PT2421357E

PT2421357E - Modelos animais e moléculas terapêuticas

Info

Publication number: PT2421357E
Application number: PT107345464T
Authority: PT
Inventors: Allan Bradley; E-Chiang Lee; Qi Liang; Wei Wang
Original assignee: Kymab Ltd
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2013-04-18
Also published as: US20230263143A1; EP3622815B1; CN105340834A; EP3028564B1; EP2517556B2; EP2517557B2; LT3241435T; HUE061788T2; US20230225302A1; EP2792236A3; AU2016244326B2; EP3622815A1; JP5944312B2; AU2018206729B2; ES2537239T3; ES2884309T3; US20150334998A1; DK2517557T4; EP3888457A1; EP2421357A1

Description

ΡΕ2421357 1

DESCRIÇÃO "MODELOS ANIMAIS E MOLÉCULAS TERAPÊUTICAS"

Antecedentes 0 presente invento está relacionado, inter alia, com animais e células não humanos manipulados de forma a conterem DNA exógeno, como seja DNA do gene da imunoglobulina humana, com a sua utilização em medicina e no estudo de doenças, com métodos para a produção de animais e células não humanos e com anticorpos e cadeias de anticorpos produzidos por tais animais e derivados dos mesmos.

De forma a ultrapassar os problemas dos anticorpos humanizados, uma série de companhias decidiu gerar murganhos com sistemas imunitários humanos. A estratégia usada foi anular os loci da cadeia pesada e da cadeia leve em células ES e complementar estas lesões genéticas com transgenes destinados a expressar os genes da cadeia pesada e da cadeia leve humanas. Ainda que tenham gerado anticorpos totalmente humanos, estes modelos possuem várias limitações importantes: (i) 0 tamanho dos loci da cadeia pesada e da cadeia leve (cada com várias Mb) tornou impossível intro- 2 ΡΕ2421357 duzir a totalidade dos loci nestes modelos. Como resultado, as linhas transgénicas recuperadas possuem um reportório muito limitado de regiões V, a maioria das regiões constantes estão ausentes e regiões estimuladoras distantes importantes não foram incluídas nos transgenes. (ii) A eficiência muito baixa de geração das linhas transgénicas com grandes insertos e a complexidade e o tempo necessário para cruzar cada uma destas para dar origem a estirpes com anulação da cadeia pesada e da cadeia leve e torná-las homozigóticas novamente, restringiu o número de linhas transgénicas que poderiam ser analisadas relativamente a expressão óptima. (iii) As afinidades dos anticorpos individuais raramente atingiram as que poderiam ser obtidas a partir de animais intactos (não transgénicos). W02007117410 descreve construções quiméricas para expressão de anticorpos quiméricos. W02010039900 descreve a anulação de genes em células e mamíferos tendo um genoma codificador de anticorpos quiméricos. 0 presente invento proporciona, inter alia, um processo para a geração, em mamíferos não humanos, de anticorpos que compreendem uma região variável de Ig humana e ainda proporciona modelos animais não humanos para a geração de tais anticorpos. 3 ΡΕ2421357

Sumário do invento

Num aspecto, o invento está relacionado com um mamifero ou célula não humano ou método como reivindicado nas reivindicações 1 a 15. São igualmente aqui descritos:

Um método para a produção de uma célula ou mamifero não humano compreendendo a inserção num genoma de célula de mamifero não humano, como seja um genoma de célula ES, de; (a) uma pluralidade de regiões V de IgH humana,

uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas a montante da região constante do mamifero hospedeiro não humano; e (b) facultativamente, uma ou mais regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamifero não humano e/ou uma ou mais regiões V da cadeia leve lambda de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamifero não humano; respectivamente, a inserção sendo tal que a célula ou mamifero não 4 ΡΕ2421357 humano é capaz de produzir um reportório de anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, em que os passos (a) e (b) podem ser realizados em qualquer uma das ordens e cada um dos passos (a) e (b) pode ser realizado numa forma gradual ou como passo único. A inserção pode ser por recombinação homóloga.

Um método para a produção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo específico para um antigénio de interesse, o método compreendendo a imunização de um mamífero não humano transgénico como aqui descrito com o antigénio pretendido e recuperação do anticorpo ou cadeia de anticorpo.

Um método para a produção de um anticorpo totalmente humanizado compreendendo a imunização de um mamífero não humano transgénico como aqui descrito com o antigénio pretendido, recuperação do anticorpo ou células produtoras de anticorpo e depois a substituição da região constante de mamífero não humano com uma região constante humana, por exemplo por manipulação de proteínas ou de DNA.

Os anticorpos humanizados e cadeias de anticorpos produzidas de acordo com o presente invento, ambos na forma quimérica (por exemplo murganho-humana) e na forma totalmente humanizada, assim como fragmentos e derivados dos referidos anticorpos e cadeias e utilização em medi- 5 ΡΕ2421357 cina, incluindo diagnóstico, dos referidos anticorpos cadeias e fragmentos,.

Uso de um mamifero não humano como aqui descrito como modelo para testar fármacos e vacinas.

Figuras

Figuras 1-8 mostram um processo iterativo para a inserção de uma série de BACs humanos num locus de Ig de murganho.

Figuras 9-18 mostram com mais detalhe os processos das figuras 1-8 para a IgH e o locus kappa.

Figuras 19 e 20 mostram os princípios subjacentes à geração de anticorpos em murganhos quiméricos.

Figura 21 mostra um local de inserção possível para o DNA humano num cromossoma de murganho.

Figuras 22-26 descrevem um processo iterativo alternativo para a inserção de uma série de BACs humanos num locus de Ig de murganho.

Figura 27-29 ilustra um mecanismo para a inversão da região VDJ do hospedeiro.

Figura 30 ilustra a prova de princípio para a inserção de um plasmídeo usando a abordagem RMCE. 6 ΡΕ2421357

Figura 31 ilustra integração sequencial por RMCE na plataforma de aterragem.

Figura 33 ilustra a confirmação por PCR da cura do extremo 3'.

Figura 34 ilustra a inserção de BAC#1 e Diagnóstico por PCR.

Descrição geral

Todas as coordenadas de nucleótidos para o murganho são do NCBI m37, April 2007 ENSEMBL release 55.37h para a estirpe de murganho C57BL/6J. Os nucleótidos humanos são do GRCh37, Feb 2009 ENSEMBL release 55, 37 e para rato do RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w.

Descrevemos aqui métodos para a construção de loci quiméricos para as cadeia pesada e leve humanas num mamífero não humano, por exemplo um murganho. É aqui feita referência a trabalho em murganhos apenas como exemplo e a referência a murganhos pretende incluir referência a todos os mamíferos não humanos, a menos que de outra forma seja aparente a partir desta descrição, com os murganhos a serem preferidos como mamífero não humano.

Num aspecto, o invento está relacionado cm um mamífero não humano de acordo com a reivindicação 1. 7 ΡΕ2421357

Facultativamente, o genoma de mamífero não humano é modificado para evitar a expressão de anticorpos totalmente específicos da espécie hospedeira.

Num aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo menos 50% dos genes variáveis (V) da cadeia pesada humana, como seja pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e num aspecto a totalidade de genes V humanos.

Num aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo menos 50% dos genes de diversidade (D) da cadeia pesada humana, como seja pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e num aspecto todos os genes D humanos.

Num aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo menos 50% dos genes de ligação (J) da cadeia pesada humana, como seja pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e num aspecto a totalidade dos genes J humanos.

Num aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo menos 50% dos genes variáveis (V) da cadeia leve humana, como seja pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e num aspecto a totalidade dos genes V da cadeia leve humana. ΡΕ2421357

Num aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo menos 50% dos genes de ligação (J) da cadeia leve humana, como seja pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e num aspecto a totalidade dos genes J da cadeia leve humana.

Os genes humanos inseridos podem derivar do mesmo indivíduo ou de indivíduos diferentes, ou podem ser sintéticos ou representar sequências de consenso humanas.

Ainda que o número de regiões V, D e J seja variável entre indivíduos humanos, num aspecto são considerados como seno 51 os genes V humanos, 27 os genes D e 6 os genes J na cadeia pesada, 40 os genes V humanos e 5 os genes J na cadeia leve kappa e 29 os genes V humanos e 4 os genes J na cadeia leve lambda (Janeway and Travers, Immunobiology, Third Edition).

Num aspecto, o locus da cadeia pesada humana inserido num mamífero não humano possui a totalidade do reportório das regiões V, D e J humanas, o qual no genoma está num arranjo funcional com as regiões constantes de mamífero não humano, de forma que possam ser produzidos anticorpos quiméricos funcionais entre as regiões variáveis humanas e as regiões constantes de mamífero não humano. Este material genético da totalidade da cadeia pesada humana inserido é referido aqui como a região VDJ de IgH humana e compreende DNA de um genoma humano que codifica todos os exões codificadores das porções V, D e J humanas 9 ΡΕ2421357 e, adequadamente, também os intrões associados. De forma semelhante, aqui a referência às regiões V e J da cadeia leve kappa de Ig humana é relativa a DNA humano compreendendo todos os exões codificadores das regiões V e J e, adequadamente, também todos os intrões associados do genoma humano. A referência às regiões V e J da cadeia leve lambda de Ig humana refere-se a DNA humano compreendendo todos os exões codificadores das regiões V e J e adequadamente também todos os intrões associados do genoma humano.

As regiões variáveis humanas são inseridas a montante da região constante de mamifero não humano, esta última compreendendo a totalidade do DNA necessário para codificar toda a região constante ou uma porção suficiente da região constante para permitir a formação de um anticorpo quimérico eficaz capaz de especificamente reconhecer um antigénio.

Num aspecto, os anticorpos ou cadeias de anticorpos quiméricos possuem uma parte de uma região constante do hospedeiro suficiente para proporcionar uma ou mais funções efectoras observadas em anticorpos naturais num hospedeiro mamífero, por exemplo a de serem capazes de interagir com receptores Fc e/ou se ligarem ao complemento. A referência a um anticorpo ou cadeia de anticorpo quimérico tendo uma região constante do hospedeiro não mamífero não está pois limitada à região 10 ΡΕ2421357 constante completa mas inclui também anticorpos ou cadeias quiméricas possuidoras de toda a região constante do hospedeiro ou uma parte da mesma suficiente para proporcionar uma ou mais funções efectoras. Isto aplica-se igualmente a mamiferos e células não humanas e métodos aqui descritos em que o DNA da região variável humana pode ser inserido no genoma do hospedeiro, de forma a formar uma cadeia de anticorpo quimérica com a totalidade ou parte de uma região constante do hospedeiro. Num aspecto, a totalidade de uma região constante do hospedeiro é operacionalmente ligada a DNA da região variável humana. A região constante do hospedeiro mamifero não humano é, de preferência, a região constante selvagem endógena do hospedeiro localizada no locus selvagem, conforme apropriado para a cadeia pesada ou leve. Por exemplo, o DNA da cadeia pesada humana é adequadamente inserido no cromossoma 12 de murganho, adequadamente adjacente à região constante da cadeia pesada de murganho.

Num aspecto, a inserção do DNA humano, como seja a região VDJ humana é direccionada para a região entre o exão J4 e o locus Cy no locus IgH do genoma de murganho e num aspecto, é inserido entre as coordenadas 114667090 e 114665190, adequadamente na coordenada 114667091. Num aspecto, a inserção do DNA humano, como seja VJ da cadeia leve kappa humana, é direccionada para o cromossoma 6 de murganho entre as coordenadas 70673899 e 70675515, adequadamente na posição 70674734 ou uma posição equivalente no locus lambda de murganho no cromossoma 16. 11 ΡΕ2421357

Num aspecto, a região constante do hospedeiro mamífero não humano para formar o anticorpo quimérico pode estar num locus cromossómico diferente (não endógeno). Neste caso, o DNA humano inserido, como sejam as regiões variáveis humanas VDJ ou VJ, pode ser então inserido no genoma não humano num local que é distinto daquele em que naturalmente ocorre a região constante pesada ou leve. A região constante nativa pode ser inserida no genoma ou duplicada dentro do genoma, num locus cromossómico diferente relativamente à posição nativa, de forma que esteja num arranjo funcional com a região variável humana para que os anticorpos quiméricos do invento possam ainda ser produzidos.

Num aspecto, o DNA humano é inserido na região constante selvagem endógena do hospedeiro no locus selvagem entre a região constante do hospedeiro e a região VDJ do hospedeiro. A referência à localização da região variável a montante da região constante do mamífero não humano significa que existe uma localização relativa adequada das duas porções de anticorpo, variável e constante, para permitir que as regiões variável e constante formem um anticorpo ou cadeia de anticorpo quimérico In vivo no mamífero. Assim, o DNA humano inserido e a região constante do hospedeiro estão em arranjo funcional um relativamente ao outro para a produção de anticorpos ou de cadeias de anticorpo. 12 ΡΕ2421357

Num aspecto, o DNA humano inserido é capaz de ser expresso com diferentes regiões constantes do hospedeiro através da mudança de isotipo. Num aspecto, a mudança de isotipo não requer ou envolve a mudança em trans. A inserção do DNA da região variável humana no mesmo cromossoma que a região constante relevante do hospedeiro significa que não existe a necessidade de mudança em trans para produzir a mudança de isotipo.

Como explicado atrás, os loci transgénicos usados para os modelos de trabalhos anteriores foram de origem humana, assim mesmo naqueles casos em que os transgenes eram capazes de complementar o locus de murganho de forma que os murganhos produziam células B produtoras de anticorpos totalmente humanos, as afinidades dos anticorpos individuais raramente atingiram as que podiam ser obtidas a partir de animais intactos (não transgénicos). 0 principal motivo para isto (para além do reportório e niveis de expressão descritos atrás) é o facto de os elementos de controlo do locus serem humanos. Assim, os componentes de sinalização, por exemplo para activarem a hipermutação e selecção de anticorpos de elevada afinidade, estão comprometidos.

