リンカー1を作製するため、PCR1(313bp、プライマー1 F): TCATGCCCCTAGAGTTGGCTG; プライマー1 R: GAACCCCTCCTCCCTATACGTCCTCTTTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAGAGAAATG (配列番号6))、及びPCR2(258bp、プライマー2 F: AGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTC(配列番号7); プライマー2 R: ATGCCAGGCTGTTTTTGGGTA(配列番号8)を、テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用して合成した。オーバーラップする配列を含むPCR1及びPCR2は、プライマー1 F及びプライマー2 Rを使用する融合PCRによってリンカー1に構築された。
TACATCTTTTTTCCTCTCTGTCTGCATCGCTGAAGGTGTTTCGTCGCCGCACTTATGACT GTCTTCTTTA TCATGCAACT(配列番号9)
LEU2遺伝子マーカーを有する5.7kbのYACアームは、PshAI及びBamHI制限酵素を用いて、pYNOTベクター(図8、URA3をLEU2マーカーで置き換えることによりpYAC3から得たもの)を消化することによって作製した。
酵母スフェロプラスト形質転換(Sanchez and Lanzer, 2006)を使用し、5つのフラグメント(マウスEμ、マウスCγ1、YACアーム、リンカー1及びリンカー2)を、ヒトC領域を含むYACを有する酵母YLBW1株へ導入した。形質転換体は、トリプトファン及びロイシン欠失培地で選択した。ヒトJ6でオーバーラップする配列間の相同組換えによって、ヒト遺伝子がマウスEμ及びCγ1で置き換えられた。この新しいYACは、PCR及び連結部位の配列決定により特性決定された。
42kbの3'エンハンサーフラグメントのBAC-YACベクターへのクローニング
マウス3'エンハンサーは、42kbの領域3'から最後の定常遺伝子Cαに散在されているエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含有している。Cγ1遺伝子の3'部位に全エンハンサーを付加するため、エンハンサーエレメントの全てをカバーする42kbのMfeIフラグメントを、invitrogen社によって提供されている説明書に従って、BAC-YACベクターpYES1L(Invitrogen社)へサブクローニングした。構築物は、PCR、PFGE及び配列決定によって完全に特性決定された。MfeI消化によって、その後の酵母形質転換用のベクターから42kbのフラグメントが切り離された。
YACベクター(pHKT-Hy、図9)は、ハイグロマイシン(Hy)耐性遺伝子をpHKT(LEU2をHIS3マーカーで置き換えることによりpYNOTから誘導したもの)中へ挿入することによって構築した。SpeI及びBamHIを用いるこのベクターのダブル消化によって、Hy-HIS3-テロメアを含有する6.2kbのYACアームフラグメントが作製された。
マウスCγ1及び42kb 3'エンハンサーに対するリンカー1(626bp)
ACGGCTCAGGAGGAAAAGGCACTCTGTGTGGAGCTCTTCAGTGGGTATGAAATGGTGATGGAGAAGCCCAGGTGCACTGAAAATCCAGGAGCTGAATTTGATCACCAGGACGCATATGGTAGAGAGGAAAATGAATTGATTCCCAAATGTTCTCCTCTATGTGTGCACCGTGGCATGTGCATGCACACAATTACACATAAACACATTCAACATAAATACAACACACATATACACGCTGCACACACATACACACACAGAACACACACCACACACACACACCACACACAATCACACACATATTCCACACAGTACACCACAAACATCTATACACACCACACACACACAGACACACACACACACACATTCATACACAGCACAACACAAACATCTATACACAACACACACACAATACACATAGTCACACGCATATTCACTCACACACATATTCACCCACACACAATCATACATAGACACATTCAACATAAACACAACACCACACACACACACACTTGCACACACAAATGTAATGATTTTTTTAAGGACTACATCTTTTTTCCTCTCTGTCTGCATCGCTGAAGGTGTTCAATTGCCAAAATCACAGGTGAGCCCAGATGCATACCCGGGAC(配列番号10)。リンカー1を作製するため、PCR1(604bp、プライマー1 F: ACGGCTCAGGAGGAAAAGGCAC (配列番号11);プライマー1 R: TCACCTGTGATTTTGGCAATTGAACACCTTCAGCGATGCAGAC (配列番号12))を、テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用して合成した。次いで、PCR1は、プライマー1 F及びプライマーR: GTCCCGGGTATGCATCTGGGCTCACCTGTGATTTTGGCAATTG (配列番号13)により626bpまで延長した。
