CN117440753A - 表达嵌合马科动物-啮齿动物抗体的转基因啮齿动物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了表达具有马科动物可变结构域的免疫球蛋白的转基因哺乳动物，包括表达具有马科动物可变结构域的免疫球蛋白以开发治疗性马科动物抗体的转基因啮齿动物。

Description

表达嵌合马科动物-啮齿动物抗体的转基因啮齿动物及其使 用方法
发明领域
本发明涉及免疫球蛋白分子的生产，包括用于产生能够产生抗原特异性抗体分泌细胞以用于产生马科动物(equine)单克隆抗体的转基因哺乳动物的方法。
发明背景
在以下讨论中，出于背景和介绍的目的描述了某些文章和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的文章和方法不构成现有技术的权利。
抗体已经成为重要的生物药物，因为它们(i)表现出可以靶向不同分子形式的抗原的精准结合特性，(ii)是具有使其在治疗的人类和动物中良好耐受的期望药代动力学的生理分子，并且(iii)与天然抵御感染原(infectious agent)的强大免疫特性关联。此外，存在已建立的用于从实验室动物快速分离抗体的技术，所述技术可以容易地针对几乎任何不天然存在于身体中的外来物质产生特异性抗体反应。
在抗体的最基本形式中，抗体包括各自与相同的轻(L)链配对的两条相同的重(H)链。H链和L链二者的N-末端都包括可变结构域(分别地，VH和VL)，所述可变结构域共同为配对的H-L链提供独特的抗原结合特异性。
编码抗体VH和VL结构域的外显子在种系DNA中不存在。而是，每一个VH外显子由存在于免疫球蛋白H链基因座中的随机选择的VH、D和JH基因区段的重组产生；同样，单独VL外显子由轻链基因座中随机选择的VL和JL基因区段的染色体重排产生。
在哺乳动物中，基因组通常包含两个可以表达H链的等位基因、两个可以表达kappa(κ)L链的等位基因和两个可以表达lambda(λ)L链的等位基因(每个亲本一个等位基因)。免疫球蛋白H链基因座上存在多个VH、D和JH基因区段，免疫球蛋白κ(IGK)和免疫球蛋白λ(IGL)L链基因座上也存在多个VL和JL基因区段(Collins和Watson(2018)ImmunoglobulinLight Chain Gene Rearrangements,Receptor Editing and the Development of aSelf-Tolerant Antibody Repertoire.Front.Immunol.9:2249.(doi:10.3389/fimmu.2018.02249))。
在重链基因座中，也存在用于表达不同抗体类别(同种型)的外显子。例如，在马科动物中，编码的同种型是IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgE和IgA。多态性变体(称为同种异型)也存在于编码的同种型中，并可用作等位基因标记。在马科动物中，IgM、IgG3、IgG4、IgG7和IgE同种异型存在多态性变体。
在B细胞发育期间，基因重排首先发生在包含H链可变基因区段的两条同源染色体中的一条上。在前B细胞中，产生的VH外显子然后在RNA水平上被剪接到Cμ外显子，用于IgM H链(μH链)的表达。前B细胞合成的μH链大部分保留在内质网(ER)中，并且最终由于部分未折叠的μH链CH1结构域与驻留的ER伴侣BiP之间的非共价相互作用而降解(Haas和Wabl,Nature,306:387-9,1983；Bole等人,J Cell Biol.102:1558,1986)。然而，一小部分μH链与替代轻链复合物缔合，该复合物包括不变的λ5和VpreB蛋白。这种缔合取代了BiP，并允许μH链/λ5/VpreB复合物与Igα/β信号传导分子异二聚体一起作为preB细胞受体(preBCR)离开ER，并通过分泌途径运输至质膜。
随后，VL-JL重排一次发生在一个L链等位基因上，直到产生功能性L链，之后L链多肽可以与IgM H链同源二聚体缔合，形成完整功能抗原特异性B细胞受体(BCR)，其在未成熟B细胞的表面表达。
未成熟的B细胞迁移到次级淋巴器官，在那里它们分化为成熟的B细胞，成熟的B细胞可以对同源抗原响应，并分化成分泌抗体的浆细胞和记忆B细胞。在T细胞的帮助下，B细胞可以进行同种型转换，将抗体同种型从IgM转变为IgG、IgA或IgE，还可以进行体细胞高突变，改变VH和VL外显子的氨基酸序列。虽然这些突变被随机引入VH和VL外显子，但对免疫抗原具有较高亲和力的B细胞能够吸收更多的抗原，加工抗原并将其呈递给T滤泡性辅助细胞，并且因此与对免疫抗原具有低亲和力或没有亲和力的B细胞相比优先被激活。结果，体细胞突变在互补决定区(CDR)1、2和3中变得富集，因为这些是VH和VL结构域与抗原相互作用的区域。
编码各种小鼠免疫球蛋白的基因已被广泛表征。例如，Blankenstein和Krawinkel在Eur.J.Immunol.,17:1351-1357(1987)中描述了小鼠可变重链区域。马科动物免疫球蛋白基因(例如，来自纯种马、家马(Equus caballus)、暮光马(Twilight breed))已在结构上被表征。Sun等人,(Dev.Comp.Immunol.34:109(2010))和Talmadge等人,(Dev.Comp.Immunol.1:33(2013)；Dev.Comp.Immunol.46:171(2014))描述了马基因组中的Ig重链和λ轻链基因，并且Walther等人描述了所有Ig基因座(Igh、Igκ和Igλ)的分子表征(Dev.Comp.Immunol.3:303(2015))。
转基因动物诸如具有各种免疫球蛋白基因座的小鼠的产生已经允许在各种研究和开发应用中，例如在药物发现和对各种生物系统的基础研究中使用这样的转基因动物。例如，携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠的产生描述于国际申请第WO 90/10077号和第WO 90/04036号中。WO 90/04036描述了具有整合的人类免疫球蛋白“微(mini)”基因座的转基因小鼠。WO 90/10077描述了用于在产生转基因动物中使用的包含免疫球蛋白显性控制区的载体。
已经开发了用于用例如人类免疫球蛋白序列修饰小鼠内源性免疫球蛋白可变区基因座以产生用于药物发现目的的部分或完全人类抗体的许多方法。这样的小鼠的实例包括例如以下中描述的那些：美国专利第7,145,056号；第7,064,244号；第7,041,871号；第6,673,986号；第6,596,541号；第6,570,061号；第6,162,963号；第6,130,364号；第6,091,001号；第6,023,010号；第5,593,598号；第5,877,397号；第5,874,299号；第5,814,318号；第5,789,650号；第5,661,016号；第5,612,205号；和第5,591,669号。
使用发挥作为药物的功能的抗体不限于人类疾病的预防或疗法。像马这样的家畜也会遭受与人类相似的痛苦，例如癌症、特应性皮炎和慢性疼痛。分别靶向CD20、IgE和神经生长因子的单克隆抗体已经在兽医中用于治疗其中一些状况。然而，在临床使用之前，在小鼠体内制备的单克隆抗体必须被马源化(equineized)，即它们的氨基酸序列必须从小鼠改变为马，以防止受体马产生不良免疫反应。
基于以上所述，显然需要一种高效且具有成本效益的方法来生产用于治疗马的疾病的马科动物抗体。更具体地说，本领域需要能够产生抗原特异性马科动物免疫球蛋白的小型、快速繁殖的非马科动物哺乳动物(non-equine mammals)，特别是用于产生能够大规模生产马科动物单克隆抗体的杂交瘤。因此，仍然需要改进方法来产生能够产生马科动物抗体的转基因非人类动物，例如，具有马科动物V区的抗体。
发明概述
提供本概述是为了以简化的形式介绍概念选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。本概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从以下撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求书中限定的那些方面，所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是明显的。
本文描述了产生具有马科动物免疫球蛋白可变区的小鼠抗体的方法。一方面，提供了一种具有马科动物可变区的抗体，该抗体可以在转基因哺乳动物中或体外细胞培养中产生。
一方面，提供了具有包括异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的基因组的非马科动物哺乳动物细胞或非马科动物哺乳动物。一方面，异源性基因座包括马科动物免疫球蛋白可变区基因的编码序列和基于非马科动物哺乳动物宿主的内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码序列。一方面，非马科动物哺乳动物细胞或哺乳动物能够表达嵌合B细胞受体(BCR)或抗体，其包括非马科动物哺乳动物宿主细胞或哺乳动物内源性的马科动物重链(H)和轻链(L)可变区和恒定区。一方面，转基因哺乳动物宿主细胞或哺乳动物具有部分或全部内源性免疫球蛋白可变区基因座被去除的基因组。
为了在非马科动物哺乳动物宿主中产生嵌合马科动物单克隆抗体，宿主基因组应该具有至少一个表达嵌合马科动物免疫球蛋白H链或L链的基因座。一方面，宿主基因组包括一个重链基因座和两个轻链基因座，分别表达嵌合的马科动物免疫球蛋白H链和L链。
在一些方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主的内源性VH基因座的非编码序列。在一些方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主的内源性VH基因座的非编码调控或支架序列。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物DH和JH基因区段编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源性DH和JH基因区段的非编码序列。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物DH和JH基因区段编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源性DH和JH基因区段的非编码调控或支架序列。
在其他方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VL编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主的内源性VL基因座中的非编码序列。在其他方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VL编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主的内源性VL基因座中的非编码调控或支架序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VL编码序列和马科动物JL基因区段编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源性JL基因区段的非编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VL编码序列和马科动物JL基因区段编码序列和存在于非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源性JL基因区段的非编码调控或支架序列。
一方面，非马科动物哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。
一方面，提供了一种用于产生包括部分马科动物免疫球蛋白基因座的非马科动物哺乳动物细胞的方法。一方面，该方法包括：a)将两个或更多个重组酶靶向位点引入非马科动物哺乳动物宿主细胞的基因组中，并整合在包括内源性免疫球蛋白VH、DH和JH基因或内源性VL和JL基因的基因组区域的上游的至少一个位点和下游的至少一个位点；和b)通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)将异源性部分马科动物免疫球蛋白可变基因座引入非马科动物哺乳动物宿主细胞，该基因座包含马科动物VH、DH和JH基因或马科动物VL和JL基因编码序列和基于非马科动物哺乳动物宿主内源性免疫球蛋白可变区基因座中存在的非编码序列的非编码序列。
另一方面，该方法包括在通过RMCE将异源性部分马科动物免疫球蛋白可变基因座引入非马科动物哺乳动物宿主细胞之前，缺失宿主动物基因组中侧翼为两个异源性重组酶靶向位点的内源性免疫球蛋白可变区。
一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH基因区段编码序列、马科动物DH和JH区段编码序列以及马科动物DH基因区段(pre-D序列，图1)上游的非编码调控或支架序列，所述非编码调控或支架序列是基于非马科动物哺乳动物宿主基因组的内源性DH基因区段上游存在的序列。一方面，上游支架序列包含非免疫球蛋白基因，如Adam6(图1)，其与雄性生育力有关(Nishimura等人,Developmental Biol.233(1):204-213(2011))。一方面，使用此前已经被引入到同一染色体上内源性免疫球蛋白VH基因座的上游和内源性JH基因座的下游的重组酶靶向位点将部分马科动物免疫球蛋白基因座引入到宿主细胞中。
一方面，支架序列包括来自另一物种的天然存在的核酸序列。一方面，所述支架序列可以基于来自另一物种的天然存在的核酸序列来设计，例如，所述支架序列可以包括来自另一物种的天然存在的核酸序列，该序列已经被修饰过，例如，通过一个或更多个核酸置换、插入、缺失或其他修饰。一方面，支架序列可以包括人工序列。一方面，所述支架序列包括存在于马科动物基因组的免疫球蛋白基因座中的序列与其他序列组合，所述其他序列例如来自其他物种的支架序列。
另一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物免疫球蛋白VL基因区段编码序列、马科动物JL基因区段编码序列和基于非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源性L链基因座中存在的非编码序列的非编码序列。一方面，非编码序列包括调控或支架序列。一方面，使用先前已经被引入到同一染色体上内源性免疫球蛋白VL基因座的上游和内源性JL基因座的下游的重组酶靶向位点将异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座引入到宿主细胞中。
一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座作为单个核酸合成，并且作为单个核酸区域引入到非马科动物哺乳动物宿主细胞中。异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座也可以在两个或更多个连续的区段中合成，并作为离散的区段引入哺乳动物宿主细胞。异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座也可以使用重组方法产生，并在引入非马科动物哺乳动物宿主细胞之前进行分离。一方面，部分马科动物免疫球蛋白重链可变区基因座可通过计算机模拟如下生成：例如，小鼠重链免疫球蛋白基因座的基因组序列，以及马科动物VH、D和JH编码序列从美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)获得。小鼠VH、D和JH编码序列被马科动物VH、D和JH编码序列计算机模拟地替换，例如，使用商业上可获得的软件。有利地，VH、D和JH编码序列可以被替换，同时保持中间的小鼠非编码序列完整。类似地，部分马科动物免疫球蛋白轻链可变区基因座可通过计算机模拟如下生成：例如，小鼠轻链免疫球蛋白基因座的基因组序列和马科动物VL和JL编码序列从美国国家生物技术信息中心获得。小鼠VL和JL编码序列被马科动物VL和JL编码序列计算机模拟地替换，例如，使用商业上可获得的软件。再一次，VL和JL编码序列可以被替换，同时保持中间的小鼠非编码序列完整。基于计算机模拟序列，用于合成包括部分马科动物免疫球蛋白基因座的DNA序列的方法是已知的。
