CN103025884B

CN103025884B - 转基因动物和使用方法

Info

Publication number: CN103025884B
Application number: CN201180036683.0A
Authority: CN
Inventors: 马赛厄斯·瓦布尔; 奈杰尔·基林
Original assignee: Trianni Inc
Current assignee: Trianni Inc
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2031-07-26
Also published as: KR20130097156A; US20210037799A1; JP2013535202A; AU2011286185A1; US20130219535A1; JP2019083823A; IL224327B; CA2806233A1; AU2011286185B2; JP6801030B2; EP2597945A2; WO2012018610A2; RU2580017C2; EP2597945A4; JP6482757B2; DK2597945T3; JP2021027840A; CA2806233C; WO2012018610A3; EP2597945B1

Abstract

本发明包括具有包括被引入的部分人免疫球蛋白区的基因组的非人脊椎动物细胞和非人哺乳动物，所述被引入的区包括人V_H编码序列和基于非人哺乳动物的内源性基因组的非编码V_H序列。

Description

转基因动物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年7月26日提交且通过引用并入本文的美国临时专利申请第61/367,809号的益处。

发明领域

本发明涉及转基因脊椎动物，且更具体地涉及用于发展人治疗学的转基因脊椎动物。

发明背景

在以下论述中，为了背景和介绍的目的，将描述某些文章和方法。被包含在本文中的任何内容不应被理解为“承认”现有技术。申请人明确保留适当时表明本文引用的文章和方法在适用法定条款下不构成现有技术的权利。

编码人和小鼠免疫球蛋白的基因已经被广泛表征。Berman等人(1988)EMBOJ.7：727-738描述了包括V_H，D和J_H基因区段的人IgV_H基因座。Sakano等人(1981)Nature290：562-565描述了免疫球蛋白重链基因的多样性区段。Blankenstein和Kruwinkel(1987)Eur.J.Immunol.17：1351-1357描述了小鼠可变重链区。转基因动物例如具有变化的免疫球蛋白基因座的小鼠的产生，允许将这样的转基因动物用于各种研究和开发应用，例如用于药物发现和对各种生物系统的基础研究。带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的产生被描述在国际申请WO90/10077和WO90/04036中。WO90/04036描述了具有整合人免疫球蛋白“小型（mini）”基因座的转基因小鼠。WO90/10077描述了用于产生转基因动物的包含免疫球蛋白显性控制区的载体。

已经开发用人免疫球蛋白序列替换内源性小鼠免疫球蛋白区，以产生用于药物发现目的的部分人抗体或完全人抗体的大量方法。这样的小鼠的实例包括被描述在以下中的那些，例如，美国专利第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号；和第5,591,669号。完全人源化免疫球蛋白的小鼠中的许多具有低于正常速率的抗体产生，这是由于较低效的V(D)J重组和由部分基因互补（partialgenecomplement）造成的有限的抗体产生。由于个体小鼠外显子用同线性（syntenic）的人对应物替换的途径，小鼠编码序列已经用人序列“交换”的其他完全人源化免疫球蛋白的小鼠的产生是非常费时的和高成本的。

基于前述内容，明显的是，对有效产生人抗体的高效的和有成本效益的方法存在需求。更特别地，本领域中对包括人免疫球蛋白区的非人脊椎动物和具有适当地响应抗原的能力的转基因动物存在需求。

发明概述

根据前述目的，提供了能够产生具有人V区的抗体的转基因非人动物。

提供该概述来以简化形式介绍概念的选择，所述概念在下文在详细描述中进一步描述。该概述不意图确定所要求保护的主题的关键或必要特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从包括在附图中阐明的和所附的权利要求中界定的那些方面的以下书面详细描述，所要求保护的主题的其他特征、细节、实用性和优点将是明显的。

本发明包括非人脊椎动物细胞和非人脊椎动物，所述非人脊椎动物细胞和非人脊椎动物具有包括被引入的部分人免疫球蛋白区（partiallyhumanimmunoglobulinregion）的基因组，所述被引入的区包括人免疫球蛋白可变区基因座编码序列和基于非人脊椎动物的内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列。优选地，本发明的转基因细胞和动物具有内源性免疫球蛋白区的一部分或全部被除去的基因组。

最少地，在非人脊椎动物中生产人单克隆抗体要求宿主具有将表达人免疫球蛋白重链蛋白的至少一个基因座和将表达人免疫球蛋白轻链蛋白的一个基因座。

在一些方面，部分人免疫球蛋白可变区基因座包括人V_H编码序列和基于非人脊椎动物的内源性V_H区的非编码V_H序列。在这些方面，部分人免疫球蛋白可变区基因座还包括人D和J基因编码序列和基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因序列。在这些方面，从所述脊椎动物宿主基因组缺失内源性V_H、D和J序列的一部分或全部。

在其他方面，免疫球蛋白区包括被引入的区，所述被引入的区包括人V_L编码序列和基于非人脊椎动物的内源性V_L区的非编码V_L序列。更优选地，包括人V_L编码序列的被引入的部分人免疫球蛋白区还包括人J基因编码序列和基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码J基因序列。

在某些方面，脊椎动物是哺乳动物，且优选地，哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。在其他方面，脊椎动物是禽类，例如，鸡。

在一个具体的方面，本发明提供了一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括：a)将两个或更多个重组酶靶向位点引入非人脊椎动物细胞中以及在包括内源性免疫球蛋白可变区基因座的基因组区的上游将至少一个位点整合入所述细胞的基因组中并在包括所述内源性免疫球蛋白可变区基因座的基因组区的下游将至少一个位点整合入所述细胞的基因组中；和b)将包括人免疫球蛋白可变区编码序列和基于非人脊椎动物宿主的内源性免疫球蛋白可变区的非编码序列的部分人免疫球蛋白可变区基因座经由重组酶介导的交换引入非人脊椎动物宿主细胞中。

在该方法的具体的方面，被引入的部分人免疫球蛋白区包括人V_H基因编码区，且还包括i)人D和J基因编码序列和ii)基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。优选地使用重组酶靶向位点来将部分人免疫球蛋白区引入宿主细胞中，所述重组酶靶向位点在内源性V_H免疫球蛋白基因的上游和内源性D和J基因区的下游被引入。

在其他方面，V_H基因编码区(至少部分地)源自其他来源-例如，它们可以是合理地或以其他方式设计的序列、是人序列和其他设计序列的组合的序列、或来自其他物种例如非人灵长类的序列。

在又一个具体的方面，被引入的部分人免疫球蛋白区包括人V_L基因编码区，且还包括i)人J基因编码序列和ii)基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码J基因序列。优选地使用重组酶靶向位点将部分人免疫球蛋白区引入宿主细胞中，所述重组酶靶向位点在内源性V_L免疫球蛋白基因的上游和内源性J区的下游被引入。优选地，所述重组酶位点与一个或多个选择性标记一起被引入。

优选地，部分人免疫球蛋白区作为单一核酸被合成，且作为单一核酸区被引入非人脊椎动物宿主细胞中。部分人免疫球蛋白区还可以以两个或更多个毗连区段（contiguoussegment）被合成，且以这些离散区段（discretesegment）被引入脊椎动物宿主细胞中。优选地，所述可变基因区是V_H基因区。部分人核酸还可以使用重组方法来产生，且在将所述核酸引入非人脊椎动物宿主细胞之前被分离。

在另一个优选的方面，该方法还提供在步骤b)之前缺失侧翼为两个被引入的重组酶位点的基因组区。

在另一个方面，本发明提供了用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括：a)将不能够彼此重组的两个或更多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组中，其中至少一个重组位点在内源性免疫球蛋白可变区基因座的上游被引入，且至少一个重组位点在内源性免疫球蛋白可变区基因座的下游被引入；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人免疫球蛋白可变区编码序列和ii)基于宿主细胞的内源性免疫球蛋白可变区的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为在a)的宿主细胞的内源性可变免疫球蛋白区的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)将步骤b)的载体以及能够识别两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入细胞；d)允许在a)的细胞的基因组和部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用部分人免疫球蛋白区基因座替换内源性免疫球蛋白可变区基因座。在该方法的具体的方面，部分人免疫球蛋白区包括V_H免疫球蛋白基因编码序列，且还包括i)人D和J基因编码序列和ii)基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。重组酶靶向位点在内源性V_H免疫球蛋白基因的上游和内源性D和J基因序列的下游被引入。

在该方法的另一个具体的方面，方法还提供了在步骤c)之前缺失侧翼为两个被引入的重组酶位点的基因组区。

在另一个方面，本发明提供一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括：a)将不能够彼此重组的两个或更多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组中，其中至少一个重组位点在内源性V_H免疫球蛋白区的上游被引入，且至少一个重组位点在所述内源性V_H免疫球蛋白区的下游被引入；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人V_H编码序列和ii)基于所述宿主细胞的所述内源性V_H区的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为在a)的所述宿主细胞的所述内源性V_H免疫球蛋白区的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)将步骤b)的所述载体以及能够识别所述两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入所述细胞中；和d)允许在a)的所述细胞的所述基因组和所述部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用所述部分人免疫球蛋白区替换所述内源性V_H免疫球蛋白区。

在该方法的一个具体的方面，其中所述第一重组酶位点可以在包括所述内源性V_H免疫球蛋白基因的基因组区的上游被引入，且所述第二重组酶位点可以在包括所述内源性V_H免疫球蛋白基因的基因组区的下游被引入。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述部分人免疫球蛋白区还可以包括i)人D和J基因编码序列和ii)基于所述非人宿主的所述内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述方法还提供了在步骤c)之前缺失侧翼为所述两个被引入的重组酶位点的所述基因组区。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述细胞可以是胚胎干(ES)细胞。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述方法还提供了选择包括所述部分人免疫球蛋白区的细胞和分离所述细胞。

在另一个方面，本发明提供一种用于产生包括部分人免疫球蛋白可变区基因座的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括：a)将不能够彼此重组的两个或更多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组，其中至少一个重组位点在内源性V_L免疫球蛋白区的上游被引入，且至少一个重组位点在所述内源性V_L免疫球蛋白区的下游被引入；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人V_L编码序列和ii)基于所述宿主细胞的所述内源性V_L区的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为在a)的所述宿主细胞的所述内源性V_L免疫球蛋白区的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)将步骤b)的所述载体以及能够识别所述两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入所述细胞中；和d)允许在a)的所述细胞的所述基因组和所述部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用所述部分人免疫球蛋白区替换所述内源性V_L免疫球蛋白区。

