KR20130116375A - Ａｄａｍ６ 마우스 - Google Patents

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린 맥도날드
션 스티븐스
앤드류 제이. 머피
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

내생적 ADAM6 유전자좌로부터 ADAM6 활성이 감소 또는 결실된 마우스 또는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 내생적 유전자좌가 결여된 마우스가 제공되며, 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 이소성 ADAM6 서열이거나 또는 수컷 마우스에게 교미에 의해 새끼를 생성할 능력을 부여하는 서열이다. 또한, 마우스 ADAM6 또는 이의 기능성 단편 또는 상동체 또는 이종상동체를 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스 및 세포도 제공된다.

Description

ＡＤＡＭ６ 마우스{ADAM6 MICE}
기능성 ADAM6 유전자좌(locus)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 세포, 배아, 및 조직이 기술된다. 변형은 사람 및/또는 사람화된 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 기능성 내생적(endogenous) ADAM6 유전자는 결여되어 있으나 ADAM6 기능은 포함하는 마우스가 기술되어 있고, ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성(ectopic) 핵산 서열을 포함하는 마우스가 포함된다. 마우스가 기능성 ADAM6 단백질을 생성할 수 없게 하여 생식력을 상실시키는 내생적 면역글로불린 VH 유전자좌의 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 및 수컷 마우스에서의 ADAM6 기능을 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 기술되어 있고, 수컷 마우스의 생식력을 회복시키는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스가 포함된다.
사람 항체 유전자를 포함하는 마우스는 당업계에 공지되어 있다. 지난 20년 동안의 항체에 대한 약제학적 응용은 사람 치료제로서 사용하기에 적합한 항체를 제조하는데 많은 연구가 이루어지게 했다. 마우스 항체에 기반한 초기 항체 치료제는, 사람에게 마우스 항체를 반복적으로 투여함에 따라 장기 치료 요법을 어렵게 할 수 있는 면역원성을 초래하기 때문에, 사람 치료제로서 이상적이지 않았다. 마우스 항체를 더욱 사람-유사하고 덜 마우스-유사하게 하기 위해 마우스 항체를 사람화하는 것에 기반하는 해법이 개발되었다. 항체에 사용하기 위한 사람 면역글로불린 서열을 발현시키기 위한 방법들이 뒤이어 개발되었으며, 이들은 대부분 파지, 세균 또는 효모에서 사람 면역글로불린 라이브러리를 시험관내 발현시키는 것에 기반하였다. 마지막으로, 사람 조혈 세포와 접목된 마우스 및 불능화된(disabled) 내생적 면역글로불린 유전자좌를 갖는 염색체전이(transchromosomal) 또는 유전자전이(transgenic) 마우스에서 사람 림프구로부터 유용한 사람 항체를 시험관내에서 제조하기 위한 시도가 이루어졌다. 유전자전이 마우스에서는, 무작위로 통합된 완전 사람 전이유전자가, 마우스에서 발현된 면역글로불린 서열의 공급원으로서 기능하도록, 내생적 마우스 면역글로불린 유전자를 불능화하는 것이 필요했다. 이러한 마우스는 사람 항체를 사람 치료제로서의 용도에 적합하게 할 수 있지만, 이들 마우스는 이들의 면역계에 실질적인 문제를 나타낸다. 이들 문제는 (1) 마우스가 충분히 다양한 항체 레퍼토리를 생성할 수 없게 하고, (2) 광범위한 재-설계 해법(re-engineering fix)의 사용을 요구하며, (3) 사람과 마우스 요소 사이의 부적합성으로 인하여 차선의 클론 선별 공정을 제공하고, (4) 이들 마우스에게 사람 치료제를 제조하는데 실제로 유용하도록 요구되는 크고 다양한 집단의 사람 가변 서열의 신뢰할 수 없는 공급원을 제공한다.
당업계에서는 사람 항체 서열을 포함하는 면역글로불린 서열을 생성하는데 유용한, 개선된 유전적으로 변형된 마우스를 제조하는 것에 대한 요구가 남아 있다. 또한, 유용한 재배열된 면역글로불린 유전자를 형성하도록 면역글로불린 유전자 절편을 재배열하거나 변경된 면역글로불린 유전자좌로부터 단백질을 제조할 수 있고, 동시에 유전적 변형으로부터 발생할 수 있는 유해한 변화를 감소시키거나 제거시킬 수 있는 마우스에 대한 요구가 남아 있다.
발명의 요약
한 양상에서, 비기능성 내생적 마우스 ADAM6 단백질 또는 ADAM6 유전자를 초래하는 변형(예를 들면, 내생적 ADAM6 유전자의 녹아웃 또는 이의 결실)을 포함하는 마우스를 제조하기 위한, 핵산 작제물, 세포, 배아, 마우스 및 방법이 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체(ortholog), 상동체(homolog) 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
한 양상에서, 내생적 마우스 면역글로불린 유전자좌의 변형을 포함하는 마우스를 제조하기 위한, 핵산 작제물, 세포, 배아, 마우스 및 방법이 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 내생적 마우스 면역글로불린 유전자좌는 면역글로불린 중쇄 유전자좌이고, 상기 변형은 수컷 마우스의 세포 또는 조직의 ADAM6 활성을 감소시키거나 제거한다.
한 양상에서, 마우스 ADAM6, 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되고, 또한, 마우스 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 내생적 뉴클레오타이드 서열, 및 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 마우스도 제공된다.
한 양상에서, 내생적 마우스 면역글로불린 유전자좌의 변형을 포함하는 마우스를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 포함한다. 본 발명에 따른 마우스는, 예를 들면, 본원에 기술되는 방법으로 수득가능하다.
한 양상에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 유전적 변형을 포함하는 마우스를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 방법의 적용은 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 이의 결실)를 포함하는 수컷 마우스를 생성하고, 상기 수컷 마우스는 교미(mating)에 의해 새끼를 생산할 수 있다. 한 실시형태에서, 수컷 마우스는 마우스 난관을 통해 마우스 자궁으로부터 수송되어 마우스 난자를 수정시킬 수 있는 정자를 생성할 수 있다.
한 양상에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 유전적 변형을 포함하는 마우스를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 방법의 적용은 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 이의 결실)를 포함하는 수컷 마우스를 생성하고, 상기 수컷 마우스는 생식력의 감소를 나타내고, 상기 마우스는 생식력 감소의 전부를 또는 일부를 회복시키는 유전적 변형을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 생식력의 감소는 마우스 난관을 통해 마우스 자궁으로부터 이동되어 마우스 난자를 수정시키는 수컷 마우스의 정자의 무능력을 특징으로 한다. 다양한 실시형태에서, 생식력의 감소는 생체내 이동 결함을 나타내는 정자를 특징으로 한다. 다양한 실시형태에서, 생식력의 전부 또는 일부 감소를 회복시키는 유전적 변형은 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열이다.
한 실시형태에서, 유전적 변형은 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 다른 종(예를 들면, 비-마우스 종)의 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌로 대체하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, 유전적 변형은 이종상동체 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌에 삽입하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 종은 사람이다. 한 실시형태에서, 유전적 변형은 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 포함하고, 여기서, 상기 결실은 내생적 ADAM6 기능의 상실을 초래한다. 특정 실시형태에서, 내생적 ADAM6 기능의 상실은 수컷 마우스에서 생식력의 감소와 연관되어 있다.
한 양상에서, 변형을 갖는 수컷 마우스가 내생적 ADAM6 기능의 감소 또는 제거로 인해 감소된 생식력(예를 들면, 교미에 의한 새끼 생산 능력의 심각한 저하)을 나타내거나 근본적으로 불임이 되도록, 내생적 ADAM6 대립유전자로부터 마우스 ADAM6 발현을 감소시키거나 제거시키는 변형을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 이소성 ADAM6 서열 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 추가로 포함한다. 한 양상에서, 마우스 ADAM6 발현을 감소시키거나 제거시키는 변형은 마우스 면역글로불린 유전자좌의 변형(예를 들면, 삽입, 결실, 대체 등)이다.
한 실시형태에서, ADAM6 기능의 감소 또는 상실은 마우스 자궁으로부터 마우스 난관을 통해 이동되어 마우스 난자를 수정시킬 수 있는 정자를 생산하는 것에 대한 마우스의 무능력 또는 실질적 무능력을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스의 사정액 용량 중 생성된 정자 세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 교미 및 마우스 난자의 수정 후 생체내에서 난관을 통해 횡단할 수 없다.
한 실시형태에서, ADAM6 기능의 감소 또는 상실은 마우스의 정자 세포 표면 상에 ADAM2 및/또는 ADAM3 및/또는 ADAM6의 복합체를 형성하는 것에 대한 무능력 또는 실질적 무능력을 포함한다. 한 실시형태에서, ADAM6 기능의 상실은 암컷 마우스와의 교미에 의해 마우스 난자를 수정시키는 것에 대한 실질적 무능력을 포함한다.
한 양상에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고, 마우스에게 ADAM6 기능성을 부여하는 단백질(또는 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 마우스는 수컷 마우스이고, 상기 기능성은 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있는 마우스와 비교하여 향상된 생식력을 포함한다.
한 실시형태에서, 단백질은 마우스의 배선(germline)의 면역글로불린 유전자좌 내에 위치된 게놈 서열에 의해 암호화된다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이다. 다른 특정 실시형태에서, 중쇄 유전자좌는 적어도 하나의 사람 VH, 적어도 하나의 사람 DH 및 적어도 하나의 사람 JH 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 이소성 단백질은 마우스의 배선의 비-면역글로불린 유전자좌 내에 위치된 게놈 서열에 의해 암호화된다. 한 실시형태에서, 비-면역글로불린 유전자좌는 전사적으로 활성인 유전자좌이다. 특정 실시형태에서, 전사적으로 활성인 유전자좌는 ROSA26 유전자좌이다. 특정 실시형태에서, 전사적으로 활성인 유전자좌는 조직-특이적 발현과 연관되어 있다. 한 실시형태에서, 조직-특이적 발현은 생식 조직에 존재한다. 한 실시형태에서, 단백질은 마우스의 배선으로 무작위로 삽입되는 게놈 서열에 의해 암호화된다.
한 실시형태에서, 마우스는 사람 또는 키메라 사람/마우스 또는 키메라 사람/래트 경쇄(예를 들면, 사람 가변, 마우스 또는 래트 불변) 및 키메라 사람 가변/마우스 또는 래트 불변 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스는 전사적으로 활성인 프로모터, 예를 들면, ROSA26 프로모터에 작동적으로 연결된 키메라 사람 가변/래트 또는 마우스 불변 경쇄 유전자를 포함하는 전이유전자를 포함한다. 추가의 특정 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 또는 래트 경쇄 전이유전자는 마우스의 배선에 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 배선의 면역글로불린 유전자좌 내에 위치된다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이다. 한 실시형태에서, 중쇄 유전자좌는 적어도 하나의 사람 VH, 적어도 하나의 사람 DH 및 적어도 하나의 사람 JH 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 배선의 비-면역글로불린 유전자좌 내에 위치된다. 한 실시형태에서, 비-면역글로불린 유전자좌는 전사적으로 활성인 유전자좌이다. 특정 실시형태에서, 전사적으로 활성인 유전자좌는 ROSA26 유전자좌이다. 한 실시형태에서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 배선으로 무작위 삽입으로 위치된다.
한 양상에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 마우스 ADAM6 기능의 상실을 보완하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스에게 기능성 내생적 ADAM6 유전자를 포함하는 상응하는 야생형 마우스와 비교할 만한 새끼를 생산하는 능력을 부여한다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 마우스에게 마우스의 정자 세포의 표면 상에 ADAM2 및/또는 ADAM3 및/또는 ADAM6의 복합체를 형성하는 능력을 부여한다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 마우스에게 마우스 자궁으로부터 마우스 난관을 통해 마우스의 난자로 이동하여 난자를 수정시키는 능력을 부여한다.
한 실시형태에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 동일한 나이 및 스트레인의 야생형 마우스가 6개월의 기간에 생산하는 한배 새끼(litter) 수의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 생산한다.
한 실시형태에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는, 6개월의 기간에 걸쳐 사육되는 경우, 실질적으로 동일한 기간에 걸쳐 실질적으로 동일한 조건 하에서 사육되는 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있는 동일한 나이 및 동일하거나 유사한 스트레인의 마우스보다 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 4배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 또는 약 10배 이상의 자손을 생산한다.
한 실시형태에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는, 4개월 또는 6개월의 사육 기간에, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있으며 동일한 기간 동안 사육되는 마우스보다 한배 새끼당 평균으로 적어도 약 2배, 3배 또는 4배 많은 수의 새끼를 생산한다.
한 실시형태에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 수컷 마우스이고, 이러한 수컷 마우스는, 교미 후 약 5 내지 6시간에 난관으로부터 회수시, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있는 마우스보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 100배, 110배, 또는 120배 높은 난관 이동을 반영하는 정자를 생산한다.
한 실시형태에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는, 암컷 마우스와 교미시, 야생형 마우스로부터의 정자와 대략 동등한 효율로 약 6시간 내에 자궁을 횡단하고 난관에 들어가 난관을 횡단할 수 있는 정자를 생산한다.
한 실시형태에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는, 기능성 ADAM6 유전자가 결여되어 있고 이소성 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있는 마우스보다 비슷한 기간에 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 또는 약 4배 이상의 한배 새끼를 생산한다.
한 양상에서, 면역글로불린 단백질을 암호화하는 비-마우스 핵산 서열을 배선에 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 비-마우스 면역글로불린 서열은 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 비-마우스 면역글로불린 서열은 사람 면역글로불린 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 사람 면역글로불린 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 하나 이상의 V 유전자 절편, 하나 이상의 D 유전자 절편, 및 하나 이상의 J 유전자 절편을 포함하고; 한 실시형태에서, 상기 서열은 하나 이상의 V 유전자 절편 및 하나 이상의 J 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 V, D, 및 J 유전자 절편, 또는 하나 이상의 V 및 J 유전자 절편은 재배열되지 않는다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 V, D, 및 J 유전자 절편, 또는 하나 이상의 V 및 J 유전자 절편은 재배열된다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 V, D, 및 J 유전자 절편, 또는 하나 이상의 V 및 J 유전자 절편의 재배열 후, 마우스는 이의 게놈에 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 재배열 후, 마우스는 이의 게놈에 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 적어도 2개의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 재배열 후, 마우스는 이의 게놈에 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 B 세포에 ADAM6 유전자 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 비-B 세포에 ADAM6 유전자 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 포함한다.
한 양상에서, 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이의 기능성 단편을 발현하는 마우스가 제공되고, 여기서 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성을 포함한다.
한 실시형태에서, 수컷 마우스는 내생적 ADAM6 유전자좌에 단일의 비변형된 내생적 ADAM6 대립유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 포함한다.
한 실시형태에서, 수컷 마우스는 ADAM6 기능을 부여하는 단백질을 암호화하는 이소성 마우스 ADAM6 서열 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 포함한다.
한 실시형태에서, 수컷 마우스는 내생적 마우스 ADAM6 대립유전자의 위치에 가까운 마우스 게놈에서의 위치, 예를 들면, 마지막 V 유전자 절편 서열의 3' 및 초기 D 유전자 절편의 5'에 ADAM6 서열 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 포함한다.
한 실시형태에서, 수컷 마우스는 면역글로불린 가변 유전자 절편을 암호화하는 핵산 서열의 (ADAM6 서열의 전사 방향에 대해) 상류, 하류 또는 상류 및 하류에 플랭킹되는 ADAM6 서열 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 가변 유전자 절편은 사람 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, 면역글로불린 가변 유전자 절편은 사람 유전자 절편이고, 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 서열은 사람 V 유전자 절편 사이에 존재하고; 한 실시형태에서, 마우스는 2개 이상의 사람 V 유전자 절편을 포함하고, 상기 서열은 마지막 V 유전자 절편과 끝에서 두 번째 V 유전자 절편 사이의 위치에 존재하고; 한 실시형태에서, 상기 서열은 마지막 V 유전자 절편 및 처음 D 유전자 절편 다음의 위치에 존재한다.
한 양상에서, 배선에 비기능성 내생적 ADAM6 유전자, 또는 내생적 ADAM6 유전자의 결실을 포함하는 수컷 마우스가 제공되고; 여기서, 마우스의 정자 세포는 암컷 마우스의 난관을 통과하여 난자를 수정시킬 수 있다. 한 실시형태에서, 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편의 염색체외 카피(extrachromosomal copy)를 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 이소성 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 포함한다.
한 양상에서, 내생적 마우스 ADAM6 기능을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는, 전부 또는 일부가 기능성 내생적 비변형된 대립유전자(예를 들면, 이형접합체)에 의해 또는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 이소성 서열로부터의 발현에 의해 제공되는 적어도 소정의 ADAM6 기능성을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는, 기능성 ADAM6이 결여되어 있는 수컷 마우스와 비교하여, 수컷 마우스에게 교미에 의해 새끼를 생산하는 능력을 부여하기에 충분한 ADAM6 기능을 포함한다. 한 실시형태에서, ADAM6 기능은 마우스 ADAM6 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열의 존재에 의해 부여된다.
수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 상동체 또는 이종상동체 또는 이의 단편은 충분한 내생적 마우스 ADAM6 활성이 결여되어 있는 수컷 마우스에서 관찰되는 새끼를 생산하는 능력의 상실, 예를 들면, ADAM6 녹아웃 마우스에서 관찰되는 능력 상실을 전부 또는 일부 회복하는 것들을 포함한다. 이러한 의미에서, ADAM6 녹아웃 마우스는 내생적 유전자좌 또는 이의 단편을 포함하지만 기능성은 아닌, 즉 ADAM6(ADAM6a 및/또는 ADAM6b)을 전혀 발현시키지 않하거나, 야생형 수컷 마우스의 새끼를 생산하는 근본적으로 정상인 능력을 지지하기에는 불충분한 수준으로 ADAM6(ADAM6a 및/또는 ADAM6b)을 발현하는 마우스를 포함한다. 기능의 상실은, 예를 들면, 상기 유전자좌의 구조적 유전자(즉, ADAM6a 또는 ADAM6b 암호화 영역) 또는 상기 유전자좌의 조절 영역(예를 들면, ADAM6a 유전자에 대해 5' 또는 ADAM6a 또는 ADAM6b 암호화 영역의 3'인 서열(여기서, 상기 서열은 ADAM6 유전자의 전사, ADAM6 RNA의 발현 또는 ADAM6 단백질의 발현을 전부 또는 일부 제어한다))에서의 변형으로 인한 것일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 수컷 마우스에서 기능성인 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편은 수컷 마우스의 정자(또는 수컷 마우스의 사정액 중의 다수의 정자 세포)가 마우스 난관을 통과하여 마우스 난자를 수정시킬 수 있도록 하는 것들이다.
한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 가변 영역 또는 이의 기능성 단편을 발현하는 수컷 마우스는, 수컷 마우스에게 암컷 마우스와의 교미에 의해 새끼를 생산하는 능력을 부여하기에 충분한 ADAM6 활성을 포함하고, 한 실시형태에서, 수컷 마우스는, 암컷 마우스와의 교미하는 경우, 1개 또는 2개의 내생적 비변형된 ADAM6 대립유전자를 갖는 마우스의 능력에 비해, 한 실시형태에서는 적어도 25%, 한 실시형태에서는 적어도 30%, 한 실시형태에서는 적어도 40%, 한 실시형태에서는 적어도 50%, 한 실시형태에서는 적어도 60%, 한 실시형태에서는 적어도 70%, 한 실시형태에서는 적어도 80%, 한 실시형태에서는 적어도 90%, 한 실시형태에서는 대략 동일한, 새끼를 생산하는 능력을 나타낸다.
한 실시형태에서, 수컷 마우스는, 수컷 마우스로부터의 정자 세포가 암컷 마우스 난관을 통과하고 마우스 난자를 수정시킬 수 있도록 하기에 충분한 ADAM6(또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편)을 발현한다.
한 실시형태에서, ADAM6 기능성은 마우스 염색체 서열과 인접한 핵산 서열에 의해 부여된다(예를 들면, 상기 핵산은 마우스 염색체에 무작위로 통합되거나; 예를 들면, 핵산을 특정 위치에 표적화함으로써, 예를 들면, 부위-특이적 재조합효소-매개된(예: Cre-매개된) 삽입 또는 상동성 재조합에 의해 특정 위치에 배치된다). 한 실시형태에서, ADAM6 서열은 마우스의 염색체와는 별개인 핵산에 존재한다(예를 들면, ADAM6 서열은 에피좀에, 즉 염색체외에, 예를 들면, 발현 작제물, 벡터, YAC, 전이염색체(transchromosome) 등에 존재한다).
한 양상에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스 및 세포가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 면역글로불린 중쇄 서열의 적어도 일부, 예를 들면, 사람 서열의 적어도 일부를 발현하고, 여기서, 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 변형은 마우스의 ADAM6 활성을 감소시키거나 제거한다. 한 실시형태에서, 마우스는 ADAM6 활성을 암호화하는 대립유전자 모두가 부재하거나 수컷 마우스에서 정상적인 교미를 지지하기 위해 실질적으로 기능하지 않는 ADAM6를 발현하도록 변형된다. 한 실시형태에서, 마우스는 마우스 ADAM6, 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 추가로 포함한다.
한 양상에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는, 유전학적으로 변형된 마우스 및 세포가 제공되고, 여기서, 상기 변형은 상기 유전자좌의 ADAM6 서열로부터 발현되는 ADAM6 활성을 감소시키거나 제거하고, 여기서, 상기 마우스는 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 포함한다. 다양한 실시형태에서, ADAM6 단백질 또는 이의 단편은 이소성 ADAM6 서열에 의해 암호화된다. 다양한 실시형태에서, ADAM6 단백질 또는 이의 단편은 내생적 ADAM6 대립유전자로부터 발현된다. 다양한 실시형태에서, 마우스는 제1 면역글로불린 중쇄 대립유전자로부터 기능성 ADAM6의 발현을 감소시키거나 제거하는 제1 변형을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 대립유전자를 포함하고, 마우스는 제2 면역글로불린 중쇄 대립유전자로부터 기능성 ADAM6의 발현을 실질적으로 감소시키거나 제거하지 않는 제2 변형을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 대립유전자를 포함한다.
한 실시형태에서, 제2 변형은 최종 마우스 V 유전자 절편의 (마우스 V 유전자 절편의 전사 방향성에 대해) 3' 에 위치되고, 마우스(또는 키메라 사람/마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 유전자 또는 이의 단편(예를 들면, 사람 및/또는 마우스: CH1 및/또는 힌지 및/또는 CH2 및/또는 CH3을 암호화하는 핵산 서열)의 (불변 서열의 전사 방향성에 대해) 5'에 위치된다.
한 실시형태에서, 변형은 제1 ADAM6 대립유전자를 암호화하는 제1 유전자좌의 제1 면역글로불린 중쇄 대립유전자에 존재하고, ADAM6 기능은 기능성 ADAM6를 암호화하는 제2 유전자좌의 제2 면역글로불린 중쇄 대립유전자에서 내생적 ADMA6의 발현으로부터 수득되고, 여기서, 상기 제2 면역글로불린 중쇄 대립유전자는 V, D, 및/또는 J 유전자 절편의 적어도 하나의 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, V, D, 및/또는 J 유전자 절편의 적어도 하나의 변형은, 결실, 사람 V, D, 및/또는 J 유전자 절편으로의 대체, 카멜리드(camelid) V, D, 및/또는 J 유전자 절편으로의 대체, 사람화되거나 카멜리드화된 V, D, 및/또는 J 유전자 절편으로의 대체, 중쇄 서열의 경쇄 서열로의 대체, 및 이들의 조합이다. 한 실시형태에서, 적어도 하나의 변형은 하나 이상의 중쇄 V, D, 및/또는 J 유전자 절편의 결실 및 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 경쇄 V 및/또는 J 유전자 절편(예: 사람 경쇄 V 및/또는 J 유전자 절편)으로의 대체이다.
한 실시형태에서, 변형은 제1 유전자좌에서의 제1 면역글로불린 중쇄 대립유전자 및 제2 유전자좌에서의 제2 면역글로불린 중쇄 대립유전자에 존재하며, ADAM6 기능은 마우스의 배선의 비-면역글로불린 유전자좌에서의 이소성 ADAM6의 발현으로부터 수득된다. 특정 실시형태에서, 비-면역글로불린 유전자좌는 ROSA26 유전자좌이다. 특정 실시형태에서, 비-면역글로불린 유전자좌는 생식 조직에서 전사적으로 활성이다.
한 양상에서, ADAM6의 이형접합성 또는 동형접합성 녹아웃을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 마우스는 사람 또는 사람화된 면역글로불린 서열, 또는 낙타 또는 낙타화된 사람 또는 마우스 면역글로불린 서열인 변형된 면역글로불린 서열을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 서열은 내생적 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 존재한다. 한 실시형태에서, 변형된 면역글로불린 서열은 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 사람 중쇄 가변 유전자 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 중쇄 가변 유전자 서열은 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 내생적 마우스 중쇄 가변 유전자 서열을 대체한다.
한 양상에서, 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌로부터 기능성 내생적 마우스 ADAM6을 발현시킬 수 없는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 마우스는 마우스에서 기능성인 ADAM6 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이소성 핵산 서열은 ADAM6 녹아웃에 대해 동형접합성인 수컷 마우스에 의해 나타나는 새끼를 생산하는 능력의 상실을 구조하는 단백질을 암호화한다. 특정 실시형태에서, 이소성 핵산 서열은 마우스 ADAM6 단백질을 암호화한다.
한 양상에서, 기능성 내생적 ADAM6 유전자좌가 결여되어 있고 마우스에 ADAM6 기능을 부여하는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 핵산 서열은 내생적 마우스 ADAM6 서열 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 내생적 마우스 ADAM6 서열은 야생형 마우스에서 최말단 3'(3'-most) 마우스 면역글로불린 중쇄 V 유전자 절편(VH)과 최말단 5'(5'-most) 마우스 면역글로불린 중쇄 D 유전자 절편(DH) 사이에 위치되는 ADAM6a- 및 ADAM6b-암호화 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 핵산 서열은 마우스 ADAM6a 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 서열 및/또는 마우스 ADAM6b 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 서열을 포함하고, 여기서, 상기 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 또는 이의 기능성 단편(들)은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 한 실시형태에서, 프로모터는 사람 프로모터이다. 한 실시형태에서, 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터이다. 특정 실시형태에서, ADAM6 프로모터는 마우스의 최말단 5' DH 유전자 절편에 가장 근접한 제1 ADAM6 유전자의 제1 코돈과 최말단 5' DH 유전자 절편의 재조합 신호 서열 사이에 위치되는 서열을 포함하고, 여기서, 5'은 마우스 면역글로불린 유전자의 전사 방향에 대해 지시된다. 한 실시형태에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 바이러스 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다. 한 실시형태에서, 프로모터는 유비퀴틴 프로모터이다.
한 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 한 실시형태에서, 유도성 프로모터는 비-생식 조직에서의 발현을 조절한다. 한 실시형태에서, 유도성 프로모터는 생식 조직에서의 발현을 조절한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 서열 또는 이의 기능성 단편(들)의 발현은 생식 조직에서 유도성 프로모터에 의해 발전적으로 조절된다.
한 실시형태에서, 마우스 ADAM6a 및/또는 ADAM6b는 서열번호 1의 ADAM6a 및/또는 서열번호 2 서열의 ADAM6b로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 서열번호 3의 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 제1 코돈의 (ADAM6a의 전사 방향에 대해) 직접적으로 상류이고 ADAM6 암호화 영역의 상류의 서열번호 3의 말단까지 연장된 서열번호 3의 핵산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 개시 코돈 상류의 약 5 내지 약 20 뉴클레오타이드로부터 ADAM6a의 개시 코돈 상류의 약 0.5kb, 1kb, 2kb, 또는 3kb 이상까지 연장된 단편이다.
한 실시형태에서, 핵산 서열은, 불임이거나 ADAM6의 결여로 인해 생식력이 낮은 마우스에 배치되는 경우 생식력을 개선하거나 생식력을 대략 야생형 생식력으로 회복시키는 서열번호 3 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 서열번호 3 또는 이의 단편은, 수컷 마우스에게, 암컷 마우스 난관을 통과하여 마우스 난자를 수정시킬 수 있는 정자 세포를 생성하는 능력을 부여한다.
한 양상에서, ADAM6 단백질을 암호화하는 내생적 뉴클레오타이드 서열의 결실, 내생적 마우스 VH 유전자 절편의 사람 VH 유전자 절편으로의 대체, 및 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다.
한 실시형태에서, 마우스는 내생적 ADAM6 유전자를 포함하는 내생적 면역글로불린 유전자좌 뉴클레오타이드 서열의 결실을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하고, 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 존재하거나 뉴클레오타이드 서열에 직접적으로 인접한다.
한 실시형태에서, 마우스는, 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 VH 유전자 절편을 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 것을 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 존재하거나 뉴클레오타이드 서열에 직접적으로 인접한다. 한 실시형태에서, 마우스는, 내생적 DH 유전자의 유전자좌에서 하나 이상의 내생적 DH 유전자 절편을 하나 이상의 사람 DH 유전자 절편으로 대체하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 내생적 JH 유전자의 유전자좌에서 하나 이상의 내생적 JH 유전자 절편을 하나 이상의 사람 JH 유전자 절편으로 대체하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 내생적 VH, DH, 및 JH 유전자의 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 VH, DH, 및 JH 유전자 절편을 사람 VH, DH, 및 JH 유전자 절편으로 대체하는 것을 포함하고, 여기서, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열은 존재하는 사람 VH 유전자 절편의 끝에서 두 번째의 최말단 3' VH 유전자 절편과 존재하는 사람 VH 유전자 절편의 최종(ultimate) 3' VH 유전자 절편 사이에 배치된다. 특정 실시형태에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편의 결실 및 모든 또는 실질적으로 모든 사람 VH 유전자 절편으로의 대체를 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 사람 유전자 절편 VH1-2의 하류 및 사람 유전자 절편 VH6-1의 상류에 배치된다.
특정 실시형태에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 VH 유전자 절편을 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 것을 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 존재하거나 뉴클레오타이드 서열에 직접적으로 인접한다.
한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스 게놈의 전이유전자 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스에서 염색체외에 존재한다.
한 양상에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 서열을 포함하는 B 세포를 발현하고, 상기 B 세포는 이의 게놈에(예를 들면, B 세포 염색체 상에) 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 유전자를 포함한다. 한 실시형태에서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 서열은 사람 중쇄 V, D, 및/또는 J 서열; 마우스 중쇄 V, D, 및/또는 J 서열; 사람 또는 마우스 경쇄 V 및/또는 J 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 또는 마우스 중쇄 서열을 포함한다.
한 양상에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 기능적으로 침묵된(silenced) 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하고, 추가로 하나 이상의 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 절편을 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 절편으로 대체하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 마우스는 기능성 내생적 ADAM6 유전자좌가 결여되어 있고, 여기서, 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 양상에서, 기능성 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 서열이 결여되어 있고, 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 서열의 기능성 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 반대 성의 마우스와 교미하여 이소성 ADAM6 유전자좌 또는 서열을 포함하는 자손을 생산할 수 있다. 한 실시형태에서, 마우스는 수컷이다. 한 실시형태에서, 마우스는 암컷이다.
한 양상에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자의 유전자좌에 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 절편을 포함하고, 상기 마우스에는 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자의 유전자좌에 내생적 기능성 ADAM6 서열이 결여되어 있으며, 여기서, 상기 마우스는 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 단백질을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 염색체외에 존재한다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 단백질을 발현하는 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스의 게놈의 하나 이상의 유전자좌에 통합된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 유전자좌는 면역글로불린 유전자좌를 포함한다.
한 양상에서, 변형된 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 면역글로불린 중쇄 서열을 발현하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 중쇄는 사람 V 유전자 절편, D 유전자 절편, 및 J 유전자 절편으로부터 유도되고, 여기서, 상기 마우스는 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는 다수의 사람 V 유전자 절편, 다수의 D 유전자 절편, 및 다수의 J 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, D 유전자 절편은 사람 D 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, J 유전자 절편은 사람 J 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, 마우스는 사람화된 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 상기 사람화는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열의 대체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄는 사람 V 유전자 절편, 사람 D 유전자 절편, 사람 J 유전자 절편, 사람 CH1 서열, 사람 또는 마우스 힌지 서열, 마우스 CH2 서열, 및 마우스 CH3 서열으로부터 유도된다. 다른 특정 실시형태에서, 마우스는 사람 경쇄 불변 서열을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, D 유전자 절편은 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열에 의해 (D 유전자 절편의 전사 방향에 대해) 5' 플랭킹된다.
한 실시형태에서, 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성은 변형된 내생적 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 (V 유전자 절편의 전사 방향에 대해) 최말단 5' D 유전자 절편의 5' 및 최말단 3' V 유전자 절편의 3'에 위치되는 뉴클레오타이드 서열의 발현으로부터 수득된다.
한 실시형태에서, 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성은 변형된 내생적 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 2개의 사람 V 유전자 절편 사이에 위치된 뉴클레오타이드 서열의 발현으로부터 수득된다. 한 실시형태에서, 2개의 사람 V 유전자 절편은 사람 VH1-2 유전자 절편 및 VH6-1 유전자 절편이다.
한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6b 서열 또는 이의 기능성 단편, 마우스 ADAM6a 서열 또는 이의 기능성 단편, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 2개의 사람 V 유전자 절편 사이의 뉴클레오타이드 서열은 사람 V 유전자 절편에 대해 전사 방향의 반대로 배치된다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 ADAM6 유전자의 전사 방향에 대해 5'으로부터 3'으로 ADAM6a 서열에 이어서 ADAM6b 서열을 암호화한다.
한 실시형태에서, 마우스는 사람 V 유전자 절편 VH1-2와 VH6-1 사이에 있는 사람 ADAM6 유사유전자(pseudogene) 서열을 마우스 ADAM6 서열 또는 이의 기능성 단편으로 대체하는 것을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스에서 기능성인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 마우스 ADAM6 서열 또는 이의 기능성 단편이다.