另一方面，提供了一种用于产生包括异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的非马科动物哺乳动物细胞的方法。一方面，该方法包括：a)将两个或更多个不能彼此重组的序列特异性重组位点引入非马科动物哺乳动物宿主细胞的基因组，其中至少一个重组位点被引入内源性免疫球蛋白可变区基因座的上游，并且至少一个重组位点被引入相同的内源性免疫球蛋白可变区基因座的下游；b)提供包括异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的载体，该异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座具有i)马科动物免疫球蛋白可变区基因编码序列和ii)基于宿主细胞基因组的内源性免疫球蛋白可变区基因座的非编码调控或支架序列，其中部分马科动物免疫球蛋白基因座的侧翼是相同的两个序列特异性重组位点，所述相同的两个序列特异性重组位点位于宿主细胞的内源性免疫球蛋白可变区基因座的侧翼；c)将步骤b)的载体和能够识别两个重组酶位点的位点特异性重组酶引入宿主细胞；d)允许在细胞基因组和异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座之间发生重组事件，导致内源性免疫球蛋白可变区基因座被异源性部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座替换。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH免疫球蛋白基因区段编码序列，以及i)马科动物DH和JH基因区段编码序列，ii)在内源性地存在于非马科动物哺乳动物宿主的基因组中的个体VH、DH和JH基因区段侧翼的非编码调控序列或支架序列，以及iii)基于非马科动物哺乳动物宿主细胞的内源性基因组的pre-D序列。一方面，重组酶靶向位点被引入内源性免疫球蛋白VH基因座的上游和内源性JH基因座的下游。
一方面，提供了转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物具有其中啮齿动物内源性免疫球蛋白可变基因座已被缺失，并被异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座替换的基因组，该异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物免疫球蛋白可变基因编码序列和基于啮齿动物内源性免疫球蛋白可变基因座的非编码调控或支架序列。一方面，转基因啮齿动物的异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座是功能性的，并表达包括马科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的免疫球蛋白链。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH、DH和JH编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VL和JL编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物kappa(κ)VL和JL编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物lambda(λ)VL和JL编码序列。一方面，提供了来自转基因啮齿动物的B淋巴细胞谱系的细胞。一方面，提供了包括马科动物可变结构域和从B淋巴细胞谱系的细胞获得的啮齿动物恒定结构域序列的部分或完整免疫球蛋白分子。一方面，提供了衍生自B淋巴细胞谱系细胞的杂交瘤细胞。一方面，提供了部分或完整免疫球蛋白分子，其包括马科动物可变结构域和衍生自杂交瘤细胞的啮齿动物恒定结构域。一方面，提供了衍生自B淋巴细胞谱系细胞的永生化细胞。一方面，提供了部分或完整免疫球蛋白分子，其包括马科动物可变结构域和来源于永生化细胞的啮齿动物恒定结构域。一方面，提供了一种转基因啮齿动物，其中所述异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VL和JL编码序列。一方面，提供了一种转基因啮齿动物，其中异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH、DH和JH编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白的基因座包括马科动物kappa(κ)VL和JL编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物lambda(λ)VL和JL编码序列。一方面，啮齿动物是小鼠。一方面，非编码调控序列包括内源性宿主的下列一个或更多个序列：每个V基因区段之前的启动子、剪接位点和用于V(D)J重组的重组信号序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座还包括内源性宿主的下列序列中的一个或更多个：ADAM6基因、Pax-5激活的基因间重复(PAIR)元件、以及来自重链基因间控制区1(IGCR1)的CTCF结合位点。
一方面，非马科动物哺乳动物细胞是哺乳动物细胞。一方面，非马科动物哺乳动物细胞是哺乳动物胚胎干(ES)细胞。
一方面，选择和分离其中内源性免疫球蛋白可变区基因座被异源性部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座替换的非马科动物哺乳动物细胞。一方面，该细胞是非马科动物哺乳动物ES细胞，例如啮齿动物ES细胞。一方面，至少一个分离的非马科动物哺乳动物细胞用于产生表达异源性部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座的转基因非马科动物哺乳动物。一方面，至少一个分离的非马科动物哺乳动物ES细胞用于产生表达异源性部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座的转基因非马科动物哺乳动物。
一方面，提供了一种产生转基因啮齿动物的方法。一方面，该方法包括：a)将位点特异性重组酶的至少一个靶位点整合到内源性免疫球蛋白可变基因座上游的啮齿动物细胞的基因组中，以及将位点特异性重组酶的至少一个靶位点整合到内源性免疫球蛋白可变基因座下游的基因组中。一方面，内源性免疫球蛋白可变基因座包括VH、DH和JH基因区段。一方面，内源性免疫球蛋白可变基因座包括Vκ和Jκ基因区段。一方面，内源性免疫球蛋白可变基因座包括Vλ和Jλ基因区段。一方面，内源性免疫球蛋白可变基因座包括Vλ、Jλ基因区段和Cλ基因。一方面，该方法包括：b)提供包含异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的载体。一方面，所述异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包含嵌合马科动物免疫球蛋白基因区段。一方面，每个部分马科动物免疫球蛋白基因区段包括马科动物免疫球蛋白可变基因编码序列和啮齿动物非编码调控或支架序列。一方面，部分马科动物免疫球蛋白可变基因座的侧翼是用于位点特异性重组酶的靶位点。一方面，靶位点能够与引入啮齿动物细胞的靶位点重组。一方面，该方法包括：c)将载体和能够识别靶位点的位点特异性重组酶引入啮齿动物细胞。一方面，该方法包括：d)允许在细胞的基因组和异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座之间发生重组事件，其中内源性免疫球蛋白可变基因座被异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座替换。一方面，该方法包括：e)选择在步骤d)中产生的包括异源性部分马科动物免疫球蛋白可变基因座的细胞；以及使用该细胞产生包括异源性部分马科动物免疫球蛋白可变基因座的转基因啮齿动物。一方面，该细胞是啮齿动物胚胎干(ES)细胞。一方面，该细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
一方面，该方法还包括在步骤a)之后和步骤b)之前，通过引入识别第一组靶位点的重组酶来缺失内源性免疫球蛋白可变基因座的步骤，其中缺失步骤在啮齿动物细胞的基因组中留下在合适的位置的至少一组不能彼此重组的靶位点。一方面，载体包括马科动物VH、DH和JH编码序列。一方面，载体包括马科动物VL和JL编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物kappa(κ)VL和JL编码序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括lambda(λ)VL和JL编码序列。一方面，载体还包括以下一个或更多个：启动子、剪接位点和重组信号序列。
一方面，提供了一种用于产生转基因非马科动物哺乳动物的方法，该转基因非马科动物哺乳动物包括异源性部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座。一方面，该方法包括：a)将一个或更多个序列特异性重组位点引入非马科动物哺乳动物宿主细胞的基因组，该序列特异性重组位点位于内源性免疫球蛋白可变区基因座的侧翼，并且不能彼此重组。一方面，该方法包括：b)提供包含部分马科动物免疫球蛋白基因座的载体，该基因座具有i)马科动物可变区基因编码序列和ii)基于内源性宿主免疫球蛋白可变区基因座的非编码调控或支架序列。一方面，编码和非编码调控或支架序列的侧翼是与引入a)的宿主细胞基因组的序列特异性重组位点相同的序列特异性重组位点。一方面，该方法包括：c)将步骤b)的载体和能够识别一组重组酶位点的位点特异性重组酶引入细胞。一方面，该方法包括：d)允许在a)细胞的基因组和异源性的部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座之间发生重组事件。一方面，内源性免疫球蛋白可变区基因座被部分马科动物免疫球蛋白基因座替换。一方面，该方法包括：e)选择包含部分马科动物免疫球蛋白基因座的细胞；和f)使用该细胞产生包含部分马科动物免疫球蛋白基因座的转基因哺乳动物。
一方面，非马科动物转基因哺乳动物是啮齿动物，例如，小鼠或大鼠。
一方面，提供了包括至少103个文库成员的多样性的免疫球蛋白文库(也称为谱库(repertoire))。
一方面，提供了包括本文所述部分马科动物抗体的抗体谱库。一方面，该谱库包括多种抗体，每种抗体特异性识别相同的靶抗原。这样的谱库可以被称为具有相同抗体类型或结构的抗体文库，其中抗体的抗原结合位点不同，例如，产生识别相同表位的亲本抗体的抗体变体。一方面，抗体文库包括亲和成熟或以其他方式优化的抗体变体。一方面，抗体文库包括特异性识别靶抗原的抗体，但是这种靶抗原的不同表位。
一方面，筛选抗体谱库，并根据期望的结构或功能特性选择单个文库成员，例如，以产生抗体产物。
一方面，提供了包括本文所述部分马科动物抗体的抗体谱库。一方面，该谱库包括识别不同靶抗原的多种抗体。一方面，通过用多组分抗原免疫非马科动物哺乳动物获得该谱库，多组分抗原包括但不限于病毒或细菌，其可以具有许多不同的靶抗原，每个靶抗原可以包括多个表位。
一方面，该库是初始的抗体文库，也可以称为“免疫前谱库”。一方面，免疫前谱库由最近从骨髓中离开的成熟但缺乏抗原经验的B细胞表达。
一方面，抗体谱库的特征可以在于包含至少约103种抗体的多样性，例如，至少约104、约105、约106或约107，每一个的特征在于不同的抗原结合位点。
一方面，提供了表达异源性免疫球蛋白可变区基因座的非马科动物哺乳动物细胞，该异源性免疫球蛋白可变区基因座具有马科动物可变区基因编码序列和基于宿主基因组的内源性非马科动物免疫球蛋白基因座的非编码调控或支架序列。一方面，非马科动物哺乳动物细胞表达嵌合抗体，该嵌合抗体包括完全马科动物H或L链可变结构域和它们各自的非马科动物哺乳动物细胞或哺乳动物内源性的恒定区。
一方面，提供了一种非马科动物转基因哺乳动物，其表达异源性免疫球蛋白可变区基因座，该基因座具有马科动物可变区基因编码序列和基于宿主基因组的内源性非马科动物免疫球蛋白基因座的非编码调控或支架序列。一方面，非马科动物转基因哺乳动物表达嵌合抗体，该嵌合抗体包括完全马科动物H或L链可变结构域和它们各自的非马科动物哺乳动物细胞或哺乳动物内源性的恒定区。
一方面，提供了来自非马科动物转基因哺乳动物的B细胞，其能够表达具有完整的马科动物可变序列的部分马科动物抗体。一方面，永生化B细胞被提供作为对特定抗原特异的单克隆抗体的来源。
一方面，提供了从B细胞克隆的马科动物免疫球蛋白可变区基因序列，用于生产或优化用于诊断、预防和治疗用途的抗体。
一方面，提供了能够产生具有完整马科动物免疫球蛋白可变区序列的部分马科动物单克隆抗体的非马科动物杂交瘤细胞。
一方面，提供了从产生单克隆抗体的杂交瘤中去除编码H链和L链免疫球蛋白可变结构域的VH和VL外显子，并将VH和VL外显子修饰为包括马科动物恒定区的方法，从而产生在注射到马体内时不具有免疫原性的完整的马科动物抗体。
一方面，提供了一种生产用于治疗或诊断用途的马科动物抗体的方法。一方面，该方法包括：
(i)表达从转基因啮齿动物的抗体产生细胞克隆的具有马科动物可变结构域的抗体，所述转基因啮齿动物的基因组包括的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被异源性免疫球蛋白基因座可变区替换，所述异源性免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、DH和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个、和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包括马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列和啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列；和
(ii)分离具有马科动物可变结构域的抗体，其中所述抗体适于治疗或诊断用途。
一方面，抗体从转基因啮齿动物的B细胞克隆。一方面，啮齿动物是小鼠。一方面，提供了通过本文所述方法产生的治疗或诊断抗体。
一方面，提供了一种生产具有马科动物可变结构域的治疗性或诊断性抗体的方法。一方面，该方法包括：
(i)从转基因啮齿动物克隆由抗体产生细胞表达的抗体的马科动物可变结构域，所述转基因啮齿动物的基因组包括的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被异源性免疫球蛋白基因座可变区替换，所述异源性免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、D和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包括马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列和啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列；和
(ii)产生包括由转基因啮齿动物表达的抗体的马科动物可变结构域的治疗性或诊断性抗体。
一方面，马科动物可变结构域从转基因啮齿动物的B细胞表达的抗体克隆。一方面，啮齿动物是小鼠。一方面，提供了通过本文所述方法产生的治疗性或诊断性抗体。
一方面，提供了一种用于产生包括马科动物可变结构域的单克隆抗体的方法。一方面，该方法包括：
(i)提供来自转基因啮齿动物的B细胞，所述转基因啮齿动物的基因组包括的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被异源性免疫球蛋白基因座可变区替换，所述异源性免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、D和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包括嵌入啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列中的马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列；
(ii)使B细胞永生化；和
(iii)分离包含由永生化B细胞表达的马科动物可变结构域的单克隆抗体或编码该抗体的基因。
一方面，该方法包括：
(iv)克隆由B细胞表达的马科动物可变结构域；和
(v)生产包括从转基因啮齿动物的B细胞克隆的马科动物可变结构域的治疗性或诊断性抗体。
一方面，提供了一种用于产生包括马科动物可变结构域的抗体的方法。一方面，该方法包括提供转基因啮齿动物，其基因组包括的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被异源性免疫球蛋白基因座可变区替换，所述异源性免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、DH和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包括嵌入啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列中的马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列，其中转基因啮齿动物的异源性免疫球蛋白基因座表达包括马科动物可变结构域的抗体。