在该方法的一个具体的方面，其中所述第一重组酶位点可以在包括所述内源性V_L免疫球蛋白基因的基因组区的上游被引入，且所述第二重组酶位点可以在包括所述内源性V_L免疫球蛋白基因的基因组区的下游被引入。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述部分人免疫球蛋白区还可以包括i)人J_L基因编码序列和ii)基于所述非人宿主的所述内源性基因组的非编码J_L基因序列。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述细胞可以是哺乳动物胚胎干(ES)细胞。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述细胞可以是禽类原生殖细胞。

本发明提供了用于产生转基因非人脊椎动物细胞的又一种方法，所述方法包括：a)提供具有包括两组位点特异性重组位点的基因组的非人脊椎动物细胞，所述两组位点特异性重组位点不能够彼此重组，且在宿主基因组的内源性免疫球蛋白区的一部分的侧翼；b)通过引入识别第一组位点特异性重组位点的重组酶来缺失基因组的内源性免疫球蛋白可变区基因座的一部分，其中基因组中的这样的缺失保留第二组位点特异性重组位点；c)提供包括侧翼为第二组位点特异性重组位点的部分人免疫球蛋白可变区基因座的载体，所述部分人免疫球蛋白可变区基因座包括人编码序列和基于内源性免疫球蛋白可变区的非编码序列；d)将步骤c)的载体和能够识别第二组重组酶位点的位点特异性重组酶引入细胞中；和e)允许在细胞的基因组和部分人免疫球蛋白可变区基因座之间发生重组事件，导致用部分人免疫球蛋白可变区基因座替换内源性免疫球蛋白可变区基因座。

优选地，用于上述方法中的每一个中的非人哺乳动物细胞是哺乳动物细胞，且更优选地是哺乳动物胚胎干(ES)细胞。在其他方面，细胞可以是禽类细胞，且优选地是禽类原生殖细胞。

一旦细胞已经经历内源性免疫球蛋白可变区基因座的替换，包括被引入的部分人免疫球蛋白可变区的细胞就被选择和优选地被分离。在本发明的优选的方面，细胞是非人哺乳动物胚胎干(ES)细胞，且被分离的ES细胞然后被利用来产生表达部分人免疫球蛋白可变区基因座的转基因非人哺乳动物。在其他方面，细胞是原生殖细胞，且被分离的生殖细胞然后被利用来产生表达部分人免疫球蛋白可变区的转基因非人禽类。

在另一个方面，本发明提供一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人脊椎动物细胞的方法，所述方法包括：a)将不能够彼此重组的两个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组中；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人V_H编码序列和ii)基于内源性V_H区的非编码序列，其中所述部分人区侧翼为a)的所述宿主细胞的基因组中的相同的两个位点特异性重组位点；c)将步骤b)的所述载体以及能够识别所述两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入所述细胞中；d)允许在a)的所述细胞的所述基因组和所述部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用所述部分人免疫球蛋白区替换所述内源性V_H免疫球蛋白区。

在该方法的一个具体的方面，其中所述部分人免疫球蛋白区还可以包括i)人D和J基因编码序列和ii)基于所述非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。

在该方法的另一个具体的方面，其中所述方法还提供了选择包括所述部分人免疫球蛋白可变区基因座的细胞和分离所述细胞。

在具体的方面，本发明提供了一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的非人哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：a)提供具有包含两个位点特异性重组位点的基因组的非人哺乳动物胚胎干(ES)细胞，所述两个位点特异性重组位点不能够彼此重组，且在免疫球蛋白区的一部分的侧翼；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区包括人免疫球蛋白可变区编码序列和基于内源性免疫球蛋白可变区的非编码序列，所述部分人区侧翼为在ES细胞中的免疫球蛋白区的一部分的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)使ES细胞和所述载体与能够识别两个重组酶位点的位点特异性重组酶在适当的条件下接触以促进重组事件，导致在ES细胞中用部分人免疫球蛋白区替换内源性免疫球蛋白区的一部分。

在另一个方面，本发明提供了一种用于产生包括部分人免疫球蛋白区的转基因非人哺乳动物的方法，所述方法包括：a)将不能够彼此重组的一个或多个位点特异性重组位点引入非人脊椎动物宿主的细胞的基因组中；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区具有i)人可变编码序列和ii)基于内源性可变区的非编码序列，其中部分人区侧翼为与被引入a)的宿主细胞的基因组的那些位点特异性重组位点相同的位点特异性重组位点；c)将步骤b)的载体和能够识别一组重组酶位点的位点特异性重组酶引入细胞中；d)允许在a)的细胞的基因组和部分人免疫球蛋白区之间发生重组事件，导致用部分人免疫球蛋白区替换内源性免疫球蛋白可变区；e)选择包括部分人免疫球蛋白区的细胞；和f)利用该细胞来产生包括部分人免疫球蛋白区的转基因动物。

在具体的方面，部分人免疫球蛋白区包括人V_H编码区、人D和J基因编码序列、和基于非人脊椎动物宿主的内源性基因组的非编码D和J基因以及前DJ序列。然后，位点特异性重组位点在内源性V_H免疫球蛋白基因的上游和内源性D和J基因区的下游被引入。

本发明提供了用于产生包括部分人免疫球蛋白区的转基因非人动物的另一种方法，所述方法包括：a)提供具有包括两组位点特异性重组位点的基因组的非人脊椎动物细胞，所述两组位点特异性重组位点不能够彼此重组，且在宿主基因组的内源性免疫球蛋白可变区基因座的一部分的侧翼；b)通过引入识别第一组位点特异性重组位点的重组酶来缺失宿主基因组的内源性免疫球蛋白区的一部分，其中基因组中的这样的缺失保留第二组位点特异性重组位点；c)提供包括部分人免疫球蛋白可变区基因座的载体，所述部分人免疫球蛋白可变区基因座具有人编码序列和基于内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列，所述内源性免疫球蛋白可变区基因座侧翼为第二组位点特异性重组位点；d)将步骤c)的载体和能够识别所述第二组位点特异性重组位点的位点特异性重组酶引入细胞中；e)允许在细胞的基因组和部分人免疫球蛋白可变区之间发生重组事件，导致用部分人免疫球蛋白可变区替换内源性免疫球蛋白区；f)选择包括部分人免疫球蛋白可变区的细胞；和g)利用该细胞来产生包括部分人免疫球蛋白可变区的转基因动物。

本发明提供了用于产生包括部分人免疫球蛋白区的转基因非人哺乳动物的又一种方法，所述方法包括：a)提供具有包含两个位点特异性重组位点的基因组的非人哺乳动物胚胎干(ES)细胞，所述两个位点特异性重组位点不能够彼此重组，且在免疫球蛋白区的一部分的侧翼；b)提供包括部分人免疫球蛋白区的载体，所述部分人免疫球蛋白区包括人可变编码序列和基于内源性可变基因区的非编码序列，所述部分人区侧翼为在ES细胞中的免疫球蛋白区的一部分的侧翼的相同的两个位点特异性重组位点；c)使所述ES细胞和所述载体与能够识别两个重组酶位点的位点特异性重组酶在适当的条件下接触以促进重组事件，导致在ES细胞中用部分人免疫球蛋白区替换内源性免疫球蛋白区的一部分；d)选择包括核酸的被替换的部分的ES细胞和使用所述胚胎干细胞；和e)利用该细胞来产生包括部分人免疫球蛋白可变区基因座的转基因动物以产生杂合的部分人动物。

在本发明的具体的方面，转基因非人脊椎动物是哺乳动物，且优选地，哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。在其他方面，转基因非人脊椎动物是禽类，例如，鸡。

本发明的目的是提供表达被引入的免疫球蛋白可变区基因座的非人脊椎动物细胞和非人转基因哺乳动物，所述被引入的免疫球蛋白可变区基因座具有人可变区编码序列和基于内源性宿主基因组的非编码序列。

此外，目的是从能够表达具有人V_H序列的部分人抗体的转基因动物提供B-细胞，其中这样的B-细胞被永生化以提供对特定抗原特异性的单克隆抗体的来源。

又一个目的是提供从B细胞克隆的人可变区，以用于生产和/或优化用于诊断和治疗用途的抗体。

本发明的另外的目的是提供能够产生具有人可变区序列的部分人单克隆抗体的杂交瘤细胞。

在下面更详细地描述这些和其他方面、目的和特征。

附图简述

图1阐明了阐述来自本发明的优选实施方案的一种示例性方法的流程图。

图2是阐明经由同源性靶向载体将第一组位点特异性重组位点引入非人哺乳动物细胞的基因组的示意图。

图3是阐明经由同源性靶向载体将第一组位点特异性重组位点引入非人哺乳动物细胞的基因组的另一个示意图。

图4是阐明经由同源性靶向载体将第二组位点特异性重组位点引入非人哺乳动物细胞的基因组的示意图。

图5是阐明缺失宿主细胞的内源性免疫球蛋白区的示意图。

图6是阐明经由位点特异性靶向载体引入部分人免疫球蛋白区的示意图。

图7是阐明使用位点特异性靶向载体引入包括另外的小鼠序列的部分人免疫球蛋白区的示意图。

图8是阐明将包括另外的小鼠序列的部分人免疫球蛋白区引入小鼠重链区中的示意图。

图9是阐明将包括另外的小鼠序列的部分人免疫球蛋白区引入小鼠κ区中的示意图。

图10是阐明将包括另外的小鼠序列的部分人免疫球蛋白区引入小鼠λ区中的示意图。

图11是阐明经由位点特异性靶向载体引入包括人V_H小基因(minigene)的部分人免疫球蛋白区的示意图。

定义

本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员理解的平常的和普通的意思。除非特别表明，否则以下定义意图帮助阅读者理解本发明，但不意图改变或以其他方式限制这样的术语的意思。

如本文使用的“部分人（partiallyhuman）”是指具有来自人和非人哺乳动物两者的序列的核酸或包括具有来自人和非人哺乳动物两者的序列的核酸的动物。在本发明的部分人序列的上下文中，部分人核酸具有人免疫球蛋白编码区的序列和基于非人哺乳动物的内源性免疫球蛋白区的非编码序列的序列。当关于来自非人哺乳动物的内源性非编码序列使用时的术语“基于”是指，对应于非编码序列且与宿主哺乳动物的内源性基因座的非编码序列共有相对高的同源性程度的序列，宿主哺乳动例如从其得到ES细胞的哺乳动物。优选地，非编码序列与正向其引入包括该非编码序列的部分人分子的非人脊椎动物宿主细胞的内源性基因座中存在的相应的非编码序列共有至少80%，更优选地90%同源性。

术语“同源性靶向载体”是指包括编码靶向序列的核酸、位点特异性重组位点和任选的选择性标记基因的载体，其用于在宿主细胞中利用同源性介导的重组来修改免疫球蛋白区。例如，同源性靶向载体可以用在本发明中以将位点特异性重组位点引入宿主细胞基因组的特定区。