한 실시형태에서, 마우스는 (예를 들면, 변형된 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 마우스에서) 내생적 마우스 DFL16.1 유전자 절편 또는 사람 DH1-1 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스에 의해 발현되는 면역글로불린 중쇄의 D 유전자 절편은 내생적 마우스 DFL16.1 유전자 절편 또는 사람 DH1-1 유전자 절편으로부터 유도된다.
한 양상에서, 비-재배열된 B 세포 계통의 DNA-함유 세포에 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지만, 재배열된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 B 세포에서 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 포함하지 않는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 마우스에서 마우스 ADAM6 유전자가 나타나는 위치와는 상이한 위치의 게놈에서 발생한다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 재배열된 B 세포 계통 중에 존재하지 않는 모든 또는 실질적으로 모든 DNA-함유 세포에 존재하고; 한 실시형태에서, 상기 핵산 서열은 마우스의 배선 세포에는 존재하지만, 재배열된 B 세포의 염색체에는 존재하지 않는다.
한 양상에서, 재배열된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 B 세포를 포함한 모든 또는 실질적으로 모든 DNA-함유 세포에서 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 마우스 ADAM6 유전자가 야생형 마우스에서 나타나는 위치와는 상이한 위치의 게놈에서 나타난다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 유전자좌와 인접한 핵산 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 재배열된 면역글로불린 유전자좌와 인접한 핵산은 염색체이다. 한 실시형태에서, 염색체는 야생형 마우스에서 발견되는 염색체이고, 염색체는 마우스 면역글로불린 유전자좌에서 변형을 포함한다.
한 양상에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 게놈에 ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 포함한다. 한 실시형태에서, ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체는 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 존재한다. 한 실시형태에서, ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체는 면역글로불린 유전자좌가 아닌 유전자좌에 존재한다. 한 실시형태에서, ADAM6 서열은 이종 프로모터에 의해 유도되는 전이유전자 상에 존재한다. 특정 실시형태에서, 이종 프로모터는 비-면역글로불린 프로모터이다. 특정 실시형태에서, B 세포는 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 발현한다.
한 실시형태에서, 마우스의 B 세포의 90% 이상은 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 이의 상동체 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스는 수컷 마우스이다.
한 실시형태에서, B 세포 게놈은 ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 포함하는 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자를 포함한다. 한 실시형태에서, B 세포 게놈은 제1 대립유전자는 포함하지만, ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 포함하는 제2 대립유전자는 포함하지 않는다.
한 양상에서, 하나 이상의 내생적 ADAM6 대립유전자에 변형을 포함하는 마우스가 제공된다.
한 실시형태에서, 변형은 마우스가 하나 이상의 내생적 ADAM6 대립유전자 중 적어도 하나로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현할 수 없게 한다. 특정 실시형태에서, 마우스는 각각의 내생적 ADAM6 대립유전자로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현할 수 없다.
한 실시형태에서, 마우스는 각각의 내생적 ADAM6 대립유전자로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현시킬 수 없고, 마우스는 이소성 ADAM6 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는 각각의 내생적 ADAM6 대립유전자로부터 기능성 ADAM6 단백질을 발현시킬 수 없고, 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 (마우스 중쇄 유전자좌의 전사 방향에 대해) 상류로 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120kb 이상 내에 위치되는 이소성 ADAM6 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이소성 ADAM6 서열은 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌(예를 들면, 유전자간 V-D 영역, 2개의 V 유전자 절편 사이, V와 D 유전자 절편 사이, D와 J 유전자 절편 사이 등)에 존재한다. 특정 실시형태에서, 이소성 ADAM6 서열은 최종 마우스 V 유전자 절편과 제1 마우스 D 유전자 절편 사이의 90 내지 100kb 유전자간 서열 내에 위치된다. 다른 특정 실시형태에서, 내생적 90 내지 100 kb 유전자간 V-D 서열이 제거되고, 이소성 ADAM6 서열은 최종 V와 제1 D 유전자 절편 사이에 배치된다.
한 양상에서, 불임 수컷 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 2개 이상의 내생적 ADAM6 대립유전자 결실을 포함한다. 한 양상에서, 수컷 불임 형질의 매개체인 암컷 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 암컷 마우스는 배선에 비기능성 ADAM6 대립유전자 또는 내생적 ADAM6 대립유전자의 녹아웃을 포함한다.
한 양상에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 절편이 결여되어 있는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스의 다수의 B 세포는 ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는 2개 이상의 V 유전자 절편, 2개 이상의 D 유전자 절편, 2개 이상의 J 유전자 절편, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자 절편이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 마우스는 1개 이상 내지 89개 이하의 V 유전자 절편, 1개 이상 내지 13개 이하의 D 유전자 절편, 1개 이상 내지 4개 이하의 J 유전자 절편, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 유전자 절편이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 마우스는 약 3 Mb(megabase)의 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 염색체 12로부터 게놈 DNA 단편이 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, 마우스는 모든 기능성 내생적 중쇄 V, D, 및 J 유전자 절편이 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, 마우스는 89개의 VH 유전자 절편, 13개의 DH 유전자 절편 및 4개의 JH 유전자 절편이 결여되어 있다.
한 양상에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 배선에 게놈을 갖는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형은 하나 이상의 마우스 면역글로불린 가변 영역 서열을 하나 이상의 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열로 대체하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, DH 및 JH 서열 및 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 40개, 적어도 60개, 또는 적어도 80개의 VH 서열은 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열로 대체된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, DH, JH, 및 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 모든 VH 서열은 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열로 대체된다. 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 재배열되지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 재배열되지 않은 DH 및 JH 영역 및 비-마우스 종의 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 40개, 적어도 60개, 또는 적어도 80개의 재배열되지 않은 VH 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 비-마우스 종의 모든 VH, DH, 및 JH 영역을 포함한 완전 가변 영역을 포함한다. 비-마우스 종은 호모 사피엔스일 수 있고, 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열은 사람 서열일 수 있다.
한 양상에서, 하나 이상의 사람 가변 도메인/비-사람 불변 도메인 면역글로불린 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 마우스는 면역글로불린 유전자좌 이외의 유전자좌로부터 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 발현한다.
한 실시형태에서, ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체 또는 상동체는 마우스의 B 세포에서 발현되며, 여기서, 상기 B 세포는 사람 가변 서열 및 비-사람 불변 서열을 포함하는 재배열된 면역글로불린 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 비-사람 불변 서열은 설치류 서열이다. 한 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
한 양상에서, 불임 수컷 마우스를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 공여자 ES 세포의 내생적 ADAM6 대립유전자를 비기능성이 되게 하는 단계(또는 상기 대립유전자를 녹아웃시키는 단계), 상기 공여자 ES 세포를 숙주 배아에 도입하는 단계, 숙주 배아를 대리모에 임신시키는 단계, 및 상기 대리모가 공여자 ES 세포로부터 전부 또는 일부 유도된 자손을 낳도록 하는 단계를 포함하는, 불임 수컷 마우스를 제조하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 불임 수컷 마우스를 수득하기 위해 자손을 사육하는 것을 추가로 포함한다.
한 양상에서, 목적하는 유전적 변형을 갖는 마우스를 제조하는 방법으로서, 상기 마우스는 불임이고, 상기 방법은 (a) 게놈에 목적하는 유전적 변형을 만드는 단계; (b) 상기 게놈을 변형시켜 내생적 ADAM6 대립유전자를 녹아웃시키거나 내생적 ADAM6 대립유전자가 비기능성이 되도록 하는 단계; 및 (c) 상기 게놈을 마우스를 제조하는데 사용하는 단계를 포함하는, 목적하는 유전적 변형을 갖는 마우스를 제조하는 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 게놈은 ES 세포 유래이거나 핵 이식(nuclear transfer) 실험에 사용된다.
한 양상에서, 본원에 기술되는 바와 같은 표적화 벡터, 뉴클레오타이드 작제물, 또는 세포를 사용하여 제조되는 마우스가 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스와 야생형 마우스이거나 유전적으로 변형된 제2 마우스의 교미에 의한 자손이 제공된다.
한 양상에서, 마우스 스트레인을 유지하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 마우스 스트레인은 마우스 면역글로불린 중쇄 서열을 하나 이상의 이종 면역글로불린 중쇄 서열로 대체하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 이종 면역글로불린 중쇄 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 서열이다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 하나 이상의 마우스 VH, DH, 및/또는 JH 유전자 절편의 결실을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편, 하나 이상의 사람 DH 유전자 절편, 및/또는 하나 이상의 사람 JH 유전자 절편을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 40개, 적어도 60개, 또는 적어도 80개의 사람 VH 절편, 적어도 27개 사람 DH 유전자 절편, 및 적어도 6개의 JH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스는 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 40개, 적어도 60개, 또는 적어도 80개 사람 VH 절편, 적어도 27개 사람 DH 유전자 절편을 포함하고, 적어도 6개의 JH 유전자 절편은 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된다. 한 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자이다. 한 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 마우스 불변 영역 유전자 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 상기 방법은 마우스 면역글로불린 중쇄 서열의 대체를 위한 이형접합성 수컷 마우스를 생산하는 단계, 및 상기 이형접합성 수컷 마우스를 야생형 암컷 마우스 또는 사람 중쇄 서열에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 암컷 마우스와 함께 사육하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 이형접합성 수컷을 야생형 또는 사람 중쇄 서열에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 암컷과 반복적으로 사육함으로써 스트레인을 유지시키는 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 상기 방법은 사람 중쇄 서열에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 수컷 또는 암컷 마우스로부터 세포를 수득하는 단계, 이들 세포를 공여자 세포로 사용하거나 이로부터의 핵을 공여자 핵으로 사용하는 단계, 및 숙주 세포를 사용하고/하거나 대리모에 세포 및/또는 핵을 임신시켜 유전적으로 변형된 동물을 제조하는데 상기 세포 또는 핵을 사용하는 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 중쇄 유전자좌에서의 대체에 대해 이형접합성인 수컷 마우스만이 암컷 마우스와 함께 사육된다. 특정 실시형태에서, 암컷 마우스는 대체되는 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성, 이형접합성 또는 야생형이다.
한 실시형태에서, 마우스는 내생적 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 서열을 이종 면역글로불린 경쇄 서열로 대체하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 이종 면역글로불린 경쇄 서열은 사람 면역글로불린 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 서열이다.
한 실시형태에서, 마우스는 내생적 면역글로불린 유전자좌 이외의 유전자좌에 전이유전자를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 전이유전자는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 (재배열되지 않는 경우) 작동적으로 연결되거나 (재배열되는 경우) 융합되는 재배열되거나 재배열되지 않는 이종 λ 및/또는 κ 경쇄 서열(예를 들면, 재배열되지 않은 VL 및 재배열되지 않은 JL, 또는 재배열된 VJ)을 암호화하는 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 이종 λ 또는 κ 경쇄 서열은 사람이다. 한 실시형태에서, 불변 영역 서열은 설치류, 사람, 및 비-사람 영장류로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 불변 영역 서열은 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 전이유전자는 경쇄 서열의 발현을 유도하는 비-면역글로불린 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 전사적으로 활성인 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 ROSA26 프로모터이다.
한 양상에서, 상류 상동성 아암 및 하류 상동성 아암을 포함하는 핵산 작제물이 제공되고, 여기서, 상기 상류 상동성 아암은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상기 하류 상동성 아암은 사람 또는 마우스 면역글로불린 가변 영역 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고, 상기 상류 상동성 아암과 상기 하류 상동성 아암 사이에 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열이 배치된다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 서열은 마우스 프로모터와 작동적으로 연결되며, 마우스 ADAM6은 야생형 마우스에서 상기 마우스 프로모터에 연결된다.
한 양상에서, (a) 사람 가변 영역 유전자 절편 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 표적화 벡터가 제공된다.
한 실시형태에서, 표적화 벡터는 마우스 ADAM6을 암호화하는 서열에 작동적으로 연결되는 프로모터를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터이다.
한 양상에서, 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 변형시키기 위한 뉴클레오타이드 작제물이 제공되고, 여기서 상기 작제물은 적어도 하나의 부위-특이적 재조합효소 인식 부위 및 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 ES 세포, 만능 세포 및 유도된 만능 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 마우스 세포 및 마우스 배아가 제공된다. XX인 세포 및 XY인 세포가 제공된다. 또한, 본원에 기술되는 바와 같은 변형, 예를 들면, 전핵(pronuclear) 주사에 의해 세포에 도입되는 변형을 포함하는 핵을 포함하는 세포가 제공된다. 또한, 바이러스로 도입되는 ADAM6 유전자를 포함하는 세포, 배아 및 마우스, 예를 들면, 마우스에서 기능성인 ADAM6 유전자를 포함하는 형질도입 작제물을 포함하는 세포, 배아 및 마우스가 제공된다.
한 양상에서, 유전적으로 변형된 마우스 세포가 제공되고, 여기서, 상기 세포는 기능성 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌가 결여되어 있고, 상기 세포는 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열를 포함한다. 한 실시형태에서, 세포는 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열의 변형을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열의 변형은 마우스 VH 유전자 절편의 결실, 마우스 DH 유전자 절편의 결실, 마우스 JH 유전자 절편의 결실, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 결실을 포함한다. 특정 실시형태에서, 마우스는 하나 이상의 마우스 면역글로불린 VH, DH, 및/또는 JH 서열을 사람 면역글로불린 서열로 대체하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 사람 VH, 사람 VL, 사람 DH, 사람 JH, 사람 JL, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 세포는 전능 세포, 만능 세포 또는 유도된 만능 세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.
한 양상에서, 마우스 B 세포가 제공되고, 여기서, 상기 마우스 B 세포는 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함하고, 여기서, 상기 마우스 B 세포는, B 세포의 염색체 상에, 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스 B 세포는 핵산 서열의 2개의 대립유전자를 포함한다.
한 실시형태에서, 핵산 서열은 재배열된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 인접한 핵산 분자(예를 들면, B 세포 염색체) 상에 존재한다.
한 실시형태에서, 핵산 서열은 재배열된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 핵산 분자와는 별개인 핵산 분자(예를 들면, B 세포 염색체) 상에 존재한다.
한 실시형태에서, 마우스 B 세포는 마우스 또는 사람 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 재배열된 비-마우스 면역글로불린 가변 유전자 서열을 포함하고, 여기서, 상기 B 세포는 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
한 양상에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 염색체, 및 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 체세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 핵산은 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 상이한 염색체 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 체세포는 단일 카피의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 체세포는 적어도 2개의 카피의 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 체세포는 B 세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 배세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이다.
한 양상에서, 배세포의 염색체 상에 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 배세포가 제공되고, 여기서, 상기 마우스 ADAM6(또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 마우스 배세포의 염색체에서의 위치와는 상이한 염색체의 위치에 존재한다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 유전자좌에 존재한다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 유전자좌와 동일한 배세포의 염색체 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 유전자좌와 상이한 배세포의 염색체 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 적어도 하나의 마우스 면역글로불린 서열을 적어도 하나의 비-마우스 면역글로불린 서열로 대체하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 비-마우스 면역글로불린 서열은 사람 면역글로불린 서열이다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스로부터 유도되는 만능, 유도된 만능 또는 전능 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서, 세포는 마우스 배아 줄기(ES) 세포이다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스로부터 유도되는 조직이 제공된다. 한 실시형태에서, 조직은 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유도된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스로부터 유도되는 핵이 제공된다. 한 실시형태에서, 핵은 B 세포가 아닌 이배체 세포 유래이다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스에서 제조되는 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스에서 제조되는 항체의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스에서 제조되는 항체의 가변 영역을 암호화하는 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스에서 제조되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들면, Fab, F(ab)2, scFv)이 제공된다. 한 양상에서, 마우스의 내생적 ADAM6 유전자좌의 (면역글로불린 중쇄 유전자 절편의 전사에 대해) 상류의 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 절편을 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 유전자 절편으로 대체하는 단계, 및 마우스의 ADAM6 유전자좌의 (면역글로불린 중쇄 유전자 절편의 전사에 대해) 하류의 하나 이상의 면역글로불린 유전자 절편을 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자 절편으로 대체하는 단계를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스를 제조하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 마우스의 내생적 ADAM6 유전자좌의 상류의 하나 이상의 내생적 면역글로불린 유전자 절편을 대체하는 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 절편은 V 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스의 내생적 ADAM6 유전자좌의 상류의 하나 이상의 내생적 면역글로불린 유전자 절편을 대체하는 사람 면역글로불린 유전자 절편은 V 및 D 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스의 내생적 ADAM6 유전자좌의 하류의 하나 이상의 내생적 면역글로불린 유전자 절편을 대체하는 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 절편은 J 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스의 내생적 ADAM6 유전자좌의 하류의 하나 이상의 내생적 면역글로불린 유전자 절편을 대체하는 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 절편은 D 및 J 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스의 내생적 ADAM6 유전자좌의 하류의 하나 이상의 내생적 면역글로불린 유전자 절편을 대체하는 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 절편은 V, D 및 J 유전자 절편을 포함한다.
한 실시형태에서, ADAM6 유전자의 상류 및/또는 하류의 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 절편은, 유전적으로 변형된 전구 세포를 형성하도록 만능, 유도된 만능 또는 전능 세포에서 대체되며; 유전적으로 변형된 전구 세포는 숙주에 도입되며; 유전적으로 변형된 전구 세포를 포함하는 숙주는 유전적으로 변형된 전구 세포로부터 유도되는 게놈을 포함하는 마우스를 형성하도록 잉태된다. 한 실시형태에서, 숙주는 배아이다. 특정 실시형태에서, 숙주는 마우스 프리-모룰라(pre-morula)(예: 8- 또는 4-세포 단계), 4배체 배아, 배아 세포의 집합체 또는 배반포로부터 선택된다.
한 양상에서, 마우스 면역글로불린 유전자 절편 및 마우스 ADAM6(또는 수컷 마우스에서 기능성인 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스 뉴클레오타이드 서열을 사람 면역글로불린 유전자 절편을 포함하는 서열로 대체하여 제1 키메라 유전자좌를 형성하고, 이어서, 마우스 ADAM6-암호화 서열(또는 이의 이종상동체, 상도체 또는 기능성 단편을 암호화하는 서열)을 포함하는 서열을 사람 면역글로불린 유전자 절편을 포함하는 서열로 삽입시켜 제2 키메라 유전자좌를 형성하는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스를 제조하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 제2 키메라 유전자좌는 사람 면역글로불린 중쇄 가변(VH) 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 제2 키메라 유전자좌는 사람 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 키메라 유전자좌는 사람 DH 유전자 절편 및 사람 JH 유전자 절편에 작동적으로 연결된 사람 VH 유전자 절편 또는 사람 VL 유전자 절편을 포함한다. 추가의 특정 실시형태에서, 제2 키메라 유전자좌는, 마우스 CH2 + CH3 서열과 융합된, 사람 CH1 서열 또는 사람 CH1 서열 및 사람 힌지 서열을 포함하는 제3 키메라 유전자좌에 작동적으로 연결된다.
한 양상에서, 생식력이 있는 수컷 마우스를 제조하기 위한 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 서열을 포함하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스의 용도가 제공되고, 여기서, 상기 용도는 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 서열을 포함하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스를 기능성 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 서열이 결여된 마우스와 교미시키는 것, 및 이소성 ADAM6 유전자좌 또는 서열을 갖는 자손을 생산할 수 있는 암컷 또는 이소성 ADAM6 유전자좌 또는 서열를 포함하는 수컷인 자손을 수득하는 것을 포함하며, 상기 수컷은 야생형 수컷 마우스에 의해 나타나는 것과 대략 동일한 생식력을 나타낸다.
한 양상에서, 면역글로불린 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 제조하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 양상에서, 완전 사람 Fab 또는 완전 사람 F(ab)2를 제조하기 위한 마우스의 용도가 제공된다.
한 양상에서, 불멸화된 세포주를 제조하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 양상에서, 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 제조하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 양상에서, 사람 중쇄 가변 영역 및 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 파아지 라이브러리를 제조하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 양상에서, (a) 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 관심 항원으로 면역화시키고, (b) 단계 (a)의 면역화된 마우스로부터 림프구를 분리하며, (c) 상기 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키고, (d) 관심 항원에 결합할 수 있는 림프구를 동정하며, (e) 림프구로부터 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열을 증폭시켜 가변 영역 서열을 생성하는 것을 포함하는, 사람 항체 제조용 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 실시형태에서, 림프구는 마우스의 비장으로부터 유도된다. 한 실시형태에서, 림프구는 마우스의 림프절로부터 유도된다. 한 실시형태에서, 림프구는 마우스의 골수로부터 유도된다.
한 실시형태에서, 표지된 항체는 형광단-접합된 항체이다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 형광단-접합된 항체가 IgM, IgG 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 림프구는 B 세포이다.
한 실시형태에서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 경쇄 가변 영역 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역 서열이다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, (a) 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 관심 항원으로 면역화시키고, (b) 단계 (a)의 면역화된 마우스로부터 비장을 분리하며, (c) 상기 비장으로부터의 B 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키고, (d) 관심 항원에 결합할 수 있는 단계 (c)의 B 림프구를 동정하며, (e) B 림프구로부터 중쇄 가변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시켜 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하는 것을 포함하는, 사람 항체 제조용 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 실시형태에서, (a) 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 관심 항원으로 면역화시키고, (b) 단계 (a)의 면역화된 마우스로부터 하나 이상의 림프절을 분리하며, (c) 하나 이상의 림프절로부터의 B 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키고, (d) 관심 항원에 결합할 수 있는 단계 (c)의 B 림프구를 동정하며, (e) B 림프구로부터 중쇄 가변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시켜 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하는 것을 포함하는, 사람 항체 제조용 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
한 실시형태에서, (a) 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 관심 항원으로 면역화시키고, (b) 단계 (a)의 면역화된 마우스로부터 골수를 분리하며, (c) 골수로부터의 B 림프구를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키고, (d) 관심 항원에 결합할 수 있는 단계 (c)의 B 림프구를 동정하며, (e) B 림프구로부터 중쇄 가변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시켜 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하는 것을 포함하는, 사람 항체 제조용 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 표지된 항체가 IgM, IgG 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, 증폭된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열에 융합시키고, 융합된 중쇄 및 경쇄 서열을 세포에서 발현시키며, 발현된 중쇄 및 경쇄 서열을 회수하여 사람 항체를 생성하는 것을 추가로 포함하는, 사람 항체 제조용 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
다양한 실시형태에서, 사람 중쇄 불변 영역은 IgM, IgD, IgA, IgE 및 IgG로부터 선택된다. 다양한 특정 실시형태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, 사람 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4 또는 이들의 조합을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 경쇄 불변 영역은 면역글로불린 κ 불변 영역이다. 다양한 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포, DU145 세포, Lncap 세포, MCF-7 세포, MDA-MB-438 세포, PC3 세포, T47D 세포, THP-1 세포, U87 세포, SHSY5Y(사람 신경아세포종) 세포, Saos-2 세포, Vero 세포, CHO 세포, GH3 세포, PC12 세포, 사람 망막 세포(예를 들면, PER.C6TM 세포) 및 MC3T3 세포로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다.
한 양상에서, 본원에서 기재되는 바와 같은 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계, 상기 항원에 대해 특이적인 역-키메라 마우스-사람 항체를 생성하는 상기 마우스로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계, 및 상기 항원에 대해 특이적인 역-키메라 마우스-사람 항체를 생성하는 하나 이상의 세포를 배양하여 상기 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 관심 항원에 대해 특이적인 역-키메라 설치류-사람 항체를 생성하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 역-키메라 마우스-사람 항체는 마우스 또는 래트 중쇄 불변 유전자와 융합된 사람 중쇄 가변 도메인 및 마우스 또는 래트 또는 사람 경쇄 불변 유전자와 융합된 사람 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 항원에 대해 특이적인 역-키메라 설치류-사람 항체를 생성하는 적어도 하나의 세포의 배양은 마우스로부터 분리되는 적어도 하나의 세포로부터 생성되는 적어도 하나의 하이브리도마 세포에서 수행된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계, 상기 항원에 대해 특이적인 역-키메라 설치류-사람 항체를 생성하는 상기 마우스로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계, 상기 항원에 대해 특이적인 역-키메라 설치류-사람 항체로부터 유도되는 완전 사람 항체를 생성하는 하나 이상의 세포를 생성하는 단계, 및 상기 완전 사람 항체를 생성하는 하나 이상의 세포를 배양하여 상기 완전 사람 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 관심 항원에 대해 특이적인 완전 사람 항체를 생성하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 항원에 대해 특이적인 역-키메라 설치류-사람 항체를 생성하는 마우스로부터 분리되는 적어도 하나의 세포는 비장 세포 또는 B 세포이다.
다양한 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
다양한 실시형태에서, 관심 항원으로의 면역화는 단백질, DNA, DNA와 단백질의 배합물, 또는 항원 발현 세포로 수행된다.
한 양상에서, 면역글로불린 가변 영역 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제조하기 위한 본원에서 기술되는 마우스의 용도가 제공된다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는데 사용된다. 한 실시형태에서, 마우스는 항체, 다중-특이적 항체(예를 들면, 이-특이적 항체), scFv, 이-특이적 scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD(즉, 이원 가변 도메인 항원-결합 단백질), SVD(즉, 단일 가변 도메인 항원-결합 단백질), 또는 이특이적 T-세포 인게이저(engager)(BiTE)로부터 선택되는 항원-결합 단백질을 제조하는데 사용된다.
한 양상에서, 기능성 내생적 마우스 ADAM6 서열이 결여된 마우스로 이소성 ADAM6 서열을 도입하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공되고, 여기서, 상기 용도는 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 기능성 내생적 마우스 ADAM6 서열이 결여된 마우스와 교미하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 이소성 ADAM6 서열을 갖는 마우스를 제조하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스로부터의 유전 물질의 용도가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 용도는 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 세포의 핵을 사용하는 핵 전달을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 용도는 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 세포를 클로닝하여 상기 세포로부터 유도되는 동물을 생성하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 용도는 이소성 ADAM6 서열을 포함하는 마우스를 제조하기 위한 공정에 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 정자 또는 난자를 사용하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 제1 마우스 생식 세포를 수컷 마우스에서 기능성인 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 포함하는 제2 마우스 생식 세포를 사용하여 수정시키고; 수정된 세포를 형성하며; 수정된 세포를 배아로 분화시키며; 배아를 대리모에 잉태시켜 마우스를 수득하는 것을 포함하는, 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 생식력이 있는 수컷 마우스를 제조하는 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 수정은 수컷 마우스와 암컷 마우스를 교미시켜 달성된다. 한 실시형태에서, 암컷 마우스는 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 수컷 마우스는 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편을 포함한다.
한 양상에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 내생적 ADAM6 기능을 감소시키거나 제거시키는 변형을 포함하는 게놈을 갖는 마우스의 생식력을 회복 또는 증진시키기 위한 마우스 ADAM6 단백질, 이의 이종상동체 또는 상동체, 또는 상응하는 ADAM6 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열의 용도가 제공된다.
한 실시형태에서, 핵산 서열은 이소성 위치에서 마우스의 게놈으로 통합된다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 내생적 면역글로불린 유전자좌에서 마우스의 게놈으로 통합된다. 특정 실시형태에서, 내생적 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 내생적 면역글로불린 유전자좌 이외의 다른 위치에서 마우스의 게놈으로 통합된다.
한 양상에서, 의약(예를 들면, 항원-결합 단백질) 제조, 의약(예를 들면, 항원-결합 단백질)의 가변 서열을 암호화하는 서열의 제조 또는 사람 질환 또는 장애의 치료를 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 용도가 제공된다.
도 1a는 약 3 Mb의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌(닫힌 부호)의 약 1 Mb의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌(열린 부호)로의 직접적 게놈 대체에 대한 일반적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다.
도 1b는 약 3 Mb의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌(닫힌 부호)의 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌의 2개의 거의 동일한 반복물 중 약 0.5 Mb의 제1 또는 근위 반복물(열린 부호)로의 직접적 게놈 대체에 대한 일반적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다.
도 2a는, 모든 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 결실시키고 3개의 사람 VH, 모든 사람 DH 및 JH 유전자 절편으로 대체시키는, 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 직접적인 게놈 대체를 위한 3개의 초기 단계(A 내지 C)에 대한 상세한 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 사람 면역글로불린 중쇄 유전자 절편의 제1 삽입을 위한 표적화 벡터(3hVH BACvec)는 67 kb 5' 마우스 상동체 아암(arm), 선별 카세트(□), 부위-특이적 재조합 부위(△), 145 kb 사람 게놈 단편 및 8 kb 3' 마우스 상동체 아암과 함께 도시된다. 후속 표적화 벡터로부터 삽입되는 사람(열린 부호) 및 마우스(닫힌 부호) 면역글로불린 유전자 절편, 추가의 선별 카세트(□) 및 부위-특이적 재조합 부위(△)가 도시된다.
도 2b는, 77개의 추가의 사람 VH 유전자 절편을 삽입시키고 최종 선별 카세트를 제거시키는, 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 직접적 게놈 대체를 위한 6개의 추가 단계(D-I)에 대한 상세 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 추가의 사람 VH 유전자 절편(18hVH BACvec)을 사람 중쇄 유전자 절편(3hVH-CRE 하이브리드 대립유전자)의 초기 삽입물에 삽입시키기 위한 표적화 벡터가 20 kb 5' 마우스 상동체 아암, 선별 카세트(□), 196 kb 사람 게놈 단편 및 62 kb 사람 상동체 아암(사람 유전자 절편의 5'에 위치되는 부위-특이적 재조합 부위(△)와 함께 도시되는 사람 중쇄 유전자 절편의 초기 삽입물의 5' 말단과 겹침)과 함께 도시된다. 후속 표적화 벡터에 의해 삽입되는 사람(열린 부호) 및 마우스(닫힌 부호) 면역글로불린 유전자 절편 및 추가의 선별 카세트(□)가 도시된다.
도 2c는, 모든 마우스 Vκ, 및 Jκ 유전자 절편을 결실시키는, 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌의 직접적 게놈 대체에 대한 상세 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다(Igκ-CRE 하이브리드 대립유전자). 표적화 벡터로부터 삽입되는 선별 카세트(□) 및 부위-특이적 재조합 부위(△)가 도시된다.
도 2d는, 근위 반복물인 모든 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 삽입시키고 최종 선별 카세트를 결실시키는, 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌의 직접적 게놈 대체를 위한 5개의 추가 단계(D-H)에 대한 상세 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다(40hVκdHyg 하이브리드 대립유전자). 후속 표적화 벡터에 의해 삽입되는 사람(열린 부호) 및 마우스(닫힌 부호) 면역글로불린 유전자 절편 및 추가의 선별 카세트(□)가 도시된다.
도 3a는 표적화된 배아 줄기(ES) 세포에서 사람 중쇄 유전자 서열의 삽입 및 마우스 중쇄 유전자 서열의 상실을 검출하기 위한 정량적 PCR(qPCR) 프라이머/프로브의 위치를 포함하는 스크리닝 전략에 대한 일반적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 제1 사람 중쇄 유전자 삽입을 위한 ES 세포 및 마우스에서의 스크리닝 전략이 비변형 마우스 염색체(상단) 및 정확히 표적화된 염색체(하단)에서의 결실 영역("상실(loss)" 프로브 C 및 D), 삽입되는 영역("hIgH" 프로브 G 및 H) 및 플랭킹 영역("보유(retention)" 프로브 A, B, E 및 F)과 함께 도시된다.
도 3b는 사람 면역글로불린 중쇄 유전자 절편의 제1 삽입을 위한 모(parental) 및 변형 ES 세포에서의 관찰 프로브 카피수에 대한 대표적 계산을 나타낸다. 프로브 A 내지 F에 대한 관찰 프로브 카피수를 2/2△△Ct로 계산하였다. △△Ct는 ave[△t(샘플) - med△t(대조군)](여기서, △t는 시험 프로브와 참조 프로브(검정에 따라 4 내지 6개의 참조 프로브) 간의 Ct 차이이다)로 계산된다. 용어 med△t(대조군)는 모 ES 세포로부터의 다수의(>60) 비-표적화된 DNA 샘플에 대한 중간 △t이다. 각각의 변형된 ES 세포 클론을 6중으로 검정하였다. 모 ES 세포에서 IgH 프로브 G 및 H의 카피수를 계산하기 위해서, 이들 프로브를 변형된 ES 세포에서 1의 카피수를 갖는 것으로 상정하였으며, 비록 어떠한 증폭도 관찰되지 않았지만 35의 최대 Ct를 사용하였다.
도 3c는 단지 프로브 D 및 H만을 사용하여 계산되는 각각의 유전형의 4마리 마우스에 대한 카피수의 대표적 계산을 나타낸다. 야생형 마우스: WT 마우스; 사람 면역글로불린 유전자 절편의 제1 삽입물에 대해 이형접합성인 마우스: HET 마우스; 사람 면역글로불린 유전자 절편의 제1 삽입물에 대해 동형접합성인 마우스: Homo 마우스.
도 4a는 세균 상동성 재조합(BHR)에 의한 3hVH BACvec의 작제에 이용되는 3 단계에 대한 상세한 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 표적화 벡터로부터 삽입되는 사람(열린 부호) 및 마우스(닫힌 부호) 면역글로불린 유전자 절편, 선별 카세트(□) 및 부위-특이적 재조합 부위(△)가 도시된다.
도 4b는 NotI 분해 후의 3개의 BAC 클론(B1, B2 및 B3)에 대한 펄스-필드 겔 전기영동(PFGE)을 나타낸다. 마커 M1, M2 및 M3(New England BioLabs, Ipswich, MA)는 각각 낮은 범위, 중간 범위 및 람다 래더 PFG 마커이다.
도 5a는 증가량의 사람 면역글로불린 중쇄 유전자 절편을 사용한 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 순차적 변형에 대한 도식적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 동형접합성 마우스는 중쇄 사람화에 대한 3개의 상이한 단계 각각으로부터 제조되었다. 열린 부호는 사람 서열을 나타내고; 닫힌 부호는 마우스 서열을 나타낸다.
도 5b는 증가량의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 유전자 절편을 사용한 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 순차적 변형에 대한 도식적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 동형접합성 마우스는 κ 경쇄 사람화에 대한 3개의 상이한 단계 각각으로부터 제조되었다. 열린 부호는 사람 서열을 나타내고; 닫힌 부호는 마우스 서열을 나타낸다.