Pelo contrário, no presente invento as regiões constantes do hospedeiro mamífero não humano são mantidas e prefere-se que pelo menos um estimulador de mamífero não humano ou outra sequência de controlo, como seja uma região 13 ΡΕ2421357 de mudança, seja mantido em arranjo funcional com a região constante de mamífero não humano, de forma que o efeito do estimulador ou de outra sequência de controlo, como observado no mamífero hospedeiro, seja exercido na totalidade ou em parte no animal transgénico.

Esta abordagem atrás é desenhada para permitir uma amostragem da diversidade total, para permitir os mesmos níveis elevados de expressão que seriam conseguidos por sequências de controlo de mamífero não humano tais como estimuladores e é tal que a sinalização nas células B, por exemplo a mudança de isotipo usando locais de recombinação da mudança, ainda usaria sequências de mamífero não humano.

Um mamífero tendo tal genoma produziria anticorpos quiméricos com regiões constantes de mamífero não humano e variáveis humanas, mas estas poderiam ser facilmente humanizadas, por exemplo num passo de clonagem. Ainda, a eficácia in vivo destes anticorpos quiméricos pode ser avaliada nestes mesmos animais.

Num aspecto, a região VDJ humana inserida compreende, na configuração germinal, a totalidade das regiões V, D e J e sequências intervenientes de um ser humano.

Num aspecto, 800-1000 kb da região VDJ de IgH humana foram inseridos no locus de IgH de mamífero não humano e, num aspecto, foi inserido um fragmento de 940, 950 ou 960 kb. Adequadamente isto inclui as bases 105400051 14 ΡΕ2421357 a 106368585 do cromossoma 14 humano (todas as coordenadas referem-se a NCBI36 para o genoma humano, ENSEMBL Release 54 e NCBIM37 para o genoma de murganho, relativamente à estirpe de murganho C57BL/6J).

Num aspecto, o fragmento humano IgH inserido consiste nas bases 105400051 a 106368585 do cromossoma 14. Num aspecto o DNA da cadeia pesada humana inserido, como seja o DNA consistindo nas bases 105400051 a 106368585 do cromossoma 14 é inserido no cromossomas 12 de murganho entre o extremo da região J4 de murganho e a região Εμ, adequadamente entre as coordenadas 114667091 e 114665190, adequadamente na coordenada 114667091.

Num aspecto, a região VJ kappa humana inserida compreende, na configuração germinal, a totalidade das regiões V e J e sequências intervenientes de um ser humano.

Adequadamente, isto inclui as bases 88940356 a 89857000 do cromossoma 2 humano, adequadamente aproxima-damente 917 kb. Num outro aspecto, o inserto VJ da cadeia leve pode compreender apenas os conjuntos proximais de segmentos V e de segmentos J. Tal inserto seria de aproximadamente 473 kb.

Num aspecto o DNA da cadeia leve kappa humana, como seja o fragmento Igk humano das bases 88940356 a 89857000 do cromossoma 2 humano, é adequadamente inserido no cromossoma 6 de murganho entre as coordenadas 70673899 e 7067,515, adequadamente na posição 70674734. 15 ΡΕ2421357

Num aspecto, a região VJ lambda humana compreende, na configuração germinal, a totalidade das regiões V e J e sequências intervenientes de um ser humano.

Adequadamente isto inclui bases análogas às se-leccionadas para o fragmento kappa, do cromossoma 2 humano.

Todos os fragmentos humanos específicos atrás descritos podem variar em comprimento e podem, por exemplo, ser mais longos ou mais curtos do que o definido atrás, como sejam 500 bases, 1 kb, 2k, 3k, 4k, 5kb, lOkb, 20kb, 30 kb, 4 0 kb ou 50 kb ou mais, o que adequadamente compreende a totalidade ou parte da região V(D)J humana, ao mesmo tempo, de preferência, mantendo o requisito para o inserto final compreender material genético humano codificador da região da cadeia pesada e da região da cadeia leve completas, conforme adequado, como descrito atrás.

Num aspecto, o extremo 5' do inserto humano atrás descrito é aumentado em comprimento. Quando o inserto é gerado de forma gradual então o aumento de comprimento é, de um modo geral, relativamente ao clone a montante (5').

Num aspecto, o extremo 3' do último gene humano inserido, de um modo geral o último gene J humano a ser inserido, é inferior a 2 kb, de preferência inferior a 1 kb, da região de união humano-murganho. 16 ΡΕ2421357

Num aspecto, o mamífero não humano compreende parte ou a totalidade da região VJ da cadeia leve kappa humana como aqui descrito mas não a região VJ da cadeia leve lambda humana.

Num outro aspecto, o genoma compreende uma inserção de genes V, D (apenas a cadeia pesada) e J como aqui descrito no locus da cadeia pesada e um locus da cadeia leve, ou no locus da cadeia pesada e ambos os loci da cadeia leve. De preferência, o genoma é homozigótico em um, em dois ou em três loci.

Num outro aspecto, o genoma pode ser hetero-zigótico num ou mais loci, como seja heterozigótico para DNA codificador de uma cadeia de anticorpo quimérica e cadeia de anticorpo nativa (célula hospedeira). Num aspecto, o genoma pode ser heterozigótico para DNA capaz de codificar 2 cadeias de anticorpo diferentes do invento, por exemplo, compreendendo 2 cadeias pesadas quiméricas diferentes ou 2 cadeias leves quiméricas diferentes.

Num aspecto, o invento está relacionado com um mamífero ou célula não humana e métodos para a produção do referido mamífero ou célula, como aqui descrito, em que o DNA humano inserido, como seja a região VDJ e/ou as regiões V, J da cadeia leve de IgH humana é encontrado apenas num alelo e não em ambos os alelos no mamífero ou célula. Neste aspecto, um mamífero ou célula tem o potencial para expressar uma cadeia pesada ou leve do anticorpo endógeno do hospedeiro e uma cadeia pesada ou leve quimérica. 17 ΡΕ2421357

Num outro aspecto do invento, a região VDJ humana ou a região VJ da cadeia leve, não é usada na sua totalidade, mas podem ser usadas partes da região VDJ ou VJ equivalente humana, tais como os exões, de outras espécies ou sequências reguladoras de outras espécies. Num aspecto, as sequências usadas no lugar das sequências humanas não são humanas ou de murganho. Num aspecto, as sequências usadas podem ser de roedor ou de primata, como seja chimpanzé. Por exemplo 1, 2, 3, 4 ou mais, ou todas as regiões J de um primata que não seja humano podem ser usadas para substituir um, 2, 3, 4 ou mais ou a totalidade dos exões J humanos na região VDJ/VJ das células e animais do invento.

Num outro aspecto, o DNA humano inserido, como seja a região VDJ de IgH humana e/ou regiões VJ da cadeia leve, pode ser inserido de forma a ficar operacionalmente ligado no genoma com uma região constante mu de uma espécie não humana, não murganho, como seja uma sequência de roedor ou de primata, como seja uma sequência de rato.

Outras espécies não humanas, não de murganho das quais os elementos de DNA podem ser usados no presente invento incluem coelhos, lamas, dromedários, alpacas, camelos e tubarões.

Num aspecto, o DNA humano inserido, como seja a região VDJ ou VJ humana, não está operacionalmente ligado à 18 ΡΕ2421357 sequência mu endógena do hospedeiro mas antes a uma sequência mu que não seja do hospedeiro. A ligação operacional adequadamente permite a produção de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo compreendendo a região variável humana.

Num aspecto, o DNA humano inserido, como seja a região VDJ de IgH humana (e/ou regiões VJ da cadeia leve) pode ser inserido no cromossoma do hospedeiro juntamente com o ácido nucleico da região constante mu e, de preferência, é uma região constante mu de uma espécie não murganho não humana. Adequadamente, o DNA humano inserido, como seja a região VDJ humana (e/ou regiões VJ da cadeia leve) é operacionalmente inserido em mu não humano não murganho e é capaz de formar uma cadeia pesada ou leve de anticorpo quimérico. Num outro aspecto, mu não murganho não humano pode ser inserido no cromossoma do hospedeiro num elemento genético separado do da região variável humana ou numa localização diferente no genoma, adequadamente ligado operacionalmente à região variável de forma a poder ser formada uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de anticorpo quimérico.

Num aspecto, o invento está relacionado com uma célula, ou mamífero não humano, o genoma da qual compreende: uma ou mais regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da totalidade ou de parte da região constante kappa humana. 19 ΡΕ2421357

Num outro aspecto, o invento está relacionado com uma célula, ou mamífero não humano, o genoma da qual compreende: uma ou mais regiões V da cadeia leve lambda de

Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de

Ig humana a montante da totalidade ou de parte da região constante lambda humana.

Adequadamente, as regiões VJ e C da cadeia leve são capazes de formar cadeias de anticorpo in vivo capazes de especificamente reagirem com um antigénio.

Num aspecto do invento não existe sequência codificadora não humana na região da cadeia leve inserida.

Em tais aspectos uma região kappa e/ou lambda humana é inserida no genoma, em combinação com a inserção da região VDJ da cadeia pesada ou parte da mesma, a montante da região constante da cadeia pesada do hospedeiro como aqui descrito.

Assim a célula ou mamífero não humano do invento compreende: (a) uma pluralidade das regiões V de IgH humana, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas a montante da região constante do hospedeiro mamífero não humano; e 20 ΡΕ2421357 (b) uma ou mais regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da totalidade ou de parte da região constante kappa não humana, em que o mamífero não humano é capaz de produzir um reportório de anticorpos tendo uma cadeia de anticorpo compreendendo a região constante de mamífero não humano e a região variável humana. A célula ou mamífero não humano do invento pode compreender (a) uma pluralidade de regiões V de IgH humana, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas da região constante do hospedeiro mamífero não humano; e uma ou mais regiões V da cadeia leve lambda humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano; em que o mamífero não humano é capaz de produzir um reportório de anticorpos tendo uma cadeia de anticorpo compreendendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana.

Adequadamente, a inserção do DNA de VJC da cadeia leve humana ou parte do mesmo como atrás descrito, é feita no locus equivalente de murganho. Num aspecto, o DNA de VJC da cadeia leve kappa humana ou parte da mesma, é inserido imediatamente a montante ou a jusante da região VJC kappa de murganho. Num aspecto, a região VJC da cadeia leve lambda humana ou parte da mesma é inserida imediatamente a 21 ΡΕ2421357 montante ou a jusante da região VJC lambda de murganho. Num aspecto, é inserido apenas o locus VJC kappa humano. Podem ser feitas inserções usando as técnicas aqui descritas e, adequadamente, não se remove do genoma as sequências do hospedeiro. Num aspecto, as sequências VJC do hospedeiro mamífero não humano podem ser inactivadas de alguma forma, através de mutação ou inversão ou através de inserção do DNA da região variável humana, ou através de outros meios. Num aspecto, a célula ou mamifero não humano do invento pode compreender uma inserção da região VJC humana completa . 0 DNA da região variável kappa humana deve ser inserido no genoma em arranjo funcional com uma região constante lambda, por exemplo a inserida a montante da região constante lambda. Como alternativa, o DNA variável da região lambda humana deve ser inserida em arranjo funcional com uma região constante kappa, por exemplo inserido a montante de uma região constante kappa.

Num aspecto, uma ou mais sequências de controlo de mamifero não humano, como sejam as sequências estimuladoras, são mantidas a montante da região constante Mu de mamífero não humano, adequadamente na sua posição nativa relativamente à distância à região constante.

Num aspecto, uma ou mais sequências de controlo de mamifero não humano, como seja uma ou mais sequências estimuladoras, são mantidas a jusante da região constante 22 ΡΕ2421357

Mu de mamífero não humano, adequadamente na sua posição nativa relativamente à distância à região constante.

Num aspecto, uma sequência de mudança de mamífero não humano, adequadamente a sequência de mudança endógena, foi mantida a montante da região constante Mu de mamífero não humano, adequadamente na sua posição nativa relativamente à distância da região constante.

Nessa localização, as sequências estimuladoras ou de mudança do hospedeiro são operacionalmente ligadas in vivo às sequências da região constante do hospedeiro.

Num aspecto, uma sequência de mudança não é humana nem nativa no mamífero não humano, por exemplo num aspecto uma sequência de mudança de mamífero não humano não é uma sequência de mudança de murganho ou humana. A sequência de mudança pode ser, por exemplo, uma sequência de roedor ou de primata, ou uma sequência sintética. Em particular, a sequência de mudança pode ser uma sequência de rato em que o mamífero não humano é um murganho. Como exemplo, uma sequência constante Mu de murganho ou humana pode ser colocada sob o controlo de uma sequência de mudança de rato ou chimpanzé ou outra sequência de mudança adequadamente capaz de permitir que a mudança de isotipo ocorra in vivo. A célula ou mamífero do invento pode assim compreender uma sequência de mudança de mamífero humano ou 23 ΡΕ2421357 não humano e uma região ou regiões estimuladoras de mamifero não humano. Estas podem estar a montante de uma região constante de mamifero humano ou não humano. De preferência, as sequências de controlo são capazes de dirigir a expressão ou de outra forma controlar a produção de anticorpos compreendendo uma região constante com a qual estão associadas. Uma combinação perspectivada é uma região de mudança de rato com sequências estimuladoras de murganho e regiões constantes de murganho numa célula de murganho.

Num aspecto o invento está relacionado com um roedor ou célula de roedor, compreendendo um locus da cadeia pesada ou da cadeia leve de imunoglobulina tendo DNA de 3 ou mais espécies. Por exemplo, a célula ou animal pode compreender DNA da região constante da célula hospedeira, uma ou mais sequências humanas codificadoras de V, D ou J e uma ou mais regiões de DNA não humano não hospedeiro que sejam capazes de controlar uma região do locus da imunoglobulina, como seja uma sequência de mudança, promotor ou estimulador que sejam capazes de controlar a expressão ou de mudar o isotipo in vivo do DNA de Ig. Num aspecto, a célula ou animal é um murganho e compreende ainda DNA humano do locus de Ig humano e ainda uma sequência de DNA de murganho, como seja uma sequência de DNA de rato, capaz de regular o DNA de murganho ou humano.

