ES2829376T3 - Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos - Google Patents
Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2829376T3 ES2829376T3 ES14715432T ES14715432T ES2829376T3 ES 2829376 T3 ES2829376 T3 ES 2829376T3 ES 14715432 T ES14715432 T ES 14715432T ES 14715432 T ES14715432 T ES 14715432T ES 2829376 T3 ES2829376 T3 ES 2829376T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- human
- gene
- segments
- locus
- gene segments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title description 33
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title description 9
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 claims abstract description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 54
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 54
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 54
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 54
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 22
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 21
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 18
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000003720 plasmablast Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 69
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 51
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 230000007720 allelic exclusion Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 102000016897 CCCTC-Binding Factor Human genes 0.000 description 6
- 108010014064 CCCTC-Binding Factor Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 6
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100365003 Mus musculus Scel gene Proteins 0.000 description 3
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 3
- 101710101078 Proton-activated chloride channel Proteins 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000614095 Homo sapiens Proton-activated chloride channel Proteins 0.000 description 1
- 101150006978 J1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150061944 J2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150001433 J3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071292 J4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150073538 V1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000889 V2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 1
- 102000022628 chromatin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091013410 chromatin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010045512 cohesins Proteins 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un ratón transgénico que comprende: (a) un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2 y una región de control de locus (LCR) relacionada, y (b) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen de VH humano, segmentos del gen D humano, segmentos del gen J humano, segmentos del gen de región constante de rata, y una LCR relacionada, en donde: los segmentos del gen de VH humano consisten de, en el orden siguiente de 5' a 3', VH169, VH459, VH353, VH349, VH434, VH348, VH330, VH333, VH323, VH118, VH315, VH4b, VH18, VH307, VH25, VH44, VH12, y VH61, los segmentos del gen J humano comprenden los seis segmentos del gen J humanos los segmentos del gen D humano consisten de 21 segmentos del gen D humano en el orden siguiente de 5' a 3': D11, D22, D39, D310, D411, D512, D613, D114, D2 15, D316, D317, D518, D619, D120, D221, D322, D423, D524, D625, D126, y D727, y los segmentos del gen de la región constante de rata comprenden Cμ, Cγ2c, Cγ1, Cγ2b, y Cα, y en donde el locus de cadena pesada de ratón endógeno y el locus de cadena ligera kappa de ratón endógeno se han deshabilitado.
Description
DESCRIPCIÓN
Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos mejorados para la derivación y selección usando mamíferos no humanos transgénicos de un repertorio diverso de inmunoglobulinas tetraméricas maduradas por afinidad funcionales que comprenden cadenas pesadas y ligeras en respuesta a la exposición al antígeno y usos de los mismos.
En la siguiente descripción, todos los números de posición de los residuos de aminoácidos se dan de acuerdo con el sistema de numeración ideado por Kabat et al. (1991) US Public Health Services publicación N° 91 3242.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Anticuerpos
La estructura de los anticuerpos es bien conocida en la técnica. La mayoría de los anticuerpos naturales son tetraméricos, comprendiendo dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se unen entre sí mediante enlaces disulfuro entre los dominios bisagra localizados aproximadamente en la mitad de cada cadena pesada. Una cadena ligera está asociada con cada cadena pesada en el lado N-terminal del dominio bisagra. Cada cadena ligera está normalmente unida a su cadena pesada respectiva por un enlace disulfuro cerca del dominio bisagra.
Cuando una molécula de anticuerpo se pliega correctamente, cada cadena se pliega en una serie de dominios globulares distintos unidos por secuencias polipeptídicas más lineales. Por ejemplo, la cadena ligera se pliega en un dominio variable (Vl) y uno constante (Ck o Ca). Las cadenas pesadas tienen un único dominio variable VH, un primer dominio constante (Ch1), un dominio bisagra y dos o tres dominios constantes adicionales. Los dominios constantes de la cadena pesada y el dominio bisagra forman juntos lo que se conoce generalmente como la región constante de una cadena pesada del anticuerpo. La interacción de los dominios variables de la cadena pesada (Vh) y ligera (Vl) da como resultado la formación de una región de unión a antígeno (Fv). La interacción de las cadenas pesada y ligera se facilita por el dominio Ch1 de la cadena pesada y el dominio Ck o Ca de la cadena ligera. En general, se requieren tanto Vh como Vl para la unión a antígenos, aunque se ha demostrado que los dímeros de cadena pesada y los fragmentos aminoterminales retienen la actividad en ausencia de cadena ligera (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). Generalmente, la proporción de cadena ligera A circulante es baja, representando quizás el 2-5% de la cadena ligera total complejada como una inmunoglobulina tetramérica en plasma (Goldsby et al. (2003) Immunology, 5a edición, W.H. Freeman & Co NY). La manipulación in vitro de genes de inmunoglobulina de la cadena pesada para construir nuevos anticuerpos se describió por primera vez en la década de 1980. Gran parte del trabajo de ingeniería de anticuerpos inicial usó un gen de inmunoglobulina g (IgM) de ratón reordenado generado contra un antígeno bien caracterizado. Una característica de este anticuerpo era que se sabía que la especificidad de unión al antígeno residía en los dominios Vh, ya que el ensamblaje y la secreción con una cadena ligera irrelevante mostraba retención de la unión al antígeno (Neuberger y Williams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond., A317, 425-432). Usando este sistema, se demostró que un dominio de unión a Vh específico de antígeno de ratón podría usarse para derivar un nuevo anticuerpo que comprenda una región efectora constante £ humana fusionada a un dominio Vh específico de antígeno de ratón. La IgE híbrida resultante retuvo la especificidad del antígeno y mostró la actividad efectora esperada de una IgE (Neuberger et al. (1985) Nature, 314, 268-270). Otros ejemplos de la bibliografía de la ingeniería de la cadena pesada incluyen: genes de anticuerpos de ratónhumano híbridos que codifican fusiones de anticuerpos IgA o IgG humanos Vh de ratón que retienen la actividad anti-fosfocolina (Morrison et al (1984) PNAS, 81, 6851 a 6.855.); un anticuerpo de antígeno 17-1A asociado a anti carcinoma que comprende Vh ratón y la región constante de IgG humana (y3) (Sun et al. (1987) PNAS, 84, 214 218.); y un anticuerpo de células T anti-humano (anti CD7) que comprende la región constante de IgG humana (y1I) y dominios Vh de ratón (ver Heinrich et al. (1989) J. Immunol, 143, 3589-97).
Las células B humanas normales contienen un único locus de cadena pesada de inmunoglobulina en el cromosoma 14 a partir del cual se produce por reordenamiento el gen que codifica una cadena pesada. En el ratón, el locus de la cadena pesada está localizado en el cromosoma 12. Un locus de la cadena pesada normal comprende una pluralidad de segmentos del gen V, una serie de segmentos del gen D y una serie de segmentos del gen J. La mayor parte de un dominio Vh está codificado por un segmento del gen V, pero el extremo C terminal de cada dominio Vh está codificado por un segmento del gen D y un segmento del gen J. El reordenamiento de VDJ en las células B, seguido de la maduración por afinidad, proporciona a cada dominio VH su especificidad de unión al antígeno. El análisis de secuencia de tetrámeros H2L2 normales derivados de una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende un único segmento V demuestra que la diversidad en respuesta a la exposición al antígeno resulta principalmente de una combinación del reordenamiento de VDJ y de la hipermutación somática (Xu y Davies
(2000) Immunity, 13, 37-45). Hay más de 50 segmentos del gen V humanos presentes en el genoma humano de los cuales solo 39 son funcionales. En las células B productoras de anticuerpos diploides normales, cada célula produce un tetrámero de anticuerpo (H2L2) a partir de un único conjunto de loci de anticuerpos de cadena pesada y ligera. El otro conjunto de loci no se usa de forma productiva como resultado de un proceso llamado exclusión alélica (Singh et al. (2003) J. Exp. Med., 197, 743-750 y referencias en el mismo).
Los anticuerpos completamente humanos (H2L2) ahora pueden derivarse de ratones transgénicos en respuesta a la exposición al antígeno. Tales ratones transgénicos generalmente comprenden un único locus de inmunoglobulina de cadena pesada humana y un locus de inmunoglobulina de cadena ligera humana separado. Las correspondientes secuencias codificantes de loci de cadena pesada endógena de ratón, cadena ligera kappa y, opcionalmente, cadena ligera lambda se eliminan o se eliminan parcialmente. Por tanto, solo se producen anticuerpos humanos que comprenden una cadena ligera kappa en un fondo bajo de anticuerpos de ratón/humanos que comprenden una cadena pesada humana y una cadena ligera lambda de ratón (WO90/04036; W093/12227; WO98/24893; US5877397, US5814318 y US6162963). Se ha logrado la eliminación de segmentos de todos los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera endógena de murino para eliminar completamente la expresión génica de cadena pesada y ligera endógena, pero sigue siendo técnicamente exigente, particularmente si se considera necesaria la eliminación de toda la secuencia codificante de la cadena ligera lambda. La eliminación de la secuencia codificante de la cadena ligera lambda murina se ha logrado mediante la eliminación completa de todos los segmentos de los genes V y J funcionales y las regiones constantes C1, C2 y C3 del locus lambda, dando como resultado un ratón con un locus de cadena ligera lambda silenciado (ver EP1399559).