도 6은 야생형 및 VELOCIMMUNE® 사람화된 마우스에서의 B 세포 군집의 FACS 도트 플롯을 나타낸다. 야생형(wt), VELOCIMMUNE® 1(V1), VELOCIMMUNE® 2(V2) 또는 VELOCIMMUNE® 3(V3) 마우스의 비장(상단의 열, 상단으로부터 제3 열 및 하단 열) 또는 서해부 림프절(상단으로부터 제2 열)로부터의 세포를 표면 IgM 발현 B 세포(상단 열 및 상단으로부터 제2 열), κ 또는 λ 경쇄를 포함하는 표면 면역글로불린(상단으로부터 제3 열) 또는 특정 단상형(일배체형)의 표면 IgM(하단 열)로 염색하고, 세포 군집을 FACS로 분리시켰다.
도 7a는 VH-DH-JH (CDR3) 접합부(junction) 주변의 무작위로 선별된 VELOCIMMUNE® 항체의 대표적 중쇄 서열 CDR3 서열을 나타내며, 접합부의 다양성 및 뉴클레오타이드 첨가를 보여준다. 중쇄 CDR3 서열은 DH 유전자 절편 사용에 따라 그룹화되었으며, 배선이 각각의 그룹 위에 굵게 나타나 있다. 각각의 중쇄 CDR3 서열의 VH 유전자 절편이 각각의 서열의 5' 말단에서 괄호 안에 언급된다(예를 들면, 3-72는 사람 VH3-72이다). 각각의 중쇄 CDR3 서열의 JH 유전자 절편이 각각의 서열의 3' 말단에서 괄호 안에 언급된다(예를 들면, 3은 사람 JH3이다). 도시된 각각의 서열에 대한 서열번호는 하기와 같다(상단부터 하단으로 진행): 서열번호 21; 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39.
도 7b는 Vκ-Jκ(CDR3) 접합부 주변의 무작위로 선별된 VELOCIMMUNE® 항체의 대표적 경쇄 서열 CDR3 서열을 나타내며, 접합부의 다양성 및 뉴클레오타이드 첨가를 보여준다. 각각의 경쇄 CDR3 서열의 VH 유전자 절편이 각각의 서열의 5' 말단에서 괄호 안에 언급된다(예를 들면, 1-6는 사람 Vκ1-6이다). 각각의 경쇄 CDR3 서열의 Jκ 유전자 절편이 각각의 서열의 3' 말단에서 괄호 안에 언급된다(예를 들면, 1은 사람 Jκ1이다). 도시된 각각의 서열에 대한 서열번호는 하기와 같다(상단부터 하단으로 진행): 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 42; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 서열번호 46; 서열번호 47; 서열번호 48; 서열번호 49; 서열번호 50; 서열번호 51; 서열번호 52; 서열번호 53; 서열번호 54; 서열번호 55; 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58.
도 8은 38(비면역화된 IgM), 28(비면역화된 IgG), 32(IgG로부터의 비면역화된 Igκ from IgG), 36(면역화된 IgG) 또는 36(IgG로부터의 면역화된 Igκ) 서열의 세트 중 각각의 뉴클레오타이드(NT; 좌측 컬럼) 또는 아미노산(AA; 우측 컬럼) 위치에서 변화되는 서열의(백분율(%)로서 (매칭 배선 서열에 대해 정렬한 후) 스코어를 매긴 VELOCIMMUNE® 항체의 중쇄 및 경쇄의 체세포 초돌연변이 빈도를 나타낸다. 빗금친 막대는 CDR 위치를 나타낸다.
도 9a는 야생형(열린 막대) 또는 VELOCIMMUNE® 마우스(닫힌 막대)에서 IgM 및 IgG 이소타입에 대한 혈청 면역글로불린 수준을 나타낸다.
도 9b는 야생형(열린 막대) 또는 VELOCIMMUNE® 마우스(닫힌 막대)에서 IgA 이소타입에 대한 혈청 면역글로불린 수준을 나타낸다.
도 9c는 야생형(열린 막대) 또는 VELOCIMMUNE® 마우스(닫힌 막대)에서 IgE 이소타입에 대한 혈청 면역글로불린 수준을 나타낸다.
도 10a는, IL-6R의 엑토도메인(ectodomain)으로 2 라운드(출혈 1) 또는 3 라운드(출혈 2)의 면역화 후, 7마리의 VELOCIMMUNE®(VI) 및 5마리의 야생형(WT) 마우스로부터의 혈청의 인터류킨-6 수용체(IL-6R)에 대한 항원-특이적 IgG 역가를 나타낸다.
도 10b는 7마리의 VELOCIMMUNE®(VI) 및 5마리의 야생형(WT) 마우스로부터의 항-IL-6R-특이적 IgG 이소타입-특이적 역가를 나타낸다.
도 11a는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 생성된 항-인터류킨-6 수용체 모노클로날 항체의 친화도 분포를 나타낸다.
도 11b는 VELOCIMMUNE®(VI) 및 야생형(WT) 마우스에서 생성된 항-인터류킨-6 수용체 모노클로날 항체의 항원-특이적 차단을 나타낸다.
도 12는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 도식적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b를 사람화된 내생적 중쇄 유전자좌에 삽입시키는데 사용되는 표적화 벡터(mADAM6 표적화 벡터)가 5' 및 3' 말단에 조립된 제한 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합 부위(Frt)에 의해 플랭킹되는 선별 카세트(HYG: 하이그로마이신)와 함께 도시된다.
도 13은 사람 중쇄 가변 유전자 절편 1-2(VH1-2)와 6-1(VH6-1) 사이에 위치되는 사람 ADAM6 유사유전자(hADAM6ψ)의 도식적 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)를 나타낸다. 사람 ADAM6 유사유전자를 결실시키고, 독특한 제한 부위를 사람 중쇄 유전자좌에 삽입시키기 위한 세균의 상동성 재조합용 표적화 벡터(hADAM6ψ 표적화 벡터)가 5' 및 3' 말단에 조립된 제한 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합 부위(loxP)에 의해 플랭킹되는 선별 카세트(NEO: 네오마이신)와 함께 도시된다. 부위-특이적 재조합 부위에 의해 플랭킹되는 선별 카세트를 포함하는 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 게놈 단편을 포함하는 생성된 표적화된 사람화된 중쇄 유전자좌에 대한 도해(일정 비율로 축소한 것이 아님)가 도시된다.
도 14a는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 골수 중의 IgM 및 B220의 표면 발현에 대한 싱글렛(singlet)으로 게이팅된(gated) 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220highIgM+) B 세포의 백분율(%)이 각각의 등고선 선도에서 주목된다.
도 14b는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 대퇴골로부터 분리된 골수 중의 미성숙(B220intIgM+) 및 성숙(B220highIgM+) B 세포의 총수를 나타낸다.
도 15a는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 골수 중의 c-kit 및 CD43의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. pro-B(CD19+CD43+ckit+) 및 pre-B(CD19+CD43-ckit-) 세포의 백분율(%)이 각각의 등고선 선도의 상단 우측 사분면 및 하단 좌측 사분면 각각에서 주목된다.
도 15b는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 대퇴골로부터 분리된 골수 중의 pro-B 세포(CD19+CD43+ckit+) 및 pre-B 세포(CD19+CD43-ckit-)의 총수를 나타낸다.
도 16a는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 골수 중의 CD19 및 CD43의 표면 발현에 대한 싱글렛으로 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 미성숙 B(CD19+CD43-), pre-B(CD19+CD43int) 및 pro-B(CD19+CD43+) 세포의 백분율(%)이 각각의 등고선 선도에서 주목된다.
도 16b는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 분리된 골수 중의 미성숙 B(CD19+CD43-) 및 pre-B(CD19+CD43int) 세포의 히스토그램을 나타낸다.
도 17a는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 비장 세포 중의 CD19 및 CD3의 표면 발현에 대한 싱글렛으로 게이팅된 림프구의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. B(CD19+CD3-) 및 T(CD19-CD3+) 세포의 백분율(%)이 각각의 등고선 선도에서 주목된다.
도 17b는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 비장 중의 Igλ 및 Igκ 경쇄의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. Igλ+(상단 좌측 사분면) 및 Igκ+(하단 우측 사분면) B 세포의 백분율(%)이 각각의 등고선 선도에서 주목된다.
도 17c는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 비장 중의 CD19+ B 세포의 총수를 나타낸다.
도 18a는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 비장 중의 IgD 및 IgM의 표면 발현에 대한 CD19+-게이팅된 B 세포의 FACS 등고선 선도를 나타낸다. 성숙 B 세포(CD19+IgDhighIgMint)의 백분율(%)이 각각의 등고선 선도에서 주목된다. 우측 등고선 선도 상의 화살표는 IgM 및 IgD 표면 발현과 관련하여 B 세포의 성숙 과정을 도해한다.
도 18b는 CD19+IgMhighIgDint로부터 CD19+IgMintIgDhigh로의 성숙 동안 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+)의 비장 중의 B 세포의 총수를 나타낸다.
도 19는 사람 세포 표면 수용체(항원 A)로 면역화된 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+; n=5) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+; n=5)로부터의 제1 및 제2 출혈물에 대한 항체 역가를 나타낸다.
도 20은 사람 수용체 티로신-단백질 키나제(항원 B)로 면역화된 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+; n=5) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+; n=10)로부터의 제1 및 제2 출혈물에 대한 항체 역가를 나타낸다.
도 21은 TGF-β 신호전달 경로의 조절에 작용하는 분비형 사람 단백질(항원 C)로 면역화된 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+κ+/+; n=12) 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+; n=12)로부터의 제1 및 제2 출혈물에 대한 항체 역가를 나타낸다.
도 22는 사람 수용체 티로신 키나제(항원 D)로 면역화된 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스(H+/+A6resκ+/+; n=12)로부터의 제1 및 제2 출혈물에 대한 항체 역가를 나타낸다.
본원에서 기술되는 방법 및 실험 조건들은 다양할 수 있으므로, 본 발명은 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해 한정되므로, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하고자 하는 것이지 한정하고자 하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어 및 어구는 반대의 것이 명시되거나 해당 용어 또는 어구가 사용되는 문맥으로부터 분명하지 아니하는 한 당해 기술 분야에서 달성되는 의미를 포함한다. 비록 본원에서 기술되는 방법 및 재료와 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 하기에서는 특정 방법 및 재료가 기술된다. 기술되는 모든 문헌은 본원에 참조로 도입된다.
어구 "실질적" 또는 "실질적으로"는, 유전자 절편의 양을 지칭하기 위해 사용되는 경우(예: "실질적으로 모든" V 유전자 절편), 기능성 유전자 절편 및 비기능성 유전자 절편을 모두 포함하며, 다양한 실시형태에서는 예를 들면, 모든 유전자 절편의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상을 포함하고; 다양한 실시형태에서, "실질적으로 모든" 유전자 절편은, 예를 들면, 기능성(즉, 비-유사유전자) 유전자 절편의 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.
용어 "대체"는, 게놈 내의 서열을 게놈 서열의 유전자좌에서 이종성 서열(예: 마우스에서 사람 서열)로 대체하도록 하는 방식으로 DNA 서열이 세포의 게놈에 배치되는 것을 포함한다. 이렇게 배치되는 DNA 서열은 이렇게 배치되는 서열을 수득하기 위해 사용되는 공급원 DNA의 일부인 하나 이상의 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비번역 영역, 적절한 재조합 신호 서열 등)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 다양한 실시형태에서, 대체는, 이렇게 배치된(이종성 서열을 포함하는) DNA 서열로부터의 유전자 생성물을 생산하지만 내생적 서열은 발현시키지 않는, 이종성 서열로 내생적 서열을 치환시키는 것이거나; 내생적 게놈 서열을 내생적 게놈 서열에 의해 암호화되는 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열(예: 면역글로불린 유전자 또는 도메인을 암호화하는 내생적 게놈 서열 및 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 또는 도메인을 암호화하는 DNA 단편)로 대체시키는 것이다. 다양한 실시형태에서, 내생적 유전자 또는 이의 단편은 상응하는 사람 유전자 또는 이의 단편으로 대체된다. 상응하는 사람 유전자 또는 이의 단편은 대체되는 내생적 유전자 또는 이의 단편의 이종상동체이거나, 상동체이거나, 이와 구조적 및/또는 기능적으로 실질적으로 동일하거나 유사한, 사람 유전자 또는 단편이다.
유전자 모델로서의 마우스는 유전자전이 및 녹아웃 기술에 의해 크게 향상되어 왔고, 이는 특정 유전자의 지시된 과발현 또는 결실 효과의 연구를 가능하게 하였다. 모든 이의 장점에도 불구하고, 상기 마우스는 사람 질환에 대해 불완전한 모델이고 사람 치료제를 시험하거나 이를 제조하는데 불완전한 플랫폼이도록 하는 유전적 장애를 여전히 나타낸다. 첫 번째로, 약 99%의 사람 유전자가 마우스 상동체를 갖지만[참조: Waterston et al . 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420:520-562], 잠재적 치료제는 종종 의도된 사람 표적물의 마우스 이종상동체와 교차-반응하지 못하거나 부적절하게 교차-반응한다. 이러한 문제점을 제거하기 위해서, 선택된 표적 유전자를 "사람화"시킬 수 있다(즉, 마우스 유전자를 제거시키고 상응하는 사람 이종상동체 유전자 서열로 대체시킬 수 있다)[참조: US 6,586,251, US 6,596,541, 및 US 7,105,348, 본원에 참조로 포함됨]. 초기에, 녹아웃 + 유전자전이 사람화" 전략에 의해 마우스 유전자를 사람화시키기 위한 노력은 내생적 유전자가 결실된(즉, 녹아웃) 마우스를 무작위로 통합된 사람 전이유전자를 갖는 마우스와 교미시키는 것을 포함하였다[참조: Bril et al ., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al ., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al ., 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al ., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mouse, Mol Immunol 43:1741-1750]. 그러나, 이러한 노력은 크기 제한에 의해 저지되었으며; 통상의 녹아웃 기술은 거대 마우스 유전자를 거대 사람 게놈 대응물(counterpart)로 직접적으로 대체시키기에는 충분하지 않았다. 내생적 마우스 유전자를 마우스 유전자의 동일한 정확한 유전자 위치에서(즉, 내생적 마우스 유전자좌에서) 사람 대응물 유전자로 직접적으로 대체시키는 직접적인 상동성 대체를 위한 쉬운 접근은 기술적 어려움 때문에 거의 시도되지 않는다. 지금까지도, 직접적 대체를 향한 노력은 정교하고 힘든 절차를 수반하므로, 취급될 수 있는 유전 물질의 길이가 제한되고 정확히 다루어져야 하는 제한을 가졌다.
외생적으로 도입된 사람 면역글로불린 전이유전자는 마우스의 전구체 B 세포에서 재배열된다[참조: Alt et al ., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236]. 이러한 발견은 사람 항체를 발현하도록 녹아웃 + 유전자전이 접근을 이용하여 마우스를 조작함으로써 밝혀졌다[참조: Green et al ., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al ., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al ., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143]. 이들 마우스에서 마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌를 각각의 내생적 유전자좌의 작지만 중요한 부분을 표적화 결실시키고, 이어서, 사람 면역글로불린 유전자 유전자좌를, 상술된 바와 같이, 무작위로 통합된 거대 전이유전자로서 또는 미니염색체로서 도입함으로써 불활성화시켰다[참조: Tomizuka et al ., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727]. 이러한 마우스는 유전자 조작에서 중요한 진전을 나타내었으며; 이들로부터 분리된 완전 사람 모노클로날 항체는 다양한 사람 질환을 치료하는데 유망한 치료학적 잠재력을 지녔다[참조: Gibson et al ., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al ., 2007; Kim et al ., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al ., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al ., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831]. 그러나, 상술된 바와 같이, 이들 마우스는 야생형 마우스와 비교하는 경우 손상된 B 세포 발달 및 면역 결핍을 나타낸다. 이러한 문제점은 잠재적으로 왕성한 체액성 반응을 지지하고 결과적으로 일부 항원에 대한 완전 사람 항체를 생성하는 능력을 제한한다. 이러한 결핍은 (1) 사람 면역글로불린 전이유전자의 무작위 도입에 기인한 비효율적 기능성 및 상류 및 하류 제어 요소의 결여에 기인한 부정확한 발현[참조: Garrett et al ., 2005, Chromatin architecture near a potential 3' end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al ., 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al ., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851]; (2) 정상적 성숙, 증식 및 B 세포의 생존에 필요한 신호전달 과정을 손상시킬 수 있는, 세포 표면 상의 B-세포 수용체 신호전달 컴플렉스의 마우스 성분과 사람 불변 도메인 사이의 비효율적인 종간 상호작용[참조: Hombach et al ., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762]; 및 (3) 친화성 선별[참조: Rao et al ., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868] 및 면역글로불린 혈청 농도[참조: Brambell et al ., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al ., 2002; Hjelm et al ., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204]을 감소시킬 수 있는 마우스 Fc 수용체와 가용성 사람 면역글로불린 사이의 비효율적 종간 상호작용에 기인할 수 있다. 이러한 결핍은 내생적 중쇄 및 경쇄 유전자좌에서 천연 위치 내의 마우스 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역만을 제자리(in situ) 사람화시킴으로써 교정될 수 있다. 이는 마우스 불변 영역을 보유하는 것에 기초하여 마우스 환경과 정상적으로 상호작용하고 선별할 수 있는 "역-키메라(reverse chimeric)"(즉, 사람 V:마우스 C) 항체를 제조하는 마우스를 효과적으로 생성할 것이다. 또한, 이러한 역-키메라 항체는 치료 목적을 위한 완전 사람 항체로 쉽게 재포맷(reformatted)될 수 있다.
내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 이종성(예를 들면, 다른 종으로부터의) 면역글로불린 서열로의 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 동물이, 내생적 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서의 대체와 관련하거나 면역글로불린 경쇄 전이유전자(예: 키메라 면역글로불린 경쇄 전이유전자 또는 완전 사람 완전 마우스 등)와 관련하여 생성될 수 있다. 이종성 면역글로불린 중쇄 서열이 유도되는 종은 매우 다양할 수 있고; 면역글로불린 경쇄 서열 대체에 사용되는 면역글로불린 경쇄 서열 또는 면역글로불린 경쇄 전이유전자의 경우에도 마찬가지이다.
면역글로불린 가변 영역 핵산 서열, 예를 들면, V, D, 및/또는 J 절편은 다양한 실시형태에서 사람 또는 비-사람 동물로부터 수득된다. V, D, 및/또는 J 절편을 제공하기에 적합한 비-사람 동물은, 예를 들면, 경골 어류, 연골 어류, 예를 들면, 상어 및 가오리, 양서류, 파충류, 포유동물, 조류(예: 닭)를 포함한다. 비-사람 동물은, 예를 들면, 포유동물을 포함한다. 포유동물은, 예를 들면, 비-사람 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소(예: 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 낙타, 페렛 및 설치류 및 비-사람 영장류(예: 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 마모셋, 레서스(rhesus) 원숭이, 개코 원숭이)를 포함한다. 적합한 비-사람 동물은 래트, 마우스 및 햄스터를 포함하는 설치류 부류로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이다. 문맥으로부터 명확해지는 바와 같이, 다양한 비-사람 동물{예: 상어, 가오리, 포유동물[예: 낙타, 설치류(예: 마우스 및 래트)]}이 가변 도메인 또는 가변 영역 유전자 절편의 공급원으로 사용될 수 있다.
문맥에 따라서, 비-사람 동물은 또한 가변 서열 또는 절편과 관련하여 사용될 불변 영역 서열의 공급원으로도 사용되고, 예를 들면, 설치류 불변 서열은 사람 또는 비-사람 가변 서열(예를 들면, 마우스 또는 래트 또는 햄스터의 설치류 불변 서열에 작동적으로 연결된 사람 또는 비-사람 영장류 가변 서열)에 작동적으로 연결된 전이유전자에 사용될 수 있다. 따라서, 다양한 실시형태에서, 사람 V, D, 및/또는 J 절편은 설치류(예: 마우스 또는 래트 또는 햄스터) 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 사람 V, D, 및/또는 J 절편(또는 하나 이상의 재배열된 VDJ 또는 VJ 유전자)은, 예를 들면, 내생적 면역글로불린 유전자좌가 아닌 유전자좌에서 통합되는 전이유전자의 마우스, 래트 또는 햄스터 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결되거나 이에 융합된다.
특정 실시형태에서, 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 VH, DH, 및 JH 절편이 하나 이상의 사람 VH, DH, 및 JH 절편으로 대체되는 마우스가 제공되며, 여기서, 하나 이상의 사람 VH, DH, 및 JH 절편은 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동적으로 연결되고; 여기서, 상기 마우스는 내생적 면역글로불린 유전자좌가 아닌 다른 유전자좌에서 전이유전자를 포함하고, 여기서, 상기 전이유전자는 마우스 또는 래트 또는 사람 불변 영역에 작동적으로 연결된 재배열되지 않거나 재배열된 사람 VL 및 사람 JL 절편을 포함한다.
새끼를 생산하는 마우스의 능력은 유지하면서 마우스 배선 면역글로불린 가변 유전자 유전자좌를 사람 배선 면역글로불린 가변 유전자 유전자좌로 대규모 제자리 유전자 대체하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 마우스 불변 영역을 온전하게 남겨두면서 6 Mb의 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 면역글로불린 가변 유전자 유전자좌 모두를 이들의 사람 대응물로 정확히 대체하는 것이 기술된다. 그 결과, 마우스 불변 영역은 유지하면서 전체 배선 면역글로불린 가변 레퍼토리가 동등한 사람 배선 면역글로불린 가변 서열로 정확히 대체된 마우스가 만들어졌다. 사람 가변 영역이 마우스 불변 영역에 연결되어 생리학적으로 적절한 수준으로 재배열 및 발현되는 키메라 사람-마우스 면역글로불린 유전자좌를 형성한다. 발현되는 항체가 "역 키메라(reverse chemera)"이고; 즉, 이 항체는 사람 가변 영역 서열 및 마우스 불변 영역 서열을 포함한다. 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 항체를 발현하는 사람화된 면역글로불린 가변 영역을 갖는 이들 마우스를 VELCOIMMUNE® 마우스라 지칭한다.
VELOCIMMUNE® 사람화된 마우스는 야생형 마우스의 것과 본질적으로 구별이 불가능한 완전 기능성 체액 면역계를 나타낸다. 이들은 B 세포 발달의 모든 단계에서 정상적 세포 군집을 나타낸다. 이들은 정상적 림프 기관 형태를 나타낸다. VELOCIMMUNE® 마우스의 항체 서열은 정상적 V(D)J 재배열 및 정상적 체세포 초돌연변이 빈도를 나타낸다. 이들 마우스의 항체 군집은 정상적 클래스 스위칭(예: 정상적 이소타입 cis-스위칭)으로부터 생기는 이소타입 분포를 반영한다. VELOCIMMUNE® 마우스를 면역화시킴으로써 치료 후보물로서 사용하기에 적합한 사람 면역글로불린 가변 도메인을 갖는 거대하고 다양한 항체 레퍼토리를 생성하는 강력한 체액 면역 반응을 생성한다. 이러한 플랫폼은 약제학적으로 허용되는 항체 및 다른 항원-결합 단백질을 제조하기 위한 천연적으로 친화도-성숙된 사람 면역글로불린 가변 영역 서열의 풍부한 공급원을 제공한다.
이것이 마우스 면역글로불린 가변 서열을 VELOCIMMUNE® 마우스의 제조를 가능하게 하는 사람 면역글로불린 가변 서열로의 정확한 대체이다. 하지만, 중쇄 및 경쇄 유전자좌에서 내생적 마우스 면역글로불린 서열을 매우 다양한 사람 면역글로불린 서열의 순차적 재조합에 의해 동등한 사람 면역글로불린 서열로 정확히 대체하는 것은 마우스와 사람 사이의 면역글로불린 유전자좌의 분지적 진화(divergent evolution) 때문에 다소의 도전을 제시할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 유전자좌 내에 산재된(interspersed) 유전자간 서열이 마우스와 사람 사이에 동일하지 않고, 일부의 경우엔 기능적으로 동등하지 않을 수 있다. 이들의 면역글로불린 유전자좌에서 마우스와 사람 사이의 차이는, 사람화된 마우스, 특히 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 특정 부분을 사람화 또는 조작하는 경우, 여전히 이상을 초래할 수 있다. 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서의 일부 변형은 유해하다. 유해한 변형은, 예를 들면, 교미하고 새끼를 낳는 변형된 마우스의 능력을 상실시키는 것을 포함할 수 있다.
모든 마우스 불변쇄 유전자 및 유전자좌 전사 제어 영역을 포함한 플랭킹 마우스 서열은 온전한 상태로 두고 하이브리드 유전자좌 내에서 기능적이도록 하면서, 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 6 Mb의 가변 영역(VH-DH-JH 및 Vκ-Jκ)을 상응하는 1.4 Mb의 사람 게놈 서열로 정확히 대규모로 제자리 대체하였다(도 1a 및 도 1b). 구체적으로, 사람 VH, DH, JH, Vκ 및 Jκ 유전자 서열을 사람 배선 가변 유전자좌의 중복 단편을 갖는 13개의 키메라 BAC 표적화 벡터의 단계적 삽입을 통해 VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 이용하여 마우스 ES 세포로 도입하였다[참조: 예를 들면, US 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al ., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659].
마우스 면역글로불린 유전자의 사람화는 지금까지 마우스 게놈에 대한 가장 큰 유전적 변형을 나타낸다. 무작위로 통합되는 사람 면역글로불린 전이유전자를 사용하는 이전의 노력들로 (상기 논의된 바와 같은) 다소의 성공이 있었지만, 마우스 면역글로불린 유전자를 사람 대응물로 직접적으로 대체하는 것이 다른 상황에서는 정상적인 마우스에서 완전-사람 항체를 효율적으로 생성할 수 있는 효율을 극적으로 증진시킨다. 또한, 이러한 마우스는, 무능력해진 내생적 유전자좌 및 완전 사람 항체 전이유전자를 갖는 마우스와 비교하여, 사실상 임의의 항원으로 면역화 후 수득될 수 있는 완전 사람 항체에 대해 극적으로 증가된 다양성을 나타낸다. 다수 버젼의 대체된 사람화된 유전자좌는, 다양한 분화 단계에서 상당히 감소된 B 세포 군집을 나타내는 무작위로 통합된 사람 전이유전자를 갖는 마우스와는 대조적으로, 완전히 정상적인 수준의 성숙 및 미성숙 B 세포를 나타낸다. 사람 유전자전이 마우스에서 사람 유전자 절편의 수를 증가시키기 위한 노력으로 이러한 결함이 감소되었으나, 확장된 면역글로불린 레퍼토리가 야생형 마우스와 비교하여 B 세포 군집의 감소를 완전히 바로잡지는 못했다.
대체된 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스(즉, VELOCIMMUNE® 마우스)에서 거의 야생형인 체액 면역 기능이 관찰됨에도 불구하고, 무작위로 통합된 전이유전자를 사용하는 일부 접근에서는 부딪히지 못하는 면역글로불린의 직접적 대체를 이용하는 경우 부딪히는 다른 도전이 있다. 마우스와 사람 사이의 면역글로불린 유전자좌의 유전적 조성 차이는 대체된 면역글로불린 유전자 절편을 갖는 마우스의 증식에 대해 유리한 서열을 발견할 수 있게 하였다. 구체적으로, 내생적 면역글로불린 유전자좌 내에 위치되는 마우스 ADAM 유전자가 생식력에서의 이의 역할 때문에 대체된 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스에서 최적으로 존재한다.
마우스 ADAM6 의 게놈 위치 및 기능
임의의 기능성 ADAM6 단백질의 발현 능력이 결여된 수컷 마우스는 놀랍게도 교미하여 새끼를 생산하는 마우스의 능력에 결함을 나타낸다. 상기 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 가변 영역 유전자 절편을 사람 가변 영역 유전자 절편으로 대체시킴으로써 기능성 ADAM6 단백질을 발현하는 능력이 결여된다. ADAM6 기능의 상실은, ADAM6 유전자좌가 DH 유전자 절편의 상류에 있는 VH 유전자 절편 유전자좌의 3' 말단에 인접한 내생적 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 유전자좌의 영역 내에 위치되기 때문에 발생된다. 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 마우스 중쇄 가변 유전자 절편의 사람 중쇄 가변 유전자 절편으로의 대체를 위한 동형접합성 마우스를 사육하기 위해서, 대체를 위한 각각 동형접합성인 수컷 및 암컷을 준비하고 생산적인 교미를 기다리는 것은 일반적으로 다루기 어려운 접근이다. 성공적인 한배의 새끼를 얻는 빈도 및 크기가 낮다. 대신에, 대체에 대해 이형접합성인 수컷을 대체에 대해 동형접합성인 암컷과 교미시켜 대체에 대해 이형접합성인 자손을 생산하고, 이어서, 이로부터의 동형접합성 마우스를 사육하였다. 본 발명자들은 수컷 마우스에서 생식력의 상실에 대한 가능한 원인이 동형접합성 수컷 마우스에서 기능성 ADAM6 단백질의 부재라는 것을 밝혔다.
다양한 양상에서, 손상된(즉, 비기능성 또는 미미한 기능성) ADAM6 유전자를 포함하는 수컷 마우스는 생식력의 감소 또는 제거를 나타낸다. 마우스(및 다른 설치류)에서 ADAM6 유전자는 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치되기 때문에, 본 발명자들은 대체된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를 증식시키기 위해 또는 마우스의 스트레인을 제조하고 유지시키기 위해 다양한 변형된 사육 또는 증식 계획을 이용한다는 것을 밝혔다. 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 대체를 위한 동형접합성 수컷 마우스의 낮은 생식력 또는 불임은 마우스 스트레인에서 이러한 변형을 유지하는 것을 어렵게 한다. 다양한 실시형태에서, 상기 스트레인의 유지는 대체를 위한 동형접합성 수컷 마우스에 의해 보여지는 불임 문제를 피하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스 스트레인을 유지시키기 위한 방법이 제공된다. 마우스 스트레인은 이소성 ADAM6 서열을 포함할 필요가 없으며, 다양한 실시형태에서 마우스 스트레인은 ADAM6의 녹아웃 (예: 기능성 녹아웃)에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다.
마우스 스트레인은 수컷 마우스에서 생식력의 감소 또는 상실을 초래하는 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함한다. 한 실시형태에서, 변형은 조절 영역 및/또는 ADAM6 유전자의 암호화 영역의 결실을 포함한다. 특정 실시형태에서, 변형은 이를 포함하는 수컷 마우스의 생식력을 감소 또는 제거시키는 내생적 ADAM6 유전자 (조절 및/또는 암호화 영역)의 변형을 포함하고; 특정 실시형태에서, 변형은 변형에 대해 동형접합성인 수컷 마우스의 생식력을 감소 또는 제거시킨다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 ADAM6 유전자의 녹아웃 (예: 기능성 녹아웃) 또는 결실에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 변형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 마우스로부터 세포를 분리하고, 숙주 배아에 공여자 세포를 사용하고, 대리모에 숙주 배아 및 공여자 세포를 잉태시키고, 대리모로부터, 유전적 변형을 포함하는 자손을 수득함으로써 유지된다. 한 실시형태에서, 공여자 세포는 ES 세포이다. 한 실시형태에서, 공여자 세포는 만능 세포, 예를 들면, 유도된 만능 세포이다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 변형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 마우스로부터 변형을 포함하는 핵산 서열을 분리시키고, 핵산 서열을 숙주 핵에 도입하고, 핵산 서열을 포함하는 세포 및 숙주 핵을 적합한 동물에 잉태시킴으로써 유지된다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 숙주 난모 세포 배아로 도입된다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 변형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 마우스로부터 핵을 분리시키고, 핵을 숙주 세포에 도입하고, 핵 및 숙주 세포를 적합한 동물에 잉태시켜 변형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 자손을 수득함으로써 유지된다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 유전적 변형을 포함하는 수컷 마우스로부터의 정자를 사용하는 암컷 마우스 (야생형, 변형에 대해 동형접합성 또는 변형에 대해 이형접합성)의 시험관내 수정(IVF)을 이용함으로써 유지된다. 한 실시형태에서, 수컷 마우스는 유전적 변형에 대해 이형접합성이다. 한 실시형태에서, 수컷 마우스는 유전적 변형에 대해 동형접합성이다.
한 실시형태에서, 마우스 스트레인은 유전적 변형에 대해 이형접합성인 수컷 마우스를 암컷 마우스와 함께 사육하여 유전적 변형을 포함하는 자손을 수득하고, 유전적 변형을 포함하는 수컷 및 암컷 자손을 확인하고, 유전적 변형에 대해 이형접합성인 수컷을 유전적 변형에 대해 야생형, 동형접합성 또는 이형접합성인 암컷과의 사육에 사용하여 유전적 변형을 포함하는 자손을 수득함으로써 유지된다. 한 실시형태에서, 유전적 변형에 대해 이형접합성인 수컷을 야생형 암컷, 유전적 변형에 대해 이형접합성인 암컷 또는 유전적 변형에 대해 동형접합성인 암컷과 함께 사육하는 단계는 마우스 스트레인에서 유전적 변형이 유지되도록 하기 위해 반복된다.
한 양상에서, 이형접합성 수컷 마우스를 생산하도록 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 서열로 대체된 마우스 스트레인을 사육하는 것을 포함하는, 상기 마우스 스트레인을 유지시키는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 이형접합성 수컷 마우스는 상기 스트레인 내에 유전적 변형이 유지되도록 사육된다. 특정 실시형태에서, 스트레인은 동형접합성 수컷과 야생형 암컷, 유전적 변형에 대해 동형접합성인 암컷 또는 유전적 변형에 대해 이형접합성인 암컷과의 어떠한 사육에 의해서도 유지되지 않는다.