Num outro aspecto, o invento está relacionado com um roedor ou célula de roedor, compreendendo um locus de cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobulina tendo DNA ΡΕ2421357 - 24 - de 2 ou mais genomas humanos diferentes. Por exemplo, poderá compreender sequências V(D)J da cadeia pesada de mais de um genoma humano dentro de uma cadeia pesada ou leve, ou DNA VDJ da cadeia pesada de um genoma e sequências VJ da cadeia leve de um genoma diferente.

Descreve-se um fragmento de DNA ou célula ou mamífero não humano compreendendo um locus de cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobulina, ou parte do mesmo, tendo DNA de 2 ou mais espécies, em que uma espécie contribui com uma região não codificadora como seja uma região reguladora e a outra espécie com as regiões codificadoras tais como regiões V, D, J ou constantes,

Num aspecto o promotor humano e/ou outros elementos de controlo que estejam associados a diferentes regiões V, D ou J humanas são mantidos no genoma de murganho.

Num outro aspecto, um ou mais elementos do promotor ou outros elementos de controlo, das regiões humanas, como sejam regiões V humanas, são optimizados para interagir com a maquinaria de transcrição de um mamífero não humano.

Adequadamente, uma sequência codificadora humana pode ser colocada sob o controlo de um promotor adequado de mamífero não humano, o qual permite ao DNA humano ser transcrito eficientemente na célula animal não humana 25 ΡΕ2421357 adequada. Num aspecto a região humana é uma sequência codificadora da região V humana e uma região V humana é colocada sob o controlo de um promotor de mamifero não humano. A substituição funcional do promotor humano ou de outras regiões de controlo pelo promotor ou regiões de controlo de mamifero não humano pode ser realizada usando engenharia recombinogénica ou outras tecnologias de DNA recombinante, para inserir uma parte da região de Ig humana (como seja uma região V humana) num vector (como seja BAC) contendo uma região Ig não humana. A técnica de engenharia recombinogénica/recombinante adequadamente substitui uma porção de DNA não humano (e.g. murganho) com a região de Ig humana e assim coloca a região de Ig humana sob o controlo do promotor ou de outras regiões de controlo de mamifero não humano. Adequadamente, a região codificadora humana de uma região V humana substitui uma sequência codificadora da região V de murganho. Adequadamente, a região codificadora humana de uma região D humana substitui uma sequência codificadora da região D de murganho. Adequadamente, a região codificadora humana de uma região J humana substitui uma sequência codificadora da região J de murganho. Desta forma, regiões V, D ou J humanas podem ser colocadas sob o controlo de um promotor de mamifero não humano, como seja um promotor de murganho.

Num aspecto, o único DNA humano inserido na célula de mamifero não humana ou animal são as regiões 26 ΡΕ2421357 codificadoras V, D ou J, e estas são colocadas sob o controlo das sequências reguladoras do hospedeiro ou de outras sequências (não humanas, não hospedeiro). Num aspecto, referência a regiões codificadoras humanas inclui intrões e exões humanos ou num outro aspecto simplesmente exões sem intrões, que pode ser na forma de cDNA.

Como alternativa, é possível usar engenharia recombinogénica ou outras tecnologias de DNA recombinante, para inserir um promotor ou outra região de controlo de mamífero não humano (e.g. murganho), como seja um promotor para uma região V, num BAC contendo uma região de Ig humana. 0 passo de engenharia recombinogénica coloca então uma porção de DNA humano sob o controlo do promotor de murganho ou de outra região de controlo.

As abordagens aqui descritas podem ser igualmente usadas para inserir algumas ou todas as regiões V, D e J da cadeia pesada humana a montante de uma região constante da cadeia leve, em vez de ser a montante da região constante da cadeia pesada. Igualmente alguma ou a totalidade das regiões V e J da cadeia leve humana podem ser inseridas a montante da região constante da cadeia pesada. A inserção pode ser no locus da região constante endógena, por exemplo entre a região constante endógena e a região J e pode ser um ou a totalidade dos genes V, D ou J, excluindo as sequências do promotor ou do estimulador, ou pode ser um ou a totalidade dos genes V, D ou J com uma ou mais das respectivas sequências de promotor ou de estimulador. Num 27 ΡΕ2421357 aspecto a totalidade do reportório de fragmentos V, D ou J na orientação germinal pode ser inserido a montante e em arranjo funcional com uma região constante do hospedeiro.

Assim, o presente invento permite que as regiões V e/ou D e/ou J de um ser humano ou de qualquer outra espécie, sejam inseridas num cromossoma de uma célula de uma espécie diferente que compreende uma região constante, permitindo que seja expressa uma cadeia de anticorpo quimérico.

Num aspecto, o invento requer apenas que algum DNA da região variável humana seja inserido no genoma de um mamifero não humano num arranjo operacional com uma ou com a totalidade da região constante da cadeia pesada humana na região do locus endógeno da região constante da cadeia pesada, de forma que possa ser produzida uma cadeia de anticorpo. Neste aspecto do invento e quando o DNA da cadeia leve humana é adicionalmente inserido, a inserção do DNA da cadeia leve pode ser na forma de uma construção completamente humana, tendo DNA da região variável humana e DNA da região constante humana ou tendo DNA da região variável humana e DNA da região constante de uma espécie não humana não hospedeira. Outras variações são igualmente possíveis, como seja a inserção da região variável da cadeia leve humana e a região constante do genoma hospedeiro. Ainda, a inserção dos referidos transgenes da cadeia leve não necessita de ser no locus endógeno equivalente, mas pode ser em qualquer outro lugar do genoma. Nesse cenário a célula ou mamífero pode produzir 28 ΡΕ2421357 cadeias pesadas quiméricas (compreendendo DNA da região variável humana e DNA da região constante de murganho) e as cadeias leves compreendendo DNA da região variável humana e da região constante humana. Assim, num aspecto do invento, DNA da região variável humana lambda ou kappa pode ser inserido a montante do locus endógeno, ou a jusante, ou mesmo num cromossoma diferente relativamente ao locus endógeno e inserido com ou sem DNA da região constante.

Para além da inserção de DNA da cadeia leve humana a montante da região constante do hospedeiro mamifero não humano, um outro aspecto do invento está relacionado com a inserção de uma ou de ambas as regiões variáveis da cadeia leve a jusante da região constante do locus endógeno, ou algures no genoma.

De um modo geral, é preferida a inserção de DNA da região variável humana no locus endógeno ou perto dele no genoma do recipiente, por exemplo a 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 kb do limite (a montante ou a jusante) de um locus de imunoglobulina do hospedeiro.

Assim, num aspecto, o genoma da célula ou de mamifero não humano do invento compreende: (a) uma pluralidade de regiões V de IgH humana, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas a montante da região constante do hospedeiro mamifero não humano; e 29 ΡΕ2421357 (b) uma ou mais regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana; e/ou uma ou mais regiões V lambda da cadeia leve de Ig humana e uma ou mais regiões J lambda da cadeia leve de Ig humana; em que o mamifero não humano é capaz de produzir um reportório de anticorpos quiméricos ou cadeias leves ou pesadas quiméricas, tendo uma região constante e uma região variável de mamifero não humano.

Num aspecto particular, o genoma da célula ou mamifero não humano compreende: uma pluralidade de regiões V de IgH humana, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas da região constante do hospedeiro mamifero não humano; uma ou mais regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamifero não humano e uma ou mais regiões V da cadeia leve lambda de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a jusante da região constante lambda do hospedeiro mamifero não humano, facultativamente, na qual a região variável lam- 30 ΡΕ2421357 bda humana pode ser inserida a jusante do locus endógeno lambda do hospedeiro em ligação operacional com uma região constante lambda humana, de forma que o mamifero não humano ou célula podem produzir cadeias leves de anticorpo totalmente humanas e cadeias pesadas quiméricas.

Num outro aspecto diferente da divulgação, o uso dos métodos descritos permite a construção de um locus numa forma gradual através de inserções sequenciadas e assim permite a inserção de DNA variável humano juntamente com DNA da região constante humana ou não humana em qualquer localização adequada no genoma de uma célula hospedeira não humana. Por exemplo, os métodos aqui descritos podem ser usados para inserir DNA da região variável de imunoglo-bulina humana juntamente com DNA da região constante do genoma do hospedeiro algures no genoma de uma célula hospedeira não humana, permitindo que uma cadeia de anticorpo quimérica seja produzida a partir de uma local diferente da região pesada endógena. Qualquer construção de DNA da cadeia pesada ou da cadeia leve humana atrás considerada pode ser inserida em qualquer posição pretendida no genoma de uma célula hospedeira humana usando as técnicas atrás descritas. O presente invento está assim relacionado com células e mamíferos tendo genomas compreendendo tais inserções. É aqui descrito um vector, como seja um BAC, compreendendo uma região V, D ou J humana, num arranjo funcional com um promotor de mamífero não humano ou outra 31 ΡΕ2421357 sequência de controlo, de forma que a expressão da região V, D ou J humana fique sob o controlo do promotor de mamifero não humano numa célula do mamífero não humano, como seja uma célula ES, em particular uma vez inserida no genoma daquela célula. 0 invento também está relacionado com células e roedores contendo as referidas células, células ou mamíferos esses que possuem uma região V, D ou J num arranjo funcional com um promotor de mamífero não humano ou com outra sequência de controlo, de forma que a expressão da região V, D ou J humana fique sob o controlo do promotor de mamífero não humano nas células ou mamífero.

De um modo geral, um aspecto do invento está relacionado com uma célula de roedor capaz de expressar uma sequência codificadora de V, D ou J humana sob o controlo de um promotor ou região de controlo do hospedeiro, a expressão capaz de produzir um anticorpo humanizado tendo um domínio variável humano e uma região constante de mamífero não humano. É aqui descrita uma célula, como seja uma célula que não seja de mamífero, como seja uma células ES, o genoma do qual compreende a) uma pluralidade de regiões V de IgH humano, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas a montante da região constante do hospedeiro mamífero não humano; e 32 ΡΕ2421357 b) facultativamente, uma ou mais regiões V de cadeia leve kappa humana e uma ou mais regiões J de cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro não humano e/ou uma ou mais regiões V da cadeia leve lambda humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano; É aqui descrita uma célula, como seja células de mamífero não humano, como seja células ES cujo genoma compreende a) uma pluralidade de regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou uma pluralidade de regiões V da cadeia leve lambda de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano; e b) facultativamente, uma ou mais regiões V de IgH humana, uma ou mais das regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas a montante da região constante do hospedeiro mamífero não humano.

Num aspecto, a célula é uma célula ES capaz de dar origem a um mamífero não humano capaz de produzir um 33 ΡΕ2421357 reportório de anticorpos que são quiméricos, os referidos anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana. Facultativamente, o genoma da célula é modificado para prevenir a expressão de anticorpos totalmente específicos da espécie hospedeira.

Num aspecto, a célula é uma célula estaminal pluripotente induzida (célula IPS).

Num aspecto, as células são células isoladas de mamífero não humano.

Num aspecto, uma célula aqui descrita é, de preferência, uma célula de mamífero não humano. 0 invento também está relacionado com uma linha celular que é crescida ou derivada de células como aqui descrito, incluindo uma linha celular imortalizada. A linha celular pode compreender genes V, D ou J humanos inseridos como aqui descrito, quer na configuração germinal quer após rearranjo quando da maturação in vivo. A célula pode ser imortalizada através da fusão com uma célula tumoral para proporcionar uma célula e uma linha celular produtora de anticorpos ou pode ser produzida por imortalização celular directa. São aqui descritos vectores para usar no invento. Num aspecto, tais vectores são BACs (cromossomas bacte- 34 ΡΕ2421357 rianos artificiais). Será apreciado que outros vectores de clonagem podem ser usados no invento e assim é aqui feita referência a BACs para referir, de um modo geral, qualquer vector adequado.

Num aspecto, os BACs usados para a geração de DNA humano a ser inserido, como seja das regiões VDJ ou VJ, são desbastados de forma que a região VDJ ou VJ humana final, ou parte dela, no mamifero não humano não possua sequências duplicadas ou perdidas quando comparado com a sequência genómica humana original. É aqui descrito um vector compreendendo um inserto, de preferência compreendendo uma região de DNA humano de alguns dos locus humanos VDJ ou VJ, flanqueado por DNA que não é daquele locus. 0 DNA flanqueante pode compreender uma ou mais marcas seleccionáveis ou um ou mais locais de recombinação especificos. Num aspecto, o vector compreende 2 ou mais, tais como 3, locais de recombinação especificos de local hetero-especificos e incompatíveis. Num aspecto, os locais de recombinação específicos de local podem ser locais loxP, ou suas variantes, ou locais FRT ou suas variações. Num aspecto, o vector compreende uma ou mais sequências ITR (repetições terminais invertidas) de transposões.

Num aspecto, os roedores do invento adequadamente não produzem quaisquer anticorpos totalmente humanizados. Num aspecto, isto é devido a não existir DNA inserido da 35 ΡΕ2421357 região constante humana. Como alternativa, não existe DNA da região constante humana no genoma capaz de formar um anticorpo conjuntamente com o componente de DNA da região variável humana inserida, por exemplo devido a mutação dentro de qualquer DNA da região constante humana ou à distância a qualquer DNA da região constante humana e a DNA região variável humana.

