MX2013009649A

MX2013009649A - Ratones de una desintegrina y metaloproteasa 6 (adam6).

Info

Publication number: MX2013009649A
Application number: MX2013009649A
Authority: MX
Inventors: Andrew J Murphy; Sean Stevens; Lynn Macdonald
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2013-09-26
Also published as: EP2813573B1; HUE047687T2; IL268671B; DK2738258T1; US20150210776A1; CY1122820T1; ES2748832T3; SI2578688T2; US10905108B2; BR112013021771B1; RS59413B1; US20180345760A1; US20140213773A1; RU2013125717A; ES2748832T5; RU2016109443A; PL2738259T3; KR20130116375A; CY1126091T1; HRP20230526T1

Abstract

Se proporcionan ratones que comprenden una reducción o eliminación de actividad ADAM6 a partir de un locus de ADAM6 endógeno, o que carecen de un locus endógeno que codifica una proteína ADAM6 de ratón, en donde los ratones comprenden una secuencia que codifica un ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo, que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia es una secuencia ectópica de ADAM6 o una secuencia que le confiere a un ratón macho la capacidad de generar descendencia por apareamiento. También se proporcionan ratones y células con loci de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificados, que comprenden una secuencia ectópica de nucléotidos que codifica un ADAM6 de ratón o fragmento funcional u homólogo u ortólogo del mismo.

Description

RATONES DE UNA DESINTEGRINA Y METALOPROTEASA 6 (ADAM6) Campo de la Invención Se describen ratones, células, embriones y tejidos, modificados genéticamente que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un locus funcional ADAM6. Las modificaciones incluyen loci de inmunoglobulina humana y/o humanizados. Se describen los ratones que carecen de un gen funcional endógeno ADAM6 pero que comprenden la función ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópico que codifica una proteína ADAM6. Se describen ratones macho genéticamente modificados que comprenden una modificación de una locus VH de inmunoglobulina endógena que hace que el ratón incapaz de tomar una proteína funcional ADAM6 y resulta en una pérdida de la fertilidad, y que comprende además la función ADAM6 en los ratones machos, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópico que restaura la fertilidad con el ratón macho.

Antecedentes de la Invención Los ratones que contienen genes de anticuerpos humanos son conocidos en la técnica. Aplicaciones farmacéuticas para anticuerpos en las dos últimas décadas han alimentado una gran cantidad de investigación en la fabricación de anticuerpos que son adecuados para uso como agentes Ref. 241718 terapéuticos humanos. Los primeros anticuerpos terapéuticos, que se basaron en anticuerpos de ratón, no eran ideales como terapéuticos humanos debido a que la administración repetida de anticuerpos de ratón a humanos resulta en la inmunogenicidad que pueden confundir a regímenes de tratamiento a largo plazo. Se desarrollaron soluciones basadas en la humanización de anticuerpos de ratón para hacerlos parecer más humano y menos del tipo ratón. Se continuó con los métodos para expresar secuencias de inmunoglobulina humana para su uso en anticuerpos, en su mayoría basados en la expresión in vitro de bibliotecas de inmunoglobulina humana en fagos, bacterias, o levaduras. Por último, se hicieron intentos para producir anticuerpos humanos útiles a partir de linfocitos humanos in vitro, en ratones injertados con células hematopoyéticas humanas, y en ratones transgénicos o transcromosomales con loci discapacitados de inmunoglobulina endógena. En los ratones transgénicos, era necesario desactivar los genes de inmunoglobulina de ratón endógenos de modo que los transgenes humanos totalmente integrados al azar funcionarían como la fuente de secuencias de inmunoglobulina expresados en el ratón. Tales ratones pueden producir anticuerpos humanos adecuados para su uso como agentes terapéuticos humanos, pero estos ratones muestran problemas sustanciales con sus sistemas inmunológicos . Estos problemas (1) hacen que los ratones sean poco prácticos para la generación de un repertorio de anticuerpos suficientemente diverso, (2) requieren el uso de grandes correcciones de re- ingeniería , (3) proporcionan un proceso de selección clonal subóptimo probablemente debido a la incompatibilidad entre los elementos del humano y de ratón, y (4) hacen de estos ratones una fuente poco fiable de grandes y diversas poblaciones de secuencias variables humanas necesarias para ser verdaderamente útiles para hacer agentes terapéuticos humanos.

Sigue habiendo una necesidad en la técnica para la fabricación de ratones modificados genéticamente mejorados que seann útiles en la generación de secuencias de inmunoglobulína, incluyendo secuencias de anticuerpos humanos. También sigue habiendo una necesidad para ratones que sean capaces de reordenar segmentos génicos de inmunoglobulína para formar genes de inmunoglobulina reordenados útiles, o capaces de hacer las proteínas a partir de loci de inmunoglobulinas alteradas, mientras que al mismo tiempo reducen o eliminan los cambios pe judiciales que podrían resultar de las modificaciones genéticas.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto, se proporcionan constructos de ácido nucleico, células, embriones, ratones, y métodos para la fabricación de ratones que comprenden una modificación que resulta en una proteína no funcional ADAM6 de ratón endógena o gen ADAM6 (por ejemplo, un gen inactivado de, o una supresión en un gen endógeno ADAM6) , en donde los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan constructos de ácido nucleico, células, embriones, ratones, y métodos para la fabricación de ratones que comprenden una modificación de un locus de inmunoglobulina de ratón endógeno, en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, el locus de inmunoglobulina de ratón endógeno es un locus de cadena pesada de la inmunoglobulina, y la modificación reduce o elimina la actividad ADAM6 de una célula o tejido de un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica un ratón ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo; ratones también se proporcionan que comprenden una secuencia de nucleótido endógeno que codifica un ratón ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo, y al menos una modificación genética de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada.

En un aspecto, se proporcionan métodos para la fabricación de ratones que comprenden una modificación de un locus de inmunoglobulina de ratón endógeno, en el que los ratones ADAM6 comprenden una proteína u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho. Los ratones de acuerdo con la invención se pueden obtener, por ejemplo, por los métodos descritos en este documento.

En un aspecto, se proporcionan métodos para la fabricación de ratones que comprenden una modificación genética de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la aplicación de los métodos resulta en ratones machos que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificada (o una supresión del mismo) , y los ratones machos son capaces de generar descendencia en el apareamiento. En una modalidad, los ratones machos son capaces de producir esperma que puede transitar desde un útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un huevo de ratón.

En un aspecto, se proporcionan métodos para la fabricación de ratones que comprenden una modificación genética de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la aplicación de métodos resulta en ratones machos que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificada (o una supresión del mismo) , y los ratones machos exhiben una reducción de la fertilidad, y los ratones comprenden una modificación genética que restaura en su totalidad o en parte la reducción de la fertilidad. En diversas modalidades, la reducción de la fertilidad se caracteriza por la incapacidad de los espermatozoides de los ratones machos para migrar de un útero de ratón a través de un oviducto del ratón para fertilizar un huevo de ratón. En diversas modalidades, la reducción de la fertilidad se caracteriza por el esperma que exhibe un defecto en la migración in vivo. En diversas modalidades, la modificación genética que restaura en su totalidad o en parte, la reducción en la fertilidad es una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, la modificación genética comprende la sustitución de loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina de otra especie (por ejemplo, una especie que no es ratón) . En una modalidad, la modificación genética comprende la inserción de loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina ortólogos dentro de loci variables de cadenas pesadas de inmunoglobulina endógenos. En una modalidad específica, la especie es humana. En una modalidad, la modificación genética comprende la eliminación de un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena en su totalidad o en parte, en donde la supresión resulta en una pérdida de la función endógena ADAM6. En una modalidad específica, la pérdida de la función endógena ADAM6 se asocia con una reducción de la fertilidad en ratones macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una modificación que reduce o elimina la expresión del ratón ADAM6 de un alelo endógeno ADAM6 , de tal manera que un ratón macho que tiene la modificación exhibe una fertilidad reducida (por ejemplo, una capacidad muy reducida para generar descendencia en el apareamiento) , o es esencialmente estéril, debido a la reducción o eliminación de la función endógena ADAM6 , en donde los ratones comprenden además una secuencia de ADAM6 ectópico u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En un aspecto, la modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 del ratón es una modificación (por ejemplo, una inserción, una supresión, una sustitución, etc) en un locus de inmunoglobulina de ratón.

En una modalidad, la reducción o pérdida de la función ADAM6 comprende una incapacidad o la imposibilidad sustancial del ratón para producir esperma que puede viajar desde un útero de ratón a través de un oviducto del ratón para fertilizar un huevo de ratón. En una modalidad especifica, al menos alrededor de 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de las células de esperma producidas en un volumen de eyaculación del ratón son incapaces de atravesar a través de un oviducto in vivo después de la copulación y la fertilización un óvulo de ratón.

En una modalidad, la reducción o pérdida de la función ADAM6 comprende una incapacidad para formar o la incapacidad sustancial para formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 sobre una superficie de una célula de esperma del ratón. En una modalidad, la pérdida de función de ADAM6 comprende una incapacidad sustancial para fertilizar un huevo de ratón por copulación con una hembra de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen funcional endógeno ADAM6 , y comprende una proteína (o una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una proteína) que confiere funcionalidad ADA 6 en el ratón. En una modalidad, el ratón es un ratón macho y la funcionalidad comprende la fertilidad mejorada en comparación con un ratón que carece de un gen funcional endógeno ADAM6.

En una modalidad, la proteína está codificada por una secuencia genómica situada dentro de un locus de inmunoglob lina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En otra modalidad específica, el locus de cadena pesada comprende al menos una VH humana, por lo menos un DH humana y al menos un segmento del gen JH humano. En una modalidad, la proteína ectópica es codificada por una secuencia genómica situada dentro de un locus que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad, el locus que no es de inmunoglobulina es un locus transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el locus transcripcionalmente activo es el locus ROSA26. En una modalidad específica, el locus transcripcionalmente activo se asocia con la expresión específica de tejido. En una modalidad, la expresión específica de tejido está presente en los tejidos reproductivos. En una modalidad, la proteína está codificada por una secuencia genómica insertada al azar en la línea germinal del ratón.

En una modalidad, el ratón comprende una cadena ligera humano/rata quimérica o humano/ratón quimérica o humana (por ejemplo, variable humana, constante de ratón o rata) y una cadena pesada constante de rata o ratón/variable de humano quimérica. En una modalidad específica, el ratón comprende un transgén que comprende un gen de cadena ligera constante de ratón o rata/variable quimérico humano ligado operativamente a un promotor transcripcionalmente activo, por ejemplo, un promotor ROSA26. En una modalidad específica adicional, el transgén de cadena ligera humano/ de ratón o rata quimérico comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada en la línea germinal del ratón.

En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos se encuentra dentro de un locus de i munoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el locus de inmunoglobulina es un locus de cadena pesada. En una modalidad, el locus de cadena pesada comprende al menos una VH humana, por lo menos una DH humana y al menos un segmento del gen JH humano. En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos se encuentra dentro de un locus que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad, el locus que no es de inmunoglobulina es un locus transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el locus transcripcionalmente activo es el locus ROSA26. En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos se inserta aleatoriamente colocada en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un gen funcional endógeno ADAM6, en donde el ratón comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que complementa la pérdida la función de ADAM6 de ratón. En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos confiere al ratón una capacidad para producir descendencia que es comparable a un correspondiente ratón de tipo natural que contiene un gen funcional endógeno ADAM6. En una modalidad, la secuencia confiere al ratón una capacidad para formar un complejo de ADAM2 y/o ADAM3 y/o ADAM6 en la superficie de células de esperma del ratón. En una modalidad, la secuencia le confiere al ratón una capacidad de viajar a partir de un útero de ratón a través de un oviducto del ratón a un óvulo de ratón para fertilizar el óvulo .

En una modalidad, el ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce al menos alrededor de 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% del número de carnadas un ratón de tipo natural de la misma edad y la cepa produce en un período de tiempo de seis meses .

En una modalidad, el ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce al menos alrededor de 1.5 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 2.5 veces, alrededor de 3 veces, alrededor de 4 veces, alrededor de 6 veces, alrededor de 7 veces, alrededor de 8 veces, o alrededor de 10 veces o más descendencia cuando es criado durante un período de tiempo de seis meses en comparación con un ratón de la misma edad y la misma o similar cepa que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos que se cría sobre sustancialmente el mismo período de tiempo y bajo sustancialmente las mismas condiciones.

En una modalidad, el ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce un promedio de al menos alrededor de 2 veces, 3 veces, o 4 veces mayor número de crías por carnada en un período de reproducción de 4 o 6 meses que un ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos, y que se cría por el mismo período de tiempo.

En una modalidad, el ratón que carece del gen funcional endógeno ADA 6 y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos es un ratón macho, y el ratón macho produce esperma que cuando se recuperó de oviductos en alrededor de 5-6 horas después de la copulación, refleja una migración al oviducto que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, 100 veces, 110 veces, o 120 veces o más alto que un ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos.

En una modalidad, el ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos cuando copula con un ratón hembra, genera esperma que es capaz de atravesar el útero y entrar y atravesar el oviducto dentro de alrededor de 6 horas a una eficiencia que es aproximadamente igual a los espermas de un ratón de tipo natural .

En una modalidad, el ratón que carece del gen funcional endógeno ADAM6 y que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos produce alrededor de 1.5 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, o alrededor de 4 veces o más carnadas en un período comparable de tiempo que un ratón que carece del gen funcional ADAM6 y que carece de la secuencia ectópica de nucleótidos.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende en su línea germinal una secuencia de ácido nucleico que no es de ratón que codifica una proteína de inmunoglobulina, en donde la secuencia de inmunoglobulina que no es de ratón comprende una inserción de un gen ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina que no es de ratón comprende una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende una secuencia de cadena pesada de, la inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia comprende una secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera humana. En una modalidad, la secuencia comprende uno o más segmentos génicos V, uno o más segmentos génicos D, y uno o más segmentos génicos J; en una modalidad, la secuencia comprende uno o más segmentos génicos V y uno o más segmentos génicos J. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos V, D, y J, o uno o más segmentos génicos V y J, no se reconfiguran . En una modalidad, el uno o más segmentos génicos V, D, y J, o uno o más segmentos génicos V y J, se reconfiguran . En una modalidad, después de la reconfiguración de uno o más segmentos génicos V, D, y J, o uno o más segmentos génicos V y J, el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, después de la reconfiguración el ratón comprende en su genoma al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican un gen ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, después de la reconfiguración el ratón comprende en su genoma al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o un homólogo u o ortólogo o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, el ratón comprende el gen ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo en una célula B. En una modalidad, el ratón comprende el gen ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo o en una célula que no es B.

En un aspecto, se proporcionan los ratones que expresan una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana o un fragmento funcional de la misma a partir de un locus de cadena pesada endógena de inmunoglobulina de ratón, en donde los ratones comprenden una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, los ratones macho comprenden un solo alelo ADAM6 no modificado endógeno u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un locus ADAM6 endógeno.

En una modalidad, los ratones macho comprenden una secuencia ectópica ADAM6 de ratón u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que codifica una proteína que confiere función ADAM6.

En una modalidad, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma en una ubicación en el genoma del ratón que se aproxima a la ubicación del alelo ADAM6 endógeno de ratón, por ejemplo, en 3 ' de una secuencia de segmento de gen V final y en 5 ' de un segmento inicial de gen D.

En una modalidad, los ratones machos comprenden una secuencia ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma flanqueado cadena arriba, cadena abajo, o cadena arriba y cadena abajo (con respecto a la dirección de la transcripción de la secuencia de ADAM6) de un secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento de gen variable de la inmunoglobulina . En una modalidad específica, el segmento de gen variable de la inmunoglobulina es un segmento de gen humano. En una modalidad, el segmento de gen variable de la inmunoglobulina es un segmento de gen humano, y la secuencia que codifica el ratón ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un ratón está entre segmentos génicos V humanos; en una modalidad, el ratón comprende dos o más segmentos génicos V humanos, y la secuencia está en una posición entre el último segmento de gen V y el penúltimo segmento de gen V; en una modalidad, la secuencia está en una posición después del segmento final de gen V y el primer segmento de gen D.

En un aspecto, se proporciona un ratón macho que comprende un gen ADAM6 no funcional endógeno, o una supresión de un gen ADAM6 endógeno, en su línea germinal, en donde las células de esperma del ratón son capaces de transitar por un oviducto de un ratón hembra y fertilizar un óvulo. En una modalidad, los ratones comprenden una copia extracromosómica de un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, los ratones comprenden un gen ADAM6 ectópico de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una' modificación genética que reduce la función ADAM6 de ratón endógena, en donde el ratón comprende al menos alguna funcionalidad ADAM6 proporcionada ya sea por un alelo no modificado endógeno que es funcional en su totalidad o en parte (por ejemplo, un heterocigoto) , o por la expresión de una secuencia ectópica que codifica ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho .

En una modalidad, los ratones comprenden la función ADAM6 suficiente para conferir a los ratones macho de la capacidad para generar descendencia en el apareamiento, en comparación con ratones machos que carecen de un ADAM6 funcional. En una modalidad, la función ADAM6 es conferida por la presencia de una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica un ADAM6 de ratón o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma. Los homólogos u ortólogos de ADAM6 o fragmentos de los mismos que son funcionales en un ratón macho incluyen aquellos que restauran, en su totalidad o en parte, la pérdida de la capacidad para generar descendencia observada en un ratón macho que carece de suficiente actividad ADAM6 de ratón endógena, por ejemplo, la pérdida en capacidad observada en un ratón con gen inactivado ADAM6. En este sentido los ratones con gen inactivado ADAM6 incluyen ratones que comprenden un locus endógeno o fragmento del mismo, pero que no es funcional, es decir, que no expresa ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) en absoluto, o que expresa ADAM6 (ADAM6a y/o ADAM6b) a un nivel que es insuficiente para soportar una capacidad esencialmente normal para generar descendencia de un ratón macho de tipo natural . La pérdida de la función puede ser debido, por ejemplo, a una modificación en un gen estructural del locus (es decir, en una región de codificación ADAM6a o ADAM6b) o en una región reguladora del locus (por ejemplo, en una secuencia 5' al gen ADAM6a, o 3' de la región de codificación ADAM6a o ADAM6b, en donde la secuencia controla, en su totalidad o en parte, la transcripción de un gen ADAM6 , la expresión de un ARN de ADAM6, o la expresión de una proteína ADAM6) . En diversas modalidades, los ortólogos u homólogos o fragmentos de los mismos que son funcionales en un ratón macho son aquellos que permiten que un esperma de un ratón macho (o una mayoría de las células de esperma en el eyaculado de un ratón macho) transite al oviducto del ratón y fertilizar un óvulo de ratón.

En una modalidad, los ratones machos que expresan la región variable de inmunoglobulina humana o un fragmento funcional de la misma comprenden suficiente actividad ADAM6 para conferir a los ratones macho la capacidad para generar descendencia por apareamiento con ratones hembra y, en una modalidad, los ratones machos exhiben una capacidad para generar descendencia cuando hacen el apareamiento con ratones hembra que es en una modalidad al menos 25%, en una modalidad, al menos 30%, en una modalidad, al menos 40%, en una modalidad, al menos 50%, en una modalidad, al menos 60%, en una modalidad, al menos el 70%, en una modalidad, al menos el 80%, en una modalidad, al menos el 90%, y en una modalidad alrededor de la misma que, la de los ratones con uno o dos alelos ADAM6 no modificados endógenos.

En una modalidad los ratones machos expresan suficiente ADAM6 (o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) para permitir que una célula de esperma de los ratones machos atraviese un oviducto del ratón hembra y fertilizar un óvulo de ratón.

En una modalidad, la funcionalidad ADAM6 es conferida por una secuencia de ácido nucleico que es contigua con una secuencia cromosómica de ratón (por ejemplo, el ácido nucleico se integra al azar en un cromosoma de ratón, o colocado en un lugar específico, por ejemplo, por direccionar el ácido nucleico a una ubicación específica, por ejemplo, mediante la inserción mediada por recombinasa específica de sitio (por ejemplo, mediada por Cre) o la recombinación homologa) . En una modalidad, la secuencia de ADAM6 está presente en un ácido nucleico que es distinto de un cromosoma del ratón (por ejemplo, la secuencia de ADAM6 está presente en un episoma, es decir, de forma extracromosómica , por ejemplo, en una construcción de expresión, un vector, un YAC, un transcromosoma, etc.) .

En un aspecto, se proporcionan los ratones y las células modificadas genéticamente que comprenden una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde los ratones expresan al menos una porción de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, al menos una porción de una secuencia humana, en donde los ratones comprenden una actividad ADAM6 que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la modificación reduce o elimina la actividad de ADAM6 del ratón. En una modalidad, el ratón se modifica de tal manera que los dos alelos que codifican la actividad ADAM6 están ausentes o expresan un ADAM6 que no funciona sustancialmente para apoyar el apareamiento normal en un ratón macho. En una modalidad, el ratón comprende además una secuencia ectópica de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo.

En un aspecto, se proporcionan los ratones y las células modificadas genéticamente que comprenden una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde la modificación reduce o elimina la actividad de ADA 6 expresada a partir de una secuencia de ADAM6 del locus, y en donde los ratones comprenden una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo. En diversas modalidades, la proteína ADAM6 o fragmento de la misma está codificada por una secuencia ectópica ADAM6. En diversas modalidades, la proteína ADAM6 o fragmento de la misma se expresa a partir de un alelo endógeno ADAM6. En diversas modalidades, el ratón comprende un primer alelo de cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende una primera modificación que reduce o elimina la expresión de un ADAM6 funcional desde el primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina, y el ratón comprende un segundo alelo de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una segunda modificación que no reduce sustancialmente o no elimina la expresión de un ADAM6 funcional desde el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina.

En una modalidad, la segunda modificación se encuentra 3' (con respecto a la direccionalidad de la transcripción del segmento de gen V de ratón) de un segmento de gen V de ratón final y situado 5' (con respecto a la direccionalidad de la transcripción de la secuencia constante) de un gen de ratón (o humano/ratón quimérico) constante de cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un CH1 humano y/o del ratón y/o bisagra y/o CH2 y/o CH3) .

En una modalidad, la modificación está en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus que codifica un primer alelo ADA 6 , y la función ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 endógeno en un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus que codifica un ADAM6 funcional, en donde el segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una modificación de un segmento de gen V, D, y/o J. En una modalidad específica, la al menos una modificación del segmento de gen V, D y/o J es una supresión, una sustitución con un segmento de gen humano V, D, y/o J, un reemplazo con un segmento de gen camélido V, D, y/o J, un reemplazo con un segmento de gen humanizado o camelizado V, D, y/o J, una sustitución de una secuencia de cadena pesada con una secuencia de cadena ligera, y una combinación de los mismos. En una modalidad, la al menos una modificación es la supresión de uno o más segmentos génicos V, D, y/o J y un reemplazo con uno o más de los segmentos génicos V y/o J de la cadena ligera (por ejemplo, un segmento génico V, y/o J de cadena ligera humana) en el locus de cadena pesada.

En una modalidad, la modificación es en un primer alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un primer locus y un segundo alelo de cadena pesada de inmunoglobulina en un segundo locus, y la función ADAM6 resulta de la expresión de un ADAM6 ectópico en un locus no de inmunoglobulina en la línea germinal del ratón. En una modalidad específica, el locus que no es de inmunoglobulina es el locus ROSA26. En una modalidad específica, el locus no inmunoglobulina es transcripcionalmente activo en tejido reproductivo.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende un gen inactivado en el heterocigoto u homocigótico de ADAM6. En una modalidad, el ratón comprende además una secuencia de inmunoglobulina modificada que es una secuencia de inmunoglobulina humana o humanizada, o una secuencia de inmunoglobulina de ratón o humana camelizada o de camélido. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina modificada está presente en el locus de la inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina modificada comprende una secuencia génica humana de cadena pesada variable en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno. En una modalidad, la secuencia génica variable de cadena pesada humana reemplaza a una secuencia génica variable de cadena pesada de ratón endógeno en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno.

En un aspecto, se proporciona un ratón incapaz de expresar un ADAM6 de ratón endógeno funcional a partir de un locus ADA 6 de ratón endógeno. En una modalidad, el ratón comprende una secuencia ectópica de ácido nucleico que codifica un ADAM6 , o fragmento funcional del mismo, que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, la secuencia ectópica de ácido nucleico codifica una proteína que rescata a una pérdida en la capacidad para generar descendencia exhibida por un ratón macho que es homocigótico para un gen inactivado ADAM6. En una modalidad específica, la secuencia ectópica de ácido nucleico codifica una proteína ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un locus ADAM6 endógeno funcional, y que comprende una secuencia ectópica de ácido nucleico que confiere la función ADAM6 de ratón. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia endógena ADAM6 del ratón o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, la secuencia ADAM6 de ratón endógeno comprende la secuencia de codificación de ADAM6a y ADAM6b situada en un ratón de tipo natural entre el segmento génico V de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) y el segmento génico D de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón más hacia 5' .

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica ADAM6a de ratón o fragmento funcional del mismo y/o una secuencia que codifica ADAM6b de ratón o fragmento funcional del mismo, en donde el ADAM6a y/o ADAM6b o fragmento (s) funcional (es) de los mismos están operativamente unidos a un promotor. En una modalidad, el promotor es un promotor humano. En una modalidad, el promotor es el promotor ADAM6 de ratón. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 comprende la secuencia localizada entre el primer codón del primer gen ADAM6 más cercano al segmento génico DH de ratón más a 5' y la secuencia señal de recombinación del segmento génico DH más a 5' , en donde 5' se indica con respecto a la dirección de la transcripción de los genes de la inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, el promotor es un promotor viral. En una modalidad específica, el promotor viral es un promotor de citomegalovirus (CMV) . En una modalidad, el promotor es un promotor de ubiquitina.

En una modalidad, el promotor es un promotor inducible. En una modalidad, el promotor inducible regula la expresión en los tejidos no reproductivos. En una modalidad, el promotor inducible regula la expresión en los tejidos reproductivos. En una modalidad específica, la expresión de las secuencias ADAM6a y/o ADAM6b de ratón o fragmentos funcionales de las mismas es regulada en el desarrollo por el promotor inducible en los tejidos reproductivos.

En una modalidad, el ADAM6a y/o ADAM6b de ratón se seleccionan del ADAM6a de SEQ ID NO: 1 y/o ADAM6b de la secuencia de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el promotor ADAM6 de ratón es un promotor de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad específica, el promotor ADAM6 de ratón comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 directamente cadena arriba (con respecto a la dirección de la transcripción de ADAM6a) del primer codón de ADAM6a y que se extiende hasta el final de la SEQ ID NO: 3 cadena arriba de la región codificante ADAM6. En otra modalidad específica, el promotor ADAM6 es un fragmento que se extiende desde dentro de alrededor de 5 a alrededor de 20 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a hasta alrededor de 0.5 kb, 1 kb, 2 kb, o 3kb o más cadena arriba del codón de inicio de ADAM6a.

En una modalidad, la secuencia de . ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma que cuando se coloca en un ratón que es estéril o que tiene baja fertilidad debido a la falta de ADAM6, mejora la fertilidad o restaura la fertilidad a alrededor de una fertilidad de tipo natural. En una modalidad, la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma confiere a un ratón macho la capacidad de producir una célula de esperma que es capaz de atravesar un oviducto de ratón hembra con el fin de fertilizar un huevo de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una supresión de una secuencia endógena de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 , un reemplazo de un segmento génico VH de ratón endógeno con un segmento génico de VH humana, y una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica un proteína ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, el ratón comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una supresión de una secuencia de nucleótidos de locus de inmunoglobulina endógena que comprende un gen endógeno ADAM6 , comprende una secuencia nucleotídica que codifica uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana, y en donde el secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 ratón está dentro de o directamente adyacente a la secuencia de nucleótidos que codifica los uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos con una secuencia nucleotídica que codifica uno o más segmentos génicos VH humanos, y la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 de ratón está dentro de, o directamente adyacente a, la secuencia de nucleótidos que codifica los uno o más segmentos génicos VH humanos. En una modalidad, el ratón comprende además una sustitución de uno o más segmentos génicos DH endógenos con uno o más segmentos génicos DH humanos en el locus del gen DH endógeno. En una modalidad, el ratón comprende además una sustitución de uno o más segmentos génicos JH endógenos con uno o más segmentos génicos JH humanos en el locus del gen JH endógeno. En una modalidad, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de VH, DH, y JH endógeno y un reemplazo en los loci de genes VH, DH, y JH endógenos con los segmentos génicos VH, DH, y JH humanos, en donde el ratón comprende una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una modalidad específica, se coloca la secuencia ectópica que codifica la proteína ADAM6 de ratón entre el penúltimo segmento génico VH más en 3' de los segmentos génicos VH humanos presentes, y el segmento génico VH en 3' final de los segmentos génicos VH humanos presentes. En una modalidad específica, el ratón comprende una supresión de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón, y un reemplazo con todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH humanos, y la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 de ratón se coloca cadena abajo del segmento génico humano VHl-2 y cadena arriba del segmento génico humano VH6-1.

En una modalidad específica, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH endógenos con una secuencia nucleotídica que codifica uno o más segmentos génicos VH humanos, y la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADA 6 ratón está dentro de, o directamente adyacente a, la secuencia de nucleótidos que codifica los uno o más segmentos génicos VH humanos.

En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína de ratón ADAM6 está presente en un transgén en el genoma del ratón. En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos que codifica la proteína ADAM6 de ratón está presente extracromosómicamente en el ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde el ratón expresa una célula B que comprende una secuencia de inmunoglobulina reconfigurada ligada operativamente a una secuencia génica de la región constante de cadena pesada, y la célula B comprende en su genoma (por ejemplo, en un cromosoma de la célula B) un gen que codifica un ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina reconfigurada ligada operativamente a la secuencia génica de la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de cadena pesada humana V, D, y/o J; una secuencia de ratón de cadena pesada V, D, y/o J; una secuencia humana o de ratón de cadena ligera V y/o J. En una modalidad, la secuencia génica de la región constante de cadena pesada comprende una secuencia de cadena pesada de humano o de ratón seleccionada del grupo que consiste de un CH1, una bisagra, una CH2 , una CH3 , y una combinación de los mismos.

En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende un gen de inmunoglobulina de cadena ligera funcionalmente silenciado, y comprende además una sustitución de uno o más segmentos génicos endógenos de la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada con uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde el ratón carece de un locus endógeno funcional ADAM6 , y en donde el ratón comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho .

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un locus o secuencia funcional ADAM6 de ratón endógeno y que comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica un locus o fragmento funcional ADAM6 de ratón de un locus o secuencia ADAM6 de ratón, en donde el ratón es capaz de apareamiento con un ratón del sexo opuesto para producir una progenie que comprende el locus o secuencia de ADAM6 ectópico. En una modalidad, el ratón es de sexo masculino. En una modalidad, el ratón es de sexo femenino.

En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende un segmento génico de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana en un locus del gen de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno, el ratón carece de una secuencia endógena funcional ADAM6 en el locus de gen de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno, y en donde el ratón comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que expresa una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho.