ADAM6 단백질은 ADAM 패밀리의 단백질의 일원이며, 여기서, ADAM은 A Disintegrin And Metalloprotease (디스인테그린 및 메탈로프로테아제)의 두문자어이다. ADAM 패밀리의 단백질은 세포 부착을 포함한 다양한 기능과 함께 크고 다양하다. ADAM 패밀리의 일부 구성원은 정자생성 및 수정에 연루된다. 예를 들면, ADAM2는 단백질 퍼틸린(fertilin)의 아단위를 암호화하며, 이는 정자-난자 상호작용에 연루된다. ADAM3 또는 시리테스틴(cyritestin)은 투명대에 대한 정자 결합에 필요한 것으로 보인다. ADAM2 또는 ADAM3의 부재는 불임을 초래한다. ADAM2, ADAM3, 및 ADAM6이 마우스 정자 세포의 표면에서 컴플렉스를 형성한다고 주장되었다. 일반적으로 사람 VH 유전자 절편 VH1-2와 VH6-1 사이에서 발견되는 사람 ADAM6 유전자는 유사유전자인 것으로 보인다(도 12). 마우스에서, 마우스 VH와 DH 유전자 절편 사이의 유전자간 영역에서 발견되는 2개의 ADAM6 유전자 - ADAM6a 및 ADAM6b - 가 있으며, 마우스에서 ADAM6a와 ADAM6b 유전자는 주위의 면역글로불린 유전자 절편의 전사 방향과 반대의 전사 방향으로 배향된다(도 12). 마우스에서, 기능성 ADAM6 유전자좌가 정상적인 수정에 분명히 요구된다. 이어서, 기능성 ADAM6 유전자좌 또는 서열은 없어진 또는 비기능성 내생적 ADAM6 유전자좌를 갖는 수컷 마우스에서 나타나는 현저히 감소된 수정을 보완하거나 구제할 수 있는 ADAM6 유전자좌 또는 서열을 말한다.
ADAM6a 및 ADAM6b을 암호화하는 마우스에서의 유전자간 서열의 위치는, 내생적 마우스 중쇄를 변형시키는 경우, 유전자간 서열이 변형에 민감하게 한다. VH 유전자 절편이 결실되거나 대체되는 경우 또는 DH 유전자 절편이 결실되거나 대체되는 경우, 생성된 마우스는 생식력에 심각한 결여를 보일 가능성이 높다. 결함을 보완하기 위해, 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌의 변형에 기인한 ADAM6 활성 상실을 보완할 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 마우스를 변형시킨다. 다양한 실시형태에서, 보완 뉴클레오타이드 서열은 생식력 결여를 구제하는 마우스 ADAM6a, 마우스 ADAM6b, 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 것이다.
생식력을 구제하는 뉴클레오타이드 서열은 임의의 적합한 위치에 배치될 수 있다. 유전자간 영역에 또는 게놈의 임의의 적합한 위치에 (즉, 이소성으로) 배치될 수 있다. 한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 게놈으로 무작위로 통합되는 전이유전자에 도입될 수 있다. 한 실시형태에서, 서열은 에피솜으로, 즉, 마우스 염색체 상 보다는 별개의 핵산 상으로 유지될 수 있다. 적합한 위치는 전사적으로 허용되는 또는 활성인 위치, 예를 들면, ROSA26 유전자좌[참조: Zambrowicz et al ., 1997, PNAS USA 94:3789-3794], BT-5 유전자좌[참조: Michael et al ., 1999, Mech . Dev . 85:35-47], 또는 Oct4 유전자좌[참조: Wallace et al ., 2000, Nucleic Acids Res . 28:1455-1464]를 포함한다. 뉴클레오타이드 서열을 전사적으로 활성인 유전자좌에 대해 표적화하는 것이, 예를 들면, US 7,473,557(본원에 참조로 도입됨)에 기재되어 있다.
대안으로, 생식력을 구제하는 뉴클레오타이드 서열은 적절한 세포 및/또는 조직, 예를 들면, 생식 조직에서 최적의 발현을 용이하게 하도록 유도성 프로모터와 커플링될 수 있다. 예시적인 유도성 프로모터는 물리적(예: 열 쇼크 프로모터) 및/또는 화학적 수단(예: IPTG 또는 테트라사이클린)에 의해 활성화되는 프로모터를 포함한다.
또한, 뉴클레오타이드 서열의 발현은 특정 발달 단계에서 또는 특정 조직 내에서 발현되도록 다른 유전자에 연결될 수 있다. 이러한 발현은 뉴클레오타이드 서열을 특정 발달 단계에서 발현되는 유전자의 프로모터와 작동가능하게 연결시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 숙주 종의 게놈으로 조작되는 하나의 종으로부터의 면역글로불린 서열이 숙주 종으로부터의 CD19 유전자 (B 세포 특이적 유전자)의 프로모터 서열과 작동적으로 연결된다. 면역글로불린의 발현시 정확한 발달 단계에서 B 세포-특이적 발현이 달성된다.
삽입되는 뉴클레오타이드 서열의 왕성한 발현을 달성하기 위한 또 다른 방법은 구성적 프로모터를 사용하는 것이다. 예시적인 구성적 프로모터는 SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK 및 CAGG를 포함한다. 유사한 방식으로, 목적하는 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 단백질(들)의 높은 수준의 발현을 제공하는 선택된 구성적 프로모터와 작동가능하게 연결된다.
용어 "이소성"은 정상적으로는 자연에서 마주치지 않는 위치에서의 대체 또는 배치(예: 야생형 마우스에서 핵산 서열이 발견되는 위치와 동일한 위치가 아닌 위치에서의 핵산 서열의 배치)를 포함하는 것으로 의도된다. 다양한 실시형태에서, 이 용어는 대상체가 정상적 또는 적합한 위치를 벗어난다는 의미에서 사용된다. 예를 들면, 어구 " ... 을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열"은 마우스에서 정상적으로 마주치지 않는 위치에서 나타나는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 예를 들면, 마우스 ADAM6 단백질(또는 수컷 마우스에 동일하거나 유사한 생식력을 제공하는 이의 이종상동체, 상동체 또는 단편)을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열의 경우, 이 서열은 야생형 마우스에서 통상 발견되는 위치와는 상이한 마우스 게놈 위치에 배치될 수 있다. 이러한 경우, 마우스 서열의 신규한 서열 졉합부는 이 서열을 야생형 마우스에서의 위치와는 상이한 마우스 게놈 위치에 배치시킴으로써 생성될 것이다. 마우스 ADAM6의 기능성 상동체 또는 이종상동체는 ADAM6-/- 마우스에서 관찰되는 생식력의 상실(예: 교미에 의해 새끼를 생산하는 수컷 마우스의 능력 상실)을 구제하는 서열이다. 기능성 상동체 또는 이종상동체는 ADAM6a의 아미노산 서열 및/또는 ADAM6b의 아미노산 서열에 적어도 89% 이상의 동일성, 예를 들면, 99% 이하의 동일성을 갖는 단백질, 및 ADAM6a 및/또는 ADAM6b의 결실 또는 녹아웃을 포함하는 유전형을 갖는 마우스의 성공적인 교미 능력을 보완하거나 구제할 수 있는 단백질을 포함한다.
이소성 위치는 (예를 들면, 마우스 ADAM6 서열을 포함하는 전이유전자의 무작위 삽입과 함께) 임의의 곳에 위치되거나, 야생형 마우스에서의 위치와 가까운(단, 동일하지는 않은) 위치에(예를 들면, 천연 위치의 상류 또는 하류인 변형된 내생적 마우스 면역글로불린 유전자좌에서, 예를 들면, 변형된 면역글로불린 유전자좌 내이지만 상이한 유전자 절편 사이에, 또는 마우스 V-D 유전자간 서열의 상이한 위치에) 위치될 수 있다. 이소성 배치의 한 예는 사람화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내의 배치이다. 예를 들면, 하나 이상의 내생적 VH 유전자 절편이 사람 VH 유전자 절편으로 대체되어 내생적 ADAM6 서열이 제거되는 마우스는 사람 VH 유전자 절편을 포함하는 서열 내에 위치되는 마우스 ADAM6 서열을 갖도록 조작될 수 있다. 생성된 변형은 사람 유전자 서열 내에 (이소성) 마우스 ADAM6 서열을 생성할 수 있으며, 사람 유전자 서열 내의 마우스 ADAM6 서열의 (이소성) 배치는 사람 ADAM6 유사유전자의 위치와 가깝거나(즉, 2개의 V 절편 사이), 마우스 ADAM6 서열의 위치와 가까울 수 있다(즉, V-D 유전자간 영역 내). (이소성) 마우스 ADAM6 서열을 마우스의 배선 내의 사람 유전자 서열(예: 면역글로불린 유전자 서열) 내에 또는 이에 인접하게 연결시킴으로써 제조되는 생성 서열 접합부는 야생형 마우스 게놈 내의 동일하거나 유사한 위치와 비교하여 신규한 것일 것이다.
다양한 실시형태에서, ADAM6 또는 이의 이종상동체 또는 상동체가 결여되어 비-사람 동물이 불임되거나 비-사람 동물의 생식력이 실질적으로 감소된 비-사람 동물이 제공된다. 다양한 실시형태에서, ADAM6 또는 이의 이종상동체 또는 상동체의 결여는 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형에 기인한다. 생식력의 실질적 감소는, 예를 들면, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 생식력 감소 (예: 사육 횟수, 한배의 새끼당 새끼수, 해 (year)당 한배의 새끼 등)이다. 다양한 실시형태에서, 비-사람 동물은 비-사람 동물의 수컷에서 기능성인 마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편으로 보충되고, 여기서 보충된 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편은 생식력의 감소를 전부 또는 실질적인 부분을 구제한다. 실질적인 부분의 생식력 구제는 예를 들면, 비변형된(즉, ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체 또는 상동체에 대해 변형이 없는 동물) 중쇄 유전자좌와 비교하여, 적어도 70%, 80%, 또는 90% 이상의 생식력을 보이도록 생식력이 회복되는 것이다.
다양한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물(즉, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형에 기인하여, 기능성 ADAM6 또는 이의 이종상동체 또는 상동체가 결여된 동물)에 부여되는 서열은 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체 또는 상동체로부터 선택된다. 예를 들면, 마우스에서 ADAM6 기능의 상실은 한 실시형태에서 마우스 ADAM6 유전자를 가함으로써 구제된다. 한 실시형태에서, 마우스에서 ADAM6 기능의 상실은 마우스, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 상이한 스트레인 또는 종의 마우스, 임의의 종의 래트, 설치류와 관련하여 밀접하게 관련된 종의 이종상동체 또는 상동체를 가함으로써 구제되며; 여기서, 이종상동체 또는 상동체의 마우스에의 첨가는 ADAM6 기능의 상실 또는 ADAM6 유전자의 상실에 기인한 생식력의 상실을 구제한다. 다양한 실시형태에서, 다른 종으로부터의 이종상동체 및 상동체는 계통발생적으로 관련된 종으로부터 선택되며, 다양한 실시형태에서 내생적 ADAM6(또는 이의 이종상동체)와 약 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 또는 97% 이상의 동일성 백분율을 나타내며; (비-마우스에서) ADAM6-관련되거나 ADAM6 이종상동체-관련된 생식력의 상실을 구제한다. 예를 들면, ADAM6 기능이 결여된 유전적으로 변형된 수컷 래트 (예를 들면, 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역으로 대체된 내생적 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 래트 면역글로불린 중쇄 영역에 녹아웃을 갖는 래트)에서, 래트의 생식력 상실이 래트 ADAM6의 첨가, 또는 일부 실시형태에서, 래트 ADAM6의 이종상동체(예: 다른 래트 스트레인 또는 종으로부터 또는 한 실시형태에서 마우스로부터의 ADAM6 이종상동체)의 첨가에 의해 구제된다.
따라서, 다양한 실시형태에서, ADAM6 단백질(또는 이의 이종상동체 또는 상동체)을 암호화하는 핵산 서열 또는 이러한 핵산 서열과 작동적으로 연결된 조절 영역의 변형에 의해 생식력이 없거나 생식력이 감소된 유전적으로 변형된 동물은, 생식력의 상실을 보완하거나 회복시키는 핵산 서열이 동일한 종의 상이한 스트레인으로부터의 것이거나 계통발생적으로 관련된 종으로부터의 것인, 생식력의 상실을 보완하거나 회복시키는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 보완하는 핵산 서열은 ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편이다. 다양한 실시형태에서, 보완하는 ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 생식력 결함을 갖는 유전적으로 변형된 동물과 밀접히 관련된 비-사람 동물로부터의 것이다. 예를 들면, 유전적으로 변형된 동물이 특정 스트레인의 마우스인 경우, ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 다른 스트레인의 마우스 또는 관련된 종의 마우스로부터 수득될 수 있다. 한 실시형태에서, 생식력 결함을 갖는 유전적으로 변형된 동물이 쥐목(Rodentia)의 동물로인 경우, ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 쥐목의 다른 동물로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 생식력 결함을 갖는 유전적으로 변형된 동물은 미오모르파(Myomorpha) 아목의 동물(예: 날쥐(jerboas), 점핑 마우스, 마우스-유사 햄스터, 햄스터, 뉴 월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐(vole), 트루(true) 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐(gerbil), 가시(spiny) 마우스, 돌기가 있는(crested) 래트, 클라이밍(climbing) 마우스, 록(rock) 마우스, 흰-꼬리 래트, 말라가시(malagasy) 래트 및 마우스, 가시 겨울잠쥐(spiny dormouse), 몰 래트(mole rat), 대나무 래트(bamboo rat), 조코르(zokor))이며, ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 쥐목 또는 미오모르파 아목의 동물로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 디포도이대(Dipodoidea) 상과로부터의 동물이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 뮤로이대(Muroidea) 상과로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 뮤로이대 상과로부터의 동물이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 디포도이대 상과로부터의 것이다.
한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 설치류는 뮤로이대 상과로부터 선택되고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 뮤로이대 상과 내의 상이한 종으로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미시대(Calomyscidae)(예: 마우스-유사 햄스터), 크리세티대(Cricetidae)(예: 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 들쥐), 뮤리대(Muridae)(트루 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 가시 마우스, 돌기가 있는 래트), 네소미이대(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 록 마우스, 흰-꼬리 래트, 말라가시 래트 및 마우스), 플라타칸토미이대(Platacanthomyidae)(예: 가시 겨울잠쥐), 및 스팔라시대(Spalacidae)(예: 몰 래트, 대나무 래트, 및 조코르)로부터의 동물이고; ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 동일한 과의 상이한 종으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트 (뮤리대과)로부터 선택되고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 게루빌루스쥐, 가시 마우스 또는 돌기가 있는 래트로부터 선택된 종으로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 뮤리대과의 일원으로부터 마우스이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 뮤리대과의 상이한 종으로부터의 것이다. 특정 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류는 뮤리대과의 마우스이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 뮤리대과의 래트, 게르빌루스쥐, 가시 마우스 또는 돌기가 있는 래트로부터의 것이다.
다양한 실시형태에서, 어떤 하나의 과의 설치류의 하나 이상의 설치류 ADAM6 이종상동체 또는 상동체 또는 이의 기능성 단편은 ADAM6 이종상동체 또는 상동체가 결여된 동일한 과(예: 크리세티대(예: 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 들쥐); 뮤리대(예: 트루 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 가시 마우스, 돌기가 있는 래트))의 유전적으로 변형된 설치류에 대해 생식력을 회복시킨다.
다양한 실시형태에서, ADAM6 이종상동체, 상동체 및 이의 단편은 이종상동체, 상동체 또는 단편의 기능성은 ADAM6 활성이 결여된 유전적으로 변형된 수컷 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, ADAM6 또는 이의 이종상동체의 녹아웃을 포함하는 마우스 또는 래트)에 대해 생식력을 회복시키는지의 여부를 확인함으로써 평가된다. 다양한 실시형태에서, 기능성은 내생적 ADAM6 또는 이의 이종상동체 또는 상동체가 결여된 유전적으로 변형된 동물의 정자가 난관을 통해 이동하고 동일 종의 유전적으로 변형된 동물의 난자를 수정시키는 능력으로 정의된다.
다양한 양상에서, 마우스 ADAM6에 유사한 생식력 이점을 부여하는 단백질 (예: 수컷 마우스에서 기능성인 이의 이종상동체 또는 상동체 또는 단편)을 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 내생적 중쇄 가변 영역 유전자좌 또는 이의 부분의 결실 또는 대체를 포함하는 마우스가 제조될 수 있다. 이소성 뉴클레오타이드 서열은, 상이한 마우스 스트레인 또는 상이한 종, 예를 들면, 상이한 설치류 종의 ADAM6 상동체 또는 이종상동체(또는 이의 단편)인 단백질을 암호화하고, 생식력, 예를 들면, 특정 시간 기간에 걸쳐 한배의 새끼의 수의 증가 및/또는 한배의 새끼 당 새끼의 수의 증가, 및/또는 마우스의 난자를 수정시키도록 마우스 난관을 통해 이동하는 수컷 마우스의 정자 세포의 능력에 이점을 부여하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, ADAM6는 마우스 ADAM6 단백질과 적어도 89% 내지 99% 동일한(예: 마우스 ADAM6a 또는 마우스 ADAM6b와 적어도 89% 내지 99% 동일한) 상동체 또는 이종상동체이다. 한 실시형태에서, 이소성 뉴클레오타이드 서열은 마우스 ADAM6a와 적어도 89% 동일한 단백질, 마우스 ADAM6b와 적어도 89% 동일한 단백질 및 이의 조합으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 한 실시형태에서, 상동체 또는 이종상동체는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b와 약 89% 이상 동일하거나 동일하도록 변형된 래트, 햄스터, 마우스 또는 기니아 피그 단백질이다. 한 실시형태에서, 상동체 또는 이종상동체는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b이거나 이와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
사람화된 중쇄 마우스에서의 이소성 ADAM6
현재, 유전자 표적화의 발달, 예를 들면, 세균 인공 염색체(BAC)의 발달은 비교적 큰 게놈 단편의 재조합을 가능하게 한다. BAC 조작은 거대 결실 및 마우스 ES 세포에 거대 삽입을 만드는 것을 가능하게 하였다.
사람 항체를 제조하는 마우스가 입수가능하게 된지 좀 되었다. 이들 마우스가 사람 치료제 항체의 개발에 있어 중요한 진전을 나타내지만, 이들 마우스는 이들의 유용성을 제한하는 다수의 유의한 이상을 나타낸다. 예를 들면, 손상된 B 세포 발달을 나타낸다. 손상된 발달은 유전자전이 마우스와 야생형 마우스 간의 다양한 차이에 기인할 수 있다.
사람 항체는 클론 선별 동안 성숙, 증식 또는 생존을 위해 신호전달하는 마우스 세포 표면 상의 마우스 프리(pre) B 세포 또는 B 세포 수용체와 최적으로 상호작용하지 않을 수 있다. 완전 사람 항체는 마우스 Fc 수용체 시스템과 최적으로 상호작용하지 않을 수 있고; 마우스는 사람 Fc 수용체와 1 대 1 상응을 보이지 않는 Fc 수용체를 발현한다. 마지막으로, 완전 사람 항체를 제조하는 다양한 마우스는 모든 진성 마우스 서열, 예를 들면, 하류 인핸서 요소 및 야생형 B 세포 발달에 필요할 수 있는 다른 유전자좌 제어 요소를 포함하지 않는다.
완전 사람 항체를 제조하는 마우스는 일반적으로 어떤 점에서는 불능이 된 내생적 면역글로불린 유전자좌를 포함하며, 가변 및 불변 면역글로불린 유전자 절편을 포함하는 사람 전이유전자가 마우스 게놈의 무작위 위치에 도입된다. 유전자 절편이 기능성 면역글로불린 유전자를 형성하도록 재배열되지 않도록 내생적 유전자좌가 충분히 불능이 되는 한, 비록 손상된 B 세포 발달을 갖지만, 이러한 마우스에서 완전 사람 항체를 제조하는 목표는 달성될 수 있다.
사람 전이유전자 유전자좌로부터 완전 사람 항체를 제조하도록 강요되긴 하지만, 마우스에서 사람 항체를 생산하는 것은 분명히 유리하지 않은 과정이다. 일부 마우스에서, 이 과정은 유리하지 않아서 trans-스위칭 기작을 통해 키메라 사람 가변/마우스 불변 중쇄(단, 경쇄는 아님)를 형성한다. 이러한 기작에 의해서, 완전 사람 항체를 암호화하는 전사물은 사람 이소타입으로부터 마우스 이소타입으로 트랜스로 이소타입 스위칭을 겪는다. 이 과정은, 완전 사람 전이유전자가 손상되지 않은 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 카피를 보유하는 내생적 유전자좌로부터 떨어져서 위치되기 때문에, 트랜스로(in trans) 수행된다. 비록 이러한 마우스에서 trans-스위칭이 매우 분명하기는 하지만, 이 현상이 사실상 손상된 채로 남아 있는 B 세포 발달을 구조하기에는 여전히 불충분하다. 어떠한 경우에도, 트랜스-스위칭 현상은 경쇄에 대해서는 일어나지 않기 때문에, 이러한 마우스에서 만들어진 trans-스위칭된 항체는 완전 사람 경쇄를 보유하고; 아마도 트랜스-스위칭은 (비록 다르기는 하지만) 시스(cis)로의 정상적 이소타입 스위칭에 사용되는 내생적 유전자좌의 스위칭 서열에 의존적이다. 따라서, 완전 사람 항체를 제조하도록 조작된 마우스가 마우스 불변 영역을 갖는 항체를 만들도록 trans-스위칭 기작을 채택하는 경우에도, 정상적인 B 세포 발달을 구제하기에는 여전히 불충분하다.
항체-기반 사람 치료제를 제조하는데 있어서 1차적 관심은 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 이들을 목적하는 친화도로, 통상적으로 (항상은 아님) 고친화성으로 결합하는 유용한 가변 도메인을 확인하도록 충분히 다양한 사람 면역글로불린 가변 영역을 제조하는 것이다. VELOCIMMUNE® 마우스(본원에 기술됨)를 개발하기 전, 마우스 불변 영역과 함께 사람 가변 영역을 발현하는 마우스가 전이유전자로부터 사람 항체를 제조하는 마우스와 임의의 유의한 차이를 나타낼 것이라는 암시도 없었다. 그러나, 이러한 추정은 부정확했다.
내생적 마우스 유전자좌에서 마우스 면역글로불린 가변 영역이 사람 면역글로불린 가변 영역으로 정확히 대체된 VELOCIMMUNE® 마우스는 B 세포 발달에 있어 야생형 마우스와 놀랍고도 현저한 유사함을 나타낸다. 놀랍고도 굉장하게도, VELOCIMMUNE® 마우스는 야생형 마우스와는 단지 하나의 유의한 관점만 상이한 본질적으로 정상적인 야생형의 면역 반응을 나타내었다 - 면역화 반응에서 생성되는 가변 영역은 완전 사람의 것이다.
VELOCIMMUNE® 마우스는 내생적 유전자좌에서 마우스 면역글로불린 중쇄 (IgH) 및 면역글로불린 경쇄(예: κ 경쇄, Igκ)의 배선 가변 영역의 상응하는 사람 면역글로불린 가변 영역으로의 정확한 대규모 대체를 포함한다. 총체적으로, 약 6 Mb의 마우스 유전자좌가 약 1.5 Mb의 사람 게놈 서열로 대체된다. 이러한 정확한 대체로 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 중쇄 및 경쇄를 제조하는 하이브리드 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스가 생성된다. 마우스 VH-DH-JH 및 Vκ-Jκ 절편의 정확한 대체는 하이브리드 면역글로불린 유전자좌에서 플랭킹 마우스 서열이 온전하고 기능적이게 한다. 마우스의 체액 면역게는 야생형 마우스의 것과 유사하게 기능한다. 어떠한 유의한 관점에서도 B 세포 발달이 방해되지 않으며, 항원 시험처리(challenge)시 마우스에서 다양한 사람 가변 영역이 생성된다.
VELOCIMMUNE® 마우스는 중쇄 및 κ 경쇄에 대한 면역글로불린 유전자 절편이 사람 및 마우스에서 유사하게 재배열되기 때문에 (이는 이들의 유전자좌가 동일하다는 것을 말하고자 하는 것이 아니며 심지어 거의 분명히 이들은 동일하지 않다) 가능할 수 있다. 그러나, 유전자좌는, 중쇄 가변 유전자좌의 사람화가 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 절편을 포함하는 약 3백만 염기쌍의 인접한 마우스 서열을 사람 면역글로불린 유전자좌로부터의 기본적으로 동등한 서열을 커버하는 약 1백만 염기의 사람 게놈 서열로 대체함으로써 달성될 수 있는 정도로 충분히 유사하다.
일부 실시형태에서, 특정 마우스 불변 영역 유전자 서열의 사람 유전자 서열로의 추가의 대체(예: 마우스 CH1 서열의 사람 CH1 서열로의 대체 및 마우스 CL 서열의 사람 CL 서열로의 대체)는, 예를 들면, 완전 사람 항체 단편, 예를 들면, 완전 사람 Fab를 제조하기에 적합한 사람 가변 영역 및 부분적으로 사람 불변 영역을 갖는 항체를 제조하는 하이브리드 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스를 얻는다. 하이브리드 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스는 정상적인 가변 유전자 절편 재배열, 정상적인 체세포 초돌연변이 빈도 및 정상적인 클래스 스위칭을 나타낸다. 이들 마우스는 야생형 마우스와 구별이 불가능한 체액 면역계를 나타내고, 심지어 마우스에서 사람 가변 영역 유전자 절편의 완전 레퍼토리가 결여되어 있는 경우에도, B 세포 발달의 모든 단계에서 정상적인 세포 군집 및 정상적인 림프 기관 구조를 나타낸다. 이들 마우스의 면역화로 다양한 가변 유전자 절편 사용을 나타내는 왕성한 체액 반응이 초래된다.
마우스 배선 가변 영역 유전자 절편의 정확한 대체는 사람 면역글로불린 유전자좌를 부분적으로 갖는 마우스를 제조하는 것을 가능하게 한다. 부분적인 사람 면역글로불린 유전자좌가 재배열되고 초돌연변이되며 정상적인 클래스 스위칭되기 때문에, 부분적인 사람 면역글로불린 유전자좌는 사람 가변 영역을 포함하는 마우스에서 항체를 생성한다. 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 확인하고, 클로닝한 후, 임의의 선택 서열, 예를 들면, 특정 용도에 적합한 임의의 면역글로불린 이소타입과 융합함으로써 전적으로 사람 서열로부터 유도되는 항체 또는 항원-결합 단백질을 생성할 수 있다.
재조합 방법에 의한 대규모 사람화는, 본질적으로 모든 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 절편을 포함하는 3 Mb 이하의 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 일부 또는 본질적으로 모든 사람 VH, DH, 및 JH 유전자 절편을 포함하는 1 Mb 이하의 사람 게놈 서열을 갖는 동등한 사람 유전자 절편으로 정확히 대체하기 위해 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 변형시키는데 사용하였다. 본질적으로 모든 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 암호화하는 2개의 반복물 중 하나를 포함하는 사람 게놈의 1/2 Mb 이하의 절편을, 본질적으로 모든 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 포함하는 3 Mb의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 절편으로 대체하는데 사용하였다.
이러한 대체된 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 최말단 3' VH 유전자 절편과 최말단 5' DH 유전자 절편 사이에서 일반적으로 발견되는 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌의 파괴 또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 영역에서의 파괴는 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌의 기능성을 감소시키거나 제거시킬 수 있다. 사람 중쇄 레퍼토리의 최말단 3' VH 유전자 절편이 대체에 사용되는 경우, 사람 ADAM6 유사유전자인 것으로 보이는 유사유전자를 포함하는 유전자간 영역이 이들 VH 유전자 절편 사이, 즉 사람 VH1-2와 VH1-6 사이에 존재한다. 그러나, 이러한 사람 유전자간 서열을 포함하는 수컷 마우스는 생식력 감소를 나타낸다.
상기 기술되는 바와 같은 대체된 유전자좌를 포함하고 또한 마우스 ADAM6를 암호화하는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스가 기술되며, 여기서, 상기 마우스는 본질적으로 정상적인 생식력을 나타낸다. 한 실시형태에서, 이소성 핵산 서열은 변형된 내생적 중쇄 유전자좌에서 사람 VH1-2와 사람 VH6-1 사이에 배치되는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b 서열 또는 이들의 기능성 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 이소성 핵산 서열은 변형된 내생적 중쇄 유전자좌에서 사람 VH1-2와 사람 VH6-1 사이에 배치되는 서열번호 3이다. 서열번호 3의 ADAM6 유전자의 전사 방향은 주위의 사람 VH 유전자 절편의 전사 방향에 대해 반대이다. 비록 본원에서의 예시는 지시된 사람 VH 유전자 절편 사이에 이소성 서열을 배치함으로써 생식력의 구제를 나타내지만, 당업자라면 마우스 게놈 내의 임의의 적합한 전사적으로 허용되는 유전자좌에서 (또는 심지어 염색체외적으로) 이소성 서열의 대체에 의해 수컷 마우스에서 생식력을 유사하게 구제하는 것을 예상할 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
마우스 ADAM6 유전자 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 포함하는 이소성 서열로 기능성 ADAM6 유전자좌가 결여된 마우스를 보완하는 현상이 비기능성인 또는 최소한으로 기능성 내생적 ADAM6 유전자좌를 갖는 임의의 마우스를 구제하는데 적용할 수 있는 일반적인 방법이다. 따라서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 ADAM6-파괴 변형을 포함하는 매우 많은 마우스를 본 발명의 조성물 및 방법으로 구제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 내생적 ADAM6 기능을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 다양한 변형을 갖는 마우스를 포함한다. 일부 (비-제한적) 예시가 본원에 제공된다. 기술되는 VELOCIMMUNE® 마우스에 추가하여, 예를 들면, 중쇄 유전자좌를 다양한 방식으로 변형시키는 경우, ADAM6와 관련된 조성물 및 방법이 많은 적용에 사용될 수 있다.
한 양상에서, 기능성 ADAM6 단백질 (또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로의 대체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 절편 및 JH 유전자 절편의 사람 DH 및 사람 JH 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 마우스가 제공되며, 여기서 상기 마우스는 CH1 및/또는 힌지 영역이 결여된다. 한 실시형태에서, 마우스는 (a) 사람 VH - 마우스 CH1 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3; (b) 사람 VH - 마우스 힌지 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3; 및 (c) 사람 VH - 마우스 CH2 - 마우스 CH3으로부터 선택되는 면역글로불린 쇄의 이량체인 단일 가변 도메인 결합 단백질을 제조한다.
한 양상으로, 생식력을 구제하는 뉴클레오타이드 서열은, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편(mVH의 절편, mDH의 절편, 및/또는 mJH의 절편)이 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편 (hVH의 절편, hDH의 절편, 및/또는 hJH의 절편)으로 대체된 마우스에서 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 내에(예를 들면, 사람 VH1-2와 VH1-6 유전자 절편 사이에) 배치되며, 마우스는 추가로 하나 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편(mVκ의 절편 및/또는 mJκ의 절편)이 하나 이상의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편(hVκ의 절편 및/또는 hJκ의 절편)으로 대체된다.
한 실시형태에서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편은 약 3 Mb의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 적어도 89개의 VH 유전자 절편, 적어도 13개의 DH 유전자 절편, 적어도 4개의 JH 유전자 절편 또는 이들의 조합을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편은 약 1 Mb의 사람 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편은 사람 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 적어도 80개의 VH 유전자 절편, 적어도 27개의 DH 유전자 절편, 적어도 6개 JH 유전자 절편 또는 이들의 조합을 포함한다.
한 실시형태에서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편은 약 3 Mb의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편은 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 적어도 137개의 Vκ 유전자 절편, 적어도 5개의 Jκ 유전자 절편 또는 이들의 조합을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편은 약 1/2 Mb의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편은 사람 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 (면역글로불린 κ 불변 영역에 대해) 근위 반복물을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편은 사람 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 적어도 40개의 Vκ 유전자 절편, 적어도 5개의 Jκ 유전자 절편 또는 이들의 조합을 포함한다.
한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 2개의 사람 면역글로불린 유전자 절편 사이에 배치된다. 특정 실시형태에서, 2개의 사람 면역글로불린 유전자 절편은 중쇄 유전자 절편이다. 한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 VELOCIMMUNE® 마우스에서 사람 VH1-2 유전자 절편과 사람 VH1-6 유전자 절편 사이에 배치된다[참조: US 6,596,541 및 US 7,105,348, 본원에 참조로 포함됨]. 한 실시형태에서, 이렇게 변형된 VELOCIMMUNE® 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 절편의 적어도 80개의 사람 VH 유전자 절편, 27개의 사람 DH 유전자 절편 및 6개의 사람 JH 유전자 절편으로의 대체, 및 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 절편의 적어도 40개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 5개의 사람 Jκ 유전자 절편으로의 대체를 포함한다.
한 양상에서, 기능성 마우스 ADAM6 유전자좌(또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편)는 내생적 마우스 VH 유전자 절편을 대체하는 사람 VH 유전자 절편의 중간에 존재한다. 한 실시형태에서, 적어도 89개의 마우스 VH 유전자 절편이 제거되고, 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로 대체되고, 마우스 ADAM6 유전자좌가 사람 VH 유전자 절편의 3' 말단에 바로 인접하게 또는 2개의 사람 VH 유전자 절편 사이에 존재한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 삽입되는 사람 VH 유전자 절편의 3' 말단의 약 20 kb(kilo bases) 내지 약 40 kb 내의 2개의 VH 유전자 절편 사이에 존재한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 삽입되는 사람 VH 유전자 절편의 3' 말단의 약 29 kb 내지 약 31 kb 내의 2개의 VH 유전자 절편 사이에 존재한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 삽입되는 사람 VH 유전자 절편의 3' 말단의 약 30 kb 내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 삽입되는 사람 VH 유전자 절편의 3' 말단의 약 30,184 bp 내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 대체는 사람 VH 유전자 절편 VH1-2 및 VH6-1을 포함하고, 마우스 ADAM6 유전자좌는 VH1-2 유전자 절편의 하류 및 VH6-1 유전자 절편의 상류에 존재한다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 사람 VH1-2 유전자 절편과 사람 VH6-1 유전자 절편 사이에 존재하고, 여기서 마우스 ADAM6 유전자좌의 5' 말단은 사람 VH1-2 유전자 절편의 3' 말단으로부터 약 13,848 bp이고, ADAM6 유전자좌의 3' 말단은 사람 VH6-1 유전자 절편의 5' 말단으로부터 약 29,737 bp이다. 특정 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 마우스의 세포 내에 ADAM6 기능을 부여하는 서열번호 3 또는 이의 단편을 포함한다. 이어서, 특정 실시형태에서, 사람 VH 유전자 절편의 배열은 (사람 VH 유전자 절편의 전사 방향에 대해 상류로부터 하류로) 사람 VH1-2 - 마우스 ADAM6 유전자좌 -사람 VH6-1이다. 특정 실시형태에서, 사람 VH1-2와 사람 VH6-1 사이의 ADAM6 유사유전자가 마우스 ADAM6 유전자좌로 대체된다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 배향이 사람 VH 유전자 절편의 배향과 비교하여 전사 방향에 대해 반대이다. 대안으로, 마우스 ADAM6 유전자좌는 최말단 3' 사람 VH 유전자 절편과 최말단 5' DH 유전자 절편 사이의 유전자 영역에 존재한다. 이는 최말단 5' DH 절편이 마우스 또는 사람의 절편인 경우에 존재할 수 있다.
