CN105861548B - Adam6小鼠 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含内源ADAM6基因座的ADAM6活性降低或缺失或缺少编码小鼠ADAM6蛋白的内源基因座的小鼠，其中所述小鼠包含编码在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的序列。在一个实施方案中，所述序列是异位ADAM6序列或赋予雄性小鼠通过交配产生后代的能力的序列。本发明还提供了具有经过基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的小鼠和细胞，所述基因座包含编码小鼠ADAM6或其功能片段或同源物或直系同源物的异位核苷酸序列。

Description

ADAM6小鼠
本申请是申请号为201280010457.X、申请日为2012年2月24日、发明名称为“ADAM6小鼠”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2012/026416的国家阶段申请，该国际申请要求申请日分别为2011年2月25日、2011年6月16日和2012年2月6日，申请号分别为61/446,895、61/497,650和61/595,200的美国申请的优先权。这些专利申请特此以全文引用的方式并入。
技术领域
描述了包含编码功能性ADAM6基因座的核酸序列的基因修饰小鼠、细胞、胚胎和组织。修饰包括人和/或人源化的免疫球蛋白基因座。描述了缺少功能性内源ADAM6基因但包含ADAM6功能的小鼠，包括包含编码ADAM6蛋白的异位核酸序列的小鼠。描述了包含使小鼠不能制造功能性ADAM6蛋白并导致生育力丧失的内源免疫球蛋白VH基因座修饰、并且其中还包含ADAM6功能的基因修饰雄性小鼠，包括包含使雄性小鼠恢复生育力的异位核酸序列的小鼠。
背景技术
所属领域中已知含有人抗体基因的小鼠。在过去二十年里，抗体的医药应用已经深化了对制造适合用作人治疗剂的抗体的大量研究。基于小鼠抗体的早期抗体治疗剂作为人治疗剂并不理想，因为对人重复施用小鼠抗体会产生能打乱长期治疗方案的免疫原性。开发了基于人源化的小鼠抗体的解决方案，这使所述抗体更像人的，而不那么像小鼠的。随后开发了用于抗体的人免疫球蛋白序列的表达方法，主要基于人免疫球蛋白文库在噬菌体、细菌或酵母中的体外表达。最后尝试了在移植了人造血细胞的小鼠中和在内源免疫球蛋白基因座失去功能的转染色体或转基因小鼠中，从人淋巴细胞在体外制造有用的人抗体。在转基因小鼠中，必需使内源小鼠免疫球蛋白基因失去功能，使得随机整合的完全人转基因充当在小鼠中表达的免疫球蛋白序列源。所述小鼠可制造适合用作人治疗剂的人抗体，但这些小鼠的免疫系统会出现重大问题。这些问题(1)导致小鼠无法用于产生足够多样性的抗体谱系，(2)需要使用大量的重组工程固定物，(3)提供欠佳的克隆选择过程，这很可能是因为人元件与小鼠元件之间的不相容性所致，并(4)使得这些小鼠无法成为庞大且多样性的人可变序列群体的可靠来源，所述人可变序列群体是实际用于制造人治疗剂所必需的。
所属领域仍然需要制造可用于产生免疫球蛋白序列(包括人抗体序列)的改良型基因修饰小鼠。另外也仍然需要下述的小鼠，即其能够重排免疫球蛋白基因区段以形成有用的重排免疫球蛋白基因，或能够从被改变的免疫球蛋白基因座制造蛋白质，同时降低或消除了可能由基因修饰形成的有害变化。
发明内容
在一个方面，提供了用于制造包含产生非功能性内源小鼠ADAM6蛋白或ADAM6基因的修饰(例如内源ADAM6基因的敲除或缺失)的小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，其中所述小鼠包含编码在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
在一个方面，提供了用于制造包含内源小鼠免疫球蛋白基因座的修饰的小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方案中，所述内源小鼠免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座，并且所述修饰降低或消除了雄性小鼠的细胞或组织的ADAM6活性。
在一个方面，提供了包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或功能片段的异位核苷酸序列的小鼠；还提供了包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的内源核苷酸序列、以及重链免疫球蛋白基因座的至少一个基因修饰的小鼠。
在一个方面，提供了用于制造包含内源小鼠免疫球蛋白基因座的修饰的小鼠的方法，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段。本发明的小鼠例如可以通过本文所述的方法获得。
在一个方面，提供了用于制造包含免疫球蛋白重链基因座的基因修饰的小鼠的方法，其中所述方法的应用产生了包含被修饰的免疫球蛋白重链基因座(或其缺失)的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方案中，所述雄性小鼠能够产生可从小鼠子宫迁移通过小鼠输卵管以使小鼠卵子受精的精子。
在一个方面，提供了用于制造包含免疫球蛋白重链基因座的基因修饰的小鼠的方法，其中所述方法的应用产生了包含被修饰的免疫球蛋白重链基因座(或其缺失)的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠展现出生育力下降，并且所述小鼠包含使生育力下降完全或部分恢复的基因修饰。在各实施方案中，生育力下降的特征为雄性小鼠的精子不能从小鼠子宫迁移通过小鼠输卵管以使小鼠卵子受精。在各实施方案中，生育力下降的特征为精子展现出体内迁移缺陷。在各实施方案中，使生育力下降完全或部分恢复的基因修饰是编码在雄性小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
在一个实施方案中，所述基因修饰包含用另一个种(例如非小鼠种)的免疫球蛋白重链可变基因座置换内源免疫球蛋白重链可变基因座。在一个实施方案中，所述基因修饰包含将直系同源免疫球蛋白重链可变基因座插入内源免疫球蛋白重链可变基因座中。在一个具体实施方案中，所述种是人。在一个实施方案中，所述基因修饰包括使内源免疫球蛋白重链可变基因座完全地或部分地缺失，其中所述缺失导致内源ADAM6功能的丧失。在一个具体实施方案中，所述内源ADAM6功能的丧失与雄性小鼠的生育力下降有关。
在一个方面，提供了包含下述修饰的小鼠，所述修饰降低或消除了从内源ADAM6等位基因表达小鼠ADAM6，使得因为内源ADAM6功能的降低或消除，具有所述修饰的雄性小鼠展现出下降的生育力(例如通过交配产生后代的能力高度下降)或基本上不育，其中所述小鼠进一步包含异位ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能片段。在一个方面，所述降低或消除了小鼠ADAM6表达的修饰是小鼠免疫球蛋白基因座中的修饰(例如插入、缺失、置换等)。
在一个实施方案中，ADAM6功能的降低或丧失包括小鼠不能或基本不能产生可从小鼠子宫迁移通过小鼠输卵管以使小鼠卵子受精的精子。在一个具体实施方案中，在小鼠射精量中所产生的至少约95％、96％、97％、98％或99％的精细胞不能在性交后在体内迁移通过输卵管并且不能使小鼠卵子受精。
在一个实施方案中，ADAM6功能的降低或丧失包括在小鼠精细胞的表面上不能形成或基本不能形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方案中，ADAM6功能的丧失包括基本不能通过与雌性小鼠性交来使小鼠卵子受精。
在一个方面，提供了一种缺少功能性内源ADAM6基因并且包含赋予小鼠ADAM6功能性的蛋白质(或编码该蛋白质的异位核苷酸序列)的小鼠。在一个实施方案中，所述小鼠是雄性小鼠，并且所述功能性包括与缺少功能性内源ADAM6基因的小鼠相比增强的生育力。
在一个实施方案中，所述蛋白质由位于小鼠种系中的免疫球蛋白基因座内的基因组序列编码。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在另一个具体实施方案中，所述重链基因座包含至少一个人VH、至少一个人DH和至少一个人JH基因区段。在一个实施方案中，所述异位蛋白质由位于小鼠种系中的非免疫球蛋白基因座内的基因组序列编码。在一个实施方案中，所述非免疫球蛋白基因座是转录活性基因座。在一个具体实施方案中，所述转录活性基因座是ROSA26基因座。在一个具体实施方案中，所述转录活性基因座与组织特异性表达有关。在一个实施方案中，所述组织特异性表达存在于生殖组织中。在一个实施方案中，所述蛋白质由随机插入小鼠种系中的基因组序列编码。
在一个实施方案中，所述小鼠包含人或嵌合人/小鼠或嵌合人/大鼠轻链(例如人可变轻链、小鼠或大鼠恒定轻链)和嵌合人可变/小鼠或大鼠恒定重链。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含含有可操作地连接到转录活性启动子(例如ROSA26启动子)上的嵌合人可变/大鼠或小鼠恒定轻链基因的转基因。在另一个具体实施方案中，所述嵌合人/小鼠或大鼠轻链转基因包含小鼠的种系中的重排的人轻链可变区序列。
在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列位于小鼠种系中的免疫球蛋白基因座内。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方案中，所述重链基因座包含至少一个人VH、至少一个人DH和至少一个人JH基因区段。在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列位于小鼠种系中的非免疫球蛋白基因座内。在一个实施方案中，所述非免疫球蛋白基因座是转录活性基因座。在一个具体实施方案中，所述转录活性基因座是ROSA26基因座。在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列随机插入小鼠的种系中。
在一个方面，提供了一种缺少功能性内源ADAM6基因的小鼠，其中所述小鼠包含补偿小鼠ADAM6功能的丧失的异位核苷酸序列。在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列赋予所述小鼠产生与含有功能性内源ADAM6基因的对应野生型小鼠相当的后代的能力。在一个实施方案中，所述序列赋予所述小鼠在其精细胞表面上形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物的能力。在一个实施方案中，所述序列赋予所述小鼠从小鼠子宫迁移穿过小鼠输卵管抵达小鼠卵子以使所述卵子受精的能力。
在一个实施方案中，所述缺少功能性内源ADAM6基因并且包含所述异位核苷酸序列的小鼠在六个月时期内所产生的窝数是相同年龄和品系的野生型小鼠所产生的窝数的至少约50％、60％、70％、80％或90％。
在一个实施方案中，所述缺少所述功能性内源ADAM6基因并且包含所述异位核苷酸序列的小鼠在交配繁殖6个月时所产生的后代是缺少所述功能性ADAM6基因且缺少所述异位核苷酸序列的相同年龄和相同或相似品系的小鼠在基本相同条件下交配繁殖基本相同时间所产生的后代的至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10倍或以上。
在一个实施方案中，所述缺少功能性内源ADAM6基因并且包含所述异位核苷酸序列的小鼠在4或6个月的交配繁殖期内每窝所产生的平均幼崽数是缺少功能性内源ADAM6基因并缺少所述异位核苷酸序列并且交配繁殖相同时间的小鼠每窝所产生的幼崽数的至少约2倍、3倍或4倍。
在一个实施方案中，所述缺少功能性内源ADAM6基因并且包含所述异位核苷酸序列的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生的精子当在性交后约5-6小时从输卵管回收时反映出的输卵管迁移性是缺少功能性内源ADAM6基因并且缺少所述异位核苷酸序列的小鼠的至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或更高倍。
在一个实施方案中，所述缺少功能性内源ADAM6基因并且包含所述异位核苷酸序列的小鼠当与雌性小鼠性交时产生能在约6小时内以和野生型小鼠的精子大致相同的效率穿过子宫并进入和穿过输卵管的精子。
在一个实施方案中，所述缺少功能性内源ADAM6基因并且包含所述异位核苷酸序列的小鼠在相当的时期内所产生的窝数是缺少所述功能性内源ADAM6基因并缺少所述异位核苷酸序列的小鼠所产生的窝数的约1.5倍、约2倍、约3倍或约4倍或以上。
在一个方面，提供了一种在其种系中包含编码免疫球蛋白的非小鼠核酸序列的小鼠，其中所述非小鼠免疫球蛋白序列包含小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段的插入。在一个实施方案中，所述非小鼠免疫球蛋白序列包含人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，所述序列包含人免疫球蛋白重链序列。在一个实施方案中，所述序列包含人免疫球蛋白轻链序列。在一个实施方案中，所述序列包含一个或多个V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段；在一个实施方案中，所述序列包含一个或多个V基因区段和一个或多个J基因区段。在一个实施方案中，所述一个或多个V、D和J基因区段或一个或多个V和J基因区段未被重排。在一个实施方案中，所述一个或多个V、D和J基因区段或一个或多个V和J基因区段被重排。在一个实施方案中，在所述一个或多个V、D和J基因区段、或一个或多个V和J基因区段重排之后，所述小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段的核酸序列。在一个实施方案中，在重排之后，所述小鼠在其基因组中包含至少两个编码小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段的核酸序列。在一个实施方案中，在重排之后，所述小鼠在其基因组中包含至少一个编码小鼠ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述小鼠在B细胞中包含ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段。在一个实施方案中，所述小鼠在非B细胞中包含ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段。
在一个方面，提供了从内源小鼠免疫球蛋白重链基因座表达人免疫球蛋白重链可变区或其功能片段的小鼠，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6活性。
在一个实施方案中，所述雄性小鼠在内源ADAM6基因座处包含单个未经修饰的内源ADAM6等位基因或其直系同源物或同源物或功能片段。
在一个实施方案中，所述雄性小鼠包含编码赋予ADAM6功能的蛋白质的异位小鼠ADAM6序列或其同源物或直系同源物或功能片段。
在一个实施方案中，所述雄性小鼠在接近内源小鼠ADAM6等位基因位置的小鼠基因组中的位置处(例如最后一个V基因区段序列的3’和最初的D基因区段的5’)包含ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段。
在一个实施方案中，所述雄性小鼠包含在编码免疫球蛋白可变基因区段的核酸序列的上游、下游或上下游(相对于ADAM6序列的转录方向)侧接的ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能片段。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白可变基因区段是人基因区段。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白可变基因区段是人基因区段，并且所述编码在小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的序列介于人V基因区段之间；在一个实施方案中，所述小鼠包含两个或两个以上人V基因区段，并且所述序列处于最后一个V基因区段和倒数第二个V基因区段之间的位置；在一个实施方案中，所述序列处于在最后一个V基因区段和第一个D基因区段之后的位置。
在一个方面，提供了一种在其种系中包含非功能性内源ADAM6基因或内源ADAM6基因的缺失的雄性小鼠，其中所述小鼠的精细胞能穿过雌性小鼠的输卵管并使卵子受精。在一个实施方案中，所述小鼠包含在雄性小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能片段的染色体外拷贝。在一个实施方案中，所述小鼠包含在雄性小鼠中发挥功能的异位小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能片段。
在一个方面，提供了包含降低内源小鼠ADAM6功能的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包含由完全或部分发挥功能的未经修饰的内源等位基因(例如杂合体)提供的或通过从编码在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或功能片段的异位序列进行表达而提供的至少一些ADAM6功能性。
在一个实施方案中，与丧失功能性ADAM6的雄性小鼠相比，所述小鼠包含足以赋予雄性小鼠通过交配产生后代的能力的ADAM6功能。在一个实施方案中，所述ADAM6功能是通过存在编码小鼠ADAM6或其同源物或直系同源物或功能片段的异位核苷酸序列赋予的。在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6同源物或直系同源物或其片段包括使在缺少足够内源小鼠ADAM6活性的雄性小鼠中观察到的后代产生能力的丧失(例如在ADAM6敲除小鼠中观察到的能力丧失)完全或部分地得到恢复的那些。从这个意义上讲，ADAM6敲除小鼠包括包含内源基因座或其片段但其不发挥功能的小鼠，所述不发挥功能即完全不表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)，或表达的ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)水平不足以支持基本正常的产生野生型雄性小鼠后代的能力。功能丧失可归因于，例如，所述基因座的结构基因中(即，在ADAM6a或ADAM6b编码区中)或所述基因座的调控区中(例如在所述ADAM6a基因5’或ADAM6a或ADAM6b编码区3’的序列中，其中所述序列完全或部分地控制ADAM6基因的转录、ADAM6RNA的表达或ADAM6蛋白的表达)的修饰。在各实施方案中，在雄性小鼠中发挥功能的直系同源物或同源物或其片段是能够使雄性小鼠的精子(或在雄性小鼠精液中的大部分精细胞)穿过小鼠输卵管并使小鼠卵子受精的那些。
在一个实施方案中，表达人免疫球蛋白可变区或其功能片段的雄性小鼠包含足够的ADAM6活性以对该雄性小鼠赋予通过与雌性小鼠交配而产生后代的能力，并且在一个实施方案中，与具有一个或两个未经修饰的内源ADAM6等位基因的小鼠相比，所述雄性小鼠当与雌性小鼠交配时所展现的后代产生能力，在一个实施方案中是至少25％，在一个实施方案中是至少30％，在一个实施方案中是至少40％，在一个实施方案中是至少50％，在一个实施方案中是至少60％，在一个实施方案中是至少70％，在一个实施方案中是至少80％，在一个实施方案中是至少90％，并且在一个实施方案中大致相同。
在一个实施方案中，雄性小鼠表达足够的ADAM6(或其直系同源物或同源物或功能片段)，使精细胞能够从该雄性小鼠穿过雌性小鼠输卵管并使小鼠卵子受精。
在一个实施方案中，所述ADAM6功能性是由与小鼠染色体序列邻接的核酸序列(例如，将所述核酸随机整合入小鼠染色体中；或通过诸如位点特异性的重组酶介导(例如Cre介导)的插入或同源重组，从而使得例如所述核酸被靶向至特定位置，由此将所述核酸放置在特定位置)赋予的。在一个实施方案中，所述ADAM6序列存在于不同于小鼠染色体的核酸上(例如，所述ADAM6序列存在于附加体上，即存在于染色体外，例如在表达构建体、载体、YAC、转染色体等中)。
在一个方面，提供了包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的基因修饰小鼠和细胞，其中所述小鼠表达免疫球蛋白重链序列的至少一部分，例如人序列的至少一部分，其中所述小鼠包含在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6活性。在一个实施方案中，所述修饰降低或消除了该小鼠的ADAM6活性。在一个实施方案中，对所述小鼠进行修饰以使得编码ADAM6活性的两个等位基因均不存在或表达基本上不能支持雄性小鼠的正常交配的ADAM6。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含编码小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或功能片段的异位核酸序列。
在一个方面，提供了包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的基因修饰小鼠和细胞，其中所述修饰降低或消除了从所述基因座的ADAM6序列表达而来的ADAM6活性，并且其中所述小鼠包含ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能片段。在各实施方案中，ADAM6蛋白或其片段是由异位ADAM6序列编码。在各实施方案中，ADAM6蛋白或其片段从内源ADAM6等位基因表达。在各实施方案中，所述小鼠包含第一免疫球蛋白重链等位基因，所述第一免疫球蛋白重链等位基因包含降低或消除了从所述第一免疫球蛋白重链等位基因表达功能性ADAM6的第一修饰，并且所述小鼠包含第二免疫球蛋白重链等位基因，所述第二免疫球蛋白重链等位基因包含不显著降低或不消除从所述第二免疫球蛋白重链等位基因表达功能性ADAM6的第二修饰。
在一个实施方案中，所述第二修饰位于最后一个小鼠V基因区段的3’(相对于小鼠V基因区段的转录方向)并且位于小鼠(或嵌合人/小鼠)免疫球蛋白重链恒定基因或其片段(例如编码人和/或小鼠CH1和/或铰链和/或CH2和/或CH3的核酸序列)的5’(相对于恒定序列的转录方向)。
在一个实施方案中，所述修饰位于编码第一ADAM6等位基因的第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因处，并且ADAM6功能获自编码功能性ADAM6的第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因处的内源ADAM6的表达，其中所述第二免疫球蛋白重链等位基因包含V、D和/或J基因区段的至少一个修饰。在一个具体实施方案中，所述V、D和/或J基因区段的至少一个修饰是缺失，用人V、D和/或J基因区段进行的置换，用骆驼V、D和/或J基因区段进行的置换，用人源化或骆驼化V、D和/或J基因区段进行的置换，轻链序列对重链序列的置换，和其组合。在一个实施方案中，所述至少一个修饰是一个或多个重链V、D和/或J基因区段的缺失，和用一个或多个轻链V和/或J基因区段(例如人轻链V和/或J基因区段)在重链基因座上进行的置换。
在一个实施方案中，所述修饰位于第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因处和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因处，并且ADAM6功能获自该小鼠种系中的非免疫球蛋白基因座处的异位ADAM6的表达。在一个具体实施方案中，所述非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。在一个具体实施方案中，所述非免疫球蛋白基因座在生殖组织中具有转录活性。
在一个方面，提供了一种包含ADAM6的杂合型或纯合型敲除的小鼠。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含被修饰的免疫球蛋白序列，其为人的或人源化的免疫球蛋白序列，或骆驼的或骆驼化的人或小鼠免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，所述被修饰的免疫球蛋白序列存在于内源小鼠重链免疫球蛋白基因座处。在一个实施方案中，所述被修饰的免疫球蛋白序列在内源小鼠免疫球蛋白重链基因座处包含人重链可变基因序列。在一个实施方案中，所述人重链可变基因序列置换了内源小鼠免疫球蛋白重链基因座处的内源小鼠重链可变基因序列。
在一个方面，提供了一种不能从内源小鼠ADAM6基因座表达功能性内源小鼠ADAM6的小鼠。在一个实施方案中，所述小鼠包含编码在该小鼠中发挥功能的ADAM6或其功能片段的异位核酸序列。在一个具体实施方案中，所述异位核酸序列编码挽救了就ADAM6敲除来说为纯合型的雄性小鼠所展现的后代产生能力的丧失的蛋白质。在一个具体实施方案中，所述异位核酸序列编码小鼠ADAM6蛋白。
在一个方面，提供了一种缺少功能性内源ADAM6基因座并包含赋予小鼠ADAM6功能的异位核酸序列的小鼠。在一个实施方案中，所述核酸序列包含内源小鼠ADAM6序列或其功能片段。在一个实施方案中，所述内源小鼠ADAM6序列包含ADAM6a和ADAM6b编码序列，所述编码序列位于野生型小鼠中3’端小鼠免疫球蛋白重链V基因区段(VH)与5’端小鼠免疫球蛋白重链D基因区段(DH)之间。
在一个实施方案中，所述核酸序列包含编码小鼠ADAM6a或其功能片段的序列和/或编码小鼠ADAM6b或其功能片段的序列，其中所述ADAM6a和/或ADAM6b或其功能片段可操作地连接到启动子上。在一个实施方案中，所述启动子是人启动子。在一个实施方案中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。在一个具体实施方案中，所述ADAM6启动子包含位于距离小鼠5’端的DH基因区段最近的第一ADAM6基因的第一密码子与该5’端的DH基因区段的重组信号序列之间的序列，其中5’是相对于所述小鼠免疫球蛋白基因的转录方向来指定的。在一个实施方案中，所述启动子是病毒启动子。在一个具体实施方案中，所述病毒启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方案中，所述启动子是泛素启动子。
在一个实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在一个实施方案中，所述诱导型启动子调控非生殖组织中的表达。在一个实施方案中，所述诱导型启动子调控生殖组织中的表达。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6a和/或ADAM6b序列或其功能片段的表达在发育方面由生殖组织中的诱导型启动子调控。
在一个实施方案中，所述小鼠ADAM6a和/或ADAM6b选自SEQ ID NO:1的ADAM6a和/或序列SEQ ID NO:2的ADAM6b。在一个实施方案中，所述小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:3的启动子。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6启动子包含恰好在ADAM6a的第一密码子上游(相对于ADAM6a的转录方向)并且延伸到ADAM6编码区上游的SEQ ID NO:3末端的SEQ IDNO:3的核酸序列。在另一个具体实施方案中，所述ADAM6启动子是从ADAM6a的起始密码子上游的约5个到约20个核苷酸内延伸到ADAM6a的起始密码子上游的约0.5kb、1kb、2kb或3kb或以上的片段。
在一个实施方案中，所述核酸序列包含下述的SEQ ID NO:3或其片段，当被放置到因为缺少ADAM6而无法生育或具有低生育力的小鼠中时，所述SEQ ID NO:3或其片段会提高生育力或使生育力恢复到与野生型生育力大致相同。在一个实施方案中，SEQ ID NO:3或其片段赋予雄性小鼠产生能够穿过雌性小鼠输卵管以使小鼠卵子受精的能力。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，该小鼠包含编码ADAM6蛋白的内源核苷酸序列的缺失，用人VH基因区段对内源小鼠VH基因区段进行的置换，并且该小鼠包含编码在雄性小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述小鼠包含下述的免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含含有内源ADAM6基因的内源免疫球蛋白基因座核苷酸序列的缺失，包含编码一个或多个人免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列，并且其中所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于编码所述一个或多个人免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列内或与所述核苷酸序列直接相邻。
在一个实施方案中，所述小鼠包含编码一个或多个人VH基因区段的核苷酸序列对所有或基本上所有内源VH基因区段的置换，并且所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于编码所述一个或多个人VH基因区段的核苷酸序列内或与所述核苷酸序列直接相邻。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含在内源DH基因座位处的一个或多个人DH基因区段对一个或多个内源DH基因区段的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含在内源JH基因座位处的一个或多个人JH基因区段对一个或多个内源JH基因区段的置换。在一个实施方案中，所述小鼠包含人VH、DH和JH基因区段对所有或基本上所有内源VH、DH和JH基因区段的置换和在内源VH、DH和JH基因座位处的置换，其中所述小鼠包含编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列。在一个具体实施方案中，所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列被放置在所存在的人VH基因区段的倒数第二个3’端VH基因区段与所存在的人VH基因区段的最后一个3’VH基因区段之间。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含所有或基本上所有小鼠VH基因区段的缺失和用所有或基本上所有人VH基因区段所进行的置换，并且所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列被放置在人基因区段VH1-2的下游和人基因区段VH6-1的上游。
在一个具体实施方案中，所述小鼠包含用编码一个或多个人VH基因区段的核苷酸序列对所有或基本上所有内源VH基因区段的置换，并且所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于编码一个或多个人VH基因区段的核苷酸序列内或与所述核苷酸序列直接相邻。
在一个实施方案中，所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠基因组中的转基因上。在一个实施方案中，所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠的染色体外。