一方面，该方法包括分离具有由转基因啮齿动物表达的马科动物可变区的抗体或编码该抗体的基因。一方面，该方法包括：(i)从表达针对所述靶抗原的特异性抗体的转基因啮齿动物获得B细胞；(ii)使B细胞永生化；和(iii)从永生化的B细胞中分离针对靶抗原的特异性抗体。
一方面，该方法包括从对特定抗原特异的B细胞克隆马科动物可变区。一方面，啮齿动物是小鼠。一方面，该方法包括使用从B细胞克隆的马科动物可变区产生治疗性或诊断性抗体。一方面，提供了通过本文所述方法产生的治疗性或诊断性抗体。
这些和其他方面在下面更详细地描述。
附图简述
图1描绘了小鼠的位于12号染色体端粒端的Igh基因座(上图)(包括V(IghV)、D(IghD)、J(IghJ)和C(IghC)基因区段)，位于6号染色体上的Igκ基因座(中图)(包括V(IgkV)、J(IgkJ)和C(IgkC)基因区段)和位于16号染色体上的Igλ基因座(下图)(包括IglV(V)、IglJ(J)和IglC(C)基因区段)。Igh基因座中还显示了1)PAIR元件，它们是顺式调控序列，对Igh成环(looping)至关重要，以确保在VDJ重排中利用远端VH基因区段，2)Adam6a雄性生育力使能基因(male fertility-enabling gene)，3)基因间控制区1(IGCR1)，其包含调控Igh基因座的有序的、谱系特异性重排的位点，4)Eμ重链内含子增强子，5)Sμ转换区，6)3’调控区(3’RR)，一种控制同种型转换的顺式作用元件。在Igκ基因座中还显示了5’(E5’)和3’(E3’)增强子，并且在Igλ基因座中显示了三个增强子，Eλ2-4、Eλ和Eλ3-1 6)。
图2是图示通过同源重组将第一组序列特异性重组位点引入到非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组中的H链可变区基因座上游区域中的靶向策略的示意图。
图3是图示经由同源靶向载体将第二组序列特异性重组位点引入到非马科动物哺乳动物细胞基因组中的H链可变区基因座下游区域中的示意图。该图还图示了内源性免疫球蛋白H链可变区基因座以及选择标记从非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的缺失。
图4是图示将异源性部分马科动物免疫球蛋白H链基因座引入到先前已经被修饰为缺失内源性免疫球蛋白H链可变区基因座的非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组中的RMCE策略的示意图。
图5是图示将异源性部分马科动物免疫球蛋白κL链可变区基因座引入到小鼠基因组的内源性免疫球蛋白κL链基因座的示意图。
图6A和图6B是图示将异源性部分马科动物免疫球蛋白λL链可变区基因座引入到小鼠基因组的内源性免疫球蛋白λL链基因座的示意图。
定义
本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制这样的术语的含义，除非特别地指示。
如本文使用的术语“基因座”是指分别内源性地存在于基因组中或被(或即将被)引入到基因组中的染色体区段或核酸序列。例如，免疫球蛋白基因座可以包括支持免疫球蛋白H或L链多肽表达的部分或全部基因(即，VH、DH和JH基因区段或VL和JL基因区段以及恒定区基因)和中间的非编码序列(即内含子、增强子等)。术语“基因座”(例如，免疫球蛋白重链可变区基因座)可以指更大基因座的特定部分(例如，免疫球蛋白H链基因座的包括VH、DH和JH基因区段的部分)。类似地，免疫球蛋白轻链可变区基因座可以指更大基因座的特定部分(例如，免疫球蛋白L链基因座的包括VL和JL基因区段的部分)。
如本文使用的术语“免疫球蛋白可变区基因”是指可变(V)、多样性(D)、连接(J)基因区段，包括免疫球蛋白重链可变区中的VH、DH或JH基因区段或免疫球蛋白轻链可变区中的VL或JL基因区段，它们分别编码免疫球蛋白H或L链可变结构域的一部分。如本文使用的术语“免疫球蛋白可变区基因座”是指含有VH、DH或JH基因区段或VL或JL基因区段和中间的非编码序列(包括例如非编码调控序列或支架序列)的簇的部分或完整染色体区段或核酸链。
如本文使用的术语“基因区段”是指编码免疫球蛋白分子的重链或轻链可变结构域的一部分的核酸序列。基因区段可以包括编码序列和非编码序列。基因区段的编码序列是可以翻译为多肽(诸如前导肽和重链或轻链可变结构域的N-末端部分)的核酸序列。基因区段的非编码序列是位于编码序列侧翼的序列，其可以包括启动子、5’非翻译序列、前导肽编码序列中间插的内含子、一个或更多个重组信号序列(RSS)和剪接位点。免疫球蛋白重链(IGH)基因座中的基因区段包括VH、DH和JH基因区段(也分别称为IGHV、IGHD和IGHJ)。免疫球蛋白κ和λ轻链基因座中的轻链可变区基因区段可以称为VL和JL基因区段。在κ轻链中，VL和JL基因区段可以称为Vκ和Jκ基因区段或IGKV和IGKJ。类似地，在λ轻链中，VL和JL基因区段可以称为Vλ和Jλ基因区段或IGLV和IGLJ。
重链恒定区可以称为CH或者IGHC。马中编码IgM、IgD、IgG1-7、IgE或IgA的CH区外显子可分别称为Cμ、Cδ、Cγ1-7、Cε或Cα。类似地，免疫球蛋白κ或λ恒定区可以分别称为Cκ或Cλ，以及IGKC或IGLC。
如本文使用的“部分马科动物(partly equine)”是指包括对应于在马科动物和非马科动物哺乳动物宿主二者的给定基因座中发现的序列的序列的核酸或其表达的蛋白质和RNA产物。如本文使用的“部分马科动物”也指包括来自马科动物和非马科动物哺乳动物二者的核酸序列的免疫球蛋白基因座。一方面，“部分马科动物”是指包括例如来自啮齿动物例如小鼠的核酸序列的免疫球蛋白基因座。一方面，部分马科动物核酸具有马科动物免疫球蛋白H链或L链可变区基因区段的编码序列和基于非马科动物哺乳动物的内源性免疫球蛋白基因座的非编码调控或支架序列的序列。
在提及来自非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组的内源性非编码调控或支架序列使用时，术语“基于”是指存在于哺乳动物宿主细胞基因组的对应的内源性基因座中的非编码调控或支架序列。一方面，术语“基于”意指，存在于部分马科动物免疫球蛋白基因座中的非编码调控或支架序列与宿主哺乳动物内源性基因座的非编码调控或支架序列共有相对高度的同源性。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座中的非编码序列与宿主哺乳动物内源性基因座中发现的相应非编码序列具有至少约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同源性。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座中的非编码序列与宿主哺乳动物内源性基因座中发现的相应非编码序列相同。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座中的非编码序列从宿主哺乳动物的免疫球蛋白基因座保留。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座中的非编码序列与宿主哺乳动物内源性基因座中存在的相应非编码序列相同。一方面，马科动物编码序列嵌入到宿主哺乳动物免疫球蛋白基因座的非调控序列或支架序列中。一方面，非马科动物宿主动物是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
“嵌合”是指包含来自两种或更多种动物物种的核苷酸序列的核苷酸序列，或由包含来自两种或更多种动物物种的核苷酸序列的核苷酸序列编码的多肽，例如抗体。“嵌合”免疫球蛋白基因座是指包括来自两种或更多种动物物种的核酸序列的免疫球蛋白基因座。一方面，嵌合免疫球蛋白基因座包括马科动物核酸序列和小鼠核酸序列。一方面，嵌合免疫球蛋白包括来自两种或更多种动物物种的蛋白质序列。一方面，嵌合免疫球蛋白包括马科动物序列和小鼠序列。一方面，嵌合免疫球蛋白包括马科动物可变结构域和小鼠恒定结构域。一方面，嵌合免疫球蛋白可变区基因座包括马科动物VH、DH和JH编码序列或马科动物VL和JL编码序列和非马科动物非编码序列。一方面，嵌合免疫球蛋白可变区基因座包括马科动物VH、DH和JH编码序列或马科动物VL和JL编码序列和小鼠非编码序列。
本文使用的“侧翼”是指位于参考序列上游或下游的序列，例如，核苷酸序列。一方面，侧翼序列与参考序列相邻。一方面，一对序列位于参考序列的侧翼，使得第一序列位于参考序列的上游，并且第二序列位于参考序列的下游。
“内源性”是指生物体或细胞内天然存在的核酸序列或多肽。
“异源性”是指生物体或细胞内天然不存在的核酸序列或多肽。
“非编码调控序列”是指已知对于以下至关重要的序列：(i)V(D)J重组、(ii)同种型转换、(iii)V(D)J重组后全长免疫球蛋白H链或L链的正确表达、或(iv)可变剪接以产生例如免疫球蛋白H链的膜和分泌形式。“非编码调控序列”还可以包括以下序列：增强子和基因座控制元件，诸如CTCF和PAIR序列(Proudhon等人.Adv.Immunol.128:123-182(2015))；每个内源性V基因区段之前的启动子；剪接位点；内含子；或每个V、D或J基因区段侧翼的重组信号序列。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座的“非编码调控序列”与非马科动物哺乳动物宿主细胞内源性免疫球蛋白基因座中发现的相应非编码序列共有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％和高达约100％的同源性。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座的“非编码调控序列”与在非马科动物哺乳动物宿主细胞的内源性免疫球蛋白基因座中发现的相应非编码序列具有相同的序列。
“支架序列”是指存在于宿主细胞基因组的内源性免疫球蛋白基因座中的基因区段中间插的序列。在某些方面，支架序列被对于功能性非免疫球蛋白基因表达至关重要的序列，例如，ADAM6A或ADAM6B间隔开。一方面，支架序列可以包括来自另一物种的天然存在的核酸序列。一方面，支架序列可以是异源性的，基于来自另一物种的天然存在的核酸序列。一方面，支架序列可以包括人工序列。一方面，支架序列包括存在于马科动物基因组的免疫球蛋白基因座中的序列与其他序列组合，例如来自其他物种的支架序列。短语“非编码调控或支架序列”具有包容性的含义，并且可以指免疫球蛋白基因座中的非编码调控序列和支架序列二者。
“特异性结合”是指抗体或免疫球蛋白与特定抗原的表位或抗原决定簇结合的能力，其亲和力远高于抗体或免疫球蛋白与其他抗原结合的亲和力。
术语“同源靶向载体”是指用于通过同源重组修饰哺乳动物宿主细胞内源性基因组的核酸序列。同源靶向载体可以包括例如与非马科动物哺乳动物宿主基因组中存在的待修饰基因座侧翼的相应内源性序列具有同源性的靶向序列。一方面，同源靶向载体包括至少一个序列特异性重组位点。一方面，同源靶向载体包括非编码调控或支架序列。一方面，同源靶向载体包括一个或更多个选择标记基因。一方面，同源性靶向载体可以用于将序列特异性重组位点引入到宿主细胞基因组的特定区域。
“位点特异性重组”或“序列特异性重组”是指两个相容的重组序列(也称为“序列特异性重组位点”或“位点特异性重组序列”)之间的DNA重排过程。位点特异性重组可以包括以下三个事件中的任何一个：a)重组位点侧翼的预选核酸的缺失；b)重组位点侧翼的预选核酸的核苷酸序列的倒位，和c)位于不同核酸链上的重组位点附近的核酸序列的相互交换。应当理解，核酸区段的这种相互交换可以用作将异源性核酸序列引入到宿主细胞基因组中的靶向策略。
术语“靶向序列”是指与细胞基因组中的位于待修饰的免疫球蛋白基因座区域的侧翼或与之相邻的DNA序列同源的序列。侧翼或相邻序列可以位于基因座本身中，或者在宿主细胞基因组中的编码序列的上游或下游。将靶向序列插入到可以用于转染宿主细胞例如ES细胞的重组DNA载体中，使得被插入到宿主细胞基因组中的序列(诸如重组位点的序列)的侧翼为载体的靶向序列。
本文使用的术语“位点特异性靶向载体”是指包括编码序列特异性重组位点的核酸、异源性部分马科动物基因座和任选的选择标记基因的载体。一方面，“位点特异性靶向载体”用于使用重组酶介导的位点特异性重组来修饰宿主中的内源性免疫球蛋白基因座。靶向载体的重组位点适用于与已经被插入到宿主细胞的基因组序列中(例如，经由同源靶向载体)的、与待修饰的免疫球蛋白基因座相邻的另一个对应的重组位点进行位点特异性重组。将异源性部分马科动物序列整合到免疫球蛋白基因座的重组位点导致异源性部分马科动物区域替换内源性基因座。
本文中使用术语“转基因”来描述已经或将要被人工插入到细胞的基因组并且特别地哺乳动物宿主动物的细胞的基因组中的遗传物质。如本文使用的术语“转基因”是指部分马科动物核酸，例如，异源性表达构建体或靶向载体形式的部分马科动物核酸。
“转基因动物”是指具有作为染色体外元件存在于其细胞的一部分中或稳定整合到其种系DNA中(即，在其大部分或全部细胞的基因组序列中)的异源性核酸序列的非马科动物，通常为哺乳动物。在本发明中，根据本领域熟知的方法，通过对例如宿主动物的胚胎或胚胎干细胞的遗传操纵，将部分马科动物核酸引入到这样的转基因动物的种系中。
“载体”包括无论是否自我复制，均可以用于转化或转染细胞的质粒和病毒以及任何DNA或RNA分子。
发明详述
除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、和利用标记物的杂交检测。合适的技术的具体说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然，也可以使用其他等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册诸如以下：Green等人,Eds.(1999),Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)；Weiner,Gabriel,Stephens,Eds.(2007),Genetic Variation:A LaboratoryManual；Dieffenbach和Dveksler,Eds.(2007),PCR Primer:A Laboratory Manual；Bowtell和Sambrook(2003),DNA Microarrys:AMolecular Cloning Manual；Mount(2004),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis；Sambrook和Russell(2006),CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual；以及Green和Sambrook(2012),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(都来自Cold Spring HarborLaboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(4th Ed.)W.H.Freeman,New YorkN.Y.；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London；Nelson和Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry 3.sup.rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；和Berg等人.(2002)Biochemistry,5.Sup.th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，所有这些文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
注意，除非上下文另外清楚指示，否则如本文和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个基因座”指一个或更多个基因座，并且提及“一种方法”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法，等等。
如本文使用的，术语“或”可以意指“和/或”，除非明确指示仅指替代方案或者替代方案是互斥的。术语“包括/包含(including)”、“包括/包含(includes)”和“包括/包含(included)”不是限制性的。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有出版物出于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的装置、制剂和方法的目的通过引用并入。
