RS64280B1 - Adam6 miševi - Google Patents

Adam6 miševi

Info

Publication number
RS64280B1
RS64280B1 RS20230475A RSP20230475A RS64280B1 RS 64280 B1 RS64280 B1 RS 64280B1 RS 20230475 A RS20230475 A RS 20230475A RS P20230475 A RSP20230475 A RS P20230475A RS 64280 B1 RS64280 B1 RS 64280B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
human
mice
gene
immunoglobulin
Prior art date
Application number
RS20230475A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45998616&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64280(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64280B1 publication Critical patent/RS64280B1/sr

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • B60H1/22—Heating, cooling or ventilating devices the heat source being other than the propulsion plant
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • B60H1/32—Cooling devices
    • B60H1/3204—Cooling devices using compression
    • B60H1/3228—Cooling devices using compression characterised by refrigerant circuit configurations
    • B60H1/32281—Cooling devices using compression characterised by refrigerant circuit configurations comprising a single secondary circuit, e.g. at evaporator or condenser side
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • B60H1/32—Cooling devices
    • B60H1/3204—Cooling devices using compression
    • B60H1/323—Cooling devices using compression characterised by comprising auxiliary or multiple systems, e.g. plurality of evaporators, or by involving auxiliary cooling devices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • B60H1/00642—Control systems or circuits; Control members or indication devices for heating, cooling or ventilating devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • B60H1/00007—Combined heating, ventilating, or cooling devices
    • B60H1/00021—Air flow details of HVAC devices
    • B60H2001/00185—Distribution of conditionned air
    • B60H2001/00192—Distribution of conditionned air to left and right part of passenger compartment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B60—VEHICLES IN GENERAL
    • B60H—ARRANGEMENTS OF HEATING, COOLING, VENTILATING OR OTHER AIR-TREATING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR PASSENGER OR GOODS SPACES OF VEHICLES
    • B60H1/00—Heating, cooling or ventilating devices
    • B60H1/00007—Combined heating, ventilating, or cooling devices
    • B60H1/00021—Air flow details of HVAC devices
    • B60H2001/00185—Distribution of conditionned air
    • B60H2001/002—Distribution of conditionned air to front and rear part of passenger compartment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

]pis
OBLAST PRONALASKA
[0001 Opisani su genetički modifikovani miševi, ćelije i tkiva koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni lokus ADAM6. Modifikacije uključuju humane i/ili humanizovane lokuse imunoglobulina. Opisani su miševi kojima nedostaje funkcionalni endogeni gen ADAM6, ali koji sadrže funkciju ADAM6, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6. Opisani su genetički modifikovani mužjaci miša koji sadrže modifikaciju endogenog VHlokusa imunoglobulina koja čini da miš nije u stanju da proizvodi funkcionalni protein ADAM6 i dovodi do gubitka plodnosti, i koji dalje sadrže funkciju ADAM6 kod mužjakā miša, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja vraća plodnost mužjacima miša.
STANJE TEHNIKE
[0002 U stanju tehnike poznati su miševi koji sadrže gene humanih antitela. Farmaceutska primena antitela u poslednje dve decenije podstakla je veliki broj ispitivanja koja se tiču pravljenja antitela koja su pogodna za upotrebu kao humana terapijska sredstva. Prva terapijska sredstva sa antitelima, koja su zasnovana na mišjim antitelima, nisu bila idealna kao humana terapijska sredstva, jer učestalo davanje mišjih antitela ljudima dovodi do imunogenosti koja može poremetiti dugoročne režime lečenja. Razvijena su rešenja zasnovana na humanizovanju mišjih antitela da bi postala humanija i manje nalik mišjim. Usledili su postupci ekprimovanja humanih sekvenci imunoglobulina za upotrebu u antitelima, uglavnom zasnovani na ekspresiji in vitro humanih imunoglobulinskih biblioteka u fagima, bakterijama ili kvascu. Konačno, učinjeni su pokušaji da se dobiju korisna humana antitela iz humanih limfocita in vitro, u miševima kojima su transplantirane humane hematopoetske ćelije i u transhromozomskim ili transgenim miševima sa onesposobljenim endogenim lokusima imunoglobulina. Kod transgenskih miševa, bilo je neophodno da se onesposobe endogeni mišji geni imunoglobulina kako bi nasumično integrisani potpuno humani transgeni funkcionisali kao izvor imunoglobulinskih sekvenci eksprimovanih u miševima. Takvi miševi mogu praviti humana antitela pogodna za upotrebu kao humana terapijska sredstva, ali ti miševi pokazuju znatne probleme sa svojim imunim sistemom. Ti problemi (1) čine miševe nepraktičnim za stvaranje dovoljno raznovrsnog repertoara antitela, (2) zahtevaju obimne rekonstruktivne prepravke, (3) obezbeđuju podoptimalan postupak selekcije klonova po svoj prilici usled nekompatibilnosti između humanih i mišjih elemenata, i (4) čine te miševe nepouzadnim izvorom velikih i raznovrsnih populacija humanih varijabilnih sekvenci koje su potrebne da bi bile zaista korisne za pravljenje humanih terapijskih sredstava.
[0003 ] U stanju tehnike i dalje postoji potreba za pravljenjem poboljšanih genetički modifikovanih miševa koji su korisni za stvaranje sekvenci imunoglobulina, uključujući sekvence humanih antitela. Takođe, i dalje postoji potreba za miševima koji su sposobni za rearanžiranje genskih segmenata imunoglobulina da bi obrazovali korisne rearanžirane gene imunoglobulina, ili su sposobni da prave roteine iz izmenjenih lokusa imunoglobulina, dok se u isto vreme umanjuju ili eliminišu štetne promene koje mogu biti rezultat genskih modifikacija.
SUŠTINA PRONALASKA
[0004 ] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0005] U jednom aspektu, obezbeđeni su ćelije, miševi i postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju endogenog mišjeg lokusa imunoglobulina, pri čemu miševi sadrže protein ADAM6a ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša, i/ili protein ADAM6b ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. Endogeni mišji lokus imunoglobulina je lokus teškog lanca imunoglobulina i modifikacija eliminiše endogenu funkciju ADAM6, koja je povezana sa smanjenjem plodnosti kod mužjakā miša.
[0006 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su postupci za pravljenje miševa koji sadrže gensku modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu primena postupka dovodi do mužjakā miša koji sadrže modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina (ili njegovu deleciju), i mužjaci miša ispoljavaju smanjenje plodnosti, i miševi sadrže gensku modifikaciju koja u celosti ili delimično vraća smanjenu plodnost. U različitim izvođenjima, smanjenje plodnosti karakterisano je nemogućnošću spermatozoida mužjakā miša da migriraju iz mišje materice (uterusa) kroz mišji jajovod da bi oplodili mišje jajašce. U različitim izvođenjima, smanjenje plodnosti karakterisano je spermatozoidima koji ispoljavaju migracioni defekt in vivo. Genska modifikacija koja u celosti ili delimično vraća smanjenu plodnost jeste sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0007 ] U jednom izvođenju, genska modifikacija obuhvata zamenu endogenih varijabilnih lokusa teškog lanca imunoglobulina varijabilnim lokusima teškog lanca imunoglobulina druge vrste (npr. nemišjih vrsta). U jednom izvođenju, genska modifikacija obuhvata insertovanje ortolognih varijabilnih lokusa teškog lanca imunoglobulina u endogene varijabilne lokuse teškog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, ta vrsta je čovek. Genska modifikacija obuhvata deleciju endogenog varijabilnog lokusa teškog lanca imunoglobulina u celosti ili delimično, pri čemu delecija dovodi do gubitka endogene funkcije ADAM6. Gubitak endogene funkcije ADAM6 povezan je sa smanjenjem plodnosti kod mužjakā miša.
[0008 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su miševi koji sadrže modifikaciju koja eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 iz endogenog alela ADAM6 tako da mužjaci miša koji imaju modifikaciju ispoljavaju smanjenu plodnost (npr. veoma smanjena sposobnost stvaranja potomstva parenjem), ili su u suštini neplodni, usled elimininacije endogene funkcije ADAM6, pri čemu miševi dalje sadrže ektopičnu sekvencu ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, modifikacija koja eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 jeste modifikacija (npr. insertovanje, delecija, zamena, itd.) u mišjem lokusu imunoglobulina.
[0009 ] U jednom izvođenju, gubitak funkcije ADAM6 obuhvata nesposobnost ili suštinsku nesposobnost miša da proizvede spermatozoide koji mogu putovati iz mišje materice kroz mišji jajovod da bi oplodili jajašce miša. U specifičnom izvođenju, barem oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ćelija spermatozoida proizvedenih u zapremini ejakulata miša nesposobno je za prolaženje kroz jajovod in vivo posle kopulacije i oplođivanje mišje jajne ćelije.
[0010 ] U jednom izvođenju, gubitak funkcije ADAM6 obuhvata nesposobnost obrazovanja ili suštinsku nesposobnost obrazovanja kompleksa ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelija spermatozoida miša. U jednom izvođenju, gubitak funkcije ADAM6 obuhvata sušinsku nesposobnost oplodnje mišjeg jajašceta kopulacijom sa ženkom miša.
[0011 ] U jednom izvođenju, mužjak miša sadrži jedan nemodifikovani endogeni alel ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment na endogenom lokusu ADAM6.
[0012 ] U jednom izvođenju, mužjak miša sadrži ektopičnu mišju sekvencu ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji kodira protein koji daje funkciju ADAM6.
[0013 ] U jednom izvođenju, mužjak miša sadrži sekvencu ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment na lokaciji u mišjem genomu koja je približna lokaciji endogenog mišjeg alela ADAM6, npr. sekvencu 3' krajnjeg V genskog segmenta i 5' početnog D genskog segmenta.
[0014 ] U jednom izvođenju, mužjak miša sadrži sekvencu ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment flankiran ushodno, nishodno, ili ushodno i nishodno (u odnosu na smer transkripcije sekvence ADAM6) od sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni genski segment imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, varijabilni genski segment imunoglobulina je humani genski segment. U jednom izvođenju, varijabilni genski segment imunoglobulina je humani genski segment, i sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment funkcionalan u mišu nalazi se između humanih V genskih segmenata; u jednom izvođenju, miš sadrži dva ili više humanih V genskih segmenata, i sekvenca je u položaju između krajnjeg V genskog segmenta i pretposlednjeg V genskog segmenta; u jednom izvođenju, sekvenca je u položaju koji je posle krajnjeg V genskog segmenta i prvog D genskog segmenta.
[0015 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su genetički modifikovani miševi i ćelije koji sadrže modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu miševi eksprimuju barem deo sekvence teškog lanca imunoglobulina, npr. barem deo humane sekvence, pri čemu miš ima aktivnost ADAM6 koja je funkcionalna kod mužjaka miša. Modifikacija ukida aktivnost ADAM6 kod miša. U jednom izvođenju, miš je modifikovan tako da su oba alelela koji kodiraju aktivnost ADAM6 ili odsutna ili eksprimuju ADAM6 koji u suštini ne funkcioniše tako da podržava normalno parenje kod mužjakā miša. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišjii ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment.
[0016 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su genetički modifikovani miševi i ćelije koji sadrže modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu modifikacija eliminiše aktivnost ADAM6 eksprimovanu iz sekvence ADAM6 lokusa, i pri čemu miš sadrži protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. U različitim izvođenjima, protein ADAM6 ili njegov fragment kodirani su ektopičnom sekvencom ADAM6.
[0017 ] U jednom izvođenju, modifikacija je na prvom alelu teškog lanca imunoglobulina na prvom lokusu i drugom alelu teškog lanca imunoglobulina na drugom lokusu, i funkcija ADAM6 rezultat je ekspresije ektopičnog ADAM6 na neimunoglobulinskom lokusu u germinativnoj liniji miša. U specifičnom izvođenju, neimunoglobulinski lokus je lokus ROSA26. U specifičnom izvođenju, neimunoglobulinski lokus je transkripciono aktivan u reproduktivnom tkivu.
[0018 ] U jednom izvođenju, ADAM6a i/ili ADAM6b ili njihov funkcionalni fragment (fragmenti) operativno je povezan sa promoterom. U jednom izvođenju, promoter je humani promoter. U jednom izvođenju, promoter je mišji promoter ADAM6. U specifičnom izvođenju, promoter ADAM6 obuhvata sekvencu koja se nalazi između prvog kodona prvog gena ADAM6 najbližeg mišjem 5`-najvišeg DHgenskog segmenta i rekombinantne signalne sekvence 5`-najvišeg DHgenskog segmenta, pri čemu je 5` označen u odnosu na smer transkripcije mišjih gena imunoglobulina. U jednom izvođenju, promoter je virusni promoter. U specifičnom izvođenju, virusni promoter je citomegalovirusni (CMV) promoter. U jednom izvođenju, promoter je ubikvitinski promoter.
[0019 ] U jednom izvođenju, promoter je inducibilni promoter. U jednom izvođenju, inducibilni promoter reguliše ekspresiju u nereproduktivnim tkivima. U jednom izvođenju, inducibilni promoter reguliše ekspresiju u reproduktivnim tkivima. U specifičnom izvođenju, ekspresija mišjih sekvenci ADAM6a i/ili ADAM6b ili njihovog funkcionalnog fragmenta (fragmenata) razvojno je regulisana inducibilnim promoterom u reproduktivnim tkivima.
[0020 ] U jednom izvođenju, mišji ADAM6a i/ili ADAM6b izabrani su od ADAM6a SEQ ID NO: 1 i/ili ADAM6b sekvence SEQ ID NO:2. U jednom izvođenju, mišji promoter ADAM6 je promoter SEQ ID NO:3. U specifičnom izvođenju, mišji promoter ADAM6 obuhvata sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO:3 direktno ushodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) prvog kodona ADAM6a i proteže se do kraja SEQ ID NO:3 ushodno od kodirajućeg regiona ADAM6. U još jednom specifičnom izvođenju, promoter ADAM6 je fragment koji se proteže od između oko 5 do oko 20 nukleotida ushodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5 kb, 1 kb, 2 kb ili 3 kb ili više ushodno od start kodona ADAM6a.
[0021 ] U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline obuhvata SEQ ID NO:3 ili njen fragment koji, kada se smesti u miša koji je neplodan ili ima slabu plodnost usled nedostatka ADAM6, poboljšava plodnost ili vraća plodnost do oko plodnosti divljeg tipa. U jednom izvođenju, SEQ ID NO:3 ili njen fragment daje mužjaku miša sposobnost da proizvodi ćeliju spermatozoida koja je sposobna da pređe jajovod ženke miša kako bi oplodila mišje jajašce.
[0022 ] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži deleciju endogene nukleotidne sekvence koja kodira protein ADAM6, zamenu endogenog mišjeg VHgenskog segmenta humanim VHgenskim segmentom, i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0023 ] U jednom izvođenju, miš sadrži lokus teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata deleciju endogene nukleotidne sekvence lokusa imunoglobulina koja obuhvata endogeni gen ADAM6, koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više humanih genskih segmenata imunoglobulina, i pri čemu se ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 nalazi unutar ili direktno pored nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih genskih segmenata imunoglobulina.
[0024 ] U jednom izvođenju, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VHgenskih segmenata nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 nalazi se unutar ili direktno pored nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih VHgenskih segmenata. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih DHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih DHgenskih segmenata na endogenom DHgenskom lokusu. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više JHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih JHgenskih segmenata na endogenom JHgenskom lokusu. U jednom izvođenju, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH, DH, i JHgenskih segmenata i zamenu na endogenim VH, DH, i JHgenskim lokusima humanim VH, DH, i JH, genskim segmentima, pri čemu miš sadrži ektopičnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6. U specifičnom izvođenju, ektopična sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 smeštena je između pretposlednjeg 3’-najvišeg VHgenskog segmenta prisutnih humanih VHgenskih segmenata, i krajnjeg 3’ VHgenskog segmenta prisutnih humanih VHgenskih segmenata. U specifičnom izvođnju, miš sadrži delecije svih ili u suštini svih mišjih VHgenskih segmenata i zamenu svim ili u suštini svim humanim VHgenskim segmentima, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 smeštena je nishodno od humanog genskog segmenta VH1-2 i ushodno od humanog genskog segmenta VH6-1.
[0025 ] U specifičnom izvođenju, miš sadrži zamene svih ili u suštini svih endogenih VHgenskih segmenata nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 nalazi se unutar ili direktno pored nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih VHgenskih segmenata.
[0026 ] U jednom izvođenju, ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein ADAM6 prisutna je na transgenu u genomu miša. U jednom izvođenju, ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji protein prisutna je ekstrahromozomski u mišu.
[0027 ] U jednom aspektu, obezbeđen je genetički modifikovan miš, pri čemu miš sadrži funkcionalno isključen gen lakog lanca imunoglobulina, i još sadrži zamenu jednog ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina jednim ili većim brojem humanih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, pri čemu mišu nedostaje funkcionalni endogeni lokus ADAM6, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimuje mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0028 ] U jednom aspektu, obezbeđen je genetički modifikovan miš, pri čemu miš sadrži humani genski segment varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina na endogenom mišjem genskom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, mišu nedostaje endogena funkcionalana sekvenca ADAM6 na endogenom mišjem genskom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimuje mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0029 ] U jednom izvođenju, ektopična nukleotidna sekvenca koja eksprimuje mišji protein ADAM6 jeste ekstrahromozomska. U jednom izvođenju, ektopična nukleotidna sekvenca koja eksprimuje mišji protein ADAM6 integrisana je u jedan ili više lokusa u genomu miša. U specifičnom izvođenju, jedan ili više lokusa uključuju lokus imunoglobulina.
[0030 ] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži modifikaciju na endogenim alelima ADAM6.
[0031 ] Modifikacija čini miša nesposobnim za ekprimovanje funkcionalnog proteina ADAM6 iz svakog endogenog alela ADAM6, i miš sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6.
[0032 ] U jednom izvođenju, miševi sadrže ektopične sekvence ADAM6 koje se nalaze unutar 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više kb ushodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa teškog lanca) od mišje sekvence konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, ektopična sekvenca ADAM6 nalazi se na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina (npr., u intergenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i D genskog segmenta, između D i J genskog segmenta, itd.). U specifičnom izvođenju, ektopična sekvenca ADAM6 nalazi se unutar intergenske sekvence od 90 do 100 kb između krajnjeg mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta. U drugom specifičnom izvođenju, endgodena intergenska V-D sekvenca od 90 do 100 kb je uklonjena i ektopična sekvenca ADAM6 smeštena je između krajnjeg V i prvog D genskog segmenta.
[0033 ] U jednom aspektu, obezbeđena je pluripotentna, indukovana pluripotentna, ili totipotentna ćelija izvedena iz miša kao što je opisano ovde. U specifičnom izvođenju, ćelija je mišja embrionska matična (ES) ćelija.
[0034 ] U jednom aspektu, obezbeđeno je tkivo izvedeno iz miša kao što je opisano ovde. U jednom izvođenju, tkivo se izvodi iz slezine, limfnog čvora ili koštane srži miša kao što je opisano ovde.
Aspekti koji ne čine deo pronalaska:
[0035 ] U jednom aspektu, obezbeđena je nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region imunoglobulina napravljena u mišu kao što je opisano ovde.
[0036 ] U jednom aspektu, obezbeđena je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina ili lakog lanca imunoglobulina antitela napravljena u mišu kao što je opisano ovde.
[0037 ] U jednom aspektu, obezbeđena je nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina ili lakog lanca imunoglobulina koja kodira varijabilni region antitela napravljena u mišu kao što je opisano ovde.
[0038 ] U jednom aspektu, obezbeđeni su antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen (npr., Fab, F(ab)2, scFv) napravljeni u mišu kao što je opisano ovde. U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za pravljenje genetički modifikovanog miša, koji obuhvata zamenjivanje jednog ili više genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina ushodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina) od endogenog lokusa ADAM6 miša jednim ili većim brojem humanih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina, i zamenjivanje jednog ili više genskih segmenata imunoglobulina nishodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina) od lokusa ADAM6 miša jednim ili većim brojem humanih genskih segmenata teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih genskih segmenata imunoglobulina koji zamenjuju jedan ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulina ushodno od endogenog lokusa ADAM6 miša uključuju V genske segmente. U jednom izvođenju, humani genski segmenti imunoglobulina koji zamenjuju jedan ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulina nishodno od endogenog lokusa ADAM6 miša uključuju V i D genske segmente. U jednom izvođenju, jedan ili više genskih segmenata imunoglobulina koji zamenjuju jedan ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulina nishodno od endogenog lokusa ADAM6 uključuju J genske segmente. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih genskih segmenata imunoglobulina koji zamenjuju jedan ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulina nishodno od endogenog lokusa ADAM6 miša uključuju D i J genske segmente. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih genskih segmenata imunoglobulina koji zamenjuju jedan ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulina nishodno od endogenog lokusa ADAM6 miša uključuju V, D i J genske segmente.
[0039 ] U jednom izvođenju, jedan ili više genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina ushodno i/ili nishodno od gena ADAM6 zamenjuju se u pluripotentnoj, indukovanoj pluripotentnoj ili totipotentnoj ćeliji da bi se obrazovala genetički modifikovana progenitorska ćelija, genetički modifikovana progenitorska ćelija uvodi se u domaćina, i domaćin koji sadrži genetički modifikovanu progenitorsku ćeliju uvodi se u gestaciju da bi se formirao miš koji sadrži genom izveden iz genetički modifikovane progenitorske ćelije. U jednom izvođenju, domaćin je embrion. U specifičnom izvođenju, domaćin se bira od miša u stadijumu pre morule (npr. stadijum sa 8 ili 4 ćelije), tetraploidnog embiona, agregata embrionskih ćelija, ili blastocista.
[0040 ] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za dobijanje genetički modifikovanog miša, koji obuhvata zamenu mišje nukleotidne sekvence koja obuhvata mišji genski segment imunoglobulina i mišju neukelotidnu sekvencu ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili fragment funkcionalan u mužjaku miša) sekvencom koja obuhvata humani genski segment imunoglobulina da bi se obrazovao prvi himerni lokus, zatim insertovanje sekvence koja obuhvata mišju sekvencu za kodiranje ADAM6 (ili sekvencu koja kodira njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) u sekvencu koja obuhvata humani genski segment imunoglobulna da bi se obrazovao drugi himerni lokus.
[0041] U jednom izvođenju, drugi himerni lokus obuhvata humani varijabilni (VH) genski segment teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, drugi himerni lokus obuhvata humani varijabilni (VL) genski segment lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, drugi himerni lokus obuhvata humani VH genski segment ili humani VL genski segment koji su u operativnoj vezi sa humanim DH genskim segmentom i humanim JH genskim segmentom. U daljem specifičnom izvođenju, drugi himerni lokus je u operativnoj vezi sa trećim himernim lokusom koji obuhvata humanu CH1 sekvencu, ili humanu CH1 i humanu zglobnu sekvencu, spojenu sa mišjom CH2 CH3 sekvencom.
[0042] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja obuhvata mišji lokus ili sekvencu ADAM6 kako bi se dobio plodan mužjak miša, pri čemu upotreba obuhvata parenje miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja obuhvata mišji lokus ili sekvencu ADAM6 sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni mišji lokus ili sekvenca ADAM6, i dobijanje potomka koji je ženka sposobna da dobija potomstvo koje ima ektopični lokus ili sekvencu ADAM6 ili koji je mužjak koji sadrži ektopični lokus ili sekvencu ADAM6, i mužjak ispoljava plodnost koja je približno ista kao plodnost koju ispoljavaju mužjaci miša divljeg tipa.
[0043] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se dobila nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina.
[0044] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se dobio potpuno humani Fab ili potpuno humani F(ab)2.
[0045] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se dobila imortalizovana ćelijska linija.
[0046] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se dobio hibridom ili kvadrom.
[0047] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se dobila biblioteka faga koja sadrži varijabilne regione humanog teškog lanca i varijabilne regione humanog lakog lanca.
[0048] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se stvorila sekvenca varijabilnog regiona za pravljenje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizovanje miša kao što je opisano ovde antigenom od interesa, (b) izolovanje limfocita iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje limfocita jednom ili većem broju obeleženih antitela, (d) identifikovanje limfocita koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) umnožavanje jedne ili više aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona iz limfocita čime se stvara sekvenca varijabilnog regiona.
[0049] U jednom izvođenju, limfocit je izveden iz slezine miša. U jednom izvođenju, limfocit je izveden iz limfnog čvora miša. U jednom izvođenju, limfocit je izveden iz koštane srži miša.
[0050] U jednom izvođenju, obeleženo antitelo je antitelo konjugovano sa fluoroforom. U jednom izvođenju, jedno ili više antitela konjugovanih sa fluoroforom izabrano je od IgM, IgG i/ili njihove kombinacije.
[0051] U jednom izvođenju, limfocit je B ćelija.
[0052] U jednom izvođenju, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca. U jednom izvođenju, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona obuhvata sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca. U specifičnom izvođenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca je sekvenca varijabilnog regiona κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona obuhvataju sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.
[0053] U jednom izvođenju, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se stvorila sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizovanje miša kao što je opisano ovde antigenom od interesa, (b) izolovanje slezine iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz slezine jednom ili većem broju obeleženih antitela, (d) identifikovanje B limfocita iz (c) koji je sposoban da se vezuje za antigen od interesa, i (e) umnožavanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lanca iz B limfocita čime se stvara sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.
[0054] U jednom izvođenju, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se stvorila sekvenca varijabilnog regona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizovanje miša kao što je opisano ovde antigenom od interesa, (b) izolovanje jednog ili više limfnih čvorova iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz jednog ili više limfnih čvorova jednom ili većem broju antitela, (d) identifikovanje B limfocita iz (c) koji je sposoban da se vezuje za antigen od interesa, i (e) umnožavanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se stvaraju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.
[0055] U jednom izvođenju, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se stvorila sekvenca varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja obuhvata (a) imunizovanje miša kao što je opisano ovde antigenom od interesa, (b) izolovanje koštane srži iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz koštane srži jednom ili većem broju obeleženih antitela, (d) identifikovanje B limfocita iz (c) koji je sposoban da se vezuje za antigen od interesa, i (e) umnožavanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se stvaraju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca. U različitim izvođenjima, jedno ili više obeleženih antitela biraju se od IgM, IgG i/ili njihove kombinacije.
[0056] U različitim izvođenjima, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se stvorila sekvenca varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja dalje obuhvata spajanje umnoženih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca sa sekvencama konstantnog regiona humanog teškog i lakog lanca, eksprimovanje spojenih sekvenci teškog i lakog lanca u ćeliji, i regenerisanje eksprimovanih sekvenci teškog i lakog lanca čime se stvara humano antitelo.
[0057] U različitim izvođenjima, humani konstantni regioni teškog lanca biraju se od IgM, IgD, IgA, IgE i IgG. U različitim specifičnim izvođenjima, IgG se bira od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U različitim izvođenjima, humani konstantni region teškog lanca obuhvata CH1, zglob, CH2, CH3, CH4, ili njihovu kombinaciju. U različitim izvođenjima, konstantni region lakog lanca je κ konstantni region imunoglobulina. U različitim izvođenjima, ćelija se bira od HeLa ćelije, DU145 ćelije, Lncap ćelije, MCF-7 ćelije, MDA-MB-438 ćelije, PC3 ćelije, T47D ćelije, THP-1 ćelije, U87 ćelije, SHSY5Y (humani neuroblastom) ćelije, Saos-2 ćelije, Vero ćelije, CHO ćelije, GH3 ćelije, PC12 ćelije, humane ćelije retine ™
(npr., PER.C6 ćelije), i MC3T3 ćelije. U specifičnom izvođenju, ćelija je CHO ćelija.
[0058] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za stvaranje reverznih himernih glodarsko-humanih antitela specifičnih protiv antigena od interesa, koji obuhvata korake imunizovanja miša kao što je opisano ovde anitegom, izolovanje barem jedne ćelije iz miša koji proizvodi reverzno himerno mišjehumano antitelo specifično protiv antigena, kultivisanje barem jedne ćelije koja proizvodi reverzno himerno mišje-humano antitelo specifično protiv antigena, i dobijanje navedenog antitela.
[0059] U jednom izvođenju, reverzno himerno mišje-humano antitelo obuhvata humani varijabilni domen teškog lanca spojen sa mišjim ili pacovskim konstantnim genom teškog lanca, i humani varijabilni domen lakog lanca spojen sa mišjim ili pacovskim ili humanim konstantnim genom lakog lanca.
[0060] U jednom izvođenju, kultivisanje barem jedne ćelije koja proizvodi reverzno himerno glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena izvodi se na barem jednoj ćeliji hibridoma stvorenoj iz barem jedne ćelije izolovane iz miša.
[0061] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za stvaranje potpuno humanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji obuhvata korake imunizovanja miša kao što je opisano ovde antigenom, izolovanje barem jedne ćelije iz miša koji proizvodi reverzno himerno glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena, stvaranje barem jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo izvedeno iz reverznog himernog glodarsko-humanog anitela specifičnog protiv antigena, i kultivisanje barem jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo, i dobijanje navedenog potpuno humanog antitela.
[0062] U različitim izvođenjima, barem jedna ćelija izolovana iz miša koji proizvodi reverzno himerno glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena jeste splenocit ili B ćelija.
[0063] U različitim izvođenjima, antitelo je monoklonsko antitelo.
[0064] U različitim izvođenjima, imunizacija antigenom od interesa izvodi se pomoću proteina, DNK, kombinacije DNK i proteina, ili ćelija koje eksprimuju antigen.