Num aspecto, o DNA da região constante da cadeia leve humana pode ser incluido no genoma celular, de forma que uma cadeia de anticorpo lambda ou kappa totalmente humana pode ser gerada, mas esta será apenas capaz de formar um anticorpo com uma cadeia pesada quimérica e não produz um anticorpo totalmente humano tendo regiões variáveis e constantes humanas.

Num aspecto, o genoma de mamífero não humano é modificado para prevenir a expressão de anticorpos totalmente específicos da espécie do hospedeiro. Anticorpos totalmente específicos da espécie hospedeira são anticorpos que possuem as regiões variável e constante do organismo hospedeiro. Neste contexto, o termo "específico" não se destina a relacionar a ligação dos anticorpos produzidos pelas células ou animais do invento mas antes a origem do DNA que codifica esses anticorpos.

Num aspecto, o genoma de mamífero não humano é modificado para prevenir a expressão dos anticorpos nativos (totalmente específicos da espécie hospedeira) no mamífero 36 ΡΕ2421357 através da inactivação da totalidade ou de parte dos loci Ig do hospedeiro mamífero não humano. Num aspecto isto é conseguido através da inversão da totalidade ou de parte da região VDJ ou da região VJ do mamífero não humano, facultativamente através da inserção de um ou mais locais específicos de recombinase no genoma e depois o uso destes locais na excisão ou inversão mediada por recombinase da totalidade ou de parte do locus da Ig de mamífero não humano. Num aspecto, pode ser empregue uma dupla inversão, a primeira para remover as V(D)Js do locus endógeno e depois uma inversão mais localizada que as coloca na orientação correcta. Num aspecto, um único local loxP é usado para inverter a região VDJ de mamífero não humano para um locus centromérico ou telomérico. 0 genoma de roedor, no qual o DNA humano é inserido, compreende regiões V, (D) e J endógenas e as sequências endógenas não foram eliminadas. É aqui descrito um método para a inserção de múltiplos fragmentos de DNA num DNA alvo, adequadamente para formar uma inserção contígua na qual os fragmentos inserido são ligados uns aos outros directamente sem sequências intervenientes. 0 método é especialmente aplicável à inserção de um grande fragmento de DNA num cromossoma do hospedeiro que pode ser realizado numa forma gradual.

Num aspecto, o método compreende a inserção de 37 ΡΕ2421357 uma primeira sequência de DNA num alvo, a sequência tendo uma porção do DNA vector e uma primeira sequência de interesse (XI); inserção de uma segunda sequência de DNA na porção de vector da primeira sequência, a segunda sequência de DNA tendo uma segunda sequência de interesse (X2) e uma segunda porção de vector; e depois excisão de qualquer DNA da sequência de vector que separe XI e X2 para proporcionar uma sequência X1X2 ou X2X1 contígua dentro do alvo. Existe, facultativamente, a inserção de mais uma ou mais sequências de DNA, cada sequência de DNA tendo uma outra sequência de interesse (X3, ...) e uma outra porção de vector, na porção de vector da sequência de DNA anterior, para construir um fragmento de DNA contiguo no alvo. 0 DNA alvo para a inserção da primeira sequência de DNA pode ser um local especifico ou qualquer ponto no genoma de uma célula particular. 0 método geral é aqui descrito relativamente à inserção de elementos da região VDJ humana, mas é aplicável à inserção de qualquer região de DNA, de qualquer organismo e, em particular, a inserção de grandes fragmentos de DNA, >100 kb, como seja 100-250 kb, ou mesmo maiores, como sejam os de TCR ou HLA. As caracterí sticas e abordagens aqui descritas relativamente à inserção VDJ podem ser igualmente aplicadas a qualquer um dos métodos aqui descritos.

Num aspecto, o DNA inserido é DNA humano, como seja da região VDJ ou VJ humana, montado no genoma de uma 38 ΡΕ2421357 célula, como seja uma célula ES, numa forma gradual usando 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais inserções separadas para cada região da cadeia pesada ou da cadeia leve. Os fragmentos são adequadamente inseridos no mesmo locus, ou substancialmente no mesmo locus, da célula, e.g. locus da célula ES, um a seguir ao outro, para formar a região VDJ ou VJ completa, ou parte da mesma. São aqui descritas células e animais não humanos compreendendo intermediários no processo cujos genomas podem compreender apenas uma região VDJ parcial, como seja apenas DNA da região variável humana.

Num outro aspecto, o método de produção de um mamifero não humano transgénico compreende a inserção de regiões VDJ ou VJ a montante da região constante do hospedeiro mamifero não humano através da inserção gradual de múltiplos fragmentos através de recombinação homóloga, de preferência usando um processo iterativo. Adequadamente, são inseridos fragmentos de aproximadamente 100 kb do locus VDJ e VJ humano, adequadamente para formar parte de uma região VDJ ou VJ completa após a iteração final do processo de inserção, como aqui descrito.

Num aspecto, o processo de inserção começa num local onde uma cassete de iniciação foi inserida no genoma de uma célula, como seja uma célula ES, proporcionando uma única região alvo. Num aspecto, a cassete de iniciação é inserida no locus da cadeia pesada de mamifero não humano, para usar na inserção de DNA da cadeia pesada humana. De 39 ΡΕ2421357 forma semelhante, uma cassete de iniciação é inserida no locus da cadeia leve de mamifero não humano. Para usar na inserção do DNA VJ da cadeia leve humana, a cassete de iniciação adequadamente compreende uma sequência esqueleto vector com a qual um vector tendo um fragmento de DNA humano na mesma sequência esqueleto pode recombinar para inserir o DNA humano no genoma da célula (e.g. ES) e adequadamente uma marca de selecção, como seja uma marca de selecção negativa. Adequadamente, a sequência esqueleto do vector é a de uma biblioteca BAC, para permitir que sejam usados BACs na construção das células ES e de mamíferos. A sequência esqueleto do vector pode no entanto ser qualquer sequência que sirva como local alvo no qual uma sequência homóloga possa inserir-se, por exemplo por recombinação homóloga e RMCE, e é de preferência DNA não codificador de qualquer uma das regiões VDJ ou constante.

Num aspecto, a inserção do primeiro fragmento de DNA numa cassete de iniciação é seguido da inserção de um segundo fragmento de DNA numa porção do primeiro fragmento de DNA, adequadamente uma parte do esqueleto vector do segundo fragmento de DNA. Num aspecto, um fragmento de DNA inserido compreende uma parte da região VDJ humana flanqueada por sequências 5' e/ou 3' que não sejam da região VDJ humana. Num aspecto, as sequências flanqueantes 5' e/ou 3' podem conter individualmente uma ou mais marcas seleccionáveis ou serem capazes de criar um sistema seleccionável uma vez inseridas no genoma. Num aspecto, uma ou ambas as sequências flanqueantes podem ser removidas do 40 ΡΕ2421357 genoma in vitro ou in vivo, após inserção. Num aspecto, o método compreende a inserção de um fragmento de DNA seguido da selecção de ambos os extremos 5' e 3' do fragmento inserido flanqueante do DNA VDJ humano. Num aspecto, a inserção iterativa é feita através da inserção de fragmentos de DNA no extremo 5' do fragmento previamente inserido e neste aspecto pode haver selecção in vivo do DNA vector que separa as sequências de DNA humano inseridas, para proporcionar uma sequência contígua de DNA humano.

Num aspecto, a inserção de DNA VDJ humano num genoma pode ser conseguida sem deixar qualquer DNA flanqueante no genoma, por exemplo através de excisão de DNA mediada por transposase. Uma transposase adequada é a transposase Piggybac.

Num aspecto, o primeiro fragmento da região variável humana é inserido por recombinação homóloga na sequência esqueleto da cassete de iniciação e depois o DNA de qualquer marca de selecção negativa e a cassete de iniciação são subsequentemente removidos por recombinação entre as sequências alvo da recombinase, tais como FRT, usando neste exemplo a expressão de FLPase. Geralmente as inserções dirigidas repetidas na sequência esqueleto de iniciação (e.g. BAC) e subsequente remoção através do rearranjo entre as sequências alvo da recombinase são repetidas para se construir toda a região VDJ humana a montante da região constante do hospedeiro não mamífero. 41 ΡΕ2421357

Num aspecto uma marca ou sistema seleccionável pode ser usado no método. A marca pode ser gerada quando da inserção de um fragmento de DNA num genoma, por exemplo formando uma marca seleccionável conjuntamente com um elemento de DNA já presente no genoma.

Num aspecto, o genoma da célula (e.g. ES) não contém 2 marcas de selecção idênticas em simultâneo durante o processo. Pode-se observar que o processo iterativo de inserção e selecção pode ser realizado usando apenas 2 marcas de selecção diferentes, como descrito no exemplos aqui apresentados, e por exemplo a terceira marca seleccionável pode ser idêntica à primeira marca, uma vez que quando da inserção do terceiro fragmento vector, o primeiro fragmento vector e a primeira marca foram removidos.

Num aspecto, um evento de inserção correcto é confirmado antes de se passar ao passo seguinte de qualquer processo de clonagem em múltiplos passos, por exemplo através da confirmação da estrutura BAC usando os arranjos genómicos de elevada densidade para testar as células ES para identificar as que possuem inserções intactas, sequenciação e verificação por PCR.

Num aspecto, o método usa recombinação especifica de local para inserção de um ou mais vectores no genoma de uma célula, como seja uma célula ES. Os sistemas de recombinase especifica de local são conhecidos e podem 42 ΡΕ2421357 incluir Cre-lox e FLP/FRT ou combinações dos mesmos, em que a recombinação ocorre entre 2 locais tendo homologia de sequências. BACs adequados estão disponíveis no centro Sanger, ver "A genome-wide, end-sequenced 129Sv Bac library resource for targeting vector construction". Adams DJ, Quail MA, Cox T, van der Weyden L, Gorik BD, Su Q, Chan WI, Davies R, Bonfield JK, Law F, Humphray S, Plumb B, Liu P, Rogers J Bradley A. Genomics. 2005 Dec; 86(6) :753-8. Epub 2005 Oct 27. The Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire CB10 ISA, UK. BACs contendo DNA humano estão igualmente disponíveis, por Exemplo, na Invitrogen. Uma biblioteca adequada está descrita em Osoegawa K et al., Genome Research 2001. 11:483-496. É aqui descrito um método que especificamente compreende: (1) inserção de um primeiro fragmento de DNA numa célula ES não humana, o fragmento contendo uma primeira porção de DNA da região VDJ ou VJ humana e uma primeira porção de vector contendo uma primeira marca seleccionável. (2) facultativamente, deleção de uma parte da primeira porção do vector; (3) inserção de um segundo fragmento de DNA numa célula ES não humana, a inserção ocorrendo dentro da 43 ΡΕ2421357 primeira porção do vector, o segundo fragmento de DNA contendo uma segunda porção da região VDJ ou VJ e uma segunda porção de vector contendo uma segunda marca seleccionável. (4) deleção da primeira marca seleccionável e da primeira porção do vector, de preferência pela acção de uma enzima recombinase; (5) inserção de um terceiro fragmento de DNA numa célula ES não humana contendo o segundo fragmento de DNA, a inserção ocorrendo dentro da segunda porção de vector, o terceiro fragmento de DNA contendo uma terceira porção da região VDJ ou VJ humana e uma terceira porção de vector contendo a marca seleccionável, (6) deleção da segunda marca seleccionável e da segunda porção do vector; e (7) iteração dos passos de inserção e deleção, conforme necessário, para o quarto e mais fragmentos das regiões VDJ ou VJ humanas, para produzir uma célula ES com uma parte ou a totalidade da região VDJ ou VJ humana inserida como aqui descrito e adequadamente para remover a totalidade das porções do vector dentro do genoma da célula ES.

Um outro método compreende 44 ΡΕ2421357 1. inserção de DNA formador de uma cassete de iniciação no genoma de uma célula; 2. inserção de um primeiro fragmento de DNA na cassete de iniciação, o primeiro fragmento de DNA compreendendo uma primeira porção de um DNA humano e uma primeira porção de vector contendo uma primeira marca seleccionável ou geração de uma marca seleccionável quando da inserção;

3. facultativamente, remoção de parte do DNA vector; 4. inserção de um segundo fragmento de DNA na porção vector do primeiro fragmento de DNA, o segundo fragmento de DNA contendo uma segunda porção de DNA humano e uma segunda porção de vector, a segunda porção de vector contendo uma segunda marca seleccionável ou geração de uma segunda marca seleccionável quando da inserção; 5. facultativamente, remoção de qualquer DNA vector para permitir que o primeiro e segundo fragmentos de DNA humano formem uma sequência contígua; e 6. iteração dos passos de inserção de DNA VDJ humano e remoção do DNA vector, conforme necessário, para produzir uma célula com a totalidade ou parte da região VDJ ou VJ humana suficiente para ser capaz de gerar um anticorpo quimérico conjuntamente com uma região constante do hospedeiro, 45 ΡΕ2421357 em que a inserção de um ou mais ou da totalidade dos fragmentos de DNA usa recombinação especifica de local.

Num aspecto, o mamifero não humano é capaz de gerar uma diversidade de pelo menos 1 x 10s combinações diferentes de combinações de sequências de imunoglobulinas quiméricas funcionais.

Num aspecto, a inserção direccionada é realizada em células ES derivadas da estirpe de murganho C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 ou 129Sv.

Os animais não humanos, tais como murganhos, são gerados num fundo deficiente em RAG-1 ou noutro fundo genético adequado que evite a produção de linfócitos T e B maduros do hospedeiro. 0 mamifero não humano é um roedor, adequadamente um murganho, e as células do invento são células de roedor ou células ES, adequadamente células ES de murganho.

