ES2965212T3 - Modelos de animales y moléculas terapéuticas - Google Patents

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Abstract

La invención describe métodos para la generación de anticuerpos quiméricos humanos - no humanos y cadenas de anticuerpos quiméricos, anticuerpos y cadenas de anticuerpos así producidos, y derivados de los mismos, incluidos anticuerpos completamente humanizados; composiciones que comprenden dichos anticuerpos, cadenas de anticuerpos y derivados, así como células, mamíferos no humanos y vectores, adecuados para su uso en dichos métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Modelos de animales y moléculas terapéuticas
Antecedentes
La presente divulgación se refiere, entre otros, a roedores y células que se modifican por ingeniería genética para que contengan ADN exógeno, tal como ADN de gen de inmunoglobulina humana, a su uso en medicina y al estudio de enfermedades, a métodos para la producción de roedores y células, y anticuerpos y cadenas de anticuerpos producidos por tales roedores y derivados de los mismos.
Con el fin de solventar los problemas de la humanización de los anticuerpos, una serie de compañías empezaron a generar ratones con sistemas inmunitarios humanos. La estrategia utilizada fue inactivar los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera en células ES y complementar estas lesiones genéticas con transgenes diseñados para que expresen los genes humanos de las cadenas pesada y ligera. Aunque se podían generar anticuerpos completamente humanos, estos modelos tienen varias limitaciones importantes:
(i) El tamaño de los loci de las cadenas pesada y ligera (cada uno de varias Mb) hacía imposible introducir los loci enteros en estos modelos. Como resultado, las líneas transgénicas recuperadas tenían un repertorio muy limitado de regiones V, la mayoría de las regiones constantes estaban ausentes y en los transgenes no se incluyeron regiones potenciadoras importantes distantes.
(ii) La bajísima eficiencia a la hora de generar las líneas transgénicas con una gran inserción y la complejidad y el tiempo necesarios para cruzar cada una de éstas con las cepas que tienen inactivadas las cadenas ligera y pesada y hacerlas de nuevo homocigotas restringió el número de líneas transgénicas que se pudieron analizar en busca de la expresión óptima.
(iii) afinidades de los anticuerpos individuales raramente alcanzaba las que se podían obtener con animales (no transgénicos) intactos.
El documento WO2007117410 describe construcciones quiméricas para expresar anticuerpos quiméricos.
El documento WO2010039900 describe células y mamíferos con genes insertados que tienen un genoma que codifica anticuerpos quiméricos.
La presente divulgación proporciona, entre otros, un procedimiento para la generación en roedores de anticuerpos que comprenden una región variable de Ig humana y, además, proporciona modelos de roedores para generar anticuerpos de este tipo.
Sumario de la Invención
La invención se define en las reivindicaciones 1-14.
Cualquier referencia a mamíferos no humanos y células de mamíferos no humanos en la presente memoria es a roedores y células de roedores, respectivamente.
Realizaciones dirigidas a métodos para la construcción de loci de las cadenas pesada y ligera humanas quiméricas en un mamífero no humano no quedan abarcadas por la redacción de las reivindicacione, sino que se consideran útiles para comprender la invención.
Figuras
Las Figuras 1 - 8 muestran un procedimiento repetitivo para la inserción de una serie de BACs humanos en un locus de Ig de ratón.
Las Figuras 9 - 18 muestran con más detalle el procedimiento de las Figuras 1-8 para el locus de IgH y kappa. Las Figuras 19 y 20 muestran los principios en los que se basa la generación de anticuerpos en ratones quiméricos.
La Figura 21 muestra un posible sitio de inserción para el ADN humano en un cromosoma de ratón.
Las Figuras 22 - 26 describen un procedimiento repetitivo alternativo para la inserción de una serie de BACs humanos en un locus de Ig de ratón.
Las Figuras 27 - 29 ilustran un mecanismo para la inversión de la región VDJ del huésped.
La Figura 30 ilustra la demostración del principio de la inserción de un plásmido utilizando una estrategia RMCE. La Figura 31 ilustra la RMCE secuencial - Integración en una plataforma de integración.
La Figura 32 ilustra la confirmación de la inserción satisfactoria en la superficie de apoyo.
La Figura 33 ilustra la confirmación por PCR del curado del extremo 3'.
La Figura 34 ilustra la inserción del BAC n°1 y el diagnóstico por PCR.
Descripción General
Todas las coordenadas de nucleótidos para el ratón son del NCBI m37, abril de 2007 ENSEMBL versión 55.37h para la cepa C57BL/6J de ratón. Los nucleótidos humanos son de GRCh37, febrero de 2009 ENSEMBL versión 55.37 y los de rata de RGSC 3.4 de diciembre de 2004 ENSEMBL versión 55.34w.
En la presente memoria se describen, pero no son parte de la invención, métodos para la construcción de loci quiméricos de las cadenas ligera y pesada humanas en un roedor, por ejemplo un ratón. La referencia al trabajo con ratones en la presente memoria se hace tan solo a modo de ejemplo, y la referencia a los ratones se toma para incluir la referencia a todos los roedores, a menos que resulte de otro modo evidente a partir de la divulgación, en donde se prefiere que los ratones sean el roedor.
En un aspecto la divulgación, que no es parte de la invención, se refiere a un mamífero no humano, cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped; y
(b) opcionalmente una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la
cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped y/o una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda del mamífero no humano huésped;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
En un aspecto adicional, que no es parte de la invención, la divulgación se refiere a un mamífero no humano, cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera
kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped y/o una pluralidad de regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda del mamífero no humano huésped; y
(b) opcionalmente una o varias regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones
J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Opcionalmente, el genoma del mamífero no humano está modificado para impedir la expresión de los anticuerpos completamente específicos de la especie del huésped.
Los genes humanos insertados pueden proceder del mismo individuo o de diferentes individuos, o pueden ser sintéticos o representar secuencias consenso humanas.
Aunque el número de regiones V, D y J es variable entre los individuos humanos, en un aspecto se considera que hay 51 genes V humanos, 27 genes D y 6 genes J en la cadena pesada, 40 genes V humanos y 5 genes J en la cadena ligera kappa y 29 genes V humanos y 4 genes J en la cadena ligera lambda (Janeway y Travers, Immunobiology, Tercera edición).
El locus de la cadena pesada humana que se ha insertado en el mamífero no humano contiene el repertorio completo de regiones V, D y J humanas, las cuales están en el genoma en disposición funcional con las regiones constantes del roedor, de tal forma que los anticuerpos quiméricos funcionales se pueden producir entre las regiones variables humanas y las regiones constantes del roedor. Todo este material genético insertado de la cadena pesada humana se denomina en la presente memoria la región VDJ de IgH humana, y comprende ADN de un genoma humano que codifica todos los exones que codifican las porciones V, D y J humanas y convenientemente también los intrones asociados. De manera similar, la referencia a las regiones V y J de la cadena ligera kappa de Ig humana en la presente memoria se refiere al ADN humano que comprende todos los exones que codifican las regiones V y J y convenientemente también los intrones asociados del genoma humano. La referencia a las regiones V y J de la cadena ligera lambda de Ig humana en la presente memoria se refiere al ADN humano que comprende todos los exones que codifican las regiones V y J y convenientemente también los intrones asociados del genoma humano.
Las regiones variables humanas están insertadas aguas arriba de la región constante del roedor, en donde este último comprende todo el ADN necesario para codificar la región constante completa o una porción suficiente de la región constante que permite la formación de un anticuerpo quimérico eficaz que es capaz de reconocer específicamente un antígeno.
En un aspecto, los anticuerpos o cadenas de anticuerpo quiméricos tienen una parte de una región constante del huésped que es suficiente para proporcionar una o varias funciones efectoras que se observan en los anticuerpos que se producen de forma natural en un mamífero huésped, por ejemplo son capaces de interactuar con los receptores de Fc, y/o fijarse al complemento.
Por lo tanto, en la presente memoria, la referencia a un anticuerpo o cadena de anticuerpo quimérico que tiene una región constante del huésped roedor no se limita a la región constante completa, sino que también incluye anticuerpos quiméricos o cadenas que tienen toda la región constante del huésped, o una parte de la misma suficiente para proporcionar una o más funciones efectoras. Esto también se aplica a las células de roedores y a los métodos descritos en la presente memoria en los cuales el ADN de la región variable humana puede insertarse en el genoma del huésped de tal manera que forma una cadena de anticuerpo quimérico con toda o parte de una región constante del huésped. En un aspecto, toda la región constante del huésped está enlazada operativamente al ADN de la región variable humana.
La región constante del roedor huésped en la presente memoria es preferiblemente la región constante endógena de tipo salvaje del huésped localizada en el locus de tipo salvaje, como convenga para la cadena ligera o pesada. Por ejemplo, el ADN de la cadena pesada humana está insertado convenientemente en el cromosoma 12 de ratón, convenientemente adyacente a la región constante de la cadena pesada de ratón.
En un aspecto, la inserción del ADN humano, tal como la región VDJ humana, está fijada como objetivo a la región entre el exón J4 y el locus Cg del locus de IgH del genoma de ratón, y en un aspecto está insertado entre las coordenadas 114.667.090 y 114.665.190, convenientemente en la coordenada 114.667.091. En un aspecto, la inserción del ADN humano, tal como el de VJ de la cadena ligera kappa humana, está integrado en el cromosoma 6 de ratón entre las coordenadas 70.673.899 y 70.675.515, convenientemente en la posición 70.674.734, o una posición equivalente en el locus lambda de ratón en el cromosoma 16.
En un aspecto, la región constante de mamífero no humano huésped para formar el anticuerpo quimérico puede estar en un locus cromosómico diferente (no endógeno). En este caso, el ADN humano insertado, tal como la región o regiones variables VDJ o VJ humanas, se puede insertar entonces en el genoma no humano en un sitio que es distinto del sitio en el que está de forma natural la región constante de las cadenas pesada o ligera. La región constante nativa se puede insertar en el genoma, o duplicar dentro del genoma, en un locus cromosómico diferente al de la posición nativa, de tal forma que se encuentra en una disposición funcional con la región variable humana de tal forma que aún se pueden producir los anticuerpos quiméricos.
En un aspecto, el ADN humano se inserta en la región constante endógena de tipo salvaje del huésped ubicada en el locus de tipo salvaje entre la región constante del huésped y la región VDJ del huésped.
La referencia a que la región variable se ubica aguas arriba de la región constante del roedor significa que existe una ubicación relativa adecuada de las dos porciones de anticuerpo, variable y constante, para permitir que las regiones variable y constante formen un anticuerpo o cadena de anticuerpo quiméricoin vivoen el mamífero. Por lo tanto, el ADN humano insertado y la región constante del huésped se encuentran en una disposición funcional una respecto a la otra que permite la producción de anticuerpos o cadenas de anticuerpos.
En un aspecto, el ADN humano insertado es capaz de expresarse con diferentes regiones constantes del huésped por medio del cambio de isotipo. En un aspecto, el cambio de isotipo no requiere o no implica el cambio en trans. La inserción del ADN de la región variable humana en el mismo cromosoma que la región constante relevante del huésped significa que no hay necesidad de cambiar en trans para producir el cambio de isotipo.
Tal y como se explicó más arriba, los loci transgénicos utilizados para los modelos de la técnica anterior fueron de origen humano, por lo tanto incluso en los casos en los que los transgenes eran capaces de complementar el locus de ratón de modo que los ratones produjeran linfocitos B productoras de anticuerpos completamente humanos, las afinidades de los anticuerpos individuales raramente alcanzaron la que se podía obtener en los animales intactos (no transgénicos). La razón principal de esto (además del repertorio y los niveles de expresión descritos más arriba) es el hecho de que los elementos de control del locus son humanos. Por lo tanto, están comprometidos los componentes de señalización, por ejemplo para activar la hiper-mutación y la selección de anticuerpos de alta afinidad.
Por el contrario, en la presente divulgación se mantienen las regiones constantes del roedor huésped y se prefiere que al menos un potenciador del mamífero no humano u otra secuencia de control, tal como una región de cambio, se mantengan en la disposición funcional con la región constante del roedor, de tal forma que el efecto del potenciador o de otra secuencia de control, tal y como se observa en el mamífero huésped, se ejerce en todo o en parte del animal transgénico.