마찬가지로, 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 마우스 VH 유전자 절편을 대체시키는 하나 이상의 사람 VL 유전자 절편(예: Vκ 또는 Vλ 절편)으로 변형된 마우스는, 본원에서 기술되는 바와 같이, 예를 들면, 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 하류 상동성 아암을 갖는 표적화 벡터를 사용함으로써, 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌를 유지시키거나, 손상된 마우스 ADAM6 유전자좌를 2개의 사람 VL 유전자 절편 사이 또는 사람 VL 유전자 절편과 DH 유전자 절편(사람 또는 마우스, 예를 들면, Vλ + m/hDH), 또는 J 유전자 절편(사람 또는 마우스, 예를 들면, Vκ + JH) 사이에 위치되는 이소성 서열로 대체시키도록 변형될 수 있다. 한 실시형태에서, 대체는 2개 이상의 사람 VL 유전자 절편을 포함하고, 마우스 ADAM6 유전자좌 또는 이의 기능성 단편은 2개의 최말단 3' VL 유전자 절편 사이에 존재한다. 이어서, 특정 실시형태에서, 사람 VL 유전자 절편의 배열은 (사람 유전자 절편의 전사 방향에 대해 상류로부터 하류로) 사람 VL3'-1 - 마우스 ADAM6 유전자좌 - 사람 VL3'이다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 유전자좌의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 배향은 사람 VL 유전자 절편의 배향과 비교하여 전사 방향에 대해 반대이다. 대안으로, 마우스 ADAM6 유전자좌는 최말단 3' 사람 VL 유전자 절편과 최말단 5' DH 유전자 절편 사이의 유전자간 영역에 존재한다. 이는 최말단 5' DH 절편이 마우스 또는 사람의 절편인 경우일 수 있다.
한 양상에서, 하나 이상의 내생적 마우스 VH 유전자 절편이 대체되고 적어도 하나의 내생적 마우스 DH 유전자 절편을 포함하는 마우스가 제공된다. 이러한 마우스에서, 내생적 마우스 VH 유전자 절편의 변형은 하나 이상의 최말단 3' VH 유전자 절편의 변형은 포함하지만, 최말단 5' DH 유전자 절편의 변형은 포함하지 않을 수 있으며, 여기서, 하나 이상의 최말단 3' VH 유전자 절편이 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌를 파괴하거나 비기능성이 되게 하지 않도록 주의해야 한다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로의 대체를 포함하며, 마우스는 하나 이상의 내생적 DH 유전자 절편 및 기능성 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌를 포함한다.
다른 실시형태에서, 마우스는 마우스의 내생적인 최말단 3' VH 유전자 절편의 변형 및 하나 이상의 내생적 마우스 DH 유전자 절편의 변형을 포함하고, 변형은 내생적 ADAM6 유전자좌가 기능성을 보유하는 정도로 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌의 통합성을 유지하도록 수행된다. 하나의 예시에서, 이러한 변형은 2단계로 수행된다: (1) 상류 상동성 아암 및 기능성 마우스 ADAM6 유전자좌 전부 또는 일부를 포함하는 하류 상동성 아암을 갖는 표적화 벡터를 사용하여 최말단 3' 내생적 마우스 VH 유전자 절편을 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로 대체시키는 단계; (2) 이어서, 마우스 ADAM6 유전자좌의 전부 또는 기능성 부분을 포함하는 상류 상동성 아암을 갖는 표적화 벡터로 내생적 마우스 DH 유전자 절편을 대체시키는 단계.
다양한 양상에서, 마우스 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 이소성 서열을 포함하는 마우스를 사용하는 것은, 변형이 내생적 마우스 ADAM6의 기능을 파괴하는 경우에 유용하다. 내생적 마우스 ADAM6 기능을 파괴할 가능성은 마우스 면역글로불린 유전자좌에 변형을 가하는 경우, 특히 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 주위 서열을 변형시키는 경우 높다. 따라서, 이러한 마우스는 전부 또는 부분적으로 결실되거나, 전부 또는 부분적으로 사람화되거나, 전부 또는 부분적으로(예를 들면, Vκ 또는 Vλ 서열로) 대체되는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 갖도록 하는 경우 특히 유리하다. 후술되는 마우스에 대해 기술되는 유전적 변형을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
마우스 ADAM6 단백질, 또는 마우스 ADAM6 단백질의 생식력 이점을 부여하는 실질적으로 동일하거나 유사한 단백질을 암호화하는 이소성 서열을 포함하는 마우스는 내생적 마우스 ADAM6 서열을 파괴하거나 결실시키는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌에 대한 변형과 관련하여 특히 유용하다. 비록 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 항체를 발현하는 마우스와 관련하여 주로 기술하였지만, 이러한 마우스는 내생적 마우스 ADAM6 유전자를 파괴하는 임의의 유전적 변형과 관련하여 유용하다. 당업자는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 변형을 포함하는 다양한 유전적으로 변형된 마우스를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 이들은, 예를 들면, 다른 변형과 무관하게 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자 절편의 전부 또는 일부가 결실 또는 대체된 마우스를 포함한다. 비-제한적 예가 후술된다.
일부 양상에서, 마우스에서 기능성인 이소성 마우스, 설치류, 또는 기타 ADAM6 유전자 (또는 이종상동체, 상동체 또는 단편) 및 하나 이상의 사람 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자 절편을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 마우스에서 기능성인 다른 ADAM6 유전자 이종상동체, 상동체 또는 단편은 소, 개, 영장류, 토끼 또는 다른 비-사람 서열로부터의 서열을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 기능성 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로의 대체; 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 DH 유전자 절편으로의 대체; 및 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 JH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 JH 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다.
한 실시형태에서, 마우스는 추가로 마우스 CH1 뉴클레오타이드 서열의 사람 CH1 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 마우스 힌지 뉴클레오타이드 서열의 사람 힌지 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌 (VL 및 JL)의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌로의 대체를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 마우스는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 뉴클레오타이드 서열의 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, VL, JL, 및 CL은 면역글로불린 κ 경쇄 서열이다. 특정 실시형태에서, 마우스는 사람 힌지 및 사람 CH1 서열에 융합된 마우스 CH2 및 마우스 CH3 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함하여, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 (a) 사람 가변 영역, 사람 CH1 영역, 사람 힌지 영역, 및 마우스 CH2 및 마우스 CH3 영역을 갖는 중쇄; 및 (b) 사람 가변 도메인 및 사람 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 유전자를 포함하는 결합 단백질을 암호화하는 유전자를 형성하도록 재배열된다.
한 양상에서, 기능성 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VL 유전자 절편으로의 대체, 및 임의로 모든 또는 실질적으로 모든 DH 유전자 절편 및/또는 JH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 DH 유전자 절편 및/또는 사람 JH 유전자 절편으로의 대체, 또는 임의로 모든 또는 실질적으로 모든 DH 유전자 절편 및 JH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 JL 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다.
한 실시형태에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 절편의 하나 이상의 VL, 하나 이상의 DH, 및 하나 이상의 J 유전자 절편 (예: Jκ 또는 Jλ)으로의 대체를 포함하며, 여기서, 상기 유전자 절편은 내생적 마우스 힌지 영역에 작동적으로 연결되고, 여기서, 마우스는 5'부터 3'로 전사 방향으로 사람 VL - 사람 또는 마우스 DH - 사람 또는 마우스 J - 마우스 힌지 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3을 포함하는 재배열된 면역글로불린 쇄 유전자를 형성한다. 한 실시형태에서, J 영역은 사람 Jκ 영역이다. 하나의 실시형태에서, J 영역은 사람 JH 영역이다. 한 실시형태에서, J 영역은 사람 Jλ 영역이다. 한 실시형태에서, 사람 VL 영역은 사람 Vλ 영역 및 사람 Vκ 영역으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 마우스는 마우스 또는 사람 불변 영역 및 사람 Vκ, 사람 DH 및 사람 Jκ; 사람 Vκ, 사람 DH, 및 사람 JH; 사람 Vλ, 사람 DH, 및 사람 Jλ; 사람 Vλ, 사람 DH, 및 사람 JH; 사람 Vκ, 사람 DH, 및 사람 Jλ; 사람 Vλ, 사람 DH, 및 사람 Jκ로부터 유도되는 가변 영역을 갖는 단일 가변 도메인 항체를 발현한다. 특정 실시형태에서, 재조합 인식 서열은 생산적 재배열이 인용된 V, D, 및 J 유전자 절편 사이에서 또는 인용된 V 및 J 유전자 절편 사이에서 일어나는 것이 가능하도록 변형된다.
한 양상에서, 기능성 ADAM6 단백질 (또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VL 유전자 절편으로의 대체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 절편 및 JH 유전자 절편의 사람 JL 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 마우스가 제공되며, 여기서 상기 마우스에는 CH1 및/또는 힌지 영역이 결여되어 있다.
한 실시형태에서, 마우스에는 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 마우스에는 힌지 영역을 암호화하는 서열이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 마우스에는 CH1 도메인 및 힌지 영역을 암호화하는 서열이 결여되어 있다.
특정 실시형태에서, 마우스는 마우스 CH3 도메인에 부착되는 마우스 CH2 도메인에 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(λ 또는 κ)을 포함하는 결합 단백질을 발현한다.
한 양상에서, 기능성 ADAM6 단백질 (또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편)을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VL 유전자 절편으로의 대체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 및 JH 유전자 절편의 사람 JL 유전자 절편으로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다.
한 실시형태에서, 마우스는 CH1 영역, 힌지 영역, CH1 및 힌지 영역, 또는 CH1 영역 및 힌지 영역 및 CH2 영역을 암호화하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열의 결실을 포함한다.
한 실시형태에서, 마우스는 하기로부터 선택되는 동종이량체를 포함하는 단일 가변 도메인 결합 단백질을 제조한다: (a) 사람 VL - 마우스 CH1 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3; (b) 사람 VL - 마우스 힌지 - 마우스 CH2 - 마우스 CH3; (c) 사람 VL - 마우스 CH2 - 마우스 CH3.
한 양상에서, 무능력해지거나 결실된 내생적 마우스 ADAM6 유전자좌를 포함하는 무능력해진 내생적 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스가 제공되며, 여기서, 상기 마우스는 사람 또는 마우스 또는 사람/마우스 또는 다른 키메라 항체를 발현하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 마우스 게놈으로 무작위로 통합되는 전이유전자 상에 존재한다. 한 실시형태에서, 핵산 서열은 야생형 마우스에서는 발견되지 않는 에피솜(예: 염색체) 상에 존재한다.
한 실시형태에서, 마우스는 무능력해진 내생적 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 내생적 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄 유전자좌로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 마우스는 무능력해진 내생적 κ 경쇄 유전자좌 및 무능력해진 λ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서, 상기 마우스는 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 사람 면역글로불린 경쇄 도메인을 포함하는 항체를 발현한다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 도메인은 사람 κ 경쇄 도메인 및 사람 λ 경쇄 도메인으로부터 선택된다.
한 양상에서, 유전적으로 변형된 동물에서 기능성인 ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 발현하고 키메라 항체를 발현하는 유전적으로 변형된 동물이 제공된다.
한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 마우스 및 래트로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 마우스이고, ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체 또는 상동체는 유전적으로 변형된 동물과 상이한 스트레인인 마우스 스트레인으로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 크리세티대과의 설치류(예를 들면, 햄스터, 뉴 월드 래트 또는 마우스, 들쥐)이고, ADAM6 단백질 이종상동체 또는 상동체는 뮤리대과의 설치류(예: 트루 마우스 또는 래트, 게르빌루스쥐, 가시 마우스, 돌기가 있는 래트)로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 뮤리대과의 설치류이고, ADAM6 단백질 이종상동체 또는 상동체는 크리세티대과의 설치류로부터의 것이다.
한 실시형태에서, 키메라 항체는 사람 가변 도메인 및 설치류의 불변 영역 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 설치류는 크리세티대과의 설치류 및 뮤리대과의 설치류로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 크리세티대과의 설치류 및 뮤리대과의 설치류는 마우스이다. 특정 실시형태에서, 크리세티대과의 설치류 및 뮤리대과의 설치류는 래트이다. 한 실시형태에서, 키메라 항체는 사람 가변 도메인 및 마우스 또는 래트로부터 선택되는 동물로부터의 불변 도메인을 포함하고; 특정 실시형태에서, 마우스 또는 래트는 크리세티대과 및 뮤리대과로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 키메라 항체는 사람 중쇄 가변 도메인, 사람 경쇄 가변 도메인 및 마우스 및 래트로부터 선택되는 설치류로부터 유도되는 불변 영역 서열을 포함하며, 여기서 상기 사람 중쇄 가변 도메인 및 사람 경쇄는 동족체(cognate)이다. 특정 실시형태에서, 동족체는 사람 중쇄 및 사람 경쇄 가변 도메인이 사람 경쇄 가변 도메인 및 사람 중쇄 가변 도메인을 함께 발현하고 가변 도메인을 개별적 B 세포의 표면 상에 함께 제시하는 단일 B 세포로부터의 것인 것을 포함한다.
한 실시형태에서, 키메라 항체는 면역글로불린 유전자좌로부터 발현된다. 한 실시형태에서, 키메라 항체의 중쇄 가변 도메인은 재배열된 내생적 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 발현된다. 한 실시형태에서, 키메라 항체의 경쇄 가변 도메인은 재배열된 내생적 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 발현된다. 한 실시형태에서, 키메라 항체의 중쇄 가변 도메인 및/또는 키메라 항체의 경쇄 가변 도메인은 재배열된 전이유전자(예: 내생적 면역글로불린 유전자좌와는 다른 유전자좌에서 동물의 게놈으로 통합된 재배열되지 않은 핵산 서열로부터 유도되는 재배열된 핵산 서열)로부터 발현된다. 한 실시형태에서, 키메라 항체의 경쇄 가변 도메인은 재배열된 전이유전자(예: 내생적 면역글로불린 유전자좌와는 다른 유전자좌에서 동물의 게놈으로 통합된 재배열되지 않은 핵산 서열로부터 유도되는 재배열된 핵산 서열)로부터 발현된다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 전사적으로 활성인 유전자좌, 예를 들면, ROSA26 유전자좌, 예를 들면, 뮤린(예: 마우스) ROSA26 유전자좌로부터 발현된다.
한 양상에서, 사람화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-사람 동물이 제공되고, 여기서, 상기 사람화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 비-사람 ADAM6 서열 또는 이의 이종상동체 또는 상동체를 포함한다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택되는 설치류이다.
한 실시형태에서, 비-사람 ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 마우스 ADAM6 서열에 대해 이종상동체 및/또는 상동성인 서열이고, 여기서, 상기 이종상동체 및 상동체는 비-사람 동물에서 기능성이다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택되고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택되는 비-사람 동물로부터의 것이다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 상이한 마우스종, 래트 및 햄스터로부터 선택되는 동물로부터의 것이다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 래트이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 상이한 래트종, 마우스 및 햄스터로부터 선택되는 설치류로부터의 것이다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 햄스터이고, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 상이한 햄스터종, 마우스 및 래트로부터 선택되는 설치류로부터의 것이다.
특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 미오모르파 아목으로부터의 것이고, ADAM6 서열은 디포도이대 상과의 설치류 및 뮤로이대 상과의 설치류로부터 선택되는 동물로부터의 것이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 뮤로이대 상과의 마우스이며, ADAM6 이종상동체 또는 상동체는 뮤로이대 상과의 마우스, 래트 또는 햄스터로부터의 것이다.
한 실시형태에서, 사람화된 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편, 하나 이상의 사람 DH 유전자 절편 및 하나 이상의 사람 JH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편, 하나 이상의 사람 DH 유전자 절편 및 하나 이상의 사람 JH 유전자 절편은 하나 이상의 사람, 키메라 및/또는 설치류(예: 마우스 또는 래트) 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된다. 한 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 마우스로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 래트로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 햄스터로부터의 것이다. 한 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 불변 영역 유전자는 힌지, CH2, 및 CH3 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 비-사람 ADAM6 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 서열과 인접한다. 한 실시형태에서, 비-사람 ADAM6 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 서열 내에 위치된다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 중쇄 서열은 V, D 및/또는 J 유전자 절편을 포함한다.
한 실시형태에서, 비-사람 ADAM6 서열은 2개의 V 유전자 절편 사이에 위치된다. 한 실시형태에서, 비-사람 ADAM6 서열은 V와 D 유전자 절편 사이에 병치된다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 서열은 V와 J 유전자 절편 사이에 위치된다. 한 실시형태에서, 마우스 ADAM6 서열은 D와 J 유전자 절편 사이에 병치된다.
한 양상에서, 면역글로불린 유전자좌로부터의 사람 VL 도메인과 함께 사람 VH 도메인 동족체를 발현하는 B 세포를 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 제공되며, 여기서 비-사람 동물은 면역글로불린 유전자좌로부터의 비-면역글로불린 비-사람 단백질을 발현한다. 한 실시형태에서, 비-면역글로불린 비-사람 단백질은 ADAM 단백질이다. 특정 실시형태에서, ADAM 단백질은 ADAM6 단백질 또는 이의 상동체, 이종상동체 또는 기능성 단편이다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 설치류(예: 마우스 또는 래트)이다. 한 실시형태에서, 설치류는 뮤리대과이다. 한 실시형태에서, 설치류는 뮤리대 아과이다. 특정 실시형태에서, 뮤리대 아과의 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 비-면역글로불린 비-사람 단백질은 설치류 단백질이다. 한 실시형태에서, 설치류는 뮤리대과이다. 한 실시형태에서, 설치류는 뮤리대 아과이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 사람 VH 및 VL 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 직접적으로 또는 링커를 통해 부착된다. 특정 실시형태에서, 불변 도메인 서열은 힌지, CH2, CH3 및 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 VL 도메인은 Vκ 또는 Vλ 도메인으로부터 선택된다.
한 양상에서, 사람 면역글로불린 서열을 배선에 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 제공되며, 여기서 수컷 비-사람 동물의 정자는 생체내 이동 결함을 특징으로 한다. 한 실시형태에서, 생체내 이동 결함은 동일종의 암컷 비-사람 동물의 자궁으로부터 난관을 통해 이동하는 수컷 비-사람 동물의 정자의 무능력을 포함한다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물에는 ADAM6 단백질 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, ADAM6 단백질 또는 이의 기능성 단편은 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 단백질 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 설치류이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다.
한 양상에서, ADAM6 단백질 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는 비-사람 서열에 인접한 사람 면역글로불린 서열을 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 설치류이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 면역글로불린 중쇄 서열이다. 한 실시형태에서, 면역글로불린 서열은 하나 이상의 VH 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 하나 이상의 DH 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 하나 이상의 JH 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 하나 이상의 VH 유전자 절편, 하나 이상의 DH 유전자 절편 및 하나 이상의 JH 유전자 절편을 포함한다.
한 실시형태에서, 면역글로불린 서열은 천연 사람 레퍼토리에서 고빈도인 하나 이상의 VH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 VH 유전자 절편은 2개 미만의 VH 유전자 절편, 3개 미만의 VH 유전자 절편, 4개 미만의 VH 유전자 절편, 5개 미만의 VH 유전자 절편, 6개 미만의 VH 유전자 절편, 7개 미만의 VH 유전자 절편, 8개 미만의 VH 유전자 절편, 9개 미만의 VH 유전자 절편, 10개 미만의 VH 유전자 절편, 11개 미만의 VH 유전자 절편, 12개 미만의 VH 유전자 절편, 13개 미만의 VH 유전자 절편, 14개 미만의 VH 유전자 절편, 15개 미만의 VH 유전자 절편, 16개 미만의 VH 유전자 절편, 17개 미만의 VH 유전자 절편, 18개 미만의 VH 유전자 절편, 19개 미만의 VH 유전자 절편, 20개 미만의 VH 유전자 절편, 21개 미만의 VH 유전자 절편, 22개 미만의 VH 유전자 절편 또는 23개 미만의 VH 유전자 절편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 VH 유전자 절편은 5개의 VH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 VH 유전자 절편은 10개의 VH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 VH 유전자 절편은 15개의 VH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 VH 유전자 절편은 20개의 VH 유전자 절편을 포함한다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 및 VH3-74로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 및 VH5-51로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 및 VH5-51로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 및 VH4-59로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 및 VH4-39로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH1-18, VH3-23 및 VH4-39로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH3-21, VH3-23 및 VH3-30으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, VH 유전자 절편은 VH3-23, VH3-30 및 VH4-39로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 적어도 18개의 VH 유전자 절편, 27개의 DH 유전자 절편 및 6개의 JH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 적어도 39개의 VH 유전자 절편, 27개의 DH 유전자 절편 및 6개의 JH 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 적어도 80개의 VH 유전자 절편, 27개의 DH 유전자 절편 및 6개의 JH 유전자 절편을 포함한다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이고, 마우스는 내생적 마우스 VH 유전자 절편의 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로의 대체를 포함하고, 여기서 상기 사람 VH 유전자 절편은 마우스 CH 영역 유전자에 작동적으로 연결되어 마우스는 사람 VH 유전자 절편을 재배열하고 사람 VH 도메인 및 마우스 CH를 포함하는 역-키메라 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 한 실시형태에서, 재배열되지 않는 마우스 VH 유전자 절편의 90 내지 100%는 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 대체된다. 특정 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내생적 마우스 VH 유전자 절편은 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 대체는 적어도 19개, 적어도 39개, 또는 적어도 80개 또는 81개의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로의 대체이다. 한 실시형태에서, 대체는 적어도 12개의 기능적인 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편, 적어도 25개의 기능적인 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편, 또는 적어도 43개의 기능적인 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 절편으로의 대체이다. 한 실시형태에서, 마우스는 모든 마우스 DH 및 JH 절편의 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 DH 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 JH 절편으로의 대체를 포함한다. 한 실시형태에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 DH 절편은 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 JH 절편은 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편은 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 절편 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 서열은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스, 래트, 또는 햄스터)의 배선 내의 불변 영역과 작동적으로 연결된다. 한 실시형태에서, 불변 영역은 사람, 키메라 사람/마우스 또는 키메라 사람/래트 또는 키메라 사람/햄스터, 마우스, 래트, 또는 햄스터 불변 영역이다. 한 실시형태에서, 불변 영역은 설치류(예: 마우스 또는 래트 또는 햄스터) 불변 영역이다. 특정 실시형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 다양한 실시형태에서, 불변 영역은 적어도 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 중쇄 서열은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트 또는 햄스터)의 배선 내의 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치된다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 중쇄 서열은 비-사람 동물의 배선 내의 비-면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치되며, 여기서 비-중쇄 유전자좌는 전사적으로 활성인 유전자좌이다. 특정 실시형태에서, 비-중쇄 유전자좌는 ROSA26 유전자좌이다.
다양한 양상에서, 비-사람 동물은 비-사람 동물의 배선에 사람 면역글로불린 경쇄 서열(예: 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 서열, 또는 하나 이상의 재배열된 VJ 서열)을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 서열이다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 하나 이상의 VL 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 하나 이상의 JL 유전자 절편을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 하나 이상의 VL 유전자 절편 및 하나 이상의 JL 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 16개의 Vκ 유전자 절편 및 5개의 Jκ 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 30개의 Vκ 유전자 절편 및 5개의 Jκ 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 적어도 40개의 Vκ 유전자 절편 및 5개의 Jκ 유전자 절편을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트 또는 햄스터)의 배선 내의 불변 영역과 작동적으로 연결된다. 한 실시형태에서, 불변 영역은 사람, 키메라 사람/설치류, 마우스, 래트, 또는 햄스터 불변 영역이다. 특정 실시형태에서, 불변 영역은 마우스 또는 래트 불변 영역이다. 특정 실시형태에서, 불변 영역은 마우스 κ 불변(mCκ) 영역 또는 래트 κ 불변(rCκ) 영역이다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이고, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 적어도 6개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 절편으로의 대체를 포함한다. 한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 절편은 적어도 16개의 사람 Vκ 유전자 절편(사람 Vκ) 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 절편은 적어도 30개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 절편은 적어도 40개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 절편으로 대체된다. 한 실시형태에서, 적어도 하나의 Jκ 유전자 절편은 2개, 3개, 4개 또는 5개의 사람 Jκ 유전자 절편을 포함한다.
한 실시형태에서, 사람 Vκ 유전자 절편은 Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, 및 Vκ1-6을 포함한다. 한 실시형태에서, Vκ 유전자 절편은 Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15 및 Vκ1-16을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 Vκ 유전자 절편은 Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, 및 Vκ2-30을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 Vκ 유전자 절편은 Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, 및 Vκ2-40을 포함한다.
특정 실시형태에서, Vκ 유전자 절편은 Vκ4-1로부터 Vκ2-40까지의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 걸친 인접한 사람 면역글로불린 κ 유전자 절편을 포함하며, Jκ 유전자 절편은 Jκ1부터 Jκ5까지의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 걸친 인접한 유전자 절편을 포함한다.
한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 비-사람 동물의 배선 내의 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물의 배선 내의 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌이다. 한 실시형태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 전사적으로 활성인 비-사람 동물의 배선 내의 비-면역글로불린 경쇄 유전자좌에 위치된다. 특정 실시형태에서, 비-면역글로불린 유전자좌는 ROSA26 유전자좌이다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 세포에 암호화되는 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열로부터 유도되는 가변 도메인을 포함하는 사람 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
한 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 항체 또는 비-사람 동물로부터 분리되는 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열로부터 유도되는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 항체이다. 한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 중쇄 항체이다. 한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 단일쇄 가변 단편(예: scFv)이다.
한 양상에서, 항체를 제조하기 위한 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 용도가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 항체는 비-사람 동물로부터 분리되는 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열로부터 유도되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가변 영역 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 유전자 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가변 영역 핵산 서열은 면역글로불린 경쇄 유전자 절편을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 이용하는지를 기술하기 위해 제공되는 것이고, 본 발명자들이 본 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 달리 지시되지 않는 한, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.
실시예 1
마우스 면역글로불린 유전자의 사람화
마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌를 사람화하기 위한 13개의 상이한 BAC 표적화 벡터 (BACvec)를 조작하기 위해 사람 및 마우스 세균 인공 염색체 (BAC)를 사용하였다. 표 1 및 표 2는, 각각 마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌를 사람화하는데 사용되는 모든 BACvec를 작제하기 위해 수행되는 단계를 기술한다.
사람 및 마우스 BAC 의 확인. 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌의 5' 및 3' 말단에 걸친 마우스 BAC를 BAC 라이브러리로 스폿팅된 필터의 하이브리드화 또는 마우스 BAC 라이브러리 DNA 푸울(pool)을 스크리닝하는 PCR로 확인하였다. 필터를 관심 영역에 상응하는 프로브를 사용하여 표준 조건 하에서 하이브리드화하였다. 라이브러리 푸울을 관심 표적 영역을 플랭킹하는 특정 프라이머 쌍을 사용하는 PCR로 스크리닝하였다. 동일한 프라이머를 사용하는 추가의 PCR을 수행하여 소정의 웰을 탈회선(deconvolute)하고 상응하는 관심 BAC를 분리하였다. BAC 필터 및 라이브러리 푸울 모두를 129 SvJ 마우스 ES 세포(Incyte Genomics/Invitrogen)로부터 생성하였다. 전체 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌를 커버하는 사람 BAC를 PCR-기반 방법에 의한 사람 BAC 라이브러리 푸울(Caltech 라이브러리, Invitrogen) 스크리닝을 통해 BAC 라이브러리(Caltech B, C, 또는 D 라이브러리 & RPCI-11 라이브러리, Research Genetics/Invitrogen)로 스폿팅된 필터의 하이브리드화에 의해 또는 BAC 말단 서열 데이터베이스(Caltech D 라이브러리, TIGR)를 사용하여 확인하였다.
세균 상동성 재조합 및 라이게이션에 의한 BACvec 의 작제 . 세균 상동성 재조합(BHR)을 문헌[참조: Valenzuela et al ., 2003; Zhang et al ., 1998, A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nat Genet 20:123-128]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 대부분의 경우에, 선형 단편은 PCR-생성된 상동성 박스를 클로닝된 카세트에 라이게이션시킨 후 라이게이션 생성물을 겔 분리하고 표적 BAC를 갖는 BHR-컴피턴트(competent) 세균으로 전기천공시켜 생성하였다. 적절한 항생제 페트리 접시에서 선별한 후, 정확히 재조합된 BAC를 신규한 접합 모두에 걸친 PCR에 이어서 펄스-장 겔(pulsed-field gel) 상에서의 제한 분석[참조: Schwartz and Cantor, 1984, Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis, Cell 37:67-75] 및 사람 서열에 걸쳐 분포되는 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 스폿-점검에 의해 생성되었다.
3hVH BACvec를 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 사람화에 대한 초기 단계를 위한 3개의 순차적 BHR 단계를 이용하여 작제하였다(도 4a 및 표 1). 초기 단계에서(단계 1), 카세트를 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌(HB1)에 대한 상동성 영역, 세균에서 카나마이신 내성 및 동물 세포에서 G418 내성을 부여하는 유전자 (kanR) 및 부위-특이적 재조합 부위(예: loxP)를 포함하는 사람 VH1-3 유전자 절편으로부터 상류인 사람 모(parental) BAC에 도입하였다. 제2 단계에서(단계 2), 제2 카세트를 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌(HB2)에 상동성인 제2 영역 및 세균에서 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자(specR)를 포함하는 마지막 JH 절편으로부터 바로 하류에 도입하였다. 이러한 제2 단계는 JH6 및 BAC 벡터 클로람페니콜 내성 유전자(cmR)로부터 하류에 있는 사람 면역글로불린 중쇄 유전자좌 서열을 결실시키는 것을 포함한다. 이어서, 제3 단계에서(단계 3), 처음 2개의 단계 동안 가해지고 2개의 상동성 영역(HB1 및 HB2)을 통해 마우스 BAC(B2)로 통합된 I-CeuI 부위를 사용하여 이중 변형 사람 BAC(B1)를 선형화시켰다. 목적 생성물에 대해 특이적인 제1 (cm/kan), 제2 (spec/kan) 및 제3 (cm/kan) 단계에 대한 약물 선별을 디자인하였다. 변형된 BAC 클론을 제한 효소로의 분해 후 펄스-장 겔 전기영동(PFGE)에 의해 분석함으로써 적절한 작제물을 확인하였다 (도 4b).
유사한 방식으로, 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌의 사람화를 위한 12개의 추가의 BACvec를 조작하였다. 일부 예에서, BAC 라이게이션을 BHR 대신 수행하여 2개의 거대 BAC를 드문(rare) 제한 부위의 도입을 통해 모 BACvec 모두에 조심스러운 선별 마커의 대체와 함께 BHR에 의해 결합시켰다. 이는 특정 약물 마커 배합물로의 선별시 목적하는 라이게이션 생성물의 생존을 가능하게 한다. 드문 제한 효소에 의한 분해 후 라이게이션에 의해 수득되는 재조합 BAC를 (상기 기술되는 바와 같이) BHR에 의해 수득되는 것과 유사한 방식으로 확인하고 스크리닝하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
배아 줄기 ( ES ) 세포의 변형 및 마우스의 생성. ES 세포(F1H4) 표적화를 문헌[참조: Valenzuela et al., 2003]에 기술되는 바와 같은 VELOCIGENE® 유전자 조작을 이용하여 수행하였다. 배반포[참조: Valenzuela et al ., 2003] 또는 8-세포 주입[참조: Poueymirou et al ., 2007, F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99]에 의한 변형된 ES 세포로부터 마우스의 유도는 기재되어 있는 바와 같다. 표적화된 ES 세포 및 마우스를 PCR 기반 검정으로 고유의 세트의 프로브 및 프라이머로 ES 세포 또는 마우스로부터 DNA를 스크리닝함으로써 확인하였다. 모든 마우스 연구는 IACUC(Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 검사되고 승인되었다.
핵형 분석 및 형광 제자리 하이브리드화 ( FISH ). 핵형 분석은 코리엘 세포 레포지토리즈(Coriell Cell Repositories, Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ)에 의해 수행되었다. FISH는 문헌[참조: Valenzuela et al ., 2003]에 기술되어 있는 바와 같이 표적화된 ES 세포에서 수행되었다. 마우스 BAC DNA 또는 사람 BAC DNA에 상응하는 프로브를 형광 표지된 dUTP 뉴클레오타이드 스펙트럼 오렌지 또는 스펙트럼 그린(Vysis)을 사용하여 닉 번역(Invitrogen)에 의해 표지화하였다.
면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌. 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 사람화는 VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 이용하여 모든 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하는 약 3백만 염기쌍(Mb)의 인접한 마우스 게놈 서열을 동등한 사람 유전자 절편을 포함하는 약 1 Mb의 인접한 사람 게놈 서열(도 1a 및 표 1)로 직접 대체시킴으로써 9개의 연속 단계로 달성되었다[참조예: US 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al ., 2003].