En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos que expresa la proteína ADAM6 de ratón es extracromosómica . En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos que expresa la proteína ADAM6 de ratón se integra en uno o más loci en el genoma del ratón. En una modalidad específica, el uno o más loci incluyen un locus de inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina a partir de un locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno, en donde cadena pesada se deriva de un segmento génico V humano, un segmento génico D, y un segmento génico J, en donde el ratón comprende una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, el ratón comprende una pluralidad de segmentos génicos V humanos, una pluralidad de segmentos génicos D, y una pluralidad de segmentos génicos J. En una modalidad, los segmentos génicos D son segmentos génicos D humanos. En una modalidad, los segmentos génicos J son segmentos génicos J humanos. En una modalidad, el ratón comprende además una secuencia de región constante de cadena pesada humanizada, en donde la humanización comprende la sustitución de una secuencia seleccionada a parti °de un CH1, bisagra, CH2 , CH3 , y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, la cadena pesada se deriva de un segmento génico V humano, un segmento génico D humano, un segmento génico J humano, una secuencia de CH1 humana, una secuencia bisagra humana o de ratón, una secuencia de ratón CH , y una secuencia de ratón CH3. En otra modalidad específica, el ratón comprende además una secuencia constante de la cadena ligera humana.

En una modalidad, el segmento génico D está flanqueado en 5' (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico D) por una secuencia que codifica una actividad ADAM6 que es funcional en el ratón.

En una modalidad, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótidos localizada 5' del segmento génico D más en 51 y 3' del segmento génico V más en 3' (con respecto a la dirección de la transcripción del segmento génico V) del locus modificado de la inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno.

En una modalidad, la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón resulta de la expresión de una secuencia de nucleótidos situada entre dos segmentos génicos V humanos en el locus modificado de la inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno. En una modalidad, los dos segmentos génicos V humanos son un segmento génico VHl-2 y un segmento génico VH6-1 humanos .

En una modalidad, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia seleccionada de una secuencia ADAM6b de ratón o un fragmento funcional de la misma, una secuencia ADAM6a ratón o un fragmento funcional de la misma, y una combinación de los mismos.

En una modalidad, la secuencia de nucleótidos entre los dos segmentos génicos V humanos se coloca en la orientación de transcripción opuesta con respecto a los segmentos génicos V humanos. En una modalidad específica, la secuencia de nucleótidos codifica, desde 5' a 3' con respecto a la dirección de la transcripción de los genes ADAM6 , y la secuencia de ADAM6a seguido por una secuencia de ADAM6b .

En una modalidad, el ratón comprende una sustitución de una secuencia de pseudogen ADAM6 humana entre los segmentos génicos V humano VHl-2 y VH6-1 con una secuencia ADAM6 de ratón o un fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, la secuencia que codifica la actividad ADAM6 que es funcional en el ratón es una secuencia ADAM6 de ratón o fragmento funcional de la misma.

En una modalidad, el ratón comprende un segmento génico DFL16.1 de ratón endógeno (por ejemplo, en un ratón heterocigótico para el locus modificado de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno) , o un segmento génico humano DH1-1. En una modalidad, el segmento génico D de cadena pesada de la inmunoglobulina expresada por el ratón se deriva de un segmento génico de ratón endógeno DFL16.1 o un segmento génico humano DH1-1.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en una célula que transporta ADN de linaje de células B no reconfigurado, pero no comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional de la misma) en una célula B que comprenden loci de inmunoglobulina reconfigurados , en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) se produce en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la que un gen ADAM6 ratón aparece en un ratón de tipo natural. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en todas o sustancialmente todas las células portadoras de ADN que no son de linaje reconfigurado de células B; en una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está presente en las células de la línea germinal del ratón, pero no en un cromosoma de una célula B reconfigurado .

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) en la totalidad o sustancialmente todas las células portadoras de ADN, incluyendo las células B que comprenden loci de inmunoglobulina reconfigurados , en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) se produce en el genoma en una posición que es diferente de una posición en la que un gen ADAM6 de ratón aparece en un ratón de tipo natural. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está en un ácido nucleico que es contiguo con el locus de inmunoglobulina reconfigurado . En una modalidad, el ácido nucleico que es contigua con el locus de inmunoglobulina reconfigurado es un cromosoma. En una modalidad, el cromosoma es un cromosoma que se encuentra en un ratón de tipo natural y el cromosoma comprende una modificación de un locus de inmunoglobulina de ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón modificado genéticamente, en donde el ratón comprende una célula B que comprende en su genoma una secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma. En una modalidad, la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma se encuentra en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina . En una modalidad, la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma se encuentra en un locus que no es un locus de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 está en un transgén dirigido por un promotor heterólogo. En una modalidad específica, el promotor heterólogo es un promotor que no es inmunoglobulina. En una modalidad específica, la célula B expresa una proteína de ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma .

En una modalidad, el 90% o más de las células B del ratón comprenden un gen que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo de la misma o un homólogo de la misma o un fragmento de la misma que es funcional en el ratón. En una modalidad específica, el ratón es un ratón macho.

En una modalidad, el genoma de la célula B comprende un primer alelo y un segundo alelo que comprende la secuencia ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma. En una modalidad, el genoma de la célula B comprende un primer alelo pero no un segundo alelo que comprende la secuencia ADAM6/u ortólogo u homólogo de la misma.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una modificación en uno o más alelos endógenos ADAM6.

En una modalidad, la modificación hace que el ratón sea incapaz de expresar una proteína funcional ADAM6 a partir de al menos uno de los uno o más alelos ADAM6 endógenos. En una modalidad específica, el ratón es incapaz de expresar una proteína funcional ADAM6 de cada uno de los alelos endógenos ADA 6.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una proteína funcional ADAM6 a partir de cada alelo endógeno ADAM6, y los ratones comprenden una secuencia ectópica ADAM6.

En una modalidad, los ratones son incapaces de expresar una proteína funcional ADAM6 de cada alelo endógeno ADAM6 , y los ratones comprenden una secuencia ectópica ADAM6 situada dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 , 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, o 120 o más kb cadena arriba (con respecto a la dirección de la transcripción del locus de cadena pesada de ratón) de una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad específica, la secuencia ectópica ADAM6 está en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena (por ejemplo, en una región intergénica V-D, entre dos segmentos génicos V, entre un segmento génico V y uno D, entre un segmento génico D y uno J, etc.) . En una modalidad específica, la secuencia ectópica ADAM6 se encuentra dentro de una secuencia intergénica de 90 a 100 kb entre el segmento génico V de ratón final y el primer segmento génico D del ratón. En otra modalidad específica, se elimina la secuencia de V-D endógena de 90 a 100 kb, y la secuencia ectópica ADAM6 se coloca entre el primer segmento génico D y el D final .

En un aspecto, se proporciona un ratón macho estéril, en donde el ratón comprende una supresión de dos o más alelos endógenos ADAM6. En un aspecto, se proporciona un ratón hembra que es un portador de un rasgo de la infertilidad masculina, en donde el ratón hembra comprende en su línea germinal un alelo ADAM6 no funcional o un gen inactivado de un alelo endógeno ADAM6.

En un aspecto, se proporciona un ratón que carece de un segmento génico V, D, y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, en donde una mayoría de las células B del ratón comprenden una secuencia de ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma .

En una modalidad, el ratón carece de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena seleccionados a partir de dos o más segmentos génicos V, dos o más segmentos génicos D, dos o más segmentos génicos J, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el ratón carece de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionados a partir de al menos uno y hasta 89 segmentos génicos V, al menos uno y hasta 13 segmentos génicos D, al menos uno y hasta cuatro segmentos génicos J, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el ratón carece de un fragmento de ADN genómico del cromosoma 12 que comprende alrededor de tres megabases del locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, el ratón carece de todos los segmentos génicos V, D, y J de cadena pesada funcional endógeno. En una modalidad específica, el ratón carece de 89 segmentos génicos VH, 13 segmentos génicos DH y cuatro segmentos génicos JH.

En un aspecto, se proporciona un ratón, en donde el ratón tiene un genoma en la línea germinal que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación del locus de cadena pesada de la inmunoglobulina comprende la sustitución de una o más secuencias de la región variable de inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias de región variable no de inmunoglobulina de ratón, y en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una modalidad preferida, las secuencias de DH y JH y al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias de VH del locus de cadena pesada de la inmunoglobulina se sustituyen por secuencias de la región variable de inmunoglobulina que no es de ratón. En una modalidad preferida adicional, el DH, H, y todas las secuencias de VH de locus de cadena pesada de la inmunoglobulina se sustituyen por las secuencias de región variable que no son de inmunoglobulina de ratón. Las secuencias de región variable de inmunoglobulina que no es de ratón pueden ser no reconfiguradas . En una modalidad preferida, las secuencias de región variable que no son de inmunoglobulina de ratón comprenden regiones completas no reconfiguradas ¾ y ¾ y al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 secuencias de VH no reconfiguradas de las especies no de ratón. En una modalidad preferida adicional, las secuencias de región variable que no son de inmunoglobulina de ratón comprenden la región variable completa, incluyendo todas las regiones JH, VH, DH, de las especies no de ratón. Las especies que no son de ratón pueden ser Homo sapiens y las secuencias de la región variable que no son de inmunoglobulina de ratón pueden ser secuencias humanas .

En un aspecto, se proporciona un ratón que expresa un anticuerpo que comprende al menos un polipéptido de inmunoglobulina de dominio variable humano/dominio constante no humano, en donde el ratón expresa una proteína ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo de la misma a partir de un locus distinto a un locus de inmunoglobulina.

En una modalidad, la proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma se expresa en una célula B del ratón, en donde la célula B comprende un secuencia de inmunoglobulina reconfigurada que comprende una secuencia variable humana y una secuencia constante no humana.

En una modalidad, la secuencia constante no humana es una secuencia de roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata, y un hámster.

En un aspecto, se proporciona un método para la fabricación de un ratón macho estéril, que comprende convertir un alelo endógeno ADAM6 de una célula ES donadora no funcional (o la inactivación de el alelo) , introduciendo la célula ES donadora en un embrión hospedero, incubar el embrión hospedero en una madre sustituta, y permitir que la madre sustituta de luz a la progenie obtenida en su totalidad o en parte de la célula ES donante. En una modalidad, el método comprende además la cría de la progenie para obtener un ratón macho estéril.

En un aspecto, se proporciona un método para la fabricación de un ratón con una modificación genética de interés, en donde el ratón es estéril, comprendiendo el método las etapas de (a) hacer una modificación genética de interés en un genoma; (b) modificar el genoma para inactivar el gen de un alelo endógeno ADAM6 , o hacer un alelo endógeno ADAM6 no funcional, y, (c) emplear el genoma en la fabricación de un ratón. En diversas modalidades, el genoma es de una célula ES o utilizado en un experimento de transferencia nuclear.

En un aspecto, se describe un ratón hecho usando un vector de direccionamiento, constructo de nucleótidos, o célula como se proporciona aquí.

En un aspecto, se proporciona una progenie de un apareamiento de un ratón como se describe en este documento con un segundo ratón que es un ratón de tipo natural o modificado genéticamente.

En un aspecto, se proporciona un método para el mantenimiento de una cepa de ratón, en donde la cepa de ratón comprende una sustitución de una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogas. En una modalidad, la una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogas son secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina humanas.

En una modalidad, la cepa de ratón comprende una supresión de uno o más segmentos génicos VH, DH, y/o JH de ratón. En una modalidad, el ratón comprende además uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos DH humanos, y/o uno o más segmentos génicos JH humanos. En una modalidad, el ratón comprende al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 segmentos VH humanos, al menos 27 segmentos génicos DH humanos, y al menos seis segmentos génicos JH. En una modalidad específica, el ratón comprende al menos 3, al menos 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, o al menos 80 segmentos VH humanos, los al menos 27 segmentos génicos DH humanos, y los al menos seis segmentos génicos JH se unen operativamente a un gen de la región constante. En una modalidad, el gen de la región constante es un gen de la región constante de ratón. En una modalidad, el gen de la región constante comprende una secuencia génica de la región constante de ratón seleccionada de un CH1, una bisagra, un CH2 , un CH3 , y/o un CH4 o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el método comprende la generación de un ratón macho heterocigótico para la sustitución de la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y la cría del ratón macho heterocigótico con una hembra de ratón de tipo natural o un ratón hembra que es homocigótico o heterocigótico para la secuencia de cadena pesada humana. En una modalidad, el método comprende mantener la cepa por la cría repetidamente de machos heterocigotos con las hembras que son de tipo natural u homocigóticos o heterocigotos para, la secuencia de cadena pesada humana.

En una modalidad, el método comprende la obtención de células de ratones machos o hembras homocigóticos o heterocigotos para la secuencia de cadena pesada humana, y el empleo de las células como las células del donante o núcleos de ellas como núcleos donantes, y el uso de las células o núcleos para hacer animales genéticamente modificados utilizando células hospederas y/o gestar las células y/o núcleos en las madres sustitutas.

En una modalidad, sólo los ratones machos que son heterocigotos para la sustitución en el locus de cadena pesada son criados a ratones hembra. En una modalidad específica, los ratones hembra son homocigóticos , heterocigotos , o de tipo natural con respecto a un locus de cadena pesada sustituido.

En una modalidad, el ratón comprende además una sustitución de secuencias variables de la cadena ligera ? y/o K en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena con secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina heterólogas . En una modalidad, las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina heterólogas son secuencias variables de la cadena ? y/o ? de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, el ratón comprende además un transgén en un locus distinto de un locus de inmunoglobulina endógena, en donde el transgén comprende una secuencia que codifica una secuencia de cadena ligera ? y/o ? heteróloga reconfigurada o sin reconfigurar (por ejemplo, VL no reconfigurado y JL no reconfigurados o Vj reconfigurados) operativamente ligados, (para los no recon igurados) o fusionados (para los reconfigurados) a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera heteróloga ? y/o ? es humana. En una modalidad, la secuencia de región constante se selecciona de roedores, humanos, y de primates no humanos. En una modalidad, la secuencia de región constante se selecciona de entre ratón, rata, y hámster. En una modalidad, el transgén comprende un promotor que no es inmunoglobulina que conduce la expresión de las secuencias de cadena ligera. En una modalidad específica, el promotor es un promotor transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el promotor es un promotor ROSA26.

En un aspecto, se proporciona un constructo de ácido nucleico, que comprende un brazo de homología cadena arriba y un brazo de homología cadena abajo, en donde el brazo de homología cadena arriba comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, el brazo de homología cadena abajo comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de región variable de inmunoglobulina humana o de ratón, y dispuesta entre los brazos de homología de cadena arriba y cadena abajo está una secuencia que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 de ratón. En una modalidad específica, la secuencia que codifica el gen ADAM6 de ratón está ligado operativamente con un promotor de ratón con el cual el ADAM6 ratón está ligado en un ratón de tipo natural.

En un aspecto, se proporciona un vector de direccionamiento, que comprende (a) una secuencia de nucleótidos que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos del segmento génico de la región variable humana, y, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón.

En una modalidad, el vector de direccionamiento comprende además un promotor ligado operativamente a la secuencia que codifica el ADAM6 de ratón. En una modalidad específica, el promotor es un promotor ADAM6 de ratón.

En un aspecto, se proporciona un constructo de nucleótidos para la modificación de un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en donde la constructo comprende al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa específica del sitio y una secuencia que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón.

En un aspecto, se proporcionan células de ratón y embriones de ratón, incluyendo, pero no limitado a las células ES, células pluripotentes y células pluripotentes inducidas, que comprenden modificaciones genéticas, como se describe en este documento. Se proporcionan células que son XX y las células que son XY. También se proporcionan células que comprenden un núcleo que contiene una modificación como se describe en este documento, por ejemplo, una modificación introducida en una célula mediante inyección pronuclear. También se proporcionan células, embriones y ratones que comprenden un gen ADAM6 viralmente introducido, por ejemplo, células, embriones y ratones, que comprenden un constructo de transducción que comprende un gen ADAM6 que es funcional en el ratón.

En un aspecto, se proporciona una célula de ratón modificado genéticamente, en donde la célula carece de un locus funcional ADAM6 de ratón endógeno, y la célula comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína del ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo. En una modalidad, la célula comprende además una modificación de una secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, la modificación de la secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena comprende una supresión seleccionada de una supresión de un segmento génico VH de ratón, una supresión de un segmento génico DH de ratón, una supresión de un segmento génico JH de ratón, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el ratón comprende una sustitución de una o más secuencias VH, DH y/o JH de inmunoglobulina de ratón con una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana se selecciona de una VH humana, una VL humana, una DH humana, una JH humana, una JL humana, y una combinación de los mismos.

En una modalidad, la célula es una célula totipotente, una célula pluripotente , o una célula pluripotente inducida. En una modalidad específica, la célula es una célula ES de ratón.

En un aspecto, se proporciona una célula B de ratón, en donde la célula B de ratón comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada reconfigurado, en donde la célula B comprende en un cromosoma de la célula B una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo o homólogo o fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la célula de ratón B comprende dos alelos de la secuencia de ácido nucleico.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de la célula B) que está contigua con locus de cadena pesada reconfigurado de la inmunoglobulina de ratón.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma de la célula B) que es distinta de la molécula de ácido nucleico que comprende el locus de cadena pesada reconfigurado de la inmunog1obulina de ratón .

En una modalidad, la célula B de ratón comprende una secuencia génica reconfigurada variable que no es de inmunoglobulina de ratón ligada operativamente a un gen de la región constante de inmunoglobulina de ratón o humano, en donde la célula B comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

En un aspecto, se proporciona una célula somática de ratón, que comprende un cromosoma que comprende un locus de cadena pesada modificada de inmunoglobulina, y una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma como el locus modificado de cadena pesada de la inmunoglobulina. En una modalidad, el ácido nucleico está en un cromosoma diferente del locus modificado de cadena pesada de la inmunoglobulina. En una modalidad, la célula somática comprende una única copia de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad, la célula somática comprende al menos dos copias de la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad específica, la célula somática es una célula B. En una modalidad específica, la célula es una célula germinal. En una modalidad específica, la célula es una célula madre.

En un aspecto, se proporciona una célula germinal de ratón, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón (u homólogo o fragmento ortólogo o funcional del mismo) en un cromosoma de la célula germinal, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el ADAM6 de ratón (u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo) está en una posición en el cromosoma que es diferente de una posición en un cromosoma de una célula germinal de ratón de tipo natural. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un locus de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en el mismo cromosoma de la célula germinal como un locus de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un cromosoma diferente de la célula germinal que el locus de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, el locus de inmunoglobulina de ratón comprende una sustitución de al menos una secuencia de inmunoglobulina de ratón con al menos una secuencia de inmunoglobulina que no es de ratón. En una modalidad específica, la al menos una secuencia de inmunoglobulina que no es de ratón es una secuencia de inmunoglobulina humana.

En un aspecto, se proporciona una célula pluripotente, pluripotente inducidas, o totipotente derivada de un ratón como se describe aquí. En una modalidad específica, la célula es una célula madre embrionaria de ratón (ES, por sus siglas en inglés) .

En un aspecto, se proporciona un tejido derivado de un ratón como se describe en este documento. En una modalidad, el tejido se deriva de bazo, ganglios linfáticos o médula ósea de un ratón como se describe en este documento.

En un aspecto, se proporciona un núcleo derivado de un ratón como se describe en este documento. En una modalidad, el núcleo es de una célula diploide que no es una célula B.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de inmunoglobulina hecha en un ratón como se describe en este documento .

En un aspecto, se proporciona una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o cadena pesada de inmunoglobul na de un anticuerpo hecho en un ratón como se describe en este documento .

En un aspecto, se proporciona una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región variable de un anticuerpo hecho en un ratón como se describe en este documento.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace al antígeno del mismo (por ejemplo, Fab, F(ab)2í scFv) realizados en un ratón como se describe en este documento. En un aspecto, se proporciona un método para la fabricación de un ratón modificado genéticamente, que comprende el reemplazo de uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina de cadena pesada cadena arriba (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina) de un locus ADAM6 endógeno del ratón con uno o más segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la sustitución de uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina cadena abajo (con respecto a la transcripción de los segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina) del locus ADAM6 del ratón con uno o más segmentos génicos de la cadena ligera o de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, los uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que sustituyen uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena cadena arriba de un locus ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos génicos V. En una modalidad, los segmentos génicos de inmunoglobulina humana que sustituyen uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena cadena arriba de un locus ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos génicos V y D. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que sustituyen uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del ratón incluyen segmentos génicos J. En una modalidad, los uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que sustituyen uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del ratón incluyen los segmentos génicos D y J. En una modalidad, los uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana que sustituyen uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina endógena cadena abajo de un locus ADAM6 endógeno del ratón incluyen los segmentos génicos V, D y J.

En una modalidad, los uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina de cadena pesada cadena arriba y/o cadena abajo del gen ADAM6 se sustituyen en una célula pluripotente , pluripotente inducida, o totipotente para formar una célula progenitora modificada genéticamente; la célula progenitora modificada genéticamente se introduce en un hospedero, y, el hospedero que comprende la célula progenitora modificada genéticamente se gesta para formar un ratón que comprende un genoma derivado de la célula progenitora modificada genéticamente. En una modalidad, el hospedero es un embrión. En una modalidad específica, el hospedero se selecciona a partir de un ratón de pre-mórula (por ejemplo, de la etapa de 4 u 8 células) , un embrión tetraploide, un agregado de células embrionarias, o un blastocisto.

En un aspecto, se proporciona un método para la fabricación de un ratón modificado genéticamente, que comprende sustituir una secuencia de nucleótidos de ratón que comprende un segmento génico de inmunoglobulina de ratón y una secuencia de nucleótidos ADAM6 de ratón (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo en un ratón macho) con una secuencia que comprende un segmento génico de inmunoglobulina humana para formar un primer locus quimérico, luego con la inserción de una secuencia que comprende una secuencia que codifica un ADAM6 de ratón (o una secuencia que codifica un ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) en la secuencia que comprende el segmento génico de inmunoglobulina humana para formar un segundo locus quimérico .

En una modalidad, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el segundo locus quimérico comprende un segmento segmento génico variable (VL) de la cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el segundo locus quimérico comprende un segmento génico VH humano o un segmento génico VL humano ligado operativamente a un segmento génico DH humano y un segmento génico JH humano. En una modalidad específica adicional, el segundo locus quimérico está ligado operativamente a un tercer locus quimérico que comprende una secuencia de CH1 humana, o una secuencia de CH1 humana y bisagra humana, fusionado con una secuencia de ratón CH2 + CH3.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón que comprende una secuencia ectópica de nucleótidos que comprende un locus o secuencia ADAM6 de ratón para hacer fértil a un ratón macho, en donde el uso comprende aparear el ratón que comprende la secuencia ectópica de nucleótidos que comprende el locus o secuencia ADAM6 de ratón con un ratón que carece de un locus o secuencia funcional ADAM6 de ratón endógeno, y la obtención de una progenie que es una hembra capaz de producir progenie que tiene el locus o secuencia ADAM6 ectópico o que es un macho que comprende el locus o secuencia de ADAM6 ectópico, y el macho presenta una fertilidad que es alrededor de la misma que una fertilidad exhibida por un ratón macho de tipo natural.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para hacer una secuencia de nucleótidos de la región variable de inmunoglobulina .

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para hacer un Fab completamente humano o un F(ab)2 completamente humano.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para hacer una línea celular inmortalizada .

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para hacer que un hibridoma o cuadroma .

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para hacer una biblioteca de fagos que contienen las regiones variables de cadenas pesadas humanas y regiones variables de cadenas ligeras humanas.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para generar una secuencia de región variable para la fabricación de un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en este documento con un antígeno de interés, (b) aislar un linfocito a partir del' ratón inmunizado de (a) , (c) exponer el linfocito a uno o más anticuerpos etiquetados, (d) la identificación de un linfocito que es capaz de enlazarse al antígeno de interés, y (e) amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de regiones variables a partir de los linfocitos generando de ese modo una secuencia de región variable .

En una modalidad, el linfocito se deriva a partir del bazo del ratón. En una modalidad, el linfocito se deriva de un ganglio linfático del ratón. En una modalidad, el linfocito se deriva de la médula ósea del ratón.

En una modalidad, el anticuerpo marcado es un anticuerpo conjugado con fluoróforo. En una modalidad, los uno o más anticuerpos conjugados con fluoróforo se seleccionan de una IgM, una IgG, y/o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el linfocito es una célula B.

En una modalidad, la una o más secuencia de ácido nucleico de la región variable comprende una secuencia de región variable de cadena pesada. En una modalidad, la una o más secuencia de ácido nucleico de la región variable de comprende una secuencia de región variable de cadena ligera. En una modalidad específica, la secuencia de región variable de cadena ligera es una inmunoglobuli a secuencia de región variable de la cadena ligera . En una modalidad, la una o más secuencia de ácido nucleico de la región variable comprende una cadena pesada y una secuencia de región variable de la cadena ligera .

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para generar una secuencia de región variable de la cadena ligera ? y una pesada para la fabricación de un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en este documento con un antígeno de interés, (b) aislar el bazo del ratón inmunizado de (a) , (c) la exposición de los linfocitos B del bazo a uno o más anticuerpos etiquetados, (d) la identificación de un linfocito B de (c) que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y una secuencia* de ácido nucleico de región variable de cadena ligera ? a partir de los linfocitos B generando de este modo las secuencias de cadena pesada y de región variable de cadena ligera K.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para generar una secuencia de región variable de la cadena ligera ? y una pesada para la fabricación de un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en este documento con un antígeno de interés, (b) aislar el uno o más ganglios linfáticos del ratón inmunizado de (a) , (c) la exposición de los linfocitos B del uno o más ganglios linfáticos a uno o más anticuerpos etiquetados, (d) la identificación de un linfocito B de (c) que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera a partir de los linfocitos B generando de este modo las secuencias de cadena pesada y de región variable de cadena ligera ?.

En una modalidad, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para generar una secuencia de región variable de la cadena ligera ? y una pesada para la fabricación de un anticuerpo humano, que comprende (a) inmunizar un ratón como se describe en este documento con un antígeno de interés, (b) aislar la médula ósea del ratón inmunizado de (a) , (c) la exposición de los linfocitos B de la médula ósea a uno o más anticuerpos etiquetados, (d) la identificación de un linfocito B de (c) que es capaz de unirse al antígeno de interés, y (e) amplificar una secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera ? a partir de los linfocitos B generando de este modo las secuencias de cadena pesada y de región variable de cadena ligera ?. En diversas modalidades, los uno o más anticuerpos etiquetados se seleccionan a partir de una Ig , una IgG, y/o una combinación de los mismos.

En diversas modalidades, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para generar una secuencia de región variable de cadena ligera y de cadena pesada para la fabricación de un anticuerpo humano, que comprende además la fusión de las secuencias amplificadas de la región variable de cadena pesada y ligera a secuencias de región constante de cadena pesada y cadena ligera humanas, que expresan las secuencias de cadena pesada y ligera fusionadas en una célula, y la recuperación de las secuencias de cadena pesada y ligera expresadas generando de ese modo un anticuerpo humano.

En diversas modalidades, las regiones constantes de cadena pesada humana se seleccionan a partir de IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. En diversas modalidades específicas, la IgG se selecciona de una IgGl, una IgG2 , una IgG3 y una IgG4. En diversas modalidades, la región constante de cadena pesada humana comprende una CH1, una bisagra, una CH2 , un CH3 , una CH , o una combinación de los mismos. En diversas modalidades, la región constante de cadena ligera es una región constante de inmunoglobulina . En diversas modalidades, la célula se selecciona entre una célula HeLa, una célula DU145, una célula LNCaP, una célula MCF-7, una célula MDA-MB-438, una célula PC3 , una célula T47D, una célula THP-1, una célula U87, una célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), una célula Saos-2, una célula Vero, una célula CHO, una célula GH3 , una célula PC12 , una célula de la retina humana (por ejemplo, una célula PER . C6™) , y una célula MC3T3. En una modalidad específica, la célula es una célula CHO.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo humano-roedor quimérico- inverso específica contra un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunizar a un ratón como se describe en este documento con el antígeno, aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo humano-ratón quimérico-inverso específico contra el antígeno, cultivar al menos una célula que produce el anticuerpo humano-ratón quimérico-inverso específico contra el antígeno, y la obtención del anticuerpo.

En una modalidad, el anticuerpo humano-ratón quimérico-inverso comprende un dominio variable de cadena pesada humana fusionado con un gen constante de cadena pesada de ratón o de rata, y dominio variable de cadena ligera humano fusionado con un gen constante de cadena ligera de ratón o de rata o humana .

En una modalidad, el cultivo de al menos una célula que produce el anticuerpo de humano-roedor quimérico-inverso específico contra el antígeno se lleva a cabo en al menos una célula de hibridoma generada a partir de la al menos una célula aislada del ratón.

En un aspecto, se proporciona un método para generar un anticuerpo completamente humano específico contra un antígeno de interés, que comprende las etapas de inmunizar a un ratón como se describe en este documento con el antígeno, aislar al menos una célula a partir de un ratón para producir un anticuerpo humano-roedor quimérico- inverso específico contra el antígeno, generar al menos una célula productora de un anticuerpo completamente humano derivada del anticuerpo humano-roedor quimérico-inverso específico contra el antígeno, y el cultivo de al menos una célula que produce el anticuerpo completamente humano, y la obtención de el anticuerpo totalmente humano.

En diversas modalidades, la al menos una célula aislada del ratón que produce un anticuerpo de roedor quimérico-humano- inverso específico contra el antígeno es un esplenocito o una célula B.

En diversas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

En diversas modalidades, la inmunización con el antígeno de interés se lleva a cabo con la proteína, ADN, una combinación de ADN y proteínas, o las células que expresan el antígeno.

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para hacer una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina o fragmento de la misma. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se utiliza para hacer un anticuerpo humano o fragmento de enlace a antígeno de los mismos. En una modalidad, el ratón se usa para hacer una proteína de enlace a antígeno seleccionada de un anticuerpo, un anticuerpo múltiple específico (por ejemplo, un anticuerpo bi-específico) , un scFv, un scFv biespecífico , un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un V-NAR, un VHH, una VL, un F(ab), un F(ab)2, un DVD (es decir, proteína del dominio variable doble de enlace al antígeno) , una SVD (es decir, proteína de enlace a antígeno de un solo dominio variable) , o un acoplador de células T biespecífico (BITE, por sus siglas en inglés) .

En un aspecto, se proporciona el uso de un ratón como se describe en este documento para introducir una secuencia ectópica ADAM6 en un ratón que carece de una secuencia funcional ADAM6 de ratón endógeno, en donde el uso comprende el apareamiento de un ratón como se describe en este documento con el ratón que carece de la secuencia ADAM6 funcional del ratón endógeno.

En un aspecto, se proporciona el uso de material genético de un ratón como se describe en este documento para hacer un ratón que tiene una secuencia ectópica ADAM6. En una modalidad, el uso comprende la transferencia nuclear usando un núcleo de una célula de un ratón como se describe en este documento. En una modalidad, el uso comprende la clonación de una célula de un ratón como se describe en este documento para producir un animal derivado de la célula. En una modalidad, el uso comprende el empleo de un espermatozoide o un óvulo de un ratón como se describe en este documento en un proceso para la fabricación de un ratón que comprende la secuencia ectópica ADAM6.

En un aspecto, se proporciona un método para la fabricación de un ratón macho fértil que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificada, que comprende fertilizar una primera célula germinal de ratón que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con una segunda célula germinal de ratón que comprende un gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho; formar una célula fertilizada; permitir que la célula fertilizada se desarrolle en un embrión, y, hacer la gestación del embrión en una madre sustituta para obtener un ratón.

En una modalidad, la fertilización se logra mediante el apareamiento de un ratón macho y una hembra de ratón. En una modalidad, el ratón hembra comprende el gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo. En una modalidad, el ratón macho comprende el gen ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento del mismo.