在一个方面，提供了一种包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的小鼠，其中所述小鼠表达包含可操作地连接到重链恒定区基因序列上的重排免疫球蛋白序列的B细胞，并且所述B细胞在其基因组中(例如在B细胞染色体上)包含编码在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的基因。在一个实施方案中，所述可操作地连接到重链恒定区基因序列上的重排免疫球蛋白序列包含人重链V、D和/或J序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人或小鼠轻链V和/或J序列。在一个实施方案中，所述重链恒定区基因序列包含选自由CH1、铰链、CH2、CH3和其组合组成的群组的人或小鼠重链序列。
在一个方面，提供了一种基因修饰小鼠，其中所述小鼠包含功能沉默的免疫球蛋白轻链基因，并且进一步包含一个或多个人免疫球蛋白重链可变区基因区段对一个或多个内源免疫球蛋白重链可变区基因区段的置换，其中所述小鼠缺少功能性内源ADAM6基因座，并且其中所述小鼠包含表达在雄性小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个方面，提供了一种缺少功能性内源小鼠ADAM6基因座或序列并且包含编码小鼠ADAM6基因座或者小鼠ADAM6基因座或序列的功能片段的异位核苷酸序列的小鼠，其中所述小鼠能够和异性小鼠交配产生包含异位ADAM6基因座或序列的后代。在一个实施方案中，所述小鼠是雄性。在一个实施方案中，所述小鼠是雌性。
在一个方面，提供了一种基因修饰小鼠，其中所述小鼠在内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位上包含人免疫球蛋白重链可变区基因区段，所述小鼠在该内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位处缺少内源功能性ADAM6序列，并且其中所述小鼠包含表达在雄性小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于染色体外。在一个实施方案中，所述表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列被整合在该小鼠基因组中的一个或多个基因座处。在一个具体实施方案中，所述一个或多个基因座包括免疫球蛋白基因座。
在一个方面，提供了一种从被修饰的内源小鼠免疫球蛋白重链基因座表达免疫球蛋白重链序列的小鼠，其中所述重链是来源于人V基因区段、D基因区段和J基因区段，其中所述小鼠包含在小鼠中发挥功能的ADAM6活性。
在一个实施方案中，所述小鼠包含多个人V基因区段、多个D基因区段和多个J基因区段。在一个实施方案中，所述D基因区段是人D基因区段。在一个实施方案中，所述J基因区段是人J基因区段。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人源化重链恒定区序列，其中所述人源化包含对选自CH1、铰链、CH2、CH3和其组合的序列的置换。在一个具体实施方案中，所述重链是来源于人V基因区段、人D基因区段、人J基因区段、人CH1序列、人或小鼠铰链序列、小鼠CH2序列和小鼠CH3序列。在另一个具体实施方案中，所述小鼠进一步包含人轻链恒定序列。
在一个实施方案中，所述D基因区段在5’被编码在小鼠中发挥功能的ADAM6活性的序列侧接(相对于D基因区段的转录方向)。
在一个实施方案中，所述在小鼠中发挥功能的ADAM6活性获自于位于被修饰的内源小鼠重链免疫球蛋白基因座的5’端D基因区段的5’和3’端V基因区段的3’(相对于V基因区段的转录方向)的核苷酸序列的表达。
在一个实施方案中，所述在小鼠中发挥功能的ADAM6活性获自于位于被修饰的内源小鼠重链免疫球蛋白基因座中的两个人V基因区段之间的核苷酸序列的表达。在一个实施方案中，所述两个人V基因区段是人VH1-2基因区段和VH6-1基因区段。
在一个实施方案中，所述核苷酸序列包含选自小鼠ADAM6b序列或其功能片段、小鼠ADAM6a序列或其功能片段和其组合的序列。
在一个实施方案中，所述位于两个人V基因区段之间的核苷酸序列以相对于人V基因区段相反的转录取向放置。在一个具体实施方案中，核苷酸序列从相对于ADAM6基因的转录方向的5’到3’先后编码ADAM6a序列和ADAM6b序列。
在一个实施方案中，所述小鼠包含小鼠ADAM6序列或其功能片段对位于人V基因区段VH1-2与VH6-1之间的人ADAM6假基因序列的置换。
在一个实施方案中，所述编码在小鼠中发挥功能的ADAM6活性的序列是小鼠ADAM6序列或其功能片段。
在一个实施方案中，所述小鼠包含(例如就被修饰的内源小鼠免疫球蛋白重链基因座来说为杂合型的小鼠中的)内源小鼠DFL16.1基因区段或人DH1-1基因区段。在一个实施方案中，由所述小鼠所表达的免疫球蛋白重链的D基因区段来源于内源小鼠DFL16.1基因区段或人DH1-1基因区段。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其在非重排B细胞种系的含DNA细胞中包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列，但在包含重排免疫球蛋白基因座的B细胞中不包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列，其中所述编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列在基因组中的位置不同于小鼠ADAM6基因在野生型小鼠中的位置。在一个实施方案中，所述编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列存在于非重排B细胞种系的所有或基本上所有含DNA细胞中；在一个实施方案中，所述核酸序列存在于小鼠的种系细胞中，但不存在于重排B细胞的染色体中。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其在所有或基本上所有含DNA细胞(包括包含重排免疫球蛋白基因座的B细胞)中包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列，其中所述编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列在基因组中的位置不同于小鼠ADAM6基因在野生型小鼠中的位置。在一个实施方案中，所述编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列位于与重排免疫球蛋白基因座邻接的核酸上。在一个实施方案中，所述与重排免疫球蛋白基因座邻接的核酸是染色体。在一个实施方案中，所述染色体是存在于野生型小鼠中的染色体，并且所述染色体包含小鼠免疫球蛋白基因座的修饰。
在一个方面，提供了一种基因修饰小鼠，其中所述小鼠包含在其基因组中包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物的B细胞。在一个实施方案中，所述ADAM6序列或其直系同源物或同源物位于免疫球蛋白重链基因座处。在一个实施方案中，所述ADAM6序列或其直系同源物或同源物位于不是免疫球蛋白基因座的基因座处。在一个实施方案中，所述ADAM6序列位于由异源启动子驱动的转基因上。在一个具体实施方案中，所述异源启动子是非免疫球蛋白启动子。在一个具体实施方案中，B细胞表达ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，90％或90％以上的小鼠B细胞包含编码在小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或其同源物、或其片段的基因。在一个具体实施方案中，所述小鼠是雄性小鼠。
在一个实施方案中，所述B细胞基因组包含第一等位基因和包含所述ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第二等位基因。在一个实施方案中，所述B细胞基因组包含第一等位基因但不包含包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第二等位基因。
在一个方面，提供了一种在一个或多个内源ADAM6等位基因处包含修饰的小鼠。
在一个实施方案中，所述修饰导致所述小鼠不能从一个或多个内源ADAM6等位基因中的至少一个表达功能性ADAM6蛋白。在一个具体实施方案中，所述小鼠不能从每个内源ADAM6等位基因表达功能性ADAM6蛋白。
在一个实施方案中，所述小鼠不能从每个内源ADAM6等位基因表达功能性ADAM6蛋白，并且所述小鼠包含异位ADAM6序列。
在一个实施方案中，所述小鼠不能从每个内源ADAM6等位基因表达功能性ADAM6蛋白，并且所述小鼠包含位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游(相对于小鼠重链基因座的转录方向)1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120kb或超过120kb内的异位ADAM6序列。在一个具体实施方案中，所述异位ADAM6序列位于内源免疫球蛋白重链基因座处(例如，在基因间V-D区中，在两个V基因区段之间，在V基因区段与D基因区段之间，在D基因区段与J基因区段之间等)。在一个具体实施方案中，所述异位ADAM6序列位于最后一个小鼠V基因区段与第一个小鼠D基因区段之间的90到100kb基因间序列内。在另一个具体实施方案中，去除了内源的90到100kb基因间V-D序列，并将所述异位ADAM6序列放置在最后一个V基因区段与第一个D基因区段之间。
在一个方面，提供了一种不育的雄性小鼠，其中所述小鼠包含两个或两个以上内源ADAM6等位基因的缺失。在一个方面，提供了一种作为雄性不育特性的载体的雌性小鼠，其中所述雌性小鼠在其种系中包含非功能性ADAM6等位基因，或内源ADAM6等位基因的敲除。
在一个方面，提供了一种缺少内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段的小鼠，其中所述小鼠大部分的B细胞都包含ADAM6序列或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，所述小鼠缺少选自两个或两个以上V基因区段、两个或两个以上D基因区段、两个或两个以上J基因区段和其组合的内源免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方案中，所述小鼠缺少选自至少一个并且至多89个V基因区段、至少一个并且至多13个D基因区段、至少一个并且至多4个J基因区段和其组合的免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方案中，所述小鼠缺少来自染色体12的包含约3兆碱基的内源免疫球蛋白重链基因座的基因组DNA片段。在一个具体实施方案中，所述小鼠缺少所有的功能性内源重链V、D和J基因区段。在一个具体实施方案中，所述小鼠缺少89个VH基因区段、13个DH基因区段和4个JH基因区段。
在一个方面，提供了一种小鼠，其中所述小鼠在种系中具有包含对免疫球蛋白重链基因座的修饰的基因组，其中所述对免疫球蛋白重链基因座的修饰包括用一个或多个非小鼠免疫球蛋白可变区序列置换一个或多个小鼠免疫球蛋白可变区序列，并且其中所述小鼠包含编码小鼠ADAM6蛋白的核酸序列。在一个优选实施方案中，用非小鼠免疫球蛋白可变区序列置换免疫球蛋白重链基因座的DH和JH序列和至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个VH序列。在另一个优选实施方案中，用非小鼠免疫球蛋白可变区序列置换免疫球蛋白重链基因座的DH、JH和所有的VH序列。所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列可以是非重排的。在一个优选实施方案中，所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列包含非小鼠种的全部非重排DH和JH区域和至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个非重排VH序列。在另一个优选实施方案中，所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列包含非小鼠种的全部可变区，包括所有的VH、DH和JH区域。所述非小鼠种可以是人(homo sapiens)并且所述非小鼠免疫球蛋白可变区序列可以是人序列。
在一个方面，提供了一种表达包含至少一个人可变域/非人恒定域免疫球蛋白多肽的抗体的小鼠，其中所述小鼠从非免疫球蛋白基因座的基因座表达小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，所述ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物在小鼠B细胞中表达，其中所述B细胞包含重排的包含人可变序列和非人恒定序列的免疫球蛋白序列。
在一个实施方案中，所述非人恒定序列是啮齿动物序列。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个方面，提供了一种产生不育雄性小鼠的方法，其包括使供体ES细胞的内源ADAM6等位基因不发挥功能(或敲除所述等位基因)，将所述供体ES细胞引入宿主胚胎中，在代孕母亲中孕育所述宿主胚胎，和使所述代孕母亲生出完全或部分来源于所述供体ES细胞的后代。在一个实施方案中，所述方法进一步包含使后代交配繁殖以获得不育雄性小鼠。
在一个方面，提供了一种制造具有目的基因修饰的小鼠的方法，其中所述小鼠是不育的，所述方法包括以下步骤：(a)在基因组内产生目的基因修饰；(b)修饰所述基因组以敲除内源ADAM6等位基因，或使内源ADAM6等位基因不发挥功能；和(c)使用所述基因组产生小鼠。在各实施方案中，所述基因组来自于ES细胞或在核移植实验中使用。
在一个方面，提供了一种使用本文所述的靶向载体、核苷酸构建体或细胞产生的小鼠。
在一个方面，提供了一种本文所述的小鼠与野生型或基因修饰的第二小鼠的交配后代。
在一个方面，提供了一种用于维持小鼠品系的方法，其中所述小鼠品系包含一个或多个异源免疫球蛋白重链序列对小鼠免疫球蛋白重链序列的置换。在一个实施方案中，所述一个或多个异源免疫球蛋白重链序列是人免疫球蛋白重链序列。
在一个实施方案中，所述小鼠品系包含一个或多个小鼠VH、DH和/或JH基因区段的缺失。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和/或一个或多个人JH基因区段。在一个实施方案中，所述小鼠包含至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个人VH区段、至少27个人DH基因区段和至少6个JH基因区段。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个人VH区段，所述至少27个人DH基因区段和所述至少6个JH基因区段可操作地连接到恒定区基因上。在一个实施方案中，所述恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方案中，所述恒定区基因包含选自CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4或其组合的小鼠恒定区基因。
在一个实施方案中，所述方法包括产生就小鼠免疫球蛋白重链序列的置换来说为杂合型的雄性小鼠，和使所述杂合型雄性小鼠与野生型雌性小鼠或就人重链序列来说为纯合型或杂合型的雌性小鼠交配繁殖。在一个实施方案中，所述方法包括通过使杂合型雄性小鼠与野生型或就人重链序列来说为纯合型或杂合型的雌性小鼠反复交配繁殖来维持品系。
在一个实施方案中，所述方法包括从就人重链序列来说为纯合型或杂合型的雄性或雌性小鼠获得细胞，和使用那些细胞作为供体细胞或来自那些细胞的核作为供体核，以及使用所述细胞或核并使用宿主细胞产生基因修饰动物，和/或在代孕母亲中孕育所述细胞和/或核。
在一个实施方案中，只有就重链基因座处的置换来说为杂合型的雄性小鼠才和雌性小鼠交配繁殖。在一个具体实施方案中，所述雌性小鼠就被置换的重链基因座来说为纯合型、杂合型或野生型。
在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含异源免疫球蛋白轻链序列对内源免疫球蛋白轻链基因座处的λ和/或κ轻链可变序列的置换。在一个实施方案中，所述异源免疫球蛋白轻链序列是人免疫球蛋白λ和/或κ轻链可变序列。
在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含位于非内源免疫球蛋白基因座的基因座处的转基因，其中所述转基因包含编码重排或非重排的异源λ或κ轻链序列(例如非重排的VL和非重排的JL，或重排的VJ)的序列，所述异源λ或κ轻链序列可操作地连接(对于非重排的来说)或融合(对于重排的来说)到免疫球蛋白轻链恒定区序列上。在一个实施方案中，所述异源λ或κ轻链序列是人序列。在一个实施方案中，所述恒定区序列选自啮齿动物、人和非人灵长类动物。在一个实施方案中，所述恒定区序列选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方案中，所述转基因包含驱动所述轻链序列的表达的非免疫球蛋白启动子。在一个具体实施方案中，所述启动子是转录活性启动子。在一个具体实施方案中，所述启动子是ROSA26启动子。
在一个方面，提供了一种核酸构建体，其包含上游同源臂和下游同源臂，其中所述上游同源臂包含与人免疫球蛋白重链可变区序列相同或基本相同的序列，所述下游同源性支臂包含与人或小鼠免疫球蛋白可变区序列相同或基本相同的序列，并且在所述上下游同源臂之间安置了包含编码小鼠ADAM6蛋白的核苷酸序列的序列。在一个具体实施方案中，所述编码小鼠ADAM6基因的序列与野生型小鼠中与该小鼠ADAM6所连接的小鼠启动子可操作地连接。
在一个方面，提供了一种靶向载体，其包含(a)和人可变区基因区段核苷酸序列相同或基本相同的核苷酸序列；和(b)编码在小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述靶向载体进一步包含可操作地连接到所述编码小鼠ADAM6的序列上的启动子。在一个具体实施方案中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。
在一个方面，提供了一种用于修饰小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的核苷酸构建体，其中所述构建体包含至少一个位点特异性重组酶识别位点，和编码在小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的序列。
在一个方面，提供了包含本文所述的基因修饰的小鼠细胞和小鼠胚胎，包括但不限于ES细胞、多能细胞和诱导型多能细胞。提供了XX型细胞和XY型细胞。还提供了所包含的核含有本文所述的修饰(例如通过原核注射引入细胞中的修饰)的细胞。还提供了包含由病毒引入的ADAM6基因的细胞、胚胎和小鼠，例如包含含有在小鼠中发挥功能的ADAM6基因的转导构建体的细胞、胚胎和小鼠。
在一个方面，提供了一种基因修饰小鼠细胞，其中所述细胞缺少功能性内源小鼠ADAM6基因座，并且所述细胞包含编码小鼠ADAM6蛋白或其功能片段的异位核苷酸序列。在一个实施方案中，所述细胞进一步包含内源免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰。在一个具体实施方案中，所述内源免疫球蛋白重链可变基因序列的修饰包含选自以下缺失的缺失：小鼠VH基因区段的缺失、小鼠DH基因区段的缺失、小鼠JH基因区段的缺失和其组合。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含人免疫球蛋白序列对一个或多个小鼠免疫球蛋白VH、DH和/或JH序列的置换。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白序列选自人VH、人VL、人DH、人JH、人JL和其组合。
在一个实施方案中，所述细胞是全能细胞、多能细胞或诱导型多能细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞是小鼠ES细胞。
在一个方面，提供了一种小鼠B细胞，其中所述小鼠B细胞包含重排的免疫球蛋白重链基因，其中所述B细胞在其染色体上包含编码在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述小鼠B细胞包含所述核酸序列的两个等位基因。
在一个实施方案中，所述核酸序列位于与所述重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座邻接的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方案中，所述核酸序列位于和包含所述重排的小鼠免疫球蛋白重链基因座的核酸分子不同的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方案中，所述小鼠B细胞包含可操作地连接到小鼠或人免疫球蛋白恒定区基因上的重排的非小鼠免疫球蛋白可变基因序列，其中所述B细胞包含编码在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
在一个方面，提供了一种小鼠体细胞，其包含的染色体含有被修饰的免疫球蛋白重链基因座，和编码在雄性小鼠中发挥功能的小鼠ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列和所述被修饰的免疫球蛋白重链基因座位于同一染色体上。在一个实施方案中，所述核酸序列和所述被修饰的免疫球蛋白重链基因座位于不同染色体上。在一个实施方案中，所述体细胞包含单拷贝的所述核酸序列。在一个实施方案中，所述体细胞包含至少两个拷贝的所述核酸序列。在一个具体实施方案中，所述体细胞是B细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞是生殖细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞是干细胞。
在一个方面，提供了一种小鼠生殖细胞，其在其染色体上包含编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列，其中所述编码小鼠ADAM6(或其同源物或直系同源物或功能片段)的核酸序列在染色体中的位置不同于所述核酸序列在野生型小鼠生殖细胞的染色体中的位置。在一个实施方案中，所述核酸序列位于小鼠免疫球蛋白基因座处。在一个实施方案中，所述核酸序列和小鼠免疫球蛋白基因座位于所述生殖细胞的同一染色体上。在一个实施方案中，所述核酸序列和所述小鼠免疫球蛋白基因座位于所述生殖细胞的不同染色体上。在一个实施方案中，所述小鼠免疫球蛋白基因座包含至少一个非小鼠免疫球蛋白序列对至少一个小鼠免疫球蛋白序列的置换。在一个具体实施方案中，所述至少一个非小鼠免疫球蛋白序列是人免疫球蛋白序列。
在一个方面，提供了一种来源于本文所述的小鼠的多能细胞、诱导型多能细胞或全能细胞。在一个具体实施方案中，所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，提供了一种来源于本文所述的小鼠的组织。在一个实施方案中，所述组织是来源于本文所述的小鼠的脾、淋巴结或骨髓。
在一个方面，提供了一种来源于本文所述的小鼠的核。在一个实施方案中，所述核是来自于不是B细胞的二倍体细胞。
在一个方面，提供了一种在本文所述的小鼠中产生的编码免疫球蛋白可变区的核苷酸序列。
在一个方面，提供了一种在本文所述的小鼠中产生的抗体的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种在本文所述的小鼠中产生的编码抗体可变区的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
在一个方面，提供了一种在本文所述的小鼠中产生的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。在一个方面，提供了一种产生基因修饰小鼠的方法，包括用一个或多个人免疫球蛋白重链基因区段置换小鼠内源ADAM6基因座上游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录)的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，和用一个或多个人免疫球蛋白重链或轻链基因区段置换小鼠ADAM6基因座下游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录)的一个或多个免疫球蛋白基因区段。在一个实施方案中，所述置换小鼠内源ADAM6基因座上游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括V基因区段。在一个实施方案中，所述置换小鼠内源ADAM6基因座上游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的人免疫球蛋白基因区段包括V和D基因区段。在一个实施方案中，所述置换小鼠内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括J基因区段。在一个实施方案中，所述置换小鼠内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括D和J基因区段。在一个实施方案中，所述置换小鼠内源ADAM6基因座下游的一个或多个内源免疫球蛋白基因区段的一个或多个人免疫球蛋白基因区段包括V、D和J基因区段。
在一个实施方案中，在多能细胞、诱导型多能细胞或全能细胞中置换ADAM6基因上游和/或下游的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，以形成基因修饰的祖细胞；将所述基因修饰的祖细胞引入宿主中；和孕育所述包含基因修饰的祖细胞的宿主，以形成包含来源于所述基因修饰的祖细胞的基因组的小鼠。在一个实施方案中，所述宿主是胚胎。在一个具体实施方案中，所述宿主选自小鼠前桑椹胚(例如8或4细胞阶段)、四倍体胚胎、胚胎细胞聚集体或胚泡。
在一个方面，提供了一种产生基因修饰小鼠的方法，包括用包含人免疫球蛋白基因区段的序列置换包含小鼠免疫球蛋白基因区段和小鼠ADAM6(或在雄性小鼠中发挥功能的其直系同源物或同源物或片段)核苷酸序列的小鼠核苷酸序列以形成第一嵌合基因座，然后将包含小鼠ADAM6编码序列(或编码其直系同源物或同源物或功能片段的序列)的序列插入到所述包含人免疫球蛋白基因区段的序列中以形成第二嵌合基因座。
在一个实施方案中，所述第二嵌合基因座包含人免疫球蛋白重链可变(VH)基因区段。在一个实施方案中，所述第二嵌合基因座包含人免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段。在一个具体实施方案中，所述第二嵌合基因座包含可操作地连接到人DH基因区段和人JH基因区段上的人VH基因区段或人VL基因区段。在另一个具体实施方案中，所述第二嵌合基因座可操作地连接到包含与小鼠CH2+CH3序列融合的人CH1序列、或者人CH1和人铰链序列的第三嵌合基因座上。
在一个方面，提供了包含含有小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠用于产生可生育的雄性小鼠的用途，其中所述用途包含：使所述包含含有小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠与缺少功能性内源小鼠ADAM6基因座或序列的小鼠交配，和获得能够产生具有异位ADAM6基因座或序列的后代的雌性后代，或包含异位ADAM6基因座或序列的雄性后代，并且所述雄性所展现的生育力与野生型雄性小鼠所展现的生育力大致相同。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生免疫球蛋白可变区核苷酸序列的用途。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生完全人Fab或完全人F(ab)2的用途。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生永生化细胞系的用途。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)的用途。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生含有人重链可变区和人轻链可变区的噬菌体文库的用途。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生用于制备人抗体的可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原对本文所述的小鼠进行免疫，(b)从(a)的被免疫小鼠分离淋巴细胞，(c)使所述淋巴细胞暴露于一个或多个被标记的抗体，(d)鉴别能够结合所述目的抗原的淋巴细胞，和(e)扩增来自所述淋巴细胞的一个或多个可变区核酸序列，从而产生可变区序列。
在一个实施方案中，所述淋巴细胞来源于所述小鼠的脾。在一个实施方案中，所述淋巴细胞来源于所述小鼠的淋巴结。在一个实施方案中，所述淋巴细胞来源于所述小鼠的骨髓。
在一个实施方案中，所述被标记的抗体是荧光团缀合的抗体。在一个实施方案中，一个或多个荧光团缀合的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在一个实施方案中，所述淋巴细胞是B细胞。
在一个实施方案中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链可变区序列。在一个实施方案中，所述一个或多个可变区核酸序列包含轻链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述轻链可变区序列是免疫球蛋白κ轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方案中，提供了本文所述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原对本文所述的小鼠进行免疫，(b)从(a)的被免疫小鼠分离脾，(c)使来自所述脾的B淋巴细胞暴露于一个或多个被标记的抗体，(d)鉴别能够结合所述目的抗原的(c)的B淋巴细胞，和(e)扩增来自所述B淋巴细胞的重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列，从而产生所述重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方案中，提供了本文所述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原对本文所述的小鼠进行免疫，(b)从(a)的被免疫小鼠分离一个或多个淋巴结，(c)使来自所述一个或多个淋巴结的B淋巴细胞暴露于一个或多个被标记的抗体，(d)鉴别能够结合所述目的抗原的(c)的B淋巴细胞，和(e)扩增来自所述B淋巴细胞的重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列，从而产生所述重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方案中，提供了本文所述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)用目的抗原对本文所述的小鼠进行免疫，(b)从(a)的被免疫小鼠分离骨髓，(c)使来自所述骨髓的B淋巴细胞暴露于一个或多个被标记的抗体，(d)鉴别能够结合所述目的抗原的(c)的B淋巴细胞，和(e)扩增来自所述B淋巴细胞的重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列，从而产生所述重链和κ轻链可变区序列。在各实施方案中，所述一个或多个被标记的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在各实施方案中，提供了本文所述的小鼠用于产生用于制备人抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，其进一步包括：使所述被扩增的重链和轻链可变区序列融合到人重链和轻链恒定区序列上，在细胞中表达所述被融合的重链和轻链序列，和回收所述被表达的重链和轻链序列，从而产生人抗体。