[0065] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se dobila sekvenca nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region imunoglobulina ili njegov fragment. U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline upotrebljava se za dobijanje humanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen. U jednom izvođenju, miš se upotrebljava za dobijanje proteina koji se vezuje za antigen koji se bira od antitela, multispecifičnog antitela (npr., bispecifičnog antitela), scFv, bispecifičnog scFv, diatela, tiratela, tetratela, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (tj., proteina koji vezuje antigen sa dvostrukim varijabilnim domenom), SVD (tj., proteina koji vezuju antigen sa jednim varijabilnim domenom), ili bispecifičnog pokretača T ćelije (BiTE).
[0066] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde da bi se ektopična sekvenca ADAM6 uvela u miša kome nedostaje funkcionalna endogena mišja sekvenca ADAM6, pri čemu upotreba obuhvata parenje miša kao što je opisano ovde sa mišem kome nedostaje funkcionalna endogena mišja sekvenca ADAM6.
[0067] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba genskog materijala iz miša kao što je opisano ovde da bi se dobio miš koji ima ektopičnu sekvencu ADAM6. U jednom izvođenju, upotreba obuhvata nuklearni transfer pomoću nukleusa ćelije miša kao što je opisano ovde. U jednom izvođenju, upotreba obuhvata kloniranje ćelije miša kao što je opisano ovde da bi se proizvela životinja koja potiče iz te ćelije. U jednom izvođenju, upotreba obuhvata korišćenje spermatozoida ili jajašceta miša kao što je opisano ovde u postupku dobijanja miša koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6.
[0068] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za pravljenje plodnog mužjaka miša koji sadrži modifikovan lokus teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata oplodnju prve mišje germinativne ćelije koja sadrži modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina drugom mišjom germinativnom ćelijom koja sadrži gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša; formiranje oplođene ćelije; omogućavanje da se oplođena ćelija razvije u embrion; i uvođenje u gestaciju embriona u surogat majci da bi se dobio miš.
[0069] U jednom izvođenju, oplodnja se postiže parenjem mužjaka miša i ženke miša. U jednom izvođenju, ženka miša sadrži gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment. U jednom izvođenju, mužjak miša sadrži gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment.
[0070] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba sekvence nukleinske kiseline koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment odgovarajućeg proteina ADAM6 za vraćanje ili poboljšavanje plodnosti miša čiji genom obuhvata modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu modifikacija smanjuje ili eliminiše endogenu funkciju ADAM6.
[0071] U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline integrisana je u genom miša na ektopičnom položaju. U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline integrisana je u genom miša na endogenom lokusu imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, endogeni lokus imunoglobulina je lokus teškog lanca. U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline integrisana je u genom miša na položaju koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina.
[0072] U jednom aspektu, obezbeđena je upotreba miša kao što je opisano ovde za proizvodnju leka (npr., proteina koji se vezuje za antigen), ili za proizvodnju sekvence koja kodira varijabilnu sekvencu leka (npr., proteina koji se vezuje za antigen), za lečenje humane bolesti ili poremećaja.
SAŽET OPIS SLIKA
[0073]
SL. 1A prikazuje opštu ilustraciju, koja nije u razmeri, direktne genomske zamene od oko tri magabaze (Mb) mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina (zatvoreni simboli) sa oko jednom megabazom (Mb) humanog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina (otvoreni simboli).
SL. 1B prikazuje opštu ilustraciju, koja nije u razmeri, direktne genomske zamene od oko tri megabaze (Mb) mišjeg varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina (zatvoreni simboli) sa oko 0.5 megabaza (Mb) prvog, ili proksimalnog, ili dva gotovo identična ponavljanja humanog varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina (otvoreni simboli).
SL. 2A prikazuje detaljnu ilustraciju, koja nije u razmeri, tri početna koraka (A–C) za direktnu genomsku zamenu mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina koja dovodi do delecije svih mišjih VH, DHand JHgenskih segmenata i zamene sa tri humana VH, svim humanim DHi JHgenskim segmentima. Prikazan je ciljni vektor za prvo insertovanje humanih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina (3hVHBACvec) sa 5’ homolognim krakom od 67 kb, selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), mestom za rekombinaciju specifičnu za mesto (otvoreni trougao), humanim genomskim fragmentom od 145 kb i 3’ mišjim homolognim krakom od 8 kb. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) genski segmenti imunoglobulina, dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesta rekombinacije specifične za mesto (otvoreni trouglovi) insertovani u naredne ciljne vektore.
SL. 2B prikazuje detaljnu ilustraciju, koja nije u razmeri, šest dodatnih koraka (D–I) za direktnu genomsku zamenu mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina koja dovodi do insertovanja 77 dodatnih humanih VHgenskih segmenata i uklanjanja krajnje selekcione kasete. Ciljni vektor za insertovanje dodatnih humanih VHgenskih segmenata (18hVHBACvec) do početnog insertovanja humanih genskih segmenata teškog lanca (3hVH-CRE hibridni alel) prikazan je sa 5’ mišjim homolognim krakom od 20 kb, selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), humanim genomskim fragmentom od 196 kb i humanim homolognim krakom od 62 kb koji se preklapa sa 5’ krajem početnog inserta humanih genskih segmenata teškog lanca koji je prikazan sa mestom rekombinacije specifične za mesto (otvoreni trougao) koje se nalazi 5’ do humanih genskih segmenata. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) genski segmenti imunoglobulina i dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) insertovani pomoću narednih ciljnih vektora.
SL. 2C prikazuje detaljnu ilustraciju, koja nije u razmeri, tri početna koraka (A–C) za direktnu genomsku zamenu mišjeg varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina koja dovodi do delecije svih mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata (Igκ-CRE hibridni alel). Prikazane su selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesta rekombinacije specifične za mesto (otvoreni trouglovi) insertovana iz ciljnih vektora.
SL. 2D prikazuje detaljnu ilustraciju, koja nije u razmeri, pet dodatnih koraka (D–H) za direktnu genomsku zamenu mišjeg varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina koja dovodi do insertovanja svih humanih Vκ i Jκ genskih segmenata proksimalnog ponavljanja i delecije krajnje selekcione kasete (40hVκdHyg hibridni alel). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) genski segmenti imunoglobulina i dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) insertovane pomoću narednih ciljnih vektora.
SL. 3A prikazuje opštu ilustraciju, koja nije u razmeri, strategije skrininga koja uključuje lokacije setova kvantitativnih PCR (qPCR) prajmera/sondi za detektovanje insertovanja humanih genskih sekvenci teškog lanca i gubitka mišjih genskih sekvenci teškog lanca u ciljanim embrionskim matičnim (ES) ćelijama. Strategija skrininga u ES ćelijama i miševima za prvo humano insertovanje teškog gena prikazana je sa setovima qPCR prajmera/sondi za deletirani region (sonde C i D za „gubitak“), insertovani region (sonde G i H za „hlgH“) i flankirajuće regione (tj. koji se nalaze bočno sa strana) (sonde A, B, E i F za „zadržavanje“) na nemodifikovanom mišjem hromozomu (gornji deo) i pravilno ciljanom hromozomu (donji deo).
SL. 3B prikazuje reprezentativno izračunavanje uočenog broja kopija sonde u roditeljskim ES ćelijama za prvo insertovanje humanih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina. Uočen broj kopija sonde za sonde A kroz F izračunat je kao 2/2ΔΔCt. ΔΔCt je izračunat kao ave[ΔCt(uzorak) -medΔCt(kontrola)] gde je ΔCt razlika u Ct između testiranih i referentnih sondi (između 4 i 6 referentnih sondi zavisno od testa). Termin medΔCt(kontrola) je medijana ΔCt višestrukih (>60) neciljanih uzoraka DNK iz roditeljskih ES ćelija. Svaki modifikovani klon ES ćelije testiran je u šest primeraka. Da bi se izračunali brojevi kopija sondi G i H za IgH u roditeljskim ES ćelijama, smatralo se da te sonde imaju broj kopija od 1 u modifikovanim ES ćelijama i upotrebljen je maksimalan Ct od 35 premda nije uočeno umnožavanje.
SL. 3C prikazuje reprezentativno izračunavanje broja kopija za četiri miša svakog genotipa izračunato upotrebljavajući samo sonde D i H. Divlji tip miša: WT miševi; Miševi heterozigotni za prvo insertovanje humanih genskih segmenata imunoglobulina; HET miševi; Miševi homozigotni za prvo insertovanje humanih genskih segmenata imunoglobulina: Homo miševi.
SL.4A prikazuje detaljnu ilustraciju, koja nije u razmeri, tri koraka korišćena za konstruisanje 3hVH BACvec pomoću bakterijske homologne rekombinacije (BHR). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) genski segmenti imunoglobulina, selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesta rekombinacije specifična za mesto (otvoreni trouglovi) insertovana iz ciljnih vektora.
SL.4B prikazuje gel elektroforezu u pulsnom polju (PFGE) tri BAC klona (B1, B2 i B3) nakon digestije sa Notl. Markeri M1, M2 i M3 su niskog opsega, srednjeg opsega i lambda stepenasti PFG markeri, tim redom (New England BioLabs, Ipswich, MA).
SL.5A prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, sekvencijalnih modifikacija mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina sa povećanom količinom humanih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina. Homozigotni miševi napravljeni su iz svakog od tri stadijuma humanizacije teškog lanca. Otvoreni simboli ukazuju na humanu sekvencu; zatvoreni simboli ukazuju na mišju sekvencu.
SL.5B prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, sekvencijalnih modifikacija mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina sa povećanom količinom humanih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina. Homozigotni miševi napravljeni su iz svakog od tri različita stadijuma humanizacije κ lakog lanca. Otvoreni simboli ukazuju na humanu sekvencu; zatvoreni simboli ukazuju na mišju sekvencu.
SL. 6 prikazuje FACS tačkaste dijagrame populacija B ćelija kod miševa divljeg tipa i ®
VELOCIMMUNE humanizovanih miševa. Ćelije iz slezine (gornji red, treći red odozgo i donji red) ili iz preponskih (ingvinalnih) limfinih čvorova (drugi red odozgo) miševa divljeg tipa (wild type –
® ® ®
wt), VELOCIMMUNE 1 (V1), VELOCIMMUNE 2 (V2) ili VELOCIMMUNE 3 (V3) obojene su za B ćelije koje eksprimuju površinski IgM (gornji red, i drugi red odozgo), površinski imunoglobulin koji sadrži bilo κ ili λ lake lance (treći red odozgo) ili površinski IgM specifičnih haplotipova (donji red), i populacije odvojene pomoću FACS.
SL. 7A prikazuje reprezentativne sekvence CDR3 teškog lanca nasumično izabranih ®
VELOCIMMUNE antitela oko VH-DH-JH(CDR3) spoja, koje pokazuju spojnu raznolikost i nukleotidne adicije. Sekvence CDR3 teškog lanca grupisane su prema upotrebi DH genskog segmenta, čija je germinativna linija obezbeđena iznad svake grupe podebljanim slovima. VH genski segmenti za svaku sekvencu CDR3 teškog lanca navedeni su u zagradama na 5’ kraju svake sekvence (npr., 3-72 je humani VH3-72). JHgenski segmenti za svaki CDR3 teškog lanca navedeni su u zagradama na 3’ kraju svake sekvence (npr., 3 je humani JH3). SEQ ID NOs za svaku prikazanu sekvencu dati su kao što sledi odozgo nadole: SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ IDNO:36; SEQ ID NO:37; SEQIDNO:38; SEQIDNO:39.
® SL.7B prikazuje reprezentativne sekvence CDR3 lakog lanca nasumično izabranih VELOCIMMUNE antitela oko Vκ-JκD (CDR3) spoja, koje pokazuju spojnu raznolikost i nukleotidne adicije. Vκ genski segmenti za svaku sekvencu CDR3 lakog lanca navedeni su u zagradama na 5’ kraju svake sekvence (npr., 1-6 je humani Vκ1-6). Jκ genski segmenti za svaki CDR3 lakog lanca navedeni su u razgradama na 3’ kraju svake sekvence (npr., 1 je humani Jκ1). SEQ ID NOs za svaku prikazanu sekvencu date su kao što sledi odozgo nadole: SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:58.
® SL. 8 prikazuje učestalosti somatskih hipermutacija teških i lakih lanaca VELOCIMMUNE antitela ocenjenih (nakon poravnavanja sa odgovarajućim sekvencama germinativne linije) kao procenat sekvenci izmenjenih na svakom nukleotidu (Nt; leva kolona) ili položaja aminokiselina (AA; desna kolona) među setovima od 38 (neimunizovani IgM), 28 (neimunizovani IgG), 32 (neimunizovani Igκ iz IgG), 36 (imunizovani IgG) ili 36 (imunizovani Igκ iz IgG) sekvenci. Osenčeni stupci ukazuju na lokacije CDR regiona.
SL. 9A prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgM i IgG izotipove kod miševa divljeg tipa ®
(otvoreni stupci) ili VELOCIMMUNE miševa (zatvoreni stupci).
SL. 9B prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgA izotip kod miševa divljeg tipa (otvoreni ®
stupci) ili VELOCIMMUNE miševa (zatvoreni stupci).
SL. 9C prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgE izotip kod miševa divljeg tipa (otvoreni ®
stupci) ili VELOCIMMUNE miševa (zatvoreni stupci).
SL. 10A prikazuje antigen-specifične IgG titre naspram interleukin-6 receptora (IL-6R) seruma iz ®
sedam VELOCIMMUNE (VI) i pet miševa divljeg tipa (WT) nakon dve (krvarenje 1) ili tri (krvarenje 2) runde imunizacije ektodomenom IL-6R.
® SL. 10B prikazuje anti-IL-6R-specifični IgG izotip-specifične titre za sedam VELOCIMMUNE (VI) miševa i pet miševa divljeg tipa (WT).
SL. 11A prikazuje afinitetnu distribuciju monoklonskih antitela receptora anti-interleukin-6
®
stvorenih u VELOCIMMUNE miševima.
SL.11B prikazuje antigen-specifično blokiranje monoklonskih antitela receptora anti-interleukin-6
®
stvorenih u VELOCIMMUNE (VI) i miševima divljeg tipa (WT).
SL.12 prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, mišjih gena ADAM6a i ADAM6b u mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina. Ciljni vektor (mADAM6 ciljni vektor) upotrebljen za insertovanje mišeg ADAM6a i ADAM6b u humanizovani endogeni lokus teškog lanca prikazan je sa selekcionom kasetom (HYG: higromicin) flankiranom mestima rekombinacije specifične za mesto (Frt) uključujući konstruisana restrikciona mesta na 5’ i 3’ krajevima.
SL. 13 prikazuje šematsku ilustraciju, koja nije u razmeri, humanog pseudogena ADAM6 (hADAM6Ψ) koji se nalazi između varijabilnih genskih segmenata 1-2 (VH1-2) i 6-1 (VH6-1) humanog teškog lanca. Ciljni vektor za bakterijske homologne rekombinacije (hADAM6Ψ ciljni vektor) za deletiranje humanog pseudogena ADAM6 i insertovanje jedinstvenih restrikcionih mesta u lokus humanog teškog lanca prikazan je sa selekcionom kasetom (NEO: neomicin) flankiranom mestima rekombinacije specifične za mesto (loxP) uključujući konstruisana restrikciona mesta na 5’ i 3’ krajevima. Prikazana je ilustracija, koja nije u razmeri, dobijenog ciljanog lokusa humanizovanog teškog lanca koji sadrži genomski fragment koji kodira za mišje gene ADAM6a i ADAM6b uključujući selekcionu kasetu flankiranu mestima rekombinacije specifične za mesto.
SL. 14A prikazuje FACS konturne dijagrame limfocita ograđenih (gated) po singletima za površinsku ekspresiju IgM i B220 u koštanoj srži za miša homozigotnog za varijabilne genske lokuse
/+ /+
humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miša homozigotnog za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji /+ res /+ int high kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ). Procenat nezrelih (B220 lgM ) i zrelih (B220 IgM ) B ćelija naveden je u svakom konturnom dijagramu.
int high
SL. 14B prikazuje ukupan broj nezrelih (B220 IgM ) i zrelih (B220 IgM ) B ćelija u koštanoj srži izolovanoj iz butnih kosti (femura) miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog
/+ /+
teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira /+ res /+
mišje gene ADAM6 (W A6 κ ).
SL. 15A prikazuje FACS konturne dijagrame B ćelija ograđenih po CD19 za površinsku ekspresiju c-kita i CD43 u koštanoj srži za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog /+ /+
i κ lakog lanca (H κ ) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6 /+ res /+ -(H A6 κ ). Procenat pro-B (CD19 CD43 ckit ) i pre-B (CD19 CD43ckit) ćelija naveden je u gornjem desnom i donjem levom kvadrantu, tim redom, svakog kontrunog dijagrama.
- -SL. 15B prikazuje ukupan broj pro-B ćelija (CD19 CD43 ckit ) i pre-B ćelija (CD19 CD43ckit) u koštanoj srži izolovanoj iz butnih kosti miševa homogizotnih za varijabilne genske lokuse humanog
/+ /+
teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira /+ res /+
mišje gene ADAM6 (H A6 κ ).
SL.16A prikazuje FACS konturne dijagrame limfocita ograđenih po singletima za površinsku ekspresiju CD19 i CD43 u koštanoj srži za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse
/+ /+
humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji /+ res /+ - int kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ). Procenat nezrelih B (CD19CD43), pre-B (CD19CD43 ) i
pro-B (CD19CD43) ćelija naveden je u svakom konturnom dijagramu.
- int
SL.16B prikazuje histograme nezrelih B (CD19CD43) i pre-B (CD19CD43 ) ćelija u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca /+ /+
(H κ ) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog /+ res /+ lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ).
SL.17A prikazuje FACS konturne dijagrame limfocita ograđenih po singletima za površinsku ekspresiju CD19 i CD3 u splenocitima za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse
/+ /+
humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji /+ res /+ - -
kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ). Procenat B (CD19CD3) i T (CD19CD3) ćelija naveden je u svakom konturnom dijagramu.
SL.17B prikazuje FACS konturne dijagrame za B ćelije ograđene po CD19 za površinsku ekspresiju lakog lanca Igλ i Igκ u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i /+ /+
humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene /+ res /+ □
ADAM6 (W A6 κ ). Procenat B ćelija sa Igλ (gornji levi kvadrant) i Igκ (donji desni kvadrant) naveden je u svakom konturnom dijagramu.
SL.17C prikazuje ukupan broj B ćelija sa CD19 u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske
/+ /+
lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski /+ res /+
fragment koji kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ).
SL.18A prikazuje FACs konturne dijagrame B ćelija ograđenih po CD19 za površinsku ekspesiju IgD i IgM u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ /+ /+
lakog lanca (H κ ) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6 /+ res /+ high int
(H A6 κ ). Procenat zrelih B ćelija (CD19IgD IgM ) naveden je za svaki konturni dijagram. Strelica na desnom konturnom dijagramu ilustruje poroces sazrevanja za B ćelije u odnosu na površinsku ekspresiju IgM i IgD.
SL.18B prikazuje ukupan broj B ćelija u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse
/+ /+
humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji /+ res /+ high int kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ) tokom sazrevanja od CD19lgM lgD do int high
CD19+IgM IgD .
SL.19 prikazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje miševa homozigotnih za varijabilne genske
/+ /+
lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ; n=5) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski /+ res /+
fragment koji kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ; n=5) koji su imunizovni humanim površinskim ćelijskim receptorom (Antigen A).
SL.20 prikazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje miševa homozigotnih za varijabilne genske
/+ /+
lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ; n=5) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski /+ res /+
fragment koji kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ; n=10) koji su imunizovani humanim antitelom specifičnim za humani receptor tirozin-protein kinazu (Antigen B).
SL.21 prikazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje miševa homozigotnih za varijabilne genske /+ /+
lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ; n=12) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji /+ res /+
genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ; n=12) koji su imunizovani izlučenim humanim proteinom koji funkcioniše u regulaciji signalnih puteva TGF-β (Antigen C). SL.22 prikazuje titar antitela za prvo i drugo krvarenje miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji /+ res /+
kodira mišje gene ADAM6 (H A6 κ ; n=12) koji su imunizovani humanim receptorom tirozin kinazom (Antigen D).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0074] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
[0075] Osim ako nije definisano drugačije, svi termini I fraze koji se upotrebljavaju ovde uključuju značenja koja su ti termini i fraze zadobili u oblasti tehnike, osim ako suprotno nije jasno naznačeno ili jasno očigledno iz konteksta u kome se termin ili fraza upotrebljavaju.
[0076] Fraza „suštinski“ ili „u suštini“, kada se upotrebljava tako da se odnosi na količinu genskih segmenata (npr., „u suštini svi“ V genski segmenti) uključuje i funkcionalne i nefunkcionalne genske segmente i uključuje, u različitim izvođenjima, npr., 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, ili 99% ili više svih genskih segmenata; u različitim izvođenjima, „u suštini svi“ genski segmenti uključuju, npr., barem 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% funkcionalnih (tj. ne-pseudogenih) genskih segmenata.
[0077] Termin „zamena“ uključuje smeštanje sekvence DNK u genom ćelije na takav način da se zamenjuje sekvenca unutar genoma heterolognom sekvencom (npr., humana sekvenca u mišu), na lokusu genomske sekvence. Tako smeštena sekvenca DNK može uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne DNK upotrebljene za dobijanje tako smeštene sekvence (npr., promotere, pojačivače, 5’- ili 3’-neprevedene regione, odgovarajuće rekombinacione signalne sekvence, itd.). Na primer, u različitim izvođenjima, zamena je supstitucija endogene sekvence za heterolognu sekvencu što dovodi do proizvođenja genskog proizvoda iz tako smeštene sekvence DNK (koja obuhvata hteterolognu sekvencu), ali ne do ekspresije endogene sekvence; zamena je zamena endogene genomske sekvence sekvencom DNK koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom genomskom sekvencom (npr., endogena genomska sekvenca kodira gen ili domen imunoglobulina, i fragment DNK kodira jedan ili više gena ili domena imunoglobulina). U različitim izvođenjima, endogeni gen ili njegov fragment zamenjen je odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, homolog ili u suštini identičan ili isti po strukuturi i/ili funkciji, kao endogeni gen ili njegov fragment koji je zamenjen.
[0078] Miš je kao genski model bio veoma unapređen transgenim i „nokaut“ tehnologijama, koje su omogućile studije efekata direktne prekomerne ekspresije ili delecije specifičnih gena. Uprkos svim tim prednostima, miš i dalje predstavlja genetičke prepreke koje ga čine nesavršenim modelom za humane bolesti i nesavršenom platformom za testiranje humanih terapijskih sredstava ili njihovo pravljenje. Prvo, premda oko 99% humanih gena ima mišji homolog (Waterston et al. 2002, Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature 420:520-562), potencijalna terapijska sredstva često ne uspevaju da reguju unakrsno, ili neadekvatno reaguju unakrsno, sa mišjim ortolozima predviđenih humanih meta. Da bi se izbegao taj problem, izabrani ciljani geni mogu biti „humanizovani“, to jest, mišji gen se može eliminisati i zameniti odgovarajućom humanom ortolognom genskom sekvencom (npr., US 6,586,251, US 6,596,541 i US 7,105,348). U početku, napori da se humanizuju mišji geni strategijom „nokaut-plus-transgena humanizacija“ podrazumevali su ukrštanje miša koji nosi deleciju (tj., nokaut) endogenog gena sa mišem koji nosi nasumično integrisan humani transgen (videti, npr., Bril et al., 2006, Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al., 2006, Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al., 2006, A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al., 2006, Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gammaand CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Ali, ti napori bili su ometani ograničenjima veličine; konvencionalne „nokaut“ tehnologije nisu bile dovoljne za direktno zamenjivanje velikih mišjih gena njihovim velikim humanim genomskim pandanima. Neposredan pristup direktne homologne zamene, u kojoj se endogeni mišji gen direktno zamenjuje humanim odgovarajućim genom na istoj preciznoj genskoj lokaciji mišjeg gena (tj., na endogenom mišjem lokusu), retko je pokušavano zbog tehničkih teškoća. Do sada, napori u direktnom zamenjivanju uključivali su složene i teške procedure, čime se ograničavala dužina genskog materijala kojim se moglo rukovati i preciznost sa kojom se moglo raditi.
[0079] Egzogeno uvedeni humani transgeni imunoglobulina rearanžiraju se u prekursorskim B ćelijama u miševima (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). To otkriće korišćeno je u konstruisanju miševa pomoću nokaut-plus-transgenog pristupa za eksprimovanje humanih antitela (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Mišji lokusi teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina inaktivirani su kod tih miševa ciljanom delecijom malih ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, za čim je sledilo uvođenje humanih genskih lokusa imunoglobulina kao nasumično integrisanih velikih transgena, kao što je opisano iznad, ili minihromozoma (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Takvi miševi predstavljali su važan napredak u genetičkom inženjeringu; potpuno humana monoklonska antitela izolovana iz njih pružala su obećavajući terapijski potencijal za lečenje različitih humanih bolesti (Gibson et al., 2006, Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al., 2007, Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005, Human antibodies from transgenic animals, Nat Biotechnol 23:1117-1125; Maker et al., 2005, Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al., 2006, Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, New Engl J Med 354:821-831). Ali, kao što je razmotrano iznad, ti miševi ispoljavaju kompromitovan razvoj B ćelija i imunološke nedostatke u poređenju sa miševima divljeg tipa. Takvi problemi potencijalno ograničavaju sposobnost miševa da podržavaju snažan humoralni odgovor i, posledično, stvaraju potpuno humana antitela protiv nekih antigena. Nedostaci mogu biti usled: (1) neefikasne funkcionalnosti usled nasumičnog uvođenja humanih transgena imunoglobulina i, kao rezultat toga, netačne ekspresije usled nedostatka ushodnih i nishodnih kontrolnih elemenata (Garrett et al., 2005, Chromatin architecture near a potential 3’ end of the IgH locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al., 2003, Elucidation of a nishodno boundary of the 3’ IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al., 2006, Identification of a candidate regulatory element within the 5’ flanking region of the mouse IgH locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 176:6839-6851); (2) neefikasnih međuvrsnih interakcija između humanih konstatnih domena i mišjih komponenata signalnog kompleksa receptora B ćelija na ćelijskoj porvšini, što može narušiti signalne procese neohodne za normalno sazrevanje, proliferaciju i preživljavanje B ćelija (Hombach et al., 1990, Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762); i (3) neefikasnih međuvrsnih interakcija između rastvorljivih humanih imunoglobulina i mišjih Fc receptora koji mogu smanjiti afinitetnu selekciju (Rao et al., 2002, Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) i koncentracije imunoglobulina u serumu (Brambell et al., 1964, A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans and Anderson, 1996, The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA 93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al., 2006, Antibodymediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn and Ravetch, 2007, Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Ti nedostaci mogu se ispraviti in situ humanizacijom samo varijabilnih regiona mišjih lokusa imunoglobulina unutar njihovih prirodnih lokacija na endogenim lokusima teškog i lakog lanca. To bi efektivno dovelo do miševa koji prave „reverzna himerna“ (tj., humana V : mišja C) antitela koja bi bila sposobna za normalne interakcije i selekciju sa mišjim okruženjem na osnovu zadržanih mišjih konstantnih regiona. Dalja takva reverzna himerna antitela mogu se lako reformatirati u potpuno humana antitela za terapijske svrhe.
[0080] Genetički modifikovane životinje koje sadrže zamenu na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina heterolognim (npr., od druge vrste) sekvencama imunoglobulina mogu se napraviti u konjunkciji sa zamenama na endogenim lokusima lakog lanca imunoglobulina ili u konjunkciji sa transgenima lakog lanca imunoglobulina (npr., himernim transgenima lakog lanca imunoglobulina ili potpuno humanim potpuno mišjim, itd.). Vrste od kojih se izvode heterologne sekvence teškog lanca imunoglobulina mogu u velikoj meri varirati; kao i sekvence lakog lanca imunoglobulina korišćene u zamenama sekvenci lakog lanca imunoglobulina ili transgenima lakog lanca imunoglobulina.
[0081] Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina, npr., V, D i/ili J segmenti, u različitim izvođenjima dobijaju se od ljuskog bića ili ne-humane životinje. Ne-humane životinje pogodne za obezbeđivanje V, D i/ili J segmenata uključuju, na primer, koštane ribe, hrskavičave ribe kao što su ajkule i raže, amfibije, reptile, sisare, ptice (npr. kokoške). Ne-humane životinje uključuju, na primer, sisare. Sisari uključuju, na primer, ne-humane primate, koze, ovce, svinje, pse, goveda (npr., kravu, bika, bizona), jelena, kamile, feretke i glodare i ne-humane primate (npr., šimpanze, orangutane, gorile, marmozete, rezus majmune babune). Pogodne ne-humane životinje biraju se iz porodice glodara uključujući pacove, miševe i hrčke. U jednom izvođenju, ne-humane životinje su miševi. Kao što je jasno iz konteksta, različite ne-humane životinje mogu se upotrebljavati kao izvor varijabilnih domena ili genskih segmenata varijabilnih regiona (npr., ajkule, raže, sisari (npr., kamile, glodari kao što su miševi i pacovi)).
[0082] Prema kontekstu, ne-humane životinje takođe se upotrebljavaju kao izvori sekvenci konstantnog regiona koji će se upotrebljavati u vezi sa varijabilnim sekvancama ili segmentima, na primer, konstantne sekvence glodara mogu se upotrebljavati u transgenima u operativnoj vezi sa humanim ili ne-humanim varijabilnim sekvencama (npr., varijabilne sekvence ljudskog bića ili nehumanog primata koje su operativno povezane sa, npr., konstantnim sekvencama glodara, npr., miša ili pacova ili hrčka). Prema tome, u različitim izvođenjima, humani V, D i/ili J segmenti operativno su povezani sa genskim sekvencama konstantnog regiona glodara (npr., miša ili pacova ili hrčka). U nekim izvođenjima, humani V, D i/ili J segmenti (ili jedan ili više rearanžiranih VDJ ili VJ gena) operativno su povezani ili spojeni sa genskim sekvencama konstantnog regiona miša, pacova ili hrčka u, npr., trangenu integrisanom na lokusu koji nije endogeni lokus imunoglobulina.