La estrategia anterior está diseñada para permitir la formación de toda la diversidad del locus humano a ser muestreado, para permitir los mismos niveles de expresión elevados que se conseguirían mediante las secuencias de control del mamífero no humano, tales como los potenciadores, y es tal que la señalización en las células B, por ejemplo el cambio de isotipo utilizando los sitios de recombinación para el cambio, seguiría utilizando las secuencias del mamífero no humano.
Un mamífero no humano con un genoma de este tipo produciría anticuerpos quiméricos con las regiones variable humana y constante del roedor, pero éstas podrían humanizarse con facilidad, por ejemplo, en una etapa de clonación. Además, la eficaciain vivode estos anticuerpos quiméricos podría evaluarse en estos mismos animales.
En un aspecto, la región VDJ de IgH humana insertada comprende, en la configuración de la línea germinal, todas las regiones V, D y J y las secuencias intermedias de un ser humano.
En un aspecto, 800-1000 kb de la región VDJ de IgH humana están insertados en el locus de IgH del mamífero no humano y, en un aspecto, está insertado un fragmento de 940, 950 o 960 kb. Convenientemente, esto incluye las bases de 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano (todas las coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano, versión 54 del ENSEMBL, y NCBIM37 para el genoma de ratón, que se refiere a la cepa de ratón C57BL/6J).
En un aspecto, el fragmento de IgH humana insertado consiste en las bases 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14. En un aspecto, el ADN de la cadena pesada humana insertado, tal como el ADN que consiste en las bases 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14, está insertado en el cromosoma 12 de ratón entre el extremo de la región J4 de ratón y la región Ep, convenientemente entre las coordenadas 114.667.091 y 114.665.190, convenientemente en la coordenada 114.667.091.
La inserción VJ de la cadena ligera humana comprende solo los agrupamientos proximales de los segmentos V y de los segmentos J. Una inserción de este tipo tendría aproximadamente 473 kb.
En un aspecto, cuando está presente, la región VJ lambda humana comprende, en la configuración de la línea germinal, todas las regiones V y J y las secuencias intermedias de un ser humano.
Convenientemente, esto incluye bases análogas a las seleccionadas del fragmento kappa del cromosoma 2 humano.
Todos los fragmentos humanos específicos descritos más arriba pueden variar de longitud y pueden, por ejemplo, ser más largos o más cortos de lo que se ha definido más arriba, tal como 500 bases, 1 KB, 2 K, 3 K, 4 K, 5 KB, 10 KB, 20 KB, 30 KB, 40 KB o 50 KB o más, que convenientemente comprenden toda o parte de la región V(D)J humana, al tiempo que conservan preferiblemente el requisito de que la inserción final comprenda el material genético humano que codifica toda la región de la cadena pesada y toda la región de la cadena ligera, cuando sea apropiado, como se describe más arriba.
En un aspecto, el extremo 5' de la inserción humana descrito más arriba aumenta en longitud. En los casos en los que se genera la insercción de una manera escalonada, entonces el aumento de longitud se produce generalmente aguas arriba del clon (en 5').
En un aspecto, el extremo 3' del último gen humano insertado, por lo general el último gen J humano que se ha de insertar, tiene menos de 2 kb, preferiblemente menos de 1 kb, desde la región de unión ser humano-ratón.
En un aspecto, el mamífero no humano comprende algo o toda la región VJ de la cadena ligera humana como se describe en la presente memoria, pero no la región VJ de la cadena ligera lambda humana.
En un aspecto adicional, el genoma comprende una inserción de los genes V, D (solo de la cadena pesada) y J tal y como se describe en la presente memoria en el locus de la cadena pesada y en un locus de la cadena ligera, o en el locus de la cadena pesada y en ambos loci de las cadenas ligeras. Preferiblemente, el genoma es homocigoto en uno, o ambos, o los tres loci.
En otro aspecto, el genoma puede ser heterocigoto en uno o más de los loci, tal como heterocigoto para el ADN que codifica una cadena de anticuerpo quimérico y una cadena de anticuerpo nativo (de la célula huésped).
En un aspecto, el genoma puede ser heterocigoto para el ADN capaz de codificar 2 cadenas de anticuerpo diferentes, por ejemplo, puede comprender 2 cadenas pesadas quiméricas diferentes o 2 cadenas ligeras quiméricas diferentes.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un mamífero no humano o célula, y a métodos para producir dicho mamífero o célula, tal y como se describe en la presente memoria, en donde el ADN humano insertado, tal como la región VDJ de la IgH y/o las regiones V y J de la cadena ligera, ambas humanas, se encuentran en solo un alelo y no en ambos alelos del mamífero o de la célula. En este aspecto, un mamífero o célula tiene el potencial de expresar tanto una cadena ligera o pesada de anticuerpo endógena huésped como una cadena ligera o pesada quimérica.
En un aspecto adicional, el ADN humano insertado, tal como la región VDJ de la IgH y/o las regiones VJ de la cadena ligera, ambas humanas, se pueden insertar de tal forma que estén enlazadas operativamente en el genoma con una región constante de un roedor, tal como una secuencia de rata.
Otras especies que no sean humanas ni murinas, de las cuales se pueden utilizar elementos del ADN en la presente invención, incluyen conejos, llamas, dromedarios, alpacas, camellos y tiburones.
El enlace operativo permite convenientemente la producción de un anticuerpo cuya cadena ligera o pesada comprende la región variable humana.
En otro aspecto, se proporciona una célula, o un mamífero no humano, cuyo genoma comprende: una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de toda o parte de la región constante lambda humana.
Convenientemente, las regiones VJ y C de la cadena ligera son capaces de formar cadenas de anticuerpo in vivo capaces de reaccionar específicamente con un antígeno.
En un aspecto de la divulgación hay una secuencia codificante no humana en la región de la cadena ligera insertada. En aspectos de este tipo, una región kappa humana, opcionalmente con una región lambda humana se inserta en el genoma, en combinación con la inserción de la región VDJ de la cadena pesada o parte de la misma, aguas arriba de la región constante de la cadena pesada del huésped tal y como se describe en la presente memoria.
Por lo tanto, la célula o mamífero no humano de la divulgación, que no forma parte de la invención, puede comprender: (a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped; y
(b) una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de toda o parte de la región constante kappa no humana, en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos que tienen una cadena de anticuerpos que comprenden una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
La célula o mamífero no humano de la divulgación, que no forma parte de la invención, puede comprender:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped; y
una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano; y
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos que tienen una cadena de anticuerpo que comprende una región constante de mamífero no humano y una región variable humana. En un aspecto, las secuencias de VJC del mamífero no humano huésped pueden inactivarse de algún modo, por mutación o inversión, o por inserción del ADN de la región variable humana, o por otros medios.
En un aspecto, una o varias de las secuencias de control del mamífero no humano, tal como la secuencia o secuencias del potenciador, se mantienen aguas arriba de la región constante de Mu del roedor, convenientemente en su posición nativa con respecto a la distancia que la separa de la región constante.
En un aspecto, una o varias secuencias de control del mamífero no humano, tal como una secuencia o secuencias del potenciador, se mantienen aguas abajo de la región constante de Mu del roedor, convenientemente en su posición nativa con respecto a la distancia que la separa de la región constante.
En un aspecto, una secuencia de cambio del mamífero no humano, convenientemente la secuencia de cambio endógena, se mantiene aguas arriba de la región constante de Mu del roedor, convenientemente en su posición nativa con respecto a la distancia que la separa de la región constante.
En una localización de este tipo, las secuencias de potenciador del huésped o de cambio son operativas in vivo con la secuencia o secuencias de la región constante del huésped.
En un aspecto, una secuencia de cambio no es ni humana ni nativa en el mamífero no humano, por ejemplo, en un aspecto, una secuencia de cambio de mamífero no humano no es una secuencia de cambio de ratón ni humana. La secuencia de cambio puede ser, por ejemplo, una secuencia de roedor o de primate, o una secuencia sintética. En particular, la secuencia de cambio puede ser una secuencia de rata, en donde el mamífero no humano es un ratón. A modo de ejemplo, una secuencia mu constante de ratón o ser humano puede colocarse bajo el control de una secuencia de cambio de una rata o de un chimpancé u otra secuencia de cambio, convenientemente capaz de permitir que se produzca in vivo el cambio de isotipo.
La célula o mamífero no humano de la divulgación puede, por lo tanto, comprender una secuencia de cambio de mamífero humano o no humano y una región o regiones potenciadoras de mamífero humano o no humano. Preferiblemente, las secuencias de control son capaces de dirigir la expresión o, de lo contrario, controlar la producción de anticuerpos que comprenden una región constante con la que se asocian. Una combinación contemplada es un cambio de rata con secuencias potenciadoras de ratón y regiones constantes de ratón en una célula de ratón.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un roedor, que comprende un locus de la cadena pesada o de la cadena ligera de la inmunoglobulina que tiene ADN de 3 o más especies. Por ejemplo, el roedor puede comprender ADN de la región constante de la célula huésped, secuencias codificantes de V, D o J humanas de acuerdo con las reivindicaciones y una o varias regiones de ADN que no son ni humanas ni del huésped y que son capaces de controlar una región del locus de la inmunoglobulina, tal como una secuencia de cambio, promotor o potenciador que es capaz de controlar la expresión o el cambio del isotipo in vivo del ADN de la Ig. En un aspecto, el roedor es un ratón y comprende adicionalmente ADN humano del locus de la Ig humana y adicionalmente una secuencia de ADN que no es de ratón, tal como una secuencia de ADN de rata, capaz de regular el ADN de ratón o humano.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un un roedor, que comprende un locus de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina que tiene ADN de 2 o más genomas humanos diferentes. Por ejemplo, podría comprender secuencias V(D)J de la cadena pesada de más de un genoma humano dentro de una cadena pesada o ligera, o ADN de VDJ de la cadena pesada de un genoma y secuencias VJ de la cadena ligera de un genoma diferente.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un roedor que comprende un locus de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, o parte de la misma, que tiene ADN de 2 o más especies, en que una especie contribuye con una región no codificante tal como una región reguladora, y la otra especie codifica regiones tales como las regiones V, D, J o constantes.
En un aspecto, el promotor humano y/o los otros elementos de control que están asociados a las diferentes regiones V, D o J humanas se mantienen en el genoma de ratón.
En otro aspecto, uno o varios de los elementos promotores, u otros elementos de control, de las regiones humanas, tal como las regiones V humanas, están optimizados para interactuar con la maquinaria transcripcional de un roedor.
Convenientemente, una secuencia codificante humana puede estar colocada bajo el control de un promotor adecuado de mamífero no humano, lo que permite que el ADN humano se transcriba con eficacia en la célula animal no humana adecuada. En un aspecto, la región humana es una secuencia que codifica la región V humana, y la región V humana se coloca bajo el control de un promotor del mamífero no humano.
El reemplazo funcional del promotor o de otras regiones de control humanas por el promotor o por las regiones de control del mamífero no humano puede llevarse a cabo mediante el uso de ingeniería de recombinación, u otras tecnologías de ADN recombinante, para insertar una parte de la región de Ig humana (tal como una región V humana) en un vector (tal como BAC) que contiene una región de Ig no humana. La técnica recombinante/de ingeniería de recombinación reemplaza convenientemente una porción del ADN no humano (p. ej., de ratón) con la región de Ig humana y, por lo tanto, coloca la región de Ig humana bajo el control del promotor o de otra región de control del mamífero no humano. Convenientemente, la región codificante humana de una región V humana reemplaza una secuencia codificante de la región V de ratón. Convenientemente, la región codificante humana de una región D humana reemplaza una secuencia codificante de la región D de ratón. Convenientemente, la región codificante humana de una región J humana reemplaza una secuencia codificante de la región J de ratón. De este modo, las regiones V, D o J humanas pueden colocarse bajo el control de un promotor de mamífero no humano, tal como un promotor de ratón.
En un aspecto, el único ADN humano insertado en la célula de mamífero no humano o el animal son las regiones codificantes V, D o J, y éstas se colocan bajo el control de las secuencias reguladoras del huésped u otras secuencias (no humanas no del huésped). En un aspecto, la referencia a regiones codificantes humanas incluye tanto intrones como exones humanos o, en otro aspecto, simplemente exones y no intrones, que pueden estar en forma de ADNc.