GAGGTACAGGGGGCTCATGGGTTTATAAGTTCAGGTTTATACCAAGGTTTCGGGGGGTAGCCTGAGGCTCATGTACCTTCTTGTGGTAGCCCCCAGGTTCTGTGCATGGTACTGCTCAGTTACTGGCATGGCTTCTGGGAAGGCTGGGCTCCCACGTCCCCTGTGGACACATGGTTACGCCAAGAACAGAACTACAAAGTTAGGAGTTACCATTCCCACCTGCACCTGTATCTCCAGTACCTGGGTTTCTAAGACGTAGTGAGTCCTCTTGCCAACCAGGGTCTGCCACAATGGTCAGGCACAGCTGTGGGCCGGTCAGCCCCATCAGGTCACACCAGCAGGTCCCAGGAGCACAGAGCTTAAATGCCCCCTAGTGTCCCTAGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGC(配列番号14)。リンカー2を作製するため、PCR1(379bp、プライマー1 F: GAGGTACAGGGGGCTCATGGGT (配列番号15);プライマー1 R:AGCCTCACTAGGGACACTAGGGGGCATTTAAGC (配列番号16))及びPCR2(387bp、プライマー2 F:CCCTAGTGTCCCTAGTGAGGCTCCGGTGCCCGT (配列番号17);プライマー2 R:GCGCAAGGCCTCGAACTCTC (配列番号18)を、テンプレートとしてBAC RP23-354L16及びBAC RP24-72M1をそれぞれ使用して合成した。オーバーラップする配列を有するPCR1及びPCR2は、プライマー1 F及びプライマー2 Rを使用する融合PCRによって、構築されリンカー2が作製された。
4つのフラグメント(3'エンハンサー、Hy-HIS3-テロメアYACアーム、リンカー1及びリンカー2)は、酵母スフェロプラスト形質転換によって、3'エンハンサー付加用のYACを含有する酵母YLBW1株に導入された。形質転換体は、トリプトファン及びヒスチジン欠失培地上で選択した。オーバーラップするフラグメント間の相同組換えによって、3'エンハンサー及びYACを選択するためのHy-HIS3-テロメアアームが付加され、Crescendo YAC1又はYAC2が作製された(図10)。この新しいYACは、PCR及び連結部位の配列決定により特性決定された。この新しいYACのサイズは、PFGE及びサザンブロッティングによって確認した。
マウスCγ1遺伝子を含有するYACに加えて、複数の定常遺伝子-全てがCH1ドメインを欠失しているマウス定常遺伝子Cγ1、Cγ2b及びCγ2aを含むように他のYACが設計された(図10)。
下記に挙げたプライマーを使用し、7つのオーバーラップするPCRフラグメントを、テンプレートとしてRP24-72M1を使用して増幅させた。フラグメント3は、Cγ2b(CH1欠失)との融合PCRによって合成された。フラグメント6は、Cγ2a(CH1欠失)との融合PCRによって合成された。
フラグメント1:45k-1 8057bp
フォワード:GGTTGGATTCTATCTTCGCATGG(配列番号19)
リバース:TGGGTCCTGTCTTTCTACCTTTG (配列番号20)
フラグメント2:45k-2 8304bp
フォワード:GCTCCTTGCTGGGTCTTAATGTT(配列番号21)
リバース:TTAGAACCGTGTCTTCTACAATTGA(配列番号22)
フラグメント3:45k-3 1.3kb CH1Δ
45k-3-左
フォワード:GGGTAGGAGGTTGTTGGTTA(配列番号23)
リバース:CCCGCTGGGCTCTGCAAGAGAGGAGAATGTGTGA(配列番号24)
45K-3-右
フォワード:CTCTCTTGCAGAGCCCAGCGGGCCCATTTCA(配列番号25)
リバース:GCTTGTTTTTATATCGAGCTTGC(配列番号26)
フラグメント4:45k-4 8412bp
フォワード:TCAGTCTCACTTGCCTGGTCGT(配列番号27)
リバース:CTTTGTAGCACATGCGTCATCC(配列番号28)
フラグメント5:45k-5 9012bp
フォワード:TGAAGGCATGAAGGAGTTGAGC(配列番号29)
リバース:ACAACCCCCTATCCTACACATT(配列番号30)
フラグメント6:45k-6 2274b CH1Δ
45k-6-左