[0083] U specifičnom izvođenju, obezbeđen je miš koji sadrži zamenu VH, DHi JHsegmenata na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina jednim ili većim brojem humanih VH, DHi JHsegmenata, pri čemu su jedan ili više humanih VH, DHi JHsegmenata u operativnoj vezi sa endogenim genom teškog lanca imunoglobulina; pri čemu miš sadrži transgen na lokusu koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina, pri čemu transgen obuhvata nerearanžirani ili rearanžirani humani VLi humani JLsegment u operativnoj vezi sa mišjim ili pacovskim ili humanim konstantnim regionom.
[0084] Opisan je postupak za veliku in situ gensku zamenu varijabilnog genskog lokusa imunoglobulina mišje germinativne linije varijabilnim genskim lokusom imunoglobulina humane germinativne linije pri čemu se zadržava sposobnost miša da stvara potomstvo. Određenije, opisana je precizna zamena šest megabaza oba mišja varijabilna genska lokusa teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina njihovim humanim pandanima pri čemu se mišji konstantni regioni ostaju netaknuti. Kao rezultat, kreirani su miševi koji imaju preciznu zamenu celog svog varijabilnog repertoara imunoglobulina germinativne linije ekvivalentnim humanim varijabilnim sekvencama imunoglobulina germinativne linije, pri čemu se zadržavaju mišji konstantni regioni. Humani varijabilni regioni povezani su sa mišjim konstantnim regionima da bi obrazovali himerne humano-mišje lokuse imunoglobulina koji se rearanžiraju i eksprimuju na fiziološki odgovarajućim nivoima. Eksprimovana antitela su „reverzne himere“, tj., ona obuhvataju humane sekvence varijabilnog regiona i mišje sekvence konstantnog regiona. Ti miševi koji imaju humanizovane varijabilne regione imunoglobulina koji eksprimuju antitela koja imaju humane ®
varijabilne regione i mišje konstantne regione nazivaju se VELCOIMMUNE miševi.
®
[0085] VELOCIMMUNE humanizovani miševi ispoljavaju potpuno funkcionalan humoralni imunski sistem koji se suštinski ne može razlikovati od onog kod miša divljeg tipa. Oni pokazuju normalne ćelijske populacije u svim stadijumima razvoja B ćelija. Ispoljavaju normalnu morfologiju limfnih organa. Sekvence antitela VELOCIMMUNE miševa ispoljavaju normalno V(D)J rearanžiranje i normalne učestalosti somatske hipermutacije. Populacije antitela kod tih miševa odražavaju raspodele izotipova koje su rezultat normalne promene klase (eng. class switching) (npr., normalne cis-promene ®
izotipa). Imunizovanje VELOCIMMUNE miševa dovodi do jakog humoralno imunskog odgovora koji stvara velike, raznovrsne repertoare antitela koji imaju humane varijabilne domene imunoglobulina pogodne za upotrebu kao kandidati za terapijska sredstva. Ta platforma obezbeđuje obilan izvor prirodno afinitetno sazrelih humanih sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina za pravljenje farmaceutski prihvatljivih antitela i drugih proteina koji se vezuju za antigen.
[0086] Precizna zamena mišjih varijabilnih sekvenci imunoglobulina humanim varijabilnim ®
sekvencama imunoglobulina omogućava pravljenje VELOCIMMUNE miševa. Ipak, čak i precizna zamena endogenih mišjih sekvenci imunoglobulina na lokusima teškog i lakog lanca ekvivalentnim humanim sekvencama imunoglobulina, uzastopnim rekombinovanjem veoma velikih raspona humanih sekvenci imunoglobulina, može predstavljati izvesne izazove usled divergentne evolucije lokusa imunoglobulina kod miša i kod čoveka. Na primer, intergenske sekvence koje se smenjuju unutar lokusa imunoglobulina nisu identične kod miša i kod ljudi i, u nekim okolnostima, može se desiti da nisu funkcionalni ekvivalent. Razlike između miševa i ljudi u njihovim lokusima imunoglobulina i dalje mogu dovesti do abnormalnosti kod humanizovanih miševa, posebno prilikom humanizacije ili manipulisanja izvesnim delovima endogenih mišjih lokusa teškog lanca imunoglobulina. Neke su modifikacije na mišjim lokusima teškog lanca imunoglobulina štetne. Štetne modifikacije mogu uključivati, na primer, gubitak sposobnosti modifikovanih miševa da se pare i proizvode potomstvo.
[0087] Izvedena je precizna, velikih razmera, in situ zamena šest megabaza varijabilnih regiona mišjih imunoglobulinskih lokusa teškog i lakog lanca (VH-DH-JHi Vκ-Jκ) odgovarajućim humanim genomskim sekvencama od 1,4 megabaze, pri čemu su flankirajuće mišje sekvence ostajale netaknute i funkcionalne unutar hibridnih lokusa, uključujući sve mišje gene konstantnog lanca i transkripcione kontrolne regione lokusa (SL. 1A i SL. 1B). Određenije, humani VH, DH, JH, Vκ i Jκgenske sekvence uvedene su putem više koraka insertovanja 13 himernih BAC ciljnih vektora koji nose preklapajuće fragmente humanih varijabilnih lokusa germinativne linije u mišje ES ćelije pomoću tehnologije ®
genetičkog inženjeringa VELOCIGENE (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 and Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).
[0088] Humanizacija mišjih gena imunoglobulina predstavlja do danas najveću gensku modifikaciju u mišjem genomu. Dok su prethodni napori sa nasumično integrisanim humanim transgenima imunoglobulina postigli izvestan uspeh (razmatrano iznad), direktna zamena mišjih gena imunoglobulina njihovim humanim pandanima dramatično povećava efikasnost sa kojom se mogu stvoriti potpuno humana antitela u inače normalnim miševima. Dalje, takvi miševi ispoljavaju dramatično povećanu raznovrsnost potpuno humanih antitela koja se mogu dobiti nakon imunizacije praktično bilo kojim antigenom, u poređenju sa miševima koji nose onesposobljene endogene lokuse i potpuno humane transgene antitela. Višestruke verzije zamenjenih, humanizovanih lokusa ispoljavaju potpuno normalne nivoe zrelih i nezrelih B ćelija, nasuprot miševima sa nasumično integrisanim humanim transgenima, koji ispoljavaju znatno smanjene populacije B ćelija u različitim stadijumima diferencijacije. Dok su napori da se poveća broj humanih genskih segmenata kod humanih transgenih miševa smanjili takvi defekti, prošireni repertoari imunoglobulina nisu sasvim korigovali smanjenja populacija B ćelija u poređenju sa divljim tipom miševa.
[0089] Bez obzira na humoralnu imunsku funkciju gotovo divljeg tipa uočenu kod miševa sa zamenjenim lokusima imunoglobulina (tj., VELOCIMMUNE miševa), ne postoje drugi izazovi sa kojima se susretalo kada je korišćena direktna zamena imunoglobulina sa kojima se nije susretalo u nekim pristupima koji su koristili nasumično integrisane transgene. Razlike u genskoj kompoziciji lokusa imunoglobulina između miševa i ljudi dovele su do otkrića sekvenci korisnih za propagaciju miševa sa zamenjenim genskim segmentima imunoglobulina. Određenije, mišji geni ADAM koji se nalaze unutar endogenih lokusa imunoglobulina optimalno su prisutni u miševima sa zamenjenim lokusima imunoglobulina, zahvaljujući njihovoj ulozi u plodnosti.
Genomska lokacija i funkcija mišjeg ADAM6
[0090] Mužjaci miša kojima nedostaje sposobnost da eksprimuju bilo koji funkcionalni protein ADAM6 iznenađujuće ispoljavaju defekt u sposobnosti miševa da se pare i stvaraju potomstvo. Miševima nedostaje sposobnost da eksprimuju funkcionalni protein ADAM6 putem zamene svih ili u suštini svih mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulina humanim genskim segmentima varijabilnog regiona. Do gubitka funkcije ADAM6 dolazi zato što se lokus ADAM6 nalazi unutar regiona endogenog mišjeg genskog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca imunuglobulina, koji se nalazi blizu 3’ kraja lokusa VHgenskog segmenta koji se nalazi ushodno od DHgenskih segmenata. Za ukrštanje miševa koji su homozigotni za zamenu svih ili u suštini svih endogenih mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca humanim varijabilnim genskim segmentima teškog lanca, generalno je glomazan pristup da se postave mužjaci i ženke koji su i jedni i drugi homozigotni za zamenu i zatim čeka produktivno parenje. Uspešni okoti imaju malu učestalost i veličinu. Umesto toga, mužjaci heterozigotni za zamenu korišćeni su za parenje za ženkama homozigotnim za zamenu da bi se stvorilo potomstvo koje je heterozigotno za zamenu, a onda se od njega ukrštao homozigotni miš. Pronalazači su utvrdili da je verovatan uzrok gubitka plodnosti kod mužjakā miša odsustvo funkcionalnog proteina ADAM6 kod homozigotnih mužjakā miša.
[0091] U različitim aspektima, mužjaci miša koji sadrže oštećen (tj., nefunkcionalan ili marginalno funkcionalan) gen ADAM6 ispoljavaju smanjenu ili eliminisanu plodnost. Zato što se kod miševa (i drugih glodara) gen ADAM6 nalazi na lokusu teškog lanca imunoglobulina, pronalazači su utvrdili da se za propagiranje miševa, ili stvaranje i održavanje soja miševa, koji sadrže zamenjen lokus teškog lanca imunoglobulina, koriste različite šeme ukrštanja ili propagacije. Mala plodnost, ili neplodnost, mužjakā miša homozigotnih za zamenu endogenog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina čini da je održavanje takve modifikacije u soju miševa teško. U različitim izvođenima, održavanje soja obuhvata izbegavanje problemā neplodnosti koje su ispoljili mužjaci miša homozigotni za zamenu.
[0092] Ovde je prikazan, ali nije deo pronalaska, postupak za održavanje mišjeg soja kao što je ovde opisano. Mišji soj ne mora da sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6, i u različitim izvođenjima mišji soj je homozigotan ili heterozigotan za „nokaut“ (npr., funckonalni „nokaut“) ADAM6.
[0093] Mišji soj sadrži modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina koji dovodi do smanjenja ili gubitka plodnosti kod mužjaka miša. U jednom izvođenju, modifikacija obuhvata deleciju regulatorne regije i/ili kodirajućeg regiona gena ADAM6. U specifičnom izvođenju, modifikacija može obuhvatati modifikaciju endogenog gena ADAM6 (regulatornog i/ili kodirajućeg regiona) koja smanjuje ili eliminiše plodnost mužjaka miša koji sadrži modifikaciju; u specifičnom izvođenju, modifikacija smanjuje ili eliminiše plodnost mužjaka miša koji je homozigotan za modifikaciju.
[0094] U jednom izvođenju, mišji soj je homozigotan ili heterozigotan za „nokaut“ (npr., funkcionalni „nokaut“) ili deleciju gena ADAM6.
[0095] U jednom izvođenju, mišji soj se održava izolovanjem ćelije iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju, i korišćenjem ćelije donora u embrionu domaćina, i uvođenjem u gestaciju embriona domaćina i ćelije donora u surogat majci, i dobijanje od surogat majke potomstva koje sadrži gensku modifikaciju. U jednom izvođenju, ćelija donora je ES ćelija. U jednom izvođenju, ćelija donora je pluripotentna ćelija, npr., indukovana pluripotentna ćelija.
[0096] U jednom izvođenju, mišji soj se održava izolovanjem iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata modifikaciju, i uvođenjem sekvence nukleinske kiseline u nukleus domaćina, i uvođenjem u gestaciju ćelije koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline i nukleus domaćina u pogodnoj životinji. U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline uvodi se u embrion oocita domaćina.
[0097] U jednom izvođenju, mišji soj se održava izolovanjem iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju mukleusa, i uvođenjem nukleusa u ćeliju domaćina, i uvođenjem u gestaciju nukleusa i ćelije domaćina u pogodnoj životinji da bi se dobilo potomstvo koje je homozigotno ili heterozigotno za modifikaciju.
[0098] U jednom izvođenju, mišji soj se održava korišćenjem oplodnje in vitro (IVF) ženke miša (divljeg tipa, homozigotnog za modifikaciju, ili heterozigotnog za modifikaciju) korišćenjem spermatozoida iz mužjaka miša koji sadrži gensku modifikaciju. U jednom izvođenju, mužjak miša je heterozigotan za gensku modifikaciju. U jednom izvođenju, mužjak miša je homozigotan za gensku modifikaciju.
[0099] U jednom izvođenju, mišji soj se održava ukrštanjem mužjaka miša koji je heterozigotan za gensku modifikaciju sa ženkom miša da bi se dobilo potomstvo koje sadrži gensku modifikaciju, identifikovanjem muškog i ženskog potomstva koje sadrži gensku modifikaciju, i korišćenjem mužjaka koji su heterozigotni za gensku modifikaciju u ukrštanju sa ženkama koje su divljeg tipa, homozigotne, ili heterozigotne za gensku modifikaciju da bi se dobilo potomstvo koje sadrži gensku modifikaciju. U jednom izvođenju, korak ukrštanja mužjaka heterozigotnog za gensku modifikaciju sa ženkom divljeg tipa, ženkom heterozigotnog tipa za gensku modifikaciju, ili ženke homozigotne za gensku modifikaciju ponavlja se kako bi se u mišjem soju održala genska modifikacija.
[0100] Ovde je prikazan, ali nije deo pronalaska, postupak obezbeđen za održavanje mišjeg soja koji sadrži zamenu endogenog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina jednom ili većim brojem humanih sekvenci teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata ukrštanje mišjeg soja tako da stvara heterozigotne mužjake miša, pri čemu su heterozigotni mužjaci miša uzgojeni da održavaju gensku modifikaciju u soju. U specifičnom izvođenju, soj se ne održava nikakvim ukrštanjem homozigotnog mužjaka sa ženkom divljeg tipa, ili ženkom homozigotnom ili heterozigotnom za gensku modifikaciju.
[0101] Protein ADAM6 je član porodice proteina ADAM, gde je ADAM skraćenica za dezintegrin i metaloproteazu (A Disintegrin And Metalloprotease). Porodica proteina ADAM velika je i raznovrsna, sa raznovrsnim funkcijama uključujući ćelijsku adheziju. Neki članovi porodice ADAM umešani su u spermatogenezu i oplodnju. Na primer, ADAM2 kodira podjedinicu proteina fertilina, koji je umešan u interakciju spermatozoida i jajašceta. ADAM3, ili ciritestin, izgleda da je neophodan za vezivanje spermatozoida za zona pellucida. Odsustvo bilo ADAM2 ili ADAM3 dovodi do neplodnosti. Pretpostavljano je da ADAM2, ADAM3 i ADAM6 obrazuju kompleks na površini ćelija mišjih spermatozoida. Humani gen ADAM6, koji se normalno pronalazi između humanih VHgenskih segmenata VH1-2 i VH6-1, izgleda da je pseudogen (Slika 12). Kod miševa, postoje dva gena ADAM6 – ADAM6a i ADAM6b – koji se pronalaze u intergenskom regionu između mišjih VHi DHgenskih segmenata, i kod miševa su ADAM6a i ADAM6b orijentisani u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji prema okolnim genskim segmentima imunoglobulina (SL.12). Kod miševa, funkcionalni lokus ADAM6 očito je potreban za normalnu oplodnju. Funkcionalni lokus ili sekvenca ADAM6 se, tada, odnose na lokus ili sekvencu ADAM6 koji mogu dopuniti, ili oporaviti, drastično smanjenu oplodnju koja se ispoljava kod mužjakā miša sa nedostajućim ili nefunkcionalnim endogenim lokusima ADAM6.
[0102] Položaj intergenske sekvence kod miševa koja kodira ADAM6a i ADAM6b čini da je intergenska sekvenca podložna modifikaciji kada se modifikuje endogeni mišji teški lanac. Kada su VHgenski segmenti deletirani ili zamenjeni, ili kada su DHgenski segmenti deletirani ili zamenjeni, postoji velika verovatnoća da će dobijeni miš ispoljavati ozbiljan defekt u plodnosti. Kako bi se kompenzovao taj nedostatak, miš se modifikuje tako da uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji će dopunjavati gubitak aktivnosti ADAM6 usled modifikacije endogenog mišjeg lokusa ADAM6. U različitim izvođenjima, dopunjavajuća nukleotidna sekvenca je ona koja kodira mišji ADAM6a, mišji ADAM6b, ili njihov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji oporavlja nedostatak plodnosti.
[0103] Nukleotidna sekvenca koja oporavlja plodnost može se smestiti na bilo koji pogodan položaj. Ona se može smestiti u intergenski region, ili na bilo koji pogodan položaj u genomu (tj., ektopično). U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca može se uvesti u transgen koji se nasumično integriše u mišji genom. U jednom izvođenju, sekvenca se može održavati epizomalno, to jest, na odvojenoj nukleinskoj kiselini, pre nego na na mišjem hromozomu. Pogodni položaji uključuju položaje koji su transkripciono permisivni ili aktivni, npr., lokus ROSA26 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), a BT-5 locus (Michael et al., 1999, Mech. Dev.85:35-47), or an Oct4 locus (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Opisane su nukleotidne sekvence koje ciljaju u transkripciono aktivne lokuse, npr., u US 7,473,557.
[0104] Alternativno, nukleotidna sekvenca koja oporavlja plodnost može se kuplovati sa inducibilnim promoterom tako da olakšava optimalnu ekspresiju u odgovarajućim ćelijama i/ili tkivima, npr., reproduktivnim tkivima. Primeri inducibilnih promotera uključuju promotere aktivirane fizičkim (npr., promoter toplotnog šoka) i/ili hemijskim sredstvima (npr., IPTG ili tetraciklin).
[0105] Dalje, ekspresija nukleotidne sekvence može se povezati sa drugim genima tako da postigne ekspresiju u specifičnim stadijumima razvoja ili unutar specifičnih tkiva. Takva ekspresija može se postići stavljanjem nukleotidne sekvence u operativnu vezu sa promoterom gena eksprimovanog u specifičnom stadijumu razvoja. Na primer, sekvence imunoglobulina iz jedne vrste konstruisane u genom domaćinske vrste stavljaju se u operativnu vezu sa promoterskom sekvencom gena CD19 (specifičnog gena iz B ćelije) iz vrste domaćina. Postiže se ekspresija specifična za B ćeliju u preciznim stadijumima razvoja kada se eksprimuje imunoglobulin.
[0106] Još jedan postupak za postizanje snažne ekspresije insertovane nukleotidne sekvence jeste korišćenje konstitutivnog promotera. Primeri konstitutivnih promotera uključuju SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK i CAGG. Na sličan način, željena nukleotidna sekvenca stavlja se u operativnu vezu sa izabranim konstitutivnim promoterom, koji obezbeđuje visok nivo ekspresije proteina (proteinā) kodiranog nukleotidnom sekvencom.
[0107] Termin „ektopični“ predviđeno je da uključuje premeštanje, ili smeštanje na položaj koji se normalno ne susreće u prirodi (npr., smeštanje sekvence nukleinske kiseline na položaj koji nije isti položaj kao onaj na kome se nukleinska kiselina nalazi u mišu divljeg tipa). Termin se, u različitim izvođenjima, upotrebljava u smislu da je njegov predmet van normalnog, ili pravog, položaja. Na primer, fraza „ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira…“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se pojavljuje na položaju na kome se normalno ne susreće kod miša. Na primer, u slučaju ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji obezbeđuje istu ili sličnu prednost plodnosti u mužjaku miša), sekvenca se može smestiti na drugačiji položaj u genomu miša nego što se normalno pronalazi kod miša divljeg tipa. U takvim slučajevima, novi spojevi sekvenci mišje sekvence biće stvoreni smeštanjem sekvence na položaj u genomu miša koji je drugačiji nego kod miša divljeg tipa. Funkcionalni homolog ili ortolog mišjeg ADAM6 je sekvenca koja daje oporavak gubitka plodnosti (npr., gubitka sposobnosti mužjaka miša da parenjem stvara
-/-
potomstvo) koji se uočava kod miša sa ADAM6 . Funkcionalni homolozi ili ortolozi uključuju proteine koji imaju barem oko 89% identičnosti ili više, npr., do 99% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6a i/ili sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6b, i koji mogu dopuniti, ili oporaviti sposobnost uspešnog parenja, miša koji ima genotip koji uključuje deleciju ili „nokaut“ ADAM6a i/ili ADAM6b.
[0108] Ektopični položaj može biti bilo gde (npr., kao sa nasumičnim insertovanjem transgena koji sadrži mišju sekvencu ADAM6), ili može biti, npr., na položaju koji se približava (ali nije precizno isti kao) svojoj lokaciji kod miša divljeg tipa (npr., u modifikovanom endogenom mišjem lokusu imunoglobulina, ali bilo ushodno ili nishodno od svog prirodnog položaja, npr., unutar modifikovanog lokusa imunoglobulina ali između različitih genskih segmenata, ili na različitim položajima u mišjoj V-D intergenskoj sekvenci). Jedan primer ektopičnog smeštanja jeste smeštanje unutar humanizovanog lokusa teškog lanca imunoglobulina. Na primer, miš koji sadrži zamenu jednog ili više endogenih VHgenskih segmenata humanim VHgenskim segmentima, pri čemu zamena uklanja endogenu sekvencu ADAM6, može se konstruisati tako da ima mišju sekvencu ADAM6 koja se nalazi unutar sekvence koja sadrži humane VHgenske segmente. Dobijena modifikacija stvorila bi (ektopičnu) mišju sekvencu ADAM6 unutar humane genske sekvence, i (ektopično) smeštanje mišje sekvence ADAM6 unutar humane genske sekvence može biti približno položaju humanog pseudogena ADAM6 (tj., između dva V segmenta) ili može biti približno položaju mišje sekvence ADAM6 (tj., unutar V-D intergenskog regiona. Dobijeni spojevi sekvenci stvoreni spajanjem (ektopične) mišje sekvence ADAM6 unutar ili pored humane genske sekvence (npr., genske sekvence imunoglobulina) unutar germinativne linije miša bili bi novi u poređenju sa istim ili sličnim položajima u genomu miša divljeg tipa.
[0109] U različitim izvođenjima, obezbeđeni su miševi kojima nedostaje ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, pri čemu nedostatak čini da je miš neplodan, ili suštinski smanjuje plodnost miša. Do nedostatka ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa dolazi usled modifikacije endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina. Suštinsko smanjenje plodnosti je, npr., smanjenje plodnosti (npr., učestalost ukrštanja, mladunci po okotu, okoti po godini, itd.) od oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95% ili više. Miševi su dopunjeni mišjim genom ADAM6 ili njegovim ortologom ili homologom ili funkcionalnim fragmentom koji je funkcionalan u mužjaku miša, pri čemu dopunjeni gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment oporavlja smanjenu plodnost u celini ili u suštinskom delu. Oporavljanje plodnosti u suštinskom delu je, npr., vraćanje plodnosti tako da miš ispoljava plodnost koja je barem 70%, 80%, ili 90% ili više u poređenju sa nemodifikovanim (tj., mišom bez modifikacije gena ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa) lokusom teškog lanca.
[0110] Sekvenca koja daje genetički modifikovanom mišu (tj., mišu kome nedostaje funkcionalni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, usled, npr., modifikacije lokusa teškog lanca imunoglobulina), u različitim izvođenjima, bira se od gena ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa. Na primer, kod miša, gubitak funkcije ADAM6 oporavlja se dodavanjem, u jednom izvođenju, mišjeg gena ADAM6. U jednom izvođenju, izgubljena funkcija ADAM6 kod miša oporavlja se dodavanjem ortologa ili homologa vrste koja je blisko srodna u odnosu na miša, npr., glodara, npr., miša različitog soja ili vrste, pacova bilo koje vrste, glodara; pri čemu dodavanje ortologa ili homologa mišu oporavlja izgubljenu plodnost usled gubitka funkcije ADAM6 ili gubitka gena ADAM6. Ortolozi ili homolozi iz drugih vrsta, u različitim izvođenjima, biraju se od filogenetski srodnih vrsta i, u različitim izvođenjima, ispoljavaju identičnost postotka sa endogenim ADAM6 (ili ortologom) koja je oko 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, ili 97% ili više; i da oporavljaju plodnost čiji je gubitak povezan sa ADAM6 ili (kod ne-miševa) povezan sa ortologom ADAM6. Na primer, kod genetički modifikovanog mužjaka pacova kome nedostaje funkcija ADAM6 (npr., pacova sa endogenim varijabilnim regionom teškog lanca imunoglobulina zamenjenim humanim varijabilnim regionom teškog lanca imunoglobulina, ili „nokautom“ u pacovskom regionu teškog lanca imunoglobulina), izgubljena plodnost kod pacova oporavlja se dodavanjem pacovskog ADAM6 ili, u nekim izvođenjima, ortologa pacovskog ADAM6 (npr., ortologa ADAM6 iz drugog pacovskog soja ili vrste, ili, u jednom izvođenju, iz miša).
[0111] Prema tome, u različitim izvođenjima, genetički modifikovani miševi koji ispoljavaju odsustvo plodnosti ili smanjenje plodnosti usled modifikacije sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog) ili regulatorni region u operativnoj vezi sa sekvencom nukleinske kiseline, sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja dopunjava, ili vraća, gubitak plodnosti kada je sekvenca nukleinske kiseline koja dopunjava ili vraća gubitak plodnosti iz drugog soja iste vrste ili iz filogenetski srodnih vrsta. Dopunjavajuća sekvenca nukleinske kiseline je ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment. U različitim izvođenjima, dopunjavajući ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment je iz ne-humane životinje koja je blisko srodna genetički modifikovanoj životinji koja ima defekt plodnosti. Na primer, kada je genetički modifikovan miš miš posebnog soja, ortolog ili homolog ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment može se dobiti iz miša drugog soja, ili miša iz srodne vrste.
[0112] U jednom izvođenju, genetički modifikovan miš je iz člana porodice Muridae, i ortolog ili homolog ADAM6 je iz različite vrste iz familije Muridae. U specifičnom izvođenju, genetički modifikovan glodar je miš iz familije Muridae, i ortolog ili homolog ADAM6 je iz pacova, skočimiša, bodljikavog miša, ili grivastog pacova iz porodice Muridae.
[0113] U različitim izvođenjima, ortolozi, homolozi i fragmenti ADAM6 procenjeni su po funkcionalnosti utvrđivanjem da li ortolog, homolog ili fragment vraćaju plodnost genetički modifikovanom mužjaku miša kome nedostaje aktivnost ADAM6. U različitim izvođenjima, funkcionalnost se definiše kao sposobnost spermatozoida genetički modifikovanog miša kome nedostaje endogeni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog da prođe kroz mišji jajovod i oplodi jajnu ćeliju.
[0114] U različitim aspektima, miševi koji sadrže delecije ili zamene endogenog lokusa varijabilnog regiona teškog lanca ili njegovi delovi mogu se napraviti tako da sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji daje slične benefite plodnosti mišjem ADAM6 (npr., njegovom ortologu ili homologu ili fragmentu koji je funkcionalan u mužjaku miša). Ektopična nukleotidna sekvenca može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji je homolog ili ortolog ADAM6 (ili njegov fragment) različitih mišjih sojeva ili različitih vrsta, npr., različite vrste glodara, i koji daje benefit u plodnosti, npr., povećan broj okota tokom navedenog perioda vremena, i/ili povećan broj mladunaca po okotu, i/ili sposobnost ćelije spermatozoida mužjaka miša da prođe kroz mišji jajovod da bi oplodila mišje jajašce.
[0115] U jednom izvođenju, ADAM6 je homolog ili ortolog koji je barem 89% do 99% identičan sa mišjim proteinom ADAM6 (npr., barem 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6a ili mišjim ADAM6b). U jednom izvođenju, ektopična nukleotidna sekvenca kodira jedan ili više proteina nezavisno izabranih od proteina barem 89% identičnog sa mišjim ADAM6a, proteina barem 89% identičnog sa mišjim ADAM6b, i njihove kombinacije. U jednom izvođenju homolog ili ortolog je protein pacova, hrčka, miša ili zamorca koji jeste ili je modifikovan da bude 89% ili više identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b. U jednom izvođenju, homolog ili ortolog jeste ili je barem 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b.
Ektopični ADAM6 kod miševa sa humanizovanim teškim lancem
[0116] Razvoji u genskom ciljanju, npr., razvoj bekterijskih veštačkih hromozoma (BAC-ova), sada omogućava rekombinaciju relativno velikih genomskih fragmenata. Konstruisanje BAC-ova omogućilo je sposobnost pravljenja velikih delecija, i velikih insertovanja, u mišje ES ćelije.
[0117] Miševi koji prave humana antitela dostupni su već neko vreme. Premda predstavljaju važan napredak u razvoju humanih terapijskih antitela, ti miševi pokazuju izvestan broj abnormalnosti koje ograničavaju njihovu korisnost. Na primer, oni pokazuju kompromitovan razvoj B ćelija. Do kompromitovanog razvoja može doći usled raznovrsnih razlika između transgenih miševa i miševa divljeg tipa.
[0118] Humana antitela možda neće optimalno reagovati sa mišjim receptorima pre-B ćelija ili B ćelija na površini mišjih ćelija koji signalizuju sazrevanje, proliferaciju ili preživljavanje tokom klonske selekcije. Potpuno humana antitela možda neće optimalno reagovati sa mišjim sistemom Fc receptora; miševi eksprimuju Fc receptore koji ne pokazuju korespondenciju jedan-na-jedan sa humanim Fc receptorima. Konačno, različiti miševi koji prave potpuno humana antitela ne uključuju sve originalne mišje sekvence, npr., nishodne elemente pojačivača i druge elemente kontrole lokusa, koji mogu biti potrebni za razvoj B ćelija divljeg tipa.