如本文使用的术语“免疫球蛋白可变区”是指编码抗体分子的可变区的全部或一部分或控制抗体分子的表达的调控性核苷酸序列的全部或一部分的核苷酸序列。重链的免疫球蛋白区可以包括但不限于V、D、J和转换区的全部或一部分，包括内含子。轻链的免疫球蛋白区可以包括但不限于V和J区、它们的上游侧翼序列、与轻链恒定区基因相关联（associatedwith）或邻近的内含子。

“位点特异性重组”是指在两个相容的重组位点之间的重组过程，包括以下三个事件中的任一个：a)缺失侧翼为该重组位点的预选的核酸；b)反转侧翼为重组位点的预选的核酸的核苷酸序列；和c)相互交换（reciprocalexchange）位于不同核酸分子上的最接近重组位点的核酸区。应理解，如果核酸分子中的一个或两个是环形的，则核酸区段的这种相互交换导致整合事件。

术语“靶向序列”是指与细胞的基因组中在待修改的免疫球蛋白区的区域侧翼或在待修改的免疫球蛋白区的区域邻近出现的DNA序列同源的序列。侧翼或邻近序列可以在基因座本身内或在宿主细胞的基因组中的编码序列的上游或下游。靶向序列被插入用于转染的重组DNA载体中，使得插入细胞基因组中的序列例如重组位点的序列侧翼为载体的靶向序列。

如本文使用的术语“位点特异性靶向载体”是指包括编码位点特异性重组位点的核酸、部分人核酸和任选的选择性标记基因的载体，其用于使用重组酶介导的位点特异性重组来修改宿主中的内源性免疫球蛋白区。靶向载体的重组位点适合于与已经插入宿主细胞的基因组序列中(例如，经由同源性靶向载体)、邻近待修改的免疫球蛋白区的另一个相应的重组位点进行位点特异性重组。将部分人序列整合入免疫球蛋白区中的重组位点导致内源性区被引入的部分人区替换。

本文使用术语“转基因”来描述已经或即将被人工插入细胞且特别地是脊椎动物宿主动物的细胞的基因组中的遗传物质。如本文使用的术语“转基因”是指部分人核酸，例如，以表达构建体和/或靶向载体的形式的部分人核酸。

对于“转基因动物”，是指具有作为在其细胞的一部分中的染色体外元件存在或稳定地整合入其种系DNA中(即，在其大部分或全部细胞的基因组序列中)的外源性核酸序列的非人动物，通常哺乳动物。在本发明中，通过根据本领域熟知的方法对例如宿主动物的胚胎或胚胎干细胞进行遗传操作来将部分人核酸引入这样的转基因动物的种系。

“载体”包括无论是自我复制的还是不是自我复制的、可以用于转化或转染细胞的质粒和病毒以及任何DNA或RNA分子。

发明详细描述

除非另外表明，否则本文描述的技术的实践可以采用在本领域内实践的技术人员的技术内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和说明。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、和使用标记检测杂交。合适技术的具体阐明可以通过参考本文的实施例得到。然而，当然还可以使用其他等效常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，例如Green等人编辑(1999)，GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries(第I-IV卷)；Weiner，Gabriel，Stephens编辑(2007)，GeneticVariation:ALaboratoryManual；Dieffenbach，Dveksler编辑(2003)，PCRPrimer:ALaboratoryManual；Bowtell和Sambrook(2003)，DNAMicroarrays:AMolecularCloningManual；Mount(2004)，Bioinformatics:SequenceandGenomeAnalysis；Sambrook和Russell(2006)，CondensedProtocolsfromMolecularCloning:ALaboratoryManual；以及Sambrook和Russell(2002)，MolecularCloning:ALaboratoryManual(全部来自ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Stryer，L.(1995)Biochemistry(第4版)W.H.Freeman，NewYorkN.Y.；Gait，"OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach"1984，IRLPress，London;Nelson和Cox(2000)，Lehninger，PrinciplesofBiochemistry第3版，W.H.FreemanPub.，NewYork，N.Y.；和Berg等人(2002)Biochemistry，第5版，W.H.FreemanPub.，NewYork，N.Y.，它们全部为了所有的目的通过引用以其整体并入本文。

注意如本文和在所附的权利要求中使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括复数指示物。因此，例如，对“一个基因座”的提及是指一个或多个基因座，且对“该方法”的提及包括对本领域技术人员已知的等效步骤和方法的提及，等等。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。为了描述和公开可以与目前所描述的发明结合使用的装置、制剂和方法学的目的，本文提及的所有出版物通过引用并入。

当提供值的范围时，应理解，在该范围的上限和下限之间的每一个插入值（interveningvalue）和在该所述范围中的任何其他所述值或插入值被包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围中，且还被包括在本发明内，服从所述范围中的任何特别地排除的限值。当所述范围包括限值中的一个或两个时，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。

在以下描述中，阐述许多具体的细节以提供对本发明的更充分的理解。然而，对本领域技术人员来说将明显的是，在没有这些具体的细节中的一个或多个的情况下可以实践本发明。在其他情况中，没有描述熟知的特征和本领域技术人员熟知的程序以避免使本发明不清楚。

大体的发明

在体液免疫系统中，通过在被称为V(D)J重组的过程中IgH(Igh)和IgL链(Igl)基因座位的组合和接合多样化来产生多样化抗体谱。在正在发育的B细胞中，在重链基因座的一个D基因区段和一个J基因区段之间发生第一重组事件，且在这两个基因之间的DNA被缺失。该D-J重组接着是从新形成的DJ复合物的上游的区接合一个V基因，形成重排的V(D)J基因。现在从单个B细胞的基因组缺失在新的V(D)J基因的V区段和D区段之间的所有其他基因。该重排的基因最终在B细胞表面上作为IgH多肽被表达，其与IgL联合以形成B细胞受体。鼠科动物和人Ig基因座是高度复杂的，跨越约2Mb的区域，包含若干恒定区基因区段、J基因区段、D基因区段和较大数量的可变基因。

本发明提供包括被引入的部分人核酸的非人脊椎动物细胞，被引入的部分人核酸包括人可变区的编码区和来自脊椎动物宿主基因组的非编码序列，例如，当宿主哺乳动物是小鼠时，小鼠基因组的非编码序列。该部分人核酸允许转基因动物产生包括人V_H区的重链谱，而保留可以在帮助促进有效的抗体产生和抗原识别的特定宿主基因组中的间插序列内见到的调控序列和其他元件。本发明包括使用包括人编码序列和来自V_H基因座的非人非编码序列两者的合成的或重组产生的部分人区。

因为本发明的方法可以利用在工程化基因组内的两组或更多组位点特异性重组位点，所以重组步骤允许向部分人基因座进行多重插入。

在本发明的优选的方面，待被引入宿主脊椎动物细胞中的该部分人区包括全部或相当大数量的已知的人V_H基因。然而，在一些情况下，可能期望能够使用一小组这样的V_H基因，且在具体的情况下，甚至少至一个人V_H编码序列可以用于本发明的细胞和动物中。

本发明的优选的方面包括包含部分人免疫球蛋白基因座的非人哺乳动物和哺乳动物细胞，部分人免疫球蛋白基因座包括人V_H基因且还包括D和J基因人编码区和基于非人哺乳动物宿主的内源性基因组的前DJ序列。在某些方面，被引入的部分人区可以包括一个或多个完全重组的V(D)J区段。

在本发明的具体的方面，转基因非人哺乳动物包括被引入的核酸，被引入的核酸包括具有基于非人哺乳动物宿主基因座中的间插序列的间插序列的多个人V_H基因以及人D和J基因的人编码区。在特别优选的方面，部分人核酸包括人V_H基因、基于非人哺乳动物宿主的基因组例如小鼠基因组的前D区、以及人D和J外显子。

在示例性的实施方案中，如在实施例部分中更详细阐述的，小鼠的全部内源性V_H免疫球蛋白基因座(包括J558基因座)被缺失，且小鼠的J558V_H区基因座的V_H外显子被包括44个人V_H基因的核酸代替，其因此，被点缀有对应于小鼠的非编码序列的非编码区。完整的被引入的免疫球蛋白V_H区还包括人D和J外显子以及V_H基因。在该方面，10Kb前D区包括小鼠序列，而D和J区包括人编码序列。优选地，D和J区作为包括人D基因和人J基因的人DJ编码区被提供。

本发明的方法利用同源重组和位点特异性重组的组合来产生本发明的细胞和动物。同源性靶向载体首先用于在内源性免疫球蛋白基因座的所需位置处将位点特异性重组位点引入宿主哺乳动物基因组中。经由相关联的靶向序列与基因组DNA在体内的同源重组将位点特异性重组位点插入基因组序列优选地不会修改由转染细胞表达的抗体分子的氨基酸序列。该方法保持免疫球蛋白基因的正确的转录和翻译，这在插入重组位点和任选的任何另外的序列例如选择性标记基因之后产生所需的抗体。然而，在一些情况下，可以将重组酶位点和其他序列插入免疫球蛋白基因座序列中，使得抗体分子的氨基酸序列通过插入而被改变，但抗体仍保留用于所需目的的足够功能性，且本发明设想也包括这样的插入。

示例性的同源重组方法学被描述在美国专利第6,689,610号；第6,204,061号；第5,631,153号；第5,627,059号；第5,487,992号；和第5,464,764号中，它们中的每一个通过引用以其整体并入。

在本发明的具体的方面，同源性靶向载体可以用来替换在同源性基因组内的某些序列以及引入位点特异性重组位点和选择性标记。例如，用于在V_H基因区的3'引入元件的同源性靶向可以用于使用人等效物替换小鼠前D和DJ序列。

位点特异性重组

位点特异性重组不同于一般的同源重组，因为重组酶识别所需要的短的特异性DNA序列是发生重组的唯一位点。位点特异性重组需要专用的重组酶来识别位点和在这些位点处催化重组。许多噬菌体和酵母衍生的位点特异性重组系统，各自包括重组酶和特异性同源位点，已经被表明在真核细胞中对于DNA整合的目的起作用，且因此适合用于本发明中，且这些包括位点特异性重组酶的酪氨酸家族的噬菌体P1Cre/lox、酵母FLP-FRT系统和Dre系统。这样的系统和使用方法被描述在例如美国专利第7,422,889号；第7,112,715号；第6,956,146号；第6,774,279号；第5,677,177号；第5,885,836号；第5,654,182号；和4,959,317号中，它们通过引用并入本文，以教导使用这样的重组酶的方法。重组酶介导的盒式交换(RMCE)程序通过使用野生型和突变的loxP(或FRT等)位点连同阴性选择的组合来促进。然而，当仅使用非突变位点和/或在没有选择的情况下时，重组酶介导的盒式交换程序将发生。但效率是非常低的，因为有利于切除而不是插入反应且(没有结合阳性选择)将不存在适当突变的细胞的富集。