En un aspecto, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo de la misma o un fragmento funcional de la proteína correspondiente ADAM6 para restaurar o mejorar la fertilidad de un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la modificación reduce o elimina la función del ADAM6 endógeno .

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma del ratón en una posición ectópica. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma del ratón en un locus de inmunoglobulina endógena. En una modalidad específica, el locus de inmunoglobulina endógena es un locus de cadena pesada. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma del ratón en una posición que no sea un locus de inmunoglobulina endógena .

En un aspecto, se proporciona el uso del ratón como se describe en este documento para la fabricación de un medicamento (por ejemplo, una proteína de enlace a antígeno) , o para la fabricación de una secuencia que codifica una secuencia variable de un medicamento (por ejemplo, un antígeno-proteína de enlace) , para el tratamiento de una enfermedad o trastorno humano.

Breve Descripción de lats Figuras La FIG. 1A muestra una ilustración general, que no está a escala, de una sustitución genómica directa de alrededor de tres megabases (Mb) de un locus de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con alrededor de una megabase (Mb) del locus de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) .

La FIG. IB muestra una ilustración general, que no está a escala, de una sustitución genómica directa de alrededor de tres megabases (Mb) de un locus de gen variable de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón (símbolos cerrados) con alrededor de 0.5 megabases (Mb) de la primera, o próxima, de dos repeticiones casi idénticas de un locus de gen variable de cadena ligera ? de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) .

La FIG. 2A muestra una ilustración detallada, que no está a escala, de tres etapas iniciales (A-C) para sustitución genómica directa de un locus de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que resulta en supresión de todos los segmentos génicos VH, DH y JH de ratón y la sustitución con tres segmentos génicos humano VH, y DH y JH todos humanos. Se muestra un vector de direccionamiento para una primera inserción de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana (3hVH BACvec) con un brazo de homología de ratón de 67 kb en 5', un cásete de selección (rectángulo abierto) , un sitio de recombinación específico del sitio (triángulo abierto) , un fragmento genómico humano de 145 kb y un brazo de homología de ratón de 8 kb en 31. Se muestran los segmentos génicos de inmunoglobulina de humano (símbolos abiertos) y ratón (símbolos cerrados) , casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos del sitio (triángulos abiertos) insertados a partir de los vectores de direccionamiento posteriores .

La FIG. 2B muestra una ilustración detallada, que no está a escala, de seis etapas adicionales (D-I) para sustitución genómica directa de un locus de gen variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que resulta en la inserción de 77 segmentos génicos humanos adicionales VH y la remoción de un cásete de selección final . Se muestra un vector de direccionamiento para inserción de segmentos génicos humanos adicionales VH (18hVH BACvec) a la inserción inicial de segmentos génicos de cadena pesada humana (Alelo Híbrido 3hVH-CRE) con un brazo de homología de ratón de 20 kb en 5' , un cásete de selección (rectángulo abierto) , un fragmento genómico humano de 196 kb y un brazo de homología humano de 62 kb que se traslapa con el extremo en 51 de la inserción inicial de segmentos génicos de cadena pesada humana, el cual se muestra con un sitio de recombinación específico del sitio (triángulo abierto) localizado 5' a los segmentos génicos humanos. Se muestran segmentos génicos de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados por vectores de direccionamiento posteriores.

La FIG. 2C muestra una ilustración detallada, que no está a escala, de tres etapas iniciales (A-C) para la sustitución genómica directa de un locus de gen variable de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón que resulta en supresión de todos los segmentos génicos VK, y JK de ratón (IgK-CRE Alelo Híbrido) . Se muestran los casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos del sitio (triángulos abiertos) insertados desde los vectores de direccionamiento.

La FIG. 2D muestra una ilustración detallada, que no está a escala, de cinco etapas adicionales (D-H) para sustitución genómica directa de un locus de gen variable de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón que resulta en la inserción de todos los segmentos génicos VK y JK humanos de la repetición próxima y supresión de un cásete de selección final (40hVKdHyg Alelo Híbrido) . Se muestran los segmentos génicos de inmunoglobulina humana (símbolos abiertos) y ratón (símbolos cerrados) y casetes de selección adicionales (rectángulos abiertos) insertados por los vectores de direccionamiento posteriores.

La FIG. 3A muestra una ilustración general, que no está a escala, de una estrategia de cribado que incluye las ubicaciones de conjuntos de cebador/sonda por PCR cuantitativa (qPCR) para detectar la inserción de secuencias génicas de cadena pesada humana y pérdida de secuencias génicas de cadena pesada de ratón en células madre embrionarias dirigidas (ES) . La estrategia de cribado en células ES y ratones para una primera inserción de gen pesado humano se muestra con los conjuntos de cebador/sonda qPCR para la región eliminada (sondas de "pérdida" C y D) , la región insertada ("hlgH" sondas G y H) y regiones de flanqueo (sondas de "retención" A, B, E y F) sobre un cromosoma de ratón sin modificar (superior) y un cromosoma correctamente direccionado (fondo) .

La FIG. 3B muestra un cálculo representativo del número de copias de sondas observado en células ES precursoras y modificadas para una primera inserción de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana. El número de copias de sonda observado para las sondas A a la F se calculó como 2/2AACt. AACt se calcula como promedio [ACt (muestra) -medACt (control) ] donde ACt es la diferencia en Ct entre las sondas de prueba y de referencia (entre 4 y 6 sondas de referencia dependiendo del ensayo) . El término medACt (control) es la ACt mediana de muestras múltiples (>60) de ADN no direccionado a partir de células precursoras ES. Cada clon modificado de células ES se ensayó por sextuplicado. Para calcular el número de copias de las sondas de IgH G y H en células precursoras ES, estas sondas se asumieron para tener un número de copias de 1 en células ES modificadas y un Ct máximo de 35 se usó aunque no se observara amplificación.

La FIG. 3C muestra un cálculo representativo de números de copias para cuatro ratones de cada genotipo calculado al usar solamente las sondas D y H. Ratones de tipo natural: Ratones T; Ratones heterocigotos para una primera inserción de segmentos génicos de inmunoglobulina humana: Ratones HET; Ratones homocigóticos para una primera inserción de segmentos génicos de inmunoglobulina humana: Homo Ratones.

La FIG. 4A muestra una ilustración detallada, que no está a escala, de las tres etapas empleadas para la construcción de un 3hVH BACvec por recombinación homologa bacterial (BHR, por sus siglas en inglés) . Se muestran los segmentos génicos de inmunoglobulina humanos (símbolos abiertos) y de ratón (símbolos cerrados) , casetes de selección (rectángulos abiertos) y sitios de recombinación específicos del sitio (triángulo abiertos) insertados desde los vectores de direccionamiento .

La FIG. 4B muestra electroforesis en gel de pulso-campo (PFGE, por sus siglas en inglés) de tres clones BAC (Bl, B2 y B3) después de la digestión Notl. Los marcadores MI, M2 y M3 son marcadores PFG línder de inérvalo bajo, intervalo medio y lambda, respectivamente (New England BioLabs, Ipswich, MA) .

La FIG. 5A muestra una ilustración esquemática, que no está a escala, de modificaciones secuenciales de locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con cantidades crecientes de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los ratones homocigóticos se hicieron a partir de cada una de las tres fases diferentes de humanización de cadena pesada. Los símbolos abiertos indican secuencia humana; los símbolos cerrados indican secuencia de ratón.

La FIG. 5B muestra una ilustración esquemática, que no está a escala, de modificaciones secuenciales de locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón con cantidades crecientes de segmentos génicos de cadena ligera ? de inmunoglobulina humana. Los ratones homocigóticos se hicieron a partir de cada una de las tres fases diferentes de humanización de cadena ligera . Los símbolos abiertos indican secuencia humana; los símbolos cerrados indican secuencia de ratón.

La FIG. 6 muestra gráficas de punto FACS de poblaciones de célula B en ratone shumanizados VELOCIMMUNE® y de tipo natural. Las células del bazo (hilera superior, tercera hilera desde arriba e hilera inferior) o ganglio linfático inguinal (segunda hilera desde arriba) de ratones de tipo natural (wt) , VELOCIMMUNE® 1 (VI) , VELOCIMMUNE® 2 (V2) o VELOCIMMU E® 3 (V3) se tiñeron para células B que expresan IgM de superficie (hilera superior, y segunda hilera desde arriba) , la inmunoglobulina de superficie contiene cadenas ligeras ya sea o ? (tercera hilera desde arriba) o IgM de superficie de haplotipos específicos (hilera inferior) , y poblaciones separadas por FACS.

La FIG. 7A muestra secuencias CDR3 de cadena pesada representativas de anticuerpos VELOCIMMUNE® aleatoriamente seleccionados alrededor de la unión VH-DH-JH (CDR3), lo que demuestra una diversidad de unión y adiciones de nucleótido. Las secuencias CDR3 de cadena pesada se agrupan de acuerdo con el uso del segmento de gen DH, la línea germinal de la cual se proporciona anteriormente cada grupo está en negrita. Los segmentos génicos VH para cada secuencia CDR3 de cadena pesada se señalan dentro del paréntesis en el extremo 5' de cada secuencia (por ejemplo, 3-72 es VH3-72 humano) . Los segmentos génicos JH para cada CDR3 de cadena pesada se señalan dentro del paréntesis en el extremo 3' de cada secuencia (por ejemplo, 3 es JH3 humano) . Las SEQ ID NOs para cada secuencia mostrada son como sigue procediendo desde arriba hacia abajo: SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39.

La FIG. 7B muestra secuencias representativas de CDR3 de cadena ligera de anticuerpos VELOCIMMUNE® aleatoriamente seleccionados alrededor de la unión VK-JK (CDR3) , lo que demuestra la diversidad de unión y adiciones de nucleótido. Los segmentos génicos VK para cada secuj encía CDR3 de cadena ligera se señalan dentro del paréntesis en el extremo 5' de cada secuencia (por ejemplo, 1-6 es VK1-6 humano). Los segmentos génicos JK para cada CDR3 de cadena ligera se señalan dentro del paréntesis en el extremo 3' de cada secuencia (por ejemplo, 1 es JKI humano) . Las SEQ ID NOs para cada secuencia mostrada son como sigue procediendo desde arriba hacia abajo: SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58.

La FIG. 8 muestra frecuencias de hipermutación somática de cadenas pesada y ligera de anticuerpos VELOCIMMUNE® registrados (después de la alineación para emparejar las secuencias de línea germinal) como porcentaje de secuencias cambiadas en cada posición de nucleótido (NT; columna de la izquierda) o aminoácido (AA; columna de la derecha) entre conjuntos de 38 (IgM no inmunizado) , 28 (IgG no inmunizado) , 32 (IgK no inmunizado de IgG) , 36 (IgG inmunizado) o 36 (IgK inmunizado de IgG) msecuencias. Las barras sombreadas indican las ubicaciones de CDRs .

La FIG. 9A muestra los niveles de inmunoglobulina en suero para isotipos IgM e IgG en ratones de tipo natural (barras abiertas) o VELOCIMMTJNE® (barras cerradas) .

La FIG. 9B muestra los niveles de inmunoglobulina en suero para el isotipo IgA en ratones de tipo natural (barras abiertas) o VELOCIMMU E® (barras cerradas) .

La FIG. 9C muestra los niveles de inmunoglobulina en suero para el isotipo IgE en ratones de tipo natural (barras abiertas) o VELOCIMMUNE® (barras cerradas) .

La FIG. 10A muestra concentraciones IgG específicas de antígeno contra receptor de interleucina 6 (IL-6R) de suero a partir de siete ratones VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones de tipo natural (WT, por sus siglas en inglés) después de dos (sangrado 1) o tres (sangrado 2) rondas de inmunización con el ectodominio de IL-6R.

La FIG. 10B muestra concentraciones específicas del isotipo IgG específicas anti-IL-6R a partir de siete ratones VELOCIMMUNE® (VI) y cinco ratones de tipo natural (WT) .

La FIG. 11A muestra la afinidad de distribución de anticuerpos monoclonales del receptor anti- interleucina 6 generados en ratones VELOCIMMUNE®.

La FIG. 11B muestra el bloqueo específico de antígeno de anticuerpos monoclonales del receptor anti-interleucina 6 generados en ratones VELOCIMMUNE® (VI) y ratones de tipo natural (WT) .

La FIG. 12 muestra una ilustración esquemática, que no está a escala, de genes de ratón ADAM6a y ADAM6b en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Un vector de direccionamiento (Vector de direccionamiento n\ADAM6) usado para inserción de ADAM6a y ADAM6b de ratón en un locus de cadena pesada endógeno humanizado se muestra con un cásete de selección (HYG: higromicina) flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio (Frt) incluyendo sitios de restricción preparados por ingeniería en los extremos 5' y 3 ' .

La FIG. 13 muestra una ilustración esquemática, que no está a escala, de un pseudogen ADAM6 humano (?????ß?) localizado entre segmentos génicos variables de cadena pesada humana 1-2 (VHl-2) y 6-1 (VH6-1) . Un vector de direccionamiento para recombinación homologa bacteriana (Vector de direccionamiento ???? ß?) para eliminar un pseudogen ADAM6 humano e inserta sitios de restricción únicos en un locus de cadena pesada humana se muestra con un cásete de selección (NEO: neomicina) flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio (loxP) incluyendo sitios de restricción preparados por ingeniería en los extremos 51 y 3'. Una ilustración, que no está a escala, del locus de cadena pesada humanizado direccionado resultante que contiene un fragmento genómico que codifica para los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón incluyendo un cásete de selección flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio se muestra.

La FIG. 14A muestra gráficas de contorno FACS de linfocitos abiertos en singletes para expresión en superficie de IgM y B220 en la médula ósea para ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera humana y pesada humana (?+,+ +/+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+ +) . El porcentaje de células inmaduras (B220intlgM+) y maduras (B220altolgM+) B se señala en cada gráfica de contorno.

La FIG. 14B muestra el número total de células B inmaduras (B220intlgM+) y maduras (B220altolgM+) en la médula ósea aislada de fémures de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera humana y pesada humana (?+/+?+ +) y ratones homocigóticos para loci de gen variable de cadena ligera ? humana y pesada humana que tiene un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+) .

La FIG. 15A muestra gráficas de contorno FACS de células B abiertas CD19+ para expresión en superficie de kit c y CD43 en la médula ósea para ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humana y pesada humana (?+/+?+ +) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+ +) . El porcentaje de células pro-B (CD19+CD43+kitc+) y pre-B (CD19+CD43"kitc") se notan en los cuadrantes superior derecho e inferior izquierdo, respectivamente, de cada gráfica de contorno.

La FIG.15B muestra el número total de células pro-B (CD19+CD43+kitc+) y células pre-B (CD19+CD43~kitc~) en la médula ósea aislada de fémures de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humana y pesada humana (?+/+?+/+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resK+/+) .

La FIG.16A muestra gráficas de contorno FACS de linfocitos abiertos en singletes para expresión en superficie de CD19 y CD43 en la médula ósea para ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humana y pesada humana (?+^+ +,+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humana y pesada humana que tiene un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+ +A6res + +) . Porcentaje de células B inmaduras (CD19+CD43) , pre-B (CD19+CD43int) y pro-B (CD19+CD43+) se señala en cada gráfica de contorno.

La FIG. 16B muestra histogramas de células B inmaduras (CD19+CD43~) y pre-B (CD19+CD43int) en la médula ósea de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+/+?+^+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tiene un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6reK+/+) .

La FIG.17A muestra gráficas de contorno FACS de linfocitos abiertos en singletes para expresión en superficie de CD19 y CD3 en esplenocitos por ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+/+?+/+) , y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resk+ +) . El porcentaje de células B (CD19+CD3") y T (CD19"CD3+) se nota en cada gráfica de contorno .

La FIG.17B muestra gráficas de contorno FACS para células B abiertas CD19+ para expresión en superficie de cadena ligera IgA e Igk en el bazo de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+,+?+/+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADA 6 de ratón (H+ +A6resk+/+) . El porcentaje de células B IgA* (cuadrante izquierdo superior) e Igk+ (cuadrante derecho inferior) se nota en cada gráfica de contorno.

La FIG.17C muestra el número total de células B CD19+ en el bazo de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+/+ +/+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resk+ +) .

La FIG.18A muestra gráficas de contorno FACS de células B abiertas CD19+ para expresión en superficie de IgD y IgM en el bazo de ratones homocigóticos para loci de gen variable de cadena ligera k humana y pesada humana (H+,+k+/+) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6rek+ +) . El porcentaje de células B maduras (CD19+IgDhighIgMint) se nota para cada gráfica de contorno. La flecha en la gráfica de contorno derecha ilustra el proceso de maduración para células B con relación a la expresión en superficie IgM e IgD.

La FIG.18B muestra el número total de células B en el bazo de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+ +?+ +) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+/+A6resk+ +) durante la maduración de CD19+Ig highIgDint a CD19+IgMinIgDhÍ9h .

La FIG.19 muestra la concentración de anticuerpos para primero y segundo sangrados de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (H+,/+k+/+; n=5) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+ +A6resK+ + ; n=5) que se inmunizaron con un receptor de superficie de célula humano (Antígeno A) .

La FIG. 20 muestra la concentración de anticuerpos para primero y segundo sangrados de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+/'+?+'+; n=5) y ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADA 6 de ratón (H+/+A6resk+ + ; n=10) que se inmunizaron con un anticuerpo humano específico para un receptor humano de tirosina-proteína cinasa (Antígeno B) .

La FIG. 21 muestra la concentración de anticuerpos para primero y segundo sangrados de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana (?+ +?+ +; n=12) y ratones homocigóticos para loci de gen variable de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+ +A6resk+/+ ; n=12) que se inmunizaron con la proteína humana secretada que funciona en la regulación de la trayectoria de señalización TGF-ß (Antígeno C) .

La FIG. 22 muestra la concentración de anticuerpos para primero y segundo sangrados de ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera k humana y pesada humana que tienen un fragmento genómico de ratón ectópico que codifica genes ADAM6 de ratón (H+ +A6rek+/+ ; n=i2) que se inmunizaron con una tirosina cinasa del receptor humano (Antígeno D) .

Descripción Detallada de la Invención Esta invención no se limita a métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos y frases usadas en este documento incluyen los significados que los términos y frases han alcanzado en la materia, a menos que se indique lo contrario claramente o sea claramente evidente por el contexto en donde se utiliza el término o frase. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales particulares. Todas las publicaciones mencionadas se incorporan aquí para referencia .

La frase "sustancial" o "sustancialmente" cuando se utiliza para referirse a una cantidad de segmentos génicos (por ejemplo, "prácticamente todos" los segmentos génicos V) incluye dos segmentos funcionales y no funcionales del gen e incluyen, en diversas modalidades, por ejemplo, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más de todos los segmentos génicos; en diversas modalidades, "sustancialmente todos" los segmentos génicos incluye, por ejemplo, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de segmentos génicos funcionales (es decir, no pseudogen) .

El término "sustitución" incluye en donde una secuencia de ADN se coloca en un genoma de una célula de tal manera como para sustituir una secuencia dentro del genoma con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia humana en un ratón), en el locus de la secuencia genómica. La secuencia de ADN es colocada de tal manera que puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte del ADN de origen utilizado para obtener la secuencia a ser colocada de tal manera (por ejemplo, promotores, potenciadores , regiones 5'-o 31 -no traducida, secuencias señal de recombinación apropiadas, etc) . Por ejemplo, en diversas modalidades, la sustitución es una sustitución de una secuencia endógena para una secuencia heteróloga que se traduce en la producción de un producto génico de la secuencia de ADN a ser colocada de tal manera (que comprende la secuencia heteróloga) , pero no la expresión de la secuencia endógena; la sustitución es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una función similar a una proteína codificada por la secuencia genómica endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un gen o dominio de inmunoglobulina, y el fragmento de ADN que codifica uno o más genes o dominios de inmunoglobulina humana) . En diversas modalidades, un gen endógeno o fragmento del mismo se sustituye con un gen humano correspondiente o fragmento del mismo. Un gen humano o fragmento correspondiente del mismo es un gen humano o fragmento que es un ortólogo de, un homólogo de, o es sustancialmente idéntico o en la misma estructura y/o función, como el gen endógeno o fragmento del mismo que se sustituye.

El ratón como modelo genético se ha mejorado en gran medida por las tecnologías de transgénicos y de inactivación, que han permitido el estudio de los efectos de la sobreexpresión o supresión de genes específicos dirigidos. A pesar de todas sus ventajas, el ratón todavía presenta obstáculos genéticos que lo hacen un modelo imperfecto para enfermedades humanas y una plataforma imperfecta para probar terapias humanas o hacerlos. En primer lugar, aunque alrededor del 99% de los genes humanos tienen un homólogo de ratón (Waterston et al. 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genoma, Nature 420:520-562) , los terapéuticos potenciales no suelen reaccionar de forma cruzada o reaccionan de forma cruzada inadecuadamente, con ortólogos de ratón de los objetivos humanos previstos. Para obviar este problema, los genes objetivo seleccionados pueden ser "humanizados", es decir, el gen de ratón puede ser eliminado y sustituido por la secuencia génica ortóloga humana correspondiente (por ejemplo, US 6,586,251, US 6,.596, 541 y US 7,105,348, incorporadas aquí como referencia) . Inicialmente , los esfuerzos para humanizar los genes del ratón por una "estrategia de humanización gen inactivado más transgénico" implicaba cruzar un ratón que porta una supresión (es decir, inactivación) del gen endógeno con un ratón que lleva un transgén humano integrado aleatoriamente (véase, por ejemplo, Bril et al., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine raodels of classic and intermedíate maple syrup uriñe disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al . , 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88 (3 ): 309-15 ; Pan et al . , 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTC ) funetion : human CD3delta/epsilon heterodimer restores the detective preTCR functi'on in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43: 1741 -1750). Pero esos esfuerzos se vieron obstaculizados por limitaciones de tamaño, las tecnologías gen inactivado convencionales no fueron suficientes para reemplazar directamente grandes genes de ratón con sus contrapartes genómicas humanas grandes . Un enfoque directo de reemplazo directo homólogo, en donde un gen endógeno de ratón se sustituye directamente por el gen homólogo humano en la misma localización genética precisa del gen del ratón (es decir, en el locus endógeno del ratón) , rara vez se intenta debido a las dificultades técnicas. Hasta ahora, los esfuerzos de reemplazo directo involucran procedimientos elaborados y costosos, lo que limita la longitud de material genético que puede ser manejado y la precisión con la que podía ser manipulado.

Introducir exógenamente transgenes de inmunoglobulina humana se reordena en las células precursoras B en ratones (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Este hallazgo fue explotado por los ratones producidos por ingeniería utilizando el enfoque gen inactivado más transgénico para expresar anticuerpos humanos (Green et al., 1994, Antigen- specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg ef al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications , Nature 368:856-859; Jakobovits ef al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first anticuerpo completamente humano product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Los loci de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina de ratón fueron inactivados en estos ratones por supresión dirigida de porciones pequeñas pero críticas de cada locus endógeno, seguido por la introducción de loci de genes de inmunoglobulina humana como transgenes grandes integrados al azar, como se describió anteriormente, o minicromosomas (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727) . Tales ratones representan un avance importante en la ingeniería genética; anticuerpos monoclonales totalmente humanos aislados de ellos produjeron un potencial prometedor terapéutico para tratar una variedad de enfermedades humanas (Gibson et al., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cáncer, Clin Colorectal Cáncer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4 ) : t o Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109 (11) : 4655-62 ; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animáis, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Pero, como se discutió anteriormente, estos ratones muestran desarrollo de las células B comprometido y deficiencias inmunitarias , en comparación con ratones de tipo natural. Estos problemas limitan potencialmente la capacidad de los ratones para soportar una respuesta humoral vigorosa y, en consecuencia, generar anticuerpos totalmente humanos contra algunos antígenos. Las deficiencias pueden ser debido a: (1) la funcionalidad ineficiente debido a la introducción aleatoria de los transgenes de inmunoglobulina humana y la expresión resultante incorrecta debido a la falta de elementos de control cadena arriba y cadena abajo (Garrett et al, 2005, Chromatin architecture near a potential 31 end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:151 1-1525; Manis et al . , 2003, Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory región, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5 ' flanking región of the mouse IgH locus defined by pro-B cell -specific hypersensitivity associated with binding of PU.l, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851); (2) interacciones interespecies ineficientes entre los dominios constantes humanos y componentes del ratón del complejo de señalización del receptor de las células B en la superficie celular, que puede afectar a los procesos de señalización necesarios para la maduración normal, la proliferación y la supervivencia de las células B (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B- cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762); y (3) interacciones interespecies ineficientes entre i munoglobulinas humanas solubles y los receptores de Fe de ratón que podrían reducir la selección por afinidad (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fe receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) y concentraciones en suero de inmunoglobulina (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2 -microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64: 177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Estas deficiencias pueden ser corregidas por la humanización in situ de sólo las regiones variables de los loci de inmunoglobulina de ratón dentro de sus lugares naturales en los loci de cadena pesada y ligera endógenos. Esto daría como resultado efectivamente en ratones que hacen anticuerpos "quiméricos inversos" (es decir, V humano : C de ratón) que serían capaces de interacciones y la selección con el medio ambiente del ratón sobre la base de retención de las regiones constantes de ratón normales. Además, tales anticuerpos quiméricos inversos pueden ser fácilmente reformateadoa en anticuerpos totalmente humanos con fines terapéuticos.

Los animales modificados genéticamente que comprenden una sustitución en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con secuencias de inmunoglobulina heterólogas (por ejemplo, de otra especie) se pueden realizar en conjunción con sustituciones en loci endógenos de inmunoglobulina de cadena ligera o en conjunción con transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina quiméricos o totalmente de ratón totalmente humano, etc.) . Las especies de las que se derivan las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogas pueden variar ampliamente; como con secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina empleadas en sustituciones de secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina o transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina .

Las secuencias de ácido nucleico de región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, segmentos V, D, y/o J, se encuentran en diversas modalidades obtenidas a partir de un ser humano o un animal no humano. Los animales no humanos adecuados para proporcionar segmentos V, D, y/o J incluyen, por ejemplo, peces óseos, peces cartilaginosos como los tiburones y las rayas, anfibios, reptiles, mamíferos, aves (por ejemplo, pollos) . Los animales no humanos incluyen, por ejemplo, mamíferos. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, primates no humanos, cabras, ovejas, cerdos, perros, bovinos (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervos, camellos, hurones y roedores y primates no humanos (por ejemplo, los chimpancés, orangutanes, gorilas, titís, monos rhesus babuinos) . Los animales no humanos adecuados se seleccionan de' la familia de los roedores incluyendo ratas, ratones y hámsteres. En una modalidad, los animales no humanos son ratones. Como es claro por el contexto, diversos animales no humanos pueden ser utilizados como fuentes de dominios variables o segmentos génicos de región variable (por ejemplo, tiburones, rayas, mamíferos (por ejemplo, camellos, roedores tales como ratones y ratas) .

De acuerdo con el contexto, los animales no humanos también se utilizan como fuentes de secuencias de región constante para ser utilizados en relación con secuencias o segmentos variables, por ejemplo, secuencias constantes de roedor pueden ser usadas en los transgenes operativamente ligados a secuencias variables humanas o no humanas (por ejemplo, secuencias variables de primates humanos o no humanos ligados operativamente a, por ejemplo, roedores, por ejemplo, secuencias constantes de ratón o de rata o hámster) . Por lo tanto, en diversas modalidades, los segmentos V, D, y/o J humanos se unen operativamente a las secuencias génicas de región constante de roedor (por ejemplo, ratón o rata o hámster) . En algunas modalidades, los segmentos V, D, y/o J (o uno o más genes VDJ o VJ reconfigurados) humanos se unen operativamente o son fusionados a una secuencia génica de la región constante de ratón, rata, o hámster en, por ejemplo, un transgén integrado en un locus que no es un locus de la inmunoglobulina endógeno.

En una modalidad específica, se proporciona un ratón que comprende una sustitución de los segmentos VH, DH, y JH en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena con uno o más de los segmentos VH, DH, y JH humano, en donde el uno o más segmentos VH, DH, y JE humanos se unen operativamente a un gen de cadena pesada de inmunoglobulina endógena; en donde el ratón comprende un transgén en un locus distinto de un locus de inmunoglobulina endógena, en donde el transgén comprende un segmento VL humano y JL humano no reconfigurado o reconfigurado ligado operativamente a una región constante de ratón o rata o humana .

Se describe un método para un reemplazo genético in situ grande de los loci de genes variables de inmunoglobulina de línea germinal de ratón con loci de genes variables de inmunoglobulina de línea germinal humanos manteniendo al mismo tiempo la capacidad de los ratones para generar progenie. Específicamente, se describe la sustitución precisa de seis megabases de tanto los loci de gen variable de inmunoglobulina de cadena ligera ? y cadena pesada de ratón con sus homólogos humanos, dejando las regiones constantes de ratón intacto. Como resultado, los ratones se han creado que tiene un reemplazo preciso de su repertorio variable de inmunoglobulina de línea germinal completo con equivalentes de secuencias variables de línea germinal de inmunoglobulina humana, manteniendo al mismo tiempo las regiones constantes de ratón. Las regiones variables humanas están ligadas a regiones constantes de ratón para formar loci de inmunoglobulina humano-ratón quiméricos que reconfiguran y expresan a niveles fisiológicamente apropiados. Los anticuerpos expresados son "quimeras inversas", es decir, que comprenden secuencias de la región variable humana y secuencias de región constante de ratón. Estos ratones que tienen regiones variables de inmunoglobulinas humanizadas que expresan anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón son llamados ratones VELCOIMMUNE®.

Los ratones humani ¦zados VELCOIMMU E® presentan un sistema inmunitario humoral completamente funcional que es esencialmente indistinguible del de los ratones de tipo natural. Estos muestran poblaciones de células normales en todas las etapas de desarrollo de las células B. Estos exhiben morfología de órgano linfoide normal. Las secuencias ® de anticuerpos de ratones VELCOIMMUNE exhiben reordenamiento V(D)J normal y frecuencias de hipermutación somática normales. Las poblaciones de anticuerpos en estos ratones reflejan distribuciones del isotipo que se derivan de la clase de conmutación normal (por ejemplo, conmutación cis de isotipo normal) . Los ratones VELCOIMMUNE inmunizados resultan en respuestas inmunitarias humorales robustas que generan una gran diversidad de repertorios de anticuerpos, que tienen dominios variables de inmunoglobulina humanos adecuados para su uso como candidatos terapéuticos. Esta plataforma proporciona una fuente abundante de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana madurada por afinidad naturalmente para la fabricación de anticuerpos farmacéuticamente aceptables y otras proteínas de unión a antígeno .

Se trata de la sustitución precisa de secuencias variables de inmunoglobulina de ratón con secuencias variables de la inmunoglobulina humana que permita para la elaboración de ratones Veloclmmune® . Sin embargo, incluso la sustitución precisa de secuencias de inmunoglobulina de ratón endógenos en los loci de cadena pesada y ligera con secuencias equivalentes de inmunoglobulina humana, por la recombinación secuencial de tramos muy grande de secuencias de inmunoglobulina humana, puede presentar ciertos desafíos debido a la evolución divergente de los loci de inmunoglobulina entre el ratón y el hombre . Por ejemplo, las secuencias intergénicas intercaladas dentro de los loci de inmunoglobulina no son idénticas entre los ratones y los humanos y, en algunas circunstancias, pueden no ser funcionalmente equivalentes. Las diferencias entre los ratones y los humanos en sus loci de inmunoglobulina todavía pueden dar lugar a anormalidades en ratones humanizados, en particular cuando se hace la humanización o la manipulación de ciertas porciones de los loci endógenos de inmunoglobulina de ratón de cadena pesada. Algunas modificaciones en los loci de inmunoglobulina de ratón de cadena pesada son perjudiciales. Las modificaciones perjudiciales pueden incluir, por ejemplo, pérdida de la capacidad de los ratones modificados para aparearse y producir progenie.