フォワード:GGGTCCTGGCAACATTAGCG(配列番号31)
リバース:CACTCTGGGCTCTGCAAGAAAGGAGGATGTGTGA(配列番号32)
45k-6-右
フォワード:CTTTCTTGCAGAGCCCAGAGTGCCCATAACAC(配列番号33)
リバース:TGGTGTTCAGCAGGCTAATTTG(配列番号34)
フラグメント7:45k-7 9968bp
フォワード:CAGGCCCCACTTCTTTACCTAA(配列番号35)
リバース:TTGTTAGTTCATCACAGGGCAATTC(配列番号36)
7つのPCR産物並びに末端のフラグメント1及びフラグメント7に対するオーバーラップ配列を含む線状化BAC-YACベクターを相同組換えのため酵母に形質転換した。45kb-YACは、連結のPCR、PFGE及び配列決定によって確認された。PmeI制限酵素は、環状YACから45kbフラグメントを切り離す。
マウスμエンハンサー及びスイッチμフラグメント、CH1が欠失したCγ1フラグメント及びリンカー1(1.3.1)、Cγ2b及びCγ2aを含有する45kb PmeI制限フラグメント、並びに末端の5'のμエンハンサーフラグメント及び3'の45kbフラグメントに対するオーバーラップ配列を有する線状化BAC-YACベクターを、相同組換え用の酵母に形質転換した。58kb-YACは、連結のPCR、PFGE及び配列決定によって確認された。PmeI制限酵素は、環状YACから58kbフラグメントを切り離す。
1つがCγ1-Cγ2b-Cγ2aを含む58kb、もう1つが、58kbフラグメントの3'末端に対するオーバーラップ配列を有するYACアームである2つのフラグメントを、スフェロプラスト形質転換によって、Cγ1-Cγ2b-Cγ2a遺伝子を付加するために設計されたYACを含有する酵母に導入した。形質転換体は、YACアームに含まれている栄養要求性マーカーに基づき、アミノ酸欠失培地で選択された。オーバーラップフラグメント間の相同組換えによって、Cγ1-Cγ2b-Cγ2aフラグメント及び新規YACアームが、選択したYACに付加された。この新しいYACは、PCR及び連結部位の配列決定によって特性決定された。この新しいYACのサイズは、PFGE及びサザンブロッティングによって確認した。次に、42kbのマウス3'エンハンサーが(上述のようにして)付加され、Crescendo YAC3が作製された(図10)。
ノックアウトマウスの作製
マウス重鎖遺伝子座(WO2004/076618及びRen, L.ら, Genomics 84 (2004), 686-695)、マウスラムダ遺伝子座(Zou, X.ら, EJI, 1995, 25, 2154-2162及びWO2003/000737)並びにカッパ遺伝子座(Zou, X.ら, JI 2003 170, 1354-1361及びWO2003/000737)を発現停止させるために使用される方法は、既に開示されている。簡単に説明すると、マウス重鎖定常領域及びマウスラムダ鎖遺伝子座の大規模な欠失により、これらの2つの免疫グロブリン鎖の発現停止が生じた。カッパ軽鎖は、ネオマイシン耐性カセットの標的挿入を介して発現停止された。
内因性軽鎖(カッパ及びラムダ)の二重発現停止を有するマウスは、従来の育種によって作製した(Zou, X.ら, JI 2003 170, 1354-1361)。これらの軽鎖KOマウスを重鎖KOマウスと共に更に飼育し、トリプルノックアウト(TKO)系を得るための交配用トリプルヘテロ接合動物を得た。この系は繁殖力があることが判明し、純粋な育種系統として維持されている。
プライマーは、内因性重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖領域のそれぞれについて、野生型と発現停止された遺伝子座との間の識別ができるように設計した。ゲノムDNAは、仔から得た尾部又は耳の生検から抽出し、PCR反応内の鋳型DNAに使用した。gDNAは、十分に開示されている方法を使用して(例えば、メーカーの使用説明書に従い、Viagen Direct PCR溶解試薬(尾部)cat no 102-Tを使用して)抽出した。以下のプライマー(Sigma社から購入したもの)をPCR反応において使用した。
TKOマウスのヌル表現型は、マウス重鎖、重鎖/軽鎖複合体及び軽鎖に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて確認した。簡単に説明すると、免疫吸着プレート(例えば、Nunc Maxisorb 96Fウェルプレート カタログ番号443404)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した捕捉抗体の5ug/ml溶液でコーティングした。PBS/0.05% Tween、PBSで洗浄し、粉乳の3%溶液でブロッキングした後、血清希釈液(3%粉乳/PBS中)をプレートにアプライした。非結合のタンパク質を洗浄した後、結合タンパク質を適切なビオチン化-検出抗体溶液で検出し、予め決定した最適希釈液を使用し、続いてニュートラアビジン-HRPで可視化を行った。様々な市販の抗体をこれらのELISAに使用することができる。Table 1(表5)は、こうした抗体の例を示す。