As células Es do presente invento podem ser usadas para gerar animais usando técnicas bem conhecidas na área, as quais compreendem a injecção da célula ES num blastócito seguido de implantação de blastócitos quiméricos em fêmeas para produzir descendência que pode ser cruzada e seleccionada relativamente a recombinantes homozigóticos tendo a inserção necessária. Num aspecto, o invento está 46 ΡΕ2421357 relacionado com um animal quimérico constituido por tecidos derivados da célula ES e tecido derivado do embrião hospedeiro. Num aspecto, o invento está relacionado com animais com gerações subsequentes geneticamente alteradas, os quais incluem animais tendo recombinantes homozigóticos para as regiões VDJ e/ou VJ.

Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método para a produção de um anticorpo especifico contra um antigénio de interesse, o método compreendendo imunização de um mamifero transgénico não humano como atrás com o antigénio de interesse e recuperação do anticorpo (ver e.g. Halow, E. & Lane, D. 1998, 5a edição, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY; e Pasqualini and Arap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257-259). Adequadamente, é entregue uma quantidade imunogénica do antigénio. Descreve-se aqui um método para a detecção de um antigénio alvo compreendendo a detecção de um anticorpo produzido como atrás com um agente de detecção secundário que reconhece uma porção daquele anticorpo.

Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método de produção de um anticorpo totalmente humanizado compreendendo a imunização de um mamifero transgénico não humano como atrás com o antigénio pretendido, recuperação do anticorpo ou células que expressam o anticorpo e depois substituição da região constante do mamifero não humano com uma região constante humana. Isto pode ser conseguido 47 ΡΕ2421357 através de técnicas convencionais de clonagem ao nivel do DNA para substituir a região constante não humana com uma sequência de região constante humana adequada - ver e.g. Sambrook, J e Russell, D. (2001, 3rd edition) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). São aqui descritos anticorpos humanizados e cadeias de anticorpos produzidas de acordo com o presente invento, ambos na forma quimérica e totalmente humanizada e uso dos referidos anticorpos em medicina. É aqui descrita uma composição farmacêutica compreendendo tais anticorpos e um veiculo farmaceuticamente aceitável ou outro excipiente.

As cadeias de anticorpo contendo sequências humanas, tais como cadeias de anticorpo quiméricas humanas-não humanas, são aqui consideradas humanizadas devido à presença de uma região codificadora de proteina humana. Os anticorpos totalmente humanizados podem ser produzidos começando com DNA codificador de uma cadeia de anticorpo quimérico do invento usando técnicas convencionais. Métodos para a geração de anticorpo monoclonais e policlonais são bem conhecidos na área e o presente invento está relacionado com anticorpo policlonais e monoclonais de anticorpos quiméricos ou totalmente humanizados produzidos em resposta à exposição ao antigénio em mamíferos não humanos do presente invento. 48 ΡΕ2421357

Ainda num outro aspecto, os anticorpos quiméricos ou cadeias de anticorpos gerados no presente invento podem ser manipulados, adequadamente ao nivel do DNA, para gerar moléculas com propriedades ou estrutura do tipo anticorpo, como seja uma região variável humana derivada de uma cadeia pesada ou leve sem uma região constante, por exemplo um dominio de anticorpo; ou uma região variável humana com qualquer região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve da mesma espécie ou de uma espécie diferente; ou uma região variável com uma região constante não natural; ou região variável humana juntamente com qualquer outro parceiro de fusão. São aqui descritos derivados de anticorpos quiméricos, obtidos a partir de anticorpos quiméricos identificados de acordo com o presente invento. É aqui descrito o uso de animais do presente invento na análise de efeitos prováveis de fármacos e vacinas no contexto de um reportório de anticorpos quasi-humano. É aqui descrito um método para a identificação ou validação de um fármaco ou vacina, o método compreendendo a entrega da vacina ou fármaco a um mamifero do invento e monitorização de uma ou mais de: resposta imune, perfil de segurança, efeito sobre a doença.

Descreve-se aqui um kit compreendendo um anticorpo ou derivado de anticorpo como aqui descrito e instruções para uso de tal anticorpo ou de um reagente de 49 ΡΕ2421357 laboratório adequado, como seja um tampão, reagente de detecção do anticorpo. São aqui descritos: (a) a região VDJ de IgH humana a montante da região constante do hospedeiro mamífero não humano; e (b) as regiões V e J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou as regiões V e J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano; em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repor-tório de anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, e, facultativamente, em que o genoma de mamífero não humano é modificado para prevenir a expressão de anticorpos totalmente específicos de espécies hospedeiras humanas.

Uma célula ES de mamífero não humano cujo genoma compreende: (a) a região V, D e J de IgH humana a montante de uma região constante de mamífero não humano; e (b) as regiões V e J da cadeia leve kappa do 50 ΡΕ2421357 locus de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou as regiões V e J da cadeia leve lambda do locus de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano em que a célula ES é capaz de dar origem a um mamífero não humano, sendo capaz de produzir reportórios de anticorpos que são quiméricos, tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana.

Um método para a produção de um mamífero transgénico não humano capaz de produzir um reportório de anticorpos quiméricos, os anticorpos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, o método compreendendo a inserção por recombinação homóloga no genoma de uma célula ES de mamífero não humano (a) a região VDJ de IgH humana a montante da região constante da cadeia pesada do hospedeiro mamífero não humano; e (b) a região VJ de IgL humana para as cadeias lambda ou kappa a montante da região constante da cadeia lambda ou kappa do hospedeiro mamífero não humano, respectivamente de forma que o mamífero não humano seja capaz de produzir um reportório de anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável 51 ΡΕ2421357 humana, em que os passo (a) e (b) podem ser realizados por qualquer ordem e os passos (a) e (b) podem ser realizados de forma gradual ou como um passo único.

Num aspecto, a inserção das regiões VDJ ou VJ humanas a montante da região constante do hospedeiro mamífero não humano é conseguida através da inserção gradual de múltiplos segmentos por recombinação homóloga.

Num aspecto, as inserções graduais começam num local em que uma cassete de iniciação foi inserida no genoma de uma célula ES, proporcionando uma região alvo única consistindo numa sequência esqueleto VAC e numa marca de selecção negativa.

Num aspecto, um primeiro fragmento de região variável humana é inserido por recombinação homóloga no esqueleto BAC da cassete de iniciação e a referida marca de selecção negativa e cassete de iniciação são subsequentemente removidos por recombinação entre as sequências alvo da recombinase.

Num aspecto, inserções repetidas dirigidas na sequência de iniciação do esqueleto BAC e subsequente remoção do esqueleto através do rearranjo entre as sequências alvo da recombinase são repetidas para construir toda a região VDJ humana a montante da região constante do hospedeiro não humano. 52 ΡΕ2421357

Outros aspectos incluem:

Um método para a produção de um anticorpo especifico contra um antigénio de interesse, o método compreendendo a imunização de um mamifero não humano como aqui descrito com o antigénio de interesse e recuperação do anticorpo ou célula produtora do anticorpo.

Um método para a produção de um anticorpo totalmente humanizado compreendendo a imunização de um mamifero não humano como aqui descrito e depois substituição da região constante de mamifero não humano de um anticorpo especificamente reactivo com o antigénio com uma região constante humana, adequadamente através de manipulação do ácido nucleico codificador do anticorpo.

Um método, célula ou mamífero como aqui descrito em que uma sequência de DNA da região codificadora humana está num arranjo funcional com uma sequência de controlo de mamífero não humano, de forma que a transcrição do DNA seja controlada pela sequência de controlo do mamifero não humano. Num aspecto, a região codificadora humana V, D ou J está num arranjo funcional com uma sequência de promotor de murganho.

Um anticorpo humanizado produzido de acordo com quaisquer métodos aqui descritos e uso do anticorpo humanizado assim produzido em medicina. 53 ΡΕ2421357

Será entendido que realizações particulares aqui descritas são apresentadas com fins ilustrativos e não como limitações do invento. As principais caracteristicas deste invento podem ser empregues em várias realizações sem se afastarem do âmbito do invento. Os familiarizados com a área reconhecerão ou serão capazes de reconhecer ou serão capazes de determinar usando um ou mais estudos de rotina, numerosos equivalentes de procedimentos específicos aqui descritos. Tais equivalentes são considerados como estando dentro do âmbito deste invento e são recuperados pelas reivindicações. Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na especificação são indicativos do nivel de conhecimento dos familiarizados com a área em que este invento se inclui. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incluídos como referência no mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incluído como referência. 0 uso da palavra "um" ou "uma" quando usado conjuntamente com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especificação pode significar "um" mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um". 0 uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou" a menos que seja explicitamente indicado para referir alternativas apenas ou que as alternativas sejam mutuamente exclusivas, ainda que a descrição suporte uma definição que refere apenas alternativas e "e/ou". Ao longo deste pedido, o termo "cerca" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o sistema, o método empregue 54 ΡΕ2421357 para determinar o valor ou a variação que existe entre os indivíduos em estudo.

Como usado nesta especificação e reivindicações as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de compreendendo, como seja "compreendem" e "compreende"), "tendo" (e qualquer forma de tendo, como seja "têm" e tem"), "incluindo" (e qualquer forma de incluindo, como seja "inclui" e "incluem") ou "contendo" (e qualquer forma de contendo, como seja "contem" e "contêm") são inclusivas ou abertas e não excluem elementos ou passos adicionais dos métodos e não referidos. 0 termo "ou combinações dos mesmos" como aqui usado refere-se a todas as permutas e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C ou combinações dos mesmos destina-se a incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC e, se a ordem for importante num contexto particular, igualmente BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, são expressamente incluídas combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, como seja BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB etc. Os familiarizados com a matéria compreenderão que, tipicamente, não existe limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outra seja óbvio no contexto.

Qualquer parte desta descrição pode ser lida em combinação com qualquer outra parte da descrição, a menos que de outra forma seja óbvio no contexto. 55 ΡΕ2421357

Todas as composições e/ou métodos aqui descritos e reivindicados podem ser realizados e executados sem experimentação desnecessária face à presente descrição. Ainda que as composições e métodos deste invento sejam descritas em termos de realizações preferidas, será aparente para os familiarizados com a matéria que podem ser aplicadas variações às composições e/ou métodos e nos passos ou na sequência de passos do método aqui descrito sem se afastar do conceito, espirito e âmbito do invento. Todos os substitutos e modificações semelhantes, aparentes para os familiarizados com a área, pretende-se que estejam dentro do espirito, âmbito e conceito do invento conforme definido pelas reivindicações apensas. 0 presente invento está descrito mais detalhada-mente nos Exemplos seguintes não limitantes. 0 Exemplo 3 descreve dados experimentais obtidos que apoiam a prova de conceito de alguns aspectos do invento, enquanto os Exemplos 1 e 2 proporcionam orientação detalhada para os familiarizados com a área para a realização do invento apenso.

Exemplo 1 Estratégia global

Um modelo de murganho do invento pode ser conseguido através da inserção de ~960 kb do locus da 56 ΡΕ2421357 cadeia pesada humana contendo a totalidade das regiões V, D e J a montante da região constante de murganho e 473 kb da região kappa humana a montante da região constante de murganho. Como alternativa, ou em tandem, a região lambda humana é inserida a montante da região constante de murganho. Esta inserção é conseguida por inserção direccionada do gene em células ES usando técnicas conhecidas na área. A inserção com elevada fidelidade das regiões V-D-J intactas em cada locus na sua configuração nativa (selvagem) é adequadamente conseguida através da inserção de cromossomas artificiais bacterianos humanos (BACs) no locus. Adequadamente, os BACs são desbastados de forma que no locus final não constem sequências em duplicado ou que se tenham perdido comparativamente com o original. Tal des-bastamento pode ser feito por engenharia recombinogénica.

Os BACs humanos relevantes, adequadamente desbastados cobrindo estes loci têm, em média, 90 kb de tamanho.

Numa abordagem, o complemento completo de elementos D e J humanos assim como sete ou oito regiões V humanas são cobertos pelos primeiros BACs a serem inseridos no esquema de inserção experimental descrito abaixo. Os primeiros BAcs a serem inseridos nos loci IgH e IgK podem conter as seguintes regiões V: IgH: V6-1, VII-1-1, Vl-2, VI11-2 -1, Vl-3, V4-4, V2-5 e IgK: V4-1, V5-2, V7-3, V2-4, Vl-5, Vl-6, V3-7, VI-8 . 57 ΡΕ2421357

Adequadamente, o desempenho de cada locus foi avaliado após a primeira inserção de BAC usando murganhos quiméricos e igualmente após cada adição subsequente de BACs. Ver abaixo para descrição detalhada deste teste de desempenho.

Serão necessárias nove inserções BAC adicionais para o locus IgH e cinco para IgK para proporcionar o complemento completo de regiões V humanas cobrindo a totalidade de 0,96 Mb e 0,473 Mb dos loci IgH e IgK, respectivamente.

Nem todos os BACs retêm a sua configuração selvagem quando inseridos no genoma da célula ES. Assim, utilizámos arranjos genómicos de elevada densidade para rastrear células ES para identificar as possuidoras de inserções BAC intactas (Barrett, M.T., Scheffer, A., Bem-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P.,

Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., et al. (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 101, 17765-17770). Este rastreio também permite a identificação e selecção de clones ES em que o genoma das células ES está comprometido e assim não permite colonizar a linha germinal de animais quiméricos. Outras ferramentas genómicas adequadas para facilitar a avaliação incluem sequenciação e verificação por PCR. 58 ΡΕ2421357

Assim, num aspecto, a estrutura correcta de BAC é confirmada antes da passagem ao passo seguinte.