在各实施方案中，所述人重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在各具体实施方案中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在各实施方案中，所述人重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3、CH4或其组合。在各实施方案中，所述轻链恒定区是免疫球蛋白κ恒定区。在各实施方案中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、PC3细胞、T47D细胞、THP-1细胞、U87细胞、SHSY5Y(人成神经细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)和MC3T3cell。在一个具体实施方案中，所述细胞是CHO细胞。
在一个方面，提供了一种用于针对目的抗原产生特异性的反转嵌合啮齿动物-人抗体的方法，其包括以下步骤：用所述抗原对本文所述的小鼠进行免疫，从所述小鼠分离产生对所述抗原特异的反转嵌合小鼠-人抗体的至少一种细胞，培养产生对所述抗原特异的所述反转嵌合小鼠-人抗体的至少一种细胞，和获得所述抗体。
在一个实施方案中，所述反转嵌合小鼠-人抗体包含与小鼠或大鼠重链恒定基因融合的人重链可变域，和与小鼠或大鼠或人轻链恒定基因融合的人轻链可变域。
在一个实施方案中，在由分离自所述小鼠的至少一种细胞形成的至少一种杂交瘤细胞上，培养产生对抗原特异的反转嵌合啮齿动物-人抗体的所述至少一种细胞。
在一个方面，提供了一种用于产生对目的抗原具有特异的完全人抗体的方法，其包括以下步骤：用所述抗原对本文所述的小鼠进行免疫；从所述小鼠分离产生对所述抗原特异的反转嵌合啮齿动物-人抗体的至少一种细胞；产生至少一种细胞，所述细胞产生来源于所述对所述抗原特异的反转嵌合啮齿动物-人抗体的完全人抗体；和培养至少一种产生所述完全人抗体的细胞，以及获得所述完全人抗体。
在各实施方案中，分离自所述小鼠的产生对所述抗原特异的反转嵌合啮齿动物-人抗体的所述至少一种细胞是脾细胞或B细胞。
在各实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在各实施方案中，用所述目的抗原进行的免疫是利用蛋白质、DNA、DNA和蛋白质的组合或者表达所述抗原的细胞进行的。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于产生编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方案中，使用所述核酸序列产生人抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，使用所述小鼠产生抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白选自抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变域抗原结合蛋白)或双特异性T细胞啮合物(BiTE)。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于将异位ADAM6序列引入缺少功能性内源小鼠ADAM6序列的小鼠中的用途，其中所述用途包括使本文所述的小鼠与所述缺少功能性内源小鼠ADAM6序列的小鼠进行交配。
在一个方面，提供了来自本文所述的小鼠的基因材料用于产生具有异位ADAM6序列的小鼠的用途。在一个实施方案中，所述用途包括使用本文所述的小鼠的细胞核进行的核移植。在一个实施方案中，所述用途包括克隆本文所述的小鼠的细胞以产生来源于所述细胞的动物。在一个实施方案中，所述用途包括将本文所述的小鼠的精子或卵子用于产生包含异位ADAM6序列的小鼠的方法中。
在一个方面，提供了一种用于产生包含被修饰的免疫球蛋白重链基因座的可生育雄性小鼠的方法，包括用第二小鼠生殖细胞使包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰的第一小鼠生殖细胞受精，所述第二小鼠生殖细胞包含在雄性小鼠中发挥功能的ADAM6基因或其直系同源物或同源物或片段；形成被受精的细胞；允许所述被受精的细胞发育成胚胎；和在代母中孕育所述胚胎以获得小鼠。
在一个实施方案中，所述受精是通过雄性小鼠与雌性小鼠交配来实现的。在一个实施方案中，所述雌性小鼠包含ADAM6基因或其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方案中，所述雄性小鼠包含ADAM6基因或其直系同源物或同源物或片段。
在一个方面，提供了编码小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或者所述对应ADAM6蛋白的功能片段的核酸序列的用途，所述核酸序列用于恢复或增强基因组包含免疫球蛋白重链基因座的修饰的小鼠的生育力，其中所述修饰降低或消除内源ADAM6功能。
在一个实施方案中，所述核酸序列被整合到小鼠基因组的异位位置处。在一个实施方案中，所述核酸序列被整合到小鼠基因组的内源免疫球蛋白基因座处。在一个具体实施方案中，所述内源免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方案中，所述核酸序列被整合到小鼠基因组的非内源免疫球蛋白基因座的位置处。
在一个方面，提供了本文所述的小鼠用于制造用以治疗人疾病或病症的药物(例如抗原结合蛋白)的用途，或者本文所述的小鼠用于制造编码用以治疗人疾病或病症的药物(例如抗原结合蛋白)的可变序列的序列的用途。
附图说明
图1A显示了约1兆碱基(Mb)的人免疫球蛋白重链可变基因座位(空心符号)对约3兆碱基(Mb)的小鼠免疫球蛋白重链可变基因座位(实心符号)的直接基因组置换的大致图示，但未按比例绘制。
图1B显示了约0.5兆碱基(Mb)的人免疫球蛋白κ轻链可变基因座位的两个几乎相同的重复单元中的第一个或近端重复单元(空心符号)对约3兆碱基(Mb)的小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座位(实心符号)的直接基因组置换的大致图示，但未按比例绘制。
图2A显示了用于对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座位进行直接基因组置换的三个起始步骤(A-C)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换使得所有小鼠VH、DH和JH基因区段缺失并被三个人VH、所有人DH和JH基因区段置换。示出了用于首次插入人免疫球蛋白重链基因区段的靶向载体(3hVH BACvec)，其具有67kb 5’小鼠同源臂、选择表达盒(空心矩形)、位点特异性重组位点(空心三角形)、145kb人基因组片段和8kb 3’小鼠同源臂。示出了从随后的靶向载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、额外的选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
图2B显示了用于对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座位进行直接基因组置换的六个额外步骤(D-I)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换插入了77个额外的人VH基因区段并去除了最后一个选择表达盒。示出了用于将额外的人VH基因区段插入到人重链基因区段的初始插入物(3hVH-CRE杂合等位基因)中的靶向载体(18hVH BACvec)，其具有20kb 5’小鼠同源臂、选择表达盒(空心矩形)、196kb人基因组片段和62kb人同源臂，所述人同源臂与人重链基因区段的初始插入物的5’端部分重叠，所述5’端被显示具有位于人基因区段5’的位点特异性重组位点(空心三角形)。显示了由随后的靶向载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和额外的选择表达盒(空心矩形)。
图2C显示了用于对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座位进行直接基因组置换的三个初始步骤(A-C)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换使所有的小鼠Vκ和Jκ基因区段缺失(Igκ-CRE杂合等位基因)。显示了从靶向载体插入的选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
图2D显示了用于对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因座位进行直接基因组置换的五个额外步骤(D-H)的详细图示，但未按比例绘制，所述直接基因组置换插入了近端重复单元的所有人Vκ和Jκ基因区段并使最后一个选择表达盒缺失(40hVκdHyg杂合等位基因)。显示了由随后的靶向载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段和额外的选择表达盒(空心矩形)。
图3A显示了筛选策略的大致图示，但未按比例绘制，所述筛选策略包括定量PCR(qPCR)引物/探针组的定位，用于检测被靶向的胚胎干(ES)细胞中人重链基因序列的插入和小鼠重链基因序列的丧失。显示了在ES细胞和小鼠中筛选第一人重链插入物的策略，qPCR引物/探针针对未经修饰的小鼠染色体(上图)和被正确靶向的染色体(下图)上的缺失的区域(“丧失”探针C和D)、插入的区域(“hIgH”探针G和H)和侧接区域(“保留”探针A、B、E和F)。
图3B显示了亲本ES细胞和被修饰ES细胞中人免疫球蛋白重链基因区段的第一插入物的实测探针拷贝数量的代表性计算结果。探针A到F的实测探针拷贝数量被计算为2/2ΔΔCt。ΔΔCt被计算为ave[ΔCt(样品)-medΔCt(对照)]，其中ΔCt是测试探针与参考探针(参考探针在4个与6个之间，这取决于分析)之间的Ct差值。术语medΔCt(对照)是来自亲本ES细胞的多个(>60个)非靶向DNA样品的中值ΔCt。每个被修饰的ES细胞克隆被重复分析六次。为了计算亲本ES细胞中的IgH探针G和H的拷贝数，假定这些探针在被修饰ES细胞中的拷贝数为1，并且使用的最大Ct为35，即使没有观察到扩增。
图3C显示了仅使用探针D和H计算的每种基因型的四只小鼠的拷贝数的代表性计算结果。野生型小鼠：WT小鼠；就人免疫球蛋白基因区段的第一插入物来说为杂合型的小鼠：HET小鼠；就人免疫球蛋白基因区段的第一插入物来说为纯合型的小鼠：Homo小鼠。
图4A显示了用于通过细菌同源重组(BHR)构建3hVH BACvec的三个步骤的详细图示，但未按比例绘制。显示了从靶向载体插入的人(空心符号)和小鼠(实心符号)免疫球蛋白基因区段、选择表达盒(空心矩形)和位点特异性重组位点(空心三角形)。
图4B显示了在NotI消化之后的三个BAC克隆(B1、B2和B3)的脉冲场凝胶电泳(PFGE)。标记物M1、M2和M3分别是低范围、中间范围和λ梯度PFG标记物(New EnglandBioLabs,Ipswich,MA)。
图5A显示了增加量的人免疫球蛋白重链基因区段对小鼠免疫球蛋白重链基因座的连续修饰的示意图，但未按比例绘制。从重链人源化的三个不同阶段中的每一个阶段产生了纯合小鼠。空心符号指示人序列，实心符号指示小鼠序列。
图5B显示了增加量的人免疫球蛋白κ轻链基因区段对小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的连续修饰的示意图，但未按比例绘制。从κ轻链人源化的三个不同阶段中的每一个阶段产生了纯合小鼠。空心符号指示人序列，实心符号指示小鼠序列。
图6显示了在野生型和
Figure BDA0000957660150000291
人源化小鼠中的B细胞群体的FACS点阵图。对来自于野生型(wt)、
Figure BDA0000957660150000292
1(V1)、
Figure BDA0000957660150000293
2(V2)或
Figure BDA0000957660150000294
3(V3)小鼠的脾(第1行、正数第3行、和最后1行)或腹股沟淋巴结(正数第2行)的细胞染色，用于检测表面IgM表达性B细胞(第1行和正数第2行)、含有κ或λ轻链的表面免疫球蛋白(正数第3行)或特异性单倍型的表面IgM(最后1行)，并且通过FACS分离群体。
图7A显示了随机选择的
Figure BDA0000957660150000295
抗体VH-DH-JH(CDR3)接合处周围的代表性重链CDR3序列，从而证明了接合多样性和核苷酸添加。根据DH基因区段的使用对重链CDR3序列进行分组，其种系以粗体在每组上方提供。每个重链CDR3序列的VH基因区段被记录在每个序列的5’端的括号内(例如3-72是人VH3-72)。每个重链CDR3的JH基因区段被记录在每个序列的3’端的括号内(例如3是人JH3)。显示的每个序列的SEQ ID NO从上到下如下所示：SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQID NO:38；SEQ ID NO:39。
图7B显示了随机选择的
Figure BDA0000957660150000301
抗体Vκ-Jκ(CDR3)接合处周围的代表性轻链CDR3序列，从而证明了接合多样性和核苷酸添加。每个轻链CDR3序列的Vκ基因区段被记录在每个序列的5’端的括号内(例如1-6是人Vκ1-6)。每个轻链CDR3的Jκ基因区段被记录在每个序列的3’端的括号内(例如1是人Jκ1)。显示的每个序列的SEQ ID NO从上到下如下所示：SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:44；SEQID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；SEQID NO:51；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQID NO:57；SEQ ID NO:58。
图8显示了
Figure BDA0000957660150000302
抗体的重链和轻链的体细胞超突变频率，其被计分(与匹配种系序列比对之后)为在各组38个(非经免疫的IgM)、28个(非经免疫的IgG)、32个(来自IgG的非经免疫的Igκ)、36个(经免疫的IgG)或36个(来自IgG的经免疫的Igκ)序列中的每个核苷酸(NT；左列)或氨基酸(AA；右列)位置处发生变化的序列的百分比。阴影条形图指示CDR的位置。
图9A显示了野生型(空心条形图)或小鼠(实心条形图)中的IgM和IgG同种型的血清免疫球蛋白含量。
图9B显示了野生型(空心条形图)或
Figure BDA0000957660150000304
小鼠(实心条形图)中的IgA同种型的血清免疫球蛋白含量。
图9C显示了野生型(空心条形图)或
Figure BDA0000957660150000305
小鼠(实心条形图)中的IgE同种型的血清免疫球蛋白含量。
图10A显示了在用IL-6R的胞外域进行两(采血1)或三(采血2)轮免疫之后，针对来自7只
Figure BDA0000957660150000306
(VI)小鼠和5只野生型(WT)小鼠的血清白细胞介素-6受体(IL-6R)的抗原特异性IgG滴度。
图10B显示了来自7只
Figure BDA0000957660150000307
(VI)小鼠和5只野生型(WT)小鼠的抗IL-6R-特异性IgG同种型-特异性滴度。
图11A显示了在
Figure BDA0000957660150000308
小鼠中产生的抗白细胞介素-6受体单克隆抗体的亲和力分布。
图11B显示了在
Figure BDA0000957660150000309
(VI)和野生型(WT)小鼠中产生的抗白细胞介素-6受体单克隆抗体的抗原特异性封闭。
图12显示了小鼠免疫球蛋白重链基因座中的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的示意图，但未按比例绘制。示出了用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b插入人源化内源重链基因座中的靶向载体(mADAM6靶向载体)，其具有被位点特异性重组位点(Frt)侧接的选择表达盒(HYG：潮霉素)，并包含在5’和3’端上的工程改造的限制位点。
图13显示了位于人重链可变基因区段1-2(VH1-2)与6-1(VH6-1)之间的人ADAM6假基因(hADAM6ψ)的示意图，但未按比例绘制。示出了用于进行细菌同源重组以使人ADAM6假基因缺失并将独特的限制位点插入人重链基因座中的靶向载体(hADAM6ψ靶向载体)，其具有被位点特异性重组位点(loxP)侧接的选择表达盒(NEO：新霉素)，并包含在5’和3’端上的工程改造的限制位点。显示了得到的被靶向的人源化重链基因座的图示，但未按比例绘制，所述被靶向的人源化重链基因座含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片段，并包含被位点特异性重组位点侧接的选择表达盒。
图14A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的骨髓中，在单线上门控的淋巴细胞中的IgM和B220表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220highIgM+)B细胞的百分比。
图14B显示了骨髓中的不成熟(B220intIgM+)和成熟(B220highIgM+)B细胞的总数，所述骨髓分离自就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的股骨。
图15A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的骨髓中，CD19+门控B细胞中的c-kit和CD43表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图的右上象限和左下象限中分别记录了原B(pro-B)(CD19+CD43+ckit+)细胞和(pre-B)前B(CD19+CD43-ckit-)细胞的百分比。
图15B显示了骨髓中的原B细胞(CD19+CD43+ckit+)和前B细胞(CD19+CD43-ckit-)的总数，所述骨髓分离自就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的股骨。
图16A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的骨髓中，在单线上门控的淋巴细胞中的CD19和CD43表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了不成熟B(CD19+CD43-)、前B(CD19+CD43int)和原B(CD19+CD43+)细胞的百分比。
图16B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的骨髓中，不成熟B(CD19+CD43-)和前B(CD19+CD43int)细胞的直方图。
图17A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的脾细胞中，在单线上门控的淋巴细胞中的CD19和CD3表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了B(CD19+CD3-)和T(CD19-CD3+)细胞的百分比。
图17B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的脾中，CD19+门控B细胞中的Igλ和Igκ轻链表面表达的FACS等高线图。在每个等高线图中记录了Igλ+(左上象限)和Igκ(右下象限)B细胞的百分比。
图17C显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的脾中的CD19+B细胞总数。
图18A显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的脾中，CD19+门控B细胞中的IgD和IgM表面表达的FACS等高线图。每个等高线图中记录了成熟B细胞(CD19+IgDhighIgMint)的百分比。右侧等高线图上的箭头说明了与IgM和IgD表面表达有关的B细胞成熟过程。
图18B显示了就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+)的脾中的B细胞在从CD19+IgMhighIgDint到CD19+IgMintIgDhigh的成熟期间的总数。
图19显示了来自于就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+；n＝5)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+；n＝5)的第一和第二采血的抗体滴度，所述小鼠经过人细胞表面受体(抗原A)免疫。
图20显示了来自于就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+；n＝5)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+；n＝10)的第一和第二采血的抗体滴度，所述小鼠经过对人受体酪氨酸蛋白激酶具有特异性的人抗体(抗原B)免疫。
图21显示了来自于就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+；n＝12)和就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+；n＝12)的第一和第二采血的抗体滴度，所述小鼠经过在TGF-β信号传导路径的调控中发挥功能的分泌人蛋白(抗原C)免疫。
图22显示了来自于就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型并具有编码小鼠ADAM6基因的异位小鼠基因组片段的小鼠(H+/+A6resκ+/+；n＝12)的第一和第二采血的抗体滴度，所述小鼠经过人受体酪氨酸激酶(抗原D)免疫。
具体实施方式
本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应了解本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不打算构成限制，因为本发明的范围是由权利要求限定的。
除非另外定义，否则本文使用的所有术语和短语都包括所述术语和短语在所属领域中已经获得的含义，除非明确地指明相反或者从使用所述术语或短语的上下文中明确了解。虽然与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但现在还是对特定的方法和材料进行了描述。所提及的所有公开出版物都以引用的方式并入本文中。
短语“基本上”或“基本上地”当用于涉及基因区段的量时(例如“基本上所有的”V基因区段)，包括功能性和非功能性基因区段两者，并且在各实施方案中，包括例如所有基因区段的80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、或99％或以上；在各实施方案中，“基本上所有的”基因区段包括例如至少95％、96％、97％、98％或99％的功能性(即非假基因)基因区段。
术语“置换”包括以下述方式将DNA序列放置入细胞基因组中，所述方式即在所述基因组序列的基因座处，用异源序列(例如小鼠中的人序列)置换该基因组内的序列。如此放置的DNA序列可以包含一个或多个作为用于获得如此放置的序列的源DNA的一部分的调控序列(例如启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区、适当的重组信号序列等)。举例来说，在各实施方案中，置换是将内源序列替换为异源序列，导致从如此放置的DNA序列(包含所述异源序列)产生基因产物，但所述内源序列并不表达；置换是用编码与所述内源基因组序列所编码的蛋白质具有类似功能的蛋白质的DNA序列置换内源基因组序列(例如，所述内源基因组序列编码免疫球蛋白基因或结构域，并且所述DNA片段编码一个或多个人免疫球蛋白基因或结构域)。在各实施方案中，用对应的人基因或其片段置换内源基因或其片段。对应的人基因或其片段是如下所述的人基因或片段，其是所置换的内源基因或其片段的直系同源物或同源物，或与所置换的内源基因或其片段的结构和/或功能基本一致或相同。
已经通过转基因和敲除技术大大地强化了作为基因模型的小鼠，这些技术已经允许研究具体基因的定向过表达或缺失的作用。尽管有许多优点，但所述小鼠仍然存在基因障碍，导致它不能成为人疾病的完美模型，并且不能成为用于测试人治疗剂或制造人治疗剂的完美平台。首先，虽然约99％的人基因具有小鼠同源物(Waterston et al.,2002,Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome,Nature 420:520-562)，但是潜在的治疗剂通常无法与预期人靶标的小鼠直系同源物交叉反应，或交叉反应不充分。为了避免这个问题，可以对选定的靶基因进行“人源化”，也就是说，可以消除小鼠基因并用对应的人直系同源基因序列置换小鼠基因(例如US 6,586,251、US 6,596,541和US 7,105,348，其以引用的方式并入本文中)。起初，通过“敲除加转基因人源化”策略对小鼠基因进行人源化的工作需要使携带内源基因的缺失(即敲除)的小鼠与携带随机整合的人转基因的小鼠进行杂交(参看例如Brilet al.,2006,Tolerance to factor VIIIin a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593)to Cys substitution,Thromb Haemost 95:341-347；Homanicset al.,2006,Productionand characterization of murine models of classic and intermediate maple syrupurine disease,BMC Med Genet 7:33；Jamsaiet al.,2006,A humanized BACtransgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia,Genomics 88(3):309-15；Panet al.,2006,Different role for mouse and human CD3delta/epsilonheterodimer in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilonheterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma-andCD3gammadelta-deficient mice,Mol Immunol 43:1741-1750)。但这些工作受到尺寸限制的阻碍；常规的敲除技术不足以将大的小鼠基因直接替换为其大的人基因组对应物。因为技术性困难，很少尝试直接同源置换的简单方法，其中在小鼠基因的相同精确基因位置处(即在内源小鼠基因座处)用人对应基因直接置换内源小鼠基因。到目前为止，在直接置换方面的工作涉及精细并且繁琐的操作，因而限制了可处理的基因材料的长度和对基因材料操纵的精确性。
外源引入的人免疫球蛋白转基因在小鼠的前体B细胞中发生重排(Altet al.,1985,Immunoglobulin genes in transgenic mice,Trends Genet 1:231-236)。通过使用敲除加转基因方法对小鼠进行工程改造，以表达人抗体而利用了这一发现(Greenet al.,1994,Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered withhuman Ig heavy and light chain YACs,Nat Genet 7:13-21；Lonberget al.,1994,Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct geneticmodifications,Nature 368:856-859；Jakobovitset al.,2007,From XenoMousetechnology to panitumumab,the first fully human antibody product fromtransgenic mice,Nat Biotechnol 25:1134-1143)。通过使每个内源基因座的较小但关键的部分定向缺失，随后引入人免疫球蛋白基因座位作为随机整合的较大转基因(如上所述)或微染色体，使这些小鼠中的小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活(Tomizukaet al.,2000,Double trans-chromosomic mice:maintenance of two individual humanchromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression offully human antibodies,PNAS USA 97:722-727)。所述小鼠代表了基因工程方面的重要进步；从所述小鼠分离的完全人单克隆抗体提供了用于治疗多种人疾病的有希望的治疗潜能(Gibsonet al.,2006,Randomized phase III trial results of panitumumab,afully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody,inmetastatic colorectal cancer,Clin Colorectal Cancer 6:29-31；Jakobovitset al.,2007；Kimet al.,2007,Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase IIstudies in refractory cutaneous T-cell lymphoma,Blood109(11):4655-62；Lonberg,2005,Human antibodies from transgenic animals,Nat Biotechnol 23:1117-1125；Makeret al.,2005,Tumor regression and autoimmunity in patients treated withcytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4blockade and interleukin 2:a phaseI/II study,Ann Surg Oncol 12:1005-1016；McClunget al.,2006,Denosumab inpostmenopausal women with low bone mineral density,New Engl J Med 354:821-831)。但是，如上文所论述，这些小鼠与野生型小鼠相比展现出受损的B细胞发育，并且有免疫缺乏。这些问题可能会限制小鼠支持有力体液应答的能力，并且因此会限制小鼠产生针对一些抗原的完全人抗体的能力。这些缺陷可归因于：(1)因为随机引入人免疫球蛋白转基因而导致的不足功能性，和因为缺少上游和下游控制元件而导致的不正确表达(Garrettetal.,2005,Chromatin architecture near a potential 3'end of the IgH locusinvolves modular regulation of histone modifications during B-Celldevelopment and in vivo occupancy at CTCF sites,Mol Cell Biol 25:1511-1525；Maniset al.,2003,Elucidation of a downstream boundary of the 3'IgH regulatoryregion,Mol Immunol 39:753-760；Pawlitzkyet al.,2006,Identification of acandidate regulatory element within the 5'flanking region of the mouse IgHlocus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with bindingof PU.1,Pax5,and E2A,J Immunol 176:6839-6851)；(2)人恒定域与小鼠细胞表面上的B细胞受体信号传导复合物的组分之间的低效种间相互作用，其可能损害B细胞的正常成熟、增殖和存活所必需的信号传导过程(Hombachet al.,1990,Molecular components of theB-cell antigen receptor complex of the IgM class,Nature 343:760-762)；和(3)可溶性人免疫球蛋白与小鼠Fc受体之间的低效种间相互作用，其可能会降低亲和力选择(Raoet al.,2002,Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptorFcgammaRIIB on germinal center cells:implications for selection of high-affinity B cells,J Immunol 169:1859-1868)和免疫球蛋白血清浓度(Brambellet al.,1964,A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism,Nature 203:1352-1354；Junghans and Anderson,1996,The protection receptor for IgG catabolism is thebeta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor,PNASUSA93:5512-5516；Raoet al.,2002；Hjelmet al.,2006,Antibody-mediated regulationof the immune response,Scand J Immunol 64:177-184；Nimmerjahn and Ravetch,2007,Fc-receptors as regulators of immunity,Adv Immunol 96:179-204)。这些缺陷可以通过仅对小鼠免疫球蛋白基因座的可变区在内源重链和轻链基因座处的天然位置进行原位人源化来校正。这将有效地产生可形成“反转嵌合”(即人V:小鼠C)抗体的小鼠，基于保留的小鼠恒定区，这些抗体将能够与小鼠环境进行正常的相互作用并由其筛选。其它这类反转嵌合抗体可以容易地重新形成用于治疗目的的完全人抗体。