JH 유전자 절편과 불변 영역 유전자 사이의 인트론(J-C 인트론)은 전사 인핸서[참조: Neuberger, 1983, Expression and regulation of immuglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells, EMBO J 2:1373-1378], 이어서 이소타입 스위칭 동안 재조합에 필요한 단순 반복물의 영역[참조: Kataoka et al ., 1980, Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch, PNAS USA 77:919-923]을 포함한다. 사람 VH-DH-JH 영역과 마우스 CH 영역 사이의 접합부(근위 접합부)는 마우스 내에서 사람화된 중쇄 유전자좌의 효과적인 발현 및 클래스 스위칭 모두를 보존하기 위해 마우스 중쇄 인트론 인핸서 및 스위치 도메인을 유지하도록 선택되었다. 모든 대체물에서 이러한 접합부 및 후속 접합부의 정확한 뉴클레오타이드 위치는 합성된 올리고뉴클레오타이드에 의해 유도되는 세균 상동성 재조합을 이용하는 VELOCIGENE® 유전자 조작법 (상기 참조)을 이용함으로써 가능하였다. 따라서, 근위 접합부는 마지막 JH 유전자 절편으로부터 약 200 bp 하류에 위치되고, 원위 접합부는 최말단 5' VH 유전자 절편의 수백 상류 및 마우스 VH1-86 유전자 절편(J558.55로서도 알려짐)으로부터 약 9 kb 하류에 위치된다. 마우스 VH1-86 (J558.55) 유전자 절편은 가장 먼 중쇄 가변 유전자 절편이며, C57BL/6 마우스에서 유사유전자이지만, 비록 저조한 RSS 서열을 가질지라도 표적화된 129 대립유전자에서 잠재적으로 활성인 것으로 보고된다. 마우스 중쇄 유전자좌의 원위 말단은 알려진 바에 따르면 유전자좌 발현 및/또는 재배열을 조절하는 제어 요소를 포함할 수 있다[참조: Pawlitzky et al ., 2006].
사람 면역글로불린 DNA 서열의 마우스로의 제1 삽입은, 약 75 kb of 마우스 상동성 아암을 사용하는 마우스 게놈 서열의 동반되는 16.6 kb의 결실과 함께, 마우스 IgH 유전자좌의 근위 말단에 삽입되는 3 VH, 모든 27 DH 및 9 JH 사람 유전자 절편을 포함하는 사람 중쇄 유전자좌의 근위 말단 144 kb를 사용하여 달성되었다 (단계 A, 도 2a; 표 1 및 표 3, 3hVH). 이러한 거대 144 kb의 삽입 및 수반되는 16.6 kb의 결실이 단일 단계(단계 A)로 수행되었으며, 0.2%의 빈도로 발생하였다 (표 3). 정확하게 표적화된 ES 세포를 결실된 마우스 서열 내의 프로브 및 이를 플랭킹하는 프로브 및 삽입된 사람 서열 내의 프로브를 사용하여 LONA(loss-of-native-allele) 검정[참조: Valenzuela et al ., 2003]으로 스코어를 매기고, 거대 사람 삽입물의 통합성을 전체 삽입물에 걸친 다수의 프로브를 사용하여 확인하였다(도 3a, 도 3b 및 도 3c). 많은 라운드의 순차적 ES 세포 표적화가 기대되므로, 이번 단계 및 모든 후속 단계에서 표적화된 ES 세포 클론을 핵형 분석하고(상기 참조), 20 스프레드 중 적어도 17 스프레드에서 정상적 핵형을 나타내는 클론들만을 후속 단계에 사용하였다.
단계 A로부터의 표적화된 ES 세포를 중쇄 유전자좌의 원위 말단에서 19 kb 결실을 생성하는 BACvec로 재표적화하였다(단계 B, 도 2a). 단계 B BACvec는 단계 A의 BACvec에 포함된 네오마이신 내성 유전자(neo)와는 대조적으로 하이그로마이신 내성 유전자 (hyg)를 포함하였다. 2개의 BACvec로부터의 내성 유전자는, 동일한 염색체에 성공적인 표적화시, VH1-86 이외의 다른 모든 마우스 VH 유전자 절편 및 DQ52 이외의 다른 DH 유전자 절편 및 2개의 내성 유전자를 포함하는 약 3 Mb의 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 loxP 부위에 의해 플랭킹되고; DQ52 및 모든 마우스 JH 쇄 유전자 절편이 단계 A에서 결실되도록 디자인되었다. 동일한 염색체에 이중 표적화되는 ES 세포 클론은, 3hVH 근위 카세트를 높은 G418에서 동형접합하게 하고[참조: Mortensen et al ., 1992, Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct, Mol Cell Biol 12:2391-2395] 원위 hyg 카세트의 운명을 따름으로써 확인되었다. loxP 부위가 플랭킹되는 방식으로 변형된 4 Mb 이하의 크기의 마우스 절편은 ES 세포에서 CRE 재조합효소의 일시적 발현에 의해 고효율(약 11% 이하)로 심지어 약물 선별의 부재 하에서도 성공적으로 결실되었다[참조: Zheng et al ., 2000, Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications, Mol Cell Biol 20:648-655]. 유사한 방식으로, 본 발명자들은 일시적 CRE 발현 후 8%의 ES 세포 클론에서 3개의 Mb 결실을 달성하였다 (단계 C, 도 2a; 표 3). 결실은 결실된 마우스 서열의 일측 말단에서 프로브를 사용한 LONA 검정뿐만 아니라 neo 및 hyg의 상실 및 유일하게 남은 loxP 부위를 포함하는 결실 포인트를 가로지르는 PCR 생성물의 출현으로 스코어를 매겼다. 또한, 결실은 형광성 제자리 하이브리드화로 확인되었다(자료 제시되지 않음).
나머지 사람 중쇄 가변 영역은, 각각의 단계마다 210 kb 이하의 사람 유전자 서열의 정확한 삽입을 수반하는, VELOCIGENE® 유전자 조작법을 이용하는 일련의 5 단계로 3hVH 대립유전자에 추가되었다(단계 E 내지 H, 도 2b). 각각의 단계에 대해, 각각의 새로운 BACvec의 근위 말단은 이전 단계의 가장 먼 사람 서열과 겹치도록 디자인되었으며, 각각의 새로운 BACvec의 원위 말단은 단계 A에서 사용되는 바와 동일한 마우스 상동성의 원위 영역을 포함하였다. 단계 E 및 G의 BACvec는 hyg 선별 카세트를 포함하는 반면, 단계 D, F 및 H의 BACvec는 neo 선별 카세트를 포함함하므로, 선별시 G418과 하이그로마이신이 교대로 사용되었다. 단계 D에서의 표적화는 3hVH 하이브리드 대립유전자의 원위 loxP 부위를 가로지르는 고유의 PCR 생성물의 상실로 검정되었다. 단계 E 내지 I에 대한 표적화는 이전 선별 카세트의 상실로 검정되었다. 마지막 단계(단계 I, 도 2b)에서, Frt 부위로 플랭킹되는 neo 선별 카세트[참조: McLeod et al ., 1986, Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle, Mol Cell Biol 6:3357-3367]는, 일시적 FLPe 발현[참조: Buchholz et al., 1998, Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis, Nat Biotechnol 16:657-662]에 의해 제거되었다. 단계 D, E 및 G에 대한 BACvec의 사람 서열은 2개의 모 사람 BAC 각각으로부터 유도되었고, 반면 단계 F 및 H로부터의 서열은 단일 BAC로부터 유도되었다. 사람 서열의 보유는 (상기 기술되는 바와 같이, 예를 들면, 도 3a, 도 3b 및 도 3c) 삽입된 사람 서열에 걸친 다수의 프로브를 사용하여 매 단계에서 확인되었다. 정상적인 핵형 및 배선 포텐셜을 갖는 클론만으로 각 단계를 진행하였다. 마지막 단계로부터의 ES 세포는 9번의 순차적 조작 후에도 여전히 배선에 기여할 수 있었다(표 3). 중쇄 대립유전자 각각에 대해 동형접합성인 마우스가 생존하였고, 건강한 것으로 보였으며, 본질적으로 야생형인 체액 면역계를 나타내었다(실시예 3 참조).
Figure pct00004
면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌. κ 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역에서와 유사한 방식으로 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 포함하는 약 3 Mb의 마우스 서열을 근접한 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 포함하는 약 0.5 Mb의 사람 서열로 직접적으로 대체시킴으로써 8개의 순차적인 단계로 사람화시켰다(도 1b; 표 2 및 표 4).
사람 κ 경쇄 유전자좌의 가변 영역은 800 kb 스페이서에 의해 분리된 2개의 거의 동일한 400 kb 반복물을 포함한다[참조: Weichhold et al ., 1993, The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity, Genomics 16:503-511]. 반복물들이 매우 유사하기 때문에, 거의 모든 유전자좌 다양성은 근위 반복물을 사용하여 마우스에서 재생성될 수 있다. 또한, 원위 반복물이 상실된 κ 경쇄 유전자좌의 천연 사람 대립유전자가 보고되었다[참조: Schaible et al ., 1993, The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals, Hum Genet 91:261-267]. 본 발명자들은 모든 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 근위 사람 Vκ 및 모든 사람 Jκ 유전자 절편으로 효과적으로 대체시키기 위해 약 3 Mb의 마우스 κ 경쇄 가변 유전자 서열을 약 0.5 Mb의 사람 κ 경쇄 가변 유전자 서열로 대체시켰다(도 2c 및 2d; 표 2 및 표 4). 중쇄 유전자좌에 대해 실시예 1에 기술된 방법과는 대조적으로, 모든 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 포함하는 전체 마우스 Vκ 유전자 영역을 임의의 사람 서열을 가하기 전에 3단계 공정으로 결실시켰다. 먼저, neo 카세트를 가변 영역의 근위 말단에 도입시켰다(단계 A, 도 2c). 다음, hyg 카세트를 κ 유전자좌의 원위 말단에 삽입하였다(단계 B, 도 2c). CRE 처리가 내성 유전자 둘 다와 함께 잔류하는 3 Mb의 마우스 Vκ 영역의 결실을 유도하도록 재조합효소 인식 부위(예: loxP)를 각각의 선별 카세트 내에 다시 위치시켰다(단계 C, 도 2c).
전체 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 약 480 kb 크기의 사람 게놈 단편을 중쇄에 대해 이용되었던 방법(실시예 1 참조)과 유사한 방법을 이용하여 단일 단계로 삽입되는 150 kb 이하의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 서열과 함께 4개의 순차적 단계로 삽입하였다(도 2d; 표 2 및 표 4). 최종 하이그로마이신 내성 유전자를 일시적 FLPe 발현에 의해 제거하였다. 중쇄에 관해서, 표적화된 ES 세포 클론을 각각의 단계 후 전체 사람 삽입물의 통합성, 정상 핵형 및 배선 포텐셜에 대해 평가하였다. 각각의 κ 경쇄 대립유전자에 대해 동형접합성인 마우스를 생성하고, 건강하고 정상적 외형를 갖는다는 것을 확인하였다.
Figure pct00005
실시예 2
다수의 사람화된 면역글로불린 대립유전자의 조합에 의한 완전히 사람화된 마우스의 생성
수개의 포인트에서, 실시예 1에 기술되는 바와 같은 사람 면역글로불린 중쇄 또는 κ 경쇄 가변 레퍼토리의 일부를 갖는 ES 세포를 미세주입하고, 생성된 마우스를 사육하여 점진적으로 커지는 분획의 사람 배선 면역글로불린 레퍼토리를 갖는 다수 버젼의 VELOCIMMUNE® 마우스를 생성하였다(표 5; 도 5a 및 도 5b). VELOCIMMUNE® 1(V1) 마우스는 18개의 사람 VH 유전자 절편 및 16개의 사람 Vκ 유전자 절편 및 모든 사람 Jκ 유전자 절편과 조합된 모든 사람 DH 및 JH 유전자 절편을 갖는다. VELOCIMMUNE® 2(V2) 및 VELOCIMMUNE® 3(V3) 마우스는 각각 총 39개의 VH 및 30개의 Vκ 및 8개의 VH 및 40개의 Vκ를 갖는 증가된 가변 레퍼토리를 갖는다. 마우스 VH, DH 및 JH 유전자 절편, 및 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 암호화하는 게놈 영역이 완전히 대체되기 때문에, 모든 버젼의 VELOCIMMUNE® 마우스에 의해 생산되는 항체는 마우스 불변 영역에 연결된 사람 가변 영역을 포함한다. 마우스 λ 경쇄 유전자좌는 VELOCIMMUNE® 마우스의 다양한 실시형태에서 온전하게 남아 있으며, 다양한 VELOCIMMUNE® κ 경쇄 유전자좌의 발현 효율을 위한 비교기로서 작용한다.
면역글로불린 중쇄와 κ 경쇄 모두의 사람화에 대해 이중으로 동형접합성인 마우스를 실시예 1에서 기술되는 대립유전자의 서브세트로부터 생성하였다. 이중 동형접합성 마우스를 생성하기 위해 사육 동안 관찰된 모든 유전형이 대략 멘델 비율로 나타났다. 각각의 사람 중쇄 대립유전자에 대해 동형접합성인 수컷 자손은 마우스 ADAM6 활성의 상실로부터 생긴 감소된 생식력을 입증하였다. 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌는 2개의 내장된 기능성 ADAM6 유전자(ADAM6a 및 ADAM6b)를 포함한다. 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 사람화 동안에, 삽입된 사람 게놈 서열은 ADAM6 유사유전자를 포함하였다. 마우스 ADAM6는 생식력에 필요하므로, 사람화된 중쇄 가변 유전자 유전자좌에서 마우스 ADAM6 유전자의 결여는 사람 유사유전자의 존재에도 불구하고 생식력의 감소를 초래할 수 있다. 실시예 7 내지 실시예 11은 마우스 ADAM6 유전자를 사람화된 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 재조작하고, 사람화된 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 이용하여 마우스에서 야생형 수준의 생식력을 회복하는 것을 기재한다.
Figure pct00006
실시예 3
사람화된 면역글로불린 유전자를 갖는 마우스에서의 림프구 군집
3개의 상이한 버젼의 VELOCIMMUNE® 마우스의 성숙 B 세포 군집을 유동 세포 분석법으로 평가하였다.
간단히, 골수, 비장 및 흉선으로부터의 세포 현탁물을 표준 방법을 이용하여 제조하였다. 세포를, 제조업자의 지시에 따라, BD 파밍겐(Pharmingen) FACS 염색 완충액에 5x105 세포/mL로 재현탁시키고, 항-마우스 CD16/32(BD Pharmingen)으로 차단시킨 후, 적절한 칵테일의 항체로 염색하고, BD CYTOFIXTM으로 고정시켰다. 최종 세포 펠렛을 0.5 mL 염색 완충액에 재현탁시키고, BD FACSCALIBURTM 및 BD CELLQUEST ProTM 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 모든 항체(BD Pharmingen)를 다량의 희석/칵테일에 제조하고, 0.5 mg/105 세포의 최종 농도로 가하였다.
골수(A-D) 염색을 위한 항체 칵테일은 다음과 같았다: A: 항-마우스 IgMb-FITC, 항-마우스 IgMa-PE, 항-마우스 CD45R(B220)-APC; B: 항-마우스 CD43(S7)-PE, 항-마우스 CD45R(B220)-APC; C: 항-마우스 CD24(HSA)-PE; 항-마우스 CD45R(B220)-APC; D: 항-마우스 BP-1-PE, 항-마우스 CD45R(B220)-APC.
비장 및 서혜부 림프절(E-H) 염색을 위한 항체 칵테일은 다음과 같았다: E: 항-마우스 IgMb-FITC, 항-마우스 IgMa-PE, 항-마우스 CD45R(B220)-APC; F: 항-마우스 Ig, λ1, λ2, λ3 경쇄-FITC, 항-마우스 Igκ 경쇄-PE, 항-마우스 CD45R(B220)-APC; G: 항-마우스 Ly6G/C-FITC, 항-마우스 CD49b(DX5)-PE, 항-마우스 CD11b-APC; H: 항-마우스 CD4(L3T4)-FITC, 항-마우스 CD45R(B220)-PE, 항-마우스 CD8a-APC. 결과는 도 6에 나타나 있다.
동형접합성 VELOCIMMUNE® 마우스의 비장 또는 림프절로부터 분리된 림프구를 마커 B220 및 IgM의 표면 발현에 대해 염색하고, 유동 세포 분석법을 이용하여 분석하였다(도 6). 시험된 모든 버젼의 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 B220+ IgM+ 성숙 B 세포 군집의 크기는 이들이 함유하는 VH 유전자 절편의 수와 무관하게 야생형 마우스의 것과 사실상 동일하였다. 또한, 동형접합성 하이브리드 사람화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스, 심지어 단지 3개의 VH 유전자 절편을 갖지만, 정상적인 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 마우스, 또는 정상적인 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 함께 동형접합성 하이브리드 사람화된 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스도 이들의 말초 구획에서 정상적인 수의 B220+ IgM+ 세포를 가졌다(자료 제시되지 않음). 이들 결과는 사람 가변 유전자 절편 및 마우스 불변 영역을 갖는 키메라 유전자좌가 성숙 B 세포 구획을 완전히 밀집(populate)시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 중쇄 또는 κ 경쇄 유전자좌에서의 가변 유전자 절편의 수 및 따라서 항체 레퍼토리의 이론적 다양성은 성숙 B 세포의 야생형 군집을 생성하는 능력과 상관관계가 없다. 이와는 대조적으로, 무작위로 통합된 완전-사람 면역글로불린 전이유전자 및 불활성화된 마우스 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스는 이들 구획에서 감소된 수의 B 세포를 가지며, 결핍의 심각성은 전이유전자에 포함된 가변 유전자 절편의 수에 의존한다[참조: Green and Jakobovits, 1998, Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglbulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495]. 이는 "제자리 유전자 사람화" 전략은 "녹아웃 + 유전자전이" 접근법으로 달성되는 무작위적으로 통합된 전이유전자보다 근본적으로 상이한 기능적 결과를 초래한다는 것을 입증한다.
대립유전자 배제 및 유전자좌 선택. 대립유전자 배제를 유지하는 능력은 상이한 버젼의 사람화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 마우스에서 조사하였다.
면역글로불린 유전자좌의 사람화를 129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합성 배아로부터 유도되는 F1 ES 주[참조: F1H4, Valenzuela et al ., 2003]에서 수행하였다. 비변형된 마우스 C576BL/6N 대립유전자는 IgMb 단상형(haplotype)을 갖는 반면, IgMa 단상형을 갖는 129S6 대립유전자에 대해 사람 중쇄 배선 가변 유전자 서열을 표적화한다. IgM에 대한 이들 대립유전자 형태는 IgMa 또는 IgMb 대립유전자에서 나타나는 다형에 대해 특이적인 항체를 사용하여 유동 세포 분석법에 의해 구분될 수 있다. 도 6(바닥줄)에 도시되는 바와 같이, 각각의 버젼의 사람화된 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 마우스에서 확인되는 B 세포는 IgMa (사람화된 대립유전자) 또는 IgMb (야생형 대립유전자)인 단일 대립유전자만을 발현한다. 이는 대립유전자 배제에 수반되는 기작이 VELOCIMMUNE® 마우스에서 온전하다는 것을 입증한다. 또한, 사람화된 대립유전자(IgMa)에 대해 양성인 B 세포의 상대적 수는 존재하는 VH 유전자 절편의 수에 대략적으로 비례한다. 사람화된 면역글로불린 유전자좌는 18개의 사람 VH 유전자 절편을 갖는 VELOCIMMUNE® 1 이형접합성 마우스의 B 세포 중 약 30%에서 발현되고, 각각 39개 및 80개의 사람 VH 유전자 절편을 갖는 VELOCIMMUNE® 2 및 3(자료 제시되지 않음) 이형접합성 마우스의 B 세포 중 50%에서 발현된다. 특히, 사람화된 마우스 대립유전자 대 야생형 마우스 대립유전자를 발현하는 세포의 비율(VELOCIMMUNE® 1 마우스에 대해 0.5 및 VELOCIMMUNE® 2 마우스에 대해 0.9)은 사람화된 유전자좌 대 야생형 유전자좌에 포함된 가변 유전자 절편의 수의 비율(VELOCIMMUNE® 1 마우스에 대해 0.2 및 VELOCIMMUNE® 2 마우스에 대해 0.4)보다 크다. 이는 대립유전자 선택 확률이 어느 한쪽의 염색체의 무작위 선택과 임의의 특정 V 절편 RSS의 무작위 선택 사이의 중간이라는 것을 나타낼 수 있다. 또한, 전부는 아니지만, B-세포의 분획이 존재할 수 있으며, 여기서, 하나의 대립유전자는 재조합에 이용가능하게 되고, 과정을 완성하고, 다른 대립유전자가 이용가능하기 전에 재조합을 멈춘다. 또한, 하이브리드 사람화된 중쇄 유전자좌 또는 야생형 마우스 중쇄 유전자좌로부터 유도되는 표면 IgM(sIgM)을 갖는 세포의 고른 분포는 하이브리드 유전자좌가 정상 수준으로 작동하고 있다는 증거이다. 이와는 대조적으로, 무작위로 통합된 사람 면역글로불린 전이유전자는 야생형 마우스 면역글로불린 유전자좌와 저조하게 경쟁한다[참조: Bruggemann et al ., 1989, A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice, PNAS 86:6709-6713; Green et al ., 1994; Tuaillon et al ., 1993, Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts, PNAS USA 90:3720-3724]. 이는 또한 VELOCIMMUNE® 마우스에 의해 생산되는 면역글로불린이 "녹아웃 + 유전자전이" 접근법으로 달성되는 무작위적으로 통합된 전이유전자에 의해 생성되는 것과 기능적으로 상이하다는 것을 입증한다.
Cκ 영역의 다형성은 사람화된 κ 경쇄 유전자좌 대 비-사람화된 κ 경쇄 유전자좌의 대립유전자 배제를 조사하기 위한 129S6 또는 C57BL/6N에서 이용불가능하다. 그러나, VELOCIMMUNE® 마우스는 모두 야생형 마우스 λ 경쇄 유전자좌를 가지므로, 사람화된 κ 경쇄 유전자좌의 재배열 및 발현이 마우스 λ 경쇄 발현을 방지할 수 있는지의 여부를 관찰할 수 있다. 마우스 λ 경쇄를 발현하는 세포의 수와 비교한 사람화된 κ 경쇄를 발현하는 세포의 수의 비율은, κ 경쇄 유전자좌에 삽입된 사람 Vκ 유전자 절편의 수와 무관하게, 야생형 마우스와 비교하여 VELOCIMMUNE® 마우스에서 비교적 변화되지 않았다(도 6, 상단으로부터 제3열). 또한, 이중 양성 (κ + λ) 세포의 수도 증가되지 않았으며, 이는 하이브리드 κ 경쇄 유전자좌에서의 생산적 재조합으로 마우스 λ 경쇄 유전자좌의 재조합이 적절히 억제된다는 것을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 불활성화된 마우스 κ 경쇄 유전자좌를 갖는, 그러나 야생형 마우스 λ 경쇄 유전자좌를 갖는, 무작위로 통합된 κ 경쇄 전이유전자를 포함하는 마우스는 급격히 증가된 λ/κ 비율을 나타내며[참조: Jakobovits, 1998], 이는 도입된 κ 경쇄 전이유전자가 이러한 마우스에서 잘 기능하지 않는다는 것을 의미한다. 이는 또한 "녹아웃 + 유전자전이" 마우스에 의해 제조된 면역글로불린과 비교하여 VELOCIMMUNE® 마우스에 의해 제조된 면역글로불린에서 상이한 기능성 결과가 관찰된다는 것을 입증한다.
B 세포 발달. VELOCIMMUNE® 마우스에서의 성숙 B 세포 군집은 (상술된 바와 같이) 야생형 마우스의 것과 유사하기 때문에, 조기 B 세포 분화의 결함은 성숙 B 세포 군집의 발현에 의해 보완될 수 있다. 다양한 단계의 B 세포 분화를 유동 세포 분석법을 이용하여 B 세포 군집을 분석함으로써 조사하였다. 표 6은, 야생형 한배 새끼와 비교하여 VELOCIMMUNE® 마우스에서, 특정 세포 표면 마커를 사용하여, FACs에 의해 정의되는 각각의 B 세포 계통(lineage)에서의 세포 분획의 비율을 나타낸다.
초기 B 세포 발달은 골수에서 일어나며, 상이한 단계의 B 세포 분화는 세포 표면 마커 발현의 유형 및 양의 변화를 특징으로 한다. 표면 발현에서의 이들 차이는 세포 내부의 면역글로불린 유전자좌에서 일어나는 분자 변화와 상관관계가 있다. pro-B의 pre-B 세포 전이는 기능성 중쇄 단백질의 성공적인 재배열 및 발현을 필요로 하며, pre-B로부터 성숙 B 단계로의 전이는 κ 또는 λ 경쇄의 정확한 재배열 및 발현에 의해 관리된다. 따라서, B 세포 분화 단계간의 비효율적 전이는 지정된 단계에서 상대적인 B 세포 군집의 변화로 검출될 수 있다.
Figure pct00007
어떠한 VELOCIMMUNE® 마우스에서도 B 세포 분화에 있어서 주요한 결함이 관찰되지 않았다. 사람 중쇄 유전자 절편의 도입은 pro-B의 pre-B로의 전이에 영향을 미치는 것으로 보이지 않으며, 사람 κ 경쇄 유전자 절편의 도입은 VELOCIMMUNE® 마우스에서 pre-B의 B로의 전이에 영향을 미치지 않는다. 이는 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 "역-키메라" 면역글로불린 분자가 마우스 환경에서 적절한 B 세포 분화를 초래하는 B 세포 신호전달 및 공-수용체 분자와 관련하여 정상적으로 기능한다는 것을 입증한다. 이와는 대조적으로, B 세포 분화 동안의 상이한 군집 사이의 균형은 무작위로 통합된 면역글로불린 전이유전자를 포함하는 마우스 및 불활성화된 내생적 중쇄 또는 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스에서 다양한 정도로 교란된다[참조: Green and Jakobovits, 1998].
실시예 4
사람화된 면역글로불린 마우스에서의 가변 유전자 레퍼토리
VELOCIMMUNE® 마우스의 사람화된 항체 레퍼토리에서 사람 가변 유전자 절편의 사용을, 비장 세포 및 하이브리도마 세포를 포함하는 다수의 공급원으로부터의 사람 가변 영역을 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)시켜 분석하였다. 가변 영역 서열, 유전자 절편 사용, 체세포 초돌연변이, 및 재배열된 가변 영역 유전자 절편의 접합부 다양성을 측정하였다.
간단히 설명하면, 총 RNA를 TRIZOLTM(Invitrogen) 또는 Qiagen RNeasyTM Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 1x107 내지 2x107개의 비장 세포 또는 약 104 내지 105개의 하이브리도마 세포로부터 추출하고, SUPERSCRIPTTM III One-Step RT-PCR 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 마우스 불변 영역 특이적 프라이머로 프라이밍하였다. 반응은 각각의 샘플로부터의 2 내지 5 μL의 RNA로, 중쇄 및 κ 경쇄 둘 다에 대한 각각의 사람 가변 영역 패밀리에 대해 푸울링된 리더 프라이머와 쌍을 이룬 상술된 3' 불변 특이적 프라이머를 사용하여 개별적으로 수행되었다. 시약 및 프라이머의 용적 및 RT-PCR/PCR 조건은 제조업자의 지시에 따라 수행되었다. 프라이머 서열은 다수의 공급원에 기초하였다[참조: Wang and Stollar, 2000, Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR, J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen]. 적절한 경우, 내포된(nested) 제2 PCR 반응을 푸울링된 패밀리-특이적 프레임워크 프라이머 및 일차 반응에서 사용된 동일한 마우스 3' 면역글로불린 불변-특이적 프라이머로 수행하였다. 각각의 반응으로부터의 분취물(5 μL)을 아가로즈 전기영동으로 분석하고, 반응 생성물을 MONTAGETM Gel Extraction Kit(Millipore)를 사용하여 아가로즈로부터 정제하였다. 정제된 생성물을 TOPOTM TA Cloning System(Invitrogen)을 사용하여 클로닝하고, 전기천공에 의해 DH10β 이. 콜라이 세포로 형질전환시켰다. 각각의 클론을 각각의 형질전환 반응물로부터 선별하고, 37℃에서 밤새 항생제 선별과 함께 2 mL LB 브로쓰 배양으로 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 키트-기반 접근(Qiagen)에 의해 세균 배양물로부터 정제하였다.
면역글로불린 가변 유전자 사용. 중쇄 및 κ 경쇄 클론 모두의 플라스미드 DNA를 ABI 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)에서 T7 또는 M13 역 프라이머로 서열분석하였다. 본래 서열 자료는 SEQUENCHERTM(v4.5, Gene Codes)에 입력되었다. 각각의 서열을 콘틱(contig)으로 어셈블링하고, 사람 VH, DH, JH 및 Vκ, Jκ 절편 이용을 확인하기 위한 검색 기능을 하는 IMGT V-Quest[참조: Brochet et al ., 2008, IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis, Nucleic Acids Res 36:W503-508]를 사용하여 사람 면역글로불린 서열에 대해 정렬하였다. 서열을 체세포 초돌연변이 및 재조합 접합 분석을 위해 배선 서열과 비교하였다.
마우스를 RAG 상보성[참조: Chen et al ., 1993, RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development, PNAS USA 90:4528-4532]에 의해 초기 중쇄 변형 (3hVH-CRE 하이브리드 대립유전자, 도 2a의 하단)을 포함하는 ES 세포로부터 생성하였고, cDNA를 비장 세포 RNA로부터 제조하였다. cDNA를 삽입된 사람 유전자 절편 내에서의 V(D)J 재조합 및 마우스 IgM 또는 IgG 불변 도메인에 대한 후속적 스플라이싱에 의해 생기는 예측된 키메라 중쇄 mRNA에 대해 특이적인 (상술된) 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. 이들 cDNA 클론으로부터 유도되는 서열(제시되지 않음)은, 적절한 V(D)J 재조합이 사람 가변 유전자 서열 내에서 일어났으며, 재배열된 사람 V(D)J 유전자 절편이 마우스 불변 도메인에 대해 인-프레임(in-frame)으로 적절히 스플라이싱되었으며, 클래스-스위치(class-switch) 재조합이 일어났다는 것을 입증하였다. 후속적 하이브리드 면역글로불린 유전자좌의 mRNA 생성물에 대한 추가의 서열 분석을 수행하였다.
유사한 실험에서, 비-면역화된 야생형 및 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 B 세포를 B220 및 IgM 또는 IgG의 표면 발현에 기초하여 유동 세포 분석법으로 분리하였다. B220+ IgM+ 또는 표면 IgG+ (sIgG+) 세포를 푸울링하고, (상술된) RT-PCR 증폭 및 클로닝 후 VH 및 Vκ 서열을 수득하였다. 비면역화된 VELOCIMMUNE® 1 마우스(표 7) 및 VELOCIMMUNE® 3 마우스(표 8)로부터의 RT-PCR 증폭된 cDNA 세트에서의 대표적인 유전자 사용이 기록되었다 (* 결함이 있는 RSS; † 상실 또는 유사유전자). 별표: 결함이 있는 RSS를 갖는 유전자 절편. †: 유전자 절편이 상실되거나 유사유전자이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
표 7 및 표 8에 나타난 바와 같이, 거의 모든 기능성 사람 VH, DH, JH, Vκ 및 Jκ 유전자 절편이 사용되었다. 본 실험의 VELOCIMMUNE® 마우스에서 기술되었으나 검출되지 않은 기능성 가변 유전자 절편 중, 수개가 결함이 있는 재조합 신호 서열 (RSS)을 갖는 것으로 보고되었으며, 따라서 이들은 발현될 것으로 기대되지 않았다[참조: Feeney, 2000, Factors that influence formation of B cell repertoire, Immunol Res 21:195-202]. 나이브(naive) 레퍼토리 및 면역화된 레퍼토리 모두로부터 분리된 다양한 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 수개의 다른 세트의 면역글로불린 서열의 분석은, 비록 빈도가 낮지만(자료 제시되지 않음), 이들 유전자 절편의 사용을 보였다. 종합적인 유전자 사용 자료는, VELOCIMMUNE® 마우스에 포함된 모든 기능성 사람 VH, DH, JH, Vκ, 및 Jκ 유전자 절편이 다양한 나이브 레퍼토리 및 면역화된 레퍼토리에서 관찰되었다는 것을 나타내었다(자료 제시되지 않음). 비록 사람 VH7-81 유전자 절편이 사람 중쇄 유전자좌 서열의 분석에서 확인되었지만[참조: Matsuda et al ., 1998, The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus, J Exp Med 188:2151-2162], 전체 VELOCIMMUNE® 3 마우스 게놈의 재-서열분석에 의해 확인되는 바와 같이, VELOCIMMUNE® 마우스에서는 존재하지 않는다.
항체의 중쇄 및 경쇄의 서열은, 특히 재배열된 가변 도메인 내의 짧은 폴리펩타이드 절편에서, 예외적인 다양성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 이들 영역은 항체 분자의 구조에서 항원에 대한 결합 부위를 생성한다. 개재 폴리펩타이드 서열은 프레임워크 영역(FR)이라 칭한다. 중쇄 및 경쇄 모두에 3개의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3) 및 4개의 FR(FR1, FR2, FR3, FR4)이 존재한다. 하나의 CDR인 CDR3은 VH, DH 및 JH 및 Vκ 및 Jκ 유전자 절편 모두의 재조합에 의해 생성되고 항원을 만나기 전 상당량의 레퍼토리 다양성을 생성한다는 점에서 독특하다. 이러한 연결은 엑소뉴클레아제 활성을 통한 뉴클레오타이드 결실 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)를 통한 비-템플레이트 암호화된 부가 모두에 의해 부정확하며, 따라서 재조합 과정으로부터 생기는 신규 서열을 허용한다. 비록 FR이 전체적으로 가변 영역의 높은 가변성으로 인해 실질적인 체세포 돌연변이를 나타낼 수 있지만, 다양성이 가변 영역에 걸쳐서 고르게 분포되지는 않는다. CDR은 항원 결합을 가능하게 하는 항체 분자 표면의 농축되고 국소화된 높은 다양성의 영역이다. 접합 다양성을 입증하는 CDR3 접합 주위의 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 각각 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다.