[0119] Miševi koji prave potpuno humana antitela generalno sadrže endogene lokuse imunoglobulina koji su na neki način isključeni, i humani transgeni koji obuhvataju varijabilne i konstantne genske segmente imunoglobulina uvode se na nasumične lokacije u mišjem genomu. Dokle god je endogeni lokus dovoljno isključen tako da ne rearanžira genske segmente da bi obrazovao funkcionalan gen imunoglobulina, cilj pravljenja potpuno humanih antitela u takvom mišu može se postići – mada sa kompromitovanim razvojem B ćelija.
[0120] Premda prinuđeno da pravi potpuno humana antitela iz humanog transgenog lokusa, stvaranje humanih antitela u mišu očigledno je nepovoljan proces. Kod nekih miševa, proces je toliko nepovoljan da dovodi do formacije himernih humanih varijabilnih / mišjih konstantnih teških lanaca (ali ne lakih lanaca) preko mehanizma trans-promene. Tim mehanizmom, transkripti koji kodiraju potpuno humana antitela trpe promenu izotipa u trans iz humanog izotipa u mišji izotip. Proces je u trans, zato što se potpuno humani transgen nalazi odvojeno od endogenog lokusa koji zadržava neoštećenu kopiju mišjeg gena konstantnog regiona teškog lanca. Premda je kod takvih miševa trans-promena očigledna, fenomen je i dalje nedovoljan da oporavi razvoj B ćelija, koji ostaje ozbiljno narušen. U svakom slučaju, trans-promenjena antitela napravljena u takvim miševima zadržavaju potpuno humani laki lanac, pošto se fenomen trans-promene očito ne javlja u odnosu na lake lance; transpromena se po svoj prilici oslanja na sekvence za promene (eng. switch sequences) u endogenim lokusima koji se upotrebljavaju (mada drugačije) u normalnoj promeni izotipova u cis. Prema tome, čak i kada miševi konstruisani da prave potpuno humana antitela biraju mehanizam trans-promene za pravljenje antitela sa mišjim konstantnim regionima, strategija je i dalje nedovoljna da se oporavi normalan razvoj B ćelija.
[0121] Primarna briga u pravljenju humanih terapijskih sredstava zasnovanih na antitelima jeste pravljenje dovoljno velike raznovrsnosti humanih sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina da bi se identifikovali varijabilni regioni koji specifično prepoznaju posebne epitope i vezuju ih sa željenim ®
afinitetom, obično – ali ne uvek – sa visokim afinitetom. Pre razvoja VELOCIMMUNE miševa (opisanih ovde), nije bilo indikacija da će miševi koji eksprimuju humane varijabilne regione sa mišjim konstantnim regionima ispoljavati bilo kakve značajne razlike u odnosu na miševe koji prave humana antitela iz transgena. Ta pretpostavka je, međutim, bila netačna.
®
[0122] VELOCIMMUNE miševi, koji sadrže preciznu zamenu mišjih varijabilnih regiona imunoglobulina humanim varijabilnim regionima imunoglobulina na endogenim mišjim lokusima, pokazuju iznenađujuću i izvanrednu sličnost sa miševima divljeg tipa u pogledu razvoja B ćelija. U
®
iznenađujućem i zapanjujućem razvoju, VELOCIMMUNE miševi pokazali su suštinski normalan, odgovor divljeg tipa na imunizaciju koji se razlikovao samo u jednom značajnom pogledu od miševa divljeg tipa – varijabilni regioni stvoreni kao odgovor na imunizaciju potpuno su humani.
®
[0123] VELOCIMMUNE miševi sadrže preciznu, velikih razmera, zamenu varijabilnih regiona germinativne linije mišjeg teškog lanca imunoglobulina (IgH) i lakog lanca imunoglobulina (npr., κ lakog lanca, Igκ) odgovarajućim humanim varijabilnim regionima imunoglobulina, na endogenim lokusima. Ukupno, oko šest megabaza mišjih lokusa zamenjeno je sa oko 1.5 megabaza humane genomske sekvence. Ta precizna zamena dovodi do miša sa hibridnim lokusima imunoglobulina koji prave teške i lake lance koji imaju humane varijabilne regione i mišji konstantni region. Precizna zamena mišjih VH-DH-JHi Vκ-Jκ segmenata ostavlja flankirajuće mišje sekvence netaknutim i funkcionalnim na hibridnim lokusima imunoglobulina. Humoralni imunski sistem miša funkcioniše kao kod miša divljeg tipa. Razvoj B ćelija je neometan u bilo kom značajnom pogledu i bogata raznovrsnost humanih varijabilnih regiona stvara se u mišu nakon antigenskog izazova.
®
[0124] VELOCIMMUNE miševi su mogući zato što se genski segmenti imunoglobulina za teški i κ laki lanac rearanžiraju slično kod ljudi i miševa, što ne znači da su njihovi lokusi isti ili čak blizu toga – jasno je da nisu. Međutim, lokusi su dovoljno slični da se humanizacija varijabilnog genskog lokusa teškog lanca može postići zamenjivanjem oko tri miliona baznih parova neposredno susedne mišje sekvence koja sadrži sve VH, DH, and JHgenske segmente sa oko jednim milionom baza neposredno susedne humane genomske sekvence koja pokriva u osnovi ekvivalentne sekvence iz humanog lokusa imunoglobulina.
[0125] Dalja zamena izvesnih mišjih genskih sekvenci konstantnog regiona humanim genskim sekvencama (npr., zamena mišje CH1 sekvence humanom CH1 sekvencom, i zamena mišje CLsekvence humanom CLsekvencom) dovodi do miševa sa hibridnim lokusima imunoglobulina koji prave antitela koja imaju humane varijabilne regione i delimično humane konstantne regione, pogodne za, npr., pravljenje potpuno humanih fragmenata antitela, npr., potpuno humanih Fab’. Miševi sa hibridnim lokusima imunoglobulina ispoljavaju normalno rearanžiranje varijabilnih genskih segmenata, normalne učestalosti somatskih hipermutacija, i normalnu promenu klase. Ti miševi ispoljavaju humoralni imunski sistem koji se ne može razlikovati od miševa divljeg tipa, i pokazuju normalne ćelijske populacije u svim stadijumima razvoja B ćelija i normalne strukture limfnih organa – čak i kada miševima nedostaje pun repertoar humanih genskih segmenata varijabilnog regiona. Imunizovanje tih miševa dovodi do snažnih humoralnih odgovora koji pokazuju široku raznovrsnost upotreba varijabilnih genskih segmenata.
[0126] Precizna zamena mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona germinativne linije omogućava pravljenje miševa koji imaju delimično humane lokuse imunoglobulina. Zato što se delimično humani lokusi imunoglobulina normalno rearanžiraju, hipermutiraju i vrše promenu klase, delimično humani lokusi imunoglobulina stvaraju antitela u mišu koja obuhvataju humane varijabilne regione. Nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione mogu se identifikovati i klonirati, zatim spojiti (npr., u sistemu in vitro) sa bilo kojim sekvencama po izboru, npr., bilo kojim izotipom imunoglobulina pogodnim za posebnu upotrebu, što dovodi do antitela ili proteina koji vezuje antigen izvedenog u potunosti iz humanih sekvenci.
[0127] Humanizacija velikih razmera postupcima rekombinovanja upotrebljavana je za modifikovanje mišjih embrionskih matičnih (ES) ćelija da bi se precizno zamenilo do tri megabaze mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca koji je uključivao suštinski sve mišje VH, DH, i JHgenske segmente ekvivalentnim humanim genskim segmentima do jednom megabazom humane genomske sekvence koja sadrži neke ili suštinski sve humane VH, DH, i JHgenske segmente. Segment od do jedne polovine megabaze humanog genoma koji obuhvata jedno od dva ponavljanja koja kodiraju suštinski sve humane Vκ i Jκ genske segmente upotrebljavan je za zamenjivanje segmenta od tri megabaze mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina koji sadrži suštinski sve mišje Vκ i Jκ genske segmente.
[0128] Miševi sa takvim zamenjenim lokusima imunoglobulina mogu obuhvatati remećenje ili deleciju endogenog mišjeg lokusa ADAM6, koji se normalno pronalazi između 3’-najvišeg VHgenskog segmenta i 5’-najvišeg DHgenskog segmenta na mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina. Poremećaj u tom regionu može voditi do smanjenja ili eliminisanja funkcionalnosti endogenog mišjeg lokusa ADAM6. Ako se 3’-najviši VHgenski segmenti humanog repertoara teškog lanca upotrebljavaju u zameni, intergenski region koji sadrži pseudogen koji je izgleda humani pseudogen ADAM6 prisutan je između tih VHgenskih segmenata, tj., između humanih VH1-2 i VH1-6. Međutim, mužjaci miša koji sadrže tu humanu intergensku sekvencu ispoljavaju smanjenu plodnost.
[0129] Opisani su miševi koji sadrže zamenjene lokuse kao što je opisano iznad, i koji takođe sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6, gde miševi ispoljavaju suštinski normalnu plodnost. U jednom izvođenju, ektopična sekvenca nukleinske kiseline obuhvata sekvencu ili funkcionalne fragmente mišjeg ADAM6a i/ili mišjeg ADAM6b smeštene između humanih VH1-2 i humanih VH6-1 na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. U jednom izvođenju, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je SEQ ID NO:3, smeštena između humanih VH1-2 i humanih VH6-1 na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Smer transkripcije gena ADAM6 SEQ ID NO:3 suprotan je u odnosu na smer transkripcije okolnih humanih VHgenskih segmenata. Premda primeri ovde pokazuju oporavak plodnosti smeštanjem ektopične sekvence između naznačenih humanih VHgenskih segmenata, stručnjaci će prepoznati da će se očekivati da smeštanje ektopične sekvence na bilo koji pogodan transkripciono-permisivan lokus u mišjem genomu (ili čak ekstrahromozomno) slično oporavi plodnost kod mužjaka miša.
[0130] Fenomen dopunjavanja miša kome nedostaje funkcionalni lokus ADAM6 ektopičnom sekvencom koja obuhvata mišji gen ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment jeste generalni postupak koji je primenljiv na oporavljanje bilo kojih miševa sa nefunkcionalnim ili minimalno funkcionalnim endogenim lokusima ADAM6. Prema tome, mnogo miševa koji sadrže modifikaciju koja remeti ADAM6 lokusa teškog lanca imunoglobulina mogu se oporaviti kompozicijama i postupcima iz pronalaska. Shodno tome, pronalazak obuhvata miševe sa širokom raznovrsnošću modifikacija lokusa teškog lanca imunoglobulina koje kompromituju endogenu funkciju ADAM6. Neki (neograničavajući) primeri obezbeđeni su u ovom opisu. Kao dodatak opisanim ®
VELOCIMMUNE miševima, kompozicije i postupci koji se odnose na ADAM6 mogu se upotrebljavati u ogromnom broju primena, npr., kada se modifikuje lokus teškog lanca na mnogo različitih načina.
[0131] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VH genskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata humanim DH i humanim JH genskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region. U jednom izvođenju, miš pravi jedan protein koji vezuje varijabilni domen koji je dimer lanaca imunoglobulina izabranih od: (a) humanog VH- mišjeg CH1 - mišjeg CH2 - mišjeg CH3; (b) humanog VH- mišjeg zglobnog - mišjeg CH2 - mišjeg CH3; i, (c) humanog VH- mišjeg CH2 - mišjeg CH3.
[0132] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja oporavlja plodnost smešta se unutar humane sekvence varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (npr., između humanih VH1-2 i VH1-6 genskih segmenata) u mišu koji ima zamenu jednog ili više mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina (mVH, mDH, i/ili mJH) jednim ili većim brojem humanih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina (hVH, hDH, i/ili hJH), i miš dalje sadrži zamenu jednog ili više mišjih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina (mVκ’s and/or mJκ’s) jednim ili većim brojem humanih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina (hVκ’s and/or hJκ’s).
[0133] U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina obuhvata oko tri megabaze mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina obuhvata barem 89 VHgenskih segmenata, barem 13 DHgenskih segmenata, barem četiri JHgenska segmenta ili njihovu kombinaciju, mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina obuhvata oko jednu megabazu humanog lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina obuhvata barem 80 VHgenskih segmenata, barem 27 DHgenskih segmenata, barem šest JHgenskih segmenata ili njihovu kombinaciju, humanog lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0134] U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata oko tri megabaze mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više mišjih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata barem 137 Vκ genskih segmenata, barem pet Jκ genskih segmenata ili njihovu kombinaciju, mišjeg lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata oko pola megabaze humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata približno ponavljanje (u odnosu na κ konstantni region imunoglobulina) humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, jedan ili više humanih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata barem 40Vκ genskih segmenata, barem pet Jκ genskih segmenata ili njihovu kombinaciju humanog lokusa κ lakog lanca imunoglobulina.
[0135] U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca smeštena je između dva humana genska segmenta imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, dva humana genska segmenta imunoglobulina su genski segmenti teškog lanca. U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca smeštena je između humanog VH1-®
2 genskog segmenta i humanog VH1-6 genskog segmenta u VELOCIMMUNE mišu (US 6,596,541 i US ®
7,105,348). U jednom izvođenju, tako modifikovan VELOCIMMUNE miš obuhvata zamenu mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina sa barem 80 humanih VHgenskih segmenata, 27 humanih DHgenskih segmenata i šest humanih JHgenskih segmenata, i zamenu mišjih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca imunoglobulina sa barem 40 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata.
[0136] U jednom aspektu, funkcionalni mišji lokus ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) prisutan je usred humanih VHgenskih segmenata koji zamenjuju endogene mišje VHgenske segmente. U jednom izvođenju, barem 89 mišjih VHgenskih segmenata uklonjeno je i zamenjeno jednim ili većim brojem humanih VHgenskih segmenata, i mišji lokus ADAM6 prisutan je neposredno pored 3’ kraja humanih VHgenskih segmenata, ili između dva humana VHgenska segmenta. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 prisutan je između dva VHgenska segmenta unutar oko 20 kilo baza (kb) do oko 40 kilo baza (kb) 3’ terminusa insertovanih humanih VHgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 prisutan je između dva VHgenska segmenta unutar oko 29 kb do oko 31 kb 3’ terminusa insertovanih humanih VH genskih segmenata. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 prisutan je unutar oko 30 kb 3’ terminusa insertovanih humanih VH genskih segmenata. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 prisutan je unutar oko 30,184 bp 3’ terminusa insertovanih humanih VH genskih segmenata. U specifičnom izvođenju, zamena uključuje humane VHgenske segmente VH1-2 i VH6-1, i mišji lokus ADAM6 prisutan je nishodno od VH1-2 genskog segmenta i ushodno od VH6-1 genskog segmenta. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 prisutan je između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta, pri čemu je 5’ kraj mišjeg lokusa ADAM6 oko 13,848 bp od 3’ terminusa humanog VH1-2 genskog segmenta i 3’ kraj lokusa ADAM6 je oko 29,737 bp 5’ humanog VH6-1 genskog segmenta. U specifičnom izvođenju, mišji lokus ADAM6 obuhvata SEQ ID NO:3 ili njegov fragment koji daje funkciju ADAM6 unutar ćelija miša. U specifičnom izvođenju, raspored humanih VHgenskih segmenata je tada sledeći (od ushodnog do nishodnog u odnosu na smer transkripcije humanih VHgenskih segmenata): humani VH1-2 - mišji lokus ADAM6 - humani VH6-1. U specifičnom izvođenju, pseudogen ADAM6 između humanog VH1-2 i humanog VH6-1 zamenjen je mišjim lokusom ADAM6. U jednom izvođenju, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg lokusa ADAM6 suprotna je u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VHgenskih segmenata. Alternativno, mišji lokus ADAM6 prisutan je u intergenskom regionu između 3’-najvišeg humanog VHgenskog segmenta i 5’-najvišeg DHgenskog segmenta. To može biti slučaj bilo da je 5’-najviši DHsegment mišji ili humani.
[0137] Slično, miš modifikovan sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata (npr., Vκ ili Vλ, segmenti) koji zamenjuju sve ili u suštini sve endogene mišje VHgenske segmente može se modifikovati tako da bilo zadržava endogeni mišji lokus ADAM6, kao što je opisano iznad, npr., korišćenjem ciljnog vektora koji ima nishodni homologni krak koji uključuje mišji lokus ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment, ili zamenjuje oštećeni mišji lokus ADAM6 ektopičnom sekvencom smeštenom između dva humana VLgenska segmenta ili između humanih VLgenskih segmenata i DHgenskog segmenta (bilo humanih ili mišjih, npr., Vλ, m/hDH), ili J genskog segmenta (bilo humanog ili mišjeg, npr., Vκ JH). U jednom izvođenju, zamena uključuje dva ili više humanih VLgenskih segmenata, i mišji lokus ADAM6 ili njegov funkcionalni fragment prisutan je između dva 3’-najviša VLgenska segmenta. U specifičnom izvođenju, raspored humanih VLgenskih segmenata je tada sledeći (od ushodnog do nishodnog u odnosu na smer transkripcije humanih genskih segmenata): humani VL3’-1 - mišji lokus ADAM6 humani VL3’. U jednom izvođenju, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg lokusa ADAM6 suprotna je u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VL genskih segmenata. Alternativno, mišji lokus ADAM6 prisutan je u intergenskom regionu između 3’-najvišeg humanog VLgenskog segmenta i 5’-najvišeg DHgenskog segmenta. To može biti slučaj bilo da je 5’-najviši DHsegment mišji ili humani.
[0138] U različitim aspektima, korišćenje miševa koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment korisno je kada modifikacije remete funkciju endogenog mišjeg ADAM6. Verovatnoća poremećaja funkcije endogenog mišjeg ADAM6 je visoka kada se prave modifikacije lokusa imunoglobulina, posebno kada se modifikuju mišji varijabilni regioni teškog lanca imunoglobulina i okolne sekvence. Stoga, takvi miševi obezbeđuju poseban benefit kada se prave miševi sa lokusima teškog lanca imunoglobulina koji su deletirani u celosti ili delimično, humanizovani u celosti ili delimično, ili zamenjeni (npr., Vκ ili Vλ, sekvencama) u celosti ili delimično. Postupci za pravljenje opisanih genskih modifikacija za miševe koji su opisani ispod poznati su stručnjacima u oblasti tehnike.
[0139] Miševi koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji protein ADAM6, ili u suštini identičan ili sličan protein koji daje benefite plodnosti mišjeg proteina ADAM6, posebno su korisni u konjunkciji sa modifikacijama mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca imunoglobulina koje remete ili deletiraju endogenu mišju sekvencu ADAM6. Premda primarno opisani u vezi sa miševima koji eksprimuju antitela sa humanim varijabilnim regionim i mišjim konstantnim regionima, takvi miševi korisni su u vezi sa bilo kakvim genskim modifikacijama koje remete endogene mišje gene ADAM6. Stručnjaci će prepoznati da to obuhvata široku raznovrsnost genetički modifikovanih miševa koji sadrže modifikacije mišjih varijabilnih genskih lokusa teškog lanca imunoglobulina. Ovi uključuju, na primer, miševe sa delecijom ili zamenom svih ili dela mišjih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina, bez obzira na druge modifikacije. Neograničavajući primeri opisani su ispod.
[0140] U nekim aspektima, obezbeđeni su genetički modifikovani miševi koji sadrže ektopični mišji, glodarski, ili drugi gen ADAM6 (ili ortolog ili homolog ili fragment) funkcionalan u mišu, i jedan ili više humanih genskih segmenata varijabilnog i/ili konstantnog regiona imunoglobulina. U različitim izvođenjima, drugi ortolozi ili homolozi ili fragmenti gena ADAM6 funkcionalni u mišu mogu uključivati sekvence iz goveđih, psećih, primatskih, zečjih ili drugih ne-humanih sekvenci.
[0141] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6, zamenu svih ili u suštini svih mišjih VHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VH genskih segmenata; zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata jednim ili većim brojem humanih DHgenskih segmenata; i zamenu svih ili u suštini svih mišjih JHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih JHgenskih segmenata.
[0142] U jednom izvođenju, miš dalje sadrži zamenu mišje CH1 nukleotidne sekvence humanom CH1 nukleotidnom sekvencom. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži zamenu mišje zglobne nukleotidne sekvence humanom zglobnom nukleotidnom sekvencom. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži zamenu varijabilnog lokusa lakog lanca imunoglobulina (VLand JL) humanim varijabilnim lokusom lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, miš dalje sadrži zamenu mišje nukleotidne sekvence konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina humanom nukleotidnom sekvencom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, VL, JL, i CLsu sekvence κ lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, miš sadrži mišju CH2 i mišju CH3 sekvencu konstantnog regiona imunoglobulina spojenu sa humanom zglobnom i humanom CH1 sekvencom, tako da se mišji lokusi imunoglobulina rearanžiraju da bi obrazovali gen koji kodira vezujući protein koji obuhvata (a) teški lanac koji ima humani varijabilni region; i (b) gen koji kodira laki lanac imunoglobulina koji obuhvata humani varijabilni domen i humani konstantni region.
[0143] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6, zamenu svih ili u suštini svih mišjih VHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VLgenskih segmenata, i opciono zamenu svih ili u suštini svih DHgenskih segmenata i/ili JH genskih segmenata jednim ili većim brojem humanih DH genskih segmenata i/ili humanih JH genskih segmenata, ili opciono zamenu svih ili u suštini svih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata jednim ili većim brojem humanih JLgenskih segmenata.
[0144] U jednom izvođenju, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH, DH, i JH genskih segmenata jednim ili većim brojem VL, jednim ili većim brojem DH, i jednim ili većim brojem J genskih segmenata (npr., Jκ ili Jλ), pri čemu su genski segmenti u operativnoj vezi sa endogenim mišjim zglobnim regionom, pri čemu miš obrazuje rearanžirani gen lanca imunoglobulina koji sadrži, od 5’ do 3’ u smeru transkripcije, humani VL- humani ili mišji DH humani ili mišji J - mišji zglobni - mišji CH2 -mišji CH3. U jednom izvođenju, J region je humani Jκ region. U jednom izvođenju, J region je humani JH region. U jednom izvođenju, J region je humani Jλ region. U jednom izvođenju, humani VLregion izabran je od humanog Vλ, regiona i humanog Vκ regiona.
[0145] U specifičnim izvođenjima, miš eksprimuje antitelo sa jednim varijabilnim domenom koje ima mišji ili humani konstantni region i varijabilni region izveden iz humanog Vκ, humanog DHi humanog Jκ; humanog Vκ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vκ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jκ. U specifičnom izvođenju, sekvence za prepoznavanje rekombinacije modifikuju se tako da omogućavaju javljanje produktivnih rearanžiranja između navedenih V, D, i J genskih segmenata ili između navedenih V i J genskih segmenata.
[0146] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DHgenskih segmenata i JHgenskih segmenata humanim JLgenskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region.
[0147] U jednom izvođenju, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domain. U jednom izvođenju, mišu nedostaje sekvenca koja kodira zglobni region. U jednom izvođenju, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen i zglobni domen.
[0148] U specifičnom izvođenju, miš eksprimuje vezujući protein koji obuhvata humani varijabilni domen (λ ili κ) lakog lanca imunoglobulina spojen sa mišjim CH2 domenom koji je vezan za mišji CH3 domen.
[0149] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži ektopičnu sekvencu ADAM6 koja kodira funkcionalni protein ADAM6 (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DHi JHgenskih segmenata humanim JLgenskim segmentima.
[0150] U jednom izvođenju, miš sadrži deleciju genske sekvence konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koja kodira CH1 region, zglobni region, CH1 i zglobni region, ili CH1 region i zglobni region i CH2 region.
[0151] U jednom izvođenju, miš pravi vezujući protein sa jednim varijabilnim domenom koji obuhvata homodimer izabran od sledećih: (a) humani VL- mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VL- mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3; (c) humani VL- mišji CH2 - mišji CH3.
[0152] U jednom aspektu, obezbeđen je miš sa onesposobljenim endogenim lokusom teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata onesposobljeni ili deletirani endogeni mišji lokus ADAM6, pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja eksprimuje humano ili mišje ili humano/mišje ili drugo himerno antitelo. U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline prisutna je na integrisanom transgenu koji je nasumično integrisan u mišji genom. U jednom izvođenju, sekvenca nukleinske kiseline je ona epizomu (npr., hromozomu) koji se ne pronalazi kod miša divljeg tipa.
[0153] U jednom izvođenju, miš dalje sadrži onesposobljeni endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina izabran je od lokusa kapa (κ) i lambda (λ) lakog lanca. U specifičnom izvođenju, miš sadrži onesposobljeni endogeni lokus κ lakog lanca i onesposobljeni lokus λ lakog lanca, pri čemu miš eksprimuje antitelo koje obuhvata humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina i humani domen lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, humani domen lakog lanca imunoglobulina izabran je od humanog domena κ lakog lanca i humanog domena λ lakog lanca.
[0154] U jednom aspektu, obezbeđen je genetički modifikovan miš koji eksprimuje himerno antitelo i eksprimuje mišji protein ADAM6 ili njego ortolog ili homolog koji je funkcionalan u genetički modifikovanom mišu.
[0155] U jednom izvođenju, protein ADAM6 je iz mišjeg soja koji je različit soj od genetički modifikovanog miša.
[0156] U jednom izvođenju, himerno antitelo sadrži humani varijabilni domen i sekvencu konstantnog regiona glodara. U jednom izvođenju, glodar je izabran od glodara iz porodice Cricetidae i glodara iz porodice Muridae. U specifičnom izvođenju, glodar iz porodice Cricetidae i iz porodice Muridae je miš. U specifičnom izvođenju, glodar iz porodice Cricetidae i iz porodice Muridae je pacov. U jednom izvođenju, himerno antitelo obuhvata humani varijabilni domen i konstantni domen iz životinje izbrane od miša ili pacova; u specifičnom izvođenju, miš ili pacov su izabrani iz porodice Cricetidae i porodice Muridae. U jednom izvođenju, himerno antitelo obuhvata humani varijabilni domen teškog lanca, humani varijabilni domen lakog lanca i sekvencu konstantnog regiona izvedenu iz glodara izabranog od miša ili pacova, pri čemu su humani varijabilni domen teškog lanca i humani laki lanac srodni. U specifičnom izvođenju, srodnost uključuje da su varijabilni domeni humanog teškog lanca i humanog lakog lanca iz jedne B ćelije koja eksprimuje varijabilni domen humanog lakog lanca i varijabilni domen humanog teškog lanca zajedno i varijabilni domeni su prisutni zajedno na površini individualne B ćelije.
[0157] U jednom izvođenju, himerno antitelo eksprimuje se iz lokusa imunoglobulina. U jednom izvođenju, varijabilni domen teškog lanca i himerno antitelo eksprimuju se iz rearanžiranog endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, varijabilni domen lakog lanca himernog antitela eksprimuje se iz rearanžiranog endogenog lokusa lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, varijabilni domen teškog lanca himernog antitela i/ili varijabilni domen lakog lanca himernog antitela eksprimuje se iz rearanžiranog trans-gena (npr., rearanžirane sekvence nukleinske kiseline izvedene iz nerearanžirane sekvence nukleinske kiseline integrisane u genom životinje na lokusu koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina). U jednom izvođenju, varijabilni domen lakog lanca himernog antitela eksprimuje se iz rearanžiranog transgena (npr., rearanžirane sekvence nukleinske kiseline izvedene iz nerearanžirane sekvence nukleinske kiseline integrisane u genom životinje na lokusu koji je drugačiji od endogenog lokusa imunoglobulina).
[0158] U specifičnom izvođenju, transgen se eksprimuje iz transkripciono aktivnog lokusa, npr., lokusa ROSA26, npr., mišjeg (murine) lokusa ROSA26 (npr., miša).
[0159] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina, pri čemu humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina obuhvata mišju sekvencu ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog.
[0160] U jednom izvođenju, humanizovani lokus teškog lanca obuhvata jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više DHgenskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata operativno su povezani sa jednim ili više humanih, himernih i/ili glodarskih (npr., miša ili pacova) gena konstantnog regiona. U jednom izvođenju, geni konstantnog regiona su mišji. U jednom izvođenju, geni konstantnog regiona su pacovski. U jednom izvođenju, geni konstantnog regiona su od hrčka. U jednom izvođenju, geni konstantnog regiona obuhvataju sekvencu izabranu od zglobne, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U specifičnom izvođenju, geni konstantnog regiona obuhvataju zglobnu, CH2, i CH3 sekvencu.
[0161] U jednom izvođenju, ne-humana sekvenca ADAM6 je susedna sa humanom sekvencom teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, ne-humana sekvenca ADAM6 smeštena je unutar humane sekvence teškog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, humana sekvenca teškog lanca imunoglobulina obuhvata V, D i/ili J genski segment.
[0162] U jednom izvođenju, ne-humana sekvenca ADAM6 smeštena je između dva V genska segmenta. U jednom izvođenju, ne-humana sekvenca ADAM6 smeštena je neposredno između V i D genskog segmenta. U jednom izvođenju, mišja sekvenca ADAM6 smeštena je između V i J genskog segmenta. U jednom izvođenju, mišja sekvenca ADAM6 smeštena je neposredno između D i J genskog segmenta.
[0163] U jednom aspektu, obezbeđen je miš koji sadrži humanu sekvencu imunoglobulina neposredno uz ne-humanu sekvencu koja kodira protein ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment.