可以形成包含在内源免疫球蛋白重链基因座处用异源(例如来自另一个种)免疫球蛋白序列进行的置换的基因修饰动物，所述基因修饰动物还包含在内源免疫球蛋白轻链基因座处进行的置换或者免疫球蛋白轻链转基因(如嵌合免疫球蛋白轻链转基因或者完全人轻链转基因或完全小鼠转基因等)。异源免疫球蛋白重链序列所来源的种可以广为不同；对于在免疫球蛋白轻链序列置换或免疫球蛋白轻链转基因中所使用的免疫球蛋白轻链序列，情况也是一样。
在各实施方案中，例如V、D和/或J区段等免疫球蛋白可变区核酸序列是从人或非人动物获得的。适合于提供V、D和/或J区段的非人动物包括例如硬骨鱼、软骨鱼(例如鲨鱼和鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、禽类(例如鸡)。非人动物包括例如哺乳动物。哺乳动物包括例如非人灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、骆驼、雪貂和啮齿动物和非人灵长类动物(例如黑猩猩、猩猩、大猩猩、狨猴、猕猴、狒狒)。合适的非人动物选自啮齿科，包括大鼠、小鼠和仓鼠。在一个实施方案中，所述非人动物是小鼠。从上下文可了解，各种非人动物可用作可变域或可变区基因区段的来源(例如鲨鱼、鳐、哺乳动物(例如骆驼、啮齿动物，如小鼠和大鼠))。
根据上下文，非人动物还用作欲与可变序列或区段一起使用的恒定区序列的来源，例如啮齿动物恒定序列可用在可操作地连接到人或非人可变序列(例如可操作地连接到例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)恒定序列上的人或非人灵长类动物可变序列)上的转基因中。因此，在各实施方案中，人V、D和/或J区段可操作地连接到啮齿动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)恒定区基因序列上。在一些实施方案中，所述人V、D和/或J区段(或一个或多个重排的VDJ或VJ基因)可操作地连接到或融合到小鼠、大鼠或仓鼠恒定区基因序列上，所述恒定区基因序列例如位于整合到非内源免疫球蛋白基因座的基因座处的转基因内。
在一个具体实施方案中，提供了下述的小鼠，其包含一个或多个人VH、DH和JH区段对内源免疫球蛋白重链基因座处的VH、DH和JH区段的置换，其中所述一个或多个人VH、DH和JH区段可操作地连接到内源免疫球蛋白重链基因上；其中所述小鼠在非内源免疫球蛋白基因座的基因座处包含转基因，其中所述转基因包含可操作地连接到小鼠或大鼠或人恒定区上的非重排或重排的人VL和人JL区段。
描述了用人种系免疫球蛋白可变基因座位对小鼠种系免疫球蛋白可变基因座位进行大型原位基因置换、同时保留小鼠产生后代的能力的方法。具体来说，描述了6兆碱基的小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变基因座位两者被人对应物精确置换，同时仍保持小鼠恒定区完整。因此，已经产生了全体种系免疫球蛋白可变谱系被相应的人种系免疫球蛋白可变序列精确置换、同时保留小鼠恒定区的小鼠。人可变区连接到小鼠恒定区上，形成发生重排并以生理上适当的水平进行表达的嵌合人-小鼠免疫球蛋白基因座。所表达的抗体是“反转嵌合体”，即它们包含人可变区序列和小鼠恒定区序列。具有表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区的这些小鼠被称为
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小鼠。
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人源化小鼠展现出具有完全功能的体液免疫系统，其基本上与野生型小鼠的体液免疫系统没有区别。它们在B细胞发育的所有阶段显示正常的细胞群体。它们展现出正常的淋巴样器官形态。
Figure BDA0000957660150000383
小鼠的抗体序列展现出正常的V(D)J重排和正常的体细胞超突变频率。这些小鼠中的抗体群体反映了由正常种型转换(例如正常同种型顺式转换)引起的同种型分布。对
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小鼠进行免疫导致了强有力的体液免疫应答，其产生适合用作治疗候选物的具有人免疫球蛋白可变区的庞大并且多样性的抗体谱系。这个平台提供了用于形成药学上可接受的抗体和其它抗原结合蛋白的天然亲和力成熟的人免疫球蛋白可变区序列的丰富来源。
用人免疫球蛋白可变序列对小鼠免疫球蛋白可变序列进行精确置换，使得可以形成
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小鼠。然而，因为在小鼠与人之间的免疫球蛋白基因座的趋异进化，即便通过对非常大的人免疫球蛋白序列链段进行连续重组工程从而用相应的人免疫球蛋白序列精确置换重链和轻链基因座处的内源小鼠免疫球蛋白序列，也可能出现某些问题。举例来说，散布在免疫球蛋白基因座内的基因间序列在小鼠与人之间不一致，并且在一些情况下可能在功能上不等效。小鼠与人在其免疫球蛋白基因座上的差别仍然可能导致人源化小鼠的异常，尤其当对内源小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分进行人源化或操纵时。在小鼠免疫球蛋白重链基因座处的一些修饰是有害的。有害的修饰可以包括例如被修饰小鼠交配和产生后代的能力的丧失。
用对应的1.4兆碱基人基因组序列对小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因座的6兆碱基可变区(VH-DH-JH和Vκ-Jκ)进行精确的大规模原位置换，同时保持侧接小鼠序列完整并且在杂合基因座内发挥功能，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区(图1A和图1B)。具体来说，使用
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基因工程技术，将13个携带人种系可变基因座重叠片段的嵌合型BAC靶向载体逐步插入小鼠ES细胞中，从而引入人VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因序列(参看例如美国专利号6,586,251和Valenzuelaet al.,2003,High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis,Nat Biotechnol 21:652-659)。
小鼠免疫球蛋白基因的人源化代表了迄今为止对小鼠基因组的最大基因修饰。虽然先前用随机整合的人免疫球蛋白转基因所进行的工作已经获得了一些成功(上文论述)，但是用人对应物直接置换小鼠免疫球蛋白基因会显著增加用其在其它方面都正常的小鼠中有效地产生完全人抗体的效率。此外，与携带无效内源基因座和完全人抗体转基因的小鼠相比，所述小鼠展现出在用几乎任何抗原进行免疫之后可获得的完全人抗体的显著增加的多样性。与在各个分化阶段均展现出显著减少的B细胞群体的具有随机整合的人转基因的小鼠相比，多种型式的被置换的人源化基因座展现出完全正常的成熟和不成熟B细胞水平。虽然增加人转基因小鼠中的人基因区段数量的工作减少了所述缺陷，但是与野生型小鼠相比，扩大的免疫球蛋白谱系没有完全校正B细胞群体的减少。
尽管在具有被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠(即
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小鼠)中观察到了接近野生型的体液免疫功能，但是当使用免疫球蛋白的直接置换时会遇到在使用随机整合的转基因的一些方法中不会遇到的其他问题。免疫球蛋白基因座的基因组成在小鼠与人之间的差别已经导致对具有被置换的免疫球蛋白基因区段的小鼠的繁殖有利的序列的发现。具体来说，在具有被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠中最好存在位于内源免疫球蛋白基因座内的小鼠ADAM基因，因为它们在生育力方面发挥功能。
小鼠ADAM6的基因组位置和功能
令人意外地，缺少表达任何功能性ADAM6蛋白的能力的雄性小鼠展现出小鼠交配和产生后代的能力的缺陷。通过用人可变区基因区段置换所有或基本上所有小鼠免疫球蛋白可变区基因区段，使得所述小鼠缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。ADAM6功能之所以丧失是因为ADAM6基因座位于内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因座位的邻近VH基因区段基因座3’端的区域中，所述VH基因区段基因座在DH基因区段的上游。为了繁殖就人重链可变基因区段对所有或基本上所有内源小鼠重链可变基因区段的置换来说为纯合型的小鼠，建立就所述置换来说各自为纯合型的雄性和雌性小鼠并等待生殖交配通常是一项繁琐的方法。成功幼仔的频率和规模都很低。相反地，已经使用了就所述置换来说为杂合型的雄性小鼠与就所述置换来说为纯合型的雌性小鼠进行交配，以产生就所述置换来说为杂合型的后代，然后从所述后代繁殖纯合型小鼠。本发明人已经确定了雄性小鼠生育力丧失的可能原因在于纯合型雄性小鼠中不存在功能性ADAM6蛋白。
在各个方面，包含受损(即非功能性的或略微功能性的)ADAM6基因的雄性小鼠展现出生育力的下降或消失。因为在小鼠(和其它啮齿动物)中ADAM6基因位于免疫球蛋白重链基因座中，所以本发明人已经确定，为了繁殖包含被置换的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，或产生并维持包含被置换的免疫球蛋白重链基因座的小鼠品系，使用了各种经过修改的生殖或繁殖方案。就内源免疫球蛋白重链可变基因座位的置换来说为纯合型的雄性小鼠的低生育力或不育导致在小鼠品系中维持这种修饰很困难。在各实施方案中，维持品系包含避免就所述置换来说为纯合型的雄性小鼠所展现的不育问题。
在一个方面，提供了一种用于维持本文所述的小鼠品系的方法。所述小鼠品系不需要包含异位ADAM6序列，并且在各实施方案中，所述小鼠品系就ADAM6的敲除(例如功能性敲除)来说为纯合型或杂合型的。
小鼠品系包含内源免疫球蛋白重链基因座的修饰，所述修饰导致了雄性小鼠生育力的下降或丧失。在一个实施方案中，所述修饰包括ADAM6基因的调控区和/或编码区的缺失。在一个具体实施方案中，所述修饰包括内源ADAM6基因(调控区和/或编码区)的修饰，所述修饰降低或消除了包含所述修饰的雄性小鼠的生育力；在一个具体实施方案中，所述修饰降低或消除了就所述修饰来说为纯合型的雄性小鼠的生育力。
在一个实施方案中，所述小鼠品系就ADAM6基因的敲除(例如功能性敲除)或缺失来说为纯合型或杂合型的。
在一个实施方案中，所述小鼠品系的维持通过以下方式进行：从就所述修饰来说为纯合型或杂合型的小鼠分离细胞，在宿主胚胎中使用供体细胞，在代孕母亲中孕育宿主胚胎和供体细胞，并从代孕母亲获得包含基因修饰的后代。在一个实施方案中，所述供体细胞是ES细胞。在一个实施方案中，所述供体细胞是多能细胞，例如诱导型多能细胞。
在一个实施方案中，所述小鼠品系的维持通过以下方式进行：从就所述修饰来说为纯合型或杂合型的小鼠分离包含所述修饰的核酸序列，将所述核酸序列引入宿主核中，并在合适动物中孕育包含所述核酸序列和所述宿主核的细胞。在一个实施方案中，将所述核酸序列引入宿主卵母细胞胚胎中。
在一个实施方案中，所述小鼠品系的维持通过以下方式进行：从就所述修饰来说为纯合型或杂合型的小鼠分离核，将所述核引入宿主细胞中，并在合适动物中孕育所述核和宿主细胞以获得就所述修饰来说为纯合型或杂合型的后代。
在一个实施方案中，所述小鼠品系的维持通过采用以下方式进行：使用从包含所述基因修饰的雄性小鼠获得的精子来对雌性小鼠(野生型，就所述修饰来说为纯合型的，或就所述修饰来说为杂合型的)进行体外受精(IVF)。在一个实施方案中，所述雄性小鼠就基因修饰来说为杂合型的。在一个实施方案中，所述雄性小鼠就基因修饰来说为纯合型的。
在一个实施方案中，所述小鼠品系的维持通过以下方式进行：使就所述基因修饰来说为杂合型的雄性小鼠与雌性小鼠交配繁殖，以获得包含所述基因修饰的后代，鉴别包含所述基因修饰的雄性和雌性后代，并利用就所述基因修饰来说为杂合型的雄性小鼠与野生型的、就所述基因修饰来说为纯合型或杂合型的雌性小鼠进行交配繁殖，以获得包含所述基因修饰的后代。在一个实施方案中，重复进行使就所述基因修饰来说为杂合型的雄性小鼠与野生型雌性小鼠、就所述基因修饰来说为杂合型的雌性小鼠或就所述基因修饰来说为纯合型的雌性小鼠进行交配繁殖的步骤，以维持小鼠品系中的所述基因修饰。
在一个方面，提供了一种用于维持包含一个或多个人免疫球蛋白重链序列对内源免疫球蛋白重链可变基因座位的置换的小鼠品系的方法，包括：使所述小鼠品系交配繁殖，以产生杂合型雄性小鼠，其中使所述杂合型雄性小鼠交配繁殖以维持品系中的所述基因修饰。在一个具体实施方案中，所述品系不通过纯合型雄性小鼠与野生型雌性小鼠、或者就所述基因修饰来说为纯合型或杂合型的雌性小鼠的任何交配繁殖来维持。
ADAM6蛋白是ADAM蛋白家族的一员，其中ADAM是A去整合素和金属蛋白酶(ADisintegrin And Metalloprotease)的首字母缩写。ADAM蛋白家族是庞大并且多样性的，并具有包括细胞粘附在内的多种功能。ADAM家族的一些成员参与到精子发生和受精中。举例来说，ADAM2编码参与到精子-卵子相互作用中的蛋白受精素(fertilin)的亚单元。ADAM3或cyritestin似乎是精子与透明带的结合所必需的。不存在ADAM2或ADAM3都会导致不育。已经假设ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠精细胞表面上形成复合物。通常在人VH基因区段VH1-2与VH6-1之间存在的人ADAM6基因似乎是假基因(图12)。在小鼠中，有存在于小鼠VH与DH基因区段之间的基因间区域中的两种ADAM6基因——ADAM6a和ADAM6b，并且在小鼠中，ADAM6a和ADAM6b基因的转录方向与周围的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反(图12)。在小鼠中，功能性ADAM6基因座显然是正常受精所必需的。那么，功能性ADAM6基因座或序列是指能够补偿或挽救在缺少功能性内源ADAM6基因座或具有非功能性内源ADAM6基因座的雄性小鼠中所展现的显著降低的受精作用。
小鼠中编码ADAM6a和ADAM6b的基因间序列的位置使得所述基因间序列在修饰内源小鼠重链时容易被修饰。当VH基因区段缺失或被置换时，或者当DH基因区段缺失或被置换时，获得的小鼠有很高的概率会展现出严重的生育力缺陷。为了补偿这种缺陷，对小鼠进行修饰以包含编码将补偿因内源小鼠ADAM6基因座修饰所致的ADAM6活性丧失的蛋白质的核苷酸序列。在各实施方案中，所述补偿性核苷酸序列是编码挽救生育力缺陷的小鼠ADAM6a、小鼠ADAM6b或其同源物或直系同源物或功能片段的核苷酸序列。
所述挽救生育力的核苷酸序列可以被放置在任何合适位置。其可以被放置在所述基因间区域中，或放置在基因组中的任何合适位置(即异位地)。在一个实施方案中，所述核苷酸序列可以被引入随机整合入小鼠基因组的转基因中。在一个实施方案中，所述序列可以被维持在附加体上，也就是说维持在另外的核酸上而不是小鼠染色体上。合适位置包括转录上允许或有活性的位置，例如ROSA26基因座(Zambrowiczet al.,1997,PNAS USA 94:3789-3794)、BT-5基因座(Michaelet al.,1999,Mech.Dev.85:35-47)或Oct4基因座(Wallaceet al.,2000,Nucleic Acids Res.28:1455-1464)。例如在US 7,473,557中描述了将核苷酸序列靶向具有转录活性的基因座，所述专利以引用方式并入本文中。
或者，所述挽救生育力的核苷酸序列可以和诱导型启动子连接，以促进在适当细胞和/或组织(例如生殖组织)中的最佳表达。示例性诱导型启动子包括通过物理(例如热休克启动子)和/或化学方法(例如IPTG或四环素)激活的启动子。
此外，所述核苷酸序列的表达可以与其它基因相关联，以在特定发育阶段或在特定组织内实现表达。所述表达可以通过以与在特定发育阶段表达的基因的启动子可操作地连接的方式放置所述核苷酸序列来实现。举例来说，以与来自宿主种的CD19基因(B细胞特异性基因)的启动子序列可操作地连接的方式放置来自被工程改造入所述宿主种的基因组中的一个种的免疫球蛋白序列。当表达免疫球蛋白时，就能实现精确发育阶段的B细胞特异性表达。
另一种实现被插入核苷酸序列的稳固表达的方法是使用组成型启动子。示例性组成型启动子包括SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK和CAGG。采用类似方式，以与所选组成型启动子以可操作地连接的方式放置所述期望的核苷酸序列，这提供了由所述核苷酸序列编码的蛋白质的高表达水平。
术语“异位”旨在包括移位，或在自然界中通常不会遇到的位置处的放置(例如，核酸序列的放置位置在与野生型小鼠中发现的所述核酸序列的位置不同)。在各实施方案中，所述术语在其对象脱离正常或正确位置的意义上使用。举例来说，短语“编码……的异位核苷酸序列”是指在小鼠中通常不会遇到的位置处出现的核苷酸序列。举例来说，在编码小鼠ADAM6蛋白(或其对雄性小鼠提供相同或类似生育益处的直系同源物或同源物或片段)的异位核苷酸序列的情况下，所述序列可以被放置在小鼠基因组中与野生型小鼠中通常发现的位置不同的位置处。在这些情况下，小鼠序列的新序列接合点将通过将该序列放置在小鼠基因组中与野生型小鼠中的位置不同的位置处来产生。小鼠ADAM6的功能性同源物或直系同源物是对ADAM6-/-小鼠中观察到的生育力丧失(例如雄性小鼠通过交配产生后代的能力的丧失)进行挽救的序列。功能性同源物或直系同源物包括下述的蛋白质：其与ADAM6a的氨基酸序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89％或更高同一性，例如具有最高达的99％同一性，并且能够补偿或挽救基因型包含ADAM6a和/或ADAM6b缺失或敲除的小鼠成功交配的能力。
异位位置可以是任何地方(例如，与含有小鼠ADAM6序列的转基因的随机插入一样)，或者可以位于例如接近(但不正好是)其在野生型小鼠中的位置的位置(例如在被修饰的内源小鼠免疫球蛋白基因座中，但在其天然位置的上游或下游，例如在被修饰的免疫球蛋白基因座中，但介于不同基因区段之间，或在小鼠V-D基因间序列中的不同位置处)。异位放置的一个实例是放置在人源化免疫球蛋白重链基因座内。举例来说，可以对包含人VH基因区段对一个或多个内源VH基因区段的置换的小鼠(其中所述置换去除了内源ADAM6序列)进行工程改造，以具有位于含有人VH基因区段的序列内的小鼠ADAM6序列。得到的修饰将在人基因序列内产生(异位)小鼠ADAM6序列，并且所述小鼠ADAM6序列在人基因序列内的(异位)放置可以接近于人ADAM6假基因的位置(即在两个V区段之间)或可以接近于小鼠ADAM6序列的位置(即在V-D基因间区域内)。与野生型小鼠的基因组中的相同或类似位置相比，通过将(异位)小鼠ADAM6序列接合到小鼠种系内的人基因序列(例如免疫球蛋白基因序列)内或邻近形成的序列接合物是新的。
在各实施方案中，提供了缺少ADAM6或其直系同源物或同源物的非人动物，其中所述缺少导致所述非人动物不育，或大幅降低所述非人动物的生育力。在各实施方案中，ADAM6或其直系同源物或同源物的缺少是因为对内源免疫球蛋白重链基因座的修饰。生育力的大幅降低是，例如，约50％、60％、70％、80％、90％或95％或以上的生育力降低(例如交配繁殖频率、每窝的幼崽数、每年的窝数等)。在各实施方案中，利用在雄性非人动物中发挥功能的小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能片段对所述非人动物进行补充，其中所述补充的ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能片段完全地或绝大部分地挽救了生育力降低。绝大部分的生育力挽救是，例如，导致非人动物与未经修饰(即ADAM6基因或其直系同源物或同源物未经修饰的动物)的重链基因座相比展现出至少70％、80％或90％或以上的生育力的生育力恢复。
在各实施方案中，赋予基因修饰动物(即缺少功能性ADAM6或其直系同源物或同源物的动物，例如归因于免疫球蛋白重链基因座的修饰)的序列选自ADAM6基因或其直系同源物或同源物。举例来说，在小鼠中，在一个实施方案中，通过添加小鼠ADAM6基因来挽救ADAM6功能的丧失。在一个实施方案中，通过添加与小鼠紧密相关的种(例如啮齿动物，例如不同品系或种的小鼠、任何种的大鼠、啮齿动物)的直系同源物或同源物来挽救小鼠的ADAM6功能丧失；其中对小鼠添加直系同源物或同源物挽救了因ADAM6功能丧失或ADAM6基因丧失所致的生育力丧失。来自其它种的直系同源物和同源物，在各实施方案中，选自种系发生学上相关的种，并且在各实施方案中，展现出与内源ADAM6(或直系同源物)约80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、96％或以上或者97％或以上的同一性百分比；并且挽救与ADAM6相关或(在非小鼠中)与ADAM6直系同源物相关的生育力丧失。举例来说，在缺少ADAM6功能的基因修饰雄性大鼠(例如内源免疫球蛋白重链可变区被人免疫球蛋白重链可变区置换的大鼠，或大鼠免疫球蛋白重链区被敲除的大鼠)中，通过添加大鼠ADAM6，或在一些实施方案中，添加大鼠ADAM6的直系同源物(例如来自另一种大鼠品系或种，或在一个实施方案中，来自小鼠的ADAM6直系同源物)来挽救大鼠生育力的丧失。
因此，在各实施方案中，因为编码ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物)的核酸序列或与所述核酸序列可操作地连接的调控区受到修饰而不展现生育力或展现出生育力下降的基因修饰动物包含补偿或恢复生育力丧失的核酸序列，其中所述补偿或恢复生育力丧失的核酸序列来自于相同种的不同品系或来自于种系发生学上相关的种。在各实施方案中，所述补偿性核酸序列是ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段。在各实施方案中，所述补偿性ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段来自于与具有生育力缺陷的基因修饰动物紧密相关的非人动物。举例来说，当基因修饰动物是特定品系的小鼠时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段可以从另一种品系的小鼠或相关种的小鼠获得。在一个实施方案中，当包含生育力缺陷的基因修饰动物属于啮齿目时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段来自于另一啮齿目动物。在一个实施方案中，包含生育力缺陷的基因修饰动物属于鼠形亚目(例如跳鼠(jerboas)、林跳鼠(jumping mice)、丽仓鼠(mouse-like hamsters)、仓鼠(hamsters)、新世界鼠(New World rats and mice)、田鼠(voles)、真鼠(true mice andrats)、沙鼠(gerbils)、刺毛鼠(spiny mice)、冠鼠(crested rats)、攀鼠(climbingmice)、岩攀鼠(rock mice)、白尾鼠(white-tailed rats)、马岛鼠(malagasy rats andmice)、刺山鼠(spiny dormice)、鼹鼠(mole rats)、竹鼠(bamboo rats)、鼢鼠(zokors))，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段选自啮齿目或鼠形亚目的动物。
在一个实施方案中，所述基因修饰动物来自于跳鼠(Dipodoidea)总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段来自于鼠(Muroidea)总科。在一个实施方案中，所述基因修饰动物来自于鼠总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段来自于跳鼠总科。
在一个实施方案中，所述基因修饰动物是啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自鼠总科，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于鼠总科内的不同种。在一个实施方案中，所述基因修饰动物来自于选自以下各科的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如丽仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩攀鼠、白尾鼠、马岛鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如刺山鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)；并且所述ADAM6直系同源物或同源物选自相同科内的不同种。在一个具体实施方案中，所述基因修饰啮齿动物选自真鼠(鼠科)，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于选自沙鼠、刺毛鼠或冠鼠的种。在一个实施方案中，基因修饰小鼠是来自于鼠科的成员，并且ADAM6直系同源物或同源物是来自于鼠科的不同的种。在一个具体实施方案中，所述基因修饰啮齿动物是鼠科的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于鼠科的大鼠、沙鼠、刺毛鼠或冠鼠。
在各实施方案中，某一科的啮齿动物的一种或一种以上啮齿动物ADAM6直系同源物或其同源物或功能片段使缺少ADAM6直系同源物或同源物的同一科的基因修饰啮齿动物(例如仓鼠科(例如仓鼠、新世界鼠、田鼠)；鼠科(例如真鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠))恢复生育力。
在各实施方案中，通过确定ADAM6直系同源物、同源物或片段是否使缺少ADAM6活性的基因修饰雄性非人动物恢复生育力来评估所述直系同源物、同源物和片段的功能性。在各实施方案中，功能性被定义为缺少内源ADAM6或其直系同源物或同源物的基因修饰动物的精子通过输卵管并使同一个种的基因修饰动物的卵子受精的能力。
在各个方面，可以产生包含内源重链可变区基因座或其部分的缺失或置换的小鼠，其含有编码赋予与小鼠ADAM6类似的生育力好处的蛋白质(例如在雄性小鼠中发挥功能的其直系同源物或同源物或片段)。异位核苷酸序列可以包括以下核苷酸序列，其编码作为不同小鼠品系或不同种(例如不同啮齿动物种)的ADAM6同源物或直系同源物(或其片段)的蛋白质，并赋予生育力好处，例如在规定时期内的窝数的增加，和/或每窝幼崽数的增加，和/或雄性小鼠的精细胞通过小鼠输卵管使小鼠卵子受精的能力。
在一个实施方案中，所述ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白有至少89％到99％同一性(例如与小鼠ADAM6a或小鼠ADAM6b有至少89％到99％同一性)的同源物或直系同源物。在一个实施方案中，所述异位核苷酸序列编码一种或一种以下蛋白质，所述蛋白质独立选自与小鼠ADAM6a有至少89％同一性的蛋白质、与小鼠ADAM6b有至少89％同一性的蛋白质和其组合。在一个实施方案中，所述同源物或直系同源物是与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有约89％或以上同一性或者被修饰成与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有约89％或以上同一性的大鼠、仓鼠、小鼠或豚鼠蛋白质。在一个实施方案中，所述同源物或直系同源物与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
人源化重链小鼠中的异位ADAM6
在基因靶向方面的发展(例如细菌人工染色体(BAC)的发展)现在使得能够实现相对较大基因组片段的重组。BAC工程改造已经实现了在小鼠ES细胞中形成较大缺失和较大插入的能力。
形成人抗体的小鼠已经获得了一段时间。虽然这些小鼠代表了人治疗抗体开发上的重要进步，但是这些小鼠显示了限制其实用性的许多显著异常。举例来说，其显示受损的B细胞发育。该受损的发育可能是因为转基因小鼠与野生型小鼠之间的多种差异。