Una sustitución in situ precisa, a gran escala, de seis megabases de las regiones variables de los loci de inmunoglobulina de cadena ligera y pesadadel ratón (VH-DH-JH y VK-JK) con las correspondientes secuencias genómicas humanas de 1.4 megabases se realizó, mientras se dejaban las secuencias flanqueantes del ratón intactas y funcionales dentro de los loci híbridos, incluyendo todos los genes de las cadenas constantes de ratón y las regiones de control transcripcional del locus (Figura 1A y la figura IB) . En concreto, las secuencias génicas VH, DH, JR, Vk y JK humanas se introdujeron a través de la inserción gradual de 13 vectores quiméricos dirigidos BAC que llevan superposición de fragmentos de los loci variables de la línea germinal humana en células madre embrionarias de ratón utilizando la tecnología de la ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A.

No. 6,586,251 y Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).

La humanización de los genes de la inmunoglobulina de ratón representa la mayor modificación genética para el genoma del ratón hasta la fecha. Si bien los esfuerzos anteriores con transgenes de inmunoglobulina humanos integrados al azar se han encontrado con algún éxito (discutido anteriormente) , la sustitución directa de los genes de la inmunoglobulina de ratón con sus contrapartes humanas aumenta dramáticamente la eficiencia con la que los anticuerpos totalmente humanos se pueden generar de manera eficiente en ratones por lo demás normales. Además, estos ratones muestran una diversidad aumentada dramáticamente de anticuerpos completamente humanos que se pueden obtener después de la inmunización con virtualmente cualquier antígeno, en comparación con ratones portadores de los loci endógenos discapacitados y transgenes de anticuerpos totalmente humanos. Múltiples versiones de loci humanizados sustituidos, presentan niveles completamente normales de células B maduras e inmaduras, en contraste con los ratones con transgenes humanos integrados al azar, que exhiben las poblaciones de células B significativamente reducidas a las diversas etapas de la diferenciación. Mientras que los esfuerzos para aumentar el número de segmentos génicos humanos en ratones transgénicos humanos han reducido tales defectos, los repertorios ampliados de inmunoglobulina no han corregido por completo la reducción de las poblaciones de células B en comparación con los ratones de tipo natural.

A pesar de la función inmune humoral cercana a la de tipo natural observada en ratones con loci de inmunoglobulina sustituidos (es decir, ratones VELOCIMMUNE®) , hay otros problemas encontrados cuando se emplea un reemplazo directo de la inmunog1obulina que no se encontró en algunos enfoques que emplean los transgenes integrados al azar. Las diferencias en la composición genética de los loci de inmunog1obulina entre ratones y humanos ha dado lugar al descubrimiento de secuencias beneficiosas para la propagación de ratones con segmentos génicos reemplazados de inmunog1obulina . Específicamente, los genes ADAM del ratón situados dentro del locus de inmunog1obulina endógena se presentan de manera óptima en ratones con loci de inmunog1obulina sustituidas, debido a su papel en la fertilidad.

Ubicación Genómica y función de ADAM6 de ratón Los ratones macho que carecen de la capacidad de expresar cualquier proteína funcional ADA 6 sorprendentemente exhiben un defecto en la capacidad de los ratones para aparearse y para generar descendencia. Los ratones carecen de la capacidad para expresar una proteína funcional ADAM6 en virtud de una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos de región variable de inmunog1obulina de ratón con segmentos génicos de región variable humana. La pérdida de la función ADAM6 resulta debido a que el locus ADAM6 se encuentra dentro de una región de la locus del gen endógeno de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, próxima al extremo 3 'del locus del segmento génico VH que está cadena arriba de los segmentos génicos DH. Con el fin de criar ratones que son homocigóticos para una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos variables de cadena pesada endógenos de ratón con segmentos génicos variables de cadena pesada humana, por lo general es un enfoque engorroso determinar los machos y hembras que son cada uno homocigóticos para la sustitución y esperar un apareamiento productivo. Las carnadas de éxito son bajas en frecuencia y tamaño. En su lugar, los machos heterocigotos para la sustitución se han empleado para aparearse con las hembras homocigóticas para la sustitución para generar progenie que sean heterocigotos para la sustitución, y a continuación, criar a partir de ello un ratón homocigótico . Los inventores han determinado que la causa probable de la pérdida de la fertilidad en los ratones machos es la ausencia en ratones machos homocigóticos de una proteína funcional ADAM6.

En varios aspectos, los ratones machos que comprenden un gen ADAM6 dañado (es decir, no funcional o funcional marginalmente) exhiben una reducción o eliminación de la fertilidad. Debido a que en los ratones (y otros roedores) el gen ADAM6 está localizado en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina, los inventores han determinado que a fin de propagar ratones, o crear y mantener una cepa de ratones, que comprenden un locus de cadena pesada de inmunoglobulina sustituido, se emplean diversos esquemas de cría o reproducción modificados. La baja fertilidad, o la infertilidad, de ratones machos homocigóticos para una sustitución del locus del gen variable de cadena pesada de la inmunoglobulina endógena hace difícil el mantenimiento de una modificación tal en una cepa de ratón. En diversas modalidades, el mantenimiento de la cepa comprende evitar problemas de infertilidad exhibidas por ratones machos homocigóticos para la sustitución.

En un aspecto, se proporciona un método para el mantenimiento de una cepa de ratón tal como se describe en este documento. La cepa de ratón no necesita comprender una secuencia ectópica ADAM6, y en diversas modalidades la cepa de ratón es homocigótica o heterocigótica para un gen inactivado (por ejemplo, un gen inactivado funcional) de ADAM6.

La cepa de ratón comprende una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno que resulta en una reducción o pérdida de la fertilidad en un ratón macho. En una modalidad, la modificación comprende una supresión de una región reguladora y/o una región de codificación de un gen ADAM6. En una modalidad específica, la modificación comprende una modificación de un gen endógeno ADAM6 (regulador y/o región de codificación) que reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que comprende la modificación, en una modalidad específica, la modificación reduce o elimina la fertilidad de un ratón macho que es homocigótico para. la modificación.

En una modalidad, la cepa de ratón es homocigótica o heterocigótica para un gen inactivado (por ejemplo, un gen inactivado funcional) o una supresión de un gen ADAM6.

En una modalidad, la cepa de ratón se mantiene mediante el aislamiento de un ratón que es homocigótico o heterocigótico para la modificación de una célula, y el empleo de la célula donante en el embrión hospedero, y la gestación del embrión hospedero y célula donante en una madre sustituta, y la obtención de la madre sustituta de una progenie que comprende la modificación genética. En una modalidad, la célula donante es una célula ES. En una modalidad, la célula donante es una célula pluripotente , por ejemplo, una célula pluripotente inducida.

En una modalidad, la cepa de ratón se mantiene mediante el aislamiento de un ratón que es homocigótico o heterocigótico para la modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende la modificación, y la introducción de la secuencia de ácido nucleico en un núcleo hospedero, y gestación de una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico y el núcleo hospedero en un animal adecuado. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico se introduce en un embrión de oocitos hospedero.

En una modalidad, la cepa de ratón se mantiene mediante el aislamiento de un ratón que es homocigótico o heterocigótico para la modificación de un núcleo, y la introducción del núcleo en una célula hospedera, y gestación del núcleo y de la célula hospedera en un animal adecuado para obtener una progenie que es homocigótica o heterocigótica para la modificación.

En una modalidad, la cepa de ratón se mantiene mediante el empleo de la fertilización in vifcro (IVF, por sus siglas en inglés) de un ratón hembra (de tipo natural, homocigótico para la modificación, o heterocigótico para la modificación) con el empleo de un esperma de un ratón macho que comprende la modificación genética. En una modalidad, el ratón macho es heterocigótico para la modificación genética. En una modalidad, el ratón macho es homocigótico para la modificación genética.

En una modalidad, la cepa de ratón se mantiene por la cría de un ratón macho que es heterocigótico para la modificación genética con un ratón hembra para obtener progenie que comprende la modificación genética, la identificación de un macho y una progenie femenina que comprende la modificación genética, y el empleo de un macho que es heterocigótico para la modificación genética en una cría con una hembra que es de tipo natural, homocigótica, o heterocigótica para la modificación genética para obtener progenie que comprende la modificación genética. En una modalidad, la etapa de la cría de un macho heterocigótico para la modificación genética con una hembra de tipo natural, una hembra heterocigótica para la modificación genética, o una hembra homocigótica para la modificación genética se repite con el fin de mantener la modificación genética en la cepa de ratón.

En un aspecto, se proporciona un método para el mantenimiento de una cepa de ratón que comprende una sustitución de un locus endógeno de gen variable de cadena pesada variable de inmunoglobulina con una o más secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que comprende la cría de la cepa de ratón con el fin de generar ratones machos heterocigóticos , en donde los ratones machos heterocigóticos son criados para mantener la modificación genética en la cepa. En una modalidad específica, la cepa no es mantenida por todo tipo de reproducción de un macho homocigótico con una hembra de tipo natural, o una hembra homocigótica o heterocigótica para la modificación genética.

La proteína ADAM6 es un miembro de la familia ADAM de las proteínas, que ADAM es un acrónimo (por sus siglas en inglés) de Una Desintegrina Y Metaloproteasa. La familia ADAM de proteínas es amplia y diversa, con diversas funciones, incluyendo la adhesión celular. Algunos miembros de la familia ADAM están implicados en la espermatogénesis y la fertilización. Por ejemplo, ADAM2 codifica una subunidad de la proteína de fertilina, que está implicada en las interacciones espermatozoide-huevo. La ADAM3 o ciritestina, resulta necesaria para la unión del esperma a la zona pelúcida. La ausencia de cualquiera de ADAM2 o ADAM3 provoca infertilidad. Se ha postulado que ADAM2 , ADAM3 , y ADAM6 forman un complejo en la superficie de las células de esperma del ratón. El gen humano ADAM6 , que normalmente se encuentra entre los segmentos génicos de VH humana VHl-2 y VH6-1, parece ser un pseudogen (Figura 12) . En los ratones, hay dos genes ADAM6 -ADAM6a y ADAM6b- que se encuentran en una región intergénica entre los segmentos génicos DH y VH de ratón, y en el ratón los genes ADAM6a y ADAM6b están orientados en la orientación transcripcional opuesta a la de los segmentos génicos de inmunoglobulina circundantes (figura 12) . En ratones, un locus funcional ADAM6 es aparentemente necesario para la fertilización normal. A locus o secuencia ADAM6 funcional, a continuación, se refiere a un locus o secuencia ADAM6 que puede complementar o rescatar, la fertilización drásticamente reducida exhibida en ratones machos con falta de o con loci no funcionales endógenos ADAM6.

La posición de la secuencia . intergénica en ratones que codifica ADAM6a y ADAM6b hace que la secuencia intergénica sea susceptible de modificación al modificar una cadena pesada de ratón endógena. Cuando los segmentos génicos VH son eliminados o sustituidos, o cuando los segmentos génicos DH son eliminados o sustituidos, hay una alta probabilidad de que un ratón resultante exhibirá una deficiencia grave en la fertilidad. Con el fin de compensar la deficiencia, el ratón se modifica para incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que va a complementar la pérdida en actividad ADAM6 debido a una modificación del locus ADAM6 de ratón endógeno. En diversas modalidades, la secuencia de nucleótidos complementaria es una que codifica un ADAM6a de ratón, un ADAM6b de ratón, o un homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo que rescata la deficiencia de la fertilidad.

La secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se puede colocar en cualquier posición adecuada. Se puede colocar en la región intergénica, o en cualquier posición adecuada en el genoma (es decir, ectópicamente) . En una modalidad, la secuencia de nucleótidos puede ser introducida en un transgén que se integra al azar en el genoma del ratón. En una modalidad, la secuencia puede ser mantenida episomalmente , es decir, en un ácido nucleico separado en lugar de en un cromosoma del ratón. Posiciones adecuadas incluyen posiciones que son transcripcionalmente permisivas o activas, por ejemplo, un locus ROSA26 (Zambro icz et al, 1997, PNAS U.S.A. 94:3789-3794), un locus de BT-5 (Michael et al, 1999, Meen. Dev. 85:35-47), o un locus de Oct4 ( allace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). El direccionamiento de las secuencias de nucleótidos a loci transcripcionalmente activos se describe, por ejemplo, en la patente US 7,473,557, incorporada aquí como referencia.

Alternativamente, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se puede acoplar con un promotor inducible a fin de facilitar la expresión óptima en las células apropiadas y/o tejidos, por ejemplo, los tejidos reproductivos . Ej emplos de promotores inducibles incluyen los promotores activados por medios físicos (por ejemplo, el promotor de choque térmico) y/o medios químicos (por ejemplo, IPTG o tetraciclina) .

Además, la expresión de la secuencia de nucleótidos puede estar ligada a otros genes con el fin de lograr la expresión en etapas específicas de desarrollo o dentro de los tejidos específicos. Tal expresión se puede lograr mediante la colocación de la secuencia de nucleótidos en ligación operativa con el promotor, de un gen expresado en una etapa específica del desarrollo. Por ejemplo, las secuencias de inmunoglobulina de una especie preparada por ingeniería en el genoma de una especie hospedera se colocan en ligación operativa con una secuencia promotora de un gen CD19 (un gen específico de células B) de las especies hospederas. Se consigue la expresión específica de células B en las etapas de desarrollo precisas cuando se expresan inmunoglobulinas .

Sin embargo, otro método para lograr la expresión robusta de una secuencia de nucleótidos insertada es emplear un promotor constitutivo. Promotores constitutivos ejemplares incluyen SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK y CAGG . En una manera similar, la secuencia de nucleótidos deseada se coloca en ligación operativa con un promotor constitutivo seleccionado, que ofrece un alto nivel de expresión de la proteína (s) codificada por la secuencia de nucleótidos.

El término "ectópico" se pretende que incluya un desplazamiento, o una colocación en una posición que no se encuentra normalmente en la naturaleza (por ejemplo, la colocación de una secuencia de ácido nucleico en una posición que no es la misma posición que la secuencia del ácido nucleico que se encuentra en un ratón de tipo natural) . El término, en diversas modalidades, se utiliza en el sentido de su objeto de estar fuera de su posición normal, o posición adecuada. Por ejemplo, la frase "una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica..." se refiere a una secuencia de nucleótidos que aparece en una posición en la que no se encuentra normalmente en el ratón. Por ejemplo, en el caso de una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína ratón ADAM6 (o un ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que proporciona igual o similar beneficio de fertilidad en ratones macho) , la secuencia se puede colocar en una posición diferente en el genoma de ratón a la que se encuentra normalmente en un ratón de tipo natural. En tales casos, las uniones de secuencia novedosas de secuencia de ratón se crearán mediante la colocación de la secuencia en una posición diferente en el genoma del ratón a la de un ratón de tipo natural. Un homólogo funcional u ortólogo ADAM6 de ratón es una secuencia que confiere un rescate de la pérdida de la fertilidad (por ejemplo, pérdida de la capacidad de un ratón macho para generar descendencia en el apareamiento) que se observa en un ratón ????ß'^' . Homólogos u ortólogos funcionales incluyen proteínas que tienen al menos alrededor de 89% de identidad o más, por ejemplo, hasta un 99% de identidad, con la secuencia de aminoácidos de ADA 6a y/o a la secuencia de aminoácidos de ADAM6b, y que puede complementar, o rescatar la capacidad de aparearse con éxito, de un ratón que tiene un genotipo que incluye una supresión o gen inactivado de ADAM6a y/o ADA 6b.

La posición ectópica puede estar en cualquier lugar (por ejemplo, como con la inserción aleatoria de un transgén que contiene una secuencia ADAM6 de ratón) , o puede estar, por ejemplo, en una posición que se aproxima a (pero no es precisamente la mismo que) su ubicación en una ratón de tipo natural (por ejemplo, en un locus de inmunoglobulina de ratón endógeno modificado, pero ya sea cadena arriba o cadena abajo de su posición natural, por ejemplo, dentro de un locus de inmunoglobulina modificada sino entre diferentes segmentos génicos, o en una posición diferente en una secuencia intergénica de ratón V-D) . Un ejemplo de una colocación ectópica es la colocación dentro de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un ratón que comprende una sustitución de uno o más segmentos génicos endógenos VH con segmentos génicos VH humanos, en donde la sustitución elimina una secuencia endógena ADAM6 , puede ser diseñado para tener una secuencia ADAM6 de ratón situada dentro de una secuencia que contiene los segmentos génicos VH humanos. La modificación resultante generaría una secuencia (ectópica) ADAM6 de ratón dentro de una secuencia génica humana, y la colocación (ectópica) de la secuencia ADAM6 de ratón dentro de la secuencia génica humana puede aproximarse a la posición del pseudogen ADA 6 humano {es decir, entre dos segmentos V) o puede aproximarse a la posición de la secuencia ADAM6 de ratón (es decir, dentro de la región intergénica V-D) . Las uniones de secuencia resultantes creadas por la unión de una secuencia (ectópica) ADAM6 del ratón dentro de o adyacente a una secuencia génica humana (por ejemplo, una secuencia génica de inmunoglobulina) dentro de la línea germinal del ratón serían novedosa, en comparación con igual o similar posición en el genoma de un ratón de tipo natural.

En diversas modalidades, se proporcionan animales no humanos que carecen de un ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo, en donde la falta hace que el animal no humano estéril, o reduce sustancialmente la fertilidad del animal no humano. En diversas modalidades, la falta de ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma se debe a una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. Una reducción sustancial en la fertilidad es, por ejemplo, una reducción en la fertilidad (por ejemplo, frecuencia de la reproducción, crías por carnada, carnadas por año, etc) de alrededor de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% o más. En diversas modalidades, los animales no humanos se complementan con un gen ADAM6 de ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo que es funcional en un macho del animal no humano, en donde el gen complementado ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo rescata la reducción de la fertilidad en su totalidad o en parte sustancial. Un rescate de la fertilidad en parte sustancial es, por ejemplo, una restauración de la fertilidad tal que el animal no humano exhibe una fertilidad que es al menos 70%, 80%, o 90% o más en comparación con un locus de cadena pesada no modificada (es decir, un animal sin una modificación en el gen ADAM6 u ortólogo u homólogo del mismo) .

La secuencia que confiere al animal modificado genéticamente (es decir, el animal que carece de un ADAM6 funcional u ortólogo de la misma o homólogo, debido a, por ejemplo, una modificación de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina) es, en diversas modalidades, seleccionado a partir de un gen ADAM6 u ortólogo u homólogo de los mismos. Por ejemplo, en un ratón, la pérdida de función de ADAM6 es rescatada mediante la adición de, en una modalidad, un gen ADAM6 de ratón. En una modalidad, la pérdida de función de ADAM6 en el ratón es rescatada mediante la adición de un ortólogo u homólogo de una especie estrechamente relacionada con respecto a la del ratón, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón de una cepa o especie diferente, una rata de cualquier especie, un roedor, en donde la adición del ortólogo u homólogo para el ratón rescata la pérdida de la fertilidad debido a la pérdida de función ADAM6 o la pérdida de un gen ADAM6. Los ortólogos y homólogos de otras especies, en diversas modalidades, se seleccionan de una especie filogenéticamente relacionada y, en diversas modalidades, presentan un porcentaje de identidad con la ADAM6 endógena (u ortólogo) que es alrededor del 80% o más, 85% o más, 90 % o más, 95% o más, 96% o más, o 97% o más, y que la pérdida relacionada al ADA 6 de rescate o (en uno que no es de ratón) la pérdida relacionada de la fertilidad con el ortólogo ADAM6. Por ejemplo, en una rata macho modificada genéticamente que carece de la función ADAM6 (por ejemplo, una rata con una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada endógena reemplazada con una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o un gen inactivado en la región de cadena pesada de inmunoglobulina de rata) , la pérdida de la fertilidad en la rata es rescatada por adición de un ADAM6 de rata o, en algunas modalidades, un ortólogo de un ADAM6 de rata (por ejemplo, un ortólogo de ADAM6 de otra cepa de rata o especies, o, en una modalidad, de un ratón) .

Por lo tanto, en diversas modalidades, los animales modificados genéticamente que no presentan ninguna fertilidad o una reducción en la fertilidad debido a la modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 (u ortólogo u homólogo de la misma) o una región reguladora ligada operativamente con la secuencia del ácido nucleico, comprenden una secuencia de ácido nucleico que complementa, o restaura, la pérdida de la fertilidad, donde la secuencia de ácido nucleico que complementa o restaura la pérdida de la fertilidad es a partir de una cepa diferente de la misma especie o de una especie filogenéticamente relacionada. En diversas modalidades, la secuencia de ácido nucleico complementaria es un ortólogo ADAM6 u homólogo o fragmento funcional del mismo. En diversas modalidades, el ortólogo u homólogo ADAM6 complementario o fragmento funcional del mismo es de un animal no humano que está estrechamente relacionado con el animal modificado genéticamente que tiene el defecto de la fertilidad. Por ejemplo, donde el animal transgénico es un ratón de una cepa particular, un ortólogo de ADAM6 u homólogo o fragmento funcional del mismo puede obtenerse a partir de un ratón de otra cepa, o un ratón de una especie relacionada. En una modalidad, donde el animal modificado genéticamente que comprende el defecto de la fertilidad es del orden Rodentia, el ortólogo ADAM6 u homólogo o fragmento funcional del mismo es de otro animal del orden Rodentia. En una modalidad, el animal modificado genéticamente que comprende el defecto de la fertilidad es un suborden Myomoropha (por ejemplo, jerbos, ratones saltarines, hámsters tipo ratón, hámsters, ratas y ratones del Nuevo Myndo, ratones de campo, ratones y ratas verdaderos, gerbillos, ratones espinosos, ratas con cresta, ratones trepadores, ratones de las rocas, ratas de cola blanca, ratas y ratones malgaches, lirones espinosos, ratas topo, ratas de bambú, zokors) , y el ortólogo ADAM6 u homólogo o fragmento funcional del mismo se selecciona de un animal del orden Rodentia, o del suborden Myomorpha .

En una modalidad, el animal modificado genéticamente es de la superfamilia de Dipodoidea, y el ortólogo ADAM6 u homólogo o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia de Muroidea. En una modalidad, el animal modificado genéticamente es de la superfamilia de Muroidea, y el ortólogo ADAM6 u homólogo o fragmento funcional del mismo es de la superfamilia de Dipodoidea.

En una modalidad, el animal modificado genéticamente es un roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona de la superfamilia de Muroidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una especie diferente dentro de la superfamilia de Muroidea. En una modalidad, el animal modificado genéticamente es de una familia seleccionada del Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres tipo ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones de campo) , Muridae (ratones y ratas verdaderos, gerbillos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de las rocas, ratas con cola blanca, ratas y ratones malgaches) , Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos) y Spalacidae (por ejemplo, las ratas topo, ratas de bambú y zokors) , y el ortólogo u homólogo ADAM6 se selecciona de una especie diferente de la misma familia. En una modalidad específica, el roedor modificado genéticamente se selecciona a partir de un cierto ratón o rata (familia Muridae) , y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una especie seleccionada a partir de un gerbillo, ratón espinoso, o rata con cresta. En una modalidad, el ratón modificado genéticamente es de un miembro de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo de ADAM6 es de una especie diferente de la familia Muridae. En una modalidad específica, el roedor modificado genéticamente es un ratón de la familia Muridae, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de una rata, hámster, ratón espinoso, o rata con cresta de la familia Muridae.

En diversas modalidades, uno o más ortólogos u homólogos ADAM6 de roedores o fragmentos funcionales de los mismos de un roedor en una familia, restauran la fertilidad de un roedor modificado genéticamente de la misma familia que carece de un ortólogo ADAM6 u homólogo (por ejemplo, Cricetidae (por ejemplo, hamsters, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones de campo) ; Muridae (por ejemplo, ratones y ratas verdaderos, gerbillos, ratones espinosos, ratas con cresta) ) .

En diversas modalidades, los ortólogos, homólogos ADAM6, y fragmentos de los mismos se evalúan para la funcionalidad con la determinación de si el ortólogo, homólogo, o fragmento restaura la fertilidad a un animal no humano macho modificado genéticamente que carece de actividad ADAM6 (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata, que comprende un gen inactivado de ADAM6 o su ortólogo) . En diversas modalidades, la funcionalidad se define como la capacidad de un esperma de un animal modificado genéticamente que carece de un ADA 6 endógeno u ortólogo u homólogo del mismo para migrar un oviducto y fertilizar un óvulo de la misma especie de animal modificado genéticamente.

En varios aspectos, los ratones que comprenden eliminaciones o sustituciones del locus de región variable de cadena pesada endógena o partes del mismo se puede hacer que contenga una secuencia ectópica de nucleótidos que codifica una proteína que confiere beneficios similares a la fertilidad al ADAM6 de ratón (por ejemplo, un ortólogo o un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho) . La secuencia ectópica de nucleótidos puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que es un homólogo u ortólogo de ADAM6 (o fragmento de la misma) de una cepa de ratón diferente o de una especie diferente, por ejemplo, una especie de roedores diferente, y que confiere un beneficio en la fertilidad, por ejemplo, aumento del número de carnadas durante un período de tiempo especificado, y/o aumento del número de crías por carnada, y/o la capacidad de una célula de esperma de un ratón macho para atravesar a través de un oviducto del ratón para fertilizar un huevo de ratón.

En una modalidad, el ADAM6 es un homólogo u ortólogo que es al menos 89% a 99% idéntico a una proteína ADAM6 de ratón (por ejemplo, al menos 89% a 99% idéntico a ADAM6a de ratón o ADAM6b de ratón) . En una modalidad, la secuencia ectópica de nucleótidos codifica una o más proteínas seleccionadas de forma independiente a partir de una proteína al menos 89% idéntica al ADAM6a de ratón, una proteína al menos 89% idéntica al ADAM6b de ratón, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el homólogo u ortólogo es una proteína de rata, hámster, ratón, o conejillo de indias que es o se modifica para ser de alrededor de 89% o más idéntica a la del ADAM6a de ratón y/o el ADAM6b de ratón. En una modalidad, el homólogo u ortólogo es o es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a un ADAM6a de ratón y/o el ADAM6b de ratón.

ADAM6 Ectópico en Ratones de Cadena Pesada Humanizada Los desarrollos en el direccionamiento de genes, por ejemplo, el desarrollo de los cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés) , ahora permiten la recombinación de fragmentos genómicos relativamente grandes. La ingeniería BAC ha permitido la capacidad de hacer grandes eliminaciones, y grandes inserciones, en las células ES de ratón.

Los ratones que producen anticuerpos humanos han estado disponibles desde hace algún tiempo. Aunque representan un avance importante en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos, estos ratones muestran una serie de anomalías significativas que limitan su utilidad. Por ejemplo, muestran el desarrollo de células B comprometidas. El desarrollo comprometido puede ser debido a una variedad de diferencias entre los ratones transgénicos y ratones de tipo natural .

Los anticuerpos humanos pudieran no interactuar de manera óptima con receptores de células B o de células pre-B de ratón en la superficie de células de ratón que señalizan la maduración, proliferación o la supervivencia durante la selección clonal. Los anticuerpos completamente humanos podrían no interactuar de manera óptima con un sistema de receptores Fe de ratón; los ratones expresan receptores Fe que no muestran una correspondencia uno-a-uno con los receptores Fe humanos. Por último, varios ratones que producen anticuerpos totalmente humanos no incluyen todas las secuencias originales de ratón, por ejemplo, elementos potenciadores cadena abajo y otros elementos de control de locus, que puedan ser necesarios para el desarrollo de células B de tipo natural.

Los ratones que producen anticuerpos completamente humanos generalmente comprenden loei de inmunoglobulina endógenos que están deshabilitados' de alguna manera, y transgenes humanos que comprenden segmentos génicos de inmunoglobulina variable y constante se introducen en una ubicación aleatoria en el genoma del ratón. Mientras el locus endógeno esté desactivado suficientemente a fin de no reorganizar segmentos génicos para formar un gen de inmunoglobulina funcional, el objetivo de hacer anticuerpos totalmente humanos en tal ratón se puede lograr -aunque con el desarrollo de células B comprometidas.

Aunque obligado a producir anticuerpos completamente humanos del locus del transgén humano, la generación de anticuerpos humanos en un ratón es al parecer un proceso desfavorecido. En algunos ratones, el proceso es tan desfavorecido como para resultar en la formación de cadenas pesadas quiméricas constantes de ratón/variables humanas (pero no las cadenas ligeras) a través del mecanismo de trans-conmutación. Por este mecanismo, las transcripciones que codifican anticuerpos totalmente humanos se someten a cambio de isotipo en trans desde el isotipo humano a un isotipo de ratón. El proceso es en trans, debido a que el transgén completamente humano se encuentra aparte de la locus endógeno que conserva una copia intacta de un gen de región constante de cadena pesada de ratón. Aunque en tales ratones la trans-conmutación es fácilmente evidente el fenómeno es aún insuficiente para rescatar el desarrollo de células B, que sigue siendo francamente deteriorado. En cualquier caso, los anticuerpos de trans-conmutación elaborados en los ratones conservan las cadenas ligeras totalmente humanas, ya que el fenómeno de trans-conmutación aparentemente no se produce con respecto a las cadenas ligeras; la transconmutación se basa presumiblemente en secuencias de cambio en los loci endógenos utilizados (aunque de forma diferente) en la conmutación de isotipos normales en cis. Por lo tanto, aun cuando los ratones diseñados para producir anticuerpos completamente humanos seleccionen un mecanismo de transconmutación para producir anticuerpos con regiones constantes de ratón, la estrategia sigue siendo insuficiente para rescatar el desarrollo normal de las células B.

Una preocupación principal en la fabricación de productos terapéuticos humanos basados en anticuerpos es hacer una diversidad suficientemente grande de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana para identificar dominios variables útiles que reconozcan específicamente epítopos particulares y los enlacen con una afinidad deseable, por lo general -pero no siempre- con alta afinidad. Antes del desarrollo de los ratones VELOCIMMU E® (descritos en este documento) , no había ninguna indicación de que los ratones que expresaban las regiones variables humanas con regiones constantes de ratón mostrarían algunas diferencias significativas de los ratones que hicieron anticuerpos humanos a partir de un transgén. Esa suposición, sin embargo, era incorrecta.

Los ratones VELOCIMMUNE®, que contienen un reemplazo exacto de regiones variables de inmunoglobulina de ratón con las regiones variables de inmunoglobulina humana en los loci endógenos de ratón, muestran una similitud sorprendente y notable con los ratones de tipo natural con respecto al desarrollo de las células B. En un desarrollo sorprendente e impresionante, los ratones VELOCIMMUNE® desplegaron una respuesta esencialmente normal., de tipo natural a la inmunización que difería sólo en un aspecto significativo de los ratones de tipo natural -las regiones variables generadas en respuesta a la inmunización eran totalmente humanas.