在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被包括在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被包括在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包含限值中的一个或两个时，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也被包括在本发明内。
在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
在体液免疫系统中，多样化抗体的谱库，通过称为V(D)J重组的过程，由IgH(Igh)链和Igl链基因座的组合和连接多样性产生。在发育中的B细胞中，发生的第一重组事件是在重链基因座的一个D基因区段与一个J基因区段之间，并且这两个基因区段之间的DNA被缺失。这种D-J重组之后是来自新形成的DJ复合物上游区域的一个V基因区段的连接，形成重排的VDJ外显子。新产生的VDJ外显子的经重组的V与D基因区段之间的全部其他序列都从个体B细胞的基因组缺失。该重排的外显子最终在B细胞表面上表达为H链多肽的可变区，该H链多肽的可变区与L链多肽缔合以形成B细胞受体(BCR)。鼠和马科动物Ig基因座在它们包含的特征数量以及它们的编码区如何通过V(D)J重排而多样化方面高度复杂；然而，这种复杂性并没有扩展至每个可变区基因区段结构的基本细节。V、D和J基因区段在其组成和组织上是一致的。例如，V基因区段具有在免疫球蛋白基因座中以基本上不变的顺序方式排列的以下特征：短转录启动子区(长度<600bp)，编码抗体链的大部分信号肽的外显子；内含子；编码抗体链信号肽的一小部分和抗体可变结构域的大部分的外显子，以及V(D)J重排所必需的3’重组信号序列。类似地，D基因区段具有以下特征：5’重组信号序列、编码区和3’重组信号序列。J基因区段具有以下特征：5’重组信号序列、编码区和3’剪接供体序列。
在一个方面，提供了包括异源性部分马科动物核酸序列的非马科动物哺乳动物细胞，该序列包括存在于哺乳动物宿主基因组的免疫球蛋白基因座中的马科动物可变区编码序列和非编码调控或支架序列，例如，当宿主哺乳动物是小鼠时，小鼠基因组非编码序列。
马科动物基因组VH区包括定位于马科动物24号染色体510kb区域的大约50个VH、40个DH和8个JH基因区段。lambda(λ)编码区定位于马科动物8号染色体，跨约1310kb，并且包含大约144个Vλ、7个Jλ和7个Cλ基因，而kappa(κ)编码区定位于马科动物15号染色体，跨约820kb，并且包含约60个Vκ、4个功能性Jκ和1个Cκ基因。马科动物Ig基因座有几个不寻常的特征，特别是明显无功能的V基因区段的高频率。例如，50个VH基因区段中只有12个是有功能的；33个是假基因，并且5个被分类为开放阅读框(ORF)，这是具有开放阅读框的可变基因区段，其在剪接位点、重组信号序列、调控元件或高度保守氨基酸的变化中具有缺陷，这些缺陷预测会导致V结构域的不正确折叠。同样，144个Vλ基因区段中只有27个，7个Jλ基因区段中有4个，并且60个Vκ基因区段中有19个有功能。λ基因座的基因组结构也是非典型的。例如，在人类和小鼠中，存在一簇(I)Vλ基因区段，接着是一簇Jλ-Cλ基因。在B细胞发育过程中，缺失重排导致其中一个Vλ基因区段与其中一个Jλ-Cλ基因相关联。另一方面，在马中，存在一簇(I)Vλ基因区段，接着是一簇Jλ-Cλ基因，接着是另一簇(II)Vλ基因区段。基于它们的方向，簇II中的Vλ基因区段经历反向V→J基因重排，其发生频率比缺失基因重排低得多，以产生包括重组的Vλ和Jλ基因区段的Vλ外显子。此外，在簇II中的34个Vλ基因区段中，25个是假基因，并且2个是ORF，尽管Walther等人.(Dev.Comp.Immunol.3:303(2015))在该簇中鉴定了7个功能性Vλ基因区段。对该重叠群(NW_001867428.1)序列的分析表明，簇II中7个推定的功能性Vλ基因区段中没有一个包含常规RSS，这使得它们不太可能用于马科动物λLC谱库。然而，如表1所示，所有这七个Vλ基因区段在GenBank中都被发现为cDNA，表明它们可以在B细胞中重排和表达。一方面，本文描述的部分马科动物Vλ基因座可以包括来自簇I和簇II二者的Vλ基因区段。一方面，在部分马科动物H和κ和λL链基因座中，所有VH、DH和JH区段和所有VL和JL区段侧翼是小鼠RSS，以促进B细胞发育过程中的重排，并对转基因小鼠的部分马科动物抗体谱库做出贡献。
与人类和小鼠一样，马表达两种类型的Ig轻链(κ和λ)。然而，这些动物之间的κ与λ之比存在显著差异。在小鼠中，血清抗体中大约96％的轻链是κ型，而人类中的κ型仅占Ig L链总群体的66％。相比之下，马的L链谱库由λ主导(95％)。
掺入到Igh、Igκ或Igλ基因座中的部分马科动物核酸序列允许转基因动物产生包含马科动物重链可变区与马科动物κ或λ可变区配对的抗体。部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座保留了宿主基因组(例如啮齿动物)的调控序列和间插序列中的其他元件，这些序列和元件有助于促进宿主中有效的抗体产生和抗原识别。
一方面，提供了合成的或重组产生的部分马科动物免疫球蛋白基因座，其包括马科动物编码序列和来自免疫球蛋白VH、Vλ或Vκ基因座的非马科动物非编码调控序列或支架序列。
一方面，合成的H链DNA区段包含以下元件中的一种或更多种：雄性生育力所需的ADAM6基因、参与Igh基因座收缩的Pax-5激活的基因间重复序列(PAIR)元件、来自重链基因间控制区1、参与调控正常的VDJ重排的CTCF结合位点(Proudhon等人.Adv.Immunol.,128:123-182(2015))或其组合。这些内源性非编码调控序列和支架序列在小鼠Igh基因座中的位置如图1所示，从左至右示出：约100个功能性重链可变区基因区段(101)；PAIR，参与用于VDJ重组的Igh基因座收缩的Pax-5激活的基因间重复序列(102)；Adam6a，雄性生育力所需的去整合素和金属肽酶结构域6A基因(103)；Pre-D区，位于最远端DH基因区段上游的21609bp片段，Ighd-5(104)；基因间控制区1(IGCR1)，含有CTCF绝缘子位点(insulatorsite)以调控VH基因区段使用(106)；DH，多样性基因区段(10-15个，取决于小鼠品系)(105)；四个连接的JH基因区段(107)；Eμ，参与VDJ重组的内含子增强子(108)；Sμ，用于同种型转换的μ转换区域(109)；八个重链恒定区基因：Cμ、Cδ、Cγ3、Cγ1、Cγ2b、C2γa/c、Cε和Cα(110)；控制同种型转换和体细胞超突变的3’调控区(3’RR)(111)。图1从Proudhon等人.Adv.Immunol.,128:123-182(2015)的图修改而来。
一方面，将整合到哺乳动物宿主细胞中的异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括全部或大量已知的马科动物VH基因区段。然而，在一些情况下，可能希望使用这样的VH基因区段的子集。一方面，甚至少至一个马科动物VH编码序列可以被包含在部分马科动物免疫球蛋白基因座中。
一方面，所述非马科动物哺乳动物或哺乳动物细胞包括异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座，所述异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括马科动物VH、DH和JH基因编码序列。一方面，部分马科动物免疫球蛋白基因座包括基于非马科动物哺乳动物宿主的内源性Igh基因座的非编码调控和支架序列，例如pre-D序列。一方面，异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座包括完全重组的V(D)J外显子。
一方面，转基因非马科动物哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠，其包括异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座，该基因座包括马科动物VH、DH和JH基因和基于啮齿动物中的间插(非编码调控或支架)序列的间插序列，包括例如pre-D区。一方面，转基因啮齿动物还包括部分马科动物Igl基因座，其分别包括马科动物Vκ或Vλ编码序列和马科动物Jκ或Jλ编码序列和间插序列，诸如啮齿动物Igl基因座中存在的非编码调控或支架序列。
一方面，小鼠基因组的整个内源性VH免疫球蛋白基因座被缺失，并被12个功能性马科动物VH基因区段和小鼠基因组的J558VH基因座的非编码序列替换。一方面，异源性免疫球蛋白基因座包括40个马科动物DH和8个JH基因区段。一方面，异源性免疫球蛋白基因座包括小鼠pre-D区。一方面，马科动物VH、DH和JH编码序列嵌入在啮齿动物的非编码序列中。
一方面，同源重组和位点特异性重组的组合用于产生转基因细胞和动物。一方面，同源靶向载体用于将序列特异性重组位点引入哺乳动物宿主细胞基因组中内源性免疫球蛋白基因座中的期望位置。一方面，序列特异性重组位点通过同源重组插入哺乳动物宿主细胞的基因组中，并且不影响哺乳动物宿主细胞中任何其他基因的表达或编码序列。一方面，免疫球蛋白基因被转录和翻译以产生抗体的能力在插入重组位点和任选的任何另外序列如选择标记基因后得以维持。然而，在一些情况下，将其他异源性序列插入到免疫球蛋白基因座序列中使得所得抗体分子的氨基酸序列通过插入而改变，但抗体保留用于所期望目的的足够功能是可能的。一方面，将一种或更多种多态性引入恒定区外显子中的内源性基因座，从而提供同种异型标记，使得可以区分不同的Ig等位基因。
一方面，同源靶向载体用于替换内源性免疫球蛋白基因座内的序列，以及将序列特异性重组位点和一个或更多个选择标记基因插入宿主细胞基因组。本领域普通技术人员应当理解，如本文使用的选择标记基因可以用于识别和消除尚未经历同源重组的细胞或携带随机整合的靶向载体的细胞。
同源重组的方法是已知的，并且包括以下中描述的那些：美国专利第6,689,610号；第6,204,061号；第5,631,153号；第5,627,059号；第5,487,992号；及第5,464,764号，其中每一项通过引用以其整体并入。
位点/序列特异性重组
位点/序列特异性重组与同源重组的差异在于重组酶识别所要求的短的、特定的DNA序列是发生重组的仅有位点。根据特定DNA链或染色体上这些位点的方向，识别这些特定序列的专门重组酶可以催化i)DNA切除或ii)DNA倒位或旋转。如果这些位点不存在于同一条染色体上，位点特异性重组也可以发生在两条DNA链之间。许多噬菌体和酵母衍生的位点特异性重组系统(每个系统都包括重组酶及其同源识别位点)已被证明在真核细胞中起作用，包括但不限于噬菌体P1 Cre/lox系统、酵母FLP-FRT系统和位点特异性重组酶酪氨酸家族的Dre系统。这样的系统和方法描述于例如以下中：美国专利第7,422,889号；第7,112,715号；第6,956,146号；第6,774,279号；第5,677,177号；第5,885,836号；第5,654,182号；及第4,959,317号；其中的每一个通过引入并入本文。
可以使用位点特异性重组酶酪氨酸家族的其他系统，包括但不限于噬菌体λ整合酶、HK2022整合酶和属于重组酶丝氨酸家族的系统，包括例如噬菌体phiC31和R4Tp901整合酶。
因为位点特异性重组可以发生在两条不同的DNA链之间，所以位点特异性重组可以用于通过称为重组酶介导的盒式交换(RMCE)的过程将异源性免疫球蛋白基因座引入宿主细胞基因组。RMCE过程可以利用重组酶蛋白的野生型和突变的(mutant)序列特异性重组位点来开发。一方面，RMCE包括负选择。例如，待靶向的染色体基因座的一个末端上的侧翼可以是野生型LoxP位点，并且另一个末端上的侧翼可以是突变的LoxP位点。同样，载体可以包括要插入宿主细胞基因组的一个末端上的侧翼是野生型LoxP位点，并且另一个末端上的侧翼是突变的LoxP位点的异源性序列。当载体在存在Cre重组酶的情况下转染到宿主细胞中时，Cre重组酶将催化内源性DNA链和载体DNA之间的RMCE，而不是催化相同DNA链上的切除反应，因为每个DNA链上的野生型LoxP和突变的LoxP位点对于与彼此的重组是不相容的。因此，一条DNA链上的LoxP位点将仅与另一条DNA链上的LoxP位点重组；并且类似地，一条DNA链上突变的LoxP位点只会与另一条DNA链上突变的LoxP位点重组。
一方面，使用被用于RMCE的相同重组酶识别的序列特异性重组位点的变体。这样的序列特异性重组位点变体的实例包括包含反向重复序列的组合的那些变体或包含具有突变间隔区序列的重组位点的那些变体。例如，两类变体重组酶位点可用于工程化稳定的Cre-loxP整合重组。二者都利用了Cre识别序列中的在8bp间隔区内或在13bp反向重复序列内的序列突变。间隔区突变体诸如lox511(Hoess等人,Nucleic Acids Res,14:2287-2300(1986))、lox5171和lox2272(Lee和Saito,Gene,216:55-65(1998))、m2、m3、m7和m11(Langer等人,Nucleic Acids Res,30:3067-3077(2002))容易与自身重组，但与野生型位点具有显著降低的重组率。这类突变体已经通过使用非相互作用的Cre-Lox重组位点和非相互作用的FLP重组位点的RMCE被用于DNA插入(Baer和Bode,Curr Opin Biotechnol,12:473-480(2001)；Albert等人,Plant J,7:649-659(1995)；Seibler和Bode,Biochemistry,36:1740-1747(1997)；Schlake和Bode,Biochemistry,33:12746-12751(1994))。
反向重复突变体是另一类变体重组酶位点。例如，LoxP位点可以包含在左侧反向重复序列(LE突变体)或右侧反向重复序列(RE突变体)中改变的碱基。LE突变体lox71在左侧反向重复序列的5’末端上具有从野生型序列改变为TACCG的5bp(Araki等人,NucleicAcids Res,25:868-872(1997))。类似地，RE突变体lox66具有改变为CGGTA的5个3’碱基。反向重复序列突变体被用于将质粒插入物整合到具有LE突变体的染色体DNA中，LE突变体被指定为“供体”RE突变体重组到其中的“靶”染色体loxP位点。重组后，loxP位点位于插入区段的顺式侧翼。重组的机制使得，重组后一个loxP位点是双突变体(包含LE和RE反向重复序列突变二者)，并且另一个是野生型(Lee和Sadowski,Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,80:1-42(2005)；Lee和Sadowski,J Mol Biol,326:397-412(2003))。双突变体与野生型位点有足够的差异，因为双突变体不能被Cre重组酶识别，并且插入的区段不能被切除。
一方面，序列特异性重组位点被引入内含子，而不是编码或调控序列中，以避免破坏抗体表达中使用的调控序列或编码序列。
序列特异性重组位点的引入可以通过常规同源重组技术实现。这样的技术在诸如以下的参考文献中描述：例如Green和Sambrook(2012)(Molecular cloning:a laboratorymanual 4th ed.(Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Nagy,A.(2003).(Manipulating the mouse embryo:a laboratory manual,3rd ed.(ColdSpring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
特异性重组到基因组中可以使用如本领域已知的设计用于正选择或负选择的载体来促进。为了促进鉴定已经经历替换反应的细胞，可以使用适当的遗传标志物系统，并且细胞通过例如使用选择组织培养基来选择。一方面，在选择含有异源性核酸的细胞后，可以去除异源性序列的两个端点处或附近的核酸序列，例如标志物系统或基因。
一方面，其中内源性免疫球蛋白基因座已经被缺失的细胞可以用于使用标志物基因进行正选择，该标志物基因可以任选地在重组事件之后或作为重组事件的结果从细胞中去除。可以使用的正选择系统是基于对通过重组事件带到一起的标志物基因诸如次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的两个非功能性部分的使用。一方面，在用异源性免疫球蛋白基因座成功替换内源性免疫球蛋白基因座后，两个非功能性部分被带到处于功能关联。一方面，功能重建的标志物基因在一侧的侧翼是另外的序列特异性重组位点(不同于用于替换反应的序列特异性重组位点)，使得可以使用合适的位点特异性重组酶从基因组中切除标志物基因。另一方面，细胞在暴露于毒素或药物时被负选择。例如，如果单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)基因位于同源区域之外，其中靶向构建体不是通过同源重组整合而是随机整合到基因组中的细胞将保留HSV-TK的表达。可以使用核苷类似物如更昔洛韦来选择这样的细胞。