Está implícito da descrição atrás que de forma a manipular completamente o loci com BACs de 90 kb, é necessário efectuar um minimo de 10 passos de inserção dirigida para IgH e 5 passos para IgK. Os murganhos com um locus IgL podem ser gerados de forma semelhante ao locus IgK. São necessários passos adicionais para remover os marcadores de selecção necessários para suportar a inserção direccionada de genes. Uma vez que estas manipulações estão a ser efectuadas em células ES numa forma gradual, num aspecto, a capacidade de transmissão à linha germinal é mantida ao longo deste processo. A manutenção do desempenho dos clones de células ES através de múltiplos ciclos de manipulação sem necessidade de testar o potencial da linha germinal em todos os passos pode ser importante no presente invento. As linhas celulares actualmente em uso para os projectos de (anulação) "knockout" global KOMP e EUCOMM foram modificadas duas vezes antes do seu uso para este projecto e as suas taxas de transmissão da linha germinal não estão alteradas relativamente às células parentais (estas linhas estão publicamente disponíveis, ver www.komp.org e www.eucomm.org). Esta linha celular, designada JM8, pode gerar murganhos 100% derivados de células ES nas condições de cultura publicadas (Pettitt, S.J., Liang, Q., Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, H.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., 59 ΡΕ2421357

Bradley, A., e Skarnes, W.C. (2009). Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. nature Methods.). Estas células demonstraram capacidade para contribuir reprodutivelmente para o tecido somático e da linha germinativa de animais quiméricos usando condições convencionais para células ES de murganho. Esta capacidade pode ser encontrada com células cultivadas numa linha celular de suporte convencional (SNL) e mesmo sem células de suporte, cultivadas apenas em placas de cultura de tecidos revestidas com gelatina. Uma sub-linha particular, JM8A3, manteve a capacidade de colonizar a linha germinal de quimeras após vários ciclos de subclonagem. Extensa manipulação genética via, por exemplo, recombinação homóloga- como seria o caso do presente invento - não pode comprometer a pluripotência das células. A capacidade para gerar quimeras com tal percentagem elevada de tecido derivado de células ES tem outras vantagens. Primeiro, niveis elevados de quimerismo estão correlacionados com o potencial de transmissão da linha germinal e proporcionam um ensaio que simula a transmissão da linha germinal demorando apenas 5 a 6 semanas. Segundo, uma vez que estes murganhos são 100% derivados de células ES os loci manipulados podem ser directamente testados, eliminando o atraso causado pelo cruzamento. 0 teste da integridade dos novos loci de Ig é possível na quimera uma vez que o embrião do hospedeiro derivará de animais que são mutantes para o gene RAG-1 como descrito na secção seguinte.

Uma outra linha celular que pode ser usada é uma 60 ΡΕ2421357 linha celular HPRT-ve, como seja AB2.1, como descrito em "Chromosome engineering in mice, Ramirez-Solis R, Liu P and Bradley A, Nature 1995; 378; 6558; 720-4.

Complementação RAG-1

Enquanto muitos clones gerarão murganhos 100% derivados de ES, alguns não o farão. Isto proporciona murganhos com células B e T 100% derivadas de ES que poderão ser usados directamente na imunização e produção de anticorpos. Podem ser usadas células tendo um fundo deficiente em RAG-2 ou um fundo combinado deficiente em RAG-l/RAG-2 ou mutações equivalentes nas quais os murganhos produzam apenas células B e/ou células T apenas derivadas de células ES.

De forma que apenas os loci IgH ou IgK humano-murganho sejam activos nestes murganhos, os loci IgH e IgK humano-murganho podem ser manipulados numa linha celular em que um alelo do locus IgH ou IgK tenha já sido inactivado. Como alternativa, após inserção, pode ser realizada a inactivação do locus Ig do hospedeiro, como seja o locus IgH ou IgK.

As estirpes de murganho que possuem o gene RAG-1 mutado são imunodeficientes uma vez que não possuem linfócitos B ou T maduros (US 5859307). Os linfócitos T e B apenas se diferenciam se ocorrer recombinação correcto V(D)J. Uma vez que RAG-1 é uma enzima que é crucial para 61 ΡΕ2421357 esta recombinação, os murganhos sem RAG-1 são imunodeficientes. Se os embriões hospedeiros forem mutantes genéticos homozigóticos para RAG-1, uma quimera produzida através da injecção desse embrião não será capaz de produzir anticorpos se os tecidos linfóides do animal derivarem do embrião hospedeiro. No entanto, células JM8 e AB2.1, por exemplo, contribuem genericamente com mais de 80% dos tecidos somáticos do animal quimérico e assim normalmente colonizam o tecido linfóide. As células JM8 possuem actividade RAG-1 selvagem e assim os anticorpos produzidos no animal quimérico serão codificados pelo genoma das células ES JM8 manipuladas geneticamente. Assim, o animal quimérico poderá ser exposto a um antigénio por imunização e subsequentemente produzir anticorpos contra aquele antigénio. Isto permite aos familiarizados com a matéria testar o desempenho dos loci IgH e IgK huma-no/murganho manipulados geneticamente, conforme descrito no presente invento. Ver figuras 19 e 20.

Os familiarizados com a matéria usarão o animal quimérico como descrito para determinar o grau de diversidade de anticorpo (ver e.g. Halow, E. & Lane, D. 1998, 5th edition, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) . Por exemplo, a existência no soro do animal quimérico de determinados epitopos de anticorpos pode ser testada através da ligação a anti-soro especifico anti-idiotipo, por exemplo, num ensaio de ELISA. Os familiarizados com a área poderão também sequenciar os genomas dos clones de células B derivados do 62 ΡΕ2421357 animal quimérico e comparar a referida sequência com a sequência selvagem para avaliar o nivel de hipermutação, como seja hipermutação indicativa da maturação natural dos anticorpos.

Os familiarizados com a área usariam igualmente o referido animal quimérico para validar a função de anticorpos em que os referidos anticorpos são codificados pelo loci Ig manipulados geneticamente (ver e.g., Halow, E. & Lane, D. 1998, 5th edition, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por exemplo, os anti-soros poderão ser testados relativamente à ligação de um antigénio, o referido antigénio usado para imunizar o animal quimérico. Tal medição poderá ser feita por um ensaio de ELISA. Como alternativa, os familiarizados com a matéria poderão testar a neutralização do antigénio através da adição do anti-soro colhido do animal quimérico adequadamente imunizado. É conhecido dos familiarizados com a matéria que os desfechos para qualquer um destes testes demonstra a capacidade do loci Ig manipulado, o objectivo do presente invento, para codificar anticorpos com regiões variáveis humanas e regiões constantes de murganhos, os referidos anticorpos capazes de funcionar como anticorpos selvagens. Técnicas experimentais A engenharia recombinogénica para a produção de 63 ΡΕ2421357 vectores para usar em recombinação homóloga em células ES está descrita e, por exemplo, W09929837 e W00104288 e as técnicas são conhecidas na área. Num aspecto, a engenharia recombinogénica do DNA humano ocorre usando BACs como fonte do referido DNA humano. 0 DNA BAC humano será isolado usando o kit de purificação de BACs da Qiagen. 0 esqueleto de cada BAC humano será modificado usando engenharia recombinogénica na mesma configuração ou numa configuração semelhante ao BAC já inserido na região IH de murganho. 0 inserto genómico de cada BAC humano será aparado usando engenharia recombinogénica de forma que uma vez os BACs inseridos, uma parte perfeitamente contígua da região genómica V(D)J humana formar-se-á no locus IgH ou IgK de murganho. A transfecção com DNA de BAC por electroporação e a genotipagem será efectuada de acordo com protocolos convencionais (Prosser, H.M., Rzadzinska, A.K., Steel, K.P., and Bradley, A. (2008). Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin Vila inactin dynamics of sterocilia. Molecular and Cellular Biology 28, 1702-1712; Ramirez-Solis, R., Davis, A.C., and Bradley, A. (1993). Gene targeting in embryonic stem cells. Methods in Enzymology 225, 855-878). A engenharia recombinogénica será efectuada usando os procedimentos e reagentes desenvolvidos por Pentao Liu e laboratórios Don Court (Chan, W., Costantino, N., Li, R., Lee, S.C., Su, Q., Melvin, D., Court, D.L., and Liu, P. (2007). A recombineerring based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Research 35, e64). 64 ΡΕ2421357

Estas e outras técnicas para a inserção direccionada de genes e recombinação de fragmentos cromossómicos derivados de BAC num genoma de mamífero não humano, como seja um murganho, estão descritas, por exemplo, em http://www.eucomm.org/information/targeting/ e http://www.eucomm.org/information/publications. A cultura de linhas celulares derivadas de C57BL/6N, tais como as células ES masculinas JM8 seguirá técnicas convencionais. Demonstrou-se que as células ES JM8 são competentes ao contribuírem extensivamente para os tecidos somáticos e para a linha germinal e estão a ser usadas para grandes programas de mutagénese de murganho no Instituo Sanger, tais como EUCOMM e KOMP (Pettitt, S.J., Liang, Q., Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, H.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarmes, W.C. (2009). Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods.). Células ES JM8 (1,0 x 107) são electroporadas (500 yF, 230 V; BioRad) com 10 yg do DNA BAC humano linearizado com I-Secl. Os transfectantes são seleccionados com puromicina (3 yg/ml) ou G418 (150 yg/ml) . A selecção começa às 24 horas (com G418) ou às 48 horas (com puromicina) pós-electroporação e prossegue durante 5 dias. 10 yg de DNA BAC humano linearizado pode dar até 500 colónias de células ES resistentes à puromicina ou a G418. As colónias de células ES resistentes aos antibióticos são transferidas para placas de cultura de células de 96 alvéolos para genotipagem para identificar os clones alvo. 65 ΡΕ2421357

Uma vez identificados os clones de células ES de murganhocom inserção, elas são analisadas através de arranjos de Hibridação Genómica Comparativa (CGH) relativamente à integridade total do genoma (Chung, Y.J., Jonkers, J., Kilston, H., Fiegler, H., Humphray, S., Scott, C., Hunt, S., Yu, Y., Nishijima, I., Velds, A., et al. (2004). A whole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes by array comparative genomic hybridization. genome research 14, 188-196 e Liang, Q., Conte, N., Skarnes, W.C., and Bradley, A. (2008). Extensive genomic copy number variation in embryonic stem cells. proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 17453-17456) . As células ES que possuem genomas anormais não contribuem eficientemente para a linha germinal do murganho quimérico. A integridade de BAC será examinada através de amplificação por PCR do gene V funcional conhecido presente em BAC. Por exemplo, numa abordagem o primeiro BAC humano escolhido para o locus IgH possui 6 genes V funcionais. Para confirmar a integridade deste BAC relativamente à presença destes 6 genes V de IgH, pelo menos 14 pares das sequências iniciadoras de PCR serão desenhados e usados para amplificar por PCR DNA genómico das células ES com inserção. O tamanho e a sequência selvagem humana destes fragmentos assegurarão que o BAC inserido não foi rearranj ado. CGH mais detalhado confirmará também a integri- 66 ΡΕ2421357 dade dos BACs inseridos. Por exemplo, os familiarizados com a matéria poderão usar uma plataforma oligo aCGH, a qual foi desenvolvida pela Agilent Technologies, Inc. Esta plataforma não só permite estudar a variação do número de cópias no DNA genómico global com elevada resolução (Barrett, M.T., Scheffer, A., Bem-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., et al., (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 17765-17770), como também permite a avaliação de uma região especifica do genoma usando arranjos desenhados por encomenda. Comparativamente com as técnicas tradicionais aCGH que se baseiam em sondas de cDNA ou sondas BAC globais, as sondas oligonucleotidicas de 60-meros podem assegurar hibridação especifica e elevada sensibilidade e precisão que é necessária para detectar as alterações que efectuámos nos cromossomas. Por exemplo, os oligos desenhados para hibri-darem em intervalos regulares ao longo de todo o BAC inserido detectará mesmo deleções, inserções ou outros arranjos muito pequenos. Igualmente, esta plataforma proporciona a maior flexibilidade aos desenhos de microarranjos por encomenda. O DNA genómico de células ES com inserção e o DNA genómico normal de seres humanos serão marcados separadamente com corantes e hibridados no arranjo. As lâminas dos arranjos serão varridas usando um varredor de microarranjos de DNA Aglient Technologies. O reciproco das intensidades de fluorescência do corante Cy5 67 ΡΕ2421357 e do corante Cy3 em cada imagem do arranjo e os valores da razão log2 serão extraídos usando o programa informático Bluefuse (Bluegnome). As manchas com padrões de fluorescência inconsistentes ("confiança" <0,29 ou "qualidade" = 0) serão excluídas antes da normalização de todos os valores da razão log2. Numa experiência, a razão log2 entre -0,29 e +0,29 para o sinal de qualquer sonda oligonu-cleotidica é interpretada como não alteração dos números de cópias. O patamar da razão log2 para "Duplicação" é, geralmente, >0,299999 e para a deleção é <0,29999.

Uma vez inserido o primeiro BAC humano no locus IgH de murganho e confirmada intacta a sua configuração nativa, o esqueleto BAC flanqueado por FRT será excisado usando recombinase especifica de Flp. Se a recombinação regular de FRT catalisada por Flp não for suficientemente elevada, pode-se usar Fio, uma versão melhorada da recombinase Flpo que em determinados testes é 3-4 vezes mais eficiente que a Flp original nas células ES. Após o esqueleto BAC ser removido, as células ES tornar-se-ão sensíveis a Puromicina (ou G418) e resistentes a FIAU (para perda da cassete TK) . Os eventos de excisão serão ainda caracterizados através de amplificação por PCR do fragmento de junção usando sequências iniciadoras do DNA genómico humano. Estas células ES sem esqueleto BAC flanqueado por FRT serão usadas no ciclo seguinte de inserção de BAC humano e na injecção de blastócitos.

A inserção de DNA no do genoma de uma célula ES 68 ΡΕ2421357 para produzir um murganho transgénico pode ser realizada usando um protocolo de acordo com o explicado com referência às figuras 1-18 apensas.