Alternativamente, es posible utilizar la ingeniería de recombinación, u otras tecnologías de ADN recombinante, para insertar un promotor u otra región de control de mamífero no humano (p. ej., ratón), tal como un promotor para una región V, en un BAC que contiene una región de Ig humana. A continuación, la etapa de ingeniería de recombinación coloca una porción del ADN humano bajo el control del promotor u otra región de control de ratón.
En un aspecto, el repertorio completo de fragmentos V, D o J en la orientación de la línea germinal puede insertarse aguas arriba de una región constante del huésped y en disposición funcional con ella.
Así pues, la presente divulgación, que no forma parte de la invención reivindicada, permite la inserción de regiones V y/o D y/o J humanas, o de cualquier especie, en un cromosoma de una célula de una especie diferente que comprende una región constante, lo que permite expresar una cadena quimérica de anticuerpo.
En un aspecto de la divulgación, el ADN de la región variable lambda humana puede estar insertado aguas arriba del locus endógeno, o aguas abajo en un cromosoma diferente al del locus endógeno, y estar insertado con o sin el ADN de la región constante.
Por lo general, se prefiere la inserción del ADN de la región variable humana en o cerca del locus endógeno equivalente en el genoma del receptor, por ejemplo, dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 kb del borde (aguas arriba o aguas abajo) de un locus de inmunoglobulina del huésped.
Por lo tanto, en un aspecto de la divulgación, que no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, pero que se considera útil para comprender la invención, puede referirse a una célula o mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped; y
(b) una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig humana, y/o una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas ligeras o pesadas quiméricas, que tienen una región constante del mamífero no humano y una región variable humana.
En un aspecto particular, que no está abarcado por la redacción de las reivindicaciones, pero que se considera útil para comprender la invención, el genoma de la célula o mamífero no humano comprende:
una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped;
una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped; y
una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas abajo de la región constante lambda del mamífero no humano huésped,
opcionalmente en las que la región variable lambda humana puede estar insertada aguas abajo del locus endógeno lambda del huésped en unión operativa con una región constante lambda humana, de tal forma que el mamífero no humano o la célula pueden producir cadenas ligeras de anticuerpo completamente humanas y cadenas pesadas quiméricas.
El uso de los métodos descritos en la presente memoria permite construir un locus de manera escalonada mediante inserciones secuenciales y, por lo tanto, garantiza la inserción del ADN de la región variable humana junto con el ADN de la región constante humana o no humana en cualquier posición adecuada del genoma de una célula huésped no humana. Por ejemplo, los métodos de la divulgación se pueden utilizar para insertar ADN de la región variable de inmunoglobulina humana junto con ADN de la región constante del genoma del huésped en cualquier lugar del genoma de una célula huésped no humana, lo que permite producir una cadena de anticuerpo quimérica desde un sitio diferente al de la región pesada endógena. Cualquier construcción de ADN de la cadena ligera o de la cadena pesada humana contemplada más arriba se puede insertar en cualquier posición deseada del genoma de una célula huésped no humana mediante las técnicas descritas en la presente memoria. Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a roedores que tienen genomas que comprenden inserciones de este tipo.
La divulgación, que no forma parte de la invención reivindicada, también se refiere a unvector, tal como un BAC, que comprende una región V, D o J humana en una disposición funcional con un promotor, u otra secuencia de control, de mamífero no humano de tal forma que la expresión de la región V, D o J humana se encuentra bajo el control del promotor de mamífero no humano en una célula del mamífero no humano, tal como una célula ES, en particular una vez insertado en el genoma de esa célula.
La divulgación también se refiere a células y a roedores que contienen células, en donde dichas células o mamíferos tienen una región V, D o J humana en una disposición funcional con un promotor de mamífero no humano, u otra secuencia de control, de tal forma que la expresión de la región V, D o J humana está bajo el control del promotor del mamífero no humano en el roedor.
Por lo general, un aspecto de la divulgación, que no forma parte de la invención reivindicada, es una célula huésped de mamífero no humano capaz de expresar una secuencia codificante de V, D o J humana bajo el control de un promotor o región de control del huésped, en donde la expresión es capaz de producir un anticuerpo humanizado que tiene un dominio variable humano y una región constante del mamífero no humano.
En un aspecto, que no forma parte de la invención reivindicada, la divulgación se refiere a una célula, tal como una célula de no mamífero, tal como una célula ES, cuyo genoma comprende
a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped; y
b) opcionalmente, una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped y/o una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda del mamífero no humano huésped.
En otro aspecto, que no forma parte de la invención reivindicada, la divulgación se refiere a una célula, tal como células de mamífero no humano, tal como células ES, cuyo genoma comprende
(a) una pluralidad de regiones V de la cadena ligera kappa de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped y/o una pluralidad de regiones V de la cadena ligera lambda de Ig humana y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda del mamífero no humano huésped; y
(b) opcionalmente, una o varias regiones V de IgH humana, una o varias regiones D humanas y una o varias regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano huésped.
En un aspecto, la célula es una célula ES capaz de desarrollarse en un roedor capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, en donde dichos anticuerpos quiméricos tienen una región constante de roedor y una región variable humana. Opcionalmente, el genoma de la célula está modificado para impedir la expresión de anticuerpos completamente específicos para la especie huésped.
La divulgación, que no forma parte de la invención reivindicada, se refiere también a una línea celular que crece, o que cuanto menos se deriva como las descritas en la presente memoria, que incluye una línea celular inmortalizada. La línea celular puede comprender genes V, D o J humanos insertados tal y como se describe en la presente memoria, bien en la configuración de la línea germinal o después de la reorganización tras la maduración in vivo. La célula se puede inmortalizar mediante la fusión a una célula tumoral para proporcionar una célula y una línea celular productora de anticuerpos, o se puede realizar mediante inmortalización celular directa.
La divulgación, que no forma parte de la invención reivindicada, se refiere también a vectores para uso en la divulgación. En un aspecto, vectores de este tipo son BACs (siglas inglesas de cromosomas artificiales bacterianos). Se apreciará que en la divulgación se pueden utilizar otros vectores de clonación y, por consiguiente, la referencia a los BACs en la presente memoria puede tomarse como referencia general a cualquier vector adecuado.
En un aspecto, los BACs utilizados para la generación de ADN humano a insertar, tal como las regiones VDJ o VJ, están recortados, de tal forma que no se duplica ni se pierde secuencia final alguna de la región VDJ o VJ humana, ni parte alguna de la misma, en el mamífero no humano cuando se compara con la secuencia genómica humana original.
En un aspecto, que no forma parte de la invención reivindicada, la divulgación se refiere también a un vector que comprende una inserción, preferiblemente que comprende una región de ADN humano de alguno de los locus VDJ o VJ humanos, flanqueado por ADN que no es de ese locus. El ADN flanqueante puede comprender uno o más marcadores seleccionables o uno o varios sitios de recombinación específica del sitio. En un aspecto, el vector comprende 2 o más, tal como 3, sitios de recombinación específica del sitio, heteroespecíficos e incompatibles. En un aspecto, los sitios de recombinación específica del sitio pueden ser sitios loxP, o variantes de los mismos, o sitios FRT o variantes de los mismos. En un aspecto, el vector comprende una o varias secuencias ITR (siglas inglesas de repetición terminal invertida) de transposones.
En un aspecto, los roedores de la divulgación no producen convenientemente anticuerpos completamente humanizados alguno. En un aspecto, esto es porque no hay insertado ADN de la región constante humana. Alternativamente, no hay ADN de la región constante humana en el genoma capaz de formar un anticuerpo junto con el componente insertado de ADN de la región variable humana, por ejemplo, debido a alguna mutación dentro de algún ADN de la región constante humana, o a la distancia entre el ADN de la región constante humana y el ADN de la región variable humana.
En un aspecto, el ADN de la región constante de la cadena ligera humana puede estar incluido en el genoma de la célula, de tal forma que podría generarse una cadena de anticuerpo humano lambda o kappa completamente humana, pero ésta solo sería capaz de formar un anticuerpo con una cadena pesada quimérica y no produciría un anticuerpo completamente humano con las regiones constante y variable humanas.
En un aspecto, el genoma del mamífero no humano está modificado para impedir la expresión de los anticuerpos completamente específicos de la especie huésped. Anticuerpos completamente específicos de la especie huésped son anticuerpos que tienen regiones variables y constantes del organismo huésped. En este contexto, el término 'específico' no pretende referirse a la unión de los anticuerpos producidos por las células o animales de la divulgación, sino más bien al origen del ADN que codifica estos anticuerpos.
En un aspecto, el genoma del mamífero no humano está modificado para impedir la expresión de los anticuerpos nativos (completamente específicos de la especie huésped) en el mamífero mediante la inactivación de todo o parte de los loci de Ig del mamífero no humano huésped. En un aspecto, esto se consigue mediante la inversión de toda o parte de la región VDJ, o de la región VJ del mamífero no humano, opcionalmente mediante la inserción en el genoma de uno o varios sitios recombinasa específica del sitio y, entonces, utilizar estos sitios para la escisión o la inversión, mediada por la recombinasa, de todo o parte del locus de Ig del mamífero no humano. En un aspecto se puede emplear una inversión doble, la primera para retirar las V(D)Js del locus endógeno y, luego, una inversión más local que las pone en la orientación correcta. En un aspecto se utiliza un único sitioloxPpara invertir la región VDJ del mamífero no humano en un locus centromérico o en un locus telomérico.
En un aspecto el genoma de mamífero no humano en el cual se inserta el ADN humano comprende regiones V, (D) y J endógenas, y las secuencias endógenas no se han eliminado.
La divulgación comprende un método para la inserción de múltiples fragmentos de ADN en una diana de ADN, convenientemente para formar una inserción contigua en la cual los fragmentos insertados quedan unidos directamente sin secuencias interpuestas. El método es especialmente aplicable a la inserción de un fragmento grande de ADN en un cromosoma del huésped que se puede llevar a cabo de manera escalonada.
En un aspecto, el método comprende la inserción de una primera secuencia de ADN en una diana, en donde la secuencia tiene una porción de vector de ADN y una primera secuencia de interés (X1); la inserción de una segunda secuencia de ADN en la porción del vector de la primera secuencia, teniendo la segunda secuencia de ADN una segunda secuencia de interés (X2) y una segunda porción de vector; y luego la escisión de cualquier ADN con secuencia de vector que separa X1 y X2 para proporcionar una secuencia X1X2 contigua, o X2X1, dentro de la diana. Opcionalmente, hay una inserción de una o varias secuencias de ADN, en donde cada secuencia de ADN tiene una secuencia adicional de interés (X3, ...) y una porción de vector adicional, en la porción del vector de la secuencia de ADN precedente, para construir un fragmento de ADN contiguo en la diana.
La diana de ADN para la inserción de la primera secuencia de ADN puede ser un sitio específico o cualquier punto del genoma de una célula particular.
En la presente memoria se describe el método general en relación con la inserción de elementos de la región VDJ humana, pero es aplicable a la inserción de cualquier región de ADN, de cualquier organismo y, en particular, a la inserción de fragmentos grandes de ADN de > 100 kb, tal como de 100 a 250 kb, o incluso más grandes, tal como la de TCR o HLA. Las características y las estrategias descritas en la presente memoria con respecto a la inserción de VDJ pueden aplicarse igualmente a cualquiera de los métodos descritos.
En un aspecto, el ADN insertado es ADN humano, tal como la región VDJ o VJ humana, se construye en el genoma de una célula, tal como una célula ES, de una manera escalonada, utilizando 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 o más inserciones separadas para cada región de la cadena pesada o de la cadena ligera. Los fragmentos se insertan convenientemente en el mismo, o sustancialmente el mismo, locus de la célula, p. ej., locus de células ES, uno tras otro, para formar la región VDJ o VJ completa, o parte de la misma. La presente divulgación se refiere también a células ES y a animales no humanos que comprenden intermedios en el proceso, cuyos genomas pueden comprender solo una región VDJ parcial, tal como solo el ADN de la región variable humana.
En un aspecto adicional, el método para producir un mamífero no humano transgénico comprende la inserción de regiones VDJ o VJ humanas aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped mediante la inserción escalonada de múltiples fragmentos por recombinación homóloga, preferiblemente utilizando un proceso repetitivo. Convenientemente, se insertan fragmentos de aproximadamente 100 kb de los locus VDJ y VJ humanos, convenientemente para formar parte, o toda, la región VDJ o VJ después de la repetición final del proceso de inserción, tal y como se describe en la presente memoria.