Los ratones VELOCIMMU E® contienen un reemplazo exacto, a gran escala de las regiones variables de la línea germinal del ratón de cadena pesada de la inmunoglobulina (IgH) y la cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, la cadena ligera ?, Igi de ratón, con las correspondientes regiones variables de inmunoglobulina humana, en los loci endógenos. En total, alrededor de seis megabases de los loci de ratón se sustituyen con alrededor de 1.5 megabases de secuencia genómica humana. Este reemplazo preciso resulta en un ratón con loci de inmunoglobulina híbrida que hacen que las cadenas pesadas y ligeras tengan regiones variables humanas y una región constante de ratón. El reemplazo preciso de los segmentos VH-DH-JH y VK-JK de ratón dejan las secuencias de flanqueo del ratón intactas y funcionales en los loci de inmunoglobulina híbrida. El sistema inmunitario humoral de del ratón funciona como el de un ratón de tipo natural . El desarrollo de células B está sin obstáculos en cualquier aspecto significativo y una rica diversidad de regiones variables humanas se genera en el ratón sobre la exposición al antígeno.

Los ratones VELOCIMMUNE® son posibles porque los segmentos génicos de inmunoglobulina de cadenas pesada y ligera ? se reordenan de manera similar en los humanos y los ratones, lo que no quiere decir que sus loci sean los mismos o incluso casi así -claramente no lo son. Sin embargo, los loci son lo suficientemente similares que la humanización del locus del gen variable de cadena pesada se puede lograr mediante la sustitución de alrededor de tres millones de pares de bases de la secuencia contigua de ratón que contiene todos los segmentos génicos VH, DH, y JH con alrededor de un millón de bases de la secuencia genómica contigua humana que cubre básicamente la secuencia equivalente de un locus de inmunog1obulina humana .

En algunas modalidades, la sustitución adicional de determinadas secuencias génicas de la región constante de ratón con secuencias génicas humanas (por ejemplo, sustitución secuencia CH1 de ratón con secuencia CH1 humana, y la sustitución de la secuencia CL de ratón con la secuencia CL humana) resulta en ratones con loci de inmunog1obulina híbrida que producen anticuerpos que tienen regiones humanas variables y regiones constantes parcialmente humanas, adecuadas para, por ejemplo, hacer los fragmentos de anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, los Fab completamente humanos . Los ratones con loci de inmunoglobulina híbridos exhiben reordenamiento del segmento génico variable normal, frecuencias normales de hipermutación somática y cambio de clase normal . Estos ratones muestran un sistéma inmunitario humoral que es indistinguible de ratones de tipo natural, y muestran poblaciones de células normales en todas las etapas de desarrollo de las células B y de las estructuras del órgano linfoide normal -incluso cuando los ratones carecen de un repertorio completo de segmentos génicos de región variable humana. La inmunización de estos ratones resulta en respuestas humorales robustas que muestran una amplia diversidad de uso del segmento génico variable.

La sustitución precisa de segmentos génicos de la región variable de la línea germinal del ratón permite elaborar ratones que tienen loci de inmunoglobulina parcialmente humanos. Debido a que los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos reordenan, hipermutan y cambian de clase con normalidad, los loci de inmunoglobulina parcialmente humanos generan anticuerpos en un ratón que comprenden regiones variables humanas. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables pueden ser identificadas y clonados, y a continuación, fusionadas (por ejemplo, en un sistema in vi tro) con cualquiera de las secuencias de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina adecuado para un uso en particular, lo que resulta en un anticuerpo o proteína de enlace a antígeno derivado en su totalidad de secuencias humanas.

La humanización a gran escala por métodos de recombinación por ingeniería se utiliza para modificar las células madre embrionarias de ratón (ES) para reemplazar precisamente hasta tres megabases del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que incluye esencialmente todos los segmentos génicos VH, DH, y JH de ratón con segmentos equivalentes de genes humanos con hasta una secuencia genómica humana de una megabase que contiene algunos o esencialmente todos los segmentos génicos VH, DH/ y JH humanos . Hasta un segmento megabase de la mitad del genoma humano, que comprende una de las dos repeticiones que codifican esencialmente todos los segmentos génicos V y J humanos se utilizó para reemplazar un segmento de tres megabase del locus de cadena ligera ? de la inmunoglobulina de ratón que contiene esencialmente todos los segmentos génicos VK y JK del ratón.

Los ratones con estos loci de inmunoglobulina sustituidos puede comprender una interrupción o supresión del locus ADAM6 de ratón endógeno, que se encuentra normalmente entre el segmento génico VH más en 31 y el segmento génico DH más en 51 en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. La disrupción en esta región puede conducir a la reducción o eliminación de la funcionalidad del locus ADAM6 del ratón endógeno. Si se utilizan los segmentos génicos VH más en 3' del repertorio de cadena pesada humana en un reemplazo, una región intergénica que contiene un pseudogen que parece ser un pseudogen ADAM6 humano está presente entre estos segmentos génicos VH, es decir, entre el VHl-2 y VHl-6 humanos. Sin embargo, los ratones machos que comprenden esta secuencia intergénica humana exhiben Una reducción de la fertilidad.

Los ratones son descritos que comprenden los loci sustituidos como se describe anteriormente, y que también comprenden una secuencia ectópica de ácido nucleico que codifica un ADAM6 de ratón, donde los ratones muestran la fertilidad esencialmente normal. En una modalidad, la secuencia ectópica de ácido nucleico comprende una secuencia ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón o fragmentos funcionales de las mismas colocada entre una VHl-2 humana y una VH6-1 humana en un locus endógeno de cadena pesada modificada. En una modalidad, la secuencia ectópica de ácido nucleico es SEQ ID NO: 3, colocada entre una VHl-2 humana y una VH6-1 humana en un locus de cadena pesada endógena modificada. La dirección de la transcripción de los genes ADAM6 de la SEQ ID NO: 3 son opuestos con respecto a la dirección de la transcripción de los segmentos génicos VH humanos circundantes. Aunque los ejemplos en este documento muestran rescate de la fertilidad mediante la colocación de la secuencia ectópica entre los segmentos génicos VH humanos indicados, las personas expertas reconocerán que la colocación de la secuencia ectópica en cualquier locus transcripcionalmente permisivo adecuado en el genoma del ratón (o incluso extracromosómicamente) se espera que de manera similar rescate la fertilidad en un ratón macho.

El fenómeno de complementar un ratón que carece de un locus ADAM6 funcional con una secuencia ectópica que comprende un gen ADAM6 ratón u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo es un método general que es aplicable a rescatar cualquiera de los ratones con loci de ADAM6 endógeno no funcional o mínimamente funcional. Por lo tanto, un gran número de ratones que comprenden una modificación de disrupción de ADAM6 del locus de cadena pesada de inmunoglobulina pueden ser rescatados con las composiciones y métodos de la invención. En consecuencia, la invención comprende los ratones con una amplia variedad de modificaciones de los loci de cadena pesada de inmunoglobulina que comprometen la función endógena ADAM6. Algunos ejemplos (no limitativos) se proporcionan en esta descripción. Además de los ratones VELOCIMMUNE® descritos, las composiciones y métodos relacionados con ADAM6 se pueden utilizar en un gran número de aplicaciones, por ejemplo, cuando se modifica un locus de cadena pesada en una amplia variedad de formas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia de ADAM6 ectópica que codifica una proteína funcional ADAM6 (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) , un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón con uno o más segmentos génicos VH humanos, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y JH de ratón con segmentos génicos DH humanos y JH humanos; en donde el ratón carece de una región CH1 y/o de bisagra. En una modalidad, el ratón hace una proteína de enlace del dominio variable sencillo que es un dímero de cadenas de inmunoglobulina seleccionado de: (a) VH humana - CHI ratón CH2 ratón - CH3 ratón, (b) VH humana - bisagra de ratón - CH2 ratón - CH3 ratón, y (c) VH humana - CH2 ratón - CH3 ratón.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que rescata la fertilidad se coloca dentro de una secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana {por ejemplo, entre segmentos génicos de VHl-2 y VHl-6 humanos) en un ratón que tiene una sustitución de uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (mVH's, mDH's, y/o mJH's) con uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana (hVH's, hDH's, y/o hJH's), y el ratón comprende además una sustitución de uno o más segmentos génicos variables de la cadena ligera de inmunoglobulina de ratón (mVK's y/o mJK's) con uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera ? de inmunoglobulina humana (hVK's y/o hJK's).

En una modalidad, los uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón comprende alrededor de tres megabases del locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, los uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón comprende al menos 89 segmentos génicos VH, al menos 13 segmentos génicos DH, al menos cuatro segmentos génicos JH o una combinación de los mismos del locus de cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, los uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprenden alrededor de una megabase de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una modalidad, los uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprenden al menos 80 segmentos génicos VH, al menos 27 segmentos génicos DH, al menos seis segmentos génicos JH o una combinación de los mismos de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, el uno o más segmentos génicos variables de la cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón comprende alrededor de tres megabases de locus de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón comprende al menos 137 segmentos génicos VK, al menos cinco segmentos génicos JK o una combinación de los mismos del locus de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera ? de inmunoglobulina humana comprende alrededor de media megabase de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos variables de la cadena ligera ? de inmunoglobulina humana comprende la repetición proximal (con respecto a la región constante de inmunoglobulina K) de un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 40 segmentos génicos VK, al menos cinco segmentos génicos JK o una combinación de los mismos de un locus de cadena ligera ? de inmunoglobulina humana.

En una modalidad, la secuencia de nucleótidos es colocada entre dos segmentos génicos de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, los dos segmentos génicos de inmunoglobulina humana son segmentos génicos de cadena pesada. En una modalidad, se coloca la secuencia de nucleótidos entre un segmento génico VHl-2 humano y un segmento génico VHl-6 humano en un ratón VELOCIMMU E® (patentes US 6,596,541 y US 7,105,348, incorporadas aquí como referencia) . En una modalidad, el ratón VELOCIMMUNE®, de manera modificada comprende una sustitución de segmentos' génicos variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con al menos 80 segmentos génicos VH humanos, 27 segmentos génicos DH humanos y seis segmentos génicos JH humanos, y un reemplazo de segmentos génicos de la cadena ligera variable de inmunoglobulina de ratón con al menos 40 segmentos génicos humanos V y cinco segmentos génicos JK humanos .

En un aspecto, un locus ADAM6 funcional de ratón (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) está presente en el medio de segmentos génicos VH humanos que reemplazan a segmentos génicos VH de ratón endógenos . En una modalidad, al menos 89 segmentos génicos VH de ratón se eliminan y se sustituyen por uno o más segmentos génicos VH humanos, y el locus ADAM6 de ratón está presente inmediatamente adyacente al extremo 31 de los segmentos génicos VH humanos, o entre dos segmentos génicos VH humanos. En una modalidad específica, el locus ADAM6 de ratón está presente entre dos segmentos génicos VH dentro de alrededor de 20 kilobases (kb) a alrededor de 40 kilobases (kb) de la terminal 3' de los segmentos génicos VH humanos insertados. En una modalidad específica, el locus ADAM6 de ratón está presente entre dos segmentos génicos VH dentro de alrededor de 29 kb hasta alrededor de 31 kb de extremo 3' de los segmentos génicos VH humanos insertados. En una modalidad específica, el locus ADAM6 de ratón está presente dentro de alrededor de 30 kb del terminal 3' de los segmentos génicos VH humanos insertados. En una modalidad específica, el locus ADAM6 de ratón está presente dentro de alrededor de 30,184 pb del terminal 3 ' de los segmentos génicos VH humanos insertados. En una modalidad específica, la sustitución incluye segmentos génicos VH humanos VHl-2 y VH6-1, y el locus ADAM6 de ratón está presente cadena abajo del segmento génico VHl-2 y cadena arriba del segmento génico VH6-1. En una modalidad específica, el locus ADAM6 de ratón está presente entre un segmento génico humano VHl-2 y un segmento génico humano VH6-1, en donde el extremo 5' del locus ADAM6 de ratón es de alrededor de 13,848 pares de bases desde el extremo 3' del segmento génico humano VHl-2 y el extremo 3 ' del locus ADAM6 es de alrededor de 29,737 pb en 5' del segmento génico humano VH6-1. En una modalidad específica, el locus ADAM6 de ratón comprende la SEQ ID NO : 3 o un fragmento de la misma que confiere la función ADAM6 dentro de las células del ratón. En una modalidad específica, la disposición de segmentos génicos VH humanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de la transcripción de los segmentos génicos VH humanos) : VHl-2 humano - locus ADAM6 de ratón - VH6-1 humano. En una modalidad específica, el pseudogen ADA 6 entre el VHl-2 humano y VH6-1 humano se sustituye con el locus ADAM6 de ratón. En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y el ADAM6b de ratón del locus ADAM6 de ratón es opuesto con respecto a la dirección de la transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos VH humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento génico VH más hacia 3' humano y el segmento génico DH más hacia 5' . Este puede ser el caso si el segmento DH más hacia 5' es de ratón o humano.

Del mismo modo, un ratón modificado con uno o más segmentos génicos de VL humanos (por ejemplo, segmentos VK O ??) que reemplazan todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón endógenos pueden ser modificados con el fin de mantener o bien el locus ADAM6 de ratón endógeno, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante el empleo de un vector de direccionamiento que tiene un brazo de homología cadena abajo que incluye un locus ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo, o para sustituir un locus ADAM6 de ratón dañado con una secuencia ectópica colocada entre dos segmentos génicos VL humanos o entre los segmentos génicos VL humanos y un segmento génico DH (ya sea humano o de ratón, por ejemplo, ?? + m/hDH) , o un segmento génico J (ya sea humano o de ratón, por ejemplo, VK + JH) . En una modalidad, la sustitución incluye dos o más segmentos génicos VL humanos, y el locus ADAM6 de ratón o fragmento funcional del mismo está presente entre los dos segmentos génicos VL más a 3' . En una modalidad específica, la disposición de segmentos génicos VL humanos es entonces la siguiente (de cadena arriba a cadena abajo con respecto a la dirección de la transcripción de los segmentos génicos humanos) : VL3'-1 humano - locus ADAM6 de ratón - VL31 humano.

En una modalidad, la orientación de uno o más de ADAM6a de ratón y ADAM6b de ratón del locus ADAM6 de ratón es opuesta con respecto a la dirección de la transcripción en comparación con la orientación de los segmentos génicos VL humanos. Alternativamente, el locus ADAM6 de ratón está presente en la región intergénica entre el segmento génico VL más hacia 3 ' humano y el segmento génico DH más hacia 51. Este puede ser el caso si el segmento DH más hacia 51 es de ratón o humano .

En un aspecto, se proporciona un ratón con una sustitución de uno o más segmentos génicos VH de ratón endógenos, y que comprende al menos un segmento génico DH de ratón endógeno. En tal ratón, la modificación de los segmentos génicos VH del ratón endógeno puede comprender una modificación de uno o más de los segmentos génicos VH más hacia 3', pero no el segmento génico DH más hacia 5', donde se tiene cuidado para que la modificación de los uno o más de los segmentos génicos VH más hacia 3' no interrumpa o haga al locus ADAM6 de ratón endógeno no funcional. Por ejemplo, en una modalidad, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón endógenos con uno o más segmentos génicos VH humanos, y el ratón comprende uno o más segmentos génicos endógenos DH y un locus ADAM6 funcional de ratón endógeno.

En otra modalidad, el ratón comprende la modificación de los segmentos génicos VH de ratón endógeno más hacia 3', y una modificación de uno o más segmentos génicos DH de ratón endógeno, y la modificación se lleva a cabo con el fin de mantener la integridad del locus ADAM6 de ratón endógeno en la medida en que el locus endógeno ADAM6 sigue siendo funcional. En un ejemplo, tal modificación se realiza en dos pasos: (1) la sustitución de los segmentos génicos VH de ratón endógeno más hacia 3' con uno o más segmentos génicos VH humanos que emplean un vector dirigido con un brazo de homología cadena arriba y un brazo de homología cadena abajo homología en donde el brazo de homología cadena abajo incluye la totalidad o una porción de un locus ADAM6 funcional de ratón; (2) luego reemplazar el segmento génico DH de ratón endógeno con un vector de direccionamiento que tiene un brazo de homología cadena arriba que incluye un todo o una porción funcional de un locus ADAM6 de ratón.

En varios aspectos, que emplean ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo u homólogos funcionales de los mismos son útiles donde las modificaciones alteran la función ADAM6 de ratón endógeno. La probabilidad de perturbar la función ADAM6 de ratón endógeno es elevada al hacer modificaciones a loci de inmunoglobulina de ratón, en particular, cuando se modifican regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y las secuencias circundantes. Por lo tanto, los ratones proporcionan un beneficio particular al hacer ratones con loci de inmunoglobulina de cadena pesada que se eliminan en su totalidad o en parte, se humanizan en su totalidad o en parte, o son sustituidos (por ejemplo, con secuencias VK o ??) en su totalidad o en parte. Los métodos para hacer las modificaciones genéticas descritas para los ratones que se describen a continuación son conocidos por los expertos en la técnica .

Los ratones que contienen una secuencia ectópica que codifica una proteína ADAM6 de ratón, o una proteína sustancialmente idéntica o similar que confiere los beneficios de fertilidad de una proteína ADAM6 de ratón, son particularmente útiles en relación con las modificaciones a un locus de genes variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que alteran o eliminan la secuencia ADAM6 de ratón endógeno. Aunque se ha descrito principalmente en relación con los ratones que expresan anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, tales ratones son útiles en relación con las modificaciones genéticas que alteran genes ADAM6 de ratón endógeno. Las personas con experiencia reconocerán que esto abarca una amplia variedad de ratones modificados genéticamente que contienen modificaciones de loci de genes variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Estos incluyen, por ejemplo, los ratones con una supresión o una sustitución de la totalidad o una parte de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, independientemente de otras modificaciones. A continuación se describen ejemplos no limitantes.

En algunos aspectos, los ratones modificados genéticamente que se proporcionan comprenden un ratón ectópico, roedor, u otro gen ADAM6 (u ortólogo u homólogo o fragmento) funcional en un ratón, y uno o más segmentos génicos de región constante y/o variable de la inmunoglobulina humana. En diversas modalidades, otros ortólogos u homólogos o fragmentos funcionales del gen ADAM6 en un ratón pueden incluir secuencias de bovino, canino, primate, conejo u otras secuencias no humanas.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína funcional ADAM6 , un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón con uno o más segmentos génicos VH humanos; un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos DH de ratón con uno o más segmentos génicos DH humanos, y un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos JH de ratón con uno o más segmentos génicos JH humanos.

En una modalidad, el ratón comprende, además, un reemplazo de una secuencia de nucleótidos CH1 de ratón con una secuencia de nucleótidos CH1 humana. En una modalidad, el ratón comprende además una sustitución de una secuencia de nucleótidos de bisagra de ratón con una secuencia de nucleótidos de bisagra humana. En una modalidad, el ratón comprende además un reemplazo de un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL y JL) con un locus variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad, el ratón comprende además una sustitución de una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón con una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, los dominios VL, JL, y CL son de secuencias de cadena ligera ? de inmunoglobulina. En una modalidad específica, el ratón comprende una secuencia de región constante de inmunoglobulina CH3 de ratón y CH2 de ratón fusionada con una bisagra humana y una secuencia de CH1 humana, de tal manera que los loci de inmunoglobulina de ratón se reconfiguran para formar un gen que codifica una proteína de enlace que comprende (a) una cadena pesada que tiene una región variable humana, una región CH1 humana, una región bisagra humana, y una región CH2 de ratón y CH3 de ratón, y (b) un gen que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende un dominio variable humano y una región constante humana .

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína funcional ADA 6 , un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón con uno o más segmentos génicos VL humanos, y, opcionalmente, un reemplazo de todo o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y/o segmentos génicos JH con uno o más segmentos génicos DH humanos y/o segmentos génicos JH humanos, u opcionalmente un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y segmentos génicos JH con uno o más segmentos génicos JL humanos.

En una modalidad, el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VH, DH, y JH de ratón con uno o más VL, uno o más DH, y uno o más segmentos génicos J (por ejemplo, JK O J ) , en donde los segmentos génicos se unen operativamente a una región bisagra endógeno del ratón, en donde el ratón forma un gen de la cadena de inmunoglobulina reconfigurado que contiene, de 51 a 3' en la dirección de la transcripción, VL humano - DH humano o de ratón - J humano o de ratón - ratón bisagra - CH2 de ratón - CH3 de ratón. En una modalidad, la región J es una región JK humana. En una modalidad, la región J es una región JH humana. En una modalidad, la región J es una región JX humana. En una modalidad, la región VL humana se selecciona de una región ?? humana y una región VK humana.

En modalidades específicas, el ratón expresa un solo anticuerpo de dominio variable que tiene una región constante de ratón o humana y una región variable derivada de un VK humano, un DH humano y un JK humano; un VK humano, un DH humano, y un JH humano, un ?? humano, un DH humano, y un JX humano, un ?? humano, un DH humano, y JH humano, un VK humano, un DH humano, y un JX humano; un ?? humano, un DH humano, y un JK humano. En modalidad específica, las secuencias de reconocimiento de recombinación se modifican a fin de permitir reordenamientos productivos que se produzcan entre los segmentos génicos mencionados V, D, J y o entre los segmentos génicos V y J.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína funcional ADAM6 (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) , un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón con uno o más segmentos génicos VL humanos, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad del segmento génico DH de ratón y segmentos génicos JH con segmentos génicos humanos JL; en donde el ratón carece de una región CH1 y/o de bisagra.

En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio CH1. En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica una región de bisagra. En una modalidad, el ratón carece de una secuencia que codifica un dominio CHl y una región de bisagra.

En una modalidad específica, el ratón expresa una proteína de enlace que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (? o ) fusionado a un dominio CH2 de ratón que se une a un dominio CH3 del ratón.

En un aspecto, se proporciona un ratón que comprende una secuencia ectópica ADAM6 que codifica una proteína funcional ADA 6 (u ortólogo u homólogo o fragmento funcional del mismo) , un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VH de ratón con uno o más segmentos génicos VL humanos, un reemplazo de la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos DH y JH de ratón con segmentos génicos humanos JL.

En una modalidad, el ratón comprende una supresión de una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que codifica una región CH1, una región bisagra, una región bisagra y una CH1, o una región CH1 y una región bisagra y una región CH2.

En una modalidad, el ratón hace una proteína de enlace del dominio variable única que comprende un homodímero seleccionado entre los siguientes: (a) VL humano - ratón CH1 -ratón CH2 - ratón CH3 , (b) VL humana - bisagra ratón - ratón CH2 - ratón CH3 , (c) VL humana - ratón CH2 - ratón CH3.

En un aspecto, se proporciona un ratón con un locus de inmunoglobulina de cadena pesada endógena discapacitado, que comprende un locus ADAM6 de ratón endógeno desactivado o eliminado, en donde el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa un humano o ratón o humano/ratón u otro anticuerpo quimérico. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está presente en un transgén integrado que se integra al azar en el genoma del ratón. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico está en un episoma (por ejemplo, un cromosoma) no se encuentra en un ratón de tipo natural.

En una modalidad, el ratón comprende además un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena discapacitado. En una modalidad específica, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena se selecciona de un locus de cadena ligera kappa ( ) y uno lambda (?) . En una modalidad específica, el ratón comprende un locus de cadena ligera endógeno discapacitado y un locus de cadena ligera ? discapacitado, en donde el ratón expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana y un dominio de cadena ligera de ' inmunoglobulina humana. En una modalidad, el dominio de la cadena ligera de inmunoglobulina humana se selecciona de un dominio de cadena ligera ? humana y un dominio de cadena ligera ? humana.

En un aspecto, se proporciona un animal modificado genéticamente que expresa un anticuerpo quimérico y expresa una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma que es funcional en el animal modificado genéticamente.

En una modalidad, el animal modificado genéticamente se selecciona de un ratón y una rata. En una modalidad, el animal modificado genéticamente es un ratón, y la proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma es de una cepa de ratón que es una cepa diferente que el animal modificado genéticamente. En una modalidad, el animal modificado genéticamente es un roedor de la familia Cricetidae (por ejemplo, un hámster, una rata o ratón del Nuevo Mundo, un ratón de campo) , y la proteína u homólogo u ortólogo de ADAM6 es de un roedor de la familia Muridae (por ejemplo, ratón o rata verdadera, hámster, ratón espinoso, rata con cresta) . En una modalidad, el animal modificado genéticamente es un roedor de la familia Muridae, y la proteína u homólogo u ortólogo de ADAM6 es de un roedor de la familia Cricetidae.

En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y una secuencia de región constante de un roedor. En una modalidad, el roedor se selecciona entre un roedor de la familia Cricetidae y un roedor de la familia Muridae, En una modalidad específica, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es un ratón. En una modalidad específica, el roedor de la familia Cricetidae y de la familia Muridae es una rata. En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable humano y un dominio constante de un animal seleccionado de un ratón o una rata, en una modalidad específica, el ratón o la rata se selecciona de la familia Cricetidae y la familia Muridae. En una modalidad, el anticuerpo quimérico comprende un dominio variable de cadena pesada humana, un dominio variable de cadena ligera humana y una secuencia de región constante derivada de un roedor seleccionado de ratón y de rata, en donde el dominio variable de cadena pesada humana y la cadena ligera humana son cognados. En una modalidad específica, el cognado incluye que los dominios variables de cadena pesada humana y la cadenas ligera humana sean de una sola célula B que expresa el dominio variable de cadena ligera humana y el dominio variable de cadena pesada humana reúnen y presentan los dominios variables juntos en la superficie de una célula B individual .

En una modalidad, el anticuerpo quimérico se expresa a partir de un locus de la inmunoglobulina . En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico se expresa a partir de locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena reconfigurado . En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena reconfigurado . En una modalidad, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo quimérico y/o el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un transgen reconfigurado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico reconfigurada derivada de una secuencia de ácido nucleico no reconfigurada integrada en el genoma del animal en un locus distinto de un locus de inmunoglobulina endógena) . En una modalidad, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo quimérico se expresa a partir de un transgen reconfigurado (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico reconfigurada derivada de una secuencia de ácido nucleico no reconfigurada integrada en el genoma del animal en un locus distinto de un locus de inmunoglobulina endógena) .

En una modalidad específica, el transgén se expresa a partir de un locus transcripcionalmente activo, por ejemplo, un locus ROSA26, por ejemplo, un locus ROSA26 murino (por ejemplo, ratón) .

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada comprende una secuencia no humana ADAM6 u ortólogo u homólogo de la misma.

En una modalidad, el animal no humano es un roedor seleccionado de un ratón, una rata, y un hámster.

En una modalidad, el ortólogo u homólogo ADAM6 no humano es una secuencia que es ortóloga y/u homologa a una secuencia ADAM6 de ratón, en donde el ortólogo u homólogo es funcional en el animal no humano.

En una modalidad, el animal no humano se selecciona entre un ratón, una rata, y un hámster y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un animal no humano seleccionado de entre un ratón, una rata, y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es un ratón y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de tun animal que se selecciona de una especie diferente de ratón, una rata, y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es una rata, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una especie diferente de rata, un ratón, y un hámster. En una modalidad específica, el animal no humano es un hámster, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un roedor que se selecciona de una especie diferente de hámster, un ratón, y una rata.

En una modalidad específica, el animal no humano es del suborden Myomorpha, y la secuencia de ADAM6 es de un animal seleccionado de un roedor de la superfamilia Dipodoidea y un roedor de la superfamilia de Muroidea. En una modalidad específica, el roedor es un ratón de la superfamilia Muroidea, y el ortólogo u homólogo ADAM6 es de un ratón o una rata o un hámster de la superfamilia Muroidea.

En una modalidad, el locus de cadena pesada humanizada comprende uno o más segmentos génicos VH humanos , uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos se unen operativamente a una o más genes de la región constante humanos, quiméricos y/o de roedor (por ejemplo, ratón o rata) . En una modalidad, los genes de región constante son ratón. En una modalidad, los genes de región constante son rata. En una modalidad, los genes de región constante son hámster. En una modalidad, los genes de región constante comprenden una secuencia seleccionada de una bisagra, una CH2 , una CH3 , y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, los genes de región constante comprenden una secuencia de bisagra, una CH2 y una CH3.

En una modalidad, la secuencia de ADAM6 no humana es contigua con una secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina humana. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 no humana se coloca dentro de una secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina humana. En una modalidad específica, la secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina humana comprende un segmento génico V, D y/o J.

En una modalidad, la secuencia de ADAM6 no humano está situada entre dos segmentos génicos V. En una modalidad, la secuencia de ADAM6 no humano está yuxtapuesta entre un segmento génico V y uno D. En una modalidad, la secuencia ADAM6 de ratón se coloca entre un segmento génico V y uno J. En una modalidad, la secuencia ADAM6 de ratón está yuxtapuesta entre un segmento génico D y uno J.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano modificado genéticamente, que comprende una célula B que expresa un dominio VH humano cognado con un dominio VL humano a partir de un locus de inmundglobulina , en donde el animal no humano expresa una proteína no humana que no es inmunoglobulina desde el locus de inmunoglobulina . En una modalidad, la proteína no humana que no es inmunoglobulina es una proteína ADAM. En una modalidad específica, la proteína ADAM es una proteína ADAM6 u homólogo u ortólogo o fragmento funcional del mismo.

En una modalidad, el animal no humano es un roedor (por ejemplo, ratón o rata) . En una modalidad, el roedor es de la familia Muridae. En una modalidad, el roedor es de la subfamilia Murinae. En una modalidad específica, el roedor de la subfamilia Murinae se selecciona de un ratón y una rata.

En una modalidad, la proteína no humana que no es inmunoglobulina es una proteína de roedores. En una modalidad, el roedor es de la familia Muridae. En una modalidad, el roedor es de la subfamilia Murinae. En una modalidad específica, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata, y un hámster.

En una modalidad, los dominios VL y VH humanos están ligados directamente o a través de una ligadura a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. En una modalidad específica, la secuencia del dominio constante comprende una secuencia seleccionada de una bisagra, una CH2 una CH3 , y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el dominio VL humano se selecciona de un dominio VK o uno ??.

En un aspecto, se proporciona un animal no humano genéticamente modificado, que comprende en su línea germinal una secuencia de inmunog1obulina humana, en donde el esperma de un animal no-humano macho se caracteriza por un defecto en la migración in vivo. En una modalidad, el defecto de la migración in vivo comprende la incapacidad de los espermatozoides del animal no humano macho para migrar de un útero a través de un oviducto de un animal no humano hembra de la misma especie. En una modalidad, el animal no humano carece de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ADAM6 o fragmento funcional de la misma. En una modalidad específica, la proteína ADAM6 o el fragmento funcional de la misma incluye una proteína ADAM6a y/o ADAM6b o fragmentos funcionales de las mismas. En una modalidad, el animal no humano es un roedor. En una modalidad específica, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata, y un hámster .

En un aspecto, se proporciona un animal no humano, que comprende una secuencia de inmunoglobulina humana contigua con una secuencia no humana que codifica una proteína ADAM6 u ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma. En una modalidad, el animal no humano es un roedor. En una modalidad específica, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata, y un hámster.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana es una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina . En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos VH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos DH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos JH. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos VH, uno o más segmentos génicos DH y uno o más segmentos génicos JH.

En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos VH que tienen una frecuencia alta en repertorios humanos naturales. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos VH comprenden no más de dos segmentos génicos VH, no más de tres segmentos génicos VH, no más de cuatro segmentos génicos VH, no más de cinco segmentos génicos VH, no más de seis segmentos génicos VH, no más de siete segmentos génicos VH, no más de ocho segmentos génicos VH, no más de nueve segmentos génicos VH, no más de 10 segmentos génicos VH, no más de 11 segmentos génicos VH, no más de 12 segmentos génicos VH, no más de 13 segmentos génicos VH, no más de 14 segmentos génicos VH, no más de 15 segmentos génicos VH, no más de 16 segmentos génicos VH, no más de 17 segmentos génicos VH, no más de 18 segmentos génicos VH, no más de 19 segmentos génicos VH, no más de 20 segmentos génicos VH, no más de 21 segmentos génicos VH, no más de 22 segmentos génicos VH o no más de 23 segmentos génicos VH.