Figura 1 ilustra três vectores esqueleto básicos; uma cassete de iniciação e 2 vectores com grandes insertos, 1 e 2 respectivamente. A cassete de iniciação compreende sequências homólogas do local de inserção pretendido no genoma de murganho, os locais que flanqueiam uma marca seleccionável e sequência iniciadora de enchimento ("stuffer") para genotipagem baseada em PCR para confirmar a inserção correcta de BACs. A sequência iniciadora de enchimento proporciona a base para a genotipagem de cada passo da adição de BAC. Esta sequência é considerada para proporcionar uma matriz de sequência robusta bem validada para a sequência iniciadora de PCR e pode estar situada no local ISecI, idealmente a ~lkb do inserto BAC.

Os vectores de inserção maiores compreendem DNA humano em plasmideos com marcas seleccionáveis e um local de restrição único para linearização do plasmideo para ajudar na recombinação homóloga no genoma da célula ES. A Figura 2 ilustra a inserção de uma cassete de iniciação no genoma de murganho por recombinação homóloga entre os exões J4 e alfa C de murganho. A selecção com puromicina permite a identificação de células ES com inserção da cassete, pu(Delta)tk é uma proteina de fusão bifuncional entre a N-acetiltransferase de puromicina 69 ΡΕ2421357 (Puro) e uma versão truncada da cinase de timidina de herpes simples tipo 1 (Delta Tk) . As células estaminais (ES) embrionárias murinas transfectadas com pu(Delta)tk tornaram-se resistentes à puromicina e sensíveis a 1- (-2-desoxi-2-fluoro-l-beta-D-arabino-furanosiul)-5-iodouracilo (FIAU). Ao contrário de outros transgenes tk de HSV1, puDeltak é facilmente transmitido através da linha germinal masculina. Assim pu(Delta)tk é uma marca de selecção positiva/negativa conveniente que pode ser largamente usada em muitas aplicações de células ES. A Figura 3 ilustra a inserção do vector com inserto grande 1 no genoma de células ES de murganho. A linearização do vector é feita na mesma posição da sequência iniciadora de enchimento que permite uma estratégia de genotipagem por reparação de hiatos, bem conhecida na área - ver Zheng et al NAR 1999, Vol 27, 11, 2354-2360. Essencialmente, a inserção aleatória do vector no genoma não "reparará" o hiato, enquanto um evento de recombinação homóloga reparará o hiato. A justaposição das sequências iniciadoras de PCR adequadas permite que as colónias sejam rastreadas individualmente relativamente a um fragmento de PCR positivo indicador da inserção correcta. A selecção positiva usando G418 permite a identificação de células ES de murganho contendo a marca de selecção neo. A verificação por PCR pode ser feita para todas as regiões criticas V, D e J. O arranjo de hibridação genómica comparativa pode ser usado para validar a estrutura do BAC. 70 ΡΕ2421357 A Figura 4 ilustra a cassete puro-delta-tk e o esqueleto do plasmideo BAC é eliminado usando Flpe e selecção em FIAU. Uma vez que Flpe funciona mal em células ES de murganho (deleção de 5% com expressão transitória de Flpe), espera-se que na maioria dos casos, a recombinação ocorra entre os dois locais FRT flanqueadores do esqueleto BAC. Flpo pode igualmente ser testado para determinar a eficiência de recombinação entre dois locais FRT que distem lOkb.

Considerando que o passo de deleção é seleccionável, é possivel juntar os clones FIAU resistentes e prosseguir imediatamente para o passo seguinte paralelamente com a análise clonal. Como alternativa, pode ser desejável mostrar por PCR de pequenos produtos que as sequências humanas estão agora adjacentes às do murganho conforme demonstrado (sequência iniciadora Hy e sequência iniciadora Mo).

Nesta fase um locus humano de 200 kb terá sido inserido. A Figura 5 ilustra um segundo vector com um grande inserto para inserção no cromossoma das células ES. O BAC humano é dirigido ao locus IgH de murganho usando a inserção da mesma cassete de iniciação seguido da linearização de BAC com ISecl, direccionamento de BAC para a cassete de iniciação e a estratégia de genotipagem por 71 ΡΕ2421357 recuperação de hiatos. A verificação da inserção de BAC foi realizada como anteriormente. A Figura 6 ilustra o esqueleto BAC flanqueado por FRTY do vector 2 com inserto grande e a marca neo eliminados através de Flpo. Note-se que este evento não é seleccionável, assim para análise será necessário clonar nesta altura. Isto permitirá a confirmação da justaposição do inserto 2 humano com o inserto 1 humano e outros esforços de validação.

Nesta fase um locus humana com -200 kb terá sido inserido. A Figura 7 ilustra o vector seguinte com inserto grande inserido no locus IgH de murganho. A cassete pu-delta TK é então removida, como na Figura 4. O processo pode ser repetido para incorporar outros BACs. A Figura 8 ilustra a construção final prevista para as células ES.

Figuras 9-18 proporcionam um outro nivel de detalhe deste processo.

Exemplo 2

Num outro método do invento a recombinação especifica de local pode igualmente ser empregue. A 72 ΡΕ2421357 recombinação específica de local (SSR) tem sido largamente usada nos últimos 20 anos para a integração de transgenes em loci cromossómicos definidos. SSR envolve recombinação entre sequências de DNA homólogas. A primeira geração de inserção cromossómico baseada em SSR envolveu a recombinação entre (i) um local alvo de recombinação (RT) único como seja loxP ou FRT num plasmídeo transfectado com (ii) um local RT cromossómico proporcionado por uma integração anterior. Um problema importante com esta abordagem é que os eventos de inserção são raros uma vez que a excisão é sempre mais eficiente do que a inserção. Uma segunda geração de SSR designada RMCE (permuta de cassetes mediada por recombinase) foi introduzida por Schlake and Bode em 1994 (Schlake, T.; J. Bode (1994). "Use of mutated FLP-recognition-target-(FRT-)sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci”. Biochemistry 33:12746-12751). O seu método baseia-se na utilização de dois RTs hetero-específicos e incompatíveis no plasmídeo transfectado que pode recombinar com locais RT compatíveis no cromossoma resultando na troca de um fragmento de DNA por um outro -ou uma permuta de cassetes. Esta abordagem foi explorada com sucesso numa variedade de inserções cromossómicas eficientes, incluindo a integração de insertos BAC superiores a 50 kb (Wallace, H.A.C. et al. (2007). "Manipulating the mouse genome to engineering precise functional syntenic replacements with humane sequence". Cell 128:197-209; Prosser, H.M. et al. (2008). "Mosaic complementation 73 ΡΕ2421357 demonstrates a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics of Stereoilia". Mol. Cell. Biol. 28:1702-12). O maior tamanho do inserto de um BAC é cerca de 300 kb e assim isto coloca um limite superior no tamanho da cassete para RMCE.

No presente invento utiliza-se uma nova técnica baseada em SSR designada RMCE sequencial (SRMCE), que permite a inserção continua dos insertos BAC no mesmo locus. O método compreende os passos de 1 inserção de DNA formador de uma cassete (também aqui designado uma plataforma de aterragem) no genoma de uma célula; 2 inserção de um primeiro fragmento de DNA no local de inserção, o primeiro fragmento compreendendo uma primeira porção de um DNA humano e uma primeira porção de vector contendo uma primeira marca seleccionável ou geração de uma marca seleccionável quando da inserção; 3 remoção de parte do DNA vector; 4 inserção de um segundo fragmento de DNA na porção do vector do primeiro fragmento de DNA, o segundo fragmento de DNA contendo uma segunda porção de DNA humano e uma segunda porção de vector, a segunda porção de vector contendo uma 74 ΡΕ2421357 segunda marca seleccionável ou geração de uma segunda marca seleccionável quando da inserção; 5 remoção de qualquer DNA do vector para permitir que o primeiro e o segundo fragmento de DNA humanos formem uma sequência contigua; e 6 iteração dos passos de inserção de uma parte do DNA V(D)J humano e remoção do DNA vector, conforme necessário, para produzir uma célula com a totalidade ou parte da região VDJ ou VJ humana suficiente para ser capaz de gerar um anticorpo quimérico conjuntamente com uma região constante do hospedeiro, em que a inserção de pelo menos um fragmento de DNA usa recombinação especifica de local.

Num aspecto especifico, a abordagem utiliza três locais loxP hetero-especificos e incompatíveis. 0 método é constituído pelos passos que se seguem e ilustrado nas Figuras 22 - 26: 1. Inserção numa plataforma de aterragem no locus definido. Um vector de entrada contendo um minigene HPRT flanqueado por ITRs de piggyBac (PB) é direccionado para uma região definida (por exemplo: uma região entre IGHJ e Εμ ou IGKJ e Εκ ou IGLCl e EX3-1) para servir como plataforma de aterragem para a inserção de BAC. 0 mini-gene HPRT é constituído por dois exões sintéticos e pelo intrão 75 ΡΕ2421357 associado. 0 exão 5' de HPRT está flanqueado por dois locais loxP hetero-especificos e incompatíveis (um selvagem e o outro um local mutado, lox5171) em orientação invertida um relativamente ao outro (Fig. 22). Estes dois locais loxP proporcionam locais de recombinação para a inserção BAC através de RMCE. 2. Inserção do 1° BAC modificado na plataforma de aterragem inserida. 0 Io BAC possui um segmento de DNA a ser inserido no genoma flanqueado por modificações introduzidas. A modificação 5' (loxP-gene neo-lox2272-promotor PGK - PB 5'LTR) e a modificação 3' (PB3'LTR - gene puroATK - lox5171) estão descritas na Fig. 23, juntamente com as orientações dos locais lox e das LTRs PB. Com a expressão transitória de CRE a partir de um vector co-electroporado, a sequência de DNA será inserida no locus definido através de RMCE. As células em que uma inserção corrigida ocorreu podem ser seleccionadas como se segue: (i) resistência à puromicina (o gene puroATK adquiriu um promotor - "PGK" - da landing pad), (ii) resistência a 6TG (o mini-gene HPRT foi destruído) e (iii) resistência a G418 (selecciona qualquer inserção através do arranjo região 5' PGK-neo). Pode ser usada qualquer combinação destes regimes de selecção. A resistência a G418 e a 6Tg selecciona os eventos correctos no extremo 5', enquanto a resistência à puromicina selecciona os eventos correctos no extremo 3'. 3. Cura (remoção) da modificação 3' da Ia inserção. Um 1° BAC adequadamente inserido resulta num extremo 3' tendo um 76 ΡΕ2421357 gene puroATK flanqueado pelas LTRs PB invertidas (Fig. 24) - essencialmente uma estrutura de transposão correcta. Este transposão pode então ser removido pela expressão transitória da transposase piggyBac (a partir de um vector electroporado). As células com o evento de excisão correcto podem ser seleccionadas por resistência a FIAU - i.e., sem actividade de cinase de timidina a partir do gene puroATK. Este remove completamente a modificação 3' sem deixar vestígios de nucleótidos. 4. Inserção de um 2° BAC modificado no extremo 5' da Ia inserção. 0 2° BAC tem um fragmento de DNA para ser inserido no genoma (geralmente destinado a ser contiguo com o DNA inserido com o Io BAC) flanqueado por modificações introduzidas. A modificação 5' (loxP - porção 5' do mini-gene HpRT - lox5171 - promotor PGK - PB LTR 5') e a modificação 3' (PB3'LTR - puroATK - lox2272) estão descritas na Fig. 25, juntamente com as orientações relativas dos locais lox e PB LTRs. Com a expressão transitória de CRE a partir de vector co-electroporado, a sequência de DNA será inserida no locus definido através de RMCE. As células em que uma inserção correcta ocorreu podem ser seleccionadas como se segue: (i) resistência a HAT (o mini-gene HPRT é reconstituído através de um evento de inserção correcta, i.e.: as estruturas dos exões 5' e 3' são juntas) e (ii) resistência à puromicina (o gene puroATK adquiriu um promotor -"PGK" - da plataforma de aterragem). 5. Cura (remoção) da modificação 3' da 2a inserção. Um 2° 77 ΡΕ2421357 BAC adequadamente inserido resulta no extremo 3' tendo um gene puroATK flanqueado por LTRs PB invertidas (Fig. 26) -essencialmente uma estrutura de transposão correcta, exactamente análoga à consequência de uma inserção bem sucedida do Io BAC. Assim, este transposão pode igualmente ser removido através da expressão transitória da transposase piggyBac (a partir de um vector electroporado). As células com o evento de excisão correcto podem ser seleccionadas através de resistência a FIAU - i.e., sem actividade de cinase de timidina do gene puroATK. Isto remove completamente a modificação 3' sem deixar vestígios de nucleótidos. 6. Após cura da modificação 3' da 2 a inserção de BAC, a plataforma de aterragem torna-se idêntica à original. Todo este processo, os passos 2 a 5, podem ser repetidos múltiplas vezes para construir um inserto grande no genoma. Quando completo, não existem nucleótidos residuais remanescentes para além do inserto pretendido.