En un aspecto, el proceso de inserción comienza en un sitio en el cual se ha insertado un casete de iniciación en el genoma de una célula, tal como una célula ES, lo que proporciona una única región fijadora de objetivo. En un aspecto, el casete de iniciación se inserta en el locus de la cadena pesada del mamífero no humano, para usarlo en la inserción del ADN de la cadena pesada humano. De manera similar se inserta un casete de iniciación en el locus de la cadena ligera del mamífero no humano, para uso en la inserción del ADN de VJ de la cadena ligera humana. El casete de iniciación comprende convenientemente una secuencia de la cadena principal del vector con la cual un vector que contiene un fragmento de ADN humano en la misma secuencia de la cadena principal puede recombinarse para insertar el ADN humano en el genoma de la célula (p. ej., célula ES), y convenientemente, un marcador de selección, tal como un marcador de selección negativa. Convenientemente, la secuencia de la cadena principal del vector es la de una colección de BAC, para permitir utilizar los BACs en la construcción de las células ES y de los mamíferos. Sin embargo, la secuencia de la cadena principal del vector puede ser cualquier secuencia que sirva como un sitio diana en el cual puede insertarse una secuencia homóloga, por ejemplo, mediante recombinación homóloga y RMCE, y es preferiblemente un ADN que no codifica región constante o VDJ alguna.
En un aspecto, la inserción del primer fragmento de ADN en un casete de iniciación va seguida de la inserción de un segundo fragmento de ADN en una porción del primer fragmento de ADN, convenientemente una parte de la cadena principal del vector del segundo fragmento de ADN. En un aspecto, un fragmento de ADN insertado comprende una parte de la región VDJ humana flanqueada por secuencias en 5' y/o 3' que no son de la región VDJ humana. En un aspecto, las secuencias flanqueantes en 5' y/o 3' pueden contener cada una uno o varios marcadores de selección, o bien pueden ser capaces de crear un sistema de selección una vez insertadas en el genoma. En un aspecto, una o ambas secuencias flanqueantes se pueden retirar del genoma in vitro, o in vivo, después de la inserción. En un aspecto, el método comprende la inserción de un fragmento de ADN seguido de la selección de ambos extremos 5' y 3' del fragmento insertado que flanquea el ADN de VDJ humano. En un aspecto, la inserción repetitiva se realiza mediante la inserción de fragmentos de ADN en el extremo 5' del fragmento insertado previamente y, en este aspecto, puede haber una deleción in vivo del ADN del vector que separa las secuencias insertadas del ADN humano para proporcionar una secuencia contigua de ADN humano.
En un aspecto, la inserción del ADN de VDJ humano en un genoma puede lograrse sin dejar ADN flanqueante alguno en el genoma, por ejemplo, mediante la escisión de ADN mediada por transposasa. Una transposasa adecuada es la transposasa del PiggyBac.
En un aspecto, el primer fragmento de la región variable humana se inserta mediante recombinación homóloga en la secuencia de la cadena principal del casete de iniciación y, luego, el ADN de cualquier marcador de selección negativo y casete de iniciación se retiran posteriormente por recombinación entre las secuencias diana de la recombinasa, tal como FRT, utilizando en este ejemplo, la expresión de FLPasa. Por lo general, las inserciones fijadas como objetivo repetidas en la secuencia de inicio de la cadena principal (p. ej., BAC) y la posterior retirada mediante reorganización entre las secuencias diana de la recombinasa se repiten para construir toda la región VDJ humana aguas arriba de la región constante del no mamífero huésped.
En un aspecto, en el método puede utilizarse un marcador o sistema de selección. El marcador puede generarse tras la inserción de un fragmento de ADN en un genoma, por ejemplo, al formar un marcador de selección junto con un elemento de ADN ya presente en el genoma.
En un aspecto, el genoma de la célula (p. ej., célula ES) no contiene 2 marcadores de selección idénticos al mismo tiempo durante el proceso. Se puede observar que el proceso repetitivo de inserción y selección puede llevarse a cabo utilizando solo 2 marcadores de selección diferentes, como se describe en los ejemplos de la presente memoria y, por ejemplo, el tercer marcador de selección puede ser idéntico al primer marcador, ya que en el momento de insertar el tercer fragmento de vector ya se han eliminado el primer fragmento de vector y el primer marcador.
En un aspecto, hay que confirmar un evento de inserción correcta antes de proseguir a la siguiente etapa de cualquier proceso de clonación multietapa, por ejemplo, mediante la confirmación de la estructura del BAC utilizando matrices genómicas de alta densidad para detectar células ES para identificar las que tienen inserciones de BAC intactas, secuenciación y verificación por PCR.
En un aspecto, el método utiliza la recombinación específica del sitio para la inserción de uno o más vectores en el genoma de una célula, tal como una célula ES. Los sistemas de recombinasa específica del sitio se conocen bien en la técnica y pueden incluir Cre-lox, y FLP/FRT o combinaciones de los mismos, en los cuales la recombinación se produce entre 2 sitios que tienen homología de secuencia.
BACs adecuados se pueden adquirir del Sanger centre, véase “A genome-wide, end-sequenced 129Sv BAC library resource for targeting vector construction”. Adams D. J., Quail M. A., Cox T., van der Weyden L., Gorick B. D., Su Q., Chan W. I., Davies R., Bonfield J. K., Law F., Humphray S., Plumb B., Liu P., Rogers J., Bradley A. Genomics. diciembre de 2005, 86 (6): 753-8. Epub 27 de octubre de 2005. The Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire CB101SA, Reino Unido. BACs que contienen ADN humano también están disponibles, por ejemplo, de Invitrogen. En Osoegawa Ket al.,Genome Research, 2001, 11: 483-496 se describe una colección adecuada.
En un aspecto, un método de la divulgación específicamente comprende:
(1) inserción de un primer fragmento de ADN en una célula ES no humana, conteniendo el fragmento una primera porción del ADN de la región VDJ o VJ humana y una primera porción de vector que contiene un primer marcador de selección;
(2) opcionalmente, deleción de una parte de la primera porción de vector;
(3) inserción de un segundo fragmento de ADN en una célula ES no humana que contiene el primer fragmento de ADN, en donde la inserción se produce dentro de la primera porción de vector, conteniendo el segundo fragmento de ADN una segunda porción de la región VDJ o VJ humana y una segunda porción de vector que contiene un segundo marcador de selección;
(4) deleción del primer marcador de selección y de la primera porción de vector, preferiblemente mediante la acción de una enzima recombinasa;
(5) inserción de un tercer fragmento de ADN en una célula ES no humana que contiene el segundo fragmento de ADN, en donde la inserción se produce dentro de la segunda porción de vector, conteniendo el tercer fragmento de ADN una tercera porción de la región VDJ o VJ humana y una tercera porción de vector que contiene un tercer marcador de selección;
(6) deleción del segundo marcador de selección y una segunda porción de vector; y
(7) repetición de las etapas de inserción y deleción, cuando sea necesario, para el cuarto y posteriores fragmentos de las regiones VDJ o VJ humanas, cuando sea necesario, para producir una célula ES con una parte o toda la región VDJ o VJ humana insertada tal y como se describe en la presente memoria y, convenientemente, retirar todas las porciones de vector dentro del genoma de la célula ES.
En otro aspecto, la divulgacción comprende:
1 inserción de ADN que forma un casete de iniciación en el genoma de una célula;
2 inserción de un primer fragmento de ADN en el casete de iniciación, comprendiendo el primer fragmento de ADN una primera porción de un ADN humano y una primera porción de vector que contiene un primer marcador seleccionable o que genera un marcador de selección tras la inserción;
3 opcionalmente, retirada de parte del ADN del vector;
4 inserción de un segundo fragmento de ADN dentro de la porción del vector del primer fragmento de ADN, conteniendo el segundo fragmento de ADN una segunda porción del ADN humano y una segunda porción de vector, conteniendo la segunda porción de vector un segundo marcador seleccionable, o generando un segundo marcador seleccionable tras la inserción;
5 opcionalmente, retirada de cualquier ADN de vector para permitir que el primer y el segundo fragmento de ADN humano formen una secuencia contigua; y
6 repetición de las etapas de inserción del ADN de VDJ humana y retirada del ADN de vector, cuando sea necesario, para producir una célula con toda o parte de la región VDJ o VJ humana suficiente para ser capaz de generar, junto a una región constante del huésped, un anticuerpo quimérico,
en donde la inserción de uno, o más, o todos los fragmentos de ADN utiliza la recombinación específica del sitio.
En un aspecto, el mamífero no humano es capaz de generar una diversidad de al menos 1 x 106 combinaciones diferentes de secuencias de inmunoglobulinas quiméricas funcionales.
En un aspecto, la fijación de objetivo se realiza en células ES procedentes de la cepa de ratón C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv.
En un aspecto, los animales no humanos, tales como ratones, se generan en un fondo genético deficiente en RAG-1, u otro fondo genético adecuado que impide la producción de linfocitos B y T maduros en el huésped.
En un aspecto, el roedor es un ratón, y las células ES descritas en la presente memoria son células ES de ratón.
Las células ES de la presente invención pueden utilizarse para generar animales utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, que comprenden la inyección de la célula ES en un blastocisto, seguido de la implantación de los blastocistos quiméricos en las hembras para producir una camada que se pueda criar y se pueda seleccionar de ellos los recombinantes homocigotos que tienen la inserción requerida. En un aspecto, la divulgación se refiere a un animal quimérico que comprende un tejido derivado de células ES y un tejido derivado del embrión huésped. En un aspecto, la divulgación se refiere a animales generados después de la alteración genética, que incluye animales que tienen recombinantes homocigotos para las regiones VDJ y/o VJ.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo específico contra un antígeno deseado, comprendiendo el método la inmunización de un mamífero no humano transgénico como anteriormente con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo (véase, p. ej., Harlow, E. y Lane, D., 1998, 5a edición, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY; y Pasqualini y Arap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101: 257-259). Convenientemente, se suministra una cantidad inmunógena del antígeno. La divulgación, que no es parte de la invención, se refiere también a un método para detectar un antígeno diana que comprende detectar un anticuerpo producido como más arriba con un agente de detección secundario que reconoce una porción de ese anticuerpo.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo completamente humanizado que comprende inmunizar un mamífero no humano como más arriba con el antígeno deseado, recuperar el anticuerpo o células que expresan el anticuerpo y, luego, reemplazar la región constante del mamífero no humano por una región constante humana. Esto puede realizarse mediante técnicas de clonación estándares a nivel del ADN para reemplazar la región constante del mamífero no humano por una secuencia de ADN de la región constante humana adecuada -véase, p. ej., Sambrook, J. y Russell, D. (2001, 3a edición) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).
En un aspecto adicional, la divulgación, que no está abarcada por la redacción de las reivindicaciones, pero que se considera útil para comprender la invención, se refiere a anticuerpos y cadenas de anticuerpo humanizados producidos de acuerdo con la presente divulgación, tanto en forma quimérica como en forma completamente humanizada, y al uso de dichos anticuerpos en medicina. La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende anticuerpos de este tipo y un soporte u otro excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las cadenas de anticuerpo que contienen secuencias humanas, tales como las cadenas de anticuerpo quimérico humano-no humano se consideran humanizadas en la presente memoria en virtud de la presencia de las regiones que codifican la proteína humana. Se pueden producir anticuerpos completamente humanizados partiendo del ADN que codifica una cadena de anticuerpo quimérica utilizando técnicas estándares.
Métodos para la generación de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales se conocen bien en la técnica y la presente divulgación se refiere tanto a anticuerpos policlonales como monoclonales de anticuerpos quiméricos o completamente humanizados producidos en respuesta a una prueba de provocación al antígeno en los mamíferos no humanos de la presente divulgación.
Aún en un aspecto adicional, los anticuerpos o cadenas de anticuerpo quiméricos generados en la presente divulgación, pueden manipularse, convenientemente al nivel de ADN, para generar moléculas con propiedades o estructuras similares a las de los anticuerpos, tal como una región variable humana de una cadena ligera o pesada que carece de una región constante, por ejemplo, un dominio de anticuerpo; o una región variable humana con cualquier región constante de cadena pesada o ligera de la misma especie o de diferentes especies; o una región variable humana con una región constante que no se produce en la naturaleza; o una región variable humana junto con cualquier otro participante en la fusión. La divulgación se refiere a todos aquellos derivados de anticuerpos quiméricos derivados de anticuerpos quiméricos identificados de acuerdo con la presente divulgación.