[0164] U jednom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina je sekvenca teškog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, sekvenca imunoglobulina obuhvata jedan ili više VHgenskih segmenata. U jednom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina sadrži jedan ili više DHgenskih segmenata. U jednom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina sadrži jedan ili više JHgenskih segmenata. U jednom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina sadrži jedan ili više VHgenskih segmenata, jedan ili više DHgenskih segmenata i jedan ili više JHgenskih segmenata.
[0165] U jednom izvođenju, sekvenca imunoglobulina obuhvata jedan ili više VH genskih segmenata ima visoku učestalost u prirodnim humanim repertoarima. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VH genskih segmenata obuhvataju ne više od dva VHgenska segmenta, ne više od tri VHgenska segmenta, ne više od četiri VHgenska segmenta, ne više od pet VHgenskih segmenata, ne više od šest VHgenskih segmenata, ne više od sedam VH genskih segmenata, ne više od osam VHgenskih segmenata, ne više od devet VH genskih segmenata, ne više od 10 VH genskih segmenata, ne više od 11 VH genskih segmenata, ne više od 12 VHgenskih segmenata, ne više od 13 VHgenskih segmenata, ne više od 14 VHgenskih segmenata, ne više od 15 VHgenskih segmenata, ne više od 16 VHgenskih segmenata, ne više od 17 VHgenskih segmenata, ne više od 18 VHgenskih segmenata, ne više od 19 VHgenskih segmenata, ne više od 20 VH genskih segmenata, ne više od 21 VH genskog segmenta, ne više od 22 VH genska segmenta ili ne više od 23 VH genska segmenta.
[0166] U specifičnom izvođenju, jedan ili više VH genskih segmenata obuhvataju pet VH genskih segmenata. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHgenskih segmenata obuhvataju 10 VHgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHgenskih segmenata obuhvataju 15 VHgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, jedan ili više VHgenskih segmenata obuhvataju 20 VHgenskih segmenata.
[0167] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 i VH3-74.
[0168] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 i VH6-1.
[0169] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 i VH5-51.
[0170] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 i VH5-51.
[0171] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 i VH4-59.
[0172] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 i VH4-39.
[0173] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH1-18, VH3-23 i VH4-39.
[0174] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH3-21, VH3-23 i VH3-30.
[0175] U različitim izvođenjima, VHgenski segmenti izabrani su od VH3-23, VH3-30 i VH4-39.
[0176] U specifičnom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina obuhvata barem 18 VHgenskih segmenata, 27 DHgenskih segmenata i šest JHgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina obuhvata barem 39 VHgenskih segmenata, 27 DHgenskih segmenata i šest JHgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, humana sekvenca imunoglobulina obuhvata barem 80 VHgenskih segmenata, 27 DHgenskih segmenata i šest JHgenskih segmenata.
[0177] U jednom izvođenju, miš sadrži zamenu endogenih mišjih VHgenskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VHgenskih segmenata, pri čemu su humani VHgenski segmenti operativno povezani sa mišjim genom CHregiona, tako da miš rearanžira humane VHgenske segmente i eksprimuje reverzni himerni teški lanac imunoglobulina koji obuhvata humani VHdomen i mišji CH. U jednom izvođenju, 90–100% nerearanžiranih mišjih VHgenskih segmenata zemenjuje se barem jednim nerearanžiranim humanim VHgenskim segmentom. U specifičnom izvođenju, svi ili u suštini svi od endogenih mišjih VHgenskih segmenata zamenjuju se barem jednim nerearanžiranim humanim VHgenskim segmentom. U jednom izvođenju, zamena je sa barem 19, barem 39, ili barem 80 ili 81 nerearanžiranim humanim VH genskim segmentom. U jednom izvođenju, zamena je sa barem 12 funkcionalnih nerearanžiranih humanih VH genskih segmenata, barem 25 funkcionalnih nerearanžiranih humanih VHgenskih segmenata, ili barem 43 funkcionalna nerearanžirana humana VH genska segmenta. U jednom izvođenju, miš sadrži zamenu svih mišjih DHi JHsegmenata barem jednim nerearanžiranim humanim DHsegmentom i barem jednim nerearanžiranim humanim JHsegmentom. U jednom izvođenju, barem jedan nerearanžirani humani DHsegment izabran je od 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, i njihove kombinacije. U jednom izvođenju, barem jedan nerearanžirani humani JH segment izabran je od 1, 2, 3, 4, 5, 6, i njihove kombinacije. U specifičnom izvođenju, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata bira se od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanog VH genskog segmenta, i njihove kombinacije.
[0178] U različitim izvođenjima, humana sekvenca imunoglobulina je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji miša. U jednom izvođenju, konstantni region je humani, himerni humano/mišji ili himerni humano/pacovski ili himerni humani/od hrčka, mišji, pacovski, ili konstantni region hrčka. U jednom izvođenju, konstantni region je konstantni region glodara (npr., miša ili pacova ili hrčka). U specifičnom izvođenju, glodar je miš ili pacov. U različitim izvođenjima, konstantni region obuhvata barem CH2 domen i CH3 domen.
[0179] U jednom izvođenju, humana sekvenca teškog lanca imunoglobulina nalazi se na lokusu teškog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša. U jednom izvođenju, humana sekvenca teškog lanca imunoglobulina nalazi se na ne-imunoglobulinskom lokusu teškog lanca u germinativnoj liniji miša, pri čemu je lokus ne-teškog lanca transkripciono aktivan lokus. U specifičnom izvođenju, lokus ne-teškog lanca je lokus ROSA26.
[0180] U različitim aspektima, miš dalje sadrži humanu sekvencu lakog lanca imunoglobulina (npr., jednu li više nerearanžiranih V i J sekvenci lakog lanca, ili jednu ili više rearanžiranih VJ sekvenci) u germinativnoj liniji miša. U specifičnom izvođenju, sekvenca lakog lanca imunoglobulina je sekvenca κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina obuhvata jedan ili više VLgenskih segmenata. U jednom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina obuhvata jedan ili više JLgenskih segmenata. U jednom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina obuhvata jedan ili više VLgenskih segmenata i jedan ili više JLgenskih segmenata. U specifičnom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina obuhvata barem 16 Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata. U specifičnom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina obuhvata barem 30 Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata. U specifičnom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina obuhvata barem 40 Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata. U različitim izvođenjima, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova ili hrčka). U jednom izvođenju, konstantni region je humani, himerni humani/glodarski, mišji, pacovski, ili konstantni region hrčka. U specifičnom izvođenju, konstantni region je mišji ili pacovski konstantni region. U specifičnom izvođenju, konstantni region je mišji κ konstantni (mCκ) region ili pacovski κ konstantni (rCK) region.
[0181] U jednom izvođenju, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih Vκ i Jκ genskih segmenata sa barem šest humanih Vκ genskih segmenata i barem jednim Jκ genskim segmentom. U jednom izvođenju, svi ili u suštini svi Vκ i Jκ genski segmenti zamenjuju se sa barem 16 humanih Vκ genskih segmenata (humani Vκ) i barem jednim Jκ genskim segmentom. U jednom izvođenju, svi ili u suštini svi Vκ i Jκ genski segmenti zamenjuju se sa barem 30 humanih Vκ genskih segmenata i barem jednim Jκ genskim segmentom. U jednom izvođenju, svi ili u suštini svi Vκ i Jκ genski segmenti zamenjuju se sa barem 40 humanih Vκ genskih segmenata i barem jednim Jκ genskim segmentom. U jednom izvođenju, barem jedan Jκ genski segment obuhvata dva, tri, četiri, ili pet humanih JK genskih segmenata.
[0182] U jednom izvođenju, humani Vκ genski segmenti obuhvataju Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, i Vκ1-6. U jednom izvođenju, Vκ genski segmenti obuhvataju Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ2-13, Vκ2-14, Vκ3-15 i Vκ1-16. U jednom izvođenju, humani Vκ genski segmenti obuhvataju Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, i Vκ2-30. U jednom izvođenju, humani Vκ genski segmenti obuhvataju Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i Vκ2-40.
[0183] U specifičnom izvođenju, Vκ genski segmenti obuhvataju susedne humane κ genske segmente imunoglobulina koji premošćuju humani lokus κ lakog lanca imunoglobulina od Vκ4-1 preko Vκ2-40, i Jκ genski segmenti obuhvataju susedne genske segmente koji premošćuju humani lokus κ lakog lanca imunoglobulina od Jκ1 preko Jκ5.
[0184] U jednom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina nalazi se na lokusu lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša. U specifičnom izvođenju, lokus lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša je lokus κ lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, humana sekvenca lakog lanca imunoglobulina nalazi se na ne-imunoglobulinskom lokusu lakog lanca u germinativnoj liniji miša koji je transkripciono aktivan. U specifičnom izvođenju, ne-imunoglobulinski lokus je lokus ROSA26.
[0185] Ovde je prikazan, ali nije deo pronalaska, postupak za pravljenje humanog antitela, pri čemu humano antitelo obuhvata varijabilne domene izvedene iz jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona kodiranih u ćeliji miša kao što je opisano ovde.
[0186] Ovde je prikazana, ali nije deo pronalaska, farmaceutska kompozicija koja obuhvata polipeptid koji obuhvata antitelo ili fragment antitela koji je izveden iz jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona izolovanih iz miša kao što je opisano ovde. U jednom izvođenju, polipeptid je antitelo. U jednom izvođenju, polipeptid je antitelo sa samo teškim lancem. U jednom izvođenju, polipeptid je jednolančani varijabilni fragment (npr., scFv).
[0187] Ovde je prikazana, ali nije deo pronalaska, upotreba miša kao što je opisano ovde za pravljenje antitela. U različitim izvođenjima, antitelo obuhvata jedan ili više varijabilnih domena koji su izvedeni iz jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog domena izolovanih iz miša. U specifičnom izvođenju, sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona obuhvataju genske segmente teškog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona obuhvataju genske segmente lakog lanca imunoglobulina.
PRIMERI
[0188] Sledeći primeri obezbeđeni su da bi se opisalo kako se prave i upotrebljavaju postupci i kompozicije iz pronalaska, i nije predviđeno da ograničavaju obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Osim ako nije naznačeno drugačije, temperatura je naznačena u Celzijusima, a pritisak je na ili blizu atmosferskom.
Primer 1
Humanizacija mišjih gena imunoglobulina
[0189] Humani i mišji bakterijski veštački hromozomi (BAC-ovi) upotrebljeni su za konstruisanje 13 različitih BAC ciljnih vektora (BACvecs) za humanizaciju mišjih lokusa teškog lanca i κ lanca imunoglobulina. Tabele 1 i 2 iznose opise koraka izvedenih za konstruisanje svih BACvecs korišćenih za humanizaciju mišjih lokusa teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina, tim redom.
[0190] Identifikacija humanih i mišjih BAC-ovi. Mišji BAC-ovi koji premošćuju 5’ i 3’ krajeve lokusa teškog lanca i κ lanca imunoglobulina identifikovani su hibridizacijom filtera istačkanih BAC bibliotekom ili PCR skriningom DNK pulova mišje BAC biblioteke. Filteri su hibridizovani pod standardnim uslovima pomoću sondi koje odgovaraju regionima od interesa. Pulovi biblioteka testirani su PCR-om pomoću jedinstvenih parova prajmera koji flankiraju ciljani region od interesa. Izveden je dodatni PCR pomoću istih prajmera da bi se dekonvulirao dati bunarčić i izolovao odgovarajući BAC od interesa. Oba BAC filtera i pulovi biblioteka stvoreni su iz 129 SvJ mišjih ES ćelija (Incyte Genomics/Invitrogen). Humani BAC-ovi koji pokrivaju čitave lokuse teškog lanca i κ lanca imunoglobulina identifikovani su bilo hibridizacijom filtera istačkanih BAC bibliotekom (Caltech B, C, ili D biblioteke & RPCI-11 biblioteka, Research Genetics/lnvitrogen) putem skrininga humanih pulova BAC biblioteka (Caltech biblioteka, Invitrogen) postupkom zasnovanim na PCR-u ili upotrebljavajući BAC i bazu podataka sekvenci (Caltech D biblioteka, TIGR).
[0191] Konstruisanje BACvecs bakterijskom homolognom rekombinacijom i ligacijom. Bakterijska homologna rekombinacija (BHR) izvedena je kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003; Zhang et al., 1998, A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nat Genet 20:123-128). U većini slučajeva, linearni fragmenti stvoreni su ligacijom homolognih box-ova generisanih PCR-om za klonirane kasete za čim je sledilo izolovanje na gelu proizvoda ligacije i elektroporacija u BHR-kompetentnu bakteriju koja nosi ciljani BAC. Nakon selekcije na odgovarajućim petrijevim posudama sa antibioticima, ispravno rekombinovani BAC-ovi identifikovani su PCR-om duž oba nova spoja za čim je sledila restrikciona analiza na gelovima sa pulsnim poljem (Schwartz and Cantor, 1984, Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis, Cell 37:67-75) i provera tačaka PCR-om pomoću prajmera raspoređenih po humanim sekvencama.
[0192] 3hVHBACvec konstruisan je pomoću tri uzastopna koraka BHR za početni korak humanizacije lokusa teškog lanca imunoglobulina (SL.4A i Tabela 1). U prvom koraku (Korak 1), kaseta je uvedena u humani roditeljski BAC ushodno od humanog VH1-3 genskog segmenta koji sadrži region homologije sa mišjim lokusom teškog lanca imunoglobulina (HB1), gen koji daje rezistenciju na kanamicin u bakterijama i rezistenciju na G418 u životinjskim ćelijama (kanR) i mesto rekombinacije specifične za mesto (npr., IoxP). U drugom koraku (Korak 2), druga kaseta uvedena je upravo nishodno od poslednjeg JHsegmenta koji sadrži drugi region homologije sa mišjim lokusom teškog lanca imunoglobulina (HB2) i gen koji daje rezistenciju u bakterijama na spektinomicin (specR). Drugi korak je uključivao deletiranje humanih sekvenci lokusa teškog lanca imunoglobulina nishodno od JH6 i gena rezistencije na hloramfenikol BAC vektora (cmR). U trećem koraku (Korak 3), dvostruko modifikovan BAC (B1) bio je tada linearizovan pomoću mesta I-Ceul koja su dodata tokom prva dva koraka i integrisana u mišji BAC (B2) BHR-om putem dva regiona homologije (HB1 i HB2). Izbori lekova za prvi (cm/kan), drugi (spec/kan) i treći (cm/kan) korak dizajnirani su da budu specifiči za željene proizvode. Modifikovani klonovi BAC-a analizirani su elektroforezom gela sa pulsnim poljem (PFGE) nakon digestije sa restrikcionim enzimima da bi se odredila odgovarajuća konstrukcija (SL.4B).
[0193] Na sličan način, 12 dodatnih BACvecs konstruisano je za humanizaciju lokusa teškog lanca i κ lakog lanca. U nekim slučajevima, ligacija BAC-a izvedena je umesto BHR-a da bi se sjedinila dva velika BAC-a putem uvođenja retkih restrikcionih mesta u oba roditeljska BACvecs BHR-om zajedno sa pažljivim smeštanjem selektibilnih markera. To je omogućilo preživljavanje željenih proizvoda ligacije nakon selekcije sa specifičnim kombinacijama markera lekova. Rekombinantni BAC-ovi dobijeni ligacijom nakon digestije sa retkim restrikcionim enzimima identifikovani su i testirani na sličan način kao oni dobijeni BHR-om (kao što je opisano iznad).
Tabela 1
(nastavak)
Tabela 2
[0194] Modifikacija embrionskih matičnih (ES) ćelija i stvaranje miševa. Ciljanje ES ćelija (F1H4) izvedeno je postupkom genetičkog inženjeringa VELOCIGENEO kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003). Izvođenje miševa iz modifikovanih ES ćelija bilo blastocistom (Valenzuela et al., 2003) ili 8-ćelijskim ubrzigavanjem (Poueymirou et al., 2007, F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99) obavljeno je kao što je opisano. Ciljane ES ćelije i miševi potvrđeni su skriningom DNK iz ES ćelija ili miševa jedinstvenim setom sondi i prajmera u testu zasnovanom na PCR-u (npr., SL.3A, 3B i 3C). Sve studije miševe nadgledane su i odobrene od strane Regeneronovog komiteta za brigu o institucionalnim životinjama i njihovu upotrebu (IACUC).
[0195] Analiza kariotipa i fluorescentna hibridizacija in situ (FISH). Analiza kariotipa izvedena je pomoću Coriell ćelijskih repozitorijuma (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). FISH je izvedena na ciljanim ES ćelijama kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003). Sonde koje su odgovarale bilo mišjoj DNK BAC-a ili humanoj DNK BAC-a obeležene su „nick“ translacijom (Invitrogen) sa spektralnom narandžastom ili spektralnom zelenom fluorescentno obeleženih dUTP nukleotida (Vysis).
[0196] Varijabilni genski lokus teškog lanca imunoglobulina. Humanizacija varijabilnog regiona lokusa teškog lanca postignuta je u devet uzastopnih koraka direktnim zamenjivanjem oko tri miona baznih parova (Mb) susednih mišjih genomskih sekvenci koje sadrže sve VH, DHi JHgenske segmente oko jednom Mb neposredno susednih humanih genomskih sekvenci koje sadrže ekveivalentne humane ®
genske segmente (SL.1A i Tabela 1) tehnologijom genetičkog inženjeringa VELOCIGENE (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003).
[0197] Intron između JHgenskih segmenata i gena konstantnog regiona (J-C intron) sadrži transkripcioni pojačivač (Neuberger, 1983, Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells, EMBO J 2:1373-1378) za kojim sledi region jednostavnih ponavljanja potrebnih za rekombinaciju tokom promene klase izotipa (Kataoka et al., 1980, Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch, PNAS USA 77:919-923). Spoj između humanog VH-DH-JHregiona i mišjeg CHregiona (proksimalni spoj) izbran je da održava da mišji intronski pojačivač teškog lanca i domen „prekidač“ u redu očuvaju i efikasnu ekspresiju i promenu klase humanizovanog lokusa teškog lanca u mišu. Tačan položaj nukleotida tog i sledećeg spoja u svim zamenama bio je moguć upotrebom postupka genetičkog ®
inženjeringa VELOCIGENE (supra), koji je koristio bakterijsku homolognu rekombinaciju usmeravanu sintetisanim oligonukleotidima. Prema tome, proksimalni spoj smešten je oko 200 bp nishodno od poslednjeg JHgenskog segmenta i distalni spoj smešten je nekoliko stotina ushodno najvišeg 5’ VHgenskog segmenta humanog lokusa i oko 9 kb nishodno od mišjeg VH1-86 genskog segmenta, takođe poznatog kao J558.55. Mišji VH1-86 (J558.55) genski segment je najdistalniji varijabilni genski segment teškog lanca, zabeležen kao pseudogen kod C57BL/6 miševa, ali potencijalno aktivan, mada sa slabom RSS sekvencom, u ciljanih 129 alela. Distalni kraj mišjeg lokusa teškog lanca navodno može sadržati kontrolne elemente koji regulišu ekspresiju i/ili rearanžiranje lokusa (Pawlitzky et al., 2006).
[0198] Prvo insertovanje humane sekvence DNK imunoglobulina u miša postignuto je pomoću 144 kb proksimalnog kraja humanog lokusa teškog lanca koji sadrži 3 VH, sve 27 DHi 9 JHhumane genske segmente insertovane u proksimalni kraj mišjeg lokusa IgH, sa istovremenom delecijom od 16.6 kb mišje genomske sekvence, pomoću oko 75 kb mišjih homolognih krakova (Korak A, SL.2A; Tabela 1 i 3, 3hVH). Taj veliki insert 144 kb i prateća delecija 16.6 kb izvedena je u jednom koraku (Korak A) koji se javljao sa učestalošću od 0.2% (Tabela 3). Pravilno ciljane ES ćelije bodovane su testom na gubitak urođenog alela (LONA) (Valenzuela et al., 2003) pomoću sondi unutar i flankirajući deletirane mišje sekvence i unutar insertovane humane sekvence, a integritet velikog humanog inserta potvrđen je pomoću višestrukih sondi koje su premošćavale čitav insert (SL.3A, 3B i 3C). Zato što je predviđeno mnogo rundi uzastopnog ciljanja ES ćelija, klonovi ciljanih ES ćelija u tom i svim sledećim koracima podvrgnuti su kariotipskoj analizi (supra) i samo oni klonovi koji su pokazivali kariotipe u barem 17 od 20 rasejavanja upotrebljavani su za sledeće korake.
[0199] Ciljane ES ćelije iz Koraka A ponovo su ciljane pomoću BACvec koji je proizvodio deleciju 19 kb na distalnom kraju lokusa teškog lanca (Korak B, SL.2A). BACvec iz Koraka B sadržao je gen rezistencije na higromicin (hyg) nasuprot genu rezistencije na neomicin (neo) koji je sadržan u BACvec-u iz Koraka A. Geni rezistencije iz dva BACvec-a konstruisani su tako da su, po uspešnom ciljanju na isti hromozom, približno tri Mb mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca koji sadrže sve mišje VHgenske segmente osim VH1-86 i sve DHgenske segmente osim DQ52, kao i dva gena rezistencije, flankirana mestima IoxP; DQ52 i svi mišji genski segmenti JHlanca deletirani su u Koraku A. Klonivi ES ćelije dvostruko ciljani na istom hromozomu identifikovani su usmeravanjem 3hVHproksimalne kasete do homozigotnosti u visokom G418 (Mortensen et al., 1992, Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct, Mol Cell Biol 12:2391-2395) i praćenjem sudbine distalne hyg kasete. Mišji segmenti sve do četiri Mb u veličini, budući da su modifikovani tako da su im flankirana mestima IoxP, uspešno su deletirani u ES ćelijama prolaznom ekspresijom CRE rekombinaze sa visokom efikasnošću (do ≈11%) čak i u odsustvu selekcije leka (Zheng et al., 2000, Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications, Mol Cell Biol 20:648-655). Na sličan način, pronalazači su postigli tri Mb delecije u 8% klonova ES ćelije nakon prolazne eskpresije CRE (Korak C, SL. 2A; Tabela 3). Delecija je bodovana testom LONA pomoću sondi na oba kraja deletirane mišje sekvence, kao i gubitkom neo i hyg i pojavom proizvoda PCR po tački delecije koja sadrži jedino preostalo mesto IoxP. Dalje, delecija je potvrđena fluorescentnom hibridizacijom in situ (podaci nisu prikazani).
[0200] Ostatak humanog varijabilnog regiona teškog lanca dodat je 3hVHalelu u seriji od 5 koraka
®
postupkom genetičkog ineženjeringa VELOCIGENE (Koraci E-H, SL. 2B), pri čemu je svaki korak uključivao precizno insertovanje do 210 kb humanih genskih sekvenci. Za svaki korak, proksimalni kraj svakog novog BACvec konstruisan je tako da preklapa većinu distalnih humanih sekvenci iz prethodnog koraka i distalni kraj svakog novog BACvec-a sadržao je isti distalni region mišje homologije kao što je upotrebljeno u Koraku A. BAC-vec-ovi iz koraka D, F i H sadržali su selekcionu kasetu neo, dok su oni iz koraka E i G sadržali selekcionu kasetu hyg, te su prema tome selekcije bile razmenjene između G418 i higromicina. Ciljanje u Koraku D testirano je gubitkom jedinstvenog proizvoda PCR po distalnom mestu loxP hibridnog alela 3hVH. Ciljanje za Korake E do I testirano je gubitkom prethodne selekcione kasete. U finalnom koraku (Korak I, SL.2B), selekciona kaseta neo, flankirana mestima Frt (McLeod et al., 1986, Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle, Mol Cell Biol 6:3357-3367), uklonjena je prolaznom ekspresijom FLPe (Buchholz et al., 1998, Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis, Nat Biotechnol 16:657-662). Humane sekvence BACvec-ova za Korake D, E i G izvedene su svaka iz dva roditeljska humana BAC-a, dok su one iz Koraka F i H bile iz jednog BAC-a. Zadržavanje humanih sekvenci potvrđeno je u svakom koraku pomoću višestrukih sondi koje premošćuju insertovane humane sekvence (kao što je opisano iznad, npr., SL. 3A, 3B i 3C). Samo oni klonovi sa normalnim potencijalom kariotipa i germinativne linije preneti su dalje u svakom koraku. ES ćelije iz finalnog koraka i dalje su bile u stanju da doprinesu germinativnoj liniji nakon devet uzastopnih manipulacija (Tabela 3). Miševi homozigotni za svaki od alela teškog lanca bili su sposobni za život, izgledali su zdravo i pokazivali su humoralni imunski sistem suštinski divljeg tipa (videti Primer 3).
Tabela 3
[0201] Varijabilni genski lokus κ lakog lanca imunoglobulina. Varijabilni region κ lakog lanca humanizovan je u osam uzastopnih koraka direktnom zamenom od oko tri Mb mišje sekvence koja sadrži sve Vκ i Jκ genske segmente sa oko 0.5 Mb humane sekvence koja sadrži proksimalne humane Vκ i Jκ genske segmente na sličan način kao onaj teškog lanca (SL.1B; Tabele 2 i 4).
[0202] Varijabilni region humanog lokusa κ lakog lanca sadrži dva gotovo identična ponavljanja od 400 kb odvojena spejserom od 800 kb (Weichhold et al., 1993, The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity, Genomics 16:503-511). Zato što su ponavljanja toliko slična, gotovo sva raznovrsnost lokusa može se reprodukovati kod miševa pomoću proksimalnog ponavljanja. Dalje, zabeležen je prirodni humani alel lokusa κ lakog lanca kome nedostaje distalno ponavljanje (Schaible et al.,1993, The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals, Hum Genet 91:261-267). Pronalazači su zamenili oko tri Mb mišje varijabilne genske sekvence κ lakog lanca sa oko 0.5 Mb humane varijabilne genske sekvence κ lakog lanca kako bi efikasno razmenili sve mišje Vκ i Jκ genske segmente proksimalnim humanim Vκ i svim humanim Jκ genskim segmentima (SL.2C i 2D; Tabele 2 i 4). Nasuprot postupku opisanom u Primeru 1 za lokus teškog lanca, čitav mišji Vκ genski region, koji sadrži sve Vκ i Jκ genske segmente, deletiran je u postupku od tri koraka pre nego što je dodata bilo koja humana sekvenca. Prvo, kaseta neo uvedena je na proksimalnom kraju varijabilnog regiona (Korak A, SL.2C). Zatim, kaseta hyg insertovana je na distalnom kraju κ lokusa (Korak B, SL.2C). Mesta prepoznavanja rekombinaze (npr., IoxP) ponovo su postavljena unutar svake selekcione kasete tako da je tretiranje CRE-om indukovalo deleciju preostale 3 Mb mišjeg Vκ regiona zajedno sa oba gena rezistencije (Korak C, SL.2C).
[0203] Humani genomski fragment od oko 400 kb u veličini koji sadrži čitav varijabilni region κ lakog lanca imunoglobulina insertovan je u četiri uzastopna koraka (SL. 2D; Tabele 2 i 4), sa do 150 kb humane sekvence κ lakog lanca imunoglobulina insertovanih u jednom koraku, postupcima sličnim onim koji se koriste za teški lanac (videti Primer 1). Finalni gen rezistencije na higromicina uklonjen je prolaznom ekspresijom FLPe. Kao sa teškim lancem, klonovi ciljanih ES ćelija evaluirani su na integritet čitavog humanog inserta, normalni kariotip i potencijal germinativne linije nakon svakog koraka. Stvoreni su miševi homozigotni za svaki od alela κ lakog lanca i ustanovljeno je da su zdravi i normalnog izgleda.
Tabela 4
Primer 2
Stvaranje potpuno humanizovanih miševa kombinacijom višestrukih humanizovanih alela imunoglobulina
[0204] U nekoliko tačaka, ES mikroinjektovane su ćelije koje nose deo humanih varijabilnih repertoara teškog lanca ili κ lakog lanca imunoglobulina kao što je opisano u Primeru 1 i dobijeni miševi uzgojeni
®
su tako da stvore višestruke verzije VELOCIMMUNE miševa sa progresivno većim frakcijama humanih ®
imunoglobulinskih repertoara germinativne linije (Tabela 5; SL.5A i 5B). VELOCIMMUNE 1 (V1) miševi poseduju osamnaest humanih VHgenskih segmenata i sve humane DHi JHgenske segmente kombinovane sa šesnaest humanih Vκ genskih segmenata i svim humanim Jκ genskim segmentima.
® ®
VELOCIMMUNE 2 (V2) and VELOCIMMUNE (V3) miševi povećali su varijabilne repertoare koji su nosili ukupno trideset devet VHi trideset Vκ, i osamdeset VHi četrdeset Vκ, tim redom. Kako su genomski regioni koji kodiraju mišje VH, DHi JHgenske segmente, i Vκ i Jκ genske segmente potpuno zamenjeni,
®
antitela proizvedena od strane svih verzija VELOCIMMUNE miševa sadrže humane varijabilne regione povezane sa mišjim konstantnim regionima. Mišji lokusi λ lakog lanca ostaju netaknuti u različitim ®
izvođenjima VELOCIMMUNE miševa i služe kao komparator za efikasnost ekspresije različitih ®
VELOCIMMUNE lokusa κ lakog lanca.
[0205] Miševi dvostruko homozigotni za obe humanizacije teškog lanca i κ lakog lanca imunoglobulina stvoreni su iz podseta alela opisanih u Primeru 1. Svi genotipovi uočeni tokom ukrštanja da bi se stvorili dvostruko homozigotni miševi javljali su se u otprilike Mendelovim odnosima. Muško potomstvo homozigotno za svaki od humanih alela teškog lanca pokazalo je smanjenu plodnost, što je dovelo do gubitka mišje aktivnosti ADAM6. Mišji varijabilni genski lokus teškog lanca sadrži dva ugrađena funkcionalna gena ADAM6 (ADAM6a i ADAM6b). Tokom humanizacije mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca, insertovana humana genomska sekvenca sadržala je pseudogen ADAM6. Mišji ADAM6 može biti potreban za plodnost, i prema tome nedostatak mišjih gena ADAM6 u humanizovanim varijabilnim genskim lokusima teškog lanca može voditi do smanjenja plodnosti i pored prisustva humanog pseudogena. Primeri 7–11 opisuju rearanžiranje mišjih gena ADAM6 u humanizovani varijabilni genski lokus teškog lanca, i vraćanje nivoa plodnosti divljeg tipa kod miševa sa humanizovanim lokusom teškog lanca imunoglobulina.