Un enfoque diferente consiste en limitar el desarrollo de células B de ratón y la secreción de inmunoglobulina mediante la alteración de los exones de la membrana del gen que codifica el gen de la cadena pesada murina. Por tanto, aunque el gen de la cadena pesada murina endógeno es funcional, ya que se transcribe y experimenta un reordenamiento de VDJ en respuesta a exposición al antígeno, como la IgM nunca se expresa en la superficie celular de las células pre-B, se detiene el desarrollo posterior, lo que da como resultado una respuesta no productiva a la exposición al antígeno (Kitamura et al. (1991) Nature, 350, 423-426), incluso aunque los genes endógenos de la cadena ligera kappa y lambda de ratón permanecen estructuralmente intactos y funcionales (Tuaillon (2000) Molecular Immunology, 37, 221-231).
Cuando los loci de genes de cadena pesada y de cadena ligera de ratón endógenos permanecen funcionales, cualquier transgén de la cadena pesada de inmunoglobulina adicional introducido también está regulado por exclusión alélica, de manera que algunas células B expresan funcionalmente sólo loci de cadena pesada y ligera de ratón y solo otros loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera de ratón (Nussenzweig et al. (1987) Science, 236, 816-819). En cualquier animal transgénico no humano individual, hay una población muy diversa de células B que expresan anticuerpos derivados de potencialmente todos los loci de inmunoglobulina en respuesta a la exposición a antígenos dispares. La selección posterior de anticuerpos específicos del antígeno usando tecnología de hibridoma establecida usando selección HAT (Davis et al. (1982) J. Immunol. Methods, 50, 161-171) no distingue entre hibridomas que expresan uno en oposición a otro locus de inmunoglobulina de cadena pesada.
Los elementos reguladores presentes en los transgenes de la cadena pesada de inmunoglobulina comprenden elementos potenciadores específicos de tejido esencial para asegurar la expresión específica de células B de una manera dependiente del número de copias. La presencia de un potenciador intrónico 5' y la región de control de locus 3' ("LCR") asegura que los transgenes estén activos en todas las etapas de la maduración de las células B (Guglielmi et al. (2003) Biochim. Biophys. Acta, 1642, 181 -190). La inclusión de LCR específicos de cadenas pesadas y ligeras en los loci del transgén asegura no solo que la expresión sea específica de células B, sino que la expresión se produzca independientemente del sitio de integración en el genoma (WO90/10077, Mills et al. (1997) J Exp. Med., 186, 845-858 y Pettersson et al. (1997) Immunobiol, 198, 236-248)). Por tanto, siempre que haya un LCR presente, cada transgén es funcional independientemente de su posición en el genoma. En el caso de que el LCR presente en el transgén se elimine parcialmente, la cromatina que rodea al transgén solo se abre parcialmente a la transcripción en cualquier punto temporal, lo que lleva a una expresión en mosaico del efecto posicional y, por lo tanto, niveles limitados de expresión del transgén en el tejido objetivo (Festenstein et al. (1996) Science, 23, 271 (5252): 1123-5; Milot et al. (1996) Cell, 87(1), 105-14).
Un enfoque alternativo para la producción de inmunoglobulinas humanas en un fondo de ratón es reemplazar los segmentos de genes de inmunoglobulina murina con los segmentos de genes homólogos de humanos. Por tanto, si sólo los segmentos de los genes V, D y J de ratón se reemplazan por homólogos humanos, dará como resultado un anticuerpo híbrido de ratón/humano funcional que comprende dominios VH y VL humanos y las regiones constantes de ratón (efectoras) después de la exposición al antígeno (WO94/04667). Si todos los segmentos de genes murinos se reemplazan por homólogos humanos, entonces dará como resultado una inmunoglobulina completamente humana después de la exposición al antígeno (US6596541). Una ventaja percibida de este enfoque es que, siempre que solo se intercambien las regiones codificantes, el transgén resultante retiene todos los elementos reguladores del ratón, asegurando de este modo la respuesta máxima a la exposición al antígeno. Este enfoque proporciona altos títulos en suero de anticuerpos humanos de alta afinidad o anticuerpos híbridos de ratón/humanos, dependiendo de la configuración final de los transgenes. En realidad, sin embargo, la
sustitución de todos los segmentos V, D y J individuales del genoma del ratón mediante recombinación homologa es una tarea larga y ardua. De manera similar, la construcción de un transgén de cadena pesada que comprende los 39 segmentos V, D y J humanos funcionales con regiones constantes (efectoras) es técnicamente muy exigente.
La WO 2010/070263 describe animales transgénicos no humanos que expresan anticuerpos humanizados y el uso de los mismos. Osborn et al. (2013) J. Immunol. 190(4):1481-1490 informa que los anticuerpos de IgG de alta afinidad se desarrollan naturalmente en ratas Ig-knockout que llevan loci de gH/IgK/IgA humanos de la línea germinal que llevan la región Ch de rata. La WO 02/066630 describe métodos de modificación de células eucariotas. Murphy et al. (2009) Recombinant Antibodies for Immunotherapy, páginas 100-107 describe la región variable de inmunoglobulina de ratones humanizados. La US 2012/192300 describe una cadena ligera común de ratón. La WO 2011/163311 describe ratones que expresan una cadena ligera con regiones constantes variables lambda y de ratón. LeFranc (2001) The Immunoglobulin Facts Book, Primera Edición, páginas 1-44 y 97-228 describe segmentos de genes de inmunoglobulina humana.
Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos que no dependan de la deleción de segmentos grandes de ADN genómico, o deleciones múltiples, que permitan (i) métodos simplificados y reproducibles para la construcción y expresión específica de células B, de loci de inmunoglobulina transgénicos, y cuya expresión funcional sea dependiente del antígeno y finalmente se determine por exclusión alélica; y (ii) la capacidad de seleccionar hibridomas o células B y sus derivados (Babcook JS et al PNAS, 1996 Jul 23;93(15):7843-8.) que expresen y secreten tetrámeros de inmunoglobulina ensamblados que comprendan el repertorio del segmento V completo presentes en los loci transgénicos de cadena pesada, o alternativamente para seleccionar células que expresen un subconjunto de segmentos del gen V presentes en uno en oposición a otro locus transgén de cadena pesada.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un ratón transgénico que comprende:
(a) un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2 y una región de control de locus (LCR) relacionada, y
(b) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen de VH humano, segmentos del gen D humano, segmentos del gen J humano, segmentos del gen de región constante de rata, y una LCR relacionada, en donde:
los segmentos del gen de CH humano consisten de, en el orden siguiente de 5’ a 3’, VH1-69, VH4-59, VH3-53, VH3-49, VH4-34, VH3-48, VH3-30, VH3-33, VH3-23, VH1-18, VH3-15, VH4-b, VH1-8, VH3-07, VH2-5, VH4-4, VH1-2, y VH6-1,
los segmentos del gen J humano comprende los seis segmentos del gen J humanos
los segmentos del gen D humano consisten de 21 segmentos del gen D humano en el orden siguiente de 5’ a 3’: D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D4-11, D5-12, D6-13, D1-14, D215, D3-16, D3-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D3-22, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, y D7-27,
y los segmentos del gen de la región constante de rata comprenden Cg, C y 2c, C y 1 , CY2b, y Ca , y en donde el locus de cadena pesada de ratón endógeno y el locus de cadena ligera kappa de ratón endógeno se han deshabilitado.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente divulgación, un mamífero no humano comprende un transgén que comprende uno o más loci de genes de cadena ligera kappa heterólogos, con o sin elementos reguladores específicos de células B asociados.
En particular, en la presente se divulga un mamífero no humano transgénico que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen Vk humano, segmentos del gen Jk humano y un segmento del gen de la región constante de rata, en donde los segmentos del gen V k humano comprenden, en el orden siguiente de 5’ a 3’, V k 2-30, V k 2-28, V k 1-5, V k 1-9, V k 1-27, V k 1-33, V k 1-39, V k 3-20, V k 3-15, Vk3-11, y Vk4-1, los segmentos del gen Jk humano comprenden los cinco segmentos del gen Jk humano, y el segmento del gen de la región constante comprende Ck.
El mamífero no humano puede comprender alternativamente o adicionalmente un transgén que comprende uno o más loci génicos de cadena ligera lambda de inmunoglobulina heterólogos, con o sin elementos reguladores específicos de células B asociados.
Por tanto, en la presente se divulga un mamífero no humano transgénico que comprende un locus de
cadena ligera lambda de inmunoglobulina heterólogo que comprende cuatro segmentos del gen VA humano, dos segmentos del gen J humano y dos segmentos del gen de la región constante de rata, en donde los segmentos del gen VA humano comprenden, en el orden siguiente de 5' a 3', VA3-19, VA3-1, VA2-8, yd VA1-51, los segmentos del gen J humano comprenden JA1 y JA3, y los segmentos del gen de la región constante comprenden CA2 y CA3.
En el mamífero no humano como se ha definido anteriormente, el transgén puede comprender un locus del gen de cadena ligera heterólogo que comprende además un gen marcador selectivo dominante.
Los mamíferos no humanos como se han definido anteriormente pueden comprender alternativamente o adicionalmente un transgén que comprende uno o más loci del gen de cadena pesada heterólogos con o sin elementos reguladores específicos de células B asociados.