En un aspecto adicional, que no forma parte de la invención, la divulgación se refiere al uso de animales de la presente divulgación en el análisis de los probables efectos de los fármacos y vacunas en el contexto de un repertorio de anticuerpos casi humanos.
La divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere también a un método para identificar o validar un fármaco o una vacuna, comprendiendo el método suministrar la vacuna o el fármaco a un mamífero de la divulgación y controlar uno o varios de: la respuesta inmunitaria, el perfil de seguridad, el efecto sobre la enfermedad.
La divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere también a un kit que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo como el descrito en la presente memoria y o bien instrucciones para el uso de un anticuerpo de este tipo, o bien un reactivo de laboratorio adecuado, tal como un tampón, reactivo de detección de anticuerpos.
En ciertos aspectos, que no forman parte de la invención, la divulgación se refiere a:
Un mamífero no humano, cuyo genoma comprende:
(a) la región VDJ de IgH humana aguas arriba de la región constante del mamífero no humano huésped; y
(b) las regiones V y J de la cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped y/o las regiones V y J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda del mamífero no humano huésped;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante del mamífero no humano y una región variable humana
y, opcionalmente, en donde el genoma del mamífero no humano está modificado para impedir la expresión de anticuerpos completamente específicos para la especie huésped.
Una célula ES de mamífero no humano, cuyo genoma comprende:
(a) la región V, D y J de IgH humana aguas arriba de una región constante de mamífero no humano; y
(b) las regiones V y J de la cadena ligera kappa del locus de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa del mamífero no humano huésped, y/o las regiones V y J de la cadena ligera lambda del locus de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda del mamífero no humano huésped,
en donde la célula ES es capaz de desarrollarse en un mamífero no humano, siendo capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Un método para producir un mamífero no humano transgénico capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, teniendo los anticuerpos una región constante del mamífero no humano y una región variable humana, comprendiendo el método insertar en un genoma de célula ES de mamífero no humano, mediante recombinación homóloga,
(a) la región VDJ de IgH humana aguas arriba de la región constante de la cadena pesada del mamífero no humano huésped,y
(b) la región VJ de las cadenas lambda o kappa de IgL humana aguas arriba de la región constante de la cadena lambda o kappa del mamífero no humano huésped, respectivamente,
de tal forma que el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana, en donde las etapas (a) y (b) se pueden llevar a cabo en cualquier orden y cada una de las etapas (a) y (b) se puede llevar a cabo de forma escalonada o en una única etapa.
En un aspecto, la inserción de las regiones VDJ o VJ humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano huésped está acompañada de la inserción escalonada de múltiples fragmentos mediante recombinación homóloga.
En un aspecto, las inserciones escalonadas comienzan en un sitio en donde se ha insertado un casete de iniciación en el genoma de una célula ES, lo que proporciona una única región de fijación de objetivo que consiste en una secuencia de la cadena principal de BAC y un marcador de selección negativo.
En un aspecto, el primer fragmento de la región variable humana se inserta por recombinación homóloga en la secuencia de la cadena principal de BAC del casete de iniciación, y dicho marcador de selección negativo y el casete de iniciación se retiran posteriormente mediante recombinación entre las secuencias diana de recombinasa.
En un aspecto, las inserciones fijadas como objetivo repetidas en la secuencia de iniciación de la cadena principal de BAC y la posterior eliminación de la cadena principal mediante la reorganización entre las secuencias diana de recombinasa se repite para construir toda la región VDJ humana aguas arriba de la región constante del no mamífero huésped.
Otros aspectos incluyen:
Un método para producir un anticuerpo específico contra un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar a un roedor de acuerdo con la invención con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o una célula que produce el anticuerpo.
Un método para producir un anticuerpo completamente humanizado que comprende inmunizar a un roedor de la invención y luego reemplazar la región constante del mamífero no humano de un anticuerpo que reacciona específicamente contra el antígeno por una región constante humana, convenientemente mediante ingeniería genética del ácido nucleico que codifica el anticuerpo.
Una célula ES o un roedor, en donde una secuencia de ADN de la región codificante humana se encuentra en una disposición funcional con una secuencia de control de mamífero no humano, de tal forma que la transcripción del ADN está controlada por la secuencia de control de mamífero no humano. En un aspecto, la región V, D o J de la región codificante humana se encuentra en una disposición funcional con una secuencia promotora de ratón.
La divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere también a un anticuerpo humanizado producido de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria y al uso de un anticuerpo humanizado así producido en medicina.
Se comprenderá que realizaciones particulares descritas en la presente memoria se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de pericia de los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención.
El uso de la palabra ”un” o ”una”, cuando se utiliza con la expresión”que comprende” en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar “uno/una o más”, “al menos uno/una” y ”uno/una o más de uno/una”. El uso del término ”o” en las reivindicaciones se utiliza con el significado de ”y/o”, a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas se excluyen mutuamente, aunque la divulgación apoye una definición que se refiere a solo alternativas e “y/o”. A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente de error del dispositivo, empleándose el método para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Tal y como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las palabras ”que comprende” (y cualquier forma de comprender, tal como ''comprenden” y ''comprende”), ”que tiene” (y cualquier forma de tener, tal como ”tienen” y ”tiene”), ”que incluye” (y cualquier forma de incluir, tal como ”incluye” e ''incluyen”) o ”que contiene” (y cualquier forma de contener, tal como ”contiene” y ”contienen”) son inclusivas o abiertas y no descartan otros elementos o etapas de método que no se han citado.
La expresión “o combinaciones de los mismos” tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden a la expresión. Por ejemplo, ”A, B, C o combinaciones de las mismas” pretende incluir al menos una de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o varios elementos o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBB<a>A<a>, CABABB, etcétera. El experto en la técnica comprenderá que típicamente no hay límite al número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que resulte evidente a partir del contexto.
Cualquier parte de esta divulgación puede ser leída en combinación con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que resulte evidente a partir del contexto.
Todas las composiciones y/o los métodos descritos y reivindicados en la presente memoria pueden realizarse y ejecutarse sin demasiada experimentación a la vista de la presente divulgación.
La presente divulgación se describe con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes. El Ejemplo 3 describe datos experimentales que se han obtenido y que apoyan la demostración preliminar de determinados aspectos de la invención, mientras que los Ejemplos 1 y 2 proporcionan una guía detallada para la persona experta en la técnica a la hora de llevar a cabo la invención reivindicada.
Ejemplo 1 (ejemplo de referencia)
Estrategia global
Se puede conseguir un modelo de ratón de la divulgación mediante la inserción de ~ 960 kb del locus de la cadena pesada humana que contiene todas las regiones V, D y J aguas arriba de la región constante de ratón y 473 kb de la región kappa humana aguas arriba de la región constante de ratón. Alternativamente, o en tándem, la región lambda humana se inserta aguas arriba de la región constante de ratón. Esta inserción se consigue mediante fijación de objetivo génico en las células ES utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.
La inserción con gran fidelidad de las regiones V-D-J intactas en cada uno de los loci en su configuración nativa (tipo salvaje) se consigue convenientemente mediante la inserción de cromosomas artificiales bacterianos (BACs) humanos en el locus. Convenientemente, los BACs están recortados de tal forma que en el locus final no se duplica ni se pierde secuencia alguna en comparación con el original. Un recorte de este tipo se puede llevar a cabo mediante ingeniería por recombinación.
Los BACs humanos relevantes y convenientemente recortados que cubren estos locus tienen un tamaño medio de 90 kb.
En una estrategia, todo el complemento de los elementos D y J humanos, así como siete u ocho regiones V humanas están cubiertos por el primero de los BACs a insertar en el esquema de inserción experimental descrito más adelante. Los primeros BACs a insertar en los loci de IgH e IgK pueden contener las siguientes regiones V: IgH: V6-1, VII-1 -1, V1-2, VIII-2-1, V1-3, V4-4, V2-5 e IgK: V4-1, V5-2, V7-3, V2-4, V1-5, V1-6, V3-7, V1-8.
Convenientemente el comportamiento de cada locus se evalúa tras la inserción del primer BAC utilizando ratones quiméricos y también tras cada adición posterior de BAC. Véase más adelante una descripción detallada de esta prueba de comportamiento.
Se requerirán nueve inserciones adicionales de BAC en el locusIgHy cinco en elIgKpara proporcionar todo el complemento de las regiones V humanas que cubren 0,96 Mb y 0,473 Mb de los lociIgHeIgK,respectivamente.
No todos los BACs conservan su configuración de tipo salvaje cuando están insertados en el genoma de células ES. Por lo tanto, los inventores han desplegado matrices genómicas de alta densidad para detectar las células ES e identificar las que presentan inserciones intactas de BAC (Barrett, M. T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P. S.,et al.(2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 17765-17770). Esta detección también permite que se puedan identificar y seleccionar clones de ES en los que el genoma de la célula ES está comprometido y, por consiguiente, que no serían capaces de poblar la línea germinal de los animales quiméricos. Otras herramientas genómicas adecuadas para facilitar esta evaluación incluyen la secuenciación y verificación por PCR.
Por lo tanto, en un aspecto, la estructura correcta del BAC se confirma antes de proseguir con la siguiente etapa.
Está implícito a partir de la descripción anterior que para reconstruir completamente los loci con los BACs de 90 kb es necesario realizar un mínimo de 10 etapas de fijación de objetivo paraIgHy 5 etapas paraIgK.Ratones con un locus IgL se pueden generar de una manera similar al locus IgK. Se requieren etapas adicionales para retirar los marcadores de selección necesarios para apoyar la fijación de objetivo génica. Dado que estas manipulaciones se realizan de manera escalonada en las células ES, en un aspecto se conserva la capacidad de transmisión de la línea germinal a lo largo de este proceso. Mantener el comportamiento de los clones de células ES a lo largo de múltiples rondas de manipulación sin necesidad de testar el potencial de la línea germinal de la línea de células ES en cada etapa puede ser importante en la presente invención. Las líneas celulares actualmente en uso para los proyectos de inactivación globales KOMP y EUCOMM se han modificado dos veces antes de su uso para este proyecto y sus velocidades de transmisión de la línea germinal sigue siendo la misma que la de las células parentales (estas líneas están disponibles al público, véase www.komp.org y www.eucomm.org). Esta línea celular, denominada JM8, puede generar ratones que proceden al 100 % de las células ES en las condiciones de cultivo publicadas (Pettitt, S. J., Liang, Q., Rairdan, X. Y., Moran, J. J., Prosser, H. M., Beier, D. R., Lloyd, K. C., Bradley, A. y Skarnes, W. C. (2009). Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods). Se ha demostrado que estas células son capaces de contribuir de forma reproducible a formar el tejido somático y de la línea germinal de los animales quiméricos utilizando las condiciones de cultivo estándares para las células Es de ratón. Esta capacidad se puede encontrar en las células cultivadas con una línea de células alimentadoras estándares (SNL, por sus siglas en inglés) e incluso libres de alimentadoras, cultivadas solo en placas de cultivo de tejidos recubiertas con gelatina. Una sub-línea particular, JM8A3, mantuvo la capacidad de poblar la línea germinal de quimeras tras varias rondas en serie de subclonación. La manipulación genética extensiva vía, por ejemplo, la recombinación homóloga - como sería el caso en la presente invención - no puede comprometer la pluripotencia de las células. La capacidad para generar quimeras con un porcentaje tan alto de tejido derivado de células ES tiene otras ventajas. Primero, unos niveles altos de quimerismo se correlacionan con el potencial de transmisión de la línea germinal y proporciona un ensayo sustitutivo para la transmisión de la línea germinal, que solo necesita 5 a 6 semanas. Segundo, ya que estos ratones proceden de las células ES al 100 %, se pueden testar directamente los loci manipulados genéticamente, con lo que se elimina el retraso ocasionado por la crianza. El análisis de la integridad de los nuevos loci de Ig se puede hacer en la quimera, ya que el embrión huésped procederá de animales que son mutantes para el gen RAG-1 tal y como se describe en la sección siguiente.
Otra línea celular que puede utilizarse es una línea celular HPRT-ve, tal como AB2.1, tal y como se describe en ”Chromosome engineering in mice”, Ramírez-Solis R, Liu P y Bradley A, Nature 1995; 378; 6558; 720-4.