人抗体可能不会与小鼠细胞表面上的小鼠前B细胞或B细胞受体进行最佳的相互作用，所述受体在克隆选择期间为成熟、增殖或存活提供信号。完全人抗体可能不会与小鼠Fc受体系统进行最佳的相互作用；小鼠表达的Fc受体不显示与人Fc受体的一一对应关系。最后，形成完全人抗体的各种小鼠不包含可能是野生型B细胞发育所必需的所有真小鼠序列，例如下游增强子元件和其它基因座控制元件。
形成完全人抗体的小鼠一般包含以某种方式失能内源免疫球蛋白基因座，并且包含可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人转基因被引入小鼠基因组的随机位置中。只要内源基因座经过充分失能从而无法重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，那么就可以实现在这类小鼠中形成完全人抗体的目标，虽然B细胞发育受损。
虽然不得不从人转基因座位形成完全人抗体，但是在小鼠中产生人抗体显然是一种不利的方法。在一些小鼠中，这种方法是如此地不利，以至于会通过反式转换(trans-switching)机制形成嵌合型人可变/小鼠恒定重链(而不是轻链)。通过这种机制，编码完全人抗体的转录物会经历同种型反式转换，从人同种型转换为小鼠同种型。这个过程是反式的，因为完全人转基因的位置远离保留小鼠重链恒定区基因的未被破坏拷贝的内源基因座。虽然在所述小鼠中反式转换容易是显而易见的，但是这个现象仍然不足以挽救B细胞发育，B细胞发育仍然是明显受损的。在任何情况下，在所述小鼠中形成的反式转换抗体都保留完全人轻链，因为轻链显然不会发生反式转换现象；据推测，反式转换依赖于正常同种型顺式转换中使用的内源基因座(虽然不同)中的转换序列。因此，即使当经过工程改造以形成完全人抗体的小鼠选择反式转换机制形成具有小鼠恒定区的抗体时，这种策略仍然不足以挽救正常B细胞发育。
形成基于抗体的人治疗剂中的主要问题在于形成足够大多样化的人免疫球蛋白可变区序列以鉴别可用的可变域，这些可变域特异性地识别特定表位并以期望亲和力(通常以高亲和力，但不总是)与其结合。在开发出
Figure BDA0000957660150000481
小鼠(本文所述)之前，并没有人指出，表达人可变区和小鼠恒定区的小鼠与从转基因形成人抗体的小鼠有任何显著的差别。然而，这个推测是不正确的。
在内源小鼠基因座处含有人免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确置换的
Figure BDA0000957660150000491
小鼠就B细胞发育来说显示与野生型小鼠令人意外并且显著的相似性。在一项令人意外并且令人震惊的研究中，
Figure BDA0000957660150000492
小鼠对于免疫作用显示了基本正常的野生型反应，其与野生型小鼠仅有一个显著不同，即响应于免疫作用而产生的可变区是完全人可变区。
小鼠在内源基因座处含有对应人免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链、Igκ)的种系可变区的精确大规模置换。总体上，约6兆碱基的小鼠基因座被约1.5兆碱基的人基因组序列置换。这种精确置换产生了具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠，所述杂合免疫球蛋白基因座形成具有人可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠VH-DH-JH和Vκ-Jκ区段的精确置换使杂合免疫球蛋白基因座处的侧接小鼠序列保持完整并发挥功能。小鼠的体液免疫系统像野生型小鼠一样发挥功能。B细胞发育没有在任何重大方面受到阻碍，并且在抗原攻击后在小鼠中产生多种多样的人可变区。
小鼠是可行的，因为重链和κ轻链的免疫球蛋白基因区段在人和小鼠中类似地重排，这并不是说它们的基因座相同甚或几乎相同——显然它们不相同。然而，这些基因座足够类似，导致重链可变基因座位的人源化可以通过用约1百万碱基的连续人基因组序列置换约3百万碱基对的连续小鼠序列来实现，所述连续小鼠序列含有所有的VH、DH和JH基因区段，所述连续人基因组序列基本覆盖来自于人免疫球蛋白基因座的同等序列。
在一些实施方案中，用人基因序列进一步置换某些小鼠恒定区基因序列(例如用人CH1序列置换小鼠CH1序列，和用人CL序列置换小鼠CL序列)产生了具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠产生具有人可变区和部分人恒定区的抗体，所述人可变区和部分人恒定区适合于(例如)产生完全人抗体片段，例如完全人Fab。具有杂合免疫球蛋白基因座的小鼠展现出正常的可变基因区段重排、正常的体细胞超突变频率和正常的种型转换。这些小鼠展现出与野生型小鼠无法区别的体液免疫系统，并显示在B细胞发育所有阶段的正常细胞群体和正常淋巴样器官结构——甚至在所述小鼠缺少人可变区基因区段的完全谱系的情况下。对这些小鼠进行免疫导致了稳固的体液应答，其显示多种多样的可变基因区段使用。
对小鼠种系可变区基因区段的精确置换允许形成具有部分人免疫球蛋白基因座的小鼠。因为所述部分人免疫球蛋白基因座正常地发生重排、超突变和种型转换，所以所述部分人免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包含人可变区的抗体。可以鉴别和克隆编码可变区的核苷酸序列，然后使其与任何所选序列(例如适合于特定用途的任何免疫球蛋白同种型)融合(例如在体外系统中)，从而产生完全来源于人序列的抗体或抗原结合蛋白。
使用通过重组工程方法进行的大规模人源化来修饰小鼠胚胎干(ES)细胞，以用具有最高达1兆碱基的人基因组序列的相应人基因区段精确置换最高达3兆碱基的小鼠重链免疫球蛋白基因座，所述小鼠重链免疫球蛋白基因座包含基本上所有的小鼠VH、DH和JH基因区段，所述人基因组序列含有一些或基本上所有的人VH、DH和JH基因区段。使用最高达0.5兆碱基的人基因组区段置换3兆碱基的包含基本上所有小鼠Vκ和Jκ基因区段的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座区段，所述人基因组区段包含编码基本上所有人Vκ和Jκ基因区段的两个重复单元中的一个重复单元。
具有所述被置换的免疫球蛋白基因座的小鼠可以包含内源小鼠ADAM6基因座的破坏或缺失，所述破坏或缺失通常存在于小鼠免疫球蛋白重链基因座处的3’端VH基因区段与5’端DH基因区段之间。这个区域中的破坏可以降低或消除内源小鼠ADAM6基因座的功能性。如果在置换中使用人重链谱系的3’端VH基因区段，那么在这些VH基因区段之间(即在人VH1-2与VH1-6之间)存在的基因间区域含有似乎是人ADAM6假基因的假基因。然而，包含这个人基因间序列的雄性小鼠展现出生育力的下降。
描述的小鼠包含如上所述被置换的基因座，而且还包含编码小鼠ADAM6的异位核酸序列，其中所述小鼠展现出基本上正常的生育力。在一个实施方案中，所述异位核酸序列包含小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b序列或其功能片段，其被放置在被修饰的内源重链基因座处的人VH1-2与人VH6-1之间。在一个实施方案中，所述异位核酸序列是SEQ ID NO:3，其被放置在被修饰的内源重链基因座处的人VH1-2与人VH6-1之间。SEQ ID NO:3的ADAM6基因的转录方向与周围人VH基因区段的转录方向是相反的。虽然本文中的实例给出通过在指定人VH基因区段之间放置异位序列来挽救生育力，但是技术人员将认识到，异位序列在小鼠基因组中的任何合适的转录允许基因座处(甚或染色体外)的放置将被预期会以相似的方式挽救雄性小鼠的生育力。
用包含小鼠ADAM6基因或其直系同源物或同源物或功能片段的异位序列对缺少功能性ADAM6基因座的小鼠进行补偿的现象是可应用来挽救具有非功能性或最小功能性的内源ADAM6基因座的任何小鼠的一种通用方法。因此，可以用本发明的组合物和方法挽救包含免疫球蛋白重链基因座的ADAM6破坏性修饰的很多种小鼠。因此，本发明包括具有多种免疫球蛋白重链基因座修饰的小鼠，这些修饰损害了内源ADAM6功能。本说明书中提供了一些(非限制性)实例。除了描述的
Figure BDA0000957660150000511
小鼠以外，与ADAM6相关的组合物和方法也可以用在很多应用中，例如在以多种方式修饰重链基因座时。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人VH基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、人DH和人JH基因区段对所有或基本上所有小鼠DH基因区段和JH基因区段的置换；其中所述小鼠缺少CH1和/或铰链区。在一个实施方案中，所述小鼠产生单可变区结合蛋白，其是免疫球蛋白链的二聚体，选自：(a)人VH-小鼠CH1-小鼠CH2-小鼠CH3；(b)人VH-小鼠铰链-小鼠CH2-小鼠CH3；和(c)人VH-小鼠CH2-小鼠CH3。
在一个方面，所述挽救生育力的核苷酸序列被放置在一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH、mDH和/或mJH)被一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段(hVH、hDH和/或hJH)置换的小鼠中的人免疫球蛋白重链可变区序列内(例如在人VH1-2与VH1-6基因区段之间)，并且所述小鼠进一步包含一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ和/或hJκ)对一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVκ和/或mJκ)的置换。
在一个实施方案中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包含约3兆碱基的小鼠免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方案中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段包含小鼠免疫球蛋白重链基因座的至少89个VH基因区段、至少13个DH基因区段、至少4个JH基因区段或其组合。在一个实施方案中，所述一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段包含约1兆碱基的人免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方案中，所述一个或多个人免疫球蛋白重链可变基因区段包含人免疫球蛋白重链基因座的至少80个VH基因区段、至少27个DH基因区段、至少6个JH基因区段或其组合。
在一个实施方案中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含约3兆碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方案中，所述一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的至少137个Vκ基因区段、至少5个Jκ基因区段或其组合。在一个实施方案中，所述一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含约0.5兆碱基的人免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个具体实施方案中，所述一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人免疫球蛋白κ轻链基因座的近端重复单元(就免疫球蛋白κ恒定区来说)。在一个实施方案中，所述一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人免疫球蛋白κ轻链基因座的至少40个Vκ基因区段、至少5个Jκ基因区段或其组合。
在一个实施方案中，所述核苷酸序列被放置在两个人免疫球蛋白基因区段之间。在一个具体实施方案中，所述两个人免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个实施方案中，所述核苷酸序列被放置在
Figure BDA0000957660150000521
小鼠的人VH1-2基因区段与人VH1-6基因区段之间(US 6,596,541和US 7,105,348，其以引用的方式并入本文)。在一个实施方案中，如此修饰的
Figure BDA0000957660150000522
小鼠包含至少80个人VH基因区段、27个人DH基因区段和6个人JH基因区段对小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段的置换，和至少40个人Vκ基因区段和5个人Jκ基因区段对小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段的置换。
在一个方面，在置换内源小鼠VH基因区段的人VH基因区段中间存在功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同源物或功能片段)。在一个实施方案中，去除了至少89个小鼠VH基因区段并用一个或多个人VH基因区段置换，并且所述小鼠ADAM6基因座紧邻人VH基因区段的3’端存在，或存在于两个人VH基因区段之间。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6基因座存在于被插入的人VH基因区段的3’末端的约20千碱基(kb)到约40千碱基(kb)内的两个VH基因区段之间。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6基因座存在于被插入的人VH基因区段的3’末端的约29kb到约31kb内的两个VH基因区段之间。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6基因座存在于被插入的人VH基因区段的3’末端的约30kb内。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6基因座存在于被插入的人VH基因区段的3’末端的约30,184bp内。在一个具体实施方案中，所述置换包括人VH基因区段VH1-2和VH6-1，并且所述小鼠ADAM6基因座存在于所述VH1-2基因区段的下游和所述VH6-1基因区段的上游。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6基因座存在于人VH1-2基因区段与人VH6-1基因区段之间，其中所述小鼠ADAM6基因座的5’端距离所述人VH1-2基因区段的3’末端约13,848bp，并且所述ADAM6基因座的3’端距离所述人VH6-1基因区段的5’端约29,737bp。在一个具体实施方案中，所述小鼠ADAM6基因座包含在小鼠细胞内赋予ADAM6功能的SEQ ID NO:3或其片段。在一个具体实施方案中，然后发生人VH基因区段的重排(就人VH基因区段的转录方向来说从上游到下游)：人VH1-2-小鼠ADAM6基因座-人VH6-1。在一个具体实施方案中，用所述小鼠ADAM6基因座置换人VH1-2与人VH6-1之间的ADAM6假基因。在一个实施方案中，就转录方向来说，所述小鼠ADAM6基因座的小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b中的一个或多个的方向与人VH基因区段的方向相反。或者，所述小鼠ADAM6基因座存在于3’端人VH基因区段与5’端DH基因区段之间的基因间区域中。无论5’端DH区段是小鼠的还是人的，情况都是如此。
类似地，可以对被置换所有或基本上所有内源小鼠VH基因区段的一个或多个人VL基因区段(例如Vκ或Vλ区段)修饰的小鼠进行修饰，目的是维持内源小鼠ADAM6基因座(如上所述)，例如通过使用具有包含小鼠ADAM6基因座或其功能片段的下游同源臂的靶向载体；或者目的是用被放置在两个人VL基因区段之间或者所述人VL基因区段与DH基因区段(无论人还是小鼠，例如Vλ+m/hDH)或J基因区段(无论人还是小鼠，例如Vκ+JH)之间的异位序列置换受损的小鼠ADAM6基因座。在一个实施方案中，所述置换包括两个或两个以上人VL基因区段，并且所述小鼠ADAM6基因座或其功能片段存在于所述两个3’端VL基因区段之间。在一个具体实施方案中，然后发生人VL基因区段的重排(就人基因区段的转录方向来说从上游到下游)：人VL3’-1-小鼠ADAM6基因座-人VL3’。在一个实施方案中，就转录方向来说，所述小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的方向与人VL基因区段的方向相反。或者，所述小鼠ADAM6基因座存在于3’端人VL基因区段与5’端DH基因区段之间的基因间区域中。无论5’端DH区段是小鼠的还是人的，情况都是如此。
在一个方面，提供了一种具有一个或多个内源小鼠VH基因区段的置换并包含至少一个内源小鼠DH基因区段的小鼠。在这类小鼠中，所述内源小鼠VH基因区段的修饰可以包含对一个或多个3’端VH基因区段但不是5’端DH基因区段的修饰，其中应当小心以使得所述一个或多个3’端VH基因区段的修饰不会破坏内源小鼠ADAM6基因座或使内源小鼠ADAM6基因座不具有功能。举例来说，在一个实施方案中，所述小鼠包含一个或多个人VH基因区段对所有或基本上所有内源小鼠VH基因区段的置换，并且所述小鼠包含一个或多个内源DH基因区段和功能性内源小鼠ADAM6基因座。
在另一个实施方案中，所述小鼠包含内源小鼠3’端VH基因区段的修饰和一个或多个内源小鼠DH基因区段的修饰，并且进行所述修饰以将所述内源小鼠ADAM6基因座的完整性维持到所述内源ADAM6基因座保持功能的程度。在一个实施例中，以两个步骤进行这种修饰：(1)利用具有上游同源臂和下游同源臂的靶向载体，用一个或多个人VH基因区段置换3’端内源小鼠VH基因区段，其中所述下游同源臂包含功能性小鼠ADAM6基因座的全部或一部分；(2)然后用具有包含小鼠ADAM6基因座的全部或功能部分的上游同源臂的靶向载体置换内源小鼠DH基因区段。
在各个方面，在修饰会破坏内源小鼠ADAM6的功能时，利用含有对小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能性同源物进行编码的异位序列的小鼠是有用的。当对小鼠免疫球蛋白基因座进行修饰时，尤其当修饰小鼠免疫球蛋白重链可变区和周围序列时，破坏内源小鼠ADAM6功能的概率很高。因此，当产生免疫球蛋白重链基因座完全或部分缺失、被完全或部分人源化或被完全或部分置换(例如用Vκ或Vλ序列置换)的小鼠时，所述小鼠提供了特别的益处。针对以下描述的小鼠所描述的进行基因修饰的方法对于所属领域技术人员是已知的。
含有下述的异位序列的小鼠在与对小鼠免疫球蛋白重链可变基因座位所作的破坏内源小鼠ADAM6序列或使之缺失的修饰结合时特别有用，所述异位序列编码小鼠ADAM6蛋白或赋予小鼠ADAM6蛋白的生育力益处的基本相同或类似的蛋白质。虽然主要结合表达具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的小鼠进行了描述，但是所述小鼠也可与破坏内源小鼠ADAM6基因的任何基因修饰结合使用。技术人员将认识到这涵盖含有小鼠免疫球蛋白重链可变基因座位的修饰的多种基因修饰小鼠。例如，这些小鼠包括全部或一部分小鼠免疫球蛋白重链基因区段缺失或被置换的小鼠，而不管其它修饰如何。以下描述非限制性实例。
在一些方面，提供了下述的基因修饰小鼠，其包含在小鼠中发挥功能的异位小鼠、啮齿动物或其它ADAM6基因(或直系同源物或同源物或片段)，和一个或多个人免疫球蛋白可变区和/或恒定区基因区段。在各实施方案中，在小鼠中发挥功能的其它ADAM6基因直系同源物或同源物或片段可以包括来自于牛、犬、灵长类动物、兔或其它非人序列的序列。
在一个方面，提供了一种下述的小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、一个或多个人VH基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、一个或多个人DH基因区段对所有或基本上所有小鼠DH基因区段的置换、和一个或多个人JH基因区段对所有或基本上所有小鼠JH基因区段的置换。
在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人CH1核苷酸序列对小鼠CH1核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人铰链核苷酸序列对小鼠铰链核苷酸序列的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人免疫球蛋白轻链可变基因座对免疫球蛋白轻链可变基因座(VL和JL)的置换。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含人免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列对小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列的置换。在一个具体实施方案中，所述VL、JL和CL是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含与人铰链和人CH1序列融合的小鼠CH2和小鼠CH3免疫球蛋白恒定区序列，使得所述小鼠免疫球蛋白基因座重排形成编码结合蛋白的基因，所述结合蛋白包含(a)具有人可变区、人CH1区、人铰链区以及小鼠CH2和小鼠CH3区的重链，和(b)编码包含人可变域和人恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列、一个或多个人VL基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换，和任选的一个或多个人DH基因区段和/或人JH基因区段对所有或基本上所有DH基因区段和/或JH基因区段的置换，或任选的一个或多个人JL基因区段对所有或基本上所有DH基因区段和/或JH基因区段的置换。
在一个实施方案中，所述小鼠包含一个或多个VL、一个或多个DH和一个或多个J基因区段(例如Jκ或Jλ)对所有或基本上所有小鼠VH、DH和JH基因区段的置换，其中所述基因区段可操作地连接到内源小鼠铰链区上，其中所述小鼠形成重排的免疫球蛋白链基因，其在转录方向上从5’到3’含有人VL-人或小鼠DH-人或小鼠J-小鼠铰链-小鼠CH2-小鼠CH3。在一个实施方案中，所述J区是人Jκ区。在一个实施方案中，所述J区是人JH区。在一个实施方案中，所述J区是人Jλ区。在一个实施方案中，所述人VL区选自人Vλ区和人Vκ区。
在具体实施方案中，所述小鼠表达具有小鼠或人恒定区和来源于以下的可变区的单可变域抗体：人Vκ、人DH和人Jκ；人Vκ、人DH和人JH；人Vλ、人DH和人Jλ；人Vλ、人DH和人JH；人Vκ、人DH和人Jλ；人Vλ、人DH和人Jκ。在具体实施方案中，对重组识别序列进行修饰以允许在所叙述的V、D和J基因区段之间或在所叙述的V和J基因区段之间发生大量重排。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人VL基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、人JL基因区段对所有或基本上所有小鼠DH基因区段和JH基因区段的置换；其中所述小鼠缺少CH1和/或铰链区。
在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码CH1结构域的序列。在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码铰链区的序列。在一个实施方案中，所述小鼠缺少编码CH1结构域和铰链区的序列。
在一个具体实施方案中，所述小鼠表达的结合蛋白包含融合到小鼠CH2结构域上的人免疫球蛋白轻链可变域(λ或κ)，所述小鼠CH2结构域连接到小鼠CH3结构域上。
在一个方面，提供了下述的一种小鼠，其包含编码功能性ADAM6蛋白(或其直系同源物或同源物或功能片段)的异位ADAM6序列、一个或多个人VL基因区段对所有或基本上所有小鼠VH基因区段的置换、人JL基因区段对所有或基本上所有小鼠DH和JH基因区段的置换。
在一个实施方案中，所述小鼠包含编码CH1区、铰链区、CH1和铰链区、或者CH1区和铰链区和CH2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的缺失。
在一个实施方案中，所述小鼠产生单可变域结合蛋白，其包含选自以下的同型二聚体：(a)人VL-小鼠CH1-小鼠CH2-小鼠CH3；(b)人VL-小鼠铰链-小鼠CH2-小鼠CH3；(c)人VL-小鼠CH2-小鼠CH3。
在一个方面，提供了一种具有失能内源重链免疫球蛋白基因座的小鼠，所述失能内源重链免疫球蛋白基因座包括失能或缺失的内源小鼠ADAM6基因座，其中所述小鼠包含表达人或小鼠或人/小鼠或其它嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸序列存在于随机整合入小鼠基因组中的整合转基因。在一个实施方案中，所述核酸序列位于不存在于野生型小鼠中的附加体(例如染色体)上。
在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含失能内源免疫球蛋白轻链基因座。在一个具体实施方案中，所述内源免疫球蛋白轻链基因座选自κ和λ轻链基因座。在一个具体实施方案中，所述小鼠包含失能内源κ轻链基因座和失能λ轻链基因座，其中所述小鼠表达包含人免疫球蛋白重链可变域和人免疫球蛋白轻链域的抗体。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链域选自人κ轻链域和人λ轻链域。
在一个方面，提供了下述的一种基因修饰动物，其表达嵌合抗体并表达在基因修饰动物中发挥功能的ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，所述基因修饰动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方案中，所述基因修饰动物是小鼠，并且所述ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物是来自于与所述基因修饰动物不同品系的小鼠品系。在一个实施方案中，所述基因修饰动物是仓鼠科啮齿动物(例如仓鼠、新世界鼠、田鼠)，并且所述ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自于鼠科啮齿动物(例如真鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)。在一个实施方案中，所述基因修饰动物是鼠科啮齿动物，并且所述ADAM6蛋白直系同源物或同源物来自于仓鼠科啮齿动物。
在一个实施方案中，所述嵌合抗体包含人可变域和啮齿动物的恒定区序列。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自仓鼠科啮齿动物和鼠科啮齿动物，在一个具体实施方案中，所述仓鼠科和鼠科啮齿动物是小鼠。在一个具体实施方案中，所述仓鼠科和鼠科啮齿动物是大鼠。在一个实施方案中，所述嵌合抗体包含人可变域和来自于选自小鼠或大鼠的动物的恒定域；在一个具体实施方案中，所述小鼠或大鼠选自仓鼠科和鼠科。在一个实施方案中，所述嵌合抗体包含人重链可变域、人轻链可变域和来源于选自小鼠和大鼠的啮齿动物的恒定区序列，其中所述人重链可变域和所述人轻链是同源的。在一个具体实施方案中，同源包括所述人重链和人轻链可变域来自于同时表达人轻链可变域和人重链可变域、并在各B细胞的表面上同时呈递所述可变区的的单一B细胞。
在一个实施方案中，所述嵌合抗体从免疫球蛋白基因座表达。在一个实施方案中，所述嵌合抗体的重链可变域从重排的内源免疫球蛋白重链基因座表达。在一个实施方案中，所述嵌合抗体的轻链可变域是从重排的内源免疫球蛋白轻链基因座表达。在一个实施方案中，所述嵌合抗体的重链可变域和/或所述嵌合抗体的轻链可变域从重排的转基因(例如重排的核酸序列，其来源于在非内源免疫球蛋白基因座的基因座处整合入动物基因组中的非重排的核酸序列)表达。在一个实施方案中，所述嵌合抗体的轻链可变域从重排的转基因(例如重排的核酸序列，其来源于在非内源免疫球蛋白基因座的基因座处整合入动物基因组中的非重排的核酸序列)表达。
在一个具体实施方案中，所述转基因从转录活性基因座(例如ROSA26基因座，例如鼠类(例如小鼠)ROSA26基因座)表达。
在一个方面，提供了下述的一种非人动物，其包含人源化的免疫球蛋白重链基因座，其中所述人源化的免疫球蛋白重链基因座包含非人ADAM6序列或其直系同源物或同源物。
在一个实施方案中，所述非人动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物。
在一个实施方案中，所述非人ADAM6直系同源物或同源物是与小鼠ADAM6序列直系同源和/或同源的序列，其中所述直系同源物或同源物在所述非人动物中发挥功能。
在一个实施方案中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于选自小鼠、大鼠和仓鼠的非人动物。在一个具体实施方案中，所述非人动物是小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于选自不同小鼠种、大鼠和仓鼠的动物。在具体实施方案中，所述非人动物是大鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于选自不同大鼠种、小鼠和仓鼠的啮齿动物。在一个具体实施方案中，所述非人动物是仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自于选自不同仓鼠种、小鼠和大鼠的啮齿动物。
在一个具体实施方案中，所述非人动物来自于鼠形亚目，并且所述ADAM6序列来自于选自跳鼠总科啮齿动物和鼠总科啮齿动物的动物。在一个具体实施方案中，所述啮齿动物是鼠总科的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物是来自于鼠总科的小鼠或大鼠或仓鼠。
在一个实施方案中，所述人源化重链基因座包含一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。在一个具体实施方案中，所述一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段可操作地连接到一个或多个人、嵌合和/或啮齿动物(例如小鼠或大鼠)恒定区基因上。在一个实施方案中，所述恒定区基因是小鼠的。在一个实施方案中，所述恒定区基因是大鼠的。在一个实施方案中，所述恒定区基因是仓鼠的。在一个实施方案中，所述恒定区基因包含选自铰链、CH2、CH3和其组合的序列。在具体实施方案中，所述恒定区基因包含铰链、CH2和CH3序列。
在一个实施方案中，所述非人ADAM6序列和人免疫球蛋白重链序列邻接。在一个实施方案中，所述非人ADAM6序列被放置在人免疫球蛋白重链序列内。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白重链序列包含V、D和/或J基因区段。
在一个实施方案中，所述非人ADAM6序列被放置在两个V基因区段之间。在一个实施方案中，所述非人ADAM6序列被并置在V基因区段与D基因区段之间。在一个实施方案中，所述小鼠ADAM6序列被放置在V基因区段与J基因区段之间。在一个实施方案中，所述小鼠ADAM6序列被并置在D基因区段与J基因区段之间。
在一个方面，提供了一种基因修饰非人动物，其包含表达与来自于免疫球蛋白基因座的人VL结构域同源的人VH结构域的B细胞，其中所述非人动物从所述免疫球蛋白基因座表达非免疫球蛋白的非人蛋白。在一个实施方案中，所述非免疫球蛋白的非人蛋白是ADAM蛋白。在一个具体实施方案中，所述ADAM蛋白是ADAM6蛋白或其同源物或直系同源物或功能片段。
在一个实施方案中，所述非人动物是啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在一个实施方案中，所述啮齿动物属于鼠科。在一个实施方案中，所述啮齿动物属于鼠亚科。在一个具体实施方案中，所述鼠亚科啮齿动物选自小鼠和大鼠。