En particular, en la presente se divulga un mamífero no humano transgénico que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen de Vh humano, segmentos del gen D humano, segmentos del gen J humano y segmentos del gen de la región constante de rata, en donde los segmentos del gen de VH humano comprenden, en el siguiente orden de 5' a 3', VH1-69, VH4-59, VH3-53, VH3-49, VH4-34, VH3-48, VH3-30, VH3-33, VH3-23, VH1-18, VH3-15, VH4-b, VH1-8, VH3-07, VH2-5, VH4-4, VH1-2, y VH6-1, los segmentos del gen J humano comprenden los seis segmentos del gen J humano, los segmentos del gen D humano comprenden 21 segmentos del gen D humano y los segmentos del gen de la región constante de rata comprenden Cg, Cy2c, Cy1, CY2b, y Ca.
Si se desea, el mamífero no humano puede comprender dos o más transgenes que comprenden dos o más loci de genes de cadena pesada heterólogos diferentes y elementos reguladores específicos de células B asociados.
En el mamífero no humano, el o cada transgén puede comprender un locus del gen de cadena pesada heterólogo que comprende un gen marcador selectivo dominante.
Preferiblemente, el mamífero no humano comprende un transgén que comprende un locus de gen de cadena ligera kappa heterólogo y un transgén que comprende uno o más loci heterólogos de cadena pesada.
Alternativamente, el mamífero no humano puede comprender un transgén que comprende un locus del gen de la cadena ligera lambda heterólogo y un transgén que comprende uno o más loci de la cadena pesada heterólogos.
En una alternativa adicional, el mamífero no humano puede comprender un transgén que comprende un locus del gen de la cadena ligera kappa heterólogo, un transgén que comprende un locus del gen de la cadena ligera lambda y un transgén que comprende uno o más loci del gen de la cadena pesada heterólogos.
Por tanto, en la presente se divulga un mamífero no humano transgénico que comprende:
i) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen de VH humano, segmentos del gen D humano, segmentos del gen J humano y segmentos del gen de la región constante de rata, en donde los segmentos del gen de VH humano comprenden, en el siguiente orden de 5' a 3', VH1-69, VH4-59, VH3-53, VH3-49, VH4-34, VH3-48, VH3-30, VH3-33, VH3-23, VH1-18, VH3-15, VH4-b, VH1-8, VH3-07, VH2-5, VH4-4, VH1-2, y VH6-1, los segmentos del gen J humano comprenden los seis segmentos del gen J humano, los segmentos del gen D humano comprenden 21 segmentos del gen D humano y los segmentos del gen de la región constante de rata comprenden Cg, Cy2c, Cy1, CY2b, y Ca; y
ii) un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen Vk humano, segmentos del gen Jk humano y un segmento del gen de la región constante de rata, en donde los segmentos del gen Vk humano comprenden, en el siguiente orden de 5' a 3', Vk2-30, Vk2-28, Vk1-5, Vk1-9, Vk1-27, Vk1-33, Vk1-39, Vk3-20, Vk3-15, Vk3-11, y Vk4-1, los segmentos del gen Jk humano comprenden los cinco segmentos del gen Jk humano, y el segmento del gen de la región constante comprende Ck; y/o un locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina heterólogo que comprende cuatro segmentos del gen VA humano, dos segmentos del gen J humano, y dos segmentos de la región constante de rato, en donde los segmentos del gen VA humano comprenden, en el siguiente orden de 5’ a 3’, VA3-1, VA3-19, VA2-8, y Vk1 -51, los segmentos del gen J humano comprenden JA1 y JA3, y los segmentos del gen de la región constante comprenden CA2 y CA3.
Preferiblemente, cada locus heterólogo incorpora una LCR relacionada.
Cada locus heterólogo es preferiblemente un locus humano.
Sin embargo, cada locus heterólogo puede ser un locus híbrido que comprende regiones variables y regiones constantes derivadas de más de una especie, como un locus híbrido que comprende regiones variables humanas y regiones constantes de rata o murino.
El mamífero no humano puede comprender grupos de transgenes que comprenden diferentes grupos de diferentes loci de genes de cadena pesada heterólogos, en donde cada grupo de transgenes comprende un gen marcador selectivo dominante diferente.
Alternativamente, el mamífero no humano puede comprender transgenes que comprenden loci de cadena ligera heterólogos y transgenes que comprenden loci de cadena pesada heterólogos, en donde los transgenes que comprenden loci de cadena ligera heterólogos y transgenes que comprenden loci de cadena pesada heterólogos comprenden cada uno un gen marcador selectivo dominante diferente.
En particular, en la presente se divulga un mamífero no humano transgénico que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1. También se divulga en la presente un mamífero no humano transgénico que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, y un mamífero no humano transgénico que comprende un locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
También se divulga en la presente un mamífero no humano transgénico que comprende:
i) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1. y ii) un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, y/o un locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3.
El mamífero no humano es preferiblemente un roedor, como un ratón.
En un aspecto de la divulgación, el locus endógeno de la cadena pesada de ratón y/o el locus endógeno de la cadena ligera kappa del ratón pueden desactivarse.
De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo monoclonal híbrido heterólogo específico de antígeno que comprende:
(a) inmunizar un ratón transgénico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 con el antígeno; (b) preparar hibridomas o células B, plasmablastos, células B de memoria o células plasmáticas, cada una de las cuales produce un anticuerpo monoclonal a partir de las células B del ratón transgénico inmunizado;
(c) seleccionar opcionalmente por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que exprese el anticuerpo heterólogo mediante el uso de genes marcadores selectivos dominantes presentes en los transgenes que comprenden los loci de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina heterólogos; y
(d) seleccionar por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que produzca un anticuerpo que se una específicamente al antígeno.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para derivar un anticuerpo humano a partir de un anticuerpo híbrido que comprende:
(a) llevar a cabo el método como se ha descrito anteriormente;
(b) seleccionar por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que produzca un anticuerpo que se une específicamente al antígeno y comprenda dominios de unión Vh y Vl de la especie de elección;
(c) clonar y secuenciar los dominios Vh y Vl;
(d) volver a clonar secuencias seleccionadas que comprenden las secuencias codificantes de los dominios de unión Vh y Vl con dominios efectores constantes de elección de la misma especie; y
(e) coexpresar las secuencias vueltas a clonar que codifican polipéptidos de cadena pesada y ligera de la especie deseada usando un vector de expresión en un tipo celular de elección.
Pueden emplearse otros métodos para obtener anticuerpos monoclonales. Ver, por ejemplo, Cheung et al., Nat Biotechnol, 25 de marzo de 2012; 30(5):447-52, doi: 10.1038/nbt.2167; Pasqualini, R. y Arap, W. Hybridoma-free generation of monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 257-259 (2004); Reddy, S.T. et al. Monoclonal antibodies isolated without screening by analyzing the variable-gene repertoire of plasma cells. Nat. Biotechnol. 28,
965-969 (2010); y Steenbakkers PG, van Meel FC, Olijve W.J Immunol Methods. 31 de julio de 1992;152(1 ):69-77. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 representa la composición de un locus híbrido de IgK humano/de rata.
El extremo 3' del locus se obtuvo del ratón (patrón de rayas diagonales) que contenía el potenciador k 3' de ratón (patrón de rayas diagonales). Las secuencias de codificación constante de ratón se reemplazaron con las de la rata, incluyendo su potenciador 5' obtenido por reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") de largo alcance a partir de ADN genómico de rata (patrón de tablero de ajedrez). Los segmentos JK humanos se obtuvieron a partir de un cromosoma artificial plásmido ("PAC") que cubre esta parte del locus humano (patrón de rayas verticales). Las cajas negras son segmentos de Vk añadidos individualmente o como un bloque. El locus resultante contiene todos los segmentos de Vk humanos usados de manera frecuente y frecuente moderada (cajas negras).
La Figura 2 representa la composición de un locus de IgH híbrido humano/de rata.
El locus se generó ligando regiones Vh juntas a un concatémero de 17 regiones Vh humanas consecutivas (cajas negras) clonadas entre sitios Scel. Se añadió una región espaciadora de ratón a un fragmento humano de 40 kb que contenía 21 segmentos Dh humanos (cuadros de patrón de cuadrícula) y los seis Jh (cuadros de patrón de rayas verticales) para mantener la distancia adecuada entre los segmentos Dh y Vh. A esto siguió la adición de un segmento Vh6-1 que contiene un sitio Scel. Luego, se añadió el concatámero sobre el Vh6-1. Finalmente, las varias regiones constantes de rata (cuadros de patrón de tablero de ajedrez), incluidas las regiones de cambio, y la LCR murina (cuadro de patrón de rayas diagonales) se añadieron en el lado 3'. El locus resultante contiene todos los segmentos de Vh humanos usados de manera frecuente y frecuente moderada.
La Figura 3 representa la composición de un locus de IgA híbrido humano/de rata.