一方面，重组酶以纯化的蛋白质提供。一方面，重组酶以从瞬时转染到宿主细胞或稳定整合到宿主细胞基因组中的载体构建体表达的蛋白质提供。可选地，包含异源性免疫球蛋白基因座的转基因动物可以与表达重组酶的动物杂交。
一方面，两组或更多组序列特异性重组位点被包含在工程化基因组中，使得可以利用多轮RMCE将部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座插入非马科动物哺乳动物宿主细胞基因组中。
一方面，使用CRISPR技术引入部分马科动物免疫球蛋白基因座。例如，CRISPR/Cas9基因组编辑系统可用于靶向重组(He等人,Nuc.Acids Res.,44:e85,(2016))。
转基因动物的生产
一方面，提供了用于产生包括异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，所述动物例如啮齿动物，例如小鼠。
一方面，转基因动物的基因组被修饰为使得转基因动物的B细胞能够在每个细胞中表达多于一个功能性VH结构域，即，所述细胞产生双特异性抗体，如2016年8月24日提交的标题为“Enhanced Production of Immunoglobulins”的WO20170/35252中所述，其公开内容通过引用并入本文。
一方面，转基因动物的基因组被修饰为使得转基因动物的B细胞能够表达包括重链但不包括轻链的抗体，即，细胞产生仅有重链的抗体(heavy chain-only antibodies)。
一方面，宿主细胞是胚胎干(ES)细胞，其随后可用于产生转基因哺乳动物。一方面，该方法包括：分离包含异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的胚胎干细胞，并使用ES细胞产生包含异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座的转基因动物。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，且以下实施例并不意在限制本发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表或隐含下文的实验是所进行的全部实验或仅有实验。本领域技术人员将会理解，在不脱离本文所述的本发明的精神或范围的情况下，可以进行许多变化或修改。因此，这些实施例被认为是说明性的，而不是限制性的。
已经作出了努力以确保关于使用的术语和数字(例如，载体、量、温度，等)的准确性，但应该考虑一定实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度以摄氏度计，且压力处于大气压或临近大气压。
实施例说明了通过位于重组位点侧翼的5’载体和3’载体二者进行的靶向以及通过RMCE引入合成DNA。在阅读说明书时，对于本领域技术人员来说将明显的是，5’载体靶向可以首先发生，然后是3’，或者3’载体靶向可以首先发生，然后是5’载体。在一些情况下，靶向可以与双重检测机制同时进行。尽管在每个实施例中使用了一些不同的策略来选择已经适当整合了5’或3’载体的细胞，但同样明显的是，通过微小的修改，这些策略可以互换以靶向Igh、Igκ或Igλ基因座。
实施例1：将异源性部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座引入到非马科动物哺 乳动物宿主细胞基因组的免疫球蛋白H链可变区基因座中
图2-图4中示出了将异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座引入到非哺乳动物ES细胞的基因组基因座中的示例性方法。图2描绘了在内源性VH基因区段的上游(5’)引入位点特异性重组序列的方法。提供了5’同源靶向载体(201)，该同源靶向载体包含嘌呤霉素磷酸转移酶-胸苷激酶融合蛋白(puro-TK)(203)，该融合蛋白的侧翼是两个不同的重组酶识别位点(例如，分别针对Flp和Cre的FRT(207)和loxP(205))和两个不同的突变的位点(例如，修饰的突变的FRT(209)和突变的loxP(211))，该突变的位点缺乏与它们各自的野生型对应物/位点(即野生型FRT(207)和野生型loxP(205))重组的能力。靶向载体包括白喉毒素受体(DTR)cDNA(217)，用于细胞的负选择。靶向载体还任选地包含可视标志物，诸如绿色荧光蛋白(GFP)(未示出)。区域213和215分别与内源非马科动物基因座中的邻接区域(229)的5’和3’部分同源，该邻接区域(229)处于包含内源非马科动物VH基因区段(219)的基因组区域的5’。同源靶向载体(201)被引入(202)到ES细胞中，该同源靶向载体(201)具有免疫球蛋白基因座(231)，该免疫球蛋白基因座(231)包含内源VH基因区段(219)、pre-D区(221)、DH基因区段(223)、JH基因区段(225)和免疫球蛋白恒定区基因(227)。来自同源靶向载体(201)的位点特异性重组序列和DTR cDNA被整合(204)到内源小鼠VH基因座5’的位点处的非马科动物基因组中，产生233处所示的基因组结构。
根据已知的程序，将小鼠胚胎干(ES)细胞(来源于C57B1/6NTac小鼠)通过电穿孔用5’载体(201)转染。在电穿孔之前，将载体DNA用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且～24小时后，将它们置于针对已经将5’载体整合到其DNA中的细胞的选择之下。没有5’载体(201)整合到其基因组中的ES细胞可以通过在培养基中包含嘌呤霉素而被选择(杀死)；只有已经将5’载体(201)稳定整合到其基因组中并组成型表达puro-TK基因的ES细胞对嘌呤霉素是抗性的。
约一周之后，在药物抗性ES细胞的集落变成裸眼可见之后，将药物抗性ES细胞的集落从其板上物理提取。将这些挑选的集落分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，将每个细胞克隆分配为使得一些细胞可以被冷冻作为存档材料(archive)，并且其余的用于DNA的分离而用于分析目的。引入5’载体的初级筛选程序可通过DNA印迹进行，或通过PCR进行，并通过二级筛选方法如DNA印迹进行确认。
来自ES细胞克隆的DNA通过PCR使用广泛实践的基因靶向测定设计进行筛选。对于该测定，其中一个PCR寡核苷酸引物序列定位于5’载体(201)和基因组DNA之间共有同源性的区域之外，而另一个定位于5’载体内，例如Puro-TK基因(203)中。根据标准设计，这些测定检测仅存在于经历5’靶向载体与内源性小鼠Igh基因座之间的同源重组的ES细胞克隆中的DNA。
DNA印迹测定根据广泛使用的程序使用三种探针和用多种限制酶消化的基因组DNA进行，所述多种限制酶选择为使得探针和消化物的组合允许克隆中靶向基因座的结构被鉴定为通过同源重组适当修饰。探针之一定位至位于5’靶向载体与基因组DNA之间共有同一性的区域5’侧的侧翼的DNA序列；第二探针定位在同一性区域之外，但在3’侧；并且第三探针定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新DNA中，例如，在Puro-TK基因(203)中。DNA印迹鉴定预期限制性酶产生的DNA片段的存在，所述DNA片段对应于由外部探针之一和Puro-TK探针检测到的经修饰的序列(即通过与5’靶向载体的同源重组)的Igh基因座的一部分。外部探针检测突变体片段，并且也检测来自同源染色体上免疫球蛋白Igh基因座的非突变体拷贝的野生型片段。
ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。具有基于DNA印迹数据的预期基因组结构、并且根据核型分析没有可检测到的染色体畸变的ES细胞克隆，被选择用于进一步使用。
如图3所示，提供了一种3’同源靶向载体(301)，其包括任选的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因(335)，可用于HPRT缺陷ES细胞的正选择；新霉素抗性基因(337)；分别用于Flp和Cre的重组酶识别位点FRT(307)和loxP(305)。区域329和339分别与位于内源性JH基因区段(325)下游和恒定区基因(327)上游的内源性小鼠基因座中的邻接区域(341)的5’和3’部分同源。同源靶向载体被引入(302)到修饰的小鼠免疫球蛋白基因座(331)中，该修饰的小鼠免疫球蛋白基因座(331)包含内源性VH基因区段(319)、pre-D区(321)、D基因区段(323)、JH基因区段(325)和恒定区基因(327)。同源靶向载体的位点特异性重组序列(307、305)、HPRT基因(335)和新霉素抗性基因(337)被整合(304)到内源小鼠恒定区基因(327)上游的小鼠基因组中，产生333处所示的基因组结构。
用3’载体(301)修饰的可接受克隆的鉴定使用的程序和筛选测定在设计上与使用5’载体(201)的程序和筛选测定基本相同，除了使用新霉素或HPRT选择代替嘌呤霉素进行选择。PCR测定、探针和消化物也被定制以匹配被3’载体修饰的基因组区域。ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。
在载体靶向和分析之后分离出已经被3’载体和5’载体二者突变的ES细胞克隆，即携带两种工程化突变的双重靶向细胞。克隆必须经历同一条染色体上而不是同源染色体上的基因靶向(即通过靶向载体产生的工程化突变必须在同一条DNA链上呈顺式，而不是在分开的同源DNA链上呈反式)。将具有顺式排列的克隆与具有反式排列的克隆通过分析程序诸如中期涂片的荧光原位杂交区分开，所述荧光原位杂交使用与存在于两个基因靶向载体(303和337)的具有基因组同一性的臂之间的新DNA杂交的探针。这两种类型的克隆也可以通过以下来区分彼此：用表达Cre重组酶的载体转染它们，如果靶向载体已经顺式整合，则Cre重组酶会缺失HPRT(335)和新霉素耐药(337)基因，并且然后通过“亲缘种选择”筛选程序分析克隆的耐药表型，其中来自每个克隆的一些细胞被测试对G418/新霉素的耐药性。由此产生的大部分顺式衍生克隆也对G418/新霉素敏感，与反式衍生克隆相反，反式-衍生克隆应保持对药物的抗性。选择重链基因座中具有工程化突变的顺式排列的双重靶向细胞克隆用于进一步使用。
在两个重组位点整合到哺乳动物宿主细胞基因组中后，然后通过引入与整合到基因组中的序列特异性重组位点相对应的重组酶之一(例如Flp或Cre)使内源性免疫球蛋白基因座经历重组。在Flp或Cre(302)存在的情况下，野生型FRT或野生型LoxP位点之间的所有间插序列，包括DTR基因(317)、内源Igh可变区基因座(319、323、325)、pre-D区(321)、以及HPRT(335)和新霉素抗性(337)基因被缺失，产生339处所示的基因组结构。程序依赖于已经发生在同一染色体上而不是其同源物上的第二靶向(即顺式而不是反式)。如果靶向如预期的顺式发生，则细胞对引入培养基的白喉毒素的负选择不敏感，因为引起对白喉毒素敏感的DTR基因(317)应该在宿主细胞基因组中不存在(从宿主细胞基因组中缺失)。同样，携带随机整合的第一或第二靶向载体的ES细胞由于未缺失的DTR基因的存在而被赋予对白喉毒素的敏感性。
用Cre重组酶表达载体和含有包含嵌入小鼠非编码序列的马科动物VH、DH和JH基因区段编码序列的部分马科动物免疫球蛋白重链基因座的载体，对携带其免疫球蛋白重链基因座的两个同源拷贝之一中的序列缺失的ES细胞克隆进行再转染。图4示出了将异源性部分马科动物免疫球蛋白重链基因座引入小鼠基因组，小鼠基因组中编码重链可变区结构域的内源性免疫球蛋白重链基因座的部分，包括内源性VH和JH基因座之间的间插序列，已经被缺失。通过RMCE将包括要插入到非马科动物宿主基因组中的部分马科动物免疫球蛋白基因座的位点特异性靶向载体(441)引入(402)宿主细胞(439)的修饰的基因组中。包括部分马科动物VH基因座(419)、小鼠pre-D区(421)、部分马科动物DH基因座(423)、部分马科动物JH基因座(425)、以及侧翼突变的FRT(409)、突变的LoxP(411)、野生型FRT(407)和野生型LoxP(405)位点的位点特异性靶向载体(441)，通过RMCE引入(402)到宿主细胞中。具体来说，部分马科动物VH基因座(419)包括12个功能性马科动物VH基因区段编码序列和存在于内源性非马科动物基因组中的基因区段的3’非马科动物RSS以及间插序列；pre-D区(421)包括存在于内源性非马科动物基因组上游的21.6kb非马科动物序列；DH区(423)包括40个马科动物DH基因区段的密码子，其侧翼为非马科动物RSS并嵌入内源性非马科动物DH区中存在的间插序列中；并且JH基因座(425)包括8个马科动物JH基因区段的密码子，其具有5’非马科动物RSS并嵌入内源性非马科动物基因组中存在的间插序列中。一方面，宿主细胞基因组的Igh基因座被修饰以缺失所有内源VH、DH和JH基因区段，包括间插序列，如参考图3描述的。作为这种修饰的结果，内源性非马科动物Igh基因座(439)与puro-TK融合基因(403)被留下，该puro-TK融合基因(703)的侧翼是上游的突变的FRT位点(409)和突变的LoxP位点(411)以及下游的野生型FRT(407)和野生型LoxP(405)。在引入适当的重组酶(404)后，部分马科动物免疫球蛋白基因座被整合到内源性小鼠恒定区基因(427)上游的基因组的lox5171(411)和loxP(405)位点之间，形成443处所示的DNA区域。
未经历RMCE和部分马科动物Igh基因座整合的ES细胞保留了puro-TK融合基因(403)，并通过向组织培养基中加入更昔洛韦而被消除。
马科动物VH、DH和JH基因区段的序列显示在SEQ ID NO.1-65中。
异源性部分马科动物免疫球蛋白区域的整合可以通过DNA印迹检测，或通过PCR检测并通过二次筛选方法如DNA印迹进行确认。筛选方法设计为检测插入的VH、DH或JH基因座以及间插序列的存在。ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。
根据标准程序，将小鼠重链基因座中携带部分马科动物免疫球蛋白重链可变区(443)的ES细胞克隆显微注射到来自品系DBA/2的小鼠胚泡中，以产生ES细胞来源的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的ES细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。分析这些交配的后代是否存在部分马科动物免疫球蛋白重链基因座。携带部分马科动物免疫球蛋白重链基因座的小鼠用于建立小鼠群体。
实施例2：将异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座引入小鼠基因组的免疫球蛋 白κ链基因座
图5示出了用部分马科动物Igκ基因座替换部分小鼠Igκ基因座的方法。该方法包括将第一位点特异性重组酶识别序列引入到小鼠基因组中，该序列可以被引入小鼠基因组的内源性VK(515)和JK(519)区域基因区段簇的5’或3’，然后将第二位点特异性重组酶识别序列引入小鼠基因组中，该序列与第一序列特异性重组位点组合，位于包括恒定区基因(521)上游的VK和JK基因区段簇的完整基因座的两侧。使用相关的位点特异性重组酶，将侧翼区域缺失并用部分马科动物免疫球蛋白轻链可变区基因座替换。
用于在VK(515)和JK(519)基因区段的任一侧引入位点特异性重组序列的靶向载体也包含另外的位点特异性重组序列，该另外的位点特异性重组序列已经被修饰，使得它仍然能被重组酶有效识别，但是不与未修饰的位点重组。该位点被定位在靶向载体中，使得在缺失VK和JK基因区段簇后，它可用于第二位点特异性重组事件，其中异源免疫球蛋白轻链可变区基因座通过RMCE插入修饰的VK基因座。在本实施例中，异源免疫球蛋白轻链可变区基因座是包括马科动物VK和JK基因区段和小鼠Igκ可变区非编码序列的合成核酸。
构建两个基因靶向载体来完成刚刚概述的方法。载体(503)之一包括取自在最远端VK基因区段的上游的基因座5’端的小鼠基因组DNA(525和541)。另一个载体(505)包含取自JK基因区段(519)的下游(3’)和恒定区基因(521)上游的基因座内的小鼠基因组DNA(543和549)。
5’载体(503)的关键特征如下：编码白喉毒素A亚基(DTA)的基因，受修饰的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因启动子的转录控制，该启动子与来自多瘤病毒的两个突变转录增强子偶联(523)；定位在κ链基因座最远端可变区基因上游的6Kb小鼠基因组DNA(525)；Flp重组酶的FRT识别序列(527)；包含小鼠Polr2a基因启动子的基因组DNA段(529)；翻译起始序列(535，嵌入“Kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)；Cre重组酶的突变的loxP识别序列(lox5171)(531)；转录终止/多腺苷酸化序列(533)；Cre重组酶的loxP识别序列(537)；在来自小鼠磷酸甘油酸激酶1基因的启动子的转录控制下的编码包括与胸苷激酶(pu-TK)的截短形式融合的赋予嘌呤霉素抗性的蛋白的融合蛋白的基因(539)；定位在载体中5’端的6Kb序列附近，并以天然相对方向排列的2.5Kb小鼠基因组DNA(541)。