Tabela 5
Primer 3
Populacije limfocita kod miševa sa humanizovanim genima imunoglobulina
®
[0206] Populacije zrelih B ćelija kod tri različite verzije VELOCIMMUNE miševa evaluirane su protočnom citometrijom.
[0207] Sažeto, suspenzije ćelija iz koštane srži, slezine i timusa napravljene su standardnim
5
postupcima. Ćelije su resuspendovane na 5 x 10 ćelija/mL u BD Pharmingen FACS puferu za bojenje, blokirane anti-mišjim CD16/32 (BD Pharmingen), obojene odgovarajućim koktelom antitela i fiksirane ™
sa BD CYTOFIX sve prema uputstvima proizvođača. Finalne ćelijske pelete resuspendovane su u 0.5
™ ™
mL pufera za bojenje i analizirane pomoću BD FACSCALIBUR i BD CELLQUEST PRO softvera. Sva antitela (BD Pharmingen) pripremljena su u masenom razblaženju/koktelu i dodata do krajnje 5
koncentraciju od 0.5 mg/10 ćelija.
b [0208] Kokteli antitela za bojenje koštane srži (A-D) bili su kao što sledi: A: anti-mišji IgM -FITC, antia
mišji Ig-M -PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; B: anti-mišji CD43(S7)-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; C: anti-mišji CD24(HSA)-PE; anti-mišji CD45R(B220)-APC; D: anti-mišji BP-1-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC.
[0209] Kokteli antitela za bojenje slezine i preponskog limfnog čvora (E-H) bili su kao što sledi: E: antib a
mišji IgM -FITC, anti-mišji IgM -PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; F: anti-mišji Ig, λ1, λ2, λ3 laki lanac-FITC, anti-mišji Igκ laki lanac-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; G: anti-mišji Ly6G/C-FITC, anti-mišji CD49b(DX5)-PE, anti-mišji CD11b-APC; H: anti-mišji CD4(L3T4)-FITC, anti-mišji CD45R(B220)-PE, antimišji CD8a-APC. Rezultati su prikazani na SL.6.
®
[0210] Limfociti izolovani iz slezine ili limfnih čvorova homozigotnih VELOCIMMUNE miševa bojeni su na površinsku ekspresiju markera B220 i IgM i analizirani pomoću protočne citometrije (SL.6). Veličine ® B220 IgM populacija zrelih B ćelija kod svih testiranih verzija VELOCIMMUNE miševa bile su praktično identične kao kod miševa divljeg tipa, bez obzira na broj VHgenskih segmenata koje su sadržale. Kao dodatak, miševi koji su sadržali homozigotne hibridne humanizovane lokuse teškog lanca imunoglobulina, čak i oni sa samo 3 VHgenska segmenta ali normalnim mišjim lokusima κ lakog lanca imunoglobulina ili miševi koji su sadržali homozigotne hibridne humanizovane lokuse κ lakog lanca imunoglobulina sa normalnim mišjim lokusima teškog lanca imunoglobulina, takođe su imali normalne
brojeve od B220 IgM ćelija u svojim perifernim kompartmentima (nije prikazano). Ti rezultati ukazuju da himerni lokusi sa humanim varijabilnim genskim segmentima i mišjim konstantnim regionima mogu potpuno nastanjivati kompartment zrelih B ćelija. Dalje, broj varijabilnih genskih segmenata na lokusima bilo teškog lanca ili κ lakog lanca, i prema tome teoretska raznovrsnost repertoara antitela, nije u korelaciji sa sposobnošću da se stvori populacije zrelih B ćelija divljeg tipa. Suprotno tome, miševi sa nasumično integrisanim potpuno humanim transgenima imunoglobulina i inaktiviranim mišjim lokusima imunoglobulina imaju smanjen broj B ćelija u tim kompartmentima, sa ozbiljnošću deficita koji zavisi od broja varijabilnih genskih segmenata uključenih u transgen (Green and Jakobovits, 1998, Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495). To pokazuje da strategija „genske humanizacije in situ“ dovodi do fundamentalno drugačijeg funkcionalnog ishoda nego nasumično integrisani transgeni dobijeni u „nokaut-plus-transgenom“ pristupu.
[0211] Alelsko isključivanje i izbor lokusa. Sposobnost da se održava alelsko isključivanje proučavana je u miševima heterozigotnim za različite verzije humanizovanih lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0212] Humanizacija lokusa imunoglobulina izvršena je u F1 ES liniji (F1H4, Valenzuela et al., 2003), izvedenoj iz 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac heterozigotnih embriona. Varijabilne genske sekvence a germinativne linije humanog teškog lanca ciljaju se na alel 129S6, koji nosi haplotip IgM , dok b
nemodifikovani mišji alel C576BL/6N nosi haplotip IgM . Ti alelski oblici IgM mogu se izvojiti a b protočnom citometrijom pomoću antitela specifičnih za polimorfizam pronađen u alelima IgM ili IgM . Kao što je prikazano na SL. 6 (donji red), B ćelije identifikoane u miševima heterozigotnim za svaku a
verziju humanihovanog lokusa teškog lanca eksprimuju samo jedan alel, bilo IgM (humanizovani alel) b
ili IgM (alel divljeg tipa). To pokazuje da su mehanizmi uključeni u alelsko isključivanje netaknuti kod ® a VELOCIMMUNE miševa. Kao dodatak, realtivni broj B ćelija pozitivnih na humanizovani alel (IgM ) ugrubo je proporcionalan broju prisutnih VHgenskih segmenata. Humanizovani lokus imunoglobulina
®
eksprimuje se u približno 30% B ćelija kod VELOCIMMUNE 1 heterozigotnih miševa, koji imaju 18
®
humanih VHgenskih segmenata, i u 50% B ćelija kod VELOCIMMUNE 2 i 3 (nije prikazano) heterozigotnih miševa, sa 39 i 80 humanih VHgenskih segmenata, tim redom. Naročito, odnos ćelija ®
koje eksprimuju humanizovane naspram mišjih alela divljeg tipa (0.5 za VELOCIMMUNE 1 miševe i 0.9
®
za VELOCIMMUNE 2 miševe) veći je od odnosa broja varijabilnih genskih segmenata sadržanim u ® ® humanizovanim naspram lokusā divljeg tipa (0.2 za VELOCIMMUNE 1 miševe i 0.4 za VELOCIMMUNE 2 miševe). To može ukazivati da je verovatnoća izbora alela na sredini između nasumičnog izbora jednog ili drugog hromozoma i nasumičnog izbora bilo koje posebne RSS V segmenta. Dalje, može postojati frakcija B ćelija, ali ne sve, u kojima jedan alel postaje dostupan za rekombinaciju, dovršava proces i zaustavljaja rekombinaciju pre no što drugi alel postane dostupan. Kao dodatak, jednaka raspodela ćelija čiji je površinski IgM (slgM) izveden bilo iz hibridnog humanizovanog lokusa teškog lanca ili iz mišjeg lokusa teškog lanca divljeg tipa dokaz je da hibridni lokus funkcioniše na normalnom nivou. Suprotno tome, nasumično integrisani humani transgeni imunoglobulina u slaboj su kompeticiji sa mišjim lokusima imunoglobulina divljeg tipa (Bruggemann et al., 1989, A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice, PNAS 86:6709-6713; Green et al., 1994; Tuaillon et al., 1993, Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts, PNAS USA 90:3720-3724). To dalje pokazuje da su
®
imunoglobulini proizvedeni od strane VELOCIMMUNE miševa funkcionalno drugačiji od onih proizvedenih od strane nasumično integrisanih transgena kod miševa napravljenih „nokaut-plustransgenim“ pristupima.
[0213] Polimorfizam Cκ regiona nije dostupan u 129S6 ili C57BL/6N za ispitivanje alelskog isključivanja ® humanizovanih nasuprot ne-humanihovanih lokusa κ lakog lanca. Međutim, svi VELOCIMMUNE miševi poseduju mišjih lokusa λ lakog lanca divljeg tipa, te je stoga moguće uočiti da li rearanžiranje i ekspresija humanihovanih lokusa κ lakog lanca može da spreči ekspresiju mišjeg λ lakog lanca. Odnos brojeva ćelija koje eksprimuju humanizovani κ laki lanca u odnosu na broj ćelija koje eksprimuju mišji λ laki lanca bio je relativno nepromenjen kod VELOCIMMUNE miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa, bez obzira na broj humanih Vκ genskih segmenata insertovanih u lokus κ lakog lanca (SL.6, treći red odozgo). Kao dodatak, nije bilo povećanja u broju dvostruko pozitivnih (κ plus λ) ćelija, što ukazuje da produktivna rekombinacija na hibridnim lokusima κ lakog lanca dovodi do odgovarajuće supresije rekombinacije mišjih lokusa λ lakog lanca. Suprotno tome, miševi koji sadrže nasumično integrisane transgene κ lakog lanca sa inaktiviranim mišjim lokusima κ lakog lanca – ali mišjim lokusima λ lakog lanca divljeg tipa – ispoljavaju dramtično povećane odnose λ/κ (Jakobovits, 1998), što ukazuje da uvedeni transgeni κ lakog lanca ne funkcionišu dobro u takvim miševima. To dalje pokazuje različite ®
funkcionalne ishode uočene kod imunoglobulinā napravljenih od strane VELOCIMMUNE miševa u poređenju sa onima napravljenim od strane „nokaut-plus-transgenih“ miševa.
®
[0214] Razvoj B ćelija. Zato što populacije zrelih B ćelija kod VELOCIMMUNE miševa nalikuju onima kod miševa divljeg tipa (opisanih iznad), moguće je da se defekti u ranoj diferencijaciji B ćelija kompenzuju ekspanzijom populacija zrelih B ćelija. Različiti stadijumi diferencijacije B ćelija proučavani su analizom populacija B ćelija pomoću protočne citometrije. Tabela 6 iznosi odnos frakcija ćelija u svakoj B-ćelijskoj liniji definisanoj sa FACs, pomoću specifičnih markera ćelijske površine, kod ®
VELOCIMMUNE miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa iz istog legla.
[0215] Rani razvoj B ćelija odvija se u koštanoj srži, i različiti stadijumi diferencijacije B ćelija karakterisani su promenama u tipovima i količinama ekspresije markera ćelijske površine. Te razlike u površinskoj ekspresiji u korelaciji su sa molekularnim promenama koje se odvijaju na imunoglobulinskim lokusima unutar ćelije. Tranzicija pro-B u pre-B ćeliju traži uspešno rearanžiranje i ekspresiju funkcionalnog proteina teškog lanca, dok tranzicijom iz pre-B u zreli B stadijum upravlja pravilno rearanžiranje i ekspresija κ ili λ lakog lanca. Prema tome, neefikasna tranzicija između stadijuma diferencijacije B ćelije može se detektovati na osnovu promena u relativnim populacijama B ćelija u datom stadijumu.
Tabela 6
®
[0216] Nisu uočeni veći defekti u diferencijaciji B ćelija kod bilo kog od VELOCIMMUNE miševa. Uvođenje humanih genskih segmenata teškog lanca izgleda da ne utiče na tranziciju pro-B u pre-B, i uvođenje humanih genskih segmenata κ lakog lanca ne utiče na tranziciju pre-B u B kod ®
VELOCIMMUNE miševa. To pokazuje da „reverzno himerni“ molekuli imunoglobulina koji poseduju humane varijabilne regione i mišje konstantne funkcionišu normalno u kontekstu signalnih i koreceptorskih molekula B ćelija što vodi do odgovarajuće diferencijacije B ćelija u mišjem okruženju. Suprotno tome, ravnoteža između različtih populacija tokom diferencijacije B ćelija poremećena je do različite mere kod miševa koji sadrže nasumično integrisane transgene imunoglobulina i inaktivirane endogene lokuse teškog lanca ili κ lakog lanca (Green and Jakobovits, 1998).
Primer 4
Varijabilni genski repertoar kod miševa sa humanizovanim imunoglobulinom
[0217] Upotreba humanih varijabilnih genskih segmenata u humanizovanom repertoaru antitela ®
VELOCIMMUNE miševa analizirana je lančanom reakcijom reverzne transkriptaze-polimeraze (RT-PCR) humanih varijabilnih regiona iz više izvora uključujući splenocite i ćelije hibridoma. Određene su sekvence varijabilnog regiona, upotreba genskih segmenata, somatska hipermutacija, i raznovrsnost spojeva rearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona.
7 7 4 5
[0218] Sažeto, ukupna RNK ekstrahovana je iz 1 x 10 – 2 x 10 splenocita ili oko 10 – 10 ćelija ™ ™
hibridoma pomoću mini kompleta TRIZOL (Invitrogen) ili Qiagen RNEASY (Qiagen) i prajmovana ™
pomoću specifičnih prajmera mišjeg konstantnog regiona pomoću SUPERSCRIPT III jednostepenog sistema RT-PCR (Invitrogen). Reakcije su izvedene sa 2-5 μL RNK iz svakog uzorka pomoću prethodno navedenih 3’ konstantnih specifičnih prajmera uparenih sa objedinjenim vodećim prajmerima za svaku porodicu humanih varijabilnih regiona i za teški lanac i za κ laki lanac, odvojeno. Zapremine reagenasa i prajmera, i uslovi RT-PCR/PCR sprovedeni su prema uputstvima proizvođača. Sekvence prajmera zasnivale su se na više izvora (Wang and Stollar, 2000, Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR, J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Gde je bilo pogodno, uklopljene sekundarne reakcije PCR izvedene su sa prajmerima u okviru specifičnom za objedinjenu porodicu i isti mišji 3’ imunoglobulinski konstantni-specifični prajmer upotrebljen je u primarnoj reakciji. Alikvoti (5 μL) iz svake reakcije analizirani su elektroforezom u agarozi i proizvodi ™ reakcije prečišćeni su od agaroze upotrebljavajući komplet za gel ekstrakciju MONTAGE (Millipore).
™
Prečišćeni proizvodi klonirani su pomoću sistema za kloniranje TOPO TA (Invitrogen) i transformisani u ćelije DH10β E. coli elektroporacijom. Pojedini klonovi odabrani su iz svake reakcije transformacije i gajeni u 2 mL kultura LB bujona sa izborom antibiotika preko noći na 37° C. Plazmidna DNK prečišćena je iz bakterijskih kultura pristupom na bazi kompleta (Qiagen).
[0219] Upotreba varijabilnog gena imunoglobulina. Plazmidna DNK klonova i teškog lanca i κ lakog lanca sekvencirana je bilo T7 ili M13 reverznim prajmerima na genetičkom analizatoru ABI 3100
™
(Applied Biosystems). Neobrađeni podaci sekvenci uvezeni su u SEQUENCHER (v4.5, Gene Codes). Svaka sekvenca je sklopljena u kontinualnu sekvencu (kontidži) i poravnata sa humanim sekvencama imunoglobulina pomoću IMGT V-Quest (Brochet et al., 2008, IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis, Nucleic Acids Res 36:W503-508) funkcije za pretragu da bi se identifikovala upotreba humanih VH, DH, JHi Vκ, Jκ segmenata. Sekvence su poređene sa sekvencama germinativne linije radi analize somatske hipermutacije i rekombinacionog spoja.
[0220] Miševi su stvoreni iz ES ćelija koje sadrže početnu modifikaciju teškog lanca (3hVH-CRE Hybrid Allele, bottom of SL. 2A) RAG komplementacijom (Chen et al., 1993, RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development, PNAS USA 90:4528-4532), i cDNK je pripremljena iz RNK splenocita. cDNK je umnožena pomoću setova prajmera (opisano iznad) specifičnih za predviđenu himernu mRNK teškog lanca koja će nastati V(D)J rekombinacijom unutra insertovanih humanih genskih segmenata i naknadnim splajsovanjem na bilo mišje IgM ili IgG konstantne domene. Sekvence izvedene iz tih klonova cDNK (nije prikazano) pokazali su da je došlo do ispravne V(D)J rekombinacije unutar humanih varijabilnih genskih sekvenci, da su rearanžirani humani V(D)J genski segmenti ispravno splajsovani u okviru sa mišjim konstantnim domenima, i da je došlo do rekombinacije koja izaziva promenu klase. Izvedena je dalja analiza sekvenci proizvodā mRNK sledećih hibridnih lokusa imunoglobulina.
® [0221] U sličnom eksperimentu, B ćelije iz neimunizovanih miševa divljeg tipa i VELOCIMMUNE miševa odvojene su protočnom citometrijom na osnovu površinske ekspresije B220 i IgM ili IgG. Ćelije
sa B220 IgM ili površinskim IgG (slgG ) sakupljene su i VHi Vκ sekvence dobijene su nakon RT-PCR amplifikacije i kloniranja (opisano iznad). Zabeležena je upotreba reprezentativnih gena u setu od ®
cDNK amplifikovanih RT-PCR-om iz neimunizovanih VELOCIMMUNE 1 miševa (Tabela 7) i ®
VELOCIMMUNE 3 miševa (Tabela 8) (*defektna RSS; †nedostaje ili je pseudogen). Asterisk: genski segmenti sa defektnom RSS. †: genski segment nedostaje ili je pseudogen.
[0222] Kao što je prikazano u Tabelama 7 i 8, upotrebljeni su gotovo svi od funkcionalnih humanih VH, DH, JH, Vκ i Jκ genskih segmenata. Od funkcionalnih varijabilnih genskih segmenata opisanih ali ne i ®
detektovanih kod VELOCIMMUNE miševa iz ovog eksperimenta, zabeleženo je da je njih nekoliko posedovalo defektne signalne sekvence za rekombinaciju (RSS) i, prema tome, ne bi se očekivalo da budu eksprimovane (Feeney, 2000, Factors that influence formation of B cell repertoire, Immunol Res ® 21:195-202). Analiza nekoliko drugih setova imunoglobulinskih sekvenci iz različitih VELOCIMMUNE miševa, izolovanih kako iz naivnih tako i iz imunizovanih repertoara, pokazala je da upotreba tih genskih segmenata, mada u nižoj učestalosti (podaci nisu prikazani). Podaci za upotrebu agregatnih gena pokazali su da su svi funkcionalni humani VH, DH, JH, Vκ, i Jκ genski segmenti sadržani u ®
VELOCIMMUNE miševima bili posmatrani u različitim naivnim i imunizovanim repertoarima (podaci nisu prikazani). Premda je humani VH7-81 genski segment bio identifikovan u analizi humanih sekvenci lokusa teškog lanca (Matsuda et al., 1998, The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus, J Exp Med 188:2151-2162), nije prisutan u ® ® VELOCIMMUNE miševima kao što je potvrđeno re-sekvenciranjem čitavog genoma VELOCIMMUNE 3 miša.
[0223] Poznato je da sekvence teških i lakih lanaca antitela pokazuju izuzetnu varijabilnost, posebno u kratkim polipeptidnim segmentima unutar rearanžiranih varijabilnih domena. Ti regioni, poznati kao hipervarijabilni regioni ili regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi), stvaraju vezujuće mesto za antigen u strukturi molekula antitela. Intervencione polipeptidne sekvence nazvane su okvirni regioni (framework regions – FR-ovi). Postoje tri CDR-a (CDR1, CDR2, CDR3) i 4 FR-a (FR1, FR2, FR3, FR4) i u teškim i u lakim lancima. Jedan CDR, CDR3, jedinstven je u tome da je CDR stvoren rekombinacijom kako VH, DHi JHtako i Vκ i Jκ genskih segmenata i stvara znatnu količinu raznovrsnosti repertoara pre susreta sa antigenom. To spajanje je neprecizno usled kako nukleotidnih delecija putem aktivnosti egzonukleaze tako i nematričnih kodiranih adicija putem terminalne dezoksinukleotidil transferaze (TdT) i, prema tome, omogućava dobijanje novih sekvenci iz procesa rekombinacije. Premda FR-ovi mogu pokazivati suštinsku somatsku mutaciju usled visoke mutabilnosti varijabilnog regiona kao celine, varijabilnost, međutim, nije raspoređena ravnomerno po varijabilnom regionu. CDR-ovi su koncentrisani i lokalizovani regioni visoke varijabilnosti u površini molekula antitela koji omogućavaju vazivanje antigena. Sekvence teškog lanca i lakog lanca izabranih antitela iz ®
VELOCIMMUNE miševa oko spojeva CDR3 koji pokazuje raznovrsnost spojeva prikazani su na SL.7A i 7B, tim redom.
[0224] Kao što je prikazano na SL.7A, nematrične kodirane nukleotidne adicije (N-adicije) uočene su i
®
na VH-DHi DH-JHspoju u antitelima iz VELOCIMMUNE miševa, ukazujući na ispravnu funkciju TdT sa humanim segmentima. Krajnje tačke VH, DHi JHsegmenata u odnosu na njihove germinativne pandane ukazuju da je takođe došlo do aktivnosti egzonukleaze. Za razliku od lokusa teškog lanca, rearanžiranja humanog κ lakog lanca ispoljavaju malo ili nimalo adicija TdT na CDR3, koje se obrazuju rekombinacijom Vκ i Jκ segmenata (SL.7B). To se očekuje usoed nedostatka ekspresije TdT kod miševa tokom rearanžiranja lakog lanca u tranziciji pre-B u B ćeliju. Raznovrsnost uočena u CDR3 rearanžiranih humanih Vκ regiona uvodi se pretežno preko aktivnosti egzonukleaze tokom događaja rekombinacije.
[0225] Somatska hipermutacija. Dodatna raznovrsnost dodaje se varijabilnim regionima rearanživanih gena imunoglobulina tokom reakcije u germinativnim centrima procesom nazvanim somatska hipermutacija. B ćelije koje eksprimuju somatski mutirane varijabilne regione takmiče se sa drugim B ćelijama za pristup antigenu prezentovanom od strane folikularnih dendritskih ćelija. Te B ćelije sa višim afinitetom za antigen dalje će se širiti i pretrpeti promenu klase pre izlaska na periferiju. Prema tome, B ćelije koje eksprimuju promenjene izotipove tipično su se susrele sa antigenom i pretrpele reakcije u germinativnim centrima i imaće povećane brojeve mutacija u odnosu na naivne B
ćelije. Dalje, očekivalo bi se da sekvence varijabilnog regiona iz pretežno naivnih slgM B ćelija imaju
relativno ređe mutacije nego varijabilne sekvence iz slgG B ćelija koje su pretrpele selekciju antigena.
[0226] Sekvence iz nasumičnih VHili Vκ klonova iz slgM ili slgG B ćelija iz neimunizovanih ®
VELOCIMMUNE miševa ili slgG B ćelija iz imunizovanih miševa upoređene su sa njihovim varijabilnim genskim segmentima germinativne linije i obeležene su promene u odnosu na germinativnu sekvencu. Dobijene nukleotidne sekvence prevedene su in silico i takođe su obeležene mutacije koje vode do promena aminokiselina. Podaci su sakupljeni iz svih varijabilnih regiona i izračunata je promena procenta na datom položaju (SL.8).
[0227] Kao što je prikazano na SL.8, humani varijabilni regioni teškog lanca izvedeni iz slgG B ćelija iz ®
neimunizovanih VELOCIMMUNE miševa ispoljavaju mnogo više nukleotida u odnosu na slgM B ćelije iz istih pulova splenocita, i varijabilni regioni teškog lanca izvedeni iz imunizovanih miševa ispoljavaju još više promena. Broj promena je povećan u regionima za određivanje komplementarnosti (CDR-ovima) u odnosu na okvirne regione, ukazujući na selekciju antigena. Odgovarajuće aminokiselinske sekvenca iz humanih varijabilnih regiona teškog lanca takođe ispoljavaju znatno veće brojeve mutacija u IgG nasuprot IgM i još više u imunizovanom IgG. Te mutacije ponovo izgleda da su učestalije u CDR-ovima u poređenju sa okvirnim sekvencama, sugerišući da su antitela bila antigenski selektovana in vivo. Slično povećanje brojeva nukleotida i aminokiselinskih mutacija viđen je u Vκ sekvencama
izvedenim iz IgG B ćelija iz imunizovanih miševa.
®
[0228] Upotreba gena i učestalost somatske hipermutacije posmatrana kod VELOCIMMUNE miševa pokazuju da su suštinski svi prisutni genski segmenti sposobni za rearanžiranje kako bi obrazovali ®
potpuno funkcionalna reverzna himerna antitela u tim miševima. Dalje, VELOCIMMUNE antitela potpuno učestvuju unutar mišjeg imunskog sistema da bi se podvrgla afinitetnoj selekciji i sazrevanju kako bi se stvorila potpuno zrela humana antitela koja mogu efikasno neutralizovani svoje ciljane ®
antigene. VELOCIMMUNE miševi su u stanju da izgrade snažne imunske odgovore na višestruke klase antigena što dovodi do upotrebe širokog spektra humanih antitela koja su i visokog afiniteta i pogodna za terapijsku upotrebu (podaci nisu prikazani).
Primer 5
Analiza limfne strukture i izotipova u serumu
[0229] Ukupne strukture slezine, preponskih limfnih čvorova, parčiča Pejerovih ploča i timusa iz
®
uzoraka tkiva iz miševa divljeg tipa ili VELOCIMMUNE miševa obojene sa H&E ispitivane su svetlosnom mikroskopijom. Nivoi imunoglobulinskih izotipova u serumu sakupljenom iz miševa divljeg tipa i ® ™
VELOCIMMUNE miševa analizirani su tehnologijom LUMINEX .
[0230] Struktura limfnih organa. Struktura i funkcija limfnih tkiva delimično su zavisne od pravilnog razvoja hematopoetskih ćelija. Defekt u razvoju ili funkciji B ćelija može se ispoljiti kao alteracija u strukturi limfnih tkiva. Posle analize obojenih isečaka tkiva, nije identifikovana nikakva značajna razlika ®
u izgledu sekundarnih limfnih organa između miševa divljeg tipa i VELOCIMMUNE miševa (podaci nisu prikazani).
[0231] Nivoi imunoglobulina u serumu. Nivo ekspresije svakog izotipa sličan je kod miševa divljeg tipa ®
i VELOCIMMUNE miševa (SL.9A, 9B i 9C). To pokazuje da humanizacija varijabilnih genskih segmenata nema vidljivih nepovoljnih efekata na promenu klase ili ekspresiju i sekreciju imunoglobulina i stoga očito zadržava sve endogene mišje sekvence potrebne za te funkcije.
Primer 6
Imunizacija i produkcija antitela kod miševa sa humanizovanim imunoglobulinom
®
[0232] Različite verzije VELOCIMMUNE miševa imunizovane su antigenom da bi se ispitao humoralni odgovor na izazov stranog antigena.
®
[0233] Imunizacija i razvoj hibridoma. VELOCIMMUNE i miševi divljeg tipa mogu se imunizovati antigenom u obliku proteina, DNK, kombinacije DNK i proteina, ili ćelija koje eksprimuju antigen. Životinje su tipično izazivane svake tri sedmice ukupno dva do tri puta. Posle svakog izazivanja antigenom, uzorci seruma iz svake životinje sakupljeni su i analizirani na odgovore antitela specifične za antigen određivanjem serumskog titra. Pre spajanja, miševi su primili finalni pre-fuzioni rastvor od 5 μg proteina ili DNK, po želji, putem intra-peritonealnih i/ili intravenskih ubrizgavanja. Splenociti su prikupljeni i spojeni sa ćelijama mijeloma Ag8.653 u elektrofuzionoj komori prema sugerisanom protokolu proizvođača (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD). Deset dana nakon kultivisanja, himbridomi su testirani na specifičnost antigena pomoću testa ELISA (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York). Alternativno, B ćelije ®
specifične za antigen izolovane su direktno iz imunizovanih VELOCIMMUNE miševa i testirani standardnim tehnikama, uključujući one opisane ovde, da bi se dobila humana antitela specifična za antigen od interesa (npr., videti US 2007/0280945A1).
[0234] Određivanje titra u serumu. Da bi se u serumu životinje pratio anti-antigenski odgovor, uzorci seruma sakupljeni su oko 10 dana nakon svakog izazivanja i titri su određeni pomoću ELISA testa
™
specifičnog za antigen. Sažeto, Nunc MAXISORP ploče sa 96 bunarčića obložene su sa 2 μg/mL antigena preko noći na 4° C i blokirane albuminom iz goveđeg seruma (Sigma, St. Louis, MO). Uzorcima seruma u serijskim 3-strukim razblaženjima omogućeno je da se vežu za ploče tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Ploče su tada oprane PBS-om koji sadrži 0.05% Tween-20 i vezani IgG detektovan je pomoću HRP-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) za ukupni IgG titar, ili poliklonska antitela specifična za izotip obeležen biotinom ili specifična za laki lanac (Southern Biotech Inc.) za titre specifične za izotip, tim redom. Za antitela obeležena biotinom, posle pranja ploče, dodat je HRP-konjugovani streptavidin (Pierce, Rockford, IL).
Sve ploče su razvijene pomoću kolorimetrijskih supstrata kao što je BD OPTEIA (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Nakon što je reakcija zaustavljena sa 1 M fosforne kiseline, snimljene su ™
optičke apsorpcije na 450 nm i podaci su analizirani pomoću PRISM softvera od Graph Pad. Razblaženja potrebna da bi se dobio dvostruki signal pozadine definisana su kao titar.