El extremo 3' del locus se obtuvo del ratón (patrón de rayas diagonales) que contenía el LCR 3' A de ratón (patrón de rayas diagonales). Las secuencias de codificación constantes de ratón se reemplazaron con las de rata mediante PCR de largo alcance a partir de ADN genómico de rata (patrón de tablero de ajedrez). El segmento en sentido descendente desde VA1-5 1 hasta las secuencias JA humanas se obtuvo de ratón (patrón de rayas diagonales) para mantener la separación apropiada entre las regiones V y J. Los segmentos de Ja humanos se obtuvieron mediante PCR de largo alcance de un PAC humano que cubría esta parte del locus humano (cajas de patrón de rayas verticales). Las cajas negras son segmentos de VA añadidos individualmente o como un bloque.
La Figura 4 representa una secuencia de locus de cadena pesada (SEQ ID NO:1).
Las secuencias resaltadas en negrita son las secuencias de codificación de aminoácidos y de intrones de los segmentos de VH. Subrayado entre estos están las secuencias de unión. Cada una de estas está flanqueada por una secuencia en cursiva que señala el comienzo y el final de cada segmento VH (secuencias de codificación más flanqueantes). Los segmentos D y los segmentos J están subrayados y las regiones constantes están en negrita y subrayadas.
La Figura 5 representa una secuencia de locus de cadena ligera Kappa (SEQ ID NO: 2).
Las secuencias resaltadas en negrita son las secuencias de codificación de aminoácidos e intrones de los segmentos de VL. Subrayado entre estas están las secuencias de unión. Cada uno de esta está flanqueada por una secuencia en cursiva que señala el comienzo y el final de cada segmento de VL (secuencias de codificación más flanqueantes). Los segmentos J están subrayados; las regiones constantes están en negrita y subrayadas. La Figura 6 representa una secuencia del locus de la cadena ligera Lambda (SEQ ID NO: 3).
Las secuencias resaltadas en negrita son las secuencias de codificación de aminoácidos e intrones de los segmentos de VL. Los segmentos de J están subrayados; las regiones constantes están en negrita y subrayadas.
La Figura 7 representa una estrategia para desactivar la IgH de ratón.
La línea superior muestra la región C|j del ratón con los diferentes exones, incluyendo los dos exones que codifican la forma de membrana de IgM. A la izquierda están las regiones J, D y Vh del locus, a la derecha las otras regiones constantes comenzando con la C5. Las líneas inferiores muestran parte de la secuencia de aminoácidos del exón M1 normal después de la recombinación. La secuencia de ADN muestra la secuencia de integración. El codón de parada está en una caja, el sitio Spe I está resaltado con una línea doble.
La Figura 8 : representa una inserción Ck de ratón para desactivar el locus k .
El locus se muestra en la línea superior. La parte inferior muestra la secuencia en el extremo 5' del exón CK (que está marcado con un asterisco en la línea superior) con la codificación de aminoácidos escrita sobre las bases. El par de bases GG al principio flanquea inmediatamente el sitio aceptor de corte y empalme que codifica el aminoácido R después del corte y empalme. La línea media muestra la inserción de una inserción de sitio lox de 34 pares de bases (secuencia repetida invertida subrayada y doble subrayada), que pone el uso de codones de la región constante fuera del marco y crea codones de parada en sentido descendente (por ejemplo, TGA en
negrita subrayado). Secuencias de potenciador k círculo negro y k -LCR círculo blanco.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En el contexto de la presente invención, el término "heterólogo" significa una secuencia de nucleótidos o un locus como se describe en la presente que no es endógeno al mamífero en el que se encuentra.
El mamífero no humano puede comprender por tanto un transgén que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina heterólogo y elementos reguladores específicos de células B asociados, que preferiblemente comprenden una LCR y/o un transgén que comprende un locus de cadena ligera lambda heterólogo y elementos reguladores específicos de células B asociados, que preferiblemente comprenden una 89LCR.
La presencia de LCR relacionadas no es esencial para la expresión específica de células B. Su inclusión dentro de los loci asegura que la expresión transgénica de alto nivel se produce en cada sitio de integración y no depende de eventos de integración aleatorios, solo algunos de los cuales se producen fortuitamente dentro de regiones de cromatina transcritas activamente en células B. El uso de LCR relacionadas reduce significativamente el número de animales transgénicos que deben ser detectados para la expresión de anticuerpos y permite la inserción de más de un locus génico, con la certeza de que todos los loci insertados se expresarán a niveles esencialmente normales en una célula B de manera específica. Por tanto, el uso de la tecnología LCR, combinado con la sorprendente observación de que los mecanismos de exclusión alélica discriminarán entre genes de inmunoglobulina endógenos y múltiples transgenes competidores, abre el camino para el ensamblaje de mamíferos no humanos transgénicos que comprenden uno o más loci de genes de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, siendo cada locus de complejidad génica de V reducida con respecto a los genes endógenos y que comprenden una pieza de ADN relativamente manejable (<300 Kb) para ensamblar in vitro con respecto a los loci endógenos (1-2Mb). Por ejemplo, los 39 segmentos del gen V de cadena pesada de inmunoglobulina humana funcional pueden clonarse en dos o más loci de cadena pesada de inmunoglobulina. Cada uno comprenderá diferentes segmentos del gen V, pero tienen en común segmentos de los genes D y J y regiones constantes (efectoras). La inclusión de la LCR asegura que cada uno se exprese de manera idéntica, independientemente del sitio de integración dentro del genoma. Por tanto, la inclusión de dos o más loci pequeños de esta manera proporciona la misma complejidad del gen V de un único gen más complejo presente en un único fragmento de gen grande que es técnicamente difícil de manipular.
Cada locus de cadena ligera heterólogo puede comprender segmentos del gen Vl, segmentos del gen J y un segmento de región constante de cadena ligera. Preferiblemente, los segmentos de los genes Vl y J y el segmento de la región constante de la cadena ligera se derivan de la misma fuente de mamífero, por ejemplo, roedor, cerdo, vaca, cabra u oveja. Preferiblemente, son de origen humano.
Alternativamente, los loci de cadenas ligeras heterólogos pueden ser loci híbridos que comprenden dominios variables de origen mamífero, preferiblemente de origen humano, y regiones constantes (efectoras) de un mamífero diferente como, pero no limitados a, ratón, rata, hámster, conejo, cerdo, cabra y vaca. Cuando el mamífero huésped es un ratón, preferiblemente las regiones constantes son de origen roedor, más preferiblemente ratón o rata. Tales loci de cadenas ligeras heterólogos comprenden segmentos de Vl y J preferiblemente de una sola especie y una región constante de cadena ligera de otra especie.
Cuando se contemplan transgenes híbridos de cadena ligera kappa, los segmentos de genes Vl y J son preferiblemente de la misma especie, contribuyendo con los segmentos de genes V, D y J de cadena pesada, y son preferiblemente de origen humano. Las regiones constante de cadena ligera kappa y constante de cadena pesada también se derivan preferiblemente de la misma especie pero una especie diferente de la de los dominios variables contribuyentes y son preferiblemente de origen roedor y preferiblemente derivadas de rata o ratón.
Una característica de todos los transgenes de cadena ligera contemplados es que, después de la exposición al antígeno, la cadena ligera se reordena de una manera específica para las células B y que, después de la transcripción y la traducción, la cadena ligera resultante es capaz de formar complejos con la inmunoglobulina de cadena pesada derivada del transgén producida en la misma célula B. La expresión productiva de tetrámeros de inmunoglobulina da lugar a la expansión de células B y los complejos de inmunoglobulina tetravalentes específicos de antígeno codificados por transgén pueden acumularse en suero en ausencia de niveles significativos de tetrámeros de inmunoglobulina endógenos.
Cuando no se ha suprimido funcionalmente la expresión de la cadena ligera lambda endógena, entonces pueden detectarse niveles bajos de anticuerpo huésped o híbrido que comprende cadenas ligeras lambda endógenas. Estas pueden descartarse tras la detección de sobrenadantes de hibridomas.
En los humanos, hay 36 segmentos del gen Vl kappa funcionales, cinco segmentos del gen Jl y una única región constante de cadena ligera kappa (http://imgt.cines.fr). Preferiblemente, un locus de cadena ligera kappa heteróloga presente en un transgén en el mamífero no humano de la divulgación comprende uno o más segmentos
del gen Vl humano, todos los segmentos del gen Jl humano y una única región constante de cadena ligera kappa humana. Los segmentos del gen Vl humano pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 segmentos del gen Vl humano seleccionados entre Vk2-30, Vk2-28, Vk1-5, Vk1-9, Vk1-27, Vk1-33, Vk1-39, Vk3-20, Vk3-15, Vk3-11, y Vk4-1. Opcionalmente, la región constante de cadena ligera kappa humana puede reemplazarse por una región constante de cadena ligera kappa de mamífero alternativa, preferiblemente de origen de rata o ratón.
El ratón transgénico también puede comprender un locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina heterólogo. Un locus de cadena ligera lambda heterólogo presente en un transgén en el ratón transgénico de la invención comprende preferiblemente una LCR lambda murina, y segmentos de genes V1 y V2 de cadena ligera lambda humana, segmentos de genes J1, J2, J3 y J4 de lambda humana, y segmentos de la región constante de cadena ligera lambda humana C1, C2, C3 y C4 (WO90/10077 y WO2003/000737). Los segmentos de los genes V1 y V2 de la cadena ligera lambda humana pueden comprender 1, 2, 3 o 4 segmentos del gen Vl humano seleccionados de VA3-19, VA3-1, VA2-8, y VA1 -51. Los segmentos del gen J humano pueden comprender JA1 y JA3. Los segmentos del gen de la región constante comprenden CA2 y CA3. Opcionalmente, los segmentos de la región constante C1, C2, C3 y C4 de la cadena ligera lambda humana pueden reemplazarse por regiones constantes de cadena ligera lambda alternativas, preferiblemente de origen de rata o ratón.