胚幹細胞の単離は開示されている(Ying, Q.L.ら, Nature, 453, 519-523, 2008, Nichols, J.ら, Development, 1136, 3215-3222, 2009, Nagy, K. & Nichols, J., "Derivation of Murine ES Cell Lines", p431 - 455 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編)。この2i法は、FGF/Erkシグナル伝達系を遮断し、ES細胞を未分化状態に維持する小分子阻害剤を利用する。更に、これらの阻害剤を含有する培地で初期の胚をインキュベートすると胚の細胞内塊が胚盤葉系統に分化し、分化誘導内胚葉の発生が阻害される。これによって、ES細胞株をより容易に得ることができる豊富な外胚葉区画が提供される。
遺伝子導入
a)前核マイクロインジェクション
トランスジェニック動物を作製するDNAの前核マイクロインジェクション技術は十分に開示されている(例えば、K. Becker & B. Jerchow "Generation of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection" pp 99-115 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編、Springer Protocols 2011を参照されたい)。簡単に説明すると、受精卵母細胞は、繁殖用雄と交配した過剰排卵雌マウスから単離する。過剰排卵にするため、雌に、妊娠雌馬血清ゴナゴトロピン(PMSG)5 I.U.を含有するPBS 100ulを2日前に腹腔内注射する。46〜48時間後、PBS 100ul中のヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)5 I.U.を投与し(腹腔内)、雌を繁殖用雄と交尾させる。翌朝、卵丘複合体を、ヒアルロニダーゼ溶液で消化することによって遊離させ、回収卵管及び卵母細胞から採取する。マイクロインジェクション用の受精卵母体の産生には、様々な系統のマウスを首尾よく使用することができる。
YAC構築物をES細胞に導入するのには様々な経路がある(下記に記載)。どの経路を選択するかにかかわらず、導入遺伝子の組み込みに成功したESクローンを取得することが目的である。前核マイクロインジェクション技術に関するES介在性遺伝子組換えの利点は、トランスジェニック系統の作製にそれらを使用する前にESクローンを完全に特性決定することができるということである。ESクローンに対して実施される特性決定は、前核インジェクション由来のF0動物及びF1動物をスクリーニングするのに使用したものと本質的に同じである(下記を参照)。またin situハイブリダイゼーションを適用して、組み込みの染色体を決定することもできる。これは、ES細胞がTKOよりもむしろwtである場合に、特に望ましい可能性がある。内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を欠損する染色体上に組み込まれたYACを有するESクローンのみが、トランスジェニック系統の作製に選択され得る。この事前選択によって、TKOバックグラウンドへの戻し交配を効果的に妨げる結合遺伝子座が存在しないことが確実になる。
YACは、前述したように、本質的に精製することができる(上記「マイクロインジェクション用のYACの調製」を参照)。精製YACは、例えば、リポフェクションを使用して(例えば、Invitrogen社リポフェクタミン試薬と共に)ES細胞に導入し、その後、ES細胞はハイグロマイシンを使用する選択に供する(YAC設計により指示されているように、代替の選択的試薬を使用することができる)。クローンが選抜及びスクリーニングされ、適切なクローンを使用してトランスジェニック系統が作製される。様々な特徴が構築物及び/又は標的化ES細胞に導入され、トランスフェクトされたESクローンの誘導を促進することができる(下記を参照)。
YACをES細胞に導入する別法は、スフェロプラスト融合による。この方法は、大きな構築物の操作が最小限に抑えられ、それによって、剪断によって構築物に損傷が生じる可能性を制限するという利点を提供する。スフェロプラスト融合技術は開示されている(Davies, N.ら, "Human antibody repertoires in transgenic mice: manipulation and transfer of YACs"p59-76 in "Antibody Engineering. A Practical Approach" Ed. McCaffertyら, IRL Press at Oxford University Press, 1996)。簡単に説明すると、酵母スフェロプラストは、酵母細胞壁のチモリアーゼ消化によって作製される。分解したES細胞をスフェロプラストと混合し、ポリエチレングリコール溶液を添加することによって融合が行われる。培地中に再懸濁した後、ES細胞を洗浄し、下記のように、選択培養、クローニング、スクリーニングに供する。