®
[0235] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE miševi imunizovani su humanim receptorom ®
interleukin-6 (hIL-6R). Reprezentativni set titara u serumu za VELOCIMMUNE miševe i miševe divljeg tipa imunizovane sa hIL-6R prikazan je na SL.10A i 10B.
®
[0236] VELOCIMMUNE i miševi divljeg tipa izgradili su snažne odgovore na IL-6R sa sličnim opsezima
®
titra (SL.10A). Nekoliko miševa iz VELOCIMMUNE i kohorti divljeg tipa dostigli su maksimalni odgovor nakon jednog izazivanja antigenom. Ti rezultati ukazuju da su snaga i kinetika imunskog odgovora na
®
taj antigen bile slične kod VELOCIMMUNE miševa i miševa divljeg tipa. Ti odgovori antitela specifični za antigen dalje su analizirani da bi se ispitali posebni izotipovi antitela specifičnih za antigen
®
pronađenih u serumima. I VELOCIMMUNE grupe i grupe divljeg tipa pretežno su izazivale odgovor IgG1 (SL.10B), što sugeriše da je promena klase tokom humoralnog odgovora slična kod svih tipova miševa.
[0237] Određivanje afiniteta vezivanja antitela za antigen u rastvoru. Test kompeticije u rastvoru na bazi testa ELISA tipično je osmišljen za određivanje afiniteta vezivanja antitela za antigen.
[0238] Sažeto, antitela u kondicioniranom medijumu prethodno su pomešana sa serijskim razblaženjima proteina antigena u opsegu od 0 to 10 mg/mL. Rastvori smeša antitela i antigena tada su inkubirani tokom dva do četiri sata na sobnoj temperaturi da bi se dostigle ravnoteže vezivanja. Količine slobodnih antitela u smeši tada su merene pomoću kvantitativnog „sendvič“ ELISA. Ploče sa ™
devedeset šest bunarčića MAXISORB (VWR, West Chester, PA) obložene su sa 1 μg/mL proteina antigena u rastvoru PBS preko noći na 4°C, za čim je sledilo BSA nespecifično blokiranje. Rastvori smeše antela i antigena tada su preneti na te ploče za čim je sledila inkubacija od jednog sata. Ploče su tada isprane puferom za ispiranje i antitela vezana za ploče detektovana su pomoću reagensa sa reagensom HRP-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG poliklonskim antitelom (Jackson Immuno Research Lab) i ™
razvijena pomoću kolorimetrijskih supstrata kao što je BD OPTEIA (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Nakon što je reakcija zaustavljena sa 1 M fosforne kiseline, snimljene su optičke apsorpcije
™
na 450 nm i podaci su analizirani pomoću PRISM softvera od Graph Pad. Zavisnost signala od koncentracija antigena u rastvoru analizirana je sa 4 parametra koji se uklapaju u analizu i zabeležena kao IC50, koncentracija antigena potrebna za postizanje 50% smanjenja signala iz uzoraka antitela bez prisustva antigena u rastvoru.
®
[0239] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE miševi imunizovani su sa hIL-6R (kao što je opisano iznad). SL. 11A i 11B prikazuju reprezentativni set merenja afiniteta za anti-hlL6R antitela iz ®
VELOCIMMUNE miševa i miševa divljeg tipa.
[0240] Nakon što su imunizovani miševi primili treći rastvor za izazivanje sa antigenom, određeni su titri u serumu pomoću testa ELISA. Splenociti su izolovani iz odabranih kohorti miševa divljeg tipa i ®
VELOCIMMUNE miševa i spojene sa ćelijama mijeloma Ag8.653 da bi se obrazovali hibridomi i gajili pod odabirom (kao što je opisano iznad). Od ukupno 671 proizvedenih anti-IL-6R hibridoma, ustanovljeno je da 236 eksprimuje antitela specifična za antigen. Medijumi sakupljeni iz bunarčića pozitivnih na antigen upotrebljen je za određivanje afiniteta antitela prema antigenu pomoću ELISA
®
kompeticije rastvora. Antitela izvedena iz VELOCIMMUNE miševa ispoljavala su širok opseg afiniteta u vezivanju za antigen u rastvoru (SL. 11A). Pored toga, ustanovljeno je da 49 od 236 anti-IL-6R hibridoma blokira IL-6 za vezivanje za receptor u bio-testu in vitro (podaci nisu prikazani). Dalje, tih 49 antitela koja blokiraju anti-IL-6R ispoljavalo je opseg visokih afiniteta rastvora sličan onima kod blokirajućih antitela izvedenih iz paralelne imunizacije miševa divljeg tipa (SL.11B).
Primer 7
Konstruisanje mišjeg ADAM6 ciljnog vektora
[0241] Usled zamene mišjih varijabilnih genskih lokusa teškog lanca imunoglobulina humanim ® varijabilnim genskim lokusima teškog lanca imunoglobulina, ranim verzijama VELOCIMMUNE miševa ® nedostajala je ekspresija mišjih gena ADAM6. Posebno, mužjaci VELOCIMMUNE miševa pokazuju smanjenje plodnosti. Prema tome, sposobnost eksprimovanja ADAM6 rekonstruisana je u ®
VELOCIMMUNE miševima da bi se oporavio defekt plodnosti.
[0242] Ciljni vektor za insertovanje mišjih gena ADAM6a i ADAM6b u humanizovani lokus teškog lanca konstruisan je pomoću tehnologije genetičkog inženjeringa VELOCIGENEO (supra) da bi se modifikovao bakterijski veštački hromozom (Bacterial Artificial Chromosome – BAC) 929d24, koji je dobijen od Dr. Frederick Alt (Harvard University). DNK BAC-a 929d24 konstruisana je da sadrži genomske fragmente koji sadrže mišje gene ADAM6a i ADAM6b i higromicinsku kasetu za ciljanu deleciju humanog pseudogena ADAM6 (hADAM6ψ) koji se nalazi između humanih VH1-2 i VH6-1 genskih segmenata humanizovanog lokusa teškog lanca (SL.12).
[0243] Prvi, genomski fragment koji sadrži mišji gen ADAM6b, -800 bp ushodno (5’) sekvence i -4800 bp nishodno (3’) sekvence podkloniran je iz klona BAC-a 929d24. Drugi genomski fragment koji sadrži mišji gen ADAM6a, -300 bp ushodno (5’) sekvence i -3400 bp nishodno (3’) sekvence, odvojeno je podkloniran iz klona BAC-a 929d24. Dva genomska fragmenta koji sadrže mišje gene ADAM6b i ADAM6a spojena su ligacijom sa higromicinskom kasetom flankiranom Frt rekombinacionim mestima da bi se stvorio ciljni vektor (mišji ADAM6 ciljni vektor, Slika 12; SEQ ID NO:3). Različita mesta restrikcionih enzima konstruisana su na 5’ kraju ciljnog vektora koji prati mišji gen ADAM6b i na 3’ kraju koji prati mišji gen ADAM6a (donji deo SL.12) za ligaciju u humanizovani lokus teškog lanca.
[0244] Napravljena je odvojena modifikacija klona BAC-a koji sadrži zamenu mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca humanim varijabilnim genskim lokusom teškog lanca, uključujući humani pseudogen ADAM6 (hADAM6ψ) koji se nalazi između humanih VH1-2 i VH6-1 genskih segmenata humanizovanog lokusa za naknadnu ligaciju mišjeg ADAM6 ciljnog vektora (SL.13).
[0245] Sažeto, neomicinska kaseta flankirana IoxP rekombinacionim mestima konstruisana je da sadrži homologne krake koji sadrže humanu genomsku sekvencu na položajima 3’ humanog VH1-2 genskog segmenta (5’ u odnosu na hADAM6ψ) i 5’ humanog VH6-1 genskog segmenta (3’ u odnosu na hADAM6ψ; videti sredinu SL.13). Lokacija mesta insertovanja tog ciljnog konstrukta bila je oko 1.3 kb 5’ i -350 bp 3’ humanog pseudogena ADAM6. Ciljni konstrukt takođe uključuje ista restrikciona mesta kao mišji ADAM6 ciljni vektor da bi se omogućila naredna ligacija BAC-a između modifikovanog klona BAC-a koji sadrži deleciju humanog pseudogena ADAM6 i mišjeg ADAM6 ciljnog vektora.
[0246] Posle digestije DNK BAC-a izvedene iz oba konstrukta, genomski fragmenti spojeni su ligacijom tako da grade konstruisani klon BAC-a koji sadrži humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopično smeštenu genomsku sekvencu koja obuhvata mišje nukleotidne sekvence ADAM6a i ADAM6b. Finalni ciljni konstrukt za deleciju humanog gena ADAM6 unutar humanizovanog lokusa teškog lanca i inserta mišjih sekvenci ADAM6a i ADAM6b u ES ćelijama sadržao je, od 5’ do 3’, 5’ genomski fragment koji sadrži ~13 kb humane genomske sekvence 3’ humanog VH1-2 genskog segmenta, -800 bp mišje genomske sekvence nishodno mišjeg gena ADAM6b, mišjeg gena ADAM6b, -4800 bp genomske sekvence ushodno mišjeg gena ADAM6b, 5’ Frt mesto, higromicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, ~300 bp mišje genomske sekvence nishodno mišjeg gena ADAM6a, mišji gen ADAM6a, -3400 bp mišje genomske sekvence ushodno mišjeg gena ADAM6a, i 3’ genomski fragment koji sadrži ~30 kb humane genomske sekvence 5’ humanog VH6-1 genskog segmenta (donji deo SL.13).
[0247] Konstruisani klon BAC-a (opisan iznad) upotrebljen je za elektroporisanje mišjih ES ćelija koje su sadržale humanizovani lokus teškog lanca za dobijanje stvorenih modifikovanih ES ćelija koje obuhvataju ektopično smeštenu mišju genomsku sekvencu koja obuhvata mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b unutar humanizovanog lokusa teškog lanca. Pozitivne ES ćelije koje sadrže ektopični mišji genomski fragment unutar humanizovanog lokusa teškog lanca identifikovane su kvantitativnim ™
testom PCR pomoću sondi TAQMAN (Lie and Petropoulos, 1998, Advances in quantitative PCR technology: 5’nuclease assays, Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). Ushodni i nishodni regioni izvan modifikovanog dela humanizovanog lokusa teškog lanca potvrđeni su PCR-om pomoću prajmera i sondi koji se nalaze unutar modifikovanog regiona da bi se potvrdilo prisustvo ektopične mišje genomske sekvence u humanizovanom lokusu teškog lanca kao i higromicinskoj kaseti. Nukleotidna sekvenca po tački ushodnog isertovanja uključivala je sledeće, što ukazuje na humanu genomsku sekvencu teškog lanca ushodno od tačke insertovanja i I-Ceul restrikciono mesto (sadržano u zagradama ispod) koji su neposredno povezani sa mišjom genomskom sekvencom prisutnom na tački insertovanja: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO:4). Nukleotidna sekvenca po nishodnoj tački insertovanja na 3’ kraju ciljanog regiona uključivala je sledeće, što ukazuje na mišju genomsku sekvencu i restrikciono mesto PI-Scel (koje se nalazi u zagradama ispod) koji su neposredno povezani sa humanom genomskom sekvencom teškog lanca nishodno od tačke insertovanja:
[0248] Ciljane ES ćelije opisane iznad upotrebljene su kao donorske ES ćelije i uvedene u mišji embrion ®
u stadijumu 8 ćelija postupkom konstruisanja miševa VELOCIMOUSE (videti, npr., US Pat. Nos.
7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopičnu mišju genomsku sekvencu koja obuhvata mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b identifikovani su genotipovanjem pomoću testa modifikacije alela (Valenzuela et al., 2003) koji je detektovao prisustvo mišjih gena ADAM6a i ADAM6b unutar humanizovanog lokusa teškog lanca.
[0249] Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži mišje gene ADAM6a i ADAM6b ukršteni su sa sojem „FLPe deleter“ miševa (videti, npr., Rodriguez et al., 2000, High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-IoxP. Nature Genetics 25:139-140) kako bi se uklonila bilo koja Frt’-ovane higromicinske kasete uvedena ciljnim vektorom koji nije uklonjen, npr., u stadijumu ES ćelije ili u embrionu. Opciono, u mišu je zadržana higromicinska kaseta.
[0250] Mladunci su genotipovani i mladunče heterozigotno za humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopični mišji genomski fragment koji obuhvata mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b izabrano je za karakterisanje ekspresije mišjeg gena ADAM6 i plodnosti.
Primer 8
Karakterizacija miševa sa oporavljenim ADAM6
[0251] Protočna citometrija. Tri miša starosti 25 sedmica, homozigotna za varijabilne genske lokuse
/+ /+
humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H κ ) i tri miša starosti 18–20 sedmica, homozigotna za humani teški i humani κ laki lanac koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje gene /+ res /+
ADAM6a i ADAM6b unutar oba alela humanog lokusa teškog lanca (H A6 κ ) žrtvovani su radi identifikacije i analize populacije ćelija limfocita pomoću FACs na sistemu BD LSR II (BD Bioscience). Limfociti su ograđeni za specifične ćelijske linije i analizirani na progresiju u različitim stadijumima ravoja B ćelija. Tkiva sakupljena iz životinja uključivala su krv, slezinu i koštanu srž. Krv je sakupljena u BD microtainer epruvete sa EDTA (BD Biosciences). Koštana srž je sakupljena iz butnih kosti ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom dopunjenim fetalnim telećim serumom, natrijum piruvatom, HEPES-om, 2merkaptoetanolom, neesencijalnim aminokiselinama, i gentamicinom. Crvene krvne ćelije iz preparata krvi, slezine i koštane srži lizirane su puferom za lizu na bazi amonijum hlorida (npr., ACK pufer za lizu), za čim je sledilo pranje kompletnim RPMI medijumom.
6
[0252] Za bojenje ćelijske populacije, 1 x 10 ćelija iz različitih izvora tkiva inkubirano je sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, za čim je sledilo obeležavanje jednim ili kombinacijom sledećih koktela antitela tokom 30 minuta na ledu.
[0253] Koštana srž: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).
[0254] Periferna krv i slezina: anti-mišji FITC-κ (187.1, BD Biosciences), PE-λ (RML-42, BioLegend), PeCy7IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). Nakon inkubacije sa obeležnim antitelima, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Dobijanje podataka izvedeno je na protočnom citometru LSRII i analizirano pomoću FlowJo (Treestar, Inc.). Rezultati iz reprezentativnog /+ /+ /+ res /+
H κ i H A6 κ miša prikazani su na SL.14–18.
/+ res /+
[0255] Rezultati pokazuju da B ćelije H A6 κ miševa napreduju u stadijumima razvoja B ćelija na /+ /+
sličan način kao kod H κ miševa u koštanoj srži i perifernim kompartmentima, i pokazuju normalne /+ res /+
obrasce sazrevanja pošto uđu u periferiju. H A6 κ miševi pokazali su povećanu populaciju int /+ /+
CD43 CD19 ćelija u poređenju sa H κ miševima (SL.16B). To može ukazivati na ubrzanu ekspresiju IgM iz humanizovanog lokusa teškog lanca koji sadrži ektopični mišji genomiski fragment koji obuhvata /+ res /+
mišje sekvence ADAM6a i ADAM6b u H A6 κ miševima. U periferiji, populacije B i T ćelija /+ res /+ /+ /+
H A6 κ miševa izgledaju normalno i slično kao kod H κ miševa.
[0256] Morfologija testisa i karakterizacija spermatozoida. Da bi se odredilo da li je neplodnost kod miševa koji imaju humanizovane varijabilne lokuse teškog lanca imunoglobulina posledica defekta testisa i/ili spermatozoida, ispitana je morfologija testisa i sadržaj spermatozoida iz pasemnika (epididymis).
[0257] Sažeto, testisi iz dve grupe (n=5 po grupi; grupa 1: miševi homozigotni za humane varijabilne
/+ /+
genske lokuse teškog i κ lakog lanca, H κ ; grupa 2: miševi heterozigotni za humane varijabilne /- /+ genske lokuse teškog lanca i homozigotni za varijabilne genske lokuse κ lakog lanca, H κ ) secirani su sa netaknutim pasemnicima i izvagani. Primerci su tada fiksirani, ukalupljeni u parafin, isečeni na delove i obojeni hematoksilinom i eozinom (HE). Isečci testisa (2 testisa po mišu, za ukupno 20) ispitani su na defekte u morfologiji i dokaz proizvodnje spermatozoida, dok su isečci pasemnika ispitani na prisustvo spermatozoida.
/+ /+
[0258] U tom eksperimentu, nisu uočene nikakve razlike u masi ili morfologiji testisa između H κ / /+
miševa i H κ miševa. Spermatozoidi su posmatrani i u testisima i u pasemnicima svih genotipova. Ti rezultati utvrđuju da odsustvo mišjih gena ADAM6a i ADAM6b ne vodi do detektabilnih promena u morfologiji testisa, i da se spermatozoidi proizvode kod miševa u prisustvu i odsustvu ta dva gena.
/+ /+
Stoga nije verovatno da su defekti u plodnosti mužjakā H κ miša posledica niske proizvodnje spermatozoida.
[0259] Pokretljivost i migracija spermatozoida. Miševi kojima nedostaju drugi članovi porodice gena ADAM neplodni su usled defekta u pokretljivosti i migraciji spermatozoida. Migracija spermatozoida definiše se kao sposobnost spermatozoida da pređu iz materice u jajovod, i normalno je neophodna za oplodnju kod miša. Da bi se odredilo da li delecija mišjeg ADAM6a and ADAM6b utiče na proces,
/+ /+
procenjene su migracija i pokretljivost spermatozoida kod H κ miševa.
[0260] Sažeto, spermatozoidi su dobijeni iz testisa (1) miševa homozigotnih za humane varijabilne /+ /+ genske lokuse teškog lanca i homozigotnih za humane varijabilne genske lokuse κ lakog lanca (H κ ); (2) miševa homozigotnih za humane varijabilne genske lokuse teškog lanca i homozigotnih za humane
/+ /+
varijabilne genske lokuse κ lakog lanca (H κ ); (3) miševa homozigotnih za humane varijabilne /+
genske lokuse teškog lanca i homozigotnih za κ laki lanca divljeg tipa (H mκ); i, (4) miševa C57 BU6 divljeg tipa (WT). Pregledom nisu uočene značajne abnormalnosti u broju spermatozoida ili ukupne pokretljivosti spermatozoida. Za sve miševe, uočeno je rasipanje kumulusa, koji ukazuje da je svaki uzorak spermatozoida bio u stanju da prodre do ćelija kumulusa i da se in vitro veže za zona pellucida.
/+ /+
Ti rezultati utvrđuju da H κ miševi imaju spermatozoide koji su sposobni da prodru u kumulus i vežu se za zona pellucida.
[0261] Oplodnja mišjih jajnih ćelija in vitro (IVF) učinjena je pomoću spermatozoida iz miševa kao što /+ /+
je opisano iznad. Nešto niži broj izdeljenih embriona uočen je za H κ miševe dan posle IVF, kao i /+ /+ smanjen broj spermatozoida vezanih za jajajšca. Ti rezultati utvrđuju da su spermatozoidi iz H κ miševa, jednom kada se izlože jajnoj ćeliji, sposobni da prodru u kumulus i vežu se za zona pellucida.
/+ /+
[0262] U drugom eksperimentu, sposobnost spermatozoida iz H κ miševa da migriraju iz materice i kroz jajovode određena je u testu migracije spermatozoida.
/+ /+
[0263] Sažeto, prva grupa superovuliranih ženki miševa (n=5) postavljena je sa H κ mužjacima (n=5)
/- /+
i druga grupa superovuliranih ženki miševa (n=5) postavljena je sa H κ mužjacima (n=5). Praćena je kopulacija sparenih parova, i pet do šest sati posle kopulacije materica je zajedno sa jajovodima uklonjena iz svih ženki i isprana radi analize. Rastvori za ispiranje provereni su na jajašca da bi se potvrdila ovulacija i dobio broj spermatozoida. Migracija spermatozoida evaluirana je na dva različita načina. Prvi, oba jajnika odvojena su od materice, isprana fiziološkim rastvorom, i izbrojani su svi identifikovani spermatozoidi. Prisustvo jajašceta takođe je navedeno kao dokaz ovulacije. Drugi, jajovodi su ostavljeni povezani sa matericom i oba tkiva su fiksirana, ukalupljena u parafin, isečena na delove i obojena (kao što je opisano iznad). Isečci su ispitani na prisustvo spermatozoida, i u materici i u oba jajovoda.
/+ /+
[0264] Za ženke koje su se parile sa pet H κ mužjaka, pronađeno je veoma malo spermatozoida u /- /+ rastvoru za ispiranje iz jajovoda. Rastvori za ispiranje iz jajovoda ženki koje su se parile sa H κ mužjacima pokazali su nivo spermatozoida oko 25 do 30-struko veći (prosek, n = 10 jajovoda) u odnosu /+ /+ na onaj prisutan u rastvorima za ispiranje iz jajovoda ženki koje su se parile sa H κ mužjacima.
/+ /+ /+ res /+
Reprezentativno poređenje ukrštanja H κ i H A6 κ miševa prikazano je u TAbeli 9.
[0265] Pripremljeni su histološki isečci materice i jajovoda. Isečci su ispitani na prisustvo spermatozoida u materici i jajovodima (colliculus tubarius). Pregled histoloških isečaka jajovoda i /+ /+
materice otkrio je da su za ženke miševa koje su se parile sa H κ miševima, spermatozoidi /+ /+ pronađeni u materici ali nisu u jajovodima. Dalje, isečci iz ženki koje su se parile sa H κ miševima otkrili su da spermatozoidi nisu pronađeni u uterotubalnom spoju (uterotubal junction – UTJ). U
/- /+
isečcima iz ženki koje su se parile sa H κ miševima, spermatozoidi su identifikovani u UTJ i u jajovodima.
[0266] Ti rezultati utvrđuju da miševi kojima nedostaju geni ADAM6a i ADAM6b prave spermatozoide koji ispoljavaju defekt migracije in vivo. U svim slučajevima, spermatozoidi su posmatrani u materici, ukazujući da se kopulacija i oslobađanje spermatozoida očito dešavaju kao i normalno, ali malo do nimalo spermatozoida nije uočeno u jajovodima nakon kopulacije merenjem bilo brojanjem spermatozoida ili histološkim posmatranjem. Ti rezultati utvrđuju da miševi kojima nedostaju geni ADAM6a i ADAM6b proizvode spermatozoide koji ispoljavaju nesposobnost da migriraju iz materice u jajovode. Taj defekt očito vodi do neplodnosti jer su spermatozoidi nesposobni da pređu kroz uterotubalni spoj u jajovod, gde se oplođuju jajašca. Uzeti zajedno, svi ti rezultati konvergiraju podržavanju hipoteze da mišji geni ADAM6 pomažu usmeravanju spermatozoida sa normalnom pokretljivošću da migriraju iz materice, kroz uterotubalni spoj i jajovod, i tako priđu jajašcetu da bi došlo do oplodnje. Mehanizam kojim ADAM6 to postiže može biti usmeravan pomoću jednog ili oba proteina ADAM6, ili preko koordinirane ekspresije sa drugim proteinima, npr., drugim proteinima ADAM, u ćeliji spermatozoida, kao što je opisano ispod.
Tabela 9
[0267] Ekspresija porodice gena ADAM. Poznato je da je kompleks proteina ADAM prisutan kao kompleks na površini spermatozoida u sazrevanju. Miševi kojima nedostaju drugi članovi porodice gena ADAM gube taj kompleks kako spermatozoidi sazrevaju, i ispoljavaju smanjenje broja višestrukih proteina ADAM u zrelim spermatozoidima. Da bi se odredilo da li nedostatak gena ADAM6a i ADAM6b utiče na druge proteine ADAM na sličan način, analizirani su Western blot-ovi ekstraktā proteina iz testisa (nezreli spermatozoidi) i pasemnika (spermatozoidi u sazrevanju) da bi se odredili nivoi ekspresije drugih članova porodice gena ADAM.
/+ /+ /-[0268] U ovom eksperimentu, ekstrakti proteina analizirani su iz grupa (n=4 po grupi) H κ i H +/+
κ miševa. Rezultati su pokazali da ekspresija ADAM2 i ADAM3 nije uticala na ekstrakte iz testida. Međutim, i ADAM2 i ADAM3 bili su dramatično smanjeni u ekstraktima iz pasemnika. To pokazuje da
/+ /+
odsustvo ADAM6a i ADAM6b u spermatozoidima H κ miševa može imati direktan uticaj na ekspresiju i moguće funkciju drugih proteina ADAM kako spermatozoidi sazrevaju (npr., ADAM2 i ADAM3). To sugeriše da su ADAM6a i ADAM6b deo kompleksa proteina ADAM na površini spermatozoida, što bi moglo biti kritično za ispravnu migraciju spermatozoida.
Primer 9
Upotreba humanog varijabilnog gena teškog lanca kod miševa sa oporavljenim ADAM6
[0269] Upotreba izabanih humanih varijabilnih gena teškog lanca određena je za miševe homozigotne za humane varijabilne lokuse teškog i κ lakog lanca kojima bilo da nedostaju mišji geni ADAM6a i /+ /+
ADAM6b (H κ ) ili sadrže ektopični genomski fragment koji kodira za mišje gene ADAM6a i ADAM6b /+ res /+ ™
(H A6 κ ) kvantitativnim testom PCR pomoću sondi TAQMAN (kao što je opisano iznad).
/+ /+ /+ res /+
[0270] Sažeto, B ćelije CD19 pročišćene su iz slezina H κ i H A6 κ miševa pomoću mišjih CD19
™ mikro-kuglica (Miltenyi Biotec) i ukupna RNK pročišćena je pomoću mini kompleta RNEASY (Qiagen). Genomska RNk uklonjena je tretmanom na koloni DNaze bez RNaze (Qiagen). Oko 200 ng mRNK reverzno je traskribovano u cDNK pomoću kompleta za sintezu prvog lanca cDNK (Invitrogen) i onda ™
umnožena sa TAQMAN Univerzalnim PCR Master Mix-om (Applied Biosystems) pomoću sistema za detektovanje sekvenci ABI 7900 (Applied Biosystems). Relativne ekspresije svakog gena normalizovane su do ekspresije mišjeg konstantnog regiona κ lakog lanca (mCκ). Tabela 10 iznosi
™
kombinacije sondi sens/antisens/TAQMAN MGB upotrebljene u ovom eksperimentu.
Tabela 10
[0271] U ovom eksperimentu, ekspresija sva četiri humana VHgena uočena je u analiziranim uzorcima.
/+ /+ /+ res /+
Dalje, nivoi ekspresije mogli su se porediti između H κ i H A6 κ miševa. Ti rezultati pokazuju da su humani VHgeni koji su i distalni u odnosu na mesta modifikacije (VH3-23 i VH1-69) i proksimalni u odnosu na mesta modifikacije (VH1-2 i VH6-1) svi bili u stanju da se rekombinuju da bi obrazovali funkcionalno eksprimovan humani teški lanac. Ti rezultati pokazuju da ektopični genomski fragment koji obuhvata mišje mouse ADAM6a i ADAM6b sekvence insertovane u humanu genomsku sekvencu teškog lanca nije uticao na V(D)J rekombinaciju humanih genskih segmenata teškog lanca unutar lokusa, i ti miševi su bili u stanju da rekombinuju humane genske segmente teškog lanca na normalan način da bi proizveli funkcionalne imunoglobulinske proteine teškog lanca.
Primer 10
Humoralni imunski odgovor kod miševa sa oporavljenim ADAM6
[0272] Humoralni imunski odgovor određen je za miševe homozigotne za humane varijabilne genske /+ /+ lokuse teškog i κ lakog lanca kojima bilo da nedostaju mišji geni ADAM6a i ADAM6b (H κ ) ili sadrže /+ res /+ ektopični genomski fragment koji kodira mišje gene ADAM6a i ADAM6b (H A6 κ ) po šemi imunizacije sa više antigena praćenom izolovanjem i karakterizacijom antitela. Rezultati su upoređeni radi određivanja bilo kakvog efekta na V(D)J rekombinaciju koja uključuje humane genske segmente imunoglobulina, procene napredovanja titra u serumu, proizvodnje antitela od strane hibridoma i afiniteta za antigen.
[0273] Protokol imunizacije. Humani površinski ćelijski receptor (Antigen A), humano antitelo specifično za humanu receptorsku tirozin-protein kinazu (Antigen B), izlučeni humani protein koji funkcioniše u regulaciji signalnog puta TGF-β (Antigen C), i humanu receptorsku tirozin kinazu (Antigen D) korišćeni su za komparativnu imunizaciju u grupama miševa. Serum je sakupljen iz grupa miševa pre imunizacije gornjim antigenima. Svaki antigen (2.3 μg svaki) davan je u početnoj aktivirajućoj imunizaciji (eng. priming immunization) pomešan sa 10 μg CpG oligonukleotida kao adjuvanta (Invivogen). Imunogen je davan preko stopala (footpad – f.p.) u zapremini od 25 μl po mišu. Nakon toga, miševi su izazvani preko f.p. sa 2.3 μg antigena zajedno sa 10 μg CpG i 25 μg Adju-Phos (Brenntag) kao adjuvanta dana 3, 6, 11, 13, 17 i 20. tokom ukupno šest izazivanja. Miševima je uzeta krv dana 15. i 22. nakon četvrtog i šestog izazivanja, tim redom, i antiserumi su testirani na titar za svaki specifični antigen.