El mamífero no humano también puede comprender un locus de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogo. Un locus de cadena pesada heterólogo presente en un transgén en el mamífero no humano de la divulgación comprende preferiblemente una LCR de inmunoglobulina de cadena pesada, preferiblemente de origen murino, uno o más segmentos del gen V humano, uno o más segmentos del gen J y uno o más segmentos del gen D. Preferiblemente, hay 10 o más segmentos del gen V humanos diferentes y todos los segmentos de los genes J y D humanos. Preferiblemente, hay 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 o más segmentos del gen V humano diferentes seleccionados de VH1-69, VH4-59, VH3-53, VH3-49, VH4-34, VH3-48, VH3-30, VH3-33, VH3-23, VH1-18, VH3-15, VH4-b, VH1-8, VH3-07, VH2-5, VH4-4, VH1-2, y VH6-1. Los segmentos del gen J humano pueden comprender los seis segmentos del gen J humano. Los segmentos del gen D humano pueden comprender 21 segmentos del gen D humano seleccionados de D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D 4-11, D 5-12, D 6-13, D, 1-14, D 2-15, D 3-16, D 3-17, D 5-18, D 6-19, D 1 -20, D 2-21, D 3-22, D 4-23, D 5-24, D 6-25, D 1 -26, y D-7-27.
El locus también puede comprender una o más regiones humanas constantes (efectoras), preferiblemente las regiones constantes p y y. Opcionalmente, las regiones efectoras constantes humanas pueden reemplazarse por regiones efectoras de otros mamíferos no humanos. Cuando el huésped mamífero no humano es un ratón o una rata, entonces las regiones constantes (efectoras) preferiblemente se derivan de rata o ratón. Los segmentos de genes de la región constante de rata pueden comprender Cp, Cy2c, Cy1, CY2b, y Ca. A diferencia de los humanos, los dominios transmembrana del complejo receptor de células B (BCR) de ratón y rata están 100% conservados. Por tanto, los ratones transgénicos para loci de anticuerpos que comprenden genes de la región constante (efectora) de rata deberían funcionar tan bien como los que comprenden genes de la región constante (efectora) de ratón después de la exposición al antígeno, y pueden ser superiores a los que comprenden genes de la región constante (efectora) humana (De Franco et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci., 766, 195-201). Los transgenes pueden comprender LCR de cadena pesada, cadena ligera kappa y lambda, preferiblemente de origen humano o de ratón. Las LCR que funcionan en todas las especies de mamíferos son conocidas y pueden sustituirse por LCR humanas o de ratón en los transgenes (Li et al. (1999) Trends Genet., 10, 403-8).
Cuando se contempla la generación de anticuerpos completamente humanos, los dominios de unión de Vh y VL específicos del antígeno humanos clonados derivados de anticuerpos híbridos expresados por hibridomas pueden fusionarse a las regiones constante de la cadena ligera y constante pesada humanas, derivando así anticuerpos tetraméricos completamente humanos de cualquier clase.
Como un refinamiento adicional, cada locus de cadena ligera kappa y/o lambda de inmunoglobulina también puede comprender un gen marcador selectivo dominante.
Los genes marcadores selectivos dominantes incorporados en los loci pueden tener los mismos mecanismos de acción o unos diferentes. Para los propósitos de la invención, puede usarse cualquier gen marcador selectivo dominante, siempre que la expresión del gen confiera un beneficio selectivo a los hibridomas o células B transformadas derivadas del mamífero transgénico no humano en presencia de una exposición selectiva o tóxica. Típicamente, los genes marcadores selectivos dominantes serán de origen procariota y se seleccionarán de un grupo que o confiera resistencia a fármacos tóxicos, como puromicina (Vara et al. (1986) NAR, 14, 4617-4624), higromicina (Santerre et al. (1984) Gene, 30, 147-156) y G418 (Colbere-Garapin et al. (1981) 150, 1-14), o comprenda genes que obvian ciertos requisitos nutricionales de tal manera que su expresión convierta una sustancia tóxica en un aminoácido esencial, por ejemplo la conversión de indol a triptófano o la conversión de histidinol a histidina (Hartmann and Mulligan, (1988) PnAS, 85, 8047-8051).
Un requisito necesario de este aspecto de la invención es que el marcador selectivo dominante se incorpore dentro del locus transgénico de la cadena ligera de inmunoglobulina y se coexprese con el alelo de cadena ligera de inmunoglobulina deseado, asegurando de este modo la expresión específica de células B. Alternativamente, el gen
de resistencia al fármaco puede insertarse en un locus de inmunoglobulina endógeno o exógeno (transgénico) usando recombinación homóloga en combinación con células ES o enfoques de transferencia nuclear (te Riele et al. (1992), PNAS, 89, 11,5128-5132).
El mamífero no humano también puede comprender un transgén o transgenes que comprenden un locus de cadena pesada heteróloga y elementos reguladores y LCR específicas de células B asociados. Puede estar presente más de un locus del gen de cadena pesada transgénica diferente, cada uno de los cuales comprende una LCR y elementos reguladores.
Los loci del gen de la cadena pesada, cada uno de los cuales comprende uno o más segmentos del gen V, uno o más segmentos del gen D, uno o más segmentos del gen J y una o más regiones constantes (efectoras) se introducen como transgenes, comprendiendo cada locus una LCR análoga.
Cada locus comprende los elementos reguladores 5' y 3' necesarios para impulsar la expresión específica de células B. Cada locus de cadena pesada o ligera se expresa de una manera esencialmente idéntica a los loci endógenos en respuesta a la exposición al antígeno, lo que lleva a la circulación en suero de ratón de inmunoglobulinas tetraméricas maduradas por afinidad específicas de antígeno codificadas por transgén.
Preferiblemente, cada locus del gen de cadena pesada comprende 18 segmentos del gen V que están presentes en cualquier locus de cadena pesada individual.
En un caso, cada locus puede comprender solo un segmento del gen V. En una alternativa, hay una serie de segmentos del gen V y cada segmento del gen V es diferente de todos los demás segmentos del gen V. En este caso, los segmentos del gen V en cualquier locus pueden derivarse todos de un organismo de la misma especie, por ejemplo, todos los segmentos del gen V pueden ser de origen humano. Alternativamente, los segmentos del gen V en cualquier locus pueden derivarse de organismos de diferentes especies, por ejemplo, algunos segmentos del gen V de humanos y otros de ovejas, vacas, conejos, camélidos o incluso tiburones. En una segunda alternativa, cada segmento del gen V es idéntico a todos los demás segmentos del gen V. Independientemente del número y la naturaleza de los segmentos del gen V presentes, los segmentos de los genes D y J restantes en cada locus pueden ser iguales o pueden ser diferentes de aquellos en todos los otros loci.
Por tanto, se prevé que el mamífero no humano pueda contener múltiples copias de un locus del gen de cadena pesada. Esto tiene la ventaja de optimizar las posibilidades de que se produzca un reordenamiento productivo en una célula B, permitiendo por tanto la producción óptima de una cadena pesada de inmunoglobulina para el reconocimiento de antígenos.
En otro caso, cada locus comprende múltiples segmentos del gen V.
Preferiblemente, los segmentos del gen V son de origen humano.
El término "segmento de gen V" abarca cualquier segmento del gen V de origen natural derivado de un vertebrado incluyendo, pero no limitado a, tiburones, roedores, camélidos y humanos. El segmento del gen V debe ser capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y un segmento del gen que codifica una región constante (efectora) de cadena pesada para generar un anticuerpo de cadena pesada de inmunoglobulina capaz de formar complejos con una cadena ligera de inmunoglobulina o kappa o lambda cuando el ácido nucleico reordenado se expresa en células B.
Un segmento del gen V también incluye dentro de su alcance cualquier secuencia de gen que codifique un homólogo, derivado o fragmento de proteína natural o manipulado que sea capaz de recombinarse con un segmento del gen D, un segmento del gen J y un segmento de gen que codifique una región constante de cadena pesada para generar una anticuerpo de cadena pesada de inmunoglobulina capaz de formar complejos con una cadena ligera de inmunoglobulina o kappa o lambda cuando el ácido nucleico reordenado se expresa en células B. Un segmento del gen V puede, por ejemplo, derivarse de un locus del receptor de células T.
Preferiblemente, los múltiples loci de cadena pesada de la divulgación comprenden cualquier número o combinación de los 39 segmentos del gen V humano funcional y variantes manipuladas de los mismos. Estos pueden estar en cualquier número de loci, por ejemplo, cuatro loci que comprenden ocho segmentos del gen V más un locus que comprende siete segmentos del gen V; siete loci que comprenden cuatro segmentos del gen V más un locus que comprende tres segmentos del gen V; o treinta y nueve loci que comprenden un segmento del gen V cada uno.