En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos VH comprenden cinco segmentos génicos VH. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos VH comprenden 10 segmentos génicos VH. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos VH comprenden 15 segmentos génicos VH. En una modalidad específica, el uno o más segmentos génicos VH comprenden 20 segmentos génicos VH.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH6-1, VHl-2, VHl-3, VH2-5, VH3-7, VHl-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VHl-45, VHl-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VHl-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VHl-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 y VH3-74.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de entre VHl-2, VHl-8, VH1-18, VHl-46, VHl-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 y VH6-1.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH1-18, VHl-46, VHl-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 y VH5-51.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH1-18, VHl-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 y VH5-51.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 y VH4-59.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 y VH4-39.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de entre VH1-18, VH3-23 y VH4-39.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH3-21, VH3-23 y VH3-30.

En diversas modalidades, los segmentos génicos VH se seleccionan de VH3-23, VH3-30 y VH4-39.

En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende al menos 18 segmentos génicos VH, 27 segmentos génicos DH y seis segmentos génicos JH. En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende al menos 39 segmentos génicos VH, 27 segmentos génicos DH y seis segmentos génicos JH. En una modalidad específica, la secuencia de inmunoglobulina humana comprende al menos 80 segmentos génicos VH, 27 segmentos génicos DH y seis segmentos génicos JH.

En una modalidad, el animal no humano es un ratón, y el ratón comprende una sustitución de segmentos génicos VH de ratón endógenos con uno o más segmentos génicos VH humanos, en los que los segmentos génicos VH humanos operativamente están ligados a un gen de la región CH . de ratón, de tal manera que el ratón reordena los segmentos génicos VH humanos y expresa una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio VH humano y una CH de ratón. En una modalidad, 90-100% de los segmentos génicos VH no reconfigurados de ratón se sustituyen con al menos un segmento génico VH no reconfigurado humano. En una modalidad específica, la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos VH de ratón endógeno se sustituyen con al menos un segmento génico VH no reconfigurado humano. En una modalidad, la sustitución es con al menos 19, al menos 39, o al menos 80 o 81 segmentos génicos VH humanos no reconfigurados . En una modalidad, la sustitución es con al menos 12 segmentos de genes funcionales VH humanos no reconfigurados , al menos 25 segmentos génicos funcionales VH humanos no reconfigurados , o al menos 43 segmentos génicos funcionales VH humanos no reconfigurados . En una modalidad, el ratón comprende una sustitución de todos los segmentos del ratón DH y JH con al menos un segmento no reconfigurado DH humano y al menos un segmento de JH humano no reconfigurado . En una modalidad, el al menos un segmento DH humano no reconfigurado se selecciona de entre 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, y una combinación de los mismos. En una modalidad, el al menos un segmento de JH humano no reconfigurados se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, y una combinación de los mismos. En una modalidad específica, el uno o más segmento génico VH humano se selecciona de un segmento génico VH humano 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, a 6-1, y una combinación de los mismos.

En diversas modalidades, la secuencia de inmunoglobulina humana está en unión operativa con una región constante en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, los roedores, por ejemplo, el ratón, la rata, o hámster) . En una modalidad, la región constante es una humana, quimérica humana/ratón o quimérica humana/rata o humana quimérica/ hámster, un ratón, una rata, o una región constante de hámster. En una modalidad, la región constante es una región constante de roedor (por ejemplo, ratón o rata o hámster) . En una modalidad específica, el roedor es un ratón o rata. En diversas modalidades, la región constante comprende al menos un dominio CH2 y un dominio CH3.

En una modalidad, la secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina humana se encuentra en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, los roedores, por ejemplo, ratón o rata o hámster) . En una modalidad, la secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana se encuentra en un locus de cadena pesada que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano, en donde el locus de cadena no pesada es un locus transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el locus de cadena no pesada es un locus ROSA26.

En varios aspectos, el animal no humano comprende además una secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera humana (por ejemplo, una o más secuencias no reconfiguradas de la cadena ligera V y J, o una o más secuencias reconfiguradas VJ) en la línea germinal de animales no humanos. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de cadena ligera ? de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera humana comprende uno o más segmentos génicos VL. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos JL. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende uno o más segmentos génicos VL y uno o más segmentos génicos JL. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 16 segmentos génicos V y cinco segmentos génicos JK. En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 30 segmentos génicos VK y cinco segmentos génicos J . En una modalidad específica, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos 40 segmentos génicos VK y cinco segmentos génicos JK. En diversas modalidades, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se encuentra en unión operativa con una región constante en la línea germinal del animal no humano (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratón o rata o hámster) . En una modalidad, la región constante es una región constante humana, quimérica humana/roedor, ratón, rata, o hámster. En una modalidad específica, la región constante es una región constante de ratón o rata. En una modalidad específica, la región constante es una región constante ? de ratón (mCK) o una región constante de rata (rCK) .

En una modalidad, el animal no humano es un ratón y el ratón comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK con al menos seis segmentos génicos VK humanos y al menos un segmento génico de JK. En una modalidad, la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK se sustituyen con al menos 16 segmentos génicos humanos (VK humana) y al menos un segmento génico de JK. En una modalidad, la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK se sustituyen con al menos 30 segmentos génicos humanos VK y al menos un segmento génico de JK. En una modalidad, la totalidad o sustancialmente todos los segmentos génicos VK y JK se sustituyen con al menos 40 segmentos génicos humanos VK y al menos un segmento génico de JK. En una modalidad, el al menos un segmento génico de JK comprende dos, tres, cuatro, o cinco segmentos génicos humanos JK.

En una modalidad, los segmentos génicos VK humanos comprenden VK4-1, VK5-2, VK7-3, VK2-4, VK1-5, y VK1-6. En una modalidad, los segmentos génicos VK comprenden VK3-7, VK1-8, VK1-9, VK2-10, VK3-11, 2 VK1-12, VK1-13, VK2-14, VK3-15 y VKI-16. En una modalidad, los segmentos génicos VK humanos comprenden VK1-17, VK2-18, VK2-19, VK3-20, VK6-21, VK1-22, VKI-23, VK2-24, VK3-25, VK2-26, VK1-27, VK2-28, VK2-29, y VK2-30. En una modalidad, los segmentos génicos VK humanos comprenden VK3-31, VKl-32, VKl-33, VK3-34, -35 VK1 , VK2-36, VKl-37, VK2-38, VKl-39, y VK2-40.

En una modalidad específica, los segmentos génicos VK comprenden segmentos génicos de inmunoglobulina humana contiguos que abarcan el locus de cadena ligera ? de la inmunoglobulina humana desde VK4-1 hasta VK2-40, y los segmentos génicos JK comprenden segmentos génicos contiguos que abarcan el locus de cadena ligera de intnunoglobulina humana de J1 hasta JK5.

En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se encuentra en un locus de inmunoglobulina de cadena ligera en la línea germinal del animal no humano. En una modalidad específica, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano es un locus de cadena ligera de inmunoglobulina. En una modalidad, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana se encuentra en un locus de cadena ligera que no es de inmunoglobulina en la línea germinal del animal no humano que es transcripcionalmente activo. En una modalidad específica, el locus que no es de inmunoglobulina es un locus ROSA26.

En un aspecto, un método de fabricación de un anticuerpo humano se proporciona, en donde el anticuerpo humano comprende los dominios variables derivados de una o más secuencias de ácido nucleico de la región variable codificadas en una célula de un animal no humano tal como se describe en este documento.

En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se deriva de una o más secuencias de ácido nucleico aisladas de la región variable de un animal no humano tal como se describe en este documento. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo. En una modalidad, el polipéptido es un anticuerpo de cadena pesada solamente. En una modalidad, el polipéptido es un fragmento variable de cadena única (por ejemplo, un scFv) .

En un aspecto, se proporciona el uso de un animal no humano, tal como se describe en este documento para hacer un anticuerpo. En diversas modalidades, el anticuerpo comprende uno o más dominios variables que se derivan de una o más secuencias de ácido nucleico de la región variable aisladas del animal no humano. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico de la región variable comprenden segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad específica, las secuencias de ácidos nucleicos de la región variable comprenden segmentos génicos de la cadena ligera de inmunoglobulina.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de describir cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es la atmosférica o próxima a ella.

Ej emplo 1 Humanización de los genes de inmunoglobulina de ratón Cromosomas artificiales bacterianos humanos y de ratón (BAC) se utilizaron para diseñar 13 diferentes vectores de direccionamiento BAC (BACvecs) para la humanización de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y loci de cadena ligera ?. Las Tablas 1 y 2 exponen descripciones de las etapas llevadas a cabo para la constructo de todos los BACvecs empleados para la humanización de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y loci de cadena ligera ?, respectivamente.

Identificación de BACs humanos y de ratón. Los BAC de ratón que abarcan todos los extremos 5 ' y 31 de cadena pesada de la inmunoglobulina y loci de cadena ligera ? se identificaron mediante hibridación de filtros manchados con la biblioteca BAC o por cribado PCR de grupos de ADN de la biblioteca BAC de ratón. Los filtros se hibridaron en condiciones estándar utilizando sondas que correspondían a las regiones de interés. Los grupos de las bibliotecas fueron seleccionados por PCR usando pares de cebadores únicos que flanquean la región objeto de interés. La PCR adicional usando los mismos cebadores se realizó para desconvolucionar un pocilio dado y aislar el BAC correspondiente de interés. Ambos filtros de BAC y los grupos de la biblioteca fueron generados a partir de células madre embrionarias de ratón SvJ 129 (Incyte Genomics/lnvitrogen) . BAC Humanos que cubren toda la cadena pesada de la inmunoglobulina y loci de cadena ligera ? fueron identificados, ya sea por la hibridación de los filtros manchados con la biblioteca BAC (bibliotecas Caltech B, C, o D y biblioteca RPCI-11, Research Genetics/lnvitrogen) a través del cribado de grupos de bibliotecas de BAC humano (biblioteca Caltech, Invitrogen) por un método basado en la PCR o mediante el uso de una base de datos de secuencia del extremo BAC (biblioteca D Caltech, TIGR) .

Construcción de BACvecs por recombinación homologa bacteriana y ligadura. La recombinación homologa bacteriana (BHR) se llevó a cabo como se describe (Valenzuela et al, 2003;. Zhang et al, 1998, A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nat Genet 20:123-128) . En la mayoría de los casos, los fragmentos lineales se generaron por ligación de recuadros de homología generados por PCR de casetes clonados seguido del aislamiento en gel de productos de ligamiento y la electroporación en bacterias competentes con BHR que albergan el objetivo de BAC. Después de la selección en cajas de Petri con antibióticos apropiados, los BAC correctamente recombinados fueron identificados por PCR a través de ambas uniones novedosas seguido por análisis de restricción en geles de campo pulsado (Schwartz y Cantor, 1984, Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis, Cell 37:67-75) y de controles in situ por PCR usando cebadores distribuidos a través de las secuencias humanas.

Una 3hVH BACvec se construyó utilizando tres pasos secuenciales BHR para el paso inicial de la humanización del locus de cadena pesada de la inmunoglobulina (Figura 4A y Tabla 1) . En la primera etapa (Etapa 1) , un c sete se introdujo en un BAC precursor humano cadena arriba del segmento génico humano VHl-3 que contiene una región de homología con el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB1) , un gen que confiere resistencia a la kanamicina en bacterias y la resistencia a G418 en células animales (kanR) y un sitio de recombinación específica del sitio (por ejemplo, loxP) . En el segundo paso (Etapa 2), un segundo cásete se introdujo justo cadena abajo desde el último segmento JH que contiene una segunda región de homología con el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (HB2) y un gen que confiere resistencia en las bacterias a la espectinomicina (specR) . Esta segunda etapa incluyó la eliminación de secuencias del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana cadena abajo de JH6 y el gen de resistencia a cloranfenicol del vector BAC (CMR) . En la tercera etapa (etapa 3) , el BAC humano doblemente modificado (Bl) se linealizó a continuación con el uso de sitios I-Ceul que se habían añadido durante los dos primeros pasos y se integran en un BAC de ratón (B2) por BHR a través de las dos regiones de homología (HB1 y HB2) . La selección de fármacos para las etapas primera (cm/kan) , segunda (spec/kan) y tercera (cm/kan) fue diseñada para ser específico para los productos deseados. Los clones BAC modificados fueron analizados por electroforesis en gel presentada con pulsos (PFGE) después de la digestión con enzimas de restricción para determinar la construcción apropiada (figura 4B) .

En una manera similar, 12 BACvecs adicionales fueron diseñados para la humanización de cadena pesada y loci de cadena ligera . En algunos casos, la ligación de BAC se lleva a cabo en lugar de BHR para unir dos grandes BAC través de la introducción de sitios de restricción raros en ambos BACvecs precursores por BHR junto con la colocación cuidadosa de los marcadores seleccionables . Esto permitió la supervivencia del producto de ligación deseado después de la selección con combinaciones específicas marcador de fármacos. Los BAC recombinantes obtenidos mediante ligación después de la digestión con enzimas de restricción raros se identifican y se seleccionan de una manera similar a los obtenidos por BHR (como se describió anteriormente) .

Tabla 1 15 20 Tabla 2 Modificación de las células madre embrionarias (ES) y la generación de ratones. El direccionamiento de las células ES (F1H4) se efectuó al usar el método de ingeniería genética de VELOCIGENE® como se describe (Valenzuela et al., 2003). La derivación de los ratones de células ES modificadas ya sea por blastocistos (Valenzuela et al., 2003) o inyección de células 8 (Poueymirou et al., 2007, F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25:91-99) fue como se describió. Las células ES dirigidas y ratones fueron confirmados por el cribado de ADN de células madre embrionarias o ratones con conjuntos únicos de sondas y cebadores en un ensayo basado en la PCR (por ejemplo, la fig. 3A, 3B Y 3C) . Todos los estudios con ratones fueron supervisados y aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucional de Regeneron (IACUC) .

Análisis del cariotipo e Hibridación fluorescente in sifcu (FISH) . El análisis de cariotipos se realizó por Coriell Cell Repositories (Instituto Coriell para la Investigación Médica, Camden, NJ) . FISH se realizó sobre células madre embrionarias específicas como se describe (Valenzuela et al., 2003) . Las sondas correspondientes a cualquiera de ADN BAC de ratón o ADN BAC humano fueron etiquetados por traducción de mella (Invitrogen) , con la espectro de nucleótidos dUTP etiquetado de forma fluorescente en color naranja o espectro verde (Vysis) .

Locus de Gen Variable de cadena pesada de inmunoglobulina . La humanización de la región variable del locus de cadena pesada se logró en nueve pasos secuenciales por la sustitución directa de alrededor de tres millones de pares de bases (Mb) de la secuencia genómica de ratón contigua que contiene todos los segmentos génicos VH, DH y JH con alrededor de un Mb de la secuencia genómica humana contigua que contiene los segmentos génicos humanos equivalentes (Fig. 1A y Tabla 1) utilizando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 6,586,251 y Valenzuela et al, 2003) .

El intrón entre los segmentos génicos JH y genes de región constante (el intrón J-C) contiene un potenciador de la transcripción (Neuberger, 1983 , . Expression and regulation of immunoglobulin hevy chain trasnfected into lymphoid cells, E BO J 2:1373-1378) seguido por una región de repeticiones simples necesaria para la recombinación durante el cambio de isotipo (Kataoka et al., 1980, Rearrangement of immunoglobulin gamma 1 chain gene and mechanism for heavy-chain class s itch, PNAS USA 77:919-923). La unión entre la región VH-DH-JH humana y la región CH de ratón (la unión próxima) fue elegida para mantener el potenciador intrónico de cadena pesada de ratón y el dominio interruptor para preservar tanto la expresión eficiente y cambio de clase del locus de cadena pesada humanizada en el ratón. La posición exacta del nucleótido de esta y las siguientes uniones en todos los reemplazos fue posible mediante el uso del método de ingeniería genética de VELOCIGENE® (supra) , que empleó la recombinación homologa bacteriana impulsado por oligonucleótidos sintetizados. Por lo tanto, la unión próxima se colocó alrededor de 200 pb cadena abajo del último segmento génico JH y la unión distal se colocó varios cientos cadena arriba del segmento génico VH más hacia 5' del locus humano y alrededor de 9 kb cadena abajo del segmento génico de ratón VHl-86, también conocido como J558.55. El segmento génico de ratón VHl-86 (J558.55) es el segmento génico variable de cadena pesada más distal, que se dice es un pseudogen en ratones C57BL/6, pero potencialmente activo, aunque con una secuencia pobre RSS, en el alelo 129 de destino. El extremo distal del locus de cadena pesada de ratón puede contener notablemente elementos de control que regulan la expresión y/o reordenamiento del locus (Pawiitzky et al . , 2006) .

Una primera inserción de la secuencia de ADN de inmunoglobulina humana en el ratón se consiguió usando 144 kb del extremo próximo del locus de cadena pesada humana que contiene 3 segmentos génicos VH, todos los 27 DH y 9 JH humanos insertados en el extremo próximo del locus IgH de ratón, con una supresión concomitante de 16.6 kb de la secuencia genómica de ratón, utilizando alrededor de 75 kb de brazos de homología de ratón (Etapa A, Figura 2A; . Tablas 1 y 3, 3hVH) . Esta gran inserción de 144kb y que acompaña a la supresión en 16.6 kb se llevó a cabo en una sola etapa (Etapa A) que se produjo con una frecuencia de 0.2% (Tabla 3) . Las células ES correctamente dirigidas fueron marcadas por un ensayo de pérdida de alelo nativo (LONA, por sus siglas en inglés) (Valenzuela et al., 2003) utilizando sondas dentro y flanqueando la secuencia de ratón borrada y dentro de la secuencia humana insertada, y la integridad del inserto grande humano se verificó utilizando múltiples sondas que abarcan toda la inserción (figura 3A, 3B y 3C) . Debido a que se prevén muchas rondas de direccionamiento de células ES secuenciales , los clones de células ES dirigidos en esto, y todos los pasos subsiguientes, se sometieron a análisis del cariotipo {supra) y sólo aquellos clones que muestran cariotipos normales en al menos 17 de 20 distribuciones se utilizaron para las etapas posteriores.

Las células ES de direccionamiento de la Etapa A se re-dirigieron con un BACvec que produjo una supresión de 19 kb en el extremo distal del locus de cadena pesada (Etapa B, figura 2A) . La etapa B BACvec contenía un gen de resistencia a higromicina (hyg) en contraste con el gen de resistencia a neomicina (neo) contenida en el BACvec de la etapa A. Los genes de resistencia de los dos BACvecs fueron diseñados de tal manera que, con el exitoso direccionamiento al mismo cromosoma, alrededor de tres Mb del locus del gen variable de cadena pesada de ratón que contiene todos los segmentos génicos VH de ratón distintos de VHl-86 y todos los segmentos génicos DH distintos de DQ52, así como los dos genes de resistencia, se flanquearon por sitios loxP; DQ52 y todos los segmentos génicos de la cadena JH de ratón se eliminaron en la etapa A. Los clones de células ES doblemente dirigidas en el mismo cromosoma fueron iden ificados por la conducción del cásete próximo 3hVH a homocigosidad en higH G418 (Mortensen et al, 1992, Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct, Mol Cell Biol . 12:2391 -2395) y el seguimiento del destino de la cásete hyg distal. Los segmentos de ratón de hasta cuatro Mb de tamaño, que han sido modificados de una manera para ser flanqueados por sitios loxP, se han eliminado con éxito en células ES por la expresión transitoria de la recombinasa CRE con alta eficiencia (hasta -11%) , incluso en ausencia de selección de fármacos (Zheng et al, 2000, Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications , Mol Cell Biol 20:648-655). De una manera similar, los inventores lograron una supresión de tres Mb en 8% de los clones de células ES después de la expresión transitoria CRE (Etapa C, figura 2A; . Tabla 3) . La supresión se marcó mediante el ensayo de LONA utilizando sondas en cada extremo de la secuencia de ratón suprimido, así como la pérdida de neo y hyg y la aparición de un producto de PCR a través del punto de eliminación que contiene el único sitio loxP restante. Además, la supresión se confirmó por hibridación fluorescente in situ (datos no mostrados) .

El resto de la región variable de cadena pesada humana se añadió al alelo 3hVH en una serie de 5 pasos usando el método de ingeniería genética VELOCIGENE® (Etapas E-H, fig. 2B) , con cada etapa que implica la inserción precisa de hasta a 210 kb de secuencias génicas humanas. Para cada etapa, el extremo próximo de cada nuevo BACvec fue diseñado para solapar las secuencias humanas más distales de la etapa anterior y el extremo distal de cada nuevo BACvec contenía la misma región distal de homología de ratón tal como se utiliza en la Etapa A. Los BACvecs de etapas D, F y H contenían casetes de selección neo, mientras que los de las etapas E y G contenían casetes de selección hyg, por lo tanto las selecciones se alternaron entre G418 e higromicina. El direccionamiento en la Etapa D se ensayó por la pérdida del producto de PCR único a través del sitio loxP distal del alelo híbrido 3hVH. El direccionamiento para las etapas E a I fue ensayado por la pérdida del cásete de selección anterior. En la etapa final (Etapa I, la fig. 2B) , el cásete de selección neo, flanqueado por sitios FRT (McLeod et al., 1986, Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle, Mol Cell Biol . 6:3357-3367), fue retirado por la expresión FLPe transitoria (Buchholz et al, 1998, Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis, Nat Biotech nol 16:657-662). Las secuencias humanas de los BACvecs para las Etapas D, E y G se derivaron de dos BAC humanos precursores cada uno, mientras que los de los etapas F y H eran de BAC individuales. La retención de secuencias humanas se confirmó en cada etapa con el uso de múltiples sondas que abarcan las secuencias humanas insertadas (como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en la fig. 3A, 3B y 3C) . Sólo los clones con cariotipo normal y potencial de línea germinal se llevaron adelante en cada etapa. Las células ES a partir de la etapa final eran todavía capaces de contribuir a la línea germinal después de nueve manipulaciones secuenciales (Tabla 3 ) . Los ratones homocigóticos para cada uno de los alelos de cadena pesada eran viables, parecían sanos y demostraron un sistema inmunitario esencialmente de tipo natural humoral (véase el Ejemplo 3 ) .

Tabla 3 Locus de Gen variable de cadena ligera ? de Inmunoglobulina . La región variable de cadena ligera ? fue humanizada en ocho etapas sucesivas por la sustitución directa de cerca de tres Mb de secuencia de ratón que contienen todos los segmentos génicos VK y JK con cerca de 0.5 Mb de secuencia humana que contienen los segmentos génicos VK y JK humanos próximos en una manera similar a la de cadena pesada (figura IB; las Tablas 2 y 4) .

La región variable del locus de cadena ligera humana contiene dos repeticiones casi idénticas de 400 kb separadas por un espaciador de 800 kb ( eichhold et al., 1993, The human immunoglobul in kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity, Genomics 16:503-511) . Debido a que las repeticiones son tan similares, casi la totalidad de la diversidad del locus puede ser reproducida en ratones mediante el uso de la repetición próxima. Además, se ha informado de un alelo humano natural del locus de cadena ligera faltante en la repetición distal (Schaible et al, 1993, The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuáis, Hum Genet 91 :261 -267). Los inventores reemplazaron alrededor de tres Mb de la secuencia génica variable de la cadena ligera ? de ratón con cerca de 0.5 Mb de secuencia génica variable de la cadena ligera humana para reemplazar eficazmente todos los segmentos génicos VK y JK de ratón con el VK humano próxioa y todos los segmentos génicos humanos JK (Fig. 2C y 2D, Tablas 2 y 4) . En contraste con el método descrito en el Ejemplo 1 para el locus de cadena pesada, la totalidad de la región del gen VK de ratón, que contiene todos los segmentos génicos VK y JK, se ha eliminado en un proceso de tres etapas antes de añadir cualquier secuencia humana. En primer lugar, un cásete neo se introdujo en el extremo próximo de la región variable (Etapa A, figura 2C) . A continuación, un cásete de hyg se insertó en el extremo distal del locus ? (Etapa B, figura 2C) . Los sitios de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, loxP) se encuentran de nuevo dentro de cada cásete de selección de tal manera que el tratamiento CRE indujo la supresión de los restantes 3 Mb de la región VK de ratón junto con ambos genes de resistencia (Etapa C, figura 2C) .

Un fragmento genómico humano de alrededor de 480 kb de tamaño que contiene toda la región variable de cadena ligera ? de inmunoglobulina se insertó en cuatro etapas secuenciales (Figura 2D; Tablas 2 y 4) , con un máximo de 150 kb de secuencia de cadena ligera ? de inmunoglobulina humana insertada en una sola etapa, utilizando métodos similares a los empleados para la cadena pesada (véase el Ejemplo 1) . El gen de resistencia a higromicina final se retira por la expresión transitoria FLPe . Al igual que con la cadena pesada, se evaluaron clones de células ES dirigidas para la integridad de todo el inserto humano, cariotipo normal y el potencial de la línea germinal después de cada etapa. Los ratones homocigóticos para cada uno de los alelos de cadena ligera ? se generaron y se encontró que estaban sanos y de aspecto normal.

Tabla 4 Ejemplo 2 Generación de ratones humanizados completamente por Combinación de alelos múltiples de inmunoglobulina humanizada En varios puntos, las células ES que llevan una porción de los repertorios variables de cadena pesada de la inmunoglobulina humana o de la cadena ligera ? como se describe en el Ejemplo 1 se microinyectaron, y los ratones resultantes se reprodujeron para crear varias versiones de ratones VELOCIM U E® con fracciones progresivamente más grandes de los repertorios de inmunoglobulina de línea germinal humana (Tabla 5; figura 5A y 5B) . Los ratones VELOCIMMUNE® (VI) poseen dieciocho segmentos génicos VH humanos y todos los segmentos génicos DH y JH humanos combinado con dieciséis segmentos génicos VK humanos y todos los segmentos génicos humanos JK. Los ratones VELOCIMMUNE® 2 (V2) y VELOCIMMUNE® (V3 ) han aumentado repertorios variables que llevan un total de treinta y nueve VH y treinta VK y ochenta VH y y cuarenta VK, respectivamente. Dado que las regiones genómicas que codifican los segmentos génicos VH/ DH y JH de ratón, y los segmentos génicos VK y K, se han reemplazado por completo, los anticuerpos producidos por todas las versiones de ratones VELOCIMMUNE® contienen regiones variables humanas ligadas a regiones constantes de ratón. Los loci de cadena ligera ? de ratón permanecen intactos en diversas modalidades de los ratones VELOCIMMUNE® y sirven como un comparador para la eficiencia de expresión de las diferentes loci de cadena ligera ? de VELOCIMMUNE®.

Los ratones doblemente homocigóticos tanto para las humanizaciones de cadena pesada de la inmunoglobulina y de cadena ligera ? se generan a partir de un subconjunto de los alelos descritos en el Ejemplo 1. Todos los genotipos observados durante el curso de la reproducción para generar los ratones doblemente homocigóticos se produjeron en proporciones más o menos mendelianas. La progenie de machos homocigóticos para cada uno de los alelos de cadena pesada humanos demostró reducción de la fertilidad, que resultó de la pérdida de la actividad del ADAM6 de ratón. El locus del gen variable de cadena pesada de ratón contiene dos genes funcionales incrustados ADAM6 (ADAM6a y ADAM6b) . Durante la humanización del locus del gen variable de cadena pesada de ratón, la secuencia genómica humana insertada contenía un pseudogen ADAM6. El ADAM6 de ratón puede ser necesario para la fertilidad, y por lo tanto la falta de genes ADAM6 de ratón en los loci de genes variables de cadena pesada humanizados podría dar lugar a una reducción de la fertilidad a pesar de la presencia del pseudogen humano. Los Ejemplos 7 a 11 describen la reingeniería de los genes ADAM6 de ratón en un locus de genes humanizado variable de cadena pesada, y la restauración de la fertilidad del nivel de tipo natural en ratones con un locus de inmunoglobulina de cadena pesada humanizada.

Tabla 5 Ejemplo 3 Poblaciones de linfocitos en ratones con genes de inmunoglobulina humanizada Las poblaciones maduras de células B en las tres versiones diferentes de ratones VELOCIMMUNE® se evaluaron por citometría de flujo.

Brevemente, suspensiones de células de la médula ósea, el bazo y el timo se hicieron usando métodos estándar. Las células se resuspendieron a 5xl05 células/ml en solución amortiguadora de tinción FACS de BD Pharmingen, bloqueados con anti-ratón de CD16/32 (BD Pharmingen) , se tiñeron con el cóctel apropiado de anticuerpos y se fija con BD Cytofix™ todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sedimentos celulares finales se resuspendieron en 0.5 mi de solución amortiguadora de tinción y se analizaron utilizando un FACSCalibur BD™ y el software BD Pro CellQuest™. Todos los anticuerpos (BD Pharmingen) se prepararon en una dilución/cóctel en masa y se añadieron a una concentración final de 0.5 mg/105 células.

Los cócteles de anticuerpos para la tinción de la médula ósea (A-D) eran como sigue: A: anti-ratón IgMb-FITC, antiratón IgMa-PE, anti-ratón CD45R(B220) -APC; B: anti-ratón CD43(S7)-PE, anti-ratón CD45R (B220) -APC, C: anti-ratón CD24 (HSA) -PE, anti-ratón CD45R (B220) -APC, D: anti-ratón BP-1-PE , anti-ratón CD45R (B220) -APC .

Los cócteles de anticuerpos para tinción del bazo y los ganglios linfáticos inguinales (E-H) fueron los siguientes: E: anti-ratón IgM-FITC, anti-ratón IgMa-PE, anti-ratón CD45R (B220) -APC; F: anti-ratón Ig, ??, ?2 , ?3 cadena ligera -FITC, anti ratón IgK cadena ligera-PE, anti-ratón CD45R(B220) -APC; G: anti-ratón Ly6G/C-FITC, anti-ratón CD49b (DX5) -PE, anti-ratón CDllb-APC, H: anti-ratón CD4(L3T4)-FITC, anti-ratón CD45R (B220) -PE, anti-ratón CD8a-APC. Los resultados se muestran en la figura 6.

Los linfocitos aislados del bazo o de los ganglios linfáticos de Ratones VELOCIMMUNE® homocigóticos se tiñeron para la expresión en la superficie de los marcadores B220 e IgM y se analizaron mediante citometría de flujo (Figura 6). Los tamaños de las poblaciones de células B220+ IgM+ maduras en todas las versiones de ratones VELOCIMMUNE® probados fueron prácticamente idénticos a los de los ratones de tipo natural, independientemente del número de segmentos génicos VH que contenían. Además, los ratones que contienen los loci de inmunoglobulina de cadena pesada híbridos homocigóticos humanizados, incluso aquellos con sólo 3 segmentos génicos VH, pero loci de cadena ligera ? de inmunoglobulina de ratón normal o ratones que contienen loci de cadena ligera ? humanizados híbridos homocigóticos con loci de cadena pesada de inmunoglobulina normal de ratón, también tenían números normales de células B220+ IgM+ en sus compartimentos periféricos (no mostrados) . Estos resultados indican que los loci quiméricos con segmentos génicos variables humanos y regiones constantes de ratón pueden poblar completamente el compartimiento de células B maduras. Además, el número de segmentos génicos variables, ya sea en los loci de cadena pesada o cadena ligera ?, y por lo tanto la diversidad teórica del repertorio de anticuerpos, no se correlaciona con la capacidad de generar poblaciones de tipo natural de las células B maduras. En contraste, los ratones con transgenes de inmunoglobulina totalmente humanos integrados al azar y loci de inmunoglobulina de ratón inactivados han reducido el número de células B en estos compartimentos, con la gravedad de la deficiencia en función del número de segmentos génicos variables incluidos en el transgén (Green y Jakobovits, 1998, egulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495) . Esto demuestra que la estrategia de "humanización genética in situ" resulta en un resultado funcional fundamentalmente diferente que los transgenes integrados al azar obtenidos en el enfoque de "gen inactivado-más-transgénico" .