Complementación de RAG-1
Mientras que muchos clones generarán ratones procedentes de ES al 100 %, algunos no lo harán. Por lo tanto, en cada etapa, los ratones se generan en un fondo deficiente en RAG-1. Esto proporciona ratones con células B y T que proceden de ES al 100 % y que pueden utilizarse directamente para la inmunización y la producción de anticuerpos. Se pueden utilizar células que tienen un fondo deficiente en RAG-2, o un fondo combinado deficiente en RAG-1/RAG-2, o mutaciones equivalentes en las cuales los ratones producen solo células B y/o células T procedentes de las células ES.
Con el fin de que solo estén activos los lociIgHoIgKde humano-ratón en estos ratones, los lociIgHeIgKde humanoratón pueden modificarse genéticamente en una línea celular en la cual un alelo del locus deIgHoIgKya está inactivado. Alternativamente, tras la inserción se puede llevar a cabo la inactivación del locus de la Ig del huésped, tal como los loci frIgH o IgK.
Las cepas de ratón que tienen el gen RAG-1 mutado son inmunodeficientes, porque no tienen linfocitos B o T maduros (documento US 5.859.307). Los linfocitos T y B solo se diferencian si se produce una recombinación de V(D)J correcta. Dado que RAG-1 es una enzima crucial para esta recombinación, los ratones que carecen de RAG-1 son inmunodeficientes. Si los embriones huéspedes son mutantes genéticamente homocigotos para RAG-1, una quimera producida por la inyección de un embrión de este tipo no será capaz de producir anticuerpos si los tejidos linfáticos del animal proceden del embrión huésped. Sin embargo, las células JM8 y las células AB2.1, por ejemplo, contribuyen por lo general en más del 80 % de los tejidos somáticos del animal quimérico y, por lo tanto, poblan habitualmente el tejido linfático. Las células JM8 tienen actividad RAG-1 de tipo salvaje y, por lo tanto, los anticuerpos producidos en el animal quimérico serían codificados solo por el genoma de las células ES JM8. Por lo tanto, el animal quimérico puede exponerse a un antígeno mediante inmunización y, posteriormente, producir anticuerpos contra ese antígeno. Esto permite que un experto en la técnica compruebe el comportamiento de los loci de IgH e IgK de humano/ratón modificados genéticamente como se describe en la presente divulgación. Véanse las Figuras 19 y 20.
El experto en la técnica utilizaría el animal quimérico como se describe para determinar el grado de diversidad de anticuerpos (véase, p. ej., Harlow, E. y Lane, D. 1998, 5a edición. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por ejemplo, en el suero del animal quimérico podría comprobarse la existencia de algunos epítopos de anticuerpo mediante la fijación a antisuero anti-idiotipo específico, por ejemplo, en un ensayo ELISA. El experto en la técnica podría también secuenciar los genomas de clones de células B procedentes del animal quimérico y comparar dicha secuencia con la secuencia de tipo salvaje para averiguar el nivel de hipermutación, siendo una hipermutación de este tipo indicativa de la maduración normal de los anticuerpos.
El experto en la técnica también utilizaría dicho animal quimérico para examinar el funcionamiento del anticuerpo, en donde dichos anticuerpos están codificados por los loci de Ig modificados genéticamente (véase., p. ej., Harlow, E. y Lane, D, 1988, 5a edición, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por ejemplo, se podrían testar antisueros mediante la unión a un antígeno, en donde dicho antígeno se utilizó para inmunizar el animal quimérico. Una medición de este tipo podría realizarse mediante un ensayo ELISA. Alternativamente, un experto en la técnica podría comprobar la neutralización del antígeno por la adición de antisueros recogidos del animal quimérico inmunizado adecuadamente.
Los expertos en la técnica saben bien que los resultados positivos para cualquiera de estos ensayos demuestran que los loci de Ig modificados genéticamente, el objeto de la presente invención, son capaces de codificar anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, siendo dichos anticuerpos capaces de funcionar de la misma manera que los anticuerpos de tipo salvaje.
Técnicas Experimentales
La ingeniería de recombinación para la producción de vectores para uso en la recombinación homóloga en células ES se describe, por ejemplo, en los documentos WO9929837 y WO0104288, y las técnicas se conocen bien en la técnica. En un aspecto, la ingeniería de recombinación del ADN humano se realiza utilizando los BACs como fuente de dicho ADN humano. El ADN de BAC humano se aislará utilizando el kit de purificación de BAC de Qiagen. La cadena principal de cada uno de los BACs humanos se modificará mediante ingeniería de recombinación para obtener exactamente la misma configuración o una similar a la del BAC ya insertado en la región de IgH de ratón. La inserción genómica de cada uno de los BACs humanos se recortará utilizando ingeniería de recombinación de tal forma que una vez que los BACs están insertados, se formará una parte contigua ininterrumpida de la región genómica V(D)J humana en el locus de IgH o IgK de ratón. La transfección del ADN de BAC mediante electroporación y el genotipado se realizarán de acuerdo con protocolos estándares (Prosser, H. M., Rzadzinska, A. K., Steel, K. P., y Bradley. A. (2008). Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin VIIa in actin dynamics of stereocilia, Molecular and Cellular Biology, 28, 1702-1712; Ramírez-Solis, R., Davis, A. C., y Bradley, A. (1993). Gene targeting in embryonic stem cells. Methods in Enzymology 225, 855-878). La ingeniería de recombinación se realizará utilizando los procedimientos y reactivos desarrollados por los laboratorios de Pentao Liu y Don Court (Chan, W., Costantino, N., Li, R., Lee, S. C., Su, Q., Melvin, D., Court, D. L y Liu, P. (2007). A recombineering based approach for highthroughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Research 35, e64).
Éstas y otras técnicas para la fijación de objetivo génica y la recombinación de fragmentos cromosómicos procedentes de bAc en un genoma de mamífero no humano, tal como un ratón, se describen, por ejemplo, en http://www.eucomm.org/information/targeting y http://www.eucomm.org/information/publications.
El cultivo celular de líneas celulares derivadas de C57BL/6N, tal como las células ES de macho JM8, seguirán las técnicas estándares. Las células ES JM8 han demostrado ser competentes a la hora de contribuir extensivamente a tejidos somáticos y a la línea germinal, y se utilizan para grandes programas de mutagénesis de ratones en el Sanger Institute tal como E<u>COMM y KOMP (Pettitt, S. J., Liang, Q., Rairdan, X. Y., Moran, J. L., Prosser, H. M., Beier, D. R., Lloyd, K. C., Bradley, A., y Skarnes, W. C. (2009) Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods). Células ES JM8 (1,0 x 107) se electroporarán (500 pF, 230 V; BioRad) con 10 pg de ADN de BAC humano linearizado con I-Scel. Los transfectantes se seleccionarán con puromicina (3 pg/ml) o G418 (150 pg/ml). La selección comenzará a las 24 horas (con G418) o 48 horas (con Puromicina) de la electroporación y tendrá lugar durante 5 días. 10 pg de ADN de BAC humano linearizado pueden producir hasta 500 colonias de células ES resistentes a puromicina o a G418. Las colonias de células ES resistentes a antibióticos se recogerán en placas de cultivo de células de 96 pocillos para genotiparlas y así identificar los clones fijados como objetivo.
Una vez que se han identificado los clones de células ES de ratón fijadas como objetivo, se analizarán mediante hibridación genómica comparativa con matrices (CGH, por sus siglas en inglés) para determinar la integridad total del genoma (Chung, Y. J., Jonkers, J., Kitson, H., Fiegler, H., Humphray, S., Scott, C., Hunt, S., Yu, Y., Nishijima, I., Velds, A., et al. (2004). A whole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes by array comparative genomic hybridization Genome Research 14, 188-196; y Lliang, Q., Conte, N., Sharknes, W. C., y Bradley, A. (2008). Extensive genomic copy number variation in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 17453-17456). Células ES que tienen genomas anómalos no contribuyen de manera eficaz en la línea germinal de los ratones quiméricos. Se examinará la integridad del BAC mediante amplificación por PCR de cada uno de los genes V funcionales conocidos en el BAC. Por ejemplo, en una estrategia, el primer BAC humano elegido para el locus de IgH tiene 6 genes V funcionales. Para confirmar la integridad de este BAC por la presencia de estos 6 genes V de IgH, se diseñarán al menos 14 pares de cebadores para PCR y se utilizarán para amplificar por PCR el ADN genómico de las células ES fijadas como objetivo. Se considera que el BAC insertado no se ha reorganizado cuando el tamaño y la secuencia de estos fragmentos son como los del tipo salvaje humano.
Una CGH más detallada también confirmará la integridad de los BACs insertados. Por ejemplo, el experto en la técnica podría utilizar una plataforma de aCGH de oligonucleótidos, que está desarrollada por Agilent Technologies, Inc. Esta plataforma no sólo permite estudiar la variación del número de copias del ADN por todo el genoma a gran resolución (Barrett, M. T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P. S., et al. (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 17765-17770), sino que permite examinar una región concreta del genoma utiilizando matrices diseñadas a medida. Al comparar las técnicas de aCGH tradicionales que se basan en sondas de ADNc o sondas de todo el BAC, las sondas de oligonucleótidos 60-meros pueden asegurar la hibridación específica y la alta sensibilidad y precisión que se necesitan con el fin de detectar las alteraciones cromosómicas por modificación genética que se han realizado. Por ejemplo, los oligonucleótidos diseñados para que se hibriden a intervalos regulares a lo largo de toda la longitud del BAC insertado detectarían incluso deleciones, inserciones u otras reorganizaciones bastante cortas. Asimismo, esta plataforma proporciona la mayor flexibilidad para los diseños de micromatrices a medida. El ADN genómico de las células ES fijadas como objetivo y el ADN genómico individual humano normal se marcarán por separado con colorantes y se hibridarán a la matriz. Los soportes de las matrices se escanearán utilizando un escáner de micromatrices de ADN de Agilent Technologies. La intensidad de fluorescencia recíproca del colorante Cy5 y del colorante Cy3 en cada una de las imágenes de la matriz y el logaritmo en base 2 de los valores de la relación se extraerán utilizando el software Bluefuse (Bluegnome). Los puntos con patrones de fluorescencia incoherentes ("confianza” < 0,29 o "calidad” = 0) se descartarán antes de normalizar todos los valores de los logaritmos en base 2 de las relaciones. Dentro de un experimento, el logaritmo en base 2 de la relación entre -0,29 y 0,29 para la señal de cualquier sonda de oligonucleótidos se considera que no implica ningún cambio en el número de copias. El umbral del logaritmo en base 2 de la relación para la "Duplicación” es normalmente > 0,29999, y para la deleción es < 0,29999.
Una vez que el primer BAC humano está insertado en el locus de IgH de ratón y se confirma que está en su configuración nativa intacta, la cadena principal de BAC flanqueado por FRT se escindirá utilizando la recombinasa Flp específica del sitio. Si la recombinación regular de FRT catalizada por Flp no es suficientemente alta, se puede utilizar Flo, una versión mejorada de la recombinasa Flp que en determinados tests es 3-4 veces más eficaz en las células ES que la Flp original. Después de haber escindido la cadena principal del BAC, las células ES se harán sensibles a la puromicina (o al G418) y resistentes a FIAU (por la pérdida del casete TK). Los eventos de escisión se caracterizarán adicionalmente mediante amplificación por PCR del fragmento de unión utilizando cebadores del ADN genómico humano. Estas células ES sin la cadena principal del BAC flanqueado por FRT se utilizarán en la siguiente ronda de inserción de BAC humano y para la inyección de blastocistos.
La fijación de objetivo en el genoma de una célula ES para producir un ratón transgénico puede llevarse a cabo utilizando un protocolo como el explicado con referencia a las Figuras 1-18 adjuntas.
La Figura 1 ilustra la cadena principal básica de tres vectores; un casete de iniciación y 2 vectores con inserciones grandes, 1 y 2, respectivamente. El casete de iniciación comprende secuencias homólogas al sitio de inserción deseado en el genoma de ratón, esos sitios que flanquean un marcador seleccionable y secuencia de relleno con el cebador para el genotipado basado en PCR para confirmar que la inserción de los BACs ha sido correcta. La secuencia de relleno con el cebador proporciona la base para el genotipado de cada una de las etapas de adición de BAC. Se considera que esta secuencia proporciona un molde de secuencia bien validado y robusto para el cebador de la PCR y puede localizarse en el sitio de I-Scel, idealmente a ~ 1 kb de la inserción del BAC.