Los genes V humanos se clasifican en siete familias, Vh1 a Vh7, y los genes individuales dentro de cada familia están numerados. La frecuencia con la que se usa cada gen depende de los requisitos variables de la respuesta inmune particular. Por ejemplo, los genes de la familia Vh3 pueden usarse preferentemente en comparación con los de la familia Vh5 cuando responden a antígenos bacterianos. Por tanto, en un caso adicional,
los grupos de segmentos del gen V que se ha demostrado que son útiles para generar una respuesta de anticuerpos contra antígenos específicos se agrupan en loci separados, cada uno de los cuales comprende un gen marcador selectivo dominante diferente. Los segmentos del gen V pueden agruparse de acuerdo con la familia o pueden agruparse de acuerdo con la función individual. Por ejemplo, si se demuestra que los genes V de la familia Vh3 son útiles para generar una respuesta inmune contra antígenos bacterianos, entonces estos pueden usarse para generar un locus que es particularmente útil para generar anticuerpos de cadena pesada solamente contra antígenos bacterianos. Alternativamente, si se demuestra que varios genes individuales de las familias Vh3 y Vh5 son útiles para generar una respuesta inmune contra antígenos bacterianos, entonces estos pueden agruparse entre sí y usarse para generar un locus que es particularmente útil para generar anticuerpos contra antígenos bacterianos.
Un "locus de cadena pesada de inmunoglobulina" en el contexto de la presente invención es como se define en las reivindicaciones En general, dicho término puede referirse a un micro-locus mínimo que codifica un dominio de Vh que comprende uno o más segmentos del gen V, uno o más segmentos del gen D y uno o más segmentos del gen J, enlazados operativamente a uno o más segmentos génicos que codifican regiones constantes (efectoras) de cadena pesada. Preferiblemente, la fuente principal de variabilidad del repertorio de anticuerpos es la región CDR3 formada por la selección de segmentos de genes V, D y J y por las uniones V-D y D-J.
La ventaja de la presente divulgación es que el repertorio y la diversidad de anticuerpos obtenidos en los segmentos de genes V, D y J reordenados pueden maximizarse mediante el uso de múltiples loci de genes de cadena pesada de inmunoglobulina en el mismo mamífero no humano transgénico explotando la exclusión alélica. El proceso de exclusión alélica, que elige aleatoriamente uno de los loci para iniciar la recombinación, seguido del siguiente locus si la primera recombinación no fue productiva, etc., hasta que se haya producido una recombinación productiva a partir de uno de los loci, aseguraría que en realidad, todos los segmentos del gen V presentes en los loci combinados serían parte del proceso de recombinación general.
El locus de inmunoglobulina en su configuración normal parece tener una estructura plegada tridimensional en base a mediciones de distancia realizadas en células B y midiendo en la dirección y a través de la región VH (Jhunjhunwala et al. (2008) Cell, 133, 265-279). Tal estructura plegada o de giro explica por qué pueden usarse regiones Vh diferentes con la misma eficacia incluso cuando están dispuestas a distancias muy diferentes de D, J y la región constante del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina.
También ha quedado claro recientemente que una estructura plegada formada por giros en varios loci está mediada por una proteína de unión a cromatina particular llamada CTCF. La CTCF parece estar directamente implicada en la formación de giros de cromatina, como lo demuestran los experimentos de mutagénesis (Splinter et al. (2006) Genes Dev., 20, 2349-2354). Más recientemente se ha demostrado que la cohesina, el complejo proteico que mantiene unidas las cromátidas hermanas, está presente en los sitios de unión de CTCF (Wendt et al. (2008) Nature, 451, 796-801). La inclusión de una serie de sitios de CTCF de la región Vh de inmunoglobulina (Kim et al. (2007) Cell, 128, 1231-1245; Denger, Wong, Jankevicius y Feeney (2009) J. Immunol, 182, 44-48) aumenta la probabilidad de que la región VH de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina transgénica pueda plegarse adecuadamente y permitir el uso eficiente de todos los diferentes segmentos del gen V presentes en ese locus. Los sitios de unión de CTCF están presentes en 3' con una serie de segmentos del gen VH humano usados en los ejemplos siguientes. Por tanto, la inclusión de la secuencia 3' que flanquea inmediatamente estos segmentos en el locus también incluye sitios de unión a CTCF.
Cada transgén que comprende un locus de cadena pesada heterólogo puede comprender además un marcador selectivo dominante. Preferiblemente, el marcador selectivo dominante es diferente del marcador selectivo dominante introducido dentro de los loci de las cadenas ligeras kappa o lambda.
Para el propósito de la invención, puede usarse cualquier gen marcador selectivo dominante, siempre que la expresión del gen confiera un beneficio selectivo a los hibridomas o células B derivadas del mamífero transgénico no humano en presencia de una exposición selectiva o tóxica. Típicamente, los genes marcadores selectivos dominantes serán de origen procariota y se seleccionarán de un grupo que confiera resistencia a fármacos tóxicos, como puromicina (Vara et al. (1986) NAR, 14, 4617-4624), higromicina
(Santerre et al. (1984) Gene, 30, 147-156) y G418 (Colbere-Garapin et al. (1981) 150, 1-14), o comprenden genes que obvian ciertos requisitos nutricionales de tal manera que su expresión convierte una sustancia tóxica en un aminoácido esencial, por ejemplo la conversión de indol a triptófano o la conversión de histidinol a histidina (ver Hartmann and Mulligan (1988) PNAS, 85, 8047-8051).
Un requisito necesario de la divulgación es que los marcadores selectivos dominantes, si se usan, residan dentro de los loci transgénicos de la cadena pesada de inmunoglobulina, asegurando así la coexpresión específica de células B. Alternativamente, el gen de resistencia a fármacos puede insertarse en un locus de inmunoglobulina endógeno o exógeno (transgénico) usando recombinación homóloga en combinación con células ES o enfoques de transferencia nuclear (por ejemplo, te Riele, Robanus Maandag y Berns (1992), PNAS, 89, 11,5128-5132).
El mismo gen marcador selectivo dominante puede incorporarse dentro de todos los loci de cadena pesada. Alternativamente, diferentes loci de cadena pesada o grupos de loci de cadena pesada pueden comprender diferentes genes marcadores selectivos dominantes.
Pueden seleccionarse hibridomas o células B, preferiblemente células plasmáticas de larga vida (Slifka et al (1998) Immunity, 8, 363-372), derivados de ratones transgénicos de la invención que expresan anticuerpos tetraméricos, libres de células que expresan inmunoglobulina endógena, debido a la coexpresión de un gen marcador selectivo dominante funcional dentro de los loci de la cadena ligera transgénica. Además, también pueden seleccionarse hibridomas o líneas de células B transformadas o células B cultivadas que expresan anticuerpos derivados de grupos específicos de segmentos V presentes en loci de cadena pesada transgénica debido a la presencia y coexpresión de diferentes marcadores selectivos dominantes dentro de loci de cadena pesada con respecto a los marcadores selectivos dominantes incorporados dentro de los loci de cadenas ligeras. Por ejemplo, la inclusión de un gen de resistencia a puromicina dentro del locus transgénico de la cadena ligera kappa permitiría la selección de todas las células que expresan el transgén de la cadena ligera kappa. Alternativamente, la inclusión del gen de resistencia G418 dentro de un locus transgénico de cadena pesada que comprende segmentos del gen V preferidos permitiría la selección de todas las células que expresan los segmentos del gen V preferidos.
En la invención, el locus de la cadena pesada de ratón endógeno y/o el locus de la cadena ligera kappa del ratón endógeno pueden desactivarse. Las estrategias para deshabilitar estos loci endógenos son conocidas en la técnica y se describen en los ejemplos de la presente.
En particular, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo monoclonal híbrido heterólogo específico de antígeno que comprende:
(a) inmunizar un ratón transgénico de la invención como se ha descrito anteriormente con el antígeno;
(b) preparar hibridomas o células B, plasmablastos, células B de memoria o células plasmáticas, cada una de las cuales produce un anticuerpo monoclonal a partir de las células B del ratón transgénico inmunizado;
(c) seleccionar por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que expresa el anticuerpo heterólogo mediante el uso de los genes marcadores selectivos dominantes presentes en los transgenes que comprenden los loci de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina heterólogos; y (d) seleccionar por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que produce un anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
La invención se describe ahora, a modo de ejemplo solamente, en la siguiente descripción detallada con referencia a las siguientes Figuras.
EJEMPLOS
En los siguientes ejemplos, se generan ratones transgénicos que expresan loci híbridos de cadena pesada y cadena ligera humana/de rata como transgenes introducidos por microinyección en óvulos fertilizados, un procedimiento de transgénesis rutinario. Los ratones donantes de óvulos pueden modificarse para que tengan una expresión muy baja o nula de los genes de la cadena pesada del ratón endógenos y de los genes de la cadena ligera del ratón. Por ejemplo, los ratones pueden ser ratones gMTE como se representa en la Figura 7, obtenidos mediante recombinación homóloga de células ES. El locus de IgH puede inactivarse mediante una estrategia similar a la publicada por Kitamura y Rajewsky con la diferencia de que el codón de parada se introduce en las regiones CM en una posición un aminoácido antes de la descrita por Kitamura et al. (1991) Nature, 350, 423-426. Además, los ratones pueden tener inactivado el locus de la cadena ligera k como se representa en la Figura 8. El locus de la cadena ligera lambda también puede inactivarse, aunque debe tenerse en cuenta que el locus lambda del ratón se usa con muy poca frecuencia.