已知酪氨酸家族的其他系统例如噬菌体λInt整合酶、HK2022整合酶以及另外属于重组酶的单独的丝氨酸家族的系统例如噬菌体phiC31、R4Tp901整合酶在哺乳动物细胞中使用它们相应的重组位点起作用(Tranche，F.等人2002)，且还可适用于本发明。

本发明的方法优选地利用位点特异性重组位点，该位点特异性重组位点利用相同的重组酶，但不会促进在位点之间的重组。例如，LoxP位点和突变的LoxP位点可以被整合入宿主的基因组中，但将Cre引入宿主中将不会使这两个位点有利于重组；相反，LoxP位点将与另一个LoxP位点重组，且突变的位点将仅与另一个同样突变的LoxP位点重组。这样的突变的重组位点的实例包括包含反向重复序列的组合的那些或包括具有突变的间隔序列的重组位点的那些。例如，两类变异重组酶位点可用于工程化稳定的Cre-loxP整合重组。两者采用在8bp间隔区内或在13-bp反向重复序列内的Cre识别序列中的序列突变。间隔突变体例如lox511(HoessRH等人，NucleicAcidsRes1986，14：2287-2300)、lox5171和lox2272(LeeG和SaitoI，Gene1998，216：55-65)、m2、m3、m7和m11(LangerSJ等人，NucleicAcidsRes2002，30：3067-3077)容易地与它们自己重组，但与野生型位点具有显著降低的重组率。该类突变体通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)使用不互相作用的Cre-Lox重组位点和不互相作用的FLP重组位点而被开发用于DNA插入(BaerA和BodeJ，CurrOpinBiotechnol2001，12：473-480；AlbertH等人，PlantJ1995，7：649-659；SeiblerJ和BodeJ，Biochemistry1997，36：1740-1747；SchlakeT和BodeJ，Biochemistry1994，33：12746-12751)。

反向重复突变体表示第二类变异重组酶位点。例如，LoxP位点可以包含在左反向重复序列(LE突变体)或右反向重复序列(RE突变体)中的改变的碱基。LE突变体lox71在左反向重复序列的5'端具有从野生型序列改变成TACCG的5bp(ArakiK等人，NucleicAcidsRes1997，25：868-872)。同样地，RE突变体lox66具有改变成CGGTA的五个最3'端碱基（3'-mostbase）。反向重复突变体用于将质粒插入片段整合入具有LE突变体的染色体DNA，其中LE突变体被指定为“靶”染色体loxP位点，“供体”RE突变体重组入其中。重组后的loxP位点以顺式定位，在所插入的区段的侧翼。重组机制是使得重组后的一个loxP位点是双重突变体(包含LE和RE反向重复突变两者)，且另一个是野生型(LeeL和SadowskiPD，ProgNucleicAcidsResMolBiol2005，80：1-42；LeeL和SadowskiPD，JMolBiol2003，326：397-412)。双重突变体充分地不同于野生型位点，其不被Cre重组酶识别，且插入的区段不被切除。

在某些方面，位点特异性重组位点可以被引入内含子而不是编码核酸区或调控序列中。这可以在将位点特异性重组位点插入动物细胞的基因组中之后避免疏忽地干扰适当的抗体表达所需的任何调控序列或编码区。

位点特异性重组位点的引入可以通过常规同源重组技术来实现。这样的技术被描述在参考文献，例如诸如Sambrook和Russell(2001)(Molecularcloning:alaboratorymanual第3版(ColdSpringHarbor，N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress)和Nagy，A.(2003).(Manipulatingthemouseembryo:alaboratorymanual，第3版(ColdSpringHarbor，N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress)。FredericP.Miller，AgnesF.Vandome和JohnMcBrewster的GeneticRecombination:Nucleicacid，Homology(biology)，Homologousrecombination，Non-homologousendjoining，DNArepair，Bacteria，Eukaryote，Meiosis，Adaptiveimmunesystem，V(D)Jrecombination(平装本-2009年12月23日)。

特异性重组入基因组可以使用设计为如本领域已知的阳性或阴性选择的载体来促进。为了利于识别已经经历替换反应的细胞，可以采用适当的遗传标记系统，且通过例如使用选择性培养基来选择细胞。然而，为了确保基因组序列在替换间隔的两个端点处或邻近两个端点基本上不含外来核酸序列，期望在选择包含被替换的核酸的细胞之后，可以除去标记系统/基因。

在本发明的方法的一个优选的方面，已经发生内源性免疫球蛋白的全部或一部分的替换的细胞，在暴露于毒素或药物之后被阴性地选择。例如，保留HSV-TK的表达的细胞可以通过适当使用核苷类似物例如更昔洛韦来选择。在本发明的另一个方面，包括内源性免疫球蛋白区的缺失的细胞可以通过使用标记基因而被阳性地选择，标记基因可以在重组事件之后或由于重组事件而任选地被从细胞除去。可以被使用的阳性选择系统是基于使用标记基因例如HPRT的两个非功能部分，这两个非功能部分通过重组事件而被结合在一起。在进行成功的替换反应之后，使这两个部分实现功能关联（functionalassociation），且其中功能上重新构建的标记基因在侧翼的任一侧上为另外的位点特异性重组位点(其不同于用于替换反应的位点特异性重组位点)，使得使用适当的位点特异性重组酶，可以从基因组切除标记基因。

重组酶可以作为纯化蛋白或在细胞内被瞬时表达以便提供重组酶活性的构建体而被提供。可选择地，细胞可以用于产生转基因动物，该转基因动物可以与表达所述重组酶的动物杂交，以便产生缺乏标记基因和相关联的重组位点的后代。

转基因动物的产生

在具体的方面，本发明提供用于产生包括被引入的部分人免疫球蛋白区的转基因动物的方法。

在一个方面，用于替换内源性免疫球蛋白基因的宿主细胞是胚胎干(ES)细胞，该胚胎干(ES)细胞然后可以用于产生转基因哺乳动物。因此，根据一个方面，本发明的方法还包括：分离包括被引入的部分人免疫球蛋白区的胚胎干细胞和使用所述ES细胞来产生包含被部分替换的免疫球蛋白基因座的转基因动物。

在另一个实例，转基因动物是禽类，且使用原生殖细胞来生产动物。因此，根据另一个方面，本发明的方法还包括：分离包括被引入的部分人免疫球蛋白区的原生殖细胞和使用所述生殖细胞来产生包含被部分替换的免疫球蛋白基因座的转基因动物。用于生产这样的转基因禽类的方法被公开在例如美国专利第7,323,618号和第7,145,057号，它们通过引用并入本文。

实施例

提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开内容和描述，且不意图限制发明人认为是他们的发明的内容的范围，它们也不意图表示或暗示下面的实验是所进行的所有实验或唯一实验。本领域技术人员应明白，可以对如在具体的实施方案中所显示的本发明进行许多变化和/或修改，而不偏离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，呈现的实施方案在各个方面应被认为是说明性的而不是限制性的。

已经努力确保关于所使用的术语和数字(例如，载体、量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外表明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是以摄氏度计，且压力是大气压或接近大气压。

实施例阐释了通过在重组位点侧翼的5'载体和3'载体两者的靶向和合成的DNA的引入。在阅读说明书之后，对本领域技术人员将是明显的是，可以首先发生5'载体靶向，接着发生3'载体靶向，或可以发生3'载体靶向，接着发生5'载体靶向。在一些情况下，靶向可以同时用双检测机制来进行。

实施例1：将部分人免疫球蛋白区引入小鼠基因组的V_H基因座位。

在图1-6中阐明用部分人免疫球蛋白区替换哺乳动物基因组的一部分的示例性方法。图1示出阐明本发明的方法的该示例性方面的不同步骤的流程图。该方法提供了将第一位点特异性重组位点引入哺乳动物基因组中，其可以在哺乳动物基因组的内源性V_H区的5'或3'被引入。然后，这接着是将第二位点特异性重组位点引入哺乳动物基因组102，第二位点特异性重组位点与第一位点特异性重组位点组合位于内源性免疫球蛋白区侧翼。侧翼的内源性区被缺失104，且包括人序列和非人序列两者的合成核酸经由重组酶介导的交换被引入106。

阐明将部分人小鼠-人免疫球蛋白区引入小鼠ES细胞的基因组的基因座的示例性方法在图2-6中更详细地阐明。在图2中，提供包括嘌呤霉素磷酸转移酶-胸苷激酶融合蛋白(puroΔTK)203的同源性靶向载体201，嘌呤霉素磷酸转移酶-胸苷激酶融合蛋白(puroΔTK)203侧翼为两个不同的重组酶识别位点，例如，对于Flp和Cre的FRT207和loxP205，和分别不具有与未修饰位点207和205重组的能力的例如对于FRT209和loxP211的修饰位点。靶向载体包括人白喉毒素受体(hDTR)cDNA217，以供在未来的步骤中表达被引入的构建体的细胞的阴性选择中使用。靶向载体还任选地包括视觉标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)(未示出)。区213和215分别与内源性小鼠基因座中的毗连区（contiguousregion）223的5'和3'部分同源，内源性小鼠基因座中的毗连区223是包括小鼠内源性V_H基因的基因组区219的5'。同源性靶向载体201被引入202小鼠ES细胞，小鼠ES细胞具有包括免疫球蛋白区的内源性V_H基因219、前D区221、J基因区225和恒定基因区227的免疫球蛋白区229。同源性靶向载体201的位点特异性重组位点和hDTRcDNA217被整合204入小鼠基因组中小鼠内源性V_H基因区的5'。

图3实际上阐明与图2相同的方法，除了加入另外的一组位点特异性重组位点，例如，用于与Dre重组酶一起使用的Rox位点331和修饰的Rox位点333。在图3中，提供包括嘌呤霉素磷酸转移酶-胸苷激酶融合蛋白303的同源性靶向载体301，嘌呤霉素磷酸转移酶-胸苷激酶融合蛋白303侧翼为重组酶识别位点FRT307、loxP305和Rox331，以及分别不具有与未修饰位点307、305和331重组的能力的对于FRT309、loxP311和Rox333的修饰位点。靶向载体还包括人白喉毒素受体(hDTR)cDNA317。区313和315分别与内源性小鼠基因座中的毗连区323的5'部分和3'部分同源，内源性小鼠基因座中的毗连区323位于包括小鼠内源性V_H基因的基因组区319的5'。同源性靶向载体301被引入302小鼠免疫球蛋白区329，小鼠免疫球蛋白区329包括免疫球蛋白区的内源性V_H基因319、前D区321、J基因区325和恒定基因区327。同源性靶向载体301的位点特异性重组位点和hDTRcDNA317被整合304入小鼠基因组中小鼠内源性V_H基因区的5'。