在一个实施方案中，所述非免疫球蛋白的非人蛋白是啮齿动物蛋白。在一个实施方案中，所述啮齿动物属于鼠科。在一个实施方案中，所述啮齿动物属于鼠亚科。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方案中，所述人VH和VL结构域直接或通过连接子连接到免疫球蛋白恒定域序列上。在一个具体实施方案中，所述恒定域序列包含选自铰链、CH2、CH3和其组合的序列。在一个具体实施方案中，所述人VL结构域选自Vκ或Vλ结构域。
在一个方面，提供了一种基因修饰非人动物，其在其种系中包含人免疫球蛋白序列，其中雄性非人动物的精子的特征为体内迁移缺陷。在一个实施方案中，所述体内迁移缺陷包括雄性非人动物的精子不能从相同种的雌性非人动物的子宫迁移通过输卵管。在一个实施方案中，所述非人动物缺少编码ADAM6蛋白或其功能片段的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，所述ADAM6蛋白或其功能片段包括ADAM6a和/或ADAM6b蛋白或其功能片段。在一个实施方案中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个方面，提供了一种非人动物，其包含与编码ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或功能片段的非人序列邻接的人免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，所述非人动物是啮齿动物。在一个具体实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白序列是免疫球蛋白重链序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白序列包含一个或多个VH基因区段。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白序列包含一个或多个DH基因区段。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白序列包含一个或多个JH基因区段。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白序列包含一个或多个VH基因区段、一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白序列包含在天然人谱系中具有高频率的一个或多个VH基因区段。在一个具体实施方案中，所述一个或多个VH基因区段包括不超过2个VH基因区段、不超过3个VH基因区段、不超过4个VH基因区段、不超过5个VH基因区段、不超过6个VH基因区段、不超过7个VH基因区段、不超过8个VH基因区段、不超过9个VH基因区段、不超过10个VH基因区段、不超过11个VH基因区段、不超过12个VH基因区段、不超过13个VH基因区段、不超过14个VH基因区段、不超过15个VH基因区段、不超过16个VH基因区段、不超过17个VH基因区段、不超过18个VH基因区段、不超过19个VH基因区段、不超过20个VH基因区段、不超过21个VH基因区段、不超过22个VH基因区段或不超过23个VH基因区段。
在一个具体实施方案中，所述一个或多个VH基因区段包括5个VH基因区段。在一个具体实施方案中，所述一个或多个VH基因区段包括10个VH基因区段。在一个具体实施方案中，所述一个或多个VH基因区段包括15个VH基因区段。在一个具体实施方案中，所述一个或多个VH基因区段包括20个VH基因区段。
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH6-1、VH1-2、VH1-3,VH2-5，VH3-7，VH1-8，VHH3-9，VH3-11,VH3-13，VH3-15,VH3-16,VH1'-18,VH3-20,VH3-21,VH3-23,VH1-24,VH2-26，VH4-28.VH3-30,VH4-31,VH3-33.VH4-34,VH3-35,VH3-38VH4-39,VH3-43,VH1-45,VH1-46,VH3-48,VH3-49,VH5-51，VH3-53,VH1-58，VH4-59,VH4-61,VH3-64，VH3-66，VH1-69，VH2-70，VH3-72，VH3-73和VH3-74
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH1-2、VH1-8、VH1-18，VH1-46,VH1-69,VH3-7,VH3-9,VH3-11,VH3-13,VH3-15,VH3-21,VH3-23,VH3-30,VH3-33,VH3-43，VH3-48，VH4-31,VH4-34，VH4-39,VH4-59,VH5-51和VH6-1。。
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH1-46.VH1-69,VH3-7,VH3-11，VH3-15,VH3-21，VH3-23,VH3-30,VH3-33,VH3-48,VH4-34,VH4-39VH4-59和VH5-51
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH1-69、VH3-7，VH3-11，VH3-15，VH3-21，VH3-23，VH3-30，VH3-43，VH3-48，VH4-39，VH4-59和VH5-51
在各实施方案中，VH基因区段选自VH1-18、VH3-11、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH4-39和VH4-59。
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH3-21、VH3-23、VH3-30和VH4-39。
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH1-18、VH3-23和VH4-39。
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH3-21、VH3-23和VH3-30。
在各实施方案中，所述VH基因区段选自VH3-23、VH3-30和VH4-39。
在一个具体实施方案中，人免疫球蛋白序列包含至少18个VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白序列包含至少39个VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白序列包含至少80个VH基因区段、27个DH基因区段和6个JH基因区段。
在一个实施方案中，所述非人动物是小鼠，并且所述小鼠包含一个或多个人VH基因区段对内源小鼠VH基因区段的置换，其中所述人VH基因区段可操作地连接到小鼠CH区基因上，使得所述小鼠重排所述人VH基因区段并表达包含人VH结构域和小鼠CH的反转嵌合免疫球蛋白重链。在一个实施方案中，90-100％的非重排的小鼠VH基因区段被至少一个非重排的人VH基因区段置换。在一个具体实施方案中，所有或基本上所有的内源小鼠VH基因区段被至少一个非重排的人VH基因区段置换。在一个实施方案中，所述置换用至少19个、至少39个或至少80或81个非重排的人VH基因区段进行。在一个实施方案中，所述置换用至少12个功能性的非重排的人VH基因区段、至少25个功能性的非重排的人VH基因区段或至少43个功能性的非重排的人VH基因区段进行。在一个实施方案中，所述小鼠包含至少一个非重排的人DH区段和至少一个非重排的人JH区段对所有小鼠DH和JH区段的置换。在一个实施方案中，所述至少一个非重排的人DH区段选自1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13、7-27和其组合。在一个实施方案中，所述至少一个非重排的人JH区段选自1、2、3、4、5、6和其组合。在一个具体实施方案中，所述一个或多个人VH基因区段选自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1人VH基因区段和其组合。
在各实施方案中，所述人免疫球蛋白序列与所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠)的种系中的恒定区可操作地连接。在一个实施方案中，所述恒定区是人、嵌合人/小鼠或嵌合人/大鼠或嵌合人/仓鼠、小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。在一个实施方案中，所述恒定区是啮齿动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)恒定区。在一个具体实施方案中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。在各实施方案中，所述恒定区至少包含CH2结构域和CH3结构域。
在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白重链序列位于所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠或仓鼠)的种系中的免疫球蛋白重链基因座处。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白重链序列位于所述非人动物的种系中的非免疫球蛋白重链基因座处，其中所述非重链基因座是转录活性基因座。在一个具体实施方案中，所述非重链基因座是ROSA26基因座。
在各个方面，所述非人动物进一步在所述非人动物的种系中包含人免疫球蛋白轻链序列(例如一个或多个非重排的轻链V和J序列，或一个或多个重排的VJ序列)。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白轻链序列是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列包含一个或多个VL基因区段。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列包含一个或多个JL基因区段。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列包含一个或多个VL基因区段和一个或多个JL基因区段。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列包含至少16个Vκ基因区段和5个Jκ基因区段。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列包含至少30个Vκ基因区段和5个Jκ基因区段。在一个具体实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列包含至少40个Vκ基因区段和5个Jκ基因区段。在各实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列与所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠或仓鼠)的种系中的恒定区可操作地连接。在一个实施方案中，所述恒定区是人、嵌合人/啮齿动物、小鼠、大鼠或仓鼠恒定区。在一个具体实施方案中，所述恒定区是小鼠或大鼠恒定区。在一个具体实施方案中，所述恒定区是小鼠κ恒定(mCκ)区或大鼠κ恒定(rCκ)区。
在一个实施方案中，所述非人动物是小鼠，并且所述小鼠包含至少6个人Vκ基因区段和至少1个Jκ基因区段对所有或基本上所有Vκ和Jκ基因区段的置换。在一个实施方案中，所有或基本上所有Vκ和Jκ基因区段被至少16个人Vκ基因区段(人Vκ)和至少1个Jκ基因区段置换。在一个实施方案中，所有或基本上所有Vκ和Jκ基因区段被至少30个人Vκ基因区段和至少1个Jκ基因区段置换。在一个实施方案中，所有或基本上所有Vκ和Jκ基因区段被至少40个人Vκ基因区段和至少1个Jκ基因区段置换。在一个实施方案中，所述至少一个Jκ基因区段包括2、3、4或5个人Jκ基因区段。
在一个实施方案中，所述人Vκ基因区段包含Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5和Vκ1-6。在一个实施方案中，所述Vκ基因区段包含Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15和Vκ1-16。在一个实施方案中，所述人Vκ基因区段包含Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29和Vκ2-30。在一个实施方案中，所述人Vκ基因区段包含Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40。
在一个具体实施方案中，所述Vκ基因区段包含从Vκ4-1到Vκ2-40贯穿人免疫球蛋白κ轻链基因座的邻接人免疫球蛋白κ基因区段，并且所述Jκ基因区段包含从Jκ1到Jκ5贯穿人免疫球蛋白κ轻链基因座的邻接基因区段。
在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列位于所述非人动物的种系中的免疫球蛋白轻链基因座处。在一个具体实施方案中，所述非人动物的种系中的免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白轻链序列位于所述非人动物的种系中的具有转录活性的非免疫球蛋白轻链基因座处。在一个具体实施方案中，所述非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。
在一个方面，提供了一种制造人抗体的方法，其中所述人抗体包含来源于一个或多个可变区核酸序列在如本文所述的非人动物的细胞中编码的可变域一个或多个。
在一个方面，提供了一种医药组合物，其包含含有来源于从如本文所述的非人动物分离的一个或多个可变区核酸序列的抗体或抗体片段的多肽一个或多个。在一个实施方案中，所述多肽是抗体。在一个实施方案中，所述多肽是仅有重链的抗体。在一个实施方案中，所述多肽是单链可变片段(例如scFv)。
在一个方面，提供了如本文所述的非人动物用于产生抗体的用途。在各实施方案中，所述抗体包含一个或多个来源于从非人动物分离的一个或多个可变区核酸序列的一个或多个可变域。在一个具体实施方案中，所述可变区核酸序列包含免疫球蛋白重链基因区段。在一个具体实施方案中，所述可变区核酸序列包含免疫球蛋白轻链基因区段。
实施例
提供了以下实施例来描述如何制造和使用本发明的方法和组合物，并且不打算限制被发明人视为其发明的内容的范围。除非另外指出，否则温度以摄氏度表示，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例1
小鼠免疫球蛋白基因的人源化
使用人和小鼠细菌人工染色体(BAC)对13种不同的BAC靶向载体(BACvec)进行工程改造，以对小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座进行人源化。表1和表2分别给出了构建用于小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人源化的所有BACvec所执行的步骤的描述。
人和小鼠BAC的鉴别通过具有BAC文库的滤器的杂交或通过PCR筛选小鼠BAC文库DNA池，鉴别了跨越免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的5’和3’端的小鼠BAC。使用与目的区域相对应的探针，在标准条件下杂交滤器。通过PCR并使用侧接被靶向的目的区域的独特引物对筛选文库池。使用相同引物执行另外的PCR以对给定孔进行去卷积(deconvolute)，并分离对应的目的BAC。BAC滤器和文库池两者都是从129SvJ小鼠ES细胞(Incyte Genomics/Invitrogen)产生的。通过具有BAC文库(Caltech B、C或D文库和RPCI-11文库,ResearchGenetics/Invitrogen)的滤器的杂交，通过采用基于PCR的方法筛选人BAC文库池(Caltech文库,Invitrogen)，或通过使用BAC末端序列数据库(Caltech D文库,TIGR)，鉴别了覆盖全部免疫球蛋白重链和κ轻链基因座的人BAC。
通过细菌同源重组和连接来构建BACvec如所描述(Valenzuelaet al.,2003；Zhanget al.,1998,A new logic for DNAengineering using recombination inEscherichia coli,Nat Genet 20:123-128)的那样进行细菌同源重组(BHR)。在大多数情况下，通过将由PCR产生的同源盒与被克隆的表达盒连接，随后对连接产物进行凝胶分离并将其电穿孔入携带目标BAC的BHR感受态细菌中，从而产生线性片段。在适当的抗生素皮氏培养皿上进行选择之后，通过跨越两个新接合点之间的PCR，随后在脉冲场凝胶上进行限制酶分析(Schwartz和Cantor,1984,Separation of yeast chromosome-sized DNAs bypulsed field gradient gel electrophoresis,Cell 37:67-75)，并通过使用分布在人序列之间的引物的PCR抽查，从而鉴别正确重组的BAC。
使用3个连续BHR步骤构建了3hVH BACvec，用于免疫球蛋白重链基因座的人源化的初始步骤(图4A和表1)。在第一步(步骤1)中，将一个表达盒引入人亲本BAC中的人VH1-3基因区段上游，所述表达盒含有小鼠免疫球蛋白重链基因座的同源区域(HB1)、在细菌中赋予卡那霉素抗性并且在动物细胞中赋予G418抗性的基因(kanR)以及位点特异性重组位点(例如loxP)。在第二步(步骤2)中，将第二个表达盒引入到紧邻最后一个JH区段的下游，所述第二个表达盒含有小鼠免疫球蛋白重链基因座的第二同源区域(HB2)和在细菌中赋予大观霉素抗性的基因(specR)。所述第二步包括使JH6下游的人免疫球蛋白重链基因座序列和BAC载体氯霉素抗性基因(cmR)缺失。在第三步(步骤3)中，被双重修饰的人BAC(B1)然后使用已经在前两个步骤中添加的I-CeuI位点进行线性化，并且通过经由所述两个同源区域(HB1和HB2)的BHR整合入小鼠BAC(B2)中。第一(cm/kan)、第二(spec/kan)和第三(cm/kan)步中的药物选择被设计成对期望产物具有特异性。在用限制酶消化之后，通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析被修饰的BAC克隆，以确定适当构建(图4B)。
以类似方式，对12种另外的BACvec进行工程改造，用于重链和κ轻链基因座的人源化。在一些情况下，通过BHR以及对选择性标记物的仔细放置，将稀有的限制位点引入两个亲本BACvec中，藉此进行BAC连接以代替BHR，从而联合两个较大的BAC。这允许期望连接产物在用特异性药物标记物组合进行选择时可以存活。在用稀有限制酶消化之后通过连接所获得的重组BAC以与通过BHR所获得的方式(如上所述)类似的方式进行鉴别和筛选。
表1
Figure BDA0000957660150000661
Figure BDA0000957660150000671
Figure BDA0000957660150000681
表2
Figure BDA0000957660150000682
对胚胎干(ES)细胞的修饰和小鼠的产生.使用所描述(Valenzuelaet al.,2003)的
Figure BDA0000957660150000692
基因工程方法进行ES细胞(F1H4)靶向。如所述，通过胚泡(Valenzuelaet al.,2003)或8细胞注射(Poueymirouet al.,2007,F0 generation micefully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediatephenotypic analyses,Nat Biotechnol 25:91-99)从被修饰的ES细胞产生小鼠。通过在基于PCR的分析中利用多组独特的探针和引物筛选来自ES细胞或小鼠的DNA，从而确认被靶向的ES细胞和小鼠(例如图3A、3B和3C)。所有小鼠研究都经过Regeneron的实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC)监督和批准。
染色体组型分析和荧光原位杂交(FISH).通过卡瑞尔细胞库(Coriell CellRepositories)(Coriell Institute for Medical Research,Camden,NJ)进行染色体组型分析。如所描述(Valenzuelaet al.,2003)的那样对被靶向的ES细胞进行FISH。通过缺口平移(nick translation)(Invitrogen)，利用经过荧光标记的dUTP核苷酸光谱橙(spectrumorange)或光谱绿(spectrum green)(Vysis)标记对应于小鼠BAC DNA或人BAC DNA的探针。
免疫球蛋白重链可变基因座位.使用基因工程技术(参看例如美国专利第6,586,251号，和Valenzuelaet al.,2003)，通过用约1百万碱基对(Mb)的含有对应人基因区段的连续人基因组序列直接置换约3Mb的含有所有VH、DH和JH基因区段的连续小鼠基因组序列(图1A和表1)，以9个连续步骤实现重链基因座的可变区的人源化。
JH基因区段与恒定区基因之间的内含子(J-C内含子)含有转录增强子(Neuberger,1983,Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain genetransfected into lymphoid cells,EMBO J 2:1373-1378)，在所述转录增强子之后是同种型转换期间的重组所必需的简单重复单元的区域(Kataokaet al.,1980,Rearrangementof immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain classswitch,PNAS USA 77:919-923)。选择人VH-DH-JH区与小鼠CH区之间的接合点(近端接合点)以维持小鼠重链基因内增强子和转换结构域，从而保持人源化重链基因座在小鼠内的有效表达和种型转换。通过使用基因工程方法(上文)，这一结合点和随后的接合点在所有置换中的精确核苷酸位置都是可能实现的，其中所述基因工程方法使用由合成的寡核苷酸驱动的细菌同源重组。因此，近端接合点被放置在最后一个JH基因区段下游约200bp处，并且远端接合点被放置在人基因座的5’端的VH基因区段上游几百kb处，并在小鼠VH1-86基因区段(也称为J558.55)下游约9kb处。小鼠VH1-86(J558.55)基因区段是最远端的重链可变基因区段，据报道其是C57BL/6小鼠中的假基因，但在被靶向的129等位基因中可能有活性，虽然其具有不良的RSS序列。小鼠重链基因座的远端据报道可能含有调控基因座表达和/或重排的控制元件(Pawlitzkyet al.,2006)。
使用插入小鼠IgH基因座近端的含有3个VH、所有27个DH和9个JH人基因区段的144kb人重链基因座近端，并使用约75kb的小鼠同源臂，实现了人免疫球蛋白DNA序列在小鼠中的首次插入，与之相伴的是16.6kb的小鼠基因组序列缺失(图2A的步骤A；表1和3的3hVH)。这一144kb大插入和伴随的16.6kb缺失是在单个步骤(步骤A)中进行的，发生频率为0.2％(表3)。通过天然等位基因丧失(LONA)分析(Valenzuelaet al.,2003)，使用缺失小鼠序列以内和两边的探针以及在被插入的人序列以内的探针，对被正确靶向的ES细胞进行评分，并使用跨越整个插入的多个探针验证大的人插入物的完整性(图3A、3B和3C)。因为先要进行多轮的连续ES细胞靶向，所以要对这一步以及所有随后步骤的被靶向的ES细胞克隆进行染色体组型分析(上文)，并且只有在17/20展开染色体(spread)中显示正常染色体组型的克隆才被用于随后步骤。
利用BACvec对来自步骤A的被靶向ES细胞进行再靶向，这在重链基因座的远端产生了19kb的缺失(图2A的步骤B)。与步骤A的BACvec上含有新霉素抗性基因(neo)不同，步骤B的BACvec含有潮霉素抗性基因(hyg)。来自两种BACvec的抗性基因经过设计，使得在成功靶向到同一染色体时，大约3Mb的含有所有小鼠VH基因区段而非VH1-86和所有DH基因区段而非DQ52的小鼠重链可变基因座位以及所述两个抗性基因被loxP位点侧接；DQ52和所有的小鼠JH链基因区段在步骤A中缺失。通过驱使3hVH近端表达盒在高G418中获得纯合性(Mortensenet al.,1992,Production of homozygous mutant ES cells with a singletargeting construct,Mol Cell Biol 12:2391-2395)并遵从远端hyg表达盒的命运来鉴别同一染色体上被双重靶向的ES细胞克隆。已经通过CRE重组酶的瞬时表达，高效地(最高达约11％)、成功地使最长达4Mb、且已经通过被loxP位点侧接的方式修饰的小鼠区段缺失，即使在不存在药物选择的情况下也如此(Zhenget al.,2000,Engineering mousechromosomes with Cre-loxP:range,efficiency,and somatic applications,Mol CellBiol 20:648-655)。以类似方式，本发明人实现了在瞬时CRE表达之后在8％的ES细胞克隆中的3Mb缺失(图2A的步骤C；表3)。通过使用在缺失小鼠序列任一端的探针的LONA分析，以及neo和hyg的丧失和在含有唯一剩下的loxP位点的缺失点之间的PCR产物的出现，对所述缺失进行评分。此外，通过荧光原位杂交(数据未显示)证实了所述缺失。
使用
Figure BDA0000957660150000711
基因工程方法，以一系列的5个步骤(图2B的步骤E-H)，将剩余的人重链可变区添加到3hVH等位基因中，其中每个步骤涉及精确插入最高达210kb的人基因序列。对于每个步骤，设计每个新的BACvec的近端以部分重叠前一步的最远端人序列，并且每个新的BACvec的远端含有与步骤A中所用的相同的远端小鼠同源区域。步骤D、F和H的BACvec含有neo选择表达盒，而步骤E和G的BACvec则含有hyg选择表达盒，因此在G418与潮霉素之间交替进行选择。通过在3hVH杂合等位基因的远端loxP位点之间的独特PCR产物的丧失来分析步骤D中的靶向。通过前一选择表达盒的丧失来分析步骤E到I中的靶向。在最后一步(图2B的步骤I)中，通过瞬时FLPe表达(Buchholzet al.,1998,Improvedproperties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis,Nat Biotechnol16:657-662)去除了被Frt位点侧接的neo选择表达盒(McLeodet al.,1986,Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in theSaccharomyces cerevisiae plasmid 2microns circle,Mol Cell Biol 6:3357-3367)。步骤D、E和G中的BACvec的人序列是各自来源于两种亲本人BAC，而来自步骤F和H的BACvec的人序列则是来源于单一BAC。使用跨越被插入的人序列的多个探针在每个步骤中证实了人序列的保留(如上所述，例如图3A、3B和3C)。只有那些具有正常染色体组型和种系潜能的克隆才在每个步骤中被继续使用。来自最后一步的ES细胞仍然能够在9个连续操纵之后产生种系(表3)。就每个重链等位基因来说为纯合型的小鼠有活力，表现健康并且显示了基本上为野生型的体液免疫系统(参看实施例3)。
表3
免疫球蛋白κ轻链可变基因座位.通过以与重链所用方式类似的方式，用约0.5Mb的含有近端人Vκ和Jκ基因区段的人序列直接置换约3Mb的含有所有Vκ和Jκ基因区段的小鼠序列，以8个连续步骤对κ轻链可变区进行人源化(图1B；表2和4)。
人κ轻链基因座的可变区含有两个几乎相同的400kb重复单元，这两个重复单元被800kb间隔子隔开(Weichholdet al.,1993,The human immunoglobulin kappa locusconsists of two copies that are organized in opposite polarity,Genomics 16:503-511)。因为这些重复单元如此类似，所以几乎所有的基因座多样性都可以通过使用所述近端重复单元在小鼠中再现。此外，已经报道了缺少远端重复单元的κ轻链基因座的天然人等位基因(Schaibleet al.,1993,The immunoglobulin kappa locus:polymorphismand haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals,Hum Genet 91:261-267)。本发明人用约0.5Mb的人κ轻链可变基因序列置换了约3Mb的小鼠κ轻链可变基因序列，以用近端人Vκ和所有的人Jκ基因区段有效地置换所有的小鼠Vκ和Jκ基因区段(图2C和2D；表2和4)。与实施例1中对于重链基因座所述的方法相反，在添加任何人序列之前，以3步法使整个小鼠Vκ基因区域——其含有所有的Vκ和Jκ基因区段——缺失。首先，在可变区的近端引入neo表达盒(图2C的步骤A)。其次，在κ基因座的远端插入hyg表达盒(图2C的步骤B)。重组酶识别位点(例如loxP)依然位于每个选择表达盒内，使得CRE处理诱导剩余的3Mb小鼠Vκ区连同两个抗性基因一起缺失(图2C的步骤C)。
使用与重链所用方法(参看实施例1)类似的方法，以4个连续步骤插入大小为约480kb并且含有整个免疫球蛋白κ轻链可变区的人基因组片段(图2D；表2和4)，其中最高达150kb的人免疫球蛋白κ轻链序列是在单个步骤中插入的。通过瞬时FLPe表达去除最后的潮霉素抗性基因。如同重链一样，在每个步骤之后评估被靶向的ES细胞克隆中的整个人插入物的完整性、正常染色体组型和种系潜能。产生了就每个κ轻链等位基因来说为纯合型的小鼠，并且发现这些小鼠是健康的并表现正常。
表4
Figure BDA0000957660150000731
实施例2
通过多个人源化免疫球蛋白等位基因的组合来产生完全人源化的小鼠
在若干位置显微注射如实施例1所描述的携带一部分人免疫球蛋白重链或κ轻链可变谱系的ES细胞，并使所获得的小鼠交配繁殖以产生多种型式的
Figure BDA0000957660150000732
小鼠，这些小鼠具有比例逐渐增加的人种系免疫球蛋白谱系(表5；图5A和5B)。
Figure BDA0000957660150000733
1(V1)小鼠具有18个人VH基因区段和所有的人DH和JH基因区段，以及16个人Vκ基因区段和所有的人Jκ基因区段。
Figure BDA0000957660150000741
2(V2)和(V3)小鼠具有增加的可变谱系，分别具有总共39个VH和30个Vκ，以及80个VH和40个Vκ。因为编码小鼠VH、DH和JH基因区段以及Vκ和Jκ基因区段的基因组区域已经被完全置换，所以由所有型式的
Figure BDA0000957660150000743
小鼠产生的抗体均含有连接到小鼠恒定区上的人可变区。小鼠λ轻链基因座在
Figure BDA0000957660150000744
小鼠的各实施方案中保持完整，并且用作各
Figure BDA0000957660150000745
κ轻链基因座的表达效率的比较物。