[0274] Titri antitela određeni su u serumima imunizovanih miševa pomoću testa ELISA. Mikrotitarske ploče sa devedeset šest bunarčića (Thermo Scientific) obložene su odgovarajućim antigenom (2 μg/ml) u fiziološkim rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS, Irvine Scientific) preko noći na 4° C. Sledećeg dana, ploče su isprane fiziološkim rastvorom sa fosfatnim puferom koji je sadržao 0.05% Tween 20 (PBS-T, Sigma-Aldrich) četiri puta pomoću perača ploča (Molecular Devices). Ploče su zatim blokirane sa 250 μl 0.5% albumina iz govođeg seruma (BSA, Sigma-Aldrich) u PBS i inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim oprane četiri puta sa PBS-T. Serumi iz imunizovanih miševa i serumi pre imunizacije serijski su razblaženi trostruko u 0.5% BSA-PBS počevši od u 1:300 ili 1:1000 i dodati blokiranim pločama u duplikatu i inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi. Poslednja dva bunarčića ostavljena su prazna da bi se upotrebila kao sekundarna kontrola antitela. Ploče su ponovo oprane četiri puta sa PBS-T u peraču ploča. Razblaženje 1:5000/1:10,000 kozjeg anti-mišjeg IgG i Fcperoksidaze iz rena (HRP, Jackson Immunoresearch) ili kozjeg anti-mišjeg IgG i kapa-HRP (Southern Biotech) konjugovanog sekundarnog antitela dodato je na ploče i inkubirano jedan sat na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo oprane osam puta sa PBS-T i razvijene pomoću TMB/H2O2kao supstratom. Supstrat je inkubirana tokom dvadeset minuta i reakcija je zaustavljena sa 2 N H2SO4(VWR) ili 1 N H3PO4(JT Baker). Ploče su očitane na spektrofotometru (Victor, Perkin Elmer) na 450 nm. Titri antitela izračunati su pomoću Graphpad PRISM softvera.
[0275] Serumski titar izračunat je kao razblaženje seruma unutar eksperimentalnog titracionog opsega pri signalu vezivanja antitela ekvivalentnom sa dva puta iznad pozadine. Rezultati za humoralni imunski odgovor prikazani su na SL. 19 (Antigen A), SL. 20 (Antigen B), SL. 21 (Antigen C) i SL. 22 (Antigen D). Pozitivni rezultati na antigen hibridoma napravljenih upotrebljavajući dve slezine izolovane iz miševa iz svake grupe odabranih imunizacija prikazani su u Tabeli 11 (rezultat antigena jednak je 2 x/pozadina).
[0276] Kao što je pokazano u ovom Primeru, titri antitela stvorenih u miševima sa oporavljenim Adam6 /+ res /+
(H A6 κ ) mogli su se porediti sa onima stvorenim u miševima kojima nedostaju ADMA6a i /+ /+ /+ res /+
ADAM6b i koji imaju humanizovani teški lanac (H κ ). Dalje, slezine iz H A6 κ miševa dale su hibridome pozitivne na antigen za sve testirane antigene, uključujući antitela visokog afiniteta, na /+ /+
nivoima koji su se mogli porediti sa H κ miševima. Prema tome, veruje se da ne postoji oštećenje V(D)J rekombinacije humanih genskih segmenata imunoglobulina kod miševa sa oporavljenim Adam6 s obzirom na proizvodnju antitela visokog afiniteta koja sadrže humane gene imunoglobulina.
Tabela 11
Primer 11
Određivanje afiniteta za vezivanje antigena
[0277] Afiniteti za vezivanje antitela koja pokazuju specifično vezivanje za Antigen B testirani su pomoću biosenzora rezonance površinskih plazmona u realnom vremenu (BIAcore 2000).
/+ /+ Kondicionirani medijumi iz hibridoma izolovanih iz dva soja miševa imunizovanih Antigenom B (H κ /+ res /+
i H A6 κ ) upotrebljeni su tokom BIAcore skrininga. Površina senzora BIAcore prvo je derivatizovana sa poliklonskim zečjim anti-mišjim antitelom (GE) da bi se uhvatila anti-antigen B antitela iz kondicioniranih medijuma. Tokom celog postupka skrininga, HBST (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v surfaktant P20) upotrebljavan je kao pufer za elektroforezu (running buffer). Fab fragment Antigena B ubrizgan je preko uhvaćene površine anti-antigen B antitela pri brzini protoka od 50 μl/minute u koncentraciji od 100 nM. Asocijacija antitela i antigena praćena je tri minuta dok je disocijacija antigena od uhvaćenog antitela posmatrana pet minuta u HBST puferu za elektroforezu. Eksperiment je izveden na 25° C. Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su obradom i uklapanjem podataka sa modelom vezivanja 1:1 pomoću Scrubber 2.0 softvera za uklapanje u krivu. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativnog polu-vremena (T1/2) izračunati su iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd / ka; i T1/2(min) = (In2/(60*kd). Rezultati za odabrana anti-antigen B antitela prikazani su u Tebeli 12.
Tabela 12
[0278] U sličnom eksperimentu, kinetika različitih monoklonskih antitela prisutnih u hibridomom kondicioniranom medijumu koji se vezuje za antigen A određena je pomoću biosenzora rezonance površinskih plazmona u realnom vremenu (BIAcore 4000) assay. Svi klonovi hibridoma upotrebljavani /+ res /+
u tom testu proizvedeni su u H A6 κ miševima.
[0279] Sažeto, da bi se uhvatila antitela specifična za antigen A, poliklonsko zečje anti-mišje antitelo (GE Catalog# BR-1008-38) prvo je imobilisano na čipu senzora. BIAcore skrining izveden je u dva različita pufera -PBSP, pH7.2 i PBSP, pH6.0. Oba pufera dopunjena su sa 0.1 mg/ml BSA. Posle hvatanja anti-antigen A antitela iz kondicioniranih medijuma, 1 μM monomera antigena A (pripremljenog u odgovarajućem puferu za elektroforezu) ubrizgano je preko površine uhvaćenog antitela tokom 1.5 minuta na 30 μl/minute i disocijacija veze monomera antigena A praćena je tokom 1.5 minuta u odgovarajućem puferu za elektroforezu na 25°C. Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su obradom i uklapanjem podataka sa modelom vezivanja 1:1 pomoću Scrubber 2.0 softvera za uklapanje u krivu. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativna polu-vremena (T1/2) izračunati su iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd / ka; i T1/2 (min) = (In2/(60*kd). Tabela 13 iznosi parametre kinetika vezivanja za odabrano vezivanje anti-antigen A antitela sa monomerom antigena A pri pH 7.2 i pH 6.0. NB: vezivanje nije detektovano pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
Ċ
Tabela 13
(nastavak)
/+ res /+ /+ /+
[0280] Kao što je prikazano iznad, antitela sa visokim afinitetom dobijena su i iz H A6 κ i iz H κ miševa na uporediv način. Među dvadeset pet antitela predstavljenih u Tabeli 12, dvadeset /+ res /+
proizvedenih u H A6 κ miševima pokazalo je opseg afiniteta od 0.5 nM do 1 μM, dok je pet /+ /+
stvorenih u H κ miševima pokazalo opseg afiniteta od 10 nM do 150 nM. Dalje, pedeset pet antitela prikazanih u Tabeli 13 pokazalo je opseg afiniteta od 20 pM do 350 nM za vezivanje za monomer antigena A.
[0281] Kao što je pokazano u ovom Primeru, ponovno insertovanje mišjih gena Adam6 u humanizovani lokus teškog lanca imunoglobulina ne narušava sposobnost miša da izgradi snažan imunizujući odgovor na višestruke antigene karakterisan repertoarom humanih antitela koja imaju raznovrsne afinitete u pod-nanomolarnom opsegu, koji su izvedeni iz humanih genskih segmenata rearanžiranih iz konstruisane germinativne linije.

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Miš čiji genom obuhvata modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina, pri čemu modifikacija eliminiše endogenu funkciju ADAM6, koja je povezana sa smanjenom plodnošću kod mužjakā miša, miš dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji protein ADAM6a, ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša, i/ili mišji protein ADAM6b, ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
2. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu navedena sekvenca nukleinske kiseline kodira mišji protein ADAM6a, ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša, ili mišji protein ADAM6b, ili njegov ortoglog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
3. Miš prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je navedena sekvenca nukleinske kiseline na endogenom lokusu imunoglobulina ili pri čemu je navedena sekvenca nukleinske kiseline integrisana u mišji genom na drugačijem položaju nego endogeni lokus imunoglobulina.
4. Miš prema bilo kom od patentnih zahteva 1–3, pri čemu modifikacija lokusa teškog lanca imunoglobulina obuhvata insertovanje jedne ili više humanih genskih sekvenci imunoglobulina ili
pri čemu modifikacija lokusa teškog lanca imunoglobulina obuhvata zamenu jedne ili više sekvenci u mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina jednom ili većim brojem humanih genskih sekvenci imunoglobulina,
poželjno pri čemu modifikacija lokusa teškog lanca imunoglobulina obuhvata zamenu endogene varijabilne genske sekvence teškog lanca humanom varijabilnom genskom sekvencom teškog lanca, i
poželjnije pri čemu modifikacija lokusa teškog lanca imunoglobulina obuhvata zamenu jednog ili više endogenih V (VH) genskih segmenata teškog lanca jednim ili većim brojem humanih V (VH) genskih segmenata teškog lanca.
5. Postupak za modifikovanje lokusa teškog lanca imunoglobulina miša, koji obuhvata:
(a) pravljenje prve modifikacije mišjeg lokusa teškog lanca imunoglobulina koja dovodi do eliminacije endogene mišje aktivnosti ADAM6 kod mužjaka miša; i
(b) pravljenje druge modifikacije miša da bi se dodala sekvenca nukleinske kiseline koja mišu daje aktivnost ADAM6 koja je funkcionalna u mužjaku miša, poželjno pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline u koraku (b) dodaje na ektopični položaj, koja sekvenca nukleinske kiseline kodira mišji protein ADAM6a ili njegov ortolog, homolog ili funkcionalni fragment, i/ili mišji protein ADAM6b ili njegov ortolog, homolog ili funkcionalni fragment.
6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, pri čemu prva modifikacija obuhvata insertovanje jedne ili više humanih genskih sekvenci imunoglobulina ili
pri čemu prva modifikacija obuhvata zamenu jedne ili više sekvenci u mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina jednom ili većim brojem humanih genskih sekvenci imunoglobulina, poželjno pri čemu prva modifikacija obuhvata zamenu endogene varijabilne genske sekvence teškog lanca humanom varijabilnom genskom sekvencom teškog lanca, i
poželjnije pri čemu prva modifikacija obuhvata zamenu jednog ili više endogenih VH genskih segmenata jednim ili većim brojem humanih VHgenskih segmenata.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5–6, pri čemu se prva i druga modifikacija prave istovremeno.
8. Izolovana ćelija ili izolovano tkivo iz miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1–4.
RS20230475A 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi RS64280B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161446895P 2011-02-25 2011-02-25
US201161497650P 2011-06-16 2011-06-16
US201261595200P 2012-02-06 2012-02-06
EP22156414.9A EP4067496B1 (en) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 mice

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64280B1 true RS64280B1 (sr) 2023-07-31

Family

ID=45998616

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150163A RS53880B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20191599A RS59661B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20191337A RS59413B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20230475A RS64280B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20200177A RS59929B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150163A RS53880B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20191599A RS59661B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi
RS20191337A RS59413B2 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200177A RS59929B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-24 Adam6 miševi

Country Status (31)

Country Link
US (12) US8642835B2 (sr)
EP (7) EP4067496B1 (sr)
JP (8) JP2014507137A (sr)
KR (1) KR101387377B1 (sr)
CN (2) CN105861548B (sr)
AU (6) AU2012243291B2 (sr)
BR (1) BR112013021771B1 (sr)
CA (1) CA2820824A1 (sr)
CY (5) CY1116301T1 (sr)
DE (5) DE14176593T1 (sr)
DK (6) DK2738259T3 (sr)
ES (6) ES2532487T3 (sr)
FI (3) FI2578688T4 (sr)
HR (5) HRP20230526T1 (sr)
HU (5) HUE024534T2 (sr)
IL (4) IL226727A (sr)
IN (1) IN2013CN07629A (sr)
LT (4) LT2738259T (sr)
ME (3) ME03732B (sr)
MX (3) MX375115B (sr)
MY (1) MY172713A (sr)
NZ (2) NZ731926A (sr)
PL (5) PL2738259T3 (sr)
PT (5) PT2738258T (sr)
RS (5) RS53880B1 (sr)
RU (2) RU2722373C2 (sr)
SG (4) SG10201913160QA (sr)
SI (5) SI2738258T2 (sr)
SM (5) SMT202300173T1 (sr)
WO (1) WO2012141798A1 (sr)
ZA (1) ZA201305998B (sr)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
EP2395016A3 (en) 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
EP4353819A3 (en) 2004-07-22 2024-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
ME03732B (me) 2011-02-25 2021-01-20 Regeneron Pharma Miševi s ADAM6
US10040826B2 (en) 2011-07-05 2018-08-07 Duke University Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) N-terminal deleted GP120 immunogens
HRP20192255T1 (hr) * 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
JP2014531452A (ja) 2011-09-19 2014-11-27 カイマブ・リミテッド 動物、レパートリーおよび方法
BR112014006390A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd anticorpos, domínios variáveis e cadeias feitos especialmente para uso humano
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
CA2850745C (en) 2011-10-03 2022-12-13 Duke University Vaccine
HRP20220253T1 (hr) 2011-10-17 2022-04-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miševi s ograničenim teškim lancem imunoglobulina
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20180295821A1 (en) * 2011-12-02 2018-10-18 Kymab Limited Transgenic Animals
ME03477B (me) 2011-12-20 2020-01-20 Regeneron Pharma Miševi sa humanizovanim lakim lancem
SG10201913428QA (en) * 2012-02-01 2020-03-30 Regeneron Pharma Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
PT2825037T (pt) 2012-03-16 2019-08-07 Regeneron Pharma Animais não humanos que expressam sequências de imunoglobulinas sensíveis ao ph
RU2014141536A (ru) 2012-03-16 2016-05-10 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Мыши, которые продуцируют антигенсвязывающие белки с зависимыми от величины ph характеристиками связывания
SMT201800395T1 (it) 2012-03-16 2018-09-13 Regeneron Pharma Anticorpi a catena leggera ingegnerizzati con istidina e roditori modificati geneticamente per la generazione degli stessi
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
GB2502127A (en) * 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
DK2838917T3 (da) 2012-04-20 2019-08-26 Merus Nv Fremgangsmåder og midler til frembringelse af heterodimere ig-lignende molekyler
KR102484480B1 (ko) * 2012-06-12 2023-01-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
HK1218866A1 (zh) 2013-02-06 2017-03-17 瑞泽恩制药公司 基於b细胞谱系的人源化动物的免疫原设计
LT2840892T (lt) * 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis
PL2967012T3 (pl) * 2013-03-14 2021-04-19 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgeniczne ssaki inne niż człowiek do wytwarzania przeciwciał
WO2014141192A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Erasmus University Medical Center Generation of heavy chain-only antibodies
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
ES2993142T3 (en) 2013-10-01 2024-12-23 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
JP6267986B2 (ja) * 2014-02-13 2018-01-24 株式会社特殊免疫研究所 ヒトの特定分子と結合する分子標的物質のｉｎｖｉｖｏ評価法
BR112016021679A2 (pt) 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
WO2016044745A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
TW202417497A (zh) 2015-10-12 2024-05-01 美商再生元醫藥公司 活化瘦素受體的抗原結合蛋白
EP3402326A1 (en) 2016-01-13 2018-11-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents having an engineered heavy chain diversity region
RU2018130010A (ru) 2016-02-16 2020-03-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Животные, отличные от человека, имеющие мутантный ген кинурениназы
CN109475109B (zh) * 2016-05-20 2021-10-29 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
SI3462853T1 (sl) 2016-06-03 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo
WO2017214089A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
EP3766343B1 (en) 2016-11-04 2022-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
US11122042B1 (en) 2017-05-12 2021-09-14 F5 Networks, Inc. Methods for dynamically managing user access control and devices thereof
EP3635009B1 (en) 2017-06-07 2026-02-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
LT3720279T (lt) 2017-12-05 2022-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, turinčios sukonstruotą imunoglobulino lambda lengvąją grandinę, ir jų panaudojimas
IL276464B2 (en) 2018-02-07 2026-01-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for administering therapeutic protein
US20210000088A1 (en) 2018-03-21 2021-01-07 Crystal Bioscience Inc. Transgenic chicken that produces human antibodies
HUE070158T2 (hu) 2018-03-24 2025-05-28 Regeneron Pharma Genetikailag módosított egerek vagy patkányok peptid-mhc komplexek elleni terápiás antitestek létrehozásra, ezek elõállítására szolgáló módszerek, valamint alkalmazásuk
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
PT3773713T (pt) 2018-04-06 2025-07-29 Regeneron Pharma Anticorpo agonista do recetor de leptina para usar no aumento da massa óssea num sujeito que sofre de disfunção metabólica ou de hipoleptinemia
MA52626A (fr) 2018-05-17 2021-03-24 Regeneron Pharma Anticorps anti-cd63, conjugués et leurs utilisations
WO2019240999A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 Crystal Bioscience Inc. Camelization of a human variable domain by gene conversion
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
WO2020169022A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
SG11202107589PA (en) 2019-02-22 2021-08-30 Regeneron Pharma Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
MX2021014893A (es) 2019-06-05 2022-03-11 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un repertorio de cadena ligera lambda limitado expresado a partir del locus kappa y usos de estos.
DK3785536T4 (da) 2019-08-28 2025-10-27 Trianni Inc Adam6-knockin-mus
AU2020395122A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-MHC II protein constructs and uses thereof
IL298632A (en) 2020-06-02 2023-01-01 Biocytogen Pharmaceuticals Beijing Co Ltd Non-human animals genetically modified with a common light chain immunoglobulin locus
EP4211155A1 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
JP2024501796A (ja) 2020-12-23 2024-01-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 膜貫通タンパク質に結合する抗体、および抗体を産生する細胞を取得する方法
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
MX2023012300A (es) 2021-04-20 2023-10-26 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra artemina y metodos de uso de estos.
WO2024015816A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to ciliary neurotrophic factor receptor (cntfr) and methods of use thereof
KR20250150011A (ko) 2023-02-13 2025-10-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-인간 cacng1 항체를 이용한 근육 관련 장애 치료
AU2024265507A1 (en) 2023-05-02 2025-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
CN121568720A (zh) 2023-07-10 2026-02-24 瑞泽恩制药公司 抗人类cacng1抗体-药物缀合物及其用途
WO2025055311A1 (zh) 2023-09-15 2025-03-20 赛业（苏州）生物科技有限公司 用于制备抗体的基因修饰小鼠及其制备方法
EP4548758A4 (en) * 2023-09-15 2025-11-19 Cyagen Biosciences Suzhou Inc Genetically modified mice for antibody preparation and the method of preparation
WO2025064738A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dntt 250-258 off-target peptides and uses thereof
WO2025064761A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kras10-18 g12d off-target peptides and uses thereof
EP4606901A1 (en) * 2024-01-02 2025-08-27 Gempharmatech Co., Ltd Animal model for producing humanized antibody, and construction method therefor
WO2026006724A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prame off-target peptides and uses thereof
WO2026006734A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Off-target peptide-mhc complex conformation modeling systems and methods for antigen-recognition molecule development
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100371784B1 (ko) * 1992-12-01 2003-07-22 프로테인 디자인랩스, 인코포레이티드 L-셀렉틴과반응성인인체화된항체
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
CN1203922A (zh) * 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
RU10506U1 (ru) 1999-04-08 1999-08-16 Кривулин Виталий Николаевич Ручной культиватор
CA2373638A1 (en) * 1999-05-27 2000-12-07 Human Genome Sciences, Inc. Adam polynucleotides and polypeptides
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
CN1789416B (zh) * 2001-05-11 2011-11-16 协和发酵麒麟株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
US7473557B2 (en) 2001-06-06 2009-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
JP4099646B2 (ja) 2002-06-04 2008-06-11 株式会社安川電機 ボイスコイルモータ
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
ATE416465T1 (de) 2005-06-30 2008-12-15 Borealis Tech Oy Überzug-schicht für energie- oder kommunikationskabel
AU2007235496B2 (en) * 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
RS52176B (sr) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Antitela visokog afiniteta prema humanom il-6 receptoru
JP5588866B2 (ja) 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
US7659842B2 (en) 2007-10-24 2010-02-09 Infineon Technologies Ag Quantization error reduction in PWM full-MASH converters
KR101987351B1 (ko) 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
RU2011129459A (ru) * 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
JP5399140B2 (ja) * 2009-06-18 2014-01-29 株式会社タイトー モールス信号通信システム
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
WO2011072204A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
AU2011266843C9 (en) 2010-06-17 2018-03-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ME03732B (me) 2011-02-25 2021-01-20 Regeneron Pharma Miševi s ADAM6
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
HRP20220253T1 (hr) 2011-10-17 2022-04-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miševi s ograničenim teškim lancem imunoglobulina
GB201118579D0 (en) 2011-10-27 2011-12-07 Micromass Ltd Control of ion populations
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ME03477B (me) 2011-12-20 2020-01-20 Regeneron Pharma Miševi sa humanizovanim lakim lancem
KR102484480B1 (ko) 2012-06-12 2023-01-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물

Also Published As

Publication number Publication date
LT2578688T (lt) 2019-11-11
PL2738258T3 (pl) 2020-08-24
JP2022071051A (ja) 2022-05-13
HRP20191895T1 (hr) 2020-01-10
JP2014507137A (ja) 2014-03-27
DE12716101T1 (de) 2013-05-08
MX343009B (es) 2016-10-21
ME03537B (sr) 2020-04-20
EP2813573B1 (en) 2020-04-22
HUE047687T2 (hu) 2020-05-28
HRP20230526T1 (hr) 2023-09-01
JP2015107131A (ja) 2015-06-11
JP2018143250A (ja) 2018-09-20
KR20130116375A (ko) 2013-10-23
FI2738258T4 (fi) 2023-05-05
US9944716B2 (en) 2018-04-17
CN105861548A (zh) 2016-08-17
PL2738258T5 (pl) 2023-05-15
SI2550363T1 (sl) 2015-04-30
HRP20192311T1 (hr) 2020-03-20
CN103429746A (zh) 2013-12-04
CY1122820T1 (el) 2021-05-05
AU2017251802A1 (en) 2017-11-16
PT2738258T (pt) 2019-12-10
EP2738259B1 (en) 2019-11-27
LT4067496T (lt) 2023-06-12
SMT202000112T1 (it) 2020-05-08
NZ797720A (en) 2024-09-27
PT2578688T (pt) 2019-10-24
US11950578B2 (en) 2024-04-09
EP2738258B2 (en) 2023-02-01
RS59661B1 (sr) 2020-01-31
ES2748832T5 (es) 2023-06-08
EP2738258A3 (en) 2014-09-24
US9932408B2 (en) 2018-04-03
IL261243A (en) 2018-10-31
EP2550363B1 (en) 2014-12-10
PT4067496T (pt) 2023-06-07
DE14154967T1 (de) 2014-08-28
EP2578688B1 (en) 2019-07-24
BR112013021771A2 (pt) 2017-07-04
FI4067496T3 (fi) 2023-05-24
DE14154918T1 (de) 2014-08-21
US20180346599A1 (en) 2018-12-06
ES2805364T3 (es) 2021-02-11
RS59413B2 (sr) 2023-06-30
CY1116301T1 (el) 2017-02-08
MX2020009714A (es) 2020-10-07
DK2578688T4 (da) 2023-05-08
CA2820824A1 (en) 2012-10-18
PT2550363E (pt) 2015-03-16
FI2578688T4 (fi) 2023-05-05
SG10201913160QA (en) 2020-03-30
EP2578688A1 (en) 2013-04-10
IL268671B (en) 2020-05-31
BR112013021771B1 (pt) 2022-11-16
LT2738259T (lt) 2020-03-10
PT2738259T (pt) 2020-02-18
US20120322108A1 (en) 2012-12-20
DK2578688T1 (da) 2014-11-24
US10072095B2 (en) 2018-09-11
PL2738259T3 (pl) 2020-08-24
DE12192727T1 (de) 2013-07-11
RU2722373C2 (ru) 2020-05-29
US20150201589A1 (en) 2015-07-23
RU2013125717A (ru) 2014-12-10
AU2012243291B2 (en) 2015-07-09
US20140213773A1 (en) 2014-07-31
DK4067496T3 (da) 2023-06-26
ES2770424T3 (es) 2020-07-01
MY172713A (en) 2019-12-11
SI2578688T1 (sl) 2019-11-29
DK4067496T5 (da) 2024-07-22
NZ703609A (en) 2016-04-29
RU2016109443A3 (sr) 2019-07-24
NZ776770A (en) 2023-03-31
JP5866127B2 (ja) 2016-02-17
US20150210776A1 (en) 2015-07-30
ZA201305998B (en) 2016-07-27
IL273986A (en) 2020-05-31
SI2738259T1 (sl) 2020-06-30
SG10201913155QA (en) 2020-02-27
IL261243B (en) 2019-08-29
SI2578688T2 (sl) 2023-05-31
EP2550363A1 (en) 2013-01-30
AU2022206806B2 (en) 2025-10-02
NZ612643A (en) 2015-06-26
NZ731926A (en) 2021-07-30
DK2738259T3 (da) 2020-02-17
US10577430B2 (en) 2020-03-03
NZ718688A (en) 2017-07-28
IN2013CN07629A (sr) 2015-08-07
US20240306617A1 (en) 2024-09-19
RU2016109443A (ru) 2018-11-26
US20210105984A1 (en) 2021-04-15
EP4067496A1 (en) 2022-10-05
PL4067496T3 (pl) 2023-07-31
DK2550363T3 (en) 2015-03-23
EP2578688B2 (en) 2023-02-08
AU2025283466A1 (en) 2026-01-22
CY1126091T1 (el) 2023-11-15
US8697940B2 (en) 2014-04-15
IL226727A (en) 2016-08-31
DK2738259T1 (da) 2014-11-24
HRP20192311T4 (hr) 2023-05-12
US20180345760A1 (en) 2018-12-06
ES2946169T3 (es) 2023-07-13
IL268671A (en) 2019-10-31
DK2738258T1 (da) 2014-11-24
SI2738258T2 (sl) 2023-05-31
RS53880B1 (sr) 2015-08-31
US20130254911A1 (en) 2013-09-26
JP2019187446A (ja) 2019-10-31
EP2813573A1 (en) 2014-12-17
SMT201500061B (it) 2015-05-05
SG192933A1 (en) 2013-09-30
JP2025032218A (ja) 2025-03-11
EP4067496B1 (en) 2023-03-29
RU2582261C2 (ru) 2016-04-20
DK2813573T1 (da) 2015-01-12
HUE046746T2 (hu) 2020-03-30
HRP20150262T1 (hr) 2015-04-10
SG10201405135RA (en) 2014-10-30
CY1122205T1 (el) 2020-11-25
ES2758974T3 (es) 2020-05-07
HUE046081T2 (hu) 2020-01-28
HK1174490A1 (en) 2013-06-14
JP2016135143A (ja) 2016-07-28
IL273986B (en) 2021-04-29
ES2748832T3 (es) 2020-03-18
MX375115B (es) 2025-03-06
AU2015238806A1 (en) 2015-10-29
DK2738258T4 (da) 2023-05-08
US20210105985A1 (en) 2021-04-15
MX2013009649A (es) 2013-09-26
KR101387377B1 (ko) 2014-04-21
US20180346598A1 (en) 2018-12-06
PL2550363T3 (pl) 2015-05-29
HK1201292A1 (en) 2015-08-28
EP2738259A3 (en) 2014-07-30
EP2738258A2 (en) 2014-06-04
RS59929B1 (sr) 2020-03-31
HRP20200294T1 (hr) 2020-05-29
CY1122459T1 (el) 2021-01-27
PL2578688T3 (pl) 2020-05-18
ME03732B (me) 2021-01-20
US10905108B2 (en) 2021-02-02
SMT202300173T1 (it) 2023-07-20
US12207628B2 (en) 2025-01-28
SMT201900744T1 (it) 2020-01-14
US10694725B2 (en) 2020-06-30
HRP20191895T4 (hr) 2023-05-12
HUE024534T2 (hu) 2016-01-28
AU2022206806A1 (en) 2022-08-18
CN105861548B (zh) 2020-01-10
EP2738258B1 (en) 2019-09-25
RS59413B1 (sr) 2019-11-29
SI2738258T1 (sl) 2020-01-31
EP3744850A1 (en) 2020-12-02
ES2532487T3 (es) 2015-03-27
CN103429746B (zh) 2016-05-11
ME02106B (me) 2015-10-20
WO2012141798A1 (en) 2012-10-18
DK2578688T3 (da) 2019-10-28
SI4067496T1 (sl) 2023-07-31
DK2738258T3 (da) 2019-12-16
AU2020201279A1 (en) 2020-03-12
JP2014110814A (ja) 2014-06-19
DE14176593T1 (de) 2015-03-05
EP2738259A2 (en) 2014-06-04
HUE062552T2 (hu) 2023-11-28
RS59661B2 (sr) 2023-06-30
ES2758974T5 (es) 2023-06-08
US10905109B2 (en) 2021-02-02
US8642835B2 (en) 2014-02-04
PL2578688T5 (pl) 2023-05-29
LT2738258T (lt) 2020-01-10
SMT201900581T1 (it) 2019-11-13
AU2012243291A1 (en) 2013-05-09
US20180362663A1 (en) 2018-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012243291B2 (en) ADAM6 mice
RS58761B1 (sr) Miševi sa humanizovanim lakim lancem
HK40073129B (en) Adam6 mice
HK40073129A (en) Adam6 mice
HK40041879A (en) Adam6 mice
NZ718688B2 (en) ADAM6 mice
HK1177226A (en) Adam6 mice
HK1193631A (en) Adam6 mice
HK1174490B (en) Adam6 mice
HK1193631B (en) ADAM6 Mice
HK1193632A (en) Adam6 mice
HK1177226B (en) Adam6 mice
HK1201292B (en) Adam6 mice