3’载体(505)的关键特征如下：定位在Jκ(519)与Cκ(521)基因座之间的内含子中的6Kb小鼠基因组DNA(543)；在小鼠Polr2a基因启动子的转录控制下的编码人类次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的基因(545)；在小鼠磷酸甘油酸激酶1基因启动子控制下的新霉素抗性基因(547)；用于Cre重组酶的loxP识别序列(537)；定位在紧邻载体中5’末端处包含的6Kb DNA片段的基因组下游的3.6Kb小鼠基因组DNA(549)，其中两个片段以与小鼠基因组相同的相对方式取向；在与来自多瘤病毒的两个突变体转录增强子偶联的修饰的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因启动子的转录控制下的编码白喉毒素A亚基(DTA)的基因(523)。
根据已知的程序，将来源于C57B1/6NTac小鼠的小鼠胚胎干(ES)细胞通过电穿孔用3’载体(505)转染。在电穿孔之前，将载体DNA用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，通过使用新霉素类似物药物G418将其置于针对已经将3’载体整合到其DNA中的细胞的正选择下。也存在针对已经将载体整合到其DNA中但不是通过同源重组进行整合的细胞的负选择。非同源重组将会导致DTA基因的保留，DTA基因在表达时将会杀死细胞，而DTA基因因为位于与小鼠Igκ基因座的载体同一性区域之外而通过同源重组缺失。约一周之后，在药物抗性ES细胞的集落变成裸眼可见之后，将药物抗性ES细胞的集落从其板上物理提取。将这些挑选的集落分解，再铺板于微孔板中，并且培养数天。此后，将每个细胞克隆分配为使得一些细胞可以被冷冻作为存档材料，并且其余的用于DNA的分离而用于分析目的。
使用基因靶向测定，通过PCR筛选来自ES细胞克隆的DNA。对于该测定，PCR寡核苷酸引物序列中的一种定位在3’载体(505)与基因组DNA(501)之间共有同一性的区域之外，而另一种定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新DNA中，例如，HPRT(545)或新霉素抗性(547)基因中。这些测定检测仅存在于源自经历了3’载体(505)和内源性小鼠Igκ基因座之间的同源重组的转染的细胞的ES细胞克隆中的DNA段。选择PCR阳性克隆进行扩增，然后使用DNA印迹测定进行进一步分析。
DNA印迹测定根据已知的程序进行；DNA印迹包括三种探针和用多种限制性酶消化的基因组DNA，所述多种限制性酶选择为使得探针和消化物的组合允许得出关于以下的结论：克隆中靶向的基因座的结构以及其是否通过同源重组被适当修饰。其中一个探针定位至位于3’κ靶向载体(505)与基因组DNA之间共有同一性的区域5’侧的侧翼的DNA序列；第二探针也定位在同一性区域之外，但在3’侧；第三探针定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新DNA中，诸如在HPRT(545)或新霉素抗性(547)基因中。DNA印迹鉴定预期限制性酶产生的DNA片段的存在，所述DNA片段对应于由一种外部探针和由新霉素抗性或HPRT基因探针检测到的正确突变(即通过与3’κ靶向载体(505)的同源重组突变)的κ基因座的一部分。外部探针检测突变体片段，并且还检测来自同源染色体上免疫球蛋白κ基因座的非突变体拷贝的野生型片段。
ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常的克隆用于进一步使用。
然后可接受的克隆用5’载体(503)使用以下程序和筛选测定进行修饰：所述程序和筛选测定在设计上使用与3’载体(505)的那些程序和筛选测定基本相同，不同之处在于使用嘌呤霉素选择替代G418/新霉素选择，并且定制方案以匹配由5’载体(503)修饰的基因组区域。5’载体(503)转染实验的目标是分离出已经被3’载体(505)和5’载体(503)二者以预期方式突变的ES细胞克隆，即携带两种工程化突变的双重靶向细胞。在这些克隆中，Cre重组酶引起由两个载体引入到κ基因座中的loxP位点之间发生重组(502)，产生507处所示的基因组DNA构型。
此外，克隆必须在同一条染色体上而不是同源染色体上经历基因靶向；即通过靶向载体产生的工程化突变必须在同一条DNA链上呈顺式，而不是在分开的同源DNA链上呈反式。将具有顺式排列的克隆与具有反式排列的克隆通过分析程序诸如中期涂片的荧光原位杂交区分开，所述荧光原位杂交使用与存在于两个基因靶向载体(503和505)的具有基因组同一性的臂之间的新DNA杂交的探针。两种类型的克隆也可以通过以下来彼此区分开：用表达Cre重组酶的载体(如果靶向载体已经以顺式整合，则该载体使pu-TK(539)、HPRT(545)和新霉素抗性(547)基因缺失)转染它们，并且将针对通过5’载体(503)引入的胸苷激酶基因进行更昔洛韦选择而存活的集落数进行比较，并且通过“亲缘种选择”筛选程序(其中测试了来自克隆的一些细胞对嘌呤霉素或G418/新霉素的抗性)分析存活克隆的药物抗性表型。具有突变的顺式排列的细胞预期比具有反式排列的细胞产生大约多103个更昔洛韦抗性克隆。大多数所得的顺式来源的更昔洛韦抗性克隆应该也对嘌呤霉素和G418/新霉素二者都敏感，相比之下，反式来源的更昔洛韦抗性克隆应该对这两种药物都保留抗性。选择κ链基因座中具有工程化突变的顺式排列的细胞克隆用于进一步使用。
将细胞的双重靶向克隆用表达Cre重组酶的载体瞬时转染(502)，并且随后将转染的细胞置于更昔洛韦选择下，如在以上总结的分析实验中的那样。分离出更昔洛韦抗性的细胞克隆，并且通过PCR和DNA印迹分析由5’载体(503)和3’载体(505)产生的两个工程化突变之间的预期缺失(507)的存在。在这些克隆中，Cre重组酶引起由两个载体引入到κ链基因座中的loxP位点(537)之间发生重组。因为loxP位点在两个载体中以相同的相对方向排列，重组导致包含两个loxP位点之间整个基因组区间的DNA圈(a circle of DNA)被切下。该圈不包含复制起点，并且因此在有丝分裂期间不被复制，并且因此在细胞经历克隆增殖时从细胞克隆中损失。所得的克隆携带最初位于两个loxP位点之间的缺失。ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常的克隆用于进一步使用。
携带其免疫球蛋白κ链基因座的两个同源拷贝之一的序列缺失的ES细胞克隆用Cre重组酶表达载体和包括含有Vκ(551)和Jκ(555)基因区段的部分马科动物免疫球蛋白κ链基因座的载体(509)再转染(504)。载体的关键特征如下：lox5171位点(531)；新霉素抗性基因开放阅读框(547)，其缺少起始甲硫氨酸密码子，但与在甲硫氨酸起始密码子(535)下游的lox5171位点(531)中的不间断的开放阅读框同框并且相邻；FRT位点(527)；19个马科动物Vκ基因区段(551)的阵列，每个区段包括在3’侧的侧翼为小鼠RSS并嵌入小鼠非编码序列中的马科动物编码序列；任选地，来自小鼠κ链基因座中Jκ区基因区段簇上游紧邻的13.5Kb基因组DNA段(未示出)；含有4个马科动物Jκ区基因区段(555)的DNA，5’侧的侧翼为小鼠RSS并嵌入小鼠非编码DNA中；与lox5171位点(531)相对方向相反的loxP位点(537)。
马科动物Vκ和Jκ基因编码区的序列显示在SEQ ID NO.66-86中。
将转染的ES克隆置于G418选择下，该选择富集已经历RMCE的细胞克隆，其中包括部分马科动物免疫球蛋白κ链基因座的供体DNA (509)被完整地整合到分别由5’(503)和3’(505)载体放置在那里的lox5171(531)和loxP(537)位点之间缺失的内源性免疫球蛋白κ链基因座中。只有已经适当地经历RMCE的细胞才具有表达新霉素抗性基因(547)的能力，因为其表达所要求的启动子(529)和起始甲硫氨酸密码子(535)不存在于载体(509)中，但已经预先存在于修饰的宿主细胞Igκ基因座(507)中。使用509序列产生的DNA区域在511处示出。位于FRT位点(527)之间的5’载体(503)的剩余元件在体外或体内通过Flp介导的重组(506)被去除，如下所述，得到部分马科动物免疫球蛋白轻链基因座，如513处所示。
G418抗性ES细胞克隆通过PCR和DNA印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的RMCE过程而没有不想要的重排或缺失。ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。具有这样的畸变的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常的克隆用于进一步使用。
根据标准程序，将携带内源性小鼠免疫球蛋白κ链基因座(513)中的部分马科动物免疫球蛋白κ链基因座的ES细胞克隆显微注射到来自品系DBA/2的小鼠胚泡中，以产生部分ES细胞衍生的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的ES细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。选择用于交配的雌性小鼠是C57B1/6NTac品系，并且还携带编码Flp重组酶的转基因，该转基因在它们的种系中表达，并且将从5’载体中缺失FRT侧翼的新霉素抗性基因(520)和其他元件。分析这些交配的后代中部分马科动物免疫球蛋白κ链基因座的存在和新霉素抗性基因的缺失。携带部分马科动物免疫球蛋白κ链基因座的小鼠用于建立小鼠集落。
携带如实施例1所述产生的部分马科动物免疫球蛋白重链基因座的小鼠可以与携带部分马科动物免疫球蛋白κ链基因座的小鼠配种。继而它们的后代以最终产生部分马科动物Igh和部分马科动物Igκ两者都是纯合的小鼠的方案一起配种。这样的小鼠产生包括马科动物可变结构域和小鼠恒定结构域的部分马科动物重链。它们还产生包括马科动物κ可变结构域和小鼠κ恒定结构域的部分马科动物κ蛋白。从这些小鼠中回收的单克隆抗体包括与马科动物κ可变结构域配对的马科动物重链可变结构域。
一方面，将部分马科动物Igh和部分马科动物Igκ两者都是纯合的小鼠与实施例3中产生的部分马科动物λ基因座纯合的小鼠配种，以产生所有三个基因座都是纯合的小鼠。
本领域技术人员将认识到，这里用于靶向Igκ基因座的5’载体(503)和后续策略也可以用来代替图2中的5’载体(201)，作为靶向Igh基因座的替代策略。在这种情况下，对5’载体(503)进行修饰，以将与Igκ基因座同源的基因组DNA区域(525和541)替换为与Igh基因座同源的基因组DNA区域(图2中的213和215)。
实施例3：将异源性部分马科动物免疫球蛋白基因座引入小鼠基因组免疫球蛋白λ 链基因座
图6A和图6B示出了用部分马科动物Igλ基因座替换部分小鼠Igλ基因座的方法。该方法包括通过同源重组过程从野生型小鼠免疫球蛋白λ基因座(601和图1，底图)中缺失包括Vλ2/Vλ3基因区段(613)、Jλ2/Cλ2基因簇(615)和Vλ1-Jλ3/Cλ3-Jλ1/Cλ1基因簇(617)的～200Kb的DNA，所述同源重组过程涉及与Vλ2/Vλ3基因区段(613)上游和Cλ1基因区段(617中最右边的方框)下游且Eλ增强子(623)的上游或下游两者的内源性小鼠免疫球蛋白λ基因座共有同一性的靶向载体(603)。该载体用设计用于允许随后位点特异性重组的元件替换内源性小鼠基因组DNA的～200Kb，其中异源免疫球蛋白λ基因座通过RMCE替换修饰的Vλ基因座(604)。在本实施例中，异源免疫球蛋白λ基因座是包括马科动物Igλ编码序列和小鼠Igλ非编码序列的合成核酸。
用于完成～200Kb缺失和插入位点特异性重组位点的基因靶向载体(603)的关键特征如下：负选择基因，诸如编码白喉毒素A亚基(DTA，659)的基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(未示出)；来自免疫球蛋白λ基因座中的小鼠Vλ2/Vλ3可变区基因区段的5’的4Kb基因组DNA(625)；FRT位点(627)；包含小鼠Polr2a基因启动子的基因组DNA(629)；翻译起始序列(嵌入“Kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)(635)；用于Cre重组酶的突变loxP识别序列(lox5171)(631)；转录终止/多腺苷酸化序列(633)；编码赋予嘌呤霉素抗性的蛋白的开放阅读框(637)，而该开放阅读框位于相对于Polr2a启动子及紧邻其的翻译起始序列的反义链上，并且随后是其自身的转录终止/多腺苷酸化序列(633)；用于Cre重组酶的loxP识别序列(639)；与嘌呤霉素抗性基因开放阅读框在相同的反义链上的翻译起始序列(嵌入“Kozak”共有序列中的甲硫氨酸密码子)(635)；鸡β肌动蛋白启动子和被定向为使得其指导嘌呤霉素抗性开放阅读框的转录的巨细胞病毒早期增强子元件(641)，其中翻译起始于loxP位点下游的起始密码子(635)处，并且继续通过loxP位点回到嘌呤霉素开放阅读框，这些全部都在相对于Polr2a启动子及紧邻其的翻译起始序列的反义链上；用于Flp重组酶的突变识别位点(643)；以及包含Eλ增强子元件(623)的基因组DNA片段(645)。
根据已知的程序，将来源于C57B1/6NTac小鼠的小鼠胚胎干(ES)细胞通过电穿孔用靶向载体(603)转染(602)。同源重组在～200Kb区域用来自靶向载体(603)的位点特异性重组位点替换内源性小鼠免疫球蛋白λ基因座，产生在(605)所示的基因组DNA构型。
在电穿孔之前，将载体DNA用稀有切割限制酶线性化，该稀有切割限制酶仅切割原核质粒序列或与其关联的多接头。将转染的细胞铺板，并且在～24小时之后，使用嘌呤霉素将其置于正药物选择下。也存在针对已经将载体整合到其DNA中但不是通过同源重组进行整合的细胞的负选择。非同源重组将导致DTA基因(659)的保留，DTA基因在表达时(823)将杀死细胞，而DTA基因因为位于与小鼠Igλ基因座的载体同源性区域之外而通过同源重组缺失。一周之后，在药物抗性ES细胞的集落变成裸眼可见之后，将它们从其板上物理提取。将这些挑选的群落分解，在微孔板中以有限稀释度重新铺板，并培养数天。此后，将每个细胞克隆分配为使得一些细胞被冷冻作为存档材料，并且其余的用于DNA的分离而用于分析目的。
使用已知的基因靶向测定，通过PCR筛选来自ES细胞克隆的DNA。对于这些测定，PCR寡核苷酸引物序列中的一种定位在靶向载体与基因组DNA之间共有同一性的区域之外，而另一种定位在载体中有基因组同一性的两个臂之间的新DNA中，例如puro基因(637)中。这些测定仅检测存在于源自在靶向载体(603)和内源性DNA(601)之间经历了同源重组的转染的细胞的细胞克隆中的DNA段。
选择来自转染的PCR阳性克隆进行扩增，随后使用DNA印迹测定进一步分析。DNA印迹包括三种探针和来自已经用多种限制酶消化的克隆的基因组DNA，所述种限制酶选择为使得探针和消化物的组合允许鉴定ES细胞DNA是否已经通过同源重组被适当修饰。
ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。显示畸变迹象的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆用于进一步使用。
将携带其免疫球蛋白λ链基因座的两个同源拷贝之一的缺失的ES细胞克隆用Cre重组酶表达载体和包括含有马科动物Vλ和Jλ区域基因区段编码序列的部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座的载体(607)再转染(604)。该载体(607)的关键特征如下：lox5171位点(631)；缺乏起始甲硫氨酸密码子但与lox5171位点(图605中的631)中不间断的开放阅读框同框并且相邻的新霉素抗性基因开放阅读框(647)；FRT位点(627)；27个功能性马科动物λ可变区基因区段的阵列，每个基因区段包括在3’侧的侧翼为小鼠RSS并嵌入小鼠λ非编码序列(651)中的马科动物λ编码序列；J-C单元的阵列，其中每个单元包括嵌入在小鼠λ基因座(655)的非编码序列中的马科动物Jλ基因区段和小鼠λ恒定结构域基因区段，包括Eλ2-4增强子元件(图1)。马科动物Jλ基因区段是那些编码Jλ1、Jλ5、Jλ6和Jλ7的基因区段(另一个Jλ基因区段是假基因)，而小鼠λ恒定结构域基因区段是Cλ1、Cλ2或Cλ3或其组合；用于Flp重组酶的突变的识别位点(643)；赋予潮霉素抗性的开放阅读框(657)，其位于相对于构建体中免疫球蛋白基因区段编码信息的反义链上；与lox5171位点相对方向相反的loxP位点(639)。
RCME将来自RCME载体(607)的部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座插入经修饰的内源性小鼠Igλ基因座，产生609所示的基因组DNA构型。