Exclusión alélica y Elección del Locus. La capacidad de mantener la exclusión alélica se examinó en ratones heterocigóticos para diferentes versiones del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado.

La humanización de los loci de inmunoglobulina se llevó a cabo en una línea de ES Fl (F1H4, Valenzuela et al., 2003), derivada de embriones heterocigóticosl29S6/SvEvTac y C57BL/6NTac. Las secuencias génicas variables de línea germinal de cadena pesada humana están dirigidas al alelo 129S6, que lleva el haplotipo IgMa, mientras que el alelo C576BL/6N de ratón sin modificar lleva el haplotipo IgMb. Estas formas alélicas de IgM se pueden distinguir por citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para los polimorfismos encontrados en los alelos IgMa o IgMb. Como se muestra en la figura 6 (fila inferior) , las células B identificados en ratones heterocigóticos para cada versión del locus de cadena pesada humanizada sólo expresan un solo alelo, ya sea IgM (alelo humanizado) o IgMb (alelo de tipo natural) . Esto demuestra que los mecanismos implicados en la exclusión alélica están intactos en ratones VELOCIMMUNE®. Además, el número relativo de células B positivas para el alelo humanizado (IgMa) es aproximadamente proporcional al número de segmentos génicos VH presentes. El locus de la inmunoglobulina humanizada se expresa en alrededor del 30% de las células B en ratones heterocigóticos VELOCIMMUNE® 1, que tienen 18 segmentos génicos VH humanos, y en el 50% de las células B en ratones heterocigóticos VELOCIMMUNE® 2 y 3 (no se muestra) , con 39 y 80 segmentos génicos VH humanos, respectivamente. En particular, la proporción de células que expresan el alelo del ratón de tipo natural frente al humanizado (0.5 para ratones VELOCIMMUNE® 1 y 0.9 para ratones VELOCIMMUNE® 2) es mayor que la relación del número de segmentos génicos variables contenidos en los loci humanizado frente a los de tipo natural (0.2 para ratones VELOCIMMUNE® 1 y 0.4 para ratones VELOCIMMUNE® 2). Esto puede indicar que la probabilidad de elección del alelo es intermedia entre una elección al azar de uno o el otro cromosoma y una elección al azar de cualquier RSS de segmento V en particular. Además, puede ser una fracción de las células B, pero no todas, en donde un alelo se vuelve accesible para la recombinación, completa el proceso de recombinación y se apaga antes de que el otro alelo se vuelva accesible. Además, la distribución uniforme de las células que tienen IgM de superficie (slgM) derivada de cualquiera de los locus de cadena pesada humanizada híbrida o de locus de cadena pesada del ratón de tipo natural es evidencia de que el locus híbrido está funcionando a un nivel normal. En contraste, los transgenes de inmunoglobulina humana integradas aleatoriamente compiten pobremente con loci de inmunoglobulina de ratón de tipo natural (Bruggemann et al, 1989, A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice, PNAS 86:6709-6713; Green et al,, 1994; Tuaillon et al., 1993, Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene- segment use in mu and gamma transcripts, PNAS USA 90:3720-3724). Esto demuestra aún más que las inmunoglobulinas producidas por los ratones VELOCIMMUNE® son funcionalmente diferentes que las producidas por los transgenes integrados al azar en ratones hechos por métodos de "gen inactivado-plus-transgénicos" .

Los polimorfismos de las regiones CK no están disponibles en 129S6 o C57BL/6N para examinar la exclusión alélica de loci de cadena ligera ? no humanizados frente a los humanizados. Sin embargo, los ratones VELOCIMMU E® poseen todos loci de cadena ligera ? del ratón de tipo natural, por lo tanto, es posible observar si reordenamiento y expresión de los loci de cadena ligera humanizados pueden prevenir la expresión de la cadena ligera ? en el ratón. La relación entre el número de células que expresan la cadena ligera humanizada ? de en relación con el número de células que expresan la cadena ligera ? de ratón era relativamente sin cambios en los ratones VELOCIMMUNE®, en comparación con ratones de tipo natural, independientemente del número de segmentos génicos VK humanos insertados en el locus de cadena ligera ? (Figura 6, tercera fila desde arriba) . Además no hubo un incremento en el número de las células dobles positivas (K más ?) , lo que indica que la recombinación productiva en los loci de cadena ligera ? híbridos resulta en la supresión apropiada de recombinación del loci de cadena ligera ? de ratón. En contraste, los ratones que contienen transgenes de cadena ligera ? integrados aleatoriamente con loci de cadena ligera ? de ratón inactivada, sino loci de cadena ligera ? de ratones tipo natural, muestran relaciones dramáticamente mayores ?/ (Jakobovits, 1998), lo que implica que los transgenes de cadena ligera ? introducidos no funcionan bien en tales ratones. Esto demuestra aún más el resultado funcional diferente observado en inmunoglobulinas hechas por los ratones VELOCIMMUNE® en comparación con los realizados por los ratones "gen inactivado-más-transgénicos" .

Desarrollo de células B. Debido a que las poblaciones de células B maduras en ratones VELOCIMMUNE® se parecen a las de los ratones de tipo natural (descritos anteriormente) , es posible que los defectos en principios de diferenciación de células B sean compensados por la expansión de poblaciones de células B maduras. Las diversas etapas de la diferenciación de células B se examinaron mediante análisis de poblaciones de células B utilizando citometría de flujo. La Tabla 6 muestra el índice de la fracción de células en cada linaje de células B definido por FACS, utilizando marcadores de superficie celular específicos, en ratones VELOCIMMUNE® en comparación con compañeros de camada de tipo natural .

El desarrollo temprano de células B se produce en la médula ósea, y las diferentes etapas de diferenciación de células B se caracterizan por los cambios en los tipos y cantidades de expresión de marcadores de superficie celular. Estas diferencias en la expresión de superficie se correlacionan con los cambios moleculares que ocurren en los loci de inmunoglobulina dentro de la célula. La transición celular pro-B a pre-B requiere del reordenamiento exitoso y la expresión de la proteína de cadena pesada funcional, mientras que la transición de la etapa pre-B a la B madura se rige por la reconfiguración correcta y la expresión de una cadena ligera o ?. Por lo tanto, la transición ineficiente entre las etapas de diferenciación de células B puede ser detectada por los cambios en las poblaciones relativas de las células B en una etapa dada.

Tabla 6 Médula Ósea Bazo Versión de ratones pro-B pre-B Inmaduro Maduro Emergente Maduro No se observaron defectos importantes en la diferenciación de células B en ninguno de los ratones VELOCIMMUNE®. La introducción de segmentos génicos de cadena pesada humana no parece afectar a la pro-B a pre-B de transición, y la introducción de segmentos génicos de la cadena ligera ? humana no afecta a la transición de pre-B a B en los ratones VELOCIMMUNE®. Esto demuestra que las moléculas de inmunoglobulina "quiméricas reversas" que poseen regiones variables humanas y constantes de ratón funcionan normalmente en el contexto de la señalización de células B y las moléculas de co-receptores que conducen a la diferenciación de células B apropiada en un entorno de ratón. En contraste, el balance entre las diferentes poblaciones durante la diferenciación de células B es perturbado en diverso grado, en ratones que contienen transgenes de inraunoglobulina integrados al azar y de cadena pesada endógena inactivada o loci de cadena ligera ? (Green y Jakobovits, 1998) .

Ej emplo 4 Repertorio de Genes Variables en ratones con inmunoglobulina humanizada El uso de segmentos génicos variables humanos en el repertorio de anticuerpos humanizados de ratones VELOCIMMUNE® se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) de las regiones variables humanas procedentes de múltiples fuentes, incluyendo los esplenocitos y células de hibridoma. Se determinaron la secuencia de región variable, el uso de segmentos génicos, hipermutación somática, y la diversidad de unión de segmentos génicos de región variable reconfigurados .

Brevemente, el ARN total se extrajo a partir de lxlO7 -2xl07 esplenocitos o alrededor de 104-105 células de hibridoma utilizando TRIZOL™ (Invitrogen) o el Mini Kit Qiagen RNEASY™ (Qiagen) y cebado con cebadores específicos de la región constante de ratón utilizando el sistema de RT-PCR SUPERSCRIPT™ III One-Step (Invitrogen) . Las reacciones se llevaron a cabo con 2-5µ1 de ARN de cada muestra utilizando los cebadores específicos constantes en 3' anteriormente mencionado que forman pares con cebadores líder agrupados para cada familia de las regiones variables humanas, tanto para la cadena pesada y la cadena ligera ? , por separado. Los volúmenes de reactivos y cebadores, y las condiciones RT-PCR/PCR se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores se basan en múltiples fuentes (Wang y Stollar, 2000, Human immunoglobulin variable región gene analysis by single RT-PCR, J Immunol Methods 244:217-225; conjuntos Ig-cebador, Novagen) . En su caso, las reacciones de PCR anidadas secundarias se llevaron a cabo con los cebadores marco específicos de la familia agrupados y el mismo cebador específico de la constante de inmunoglobulina 3' de ratón usado en la reacción primaria. Alícuotas (5 µ?) de cada reacción fueron analizadas por electroforesis de agarosa y los productos de reacción se purificaron a partir de agarosa usando un Kit de Extracción de Gel MONTAJE™ (Millipore) . Los productos purificados se clonaron utilizando elSistema de Clonación TOPO™ TA (Invitrogen) y se transformaron en células de E. coli ????ß por electroporación. Los clones individuales fueron seleccionados de cada reacción de transformación y se cultivaron en 2 mL de cultivos de caldo LB con selección de antibióticos durante la noche a 37°C. El ADN del plásmido se purificó a partir de cultivos bacterianos por un método basado en kits (Qiagen) .

Uso de Genes Variables de Inmunoglobulina . El ADN de plásmido de tanto clones de cadena pesada y de la cadena ligera ? se secuenciaron con cebadores inversos T7 o M13 en el Analizador Genético ABI 3100 (Applied Biosystems) . Los datos de la secuencia sin procesar se importaron en SEQUENCHER™ (v4.5, Gene Codes) . Cada secuencia se ensambló en contigs y fue alineada con las secuencias de inmunoglobulina humana utilizando la función de búsqueda IMGT V-Quest (Brochet et al, 2008, IMGTA/V-QUEST : . the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis, Nucleic Acids Res. 36: W503-508) para identificar uso del segmento VH, DH, JH y VK, Jk humano. Las secuencias se compararon con secuencias de la línea germinal para la hipermutación somática y el análisis de unión de recombinación.

Los ratones fueron generados a partir de células madre embrionarias que contienen la modificación de cadena pesada inicial (Alelo híbrido 3hVH-CRE, parte inferior de la figura 2A.) por complementacion RAG (Chen et al, 1993, RAG-2-deficient balstocyst complementation : an assay of gene function in lymphocyte development, PNAS USA 90:4528-4532), y se preparó ADNc a partir de ARN de esplenocitos . El cDNA se amplificó utilizando conjuntos de cebadores (descrito anteriormente) específicos para el ARNm de cadena pesada preel quimérico que se produciría por recombinación V(D)J dentro de los segmentos génicos humanos insertados y posterior empalme a cualquiera de dominios constantes de IgM o IgG de ratón. Las secuencias derivadas de estos clones de ADNc (no se muestran) demostraron que la recombinación adecuada V(D)J se había producido dentro de las secuencias génicas variables humanas, que los segmentos génicos V(D)J humanos reconfigurados eran adecuadamente empalmados en la estructura a dominios constantes de ratón, y que la recombinación de cambio de clase se había producido. Además se realizó el análisis de secuencia de los productos de mR A de posteriores loci de inmunoglobulinas híbridas.

En un experimento similar, las células B de ratones VELOCIMMUNE® no inmunizados de tipo natural fueron separadas por citometría de flujo basado en la expresión de superficie de B220 e IgM o IgG. Las células B220+ IgM+ o de superficie de IgG+ (slgG+) se agruparon y las secuencias se VH y VK se obtuvieron después de la amplificación RT-PCR y clonación (descrita anteriormente) . El uso del gen representativo en un conjunto de ADNc amplificados por RT-PCR a partir de ratones VELOCIMMUNE® 1 no inmunizados (Tabla 7) y ratones VELOCIMMUNE® 3 (Tabla 8) se registró (* RSS defectuosa; t falta o pseudogene) . Asterisco: segmentos génicos con RSS defectuoso. í: Segmento génico que falta o pseudogene.

Tabla 7 Tabla 8 VH Observado DH Observado V Observado Como se muestra en las Tablas 7 y 8, casi todos los segmentos génicos VH, DH, JH, Vk y JK funcional humanos se utilizan. De los segmentos génicos variables funcionales descritos, pero no detectados en los ratones VELOCIMMUNE® de este experimento, varios han sido reportados que poseen secuencias de señal de recombinación (RSS, por sus siglas en inglés) defectuosas y, por lo tanto, no se esperaría que se expresen (Feeney, 2000, Factors that influence formation of B cell repertoire, Immunol Res 21:195-202). El análisis de varios otros conjuntos de secuencias de inmunoglobulinas de diversos ratones VELOCIMMUNE®, aisladas a partir de repertorios tanto inmunizados y sin tratar, ha demostrado el uso de estos segmentos génicos, aunque a frecuencias más bajas (datos no mostrados) . Los datos de uso de genes agregados han mostrado que todos los segmentos génicos VH, DH, JH Vk, y JK funcionales humanos contenidos en los ratones VELOCIMMUNE® se han observado en varios repertorios sin tratar e inmunizados (datos no mostrados) . Aunque el segmento génico VH7-81 humano se ha identificado en el análisis de secuencias de locus de cadena pesada humana (Matsuda et al., 1998, The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable región locus, J. Exp . Med. 188:2151-2162 ), no está presente en los ratones VELOCIMMUNE® como se confirma por la re-secuenciación de todo el genoma del ratón VELOCIMMUNE® 3.

Las secuencias de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos son conocidas por mostrar variabilidad excepcional, especialmente en segmentos cortos de polipéptidos dentro del dominio variable reconfigurado . Estas regiones, conocidas como regiones hipervariables o regiones _ determinantes de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) , crean el sitio de unión para el antígeno en la estructura de la molécula de anticuerpo. Las secuencias de polipéptidos que intervienen se denominan regiones de estructura (FR, por sus siglas en inglés) . Hay tres CDRs (CDR1, CDR2 , CDR3) y 4 FRs (FR1, FR2 , FR3 , FR4) en ambas cadenas pesada y ligera. Una CDR, CDR3 , es única en que esta CDR es creada por recombinación de ambos segmentos génicos VH DH y JH y VK y JK y genera una cantidad significativa de la diversidad del repertorio antes de que se encuentre el antígeno. Esta unión es imprecisa debido a ambas eliminaciones de nucleótidos a través de la actividad de exonucleasa y adiciones no codificadas en plantilla a través de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y, por lo tanto, permite nuevas secuencias que resulten del proceso de recombinación. Aunque las FR pueden mostrar mutación somática sustancial debido a la alta mutabilidad de la región variable en su conjunto, la variabilidad no está, sin embargo, distribuida uniformemente a través de la región variable. Las CDR son las regiones concentradas y localizadas de alta variabilidad en la superficie de la molécula de anticuerpo que permiten el enlace al antígeno. Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos seleccionados a partir de ratones VELOCIMMUNE® alrededor de la unión CDR3 que demuestra la diversidad de unión se muestran en las figuras 7A y 7B, respectivamente.

Como se muestra en la figura 7A, las adiciones de nucleótidos no codificadas de plantilla (N-adiciones) se observan tanto en la unión VH-DH y DH-JH en anticuerpos de ratones VELOCIMMUNE®, lo que indica la función apropiada de TdT con los segmentos humanos. Los puntos finales de los segmentos VH, DH y JH con relación a sus contrapartes de linea germinal indican que se ha producido también actividad de exonucleasa. A diferencia del locus de cadena pesada, los reordenamientos de la cadena ligera ? humana exhiben poca o ninguna adiciones TdT en CDR3 , que está formada por la recombinación de los segmentos VK y JK (figura 7B) . Esto se espera debido a la falta de expresión de TdT en ratones durante reordenamientos de la cadena ligera en la transición de células pre-B a la B. La diversidad observada en la CDR3 de las regiones VK humanas reconfiguradas se introduce en su mayor parte a través de la actividad de exonucleasa durante el evento de recombinación.

Hipermutación somática. Una diversidad adicional se añade a las regiones variables de genes de inmunoglobulina reconfigurados durante la reacción del centro germinal por un proceso denominado hipermutación somática. Células B que expresan regiones variables mutadas somáticamente compiten con otras células B para el acceso a antígeno presentado por las células dendríticas foliculares. Esas células B con una mayor afinidad por el antígeno se expandirán más allá y se someterán a cambio de clase antes de salir a la periferia. Por lo tanto, las células B que expresan isotipos conmutados normalmente han encontrado antígeno y se someten a reacciones de centro germinal y tendrán un número incrementado de mutaciones en relación con las células B sin tratar. Además, las secuencias de la región variable de células B slgM+ predominantemente sin tratar se esperaría que tengan relativamente menores mutaciones que las secuencias variables de células B slgG+ que han sido sometidas a la selección de antígenos .

Las secuencias de clones VH o VK al azar de células B slgM+ o slgG+ de ratones VELOCIMMUNE® no inmunizados o células B slgG+ de los ratones inmunizados fueron comparadas con sus segmentos génicos variables de línea germinal y se registraron los cambios relativos a la secuencia de línea germinal. Las secuencias de nucleótidos resultantes se tradujeron in silico y mutaciones que conducen a cambios en aminoácidos también se anotaron. Los datos se recopilaron a partir de todas las regiones variables y el porcentaje de cambio en una posición dada se calculó (figura 8) .

Como se muestra en la figura 8, las regiones variables de cadenas pesadas humanas derivadas de células B slgG+ de ratones VELOCI MUNE® no inmunizados muestran muchos más nucleótidos en relación con células B slgM* de los mismos grupos de esplenocitos , y las regiones variables de cadena pesada derivadas de ratones inmunizados muestran aún más cambios. El número de cambios es mayor en las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) en relación con las regiones de estructura, que indica la selección de antígeno. Las correspondientes secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada humana también exhiben un número significativamente mayor de mutaciones en IgG contra IgM e incluso más en IgG inmunizadas. Estas mutaciones de nuevo parecen ser más frecuentes en las CDR en comparación con las secuencias de estructura, lo que sugiere que los anticuerpos eran seleccionados de antígenos in vivo. Un aumento similar en el número de las mutaciones de nucleótidos y aminoácidos se observa en las secuencias de VK derivadas de células B IgG+ de ratones inmunizados.

El uso del gen y la frecuencia de hipermutación somática observada en los ratones VELOCIMMUNE® demuestran que esencialmente todos los segmentos génicos presentes son capaces de reordenamiento para formar anticuerpos quiméricos inversos completamente funcionales en estos ratones. Además, los anticuerpos VELOCIMMU E® participan plenamente en el sistema inmunitario del ratón para someterse a selección y maduración de la afinidad para crear anticuerpos humanos plenamente maduros que pueden neutralizar con eficacia su antígeno diana. Los ratones VELOCIMMUNE® son capaces de montar respuestas inmunitarias sólidas a múltiples clases de antígenos que resultan en el uso de una amplia gama de anticuerpos humanos, que son a la vez de alta afinidad y adecuados para su uso terapéutico (datos no mostrados) .

Ejemplo 5 Análisis de la Estructura linfoide e isotipos de suero Las estructuras manifiestas de bazo, los ganglios linfáticos inguinales, los parches de Peyer y el timo de las muestras de tejido de ratones de tipo natural o VELOCIMMUNE® teñidas con H&E fueron examinadas por microscopía de luz . Los niveles de isotipos de inmunoglobulinas en el suero recogidas de ratones de tipo natural y VELOCIMMUNE® se analizaron utilizando la tecnología LUMINEX™.

Estructura de Órganos Linfoides . La estructura y función de los tejidos linfoides son, en parte, dependientes del desarrollo adecuado de las células hematopoyéticas . Un defecto en el desarrollo o función de células B puede ser exhibido como una alteración en la estructura de los tejidos linfoides. Tras el análisis de las secciones de tejido teñido, no se identificó diferencia significativa en la apariencia de los órganos linfoides secundarios entre los ratones de tipo natural y VELOCIMMUNE® (datos no mostrados) .

Niveles séricos de inmunoglobulinas . El nivel de expresión de cada isotipo es similar en ratones de tipo natural y VELOCIMMUNE® (Fig. 9A, 9B y 9C) . Esto demuestra que la humanización de los segmentos génicos variables no tuvo ningún efecto adverso aparente sobre el cambio de clase o la expresión y la secreción de inmunoglobulina y por lo tanto aparentemente mantiene todas las secuencias de ratón endógeno necesarias para estas funciones.

Ejemplo 6 Inmunización y producción de anticuerpos en ratones con Inmunoglobulina humanizada Las diferentes versiones de ratones VELOCIMMUNE® fueron inmunizadas con el antígeno para examinar la respuesta humoral frente a estimulación con antígenos extraños.

Inmunización y Desarrollo del hibridoma. Los ratones VELOCIMMUNE® y de tipo natural pueden ser inmunizados con un antígeno en forma de proteína, ADN, una combinación de ADN y proteínas, o las células que expresan el antígeno. Los animales se refuerzan típicamente cada tres semanas para un total de dos a tres veces . Después de cada refuerzo de antígeno, se recogieron y analizaron muestras de suero de cada animal para las respuestas de anticuerpos específicas de antígeno por determinación del título de suero. Antes de la fusión, los ratones recibieron un refuerzo final de pre-fusión de 5 µ9 de proteína o de ADN, según se desee, a través de inyecciones intra-peritoneales y/o intravenosas. Los esplenocitos se cosechan y se fusionan con células de mieloma Ag8.653 en una cámara de electrofusión de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD) . Diez días después del cultivo, los hibridomas se criban para la especificidad del antígeno usando un ensayo ELISA (Harlow y Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York) . Alternativamente, las células B específicas de antígeno se aislan directamente desde ratones VELOCIMMUNE® inmunizados y se criban utilizando técnicas estándar, incluyendo las descritas aquí, para obtener anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés (por ejemplo, véase patente US 2007/0280945A1 , incorporada aquí como referencia en su totalidad) .

Determinación del txtulo sérico. Para supervisar la respuesta en suero anti -antígeno en animales, las muestras de suero se recogieron alrededor de 10 días después de cada refuerzo y los títulos se determinaron utilizando ELISA de antígeno específico. Brevemente, placas de 96 pocilios Nunc MAXISORP™ se recubren con 2 g/ml de antígeno durante la noche a 4°C y se bloquearon con albúmina de suero (Sigma, St. Louis, MO) bovina. Las muestras de suero en una serie de 3 diluciones se les permite unirse a las placas durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entonces con PBS que contenía 0.05% de Tween-20 y se detecta la IgG ligada usando Fe anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) para una concentración total de IgG, o isotipo etiquetado con biotina específico o anticuerpos policlonales específicos de cadena ligera (Southern Biotech Inc.) para los títulos específicos de isotipo, respectivamente. Para los anticuerpos marcados con biotina, después de lavado de la placa, se añade estreptavidina conjugada con HRP (Pierce, Rockford, IL) . Todas las placas se desarrollan utilizando sustratos colorimétricos , tales como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) . Después de que la reacción se detuvo con ácido fosfórico 1 M, se registran las absorciones ópticas a 450 nm y los datos se analizan usando PRISM™ de software de Graph Pad. Las diluciones necesarias para obtener dos tantos de la señal de fondo se definen como título.

En un experimento, los ratones VELOCIMMUNE® fueron inmunizados con receptor de interleuquina 6 humana (hIL-6R) . Un conjunto representativo de los títulos en suero para ratones de tipo VELOCIMMUNE® y naturales inmunizados con hlL-6R se muestra en la figura 10A y 10B.

Los ratones VELOCIMMUNE® y de tipo natural montaron respuestas fuertes hacia IL-6R con intervalos de titulación similares (figura 10A) . Varios ratones a partir de los cohortes de VELOCIMMUNE® y de tipo natural alcanzaron una respuesta máxima después de un solo refuerzo con antígeno. Estos resultados indican que la intensidad de la respuesta inmunitaria y la cinética de este antígeno fueron similares en los ratones VELOCIMMUNE® y de tipo natural. Estas respuestas de anticuerpos ( específicas de antígeno se analizaron adicionalmente para examinar los isotipos particulares de los anticuerpos específicos de antígeno que se encuentran en los sueros. Tanto los grupos VELOCIMMUNE® y de tipo natural predominantemente produjeron una respuesta IgGl (Figura 10B) , lo que sugiere que el cambio de clase durante la respuesta humoral es similar en los ratones de cada tipo.

Determinación de Afinidad de enlace del anticuerpo al antígeno en solución. Un ensayo de competición en solución basado en ELISA está diseñado típicamente para determinar la afinidad del anticuerpo de enlace al antígeno.

En resumen, los anticuerpos en medio acondicionado se mezclan previamente con diluciones seriadas de proteína de antígeno que van de 0 a 10 mg/ml . Las soluciones de la mezcla de anticuerpo y antígeno se incuban a continuación durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente para alcanzar equilibrios de enlace. Las cantidades de anticuerpo libre en las mezclas se miden usando un ELISA de intercalado cuantitativo. Placas Maxisorb™ de noventa y seis pocilios (WVR, West Chester, PA) se recubren con 1 µ9/??1 de proteína del antígeno en solución PBS durante la noche a 4°C seguido de bloqueo no específico con BSA. Las soluciones de mezcla de anticuerpo-antígeno se transfieren a continuación a estas placas seguido de una incubación de una hora. Las placas se lavan a continuación con solución amortiguadora de lavado y los anticuerpos ligados a la placa se detectaron con un reactivo de anticuerpo policlonal IgG de anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson Immuno Research Lab) y se desarrollaron usando sustratos colorimétricos tales como BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) . Después de que la reacción se detuvo con ácido fosfórico 1M, se registran las absorciones ópticas a 450 nm y los datos se analizan usando el software de PRISM™ de Graph Pad. La dependencia de las señales en las concentraciones de antígeno en solución se analizó con un análisis de ajuste de 4 parámetros y se expresa como IC50, la concentración de antígeno necesaria para lograr la reducción de 50% de la señal de las muestras de anticuerpos sin la presencia de antígeno en solución.

En un experimento, los ratones VELOCIMMU E® fueron inmunizados con hIL-6R (como se describió anteriormente) . Las Figuras 11A y 11B muestran un conjunto representativo de mediciones de afinidad para anticuerpos anti-hIL6R de ratones VELOCIMMUNE® y de tipo natural.

Después de que los ratones inmunizados reciben un tercer refuerzo de antígeno, los títulos en suero se determinaron utilizando un ensayo ELISA. Los esplenocitos se aislaron de cohortes de ratones VELOCIMMUNE® y de tipo natural seleccionados, y se fusionan con células de mieloma Ag8.653 para formar hibridomas y crecen bajo selección (como se describe anteriormente) . De un total de 671 hibridomas anti-IL-6R producidos, 236 se encontraron para expresar anticuerpos específicos de antígeno. Medios cosechadas a partir de los pocilios positivos de antígeno se utilizaron para determinar la afinidad de los anticuerpos de enlace a antígeno usando un ELISA de competición en solución. Los anticuerpos derivados de ratones VELOCIMMUNE® exhiben una amplia gama de afinidad en el enlace a antígeno en solución (Fig. 11 A) . Por otra parte, 49 de los 236 hibridomas anti-IL-6R se encontraron para bloquear la IL-6 del enlace al receptor en un bioensayo in vitro (datos no mostrados). Además, estos 49 anticuerpos bloqueantes anti-IL-6R mostraron una gama de afinidades altas en solución similar a la de anticuerpos de bloqueo derivados de la inmunización en paralelo de los ratones de tipo natural (Fig. 11 B) .

Ej emplo 7 Constructo de un Vector de Direccionamiento ADAM6 de Ratón Debido a la sustitución de loci de genes variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón con loci génicos variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina humana, las primeras versiones de ratones VELOCIMMUNE® carecen de expresión de los genes ADAM6 de ratón. En particular, los ratones macho VELOCIMMUNE® demuestran una reducción en la fertilidad. Por lo tanto, la capacidad de expresar ADAM6 se rediseñó en ratones VELOCIMMUNE® para rescatar el defecto de la fertilidad. un vector diana para la inserción de genes de ratón ADAM6a y ADAM6b en un locus de cadena pesada humanizada se construyó utilizando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® {supra) para modificar un cromosoma artificial bacteriano (BAC) 929d24, que se obtuvo del Dr. Frederick Alt (Universidad de Harvard) . El ADN del BAC 929d24 fue diseñado por ingeniería para contener fragmentos genómicos que contienen los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón y un c sete de higromicina para la eliminación dirigida de un pseudogén humano ADAM6 (??????ß?) situado entre los segmentos génicos VHl-2 y VH6-1 humanos de un locus de cadena pesada humanizada (figura 12) .

En primer lugar, un fragmento genómico que contiene el gen ADAM6b de ratón, de -800 pb de la secuencia cadena arriba (5') y de -4800 pb de la secuencia cadena abajo (3') se subclonó a partir del clon BAC 929d24. Un segundo fragmento genómico que contiene el gen ADAM6a de ratón, -300 pb de la secuencia cadena arriba (5') y -3400 pb de la secuencia cadena abajo (3'), se subclonó por separado a partir del clon BAC 929d24. Los dos fragmentos genómicos que contienen los genes de ratón ADAM6b y ADAM6a se ligaron a un cásete de higromicina flanqueado por sitios de recombinación Frt para crear el vector de direccionamiento (vector de direccionamiento ADAM6 de ratón, Figura 12, SEQ ID NO: 3) . Diferentes sitios de enzimas de restricción fueron diseñados por ingeniería en el extremo 5 ' del vector de direccionamiento siguiendo el gen ADAM6b de ratón y en el extremo 31 después del gen ADAM6a de ratón (parte inferior de la figura 12) para la ligación en el locus de cadena pesada humanizada .

Una modificación separada se hizo a un clon BAC que contiene una sustitución del loci de genes variables de cadena pesada de ratón con loci de genes variables de cadena pesada de humano, incluyendo el pseudogen ADAM6 humano ( (?????d?) situado entre los segmentos génicos humanos VHl-2 y VH6-1 del locus humanizado para la posterior ligación del vector de direccionamiento ADAM6 de ratón (figura 13).