도 7a에 도시되는 바와 같이, 비-템플레이트 암호화된 뉴클레오타이드 부가 (N-부가)가 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 항체에서 VH-DH 및 DH-JH 접합부 모두에서 관찰되었으며, 이는 사람 절편을 갖는 TdT의 적절한 기능을 나타낸다. VH, DH 및 JH 절편의 종점은 이들의 배선 대응물과 비교하여 엑소뉴클레아제 활성이 발생하였다는 것을 보여준다. 중쇄 유전자좌와 다르게, 사람 κ 경쇄 재배열은 Vκ 및 Jκ 절편의 재조합에 의해 형성되는 CDR3에서 약간의 TdT 부가를 나내거나 전혀 TdT 부가를 나타내지 않는다(도 7b). 이는 pre-B의 B 세포로의 전이시 경쇄 재배열 동안 마우스에서 TdT 발현이 결여되기 때문인 것으로 예측된다. 재배열된 사람 Vκ 영역의 CDR3에서 관찰되는 다양성은 주로 재조합 사건 동안 엑소뉴클레아제 활성을 통해 도입된다.
체세포 초돌연변이 . 추가의 다양성이 체세포 초돌연변이라 불리는 과정에 의해 배아 중심 반응 동안 재배열된 면역글로불린 유전자의 가변 영역에 추가된다. 체세포적으로 돌연변이된 가변 영역을 발현하는 B 세포는 난포의 수지상 세포에 의해 제시되는 항원에 대한 접근에 대해 다른 B 세포와 경쟁한다. 항원에 대해 높은 친화성을 갖는 이들 B 세포는 말초로 방출되기 전 더욱 확장되고 클래스 스위칭을 겪을 것이다. 따라서, 스위칭된 이소타입을 발현하는 B 세포는 통상적으로 항원을 만나고 배아 중심 반응을 겪으며 나이브 B 세포에 비해 증가된 수의 돌연변이를 가질 것이다. 또한, 대부분 나이브 sIgM+ B 세포로부터의 가변 영역 서열은 항원 선별을 겪은 sIgG+ B 세포로부터의 가변 서열보다 상대적으로 적은 돌연변이를 가질 것이라 예상된다.
비-면역화된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 sIgM+ 또는 sIgG+ B 세포 또는 면역화된 마우스로부터의 sIgG+ B 세포로부터의 무작위 VH 또는 Vκ 클론으로부터의 서열을 이들의 배선 가변 유전자 절편 및 주해가 달린 배선 서열에 관한 변화와 비교하였다. 생성된 뉴클레오타이드 서열을 인실리코 (in silico) 번역하고 또한 아미노산 변화를 초래하는 돌연변이를 주해하였다. 모든 가변 영역으로부터의 자료를 수집하고, 지정된 위치에서의 변화율(%)을 계산하였다(도 8).
도 8에 도시되는 바와 같이, 비-면역화된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 sIgG+ B 세포로부터 유도되는 사람 중쇄 가변 영역은 동일한 비장 세포 푸울로부터의 sIgM+ B 세포에 비해 더욱 많은 뉴클레오타이드를 나타내고, 면역화된 마우스로부터 유도되는 중쇄 가변 영역은 더욱 많은 변화를 나타낸다. 변화의 총수는 프레임워크 영역에 비해 상보성-결정 영역(CDR)에서 증가하며, 이는 항원 선별을 나타낸다. 또한, 사람 중쇄 가변 영역으로부터의 상응하는 아미노산 서열은 IgM에 비해 IgG에서 상당히 큰 수의 돌연변이를 나타내며, 면역화된 IgG에서 더욱 많은 돌연변이를 나타낸다. 이들 돌연변이는 프레임워크 서열에 비해 CDR에서 더욱 빈번한 것으로 다시 나타나며, 이는 항체가 생체내에서 항원-선별되었다는 것을 제시한다. 뉴클레오타이드 및 아미노산 돌연변이의 수의 유사한 증가가 면역화된 마우스로부터의 IgG+ B 세포로부터 유도되는 Vκ 서열에서 보여진다.
VELOCIMMUNE® 마우스에서 관찰되는 유전자 사용 및 체세포 초돌연변이 빈도는 존재하는 본질적으로 모든 유전자 절편이 이들 마우스에서 완전히 기능적인 역-키메라 항체를 형성하도록 재배열될 수 있다는 것을 입증한다. 또한, VELOCIMMUNE® 항체는 표적 항원을 효과적으로 중화할 수 있는 완전 성숙 사람 항체를 생성하기 위한 친화성 선별 및 성숙을 겪도록 마우스 면역계에 완전히 참여한다. VELOCIMMUNE® 마우스는 친화성이 높고 치료적 이용에 적합한 광범위한 사람 항체의 사용을 초래하는 다양한 부류의 항원에 대한 확고한 면역 반응을 가질 수 있다.
실시예 5
림프 구조 및 혈청 이소타입의 분석
H&E로 염색된 야생형 또는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터의 비장, 서혜부 림프절, 페이에르판 (Peyer's patch) 및 흉선의 조직 샘플의 거시 구조를 광학 현미경으로 조사하였다. 야생형 및 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 수집된 혈청 중의 면역글로불린 이소타입의 수준을 LUMINEXTM 기술을 이용하여 분석하였다.
림프 기관 구조. 림프 조직의 구조 및 기능은 부분적으로 조혈 세포의 적절한 발달에 의존적이다. B 세포 발달 또는 기능의 결함은 림프 조직 구조의 변경으로 나타날 수 있다. 염색된 조직 부분의 분석시, 야생형 마우스와 VELOCIMMUNE® 마우스 사이에서 이차적인 림프 기관의 외형에 어떠한 유의한 차이도 확인되지 않았다(자료 제시되지 않음).
혈청 면역글로불린 수준. 각각의 이소타입의 발현 수준은 야생형 및 VELOCIMMUNE® 마우스에서 유사하다 (도 9a, 도 9b 및 도 9c). 이는 가변 유전자 절편의 사람화가 클래스 스위칭 또는 면역글로불린 발현 및 분비에 분명한 역효과를 갖지 않으며, 따라서 이들 기능에 필요한 모든 내생적 마우스 서열을 명백히 유지한다.
실시예 6
면역화 및 사람화된 면역글로불린 마우스에서의 항체 생성
상이한 버젼의 VELOCIMMUNE® 마우스를 외인성 항원 챌린지에 대한 체액 반응을 조사하기 위해 항원으로 면역화시켰다.
면역화 및 하이브리도마 개발. VELOCIMMUNE® 및 야생형 마우스를 단백질, DNA, DNA와 단백질의 배합물 형태의 항원, 또는 항원을 발현하는 세포로 면역화시킬 수 있다. 동물은 통상적으로 3주마다 총 2 내지 3회 부스팅된다. 각각의 항원 부스팅 후, 각각의 동물로부터의 혈청 샘플을 수집하고, 혈청 역가 측정에 의해 항원-특이적 항체 반응에 대해 분석한다. 융합 전, 필요한 경우 복막내 및/또는 정맥내 주입을 통해 5 μg 단백질 또는 DNA의 최종 융합전 부스트가 마우스에게 투여된다. 비장 세포를 수거하고, 제조업자에 의해 제시된 프로토콜(Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD)에 따라 전기융합 챔버에서 Ag8.653 골수종 세포에 융합된다. 배양한지 10일 후, ELISA 검정[참조: Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York]을 이용하여 하이브리도마를 항원 특이성에 대해 스크리닝한다. 대안으로, 항원 특이적 B 세포를 면역화된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 직접적으로 분리하고 본원에 기술되는 것을 포함하여 표준 기술을 이용하여 스크리닝함으로써 목적 항원에 대해 특이적인 사람 항체를 수득한다[참조: US 2007/0280945A1, 본원에 전부 참조로 삽입됨].
혈청 역가 측정. 동물 항-항원 혈청 반응을 모니터링하기 위해, 혈청 샘플을 각각의 부스팅 후 약 10일에 수집하고, 항원 특이적 ELISA를 이용하여 역가를 측정한다. 간단히 설명하면, Nunc MaxiSorpTM 96 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 2 μg/mL 항원으로 코팅하고, 소 혈청 알부민(Sigma, St. Louis, MO)으로 차단한다. 일련의 3배 희석물 중의 혈청 샘플을 실온에서 1시간 동안 플레이트에 결합시킨다. 이어서, 플레이트를 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 세척하고, 결합된 IgG를 총 IgG 역가에 대해서는 HRP-접합된 염소 항-마우스 Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA)를 사용하여 검출하고, 이소타입 특이적 역가에 대해서는 비오틴-표지된 이소타입 특이적 또는 경쇄 특이적 폴리클로날 항체(Southern Biotech Inc.)를 사용하여 검출한다. 비오틴-표지된 항체에 대해서는, 플레이트를 세척한 후, HRP-접합된 스트렙트아비딘 (Pierce, Rockford, IL)을 첨가한다. 모든 플레이트를 BD OPTEIATM(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)와 같은 비색 기질을 사용하여 발색시킨다. 반응을 1 M 인산으로 정지시킨 후, 450 nm에서의 흡광도를 기록하고, 자료는 Graph Pad로부터의 PRISMTM 프로그램을 사용하여 분석한다. 2배의 배경 신호를 얻는데 필요한 희석이 역가로 정의된다.
하나의 실험에서, VELOCIMMUNE® 마우스를 사람 인터류킨-6 수용체(hIL-6R)로 면역화시켰다. hIL-6R로 면역화된 VELOCIMMUNE® 및 야생형 마우스에 대한 혈청 역가의 대표적인 세트가 도 10a 및 도 10b에 도시되어 있다.
VELOCIMMUNE® 및 야생형 마우스는 IL-6R에 대해 유사한 역가 범위로 강력한 반응을 나타내었다(도 10a). VELOCIMMUNE® 및 야생형 코호트로부터의 수마리의 마우스가 단일 항원 부스팅 후 최대 반응에 도달하였다. 이러한 결과는, 이들 항원에 대한 면역 반응 강도 및 동역학이 VELOCIMMUNE® 및 야생형 마우스에서 유사하였다는 것을 나타낸다. 이들 항원-특이적 항체 반응을 추가로 분석하여 혈청에서 나타나는 항원-특이적 항체의 특정 이소타입을 조사하였다. VELOCIMMUNE® 및 야생형 그룹 모두 지배적으로 IgG1 반응을 유도하였으며(도 10b), 이는 체액 반응 동안 클래스 스위칭이 각각의 타입의 마우스에서 유사하다는 것을 제시한다.
용액 중의 항원에 대한 항체 결합의 친화성 측정. ELISA-기반 용액 경쟁 검정은 통상적으로 항원에 대한 항체-결합 친화성을 측정하기 위해 디자인된다.
간단히 설명하면, 조건화된(conditioned) 배지 중의 항체를 0 mg/ml 내지 10 mg/mL 범위의 일련의 항원 단백질 희석물과 미리 혼합한다. 이어서, 항체와 항원 혼합물의 용액을 실온에서 2 내지 4시간 동안 항온배양하여 결합 평형에 도달하게 한다. 이어서, 혼합물 중의 유리 항체의 양을 정량적 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정한다. 96 웰 MAXISORBTM 플레이트(VWR, West Chester, PA)를 4℃에서 밤새 PBS 용액 중의 1 μg/mL 항원 단백질로 코팅한 후 BSA 비특이적 차단을 수행한다. 이어서, 항체-항원 혼합물 용액을 이들 플레이트에 옮긴 후 1시간 동안 항온배양한다. 이어서, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 플레이트-결합 항체를 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체 시약(Jackson Immuno Research Lab)으로 검출하고, BD OPTEIATM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)과 같은 비색 기질을 사용하여 발색시킨다. 반응을 1 M 인산으로 정지시킨 후, 450 nm에서의 흡광도를 기록하고, 자료를 Graph Pad로부터의 PRISMTM 소프트웨어로 분석한다. 용액 중의 항원의 농도에 대한 신호 의존성을 4개 매개변수 피트(fit) 분석으로 분석하고, IC50(용액 중 항원 부재 하의 항체 샘플로부터의 신호를 50% 감소시키는데 필요한 항원 농도)으로 나타낸다.
하나의 실험에서, VELOCIMMUNE® 마우스를 (상술된 바와 같이) hIL-6R로 면역화시켰다. 도 11a 및 도 11b는 VELOCIMMUNE® 및 야생형 마우스로부터의 항-hIL6R 항체에 대한 친화성 측정의 대표적인 세트를 나타낸다.
면역화된 마우스를 제3의 항원 부스팅 후, ELISA 검정을 이용하여 혈청 역가를 측정한다. 비장 세포는 선택된 야생형 및 VELOCIMMUNE® 마우스 코호트로부터 분리하고, (상술된 바와 같이) Ag8.653 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 형성하고 선별 조건 하에 성장시킨다. 생성된 총 671개의 항-IL-6R 하이브리도마 중, 236개가 항원-특이적 항체를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 항원 양성 웰로부터 수거된 배지를 사용하여 용액 경쟁 ELISA를 이용하여 항원에 대한 결합에 대해 항체 친화성을 측정하였다. VELOCIMMUNE® 마우스로부터 유도되는 항체는 용액 중의 항원에 대한 결합에 있어 광범위의 친화성을 나타낸다(도 11a). 또한, 236개의 항-IL-6R 하이브리도마 중 49개가 시험관내 생물검정에서 수용체에 대한 결합으로부터 IL-6을 차단하는 것으로 밝혀졌다(자료 제시되지 않음). 또한, 이들 49개의 항-IL-6R 차단 항체는 야생형 마우스의 평행 면역화로부터 유도되는 차단 항체와 유사하게 다양한 높은 용액 친화도를 나타내었다.
실시예 7
마우스 ADAM6 표적화 벡터의 작제
마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 유전자좌로의 대체 때문에, 초기 버젼의 VELOCIMMUNE® 마우스에는 마우스 ADAM6 유전자의 발현이 결여되어 있다. 특히, 수컷 VELOCIMMUNE® 마우스는 생식력 감소를 나타낸다. 따라서, ADAM6를 발현하는 능력을 VELOCIMMUNE® 마우스 내로 재조작함으로써 생식력 결함을 구제하였다.
마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 사람화된 중쇄 유전자좌로 삽입하기 위한 표적화 벡터를 프레데릭 알트 박사(Dr. Frederick Alt, Harvard University)로부터 입수된 세균 인공 염색체(Bacterial Artificial Chromosome: BAC) 929d24를 변형시키기 위해 VELOGENE® 유전자 조작 기술(상기 참조)을 이용하여 작제하였다. 929d24 BAC DNA를 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자 및 사람화된 중쇄 유전자좌의 사람 VH1-2와 VH6-1 유전자 절편 사이에 위치된 사람 ADAM6 유사유전자(hADAM6ψ)의 표적화 결실을 위한 하이그로마이신 카세트를 포함하는 게놈 단편을 포함하도록 조작하였다(도 12).
먼저, 마우스 ADAM6b 유전자, 약 800 bp의 상류 (5') 서열 및 약 4800 bp의 하류 (3') 서열을 포함하는 게놈 단편을 929d24 BAC 클론으로부터 서브클로닝하였다. 마우스 ADAM6a 유전자, 약 300 bp의 상류 (5') 서열 및 약 3400 bp의 하류 (3') 서열을 포함하는 제2 게놈 단편을 929d24 BAC 클론으로부터 별도로 서브클로닝하였다. 마우스 ADAM6b 및 ADAM6a 유전자를 포함하는 2개의 게놈 단편을 표적화 벡터(마우스 ADAM6 표적화 벡터, 도 12; 서열번호 3)를 생성하기 위해 Frt 재조합 부위가 플랭킹된 하이그로마이신 카세트에 라이게이션시켰다. 상이한 제한 효소 부위를 사람화된 중쇄 유전자좌로의 라이게이션을 위해 마우스 ADAM6b 유전자 다음의 표적화 벡터의 5' 말단 및 마우스 ADAM6a 유전자 다음의 3' 말단으로 조작하였다(도 12의 하단).
마우스 ADAM6 표적화 벡터의 후속 라이게이션을 위해 사람화된 유전자좌의 사람 VH1-2과 VH6-1 유전자 절편 사이에 위치되는 사람 ADAM6 유사유전자(hADAM6ψ)를 포함하여, 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌의 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌로의 대체를 포함하는 BAC 클론에 별도의 변형을 가하였다 (도 13).
간단히 설명하면, loxP 재조합 부위로 플랭킹된 네오마이신 카세트를 사람 VH1-2 유전자 절편의 위치 3' (hADAM6ψ에 대해 5') 및 사람 VH6-1 유전자 절편의 5' (hADAM6ψ에 대해 3'; 도 13의 중간 참조)에 사람 게놈 서열을 포함하는 상동성 아암을 포함하도록 조작하였다. 이러한 표적 작제물의 삽입 부위의 위치는 사람 ADAM6 유사유전자의 약 1.3 kb 5' 및 약 350 bp 3'이었다. 또한, 표적 작제물은 사람 ADAM6 유사유전자의 결실을 포함하는 변형된 BAC 클론과 마우스 ADAM6 표적화 벡터 사이의 후속적 BAC 라이게이션이 가능하도록 마우스 ADAM6 표적화 벡터와 동일한 제한 부위를 포함하였다.
작제물 모두로부터 유도되는 BAC DNA의 분해 후, 게놈 단편을 함께 라이게이션하여 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이소성으로 배치된 게놈 서열을 포함하는 사람화된 중쇄 유전자좌를 포함하는 조작된 BAC 클론을 작제하였다. 사람화된 중쇄 유전자좌 내의 사람 ADAM6 유전자를 결실시키고 ES 세포 내에 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 삽입하기 위한 최종 표적 작제물은, 5'부터 3'로, 사람 VH1-2 유전자 절편의 3'인 약 13 kb의 사람 게놈 서열, 마우스 ADAM6b 유전자의 하류인 800bp의 마우스 게놈 서열, 마우스 ADAM6b 유전자의 상류인 약 4800 bp의 게놈 서열, 5' Frt 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' Frt 부위, 마우스 ADAM6a 유전자의 하류인 약 300 bp의 마우스 게놈 서열, 마우스 ADAM6a 유전자, 마우스 ADAM6a 유전자의 상류인 약 3400 bp의 마우스 게놈 서열, 및 사람 VH6-1 유전자 절편의 5'인 약 30 kb의 사람 게놈 서열을 포함하는 3' 게놈 단편을 포함하였다(도 13 하단).
(상술된) 조작된 BAC 클론을 사람화된 중쇄 유전자좌 내에 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성으로 배치된 마우스 게놈 서열을 포함하는 변형된 ES 세포를 제조하기 위해 사람화된 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스 ES 세포를 전기천공하는데 사용하였다. 사람화된 중쇄 유전자좌 내에 이소성 마우스 게놈 단편을 포함하는 양성 ES 세포를 TAQMANTM 프로브를 사용하는 정량적 PCR 검정으로 확인하였다[참조: Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays, Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48]. 사람화된 중쇄 유전자좌의 변형된 부분의 바깥쪽의 상류 및 하류 영역을 사람화된 중쇄 유전자좌 내의 이소성 마우스 게놈 서열 및 하이그로마이신 카세트의 존재를 확인하기 위해 변형된 영역 내에 위치되는 프라이머 및 프로브를 사용하는 PCR에 의해 확인하였다. 상류 삽입점에 걸친 뉴클레오타이드 서열은, 삽입점의 상류인 사람 중쇄 게놈 서열 및 삽입점에 존재하는 마우스 게놈 서열에 인접하게 연결된 (하기 괄호 내에 포함되는) I-CeuI 제한 부위를 나타내는 하기를 포함하였다: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (서열번호 4). 표적 영역의 3' 말단의 하류 삽입점에 걸친 뉴클레오타이드 서열은, 마우스 게놈 서열 및 삽입점의 하류인 사람 중쇄 게놈 서열에 인접하게 연결된 (하기 괄호 내에 포함되는) PI-SceI 제한 부위를 나타내는 하기를 포함하였다: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (서열번호 5).
상기된 표적화된 ES 세포는 공여자 ES 세포로서 사용되었고 VELOCIMOUSE® 마우스 조작 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아로 도입되었다[참조예: 미국 특허 제7,6598,442호, 제7,576,259호, 및 제7,294,754호]. 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 서열을 포함하는 사람화된 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스는 사람화된 중쇄 유전자좌 내의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형을 이용하여 유전형으로 확인되었다[참조: Valenzuela et al ., 2003].
마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 포함하는 사람화된 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스를, 예를 들면, ES 세포 단계 또는 배아에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 Frt'ed 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 FLPe deleter 마우스 스트레인[참조: Rodriguez et al ., 2000, High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140]으로 사육하였다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
새끼들에 대해 유전형을 조사하고, 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 포함하는 사람화된 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 새끼를 마우스 ADAM6 유전자 발현 및 생식력을 특성확인하기 위해 선별하였다.
실시예 8
ADAM6 구제 마우스의 특성확인
유동 세포 분석. 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌 (H+/+κ+/+)에 동형접합성인 25주령의 3마리의 마우스 및 사람 중쇄 유전자좌 (H+/+A6resκ+/+) 모두의 대립유전자 내의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 이소성 마우스 게놈 단편을 갖는 사람 중쇄 및 사람 κ 경쇄에 대해 동형접합성인 18 내지 20주령의 3마리의 마우스를 BD LSR II System(BD Bioscience)에서 FACs로 림프구 세포 군집의 확인 및 분석을 위해 희생시켰다. 림프구를 특정 세포 계통에 대해 게이팅하고(gated) B 세포 발달의 다양한 단계를 통한 진행에 대해 분석하였다. 동물로부터 수집된 조직은 혈액, 비장 및 골수를 포함하였다. 혈액은 EDTA(BD Biosciences)로 BD 마이크로테이너 튜브로 수집하였다. 골수는 소 태아 혈청, 나트륨 피루베이트, HEPES, 2-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산 및 겐타마이신으로 보충된 완전 RPMI 배지로 플러싱함으로써 대퇴골로부터 수집하였다. 혈액, 비장 및 골수 제제로부터의 적혈구 세포를 염화암모늄-기반 용해 완충액(예: ACK 용해 완충액)으로 용해시킨 후, 완전 RPMI 배지로 세척하였다.
세포 군집을 염색하기 위해, 다양한 조직 공급원으로부터의 1 x 106 세포를 10분 동안 얼음 상에서 항-마우스 CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences)와 함께 항온배양한 후, 얼음 상에서 30분 동안 하기 항체 칵테일 중 하나 또는 배합물로 표지하였다:
골수: 항-마우스 FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).
말초혈 및 비장: 항-마우스 FITC-κ(187.1, BD Biosciences), PE-λ(RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). 표지된 항체와의 항온배양 후, 세포를 세척하고, 2% 포름알데하이드로 고정시켰다. 자료 획득을 LSRII 유동 세포계 상에서 수행하고, FlowJo (Treestar, Inc.)로 분석하였다. 대표적인 H+/+κ+/+ 및 H+/+A6resκ+/+ 마우스로부터의 결과가 도 14 내지 도 18에 도시되어 있다.
이 결과는, H+/+A6resκ+/+ 마우스의 B 세포가 골수 및 말초 구획물에서 H+/+κ+/+ 마우스와 유사한 양상으로 B 세포 발달 단계들을 통해 진행하며, 일단 말초로 들어가면 정상적인 성숙 패턴을 나타낸다는 것을 입증한다. H+/+A6resκ+/+ 마우스는 H+/+κ+/+ 마우스와 비교하여 증가된 CD43intCD19+ 세포 군집을 나타내었다(도 16b). 이는 H+/+A6resκ+/+ 마우스에서 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 포함하는 사람화된 중쇄 유전자좌로부터의 가속된 IgM 발현을 나타낼 수 있다. 말초에서, H+/+A6resκ+/+ 마우스의 B 및 T 세포 군집은 정상적으로 보이고 H+/+κ+/+ 마우스와 유사하다.
고환 형태 및 정자 특성확인. 사람화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 갖는 마우스의 불임이 고환 및/또는 정자 생산 결함 때문인지를 측정하기 위해서, 고환 형태 및 부고환의 정자 함량을 조사하였다.
간단히 설명하면, 2개의 그룹 (그룹당 n=5; 그룹 1: 사람 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스, H+/+κ+/+; 그룹 2: 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 이형접합성이고 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스, H+/-κ+/+)으로부터의 고환을 부고환과 함께 온전하게 절개하고 중량을 재었다. 이어서, 표본을 고정시키고, 파라핀에 함몰시킨 후, 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (HE) 염색으로 염색하였다. 고환 절편 (마우스당 2개의 고환, 총 20개)은 형태 결함 및 정자 생산의 증거에 대해 조사하고, 부고환 절편은 정자의 존재에 대해 조사하였다.
이러한 실험에서, 고환 중량 또는 형태에 있어 H+/+κ+/+마우스 및 H+/-κ+/+마우스 간에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 정자는 모든 유전형의 고환 및 부고환 모두에서 관찰되었다. 이들 결과는, 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 부재가 고환 형태에 검출가능한 변화를 일으키지 않으며 정자는 이들 2개의 유전자의 존재 및 부재 하에 마우스에서 생산된다는 것을 입증한다. 따라서, 수컷 H+/+κ+/+마우스의 생식력 결함은 낮은 정자 생산에 기인할 리가 없다.
정자 활력 및 이동. 다른 ADAM 유전자 패밀리 구성원이 결여되어 있는 마우스는 정자 활력 또는 이동 결함 때문에 불임이다. 정자 이동은 자궁에서 난관으로 이동하는 정자의 능력으로 정의되며, 통상 마우스의 생식력에 필요하다. 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b의 결실이 이러한 과정에 영향을 미치는지를 측정하기 위해서, 정자 활력 및 이동을 H+/+κ+/+ 마우스에서 평가하였다.
간단히 설명하면, 정자를 (1) 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 이형접합성이고 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스 (H+/-κ+/+); (2) 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성이고 사람 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스 (H+/+κ+/+); (3) 사람 중쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성이고 야생형 κ 경쇄에 대해 동형접합성인 마우스 (H+/+mκ); 및 (4) 야생형 C57 BL/6 마우스(WT)의 고환으로부터 수득하였다. 검사상 수치 또는 전체 정자 활력에서 어떠한 유의한 이상도 관찰되지 않았다. 모든 마우스에 대해, 큐물러스 (cumulus) 확산이 관찰되었으며, 이는 각각의 정자 샘플이 시험관내에서 큐뮬러스 세포에 침투하고 투명대 (zona pellucida)에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 결과는, H+/+κ+/+ 마우스가 큐물러스에 침투하고 투명대에 결합할 수 있는 정자를 갖는다는 것을 입증한다.
상술한 바와 같이 마우스로부터의 정자를 사용하여 시험관내에서 마우스 난자를 수정하였다 (IVF). 난소에 결합된 감소된 수의 정자와 함께 약간 적은 수의 갈라진 배아가 IVF 다음날 H+/+κ+/+ 마우스에 대해 관찰되었다. 이들 결과는, H+/+κ+/+ 마우스로부터의 정자가 일단 난자에 노출되면 큐뮬러스에 침투하고 투명대에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
다른 실험에서, 자궁으로부터 난관을 통해 이동하는 H+/+κ+/+ 마우스로부터의 정자의 능력을 정자 이동 검정으로 측정하였다.
간단히 설명하면, 제1 그룹의 초배란(super-ovulated) 암컷 마우스 (n=5)를 H+/+κ+/+ 수컷 (n=5)과 함께 교미시키고, 제2 그룹의 초배란 암컷 마우스 (n=5)를 H+/-κ+/+ 수컷 (n=5)과 함께 교미시켰다. 이들 쌍들의 교미를 관찰하고, 교미 후 5 내지 6시간에 모든 암컷으로부터 자궁 및 부착된 난관을 적출하고 분석을 위해 플러싱하였다. 플러싱 용액을 난자에 대해 점검하여 배란을 확인하고 정자 수치를 얻었다. 정자 이동을 2가지의 상이한 방식으로 평가하였다. 먼저, 난관 둘 다를 자궁으로부터 적출하고, 염수로 플러싱한 후, 확인되는 모든 정자를 계수하였다. 또한, 난자의 존재를 배란의 증거로서 관찰하였다. 두 번째로, 난관을 자궁에 부착되게 나두고, 조직 둘 다를 (상술된 바와 같이) 고정시킨 후, 파라핀에 함몰시키고, 절편화한 후, 염색하였다. 절편들을 자궁과 난관 둘 다에서 정자의 존재에 대해 조사하였다.
5마리의 H+/+κ+/+ 수컷과 교미된 암컷에 대해, 매우 적은 정자가 난관으로부터의 플러싱 용액에서 발견되었다. H+/-κ+/+ 수컷과 교미된 암컷의 난관으로부터의 플러싱 용액은 H+/+κ+/+ 수컷과 교미된 암컷의 난관으로부터의 플러싱 용액에 존재하는 것보다 약 25배 내지 30배 높은 (평균, n=10 난관) 정자 수준을 나타내었다. H+/+κ+/+ 및 H+/+A6resκ+/+ 마우스의 대표적인 사육 비교가 표 9에 나타나 있다.
자궁 및 난관의 조직학적 부분이 제조되었다. 이 부분을 자궁 및 난관 (난관구: colliculus tubarius)에서의 정자 존재에 대해 조사하였다. 난관 및 자궁의 조직학적 부분을 검사한 결과, H+/+κ+/+ 마우스와 교미된 암컷 마우스에 대해 정자가 자궁에서는 발견되었지만 난관에서는 발견되지 않았다. 또한, H+/+κ+/+ 마우스와 교미된 암컷으로부터의 부분을 검사한 결과, 정자가 자궁난관 접합부 (UTJ)에서 발견되지 않았다. H+/-κ+/+ 마우스와 교미된 암컷으로부터의 부분에서, 정자는 UTJ 및 난관에서 확인되었다.
이들 결과는 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자가 결여된 마우스는 생체내 이동 결함을 나타내는 정자를 만든다는 것을 입증한다. 모든 경우에서, 정자가 자궁 내에서 관찰되었으며, 이는 교미 및 정자 방출이 분명히 정상적으로 일어나지만, 정자 수치 또는 조직학적 관찰으로 측정되는 바와 같이, 교미 후 난관 내에서 적은 정자가 관찰되거나 관찰되지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 결과는, ADAM6a 및 ADAM6b 유전자가 결여된 마우스는 자궁으로부터 난관으로 이동하는 능력이 없는 정자를 생산한다는 것을 입증한다. 이러한 결함은 정자가 난자를 수정시키는 난관으로 가기 위해 자궁-세관 접합부를 가로지를 수 없기 때문에 명백히 불임을 초래한다. 종합하면, 이들 결과는 모두가, 마우스 ADAM6 유전자가 정자로 하여금 자궁으로부터 자궁난관 접합부 및 난관을 통해 이동하여 난자에 접근하고 수정이 일어나도록 정상적인 활력을 갖도록 한다는 가설을 지지하도록 수렴한다. ADAM6이 이를 달성하는 기작은 ADAM6 단백질 중 하나 또는 둘 다에 의하거나, 후술하는 바와 같이, 다른 단백질, 예를 들면, 정자 세포 내의 다른 ADAM 단백질과의 협조 발현을 통해 지시될 수 있다.
Figure pct00011
ADAM 유전자 패밀리 발현. ADAM 단백질의 컴플렉스가 성숙 정자의 표면 상에 컴플렉스로 존재하는 것으로 공지되어 있다. 다른 ADAM 유전자 패밀리 구성원이 결여된 마우스는 정자 성숙시 이러한 컴플렉스를 상실하며, 성숙 정자에서 다수의 ADAM 단백질 감소를 나타낸다. ADAM6a 및 ADAM6b 유전자의 결여가 유사한 방식으로 다른 ADAM 단백질에 영향을 미치는지의 여부를 측정하기 위해서, 고환 (미성숙 정자) 및 부고환 (성숙 고환)으로부터의 단백질 추출물을 웨스턴 블롯팅하여 다른 ADAM 유전자 패밀리 구성원의 발현 수준을 측정하였다.
이 실험에서, H+/+κ+/+ 및 H+/-κ+/+마우스의 그룹 (그룹당 n=4)으로부터의 단백질 추출물을 분석하였다. 그 결과, ADAM2 및 ADAM3의 발현이 고환 추출물에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, ADAM2 및 ADAM3 둘 다 부고환 추출물에서 극적으로 감소되었다. 이는 H+/+κ+/+ 마우스의 정자에서 ADAM6a 및 ADAM6b의 부재가 정자 성숙 시 다른 ADAM 단백질 (예: ADAM2 및 ADAM3)의 발현 및 아마도 기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증한다. 이는 ADAM6a 및 ADAM6b가 적합한 정자 이동에 결정적일 수 있는 정자 표면 상의 ADAM 단백질 컴플렉스의 부분이라는 것을 제시한다.
실시예 9
ADAM6 구제 마우스에서의 사람 중쇄 가변 유전자 이용
선택된 사람 중쇄 가변 유전자 이용을 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자 (H+/+κ+/+)가 결여되거나 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 이소성 게놈 단편을 포함하는 (H+/+A6resκ+/+) 사람 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스에 대해 (상기 기술되는 바와 같이) TAQMANTM 프로브를 사용하여 정량적 PCR 검정으로 측정하였다.
간단히 설명하면, CD19+ B 세포를 마우스 CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec)를 사용하여 H+/+κ+/+ 및 H+/+A6resκ+/+ 마우스의 비장으로부터 정제하고, 총 RNA를 RNeasyTM Mini kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 게놈 RNA를 RNA-비함유 DNase 온-컬럼 처리 (Qiagen)를 사용하여 분리시켰다. 약 200 ng의 mRNA를 First Stand cDNA Synthesis kit (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역-전사시킨 후, ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems)를 사용하면서 TAQMANTM Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 증폭시켰다. 각각의 유전자의 상대적 발현을 마우스 κ 경쇄 불변 영역 (mCκ)의 발현에 대해 표준화하였다. 표 10은 본 실험에 사용되는 센스/안티센스/TAQMANTM MGB 프로브 조합을 나타낸다.