Com a inserção de um número impar de BACs no loci Ig, as sequências endógenas VDJ ou VJ podem ser inactivadas através de uma inversão via engenharia genética do cromossoma como se segue (ver figuras 27-29): 1. Inserção de uma cassete de "virar ao contrário" ("flip-over") numa região 5' distando 10 a 40 megabases de VDJ ou VJ endógeno. O vector de virar ao contrário

(PB3'LTR-promotor PGK mini-gene HPRT porção 5'

loxP 78 ΡΕ2421357 puroATK - promotor CAGGS - PBL3'LTR) está descrito na Fig. 27, juntamente com as orientações relativas dos locais lox e LTRs PB. 2. A expressão transitória de CRE resultará em recombi-nação entre o local loxP na cassete de "virar ao contrário" e o local loxP na modificação 5'. Esta modificação 5' é como descrito nos Passos 2 e 3 atrás - essencialmente a modificação resultante da inserção de um número impar de BACs, após a modificação 3' ter sido curada. Os locais loxP estão invertidos um em relação ao outro e assim o evento de recombinação descrito resulta numa inversão como descrito na Fig. 28. As células com a inversão correcta serão resistentes a HAT uma vez que o mini-gene HPRT é reconstituído através de uma inversão correcta. 3. Uma inversão correcta também deixa duas estruturas de transposão a flanquear a cassete de "virar ao contrário" e a modificação 5'. Ambas podem ser removidas com expressão transitória da transposase piggyBac, sem deixar vestígios de qualquer uma das modificações (Fig. 29). As células com as excisões correctas podem ser seleccionadas como se segue: (i) resistência a 6TG (o mini-gene HPRT é eliminado) e (ii) resistência a FIAU (o gene puroATK é eliminado). Uma inversão como descrita no loci Ig moverá a região endógena IGH-VDJ ou IGK-VJ para longe da região estimuladora Εμ ou EK, respectivamente, e conduzirá à inactivação das regiões IGH-VDJ ou IGK-VJ endógenas. 79 ΡΕ2421357

Os métodos de inserção do invento adequadamente proporcionam um ou mais de:

Selecção em ambos os extremos 5' e 3' do fragmento de DNA inserido;

Cura eficiente da modificação 3', de preferência através de exposição de DNA mediada por transposase;

Inactivação da actividade endógena de IGH ou IGK através de uma inversão; e

Excisão de modificações, sem deixar vestígios de nu-cleótidos remanescentes no cromossoma.

Exemplo 3 A prova de conceito da abordagem está descrita na Figura 30. Na Figura 30 uma plataforma de aterragem como se mostra na Figura 22 foi inserida no genoma de um murganho através de recombinação homóloga, seguido de inserção do plasmídeo R21 naquela plataforma de aterragem através de recombinação específica de local mediada por cre. O evento de inserção gerou uma série de eventos de inserção generalizada, 360 colónias resistentes a G418, das quais -220 tinham a inserção no locus pretendido, conforme demonstrado pela disrupção do minilocus HRPT. O vector R21 simula o vector da Ia inserção de 80 ΡΕ2421357 BAC nos extremos 5' e 3' , incluindo todos os elementos de selecção e locais alvo de recombinase. Em vez de sequências BAC, existe uma sequência de enchimento ("stuffer") mais pequena. Este vector testará todos os princípios do invento e permite avaliar facilmente os resultados devido ao PCR tendo a sequência de enchimento como alvo ser exequivel e assim permitir que sejam facilmente testados ambos os extremos da inserção. R21 foi co-electroporada com um vector que expressa cre nas células ES portadoras da plataforma de aterragem no locus IGH. Quatro séries de células transformadas foram transfectadas em paralelo e depois colocadas sob diferentes regimes de selecção conforme indicado na Figura 30. A selecção com G418 (expressão do gene neo) resultou no maior número de colónias devido a não haver necessidade de integração específica na plataforma de aterragem. A selecção com puromicina resultou num número de colónias semelhante a Puro + 6TG ou G418 + 6TG, sugerindo que a restringência da selecção com Puro é devida a PuroATK sem um promotor no vector. A expressão de Puro é apenas conseguida quando uma integração ocorre perto de um elemento promotor - neste desenho muito provavelmente especificamente na plataforma de aterragem. Estas conclusões são suportadas pelos resultados do PCR da junção que está apresentado na Figura 31. O passo seguinte no invento é "curar" o extremo 3' do vector BAC integrado, deixando uma transição contínua entre a inserção e o genoma flanqueador. Demonstrámos esta 81 ΡΕ2421357 cura através da expansão de um clone individual acima (R21 inserido na plataforma de aterragem) e expressão da recombinase piggyBac neste clone através da transfecção de um plasmideo de expressão. FIAU foi usado para seleccionar colónias em que a modificação 3' foi modificada - i.e., através da perda do elemento "PGK-puroATK" entre as repetições terminais piggyBac. Cinquenta desses clones resultaram de uma transfecção de 106 células; destas testámos 6 relativamente à estrutura genómica esperada. A cura bem sucedida resultou em PCR positivo entre a série de sequências iniciadoras designada "3" na Figura 32. Dos 6 clones, 4 tinham excisões correctas, 1 clone permaneceu na configuração original e 1 outro tinha uma deleção.

Estes dados demonstram inserção iterativa de DNA numa plataforma de aterragem num locus genómico definido usando as abordagens atrás descritas.

Exemplo 4 0 Exemplo 3 demonstrou que o projecto do invento reivindicado foi capaz de proporcionar a inserção de um vector teste no genoma numa localização definida, neste caso o vector R21 no locus IGH de murganho. 0 uso do meio de selecção adequado e a expressão da recombinase cre resultou numa alteração genómica com a estrutura prevista.

Os mesmos elementos desenhados descritos neste invento foram construídos nos extremos 5' e 3' de um 82 ΡΕ2421357 inserto BAC. 0 referido inserto compreendeu sequências humanas do locus IGH e tinha aproximadamente 116 kb. Este BAC manipulado geneticamente foi electroporado juntamente com um DNA de plasmideo expressando cre nas células ES de murganho portador da plataforma de aterragem no locus IGH de murganho. A população de células transfectadas foi cultivada em meio contendo puromicina para seleccionar os eventos de inserção adequados.

Sete clones resultantes foram isolados e ainda analisados. 0 evento de recombinação esperado e a estrutura resultante estão descritos na Figura 33. Com base nos dados da experiência com R21 descrita no Exemplo 3, uma selecção restringente dos clones correctos era esperada quando a população transfectada foi seleccionada em meio contendo puromicina. Isto é devido à região codificadora de puro requerer um elemento promotor e este é preferencialmente fornecido pela plataforma de aterragem após recombinação. Assim, a maioria dos 7 clones isolados tinham a inserção correcta no genoma na plataforma de aterragem conforme determinado pelo PCR de diagnóstico. As sequências iniciadoras para o diagnóstico e inserção correcta estão descritos na Figura 33. As junções correctas estão presentes no genoma se um fragmento de 610 pb for amplificado entre as sequências iniciadoras "A" e "X" e um fragmento de 478 pb for amplificado entre as sequências iniciadoras "Y" e "B" (Figuras 33 e 34). Note-se que existem fragmentos amplificados entre as sequências iniciadoras "A" e " 1" e as sequências iniciadoras "2" e "B" indicando a presença do 83 ΡΕ2421357 genoma parental (ou seja, apenas a plataforma de aterragem). Isto resulta das células parentais presentes internamente nas colónias de células sob selecção com puromicina escparem à selecção devido à geometria da colónia. Após passagem da colónia através de meio contendo puromicina, estes fragmentos de junção parentais desaparecem indicando que as células parentais são removidas da população. Ainda, foi demonstrado que todos os clones são resistentes a 6-TG conforme esperado se o gene HPRT for inactivado pelo evento de inserção correcto.

Estes dados indicam que a estratégia descrita para inserção de partes grandes dos loci IG humanos em posições definidas no genoma de murganho permitirá a construção de um murganho com uma pluralidade de regiões variáveis de regiões IG humanas a montante das regiões constantes de murganho como descrito.

Lisboa, 11 de abril de 2013

Claims

ΡΕ2421357 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um mamífero não humano cujo genoma compreende : (a) uma pluralidade de regiões V de IgH humana, uma u mais regiões D e uma ou mais regiões J a montante de uma região constante do mamífero hospedeiro não humano; e (b) facultativamente, uma ou mais regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou uma ou mais regiões V da cadeia leve lambda de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano em que o mamífero não humano é capaz de produzir um reportório de anticorpos quiméricos ou cadeias quiméricas pesadas e, facultativamente, cadeias leves quiméricas, tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana; em que o genoma de mamífero não humano no qual o DNA é inserido compreende regiões V(D)J endógenas que não foram eliminadas, 2 ΡΕ2421357 em que o mamífero não humano é um roedor, e em que a inserção do DNA da cadeia pesada humana é feita entre a região constante não humana e a última região J 3' de mamífero não humano ou um mamífero não humano cujo genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou uma pluralidade de regiões V da cadeia leve lambda de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano; e b) facultativamente, uma ou mais regiões V de IgH humana, uma ou mais das regiões D humanas e uma ou mais regiões J humana a montante da região constante do hospedeiro mamífero não humano. em que o mamífero não humano é capaz de produzir um reportório de anticorpos quiméricos ou cadeias leves quiméricas e, facultativamente cadeias pesadas quiméricas, tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana em que o genoma de mamífero não humano no qual o DNA é 3 ΡΕ2421357 inserido compreende regiões V(D)J endógenas que não foram eliminadas em que o mamífero não humano é um roedor, e em que a inserção do DNA da cadeia kappa humana ou da cadeia lambda humana é entre a região constante de mamífero não humano e a última região J 3' do mamífero não humano.
2. Uma célula de mamífero não humano cujo genoma compreende (a) uma pluralidade de regiões V de IgH humana, uma ou mais regiões D e uma ou mais regiões J a montante de uma região constante do hospedeiro mamífero não humano e (b) facultativamente uma ou mais regiões V kappa da cadeia leve de Ig humana e uma ou mais regiões J kappa da cadeia leve de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou uma ou mais regiões V lambda da cadeia leve de Ig humana e uma ou mais regiões J çambda da cadeia leve de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamífero não humano em que o genoma de mamífero não humano no qual o DNA é inserido compreende regiões V(D)J endógenas que não foram eliminadas, em que o mamífero não humano é um roedor, 4 ΡΕ2421357 e em que a inserção do DNA da cadeia pesada humana é feita entre a região constante de mamifero não humano e a última região J 3' de mamífero não humano, ou uma célula de mamífero não humano cujo genoma compreende (a) uma pluralidade de regiões V da cadeia leve kappa de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve kappa de Ig humana a montante da região constante kappa do hospedeiro mamífero não humano e/ou uma pluralidade de regiões V da cadeia leve lambda de Ig humana e uma ou mais regiões J da cadeia leve lambda de Ig humana a montante da região constante lambda do hospedeiro mamifero não humano; e b) facultativamente uma ou mais regiões V de IgH humana, uma ou mais das regiões D humanas e uma ou mais regiões J humana a montante da região constante do hospedeiro mamifero não humano em que o genoma de mamífero não humano no qual o DNA é inserido compreende regiões V(D)J endógenas que não foram eliminadas, em que o mamífero não humano é um roedor, e em que a inserção do DNA da cadeia pesada humana é feita entre a região constante de mamifero não humano e a última região J 3' de mamifero não humano, 5 ΡΕ2421357
3. Um mamífero ou célula de acordo com a reivindicação 1 ou 2 cujo genoma compreende DNA da região variável humana inserido, derivado de uma cadeia pesada humana e de uma cadeia leve humana, em que existem, (a) uma pluralidade de regiões V de IgH humana, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas a montante de uma região constante de hospedeiro mamífero não humano e em que a inserção do DNA da cadeia leve humana é a montante de uma região constante da cadeia leve de mamífero não humano, de forma que uma cadeia leve quimérica possa ser produzida na célula.
4. Uma célula ou mamífero não humano de acordo com as reivindicações 1-3 em que o mamífero é um murganho ou a célula é uma célula de murganho e em que a inserção do DNA da cadeia pesada humana num genoma de murganho entre as coordenadas 114667091 e 114655190 do cromossoma 12 de murganho (as coordenadas referem-se a NCBI m37, April 2007 ENSEMBL release 55.37h para a estirpe de murganho C57BL/6J).
5. Uma célula ou mamífero de acordo com as reivindicações 1-3 em que o genoma da célula ou mamífero é modificado para prevenir ou reduzir a expressão de anticorpos totalmente específicos da espécie hospedeira, 6 ΡΕ2421357 facultativamente em que o genoma de mamífero não humano é modificado por inversão da totalidade ou de parte da região VDJ ou da região VJ de mamífero não humano.
6. Uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-5 que é uma células ES, célula estaminal hematopoiética ou célula iPS capaz de se multiplicar para dar origem a um mamífero não humano, ou capaz de contribuir para tecidos e órgãos de um mamífero não humano, o mamífero sendo capaz de produzir um reportório de anticorpos ou cadeias de anticorpos que são quiméricos, os referidos anticorpos ou cadeias quiméricas tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana.
7. Uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-5 que é uma célula produtora de anticorpos .
8. Uma célula ou mamífero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo o DNA da região variável humana de pelo menos uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana.
9. Uma célula ou mamífero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o genoma da célula não compreende o DNA da região constante de uma outra célula ou organismo.
10. Uma célula ou mamífero de acordo com 7 ΡΕ2421357 qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo uma sequência de mudança de isotipo de rato.
11. Uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-10 que está imortalizada.
12. Uma célula de acordo com a reivindicação 11 que é uma célula produtora de anticorpos imortalizada através da fusão com uma célula de tumor para proporcionar uma célula e uma linha celular produtora de anticorpos, ou produzida por imortalização celular directa.
13. Um método para a produção de um anticorpo ou cadeia pesada ou leve de anticorpo especifico de um antigénio de interesse, o método compreendendo imunização de um mamífero não humano como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores com o antigénio de interesse e recuperação do anticorpo ou da cadeia de anticorpo ou recuperação de uma célula produtora do anticorpo ou da cadeia pesada ou leve.
14. Um mamífero ou célula não humano, ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 ou 5-13 em que o mamífero ou célula não humano é um murganho ou célula de murganho, respectivamente.
15. Um método para a produção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo totalmente humanizada compreendendo a imunização de um mamífero não humano de acordo com qualquer ΡΕ2421357 uma das reivindicações 1, 3-5, 8-10 e 14 e depois substituição da região constante de um anticorpo de mamifero não humano ou cadeia de anticorpo quimérica especificamente reactiva com o antigénio com uma região constante humana, facultativamente através da manipulação genética do ácido nucleico codificador do anticorpo ou cadeia de anticorpo quimérica. Lisboa, 11 de abril de 2013