YAC1導入遺伝子(後続の全てのYAC構築物に共通のコア構造を含有する)にさらなる特徴を加える代替方法は、ES細胞株内に位置しているYAC1導入遺伝子の標的伸長を実施することである(図14)。YAC1導入遺伝子を有するES細胞株は、in vitroで作製するか、又はYAC1トランスジェニックマウスの胚に由来する。新しい特徴は、本明細書の他の箇所に記載されているような相同組換えによって、又は挿入ベクターの使用によって、導入遺伝子に導入され得る。
初代の特性決定及びスクリーニング
a)導入遺伝子の存在及び生殖細胞系伝達
マイクロインジェクションを行った卵母細胞移入後の全ての仔について、それらのゲノムDNA内のYACの存在をチェックした。ES細胞由来のトランスジェニック仔では、毛色遺伝学もまた適切な胚盤胞ドナー動物の選択と組み合わせて利用され、キメラ仔は、その毛色から容易に同定され得る。以下のスクリーニングの例は、前核マイクロインジェクション遺伝子組換えに由来する同腹仔を使用する。しかし、ESクローンを遺伝子組換えの前に同様の分析に供し、得られた同腹仔を確証的な結果についてスクリーニングすることができる。
全ての場合において、トランスジェニック遺伝子座は、ヒトゲノムDNA配列を有していた。したがって、ヒト配列中に存在する繰り返しモチーフであるヒトDNA AluエレメントG15N2(Genbank X55929.1)の存在をスクリーニングすることができる。制限酵素で消化したヒトgDNAの所定領域は、Aluプローブを使用するサザンブロット分析で特性吸収帯パターンを生じる。したがって、YACのAluフィンガープリントを、トランスジェニック動物から抽出したgDNAから得られたものと比較し、導入遺伝子の構造上の完全性の指標を得る。完全なYAC導入遺伝子では、酵母内に存在するYACと同様のフィンガープリントが得られることが予想される。
YACの複数のコピーがトランスジェニックマウス(又は選択したESクローン)のゲノム内に存在している可能性がある。これは、異なる組み込み部位で、又は単一染色体の位置での繰り返し方式のいずれかで起こり得る。独立して分離される組み込み部位の数は、遺伝学上の遺伝パターンの研究及びメンデル遺伝学の適用から推論することができる。例えば、単一の組み込み部位は、後代に50%の遺伝パターンをもたらすが、2つの組み込み部位は、3:1のトランスジェニック:非トランスジェニック遺伝をもたらす。
TKOへの育種
a)従来の育種
野生型バックグラウンドで作製したトランスジェニックマウスをTKO系統と戻し交配し、導入遺伝子をこの所望のバックグラウンドに移した。これは、それぞれの育種スケジュールごとに選択される、慎重に遺伝子型が同定された後代との連続する育種工程を使用する従来の育種によって行った。
TKOバックグラウンドへのトランスジェニック系統の実施には、完了するまで、それぞれ一巡の育種に9〜12週間を要する時間のかかる手順である。しかし、IVF方略を使用し、慎重なスケジューリングを行うことにより、戻し交配を完了してTg/wtのTKO系統との最初の交配から約15週間以内にTg/TKO仔のかなり大きい同齢集団(cohort)を得ることができる程の規模まで育種を拡大した。Table 5(表9)は、こうしたIVF-促進育種プログラムから得たデータを含んでいる。同様のIVF工程を使用して、既にTKOバックグラウンドで得られているトランスジェニック系統を(例えば、TKO/ES細胞から、又は前核マイクロインジェクションからTKO卵母細胞へ)速やかに展開させることができる。
導入遺伝子使用の評価
B細胞発生中に、免疫グロブリン遺伝子座の体細胞組換えが起こり、抗体レパートリーが生じる(例えば、概説については、Kuby Immunology、第6版; T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne, J Kuby. W.H. Freeman and Company刊, New York, 2007を参照)。重鎖については、この方法はV-D-J領域の組換えを含む。これらの遺伝子セグメントのあいまいな連結によって、ナイーブレパートリーの利用され得る潜在的な多様性が増す。スプライシングされたVDJ遺伝子フラグメントによりVHドメインが生じ、これを、定常域遺伝子によってコードされている別のドメインに連結させる。再配列されたgDNAによってB細胞内にRNA転写物が生じ、これらが翻訳され、膜発現及びHcAb分子の分泌の両方が起こる。したがって、YAC導入遺伝子転写産物の機能的活性を探索する場合、B細胞及び血清タンパク質の両方をアッセイした。