En resumen, un cásete de neomicina flanqueado por sitios de recombinación loxP fue diseñado para contener brazos de homología que contienen la secuencia genómica humana en las posiciones 3' del segmento génico VHl-2 humano (51 con respecto a (hADAM6v|j) y 5' del segmento génico VH6-1 humano (31 con respecto a (?????d?) ; ver media de la figura 13). La ubicación del sitio de inserción de este constructo diana fue de alrededor de 1.3 kb en 5 'y -350 pb en 3' del pseudogen humano ADAM6. El constructo de direccionamiento también incluyó los mismos sitios de restricción como el vector de direccionamiento ADAM6 de ratón para permitir la posterior ligación de BAC entre el clon BAC modificado que contiene la supresión del pseudogen humano ADA 6 y el vector de direccionamiento ADAM6 de ratón.

Después de la digestión de ADN de BAC derivados de ambos constructos, los fragmentos genómicos se ligaron juntos para construir un clon BAC de ingeniería que contiene un locus de cadena pesada humanizada que contiene una secuencia genómica colocada de forma ectópica que comprende secuencias de nucleótidos ADAM6a y ADAM6b de ratón. El constructo final de direccionamiento para la supresión de un gen humano ADAM6 dentro de un locus de cadena pesada humanizada y la inserción de secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en células madre embrionarias contenían, de 5' a 3', un fragmento genómico de 5' que contiene -13 kb de la secuencia genómica humana 3 'del segmento génico humano VHl-2, -800 pb de la secuencia genómica de ratón cadena abajo del gen ADAM6b de ratón, el gen ADAM6b de ratón, -4800 pb de la secuencia genómica cadena arriba del gen ADAM6b ratón, un sitio 5' Frt, un cásete de higromicina , un sitio 3' Frt, -300 pb de la secuencia genómica cadena abajo del gen ADAM6a de ratón, el gen ADAM6a de ratón, -3400 pb de la secuencia genómica de ratón cadena arriba del gen ADAM6a de ratón, y un fragmento genómico 3' que contiene -30 kb de la secuencia genómica humana 5' del segmento génico VH6-1 humano (parte inferior de la figura 13) .

El clon BAC preparado por ingeniería (descrito anteriormente) se utilizó para electroporar las células ES de ratón que contenían un locus de cadena pesada humanizada a las células ES modificadas creadas que comprende una secuencia genómica de ratón ectópica colocada que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de un locus de cadena pesada humanizada. Células madre embrionarias positivas que contiene el fragmento ectópico genómico del ratón dentro del locus de cadena pesada humanizada se identificaron mediante un ensayo de PCR cuantitativa utilizando sondas TaqMan™ (Lie y Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5'nuclease assays, Curr Opinión Biotechnol 9(1) :43-48). Las regiones cadena arriba y cadena abajo fuera de la porción modificada del locus de cadena pesada humanizada se confirmaron mediante PCR utilizando cebadores y sondas situadas dentro de la región modificada para confirmar la presencia de la secuencia genómica de ratón ectópico dentro del locus de cadena pesada humanizada, así como el cásete de higromicina. La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena arriba incluye lo siguiente, que indica la secuencia genómica de cadena pesada humana cadena arriba del punto de inserción y un sitio de restricción I-Ceul (contenido dentro de los paréntesis a continuación) ligado de forma contigua a la secuencia genómica de ratón presente en el punto de inserción: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO : 4) . La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción cadena abajo en el extremo 3 'de la región objetivo incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de ratón y un sitio de restricción Pl-Scel (contenido dentro de los paréntesis a continuación) ligado de forma contigua con la secuencia genómica de cadena pesada humana cadena abajo del punto de inserción: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CATCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGAGCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCACCCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCCTACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEQ ID N0:5) .

Las células ES dirigidas descritas anteriormente se utilizaron como células ES donantes y se introducen en un embrión de ratón en etapa de 8 células por el método de ingeniería de ratón VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. 7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Los ratones que portan un locus de cadena pesada humanizada que contiene una secuencia genómica de ratón ectópico que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón se identificaron por formación de genotipos utilizando una modificación del ensayo de alelo (Valenzuela et al., 2003) que detecta la presencia de los genes ADAM6a y ADAM6b del ratón dentro del locus de cadena pesada humanizada.

Los ratones que portan un locus de cadena pesada humanizada que contiene los genes ADAM6a y ADAM6b del ratón son criados para una cepa de ratón supresora FLPe (véase, por ejemplo, Rodríguez et al., 2000, High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP, Nature Genetics 25:139-140) con el fin de eliminar cualquier cásete de higromicina con Frt introducido por el vector de direccionamiento que no se elimina, por ejemplo, en la fase de células ES o en el embrión. Opcionalmente , el cásete de higromicina se retiene en los ratones.

Las crías formaron genotipos y una cría heterocigóticá para un locus de cadena pesada humanizada que contiene un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende las secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón se ha seleccionado para la caracterización de la expresión génica y la fertilidad del ADAM6 de ratón.

Ej emplo 8 Caracterización de Ratones ADAM6 de Rescate Citometría de Flujo. Tres ratones homocigót icos en edad de 25 semanas para loci génicos variables de cadena ligera ? humana y pesada humana (H+/+ ?+/+) y tres ratones a la edad de 18 a 20 semanas homocigót icos para cadena ligera ? humana y pesada humana que tienen el fragmento genómico de ratón ectópico del ratón que codifica los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón dentro de ambos alelos del locus de cadena pesada humana (H+^+ A6res ?+/+) fueron sacrificados para la identificación y el análisis de poblaciones celulares de linfocitos mediante FACS en el Sistema II LSR de BD (BD Bioscience) . A los linfocitos se les dio entrada para linajes celulares específicos y se analizaron para la progresión a través de diversas etapas de desarrollo de las células B. Los tejidos recogidos de los animales incluyen la sangre, el bazo y la médula ósea. La sangre se recogió en tubos de microvaloración BD con EDTA (BD Biosciences) . La médula ósea se recogió a partir de fémures por lavado con medio RPMI completo suplementado con suero de ternero fetal, piruvato sódico, HEPES, 2-mercaptoetanol , aminoácidos no esenciales, y gentamicina. Los glóbulos rojos de la sangre, el bazo y preparaciones de médula ósea se lisaron con un solución amortiguadora de lisis a base de cloruro de amonio (por ejemplo, solución amortiguadora de lisis ACK) , seguido de lavado con medio RPMI completo.

Para la tinción de poblaciones de células, 1 x 10e células procedentes de las diversas fuentes de tejido se incubaron con anti-ratón CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) en hielo durante 10 minutos, seguido por el etiquetado con uno o una combinación de los siguientes cócteles de anticuerpos durante 30 minutos en hielo.

Médula ósea: FITC-CD43 anti-ratón (1B11, BioLegend) , PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (11/41, eBioscience) , PerCP-Cy5.5-IgD (ll-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).

Sangre periférica y bazo: FITC-K anti-ratón (187.1, BD Biosciences) , ??-? (RML-42, BioLegend) , PeCy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (ll-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD) , A700-CD19 (1D3, BD) , APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2 , eBioscience) . Después de la incubación con los anticuerpos marcados, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con FlowJo (Treestar, Inc.). Los resultados de un ratón representantivo H+/+ K+ + y H+ + A6rea ?+ + se muestran en las figuras 14A-18B.

Los resultados demuestran que las células B de ratones H+ + A6res K+/+ progresan a través de las etapas de desarrollo de las células B de una manera similar a los ratones H+,+ K+^+ en la médula ósea y los compartimentos periféricos, y muestran patrones normales de maduración una vez que entran en la periferia. Los ratones H+ + A6res K+ + demostraron un aumento de la población de células CD43int CD19+ en comparación con los ratones H+ + K+/+ (Figura 16B) . Esto puede indicar una expresión de IgM acelerada del locus de cadena pesada humanizada que contiene un fragmento genómico de ratón ectópico que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón en ratones H+ + A6res K+/+.En la periferia, las poblaciones de células B y T de los ratones H+/+ A6res K+/+ parecen normales y similares a los ratones H+/+ K+ +.

Morfología de los Testículos y caracterización del esperma. Para determinar si la infertilidad en ratones que tienen loci variables de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada es debida a defectos de producción en los testículos y/o de esperma, se examinó la morfología de los testículos y contenido del esperma del epidídimo.

En resumen, los testículos a partir de dos grupos (n = 5 por grupo; grupo 1: ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera y ? de cadena pesada humana, H+/+ ?+ , grupo 2: ratones heterocigóticos para loci de genes variables de cadena pesada humanos y homocigóticos para loci génicos variables de cadena ligera , H+/" ?+/+) se diseccionaron con el epidídimo intacto y se pesaron. Las muestras fueron fijadas, alojadas en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina y tinción con eosina (HE) . Secciones de testículo (2 testículos por ratón, para un total de 20) fueron examinados para detectar defectos en la morfología y la evidencia de la producción de esperma, mientras que las secciones del epidídimo se examinaron para la presencia de espermatozoides .

En este experimento, no se observaron diferencias en el peso de los testículos o la morfología entre ratones H+/+ ?+/+ y ratones H+/f~ K+/+ . Se observó esperma tanto en los testículos y el epidídimo de todos los genotipos. Estos resultados establecen que la ausencia de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón no conduce a cambios detectables en la morfología del testículo, y que los espermatozoides se producen en los ratones en la presencia y ausencia de estos dos genes. Los defectos en la fertilidad de ratones machos H+/+ ?+ +, por lo tanto no es probable que sea debido a la baja producción de esperma .

Motilidad espermática y Migración. Los ratones que carecen de otros miembros de la familia de genes ADAM son estériles debido a defectos en la motilidad del esperma o la migración. La migración de los espermatozoides se define como la capacidad de los espermatozoides para pasar desde el útero en el oviducto, y normalmente es necesaria para la fertilización en ratones. Para determinar si la supresión de ADAM6a y ADA 6b de ratón afecta a este proceso, se evaluó la migración de esperma y la motilidad en ratones H+/+ ?+ +.

En resumen, se obtuvo el esperma de los testículos de (1) los ratones heterocigóticos para loci de genes variables de cadena pesada humana y homocigóticos para loci génicos variables de cadena ligera ? humana (H+/~ K+/+) ; (2) ratones homocigóticos para los loci de genes variables de cadena pesada humanos y homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera ? humanos (H+/+ K+/+) ; (3) ratones homocigóticos para loci de gen variable de cadena pesada humana y homocigóticos para cadena ligera ? de tipo natural (H+/+ ttiK) , y (4) ratones de tipo natural C57 BL/6 (WT) . No se observaron anormalidades significativas en el recuento de esperma o motilidad del esperma en general mediante inspección. Para todos los ratones, se observó dispersión de cúmulos, lo que indica que cada muestra de esperma fue capaz de penetrar en las células del cumulus y enlazarse a la zona pelúcida in vitro. Estos resultados establecen que los ratones H+/+ K+/+ tienen espermatozoides que son capaces de penetrar en el cúmulo y hacer enlace con la zona pelúcida.

La fertilización de óvulos de ratón in vitro (FIV) se hizo usando el esperma de los ratones como se describió anteriormente. Se observó un número ligeramente inferior de embriones escindidos para ratones H+/+ ?+/+ el día después de FIV, así como un número reducido de espermatozoides ligado a los huevos. Estos resultados establecen que el esperma de los ratones H+ + ?+ +, una vez expuestos a un óvulo, son capaces de penetrar en el cúmulo y enlazar a la zona pelúcida.

En otro experimento, la capacidad de los espermatozoides de ratones H+/+ ?+/+ para migrar desde el útero y a través del oviducto se determinó en un ensayo de migración de los espermatozoides .

En resumen, un primer grupo de ratones hembra súper-ovulados (n=5) fueron establecidos con ratones machos H+/+ ?+ + (n=5) y un segundo grupo de ratones súper-ovulados hembra (n=5) se establecieron con machos H+/" ?+/+ (n = 5) . Se observaron las parejas de apareamiento para la cópula, y se retiraron y vacían cinco a seis horas después de la cópula el útero y el oviducto adjunto de todas las hembras para su análisis. Soluciones de lavado se evaluaron en los huevos para comprobar la ovulación y obtener un conteo de espermatozoides. La migración de esperma se evaluó de dos maneras diferentes. En primer lugar, ambos oviductos fueron retirados del útero, enjuagados con solución salina, y se contó cualquier esperma identificado. La presencia de los huevos también se observó como prueba de la ovulación. En segundo lugar, los oviductos se dejaron colocados en el útero y ambos tejidos se fijaron, alojados en parafina, seccionados y teñidos (como se describe más arriba) . Las secciones se examinaron para la presencia de espermatozoides, tanto en el útero y en ambos oviductos .

Para las hembras apareadas con los cinco machos H+/+ +/+, muy poco esperma se encontró en la solución de lavado desde el oviducto. Las soluciones de lavado de oviductos de las hembras apareadas con los machos H+/~ ?+/+ exhibieron un nivel de esperma de 25 a 30 veces más alto (promedio, n=10 oviductos) que el presente en soluciones de lavado de los oviductos de las hembras apareadas con los machos H+ + ?+/+. Una comparación de reproducción representativa de los ratones H+/+ ?+/+ y H+/+ A6res K+/+ se muestra en la Tabla 9.

Se prepararon cortes histológicos de útero y el oviducto. Las secciones fueron examinadas para detectar la presencia de esperma en el útero y el oviducto (el colículo tubarius) . La inspección de las secciones histológicas de oviducto y el útero reveló que para los ratones hembra apareados con ratones H+/+ K+/+, se encontró esperma en el útero, pero no en el oviducto. Además, las secciones de las hembras apareadas con ratones H+^+ ?+^+ revelaron que el esperma no se encontró en la unión útero-tubárica (UTJ) . En las secciones de las hembras apareadas con ratones H+/" ?*/+, el esperma fue identificado en el UTJ y en el oviducto.

Estos resultados demuestran que los ratones que carecen de genes ADAM6a y ADAM6b producen espermatozoides que presentan un defecto en la migración in vivo. En todos los casos, se observó esperma en el útero, lo que indica que la liberación de copulación y esperma aparentemente se produce de forma normal, pero poco o ningún espermatozoide se observó dentro de los oviductos después de la cópula, medido ya sea por el recuento de esperma o la observación histológica. Estos resultados establecen que los ratones que carecen de genes ADAM6a y ADAM6b producen esperma que presenta una incapacidad para migrar desde el útero hasta el oviducto. Este defecto parece conducir a la infertilidad porque los espermatozoides no pueden atravesar la unión útero-túbulo en el oviducto, donde se fertilizan los huevos. Tomados en conjunto, todos estos resultados convergen para el apoyo de la hipótesis de que los genes ADAM6 de ratón ayudan a dirigir al esperma con motilidad normal a migrar fuera del útero, a través de la unión útero-tubárica y el oviducto, y por lo tanto se acercan a un huevo para conseguir el evento fertilización. El mecanismo por el cual ADAM6 logra esto puede ser dirigido por una o ambas de las proteínas ADAM6 , o a través de la expresión coordinada con otras proteínas, por ejemplo, otras proteínas ADAM, en la célula de esperma, como se describe a continuación.

Tabla 9 Expresión de la familia de genes ADAM. Un complejo de proteínas ADAM se sabe que está presente como un complejo en la superficie de espermatozoides en maduración. Los ratones que carecen de otros miembros de la familia de genes ADAM pierden este complejo cuando madura los espermatozoides, y muestran una reducción de múltiples proteínas ADAM en espermatozoides maduros. Para determinar si la falta de genes ADAM6a y ADAM6b afecta a otras proteínas ADAM de una manera similar, técnicas Western blot de extractos de proteínas de testículo (espermatozoides inmaduros) y epidídimo (maduración de espermatozoides) se analizaron para determinar los niveles de expresión de otros miembros de la familia de genes ADAM.

En este experimento, se analizaron extractos de proteínas de los grupos (n=4 por grupo) de ratones H+/+ ?+/+ y K+/+# LOS resultados mostraron que la expresión de ADAM2 y ADAM3 no se vió afectada en los extractos de testículo. Sin embargo, tanto ADAM2 y ADAM3 se redujeron dramáticamente en los extractos de epidídimo. Esto demuestra que la ausencia de ADAM6a y ADAM6b en el esperma de ratones H+/+ ?+/+ pueden tener un efecto directo sobre la expresión y tal vez la función de otras proteínas ADAM cuando madure el esperma (por ejemplo, ADAM2 y ADAM3 ) . Esto sugiere que ADAM6a y ADAM6b son parte de un complejo de la proteína ADAM en la superficie de los espermatozoides, lo que podría ser crítico para la migración adecuada de los espermatozoides.

Ejemplo 9 Utilización de Genes Variables de Cadena Pesada Humana en Ratones de Rescate ADAM6 El uso del gen variable de cadena pesada humana seleccionado se determinó para los ratones homocigóticos para loci génicos variables de cadena ligera ? y pesada humana ya sea que carecen de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (H+/+ ?+/+) o que contienen un fragmento genómico ectópico que codifica genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (H+ + A6res ?+ +) por un ensayo de PCR cuantitativa usando sondas TaqMan™ (como se describió anteriormente) .

En resumen, se purificaron células B CD19+ a partir de los bazos de ratones H+/+ ?+/+ y H+/+ A6res ?+/+ utilizando microperalas de ratón CD19 (Miltenyi Biotec) y el ARN total fue purificado utilizando el Mini Kit R easy™ (Qiagen) . El ARN genómico fue eliminado utilizando un tratamiento en columna con DNasa libre de RNasa (Qiagen) . Alrededor de 200 ng de AR m fueron transcritos de forma inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de Primer soporte (Invitrogen) y luego amplificados con el Mezclador TAQMAN™ PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems) utilizando el Sistema de Detección de Secuencias ABI 7900 (Applied Biosystems) . La expresión relativa de cada gen se normalizó a la expresión de la región constante de cadena ligera ? de ratón (mCK) . La Tabla 10 establece las combinaciones sentido/antisentido en las sondas TAQMAN™ MGB utilizadas en este experimento.

Tabla 10 VH humana Secuencia (5'-3') SEQ ID NO En este experimento, se observó expresión de todos los cuatro genes VH humanos en las muestras analizadas. Además, los niveles de expresión fueron comparables entre ratones H+/+ K+/+ y H+ + A6res K+/+ . Estos resultados demuestran que los genes VH humanos que eran tanto distales al sitio de modificación (VH3-23 y VHl-69) y próximos al sitio de modificación (VHl-2 y VH6-1) fueron capaces de recombinarse para formar una cadena pesada humana expresada funcionalmente . Estos resultados demuestran que el fragmento genómico ectópico que comprende secuencias ADAM6a y ADAM6b de ratón insertadas en una secuencia genómica de cadena pesada humana no afectó la recombinación V(D)J de segmentos génicos de cadena pesada humana en el locus, y estos ratones son capaces de recombinar segmentos génicos de cadena pesada humana en forma normal para producir proteínas de inmunoglobulina de cadena pesada funcionales.

Ejemplo 10 Respuesta inmunitaria humoral en Ratones ADAM6 de Rescate La respuesta inmunitaria humoral se determinó para los ratones homocigóticos para loci de genes variables de cadena ligera y pesada humana ya sea que carecen de los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (H+ + ?+/+) o que contienen un fragmento genómico ectópico que codifica los genes ADAM6a y ADAM6b de ratón (H+/+ A6res ?+ +) por un esquema de inmunización de múltiples antígenos seguido por el aislamiento y caracterización de anticuerpos. Los resultados se compararon para la determinación de cualquier efecto sobre la recombinación V(D)J que implica los segmentos génicos de inmunoglobulina humanos, la evaluación de la progresión del título del suero, la producción de anticuerpos por los hibridomas y la afinidad para el antígeno .

Protocolo de inmunización. Un receptor de superficie celular humana (antígeno A) , un anticuerpo humano específico para un receptor de la proteína tirosina cinasa humana (antígeno B) , una proteína humana secretada que funciona en la regulación de la trayectoria de señalización TGF-ß (Antígeno C) , y un receptor de tirosina cinasa humana (antígeno D) se emplearon para inmunizaciones comparativas en grupos de ratones. Se recogió el suero a partir de grupos de ratones antes de la inmunización con los antígenos anteriores. Cada antígeno (2.3 µg de cada uno) se administró en una inmunización de cebado inicial mezclado con 10 µg de oligonucleótido CpG como adyuvante (Invivogen) . El inmunógeno se administra a través de la almohadilla plantar (FP) en un volumen de 25 µ? por ratón. Posteriormente, los ratones fueron reforzados a través de f.p. con 2.3 µg de antígeno junto con 10 µg de CpG y 25 µg de Adju-Phos (Brenntag) como adyuvantes en los días 3, 6, 11, 13, 17, y 20 para un total de seis refuerzos. Se sangraron los ratones en los días 15 y 22 después del cuarto y sexto refuerzos, respectivamente, y los antisueros se ensayaron para determinar el título de anticuerpos a cada antígeno específico.

Los títulos de anticuerpos se determinaron en los sueros de ratones inmunizados utilizando un ensayo ELISA. Placas de microtitulación de noventa y seis pocilios (Thermo Scientific) fueron recubiertas con el antígeno correspondiente (2 ug/ml) en solución salina amortiguadora de fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante la noche a 4°C. El día siguiente, las placas se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato que contiene 0.05% de Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich) cuatro veces utilizando un lavador de placas (Molecular Devices) . Las placas se bloquearon a continuación con 250 µ? de 0.5% de albúmina de suero bovina (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente . Las placas se lavaron cuatro veces con PBS-T. Los sueros de ratones inmunizados y los sueros pre- inmunes se diluyeron en serie tres veces en 0.5% de BSA-PBS a partir de 1:300 o 1:1000 y se añadió a las placas bloqueadas por duplicado y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Los dos últimos pocilios se dejan en blanco para ser utilizado como control de anticuerpo secundario. Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces con PBS-T en un lavador de placas. Una dilución 1:5000/1:10.000 anticuerpo secundario conjugado de cabra anti- ratón IgG-Fc-peroxidasa de rábano picante (HRP, Jackson Immunoresearch) o de cabra anti-ratón IgG-kappa-HRP (Southern Biotech) se añadió a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo ocho veces con PBS-T y desarrollan utilizando TMB/H202 como sustrato. El sustrato se incubó durante veinte minutos y la reacción se detuvo con H2S04 2 N (VWR) o H3PO4 1 N (JT Baker) . Las placas se leyeron en un espectrofotómetro (Víctor, Perkin Elmer) a 450 nm. Los títulos de anticuerpos se calcularon utilizando el software GraphPad Prism.

La concentración en suero se calculó como la dilución de suero en el rango de titulación experimental en la señal de enlace al antígeno equivalente a dos veces por encima del fondo. Los resultados para la respuesta inmunitaria humoral se muestran en la figura 19 (antígeno A) , la igura 20 (antígeno B) , la figura 21 (Antígeno C) , y la fig 22 (antígeno D) . La puntuación positiva de antígeno de hibridomas realizada mediante dos bazos aislados de ratones de cada grupo de inmunizaciones seleccionadas se muestra en la Tabla 11 (puntuación de antígeno es igual a 2X/fondo) .

Como se muestra en este ejemplo, los títulos de anticuerpos generados en ratones Adam6 de rescate (H+/+ A6res ?+/+) fueron comparables a los generados en los ratones que carecen de AD A6a y ADAM6b y que tiene la cadena pesada humanizada (H+/+ ?+/+) . Además, los bazos de ratones H+ + A6res ?+ + produjeron hibridomas positivos para el antígeno para todos los antígenos probados, incluyendo anticuerpos de alta afinidad, a niveles comparables a los ratones H+'+ ?+/+. Por lo tanto, se cree que no existe deterioro de la recombinación V(D)J de segmentos génicos de inmunoglobulina humana en ratones de rescate ADAM6 debido a la producción de anticuerpos con alta afinidad que contienen genes de inmunoglobulina humana .

Tabla 11 Secuencia Cepa de ratón Puntuación de Antígei Ejemplo 11 Determinación de afinidad de enlace a antigeno Las afinidades de enlace de anticuerpos que muestran enlace específico al antígeno B fueron seleccionadas utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (BIAcore 2000) . Los medios acondicionados de hibridomas aislados a partir de dos cepas de ratones inmunizados con el antígeno B (H+ + K+ + y H+/+ A6res K+/+) se utilizaron durante el cribado BIAcore. La superficie del sensor BIAcore fue primero derivada con anticuerpo anti-ratón de conejo policlonal (GE) para capturar anticuerpos anti -antígeno B de medios acondicionados. Durante todo el procedimiento de cribado, HBST (HEPES 0.01 M pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, 0.005% v/v de surfactante P20) se utilizó como solución amortiguadora de ejecución. El fragmento Fab de Antígeno B se inyectó el anticuerpo B sobre la superficie anti-antígeno capturado a una relación de flujo de 50 µ?/minuto a una concentración de 100 nM. La asociación del antígeno-anticuerpo se controló durante tres minutos, mientras que la disociación del antígeno del anticuerpo capturado se monitoreó durante cinco minutos en solución amortiguadora de ejecución HBST. El experimento se realizó a 25°C. Las relaciones de asociación (ka) y disociación (kd) cinética se determinaron al procesar y ajustar los datos a un modelo de enlace a 1:1 usando software de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de equilibrio de disociación de enlace (KD) y de vidas medias disociativas (??/2) se calcula a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD (M) = kd/ka, y T1 2 (min) = ( ln2/ (60*kd) . Los resultados para anticuerpos anti -antígeno B seleccionados se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12 Anticuerpo Cepa de ratón KD (M) T½ (min) En un experimento similar, la cinética de diferentes anticuerpos monoclonales presentes en los medios acondicionados de hibridoma con enlace al antígeno A se determinó utilizando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (BIAcore 4000) . Todos los clones de hibridoma utilizados en este ensayo se produjeron en ratones H+ + A6res +^+ .

En resumen, para capturar los anticuerpos específicos del antígeno A, anticuerpo anti-ratón de conejo policlonal (GE Catálogo#BR- 1008 - 38 ) se inmovilizó primero en el chip del sensor. El cribado BIAcore se realizó en dos soluciones amortiguadoras diferentes - PBSP, pH 7.2 y PBSP, pH 6.0. Ambas soluciones amortiguadoras fueron suplementadas con 0.1 mg/ml de BSA. Después de la captura de anticuerpos anti -antígeno A a partir de los medios acondicionados, 1 µ? de monómero de Antígeno A (preparado en la solución amortiguadora de ejecución respectiva) se inyectó sobre la superficie del anticuerpo capturado durante 1.5 minutos a 30 µ?/minuto y la disociación del monómero de Antígeno A enlazado se monitoreó durante 1.5 minutos en el solución amortiguadora de ejecución correspondiente a 25°C. Las constantes de velocidad de asociación cinética (ka) y disociación (kd) se determinaron al procesar y ajustar los datos a un modelo de enlace 1:1 usando software de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de equilibrio de disociación de enlace (KD) y de vidas medias disociativas (??/2) se calcula a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD(M) = kd/ka, y T1/2 (min) = (ln2/ (60*kd) . La Tabla 13 muestra los parámetros de la cinética de enlace del anticuerpo anti -antígeno A seleccionado que enlaza al monómero del antígeno A a un pH de 7.2 y H 6.0. NB : ningún enlace detectado en condiciones experimentales actuales.

Tabla 13 pH7.2 pH6.0 Como se muestra anteriormente, los anticuerpos de alta afinidad se obtuvieron de ambos ratones H+ + A6res ?+ + y H + + ?+ + en una manera comparable. Entre los veinticinco anticuerpos representados en la Tabla 12, veinte producidos en ratones H+ + A6 es ?+/+ demostraron un intervalo de afinidad de 0.5 nM a 1 µ? , mientras que los cinco generados en ratones H + ?+/ + demostraron un intervalo de afinidad de 10 nM a 150 nM . A-demás, los cincuenta y cinco anticuerpos que se muestran en la Tabla 13 demostraron un rango de afinidad de 20 pM a 350 nM para el enlace al monómero de Ant í geno A .

Como se demuestra en este ejemplo, la reinserción de genes ADAM6 de ratón en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada no perjudica la capacidad del ratón para montar una respuesta robusta de inmunizar a múltiples antigenos caracterizados por repertorios de anticuerpos humanos que tienen diversas afinidades en el rango subnanomolar , que se derivan de segmentos génicos humanos reconfigurados a partir de una linea germinal preparada por ingeniería .

Se hace -constar que con rélación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un ratón genéticamente modificado, caracterizado porque las modificaciones genéticas alcanzan: a) una posición ectópica de un gen ADAM6 que es funcional en un ratón macho; y b) un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado.

2. El ratón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación reduce o elimina la actividad Adam6 de una célula o tejido de un ratón macho.

3. El ratón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen ADAM6 se presente en el locus de región variable de cadena pesada modificado.

4. El ratón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen ADAM6 se presenta en una posición diferente a la del locus de gen variable de cadena pesada modificado .

5. El ratón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen ADAM6 incluye ADAM6a de ratón y/o ADAM6b de ratón.

6. El ratón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado comprende una inserción de uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano, y uno o más segmentos de gen JH humano.

7. El ratón de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el uno o más segmentos de gen VH humano incluye al menos 18, al menos 39, o al menos 80 segmentos de gen VH humano.

8. El ratón de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado comprende al menos 18 segmentos de gen VH humano, al menos uno y hasta 27 segmentos de gen DH humano, y al menos uno y hasta seis segmentos de gen JH humano.

9. El ratón de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado comprende al menos 39 segmentos de gen VH humana, al menos uno y hasta 27 segmentos de gen DH humano y al menos uno hasta seis segmentos de gen JH humano .

10. El ratón de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina modificado comprende 80 segmentos de gen VH humano, al menos uno y hasta 27 segmentos de gen DH humano, y al menos uno y hasta seis segmentos de gen JH humano .

11. El ratón de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el uno o más segmentos de gen VH humano, uno o más segmentos de gen DH humano, y uno o más segmentos de gen JH humano se ligan operablemente a un gen de región constante.

12. El ratón de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el gen' de región constante es un gen de región constante de ratón.

13. El ratón de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porgue el gen de región constante de ratón comprende una región constante seleccionada de una CHi, una bisagra, una CH2, una CH3 y/o una CH4 o una combinación de las mismas.

14. El ratón de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende uno o más segmentos de gen VK humano y uno o más segmentos de gen JK humano.

15. El ratón de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el uno o más segmentos de gen VK humano y uno o más segmentos de gen JK humano se presentan en un locus de cadena ligera ? de inmunoglobulina endógeno.

16. Una célula aislada, caracterizada porque es del ratón de conformidad con la reivindicación 1.

17. La célula aislada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la célula es . una célula madre embriónica.

18. Un embrión de ratón, caracterizado porque comprende la célula madre embriónica de conformidad con la reivindicación 17.

19. La célula aislada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la célula es una célula B.

20. Un hibridoma, caracterizado porque se hace a partir de la célula B de conformidad con la reivindicación 19.

21. Una célula inmortalizada, caracterizada porque se hace a partir de la célula aislada de conformidad con la reivindicación 16.

22. Un método para proporcionar un anticuerpo especifico para un antigeno de interés, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) inmunizar un ratón de conformidad con la reivindicación 1 con el antigeno de interés; (b) aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo especifico en contra del antigeno; y (c) cultivar al menos una célula que produce un anticuerpo de la etapa b) y obtener dicho anticuerpo.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el cultivo en la etapa (c) se efectúa sobre al menos una célula de hibridoma generada a partir de al menos una célula obtenida en la etapa (b) .

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la almenos una célula obtenida en la etapa -(b) se deriva del bazo, un ganglio linfático o médula ósea del ratón de la etapa (a) .

25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el inmunizar con el antigeno de interés en la etapa (a) se lleva a cabo con proteina, ADN, una combinación de ADN y proteina, o células que expresan el antigeno .