Figure pct00012
본 실험에서, 4개의 사람 VH 유전자 모두의 발현이 분석된 샘플에서 관찰되었다. 또한, 발현 수준은 H+/+κ+/+ 및 H+/+A6resκ+/+ 마우스 간에 비슷하였다. 이들 결과는 변형 부위에 대해 원위이고 (VH3-23 및 VH1-69) 변형 부위에 대해 근위인 (VH1-2 및 VH6-1) 사람 VH 유전자가 모두 기능적으로 발현되는 사람 중쇄를 형성하도록 재조합할 수 있었다는 것을 입증한다. 이들 결과는, 사람 중쇄 게놈 서열로 삽입된 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 게놈 단편은 유전자좌 내의 사람 중쇄 유전자 절편의 V(D)J 재조합에 영향을 미치지 않았고, 이들 마우스가 기능성 중쇄 면역글로불린 단백질을 생산하도록 일반적인 방식으로 사람 중쇄 유전자 절편을 재조합할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 10
ADAM6 구제 마우스에서의 체액 면역 반응
체액 면역 반응을 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자가 결여되거나 (H+/+κ+/+) 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자를 암호화하는 이소성 게놈 단편을 포함하는 (H+/+A6resκ+/+) 사람 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스에 대해 다수-항원 면역화 계획 후 항체 분리 및 특성확인에 의해 측정하였다. 사람 면역글로불린 유전자 절편을 수반하는 V(D)J 재조합에 대한 임의의 효과의 측정, 혈청 역가 진행에 대한 평가, 하이브리도마에 의한 항체 생성 및 항원에 대한 친화성에 대해 결과들을 비교하였다.
면역화 프로토콜. 사람 세포 표면 수용체 (항원 A), 사람 수용체 티로신-단백질 키나제에 특이적인 사람 항체 (항원 B), TGF-β신호전달 경로의 조절에 작용하는 분비형 사람 단백질 (항원 C) 및 사람 수용체 티로신 키나제 (항원 D)을 마우스 그룹의 비교 면역화에 사용하였다. 상기 항원으로의 면역화 전에 마우스의 그룹으로부터 혈청을 수집하였다. 각각의 항원 (각각 2.3 μg)을 아주방트로서 10 μg의 CpG 올리고뉴클레오타이드 (Invivogen)과 함께 혼합된 초기 프라이밍 면역화물로 투여하였다. 면역원을 마우스당 25 μL의 용적으로 발바닥 (f.p.)을 통해 투여하였다. 그 후, 마우스를 총 6번의 부스팅 동안 3, 6, 11, 13, 17, 및 20일에 아주방트로서 10 μg의 CpG 및 25 μg의 Adju-Phos (Brenntag)와 함께 2.3 μg의 항원으로 f.p.를 통해 부스팅하였다. 각각 네 번째 및 여섯 번째의 부스팅 후 15일 및 22일에 채혈하고, 각각의 특정 항원에 대한 항체 역가에 대해 항혈청을 검정하였다.
항체 역가를 ELISA 검정을 이용하여 면역화된 마우스의 혈청에서 측정하였다. 96-웰 미세역가 플레이트 (Thermo Scientific)를 4℃에서 밤새 포스페이트-완충 염수 (PBS, Irvine Scientific) 중의 각각의 항원 (2 μg/ml)으로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 0.05% Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich)을 포함하는 포스페이트-완충 염수를 사용하여 플레이트 세척기 (Molecular Devices)로 4회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 중의 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich) 250 μL로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이어서, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청 및 면역전 혈청을 1:300 또는 1:1000로 시작하여 0.5% BSA-PBS 중에 연속해서 3배 희석하고, 이중으로 차단된 플레이트에 가한 후, 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 마지막 2개의 웰을 블랭크로 하여 이차 항체 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 플레이트 세척기에서 PBS-T로 4회 세척하였다. 이차 항체에 접합된 염소 항-마우스 IgG-Fc-서양고추냉이 퍼옥시다제 HRP, Jackson Immunoresearch) 또는 염소 항-마우스 IgG-kappa-HRP (Southern Biotech)의 1:5000/1:10,000 희석액을 플레이트에 가하고, 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 플레이트를 다시 PBS-T로 8회 세척하고, 기질로서 TMB/H2O2를 사용하여 전개시켰다. 기질을 20분 동안 항온배양하고, 반응을 2 N H2SO4 (VWR) 또는 1 N H3PO4 (JT Baker)로 정지시켰다. 플레이트를 450 nm에서 분광광도계 상에서 판독하였다. 항체 역가를 Graphpad PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
항체 역가는 배경의 2배 이상에 상응하는 항원 결합 신호에서 실험 적정 범위 내의 혈청 희석도로 계산되었다. 체액 면역 반응의 결과가 도 19 (항원 A), 도 20 (항원 B), 도 21 (항원 C), 및 도 22 (항원 D)에 도시되어 있다. 선택된 면역화 그룹 각각으로부터의 마우스로부터 분리된 2개의 비장을 사용하여 제조된 하이브리도마의 항원 양성 스코어가 표 11에 나타나 있다 (항원 스코어는 2X/배경과 동일하다)
본 실시예에서 나타나는 바와 같이, Adam6 구제 마우스 (H+/+A6resκ+/+)에서 생성되는 항체 역가는 ADMA6a 및 ADAM6b가 결여되고 사람화된 중쇄 (H+/+κ+/+)를 갖는 마우스에서 생성되는 것과 유사하였다. 또한, H+/+A6resκ+/+ 마우스로부터의 비장은, 고친화성 항체를 포함하여, 시험된 모든 항원에 대해 H+/+κ+/+ 마우스에 견줄 수 있는 수준으로 항원-양성 하이브리도마를 생산하였다. 따라서, 사람 면역글로불린 유전자를 포함하는 고친화성 항체를 생산하는 한, Adam6 구제 마우스에서 사람 면역글로불린 유전자 절편의 V(D)J 재조합 장애는 존재하는 것으로 믿어지지 않는다.
Figure pct00013
실시예 11
항원 결합 친화도 측정
항원 B에 특이적 결합을 나타내는 항체의 결합 친화도를 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 (BIAcore 2000)를 사용하여 스크리닝하였다. 항원 B (H+/+κ+/+ 및 H+/+A6resκ+/+)로 면역화된 2가지의 마우스 스트레인으로부터 분리된 하이브리도마로부터의 조건조절된 배지를 BIAcore 스크리닝 동안 사용하였다. BIAcore 센서 표면을 먼저 폴리클로날 래비트 항-마우스 항체 (GE)로 피복시켜 조건조절된 배지로부터 항-항원 B 항체를 포착하였다. 전체 스크리닝 방법 동안, HBST (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)를 러닝 (running) 완충액으로 사용하였다. 항원 B의 Fab 단편을 100 nM 농도로 50 μL/분의 유속으로 항-항원 B 항체 포착된 표면 상에 주입하였다. 항체-항원 결합을 3분 동안 모니터링하고, 포착된 항체로부터 항원의 해리를 HBST 러닝 완충액에서 5분 동안 모니터링하였다. 이 실험을 25℃에서 수행하였다. 동역학적 결합 속도 상수 (ka) 및 해리 속도 상수 (kd)를 Scrubber 2.0 커브 피팅 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 자료를 프로세싱 및 피팅하여 측정하였다. 결합 해리 평형 상수 (KD) 및 해리 반감기 (T1 /2)는 동역학적 속도 상수로부터 KD (M) = kd / ka; 및 T1 /2 (min) = (ln2/(60*kd)로 계산되었다. 선택된 항-항원 B 항체에 대한 결과가 표 12에 나타나 있다.
Figure pct00014
유사한 실험에서, 항원 A에 결합하는 하이브리도마-조건조절된 배지에 존재하는 상이한 모노클로날 항체의 동역학을 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 (BIAcore 4000) 검정으로 측정하였다. 이 검정에 사용된 모든 하이브리도마 클론은 H+/+A6resκ+/+ 마우스에서 생성되었다.
간단히 설명하면, 항원 A-특이적 항체를 포착하기 위해서, 폴리클로날 래비트 항-마우스 항체 (GE Catalog# BR-1008-38)를 먼저 센서 칩에 고정시켰다. BIAcore 스코어링을 2개의 상이한 완충액 - PBSP, pH7.2 및 PBSP, pH6.0-에서 수행하였다. 완충액 둘 다 0.1 mg/ml BSA로 보충되었다. 조건조절된 배지로부터의 항-항원 A 항체를 포착한 후, 1 μM의 항원 A 모노머 (각각의 러닝 완충액에서 제조됨)를 30 μL/분으로 1.5분 동안 포착된 항체 표면 상에 주입하고, 결합된 항원 A 모노머의 해리를 25℃에서 각각의 러닝 완충액에서 1.5분 동안 모니터링하였다. 동역학적 결합 속도 상수 (ka) 및 해리 속도 상수 (kd)를 Scrubber 2.0 커브 피팅 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 자료를 프로세싱 및 피팅하여 측정하였다. 결합 해리 평형 상수 (KD) 및 해리 반감기 (T1 /2)는 동역학적 속도 상수로부터 KD (M) = kd / ka; 및 T1 /2 (min) = (ln2/(60*kd)로 계산되었다. 표 13은 pH7.2 및 pH6.0에서 항원 A 모노머에 결합하는 선택된 항-항원 A 항체에 대한 결합 동력학 변수를 제시한다. NB: 본 실험 조건 하에 검출되는 결합이 없음.
Figure pct00015
Figure pct00016
상기한 바와 같이, 고친화도 항체가 비슷한 방식으로 H+/+A6resκ+/+ 및 H+/+κ+/+ 마우스 모두로부터 수득되었다. 표 12에 나타낸 25개의 항체 중, H+/+A6resκ+/+ 마우스에서 생성된 20개는 0.5 nM 내지 1 μM의 친화도 범위를 나타내었고, H+/+κ+/+ 마우스에서 생성된 5개는 10 nM 내지 150 nM의 친화도 범위를 나타내었다. 또한, 표 13에 나타낸 55개의 항체는 항원 A 모노머에 대한 결합에 대해 20 pM 내지 350 nM의 친화도 범위를 나타내었다.
본 실시예에서 입증되는 바와 같이, 마우스 Adam6 유전자의 사람화된 면역글로불린 중쇄 유전자좌로의 재삽입은, 조작된 배선으로부터 재배열된 사람 유전자 절편으로부터 유도되는 서브나노몰 범위의 다양한 친화도를 갖는 사람 항체의 레퍼토리로 특징지어지는 다수의 항원에 대한 강력한 면역 반응을 증가시킬 마우스의 능력을 손상시키지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ADAM6 MICE <130> 1360A-WO <150> US 61/446,895 <151> 2011-02-25 <150> US 61/497,650 <151> 2011-06-16 <150> US 61/595,200 <151> 2012-02-06 <160> 58 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 754 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val 1 5 10 15 Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val 20 25 30 Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser 35 40 45 Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln 50 55 60 Ala Gln Arg Leu Leu Ser Tyr Ser Leu Arg Phe Arg Gly Gln Arg His 65 70 75 80 Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu 85 90 95 Leu Thr Thr Gln Asp Asp Gln Gly Ala Leu Gln Met Glu Tyr Pro Phe 100 105 110 Phe Pro Val Asp Cys Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Leu Gln 115 120 125 Ser Met Val Thr Val Asp Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Val Ile 130 135 140 Lys Leu Asp Asn Leu Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Asn Asp Ser Gln 145 150 155 160 Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Met Asn Ala Trp Lys His Trp Ser His Asn Thr Gly Ser Pro 180 185 190 Ser Ser Arg Leu Glu Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Arg Leu Ser Ser Lys 195 200 205 Asn Tyr Ala Thr His Pro Ala Ala Ile Lys Gly His Phe Gln Ala Thr 210 215 220 His Ser Val Tyr Ser Ala Ser Gly Gly Asp Lys Leu Ser Ser Thr Val 225 230 235 240 Glu Tyr Leu Phe Lys Val Ile Ser Leu Met Asp Thr Tyr Leu Thr Asn 245 250 255 Leu His Met Arg Tyr Tyr Val Phe Leu Met Thr Val Tyr Thr Glu Ala 260 265 270 Asp Pro Phe Ser Gln Asp Phe Arg Val Pro Gly Gly Gln Ala His Thr 275 280 285 Phe Tyr Glu Arg Val Phe Tyr Ala His Phe Arg Pro Asp Ala Gly Ala 290 295 300 Ile Ile Asn Lys Asn Ser Pro Gly Asp Asp Ala Val Asn Pro Ala Glu 305 310 315 320 Arg Ser Ile Cys Ser Pro Ser Ala Leu Ile Cys Leu Gly Gln His Gly 325 330 335 Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Ile Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg 340 345 350 Ser Leu Gly Leu Lys His Asp Glu Gly Tyr Cys Ile Cys Gln Arg Arg 355 360 365 Asn Thr Cys Ile Met Phe Lys Asn Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser 370 375 380 Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Asp Leu 385 390 395 400 Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu 405 410 415 Thr Tyr Lys Phe Cys Gly Asn Phe Lys Val Asp Asn Asn Glu Gln Cys 420 425 430 Asp Cys Gly Ser Gln Lys Ala Cys Tyr Ser Asp Pro Cys Cys Gly Asn 435 440 445 Asp Cys Arg Leu Thr Pro Gly Ser Ile Cys Asp Lys Glu Leu Cys Cys 450 455 460 Ala Asn Cys Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Thr Leu Cys Arg Pro Ile Gln 465 470 475 480 Asn Ile Cys Asp Leu Pro Glu Tyr Cys Ser Gly Ser Lys Phe Ile Cys 485 490 495 Pro Asp Asp Thr Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Pro Cys Ser Glu Glu Gly 500 505 510 Tyr Cys Tyr Lys Gly Asn Cys Thr Asp Arg Asn Ile Gln Cys Met Glu 515 520 525 Ile Phe Gly Val Ser Ala Lys Asn Ala Asn Ile Lys Cys Tyr Asp Ile 530 535 540 Asn Lys Gln Arg Phe Arg Phe Gly His Cys Thr Arg Ala Glu Glu Ser 545 550 555 560 Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu 565 570 575 Gln Cys Thr Asn Val Thr Asn Leu Pro Phe Leu Gln Glu His Val Ser 580 585 590 Phe His Gln Ser Val Ile Ser Gly Val Thr Cys Phe Gly Leu Asp Glu 595 600 605 His Arg Gly Thr Glu Thr Ala Asp Ala Gly Leu Val Arg His Gly Thr 610 615 620 Pro Cys Ser Arg Gly Lys Phe Cys Asp Arg Gly Ala Cys Asn Gly Ser 625 630 635 640 Leu Ser Arg Leu Gly Tyr Asp Cys Thr Pro Glu Lys Cys Asn Phe Arg 645 650 655 Gly Val Cys Asn Asn Arg Arg Asn Cys His Cys His Phe Gly Trp Ser 660 665 670 Pro Pro Lys Cys Lys Glu Glu Gly His Ser Gly Ser Ile Asp Ser Gly 675 680 685 Ser Pro Pro Val Gln Arg Arg Ile Ile Lys Gln Asn Leu Glu Pro Val 690 695 700 Val Tyr Leu Arg Ile Leu Phe Gly Arg Ile Tyr Phe Leu Phe Val Ala 705 710 715 720 Leu Leu Phe Gly Ile Ala Thr Arg Val Gly Val Thr Lys Ile Phe Arg 725 730 735 Phe Glu Asp Leu Gln Ala Ala Leu Arg Ser Trp Gln Glu Gln Ala Lys 740 745 750 Asp Lys <210> 2 <211> 756 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val 1 5 10 15 Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val 20 25 30 Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser 35 40 45 Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln 50 55 60 Ala Gln Arg Leu Leu Ser Tyr Ser Leu His Phe Arg Gly Gln Arg His 65 70 75 80 Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu 85 90 95 Leu Thr Thr Gln Asp Asp Gln Gly Ala Leu Gln Met Asp Tyr Pro Phe 100 105 110 Phe Pro Val Asp Cys Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Pro Gln 115 120 125 Ser Met Val Thr Val Asp Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Val Met 130 135 140 Lys Leu Asp Asp Leu Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Asn Asp Ser Gln 145 150 155 160 Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Met Asn Ala Trp Lys His Trp Ser His Asn Thr Gly Ser Pro 180 185 190 Ser Ser Arg Leu Glu Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Arg Ile Ser Ser Lys 195 200 205 Asn Tyr Ala Thr His Pro Ala Ala Ile Lys Gly His Phe Gln Ala Thr 210 215 220 Asn Ser Val Tyr Asn Ser Ala Ala Gly Asp Lys Leu Ser Ser Thr Val 225 230 235 240 Gly Tyr Leu Phe Gln Val Ile Ser Leu Met Asp Thr Tyr Leu Thr Asn 245 250 255 Leu His Met Arg Tyr Tyr Val Phe Leu Met Thr Val Tyr Thr Asn Ser 260 265 270 Asp Pro Phe Arg Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Gly Ser Ala Tyr Asn 275 280 285 Tyr Tyr Val Ser Val Phe Tyr Asn Lys Phe Lys Pro Asp Ala Gly Val 290 295 300 Leu Leu Asn Lys Tyr Gly Pro Gln Asp Asn Gln Val Asn Pro Ala Glu 305 310 315 320 Arg Ser Ile Cys Ser Ser Leu Ala Leu Ile Cys Ile Gly Lys Tyr Asp 325 330 335 Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Pro Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg 340 345 350 Ser Leu Gly Leu Lys Tyr Asp Glu Gly Tyr Cys Val Cys Gln Arg Arg 355 360 365 Asn Thr Cys Ile Met Phe Arg His Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser 370 375 380 Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Gly Leu 385 390 395 400 Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu 405 410 415 Thr Tyr Lys Phe Cys Gly Asn Phe Lys Val Asp Asn Asp Glu Gln Cys 420 425 430 Asp Cys Gly Ser Gln Lys Ala Cys Tyr Ser Asp Pro Cys Cys Gly Asn 435 440 445 Asp Cys Arg Leu Thr Pro Gly Ser Ile Cys Asp Lys Glu Leu Cys Cys 450 455 460 Ala Asn Cys Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Thr Leu Cys Arg Pro Ile Gln 465 470 475 480 Asn Ile Cys Asp Leu Pro Glu Tyr Cys Asn Gly Thr Lys Tyr Ile Cys 485 490 495 Pro Asp Asp Thr Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Pro Cys Ser Glu Asp Gly 500 505 510 Tyr Cys Tyr Lys Gly Asn Cys Thr Asp Arg Asn Ile Gln Cys Met Glu 515 520 525 Ile Phe Gly Val Ser Ala Lys Asn Ala Asn Ile Lys Cys Tyr Asp Ile 530 535 540 Asn Lys Gln Arg Phe Arg Phe Gly His Cys Thr Arg Ala Glu Glu Ser 545 550 555 560 Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu 565 570 575 Gln Cys Thr Asn Val Thr Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Glu His Val Ser 580 585 590 Phe His Gln Ser Ile Ile Ser Gly Phe Thr Cys Phe Gly Leu Asp Glu 595 600 605 His Arg Gly Thr Glu Thr Thr Asp Ala Gly Met Val Arg His Gly Thr 610 615 620 Pro Cys Ser Lys Ser Lys Phe Cys Asp Gln Gly Ala Cys Ser Gly Ser 625 630 635 640 Leu 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gtaccatgtc tcaccaatcc agcatctgct gtttctgtcc 1200 cacgatgttc atcaagccca aagcaggtaa ccccagagat aaccgattga tggaatgaaa 1260 catgttcttg caaaaatgga agattggtga cattggtaca ctgcaacctt ccacacagct 1320 tgtcctgatc agcacaagca ttgaatgtga ggctttcttc tgctctagta caatgcccaa 1380 atcgaaaccg ttgtttgttg atgtcatagc acttaatatt agcattctta gcacttacac 1440 caaagatttc catgcattgt atgttgcgat cagtgcagtt acctttatag cagtaaccct 1500 cttctgagca tggtgtccca tcttgcagat aagtgtcatc tgggcaaatg aacttagagc 1560 cactacagta ctctggaaga tcacatatgt tctggatagg tctgcagagt gtcccagaag 1620 gactgtaagt gcaatttgca cagcataatt ctttatcaca aatgctacca ggtgttaacc 1680 tgcaatcatt tccacagcag ggatctgaat aacatgcctt ttgggagcca cagtcacact 1740 gctcattgtt atctactttg aagtttccac aaaacttata agtcaatgat gtattataat 1800 aaacatgacg gtcatagaaa agacatggca tcagatcagg agtattaagt atgttgctta 1860 tctctgcaag ggaacaattg ctgaaagcat ctgttaattg aggatttttg aacatgatgc 1920 aggtgttcct tctctggcag atacagtacc cctcatcatg ttttaggcct aaactccttc 1980 caacacgatt ggttattata 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tccagaattt ttaaaaattc catctcttgg gaacattatc 3720 tctgaccccg tctgaggccg aagtggctgt ccccctccaa cctttagtat ctttctttcc 3780 tgactattgg gatttcttca agcaatcagg ctgatgggtt ctcagcagtg agaccagtag 3840 actgtcggta tgaacgtcga agagtctgcc acacactccg ggttcatcaa cagtgctttc 3900 gcgtctctta cttttgtaga aggaaatgca gcctctgagt tttctccaag aaatcattga 3960 tgaaagggtg aaaagatggg tatcacccgg agttcatgac aagccctggc tcagacacgt 4020 gagcaaggtc tacagcccca aagataggct gccctgcaac atgtatttat aagataggag 4080 aaaaaaatgg gtagttggag ggttgatcaa cttacttcct ctcaaacata tatatctcat 4140 ctaagtgtgc aggggaaaac tctgtagaac tactgggata cctgctcacc cccaggagcc 4200 tcatgaataa gtctctgctt ctgccttgta gccatgagca ttactgcacc tgatacccct 4260 gcagcttcct agggaagagg gaggaagtga cttggcccct gtctggttaa ggtaagagga 4320 gataaatccc ttctcattga ttagggtgag aggggtcatg tgctctatca ttggtgaccc 4380 agttgggaca tgggtttata ccaaagtcat cactctgagg ttctgtgtac caccaggctg 4440 aactcccata tcctacatgg acataggaca acaccaagca gaaggaggtt ttaggactaa 4500 actgaaggac agagatgcgg 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gcggtggagc tctgatgtgg gaacgcttca gtgttcagga 7920 accatatgat ttatttaaaa tatagaatca aaagtaccaa tttgcagttt tgaaagattt 7980 attccagtgt aagcattagc aatgcaccaa catcaggtga tttctgaatc caacacgtct 8040 tatgtcctca tgatattaaa aaaaaaaaaa ggccatccag aactgtgaac ttgagttcta 8100 ccttgttccc tactgacatt cagattttct tttttgcatt ctctttatct tacaggagac 8160 aggaggggag ggctaactca ttttactttg gcttgtccct tgctggtcct tgcccagaac 8220 gtaaagtagc ttgcaagtct tcaaatctaa aaatcttagt aactcctaca cgagtggcaa 8280 tgccaaagag cagtgcaaca aagaggaagt aaatacgacc aaagagtatt cttaaataca 8340 ccactggctc ttgtttttgt tttattgtgt gcctttgaac tggaggggac ccactgtcta 8400 tgctcccact tagtccctct tctttgcact ctggaggctt ccaaccaaaa tgacaatggc 8460 aattccgatg attgttacac actcctctaa aactgcattt ttctggggtg cagtcataac 8520 ccaaatgaga taaacttcca ctgcaagctc cttgatcaca gaacttactt ttggagcagg 8580 gggtaccatg tctcaccatt ccagcatctg ttgtttctgt cccacgatgt tcatcaagcc 8640 caaagcaggt aaacccagag ataatcgatt gatggaatga aacatgttct tgcaaatatg 8700 gaagattggt gacattggta 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ctgatgggtt ctcagcagtg agaccagtag actgccggta tgaacgtcga 11280 agagactgcc acacactcca ggttcatcaa cagtgctttc gcgtctctta cttttgtaga 11340 aggaaaagca gcctctgagt tatctccaag aaatcattaa tgaaagagtt aaaagatggg 11400 tatcacccgg agttcatgac aagccctggc tcagacacgt gagcaaggtc tacagcccca 11460 aagataggct gccctgcaac atgtatttat aagatagaag aaaaaaatgg gtggttggag 11520 ggttgatcaa cttacttcct ctcaaacata tatatctcat ctaagtgtgc aggggaaaac 11580 tctgtaggac tactgggatt gttattatca ttattattat tattattatt attattatta 11640 ttattattat tattaactta aggcatttta ttagatattt tcttcattta gttttcaaat 11700 gttatccccg gaacctccta tactctctcc ctgccctgct ccccaaccca cccactccta 11760 catcctggcc ctggcattcc cctatactgt ggcagatgat cttcgtaaga ccaagagcct 11820 ttcctcccat tgatggccta ctaggctatc ctcttttaca tatgcaacta gagtcacagc 11880 tctggggagg tattgcttag ttcatattgt ttttcctcct atagggttgc agatcccttt 11940 agctccttgg gtactttctc tagctcctcc attgggggcc ctgtgttcca tccaatagat 12000 gactgtgagc atccacttct gtatttgcca ggtattggca tggatcttac tgcaccttct 12060 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atatcacaat 12900 gcggttggga tatagataac tgtaaatact tgtgaaaata atggggctga gatctggggt 12960 tttcatgata gtttcaaagt cactgtactg actaaaacct tccactggcc catctccagc 13020 ttgttaatct gagggtatca aatttcccac taagtgtgtt tagaaagatc tccacctttt 13080 tgccctagtc ttccagtgcc ccacctacgt tctggtctcc cacatctgat gtcttctcag 13140 tgattctggc cctgcctgct ccacagctac aaaccccttc ctataatgag ctctgtgctg 13200 agccatcatc ctgaatcaat ccaccttaag cagatgtttt gcttattttt cctgtgtcca 13260 tactacagag gaagggtagg catgtagaag ctgaggcatc tcatctcact ctaagcaccc 13320 tcagtctcta aatgtgcccc tttgtttcca gcagttcagc ctcaagcatc ttttattcac 13380 tcgtcttaga gggacacatg tgctgtagtg ttataagatg aaatttaaag cattagttat 13440 tcccaacaag ccaattaaac aagccaaaaa cattcatcag tcattcccat ggaacctctg 13500 aagcatcttc ctgctctaac cttgagtttc ctagggctgc tgtgggatca caggagctgt 13560 cctgtttacc agcctatcct gtcccacggg attcagttat tagtgggtgc gagggggacc 13620 gcaaacctgg aagaaaatgg gattggaaga gaaaagagaa acgaagacca agtagatctt 13680 ttcctatcaa ggtcttcgtt tattaggctg aggtgcctgg 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 caggtacagc tgcagcagtc a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 ggagatggca caggtgagtg a 21 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 tccaggactg gtgaagc 17 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 tagtcccagt gatgagaaag agat 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 gagaacacag aagtggatga gatc 24 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 tgagtccagt ccaggga 17 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 12 aaaaattgag tgtgaatgga taagagtg 28 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 aaccctggtc agaaactgcc a 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 agagaaacag tggatacgt 19 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 aactacgcac agaagttcca gg 22 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 gctcgtggat ttgtccgc 18 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 cagagtcacg attacc 16 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 tgagcagcac cctcacgtt 19 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 gtggcctcac aggtatagct gtt 23 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 accaaggacg agtatgaa 18 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 gctagtagtg gggcctacag gccttttgat atc 33 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 gcaaaagccc aggggagtgg gagctactac acctatgctt ttgatatc 48 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 gcgagagagg gtatagtggg aactactgag gactttgatt ac 42 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 gcgagaggga cagtgggagc cctctttgac tac 33 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 gcgaaaccta gtgggagcta ctcctggttc gacccc 36 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 gcgagaggag gagggtataa ctggaactcg aatgcttttg atatc 45 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 27 gcgagaggat ataactggaa ctactttgac tac 33 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 28 gcgaaagagt ataactggaa ccactggtac tttgactac 39 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 29 gcgagagaga taactggaac cccctttgac tac 33 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 gcgaggggat ataactggaa cttttctttt tttgactac 39 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 gcgagaggta actggaactc tctgggcttt gactac 36 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 gcgaaaaggg ctactatggt tcggggagct cttgactac 39 <210> 33 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 gcgagagata ttactatggt tcggggagtt attataacga aggtctacgg tatggacgtc 60 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 gcgagagagt atagcagctt tgactac 27 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 gcgagagaga gtatagcagc tcgttgtgac tac 33 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 36 gcaagagagg ataggagctc gcccctcggg tactttgact ac 42 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 37 gcgagagatc ttggggaagg ctac 24 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 38 accacccata actggggagg gtttgactac 30 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 39 gcgagagata ggggaccg 18 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 40 caacagagtt atagtacccc tccggagacg 30 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 41 caacagctta atagttaccc tcggacg 27 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 42 caacagctta atagttacca ttcact 26 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 43 caacatttta atagttaccc gctcact 27 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 44 cagcagtata ataactggcc tctcact 27 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 45 ctacagcata atagttaccc gtggacg 27 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 46 ctacagcata atagttaccc tcggacg 27 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 47 cagcagtatg gtagctcacc tcggacg 27 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 48 atgcaaggta cacactggcc gtggacg 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 49 atgcaaggtt cacactggcc gtacact 27 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 50 atgcaaggta cacactggcc gctcact 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 51 caacagtatg ataatctccc tcccact 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 52 caacagtatg ataatctccc attcact 27 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 53 caacagtatg ataatctccc cgtcact 27 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 54 caacagtatg ataatctccc gatcacc 27 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 55 caacggattt acaatgccga cacc 24 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 56 caacagagtt acagtacccc catgtacact 30 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 57 caacagagtt acagtacccc tctcact 27 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 58 caacagagtt acagtactcc tcccact 27

Claims (30)

  1. 면역글로불린 중쇄 유전자좌(locus)의 변형을 포함하는 게놈을 갖는 마우스로서,
    상기 변형은 내생적(endogenous) ADAM6 기능을 감소시키거나 제거시키고, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질, 이의 이종상동체(ortholog) 또는 상동체(homolog), 또는 상응하는 ADAM6 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 게놈을 갖는 마우스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 이소성 위치(ectopic position)에 배치되는, 마우스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 서열이 내생적 면역글로불린 유전자좌에 있는, 마우스.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 서열이 내생적 면역글로불린 유전자좌 이외의 다른 위치에서 마우스 게놈에 통합되는, 마우스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형이 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 서열의 배치를 포함하는, 마우스.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형이 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 하나 이상의 서열을 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 서열로 대체하는 것을 포함하는, 마우스.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형이 하나 이상의 내생적 중쇄 V(VH) 유전자 절편을 하나 이상의 사람 중쇄 V(VH) 유전자 절편으로 대체하는 것을 포함하는, 마우스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형이 내생적 중쇄 가변 유전자 서열을 사람 중쇄 가변 유전자 서열로 대체하는 것을 포함하는, 마우스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 마우스 ADAM6a 단백질 및/또는 ADAM6b 단백질, 또는 이의 이종상동체, 상동체 또는 기능성 단편을 암호화하는, 마우스.
  10. 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 변형시키는 방법으로서,
    (a) 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에, 수컷 마우스에서의 내생적 마우스 ADAM6 활성을 감소시키거나 제거시키는 제1 변형을 가하는 단계; 및
    (b) 상기 마우스에게 수컷 마우스에서 기능성인 마우스 ADAM6 활성을 부여하는 핵산 서열을 추가하는 제2 변형을 상기 마우스에게 가하는 단계를 포함하는, 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 변형시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 핵산 서열이 이소성 위치에서 추가되는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 변형이 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 서열의 배치를 포함하는, 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 변형이, 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있는 하나 이상의 서열을 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 서열로 대체하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 변형이 하나 이상의 내생적 VH 유전자 절편을 하나 이상의 사람 VH 유전자 절편으로 대체하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 제1 변형이 내생적 중쇄 가변 유전자 서열을 사람 중쇄 가변 유전자 서열로 대체하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 변형 및 상기 제2 변형이 동시에 이루어지는, 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는, 마우스.
  18. 제1항 내지 제9항 및 제17항 중 어느 한 항의 마우스로부터의 분리된 세포.
  19. 제1항 내지 제9항 및 제17항 중 어느 한 항의 마우스로부터의 분리된 조직.
  20. 사람-마우스 역-키메라 항체, 완전 사람 항체, 완전 사람 Fab 단편, 및/또는 완전 사람 F(ab)2 단편을 생성하기 위한 제1항 내지 제9항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 마우스의 용도.
  21. 항원에 대해 특이적인 역-키메라 마우스-사람 항체를 생성하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제9항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 마우스를 상기 항원으로 면역화시키는 단계;
    b) 상기 항원에 대해 특이적인 역-키메라 마우스-사람 항체를 생성하는 상기 마우스로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계; 및
    c) 상기 단계 b)의, 항체를 생성하는 하나 이상의 세포를 배양하여 상기 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 역-키메라 마우스-사람 항체를 생성하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 단계 c)에서의 배양을, 상기 단계 b)에서 수득된 하나 이상의 세포로부터 생성되는 하나 이상의 하이브리도마 세포에서 수행하는, 방법.
  23. 항원에 대해 특이적인 완전 사람 항체를 생성하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제9항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 마우스를 상기 항원으로 면역화시키는 단계;
    b) 상기 항원에 대해 특이적인 역-키메라 마우스-사람 항체를 생성하는 상기 마우스로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계;
    c) 상기 단계 b)의 항체로부터 유도되고 상기 항원에 대해 특이적인 완전 사람 항체를 생성하는 하나 이상의 세포를 생성하는 단계; 및
    d) 상기 단계 c)의 항체를 생성하는 하나 이상의 세포를 배양하여 상기 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 완전 사람 항체를 생성하는 방법.
  24. 제21항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 수득되는 하나 이상의 세포가 비장 세포 또는 B 세포인, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)의 항원으로의 면역화가 단백질, DNA, DNA와 단백질의 배합물, 또는 상기 항원을 발현하는 세포를 이용하여 수행되는, 방법.
  27. 내생적 ADAM6 기능을 감소시키거나 제거시키는 변형인 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 게놈을 갖는 마우스의 생식력을 회복 또는 증진시키기 위한, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 이종상동체 또는 상동체, 또는 상응하는 ADAM6 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열의 용도.
  28. 제27항에 있어서, 상기 핵산 서열이 이소성 위치에서 마우스의 게놈에 통합되는, 용도.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 핵산 서열이 내생적 면역글로불린 유전자좌에서 마우스의 게놈에 통합되는, 용도.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 핵산 서열이 내생적 면역글로불린 유전자좌 이외의 다른 위치에서 마우스의 게놈에 통합되는, 용도.
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