如图4阐明的，提供了第二同源性靶向载体401，第二同源性靶向载体401包括次黄嘌呤转磷酸核糖基转移酶(HPRT)小基因435和新霉素抗性基因437以及对于Flp和Cre的重组酶识别位点FRT407和loxP405，重组酶识别位点FRT407和loxP405具有与从第一同源性靶向载体整合的FRT407和loxP405位点重组的能力。区431和433分别与内源性小鼠基因座中的毗连区441的5'部分和3'部分同源，内源性小鼠基因座中的毗连区441位于包括小鼠内源性V_H、D和J基因的基因组区的3'和恒定基因区的5'。同源性靶向载体401被引入402修改的小鼠免疫球蛋白区，该修改的小鼠免疫球蛋白区包括内源性V_H基因419、前D区421、J基因区425和恒定基因区427。同源性靶向载体401的位点特异性重组位点和HPRT小基因435以及新霉素抗性基因437被整合404入小鼠基因组中小鼠内源性V_H基因区的5'。

一旦重组位点被引入宿主哺乳动物的基因组，然后就通过引入对应于基因组中的位点特异性重组位点的重组酶中的一种（在该实施例中为FLP或Cre），使免疫球蛋白域的内源性区经历重组。如图5阐明的，当FLP被引入502时，包含位点特异性重组位点(509、511、507和505)和puroΔTK基因503的区被保留，且另外的FLP重组位点507现在存在于其他两个重组位点507和505的3'。包括hDTR517、内源性免疫球蛋白域(519、521、525)以及使用第二同源性靶向载体引入的HPRT527和Neo529基因的位于重组位点3'的区被缺失。当Cre用于重组酶介导的缺失504时，缺失的区域是相同的，但仅一个位点特异性重组位点507直接继续保留在puroΔTK基因的3'。该程序取决于已经在相同的染色体上而不是在其同源物上(即，以顺式而不是以反式)发生的第二靶向。如果靶向以反式发生，则细胞在Cre重组之后将对阴性选择不敏感。

对于缺失内源性免疫球蛋白区的初级筛选可以通过DNA印迹来进行，或使用聚合酶链反应(PCR)初筛来进行，所述聚合酶链反应(PCR)初筛被用Southern筛选和/或天然等位基因丢失qPCR筛选（loss-of-nativealleleqPCRscreen）的次级筛选（secondaryscreen）所支持。HPRT将允许HPRT缺陷的ES细胞中的(6-硫鸟嘌呤依赖性)阴性选择。免疫球蛋白区被缺失的ES细胞可以通过阴性选择使用hDTR基因来选择。

图6阐明将部分人序列引入修饰的小鼠基因组。包括待被引入哺乳动物宿主基因组的部分人免疫球蛋白区610的位点特异性靶向载体629被引入602包括位点特异性重组位点(609、611、607和605)和puroΔTK基因603的具有已缺失的内源性免疫球蛋白区的基因组区601。位点特异性靶向载体包括部分人免疫球蛋白区，该部分人免疫球蛋白区包括i)V_H区619，其包括44个人V_H编码区和基于小鼠基因组内源性序列的间插序列；ii)10kb前DJ区621，其包括小鼠序列；和iii)DJ区625，其包括人D和J基因编码区和基于小鼠基因组内源性序列的间插序列。部分人免疫球蛋白区侧翼为将允许与修饰的内源性基因座重组的重组位点(609、611、605和607)。在引入适当的重组酶604之后，部分人免疫球蛋白区在恒定基因区627的上游被整合入基因组。

对于引入部分人免疫球蛋白区的初级筛选可以通过DNA印迹来进行，或使用PCR初筛来进行，所述PCR初筛被用Southern筛选和/或天然等位基因丢失qPCR筛选的次级筛选所支持。作为重组事件的一部分的HPRT基因605的缺失将允许使用(6-硫鸟嘌呤依赖性)阴性选择来鉴定未经历重组事件的细胞。

实施例2：将部分人免疫球蛋白区引入小鼠基因组。

在某些方面，部分人免疫球蛋白区将包括如实施例1所描述的元件，但具有另外的序列，例如，在战略上被加入以引入另外的调控序列，以确保在被引入的免疫球蛋白区内的所需的间距，以确保某些编码序列与邻近被替换的免疫球蛋白区的其他序列足够并置（juxtaposition）等的序列。图7阐明将第二示例性的部分人序列引入如图2-5产生的和上面实施例1所描述的修饰的小鼠基因组。

包括待被引入哺乳动物宿主基因组的部分人免疫球蛋白区710的位点特异性靶向载体729被引入702包括位点特异性重组位点(709、711、707和705)和puroΔTK基因703的具有已缺失内源性免疫球蛋白区的基因组区701。位点特异性靶向载体包括部分人免疫球蛋白区，该部分人免疫球蛋白区包括i)V_H区719，其包括1-43个人V_H编码区和基于小鼠基因组内源性序列的间插序列；ii)10kb前DJ区721，其包括小鼠序列；iii)DJ区725，其包括人D和J编码区和基于小鼠基因组内源性序列的间插序列；和iv)小鼠非功能J_H基因区。部分人免疫球蛋白区侧翼为将允许与修饰的内源性基因座重组的重组位点709、711、705和707)。在引入适当的重组酶704之后，部分人免疫球蛋白区在恒定基因区727的上游被整合入基因组。

如实施例1所描述的，对于引入部分人免疫球蛋白区的初级筛选可以通过DNA印迹来进行，或使用PCR初筛来进行，所述PCR初筛被用Southern筛选和/或天然等位基因丢失qPCR筛选的次级筛选所支持。作为重组事件的一部分的HPRT基因705的缺失将允许使用(6-硫鸟嘌呤依赖性)阴性选择来鉴定未经历重组事件的细胞。

实施例3：将部分人免疫球蛋白区引入小鼠基因组的免疫球蛋白重链基因座位。

图8中阐明使用部分人免疫球蛋白区替换哺乳动物基因组的一部分的方法。该方法利用将第一位点特异性重组位点引入哺乳动物基因组，接着将第二位点特异性重组位点引入哺乳动物基因组。两个位点在V_H、D_H和J_H区基因区段的整个簇的侧翼。使用相关联的位点特异性重组酶缺失侧翼的内源性区，如本文描述的。

用于在野生型小鼠免疫球蛋白区801的V_H、D_H和J_H区基因区段簇的任一侧上引入位点特异性重组酶位点的靶向载体803、805包括另外的位点特异性重组酶位点，该另外的位点特异性重组酶位点已经被修饰，使得其仍被重组酶有效地识别，但将不与未修饰位点重组。该位点在靶向载体中的定位使得在缺失V_H、D_H和J_H区基因区段簇之后，其可以用于DNA的非天然段移动到修饰的V_H基因座中的第二位点特异性重组事件。使用位点特异性重组酶使DNA移动到基因座中的过程被称为“重组酶介导的盒式交换”。在该实施例中，非天然DNA是包括人序列和非人序列两者的合成核酸。

两个基因靶向载体被构建以完成刚才概述的过程。载体之一803在最远端的可变区基因区段的上游包括从基因座的5'端获得的小鼠基因组DNA。另一个载体805在J区基因区段附近包括从基因座内获得的小鼠基因组DNA。

5'载体803的按从5’至3’的次序的主要特征如下：在偶联于来自多瘤病毒的两个突变的转录增强子的修饰的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因启动子的转录控制下的编码白喉毒素A(DTA)亚基的基因；定位在重链基因座中的最远端的可变区基因区段的上游的4.5Kb小鼠基因组DNA；J区基因区段(失效的)；Flp重组酶的FRT识别序列；包含小鼠Polr2a基因启动子的一段基因组DNA；翻译起始序列(嵌入“Kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)；Cre重组酶的突变的loxP识别序列(已知为lox5171位点)；转录终止/多聚腺苷酸序列；Cre重组酶的loxP识别序列；在来自小鼠磷酸甘油酸激酶1基因的启动子的转录控制下的编码由融合至胸苷激酶的截短形式的给予对嘌呤霉素的抗性的蛋白组成的融合蛋白(pu-TK)的基因；和定位为接近于载体中的4.5Kb序列且以天然相对定向布置的3Kb小鼠基因组DNA。

3'载体805的按从5’至3’的次序的主要特征如下：在偶联于来自多瘤病毒的两个突变的转录增强子的修饰的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因启动子的转录控制下的编码白喉毒素A(DTA)亚基的基因；包含小鼠J区基因区段的3.7Kb小鼠基因组DNA，该3.7Kb小鼠基因组DNA被定向为使得定位为最接近重链可变区基因区段的区的端部最接近载体中的DTA基因；在小鼠Polr2a基因启动子的转录控制下的编码人次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基转移酶(HPRT)的小基因；在小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子的控制下的新霉素抗性基因；Cre重组酶的loxP识别序列；和2.1Kb小鼠基因组DNA，其在基因组中的定位为刚好在3.7Kb片段的下游且以与在小鼠基因组中的配置相同的配置定向这两个片段。

小鼠胚胎干(ES)细胞(源自C57Bl/6NTac小鼠)根据广泛使用的程序通过使用3'载体805电穿孔来转化。在电穿孔之前，载体DNA用NotI限制性内切酶来线性化。已转染的细胞被铺板，且在≥24小时之后，将它们放置在使用新霉素类似物G418的药物选择下。在一个多星期之后在抗药性ES细胞集落变得凭肉眼可见之后，将抗药性ES细胞集落用物理方法从它们的板提取。将这些选定的集落解聚集，重新铺板在微孔板上，并培养若干天。此后，分开细胞克隆中的每一个，使得细胞中的一些可以作为档案（archive）被冷冻，且其余为分析的目的用于分离DNA。

来自ES细胞克隆的DNA通过PCR利用广泛使用的基因-靶向测定设计来筛选。使用四个测定，且在每一种情况下，PCR寡核苷酸引物序列中的一个映射（map）在3'载体805和基因组DNA之间共有的同一性的区域外部，而另一个映射在载体中的基因组同一性的两个臂之间的新DNA内(即，在HPRT或neo基因元件中)。根据标准设计，这些测定被设计为检测仅在源自转染细胞的细胞克隆中存在的DNA段，转染细胞已经经历在3'重靶向载体（3’heavytargetingvector）和基因组之间完全合理的同源重组。

使用3'载体805进行两次单独的转染。这些中的第一次使用四个PCR测定从筛选的约300个克隆产生总共两个阳性克隆。第二次也从所筛选的约300个克隆产生总共六个阳性克隆。来自两次转染的总共六个PCR-阳性克隆被选择用于增殖，随后使用DNA印迹测定来进一步分析。