La metodología usada para la construcción de loci de cadena pesada y ligera, la generación y la detección de ratones transgénicos después de la exposición al antígeno son esencialmente las descritas anteriormente (Janssens et al. (Janssens et al. (2006) PNAS, 10, 103(41), 15130-5, WO2006/008548, WO2007/096779, WO2009/13620, WO2010/070263 y WO2010/10965) excepto que el dominio de Ch1 se retiene en todos los loci de cadena pesada. Los métodos generales para derivar vertebrados, incluyendo mamíferos, distintos de los ratones, que expresan loci de inmunoglobulina heterólogos funcionales y/o tienen loci endógenos manipulados son como se describe en la WO2006/047367. En los ejemplos siguientes, se usa la recombinación en células ME y las células ME modificadas se usan para generar ratones con las propiedades deseadas. Sin embargo, los mismos procedimientos podrían llevarse a cabo en células madre pluripotentes inducidas (células iPS) que se usan luego para generar ratones (por ejemplo, Boland, Hazen, Nazor, Rodríguez, Gifford, Martin, Kupriyanov y Baldwin (2009), 461, 7260, 91 4 y referencias en el mismo). Alternativamente, las modificaciones se llevan a cabo en células somáticas o células madre somáticas que posteriormente se reprograman en células iPS para generar ratones modificados. También,
podrían trasplantarse células madre hematopoyéticas modificadas en ratones recipiente que carecen de células B para generar anticuerpos humanos o híbridos humanos.
Ejemplo 1
Los genes de Vk más frecuentemente y moderadamente más frecuentemente usados del locus de IgK humano (Figura 1, Vk2-30, Vk2-28, Vk1-5, Vk1-9, Vk1-27, Vk1-33, Vk1-39, Vk3-20, Yk3-15, Vk3-11, y Vk4-1, evaluados usando la base de datos de Ig; http://imgt.cines.fr/) se amplificaron mediante PCR estándar y se subclonaron entre sitios Xhol/Sall, como se ha descrito anteriormente para segmentos de Vh humanos. Esto permite la multimerización de las regiones Vk, manteniendo el multímero entre los sitios Xhol y Sail.
Además, el extremo 3' del locus k del ratón, incluido el potenciador k 3', y la región constante (Ck) de rata más el potenciador 5' de rata se clonaron juntos. Luego, la región Jk humana y la región (17 kb) entre Vk y Jk de ratón se clonaron para mantener la separación normal entre las regiones Vk y Jk. Finalmente, el Vk humano se insertó en el PAC mediante procedimientos rutinarios (por ejemplo, Janssens et al. (2006), supra).
Los segmentos de Vk se multimerizaron y se ligaron en el vector PAC que contiene las regiones J humanas y los potenciadores de ratón y las regiones Ck de rata. Esto da como resultado un locus híbrido humano-rata que comprende segmentos de Vk humanos y una región constante (Ck) de rata (Figura 1).
Los insertos de loci híbridos se aislaron posteriormente del plásmido como fragmentos de ADN grandes y se inyectaron en óvulos de ratón fertilizados. Todo esto se hizo mediante métodos rutinarios (por ejemplo, Janssens et al. (2006), supra).
Ejemplo 2
Se ha generado un locus de IgH híbrido humano/de rata que tiene 18 segmentos de V h humanos y 5 regiones constantes de rata (Figura 2; Vh 6-1, Vh 1 -2, Vh 4-4, Vh 2-5, Vh 3-07, Vh 1 -8, Vh 4-b, Vh 3-15, Vh 1 -18, Vh 3 23, Vh 3-33, Vh 3-30, Vh 3-48, Vh 4-34, Vh 3-49, Vh 3-53, Vh 4-59, Vh 1-69 humanos). Primero, una región de DJ central de 70 kb del locus humano que contiene 21 segmentos del gen D y los 6 segmentos del gen J se extendió en el extremo 5' con 8 kb del intrón de IgH de ratón para mantener la distancia apropiada entre los segmentos Vh y la región D. Luego, se clonó la primera región Vh (6-1) de 10 kb con un sitio de meganucleasa Scel artificial en el extremo 5' de las secuencias de intrones de ratón. En un plásmido separado, todos las regiones Vh restantes se clonaron juntas por ranuración en segmentos de Vh de XhoI/SalI. El multímero de Vh se clonó en el plásmido VH6-1 DJ, después de lo cual se añadieron las regiones constantes de rata para completar el locus (Cp, Cy2x, Cy1 , CY2b, y Ca y las regiones de cambio). Estas se habían amplificado mediante PCR estándar de largo alcance a partir de ADN genómico de rata. Finalmente, se añadió la LCR de cadena pesada de ratón. Esta secuencia reguladora se amplificó a partir de ADN genómico de ratón en tres partes, se subclonaron juntas para restaurar la LCR completa y se añadieron al lado 3' de las regiones constantes de rata. El locus de IgH híbrido resultante contiene por tanto regiones V, D y J humanas y regiones constantes de rata con secuencias reguladoras de ratón.
Los insertos de loci híbridos se aislaron posteriormente del plásmido como fragmentos de ADN grandes y se inyectaron en óvulos de ratón fertilizados. Todo esto se hizo mediante métodos rutinarios (por ejemplo, Janssens et al. (2006), supra).
Ejemplo 3
Los ratones transgénicos IgH híbridos e IgK híbridos se criaron posteriormente para obtener ratones que son positivos para la expresión de IgH e IgK híbrida humana/de rata. Estos ratones se inmunizaron posteriormente para generar anticuerpos H2L2 híbridos humanos/de rata específicos de antígeno mediante procedimientos rutinarios.
Ejemplo 4
En este ejemplo, la diversidad del anticuerpo híbrido humano/rata aumenta aún más mediante la adición de un locus de IgK humano/de rata mediante la reproducción a los ratones que portan loci IgH y/o IgK humano/de rata descritos en los ejemplos anteriores. El locus A híbrido humano/de rata se generó de forma muy similar a como se describe para el locus de IgK humano/de rata descrito en los ejemplos anteriores (Figura 3, VA3-19, VA3-1, VA2-8, y VA1-51). La diferencia se debe al hecho de que las regiones JA y CA se producen por parejas y, por lo tanto, se clonaron 2 regiones de CA de rata en 2 regiones JA humanas (Figura 3). La separación entre los segmentos Va y Ja se mantuvo clonando las secuencias de ratón normales que aparecen en esa posición. En este ejemplo, se usaron 2 segmentos de Ja humano y Ca de rata junto con cuatro segmentos de Va humanos. Juntos, cubren más del 80% de la respuesta de IgA humana. Las secuencias reguladoras (LCR) se derivaron del ratón para asegurar una expresión óptima. Como se ha descrito anteriormente, el locus se aísla como un fragmento de restricción y se inyecta en óvulos fertilizados para generar ratones que portan el locus A transgénico.
En todos estos ejemplos, la complejidad de la respuesta se mejorará aún más añadiendo segmentos V como parte de loci transgénicos de cadena ligera o pesada adicionales presentes en el mismo ratón. Como todos los loci están sujetos a exclusión alélica (ver WO2007/096779), solo se seleccionará in vivo la reordenación preferida después de la exposición al antígeno, lo que dará como resultado la expansión de las células B y la acumulación de anticuerpos en el suero. El método también podría aplicarse a otras especies usando segmentos V específicos para estas especies.
En todos estos ejemplos, pueden usarse regiones Vh Vl, D, J y constantes de diferentes especies para generar anticuerpos de otras especies individuales o anticuerpos de especies híbridas. También resultará evidente para un experto en la técnica que, una vez que se ha identificado un anticuerpo específico de antígeno, las regiones VhDJ y VlJ pueden clonarse en regiones constantes alternativas de la misma especie o de especies diferentes mediante métodos completamente rutinarios.
El experto en la técnica apreciará que pueden realizarse variaciones a este procedimiento para generar los ratones transgénicos híbridos, como el uso de diferentes vectores, diferentes marcadores de selección, diferentes posiciones de recombinación para inactivar los genes de ratón o variaciones en la estrategia de clonación real (de rutina) de los loci híbridos. El mismo procedimiento puede usarse para generar cualquier locus normal o híbrido usando ADN de inmunoglobulina derivado de cualquier especie de mamífero individual, o loci híbridos derivados usando ADN de dos o más especies.
LISTA DE SECUENCIAS
continuación
Claims (8)
1. Un ratón transgénico que comprende:
(a) un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2 y una región de control de locus (LCR) relacionada, y
(b) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogo que comprende segmentos del gen de VH humano, segmentos del gen D humano, segmentos del gen J humano, segmentos del gen de región constante de rata, y una LCR relacionada, en donde:
los segmentos del gen de VH humano consisten de, en el orden siguiente de 5' a 3', VH1-69, VH4-59, VH3-53, VH3-49, VH4-34, VH3-48, VH3-30, VH3-33, VH3-23, VH1-18, VH3-15, VH4-b, VH1-8, VH3-07, VH2-5, VH4-4, VH1-2, y VH6-1,
los segmentos del gen J humano comprenden los seis segmentos del gen J humanos
los segmentos del gen D humano consisten de 21 segmentos del gen D humano en el orden siguiente de 5' a 3': D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, D4-11, D5-12, D6-13, D1-14, D215, D3-16, D3-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D3-22, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, y D7-27,
y los segmentos del gen de la región constante de rata comprenden C|j, Cy2c, Cy1, CY2b, y Ca, y en donde el locus de cadena pesada de ratón endógeno y el locus de cadena ligera kappa de ratón endógeno se han deshabilitado.