Los vectores con insercciones grandes comprenden ADN humano en plásmidos con marcadores seleccionables y un único sitio de restricción para la linearización del plásmido para ayudar en la recombinación homóloga en el genoma de la célula ES.
La Figura 2 ilustra la inserción de un casete de iniciación en el genoma de ratón mediante recombinación homóloga entre los exones J4 y Calfa de ratón. La selección con puromicina permite identificar las células ES con la inserción del casete. Pu(Delta)tk es una proteína de fusión bifuncional entre la puromicina N-acetiltransferasa (Puro) y una versión truncada de la timidina quinasa de tipo 1 del virus del herpes simple (DeltaTk). Células (ES) madre embrionarias murinas que están transfectadas con pu(Delta)tk se vuelven resistentes a la puromicina y sensibles a 1-(2-desoxi-2-fluoro-1-beta-D-arabino-furanosil)-5-yodouracilo (FIAU). A diferencia de otros transgenes de la tk del HSV1, pu(Delta)tk se transmite con facilidad a través de la línea germinal macho. Esta pu(Delta)tk es un marcador seleccionable positivo/negativo conveniente que se puede utilizar ampliamente en muchas aplicaciones de células ES.
La Figura 3 ilustra la fijación de objetivo de la inserción grande del vector 1 en el genoma de las células ES de ratón. La linearización del vector se realiza en la misma posición que la secuencia de relleno con el cebador, lo que permite una estrategia de genotipado por reparación de huecos, bien conocida en la técnica - véase Zheng et al. NAR 1999, vol 27, 11,2354-2360). En esencia, la inserción aleatoria del vector de fijación de objetivo en el genoma no ‘reparará’ el hueco mientras que un acontecimiento de recombinación homóloga sí reparará el hueco. La yuxtaposición de secuencias de los cebadores de PCR adecuados permite detectar colonias de forma individual en busca de un fragmento de PCR positivo que indique que la inserción fue correcta. La selección positiva utilizando G418 permite identificar las células ES de ratón que contienen el marcador de selección neo. Puede realizarse la verificación por PCR de todas las regiones V, D y J críticas. La hibridación genómica comparativa de matrices puede utilizarse para validar la estructura del BAC.
La Figura 4 ilustra el casetepuro-delta-tky la cadena principal plasmídica del BAC se elimina utilizando Flpe y selección con FIAU. Dado que Flpe trabaja con poca eficacia en células ES de ratón (deleción del 5 % con la expresión transitoria de Flpe), se espera que en la mayoría de los casos, la recombinación se produzca entre los dos sitios FRT que flanquean la cadena principal del BAC. También puede testarse Flpo para descubrir la eficacia de la recombinación entre dos sitios de FRT que están a 10 kb.
Dado que se puede seleccionar la etapa de deleción de FRT, es posible agrupar los clones resistentes a FIAU y proseguir inmediatamente a la siguiente etapa en paralelo con el análisis clonal. Alternativamente, puede ser deseable mostrar mediante PCR de poco alcance que las secuencias humanas ahora están adyacentes a las del ratón, tal y como está ilustrado (cebador Hu1 y cebador Mo).
En esta fase se habrá insertado un locus humano de 200 kb.
La Figura 5 ilustra un segundo vector con inserción grande que fija como objetivo el cromosoma de las células ES. El BAC humano fija como objetivo el locus de IgH de ratón usando la misma inserción del casete de iniciación y luego la linearización del BAC conIS cel, fijación de objetivo del BAC en el casete de iniciación y estrategia de genotipado por reparación de huecos. La verificación de la inserción del BAC se lleva a cabo igual que antes.
La Figura 6 ilustra que la cadena principal del BAC flanqueado por FRTY del vector 2 con la inserción grande y el marcador neo acaban eliminados por la acción deFlpo.Obsérvese que esto no es seleccionable, por lo que será necesario el análisis clonal en este punto. Esto permitirá confirmar la yuxtaposición de la inserción humana 2 con humano 1 y otros esfuerzos de validación.
En esta fase se habrá insertado un locus humano de ~ 200 kb.
La Figura 7 ilustra el siguiente vector con inserción grande fijado como objetivo en el locus de IgH de ratón. A continuación se retira el casete pu-delta-TK, como en la Figura 4. El proceso puede repetirse para incorporar otros BACs.
La Figura 8 ilustra la construcción final predicha en las células ES.
Las Figuras 9 - 18 proporcionan un mayor nivel de detalle de este proceso.
Ejemplo 2 (ejemplo de referencia)
En un método adicional de la divulgación se puede emplear la recombinación específica del sitio. La recombinación específica del sitio (SSR, por sus siglas en inglés) se ha utilizado ampliamente en los últimos 20 años para la integración de transgenes en loci cromosómicos definidos. La SSR implica la recombinación entre secuencias de ADN homólogas.
La primera generación de fijación de objetivo cromosómica basada en SSR implicó la recombinación entre (i) un único sitio diana de recombinación (RT, por sus siglas en inglés), tal como loxP o FRT, en un plásmido transfectado con (ii) un sitio RT cromosómico proporcionado por una integración anterior. Un problema importante con esta estrategia es que los eventos de inserción son raros, ya que la escisión siempre es más eficaz que la inserción. Se introdujo una segunda generación de SSR denominada RMCE (siglas inglesas de intercambio de casete mediado por recombinasa) por Schlake y Bode en 1994 (Schlake, T.; J. Bode (1994). ”Use of mutated FLP-recognition-target-(FRT)-sites for the exchange of expression casetes at defined chromosomal loci”. Biochemistry33: 12746-12751). Su método se basa en utilizar dos RTs heteroespecíficos e incompatibles en el plásmido transfectado que pueden recombinarse con sitios RT compatibles en el cromosoma, lo que da lugar al cambio de un trozo de ADN por otro - o a un intercambio de casete. Esta estrategia se ha explotado con éxito en una diversidad de fijaciones de objetivo cromosómicas eficaces, incluyendo la integración de inserciones de BAC de más de 50 kb (Wallace, H. A. C. et al. (2007). ”Manipulating the mouse genoma to engineering precise functional syntenic replacements with human sequence”. Cell 128: 197-209; Prosser. H. M. et al. (2008). ”Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin VIIa in actin dynamics of Stereocilia”. Mol. Cell. Biol. 28: 1702-12).
El tamaño de inserción más grande de un BAC es de aproximadamente 300 kb y, por lo tanto, esto coloca un límite superior al tamaño del casete para RMCE.
En la presente divulgación, los inventores utilizan una nueva técnica basada en la SSR denominada RMCE secuencial (SRMCE, por sus siglas en inglés), que permite la inserción continua de inserciones de BAC en el mismo locus.
El método comprende las etapas de
1 inserción de ADN que forma parte de un casete de iniciación (también denominada una plataforma de integración en la presente memoria) en el genoma de una célula;
2 inserción de un primer fragmento de ADN en el sitio de inserción, comprendiendo el primer fragmento de ADN una primera porción de un ADN humano y una primera porción de vector que contiene un primer marcador seleccionable o que genera un marcador seleccionable tras la inserción;
3 eliminación de parte del ADN del vector;
4 inserción de un segundo fragmento de ADN en la porción del vector del primer fragmento de ADN, en donde el segundo fragmento de ADN contiene una segunda porción de ADN humano y una segunda porción de vector, en donde la segunda porción de vector contiene un segundo marcador seleccionable, o que genera un segundo marcador seleccionable tras la inserción;
5 eliminación de cualquier ADN de vector para permitir que el primero y el segundo fragmentos de ADN humano formen una secuencia contigua; y
6 repetición de las etapas de inserción de una parte del ADN de V(D)J humano y eliminación del ADN del vector, cuando sea necesario, para producir una célula con toda o parte de la región VDJ o VJ humana suficiente para ser capaz de generar un anticuerpo quimérico junto con una región constante del huésped,
en donde la inserción de al menos un fragmento de ADN utiliza la recombinación específica del sitio.
En un aspecto específico, la estrategia utiliza tres sitios loxP incompatibles y heteroespecíficos. El método comprende las etapas que siguen, y que se ilustran en las Figuras 22 - 26:
1. Fijación de objetivo de una plataforma de integración en el locus definido. Un vector de entrada que contiene un minigén de HPRT flanqueado por las ITRs de piggyBac (PB) invertidas es fijado como objetivo en la región definida (por ejemplo, una región entre IgHJ y Ep o IgKJ y Eko IgLCI y EA3-1) para servir de plataforma de integración para la fijación de objetivo del BAC. El minigén de HPRT está comprendido por dos exones sintéticos y el intrón asociado. El exón de HPRT en 5' está flanqueado por dos sitios loxP heteroespecíficos e incompatibles (un sitio es de tipo salvaje y el otro es un sitio mutado, lox5171) en orientación inversa el uno respecto al otro (Fig. 22). Estos dos sitios loxP proporcionan sitios de recombinación para la inserción del BAC mediante RMCE.
2. Inserción del 1er BAC modificado en la plataforma de integración reconocida. El 1er BAC tiene un tramo del ADN a insertar en el genoma flanqueado por modificaciones introducidas mediante ingeniería genética. La modificación en 5' (loxP — gen neo — lox2272 — promotor de PGK — 5'-LTR de PB) y la modificación en 3' (3'-LTR de PB — gen puroATK — lox5171) se describen en la Fig. 23 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y las LTRs de PB. Con la expresión transitoria de CRE desde un vector co-electroporado, la secuencia de ADN se insertaría en el locus definido mediante la RMCE. Las células en las cuales se ha producido una inserción correcta pueden seleccionarse como se describe a continuación: (i) resistencia a la puromicina (el gen puroATK ha adquirido un promotor - “PGK”- que estaba en la plataforma de integración), (ii) resistencia a 6TG (el minigén de HPRT ha sido interrumpido) y (iii) resistencia a G418 (selecciona cualquier inserción vía la disposición de la región 5' de PGK-neo). Puede utilizarse cualquier combinación de estas formas de selección. La resistencia a G418 y 6TG selecciona las integraciones correctas en el extremo 5' mientras que la resistencia a la puromicina selecciona las integraciones correctas en el extremo 3'.
3. Curación (eliminación) de la modificación en 3' de la 1a inserción. Un 1er BAC insertado correctamente da lugar a que el extremo 3' tenga un gen puroATK flanqueado por las LTRs de PB invertidas (Fig. 24) - esencialmente una estructura de transposón correcta. A continuación, este transposón puede eliminarse mediante la expresión transitoria de la transposasa de piggyBac (desde un vector electroporado). Las células con el evento de escisión correcto pueden seleccionarse mediante resistencia al FIAU - es decir, no hay actividad timidina quinasa del gen puroATK. Esto elimina completamente la modificación en 3' sin dejar nucleótidos de más.
4. Inserción de un 2° BAC modificado en el extremo 5' de la 1a inserción. El 2° BAC tiene un tramo de ADN a insertar en el genoma (habitualmente se pretende que sea contiguo con el ADN insertado con el 1er BAC) flanqueado por modificaciones introducidas por ingeniería genética. La modificación en 5' (loxP — porción 5' del minigén de HPRT — lox5171 — promotor de PGK — 5-LTR de PB) y la modificación en 3' (3'-LTR de PB — puroATK — lox2272) se describe en la Fig. 25 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y las LTRs de PB. Con la expresión transitoria de CRE desde un vector co-electroporado, la secuencia de ADN se insertaría en el locus mediante RMCE. Las células en las cuales se ha producido una inserción correcta pueden seleccionarse del siguiente modo: (i) resistencia a HAT (el minigén de HPRT se reconstituye mediante un evento de inserción correcto, a saber: las estructuras exónicas en 5' y 3’ se juntan) y (ii) resistencia a la puromicina (el gen puroATK ha adquirido un promotor -”PGK”- de la plataforma de integración).
5. Curación (eliminación) de la modificación en 3' de la 2a inserción. Un 2° BAC insertado correctamente da lugar al extremo 3' que tiene un gen puroATK flanqueado por las LTRs de PB invertidas (Fig. 26) — esencialmente una estructura de transposón correcta, exactamente análoga a la consecuencia de una inserción satisfactoria del 1er BAC— . Y por lo tanto, este transposón puede eliminarse igualmente mediante la expresión transitoria de la transposasa de piggyBac (desde un vector electroporado). Las células con la escisión correcta pueden seleccionarse mediante resistencia a FIAU - es decir, no hay actividad timidina quinasa a partir del gen puroATK. Esto retira completamente la modificación en 3' sin dejar nucleótidos de más.