DNA印迹测定根据广泛使用的程序使用三个探针和用多种限制性内切酶消化的基因组DNA来进行，多种限制性内切酶被选择为使得探针和消化的组合允许克隆中被靶向的基因座的结构被鉴定为被同源重组适当地修饰。探针中的一个映射在3'重靶向载体和基因组DNA之间共有的同一性的区域的一侧侧翼的DNA序列；第二探针映射在同一性的区域的外部但在其另一侧；且第三探针映射在载体中的基因组同一性的两个臂之间的新DNA内(即，在HPRT或neo基因元件中)。

ES细胞的六个PCR-阳性克隆使用被设计为辨别在小鼠ES细胞中出现的最通常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序来核型分析。具有这样的畸变的克隆被从进一步使用中排除。基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构且基于核型分析也不具有可检测的染色体畸变的ES细胞克隆，被选择用于进一步使用。

用5'载体803来修饰可接受的克隆，除了使用嘌呤霉素选择代替G418/新霉素选择之外，使用在设计上与3'载体805使用的那些程序和筛选测定基本上相同的程序和筛选测定。PCR测定、探针和消化还被定制为匹配通过5'载体805修饰的基因组区。

已经以预期方式通过3'重载体和5'重载体两者突变的ES细胞克隆，即，携带两个工程化突变的双靶向细胞在载体靶向之后被分离。克隆必须已经在同一染色体而不是同源染色体上经历基因靶向(即，由靶向载体产生的工程化突变必须是以顺式在同一DNA链上而不是以反式在单独的同源DNA链上)。通过分析程序例如中期染色体涂染（metaphasespread）的荧光原位杂交，使用与存在于两个基因靶向载体中在它们的基因组同一性的臂之间的新DNA杂交的探针，来辨别具有顺式布置的突变的克隆和具有反式布置的那些。两种类型的克隆还可以通过如下方式被彼此辨别：用表达Cre重组酶的载体转染它们和然后比较在针对通过5'载体803引入的胸苷激酶基因的更昔洛韦选择下存活的集落数量以及通过“亲缘种选择”筛选程序来分析存活克隆的抗药性表型，在“亲缘种选择”筛选程序中测试来自该克隆的细胞中的一些对嘌呤霉素或G418/新霉素的抗性。在该类型的实验中，具有顺式布置的突变的细胞预期比具有反式布置的细胞产生多约10³个更昔洛韦抗性克隆。大部分所得到的顺式衍生的更昔洛韦抗性克隆还对嘌呤霉素和G418/新霉素两者敏感，与应保留对两种药物的抗性的反式衍生的更昔洛韦抗性克隆相反。在重链基因座中具有顺式布置的工程化突变的细胞的双靶向克隆被选择用于进一步使用。

细胞的双靶向克隆用表达Cre重组酶的载体来转染，且随后将被转染的细胞放置在更昔洛韦选择之下，如在上面概述的分析实验中的。将细胞的更昔洛韦抗性克隆分离，并通过PCR和DNA印迹来分析通过5'重靶向载体和3'重靶向载体产生的两个工程化突变之间的预期的缺失的存在。在这些克隆中，Cre重组酶使得在通过两个载体引入重链基因座中的loxP位点之间发生重组802以产生在807中示出的构建体。因为loxP位点在两个载体中以相同的相对定向被布置，所以重组导致包括在两个loxP位点之间的完整基因组间隔的DNA环的切除。该环并不包含复制起点且因此在有丝分裂期间将不被复制，且因此当它们经历克隆增殖时将从细胞的克隆丢失。所得到的克隆携带最初在两个loxP位点之间的DNA缺失。

在免疫球蛋白重链基因座的两个同源拷贝中的一个中携带序列缺失的ES细胞克隆用Cre重组酶表达载体连同包括部分人免疫球蛋白重链基因座的一段DNA809来再转染804，部分人免疫球蛋白重链基因座包含V、D和J区基因区段。这段DNA809的主要特征如下：lox5171位点；新霉素抗性基因开放阅读框(缺乏起始甲硫氨酸密码子，但在框内且与lox5171位点中的不间断的开放阅读框毗连)；转录终止/多聚腺苷酸序列；FRT位点；44个人重链可变区基因区段的阵列，每一个由嵌入小鼠非编码序列的人编码序列组成；来自刚好在小鼠重链基因座中的D区基因区段的簇的上游的7.5Kb基因组DNA段；包含人D和J区基因区段的58KbDNA段；以与lox5171位点相反的相对定向的loxP位点。

将被转染的克隆放置在G418选择之下，G418选择富集已经经历重组酶介导的盒式交换过程的细胞克隆，在重组酶介导的盒式交换过程中部分人供体DNA809以其整体被整合入在loxP和lox5171位点之间被缺失的免疫球蛋白重链基因座中，以产生在811阐明的DNA区。来自5'载体803的剩余元件经由FLP介导的重组806来除去，导致如813所示的最终的人源化基因座。

G418抗性ES细胞克隆通过PCR和DNA印迹来分析，以确定它们是否已经经历预期的重组酶介导的盒式交换过程而没有不需要的重排或缺失。具有预期的基因组结构的克隆被选择用于进一步使用。

根据标准程序，将在小鼠重链基因座中携带部分人免疫球蛋白重链DNA813的ES细胞克隆显微注射入来自品系DBA/2的小鼠胚泡中，以产生部分ES细胞衍生的嵌合小鼠。对其皮毛（coat）具有最高水平的ES细胞衍生的贡献的雄性嵌合小鼠将被选择用于与雌性小鼠交配。此处选择的雌性小鼠将具有C57Bl/6NTac品系，且还将携带编码在它们的种系中被表达的Flp重组酶的转基因。对来自这些交配的后代分析部分人免疫球蛋白重链基因座的存在，和分析在重组酶介导的盒式交换步骤中产生的侧翼为FRT的新霉素抗性基因的丢失。携带部分人基因座的小鼠将用于建立小鼠群体。

实施例4：将部分人免疫球蛋白区引入小鼠基因组的免疫球蛋白κ链基因座位。

图9中阐明使用部分人免疫球蛋白区替换哺乳动物基因组的一部分的另一种方法。该方法提供将第一位点特异性重组位点引入哺乳动物基因组，其可以在哺乳动物基因组的V_K和J_K区基因区段的主要簇的5'或3'被引入；接着将第二位点特异性重组位点引入哺乳动物基因组，其与第一位点特异性重组位点组合在V_K和J_K区基因区段的整个簇的侧翼。然后可以使用相关联的位点特异性重组酶来缺失和替换侧翼的内源性区。

用于在V_K和J_K区基因区段簇901的任一侧上引入位点特异性重组酶位点的靶向载体还包括另外的位点特异性重组酶位点，该另外的位点特异性重组酶位点已经被修饰，使得其仍被重组酶有效地识别，但将不与未修饰位点重组。该位点在靶向载体中的定位使得在缺失V_K和J_K区基因区段簇之后，其可以用于第二位点特异性重组事件，其中DNA的非天然段经由重组酶介导的盒式交换移动到修饰的V_K基因座。在该实施例中，非天然DNA是包括人序列和非人序列两者的合成核酸。

两个基因靶向载体被构建以完成刚才概述的过程。载体903中的一个在最远端的可变区基因区段的上游包括从基因座的5'端获得的小鼠基因组DNA。另一个载体905在J区基因区段附近包括从基因座内获得的小鼠基因组DNA。

5'载体903的主要特征如下：在偶联于来自多瘤病毒的两个突变的转录增强子的修饰的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因启动子的转录控制下的编码白喉毒素A(DTA)亚基的基因；定位在κ链基因座中的最远端的可变区基因区段的上游的6Kb小鼠基因组DNA；Flp重组酶的FRT识别序列；包含小鼠Polr2a基因启动子的一段基因组DNA；翻译起始序列(嵌入“Kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)；Cre重组酶的突变的loxP识别序列(已知为lox5171位点)；转录终止/多聚腺苷酸序列；Cre重组酶的loxP识别序列；在来自小鼠磷酸甘油酸激酶1基因的启动子的转录控制下的编码由融合至胸苷激酶的截短形式的给予对嘌呤霉素的抗性的蛋白组成的融合蛋白(pu-TK)的基因；和定位为接近于载体中的6Kb序列且以天然相对定向布置的2.5Kb小鼠基因组DNA。

3'载体905的主要特征如下：在偶联于来自多瘤病毒的两个突变的转录增强子的修饰的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因启动子的转录控制下的编码白喉毒素A(DTA)亚基的基因；从κ基因座J区基因区段附近获得的6Kb小鼠基因组DNA，该6Kb小鼠基因组DNA被定向为使得定位为最接近κ可变区基因区段的片段的端部最接近载体中的DTA基因；在小鼠Polr2a基因启动子的转录控制下的编码人次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基转移酶(HPRT)的小基因；在小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子的控制下的新霉素抗性基因；Cre重组酶的loxP识别序列；3.6Kb小鼠基因组DNA，其在基因组的定位为刚好在也被包括在载体中的6Kb片段的下游且以与小鼠基因组相同的相对方式定向这两个片段。

源自C57Bl/6NTac小鼠的小鼠胚胎干(ES)细胞根据广泛使用的程序通过使用3'载体905电穿孔来转染。在电穿孔之前，载体DNA用NotI限制性内切酶来线性化。已转染的细胞被铺板，且在≥24小时之后，将它们放置在使用新霉素类似物G418的药物选择下。在一个多星期之后在抗药性ES细胞集落变得凭肉眼可见之后，将抗药性ES细胞集落用物理方法从它们的板提取。将这些选定的集落解聚集，重新铺板在微孔板上，并培养若干天。此后，分开细胞克隆中的每一个，使得细胞中的一些可以作为档案被冷冻，且其余为分析的目的用于分离DNA。

来自ES细胞克隆的DNA通过PCR利用广泛使用的基因-靶向测定设计来筛选。使用四个测定，且在每一种情况下，PCR寡核苷酸引物序列中的一个映射在3'载体905和基因组DNA901之间共有的同一性的区域外部，而另一个映射在载体中的基因组同一性的两个臂之间的新DNA内(即，在HPRT或neo基因元件中)。根据标准设计，这些测定被设计为检测仅在源自转染细胞的细胞克隆中存在的DNA段，转染细胞已经经历3'载体905和基因组之间完全合理的同源重组。