リンパサンプル(例えば、血液サンプル、脾臓)をトランスジェニック動物から取得した。RNAは、市販試薬(例えば、RNeasy Qiagenキット、カタログ番号74106)を使用してリンパサンプルから単離し、Supercript III酵素(Gibco社)と共に適切なプライマー(下記に詳細)又はoligodTプライマー(Gibco社)を使用して逆転写した。関連する全てのバッファー及び条件は、メーカーにより推奨されたものであった。このようにして得られたcDNAは、VHドメインに特異的なプライマーを使用するか(いくつかは、以後のライブラリー作製に適用-以下を参照)、又はVHリーダー及び定常領域に関するプライマー(Table 6(表10))を用いて、VH領域を増幅するPCR反応に使用した。
実施例タッチダウンプログラム;
サンドイッチELISA技術は既に開示されている(TKOマウスの特性決定を参照)。適切な抗体の対を捕捉及び検出に使用し、導入遺伝子によってコードされているタンパク質をトランスジェニックマウスの血清で検出した。サンドイッチELISAに使用した試薬は、市販されている。ELISAを使用して血清内のHcAbを検出した、トランスジェニックマウスの分析を図20に示す。
細胞分析-フローサイトメトリー
B細胞発生経路は、特定の発生段階に関連した、十分に特徴づけられた様々な試薬及びマーカーを用いるフローサイトメトリーを使用してモニタリングすることができる。例えば、初期のプレB細胞は、c-kit及びIL7Rを発現し、細胞が成熟した表面Ig-陽性B細胞に進行するにつれて、例えばCD43、CD19、B220等の他のマーカーが獲得されるか(例えば、CD19、B220)、又は獲得されダウンレギュレートされる(例えば、CD43)(図21を参照)。更に、B細胞レパートリー内では、マーカーを使用して、B-2 B細胞(CD23+、CD5-)を他のB細胞サブセットと区別することができる。前者は、後天性の体液性免疫反応に関与し得る(図22を参照)。
脾臓の免疫組織化学
脾臓は、赤脾髄区域及び白脾髄区域を含む組織化構造を有し、後者はB細胞及びT細胞が豊富な領域を含有している。ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織から得た組織切片のヘマトキシリン及びエオシン染色を使用してこの構造を明らかにし、野性型マウス、トリプルKOマウス及びTg/TKOマウスに関する比較画像を示す(図23)。これらから、TKOマウスでは構造が損傷されており、卵胞の数は少なく、卵胞周辺の辺縁領域がないことが明らかである。これらの特徴は、TKOマウスにおいてB細胞が存在しないことと一致している。またTgマウスに関する画像が示すように、構造は回復され、卵胞は密集度がより高く、明白な辺縁領域によって囲まれている。
VHドメインの産生
標的特異的VHドメインは、免疫化トランスジェニックマウス又はナイーブトランスジェニックマウス由来のRNAを用いて作製されたディスプレイライブラリーを使用し単離した。
異なる標的抗原の選択は、当技術分野で周知の多数の免疫プロトコルの中の1つを使用し、トランスジェニックマウスに投与した。血清ELISAの例を図24に示す。サンドイッチELISAは、上記で概説したのと同様である。簡単に説明すると、吸着プレートを抗原でコーティングし、洗浄及びブロッキングした後、動物由来の血清の希釈液を添加した。抗原コーティングプレートに結合している全てのHCAbは、ビオチン化抗Fc Ab、次いでニュートラアビジン-HRPとインキュベーションし、基質を添加した後に検出した。
それぞれのVHファミリーの大きなライブラリーを、YAC1トランスジェニックマウス由来の113の脾臓を使用して構築した。上記のように、それぞれの脾臓を個別に処理し、個々のRNAのアリコートを異なるVHファミリーライブラリー構築に使用した。このライブラリーの特性の概要を図35のナイーブライブラリーに示す。ライブラリーは約3.81×1010クローンからなっており、各ファミリーからの配列決定のサンプルはクローン多様性が高いことを示し、ほとんどのクローンはサンプル内で1回のみ単離される。