从实施例1中所描述的一小组等位基因产生了就免疫球蛋白重链和κ轻链人源化来说为双重纯合型的小鼠。在产生双重纯合型小鼠的交配繁殖过程期间所观察到的所有基因型都以粗略的孟德尔比例存在。就每种人重链等位基因来说为纯合型的雄性后代展示了下降的生育力，这是由小鼠ADAM6活性的丧失所引起的。小鼠重链可变基因座位含有两个嵌入其中的功能性ADAM6基因(ADAM6a和ADAM6b)。在小鼠重链可变基因座位的人源化期间，被插入的人基因组序列含有ADAM6假基因。小鼠ADAM6可能是生育力所必需的，因此在人源化重链可变基因座位中缺少小鼠ADAM6基因可能会引起生育力下降，尽管存在有人假基因。实施例7-11描述将小鼠ADAM6基因再次工程改造入人源化重链可变基因座位中，并用人源化重链免疫球蛋白基因座使小鼠的生育力恢复到野生型水平。
表5
Figure BDA0000957660150000746
实施例3
具有人源化免疫球蛋白基因的小鼠中的淋巴细胞群体
通过流式细胞术评估了三种不同型式的
Figure BDA0000957660150000747
小鼠中的成熟B细胞群体。
简言之，使用标准方法获得来自于骨髓、脾和胸腺的细胞悬浮液。根据制造商的说明书，将细胞以5×105个细胞/毫升再悬浮于BD Pharmingen FACS染色缓冲液中，用抗小鼠CD16/32(BD Pharmingen)封闭，用适当的抗体混合液染色，并用BD CYTOFIXTM固定。将最后的细胞团再悬浮于0.5mL染色缓冲液中，并使用BD FACSCALIBURTM和BD CELLQUEST PROTM软件进行分析。所有抗体(BD Pharmingen)均是在物质稀释液/混合液中制备的并添加到0.5毫克/105个细胞的最终浓度。
用于骨髓染色的抗体混合液(A-D)如下所示：A：抗小鼠IgMb-FITC，抗小鼠IgMa-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；B：抗小鼠CD43(S7)-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；C：抗小鼠CD24(HSA)-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；D：抗小鼠BP-1-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC。
用于脾和腹股沟淋巴结染色的抗体混合液(E-H)如下所示：E：抗小鼠IgMb-FITC，抗小鼠IgMa-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；F：抗小鼠Ig，λ1,λ2,λ3轻链-FITC，抗小鼠Igκ轻链-PE，抗小鼠CD45R(B220)-APC；G：抗小鼠Ly6G/C-FITC，抗小鼠CD49b(DX5)-PE，抗小鼠CD11b-APC；H：抗小鼠CD4(L3T4)-FITC，抗小鼠CD45R(B220)-PE，抗小鼠CD8a-APC。结果展示在图6中。
针对标记物B220和IgM的表面表达，对从纯合型
Figure BDA0000957660150000751
小鼠的脾或淋巴结分离的淋巴细胞染色，并使用流式细胞术进行分析(图6)。在被测试的所有型式的
Figure BDA0000957660150000752
小鼠中，B220+IgM+成熟B细胞群体的规模与野生型小鼠中的情况几乎相同，而不管它们所含的VH基因区段的数目如何。此外，含有纯合型杂合子人源化的免疫球蛋白重链基因座、但小鼠免疫球蛋白κ轻链正常的小鼠——甚至是只具有3个VH基因区段的那些小鼠，或含有纯合型杂合子人源化的κ轻链基因座并且具有正常小鼠免疫球蛋白重链基因座的小鼠，在其外周隔室中也具有正常数目的B220+IgM+细胞(结果未给出)。这些结果表明，具有人可变基因区段和小鼠恒定区的嵌合基因座可以充分地存在于成熟B细胞室中。此外，在重链或κ轻链基因座处的可变基因区段的数目与产生野生型成熟B细胞群体的能力无关，因此抗体谱系的理论多样性也与所述能力无关。相反，具有随机整合的完全人免疫球蛋白转基因和失活的小鼠免疫球蛋白基因座的小鼠在这些隔室中具有减少的B细胞数目，其中所述缺陷的严重性依赖于转基因中所包含的可变基因区段的数目(Green andJakobovits,1998,Regulation of B cell development by variable gene complexityin mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes,J Exp Med 188:483-495)。这证明了“原位基因人源化”策略导致与在“敲除加转基因”方法中获得的随机整合的转基因根本不同的功能结果。
等位基因排除和基因座选择.在就不同型式的人源化免疫球蛋白重链基因座来说为杂合型的小鼠中检查维持等位基因排除的能力。
免疫球蛋白基因座的人源化在F1ES细胞系(F1H4,Valenzuelaet al.,2003)中进行，所述F1ES细胞系来源于129S6/SvEvTac和C57BL/6NTac杂合型胚胎。人重链种系可变基因序列被靶向到129S6等位基因上，所述129S6等位基因携带IgMa单倍型，而未经修饰的小鼠C576BL/6N等位基因则携带IgMb单倍型。这些IgM的等位基因形式可以通过流式细胞术，使用对存在于IgMa或IgMb等位基因中的多态性具有特异性的抗体进行区分。如图6(最后一行)所示，在就每种型式的人源化重链基因座来说为杂合型的小鼠中鉴别的B细胞只表达单一等位基因IgMa(人源化等位基因)或IgMb(野生型等位基因)。这证明了等位基因排除中所涉及的机制在
Figure BDA0000957660150000761
小鼠中是完整的。此外，人源化等位基因(IgMa)阳性的B细胞的相对数目与所存在的VH基因区段的数目大致成正比。在
Figure BDA0000957660150000762
1杂合小鼠中，大约30％的B细胞表达人源化免疫球蛋白基因座，其具有18个人VH基因区段，而在
Figure BDA0000957660150000763
2和3杂合小鼠中，50％的B细胞表达人源化免疫球蛋白基因座，其分别具有39个和80个人VH基因区段(未显示)。值得注意地，表达人源化小鼠等位基因的细胞与表达野生型小鼠等位基因的细胞的比率(在
Figure BDA0000957660150000764
1小鼠中为0.5，在
Figure BDA0000957660150000765
2小鼠中为0.9)大于人源化基因座中所含的可变基因区段的数目与野生型基因座中所含的可变基因区段的数目的比率(在
Figure BDA0000957660150000766
1小鼠中为0.2，在2小鼠中为0.4)。这可表明等位基因选择的概率介于对一条或另一条染色体的随机选择与对任何特定V区段RSS的随机选择中间。此外，可能有一部分、但不是全部的B细胞(其中一个等位基因变得可以重组)完成了这个过程并且在另一个等位基因变得可以重组之前关闭重组。此外，具有来源于杂合子人源化的重链基因座或野生型小鼠重链基因座的表面IgM(sIgM)的细胞的水平相当的分布证明了杂合基因座在正常水平下工作。相反，随机整合的人免疫球蛋白转基因竞争不过野生型小鼠免疫球蛋白基因座(Bruggemannet al.,1989,A repertoire of monoclonal antibodies with human heavychains from transgenic mice,PNAS 86:6709-6713；Greenet al.,1994；Tuaillonetal.,1993,Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination intransgenic mice:gene-segment use in mu and gamma transcripts,PNAS USA 90:3720-3724)。这进一步证明了由
Figure BDA0000957660150000771
小鼠产生的免疫球蛋白在功能上与在由“敲除加转基因”方法形成的小鼠中通过随机整合的转基因所产生的免疫球蛋白不同。
129S6或C57BL/6N中的Cκ区的多态性不能用于检查人源化κ轻链基因座对非人源化κ轻链基因座的等位基因排除。然而，
Figure BDA0000957660150000772
小鼠都具有野生型小鼠λ轻链基因座，因此，可以观察人源化κ轻链基因座的重排和表达是否能够阻止小鼠λ轻链的表达。与野生型小鼠相比，在
Figure BDA0000957660150000773
小鼠中，表达人源化κ轻链的细胞的数目相对于表达小鼠λ轻链的细胞的数目的比率相对没有改变，而不管在κ轻链基因座处插入的人Vκ基因区段的数目如何(图6，正数第三行)。此外，双阳性(κ加λ)细胞的数目没有增加，表明杂合κ轻链基因座处的大量重组导致小鼠λ轻链基因座的重组被适当抑制。相反，含有随机整合的κ轻链转基因并且具有失活的小鼠κ轻链基因座——但小鼠λ轻链基因座为野生型——的小鼠展现出显著增加的λ/κ比率(Jakobovits,1998)，暗示引入的κ轻链转基因在这样的小鼠中没有很好地发挥功能。这进一步证明，与由“敲除加转基因”小鼠所形成的免疫球蛋白相比，在由
Figure BDA0000957660150000774
小鼠所形成的免疫球蛋白中观察到了不同的功能结果。
B细胞发育.因为
Figure BDA0000957660150000775
小鼠中的成熟B细胞群体类似于野生型小鼠中的成熟B细胞群体(如上所述)，所以早期B细胞分化的缺陷可以通过成熟B细胞群体的扩增而被补偿。通过使用流式细胞术分析B细胞群体来检查B细胞分化的各个阶段。表6列出了
Figure BDA0000957660150000776
小鼠相比于野生型同窝幼崽中的每种B细胞谱系中的细胞分数的比率，所述细胞分数是使用特异性细胞表面标记物通过FACS确定的。
早期B细胞发育在骨髓中发生，并且B细胞分化的不同阶段的特征在于细胞表面标记物表达的类型和量的变化。表面表达的这些差异与细胞内部的免疫球蛋白基因座处发生的分子变化有关。原B细胞(pro-B cell)到前B细胞(pre-B cell)的转变需要功能性重链蛋白的成功重排和表达，而从前B阶段到成熟B阶段的转变是通过κ或λ轻链的正确重排和表达来控制的。因此，B细胞分化的各个阶段之间的无效转变可以通过指定阶段的相对B细胞群体的变化来检测。
表6
Figure BDA0000957660150000781
在任何
Figure BDA0000957660150000782
小鼠中都没有观察到B细胞分化的重大缺陷。在
Figure BDA0000957660150000783
小鼠中，人重链基因区段的引入似乎并不影响原B到前B的转变，并且人κ轻链基因区段的引入并不影响前B到B的转变。这证明了具有人可变区和小鼠恒定区的“反转嵌合”免疫球蛋白分子在B细胞信号传导和共受体分子的背景下正常发挥功能，从而在小鼠环境中引起适当的B细胞分化。相反，在含有随机整合的免疫球蛋白转基因和失活的内源重链或κ轻链基因座的小鼠中，在B细胞分化期间不同群体之间的平衡受到不同程度的干扰(Green and Jakobovits,1998)。
实施例4
人源化免疫球蛋白小鼠中的可变基因谱系
通过来自于多种来源(包括脾细胞和杂交瘤细胞)的人可变区的反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，分析了
Figure BDA0000957660150000784
小鼠的人源化抗体谱系中的人可变基因区段的使用情况。测定了可变区序列、基因区段的使用、体细胞超突变、以及重排的可变区基因区段的接合多样性。
简言之，使用TRIZOLTM(Invitrogen)或Qiagen RNEASYTM迷你试剂盒(Qiagen)从1×107–2×107个脾细胞或约104-105个杂交瘤细胞提取总RNA，并使用SUPERSCRIPTTMIII一步RT-PCR系统(Invitrogen)，用小鼠恒定区特异性引物引发。使用前述3’恒定区特异性引物，用2-5μL来自每种样品的RNA进行反应，所述3’恒定区特异性引物与重链和κ轻链两者的每个人可变区家族的汇集的前导引物分别配对。试剂和引物的体积以及RT-PCR/PCR条件根据制造商的说明书进行。引物序列基于多种来源(Wang and Stollar,2000,Humanimmunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR,J ImmunolMethods 244:217-225；Ig-primer sets,Novagen)。适当时，用汇集的家族特异性框架引物和在初级反应中使用的相同小鼠3’免疫球蛋白恒定区特异性引物进行巢式二级PCR反应。通过琼脂糖电泳分析来自于每个反应系的等分试样(5μL)，并使用MONTAGETM凝胶提取试剂盒(Millipore)从琼脂糖纯化反应产物。使用TOPOTMTA克隆系统(Invitrogen)克隆被纯化的产物，并通过电穿孔将其转化入DH10β大肠杆菌细胞中。从每个转化反应系中选择单独的克隆，并使其在2mL存在抗生素选择的LB肉汤培养物中在37℃下生长过夜。通过基于试剂盒的方法(Qiagen)从细菌培养物纯化质粒DNA。
免疫球蛋白可变基因的使用.在ABI 3100基因分析仪(Applied Biosystems)上，用T7或M13反向引物对重链和κ轻链克隆两者的质粒DNA测序。将原始序列数据输入SEQUENCHERTM(v4.5,Gene Codes)。将每个序列组装成毗连序列群，并使用IMGT V-Quest(Brochetet al.,2008,IMGT/V-QUEST:the highly customized and integrated systemfor IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis,Nucleic Acids Res36:W503-508)搜索功能与人免疫球蛋白序列进行比对，以鉴别人VH、DH、JH和Vκ、Jκ区段的使用。将序列与种系序列相比较以分析体细胞超突变和重组接合。
通过RAG补偿法(Chenet al.,1993,RAG-2-deficient blastocystcomplementation:an assay of gene function in lymphocyte development,PNAS USA90:4528-4532)从含有初始重链修饰(3hVH-CRE杂合等位基因，图2A的底部)的ES细胞产生小鼠，并从脾细胞RNA制备cDNA。使用针对所预测的嵌合重链mRNA具有特异性的引物组(上文描述)扩增cDNA，所述嵌合重链mRNA将通过被插入的人基因区段内的V(D)J重组和随后的与小鼠IgM或IgG恒定域的剪接而产生。来源于这些cDNA克隆的序列(未显示)表明，已经在人可变基因序列内发生了正确的V(D)J重组，重排的人V(D)J基因区段与小鼠恒定域发生了正确的框内剪接，并且已经发生了种型转换重组。对随后的杂合免疫球蛋白基因座的mRNA产物进行了进一步的序列分析。
在一项类似实验中，基于B220和IgM或者IgG的表面表达，通过流式细胞术分离来自于非经免疫的野生型和
Figure BDA0000957660150000801
小鼠的B细胞。汇集B220+IgM+或表面IgG+(sIgG+)细胞，并在RT-PCR扩增和克隆(如上所述)之后获得VH和Vκ序列。记录了来自于非经免疫的
Figure BDA0000957660150000802
1小鼠(表7)和
Figure BDA0000957660150000803
3小鼠(表8)的一组RT-PCR扩增的cDNA中的代表性基因的使用(*缺陷型RSS；
Figure BDA0000957660150000804
缺失或假基因)。*：具有缺陷型RSS的基因区段。
Figure BDA0000957660150000805
基因区段缺失或为假基因。
表7
Figure BDA0000957660150000806
表8
Figure BDA0000957660150000811
Figure BDA0000957660150000821
如表7和8所示，利用了几乎所有的功能性人VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段。在已被描述但未在这个实验的小鼠中检测到的功能性可变基因区段中，已经报道了其中的一些具有缺陷型重组信号序列(RSS)，并且因此预期不会被表达(Feeney,2000,Factors that influence formation of B cell repertoire,Immunol Res 21:195-202)。对来自于各
Figure BDA0000957660150000823
小鼠的一些其它组的免疫球蛋白序列(分离自原初和经免疫谱系)的分析已经显示了对这些基因区段的使用，但是频率较低(数据未显示)。合计的基因使用数据显示，在小鼠中所含的所有功能性人VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段都已经在各原初和经免疫谱系中观察到(数据未显示)。虽然已经在对人重链基因座序列的分析中鉴别了人VH7-81基因区段(Matsudaet al.,1998,Thecomplete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variableregion locus,J Exp Med 188:2151-2162)，但是其并不存在于
Figure BDA0000957660150000825
小鼠中，这通过对整个
Figure BDA0000957660150000826
3小鼠基因组的重新测序所证实。
已知抗体的重链和轻链序列显示不同寻常的可变性，特别是在重排的可变区内的短多肽区段中。这些区域被称为高变区或互补决定区(CDR)，其产生抗体分子结构中的抗原结合位点。居间的多肽序列被称为框架区(FR)。在重链和轻链中有3个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)和4个FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。有一个CDR，即CDR3，是独特的，原因在于这个CDR是通过VH、DH和JH以及Vκ和Jκ基因区段的重组产生的，并且在遇到抗原之前产生大量的谱系多样性。由于经由核酸外切酶活性的核苷酸缺失和经由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的非模板编码的添加物，这种接合是不精确的，因此重组过程可能会产生新的序列。尽管，由于可变区作为整体具有较高的可突变性，FR可以显示出显著的体细胞突变，但是可变性并不均匀地分布在可变区之间。CDR是抗体分子表面中允许抗原结合的集中且局部化的高变区。图7A和7B分别显示了来自于
Figure BDA0000957660150000827
小鼠的所选抗体在证明了接合多样性的CDR3接合点周围的重链和轻链序列。
如图7A所示，在来自
Figure BDA0000957660150000828
小鼠的抗体中的VH-DH和DH-JH接点处都观察到非模板编码的核苷酸添加(N-添加)，表明TdT与所述人区段有着正确的功能。VH、DH和JH区段相对于其种系对应区段的端点表明还存在核酸外切酶活性。与重链基因座不同，人κ轻链重排在CDR3处展现了很少的TdT添加，或不展现TdT添加，所述CDR3是通过Vκ和Jκ区段的重组形成的(图7B)。这是预期得到的，因为在前B到B细胞的转变中在轻链重排期间在小鼠中缺少TdT表达。在重排的人Vκ区的CDR3中观察到的多样性主要是通过核酸外切酶活性在重组事件期间被引入的。
体细胞超突变.通过被称为体细胞超突变的方法，在生发中心反应期间，将额外的多样性添加到重排的免疫球蛋白基因的可变区中。表达经过体细胞突变的可变区的B细胞与其它B细胞竞争结合由滤泡树突细胞所呈递的抗原。对所述抗原具有更高亲和力的那些B细胞将进一步扩增并经历种型转换，然后退回到外周。因此，典型地，表达转换的同种型的B细胞已经遇到了抗原并且经历了生发中心反应，并且相对于原初B细胞将具有增加数目的突变。还预期，与来自于已经历了抗原选择的sIgG+B细胞的可变序列相比，来自于主要为原初sIgM+B细胞的可变区序列将具有相对更少的突变。
将来自于非经免疫的
Figure BDA0000957660150000831
小鼠的sIgM+或sIgG+B细胞或来自于经免疫的小鼠的sIgG+B细胞的随机VH或Vκ克隆的序列与其种系可变基因区段进行比较，并且对相对于种系序列的变化进行注释。以电脑模拟法(in silico)翻译得到的核苷酸序列，并且也注释了导致氨基酸变化的突变。核对来自所有的可变区的数据，并且计算指定位置的变化百分比(图8)。
如图8所示，来源于非经免疫的
Figure BDA0000957660150000832
小鼠的sIgG+B细胞的人重链可变区相对于来自于相同脾细胞池的sIgM+B细胞展现出更多的核苷酸，并且来源于经免疫的小鼠的重链可变区甚至展现出更多的变化。相对于框架区，在互补决定区(CDR)中的变化数增加，表明有抗原选择。相对于IgM，IgG中来自于人重链可变区的对应氨基酸序列也展现了显著更高数目的突变，并且在经免疫的IgG中甚至更多。同样地，与框架序列相比，这些突变似乎在CDR中更为频繁，暗示所述抗体是在体内经过抗原选择的。在来源于经免疫的小鼠的IgG+B细胞的Vκ序列中，观察到核苷酸和氨基酸突变数目的类似增加。
在
Figure BDA0000957660150000833
小鼠中观察到的基因使用和体细胞超突变频率证明了所存在的基本上所有基因区段都能够重排从而在这些小鼠中形成完全功能反转的嵌合抗体。此外，
Figure BDA0000957660150000834
抗体充分参与到小鼠免疫系统中，以经历亲和力选择和成熟，从而产生可有效中和其目标抗原的完全成熟人抗体。
Figure BDA0000957660150000841
小鼠能够针对多种类别的抗原产生稳固的免疫应答，从而可使用具有高亲和力并且适合于治疗应用的大量抗体(数据未显示)。
实施例5
淋巴样结构和血清同种型的分析
通过光学显微术检查来自于野生型或小鼠并用H&E染色的组织样品的脾、腹股沟淋巴结、派氏结(Peyer’s patches)和胸腺的总体结构。使用LUMINEXTM技术分析从野生型和
Figure BDA0000957660150000843
小鼠收集的血清中的免疫球蛋白同种型的水平。
淋巴样器官组织.淋巴样组织的结构和功能部分依赖于造血细胞的正确发育。B细胞发育或功能的缺陷可以表现为淋巴样组织的结构的变化。在分析被染色的组织切片时，没有发现野生型与
Figure BDA0000957660150000844
小鼠之间的二级淋巴样器官的外观有显著差异(数据未显示)。
血清免疫球蛋白水平.每种同种型的表达水平在野生型和小鼠中是类似的(图9A、9B和9C)。这证明了可变基因区段的人源化对种型转换或免疫球蛋白表达和分泌不具有明显的不利影响，因此显然会维持这些功能所必需的所有内源小鼠序列。
实施例6
人源化免疫球蛋白小鼠中的免疫和抗体产生
用抗原对不同型式的
Figure BDA0000957660150000846
小鼠进行免疫以检查针对外来抗原攻击的体液应答。
免疫和杂交瘤开发.可以用以下形式的抗原对
Figure BDA0000957660150000847
和野生型小鼠进行免疫：蛋白质、DNA、DNA和蛋白质的组合、或表达所述抗原的细胞。通常会每三周对动物进行一次加强免疫，总共2到3次。在每次抗原加强免疫之后，收集来自于每个动物的血清样品，并通过血清滴度测定法分析抗原特异性抗体应答。在融合之前，小鼠通过腹膜内和/或静脉内注射接受最后一次的5μg蛋白质或DNA(根据需要)的融合前加强免疫。收获脾细胞并根据制造商建议的方案(Cyto Pulse Sciences Inc.,Glen Burnie,MD)在电融合室内将其与Ag8.653骨髓瘤细胞融合。在培养后10天，使用ELISA分析(Harlow和Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York)就抗原特异性筛选杂交瘤。或者，直接从经免疫的
Figure BDA0000957660150000851
小鼠分离抗原特异性B细胞，并使用标准技术(包括本文所描述的那些技术)进行筛选，以获得对目的抗原具有特异性的人抗体(例如参看US 2007/0280945A1，其以全文引用的方式并入本文中)。
血清滴度测定法.为了监测动物抗抗原血清应答，在每次加强免疫后约10天时收集血清样品，并使用抗原特异性ELISA测定滴度。简言之，将Nunc MAXISORPTM96孔板在4℃用2μg/mL抗原涂布过夜，并用牛血清白蛋白(Sigma,St.Louis,MO)封闭。使3倍系列稀释的血清样品在室温下结合到平板上，持续1小时。然后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤平板，并使用HRP缀合的山羊抗小鼠Fc(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,WestGrove,PA)或使用生物素标记的同种型特异性或轻链特异性多克隆抗体(SouthernBiotech Inc.)分别检测结合的IgG的总IgG滴度或同种型特异的滴度。对于生物素标记的抗体，在平板洗涤之后添加HRP缀合的抗生蛋白链菌素(Pierce,Rockford,IL)。使用例如BDOPTEIATM(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)等比色底物使所有平板显色。在用1M磷酸终止反应之后，记录450nm下的光吸收，并使用来自于Graph Pad的PRISMTM软件分析数据。获得两倍背景信号所需的稀释度被定义为滴度。
在一个实验中，用人白细胞介素-6受体(hIL-6R)对
Figure BDA0000957660150000852
小鼠进行免疫。图10A和10B显示了用hIL-6R免疫的
Figure BDA0000957660150000853
和野生型小鼠的一组代表性的血清滴度。
和野生型小鼠针对IL-6R产生了强有力的应答，并且滴度范围相当(图10A)。来自于
Figure BDA0000957660150000855
和同龄野生型的若干小鼠在单次抗原加强免疫后达到最大应答。这些结果表明，针对这种抗原的免疫应答强度和动力学在和野生型小鼠中是类似的。进一步分析这些抗原特异性抗体应答，以检查存在于血清中的抗原特异性抗体的具体同种型。
Figure BDA0000957660150000857
和野生型组两者主要引发IgG1应答(图10B)，暗示体液应答期间的种型转换在每种类型的小鼠中都是类似的。
抗体与抗原在溶液中的结合亲和力测定.典型地设计基于ELISA的溶液竞争分析以测定抗体对抗原的结合亲和力。
简言之，将条件培养基中的抗体预先与系列稀释的0到10mg/mL的抗原蛋白混合。然后将该抗体和抗原混合物的溶液在室温下孵育2到4小时，以达到结合平衡。然后使用定量夹心ELISA测量混合物中游离抗体的量。将96孔MAXISORBTM板(VWR,West Chester,PA)在4℃用PBS溶液中的1μg/mL抗原蛋白涂布，随后进行BSA非特异性封闭。然后将该抗体-抗原混合物溶液转移到这些平板上，随后孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤平板，并用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体试剂(Jackson Immuno Research Lab)检测平板结合的抗体，并使用例如BD OPTEIATM(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)等比色底物进行显色。在用1M磷酸终止反应之后，记录450nm下的光吸收，并使用来自于Graph Pad的PRISMTM软件分析数据。用4参数拟合分析法分析所述信号对溶液中的抗原浓度的依赖性，并报道为IC50，IC50是在溶液中不存在抗原的情况下使来自抗体样品的信号实现50％下降所需的抗原浓度。
在一个实验中，用hIL-6R对
Figure BDA0000957660150000861
小鼠进行免疫(如上所述)。图11A和11B显示对来自于
Figure BDA0000957660150000862
和野生型小鼠的抗hIL6R抗体的一组代表性的亲和力测量值。
在经免疫的小鼠接受第三次抗原加强免疫之后，使用ELISA分析法测定血清滴度。从所选的野生型和
Figure BDA0000957660150000863
同龄小鼠分离脾细胞，并与Ag8.653骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤并在选择(如上所述)下生长。在产生的总共671个抗IL-6R杂交瘤中，发现236个表达抗原特异性抗体。使用溶液竞争ELISA，利用从抗原阳性孔收获的培养基测定抗体与抗原的结合亲和力。来源于
Figure BDA0000957660150000864
小鼠的抗体展现出宽范围的与溶液中的抗原结合的亲和力(图11A)。此外，发现236个抗IL-6R杂交瘤中有49个在离体生物分析中封闭了IL-6与受体的结合(数据未显示)。此外，这49个抗IL-6R封闭抗体展现了与来源于平行免疫的野生型小鼠的封闭抗体类似的高溶液亲和力范围(图11B)。
实施例7
小鼠ADAM6靶向载体的构建
由于用人免疫球蛋白重链可变基因座位置换了小鼠免疫球蛋白重链可变基因座位，因此早期型式的
Figure BDA0000957660150000865
小鼠缺少小鼠ADAM6基因的表达。具体来说，雄性
Figure BDA0000957660150000866
小鼠展示了生育力的下降。因此，将表达ADAM6的能力再工程改造入
Figure BDA0000957660150000871
小鼠中以挽救生育力缺陷。
使用
Figure BDA0000957660150000872
基因工程技术(上文)构建了用于将小鼠ADAM6a和ADAM6b基因插入人源化重链基因座的靶向载体，以修饰细菌人工染色体(BAC)929d24，其获自Frederick Alt博士(哈佛大学)。对929d24BAC DNA进行工程改造以使其包含含有小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的基因组片段和用于使人ADAM6假基因(hADAM6Ψ)定点缺失的潮霉素表达盒，所述人ADAM6假基因位于人源化重链基因座的人VH1-2与VH6-1基因区段之间(图12)。
首先，从929d24BAC克隆亚克隆含有小鼠ADAM6b基因、约800bp的上游(5’)序列和约4800bp的下游(3’)序列的基因组片段。另行从929d24BAC克隆亚克隆含有小鼠ADAM6a基因、约300bp的上游(5’)序列和约3400bp的下游(3’)序列的第二基因组片段。将含有小鼠ADAM6b和ADAM6a基因的这两个基因组片段连接到被Frt重组位点侧接的潮霉素表达盒上，以产生靶向载体(小鼠ADAM6靶向载体，图12；SEQ ID NO:3)。将不同的限制酶位点工程改造到该靶向载体小鼠ADAM6b之后的5’端上和小鼠ADAM6a基因之后的3’端上(图12底部)，用于连接到人源化重链基因座中。
对含有人重链可变基因座位(包括位于人源化基因座的人VH1-2与VH6-1基因区段之间的人ADAM6假基因(hADAM6Ψ))置换了小鼠重链可变基因座位的BAC克隆进行另外的修饰，用于随后连接小鼠ADAM6靶向载体(图13)。
简言之，对被loxP重组位点侧接的新霉素表达盒进行工程改造以包含含有人VH1-2基因区段的3’位置(对于hADAM6Ψ是5’)和人VH6-1基因区段的5’位置(对于hADAM6Ψ是3’；参看图13中间)的人基因组序列的同源臂。这个靶向构建体的插入位点的位置是人ADAM6假基因5’的约1.3kb和3’的约350bp。该靶向构建体还包含与小鼠ADAM6靶向载体相同的限制位点，以允许在被修饰的含有人ADAM6假基因缺失的BAC克隆与小鼠ADAM6靶向载体之间随后进行BAC连接。
在来源于两个构建体的BAC DNA被消化之后，将基因组片段连接到一起以构建经工程改造的含有人源化重链基因座的BAC克隆，所述人源化重链基因座含有异位放置的包含小鼠ADAM6a和ADAM6b核苷酸序列的基因组序列。用于在ES细胞中使人源化重链基因座内的人ADAM6基因缺失并插入小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的最终靶向构建体从5’到3’含有：含有人VH1-2基因区段的3’的约13kb人基因组序列的5’基因组片段，小鼠ADAM6b基因下游约800bp的小鼠基因组序列，小鼠ADAM6b基因，小鼠ADAM6b基因上游约4800bp的基因组序列，5’Frt位点，潮霉素表达盒，3’Frt位点，小鼠ADAM6a基因下游约300bp的小鼠基因组序列，小鼠ADAM6a基因，小鼠ADAM6a基因上游约3400bp的小鼠基因组序列，和含有人VH6-1基因区段的5’的约30kb人基因组序列的3’基因组片段(图13底部)。