用3'载体905进行一次转染，且这使用四个PCR测定从筛选的约300个克隆产生总共十七个阳性克隆。

来自转染的总共六个PCR-阳性克隆被选择用于增殖，随后使用DNA印迹测定来进一步分析。DNA印迹测定根据广泛使用的程序来进行；它们包括三个探针和用多种限制性内切酶消化的基因组DNA，多种限制性内切酶被选择为使得探针和消化的组合允许得出关于以下的结论：克隆中的被靶向的基因座的结构和其是否已经被同源重组适当地修饰。探针中的一个映射在3'κ靶向载体和基因组DNA之间共有的同一性的区域的一侧侧翼的DNA序列；第二探针也映射同一性的区域的外部但在其另一侧；且第三探针映射在载体中的基因组同一性的两个臂之间的新DNA内(即，在neo基因中)。DNA印迹确定对应于κ基因座的正确突变的(通过与3'κ靶向载体同源重组)部分的预期的Eco911产生的DNA片段的存在，如通过外部探针中的一个和通过新霉素探针探测的(数据未示出)。外部探针探测突变片段且还探测来自同源染色体上的免疫球蛋白κ基因座的非突变拷贝的野生型片段。

ES细胞的六个PCR-阳性克隆也使用被设计为辨别在小鼠ES细胞中出现的最通常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序来核型分析。具有这样的畸变的一个克隆被从进一步使用中排除。基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的两个核型上正常的克隆，被选择用于进一步使用。

使用5'载体903来修饰两个克隆，除了使用嘌呤霉素选择代替G418/新霉素选择之外，使用在设计上与3'载体905使用的那些程序和筛选测定基本上相同的程序和筛选测定，且方案还被定制为匹配通过5'载体903修饰的基因组区。5'载体903转染实验的目标是分离已经以预期方式被3'载体905和5'载体903两者突变的ES细胞克隆，即，携带两个工程化突变的双靶向细胞。在这些克隆中，Cre重组酶使得在通过两个载体引入κ基因座的loxP位点之间发生重组902，以产生以907示出的构建体。

此外，克隆必须已经在同一染色体而不是同源染色体上经历基因靶向，即，由靶向载体产生的工程化突变必须是以顺式在同一DNA链上而不是以反式在单独的同源DNA链上。通过分析程序例如中期染色体涂染的荧光原位杂交，使用与存在于两个基因靶向载体中在它们的基因组同一性的臂之间的新DNA杂交的探针，来辨别具有顺式布置的突变的克隆和具有反式布置的那些。两种类型的克隆还可以通过如下方式被彼此辨别：用表达Cre重组酶的载体转染它们和比较在针对通过5'载体903引入的胸苷激酶基因的更昔洛韦选择下存活的集落数量以及通过“亲缘种选择”筛选程序来分析存活克隆的抗药性表型，在“亲缘种选择”筛选程序中测试来自该克隆的细胞中的一些对嘌呤霉素或G418/新霉素的抗性。

在该类型的实验中，具有顺式布置的突变的细胞预期比具有反式布置的细胞产生多约10³更昔洛韦抗性克隆。大部分所得到的顺式衍生的更昔洛韦抗性克隆还应对嘌呤霉素和G418/新霉素两者敏感，与应保留对两种药物的抗性的反式衍生的更昔洛韦抗性克隆相反。在κ链基因座中具有顺式布置的工程化突变的细胞克隆被选择用于进一步使用。

细胞的双靶向克隆用表达Cre重组酶的载体来转染，且随后将被转染的细胞放置在更昔洛韦选择之下，如在上面概述的分析实验中的。将细胞的更昔洛韦抗性克隆分离，并通过PCR和DNA印迹来分析通过5'载体903和3'载体905产生的两个工程化突变之间的预期的缺失的存在。在这些克隆中，Cre重组酶使得在通过两个载体引入κ链基因座中的loxP位点之间发生重组。因为loxP位点在两个载体中以相同的相对定向被布置，所以重组导致包括在两个loxP位点之间的完整基因组间隔的DNA环的切除。该环将不包含复制起点且因此在有丝分裂期间将不被复制，且因此当它们经历克隆增殖时将从细胞的克隆丢失。所得到的克隆携带最初在两个loxP位点之间的DNA缺失。具有预期的缺失的克隆将被选择用于进一步使用。

在免疫球蛋白κ链基因座的两个同源拷贝中的一个中携带序列缺失的ES细胞克隆将用Cre重组酶表达载体连同包括部分人免疫球蛋白κ链基因座的一段DNA909来再转染904，部分人免疫球蛋白κ链基因座包含V和J区基因区段。这段DNA(被称为“K-K”)的主要特征如下：lox5171位点；新霉素抗性基因开放阅读框(缺乏起始甲硫氨酸密码子，但在框内且与lox5171位点中的不间断的开放阅读框毗连)；转录终止/多聚腺苷酸序列；FRT位点；39个人κ可变区基因区段的阵列，每一个κ可变区基因区段由嵌入小鼠非编码序列的人编码序列组成；来自刚好在小鼠κ链基因座中的Jκ区基因区段的簇的上游的13.5Kb基因组DNA段；包含嵌入小鼠非编码DNA中的5个人J区基因区段的2KbDNA段；以与lox5171位点相反的相对定向的loxP位点。

在第二独立的实验中，部分人DNA909的可选择的段用于代替K-KDNA。该DNA(被称为“L-K”)的主要特征如下：lox5171位点；新霉素抗性基因开放阅读框，其缺乏起始甲硫氨酸密码子，但在框内且与lox5171位点中的不间断的开放阅读框毗连；转录终止/多聚腺苷酸序列；FRT位点；38个人λ可变区基因区段的阵列，每一个λ可变区基因区段由嵌入小鼠非编码序列的人编码序列组成；来自刚好在小鼠κ链基因座的J区基因区段的簇的上游的13.5Kb基因组DNA段；包含嵌入小鼠非编码DNA中的5个人Jλ区基因区段的2KbDNA段；以与lox5171位点相反的相对定向的loxP位点。

将来自K-K和L-K转染实验的被转染的克隆放置在G418选择之下，G418选择富集已经经历重组酶介导的盒式交换过程的细胞克隆，在重组酶介导的盒式交换过程中部分人供体DNA以其整体被整合入在loxP和lox5171位点之间被缺失的免疫球蛋白κ链基因座中，loxP和lox5171位点分别通过3'载体905和5'载体903放置在那里。图9中以911阐明使用K-K序列产生的DNA区。来自5'载体903的剩余元件经由FLP介导的重组906来除去，导致如913所示的最终的人源化基因座。

G418抗性ES细胞克隆通过PCR和DNA印迹来分析，以确定它们是否已经经历预期的重组酶介导的盒式交换过程而没有不需要的重排或缺失。具有预期的基因组结构的K-K和L-K克隆两者被选择用于进一步使用。

根据标准程序，将各自在小鼠κ链基因座中携带部分人免疫球蛋白DNA的K-KES细胞克隆和L-KES细胞克隆显微注射入来自品系DBA/2的小鼠胚泡中，以产生部分ES细胞衍生的嵌合小鼠。对其皮毛具有最高水平的ES细胞衍生的贡献的雄性嵌合小鼠被选择用于与雌性小鼠交配。用于交配的所选择的雌性小鼠具有C57Bl/6NTac品系，且还将携带编码在它们的种系中被表达的Flp重组酶的转基因。对来自这些交配的后代分析部分人免疫球蛋白κ链基因座的存在，和分析在重组酶介导的盒式交换步骤中产生的侧翼为FRT的新霉素抗性基因的丢失。携带部分人基因座的小鼠将用于建立K-K和L-K小鼠群体。

如实施例3所描述生产的携带部分人(即，人源化的)重链基因座的小鼠可以与携带人源化的κ链基因座的小鼠配种（breed）。它们的后代进而在最终产生对于两个人源化基因座是纯合的（即，对于重链和κ人源化的）小鼠的方案中配种。这样的小鼠产生由人可变域和小鼠恒定域组成的部分人重链。它们还产生由人κ可变域和来自它们的κ基因座的小鼠κ恒定域组成的部分人κ蛋白。从这些小鼠回收的单克隆抗体由与人κ可变域配对的人可变域组成。

配种方案的变化形式包括产生这样的小鼠：对于人源化的重链基因座是纯合的，但在κ基因座处是杂合的，使得在一个染色体上它们具有K-K人源化的基因座且在另一个染色体上它们具有L-K人源化的基因座。这样的小鼠产生由人可变域和小鼠恒定域组成的部分人重链。它们还产生由人κ可变域和来自它们的κ基因座中的一个的小鼠κ恒定域组成的部分人κ蛋白。从另一个κ基因座，它们将产生由人λ可变域和小鼠κ恒定域组成的部分人λ蛋白。从这些小鼠回收的单克隆抗体由在一些情况下与人κ可变域配对且在其他情况下与人λ可变域配对的人可变域组成。

实施例5：将部分人免疫球蛋白区引入小鼠基因组的免疫球蛋白λ链基因座位。

图10中阐明使用部分人免疫球蛋白区替换哺乳动物基因组的一部分的一种方法。该方法提供了通过包括靶向载体1003的同源重组过程，从野生型小鼠免疫球蛋白λ基因座1001缺失约194KbDNA，靶向载体1003与在V2基因区段上游和紧邻J3、C3、J1和C1基因区段的V1基因区段下游的基因座共有同一性。载体用设计为允许随后的位点特异性重组的元件替换194KbDNA，其中DNA的非天然段经由重组酶介导的盒式交换1002移动到修饰的V_L基因座。在该实施例中，非天然DNA是包括人序列和非人序列两者的合成核酸。

用于完成194Kb缺失的基因靶向载体1003的主要特征如下：阴性选择基因，例如编码白喉毒素的A亚基的基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；来自λ基因座中的小鼠V2可变区基因区段的5'的4Kb基因组DNA；FRT位点；包含小鼠Polr2a基因启动子的基因组DNA段；翻译起始序列(嵌入“Kozak”共有序列的甲硫氨酸密码子)；Cre重组酶的突变的loxP识别序列(已知为lox5171位点)；转录终止/多聚腺苷酸序列；编码给予对嘌呤霉素的抗性的蛋白的开放阅读框；该开放阅读框将在相对于Polr2a启动子和紧接于其的翻译起始序列的反义链上；开放阅读框还将后接其自己的转录终止/多聚腺苷酸序列；Cre重组酶的loxP识别序列；在与嘌呤霉素抗性基因开放阅读框相同的反义链上的翻译起始序列(嵌入“Kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)；鸡β肌动蛋白启动子和巨细胞病毒早期增强子元件，其被定向为使得其引导嘌呤霉素抗性开放阅读框的转录，且翻译在loxP位点的下游的起始密码子处起始，且继续返回通过loxP位点进入嘌呤霉素开放阅读框，全部在相对于Polr2a启动子和紧接于其的翻译起始序列的反义链上；Flp重组酶的突变识别位点，已知为“F3”位点；包含J3、C3、J1和C1基因区段和周围序列的7.3Kb基因组DNA；第二阴性选择基因，例如编码白喉毒素的A亚基的基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。