6. Después de curar la modificación en 3' de la inserción del 2° BAC, la plataforma de integración se convierte en una idéntica a la original. Este proceso completo, etapas 2 a 5, puede repetirse varias veces para construir una inserción grande en el genoma. Cuando esté completa, no quedará nucleótido residual alguno que no pertenezca a la inserción deseada.
Con la inserción de un número impar de BACs en los loci de Ig, las secuencias endógenas de VDJ o VJ pueden inactivarse a través de una inversión vía una modificación genética del cromosoma como la descrita a continuación (véanse las Figuras 27 - 29):
1. Fijación de objetivo de un casete ‘volteador” en una región en 5' que está entre 10 y 40 megabases alejada de la VDJ o VJ endógena. El vector volteador (3'-LTR de PB — promotor de PGK — porción en 5' del minigén de HPRT — loxP — puroATK — promotor de Ca GGS — 3'-LTR de PB) se describe en la Fig. 27 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y de las LTRs de PB.
2. La expresión transitoria de CRE dará lugar a la recombinación entre el sitio loxP en el casete “volteador” y el sitio loxP de la modificación en 5'. Esta modificación en 5' es como está descrito en las Etapas 2 y 3 de más arriba - esencialmente, la modificación que es el resultado de insertar un número impar de BACs, después de que se haya curado la modificación en 3'. Los sitios loxP están invertidos entre sí y, por lo tanto, el acontecimiento de recombinación descrito da lugar a una inversión como la descrita en la Fig. 28. Las células con la inversión correcta tendrán resistencia a HAT, ya que el minigén de HPRT se ha reconstituido mediante una inversión correcta.
3. Una inversión correcta también deja dos estructuras de transposón flanqueando el casete "volteador” y la modificación en 5'. Ambos pueden escindirse con la expresión transitoria de la transposasa de piggyBAC, lo que no deja ningún resto de ninguna de las modificaciones (Fig. 29). Células con las escisiones correctas pueden seleccionarse como se explica a continuación: (i) resistencia a 6TG (se ha eliminado el minigén de HPRT) y (ii) resistencia a FIAU (se ha eliminado el gen puroATK). Una inversión como la descrita en los loci de Ig alejarían la región endógena IgH-VDJ o IgK-VJ de la región potenciadora de Ep o Ek, respectivamente, y conducirían a la inactivación de las regiones endógenas IgH-VDJ o IgK-VJ.
Los métodos de inserción descritos en la presente memoria proporcionan uno o más de:
Selección de ambos extremos 5' y 3' del fragmento de ADN insertado;
Curación eficaz de la modificación en 3', preferiblemente mediante la escisión de ADN mediada por transposasa;
Inactivación de la actividad de IgH o IgK endógenas mediante una inversión; y
Escisión de las modificaciones, lo que no deja ningún nucleótido de más en el cromosoma.
Ejemplo 3 (ejemplo de referencia)
La demostración preliminar de la estrategia se describe en la Figura 30. En la Figura 30, una plataforma de integración como la mostrada en la Figura 22 se insertó en el genoma de un ratón mediante recombinación homóloga, y luego se insertó el plásmido R21 en esa plataforma de integración vía la recombinación específica del sitio mediada por cre. El evento de inserción generó un cierto número de eventos de inserción generales, 360 colonias resistentes a G418, de las cuales ~ 220 tenían al inserción en el locus deseado, como se demostró por la interrupción del minilocus de HRPT.
El vector de R21 imita los extremos en 5' y 3' del vector de inserción del 1er BAC, incluyendo todos los elementos de selección y sitios diana de la recombinasa. En lugar de las secuencias de BAC, hay una pequeña secuencia de ’relleno’. Este vector servirá para analizar todos los principales diseños de la invención y permitirá que se analicen con facilidad los resultados, ya que se puede realizar una PCR que abarque el relleno y, por lo tanto, permite el análisis fácil de ambos extremos de la inserción. R21 se co-electroporó con un vector de expresión de cre en las células ES que albergan la plataforma de integración en el locus de IgH. Se transfectaron en paralelo cuatro conjuntos de células transformadas y luego se colocaron en regímenes de selección diferentes tal y como se indica en la Figura 30. La selección por G418 (expresión del gen neo) dio lugar al mayor número de colonias debido a que no hay ningún requisito para la inserción por la plataforma de integración específica. Cualquier integración de R21 en el genoma proporcionará la expresión de neo, lo que conduce a la resistencia a G418. La selección con Puro dio lugar a un número de colonias similar a Puro 6TG o G418 6TG, lo que sugiere que el rigor de la selección con Puro se debe a que PuroATK carece de promotor en el vector. La expresión de Puro solo se adquiere cuando se produce una integración cerca de un elemento promotor —en este diseño, lo más probable es la inserción específica en la plataforma de integración. Estas conclusiones están apoyadas por los resultados de la PCR sobre la unión que se muestra en la Figura 31.
La siguiente etapa en la divulgación es ‘curar’ el extremo 3' del vector BAC integrado, lo que deja una transición ininterrumpida entre la inserción y el genoma flanqueante. Los inventores demostraron que se produjo esta curación mediante la expansión de un clon individual anterior (R21 insertado en la plataforma de integración) y la expresión de la recombinasa de piggyBAC en este clon mediante la transfección de un plásmido que la expresa. Se utilizó el FIAU para seleccionar colonias en las cuales se escindió la modificación en 3' - es decir, a través de la pérdida del elemento ’PGK — puroATK’ entre las repeticiones terminales de piggyBAC. En una transfección de 106 células se obtuvieron 50 clones de este tipo; se analizó la estructura genómica esperada en 6 de ellos. La curación satisfactoria permitía obtener una PCR positiva entre el conjunto de cebadores marcado con ”3” en la Figura 32. De los 6 clones, 4 tuvieron escisiones correctas, 1 clon se quedó con la configuración original y otro más tenía una deleción.
Estos datos demuestran la inserción repetida de ADN en una plataforma de integración en un locus genómico definido utilizando las estrategias descritas más arriba.
Ejemplo 4 (ejemplo de referencia)
El Ejemplo 3 demostró que el diseño de la divulgación reivindicada era capaz de proporcionar la inserción de un vector de ensayo en el genoma en una posición definida, en este caso el vector R21 en el locus de IgH de ratón. El uso del medio de selección adecuado y la expresión de la recombinasa cre dieron lugar a una alteración genómica con la estructura predicha.
Los mismos elementos diseñados que se describen en esta divulgación se colocaron en los extremos 5' y 3' de una inserción de BAC. Dicha inserción comprendía secuencias humanas del locus IgH y tenía aproximadamente 166 kb. Este BAC modificado genéticamente se introdujo por electroporación, junto con un ADN plasmídico que expresaba cre, en las células ES de ratón que albergan la plataforma de integración en el locus de IgH de ratón. La población de células transfectadas se hizo crecer en el medio que contenía puro para seleccionar los eventos de inserción correctos.
Se aislaron siete clones resultantes y se analizaron con más detalle. El evento de recombinación esperado y la estructura resultante se representan en la Figura 33. Basándose en los datos del experimento de R21 descrito en el Ejemplo 3, se esperaba una selección rigurosa de los clones correctos cuando se seleccionó la población transfectada en el medio que contenía puro. Esto es porque la región que codifica puro requiere un elemento promotor, y éste lo suministra preferiblemente la plataforma de integración después de la recombinación. Por consiguiente, la mayoría de los 7 clones aislados tenían la inserción correcta en el genoma en la plataforma de integración, tal y como se determinó mediante PCR diagnóstica. Los cebadores para diagnosticar una inserción correcta se describen en la Figura 33. Las uniones correctas están presentes en el genoma si se amplifica un fragmento de 610 pb entre los cebadores ’A’ y ’X’ y se amplifica un fragmento de 478 pb entre los cebadores ’Y’ y ’B’ (Figuras 33 y 34). Obsérvese que hay fragmentos amplificados entre los cebadores ’A’ y ’1’ y entre los cebadores ’2’ y ’B’, lo que indica la presencia de un genoma parental (es decir, únicamente la plataforma de integración). Estos resultan de las células parentales presentes en el interior en las colonias de células en selección con puro que escapan a la selección debido a la geometría de una colonia. Después de hacer pases de la colonia a través de medios que contienen puro, estos fragmentos de unión parentales desaparecen, lo que indica que las células parentales han sido eliminadas de la población. Además, todos los clones resultaron ser resistentes a 6-TG como se esperaba si el gen HPRT está inactivado por el evento de inserción correcto.
Estos datos indican que la estrategia descrita para insertar grandes partes de los loci de Ig humana en las posiciones definidas en el genoma de ratón permitirán la construcción de un ratón con una pluralidad de regiones variables de las regiones de Ig humana aguas arriba de las regiones constantes de ratón tal y como está descrito.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un roedor, cuyo genoma comprende:
(a) la región VDJ de IgH humana insertada aguas arriba de la región constante de la cadena pesada del roedor huésped; y
(b) una inserción VJ de la cadena ligera kappa humana que comprende solo los agrupamientos proximales de segmentos V y segmentos J humanos aguas arriba de la región constante kappa del roedor huésped; en donde el roedor es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante del roedor y una región variable humana.
2. Una célula ES de roedor, cuyo genoma comprende
(a) la región VDJ de IgH humana aguas arriba de la región constante de la cadena pesada del roedor; y (b) una inserción VJ de la cadena ligera kappa humana que comprende solo los agrupamientos proximales de segmentos V humanos y segmentos J aguas arriba de la región constante kappa de roedor huésped, en donde la célula ES es capaz de desarrollarse en un roedor, siendo capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, que tiene una región constante de roedor y una región variable humana.
3. El roedor de la reivindicadión 1, o la célula de roedor de la reivindicación 2, en donde la región constante kappa es la región constante de tipo salvaje de huésped endógena ubicada en el locus de tipo salvaje.
4. El roedor de la reivindicación 1 o 3 o la célula de roedor de la reivindicación 2 o 3, en donde la región constante de la cadena pesada es la región constante de tipo salvaje de huésped endógena ubicada en el locus de tipo salvaje.
5. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-4, o la célula de roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el genoma comprende adicionalmente una o mas Vs lambda de la cadena ligera de Ig humana y una o más Js lambda de la cadena ligera de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de roedor.
6. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-4, o la célula de roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4,en donde el genoma comprende V, D (solo la cadena pesada) y Js en el locus de la cadena pesada y un locus de la cadena ligera, pero no en ambos loci de la cadena ligera.
7. El roedor una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-6, o la célula de roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde el roedor es un ratón.
8. Un método para producir un anticuerpo quimérico o una cadena de anticuerpo específica contra un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar a un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-7 con el antígeno y recuperar el anticuerpo o cadena de anticuerpo.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo quimérico o la cadena de anticuerpo se manipula opcionalmente al nivel del ADN, para generar moléculas con propiedades similares a anticuerpos o una estructura seleccionada de:
un anticuerpo de dominio; o
una región variable humana con cualquier región constante de la cadena pesada o ligera de la misma o de diferentes especies; o
una región variable humana junto con cualquier participante en la fusión.
10. Un método para producir un anticuerpo totalmente humanizado, comprendiendo el método inmunizar a un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-7 con un antígeno, y luego reemplazar la región constante del roedor del anticuerpo quimérico específicamente reactiva con el antígeno con una región constante humana, opcionalmente modificando por ingeniería genética el ácido nucleico que codifica el anticuerpo.
11. Un método de preparar una composición farmacéutica, comprendiendo el método producir un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10 y que comprende, además, combinar el anticuerpo con un soporte u otro excipiente farmacéuticamente aceptable para producir la composición.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
13. Un método de producir un anticuerpo o cadena de anticuerpo quimérico o totalmente humanizado, comprendiendo el método llevar a cabo el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, y expresar el anticuerpo o la cadena de anticuerpo.
14. Un método de preparar una composición farmacéutica, comprendiendo el método llevar a cabo el método de producir un anticuerjpo o cadena de anticuerpo quimérico o totalmente humanizado de acuerdo con la reivindicación 13, y que comprende, además, formular el anticuerpo o la cadena de anticuerpo con un soporte u otro excipiente farmacéuticamente aceptable.
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