ディスプレイライブラリーをナイーブトランスジェニック動物及び免疫化トランスジェニック動物の両方から構築した。簡単に説明すると、リンパ系組織をRNAまで収集し、次いで機械的にホモジナイズし、溶解させた。或いは、新鮮なリンパ系組織、血液、又はハイブリドーマを含むB細胞の別の供給源をRNAの供給源として使用することができる。RNAの抽出後、(全RNA又はメッセンジャーRNAのいずれかの)cDNAを作製した。次いで、PCRを使用してVH配列を増幅させ、ファージミドベクターへのクローニングができるように適切なアダプターを加えた。VHのクローニングには、多くの手法を使用することができる。本件の場合、導入遺伝子内に存在するリーダー配列用の縮重プライマーを、J/H連結用の縮重プライマーと共に使用した。別法は、ターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いて、リーダー配列の代わりに使用するための反復デオキシリボヌクレオチドベーステール又はアンカーを付加することによる。増幅後、VH産物をNcoI及びXhoIで消化し、ベクターに連結するか、又は、プライマーとして使用し、PCR系の手法を使用してファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターをインハウスで構築した(図17を参照)。追加の適応配列(adaption sequence)を有するプライマーは、前のセクションに記載している(分子の分析;転写産物-RT-PCR、クローニング及び配列決定を参照)。
VHの特性
上記のYAC構築物の1つを有するトランスジェニックマウスは、高品質の候補薬剤の発見に関して有効な利点を提供する。従来の供給源(例えば、ヒトcDNA)から単離されるVHドメインとは異なり、VHドメインは発生し、軽鎖の非存在下で成熟する。このように、トランスジェニックマウスに由来するVHドメインは、それらの折り畳みの安定化又はそれらの溶解性の保持に、パートナー軽鎖の存在に依存しない。この証拠は、ナイーブトランスジェニックマウスから単離されたVHを、ヒトcDNAライブラリーからin vitroで誘導されたものと比較する実験から得られた。VHに関する配列を、前述のファージミドベクターにクローニングし、大腸菌における小スケール(50ml)発現試験を試みた。これらは、配列を最適化することなく、またタンパク質生産を最大限にするための特殊な方法を使用することなく実施した。IPTGによる誘導後、可溶性VHの発現を決定した。マッチしたV-遺伝子ファミリーからのVHを使用した場合、ヒトcDNA由来VHクローンでは47%のみ(15/32クローン)が、大腸菌由来のペリプラズム抽出物から少なくとも10ugの可溶性タンパク質を提供することができることを確認した。対照的に、ナイーブトランスジェニックYAC1/TKOマウスからクローニングされたVHでは79%(27/34)が、10ugを超える可溶性発現収量をもたらした。更に、図30に示した結果から明らかなように、個体群ベースで、トランスジェニックマウス内での軽鎖の非存在下で発生したVHでは、本発明者らがパートナー軽鎖と関連して発生したと推定するヒトcDNAライブラリー由来のもの(平均=37.6ug/50ml)と比較した場合、高い収量(平均=176ug/50ml)であることが明らかであった。したがって、いずれの供給源からのVHも可溶性フォーマットで発現することはできるが、トランスジェニックマウス内で発生した個体群は高い溶解性を示し、全体で約5倍の可溶性タンパク質の収率をもたらした。収量の増大は、免疫後のマウスからクローニングされた、in vivoでの親和性-成熟VHに関して明白であった。この場合、小実験室スケール培養で、約10mg/リットルまでの上昇が生じ、これはいかなる最適化も行うことなく、ファージミド発現系を使用して得られた。
Claims (29)
- a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー
d)スイッチμエレメント
e)Cγ1、Cγ2b、及び/又はCγ2aから選択される、CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子、及び
f)マウス3'エンハンサー領域
を含むベクター。 - 前記マウス3'エンハンサー領域が少なくとも42kbのサイズである、請求項1に記載のベクター。
- 前記マウス3'エンハンサー領域が、hs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7から選択される1つ又は複数のエンハンサーエレメントを含む、請求項1又は2に記載のベクター。
- 前記マウス3'エンハンサー領域が、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む、請求項3に記載のベクター。
- 10から44の機能性ヒトV遺伝子を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のベクター。
- 選択マーカーを更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のベクター。
- 酵母人工染色体(YAC)である、請求項1から6のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1から7のいずれか一項の記載のベクターで形質転換されたトランスジェニックマウス宿主細胞。