小鼠胚胎干(ES)细胞(源自C57Bl/6NTac小鼠)根据广泛使用的程序通过用靶向载体1003电穿孔来转染1002。所得到的构建体1005将在196Kb区用来自靶向载体1003的序列替换天然DNA。

在电穿孔之前，载体DNA用罕见切割限制性内切酶来线性化，罕见切割限制性内切酶仅在原核质粒序列或与其相关联的多聚接头处切割。已转染的细胞被铺板，且在≥24小时之后，将它们放置在使用嘌呤霉素的药物选择下。在一个多星期之后在抗药性ES细胞集落变得凭肉眼可见之后，将抗药性ES细胞集落用物理方法从它们的板提取。将这些选定的集落解聚集，重新铺板在微孔板上，并培养若干天。此后，分开细胞克隆中的每一个，使得细胞中的一些可以作为档案被冷冻，且其余为分析的目的用于分离DNA。

来自ES细胞克隆的DNA通过PCR利用广泛使用的基因-靶向测定设计来筛选。使用四个测定，且在每一种情况下，PCR寡核苷酸引物序列中的一个映射在靶向载体和基因组DNA之间共有的同一性的区域外部，而另一个映射在载体中的基因组同一性的两个臂之间的新DNA内(即，在puro基因中)。根据标准设计，这些测定检测仅在源自转染细胞的细胞克隆中存在的DNA段，转染细胞已经经历在靶向载体1003和天然DNA1001之间完全合理的同源重组。

来自转染1002的约六个PCR-阳性克隆被选择用于增殖，随后使用DNA印迹测定来进一步分析。DNA印迹包括三个探针和来自这些克隆的已经用多种限制性内切酶消化的基因组DNA，多种限制性内切酶被选择为使得探针和消化的组合允许识别DNA是否已经被同源重组适当地修饰。

ES细胞的六个PCR-阳性克隆使用被设计为辨别在小鼠ES细胞中出现的最通常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序来核型分析。显示出畸变迹象的克隆被从进一步使用中排除。基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型上正常的克隆，被选择用于进一步使用。

在免疫球蛋白λ链基因座的两个同源拷贝中的一个中携带缺失的ES细胞克隆将用Cre重组酶表达载体连同包括部分人免疫球蛋白λ链基因座的一段DNA1007段来再转染1004，部分人免疫球蛋白λ链基因座包含V、J和C区基因区段。这段DNA1007的主要特征如下：lox5171位点；新霉素抗性基因开放阅读框(缺乏起始甲硫氨酸密码子，但在框内且与lox5171位点中的不间断的开放阅读框毗连)；转录终止/多聚腺苷酸序列；FRT位点；38个人λ可变区基因区段的阵列，每一个人λ可变区基因区段由嵌入小鼠λ非编码序列中的人λ编码序列组成；J-C单元的阵列，其中每一个单元由嵌入在来自小鼠λ基因座的非编码序列内的人Jλ区基因区段和小鼠λ恒定域基因区段组成(人J区基因区段将是编码J1、J2、J6和J7的那些，而小鼠λ恒定域基因区段将是C1和/或C2和/或C3)；Flp重组酶的突变识别位点，已知为“F3”位点；给予潮霉素抗性的开放阅读框；该开放阅读框在构建体中位于相对于免疫球蛋白基因区段编码信息的反义链上；以与lox5171位点相反的相对定向的loxP位点。

将被转染的克隆放置在G418和/或潮霉素选择之下，G418和/或潮霉素选择富集已经经历重组酶介导的盒式交换过程的细胞克隆，在重组酶介导的盒式交换过程中部分人供体DNA以其整体被整合入在loxP和lox5171位点之间被缺失的免疫球蛋白λ链基因座中，loxP和lox5171位点通过基因靶向载体放置在那里。来自靶向载体1003的剩余元件经由FLP介导的重组1006来除去，导致如1011所示的最终的人源化基因座。

G418/潮霉素抗性ES细胞克隆通过PCR和DNA印迹来分析，以确定它们是否已经经历预期的重组酶介导的盒式交换过程而没有不需要的重排或缺失。具有预期的基因组结构的克隆将被选择用于进一步使用。

根据标准程序，将在小鼠λ链基因座中携带部分人免疫球蛋白DNA1011的ES细胞克隆显微注射入来自品系DBA/2的小鼠胚泡中，以产生部分ES细胞衍生的嵌合小鼠。对其皮毛具有最高水平的ES细胞衍生的贡献的雄性嵌合小鼠被选择用于与雌性小鼠交配。此处所选择的雌性小鼠将具有C57Bl/6NTac品系，其携带编码在它们的种系中被表达的Flp重组酶的转基因。对来自这些交配的后代分析部分人免疫球蛋白λ链基因座的存在，和分析在重组酶介导的盒式交换步骤中产生的侧翼为FRT的新霉素抗性基因和侧翼为F3的潮霉素抗性基因的丢失。携带部分人基因座的小鼠将用于建立小鼠群体。

在一些方面，使包括人源化的重链和κ基因座的小鼠(如实施例3和4所描述的)与携带人源化的λ基因座的小鼠配种。从该类型配种方案产生的小鼠对于人源化的重链基因座是纯合的，且可以对于K-K人源化的基因座或L-K人源化的基因座是纯合的。可选择地，它们可以在κ基因座处是杂合的，在一个染色体上携带K-K基因座而在另一个染色体上携带L-K基因座。这些小鼠中的每一个对于人源化的λ基因座将是纯合的。从这些小鼠回收的单克隆抗体由在一些情况下与人κ可变域配对且在其他情况下与人λ可变域配对的人可变域组成。λ可变域将得自人源化的L-K基因座或人源化的λ基因座。

实施例6：将部分人免疫球蛋白小基因引入小鼠基因组。

在某些其他方面，部分人免疫球蛋白区将包括人可变域小基因，例如图11中阐明的人可变域小基因。此处，代替包括所有的或基本上所有的人V_H基因的部分人免疫球蛋白区，小鼠免疫球蛋白区被包括较少的人V_H基因，例如1-43个人V_H基因的小基因1119替换。

包括将被引入哺乳动物宿主基因组的部分人免疫球蛋白区1110的位点特异性靶向载体1129被引入1102包括位点特异性重组位点(1109、1111、1107和1105)和puroΔTK基因1103的已缺失内源性免疫球蛋白区的基因组区1101。位点特异性靶向载体包括部分人免疫球蛋白区，该部分人免疫球蛋白区包括i)V_H区1119，其包括所有的44个人V_H编码区和基于小鼠基因组内源性序列的间插序列；ii)10kb前DJ区721，其包括小鼠序列；iii)DJ区1125，其包括人D和J编码区和基于小鼠基因组内源性序列的间插序列；和iv)小鼠非功能J_H基因区。部分人免疫球蛋白区侧翼为将允许与修饰的内源性基因座重组的重组位点1109、1111、1105和1107)。在引入适当的重组酶1104之后，部分人免疫球蛋白区在恒定基因区1127的上游被整合入基因组。

如实施例1所描述的，用于引入部分人免疫球蛋白可变区基因座的初级筛选可以通过DNA印迹来进行，或使用PCR初筛来进行，所述PCR初筛被用Southern筛选和/或天然等位基因丢失qPCR筛选的次级筛选所支持。作为重组事件的一部分的HPRT基因1105的缺失将允许使用(6-硫鸟嘌呤依赖性)阴性选择来鉴定未经历重组事件的细胞。

前述内容仅阐明本发明的原理。应明白，本领域技术人员将能够设计各种排列，这些排列虽然没有在本文明确描述或示出，但体现本发明的原理且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所述的所有实施例和条件性语言主要意图帮助阅读者理解本发明的原理和由本发明人贡献以利于本领域的概念，且应被理解为不限于这样具体叙述的实施例和条件。此外，叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实施例的本文所有陈述，意图包括其结构和功能等效物两者。另外，意图这样的等效物包括目前已知的等效物和将来开发的等效物两者，即，进行相同功能的、与结构无关的所开发的任何元件。因此，本发明的范围不意图被限于本文示出的和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附的权利要求来体现。在以下权利要求中，依据除非使用术语“手段（means）”，否则其中所述的特征或元件中没有一个应被理解为手段-加-功能（means-plus-function）限制。

Claims

1.一种工程化的小鼠免疫球蛋白基因座，所述工程化的小鼠免疫球蛋白基因座缺失所述小鼠免疫球蛋白基因座的可变区基因区段、被插入嵌合免疫球蛋白基因区段的阵列，其中所述嵌合免疫球蛋白基因区段的每一个都包括人免疫球蛋白编码序列和基于小鼠内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列，其中所述工程化的小鼠免疫球蛋白基因座包括人V_H、D_H和J_H编码序列，或V_L和J_L编码序列，其中L是指λ或κ。

2.一种用于产生具有包含根据权利要求1所述的工程化的小鼠免疫球蛋白基因座的基因组的转基因小鼠的方法，所述方法包括：

a)将一个或更多个位点特异性重组酶的两个或更多个靶向位点引入小鼠胚胎干细胞的免疫球蛋白基因座中以及在包括V、D和J基因区段，或V和J基因区段的所述基因座的部分的上游将至少一个位点整合并在包括V、D和J基因区段，或V和J基因区段的所述基因座的部分的下游将至少一个位点整合；

b)提供包括部分人免疫球蛋白可变区的载体，所述部分人免疫球蛋白可变区包括嵌合免疫球蛋白基因区段的阵列，其中所述嵌合免疫球蛋白基因区段的每一个都包括人V_H、D_H、J_H、V_L或J_L编码序列，其中L是指λ或κ，和基于小鼠内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列，整个部分人免疫球蛋白可变区侧翼为位点特异性重组位点，其中所述重组位点能够与在步骤a)中被引入所述小鼠胚胎干细胞的那些位点重组；

c)引入步骤b)的所述载体和能够识别步骤b)的所述载体中的所述重组酶位点的位点特异性重组酶；

d)允许在所述小鼠胚胎干细胞的所述基因组和所述部分人免疫球蛋白可变区之间发生重组事件，导致用所述部分人免疫球蛋白可变区替换所述内源性免疫球蛋白可变区；和

e)利用在步骤d)中产生的所述小鼠胚胎干细胞来产生包括所述部分人免疫球蛋白可变区基因座的转基因小鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，还包括通过引入识别第一组位点特异性重组位点的重组酶来从所述小鼠基因组缺失所述内源性免疫球蛋白可变区基因座的一部分的步骤，其中所述基因组中的这样的缺失在原位留下不能在所述引入步骤之后和所述提供步骤之前彼此重组的第二组位点特异性重组位点。