马科动物Vλ和Jλ基因编码区的序列显示在SEQ ID NO.87-122中。
将转染的克隆置于G418或潮霉素选择下，这富集了经历RMCE过程的细胞克隆，其中部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座整合到由基因靶向载体放置在那里的lox5171和loxP位点之间的缺失的内源性小鼠免疫球蛋白λ链基因座中。在体外或体内(见下文)，通过FLP介导的重组(606)去除来自靶向载体(603)的剩余元件，得到最终的部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座，如611所示。
611部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座的一个构型的更详细的视图显示在613，但仅作为示例提供。马科动物Vλ和Jλ基因区段和小鼠Cλ基因区段的其他排列和数量以及增强子元件的其他位置和数量也是可能的。
G418/潮霉素抗性ES细胞克隆通过PCR和DNA印迹分析，以确定它们是否已经经历预期的重组酶介导的盒式交换过程而没有不想要的重排或缺失。ES细胞的PCR阳性克隆和DNA印迹阳性克隆的核型使用被设计为区分小鼠ES细胞中出现的最常出现的染色体畸变的原位荧光杂交程序进行分析。显示畸变迹象的克隆被排除在进一步使用之外。选择基于DNA印迹数据被判断为具有预期的正确基因组结构的核型正常克隆用于进一步使用。
根据已知程序，将在小鼠免疫球蛋白λ链基因座中携带部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座(611)的ES细胞克隆显微注射到来自品系DBA/2的小鼠胚泡中，以产生部分ES细胞衍生的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高的ES细胞来源贡献水平的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。这里选择的雌性小鼠是C57B1/6NTac品系，其携带编码Flp重组酶的转基因，该转基因在其种系中表达，将使FRT侧翼的选择标记缺失。分析来自这些交配的后代的部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座的存在，以及在RMCE步骤中产生的侧翼为FRT的新霉素抗性基因和侧翼为mFRT的潮霉素抗性基因的缺失。携带部分马科动物免疫球蛋白λ链基因座的小鼠用于建立小鼠群体。
一方面，将部分马科动物免疫球蛋白重链基因座和部分马科动物免疫球蛋白κ轻链基因座纯合的小鼠(如实施例1和2所述)与携带部分马科动物免疫球蛋白λ轻链基因座的小鼠配种。由这种类型的配种方案产生的小鼠对于部分马科动物Igh基因座是纯合的，并且对于部分马科动物Igκ和Igλ基因座是纯合的。从这些小鼠中回收的单克隆抗体包括在某些情况下与马科动物κ可变结构域配对，并且在其他情况下与马科动物λ可变结构域配对的马科动物重链可变结构域。
表1.簇II中的Vλ基因区段以cDNA表达
Vλ基因命名1 Vλ基因命名2 相应的GenBank cDNA
Vλ21 IGLVxS64 KF985057.1
Vλ22 IGLV8S5 KF985111.1
Vλ23 IGLV8S6 KF748660
Vλ24 IGLV9S2 XM_0148359143
Vλ25 IGLV8S7 KF985059.1
Vλ26 IGLV8S8 KF985065.1
Vλ27 IGLV8S9 KF985065
1Sun等人，Dev.Comp.Immunol.34:1009(2010)的命名法。
2Walther等人，Dev.Comp.Immunol.53:303(2015)的命名法。
3这个cDNA来自家驴(E.asinus)，并且其他来自家马
序列信息
注意：(RC)代表反向互补物，表示与其他序列相比，这些序列处于相反的转录方向。
IGHV
SEQ ID NO.1：VH1 IGHV1-5＊01
L1：ATGGACTGGAGCTGGAGCATCCTCTTCTTGGTGGCAGTGGCTGCAG
L2：GTGTCTCCTCC
VH：
SEQ ID NO.2：VH2 IGHV4-11＊01
L1：ATGAATCACCTGTGGTTCTTCCTCTTTCTGGTGGCCGCTCCTGCAT
L2：GTGTCCTGTCC
VH：
SEQ ID NO.3：VH3 IGHV4-17＊02
L1：ATGAGACTCTTGTGTCTTCTCCTTTGCCTGGTGATGGCTCCCCAAG
L2：GAGTCCTGTCC
VH：
SEQ ID NO.4：VH4 IGHV4S1
L1：ATGAATCACCTGTGGTTCTTCCTCTTTCTGGTGGCCGCTCCTACAT
L2：GTGTCCTGTCC
VH：
SEQ ID NO.5：VH5 IGHV4-29＊02
L1：ATGAGTCACCTGTGGTTCTTCCTCTTTCTGGTGGCCGCTCCTACAT
L2：GTGTCCTGTCC
VH：
SEQ ID NO.6：VH6 IGHV1-41＊01
L1：ATGGACTGGAGCTGGAGCATCCTCTTCTTGGTGGCAGTGGCTGCAG
L2：GTGTCTCCTCC
VH：
SEQ ID NO.7：VH7 IGHV1-70＊01
L1：ATGGGCTGGAGCTGGAGAATCCTCTTCTTGGTGGCAGTAGCTTCAG
L2：GTGTCTCCTCC
VH：
SEQ ID NO.8：VH8 IGHV9-66＊01
L1：ATGGCCCCTCTCCTGGTCATCTTCTGCCTGCTGGCTGCTCTCCACG
L2：GTGTCGAGGCT
VH：
SEQ ID NO.9：VH9 IGHV4-65＊02
L1：ATGAGACTCTTGTGTCTTCTCCTTTTCCTGGTGACGGCTCCCCAAG
L2：GAGTCCTGTCC
VH：
SEQ ID NO.10：VH10 IGHV2-63＊01
L1：ATGGACACACTGTATCCCACCCTCCTGCTGCTGACCATCCCTTCCT
L2：GGGCTCTGTCC
VH：
/>
SEQ ID NO.11：VH11 IGHV4-59
L1：ATGAGGAGGCTGGGTCTTCTCCTTTTCCTGGTGACGGCTCCCCAAG
L2：GTGTCCTCTCC
VH：
SEQ ID NO.12：VH12 IGHV4-55
L1：ATGAGGCTGTTGGGTCTTCTCCTTTGTCTTGTGACGGCTTACCAGG
L2：GTGTCCTGTCC
VH：
IGHD
SEQ ID NO.13：DH1 IGHD3-1
SEQ ID NO.14：DH2 IGHD4-2
SEQ ID NO.115：DH3 IGHD2-3
SEQ ID NO.16：DH4 IGHD3-4
SEQ ID NO.17：DH5 IGHD4-5
SEQ ID NO.18：DH6 IGHD2-6
SEQ ID NO.19：DH7 IGHD3-7
SEQ ID NO.220：DH8 IGHD4-8
SEQ ID NO.221：DH9 IGHD2-9
SEQ ID NO.222：DH10 IGHD3-10
/>
SEQ ID NO.23：DH11 IGHD4-11
SEQ ID NO.224：DH12 IGHD2-12
SEQ ID NO.25：DH13 IGHD3-13
SEQ ID NO.26：DH14 IGHD4-14
SEQ ID NO.27：DH15 IGHD2-15
SEQ ID NO.28：DH16 IGHD3-16
SEQ ID NO.29：DH17 IGHD4-17
SEQ ID NO.30：DH18 IGHD2-18
SEQ ID NO.31：DH19 IGHD3-19
SEQ ID NO.32：DH20 IGHD4-20
SEQ ID NO.33：DH21 IGHD2-21
SEQ ID NO.34：DH22 IGHD3-22
SEQ ID NO.35：DH23 IGHD2-23
SEQ ID NO.36：DH24 IGHD2-24
SEQ ID NO.37：DH25 IGHD4-25
SEQ ID NO.38：DH26 IGHD2-26
SEQ ID NO.39：DH27 IGHD3-27
SEQ ID NO.40：DH28 IGHD4-28
SEQ ID NO.41：DH29 IGHD2-29
SEQ ID NO.42：DH30 IGHD3-30
SEQ ID NO.43：DH31 IGHD4-31
SEQ ID NO.44：DH32 IGHD1-32
SEQ ID NO.45：DH33 IGHD7-33
SEQ ID NO.46：DH34 IGHD6-34
SEQ ID NO.47：DH35 IGHD4-35
SEQ ID NO.48：DH36 IGHD2-36
SEQ ID NO.49：DH37 IGHD3-37
SEQ ID NO.50：DH38 IGHD4-38
SEQ ID NO.51：DH39 IGHD2-39
SEQ ID NO.52：DH40 IGHD3-40
SEQ ID NO.53：DH41 IGHD4-41
SEQ ID NO.54：DH42 IGHD1-42
SEQ ID NO.55：DH41 IGHD7-43
SEQ ID NO.56：DH41 IGHD6-44
IGHJSEQ ID NO.57：JH1 IGHJ1
SEQ ID NO.58：JH2 IGHJ2
SEQ ID NO.59：JH3 IGHJ3
/>
SEQ ID NO.60：JH4 IGHJ4
SEQ ID NO.61：JJH5 IGHJ5
SEQ ID NO.62：JH6 IGHJ6
SEQ ID NO.63：JH7 IGHJ6-2
SEQ ID NO.64：JH8 IGHJ6-3＊
SEQ ID NO.65：JH9 IGHJ6-4＊
*JH8和JH9是不同的基因区段，但具有相同的序列。
IGKV
SEQ ID NO.66：IGKV2-48＊01
L1：ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTCCTGGGGTTGCTAATACTCTGGGTCCCAG
L2：GATCCACTGGG
VK：
SEQ ID NO.67：IGKV2-46＊01
L1：ATGAAATTCGCTAGTCAGCTCCTGGGGCTACTGATGCTCTGGATCCCAG
L2：GATCCAGTGCG
VK：
SEQ ID NO.68：IGKV2-45＊01
L1：ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTGATGCTCTGGATCACAG
L2：GATCCAGTGGG
VK：
SEQ ID NO.69：IGKV5-43＊01
L1：ATGGGCTCCCAGGCTCAGCTCCTCAGCTTCCTGCTCCTCTGGATTTTTG
L2：ATACCAGGGCA
VK：
SEQ ID NO.70：IGKV2-39＊01
L1：ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTGATGCTCTGGATCCCAG
L2：GATCCAGTGGG
VK：
SEQ ID NO.71：IGKV1-36＊01
L1：ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTCAGCCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAG
L2：GTGCCAGGTGT
VK：
SEQ ID NO.72：IGKV2-33＊01
L1：ATGAAATTCCTTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGATCCCAG
L2：GATCCAGTGGA
VK：
SEQ ID NO.73：IGKV2-28＊01
L1：ATGAGGTTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTACTAATGCTCTGGATCCCAG
L2：GATCCAGTGGA
VK：
SEQ ID NO.74：IGKV4-18＊01(RC)
L1：ATGATGTCACTGACAAAGGTGTTTATGTCTTTGTTGCTCTGGGTCTCAA
L2：CTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.75：IGKV4-12＊01(RC)
L1：ATGATGTGGGAGACACAGGTCCTTATGTCCTTATTGCTCGGGGTCTCAG
L2：GTACCTTGGGG
VK：
SEQ ID NO.76：IGKV4-9-1＊01(RC)
L1：ATGATGTCACAGACACAGGTCCTCTTGTCGGTGTTTCTCTGGGTCTCAG
L2：GTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.77：IGKV4-9＊01(RC)
L1：ATGATGTCACAGACACAGGTCCTCTTGTCGGTGTTTCTCTGGGTCTCAG
L2：GTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.78：IGKV4-8＊01(RC)
L1：ATGATGTTGCAGACACAGGTCCTTATAACCTTGTTGCTCTGGGTCTCAG
L2：GTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.79：IGKV4-5-1＊01(RC)
L1：ATGATGTCGCTGACAAAGGTCCTTATATCTGTGTTGCTCTGGGTCTCAG
L2：GTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.80：IGKV5-5＊01(RC)
L1：ATGATGTCATGGACTCAGATCCTTATGTCCTTGTTGCTCTGGGTCTCAG
L2：GTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.81：IGKV4-2＊01(RC)
L1：ATGATGTCGCTGACACAGTTCCTTATATCTGTGTTGCTCTGGGTCTCAG
L2：GTGCCTGTGGG
VK：
SEQ ID NO.82：IGKV4-1＊01(RC)
L1：ATGCTGACGCAGACGCAGGTCCTTATATCTGTGTTGCTCTGGGTCTCAG
L2：GAGCCTGTGGG
VK：
IGKJ
SEQ ID NO.83：IGKJ1＊01
SEQ ID NO.84：IGKJ2＊01
SEQ ID NO.85：IIGKJ3＊01
SEQ ID NO.86：IIGK4＊01
注意：马λ基因座的序列仍然不完整。下面的序列不一定描述完整的马科动物IGLV和IGLJ谱库。
IGLV
SEQ ID NO.87：IGLV28(RC)
L1：ATGGCCTGGTCCCCGCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.88：IGLV27
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.89：IGLV26
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.90：IGLV25
L1：ATGGCCTGGTGCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.91：IGLV24
L1：ATGTCCTGTACTCCTCTCCTCCTCGTGCTCCTCTCTCACTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.92：IGLV23
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.93：IGLV22
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.94：IGLV21
L1：ATGGCCTGGACAGTGCTTCTTCTCTGGCTCCTCACTTACAGCTCAG
VL：
SEQID NO.95：IGLV20(RC)
L1：ATGGCCTGGATGGTGCTTCTTCTCGGGCTCCTTTCTTACAGCTCAG
VL：
SEQID NO.96：IGLV19(RC)
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
IGLJ
注意：IGVL基因区段同时存在于马科动物IGLJ基因区段和IGLJ基因(未显示)的上游和下游。
SEQID NO.97：IGLJ7
J7：TGCGATGGTCAGGTGGGTGCCTCCGCCGAATGCACCA
SEQID NO.98：IGLJ6
J6：TGCGATGGTCAGGTGGGTGCCTCCGCCGAATGCACCA
SEQID NO.99：IGLJ5