- 前記細胞がES細胞である、請求項8に記載のトランスジェニックマウス宿主細胞。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のベクター又は請求項8若しくは9に記載の細胞を含むトランスジェニックマウス。
- 1つ又は複数の非機能性内因性免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項10に記載のトランスジェニックマウス。
- 非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座を含む、請求項11に記載のトランスジェニックマウス。
- 非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座を含む、請求項11又は12に記載のトランスジェニックマウス。
- 非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項11から13のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
- 非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座、非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座及び非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項11に記載のトランスジェニックマウス。
- HCAbドメイン又はVHドメインの産生における、請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス又は請求項8若しくは9に記載の細胞の使用。
- ライブラリーの構築における、請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスの使用。
- 前記ライブラリーがナイーブライブラリーである、請求項17に記載のトランスジェニックマウスの使用。
- 請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスを使用してライブラリーを作製する方法。
- 前記ライブラリーがナイーブライブラリーである、請求項19に記載の方法。
- 請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス、又は請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスのex vivo組織若しくは細胞のex vivo免疫を含む、ライブラリーを作製する方法。
- マウス又はマウス宿主細胞において、請求項1から7のいずれか一項に記載のベクターを導入及び発現させることを含む、HCAbドメイン又はVHドメインを作製する方法。
- 前記マウスが1つ又は複数の非機能性内因性免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記マウスが非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記マウスが非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座を含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マウスが非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項22から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マウスが非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座、非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座及び非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項22に記載の方法。
- 単離細胞又は単離組織に由来するmRNAからVHドメインをコードする配列をクローニングすることと、クローニングした転写産物からライブラリーを構築することと、VHドメインを単離することとを含む、請求項22から27のいずれか一項に記載の方法。
- a)トランスジェニックマウスにおいて請求項1から7のいずれか一項に記載のベクターを発現させる工程と、
b)HCAbを発現する細胞又は組織を単離する工程と、
c)前記単離された細胞又は単離された組織由来のmRNAからVHドメインをコードする配列をクローニングする工程と、
d)クローニングした転写産物からライブラリーを構築する工程と、
e)VHドメインを単離する工程と
を含む、可溶性VH結合ドメインを産生する方法。
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