使用被工程改造的BAC克隆(如上所述)对含有人源化重链基因座的小鼠ES细胞进行电穿孔，以产生被修饰的ES细胞，其包含在人源化重链基因座内异位放置的包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的小鼠基因组序列。使用TAQMANTM探针，通过定量PCR分析(Lie和Petropoulos,1998,Advances in quantitative PCR technology:5’nuclease assays,Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48)鉴别在人源化重链基因座内含有异位小鼠基因组片段的阳性ES细胞。使用位于被修饰区域内的引物和探针，通过PCR证实在人源化重链基因座的被修饰部分外部的上游和下游区域，从而证实人源化重链基因座内的异位小鼠基因组序列以及潮霉素表达盒的存在情况。在上游插入点之间的核苷酸序列包括以下序列，其指示该插入点上游的人重链基因组序列和与存在于插入点处的小鼠基因组序列邻接地连接的I-CeuI限制位点(下文中包含在括号内的序列)：
(CCAGCTTCAT TACTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG
CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG
CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G)
GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA
TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG(SEQ ID NO:4)。在被靶向区域的3’端的下游插入点之间的核苷酸序列包括以下序列，其指示小鼠基因组序列和与插入点下游的人重链基因组序列邻接地连接的PI-SceI限制位点(下文中包含在括号内的序列)：
(AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA
CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC
GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT)ATCCCCCACC
AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA
TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG(SEQ ID NO:5)
将如上所述的被靶向ES细胞用作供体ES细胞，并通过
Figure BDA0000957660150000891
小鼠工程方法(参看例如美国专利号7,6598,442、7,576,259、7,294,754)引入8细胞阶段的小鼠胚胎中。使用检测人源化重链基因座内小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的存在的等位基因分析的一种改良方法(Valenzuelaet al.,2003)，通过基因分型来鉴别携带人源化重链基因座的小鼠，所述人源化重链基因座含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组序列。
使携带含有小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的人源化重链基因座的小鼠交配繁殖获得FLPe缺失小鼠品系(参看例如Rodríguezet al.,2000,High-efficiency deleter miceshow that FLPe is an alternative to Cre-loxP.Nature Genetics 25:139-140)，以去除由靶向载体引入的任何具有Frt的潮霉素表达盒，所述潮霉素表达盒例如在ES细胞阶段或在胚胎中没有被去除。任选地，潮霉素表达盒保留在小鼠中。
对幼崽进行基因分型，并选择就含有异位小鼠基因组片段(其包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列)的人源化重链基因座来说为杂合型的幼崽，用于表征小鼠ADAM6基因表达和生育力。
实施例8
对ADAM6挽救型小鼠的表征
流式细胞术.处死就人重链和人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的25周大的3只小鼠(H+/+κ+/+)和就人重链和人κ轻链来说为纯合型并在人重链基因座的两个等位基因内具有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位小鼠基因组片段的的18-20周大的3只小鼠(H+/+A6resκ+/+)，用于在BD LSR II System(BD Bioscience)上通过FACS鉴别和分析淋巴细胞群体。针对特异性细胞谱系对淋巴细胞进行门控，并通过B细胞发育的各阶段分析这些淋巴细胞的发展。从动物收集的组织包括血液、脾和骨髓。将血液收集到含有EDTA的BDmicrotainer管(BD Biosciences)中。通过用补充有胎牛血清、丙酮酸钠、HEPES、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的完全RPMI培养基进行冲洗而从股骨收集骨髓。用基于氯化铵的裂解缓冲液(例如ACK裂解缓冲液)裂解来自于血液、脾和骨髓制剂的红细胞，随后用完全RPMI培养基洗涤。
为了对细胞群体染色，将来自于各种组织来源的1×106个细胞与抗小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD Biosciences)在冰上一起孵育10分钟，随后用以下抗体混合液中的一种或其组合在冰上标记30分钟。
骨髓：抗小鼠FITC-CD43(1B11,BioLegend)，PE-ckit(2B8,BioLegend)，PeCy7-IgM(II/41,eBioscience)，PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BioLegend)，APC-eFluor780-B220(RA3-6B2,eBioscience)，A700-CD19(1D3,BD Biosciences)。
外周血和脾：抗小鼠FITC-κ(187.1,BD Biosciences)，PE-λ(RML-42,BioLegend)，PeCy7-IgM(II/41,eBioscience)，PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BioLegend)，APC-CD3(145-2C11,BD)，A700-CD19(1D3,BD)，APC-eFluor780-B220(RA3-6B2,eBioscience)。在与被标记的抗体一起孵育之后，对细胞进行洗涤并固定在2％甲醛中。在LSRII流式细胞仪上进行数据采集并用FlowJo(Treestar,Inc.)分析。图14–18显示了来自于代表性H+/+κ+/+和H+/+A6resκ+/+小鼠的结果。
这些结果证明了H+/+A6resκ+/+小鼠的B细胞以类似于H+/+κ+/+小鼠的方式在骨髓和外周隔室中经历B细胞发育的各阶段，并且这些B细胞一旦进入外周就显示正常的成熟模式。H+/+A6resκ+/+小鼠与H+/+κ+/+小鼠相比展示了增加的CD43intCD19+细胞群体(图16B)。这可能表明在H+/+A6resκ+/+小鼠中，含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组片段的人源化重链基因座中的IgM表达被加速。在外周，H+/+A6resκ+/+小鼠的B和T细胞群体表现正常并且与H+/+κ+/+小鼠类似。
睾丸形态和精子表征.为了确定具有人源化免疫球蛋白重链可变基因座的小鼠的不育是否是因为睾丸和/或精子产生缺陷，检查了睾丸形态以及附睾的精子含量。
简言之，在保持附睾完整的情况下切下来自两组(每组n＝5；第1组：就人重链和κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠，H+/+κ+/+；第2组：就人重链可变基因座位来说为杂合型并且就κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠，H+/-κ+/+)的睾丸，并称重。然后将样本固定，埋入石蜡中，切片并用苏木精和曙红(HE)染色剂染色。对睾丸切片(每只小鼠2个睾丸，总共20个)检查形态缺陷和精子产生证据，而对附睾切片则检查精子的存在。
在这个实验中，在H+/+κ+/+小鼠与H+/-κ+/+小鼠之间没有观察到睾丸重量或形态的差别。在所有基因型的睾丸和附睾中都观察到了精子。这些结果证实了不存在小鼠ADAM6a和ADAM6b基因并不会导致睾丸形态的可检测的变化，并且在存在和不存在这两种基因的情况下在小鼠中都产生了精子。雄性H+/+κ+/+小鼠的生育力缺陷因此不可能是因为精子产量低的缘故。
精子运动性和迁移性.因为精子运动性或迁移性的缺陷，缺少其它ADAM基因家族成员的小鼠是不育的。精子迁移性被定义为精子从子宫进入输卵管的能力，并且通常是小鼠受精所必需的。为了确定小鼠ADAM6a和ADAM6b的缺失是否影响这个过程，评估了H+/+κ+/+小鼠中的精子迁移性和运动性。
简言之，从以下小鼠的睾丸获得精子：(1)就人重链可变基因座位来说为杂合型并且就人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/-κ+/+)；(2)就人重链可变基因座位来说为纯合型并且就人κ轻链可变基因座位来说为纯合型的小鼠(H+/+κ+/+)；(3)就人重链可变基因座位来说为纯合型并且就野生型κ轻链来说为纯合型的小鼠(H+/+mκ)；和(4)野生型C57BL/6小鼠(WT)。通过检查没有在精子计数或总体精子运动性方面观察到显著异常。对于所有小鼠，观察到卵丘分散，表明每个精子样品均能够在体外穿透卵丘细胞并结合透明带。这些结果证明了H+/+κ+/+小鼠具有能够穿透卵丘并结合透明带的精子。
使用来自于如上所述的小鼠的精子进行小鼠卵子的体外受精(IVF)。在IVF后第二天，在H+/+κ+/+小鼠中观察到略微更少数目的裂解胚胎，以及更小数目的与卵子结合的精子。这些结果证明了来自于H+/+κ+/+小鼠的精子一旦接触卵子就能够穿透卵丘并结合透明带。
在另一个实验中，在精子迁移性分析中测定来自于H+/+κ+/+小鼠的精子从子宫迁移通过输卵管的能力。
简言之，为第一组超排卵的雌性小鼠(n＝5)提供H+/+κ+/+雄性小鼠(n＝5)，并为第二组超排卵的雌性小鼠(n＝5)提供H+/-κ+/+雄性小鼠(n＝5)。观察交配小鼠对的性交，并且在性交后5到6小时从所有雌性小鼠取出子宫和所连接的输卵管，并对其进行冲洗，用于分析。检查冲洗溶液中的卵子以验证排卵并获得精子计数。以两种不同方式评估精子迁移性。第一种方式是，从子宫取下两条输卵管，用生理盐水冲洗，并对所鉴别的任何精子计数。卵子的存在也被记录为排卵的证据。第二种方式是，保持输卵管与子宫连接并将两个组织固定，埋入石蜡中，切片并染色(如上所述)。对切片检查子宫和两条输卵管中的精子的存在。
对于和5只H+/+κ+/+雄性小鼠交配的雌性小鼠，在输卵管的冲洗溶液中发现非常少的精子。来自和H+/-κ+/+雄性小鼠交配的雌性小鼠的输卵管的冲洗溶液所展现的精子水平是来自和H+/+κ+/+雄性小鼠交配的雌性小鼠的输卵管的冲洗溶液中的精子水平的大约25到30倍(平均值，n＝10条输卵管)。表9显示了H+/+κ+/+和H+/+A6resκ+/+小鼠的代表性交配繁殖比较。
制备了子宫和输卵管的组织切片。对切片检查子宫和输卵管(colliculustubarius)中的精子存在。对输卵管和子宫的组织切片的检查揭露了对于和H+/+κ+/+小鼠交配的雌性小鼠来说，在子宫中发现了精子，但在输卵管中没有发现精子。此外，来自和H+/+κ+/+小鼠交配的雌性小鼠的切片揭露了在子宫输卵管接合处(UTJ)没有发现精子。在来自于和H+/-κ+/+小鼠交配的雌性小鼠的切片中，在UTJ和输卵管中鉴别到了精子。
这些结果证明，缺少ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠所产生的精子展现出体内迁移缺陷。在所有情况下，在子宫内均观察到了精子，表明性交和精子释放明显正常地发生，但在性交后在输卵管内观察到很少精子，甚至没有观察到精子，这是通过精子计数或组织学观察所测量的。这些结果证明，缺少ADAM6a和ADAM6b基因的小鼠所产生的精子不能从子宫迁移到输卵管。这种缺陷显然会导致不育，因为精子不能跨越子宫输卵管接合处进入卵子在其中受精的输卵管。总之，所有这些结果一起支持以下假设：小鼠ADAM6基因帮助引导具有正常运动性的精子从子宫中迁移出来，通过子宫输卵管接合处和输卵管，并因此到达卵子从而实现受精事件。使ADAM6实现这一目的的机制可以被这些ADAM6蛋白中的一种或两种引导，或者通过与精细胞中的其它蛋白(例如其它ADAM蛋白)协同表达而被引导，如下所述。
表9
Figure BDA0000957660150000921
ADAM基因家族表达.已知ADAM蛋白的复合物作为成熟精子表面上的复合物存在。缺少其它ADAM基因家族成员的小鼠随着精子成熟而丧失这种复合物，并且展现出成熟精子中的多种ADAM蛋白的减少。为了确定ADAM6a和ADAM6b基因的缺少是否以类似方式影响其它ADAM蛋白，分析了来自于睾丸(不成熟精子)和附睾(成熟精子)的蛋白提取物的Western印迹物，以测定其它ADAM基因家族成员的表达水平。
在这个实验中，分析了来自H+/+κ+/+和H+/-κ+/+小鼠组(每组n＝4)的蛋白提取物。结果显示，睾丸提取物中的ADAM2和ADAM3的表达不受影响。然而，附睾提取物中的ADAM2和ADAM3均显著减少。这证明，在H+/+κ+/+小鼠的精子中不存在ADAM6a和ADAM6b，可能会在精子成熟时对其它ADAM蛋白(例如ADAM2和ADAM3)的表达和(可能)功能具有直接影响。这暗示ADAM6a和ADAM6b是精子表面上的ADAM蛋白复合物的一部分，而该复合物可能正确的精子迁移是关键性的。
实施例9
人重链可变基因在ADAM6挽救小鼠中的利用
通过定量PCR分析，使用TAQMANTM探针(如上所述)，针对就人重链和κ轻链可变基因座位来说为纯合型的并且缺少小鼠ADAM6a和ADAM6b基因(H+/+κ+/+)或含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位基因组片段(H+/+A6resκ+/+)的小鼠测定所选人重链可变基因的使用情况。
简言之，使用小鼠CD19微珠(Miltenyi Biotec)从H+/+κ+/+和H+/+A6resκ+/+小鼠的脾纯化CD19+B细胞，并使用RNEASYTM迷你试剂盒(Qiagen)纯化总RNA。使用RNase-free DNase柱上处理(Qiagen)取出基因组RNA。使用First Stand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将约200ng mRNA反转录为cDNA中，然后使用ABI 7900序列检测系统(Applied Biosystems)，用TAQMANTM Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)扩增。将每个基因的相对表达针对小鼠κ轻链恒定区(mCκ)的表达标准化。表10列出了在这个实验中使用的正义/反义/TAQMANTM MGB探针组合。
表10
Figure BDA0000957660150000931
注：sense：正义；anti-sense：反义；probe：探针
在这个实验中，在所分析样品中观察了所有四个人VH基因的表达。此外，H+/+κ+/+与H+/+A6resκ+/+小鼠之间的表达水平是相当的。这些结果证明了远离修饰位点的人VH基因(VH3-23和VH1-69)和邻近修饰位点的人VH基因(VH1-2和VH6-1)都能够重组形成功能性表达的人重链。这些结果证明，包含插入人重链基因组序列中的小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位基因组片段不影响基因座内的人重链基因区段的V(D)J重组，并且这些小鼠能够以正常方式重组人重链基因区段以产生功能性重链免疫球蛋白。
实施例10
ADAM6挽救小鼠中的体液免疫应答
通过多抗原免疫方案，随后通过抗体分离和表征，测定就人重链和κ轻链可变基因座位来说为纯合型的并且缺少小鼠ADAM6a和ADAM6b基因(H+/+κ+/+)或含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的异位基因组片段(H+/+A6resκ+/+)的小鼠的体液免疫应答。比较结果以确定对于涉及人免疫球蛋白基因区段的V(D)J重组的任何影响、评估血清滴度发展、杂交瘤的抗体产量和对抗原的亲和力。
免疫方案.使用人细胞表面受体(抗原A)、对人受体酪氨酸-蛋白激酶具有特异性的人抗体(抗原B)、在TGF-β信号传导路径的调控中发挥功能的分泌性人蛋白(抗原C)和人受体酪氨酸激酶(抗原D)在各组小鼠中进行比较性免疫。在用以上抗原进行免疫之前，从各组小鼠收集血清。在初始启动免疫中给予每种抗原(各2.3μg)，其与作为佐剂的10μg CpG寡核苷酸(Invivogen)混合。以每只小鼠25μl的体积，通过脚掌(f.p.)给予免疫原。随后，在第3、6、11、13、17和20天，用2.3μg抗原连同作为佐剂的10μg CpG和25μg Adju-Phos(Brenntag)通过脚掌对小鼠进行加强免疫，总共进行6次加强免疫。分别在第4次和第6次加强免疫之后的第15天和第22天对小鼠采血，并分析抗血清中对每种特异性抗原的抗体滴度。
使用ELISA分析测定被免疫小鼠的血清中的抗体滴度。在4℃下用含有对应抗原(2μg/ml)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS,Irvine Scientific)对96孔微量滴定板(ThermoScientific)涂布过夜。第2天，使用洗板机(Molecular Devices)，用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-T,Sigma-Aldrich)将平板洗4次。然后用250μl含0.5％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich)的PBS封闭平板，并将其在室温下孵育1小时。然后用PBS-T将平板洗涤4次。以1:300或1:1000开始，用0.5％BSA-PBS中对被免疫小鼠的血清和免疫前的血清进行三倍系列稀释，一式两份地添加到被封闭的平板中，并在室温下孵育1小时。最后两个孔保持为空白，以用作二抗对照。在洗板机中再次用PBS-T将平板洗涤4次。将山羊抗小鼠IgG-Fc-辣根过氧化物酶(HRP,Jackson Immunoresearch)或山羊抗小鼠IgG-κ-HRP(Southern Biotech)缀合的二抗的1:5000/1:10,000稀释液添加到平板中，并在室温下孵育1小时。将平板再次用PBS-T洗涤8次，并使用TMB/H2O2作为底物进行显色。将底物孵育20分钟，并用2N H2SO4(VWR)或1N H3PO4(JT Baker)终止反应。在分光光度计(Victor,PerkinElmer)上在450nm下读取平板。使用Graphpad PRISM软件计算抗体滴度。
血清滴度被计算为在实验滴定范围内抗原结合信号等于背景的两倍时的血清稀释度。图19(抗原A)、图20(抗原B)、图21(抗原C)和图22(抗原D)显示体液免疫应答的结果。表11显示了杂交瘤的抗原阳性计分，所述杂交瘤是使用从每个所选免疫组的小鼠分离的两个脾产生的(抗原计分等于背景的两倍)。
如这个实施例中所示，在Adam6挽救小鼠(H+/+A6resκ+/+)中产生的抗体滴度与缺少ADMA6a和ADAM6b并具有人源化重链的小鼠(H+/+κ+/+)中产生的抗体滴度是相当的。此外，来自于H+/+A6resκ+/+小鼠的脾针对所测试的所有抗原(包括高亲和力的抗体)在和H+/+κ+/+小鼠相当的水平下产生了抗原阳性杂交瘤。因此，鉴于产生了具有高亲和力并且含有人免疫球蛋白基因的抗体，因此认为Adam6挽救小鼠中的人免疫球蛋白基因区段的V(D)J重组没有受到损害。
表11
Figure BDA0000957660150000961
实施例11
抗原结合亲和力测定
使用实时表面等离子体共振生物传感器(BIAcore 2000)筛选对抗原B显示特异性结合的抗体的结合亲和力。在BIAcore筛选期间使用来自杂交瘤的条件培养基，所述杂交瘤分离自用抗原B免疫的两个小鼠品系(H+/+κ+/+和H+/+A6resκ+/+)。首先用多克隆兔抗小鼠抗体(GE)对BIAcore传感器表面进行衍生化处理，以从条件培养基捕获抗-抗原B抗体。在整个筛选方法期间，使用HBST(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％v/vSurfactant P20)作为工作缓冲液(running buffer)。以50μl/分钟的流动速率和100nM浓度，将抗原B的Fab片段注射到捕获有抗-抗原B抗体的表面上。在HBST工作缓冲液中对抗体-抗原缔合监测3分钟，同时对抗原与被捕获抗体的解离监测5分钟。实验在25℃下进行。通过使用Scrubber 2.0曲线拟合软件处理数据并将数据拟合于1:1结合模型来测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。由动力学速率常数将结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(T1/2)计算为：KD(M)＝kd/ka；和T1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。表12展示了所选抗-抗原B抗体的结果。
表12
Figure BDA0000957660150000971
在类似实验中，使用实时表面等离子体共振生物传感器(BIAcore 4000)分析法测定杂交瘤条件培养基中存在的不同单克隆抗体与抗原A的结合动力学。这个分析中所使用的所有杂交瘤克隆都是以H+/+A6resκ+/+小鼠产生的。
简言之，为了捕获抗原A特异性抗体，首先将多克隆兔抗小鼠抗体(GE目录号BR-1008-38)固定在传感器芯片上。在两种不同的缓冲液(PBSP，pH 7.2和PBSP，pH 6.0)中进行BIAcore筛选。两种缓冲液都补充有0.1mg/ml BSA。在从条件培养基捕获抗-抗原A抗体之后，以30μl/分钟将1μM抗原A单体(在对应的工作缓冲液中制备)注射到捕获有抗体的表面上，持续1.5分钟，并在25℃下在对应的工作缓冲液中对结合的抗原A单体的解离监测1.5分钟。通过使用Scrubber 2.0曲线拟合软件处理数据并将数据拟合于1:1结合模型来测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。由动力学速率常数将结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(T1/2)计算为：KD(M)＝kd/ka；和T1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。表13列出了在pH 7.2和pH6.0下所选抗-抗原A抗体与抗原A单体的结合的结合动力学参数。NB：在当前实验条件下没有检测到结合。
表13
Figure BDA0000957660150000981
如上所示，以相当的方式从H+/+A6resκ+/+和H+/+κ+/+小鼠都获得了高亲和力抗体。在表12呈现的25种抗体中，H+/+A6resκ+/+小鼠中所产生的20种抗体展示出0.5nM到1μM的亲和力范围，而H+/+κ+/+小鼠中所产生的5种抗体展示出10nM到150nM的亲和力范围。此外，表13中所示的55种抗体展示出20pM到350nM的结合抗原A单体的亲和力范围。
如这个实施例中所证明，小鼠ADAM6基因再插入到人源化免疫球蛋白重链基因座中不会损害小鼠针对多种抗原产生稳固免疫应答的能力，所述稳固免疫应答的特征在于人抗体谱系具有亚纳摩尔范围内的不同亲和力，所述人抗体来源于从经过工程改造的种系重排的人基因区段。
Figure IDA0000957660210000011
Figure IDA0000957660210000031
Figure IDA0000957660210000041
Figure IDA0000957660210000051
Figure IDA0000957660210000061
Figure IDA0000957660210000071
Figure IDA0000957660210000081
Figure IDA0000957660210000091
Figure IDA0000957660210000111
Figure IDA0000957660210000121
Figure IDA0000957660210000131
Figure IDA0000957660210000151
Figure IDA0000957660210000161
Figure IDA0000957660210000171
Figure IDA0000957660210000181
Figure IDA0000957660210000191
Figure IDA0000957660210000201

Claims (25)

1.一种制备基因修饰的小鼠的方法，其包括：
(i)在所述小鼠的种系中的免疫球蛋白重链基因座插入一个或多个人免疫球蛋白基因序列，其中所述插入破坏内源ADAM6基因的功能；和
(ii)在所述小鼠的种系中插入编码小鼠ADAM6a蛋白的核酸序列和编码小鼠ADAM6b蛋白的核酸序列，其中所述小鼠ADAM6a蛋白和所述小鼠ADAM6b蛋白由所述核酸序列表达，
其中所述小鼠ADAM6a蛋白和所述小鼠ADAM6b蛋白从所述核酸序列表达且当在雄性小鼠中表达时改善或恢复生育力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(ii)中的所述核酸序列被插入在所述小鼠的种系中的异位位置。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(ii)中的所述核酸序列被插入在所述小鼠的种系中的内源免疫球蛋白基因座处。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(ii)中的所述核酸序列被插入在所述小鼠的种系中的非内源免疫球蛋白基因座的位置。
5.根据权利要求1所述的方法，其中(i)中的所述一个或多个人免疫球蛋白基因序列包括一个或多个人VH基因区段，一个或多个人DH基因区段，和一个或多个人JH基因区段。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述免疫球蛋白重链基因座失活一个或多个内源性序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一个或多个内源性序列包括一个或多个内源性VH基因区段，一个或多个内源性DH基因区段，一个或多个内源性JH基因区段或其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述免疫球蛋白重链基因座缺失一个或多个内源性序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个内源性序列包括一个或多个内源性VH基因区段，一个或多个内源性DH基因区段，一个或多个内源性JH基因区段或其组合。
10.一种用于修饰小鼠的免疫球蛋白重链基因座的方法，其包括：
(i)在免疫球蛋白重链基因座将一个或多个人免疫球蛋白基因序列插入所述小鼠的种系中，其中所述插入破坏内源ADAM6基因的功能；和
(ii)将编码小鼠ADAM6a蛋白的核酸序列和编码小鼠ADAM6b蛋白的核酸序列插入所述小鼠的种系中，其中所述小鼠ADAM6a蛋白和所述小鼠ADAM6b蛋白由所述核酸序列表达，
其中所述小鼠ADAM6a蛋白和所述小鼠ADAM6b蛋白从所述核酸序列表达且当在雄性小鼠中表达时改善或恢复生育力。
11.根据权利要求10所述的方法，其中(ii)中的所述核酸序列被插入在所述小鼠的种系中的异位位置。
12.根据权利要求10所述的方法，其中(i)中的所述一个或多个人免疫球蛋白基因序列包括一个或多个人VH基因区段，一个或多个人DH基因区段，和一个或多个人JH基因区段。
13.根据权利要求10所述的方法，还包括在所述免疫球蛋白重链基因座失活一个或多个内源性序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个内源性序列包括一个或多个内源性VH基因区段，一个或多个内源性DH基因区段，一个或多个内源性JH基因区段或其组合。
15.根据权利要求10所述的方法，还包括在所述免疫球蛋白重链基因座缺失一个或多个内源性序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个内源性序列包括一个或多个内源性VH基因区段，一个或多个内源性DH基因区段，一个或多个内源性JH基因区段或其组合。
17.一种根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法制备的小鼠用于产生人-小鼠反转嵌合抗体、完全人抗体、完全人Fab片段、完全人F(ab)2片段、永生化细胞系、杂交瘤和/或含有人重链可变区和人轻链可变区的噬菌体文库的用途。
18.一种根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法制备的小鼠用于产生四源杂交瘤的用途。
19.一种用于产生针对抗原具有特异性的反转嵌合小鼠-人抗体的方法，其包括以下步骤：
a)用所述抗原对根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法制备的小鼠进行免疫；
b)从所述小鼠分离产生针对所述抗原具有特异性的反转嵌合小鼠-人抗体的至少一种细胞；和
c)培养步骤b)的产生抗体的至少一种细胞，并获得所述抗体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤c)中的所述培养是在从步骤b)中获得的所述至少一种细胞产生的至少一种杂交瘤细胞上进行的。
21.一种用于产生针对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，其包括以下步骤：
a)用所述抗原对根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法制备的小鼠进行免疫；
b)从所述小鼠分离产生针对所述抗原具有特异性的反转嵌合小鼠-人抗体的至少一种细胞；
c)产生至少一种产生来源于步骤b)的抗体并且针对所述抗原具有特异性的完全人抗体的细胞；和
d)培养步骤c)的产生抗体的至少一种细胞，并获得所述抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤b)中获得的至少一种细胞是脾细胞。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤b)中获得的至少一种细胞是B细胞。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
25.根据权利要求21所述的方法，其中步骤a)的使用所述抗原进行免疫是用蛋白质、DNA、DNA与蛋白质的组合、或表达所述抗原的细胞进行的。
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