J5：TGCGATGGTCAGGTGGGTGCCTCCGCCGAATGCACCA
SEQID NO.100：IGLJ4
J4：GCGATGGGTCAGGTGGGTGCCTCCGCCGAATACAGCACA
SEQID NO.101：IGLJ3
J3：AGGACTATCAGCTGGGTCCCTCAGCTGAGCACAGGA
SEQID NO.102：IGLJ2
J2：CTAGGACGGTCAGATGGGTACCTCCAGTGAACTATGAA
SEQID NO.103：IGLJ1
J1：CTAGGACGGTCAGATGGGTACCTCCAGTGAACTATGAA
SEQ ID NO.104：IGLV2(RC)
L1：ATGGCCTGGACCCCTCTCCTGCTCCTCCTCCTCACTCTCTGCACAG(RC)
VL：
SEQ ID NO.105：IGLV3(RC)
L1：ATGGCCTGGACCCTTCTCCTGCTTCCCCTCCTCACTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.106：IGLV4(RC)
L1：ATGGCCTGGACCCCTCTCTTGTTTGCCTTCCTCACTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.1107：IGLV5(RC)
L1：CTGTGCAGAGAGTGAGGAAGGCTAACAAGAGAGGGGTCCAGGCCAT
VL：
SEQ ID NO.108：IGLV6(RC)
L1：1ATGGCCTGGACCCCTCTCTTGTTAGCCTTCCTCACTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.109：IGLV7(RC)
L1：ATGGCCTGGACCCCTCTCTTGTTAGCCTTCCTCTCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.110：IGLV8(RC)
L1：ATGGCCTGGACACTTCTCCTTCTCCCTCTCCTCACTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.111：IGLV9(RC)
L1：ATGGCCTGGACCCCTCTCCTGCTCCCTCTCCTCACTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.112：IGLV10(RC)
L1：ATGGCCTGGGCTCTGTTCCTCATCACCCTCCTCACTCAGGGCACAG
VL：
SEQ ID NO.113：IGLV11(RC)
L1：ATGGCCTGGACTCTGCTCCTTCTCACCCTCCTCACTCAGGGTACAG
VL：
SEQ ID NO.114：IGLV12(RC)
L1：ATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCATCAGCCTCTTCACTCAGGGCACAG
VL：
SEQ ID NO.115：IGLV13(RC)
L1ATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCATCACCCTCCTCACTCAGGGCACAG
VL：
SEQ ID NO.116：IGLV14(RC)
L1：ATGGCCTGGGTGCCACTCCTGCTCACACTTCTGGCTCACTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.117：IGLV15(RC)
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.118：IGLV16(RC)
L1：ATGGCCTGGACTCCTCTCATCCTCATGCTCCTGTCTCACTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.119：IGLV17(RC)
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
VL：
SEQ ID NO.120：IGLV18(RC)
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
L2：
SEQ ID NO.121：IGLV19(RC)
L1：ATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCCTCACCCTCATCGCTCTCTGCACAG
LV：
SEQ ID NO.122：IGLV20(RC)
L1：ATGGCCTGGATGGTGCTTCTTCTCGGGCTCCTTTCTTACAGCTCAG
VL：
pre-DJ
这是Ighd-5 DH基因上游的21609bp的片段。Pre-DJ序列可以见于：小家鼠(Musmusculus)品系C57BL/6J，12号染色体，组装：GRCm38.p4，注释版本106，序列ID：NC_000078.6整个序列位于如下所示的两个100bp序列之间：
Ighd-5 DH基因区段上游，对应于NC_000078.6中的位置113526905-113527004：
Adam6a基因上游2Kb，对应于NC_000078.6中的位置113548415-113548514：
Adam6a
Adam6a(解整合素和金属肽酶结构域6A)是与雄性生育力有关的基因。Adam6a序列可以见于：小家鼠品系C57BL/6J，12号染色体，组装：GRCm38.p4，注释版本106，序列ID：NC_000078.6，位置为113543908-113546414。
Adam6a序列ID:OTTMUSG00000051592(VEGA)。

Claims (37)

1.一种转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物的基因组中内源性啮齿动物免疫球蛋白可变基因座被缺失并被部分马科动物免疫球蛋白基因座替换，所述部分马科动物免疫球蛋白基因座包含马科动物免疫球蛋白可变基因编码序列和基于所述内源性啮齿动物免疫球蛋白可变基因座的非编码调控序列，其中所述转基因啮齿动物的所述部分马科动物免疫球蛋白基因座是功能性的并表达包含马科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的免疫球蛋白链。
2.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述部分马科动物免疫球蛋白基因座包含马科动物VH、DH和JH编码序列。
3.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述部分马科动物免疫球蛋白基因座包含马科动物κVL和JL编码序列、马科动物λVL和JL编码序列，或其组合。
4.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述部分马科动物免疫球蛋白基因座包含马科动物VH、DH和JH、马科动物κVL和JL编码序列、马科动物λVL和JL编码序列，或其组合。
5.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述啮齿动物是小鼠。
6.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述非编码调控序列包括在个体V基因区段之前的启动子、剪接位点和用于V(D)J重组的重组信号序列。
7.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述部分马科动物免疫球蛋白基因座还包含ADAM6基因。
8.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述部分马科动物免疫球蛋白基因座还包含Pax-5激活的基因间重复(PAIR)元件。
9.根据权利要求1所述的转基因啮齿动物，其中所述部分马科动物免疫球蛋白基因座还包含来自重链基因间控制区1的CTCF结合位点。
10.一种B淋巴细胞谱系的细胞，来自根据权利要求1至9中任一项所述的转基因啮齿动物。
11.一种杂交瘤细胞，衍生自权利要求10所述的B淋巴细胞谱系的细胞。
12.一种永生化细胞，衍生自权利要求10所述的B淋巴细胞谱系的细胞。
13.一种部分或完整免疫球蛋白分子，包含马科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域，源自权利要求10所述的B淋巴细胞谱系的细胞、权利要求11所述的杂交瘤或权利要求12所述的永生化细胞。
14.一种用于产生权利要求1所述的转基因啮齿动物的方法，所述方法包括：
a)在啮齿动物细胞的基因组中整合位于内源性免疫球蛋白可变基因座上游的至少一个位点特异性重组酶靶位点和位于所述内源性免疫球蛋白可变基因座下游的至少一个位点特异性重组酶靶位点，其中所述内源性免疫球蛋白可变基因座包括(i)VH、DH和JH基因区段，(ii)Vκ和Jκ基因区段，(iii)Vλ和Jλ基因区段；或(iv)Vλ和Jλ基因区段和Cλ基因；
b)提供包含部分马科动物免疫球蛋白基因座的载体，所述部分马科动物免疫球蛋白基因座包含部分马科动物免疫球蛋白可变区基因区段，其中所述部分马科动物免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个包含马科动物免疫球蛋白可变区基因编码序列和啮齿动物非编码调控序列，并且所述部分马科动物免疫球蛋白可变区基因座的侧翼是用于位点特异性重组酶的靶位点，其中所述靶位点能够与步骤a)中引入所述啮齿动物细胞的靶位点重组；
c)将步骤b)中的所述载体和能够识别所述靶位点的位点特异性重组酶引入所述细胞；
d)允许在所述细胞的基因组和所述部分马科动物免疫球蛋白基因座之间发生重组事件，导致用所述部分马科动物免疫球蛋白基因座替换所述内源性免疫球蛋白可变基因座；
e)选择在步骤d)中产生的包含所述部分马科动物免疫球蛋白可变基因座的细胞；和
f)利用所述细胞产生包含所述部分马科动物免疫球蛋白可变基因座的转基因啮齿动物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞是啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
17.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括在所述引入步骤之后和所述提供步骤之前，通过引入识别第一组靶位点的重组酶来缺失所述内源性免疫球蛋白可变基因座的步骤，其中所述缺失步骤在所述啮齿动物细胞的基因组中留下至少两个不能彼此重组的靶位点。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体包含马科动物VH、DH和JH编码序列。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体包含VL和JL编码序列，所述VL和JL编码序列是κ或λ。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体还包含内源性宿主来源的V基因启动子、剪接位点和重组信号序列。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体还包含ADAM6基因。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体还包含Pax-5激活的基因间重复元件。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体还包含来自重链基因间控制区1的CTCF结合位点。
24.一种产生治疗性或诊断性用途的抗体的方法，所述方法包括：
(i)表达具有从转基因啮齿动物的抗体产生细胞克隆的马科动物可变结构域的抗体，所述转基因啮齿动物的基因组包含的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被免疫球蛋白基因座可变区替换，所述免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、D和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包含马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列和啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列；和
(ii)分离具有所述马科动物可变结构域的抗体，其中所述抗体适于治疗或诊断用途。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体是从所述转基因啮齿动物的B细胞中克隆的。
26.一种治疗性或诊断性抗体，由权利要求24所述的方法产生。
27.一种产生具有马科动物可变结构域的治疗性或诊断性抗体的方法，所述方法包括：
(i)克隆由转基因啮齿动物的抗体产生细胞表达的抗体的马科动物可变结构域，所述转基因啮齿动物的基因组包含的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被免疫球蛋白基因座可变区替换，所述免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、DH和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包含马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列和啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列；和
(ii)产生包含由所述转基因啮齿动物表达的抗体的所述马科动物可变结构域的治疗性或诊断性抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述马科动物可变结构域是从由来自所述转基因啮齿动物的B细胞表达的抗体克隆的。
29.一种治疗性或诊断性抗体，由权利要求27所述的方法产生。
30.一种产生包含马科动物可变结构域的单克隆抗体的方法，所述方法包括：
(i)提供来自转基因啮齿动物的B细胞，所述转基因啮齿动物的基因组包含的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被免疫球蛋白基因座可变区替换，所述免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、DH和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包含嵌入啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列中的马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列；
(ii)使所述B细胞永生化；和
(iii)分离包含由永生化B细胞表达的马科动物可变结构域的单克隆抗体，或编码所述抗体的基因。
31.根据权利要求30所述的方法，所述方法还包括：
(iv)克隆由所述B细胞表达的马科动物可变结构域；和
(v)产生包含从所述转基因啮齿动物的B细胞克隆的所述马科动物可变结构域的治疗性或诊断性抗体。
32.一种产生包含马科动物可变结构域的抗体的方法，所述方法包括提供转基因啮齿动物，所述转基因啮齿动物的基因组包含的内源性啮齿动物免疫球蛋白基因座可变区已被缺失并被免疫球蛋白基因座可变区替换，所述免疫球蛋白基因座可变区在免疫球蛋白重链基因座包含嵌合VH、DH和JH免疫球蛋白可变区基因区段中的每一个的至少一个，和/或在免疫球蛋白轻链基因座包含嵌合VL和JL可变基因区段中的每一个的至少一个，其中每个嵌合基因区段包含嵌入啮齿动物免疫球蛋白可变区非编码基因区段序列中的马科动物V、D或J免疫球蛋白可变区编码序列，其中所述转基因啮齿动物的免疫球蛋白基因座表达包含马科动物可变结构域的抗体。
33.根据权利要求32所述的方法，所述方法还包括分离包含由所述转基因啮齿动物表达的马科动物可变区的抗体，或编码所述抗体的基因。
34.根据权利要求32所述的方法，所述方法还包括：
(i)从表达针对所述靶抗原的特异性抗体的所述转基因啮齿动物获得B细胞；
(ii)使所述B细胞永生化；和
(iii)从永生化B细胞中分离针对所述靶抗原的特异性抗体。
35.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括从对特定抗原特异性的B细胞克隆马科动物可变区。
36.根据权利要求35的方法，所述方法还包括使用从所述B细胞克隆的所述马科动物可变区产生治疗性或诊断性抗体。
37.一种治疗性或诊断性抗体，由权利要求32所述的方法产生。
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