2. El ratón transgénico de la reivindicación 1, que comprende además un locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina heterólogo que comprende cuatro segmentos del gen VA humano, dos segmentos del gen J humano, y dos segmentos del gen de la región constante de rata, en donde los segmentos del gen VA humano comprenden, en el orden siguiente de 5' a 3', VA3-19, VA3-1, VA2-8, yd VA1-51, los segmentos del gen J humano comprenden JA1 y JA3, y los segmentos del gen de la región constante comprenden CA2 y CA3.
3. El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho locus o loci comprenden además un marcador seleccionable, opcionalmente en donde hay más de un transgén, y cada transgén comprende un marcador seleccionable diferente.
4. El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho locus de cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1, y/o dicho locus de cadena ligera lambda de inmunoglobulina comprende la secuencia de la SEQ ID NO:3.
5. Un método para producir un anticuerpo monoclonal híbrido heterólogo específico del antígeno que comprende: (a) inmunizar un ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 con el antígeno;
(b) preparar hibridomas o células B, plasmablastos, células B de memoria o células plasmáticas, cada una de las cuales produce un anticuerpo monoclonal a partir de las células B del ratón transgénico inmunizado;
(c) seleccionar opcionalmente por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que expresa el anticuerpo heterólogo mediante el uso de genes marcadores selectivos dominantes presentes en los transgenes que comprenden los loci de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina heterólogos; y
(d) seleccionar por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que produce un anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
6. Un método para derivar un anticuerpo humano a partir de un anticuerpo híbrido que comprende:
(a) llevar a cabo el método de la reivindicación 5;
(b) seleccionar por lo menos un hibridoma o célula B, plasmablasto, célula B de memoria o célula plasmática que produce un anticuerpo que se une específicamente al antígeno y comprende los dominios de unión de Vh y Vl de la especie de elección;
(c) clonar y secuenciar los dominios Vh y Vl;
(d) volver a clonar secuencias seleccionadas que comprenden las secuencias codificantes de los dominios de unión Vh y Vl con dominios efectores constantes de elección de la misma especie; y
(e) coexpresar las secuencias vueltas a clonar que codifican polipéptidos de cadena pesada y ligera de la especie deseada usando un vector de expresión en un tipo celular de elección.
7. Un método para producir un anticuerpo monoclonal específico del antígeno que tiene una región variable humana que comprende:
(a) inmunizar un ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con el antígeno;
(b) preparar hibridomas a partir de células B del ratón transgénico inmunizado después de la maduración por afinidad; y
(c) aislardicho anticuerpode dichos hibridomas.
8. Un método para producirun anticuerpo monoclonal específicodel antígeno que tiene una regiónvariable humana que comprende:
(a)inmunizar un ratóntransgénicode cualquierade lasreivindicaciones 1a4 con elantígeno;
(b) aislar células o tejido que expresan un anticuerpo de interés exclusivo de cadena pesada específico del antígeno de dicho ratóndespués de lamaduración porafinidad;
(c)clonarellocuso locide lacadena pesada y ligeraa partirde ARNm derivado de lacélulaotejidoaislado;y (d)expresarelanticuerpo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361851974P | 2013-03-14 | 2013-03-14 | |
| PCT/IB2014/059820 WO2014141189A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-03-14 | Transgenic non-human mammal for antibody production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2829376T3 true ES2829376T3 (es) | 2021-05-31 |
Family
ID=50439438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14715432T Active ES2829376T3 (es) | 2013-03-14 | 2014-03-14 | Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9980470B2 (es) |
| EP (2) | EP3841876A1 (es) |
| ES (1) | ES2829376T3 (es) |
| PL (1) | PL2967012T3 (es) |
| WO (1) | WO2014141189A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5827127B2 (ja) | 2008-12-18 | 2015-12-02 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用 |
| EP3570668A1 (en) * | 2017-01-19 | 2019-11-27 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
| CN113874394B (zh) | 2019-02-20 | 2024-01-19 | 和铂抗体有限公司 | 抗体 |
| GB202003632D0 (en) | 2020-03-12 | 2020-04-29 | Harbour Antibodies Bv | SARS-Cov-2 (SARS2, COVID-19) antibodies |
| WO2023036982A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Harbour Antibodies Bv | Anti-sars2-s antibodies |
| GB202112935D0 (en) | 2021-09-10 | 2021-10-27 | Harbour Antibodies Bv | Sars-cov-2 (sars2, covid-19) heavy chain only antibodies |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
| GB8904009D0 (en) | 1989-02-22 | 1989-04-05 | Celltech Ltd | Vector |
| US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| US7041871B1 (en) | 1995-10-10 | 2006-05-09 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US6277969B1 (en) | 1991-03-18 | 2001-08-21 | New York University | Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor |
| EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
| DE4228162C1 (de) | 1992-08-25 | 1994-01-13 | Rajewsky Klaus Dr | Verfahren zum Ersetzen homologer Genabschnitte aus Säugern in der Keimbahn von nicht-menschlichen Säugern |
| KR20080059467A (ko) | 1996-12-03 | 2008-06-27 | 아브게닉스, 인크. | 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체 |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| GB0115256D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
| KR101151957B1 (ko) | 2004-07-22 | 2012-06-01 | 로저 킹돈 크레이그 | 결합 분자 |
| CA2584814A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Suppression of endogenous immunoglobulin expression in non-human transgenic animals |
| GB0618345D0 (en) | 2006-09-18 | 2006-10-25 | Univ Erasmus | Binding molecules |
| AU2007219159B8 (en) | 2006-01-25 | 2012-06-28 | Roger Kingdon Craig | Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals |
| AU2007235496B2 (en) | 2006-03-31 | 2013-11-21 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies |
| DK2602323T3 (en) | 2007-06-01 | 2018-04-16 | Open Monoclonal Tech Inc | Compositions and Methods for Inhibiting Endogenous Immunoglobin Genes and Producing Transgenic Human Idiotypic Antibodies |
| WO2009013620A2 (en) | 2007-06-11 | 2009-01-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Homologous recombination |
| CN102105613A (zh) | 2008-07-22 | 2011-06-22 | 独立行政法人物质·材料研究机构 | Mg基合金冷加工构件 |
| JP5827127B2 (ja) | 2008-12-18 | 2015-12-02 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用 |
| GB0905023D0 (en) | 2009-03-24 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules |
| HUE026229T2 (en) | 2010-02-08 | 2016-06-28 | Regeneron Pharma | Common light chain mouse |
| CN103228130B (zh) * | 2010-06-17 | 2016-03-16 | 科马布有限公司 | 动物模型及治疗分子 |
| NZ627119A (en) | 2010-06-22 | 2015-05-29 | Regeneron Pharma | Hybrid light chain mice |
| ME03732B (me) * | 2011-02-25 | 2021-01-20 | Regeneron Pharma | Miševi s ADAM6 |
| WO2012122512A1 (en) * | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Hco Antibody, Inc. | Recombinant production of mixtures of single chain antibodies |
-
2014
- 2014-03-14 US US14/211,130 patent/US9980470B2/en active Active
- 2014-03-14 WO PCT/IB2014/059820 patent/WO2014141189A1/en active Application Filing
- 2014-03-14 EP EP20196265.1A patent/EP3841876A1/en active Pending
- 2014-03-14 EP EP14715432.2A patent/EP2967012B1/en active Active
- 2014-03-14 ES ES14715432T patent/ES2829376T3/es active Active
- 2014-03-14 PL PL14715432T patent/PL2967012T3/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2967012B1 (en) | 2020-09-16 |
| US9980470B2 (en) | 2018-05-29 |
| WO2014141189A1 (en) | 2014-09-18 |
| EP2967012A1 (en) | 2016-01-20 |
| EP3841876A1 (en) | 2021-06-30 |
| US20140356907A1 (en) | 2014-12-04 |
| PL2967012T3 (pl) | 2021-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11877565B2 (en) | Antibody production | |
| ES2829376T3 (es) | Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos | |
| ES2641920T3 (es) | Ingeniería genética de animales no humanos para la producción de anticuerpos quiméricos | |
| AU2016202488B2 (en) | Common light chain mouse | |
| ES2813609T3 (es) | Polinucleótidos que codifican anticuerpos de roedores con idiotipos humanos y animales que los contienen | |
| ES2872475T3 (es) | Animales no humanos que producen proteínas de unión de dominio único | |
| ES2942413T3 (es) | Ratones que expresan un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina | |
| ES2678221T3 (es) | Animales no humanos con secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina modificadas | |
| AU2016204066A1 (en) | MICE THAT PRODUCE ANTIGEN-BINDING PROTEINS WITH pH-DEPENDENT BINDING CHARACTERISTICS | |
| NZ730271A (en) | Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences |