KR20210133234A - 인간화 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물 - Google Patents
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Abstract
인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포가 제공된다.
Description
우선권 주장
본 출원은 2019년 2월 18일에 출원된 PCT/CN2019/075406 및 2019년 9월 18일에 출원된 PCT/CN2019/106320의 우선권을 주장한다. 상기 출원들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포에 관한 것이다.
치료용 항체는 소분자 약물의 성장을 급속히 능가하고 있는 가장 빠르게 성장하는 부류의 치료용 화합물 중 하나이다. 이러한 치료용 항체들은 일반적으로 인간 또는 인간화 항체이다. 인간 또는 인간화 항체는 설치류 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 인간화에 의해 또는 파지 라이브러리를 이용함으로써 생성될 수 있다. 이러한 방법들에 의해 생성된 항체는 흔히 최적이 아닌 결합 친화도 및 생물물리학적 속성을 가져 제조의 어려움 및 불량한 약동학으로 이어진다. 특히, 인간화 과정은 결합 친화도에 불리하게 영향을 미치고, 항체에 면역원성 에피토프를 도입할 수 있으며, 파지 라이브러리를 이용하여 발견된 항체는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 제한된 다양성 및 비-네이티브 쌍형성을 나타낸다. 성질을 개선하기 위해서는 흔히 반복적이고 시간-소모적인 실험이 필요하다. 그리고, 일부 경우에, 이러한 항체들은 또한 환자에서 면역원성이기 때문에 시간 경과에 따라 이들의 효능이 약화될 수 있다.
완전 인간 항체를 생성하기 위한 한 가지 가능한 접근법은 인간 항체 레퍼토리를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 동물을 사용하는 것이다. 여러 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스와 같은 트랜스제닉 동물의 세대는 다양한 연구 및 개발 응용에서, 예를 들어, 다양한 생물학적 시스템으로의 약물 발견 및 기초 연구에서 그러한 트랜스제닉 동물의 사용을 가능하게 하였다. 다수의 초기 세대 트랜스제닉 동물은 불완전한 인간 항체 레퍼토리를 갖고, 덜 효율적인 V(D)J 재조합로 인해 항체 생산이 정상 속도보다 낮고, 면역원성 에피토프를 도입할 수 있는 내인성 항체 레퍼토리를 갖고, 다양한 다른 문제들을 갖는다. 인간 항체를 생산하는 효율적이고 비용-효과적인 방법에 대한 필요성, 및 항원에 반응하여 인간화 항체를 생성하는 능력을 갖는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물에 대한 필요성이 존재한다.
본 개시는 인간화 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 개시는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌, 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 인간 IGHV 유전자, 인간 IGHD 유전자, 및 인간 IGHJ 유전자는 작동 가능하게 연결되고, VDJ 재배열을 겪을 수 있다.
일부 구현예에서, 동물은 표 1로부터 선택된 약 또는 적어도 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자, 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3으로부터 선택된 약 또는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGHV2-10, IGHV3-9, 및 IGHV1-8을 제외한 표 1에서의 모든 인간 IGHV 유전자, 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGHV5-10-1 및 IGHV3-64D를 제외한 표 1에서의 모든 인간 IGHV 유전자, 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 대상체의 인간 14번 염색체의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 세포(예를 들어, 체세포, 배양 세포, 비-면역 세포, 임의의 V(D)J 재배열이 없는 세포)의 인간 14번 염색체의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 4에서의 하나 이상의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 하나 이상의 마우스 IGHD 유전자, 및/또는 표 6에서의 하나 이상의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGHV1-85 유전자에서 시작하여 마우스 IGHJ4 유전자까지 연속 서열의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 하나 이상의 내인성 IGHM, IGHδ, IGHG3, IGHG1, IGHG2b, IGHG2a, IGHE, 및 IGHA 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 또는 1000 kb이다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV1-2까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV6-1까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHD1-1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성이다. 일부 구현예에서, 동물은 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성이다.
일부 구현예에서, 동물은 추가로 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 설치류(예를 들어, 마우스)이다.
일부 양태에서, 본 개시는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGHV 유전자를 포함하는 제1 서열; 내인성 서열을 포함하는 제2 서열; 및 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 제3 서열을 포함하고, 제1 서열, 제2 서열, 및 제3 서열이 작동 가능하게 연결된, 유전적으로-변형된 동물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 제1 서열은 표 1로부터 선택된 약 또는 적어도 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열이다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 또는 1000 kb이다.
일부 구현예에서, 제2 서열은 약 또는 적어도 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 또는 20 kb인 내인성 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 서열은 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 표 3으로부터 선택된 약 또는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제3 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열이다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb 또는 100 kb이다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 4에서의 하나 이상의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 하나 이상의 마우스 IGHD 유전자, 및 표 6에서의 하나 이상의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGHV1-85 유전자에서 시작하여 마우스 IGHJ4까지 서열의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGHM, IGHδ, IGHG3, IGHG1, IGHG2b, IGHG2a, IGHE, 및 IGHA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성이다. 일부 구현예에서, 동물은 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성이다.
일부 구현예에서, 동물은 추가로 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 설치류(예를 들어, 마우스)이다.
일부 양태에서, 본 개시는 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 동물은 표 7에서 약 또는 적어도 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 또는 76개의 인간 IGKV 유전자를 포함하고/포함하거나, 표 8에서 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 IGKJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 IGKV3D-7에서 시작하여 인간 IGKJ5까지 인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 9에서의 하나 이상의 마우스 IGKV 유전자 및 표 10에서의 하나 이상의 마우스 IGKJ 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 대상체의 인간 2번 염색체의 내인성 카파쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGKV 유전자, 및 모든 인간 IGKJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 세포(예를 들어, 체세포, 배양 세포, 비-면역 세포, 임의의 V(D)J 재배열이 없는 세포)의 인간 2번 염색체의 내인성 카파쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGKV 유전자, 및 모든 인간 IGKJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGKV2-137에서 시작하여 마우스 IGKJ5까지 서열의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 내인성 IGKC를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 경쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성이다. 일부 구현예에서, 동물은 경쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성이다.
일부 구현예에서, 동물은 추가로 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 설치류(예를 들어, 마우스)이다.
일부 양태에서, 본 개시는 게놈이 하나 이상의 내인성 IGHV, 내인성 IGHD, 및 내인성 IGHJ 유전자의 하나 이상의 인간 IGHV, 인간 IGHD, 및 인간 IGHJ 유전자로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 인간 IGHV, 인간 IGHD, 및 인간 IGHJ 유전자는 IGHM, IGHδ, IGHG, IGHE, 및 IGHA 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 유전자 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 내인성 IGHV, 내인성 IGHD, 및 내인성 IGHJ 유전자는 표 1에서 약 또는 적어도 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자, 표 2에서 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서 약 또는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자로 대체된다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 표 4에서 약 또는 적어도 180개의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 모든 마우스 IGHD 유전자, 및 표 6에서의 모든 마우스 IGHJ 유전자가 대체된다.
일부 양태에서, 본 개시는 게놈이 하나 이상의 내인성 IGKV 및 내인성 IGKJ 유전자의 하나 이상의 인간 IGKV 및 인간 IGKJ 유전자로의 대체를 포함하는 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 인간 IGKV 및 인간 IGKJ 유전자는 내인성 IGKC 유전자에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 내인성 IGKV 및 내인성 IGKJ 유전자는 표 7에서 약 또는 적어도 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 또는 76개의 인간 IGKV 유전자, 및 표 8에서 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 IGKJ 유전자로 대체된다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 표 9에서의 모든 마우스 IGKV 유전자 및 표 10에서의 모든 마우스 IGKJ 유전자가 대체된다.
일부 구현예에서, 동물은 내인성 중쇄 가변 도메인(예를 들어, 마우스 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하는 핵산 서열을 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌가 결여된다.
일부 구현예에서, 동물은 내인성 경쇄 가변 도메인(예를 들어, 마우스 경쇄 가변 도메인)을 인코딩하는 핵산 서열을 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌가 결여된다.
일부 구현예에서, 동물은 인간화 항체를 생산할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 동물로부터 얻어진 세포에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자의 재배열로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 발현하는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 비-인간 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 인간 IGKV 유전자 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자의 재배열로부터 유래된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 키메라 면역글로불린 경쇄를 발현하는 B 세포이고, 여기서 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다.
일부 양태에서, 본 개시는 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항체를 제조하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 동물을 항원에 노출시키는 단계; 동물에서 수집된 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계; 및 하이브리도마에 의해 생성된 키메라 항체를 수집하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 관심 대상의 세포는 단리되고, 재배열된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정하기 위해 서열화가 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하이브리도마의 게놈을 서열화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 세포의 게놈을 변형시키는 방법으로서, 인간 염색체를 변형시키는 단계; 변형된 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및 변형된 인간 염색체와 내인성 염색체 간의 재조합을 유도하고, 이에 의해 하나 이상의 내인성 유전자를 하나 이상의 인간 유전자로 대체하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 변형된 인간 염색체는 둘 이상의 외인성 재조합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 염색체는 둘 이상의 외인성 재조합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 표 1로부터 선택된 약 또는 적어도 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자, 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3으로부터 선택된 약 또는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자가 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합된다.
일부 구현예에서, 표 7에서 약 또는 적어도 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 또는 76개의 인간 IGKV 유전자, 및 표 8에서 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 IGKJ 유전자가 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합된다.
일부 구현예에서, 인간 서열은 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합되고, 인간 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 또는 1000 kb이다.
일 양태에서, 본 개시는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 세포는 본원에 기재된 바와 같은 동물을 항원에 노출시키는 단계; 인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과, 그리고 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결하는 단계; 및 세포에서 핵산을 발현하고, 이에 의해 항체를 얻는 단계에 의해 얻어진다.
일 양태에서, 본 개시는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 결합 도메인을 인코딩하는 핵산을 얻는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및 항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 서열화하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 샘플을 얻는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및 동물로부터 샘플을 수집하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 샘플은 비장 조직, 비장 세포, 또는 B 세포이다.
일 양태에서, 본 개시는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 동물을 항원에 노출시키는 단계; 항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산의 서열을 얻는(예를 들어, 서열화에 의해) 단계; 및 세포에서 인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과, 그리고 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한 비-인간 포유동물의 자손에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 비-인간 포유동물은 설치류이다. 일부 구현예에서, 비-인간 포유동물은 마우스이다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 비-인간 포유동물 또는 이의 자손으로부터 유래된 세포(예를 들어, 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 면역 세포, B 세포, T 세포, 또는 하이브리도마) 또는 세포주, 또는 이의 일차 세포 배양물에 관한 것이다. 본 개시는 추가로 비-인간 포유동물 또는 이의 자손으로부터 유래된 조직, 기관 또는 이의 배양물에 관한 것이다.
본 개시는 추가로 면역화 과정과 관련된 산물의 발달에서 본원에 기재된 바와 같은 방법을 통해 생산된 비-인간 포유동물 또는 이의 자손, 동물 모델의 용도, 인간 항체의 제조, 또는 약리학, 면역학, 미생물학 및 의학에서 연구용 모델 시스템에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서의 사용을 위해 본원에 기재되며; 당분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려고 의도된 것이 아니다. 본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충되는 경우에는 정의를 포함하는 본 명세서가 우선될 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 인간 면역글로불린 유전자를 마우스 게놈에 도입하는 방법의 흐름도이다.
도 1b는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역으로 대체한 것의 개요이다.
도 1c는 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로 대체한 것의 개요이다.
도 2는 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 3a는 두 개의 재조합 부위가 게놈에 도입된 후 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 3b는 표적화 벡터로의 재조합 후 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 4는 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 변형시키기 위한 표적화 전략을 나타낸 것이다.
도 5a는 mIgHV-5'loxP-L-GT-F/mIGHV-005-L-GT-R2 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 mIGHV-005-5'loxP-R-GT-F2/mIgHV-5'loxP-R-GT-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 mIGHV-3'lox-L-GT-F2/mIGHV-3'lox-L-GT-R2 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 mIGHV3'lox-R-GT-F2/mIGHV-3'lox-R-GT-R1 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 강조하는 인간 14번 염색체의 개략도이다(축척에 따라 도시되지 않음). 중쇄 면역글로불린 유전자좌는 가변 영역(VH, DH, JH) 및 불변 영역(CH)을 갖는다. VH는 IGHV 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, DH는 IGHD 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, JH는 IGHJ 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, CH는 불변 도메인을 발현하는 유전자 클러스터를 나타낸다.
도 8은 변형 후 인간 14번 염색체를 보여주는 개략도이다.
도 9는 두 개의 벡터로 인간 14번 염색체에서의 변형을 나타낸 것이다.
도 10은 변형된 인간 14번 염색체를 나타낸 것이다.
도 11은 hIGHV-5'loxP-L-GT-F1 및 hIGHV-5'loxP-R-GT-R 프라이머 쌍을 사용한 염색체 hChr14-mut3 상의 loxP 부위 301에 대한 PCR 검정의 결과를 나타낸 것이다. 8-D7은 양성 대조 클론이다.
도 12는 염색체 hChr14-mut3 상의 loxP 부위 302에 대한 PCR 검정의 결과를 나타낸 것이다. 8-D7은 음성 대조 클론이다.
도 13은 인간 14번 염색체가 변형되기 전 세포의 형광 동소 혼성화(fluorescence in situ hybridization; FISH) 이미지이다.
도 14는 인간 14번 염색체가 변형된 후 세포의 FISH 이미지이다.
도 15는 변형된 12번 마우스 염색체를 보여주는 개략도이다.
도 16은 마우스 중쇄 가변 영역 유전자좌를 상응하는 인간 게놈 DNA 서열로 대체한 Cre 매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 17은 M5-L 프라이머 쌍 및 M5-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 M3 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 H5-L 프라이머 쌍 및 H5-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 H3-L 프라이머 쌍 및 H3-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 FISH 이미지이다. 흰색 화살표 (1) 및 (2)는 마우스 12번 염색체를 나타낸다. 흰색 화살표 (3)는 인간-특이적 IGH Breakapart 프로브에 의해 표지된 인간 염색체 단편을 나타낸다.
도 22는 Flp-매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 23은 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 24a는 두 개의 재조합 부위가 게놈에 도입된 후 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 24b는 표적화 벡터로의 재조합 후 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 25는 마우스 6번 염색체에 대한 유전자 표적화 전략을 보여주는 개략도이다.
도 26은 IGKV-005-C-5G-L-GT-F/IGKV-005-C-5G-L-GT-R2 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 IGKV-005-C-5G-R-GT-F1/IGKV-005-C-5G-R-GT-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 강조하는 인간 2번 염색체의 개략도이다(축척에 따라 도시되지 않음). VHK는 IGKV 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, JHK는 IGKJ 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, CHK는 IGKC 유전자를 나타낸다.
도 29는 변형된 인간 2번 염색체를 보여주는 개략도이다.
도 30은 인간 2번 염색체에 대한 유전자 표적화 전략을 보여주는 개략도이다.
도 31은 제1 재조합(벡터(2702) 도입) 후 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다. WT는 야생형 H9 세포이다.
도 32는 FISH 이미지 결과이다. 흰색 화살표는 올바른 재조합을 갖는 변형된 인간 2번 염색체를 나타낸다.
도 33은 제2 재조합(벡터(2701) 도입) 후 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 인간 경쇄 가변 영역 게놈 DNA 서열이 상응하는 마우스 유전자좌에 첨가된 Cre 매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 35는 형광 동소 혼성화(FISH) 이미지이다. 화살표 (1) 및 (3)은 마우스 6번 염색체를 나타낸다. 화살표 (2)는 인간-특이적 IGK Breakapart 프로브에 의해 표지된 인간 염색체 단편을 나타낸다.
도 36은 Flp-매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 37은 14번 염색체(14q32.33) 상의 인간 면역글로불린 중쇄(IGH) 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 38a 및 도 38b는 12번 염색체(12F2) 상의 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus))(계통 C57BL/6) IGH 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 39는 2번 염색체(2p11.2) 상의 인간 면역글로불린 카파쇄(IGK) 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 40a 및 도 40b는 6번 염색체(6C1) 상의 마우스(무스 무스쿨루스) IGK 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 41은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌(IGH)에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 42는 마우스 IGH에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 43은 인간 카파쇄 면역글로불린 유전자좌(IGK)에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 44는 마우스 IGK에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 45는 말초 혈액에서 검출된 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다.
도 46은 비장 세포에서 검출된 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다.
도 47은 림프절에서 검출된 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다.
도 48은 상이한 발달기에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 49는 상이한 발달기에서 림프절 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 50은 비장 가장자리 구역(MZ-B) 및 여포 구역(FO-B)에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 51a는 야생형 마우스로부터 얻어진 골수의 상이한 발달기에서 B 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 영역 1은 프로-B-세포를 나타내고, 영역 2는 프리-B-세포를 나타내고, 영역 3은 미성숙 B-세포를 나타낸다.
도 51b는 인간화 중쇄 이형접합 마우스로부터 얻어진 골수의 상이한 발달기에서 B 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 영역 1은 프로-B-세포를 나타내고, 영역 2는 프리-B-세포를 나타내고, 영역 3은 미성숙 B-세포를 나타낸다.
도 51c는 인간화 중쇄 동형접합 마우스로부터 얻어진 골수의 상이한 발달기에서 B 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 영역 1은 프로-B-세포를 나타내고, 영역 2는 프리-B-세포를 나타내고, 영역 3은 미성숙 B-세포를 나타낸다.
도 52는 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgA 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 53은 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG1 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 54는 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG2b 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 55는 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG2c 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 56은 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG3 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 57은 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgM 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 58은 개별 마우스 중에서 VJ 재조합 후 검출된 IGKV 유전자 발현의 분포를 나타낸 것이다.
도 59는 인간 BTLA에 의해 면역화된 후 야생형 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 60은 인간 BTLA에 의해 면역화된 후 인간화 중쇄 동형접합 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 61은 개과 PD-1(dPD-1)에 의해 면역화된 후 야생형 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 62는 개과 PD-1(dPD-1)에 의해 면역화된 후 인간화 중쇄 동형접합 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 63은 오브알부민(OVA)에 의해 면역화된 후 야생형 마우스(검은색 막대; 마우스는 1 내지 5로 표시됨) 및 인간화 중쇄 동형접합 마우스(회색 막대; 마우스는 6 내지 10으로 표시됨)의 ELISA 결과의 요약을 나타낸 것이다.
도 64는 인간 원위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자의 목록 및 인간 근위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자의 목록을 나타낸 것이다.
도 65a는 나이브 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 체중을 나타낸 것이다.
도 65b는 나이브 야생형 마우스 및 hVH/hVL의 비장 중량을 나타낸 것이다.
도 66은 나이브 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 비장에서 면역 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 67a는 비장 B 세포에서 전이형 1(T1, B220+IgM+IgD-), 전이형 2(T2, B220+IgM+IgD+) 및 성숙(M, B220+IgMlowIgD+) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 67b는 비장 B 세포에서 가장자리 구역(MZ) 및 여포성(FO) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 68a는 골수 B 세포에서 프로-B-세포(B220lowCD43highIgMlow), 프리-B-세포(B220lowCD43intIgMlow) 및 미성숙-B-세포(B220highCD43lowIgMhigh) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 68b는 골수 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 68c는 비장 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 69는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스에서 혈청 면역글로불린(Ig) 아형의 농도를 나타낸 것이다. Ig 아형 농도는 ELISA에 의해 정량적으로 측정되었다.
도 70a는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHV 사용(빈도 > 1%)을 나타낸 것이다.
도 70b는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHV 사용(빈도 < 1%)을 나타낸 것이다.
도 70c는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHD 사용을 나타낸 것이다.
도 70d는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHJ 사용을 나타낸 것이다.
도 71a는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGKV 사용(빈도 > 1%)을 나타낸 것이다.
도 71b는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGKV 사용(빈도 < 1%)을 나타낸 것이다.
도 71c는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGKJ 사용을 나타낸 것이다.
도 72는 나이브 hVH/hVL 마우스로부터 중쇄 CDR3 아미노산 길이 분포를 보여주는 히스토그램이다.
도 73은 나이브 hVH/hVL 마우스에서 중쇄 CDR3에서의 아미노산 빈도를 나타낸 것이다.
도 74는 hVH/hVL 마우스에서 시스테인 잔기를 함유하는 HCDR3의 빈도를 나타낸 것이다.
도 75의 A는 나이브 야생형 마우스의 비장에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 B는 나이브 야생형 마우스의 서혜부 림프절에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 C는 나이브 야생형 마우스의 페이어스 패치(Peyer's patch)에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 D는 나이브 hVH/hVL 마우스의 비장에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 E는 나이브 hVH/hVL 마우스의 서혜부 림프절에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 F는 나이브 hVH/hVL 마우스의 페이어스 패치에 대한 조직학 이미지이다.
도 76a는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 BCMA(B-세포 성숙 항원)를 이용한 2차 및 3차 면역화 후 BCMA-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76b는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 IL4R(인터류킨-4 수용체)를 사용한 2차 및 3차 면역화 후 IL4R-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76c는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 PD-1(세포 예정사 단백질 1)을 이용한 2차 및 3차 면역화 후 PD-1-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76d는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 Siglec15(시알산 결합 ig-유사 렉틴 15)를 이용한 2차 및 3차 면역화 후 Siglec15-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76e는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 SIRPα(신호 조절 단백질 α)를 이용한 2차 및 3차 면역화 후 SIRPα특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 77a는 면역화 후 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 체중을 나타낸 것이다.
도 77b는 면역화 후 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 비장 중량을 나타낸 것이다.
도 78은 면역화 후 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 비장에서 면역 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 79a는 비장 B 세포에서 전이형 1(T1, B220+IgM+IgD-), 전이형 2(T2, B220+IgM+IgD+) 및 성숙(M, B220+IgMlowIgD+) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 79b는 비장 B 세포에서 가장자리 구역(MZ) 및 여포성(FO) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 80a는 골수 B 세포에서 프로-B-세포(B220lowCD43highIgMlow), 프리-B-세포(B220lowCD43intIgMlow) 및 미성숙-B-세포(B220highCD43lowIgMhigh) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 80b는 골수 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 80c는 비장 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 81은 3차 면역화 후 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스에서 혈청 면역글로불린(Ig) 아형의 농도를 나타낸 것이다. Ig 아형 농도는 ELISA에 의해 결정되었다.
도 82는 면역화 후 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스에서 혈청 전체 IgG 농도를 나타낸 것이다. IgG 농도는 ELISA에 의해 결정되었다.
도 1b는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역으로 대체한 것의 개요이다.
도 1c는 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로 대체한 것의 개요이다.
도 2는 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 3a는 두 개의 재조합 부위가 게놈에 도입된 후 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 3b는 표적화 벡터로의 재조합 후 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 4는 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 변형시키기 위한 표적화 전략을 나타낸 것이다.
도 5a는 mIgHV-5'loxP-L-GT-F/mIGHV-005-L-GT-R2 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 mIGHV-005-5'loxP-R-GT-F2/mIgHV-5'loxP-R-GT-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 mIGHV-3'lox-L-GT-F2/mIGHV-3'lox-L-GT-R2 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 mIGHV3'lox-R-GT-F2/mIGHV-3'lox-R-GT-R1 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 강조하는 인간 14번 염색체의 개략도이다(축척에 따라 도시되지 않음). 중쇄 면역글로불린 유전자좌는 가변 영역(VH, DH, JH) 및 불변 영역(CH)을 갖는다. VH는 IGHV 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, DH는 IGHD 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, JH는 IGHJ 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, CH는 불변 도메인을 발현하는 유전자 클러스터를 나타낸다.
도 8은 변형 후 인간 14번 염색체를 보여주는 개략도이다.
도 9는 두 개의 벡터로 인간 14번 염색체에서의 변형을 나타낸 것이다.
도 10은 변형된 인간 14번 염색체를 나타낸 것이다.
도 11은 hIGHV-5'loxP-L-GT-F1 및 hIGHV-5'loxP-R-GT-R 프라이머 쌍을 사용한 염색체 hChr14-mut3 상의 loxP 부위 301에 대한 PCR 검정의 결과를 나타낸 것이다. 8-D7은 양성 대조 클론이다.
도 12는 염색체 hChr14-mut3 상의 loxP 부위 302에 대한 PCR 검정의 결과를 나타낸 것이다. 8-D7은 음성 대조 클론이다.
도 13은 인간 14번 염색체가 변형되기 전 세포의 형광 동소 혼성화(fluorescence in situ hybridization; FISH) 이미지이다.
도 14는 인간 14번 염색체가 변형된 후 세포의 FISH 이미지이다.
도 15는 변형된 12번 마우스 염색체를 보여주는 개략도이다.
도 16은 마우스 중쇄 가변 영역 유전자좌를 상응하는 인간 게놈 DNA 서열로 대체한 Cre 매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 17은 M5-L 프라이머 쌍 및 M5-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 M3 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 H5-L 프라이머 쌍 및 H5-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 H3-L 프라이머 쌍 및 H3-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 FISH 이미지이다. 흰색 화살표 (1) 및 (2)는 마우스 12번 염색체를 나타낸다. 흰색 화살표 (3)는 인간-특이적 IGH Breakapart 프로브에 의해 표지된 인간 염색체 단편을 나타낸다.
도 22는 Flp-매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 23은 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 24a는 두 개의 재조합 부위가 게놈에 도입된 후 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 24b는 표적화 벡터로의 재조합 후 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 25는 마우스 6번 염색체에 대한 유전자 표적화 전략을 보여주는 개략도이다.
도 26은 IGKV-005-C-5G-L-GT-F/IGKV-005-C-5G-L-GT-R2 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 IGKV-005-C-5G-R-GT-F1/IGKV-005-C-5G-R-GT-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 강조하는 인간 2번 염색체의 개략도이다(축척에 따라 도시되지 않음). VHK는 IGKV 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, JHK는 IGKJ 유전자 클러스터에 대한 세그먼트를 나타내고, CHK는 IGKC 유전자를 나타낸다.
도 29는 변형된 인간 2번 염색체를 보여주는 개략도이다.
도 30은 인간 2번 염색체에 대한 유전자 표적화 전략을 보여주는 개략도이다.
도 31은 제1 재조합(벡터(2702) 도입) 후 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다. WT는 야생형 H9 세포이다.
도 32는 FISH 이미지 결과이다. 흰색 화살표는 올바른 재조합을 갖는 변형된 인간 2번 염색체를 나타낸다.
도 33은 제2 재조합(벡터(2701) 도입) 후 PCR 검정 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 인간 경쇄 가변 영역 게놈 DNA 서열이 상응하는 마우스 유전자좌에 첨가된 Cre 매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 35는 형광 동소 혼성화(FISH) 이미지이다. 화살표 (1) 및 (3)은 마우스 6번 염색체를 나타낸다. 화살표 (2)는 인간-특이적 IGK Breakapart 프로브에 의해 표지된 인간 염색체 단편을 나타낸다.
도 36은 Flp-매개 재조합을 보여주는 개략도이다.
도 37은 14번 염색체(14q32.33) 상의 인간 면역글로불린 중쇄(IGH) 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 38a 및 도 38b는 12번 염색체(12F2) 상의 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus))(계통 C57BL/6) IGH 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 39는 2번 염색체(2p11.2) 상의 인간 면역글로불린 카파쇄(IGK) 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 40a 및 도 40b는 6번 염색체(6C1) 상의 마우스(무스 무스쿨루스) IGK 유전자좌를 보여주는 개략도이다.
도 41은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌(IGH)에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 42는 마우스 IGH에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 43은 인간 카파쇄 면역글로불린 유전자좌(IGK)에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 44는 마우스 IGK에 대한 IMGT 레퍼토리를 열거한 것이다.
도 45는 말초 혈액에서 검출된 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다.
도 46은 비장 세포에서 검출된 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다.
도 47은 림프절에서 검출된 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다.
도 48은 상이한 발달기에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 49는 상이한 발달기에서 림프절 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 50은 비장 가장자리 구역(MZ-B) 및 여포 구역(FO-B)에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 51a는 야생형 마우스로부터 얻어진 골수의 상이한 발달기에서 B 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 영역 1은 프로-B-세포를 나타내고, 영역 2는 프리-B-세포를 나타내고, 영역 3은 미성숙 B-세포를 나타낸다.
도 51b는 인간화 중쇄 이형접합 마우스로부터 얻어진 골수의 상이한 발달기에서 B 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 영역 1은 프로-B-세포를 나타내고, 영역 2는 프리-B-세포를 나타내고, 영역 3은 미성숙 B-세포를 나타낸다.
도 51c는 인간화 중쇄 동형접합 마우스로부터 얻어진 골수의 상이한 발달기에서 B 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 영역 1은 프로-B-세포를 나타내고, 영역 2는 프리-B-세포를 나타내고, 영역 3은 미성숙 B-세포를 나타낸다.
도 52는 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgA 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 53은 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG1 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 54는 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG2b 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 55는 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG2c 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 56은 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgG3 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 57은 연속 희석된 마우스 혈청에서 IgM 동형 수준을 나타낸 것이다.
도 58은 개별 마우스 중에서 VJ 재조합 후 검출된 IGKV 유전자 발현의 분포를 나타낸 것이다.
도 59는 인간 BTLA에 의해 면역화된 후 야생형 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 60은 인간 BTLA에 의해 면역화된 후 인간화 중쇄 동형접합 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 61은 개과 PD-1(dPD-1)에 의해 면역화된 후 야생형 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 62는 개과 PD-1(dPD-1)에 의해 면역화된 후 인간화 중쇄 동형접합 마우스의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 63은 오브알부민(OVA)에 의해 면역화된 후 야생형 마우스(검은색 막대; 마우스는 1 내지 5로 표시됨) 및 인간화 중쇄 동형접합 마우스(회색 막대; 마우스는 6 내지 10으로 표시됨)의 ELISA 결과의 요약을 나타낸 것이다.
도 64는 인간 원위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자의 목록 및 인간 근위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자의 목록을 나타낸 것이다.
도 65a는 나이브 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 체중을 나타낸 것이다.
도 65b는 나이브 야생형 마우스 및 hVH/hVL의 비장 중량을 나타낸 것이다.
도 66은 나이브 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 비장에서 면역 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 67a는 비장 B 세포에서 전이형 1(T1, B220+IgM+IgD-), 전이형 2(T2, B220+IgM+IgD+) 및 성숙(M, B220+IgMlowIgD+) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 67b는 비장 B 세포에서 가장자리 구역(MZ) 및 여포성(FO) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 68a는 골수 B 세포에서 프로-B-세포(B220lowCD43highIgMlow), 프리-B-세포(B220lowCD43intIgMlow) 및 미성숙-B-세포(B220highCD43lowIgMhigh) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 68b는 골수 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 68c는 비장 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 69는 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스에서 혈청 면역글로불린(Ig) 아형의 농도를 나타낸 것이다. Ig 아형 농도는 ELISA에 의해 정량적으로 측정되었다.
도 70a는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHV 사용(빈도 > 1%)을 나타낸 것이다.
도 70b는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHV 사용(빈도 < 1%)을 나타낸 것이다.
도 70c는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHD 사용을 나타낸 것이다.
도 70d는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGHJ 사용을 나타낸 것이다.
도 71a는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGKV 사용(빈도 > 1%)을 나타낸 것이다.
도 71b는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGKV 사용(빈도 < 1%)을 나타낸 것이다.
도 71c는 나이브 hVH/hVL 마우스에서 IGKJ 사용을 나타낸 것이다.
도 72는 나이브 hVH/hVL 마우스로부터 중쇄 CDR3 아미노산 길이 분포를 보여주는 히스토그램이다.
도 73은 나이브 hVH/hVL 마우스에서 중쇄 CDR3에서의 아미노산 빈도를 나타낸 것이다.
도 74는 hVH/hVL 마우스에서 시스테인 잔기를 함유하는 HCDR3의 빈도를 나타낸 것이다.
도 75의 A는 나이브 야생형 마우스의 비장에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 B는 나이브 야생형 마우스의 서혜부 림프절에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 C는 나이브 야생형 마우스의 페이어스 패치(Peyer's patch)에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 D는 나이브 hVH/hVL 마우스의 비장에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 E는 나이브 hVH/hVL 마우스의 서혜부 림프절에 대한 조직학 이미지이다.
도 75의 F는 나이브 hVH/hVL 마우스의 페이어스 패치에 대한 조직학 이미지이다.
도 76a는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 BCMA(B-세포 성숙 항원)를 이용한 2차 및 3차 면역화 후 BCMA-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76b는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 IL4R(인터류킨-4 수용체)를 사용한 2차 및 3차 면역화 후 IL4R-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76c는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 PD-1(세포 예정사 단백질 1)을 이용한 2차 및 3차 면역화 후 PD-1-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76d는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 Siglec15(시알산 결합 ig-유사 렉틴 15)를 이용한 2차 및 3차 면역화 후 Siglec15-특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 76e는 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 항원으로서 인간 SIRPα(신호 조절 단백질 α)를 이용한 2차 및 3차 면역화 후 SIRPα특이적 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 77a는 면역화 후 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 체중을 나타낸 것이다.
도 77b는 면역화 후 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 비장 중량을 나타낸 것이다.
도 78은 면역화 후 야생형 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 비장에서 면역 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 79a는 비장 B 세포에서 전이형 1(T1, B220+IgM+IgD-), 전이형 2(T2, B220+IgM+IgD+) 및 성숙(M, B220+IgMlowIgD+) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 79b는 비장 B 세포에서 가장자리 구역(MZ) 및 여포성(FO) B 세포 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 80a는 골수 B 세포에서 프로-B-세포(B220lowCD43highIgMlow), 프리-B-세포(B220lowCD43intIgMlow) 및 미성숙-B-세포(B220highCD43lowIgMhigh) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 80b는 골수 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 골수 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 80c는 비장 B 세포에서 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+) 집단의 백분율을 나타낸 것이다. 비장 B 세포는 면역화 후 야생형 또는 hVH/hVL 마우스로부터 유래된 것이다.
도 81은 3차 면역화 후 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스에서 혈청 면역글로불린(Ig) 아형의 농도를 나타낸 것이다. Ig 아형 농도는 ELISA에 의해 결정되었다.
도 82는 면역화 후 나이브 야생형 또는 hVH/hVL 마우스에서 혈청 전체 IgG 농도를 나타낸 것이다. IgG 농도는 ELISA에 의해 결정되었다.
본 개시는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌(예를 들어, 카파쇄 유전자좌)를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포에 관한 것이다.
유전적으로 변형된 동물은 인간화 항체 또는 키메라 항체를 발현할 수 있는 동물을 생산하도록 인간 면역글로불린 유전자를 비-인간 동물의 게놈에 도입함으로써 생산될 수 있다. 도 1a는 인간화 마우스를 생산하는 방법을 나타낸 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 먼저 인간 염색체 상의 인간 면역글로불린 영역을 변형시키는 단계를 포함한다. 변형된 인간 염색체는 이후 마우스 수용 세포에 도입된다. 인간 면역글로불린 가변 영역은 이후 직접 대체에 의해(예를 들어, 1 단계 대체로) 마우스 게놈의 상응하는 영역에 도입된다. 수용 세포는 이후 바람직하게는 인간 염색체를 함유하지 않는 세포에 대해 스크리닝된다. 세포는 이후 배반포에 주사되어 키메라 동물(예를 들어, 마우스)을 생산한다. 온전한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 동물을 얻기 위해 후속적인 번식이 수행될 수 있다.
본원에 기재된 유전적으로 변형된 동물은 다양한 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기재된 유전적으로 변형된 동물은 완전 인간 항체 레퍼토리를 갖는다. 따라서, 이러한 동물들에 의해 생성된 가변 도메인은 인간에서 가변 도메인의 다양성과 매우 유사한 다양성을 가질 수 있다. 게다가, 인간 면역글로불린 유전자좌에서의 전체 서열은 동물 게놈에 도입되기 때문에(변형 없음 또는 제한된 변형), 이러한 유전자들은 인간에서 발생하는 것과 매우 유사한 방식으로 V(D)J 재조합을 겪을 수 있다. 또한, 항체 생산은 매우 효율적일 수 있고, 효율적인 V(D)J 재조합으로 인해 정상 속도와 유사한 속도를 갖는다. 또한, V(D)J 재조합은 내인성 IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV 및 IGKJ 유전자와 인간 유전자 간에 발생할 수 있기 때문에, 내인성 IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV 및 IGKJ 유전자가 재배열된 중쇄 VDJ 세그먼트 또는 재배열된 경쇄 VJ 세그먼트에 혼입되는 경우, 항체 레퍼토리에 의해 생성된 항체는 인간에서 면역원성 에피토프를 가질 가능성이 있다. 면역원성은 항-약물-항체의 생산으로 이어질 수 있으며, 효능을 포함할 수 있다. 여기서, 내인성 IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV 및 IGKJ 유전자는 효과적으로 결실되었다. 항체 레퍼토리에 의해 생성된 항체는 인간에서 면역원성일 가능성이 낮다. 따라서, 항체는 인간에서 치료제로서 사용하기에 더 적합하다. 그러므로, 유전적으로 변형된 동물은 인간화 항체를 생산하도록 유리한 플랫폼을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 네 개의 폴리펩티드쇄, 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변(VH) 도메인 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변(VL) 도메인 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 추가로, 골격 영역(FR)으로 칭해지는 보다 보존된 영역과 개재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 칭해지는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단의 다음 순서로 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수 있음). 용어 "고친화성" 항체는 약 10-9 M 이하(예를 들어, 약 또는 1Х10-9 M, 1Х10-10 M, 1Х10-11 M, 1Х10-12 M 또는 각각의 값 이하)의 이의 표적 에피토프에 대한 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, KD는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어, BIACORE?? 또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 단편"은 항체의 일부가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 전장 항체의 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 적어도 하나의 가변 도메인(예를 들어, 중쇄의 가변 도메인 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유한다. 항체 단편의 비-제한적 예는, 예를 들어, Fab, Fab', F (ab')2, 및 Fv 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간에 존재하는 핵산(예를 들어, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자좌)에 의해 인코딩된 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 인간으로부터 수집되거나 인간 세포 배양물(예를 들어, 인간 하이브리도마 세포)에서 생산된다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 비-인간 세포(예를 들어, 마우스 또는 햄스터 세포주)에서 생산된다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 세균 또는 효모 세포에서 생산된다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 재배열되지 않거나 재배열된 인간 면역글로불린 유전자좌(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 인간 면역글로불린 유전자좌)를 함유하는 트랜스제닉 비-인간 동물(예를 들어, 마우스)에서 생산된다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 적어도 두 개의 상이한 항체(예를 들어, 인간 및 마우스 항체와 같은 두 개의 상이한 포유동물 종으로부터의 항체)에 존재하는 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 키메라 항체의 비-제한적 예는 인간 항체의 가변 도메인 서열(예를 들어, 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열 전부 또는 이의 일부) 및 비-인간 항체의 불변 도메인을 함유하는 항체이다. 키메라 항체의 추가 예는 본원에 기재되어 있으며, 당분야에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 비-인간(예를 들어, 마우스) 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하고 인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 비-인간 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "단쇄 항체"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 두 개의 면역글로불린 가변 도메인(예를 들어, 포유동물 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유하는 단일 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 명세서 전반에 걸쳐 상호교환 가능하게 사용되고, 동물, 인간 또는 비-인간을 나타낸다. 수의학 및 비-수의학 적용이 본 개시에 의해 고려된다. 인간 환자는 성인 인간 또는 청소년 인간(예를 들어, 18세 미만 연령의 인간)일 수 있다. 인간 외에, 환자는 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 페럿, 고양이, 개, 및 영장류를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류(예를 들어, 랫트, 마우스, 저빌, 햄스터, 페럿, 토끼), 토끼목, 돼지과(예를 들어, 돼지, 미니 돼지), 말과, 개과, 고양잇과, 소과, 및 기타 가축, 농장, 및 동물원 동물이 포함된다.
항체를 지칭할 때 본원에서 사용되는 어구 "특이적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하다"는 상호작용이 표적 분자 상에서 특정 구조(즉, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 좌우되기 때문에; 다시 말해서, 시약이 일반적으로 모든 분자보다는 특정 구조를 포함하는 분자를 인식하고 이에 결합하기 때문에, 항체가 바람직하게는 다른 분자에 대해 이의 표적 분자와 상호작용을 한다는 것을 의미한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 표적-특이적 항체로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 적어도 두 개의 아미노산의 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자", 및 "핵산 서열"은 적어도 두 개의 뉴클레오티드의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 제한 없이, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 및 이들의 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "비변형 인간 서열"은 인간 대상체, 인간 세포, 배양된 인간 세포 또는 인간 세포주로부터 유래된 서열을 지칭하고, 여기서 서열은 인간 대상체, 인간 세포, 배양된 인간 세포 또는 인간 세포주의 유전자 서열과 동일하다.
유전적으로 변형된 중쇄 면역글로불린 유전자좌
중쇄 면역글로불린 유전자좌(IGH 또는 면역글로불린 중쇄 유전자좌로도 알려짐)는 인간 항체(또는 면역글로불린)의 중쇄에 대한 유전자를 함유하는 염색체(예를 들어, 인간 14번 염색체) 상의 영역이다.
이러한 영역은 중쇄 유전자좌의 생식계열 조직을 나타낸다. 유전자좌는 V(가변), D(다양성), J(결합), 및 C(불변) 세그먼트를 포함한다. V 영역에서 유전자는 V 유전자 클러스터(IGHV 유전자 클러스터로도 알려짐)를 형성한다. D 영역에서 유전자는 D 유전자 클러스터(IGHD 유전자 클러스터로도 알려짐)를 형성한다. J 영역에서 유전자는 J 유전자 클러스터(IGHJ 유전자 클러스터로도 알려짐)를 형성한다.
B 세포 발달 동안, DNA 수준에서 재조합 이벤트는 단일 D 세그먼트(IGHD 유전자로도 알려짐)를 J 세그먼트(IGHJ 유전자로도 알려짐)와 결합하고; 이러한 부분 재배열된 D-J 영역의 융합된 D-J 엑손은 이후 V 세그먼트(IGHV 유전자로도 알려짐)에 결합된다. 융합된 V-D-J 엑손을 함유하는 재배열된 V-D-J 영역은 이후 번역되고 IGHM 불변 영역에 RNA 수준에서 융합되고; 이러한 전사물은 뮤 중쇄를 인코딩한다. 발달 후기에 B 세포는 V-D-J-C뮤-C델타 프리-메신저 RNA를 생성하고, 이는 대안적으로 뮤 또는 델타 중쇄를 인코딩하도록 스플라이싱된다. 림프절에서 성숙 B 세포는 융합된 V-D-J 유전자 세그먼트가 IGHG, IGHA, 또한 IGHE 유전자 세그먼트 중 하나에 근접하게 되고 각 세포가 감마, 알파, 또는 엡실론 중쇄를 발현하도록 스위치 재조합을 겪는다. 여러 IGHJ 유전자와 다수의 상이한 IGHV 유전자의 잠재적인 재조합은 광범위한 항원 인식을 제공한다. 추가의 다양성은 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제에 의해, 그리고 비장 및 림프절에서 B 세포 성숙 동안 발생하는 체세포 초돌연변이에 의해 뉴클레오티드의 무작위 첨가로부터 야기된 결합 다양성에 의해 달성된다. 여러 V, D, J, 및 C 세그먼트는 단백질을 인코딩할 수 없는 것으로 알려져 있고, 위유전자 세그먼트(흔히 간단히 위유전자로도 지칭됨)로 여겨진다.
인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌는 인간 14번 염색체 상에 위치한다. 표 1은 이러한 유전자좌에서 IGHV 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다.
[표 1]
RPS8P1, ADAM6, 및 KIAA0125는 또한 이러한 유전자좌에 위치한다. RPS8P1의 상대적 순서는 160이고, ADAM6의 상대적 순서는 161이고, KIAA0125의 상대적 순서는 164이다. 표 2는 인간 14번 염색체 상의 모든 IGHD 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. 표 3은 인간 14번 염색체 상의 모든 IGHJ 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. 면역글로불린 불변 도메인에 대한 유전자는 IGHV, IGHD, 및 IGHJ 유전자 뒤에 위치한다. 이들 유전자는 다음을 포함한다(다음 순서로 나타낸 바와 같이): 면역 글로불린 중쇄 불변 뮤(IGHM), 면역글로불린 중쇄 불변 델타 (IGH δ), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 3(IGHG3), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 1(IGHG1), 면역글로불린 중쇄 불변 엡실론 P1(위유전자)(IGHEP1), 면역글로불린 중쇄 불변 알파 1(IGHA1), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 P(비-기능)(IGHGP), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 2(IGHG2), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 4(IGHG4), 면역글로불린 중쇄 불변 엡실론(IGHE), 및 면역글로불린 중쇄 불변 알파 2(IGHA2). 이들 유전자 및 이들 유전자의 순서는 또한 도 37 및 도 41에 나타나 있다.
[표 2]
[표 3]
마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌는 마우스 12번 염색체 상에 위치한다. 표 4는 이러한 유전자좌에서 IGHV 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다.
[표 4]
표 5는 마우스 12번 염색체 상의 모든 IGHD 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. 표 6은 마우스 12번 염색체 상의 모든 IGHJ 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. 면역글로불린 불변 도메인에 대한 유전자는 IGHV, IGHD, 및 IGHJ 유전자 뒤에 위치한다. 이들 유전자는 다음을 포함한다(다음 순서로 나타낸 바와 같이): 면역글로불린 중쇄 불변 뮤(IGHM), 면역글로불린 중쇄 불변 델타(IGH δ), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 3(IGHG3), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 1(IGHG1), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 2b(IGHG2b), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 2a(IGHG2a), 면역글로불린 중쇄 불변 엡실론(IGHE), 및 면역글로불린 중쇄 불변 알파(IGHA) 유전자. 이들 유전자 및 이들 유전자의 순서는 또한 도 38a, 도 38b 및 도 42에 나타나 있다.
[표 5]
[표 6]
본 개시는 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및/또는 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물을 제공한다. 일부 구현예에서, 인간 IGHV 유전자, 인간 IGHD 유전자, 및 인간 IGHJ 유전자는 함께 작동 가능하게 연결되고, VDJ 재배열을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 IGHV 유전자, 인간 IGHD 유전자, 및 인간 IGHJ 유전자는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 있다.
일부 구현예에서, 동물은 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자(예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같은 유전자)를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGHV(III)-82, IGHV7-81, IGHV4-80, IGHV3-79, IGHV(II)-78-1, IGHV5-78, IGHV7-77, IGHV(III)-76-1, IGHV3-76, 및 IGHV3-75로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGHV(III)-5-2, IGHV(III)-5-1, IGHV2-5, IGHV7-4-1, IGHV4-4, IGHV1-3, IGHV(III)-2-1, IGHV1-2, IGHV(II)-1-1, 및 IGHV6-1로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGHV(III)-82, IGHV7-81, IGHV4-80, IGHV3-79, IGHV(II)-78-1, IGHV5-78, IGHV7-77, IGHV(III)-76-1, IGHV3-76, 및 IGHV3-75로부터 선택된 유전자로부터 시작하여 IGHV(III)-5-2, IGHV(III)-5-1, IGHV2-5, IGHV7-4-1, IGHV4-4, IGHV1-3, IGHV(III)-2-1, IGHV1-2, IGHV(II)-1-1, 및 IGHV6-1로부터 선택된 유전자로 종결되는 서열을 포함하는 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV1-2까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV(II)-1-1까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV-6-1까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 동물은 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자(예를 들어, 표 2에 나타낸 바와 같은 유전자)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGHD1-1, IGHD2-2, IGHD3-3, IGHD4-4, IGHD5-5, IGHD4-23, IGHD5-24, IGHD6-25, IGHD1-26, 및 IGHD7-27로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자(예를 들어, 표 3에 나타낸 바와 같은 유전자)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGHJ1P, IGHJ1, IGHJ2, IGHJ2P, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ3P, 및 IGHJ6으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGHD1-1, IGHD2-2, IGHD3-3, IGHD4-4, IGHD5-5, IGHD4-23, IGHD5-24, IGHD6-25, IGHD1-26, 및 IGHD7-27로부터 선택된 유전자로부터 시작하여 IGHJ1P, IGHJ1, IGHJ2, IGHJ2P, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ3P, 및 IGHJ6으로부터 선택된 유전자로 종결되는 서열을 포함하는 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHD1-1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHD1-1에서 시작하여 인간 IGHD7-27까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHJ1P에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHJ1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV1-2에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV(II)-1-1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 인간 IGHV6-1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 동물은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 비변형 인간 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 또는 1000 kb의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 동물은 면역글로불린 중쇄 불변 뮤(IGHM), 면역글로불린 중쇄 불변 델타(IGHδ), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 3(IGHG3), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 1(IGHG1), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 2b(IGHG2b), 면역글로불린 중쇄 불변 감마 2a(IGHG2a), 면역글로불린 중쇄 불변 엡실론(IGHE), 및 면역글로불린 중쇄 불변 알파(IGHA) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 내인성 유전자는 함께 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 이들 내인성 유전자는 야생형 동물에서와 같은 순서를 갖는다. 일부 구현예에서, 동형 스위칭(면역글로불린 클래스 스위칭)은 동물에서 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, IGHV 유전자, IGHD 유전자, 및/또는 IGHJ 유전자는 함께 작동 가능하게 연결된다. VDJ 재조합은 이들 유전자 중에서 발생하고, 기능성 항체를 생산시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 유전자는 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서의 순서와 유사한 순서로 배열된다. 이러한 배열은 다양한 이점, 예를 들어, 이들 유전자의 배열이 인간에서의 중쇄 가변 도메인의 다양성과 매우 유사한 다양성을 갖는 중쇄 가변 도메인의 생산을 가능하게 한다는 이점을 제공한다. 일부 무작위 서열이 VDJ 재조합 동안 서열에 삽입될 수 있기 때문에, 일부 구현예에서, 변형이 없거나 최소인 완전 인간 항체 레퍼토리는 비-인간 서열이 VDJ 재조합 동안 삽입될 가능성을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, IGHV 유전자, IGHD 유전자, 및/또는 IGHJ 유전자는 IGHM, IGHδ, IGHG3, IGHG1, IGHG2b, IGHG2a, IGHE, 및 IGHA 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자(예를 들어, 모든 유전자)에 함께 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 하나 이상의 내인성 IGHV 유전자, 하나 이상의 내인성 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 내인성 IGHJ 유전자의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이다. 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 또는 182개의 마우스 IGHV 유전자(예를 들어, 표 4에 나타낸 바와 같은 유전자)의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 IGHV1-86, IGHV1-85, IGHV1-84, IGHV1-83, IGHV1-82, IGHV1-81, IGHV1-80, IGHV1-79, IGHV1-78, 및 IGHV1-77로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGHV 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGHV1-86, IGHV1-85, IGHV1-84, IGHV1-83, IGHV1-82, IGHV1-81, IGHV1-80, IGHV1-79, IGHV1-78, 및 IGHV1-77(예를 들어, IGHV1-86)로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGHV 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 파괴는 IGHV5-6, IGHV5-5, IGHV2-3, IGHV6-1, IGHV5-4, IGHV5-3, IGHV2-2, IGHV5-2, IGHV2-1, 및 IGHV5-1로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGHV 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGHV5-6, IGHV5-5, IGHV2-3, IGHV6-1, IGHV5-4, IGHV5-3, IGHV2-2, IGHV5-2, IGHV2-1, 및 IGHV5-1로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGHV 유전자의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 파괴는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 마우스 IGHD 유전자(예를 들어, 표 5에 나타낸 바와 같은 유전자)의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 IGHD5-1, IGHD3-1, IGHD1-1, IGHD6-1, IGHD2-3, IGHD2-7, IGHD2-8, IGHD5-6, IGHD3-2, 및 IGHD4-1로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGHD 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGHD5-1, IGHD3-1, IGHD1-1, IGHD6-1, IGHD2-3, IGHD2-7, IGHD2-8, IGHD5-6, IGHD3-2, 및 IGHD4-1로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGHD 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 파괴는 IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, 및 IGHJ4로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, 및 IGHJ4로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 마우스 IGHJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 파괴는 약 또는 적어도 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1000 kb, 1500 kb, 2000 kb, 2500 kb, 또는 3000 kb의 내인성 서열의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 결실된 서열은 IGHV1-86에서 시작하여 IGHJ4까지, IGHV1-85에서 IGHJ4까지, IGHV1-84에서 IGHJ4까지, IGHV1-83에서 IGHJ4까지, 또는 IGHV1-82에서 IGHJ4까지(예를 들어, IGHV1-85에서 IGHJ4까지)이다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1000 kb, 1500 kb, 2000 kb, 2500 kb, 3000 kb 또는 3500 kb의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 IGHV1-2까지이다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGHV7-81에서 시작하여 IGHV1-2까지이다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGHV(II)-1-1에서 시작하여 IGHVJ6까지이다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGHV6-1에서 시작하여 IGHVJ6까지이다.
인간 IGHV 유전자, 인간 IGHD 유전자, 및 인간 IGHJ 유전자는 함께 작동 가능하게 연결되고, VDJ 재배열을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 마우스는 완전 인간 IGHV, IGHD, 및 IGHJ 유전자 레퍼토리(예를 들어, 모든 비-위 인간 IGHV, IGHD, 및 IGHJ 유전자 포함)를 갖는다. 따라서, 변형된 마우스는 완전 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, VDJ 재조합 후, 표 15에서의 하나의 IGHV 유전자(예를 들어, IGHV3-21 또는 IGHV3-74)는 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 표 15에서의 하나의 IGHD 유전자는 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 그리고 표 15에서의 하나의 IGHJ 유전자는 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 일부 구현예에서, IGHV 유전자는 IGHV3-21 또는 IGHV3-74이다.
일부 구현예에서, 도 70a 및 도 70b에서 하나의 IGHV 유전자(예를 들어, IGHV3-30, IGHV3-33, IGHV4-39, 또는 IGHV4-34)는 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 도 70c에서 하나의 IGHD 유전자(예를 들어, IGHD6-19)는 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 그리고, 도 70d에서 하나의 IGHJ 유전자(예를 들어, IGHJ4 또는 IGHJ6)는 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 일부 구현예에서, 도 71a 및 도 71b에서 하나의 IGKV 유전자(예를 들어, IGKV4-1, IGKV1-33, IGKV2-30)는 항체 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 도 71c에서 하나의 IGKJ 유전자(예를 들어, IGKJ1, IGKJ2, 또는 IGKJ4)는 항체 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다.
또한, 일부 경우에, 전체 마우스 IGHV 유전자, IGHD 유전자, 및 IGHJ 유전자(예를 들어, 모든 비-위유전자 포함)는 녹 아웃되고, 중쇄 가변 영역은 마우스로부터 유래된 서열에 의해 인코딩된 임의의 서열을 갖지 않아서 인간에서 면역원성을 최소화할 것이다.
유전적으로 변형된 카파 경쇄 면역글로불린 유전자좌
카파쇄 면역글로불린 유전자좌(IGK 또는 면역글로불린 카파 유전자좌로도 알려짐)는 인간 항체(또는 면역글로불린)의 경쇄에 대한 유전자를 함유하는 염색체(예를 들어, 인간 2번 염색체) 상의 영역이다. 유사하게, 면역글로불린 경쇄 유전자는 또한 성숙 면역글로불린 경쇄 핵산(예를 들어, 카파쇄)의 생산을 야기하는 일련의 재배열을 겪을 수 있다.
V 세그먼트(IGKV 유전자로도 알려짐) 및 J 세그먼트(IGKJ 유전자로도 알려짐)의 결합은 전체 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 연속 엑손을 형성한다. 재배열되지 않은 DNA에서, V 유전자 세그먼트(또는 IGKV 유전자 클러스터)는 C 영역에서 상대적으로 멀리 떨어져 위치한다. J 유전자 세그먼트(또는 IGKJ 유전자 클러스터)는 C 영역에 가까이 위치한다. J 유전자 세그먼트에 대한 V 세그먼트의 결합은 또한 V 유전자를 C-영역 서열에 가깝게 만든다. 재배열된 V 영역의 J 유전자 세그먼트는 인트론에 의해서만 C-영역 서열로부터 분리된다. 완전한 면역글로불린 경쇄 메신저 RNA를 만들기 위해, V-영역 엑손은 전사 후 RNA 스플라이싱에 의해 C-영역 서열에 결합된다.
인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌는 인간 2번 염색체 상에 위치한다. 표 7은 이러한 유전자좌에서 IGKV 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. IGKV1 유전자(IGKV1에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκI로도 알려짐), IGKV2 유전자(IGKV2에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκII로도 알려짐), IGKV3 유전자(IGKV3에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκIII로도 알려짐), IGKV4 유전자(IGKV4에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκIV로도 알려짐), IGKV5 유전자(IGKV5에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκV로도 알려짐), IGKV6 유전자(IGKV6에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκVI로도 알려짐), 및 IGKV7 유전자(IGKV7에서 시작하여 모든 IGKV 유전자 포함, VκVII로도 알려짐)를 포함하여, 인간 IGKV 유전자에 대한 여러 상이한 그룹이 있다.
인간 2번 염색체에서 이들 IGKV 유전자는 또한 두 개의 클러스터, 즉, 근위 Vκ 클러스터 및 원위 Vκ 클러스터를 형성한다(도 28). 두 개의 클러스터에서의 서열은 유사하지만 동일하지는 않다. 서열의 이러한 큰 세그먼트 중복은 가장 최근의 인간 혈통의 갈래가 다른 유인원과 조상을 공유하기 때문에 발생했다. 각 클러스터에서 관련 IGVK 유전자는 도 64에 요약되어 있다.
[표 7]
표 8은 인간 2번 염색체에서 모든 IGKJ 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 인코딩하는 면역글로불린 카파 불변(IGKC) 유전자는 IGKV 및 IGKJ 유전자 뒤에 위치한다. 이들 유전자 및 이들 유전자의 순서는 또한 도 39 및 도 43에 나타나 있다.
[표 8]
마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌는 마우스 6번 염색체 상에 위치한다. 표 9는 이러한 유전자좌에서 IGKV 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다.
[표 9]
Gm9728 및 Amd-ps2가 또한 이러한 유전자좌에 위치한다. Gm9728의 상대적 순서는 4이고, Amd-ps2의 상대적 순서는 134이다. 표 10은 마우스 6번 염색체 상의 모든 IGKJ 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다. 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 인코딩하는 IGKC 유전자는 IGKV 및 IGKJ 유전자 뒤에 위치한다. 이들 유전자 및 이들 유전자의 순서는 또한 도 40a, 도 40b 및 도 44에 나타나 있다.
[표 10]
본 개시는 하나 이상의 인간 IGKV 유전자 및/또는 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물을 제공한다. 일부 구현예에서, 인간 IGKV 유전자 및 인간 IGKJ 유전자는 함께 작동 가능하게 연결되고, VJ 재배열을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 IGKV 유전자 및 인간 IGKJ 유전자는 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에 있다.
일부 구현예에서, 동물은 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 또는 76개의 인간 IGKV 유전자(예를 들어, 표 7에 나타낸 바와 같은 유전자)를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGKV3D-7, IGKV1D-8, IGKV1D-43, IGKV1D-42, IGKV2D-10, IGKV3D-11, IGKV1D-12, IGKV1D-13, IGKV2D-14, 및 IGKV3D-15로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 IGKV2-10, IGKV1-9, IGKV1-8, IGKV3-7, IGKV1-6, IGKV1-5, IGKV2-4, IGKV7-3, IGKV5-2, 및 IGKV4-1로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 IGKJ 유전자(예를 들어, 표 3에 나타낸 바와 같은 유전자)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4, 및 IGKJ5로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 인간 IGKJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 내인성 IGKC를 포함한다. 일부 구현예에서, IGKV 유전자 및/또는 IGKJ 유전자는 함께 작동 가능하게 연결된다. VJ 재조합은 이들 유전자 중에서 발생하고, 기능성 항체를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 유전자는 인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서의 순서와 유사한 순서로 배열된다. 이러한 배열은 다양한 이점, 예를 들어, 이들 유전자의 배열이 인간에서의 경쇄 가변 도메인의 다양성과 매우 유사한 다양성을 갖는 경쇄 가변 도메인의 생산을 가능하게 한다는 이점을 제공한다.
일부 구현예에서, IGKV 유전자 및/또는 IGKJ 유전자는 IGKC 유전자(예를 들어, 내인성 IGKC 유전자)에 함께 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 하나 이상의 내인성 IGKV 유전자, 및 하나 이상의 내인성 IGKJ 유전자의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 마우스이다. 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 또는 163개의 마우스 IGKV 유전자(예를 들어, 표 9에 나타낸 바와 같은 유전자)의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 IGKV2-137, IGKV1-136, IGKV1-135, IGKV14-134-1, IGKV17-134, IGKV1-133, IGKV1-132, IGKV1-131, IGKV14-130, 및 IGKV9-129로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGKV 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGKV2-137, IGKV1-136, IGKV1-135, IGKV14-134-1, IGKV17-134, IGKV1-133, IGKV1-132, IGKV1-131, IGKV14-130, 및 IGKV9-129로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGKV 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 파괴는 IGKV3-10, IGKV3-9, IGKV3-8, IGKV3-7, IGKV3-6, IGKV3-5, IGKV3-4, IGKV3-3, IGKV3-2, 및 IGKV3-1로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGKV 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGKV3-10, IGKV3-9, IGKV3-8, IGKV3-7, IGKV3-6, IGKV3-5, IGKV3-4, IGKV3-3, IGKV3-2, 및 IGKV3-1로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 마우스 IGKV 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 파괴는 IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4, 및 IGKJ5로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 마우스 IGKJ 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스는 또한 IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4, 및 IGKJ5(예를 들어, IGKJ5)로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 마우스 IGKJ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물의 내인성 카파 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 파괴는 약 또는 적어도 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1000 kb, 1500 kb, 2000 kb, 2500 kb, 3000 kb 또는 3500 kb의 내인성 서열의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 결실된 서열은 IGKV2-137에서 시작하여 IGKJ4까지, IGKV1-136에서 IGKJ4까지, IGKV1-135에서 IGKJ4까지, IGKV2-137에서 IGKJ5까지, IGKV1-136에서 IGKJ5까지, 또는 IGKV1-135에서 IGKJ5까지(예를 들어, IGKV2-137에서 IGKJ5까지)이다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1000 kb, 1500 kb, 2000 kb, 2500 kb, 3000 kb 또는 3500 kb의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 동물은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 비변형 인간 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1000 kb, 1500 kb, 2000 kb, 2500 kb, 3000 kb 또는 3500 kb의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 서열은 인간 IGKV3D-7에서 시작하여 IGKJ5까지이다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGKV3D-7에서 시작하여 IGKJ4까지이다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGKV1D-8에서 시작하여 IGKJ5까지이다. 일부 구현예에서, 서열은 인간 IGKV1D-8에서 시작하여 IGKJ4까지이다.
인간 IGKV 유전자 및 인간 IGKJ 유전자는 함께 작동 가능하게 연결되고, VJ 재배열을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 마우스는 완전 인간 IGKV 및 IGKJ 유전자 레퍼토리(예를 들어, 모든 비-위 인간 IGKV 및 IGKJ 유전자 포함)를 갖는다. 따라서, 변형된 마우스는 완전 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, VJ 재조합 후, 표 16에서의 하나의 IGKV 유전자(예를 들어, IGKV1D-43, IGKV1D-13, IGKV1D-16, 또는 IGKV1D-12)는 항체 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 하나의 인간 IGKJ 유전자는 항체 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열에 기여한다. 일부 구현예에서, IGKV 유전자는 IGKV1D-43, IGKV1D-13, IGKV1D-16, 또는 IGKV1D-12이다. 또한, 일부 경우에, 전체 마우스 IGKV 유전자, 및 IGKJ 유전자(모든 비-위유전자)는 녹 아웃되고, 경쇄 가변 영역은 마우스로부터 유래된 서열에 의해 인코딩된 임의의 서열을 갖지 않아서 인간에서 면역원성을 최소화할 것이다.
일부 구현예에서, 인간 근위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자는 변형된 염색체에 포함된다. 일부 구현예에서, 인간 원위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자는 변형된 염색체에 포함된다. 일부 구현예에서, 인간 근위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자와 인간 원위 Vκ 클러스터 IGKV 유전자 둘 모두는 변형된 염색체에 포함된다.
유전적으로 변형된 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌
람다쇄 면역글로불린 유전자좌(IGL 또는 면역글로불린 람다 유전자좌로도 알려짐)는 인간 항체(또는 면역글로불린)의 경쇄에 대한 유전자를 함유하는 염색체(예를 들어, 인간 22번 염색체) 상의 영역이다. 유사하게, 면역글로불린 경쇄 유전자는 또한 성숙 면역글로불린 경쇄 핵산(예를 들어, 람다쇄)의 생산을 야기하는 일련의 재배열을 겪을 수 있다. 건강한 인간 개체에서, 전체 카파 대 람다 비는 혈청에서 거의 2:1(온전한 전체 항체 측정) 또는 유리 경쇄를 측정하는 경우 1:1.5이다. 마우스에서, 전체 카파 대 람다 비는 거의 9:1이다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 람다쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함한다.
일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 파괴는 하나 이상의 내인성 IGLV 유전자, 하나 이상의 내인성 IGLJ 유전자, 및/또는 하나 이상의 면역글로불린 람다 불변(IGLC) 유전자(예를 들어, IGLC1, IGLC2, IGLC3, 및 IGLC4)의 결실을 포함한다.
마우스 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌(IGL 유전자좌)는 마우스 16번 염색체 상에 위치한다. 표 11은 이러한 유전자좌에서 IGLV, IGLJ, 및 IGLC 유전자 및 이의 상대적 순서를 열거한 것이다.
[표 11]
동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개의 마우스 IGLV, IGLJ, 및 IGLC 유전자(예를 들어, 표 11에 나타낸 바와 같은 유전자)의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 결실은 IGLC1, IGLC2, IGLC3, 및 IGLC4로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 마우스 IGKC 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 IGLV1, IGLV2, 및 IGLV3로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 또는 3개의 마우스 IGLV 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 IGLJ1, IGLJ2, IGLJ3, IGLJ3P, 및 IGLJ4로부터 선택된 약 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 마우스 IGLJ 유전자의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 150 kb, 160 kb, 170 kb, 180 kb, 190 kb, 200 kb, 210 kb, 220 kb, 230 kb, 240 kb, 250 kb, 260 kb, 270 kb, 280 kb, 290 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 450 kb, 500 kb, 또는 1000 kb의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자에서 파괴는 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 결실된 서열은 IGLV2에서 시작하여 IGLC1까지, IGLV3에서 IGLC1까지, 또는 IGLJ2에서 IGLC1까지이다.
유전적으로 변형된 동물
일 양태에서, 본 개시는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물을 제공한다. 일부 구현예에서, 동물은 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자, 하나 이상의 인간 IGKV 유전자 및/또는 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 유전자는 내인성 면역글로불린 유전자좌에 있다.
일부 구현예에서, 동물은 인간 람다쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 갖지 않는다.
유전적으로 변형된 비-인간 동물은 다양한 동물, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소과(예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예를 들어, 마모셋, 레서스 원숭이)일 수 있다. 적합한 유전적으로 변형 가능한 배아 줄기(ES) 세포가 용이하게 입수 가능하지 않은 비-인간 동물의 경우, 유전적 변형을 포함하여 비-인간 동물을 생산하기 위해 다른 방법이 이용된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 만능 세포)을 변형시키고 핵 이식을 이용하여 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포에 이식하는 단계, 및 적합한 조건 하에 비-인간 동물에 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 가져와 배아를 형성하는 단계를 포함한다. 이러한 방법들은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[A. Nagy, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition)," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003]에 기재되어 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 인간 V, D, 및/또는 J 세그먼트는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터) 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. B 세포 발달 동안, 이러한 재배열된 인간 V, D, 및/또는 J 세그먼트는 비-인간 동물 면역글로불린 불변 영역에 연결된다.
일 양태에서, 동물은, 예를 들어, 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea) 수퍼패밀리의 포유동물이다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 설치류는 마우스, 랫트, 및 햄스터로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스-유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴 월드(New World) 랫트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(순종 마우스 및 랫트, 저빌(gerbil), 가시생쥐, 갈기생쥐), 붉은숲쥐과(Nesomyidae)(나무타기 생쥐, 바위쥐, 흰꼬리쥐, 말라가시 랫트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 뒤지, 대나무쥐, 및 조코르(zokor))로부터 선택된 과이다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 순종 마우스 또는 랫트(쥐과 패밀리), 저빌, 가시 생쥐, 및 갈기생쥐로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
일부 구현예에서, 동물은 C57 배경의 마우스(예를 들어, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통)이다. 일부 구현예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택된 129 계통이다. 이들 마우스는, 예를 들어, 둘 모두 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Festing et al., Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10: 836 (1999) ; Auerbach et al., Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines (2000)]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 129 계통과 C57BL/6 계통의 혼합이다. 일부 구현예에서, 마우스는 129 계통의 혼합, 또는 BL/6 계통의 혼합이다. 일부 구현예에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 일부 구현예에서, 마우스는 BALB 계통과 또 다른 계통의 혼합이다. 일부 구현예에서, 마우스는 잡종 계통(예를 들어, 50% BALB/c-50% 12954/Sv; 또는 50% C57BL/6-50% 129)이다.
일부 구현예에서, 동물은 랫트이다. 랫트는 위스타 랫트(Wistar rat), LEA 계통, 스프래그 다우리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 랫트 계통은 위스타, LEA, 스프래그 다우리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 계통의 혼합이다.
동물은 하나 이상의 다른 유전적 변형, 및/또는 인간화 동물이 생산되는 특정 목적에 적합한 다른 변형을 가질 수 있다.
유전적으로 변형된 비-인간 동물은 내인성 비-인간 면역글로불린 유전자좌의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 인간 단백질의 적어도 일부를 인코딩하는 인간 핵산 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 인간 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인 서열에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일). 본원에 기재된 변형을 포함할 수 있는 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, ES 세포, 체세포)가 또한 제공되지만, 다수 구현예에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 동물의 생식계열에서 내인성 유전자좌의 변형을 포함한다.
유전적으로 변형된 동물은 내인성 마우스 유전자좌로부터 인간화 항체 및/또는 키메라 항체를 발현할 수 있고, 여기서 하나 이상의 내인성 마우스 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 유전자 서열(예를 들어, IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV 및/또는 IGKJ 유전자)과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 인간 면역글로불린 유전자 및/또는 뉴클레오티드 서열로 대체되었다. 다양한 구현예에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 유전자좌는 인간 핵산 서열을 포함하도록 전부 또는 일부 변형된다.
상술된 비-인간 포유동물에 대한 유전자, 분자 및 거동 분석이 수행될 수 있다. 본 개시는 또한 동일하거나 다른 유전자형과 교배된 본 개시에 의해 제공되는 비-인간 포유동물에 의해 생산된 자손에 관한 것이다. 비-인간 포유동물은 당분야에 공지된 임의의 비-인간 동물일 수 있으며, 이는 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 비-인간 포유동물은 포유동물(예를 들어, 설치류)이다. 일부 구현예에서, 비-인간 포유동물은 마우스이다.
본 개시는 또한 비-인간 포유동물 또는 이의 자손으로부터 유래된 세포주 또는 일차 세포 배양물을 제공한다. 세포 배양물을 기반으로 한 모델은, 예를 들어, 다음 방법에 의해 제조될 수 있다. 세포 배양물은 비-인간 포유동물로부터의 단리에 의해 얻어질 수 있고, 대안적으로 세포는 동일한 작제물 및 표준 세포 형질감염 기법을 이용하여 확립된 세포 배양물로부터 얻어질 수 있다. 인간 또는 인간화 면역글로불린을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 유전자 작제물의 통합은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다.
핵산 수준에서의 방법(역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 서던 블롯팅 및 동소 혼성화를 이용한 mRNA 정량 접근법 포함) 및 단백질 수준에서의 방법(조직화학, 면역블롯 분석 및 시험관내 결합 연구 포함)을 포함하여, 외인성 DNA 또는 게놈 DNA에 대한 변형을 검출하기 위해 사용될 수 있는 다수의 분석 방법들이 존재한다. 또한, 관심 대상의 유전자의 발현 수준은 당업자에게 널리 공지된 ELISA 기법에 의해 정량화될 수 있다. 정량적 측정을 완료하기 위해 다수의 표준 분석 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 전사 수준은 RNase 보호, 서던 블롯 분석, RNA 도트 분석(RNAdot) 분석을 포함하여 RT-PCR 및 혼성화 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색, 유세포 분석, 웨스턴 블롯 분석이 또한 인간 또는 인간화 단백질의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
항체 및 항원 결합 단편
본 개시는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 항체 및 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간화 항체 또는 키메라 항체)를 제공한다.
일반적으로, 항체(면역글로불린으로도 불림)는 두 부류의 폴리펩티드쇄, 경쇄 및 중쇄로 구성된다. 본 개시의 비-제한적 항체는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 온전한 네 개의 면역글로불린쇄 항체일 수 있다. 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA, 또는 IgD를 포함한 임의의 동형 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 등을 포함한 서브클래스일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄일 수 있다. 항체는 경쇄의 두 개의 동일한 카피 및 중쇄의 두 개의 동일한 카피를 포함할 수 있다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VH) 및 다중의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 함유하는 중쇄는 이들의 불변 도메인 내에 이황화 결합을 통해 서로 결합하여 항체의 "줄기"를 형성한다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, VL) 및 하나의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 함유하는 경쇄는 이황화 결합을 통해 각각 하나의 중쇄에 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 이것이 결합되는 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 경쇄와 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 보다 보존된 골격 영역(FR) 사이에 개재된 세 개의 초가변 영역을 함유한다.
상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 이러한 초가변 영역은 항체의 주요 항원 결합 표면을 포함하는 루프를 형성한다. 네 개의 골격 영역은 주로 베타-시트 형태를 채택하고, CDR은 베타-시트 구조를 연결하는, 그리고 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 사슬 내의 CDR은 골격 영역에 의해 매우 가깝게 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항원-결합 영역의 형성에 기여한다.
항체의 아미노산 서열을 분석함으로써 항체의 CDR 영역을 확인하기 위한 방법은 널리 공지되어 있으며, 다수의 CDR 정의가 일반적으로 이용된다. 카바트(Kabat) 정의는 서열 가변성을 기준으로 하고, 코티아(Chothia) 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기준으로 한다. 이들 방법 및 정의는, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan .1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)]에 기재되어 있다.
CDR은 항원의 에피토프를 인식하는 데 있어서 중요하다. 본원에서 사용되는 "에피토프"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자의 가장 작은 부분이다. 에피토프의 최소 크기는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산일 수 있지만, 이들 아미노산은 에피토프가 항원의 이차 및 삼차 구조를 기준으로 한 항원의 3-차원 배치에 좌우될 수 있기 때문에 항원의 일차 구조의 연속적인 선형 서열에 있을 필요가 없다.
일부 구현예에서, 항체는 온전한 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, IgA)이다. IgG 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)는 고도로 보존되고, 이들의 불변 영역, 특히, 이들의 힌지 및 상위 CH2 도메인이 상이하다. IgG 서브클래스의 서열 및 차이는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016]에 기재되어 있다.
항체는 또한 임의의 종(예를 들어, 인간, 설치류, 마우스, 랫트, 낙타과)로부터 유래된 면역글로불린 분자일 수 있다. 본원에 개시된 항체는 또한 다클론성, 단클론성, 단일특이성, 다중특이성 항체, 및 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 용어 "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 단편"은 온전한 항체, 즉, 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 부분, 즉, 온전한 항체의 표적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분이다. 이는, 예를 들어, Fab, Fab', F (ab')2, 및 이들 단편의 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, scFv, Fv, Fd, dAb, 이중특이성 항체, 이중특이성 scFv, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이성 항체, 및 항체 결합 도메인이거나 이에 상동성인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비-제한적 예는, 예를 들어, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개별 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부를 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 CD3-제타 막관통- 및 엔도도메인에 융합된 본원에 기재된 바와 같은 단쇄 가변 단편(scFv)의 융합체이다.
일부 구현예에서, scFV는 하나의 중쇄 가변 도메인, 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, scFV는 두 개의 중쇄 가변 도메인, 및 두 개의 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, scFV는 두 개의 항원 결합 영역을 갖고, 두 개의 항원 결합 영역은 각각의 표적 항원에 결합할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 생산된 항체 및 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간화 항체 또는 키메라 항체)은 다양한 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 요망되는 성질(예를 들어, 결합 친화성, 열 안정성, 및/또는 제한된 응집)을 얻기 위해 추가 최적화는 필요하지 않다.
일부 구현에서, 항체(또는 이의 항원-결합 단편)는 0.1 s-1 미만, 0.01 s-1 미만, 0.001 s-1 미만, 0.0001 s-1 미만, 또는 0.00001 s-1 미만의 해리 속도(koff)로 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 해리 속도(koff)는 0.01 s-1 초과, 0.001 s-1 초과, 0.0001 s-1 초과, 0.00001 s-1 초과, 또는 0.000001 s-1 초과이다.
일부 구현예에서, 운동 해리 속도(kon)는 1 Х 102/Ms 초과, 1 Х 103/Ms 초과, 1 Х 104/Ms 초과, 1 Х 105/Ms 초과, 또는 1 Х 106/Ms 초과이다. 일부 구현예에서, 운동 해리 속도(kon)는 1 Х 105/Ms 미만, 1 Х 106/Ms 미만, 또는 1 Х 107/Ms 미만이다.
친화도는 운동 속도 상수의 몫(KD=koff/kon)으로부터 추론될 수 있다. 일부 구현예에서, KD는 1 Х 10-6 M 미만, 1 Х 10-7 M 미만, 1 Х 10-8 M 미만, 1 Х 10-9 M 미만, 또는 1 Х 10-10 M 미만이다. 일부 구현예에서, KD는 50nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만이다. 일부 구현예에서, KD는 1 Х 10-7 M 초과, 1 Х 10-8 M 초과, 1 Х 10-9 M 초과, 1 Х 10-10 M 초과, 1 Х 10-11 M 초과, 또는 1 Х 10-12 M 초과이다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 또는 0.1 nM 이하의 KD로 표적에 결합한다.
일부 구현예에서, 열 안정성이 결정된다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 또는 95℃초과의 Tm을 가질 수 있다.
IgG는 다중-도메인 단백질로서 기재될 수 있으므로, 용융 곡선은 제1 변성 온도(Tm D1), 및 제2 변성 온도(Tm D2), 및 선택적으로 제3 변성 온도(Tm D3)로 종종 두 개의 전이, 또는 세 개의 전이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 또는 95℃초과의 Tm D1을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 또는 95℃초과의 Tm D2를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 또는 95℃초과의 Tm D3를 갖는다.
일부 구현예에서, Tm, Tm D1, Tm D2, Tm D3는 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 또는 95℃미만이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 온도가 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 또는 95℃미만일 때 응집을 형성하지 않는다.
유전적으로 변형된 동물을 생산하는 방법
유전적으로 변형된 동물은 인간화 항체 또는 키메라 항체를 발현할 수 있는 동물을 생산하도록 인간 면역글로불린 유전자를 비-인간 동물의 게놈에 도입함으로써 생산될 수 있다. 도 1a는 인간화 동물을 생산하는 방법을 나타낸 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 먼저 인간 염색체 상의 인간 면역글로불린 유전자좌를 변형시키는 단계를 포함한다. 변형된 인간 염색체는 이후 마우스 수용 세포에 도입된다. 인간 면역글로불린 가변 영역은 이후 직접 대체에 의해 마우스 게놈의 상응하는 영역에 도입된다. 그 후에, 수용 세포가 스크리닝된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 염색체를 함유하지 않는다. 세포는 이후 배반포에 주사되어 키메라 마우스를 생산한다. 온전한 인간화 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 마우스를 얻기 위해 후속적인 번식이 수행될 수 있다.
예를 들어, 비상동 말단-결합(NHEJ), 상동 재조합(HR), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터-기반 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR)-Cas 시스템을 포함하여 다른 여러 기법이 유전적으로 변형된 동물을 생산하는 데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동 재조합이 이용된다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas9 게놈 편집은 유전적으로 변형된 동물을 생산하는 데 이용된다. 다수의 이러한 게놈 편집 기법들은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[Yin et al., "Delivery technologies for genome editing," Nature Reviews Drug Discovery 16.6 (2017): 387-399]에 기재되어 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 핵을 제핵된 난모세포에 미량주사하고, 제핵된 난모세포를 또 다른 유전적으로 변형된 세포와 융합하는 것과 같은 다수의 다른 방법들이 또한 게놈 편집에 제공되고 사용될 수 있다.
유전적 변형 과정은 상동 재조합에 의해 내인성 서열을 인간 서열로 대체하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위 상류 및 하류에서의 절단(예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR에 의해)은 DNA 이중 가닥 절단을 일으킬 수 있고, 상동 재조합은 내인성 서열을 인간 서열로 대체하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 인간화 동물을 생산하기 위한 방법은 내인성 유전자좌(또는 부위)에서 핵산(예를 들어, V, D, J 영역, 또는 V, J 영역)을 인간 서열의 상응하는 영역으로 대체하는 단계를 포함할 수 있다. 서열은 IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV, 및/또는 IGKJ 유전자의 영역(예를 들어, 일부 또는 전체 영역)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대체는 상동 재조합에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 대체는 Cre 재조합효소에 의해 매개된다.
도 9는 인간 염색체에 기능성 유전적 요소를 부가하기 위한 표적화 전략을 나타낸 것이다. 이러한 벡터는 V 영역의 상류에서 J 영역과 C 영역 사이에 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, 적색 형광 단백질 리포터 유전자(tdTomato), FMDV(구제역 바이러스) 자가-절단 펩티드(2A), 제오마이신 내성 유전자(Zeo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), LoxP 인식 서열, 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "3'HygR") 및 Flp 인식 표적("FRT"), 하류 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA 유전자.
제2 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, LoxP 인식 서열, PGK 프로모터, 퓨로마이신(Puromycin) 내성 유전자의 부분 서열(5'PuroR), 인간 연장 인자 1 알파로부터의 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), 피기백(piggyBac) 트랜스포사제 유전자 서열(PBase), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열, 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
이들 벡터는 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 세포는 약물 내성 마커 또는 이들의 조합(예를 들어, 제오신, G418, 및/또는 퓨로마이신)에 의해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, PB 트랜스포사제는 발현되고, 트랜스포사제 표적 서열 사이의 유전적 요소는 결실될 수 있다.
일부 구현예에서, 이들 벡터는 변형된 인간 염색체에 통합된다. 인간 염색체는 제1 및 제2 벡터가 게놈에 통합되기 전에 먼저 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 벡터가 필요에 따라 염색체의 다양한 위치에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 C 영역과 동원체 사이에 첨가된다. 제3 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 가질 수 있다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 서열(PuroR), 티미딘 키나제 유전자 서열(TK), LoxP 인식 서열, PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(5'PuroR), 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), PBase, IRES, Neo, 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열, 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA. 일부 구현예에서, 이들 벡터는 가변 유전자 영역 또는 불변 영역에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 가변 유전자 영역 또는 내인성 불변 영역의 일부는 결실된다. 일부 구현예에서, 염색체의 큰 단편은 결실된다(예를 들어, 불변 영역과 동원체 사이). 세포는 또한 Cre 효소로 처리되어 loxP 부위의 재조합으로 이어지고, 이에 의해 인간 14번 염색체 상의 J 영역과 동원체 사이에 또는 인간 14번 염색체 상의 C 영역과 동원체 사이에 게놈 DNA 서열을 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 자발적 염색체 손상이 발생할 수 있다. 요망되는 염색체 손상을 갖는 변형된 인간 염색체는 실험용으로 선택될 수 있다.
인간 염색체는 인간 세포주, 암세포, 일차 세포 배양물, 및/또는 인간 섬유아세포로부터 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 세포는 제1 벡터와 함께 도입되고, 이후 수용 세포와 융합된다. 변형된 염색체는 이후 분리되고 또 다른 적절한 수용 세포에 도입된다. 요망되는 내성을 갖는 세포는 단지 하나의 인간 염색체만을 함유하는 세포를 얻도록 선택된다. 이후, 제2 벡터가 세포에 도입되고, 세포는 내성에 의해 선택된다. 그 후에, 필요 시, 제3 벡터, 및/또는 제4 벡터가 도입될 수 있다. 수용 세포는 포유동물 세포, 인간 세포, 또는 마우스 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용 세포는 CHO 세포, 또는 바람직하게는 A9 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 염색체는 형광에 의해 표지되고 분리된다. 그리고, 변형된 염색체는 염색체 미량주사에 의해 수용 세포에 주사된다. 일부 구현예에서, 공여 세포는 이들의 염색체를 다핵화시키도록 유도된다. 이들 핵은 이후 세포막을 통해 미세세포를 형성하도록 유도되고, 미세세포는 수용 세포에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 미세세포-매개된 염색체 이식이 또한 이용될 수 있다. 염색체 조작 기법은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 CN1200014A; CN109837307A; US20120093785A1; 및 US2009253902; 문헌[Kuroiwa et al. "Manipulation of human minichromosomes to carry greater than megabase-sized chromosome inserts." Nature Biotechnology 18.10 (2000) ): 1086-1090; Chinese patent CN1717483A; Paulis, Marianna. "Chromosome Transfer Via Cell Fusion." Methods in Molecular Biology 738(2011):57; Genes, Chromosomes & Cancer 14: 126127 (1995); Tomizuka et al. "Functional expression and germline atransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice." Nature Genetics 16.2 (1997): 133-143; Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 13, No. 3, 1987, pp. 279-284]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 변형은 마우스 염색체에 대해 이루어질 수 있다. 표적화 전략은 도 4에 나타나 있다. 제1 벡터는 삽입 부위 상류 및 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 LoxP 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, Flp 인식 표적(FRT), CAG 프로모터, 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "5'HygR"), LoxP, FRT, 5'PB 트랜스포손 서열(PB5'), PGK 프로모터, 청색 형광 단백질 리포터 유전자(BFP), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제; HygR), 3'PB 트랜스포손 서열(PB3'), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
제2 벡터는 삽입 부위 상류 및 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 LoxP 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 5'PB 트랜스포손 서열(PB5'), PGK 프로모터, 녹색 형광 단백질 리포터 유전자 서열(EGFP), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 퓨로마이신 내성 유전자 서열(PuroR), 3'PB 트랜스포손 서열(PB3'), Flp 인식 표적(FRT), 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(3'PuroR), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), DT 수용체(DTR), LoxP 인식 서열, 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
도 30은 카파 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 위한 유사한 표적화 전략을 나타낸 것이다. 두 개의 벡터가 먼저 인간 염색체에 통합될 수 있다. 제1 벡터는 삽입 부위 상류 및 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 LoxP 인식 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, tdTomato, FMDV 자가-절단 펩티드(2A), Bsr, 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열, LoxP 인식 서열, 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "3'HygR"), FRT, 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
제2 벡터는 삽입 부위 상류 및 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 LoxP 인식 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 벡터는 5'에서 3'로 다음 중 하나 이상을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, LoxP 인식 서열, PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 서열의 일부(5'PuroR), EF-1a, PBase, IRES, Neo, 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열, 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
LoxP 인식 서열은 또한 인간 염색체(예를 들어, 인간 2번, 14번, 22번 염색체)에 첨가될 수 있다. 세포는 또한 Cre 효소로 처리되어 loxP 부위의 재조합으로 이어지고, 이에 의해 게놈 DNA 서열을 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 자발적 염색체 손상이 마찬가지로 게놈 DNA 서열을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌 상의 변형이 직접적으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 전체 마우스 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 대체하기 위해 직접적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 벡터는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, Flp 인식 표적(FRT), 인간 연장 인자 1 알파로부터의 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "5'HygR"), Cre 재조합효소에 대한 LoxP 인식 서열, 5'PB 트랜스포손 서열(PB5'), 청색 형광 단백질 리포터 유전자(BFP), DT 수용체(DTR), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), 3'PB 트랜스포손 서열(PB3'), 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(3'PuroR), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), DT 수용체(DTR), Cre 재조합효소에 대한 LoxP 인식 서열, 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
마우스 면역글로불린 가변 영역은 대체(예를 들어, 상동 재조합, 또는 Cre 매개 재조합)에 의해 인간 면역글로불린 가변 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Cre 재조합은 대체를 매개하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 LoxP 인식 서열을 인간 염색체에 첨가할 수 있다. 유사한 변형이 마우스 염색체에 대해 이루어질 수 있고, 여기서 두 개의 LoxP 인식 서열이 염색체에 첨가될 수 있다. 예를 들어, Cre 재조합효소는 이후 마우스 염색체 상의 V, J 영역의 인간 염색체 상의 V, J 영역으로의 대체 또는 마우스 염색체 상의 V, D, J 영역의 인간 염색체 상의 V, D, J 영역으로의 대체를 매개할 수 있다.
세포는 추가로 인간 염색체를 갖지 않는 세포에 대해 스크리닝될 수 있다(예를 들어, DT에 의해). 일부 경우에, DT에 의해 스크리닝되지 않은 세포는 재조합 인간 염색체 단편을 함유할 수 있지만, 이들 단편은 작고, 마우스 세포에서 불안정하며(예를 들어, 문헌[Shinohara et al. (2000) Chromosome Research, 8: 713 -725]), 세포 증식 중에 자연적으로 사라질 것이다. 일부 구현예에서, 변형된 인간 염색체의 큰 단편은, 예를 들어, Cre-매개 결실에 의해 또는 자발적 염색체 손상에 의해 결실된다.
5' 말단 상동성 아암 및/또는 3' 말단 상동성 아암은 상동 재조합을 용이하게 하기 위해 요망되는 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 아암은 약 또는 적어도 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 또는 50 kb(예를 들어, 약 3kb)이다. 일부 구현예에서, 상동성 아암은 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 또는 50 kb 미만이다.
일부 구현예에서, 벡터는 또한 선택적으로 리포터 단백질, 예를 들어, 루시페라제(예를 들어, Gluc) 또는 형광 단백질(예를 들어, EGFP, BFP 등)을 포함할 수 있다.
이들 변형은 다양한 세포에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 또는 수정란 세포이다.
본 개시는 추가로 하기 단계들을 포함하는 인간화 동물 모델을 확립하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 본원에 기재된 방법을 기초로 세포(예를 들어, 수정란 세포)를 제공하는 단계;
(b) 액체 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계;
(c) 배양된 세포를 수용자 암컷 비-인간 포유동물의 나팔관 또는 자궁에 이식하여 세포가 암컷 비-인간 포유동물의 자궁에서 발달할 수 있게 하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 임신한 암컷의 유전적으로 변형된 인간화 비-인간 포유동물 자손에서 생식선 전이를 확인하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 방법에서 비-인간 포유동물은 마우스(예를 들어, C57 마우스, BALB/c 마우스, 또는 C57BL/6 마우스)이다.
일부 구현예에서, 단계 (c)에서 비-인간 포유동물은 가성 임신(또는 거짓 임신)한 암컷이다.
일부 구현예에서, 상술된 방법을 위한 수정란은 C57BL/6 수정란이다. 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 또한 사용될 수 있는 다른 수정란은 FVB/N 수정란, BALB/c 수정란, DBA/1 수정란 및 DBA/2 수정란을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
수정란은 임의의 비-인간 동물, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 비-인간 동물로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 수정란 세포는 설치류로부터 유래된다. 유전자 작제물은 DNA의 미량주사에 의해 수정란에 도입될 수 있다. 예를 들어, 미량주사 후 수정란을 배양함으로써, 배양된 수정란은 거짓 임신 비-인간 동물로 이식될 수 있고, 이는 이후 비-인간 포유동물을 출산하여, 상술된 방법에서 언급된 비-인간 포유동물을 생산할 수 있다.
내인성 비-인간 유전자좌로부터 인간화 또는 키메라 항체를 발현하는 세포, 조직, 및 동물(예를 들어, 마우스)뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포, 조직, 및 동물(예를 들어, 마우스)이 또한 제공될 수 있다.
본 개시는 또한 다양한 표적화 벡터(예를 들어, 유전적으로 변형된 동물을 생산하는 데 유용한 벡터)를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 a) 변경될 영역의 5' 말단에 상동성인 DNA 단편(5' 상동성 아암); b) 요망되는 유전적 요소를 포함하는 서열(예를 들어, LoxP 인식 부위, 약물 내성 유전자, 및/또는 리포터 유전자 등); 및 c) 변경될 영역의 3' 말단에 상동성인 제2 DNA 단편(3' 상동성 아암)을 포함할 수 있다. 본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 세포에서 유전자는 이형접합성이다. 일부 구현예에서, 세포에서 유전자는 동형접합성이다.
일부 구현예에서, 비-인간 포유동물 세포는 마우스 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 수정란 세포이다.
본 개시는 추가로 둘 이상의 인간 또는 키메라 유전자를 갖는 유전적으로 변형된 동물 모델을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 동물은 하나 이상의 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌 및 추가의 인간 또는 키메라 단백질을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 인간 또는 키메라 단백질은 세포 예정사 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 림프구 활성화 3(LAG-3), B 및 T 림프구 관련(BTLA), 세포 예정사 1 리간드 1(PD-L1), CD27, CD28, CD47, CD137, CD154, Ig 및 ITIM 도메인으로의 T-세포 면역수용체(TIGIT), T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM-3), 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질(GITR), 또는 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4 또는 OX40)일 수 있다.
추가의 인간 또는 키메라 유전자(예를 들어, 인간화 유전자)를 갖는 유전적으로 변형된 동물 모델을 생산하는 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다:
(a) 본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 얻는 단계;
(b) 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 또 다른 유전적으로 변형된 비-인간 동물과 교배한 후, 자손을 스크리닝하여 둘 이상의 인간 또는 키메라 유전자를 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 얻는 단계.
일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (b)에서, 유전적으로 변형된 동물은 인간 또는 키메라 PD-1, CTLA-4, LAG-3, BTLA, PD-L1, CD27, CD28, CD47, CD137, CD154, TIGIT, TIM-3, GITR, SIRPa, 또는 OX40을 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물과 교배될 수 있다. 이러한 유전적으로 변형된 비-인간 동물들 중 일부는, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/CN2017/090320, PCT/CN2017/099577, PCT/CN2017/099575, PCT/CN2017/099576, PCT/CN2017/099574, PCT/CN2017/106024, PCT/CN2017/110494, PCT/CN2017/110435, PCT/CN2017/120388, PCT/CN2018/081628, PCT/CN2018/081629에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 인간 ADAM6 유전자, 내인성 ADAM6 유전자 또는 변형된 ADAM6 유전자를 가질 수 있다. ADAM6 단백질은 단백질의 ADAM 패밀리의 일원이며, 여기서 ADAM은 디스인테그린 및 메탈로프로테아제(A Disintegrin And Metalloprotease)의 두문자어이다. 일반적으로 인간 IGHV 유전자 IGHV1-2와 IGHV6-1 사이에 발견되는 인간 ADAM6 유전자는 위유전자이다(도 37). 마우스에는 두 개의 ADAM6 유전자인 ADAM6a와 ADAM6b가 있다. 이들은 마우스 IGHV와 IGHD 유전자 클러스터 사이의 유전자간 영역에 위치한다. 마우스 ADAM6a는 마우스 IGHV5-1과 마우스 IGHD5-1 사이에 위치한다. 마우스 ADAM6b는 마우스 IGHD3-1과 마우스 IGHD1-1 사이에 위치한다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 인간 ADAM6 유전자를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 내인성 ADAM6 유전자를 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 마우스이다. 일부 구현예에서, 마우스는 ADAM6 단백질(예를 들어, ADAM6a 또는 ADAM6b)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 서열은 임의의 적합한 위치에 배치된다. 이는 유전자간 영역에, 또는 게놈내 임의의 적합한 자리에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 마우스 ADAM6a 유전자(예를 들어, NC_000078.6의 113539230-113547024; SEQ ID NO: 53) 또는 마우스 ADAM6b 유전자(예를 들어, NC_000078.6의 113486188-113492125; SEQ ID NO: 54)와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 추가적으로 ADAM6a 유전자와 ADAM6b 유전자에 대한 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능적인 마우스 ADAM6 유전자좌는 인간 IGHV 유전자 클러스터의 중간에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 마우스 ADAM6 유전자좌는 두 개의 인간 IGHV 유전자 사이에 있다. 일부 구현예에서, 인간 VH1-2와 인간 VH(II)-1-1 사이의 인간 ADAM6 위유전자는 마우스 ADAM6 유전자좌로 대체된다. 일부 구현예에서, ADAM6a 유전자 및 ADAM6b 유전자는 동물의 게놈에서 인간 IGHV1-2와 인간 VH(II)-1-1 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 인간 유전자 서열내 마우스 ADAM6 서열의 위치는 인간 ADAM6 위유전자의 자리에 근사할 수 있거나, 마우스 ADAM6 서열의 자리(예를 들어, V-D 유전자간 영역 내)에 근사할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는다. 일부 구현예에서, 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b는 인간 IGHV1-2와 IGHV6-1 유전자 사이에 위치한다. 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b를 인간 IGHV1-2와 IGHV6-1 유전자 사이에 배치하는 것은 다양한 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 이들 유전자는 동일한 유전자좌에서 인간 ADAM6 유전자를 대체하기 때문에, 인간 ADAM6 유전자의 대체는 VDJ 재조합에 대한 제한된 영향을 가질 가능성이 있고, 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 유전자가 또한 적절하게 기능할 수 있다(내인성 유전자좌와 유사한 위치에서와 같이).
따라서, 일 양태에서, 본 개시는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 하나 이상의 인간 IGHV 유전자를 포함하는 제1 서열; ADAM6 유전자를 포함하는 제2 서열; 및 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 제3 서열을 포함하는 유전적으로-변형된 동물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 서열, 제2 서열, 및 제3 서열은 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 제1 서열은 IGHV2-10, IGHV3-9, IGHV1-8, IGHV(II)-1-1, 및 IGHV6-1을 제외하고 표 1에서의 모든 인간 IGHV 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 IGHV5-10-1 및 IGHV3-64D, IGHV(II)-1-1, 및 IGHV6-1을 제외하고 표 1에서의 모든 인간 IGHV 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열이다.
일부 구현예에서, 제2 서열은 마우스 ADAM6a 유전자 및 마우스 ADAM6b 유전자 중 하나 또는 이 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 생식력 있는 수컷 마우스이다. 일부 구현예에서, 제2 서열은 마우스 ADAM6a 유전자 또는 마우스 ADAM6b 유전자를 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 제3 서열은 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 인간 IGHV6-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 인간 IGHV(II)-1-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열이다.
일부 구현예에서, AMAM6a 및/또는 ADAM6b는 내인성 서열이다. 일부 구현예에서, AMAM6a 및/또는 ADAM6b는 대체되지 않고/않거나, 이의 내인성 또는 본래 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 마우스 IGHV1-2 이전의 마우스 IGHV 유전자는 인간 IGHV 유전자로 대체된다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 마우스 IGHV6-1 이후의 마우스 IGHV, IGHD 및 IGHJ 유전자는 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, IGHD 및/또는 IGHJ 유전자로 대체된다.
따라서, 일부 구현예에서, 마우스 IGHV, IGHD 및 IGHJ 유전자는 하나보다 많은 대체에 의해 인간 IGHV, IGHD 및 IGHJ로 대체될 수 있다. 첫 번째 단계에서, ADAM6a의 5' 측에서 선택된 수의 마우스 IGHV 유전자(예를 들어, 표 4에서의 모든 마우스 IGHV 유전자)가 인간 IGHV 유전자로 대체된다. 두 번째 단계에서, ADAM6b의 3' 측에서 선택된 수의 마우스 IGHD 및 IGHJ 유전자(예를 들어, IGHD5-1 및 IGHD3-1을 제외한 표 5에서의 모든 마우스 IGHD 유전자 및 표 6에서의 모든 IGHJ 유전자)는 인간 IGHD 및 인간 IGHJ 유전자로 대체된다. 대체는 상동 재조합 또는 Cre-매개 재조합에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 마우스는 마우스 ADAM6a 또는 ADAM6b 유전자를 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 마우스는 인간 ADAM6 유전자를 갖는다.
마우스의 생식력을 증가시키기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 과배란이 있는 암컷 마우스가 교배에 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관내 수정이 이용될 수 있다. 과배란은 혈청 고나도트로핀 및 융모막 고나도트로핀(예를 들어, 인간 또는 마우스 CG)을 성숙 암컷 마우스에 주사함으로써 유도될 수 있다. 성숙 수컷 마우스는 희생될 수 있으며, 이의 꼬리 부고환이 분리될 수 있다. 꼬리 부고환의 관은 정자를 방출하도록 절개된다. 다음으로, 과배란 성숙 암컷 마우스는 희생될 수 있고, 난관이 분리될 수 있다. 축적-난모세포-복합체(COC)가 난관으로부터 방출될 수 있다. 다음으로, 정자 현탁액이 COC에 첨가되고, 수정을 위해 인큐베이션될 수 있다. 하나의 전핵만을 함유하는 병원성 난모세포는 제거될 수 있다. 인큐베이션 후, 2-세포기의 배아는 수용 암컷에게 이식될 수 있다. 마우스 생식력을 증가시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 임의의 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 500개, 또는 600개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개, 300개, 350개, 또는 400개 미만의 아미노산 잔기이다.
일부 구현예에서, 아미노산 서열은 (i) 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 아미노산 서열로 이루어지며, 이 때 아미노산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 서열 중 어느 하나이다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 (i) 핵산 서열을 포함하거나; (ii) 핵산 서열로 이루어지며, 이 때 핵산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 서열 중 어느 하나이다.
두 개의 아미노산 서열, 또는 두 개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 이 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열이 비교 목적에 무시될 수 있음). 비교 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 80%이고, 일부 구현예에서 적어도 90%, 95%, 또는 100%이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 이후 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그러한 위치에서 동일하다(본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 같음). 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 본 발명의 목적 상, 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 12의 갭 페널티, 4의 갭 확장 페널티, 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 달성될 수 있다.
유사한 물리화학적 성질(상동성 퍼센트)로 보존된 잔기, 예를 들어, 류신 및 이소류신의 백분율이 또한 서열 유사성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 유사한 물리화학적 성질을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는, 예를 들어, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하성 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 상동성 백분율은, 다수 경우에, 동일성 백분율보다 높다. 따라서, 본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 아미노산 서열, 또는 이들 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 대해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 제공한다.
유전적으로 변형된 동물을 사용하는 방법
유전적으로 변형된 동물은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 또는 키메라 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적(예를 들어, 단백질 또는 단백질의 단편)은 다클론성 및 단클론성 항체 제조를 위한 표준 기법을 이용하여 이러한 동물들에서 항체를 생성하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 동물이 항원에 특이적인 항체를 생산하게 할 수 있는 시간 동안, 그러한 조건 하에 선택된 항원에 노출된다.
다클론성 항체는 항원 펩티드 또는 단백질의 다회 주사(예를 들어, 피하 또는 복강내 주사)에 의해 동물에서 발생될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 펩티드 또는 단백질은 적어도 하나의 애주번트와 함께 주사된다. 일부 구현예에서, 항원 펩티드 또는 단백질은 면역화될 종에서 면역원성인 작용제에 접합될 수 있다. 동물에게 항원 펩티드 또는 단백질이 1회 초과(예를 들어, 2회, 3회, 또는 4회) 주사될 수 있다.
전장 폴리펩티드 또는 단백질이 사용될 수 있거나, 대안적으로, 이의 항원 펩티드 단편이 면역원으로서 사용될 수 있다. 단백질의 항원 펩티드는 아미노산 서열의 적어도 8개(예를 들어, 적어도 10개, 15개, 20개, 또는 30개)의 아미노산 잔기를 포함하고, 펩티드에 대해 발생된 항체가 단백질과 함께 특이적 면역 복합체를 형성하도록 단백질의 에피토프를 포괄한다.
면역원은 전형적으로 적합한 대상체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 동물)를 면역화시킴으로써 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어, 재조합으로 발현된 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드(예를 들어, 단백질의 단편)를 함유할 수 있다. 제제는 추가로 애주번트, 예컨대, 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 애주번트, 또는 유사한 면역자극제를 포함할 수 있다.
다클론성 항체는 면역원으로서 폴리펩티드, 또는 이의 항원 펩티드(예를 들어, 단백질의 일부)로 적합한 대상체를 면역화시킴으로써 상술된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 대상체에서 항체 역가는 고정된 폴리펩티드 또는 펩티드를 사용하여 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 표준 기법에 의해 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 요망되는 경우, 항체 분자는 포유동물로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 단리되고, 단백질 G 중 단백질 A 크로마토그래피와 같이 널리 공지된 기법에 의해 추가로 정제되어 IgG 분획을 얻을 수 있다. 면역화 후 적절한 시간에, 예를 들어, 특이성 항체 역가가 최고일 때, 항체-생산 세포가 대상체로부터 얻어지고, 표준 기법, 예컨대, 문헌[Kohler et al. (Nature 256:495-497, 1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(문헌[Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983]), EBV-하이브리도마 기법(문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985]), 또는 트리오마 기법에 의해 단클론성 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마를 생산하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다(일반적으로, 문헌[Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조). 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 이용하여 관심 대상의 폴리펩티드 또는 에피토프를 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출된다.
일 양태에서, 본 개시는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 마우스를 제공하고, 여기서 마우스는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되는 재배열된 면역글로불린 서열을 포함하는 B 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 면역글로불린 서열은 인간 중쇄 V, D, 및/또는 J 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 또는 마우스 중쇄 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 내인성 면역글로불린 경쇄(예를 들어, 카파 또는 람다) 유전자좌의 변형을 포함하는 마우스를 제공하고, 여기서 마우스는 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되는 재배열된 면역글로불린 서열을 포함하는 B 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 면역글로불린 서열은 인간 경쇄 V 및/또는 J 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 인간 또는 마우스 경쇄 불변 영역을 포함한다.
마우스 B 세포 또는 비장 세포는, 예를 들어, 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 재배열된 비-마우스 면역글로불린 가변 유전자 서열을 포함할 수 있다. 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하기 위한 서열이 결정된다. 서열은, 예를 들어, 관심 대상의 하이브리도마 또는 B 세포를 서열화함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 B 세포 스크리닝이 사용된다. 이는 하이브리도마 융합 및 조합 디스플레이에 대한 필요 없이 천연 항체 레퍼토리를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, B 세포는 항원 바코드(들)와 개별 B 세포의 B-세포 수용체(BCR) 서열 둘 모두가 단일-세포 서열화 프로토콜을 통해 회수되도록 DNA-바코드 항원의 패널과 혼합될 수 있다.
항체는 추가로, 예를 들어, 인간 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 인간 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결하고/연결하거나, 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결함으로써 인간화 항체 또는 인간 항체를 얻도록 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 마우스가 관심 대상의 항원과 매우 유사한 단백질을 발현하는 경우, 마우스에서 면역 반응을 유발하는 것이 어려울 수 있다. 이는 면역 세포 발달 동안 자기-기원의 펩티드에 결합된 NHC 분자를 인식하는 B-세포와 T-세포가 면역 세포의 레퍼토리로부터 결실되기 때문이다. 그러한 경우에, 인간화 마우스는 추가로 변형될 수 있다. 마우스에서 상응하는 유전자는 녹 아웃될 수 있고, 마우스는 이후 관심 대상의 항원에 노출된다. 마우스는 유전자 산물에 대한 음성 선택을 거치지 않기 때문에, 마우스는 용이하게 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있다.
본 개시는 또한 항체, 핵산, 세포, 조직(예를 들어, 비장 조직)을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 동물을 항원에 노출시키는 단계를 포함한다. 항체(예를 들어, 하이브리드 항체), 항체를 인코딩하는 핵산, 세포, 및/또는 조직(예를 들어, 비장 조직)이 동물로부터 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 서열화에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 인간 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 함유하는 세포가 배양되고, 항체가 수집된다.
일부 구현예에서, 마우스 면역글로불린 V, D, J 유전자(예를 들어, 마우스 IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV, 또는 IGKJ 유전자)는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열에 기여하지 않는다. 일부 구현예에서, 동물에 의해 생산된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열은 완전 인간이고, 인간 면역글로불린 V, D, J 유전자(예를 들어, 인간 IGHV, IGHD, IGHJ, IGKV, 및 IGKJ 유전자)가 이에 전적으로 기여한다.
본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 본원에 기재된 인간, 인간화, 또는 키메라 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 DNA에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 항체의 항원-결합 부위 또는 항원-결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열내 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환을 포함한다. 그러한 변이체의 집단에서, 일부 항체 또는 항원-결합 단편은 표적 단백질에 대한 증가된 친화성을 가질 것이다. 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 도달하도록 결실, 삽입, 및/또는 조합의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편에 도입된 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수의 변화(예를 들어, 증가 또는 감소), 글리코실화 부위의 유형 변화(예를 들어, 세포에 존재하는 효소에 의해 상이한 당이 부착되도록 아미노산 서열 변화), 또는 새로운 글리코실화 부위 도입과 같이, 항체 또는 항원-결합 단편에 새로운 번역후 변형을 변경하거나 도입할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 포유동물을 포함한 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 네이티브 항체의 비제한적 예는 인간, 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 유인원, 소, 돼지, 말, 양, 낙타류(예를 들어, 낙타 및 라마), 닭, 염소, 및 인간 항체를 생산하도록 유전적으로 조작된 트랜스제닉 설치류를 비롯한 설치류(예를 들어, 랫트, 마우스, 햄스터 및 토끼)로부터 유래된 항체를 포함한다.
인간 및 인간화 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는(또는 이로부터 유래된 것들과 동일한 아미노산 서열을 갖는) 항체를 포함한다. 인간 항체는, 예를 들어, CDR에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편에 대해 추가 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역에 도입되고, 이에 의해 이러한 영역에서 쇄간 이황화 결합 형성을 가능하게 할 수 있다. 이에 따라 생성된 동종이량체 항체는 시험관내 및/또는 생체내에서 임의의 증가된 반감기를 가질 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내에서 증가된 반감기를 갖는 동종이량체 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Wolff et al. (Cancer Res. 53:2560-2565, 1993)]에 기재된 바와 같은 이종이작용성 가교제를 이용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989] 참조).
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 공유 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 공유 변형은 화학적 또는 효소적 합성에 의해, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 다른 유형의 공유 변형이 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 항체 또는 단편의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 분자에 도입된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되며, 하기 실시예는 청구항에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: 개요
마우스 게놈에 인간 면역글로불린 유전자를 도입하여 인간화 항체를 발현하는 마우스를 생산하기 위한 실험을 수행하였다. 도 1a는 인간화 마우스를 제조하는 방법을 나타낸 것이다. 상기 방법은 먼저 인간 염색체 상의 인간 면역글로불린 영역을 변형시키는 단계를 포함한다. 변형된 인간 염색체를 이후 마우스 수용 세포에 도입하였다.
마우스 면역글로불린 가변 영역을 직접 대체(예를 들어, 상동 재조합, 또는 Cre 매개 재조합)에 의해 인간 면역글로불린 가변 영역으로 대체하였다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린 가변 영역은 단계적 접근에 의해 마우스 게놈에 도입될 수 있다. 그 후에, 수용 세포를 올바른 대체에 대해 스크리닝하였다. 세포를 이후 배반포에 주사하여 키메라 마우스를 생산하였다. 후속적인 번식을 수행하여 온전한 인간 면역글로불린 가변 영역을 함유하는 마우스를 얻었다.
마우스 중쇄 유전자 및 두 개의 경쇄 유전자는 각각 12번, 6번, 및 16번 염색체에 위치하기 때문에, 인간 중쇄 가변 영역 또는 인간 경쇄 가변 영역을 함유하는 마우스가 개별적으로 생산될 수 있다(도 1b 및 도 1c). 이들 마우스는 이후 인간 중쇄 가변 도메인과 인간 경쇄 가변 도메인 둘 모두를 발현할 수 있는 마우스를 얻도록 서로 교배될 수 있다.
실시예 2: 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 변형
중쇄 면역글로불린 유전자좌는 마우스 12번 염색체 상에 위치한다. 도 2는 마우스 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다. 두 개의 재조합 부위(1301, 1302)를 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입하였고, 얻어진 변형된 염색체는 도 3a 내지 도 3b에 나타나 있다. 이들 중 하나는 야생형 loxP 부위이고, 다른 것은 이종특이성 돌연변이체 lox 부위이다(lox2272). 재조합은 야생형 loxP 부위와 이종특이성 돌연변이체 lox 부위 사이에서 발생할 수 없다. 마우스 배아 줄기 세포에서 변형을 수행하였다. 표적화 전략의 개요는 도 4에 나타나 있다. 벡터(V1401)는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, Flp 인식 표적(FRT), CAG 프로모터, 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "5'HygR"), LoxP (1301), FRT, 5'PB 트랜스포손 서열(PB5'), PGK 프로모터, 청색 형광 단백질 리포터 유전자(BFP), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제; HygR), 3'PB 트랜스포손 서열(PB3'), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
벡터(V1402)는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 5'PB 트랜스포손 서열(PB5'), PGK 프로모터, 녹색 형광 단백질 리포터 유전자 서열(EGFP), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 퓨로마이신 내성 유전자 서열(PuroR), 3'PB 트랜스포손 서열(PB3'), Flp 인식 표적(FRT), 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(3'PuroR), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), DT 수용체(DTR), LoxP 인식 서열(1302), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
벡터(V1401 및 V1402)를 마우스 배아 줄기 세포에 도입하였다. 그 후에, 세포를 히그로마이신 B 및 퓨로마이신에 의해 스크리닝하였다. 외인성 유전자의 마우스 게놈으로의 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 결과는 도 5a 내지 도 5b 및 도 6a 내지 도 6b에 나타나 있다. 030, 035, 036 및 037로 번호부여된 클론은 양성인 것으로 확인되었다.
하기 프라이머를 사용하여 PCR 검정을 수행하였다:
이들 프라이머 중, mIgHV-5'loxP-L-GT-F 및 mIgHV-5'loxP-R-GT-R은 마우스 염색체 상에 위치하고, mIGHV-005-L-GT-R2 및 mIGHV-005-5'loxP-R-GT-F2는 벡터(1401) 상에 위치하고, mIGHV-3'lox-L-GT-F2 및 mIGHV-3'lox-R-GT-R1은 마우스 염색체 상에 위치하고, mIGHV-3'lox-L-GT-R2 및 mIGHV3'lox-R-GT-F2는 벡터(1402) 상에 위치한다.
실시예 3: 인간 14번 염색체 변형
실험의 목적은 적어도 두 개의 재조합 부위가 있는 변형된 인간 염색체를 생성하는 것이다. 두 개의 재조합 부위를 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양측에 도입하였다.
중쇄 면역글로불린 유전자좌는 인간 14번 염색체 상에 위치한다. 도 7은 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 강조하는 인간 14번 염색체의 개략도이다.
변형된 인간 가변 영역은 도 8에 나타나 있다. 표적화 전략의 개요는 도 9에 나타나 있다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 301 및 302 부위는 재조합 부위이다. 재조합 부위(1301)와 재조합 부위(301)는 동일하다. 재조합 부위(1302)와 재조합 부위(302)는 동일하다.
V 영역의 상류에서, 그리고 J 영역과 C 영역 사이에서 인간 14번 염색체에 벡터를 삽입하는 실험을 수행하였다. 5'에서 3'로의 제1 표적화 벡터(V401)는 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, 적색 형광 단백질 리포터 유전자(tdTomato), FMDV(구제역 바이러스)로부터의 자가-절단 펩티드(2A), 제오신 내성 유전자 서열(Zeo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), Cre 재조합효소에 대한 LoxP 인식 서열(301), 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "3'HygR") 및 Flp 인식 표적("FRT"), 하류 DNA 상동성 아암 서열, 및 디프테리아 독소 서브유닛 A(DTA) 유전자.
5'에서 3'로의 제2 벡터(V402)는 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, Cre 재조합효소에 대한 LoxP 인식 서열(302), PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자의 부분 서열(5'PuroR), 인간 연장 인자 1 알파로부터의 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), 피기백 트랜스포사제 유전자 서열(PBase), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
일부 실험에서, 벡터(V401, V402)를 세포에 도입하고, 세포를 적절한 약물 내성 마커 또는 이들의 조합(제오신, G418)에 의해 선택하였다.
인간 염색체에 관심 대상의 벡터를 도입하기 위한 다수 방법이 존재한다. 인간 염색체는 인간 세포주, 암세포, 일차 세포 배양물, 및/또는 인간 섬유아세포로부터 얻어질 수 있다. 하나의 실험에서, 제1 벡터가 염색체에 도입된다. 변형된 염색체는 수용 세포에 첨가될 수 있고, 이후 제2 벡터는 변형된 염색체에 삽입될 수 있다. 일부 실험에서, V401를 먼저 인간 세포에 도입한 후, 염색체를 형광으로 표지하고, 그 다음 분리하고, 이후 변형된 염색체를 미량주사에 의해 수용 세포에 주사하였다. V402를 이후 세포에 도입하였다. 또 다른 실험에서, 인간 섬유아세포를 선택하고, 벡터(402)와 함께 도입하였다. 인간 섬유아세포를 이후 수용 세포(A9 세포 또는 CHO 세포)와 융합하였다.
일부 실험에서, 하나 이상의 벡터가, 예를 들어, 동일한 시간에 상동성 재조합에 의해 요망되는 위치에 인간 14번 염색체에 삽입될 수 있다. 벡터는 약물 내성 마커(제오신, G418)를 함유할 수 있고, 세포가 이후 스크리닝된다. 염색체는 표지된 후, 분리되고, 변형된 염색체는 이후 염색체 미량주사에 의해 수용 세포에 주사된다.
일부 실험에서, 하나 이상의 추가 벡터가 삽입된다. 이들 추가 벡터는 필요에 따라 인간 14번 염색체의 상이한 위치에 삽입될 수 있다. 하나의 실험에서, 제3 벡터는 5'에서 3'로 다음을 가질 수 있다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 서열(PuroR), 티미딘 키나제 유전자 서열(TK), LoxP 인식 서열(302), PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(5'PuroR), 인간 연장 인자 1 알파로부터의 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), 피기백 트랜스포사제 유전자 서열(PBase), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA. 벡터는 C 영역 내에 삽입된다.
하나의 실험에서, 제3 벡터(V403)를 C 영역과 방추사부착점 사이에 삽입하였다. 벡터는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 서열(PuroR), 티미딘 키나제 유전자 서열(TK), LoxP 인식 서열(302), PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(5'PuroR), 인간 연장 인자 1 알파로부터의 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), 피기백 트랜스포사제 유전자 서열(PBase), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
하나의 실험에서, 인간 섬유아세포를 선택하고, 벡터(402)와 함께 도입하였다. 인간 섬유아세포를 이후 수용 세포(A9 세포 또는 CHO 세포)와 융합하였다. 변형된 염색체를 분리하고, 또 다른 적절한 수용 세포에 도입하였다. 그 후에, 세포를 G418 내성에 의해 선택하여 하나의 인간 염색체만을 함유하는 세포를 얻었다. 그 다음, 벡터(401)를 세포에 도입하고, 세포를 제오신에 대한 내성에 의해 선택하였다. 그 후에, 벡터(403)를 세포에 도입하고, 세포를 퓨로마이신에 대한 내성에 의해 선택하였다. 스크리닝 후 선택된 양성 클론을 Cre 효소로 처리하였다. 염색체 기법은, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kuroiwa et al. "Manipulation of human minichromosomes to carry greater than megabase-sized chromosome inserts." Nature Biotechnology 18.10 (2000)): 1086-1090]; CN1200014A; CN109837307A; US20120093785A1; US2009253902; CN1717483A; 문헌[Paulis, Marianna . "Chromosome Transfer Via Cell Fusion." Methods in Molecular Biology 738(2011):57; Genes, Chromosomes & Cancer 14: 126127 (1995); Tomizuka et al. "Functional expression and germline atransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice." Nature Genetics 16.2 (1997): 133-143; 및 Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 13, No. 3, 1987, pp. 279-284]에 기재되어 있다.
PCR을 수행하여 염색체 상의 5'-말단 재조합 부위(301) 및 3'-말단 재조합 부위(302)의 존재를 확인하였다. 무작위 삽입이 없는 세포를 서던 블롯에 의해 확인하고, 형광 동소 혼성화(FISH)에 의해 분석하였다.
도 10은 변형된 인간 14번 염색체를 나타낸 것이다. 도 11은 염색체 hChr14-mut3 상의 loxP 부위(301)에 대한 PCR 확인의 결과를 나타낸 것이다. 도 12는 염색체 hChr14-mut3 상의 loxP 부위(302)에 대한 PCR 확인의 결과를 나타낸 것이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 12개의 클론(1-B2, 1-B8, 1-D6, 1-D10, 1-F11, 1-G11, 2-A2, 3-E5, 3-G5, 3-H4, 5-C3, 및 6-F11로 번호부여됨)은 양성 클론이었다.
하기 PCR 프라이머를 실험에 사용하였다:
CCP14 FISH 프로브(CytoTest Inc., 록빌, MD, 카탈로그 번호 CT-CCP014)를 사용하는 양성 클론을 사용하여 FISH 분석을 수행하였다. 클론 1-D10에 대한 대표적인 FISH 이미지는 도 13 및 도 14에 나타나 있다. 도 13에서, 흰색 화살표는 인간 14번 염색체의 전장(변형 전)을 나타낸다. 도 14에서, 흰색 화살표는 변형된 인간 14번 염색체 단편을 나타낸다.
실시예 4: 마우스 ES 세포로의 인간 염색체 또는 단편 도입
실시예 3에서 얻어진 변형된 염색체를 앞서 기술된 방법에 의해 실시예 2에서 얻어진 세포에 도입하였다. 세포를 이후 G418에 의해 스크리닝하였다. 하나의 인간 염색체만을 함유하는 세포만 선택하였다. 도 15는 변형된 마우스 12번 염색체를 나타낸 것이다.
Cre 재조합효소는 이후 마우스 염색체 mChr12-mut2 상의 V, D, J 영역의 인간 염색체 hChr14-mut3 상의 V, D, J 영역으로의 대체를 매개하였다(도 16). 인간 염색체 DNA 서열을 재조합 부위(1301 및 1302) 사이의 서열로 대체하였다. 히그로마이신 및 퓨로마이신을 사용하여 양성 세포를 스크리닝하였다. 세포를 추가로 DT에 의해 스크리닝하여 마우스 배반포에 주사되기 전 인간 염색체를 함유하지 않는 마우스 세포를 얻었다. 일부 경우에, 세포를 DT 스크리닝 없이 배반포에 바로 주사하였다.
인간 유전자 서열이 마우스 게놈에 통합되었는지 확인하기 위해 Cre 재조합 후 세포를 시험하였다. PCR 결과는 도 17, 도 18, 도 19, 및 도 20에 나타나 있다. 모든 PCR 결과는 1-B4, 1-B10, 및 2-A7로 번호부여된 세포가 올바른 재조합을 가졌고, 1-B10 세포에서 인간 염색체가 사라졌다는 것을 보여주었다. 뮤린 전체 염색체 페인팅 프로브(Cytocell Ltd, 케임브리지, UK; Cat. No. AMP12R) 및 인간-특이적 IGH Breakapart 프로브(Cytocell Ltd, 케임브리지, UK; Cat. No. LPH 014)를 사용하여 FISH에 의한 1-B10 세포를 시험하였다. 결과는 도 21에 나타나 있고, 이는 인간 염색체 단편이 마우스 염색체에 존재했다는 것을 확인시켜 주었다. 이들 프라이머는 하기 표에 나타나 있다.
[표 12]
실시예 5: 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 마우스 생산
양성 클론 세포를 미량주사에 의해 BALB/c 마우스의 배반포에 주사하였다. 배아 미량주사를, 예를 들어, 문헌[A. Nagy, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition)," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 주사된 수정란을 이후 단시간 배양 동안 배양 배지에 착상한 다음, 수용 마우스의 난관에 이식하여 유전적으로 변형된 인간화 마우스(F0 세대)를 생산하였다. 마우스를 이후 C57BL/6 배경을 갖는 마우스와 교배하였다. 블랙 자손을 선택하여 Flp 툴 마우스와 교배하였다(도 22). 마우스의 꼬리로부터 얻어진 DNA에 대하여 PCR 분석을 수행하였다. 마우스를 추가로 BALB/c 배경을 갖는 마우스와 수회(예를 들어, 적어도 5회) 이종교배하여 BALB/c 배경을 갖는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 이형접합 마우스를 얻었다.
마우스가 인간 항체 중쇄를 발현하는지 확인하기 위해, 키메라 마우스(F0 세대) 및 블랙 마우스(F1 세대)의 마우스로부터 혈액을 수집하였다. RNA를 추출하고, 역전사하여 cDNA를 얻었다. 하기 PCR 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시키고, 서열을 추가로 서열화하였다.
[표 13]
실시예 6: 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 변형
경쇄 면역글로불린 유전자좌는 마우스 6번 염색체 상에 위치한다. 도 23은 마우스 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 보여주는 개략도이다. 두 개의 재조합 부위를 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입하였고, 얻어진 변형된 염색체는 도 24a 내지 도 24b에 나타나 있다. 상세한 표적화 전략은 도 25에 나타나 있다.
마우스 배아 줄기 세포에서 변형을 수행하였다. 벡터(V3901)는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, Flp 인식 표적(FRT), 인간 연장 인자 1 알파로부터의 포유동물 발현 프로모터(EF-1a), 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "5'HygR"), Cre 재조합효소에 대한 LoxP 인식 서열(1101), 5'PB 트랜스포손 서열(PB5'), 청색 형광 단백질 리포터 유전자(BFP), DT 수용체(DTR), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), 3'PB 트랜스포손 서열(PB3'), 퓨로마이신 내성 유전자 부분 서열(3'PuroR), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), DT 수용체(DTR), Cre 재조합효소에 대한 LoxP 인식 서열(1102), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
벡터(V3901)를 마우스 배아 줄기 세포에 도입하였다. 상응하는 항생제 내성 유전자 마커, 또는 이들의 조합에 의해 세포를 스크리닝하였다. 마우스 게놈에서 올바른 유전자좌로의 벡터 V3901의 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 결과는 도 26 내지 도 27에 나타나 있다. 두 개의 PCR 결과의 조합은 208, 209, 215, 217 및 269로 번호부여된 세포가 양성 클론이었다는 것을 확인시켜 주었다.
하기 프라이머를 사용하여 PCR 검정을 수행하였다:
이들 프라이머 중, IGKV-005-C-5G-L-GT-F 및 IGKV-005-C-5G-R-GT-R은 마우스 염색체 상에 위치하고, IGKV-005-C-5G-L-GT-R2 및 IGKV-005-C-5G-R-GT-F1은 벡터 V3901 상에 위치했다.
따라서, 두 개의 재조합 부위를 마우스 배아 줄기 세포에서 마우스 6번 염색체에 도입하였다.
실시예 7: 인간 2번 염색체 변형
인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌는 인간 2번 염색체에 위치한다. 도 28은 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 강조하는 인간 2번 염색체의 개략도이다.
두 개의 재조합 부위를 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역의 양측에 도입하였다. VHK와 동원체(방추사부착점) 사이의 영역을 결실시켜 후속 실험을 위한 더 짧은 인공 염색체를 얻었다. 유사한 재조합 부위를 6번 염색체 상의 마우스 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역에 도입하였다. 그 후에, 인간 염색체를 마우스 수용 세포에 도입하여 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 얻었다.
변형된 인간 2번 염색체는 도 29에 나타나 있다. 표적화 전략은 도 30에 나타나 있다. 벡터(V2701)는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, PGK 프로모터, 적색 형광 단백질 리포터 유전자 서열(tdTomato), FMDV 자가-절단 펩티드(2A), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 블라스티시딘 S 데아미나제(Bsr), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), LoxP 인식 서열 2601, 히그로마이신 내성 유전자(히그로마이신 포스포트랜스페라제의 부분 서열; "3'HygR"), Flp 인식 표적(FRT), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 디프테리아 독소 서브유닛 A(DTA).
벡터(V2702)는 5'에서 3'로 다음을 갖는다: 삽입 부위 상류에서의 DNA 상동성 아암 서열, LoxP 인식 서열 2602, PGK 프로모터, 퓨로마이신 내성 유전자 서열의 일부(5'PuroR), EF-1a, PBase, IRES, 카나마이신 내성 유전자 서열(Neo), 전사 종결/폴리아데닐화 신호 서열(PolyA; "PA"), 삽입 부위 하류에서의 DNA 상동성 아암 서열, 및 DTA.
벡터(V2702)의 서열을 서열화에 의해 검증하였다. 벡터를 형질감염에 의해 인간 H9 세포에 도입하였다. 그 후에, 세포를 G418 및 우아바인(Ouabain) 내성에 의해 스크리닝하였다. 유전자의 인간 게놈으로의 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 결과는 도 31에 나타나 있다. 01, 02, 03, 및 04로 번호부여된 클론은 양성 클론인 것으로 확인되었다.
하기 프라이머를 사용하여 PCR 검정을 수행하였다:
추가 실험에 적합한 변형된 염색체를 갖는 세포를 선택하였다. 변형된 인간 염색체를 염색체 기법에 의해 수용 세포에 도입하였다. 수용 세포 A9 세포를 G418 내성에 대하여 스크리닝하였다. 추가 유전자 편집을 위해 하나의 인간 염색체만을 함유하는 세포를 선택하였다.
스크리닝 동안, 도 31에 나타나 있는 03으로 번호부여된 클론은 올바른 재조합을 가졌고, 이를 인간 2번 염색체 카운팅 프로브(CCP2 FISH 프로브)(CytoTest Inc., 록빌, MD, 카탈로그 번호 CT-CCP002)에 의해 표지하였다. 결과는 세포에 변형된 인간 2번 염색체가 있었다는 것을 확인시켜 주었다(도 32).
그 후에, 벡터(V2701)를 세포에 추가로 도입하였다. 세포를 G418 및 블라스티시딘 S 내성에 의해 스크리닝하였다. 재조합을 PCR에 의해 확인하였다. 프라이머는 하기 표에 나타나 있다. 결과는 5-C3, 1-H2, 1-H9 및 1-G5가 양성 클론이었다는 것을 보여주었다(도 33).
[표 14]
실시예 8: 인간화 항체를 생산할 수 있는 마우스 생산
마우스 배아 줄기 세포와 실시예 7에서 얻어진 세포를 융합하고, 변형된 인간 2번 염색체를 실시예 6에서 얻어진 마우스 배아 줄기 세포에 도입하였다. 하나의 변형된 인간 2번 염색체만을 함유하는 마우스 ES 세포를 선택하고, 세포를 Cre-매개 재조합(Cre 매개 재조합) 후 스크리닝하였고, 이는 도 34에 나타나 있다. 인간 유전자 서열이 마우스 게놈에 통합되었는지 확인하기 위해 Cre 재조합 후 세포를 시험하였다. 마우스 전체 염색체 페인팅 프로브(Cytocell Ltd, 케임브리지, UK; Cat. No. AMP06G) 및 인간-특이적 IGK Breakapart 프로브(Cytocell Ltd, 케임브리지, UK; Cat. No. LPH 034)를 사용하여 형광 동소 혼성화(FISH)에 의해 PCR-확인 양성 클론을 검증하였다. 결과는 도 35에 나타나 있고, 이는 인간 염색체 단편이 마우스 염색체에 존재했다는 것을 확인시켜 주었다. 세포를 배반포에 주사하였다. 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 마우스가 얻어질 수 있다.
키메라 마우스를 선택하여 C57BL/6 마우스와 교배하여 그레이 및 블랙 자손(F1 세대)을 생산하였다. 블랙 마우스의 꼬리로부터 얻어진 DNA에 대하여 PCR 분석을 수행하고, 양성 F1 세대 마우스를 선택하여 Flp 툴 마우스와 교배하였다. 도 36은 Flp-매개 재조합의 개략도를 나타낸 것이다. 방법에 의해 생산된 마우스는 C57BL/6 배경을 함유하였다. 배경이 상이한 마우스는 상이한 이점을 가질 수 있고, 본원의 방법에 의해 생산된 이형접합 또는 동형접합 마우스는 요망되는 배경을 갖는 마우스를 얻기 위해 여러 세대에 대하여 역교배에 의해 일부 다른 배경의 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스는 체액성 면역 이점을 가짐)를 생성하는 데 사용될 수 있다.
몇 마리의 마우스를 선택하고, BALB/c 마우스와 수회 이종교배하여 BALB/c 배경을 갖는 이형접합 마우스를 얻었다. 그 후에, 이형접합 마우스를 이후 서로 이종교배하여 동형접합 마우스를 얻었다.
인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스와 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스를 서로 이종교배하여 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌와 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌 둘 모두를 갖는 마우스를 얻었다.
실시예 9: 트랜스제닉 마우스에서 B-세포 발달
인간화 마우스와 야생형 마우스의 면역계를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 세 마리의 9 내지 10주령된 야생형(WT), 이형접합 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 세 마리의 마우스, 및 동형접합 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 세 마리의 마우스를 선택하였다. 이들 중에서, 이형접합 마우스와 동형접합 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 유사한 체중, 외모 및 활동성을 가졌다. 이들 마우스의 말초 혈액, 비장, 림프절 및 골수 조직을 얻었고, 분명한 해부학적 변화는 발견되지 않았다(예를 들어, 세 그룹의 마우스 간에 비장 크기, 형태 및 중량에 관찰 가능한 차이가 없었음). 유세포 분석을 수행하여 마우스의 말초 혈액, 비장, 및 림프절에서 림프구 집단 및 분포(도 45 내지 도 47) 및 비장, 림프절, 및 골수에서 B 세포 집단(도 48 내지 도 50)을 분석하였다. 결과에서, 백혈구는 다음을 포함하였다: B 세포(예를 들어, CD45+, CD19+, TCR-에 의해 특징화됨), T 세포, 및 자연 살해(NK) 세포(예를 들어, CD45+, TCR-, NK1.1+에 의해 특징화됨). T 세포는 CD45+, CD19-, TCR+에 의해 특징화되었다. CD4+T 세포(CD4)는 CD45+, CD19-, TCR+, CD4+, CD8-에 의해 특징화되었다. 그리고, CD8+ T 세포(CD8)는 CD45+, CD19-, TCR+, CD4-, CD8+에 의해 특징화되었다. 유세포 분석에는 온전한 단일의 살아 있는 백혈구만이 포함되었다.
림프절 및 비장에서 B 세포의 발달기는 T1(전이형 1 B 세포, B220+IgM+IgD-에 의해 특징화됨), T2(전이형 2 B 세포, B220+IgM+IgD+에 의해 특징화됨) 및 성숙 B 세포(B220+IgMlowIgD+에 의해 특징화됨)로 분류되었다. 도 45 내지 도 47은 상이한 조직 샘플에서 백혈구의 백분율을 나타낸 것이다. 도 48 내지 도 49는 상이한 발달기에서 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
또한, B 세포 발달을 또한 비장 가장자리 구역(가장자리 구역 B 세포, MZ-B, B220+CD21+CD23-에 의해 특징화됨) 및 여포 구역(여포성 B 세포, FO-B로 지칭됨, B220+CD21lowCD23+에 의해 특징화됨)에서 평가하였다. 도 50은 비장 가장자리 구역(MZ-B) 및 여포 구역(FO-B)에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
상이한 발달기를 기준으로, 골수에서 B 세포는 프로-B-세포(B220lowCD43highIgMlow에 의해 특징화됨), 프리-B-세포(B220lowCD43intIgMlow에 의해 특징화됨) 및 미성숙-B-세포(B220highCD43lowIgMhigh에 의해 특징화됨)로 분류되었다. 도 51a 내지 도 51c는 골수에서 상이한 발달기에 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
야생형 마우스와 비교하여, 인간화 마우스에서 면역 세포 및 B 세포의 백분율은 유사했고, 상이한 그룹들 간에 통계적 차이가 없었다. 중쇄 인간화 이형접합 마우스(이형접합체) 또는 동형접합 마우스(동형접합체)에서 B 세포 분화에 유의한 결함은 관찰되지 않았다.
실시예 10: 혈청 면역글로불린 동형 분석
추가로, 상기 실시예에서 면역화되지 않은 마우스의 혈청에서 다양한 면역글로불린의 수준을 분석하였다. 마우스에는 WT 마우스, 이형접합 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스, 및 동형접합 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스가 포함되었다.
Clonotyping System-B6/C57J-HRP(Southern Biotech, Cat#5300-05B) 키트를 사용하여 실험을 수행하였다. 먼저, 포획 항체 염소 항-마우스 Ig, 인간 ads-UNLB를 PBS(Solarbio, Cat#P1020)로 10 ug/mL까지 희석하였다. 그 후에, 0.1 mL의 희석된 항체를 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 세척하고, 4℃에서 12 시간 동안 블로킹하였다. 혈청 샘플을 1% BSA(Cell Signaling, Cat# 9998)로 연속 희석하였다. 0.1 mL의 희석된 샘플을 각 웰에 첨가하고, 이어서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 1% BSA를 블랭크 대조로서 웰에 첨가하였다.
다음으로, 플레이트를 0.05% Tween-20(Amresco, Cat#M147)를 함유하는 PBS로 세척하였다. HRP-접합 이차 항체(염소 항-마우스 IgA, IgG(1, 2b, 2c, 3), IgM)(1% BSA에 의해 300배 희석, 웰 당 0.1 mL)를 첨가하고, 37℃에서 1 시간 동안 샘플과 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 세척하고, 0.1 mL의 TMB 발색원 용액(Beyotime Biotechnology, Cat#P0209)을 각 웰에 첨가함으로써 현상하였다. 실온에서 8분 동안 암소에서 인큐베이션 후, 0.1 mL의 반응 용액(Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. LTD., Cat# EIA-0032)을 각 웰에 첨가하였다. 450 nm 및 570 nm에서 광 흡수를 마이크로플레이트 리더(Thermo MULTISKAN GO, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하고, 표준 OD 값을 계산하였다.
결과는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스가 IgA, IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3 및 IgM 항체 동형을 생성할 수 있었고, 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 각 동형에 대하여 유사한 발현 수준을 가졌다는 것을 보여주었다(도 52 내지 도 57). 이는 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 인간화가 다양한 항체 동형의 항체 클래스 전환, 발현, 또는 분비에 유의한 악영향을 미치지 않았다는 것을 지시하였다.
실시예 11: 마우스에서 인간 가변 영역 유전자 세그먼트의 V(D)J 재조합
마우스에서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 mRNA 서열을 차세대 서열화에 의해 분석하였다.
하나의 면역화되지 않은(특정 항원에 노출되지 않은) 인간화 중쇄 동형접합 마우스를 선택하였다. 비장 세포를 RNA 추출을 위해 마우스로부터 수집하였다. 5' RACE 키트(SMARTer RACE 5'/3' 키트, Takara Bio USA, Inc., Cat# 634858)를 역전사를 수행하는 데 사용하여 cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA를 5' RACE 키트의 UPM 프라이머 및 IgM 불변 영역-특이적 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켜 중쇄 가변 영역 서열 단편을 얻고, 이어서 서열화하였다. IgM 불변 영역-특이적 프라이머 서열은 5'-ccaagcttacgagggggaagacatttgggaa-3'(SEQ ID NO: 50)였다.
또 다른 실험에서, 11 마리의 경쇄 인간화 이형접합 마우스를 선택하고, RNA를 안구뒤 혈액으로부터 추출하였다. 상술된 바와 같은 방법에 의해 역전사 후, 프라이머 VKF1 및 IgKC-태그를 사용하여 VκI 패밀리 경쇄 유전자를 증폭시키고, 이어서 서열화하였다. 하기 프라이머 서열을 사용하였다:
서열화 결과를 인간 면역글로불린 서열에 대하여 NCBI Ig Blast 툴과 비교하여 V(D)J 재조합 후 인간 VH, DH, JH 및 Vκ, Jκ 유전자의 발현을 확인하였다. 135개의 분석된 클론에서, 예비 결과는 특정 VH, DH 유전자 세그먼트 및 모든 JH 유전자 세그먼트의 발현을 검출하였다(표 15). 이들 유전자 세그먼트의 일부는 인간화 단편 상의 변형 부위에 가까이 위치하고, 일부는 변형 부위에서 떨어져 있었다. 이는 마우스에 통합된 인간 염색체 단편 상의 인간 VH, DH 및 JH 유전자가 인간 면역글로불린 중쇄 서열로 내인성 염색체 단편을 대체한 후 인간 중쇄를 발현하도록 재조합될 수 있다는 것을 지시하였다.
대부분의 VκI 패밀리 경쇄 유전자는 인간화 경쇄 이형접합 마우스로부터 유래된 441개의 클론에서 검출되었다(표 16). 중쇄 검출 결과와 유사하게, 인간화 단편 상의 이들 유전자의 일부는 변형 부위에 매우 가까이 위치하고, 일부는 변형 부위에서 떨어져 있었다. 이는 내인성 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌를 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역 유전자좌로 대체한 후, 마우스 게놈에 통합된 인간 Vκ 및 Jκ 유전자가 인간 경쇄 가변 영역을 갖는 경쇄를 발현하도록 재조합될 수 있다는 것을 지시하였다. 11 마리의 마우스에서 결과의 추가 분석은 검출된 IGKV 유전자 분포가 시험된 마우스들 간에 유의하게 상이하지 않았다는 것을 보여주었다(도 58).
[표 15]
[표 16]
실시예 12: 인간화 마우스에서 면역화 및 항체 생산
5 마리의 야생형(WT) 마우스 및 5 마리의 인간화 중쇄 동형접합 마우스(9주령 내지 10주령)를 무작위로 선택하고, 외인성 항원으로 면역화시켰다. 총 3회의 면역화로 2주마다 1회 반복하여 마우스를 면역화시켰다. 2차 면역화 및 3차 면역화 후 안구뒤 혈액을 수집하였다. 혈청을 수집한 후, 혈청 역가를 ELISA 또는 FACS에 의해 측정하여 항원-특이적 항체 반응을 결정하고 분석하였다. hBTLA, dPD1 및 OVA인 세 개의 항원을 연구에 사용하였다(도 59 내지 도 63). 결과는 2차 면역화 후 대부분의 야생형(WT) 및 인간화 중쇄 동형접합 마우스가 항원-특이적 항체를 생산했다는 것을 보여주었다. 3차 면역화 후, 항체 역가는 1Х104 내지 1Х105까지 증가했다. 면역역가 시험 결과는 야생형 마우스와 비교하여 인간화 마우스에서 본질적으로 동일했는데, 이는 마우스에서 인간화 면역글로불린 가변 영역 유전자좌가 기능적이며, 항원-특이적 항체를 생산할 수 있다는 것을 지시한다.
실시예 13: hVH/hVL 마우스에서 B-세포 발달
동형접합 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스(인간화 VH 마우스 또는 hVH 마우스)와 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스(인간화 VL 마우스 또는 hVL 마우스)를 서로 이종교배하여 동형접합 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌와 동형접합 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌 둘 모두를 갖는 마우스(인간화 VH/VL 마우스, 또는 hVH/hVL 마우스)를 얻었다. hVH/hVL 마우스는 생체내에서 인간화 단클론성 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다.
나이브 인간화 VH/VL 마우스와 나이브 야생형 마우스의 면역계를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 체중 및 비장 중량을 측정하였다(도 65a 내지 도 65b). 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 평균 체중 및 비장 중량에 유의한 차이가 검출되지 않았다.
유세포 분석을 수행하여 마우스의 비장에서 림프구 집단 및 분포(도 66) 및 비장 및 골수에서 B 세포 집단(도 67a 내지 도 67b, 도 68a 내지 도 68c)을 분석하였다. 결과는 hVH/hVL 마우스에서 비장에서의 B 세포, T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 백분율이 야생형 마우스와 거의 동일했다는 것을 보여주었다. 결과에서 백혈구는 다음을 포함하였다: B 세포(예를 들어, CD45+, CD19+, TCR-에 의해 특징화됨), T 세포, 및 자연 살해(NK) 세포(예를 들어, CD45+, TCR-, NK1.1+에 의해 특징화됨). T 세포는 CD45+, CD19-, TCR+에 의해 특징화되었다. CD4+ T 세포(CD4)는 CD45+, CD19-, TCR+, CD4+, CD8-에 의해 특징화되었다. 그리고, CD8+ T 세포(CD8)는 CD45+, CD19-, TCR+, CD4-, CD8+에 의해 특징화되었다. 유세포 분석에는 온전한 단일의 살아 있는 백혈구만이 포함되었다.
도 67a는 상이한 발달기에서 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 비장에서 B 세포의 발달기는 T1(전이형 1 B 세포, B220+IgM+IgD-에 의해 특징화됨), T2(전이형 2 B 세포, B220+IgM+IgD+에 의해 특징화됨) 및 성숙 B 세포(B220+IgMlowIgD+에 의해 특징화됨)로 분류되었다. 또한, B 세포 발달을 또한 비장 가장자리 구역(가장자리 구역 B 세포, MZ-B, B220+CD21+CD23-에 의해 특징화됨) 및 여포 구역(여포성 B 세포, FO-B로 지칭됨, B220+CD21lowCD23+에 의해 특징화됨)에서 평가하였다. 도 67b는 비장 가장자리 구역(MZ-B) 및 여포 구역(FO-B)에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 68a는 골수에서 상이한 발달기에 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 골수에서 B 세포 전구 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. B220 및 CD43의 발현 수준을 기준으로, 골수에서 B 세포 전구 세포는 3개의 세포 집단, 즉, 프로-B-세포(B220lowCD43highIgMlow에 의해 특징화됨), 프리-B-세포(B220lowCD43intIgMlow에 의해 특징화됨) 및 미성숙-B-세포(B220highCD43lowIgMhigh에 의해 특징화됨)로 나뉠 수 있다. 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
또한, B 세포 발달을 또한 유세포 분석에 의해 골수 또는 비장에서 평가하여 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+)(도 68b 내지 도 68c)를 선택적으로 염색하였다. 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
hVH/hVL 및 야생형 마우스의 혈청에서 상이한 면역글로불린(Ig) 아형을 ELISA에 의해 정량적으로 측정하였다. 각 그룹에 대하여 총 6 마리의 마우스를 선택하였다. IgA, IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3 및 IgM 수준에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 69).
이러한 실험들은 hVH/hVL 마우스에서 면역계가 기능적이며, hVH/hVL 마우스에서 인간화 면역글로불린 유전자좌가 마우스 면역글로불린 불변 영역과 적절하게 상호작용할 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 14: hVH/hVL 마우스에서 생식계열 사용 분석
hVH/hVL 나이브 마우스에서 중쇄 IGHV, IGHD 및 IGHJ 사용(항원 자극 없음)을 분석하였다. 결과는 도 70a 내지 도 70d에 나타나 있다. 또한, 카파쇄 IGKV 및 IGKJ 사용을 또한 분석하였다. 결과는 도 71a 내지 도 71c에 나타나 있다.
나이브 hVH/hVL 마우스에서 생식계열 사용을 차세대 서열화(NGS)에 의해 결정하였다. 예를 들어, 도 71c에 나타낸 바와 같이, IGKJ1, IGKJ2 및 IGKJ4가 빈번하게 나이브 hVH/hVL 마우스에서 사용된 반면, IGKJ3 및 IGKJ5가 덜 빈번하게 관찰되었다. 그러한 IGKJ 생식계열 사용 패턴은 인간 IGKJ 생식계열 사용의 문헌 보고서와 일치한다.
중쇄 CDR3 길이 분포를 나이브 hVH/hVL 마우스(n=2)의 비장 세포로부터 면역 레퍼토리의 NGS 서열화에 의해 결정하였다. 도 72에 나타낸 바와 같이, CDR3의 중간 길이는 14개 아미노산이었다. 결과는 인간 면역계에서 인간 중쇄 CDR3의 중간 길이와 일치했다.
중쇄 CDR3(HCDR3)의 각 위치에서 아미노산의 유형을 분석하였다(도 73). 티로신 사용 빈도 증가 및 DH2(IGHD2) 생식계열 패밀리 사용 증가를 포함한 다중 패턴이 관찰되었다. 이들 패턴은 인간 HCDR3에서 아미노산 조성과 유사했다.
시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성할 수 있다. 인간 HCDR3는 한 개의 시스테인 잔기 또는 두 개의 시스테인 잔기를 함유할 수 있는 반면, 마우스 HCDR3는 전형적으로 시스테인을 함유하지 않는다. 도 74에서의 결과는 시스테인 잔기를 함유하는 hVH/hVL 마우스의 HCDR3의 빈도 및 HCDR3의 길이 증가에 따른 빈도 증가를 보여준다. 이 결과는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 HCDR3 다양성과 일치한다.
실시예 15: 림프 기관 조직학 분석
나이브 야생형 또는 나이브 hVH/hVL 마우스로부터의 비장, 서혜부 림프절, 및 페이어스 패치를 H&E로 염색하였다. 대표적인 절편은 도 75의 A 내지 F에 나타나 있다. 야생형(C57BL/6) 마우스 및 hVH/hVL 마우스는 분명한 여포를 갖는 정상 구조를 나타냈고, 조직학 형태에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 16: hVH/hVL 마우스에서 항체 생성
BCMA, IL4R, PD-1, Siglec15, 및 SIRPα 항원으로의 2차 및 3차 면역화 후, 혈액을 수집하고, 야생형(C57BL/6) 마우스 및 hVH/hVL 마우스의 항원-특이적 항체 역가를 ELISA에 의해 분석하였다(도 76a 내지 도 76e). 결과는 hVH/hVL 마우스가 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있고 야생형 및 hVH/hVL 마우스의 면역 반응이 유사했다는 것을 보여주었다.
실시예 17: hVH/hVL 마우스에서 B-세포 발달
면역화 후 인간화 VH/VL 마우스와 야생형 마우스의 면역계를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 야생형 및 hVH/hVL 마우스에서 체중 및 비장 중량을 측정하였다(도 77a 내지 도 77b). 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 평균 체중 및 비장 중량에 유의한 차이가 검출되지 않았다.
유세포 분석을 수행하여 마우스의 비장에서 림프구 집단 및 분포(도 78) 및 비장 및 골수에서 B 세포 집단(도 79a 내지 도 79b, 도 80a 내지 도 80c)을 분석하였다.
도 79a는 비장에서 상이한 발달기에 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 추가로, B 세포 발달을 또한 비장 가장자리 구역 및 여포 구역에서 평가하였다. 도 79b는 비장 가장자리 구역(MZ-B) 및 여포 구역(FO-B)에서 비장 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
도 80a는 골수에서 상이한 발달기에 B 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 골수에서 B 세포 전구 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
추가로, B 세포 발달을 또한 유세포 분석에 의해 골수 또는 비장에서 평가하여 혈장 세포(B220lowIgM-IgD-CD138-) 및 기억 B 세포(B220+IgM+IgD-CD38+)(도 80b 내지 도 80c)를 선택적으로 염색하였다. 야생형 마우스와 hVH/hVL 마우스 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
hVH/hVL 및 야생형 마우스의 혈청에서 상이한 면역글로불린(Ig) 아형을 ELISA에 의해 정량적으로 측정하였다. 각 그룹에 대하여 총 6 마리의 마우스를 선택하였다. IgA, IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG3 및 IgM 수준에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 81). 또한, hVH/hVL 및 야생형 마우스의 혈청에서 IgG의 총량을 ELISA에 의해 정량적으로 측정하였다. 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 82).
기타 구현예
본 발명은 발명의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하려고 의도된 것이고 본 발명의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정된다는 것을 이해해야 한다. 기타 양태, 이점, 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.
서열 목록
<110> 바이오사이토젠(북경)의약과기주식회사
<120> 인간화 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물
<130> 1
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 1
gccaaggaat ttaaaagggg attgaaagca a 31
<210> 2
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 2
gccctccatg tacagcttca tgtgc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 3
actgggcttg tcgagacaga gaaag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 4
ccacagcccg atctacttgg ctttt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 5
gcaaggtttt gactaagcgg agcac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 6
tgacgcatgt gttttatcgg tctgt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 7
gtgcctgaca cgtgctacga gattt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 8
ttcaacaata agcagggcca gaggg 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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tcaaagtcaa tttcctcagc gaggct 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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agggagggaa tggaatgagg gtgat 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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ccatgtgacc cattcgagtg tcctg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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ttgtgagggc tcaagttcag tgcat 25
<210> 13
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 13
gccaaggaat ttaaaagggg attgaaagca a 31
<210> 14
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 14
cgagagctgt ggagagaaag gcaaa 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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tatgtcctgc gggtaaatag ctgcg 25
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<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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agggagggaa tggaatgagg gtgat 25
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<212> DNA/RNA
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ccatgtgacc cattcgagtg tcctg 25
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<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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cttaccattt gcggtgcctg gtttc 25
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<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
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tcaaagtcaa tttcctcagc gaggct 26
<210> 20
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<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 20
aggaattgta tcccataggc tagcacgt 28
<210> 21
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 21
gacgacgtga ccctgttcat cagc 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 22
ccacagcccg atctacttgg ctttt 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 23
gcaaggtttt gactaagcgg agcac 25
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<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 24
cactagtctc gtgcagatgg acagc 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 25
gttagaagac ttcctctgcc ctcgg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 26
ttgtgagggc tcaagttcag tgcat 25
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<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 27
caggtscagc tggtrcagtc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 28
agggatccag agttccaggt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 29
cagrtcacct tgaaggagtc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 30
saggtgcagc tggtggagtc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 31
caggtgcagc tgcaggagtc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 32
gargtgcagc tggtgcagtc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 33
caggtacagc tgcagcagtc 20
<210> 34
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 34
tcacacacta cagcttccac cacaa 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 35
cggggaaaag tcgactctag aacgg 25
<210> 36
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 36
actgcattct agttgtggtt tgtcca 26
<210> 37
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 37
ggcctggaaa actcagctat ccttt 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 38
aaggtgactc tgcaatcagc ctctg 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 39
tcatctacag ccacaacgtg agcag 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 40
cccatgtaca ggttccgcat gaact 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 41
ctccgtccgc ttttatttcc cctgt 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 42
gttataacac ggggagtgcg tgtgc 25
<210> 43
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 43
gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 30
<210> 44
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 44
gcaacggcta caatcaacag catcc 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 45
tgggtctggg acagacttca ctctc 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 46
aaggtgactc tgcaatcagc ctctg 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 47
tcatctacag ccacaacgtg agcag 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 48
cccatgtaca ggttccgcat gaact 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 49
ctccgtccgc ttttatttcc cctgt 25
<210> 50
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 50
ccaagcttac gagggggaag acatttggga a 31
<210> 51
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 51
cataagatct cgmcatccrg wtgacccagt 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 52
ctaacactca ttcctgttga agctcttgac 30
<210> 53
<211> 7795
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 53
gggatgacag attctctgtt cagtgcactc agggtctgcc tccacgagaa tcaccatgtc 60
ctttctcaag actgtgttct gtgcagtgcc ctgtcagtgg aaatctggag agcatgcttc 120
catgagcttg tgagtagtat atctagtaag ccatggcttt gtgttaatgg tgatgttcta 180
catatcagtt ctctggctta ataatgaggt gatgattcta tgttcctgta acgcttcctc 240
aactgggtcc taagtctttc ttcactccat ctattcctct aaggaatgat cctgaaaatc 300
ccatcacaaa ctataggaga tgggaaccat caaaaaacac agtgacaaag aggtgggaac 360
gcatcagggt tcaggaacca tattttaaaa agatatcgta aataacttct taaaagagat 420
atagacaaat ctccattaat acggagacca gaggcctaag gctaagaacc aatggtggct 480
caaggtctcc tgctacccga ggagcaaacg tagagcagtt tctaatgatt tatttaaaat 540
atagaatcaa aagtaccagt ttgcaatttt gaaagattta tttcagcaat gcaacaacat 600
caggtggtgc cgagtccaac acgtcttatg tcccatgata taaacaaagg ccatccagaa 660
ctgtggactg gagttctacc ttgtccccta atgacattca gatttttttt ccattctctt 720
tatcttagag gagacagggg gctaactcat tttacttgtc ctttgcttgt tcttgccaag 780
aacgtaaagc agcttgcaag tcttcaaacc taaatatctt agtaactcct acacgagtgg 840
caatgccaaa gagcagtgca acaaagagga agtaaatacg accaaagagt attcttaaat 900
acactactgg ctctaggttc tgttttatta tgcgcctttg aaccggaggg gacccactgt 960
ctatgctccc actgtgtccc tcttctttgc actttggagg gctccaacca aaatggcaat 1020
ggcaattccg acgattgtta cacactcctc tgaaattgca tttttctggg gtgcagtcat 1080
aacccaaacg agataaactt ccattgcaag ctcctcgatc acagaactta ccccttgaac 1140
acggggtacc atgtctcacc aatccagcat ctgctgtttc tgtcccacga tgttcatcaa 1200
gcccaaagca ggtaacccca gagataaccg attgatggaa tgaaacatgt tcttgcaaaa 1260
atggaagatt ggtgacattg gtacactgca accttccaca cagcttgtcc tgatcagcac 1320
aagcattgaa tgtgaggctt tcttctgctc tagtacaatg cccaaatcga aaccgttgtt 1380
tgttgatgtc atagcactta atattagcat tcttagcact tacaccaaag atttccatgc 1440
attgtatgtt gcgatcagtg cagttacctt tatagcagta accctcttct gagcatggtg 1500
tcccatcttg cagataagtg tcatctgggc aaatgaactt agagccacta cagtactctg 1560
gaagatcaca tatgttctgg ataggtctgc agagtgtccc agaaggactg taagtgcaat 1620
ttgcacagca taattcttta tcacaaatgc taccaggtgt taacctgcaa tcatttccac 1680
agcagggatc tgaataacat gccttttggg agccacagtc acactgctca ttgttatcta 1740
ctttgaagtt tccacaaaac ttataagtca atgatgtatt ataataaaca tgacggtcat 1800
agaaaagaca tggcatcaga tcaggagtat taagtatgtt gcttatctct gcaagggaac 1860
aattgctgaa agcatctgtt aattgaggat ttttgaacat gatgcaggtg ttccttctct 1920
ggcagataca gtacccctca tcatgtttta ggcctaaact ccttccaaca cgattggtta 1980
ttataataga taaaaataaa ggatttcgac catgttgacc aagacaaatt agggctgagg 2040
gagaacatat actcctctca gctggattaa cagcatcatc tcctggcgaa ttcttgttaa 2100
ttatagctcc tgcatcaggc ctaaaatgag cataaaatac tctctcatag aaagtatgag 2160
cctgccctcc tggaactcga aaatcttgtg aaaatggatc agcctcggta tacacagtca 2220
tgagaaagac atagtaccgc atatgaagat tggtcagata ggtgtccatt aaactaatga 2280
ctttaaacaa atactcaaca gtagatgaaa gtttgtcacc tccagaagca ctatatacag 2340
aatgggttgc ttgaaagtgg ccttttatag cagctggatg tgtagcgtaa ttcttactag 2400
atagtctggg agctccatct gcatattcca atctggagga gggagaacct gtattatggc 2460
tccagtgctt ccatgcattc ataggccctg tgtcatcaga ctcagatact atctgagaaa 2520
caaggtgttc aaagctctgt gaatcattga ggggtttgat ttcataggta aggttatcca 2580
actttatgac ccctgacagg cccccataac aagtatccac agtgaccatg gattgcagga 2640
tcccctccag gtagccaata tagtaacaat ctacaggaaa aaaggggtac tccatctgta 2700
aggctccttg gtcatcttga gttgtcagca acaagtgtct gggccaaatg agtgtctttc 2760
tccgcaggtg gatgatatgt ctctggcccc gaaaacgcaa gctatacgag agcagtcttt 2820
gtgcttgaag tcctttggta tggtagatct ccttccgagg aataaccacc tccgatgaga 2880
tgtaacgcca agtgggatgg ccttgagaac accagactgg aaccaggagg agcagccaga 2940
gtgcaaatag caagaggagg accctgggga ccacaggtct ttccactagc ctcatgcccc 3000
aggtcagaga taacatcctg ggtggagcta actccctctg ctgtggccac tgcctggtct 3060
agaaaatact gacagaggac taaaaacctc ctcaggctcc caacctaagt ggttacccag 3120
acaactggag ttaggtaaca gtcactgggt gtggcaggaa ttgagtctga atgtgttagc 3180
tgaggttgag gttaaatatt gtcaaaaggg atgtctataa atgtgcctgg acaagaaaag 3240
tcagaagcag caaggagtgt ctctgacagg ctcaatcctt tcttttcttt ttttgaagtt 3300
caaaatatca tttccacgtg aatgtatttg gttcccagtg tgactctggg tctctttcta 3360
ggagtcaata tttctttata tcttggctca tgtttttcac agttgttcta acttcttgtt 3420
ttgttttgtt tgtttgtttg tttgaaagtt agaagtaaat actgtctata ttagcctttt 3480
agctataaat gattgttttt atttcttcta atcatgtttt gtttgagttt tggttaaact 3540
atttacaaat gagttttttt tttccttttg ggtgttgctc gaaagtttgg agctttctgt 3600
taatattgtg ttgttgtttc tccaatatta ttagacctga gaattctacc tgggtacctg 3660
tgaactccag aatttttaaa aattccatct cttgggaaca ttatctctga ccccgtctga 3720
ggccgaagtg gctgtccccc tccaaccttt agtatctttc tttcctgact attgggattt 3780
cttcaagcaa tcaggctgat gggttctcag cagtgagacc agtagactgt cggtatgaac 3840
gtcgaagagt ctgccacaca ctccgggttc atcaacagtg ctttcgcgtc tcttactttt 3900
gtagaaggaa atgcagcctc tgagttttct ccaagaaatc attgatgaaa gggtgaaaag 3960
atgggtatca cccggagttc atgacaagcc ctggctcaga cacgtgagca aggtctacag 4020
ccccaaagat aggctgccct gcaacatgta tttataagat aggagaaaaa aatgggtagt 4080
tggagggttg atcaacttac ttcctctcaa acatatatat ctcatctaag tgtgcagggg 4140
aaaactctgt agaactactg ggatacctgc tcacccccag gagcctcatg aataagtctc 4200
tgcttctgcc ttgtagccat gagcattact gcacctgata cccctgcagc ttcctaggga 4260
agagggagga agtgacttgg cccctgtctg gttaaggtaa gaggagataa atcccttctc 4320
attgattagg gtgagagggg tcatgtgctc tatcattggt gacccagttg ggacatgggt 4380
ttataccaaa gtcatcactc tgaggttctg tgtaccacca ggctgaactc ccatatccta 4440
catggacata ggacaacacc aagcagaagg aggttttagg actaaactga aggacagaga 4500
tgcggtttct aaacaactag ggagtgccag ggccagcctc tctaaccact ataggacact 4560
gtggagtctg gttacaaaga gagattactc aaggtcctta gcactgatta cagagcatat 4620
ctcagatgcc ttctgctgac cagatgtatc tttgcataat ctgcctatcc agattcagaa 4680
aattgatgcc acatagccaa gtggactttc aggaacagac gatttaaaaa caggcagaga 4740
gatgtgagag aaaggagaag gagagagaga agggagaggg agagaagaga gagggagacg 4800
gagaaggaaa gagggagaag gagaaggaga gaaggggcat ggacagaggg agggacagaa 4860
ggagagagga gatagagagg gggataagga agaagggagg gagggagaga gagagaaggc 4920
taagtctttc catacctggg tcccaatacc tcttataacc caagcacatg gtttcacata 4980
tcacaatgcg gttgggatat agataactgt aaatacttgt gaaaataatg gggctgagat 5040
ctggggtttt catgatagtt tcaaagtcac cgtactgact aaaaccttcc actggcccat 5100
ctccagcttc ctaatctgag ggtatcaaat ttcccactaa gtgtgtttag aaagatctcc 5160
acctttttgc ccttgtcttc cagtgcccca cctacgttct ggtctcccac atctgatgtc 5220
ttctcagtga ttctggccct gcctgctcca cagctacaaa ccccttccta taatgagctc 5280
tgtgctgagc catcatcctg aatcaatcca ccttaagcag atgttttgct tatttttcct 5340
gtgtccatac tacagaggaa aggtaggcat gtagaagctg aagcatctca cctcattcca 5400
agcaccctca gtctctaaat gtgccccctt gtttccagaa gtgcaacctc aagcatcttt 5460
tattcattca tcttagaggg ccacatgtgc tgtagtgtta taagatgaaa tttaaagcat 5520
taattattcc taacaagcca attaaacaag ccaaaaacat tcatcagtca ttcccatgga 5580
acctctgaag catcttcctg ctctaacctt gggttttcca gggctgctct gggatcacag 5640
gagctgtcct gtctaccagc catataaagg cagacctatc agaattacac cagacttctc 5700
accatagact ataaaagcca gaatatcctg gacagatgtt atacagaaac taagagaaca 5760
caaatgccag cccaggctac tatacccagc aaaactctca attaccatcg atgaagaaac 5820
caagatattc cattacaagt ccaaatttac acaatatctt tccataaatc cagccctaca 5880
aaggatagca gatggaaaac tccaacacag gtaggaaaac tacaccctag aaagagcact 5940
aaagtaatca tctttcaaca cactcaaaag aagataacca cacaaacata attccacctc 6000
taacaacaaa aataaagtag gcaacaatca ctattcctta atatctcttt taacatcaat 6060
ggactcaatt ctccaataaa aagacataga ctaacagact gaatacataa acaggacaca 6120
gcattttgct gcataaagca aacacagcgt tacttttttt tttctaaatg acatttttta 6180
ttagatattg tctttattga catttcaaat gttatcccct ttcctggttt accctctgaa 6240
atcccctatc tcctccccct ccccctgctc accaatccac ccactcccac ttccaggccc 6300
tggcaatccc ctatatttgg gcatagagcc ttcacaggac caaggtactc tccttgcatt 6360
gatgaccaac tagtccattc tctgctacaa atgcagctag atctatgagt cccaccatgt 6420
tttcttttgt tggtggtttc atgccaggga gctcttggag tactgattgg ttcatattgt 6480
tgttctccct atggggttac aaaacccttc aacttcttgg gtcctttctc tggctgcctc 6540
attggggacc ttgtgcgaag tccaatggat gactgtgagc atccacttct gtatttgcca 6600
ggcactggca gagcctctca gaagacagct atatcaagat cctggcagca agctcttgtt 6660
ggtatccaca aaagtgtctg gtggttgtct atgggatgga tccccaaagg ggcagtctct 6720
ggatggtcat tccttcagtc tctgttccac actttgtctc tttaactcct tccatgacta 6780
ttttattcct ccctctaaga aggaccgaag tattcatact ttggtcttcc ttcttgaaat 6840
tcatgtgttt tgtgaattgt atctttgata ttccgaactt ctgggctaat atccacttat 6900
cagtgagtga atatcatgtg tgttcttatg tgattgagtt acctcactca ggatgatatc 6960
ctccagaacc atccatttgt ctaagaattt aatgaattca ttgtttttaa tagctgagga 7020
gtactccatt gtgtaaatgt accacatttt ctgtacccat tgttctcttg agggacatct 7080
gggttcttta aagcttctgg acattaaata taaggctgct atggaaatag tggagaatgt 7140
gtccttatta catgttggag catcttctgg gtatatgccc aggagtgcta ttgctggatc 7200
ctctgatagt actatgtcca attttctgag gaactgccaa actgatttac agagtggttg 7260
taccagcttg caattccacc agcaatggag aaatgttccc cttcctccac atcctcacca 7320
acatctgctg tcacctcaat ttgttcttag tgattcagac aggtgtgagg tggaatatca 7380
gggttgtttg gcatttccct gatgactagt gatattgaaa aaaattttaa gtgtttctca 7440
gccattcagt attcttcagt tgagaattca ctgtttagct ctgtactcag gtttttttaa 7500
tagggttatt tggttttctg gagtctaacg tcttgaattc tttctatata ttggatatta 7560
gccctctgtc atatttagga ttggtaaaga tctttcccaa tatgttggct gcctttttgt 7620
gtcctttgcc ttacagaacc tttttaattt tatgaggtcc catttgctaa ttcttcattt 7680
tacagcacaa gccattggtg ttctgttcaa aaatctttcc ccctgaaccc tatcttcgag 7740
gatcttcccc actttctcct ctataagttt cagtgtctct attattgtgc tgagg 7795
<210> 54
<211> 5938
<212> DNA/RNA
<213> 인공 서열
<400> 54
tgatgtggga acgcttcagt gttcaggaac catatgattt atttaaaata tagaatcaaa 60
agtaccaatt tgcagttttg aaagatttat tccagtgtaa gcattagcaa tgcaccaaca 120
tcaggtgatt tctgaatcca acacgtctta tgtcctcatg atattaaaaa aaaaaaaagg 180
ccatccagaa ctgtgaactt gagttctacc ttgttcccta ctgacattca gattttcttt 240
tttgcattct ctttatctta caggagacag gaggggaggg ctaactcatt ttactttggc 300
ttgtcccttg ctggtccttg cccagaacgt aaagtagctt gcaagtcttc aaatctaaaa 360
atcttagtaa ctcctacacg agtggcaatg ccaaagagca gtgcaacaaa gaggaagtaa 420
atacgaccaa agagtattct taaatacacc actggctctt gtttttgttt tattgtgtgc 480
ctttgaactg gaggggaccc actgtctatg ctcccactta gtccctcttc tttgcactct 540
ggaggcttcc aaccaaaatg acaatggcaa ttccgatgat tgttacacac tcctctaaaa 600
ctgcattttt ctggggtgca gtcataaccc aaatgagata aacttccact gcaagctcct 660
tgatcacaga acttactttt ggagcagggg gtaccatgtc tcaccattcc agcatctgtt 720
gtttctgtcc cacgatgttc atcaagccca aagcaggtaa acccagagat aatcgattga 780
tggaatgaaa catgttcttg caaatatgga agattggtga cattggtaca ctgcaacctt 840
ccacacagct tgtcctgatc agcacaagca ttgaatgtga ggctttcttc tgctctagta 900
caatgcccaa atcgaaaccg ttgtttgttg atgtcatagc acttaatatt agcattctta 960
gcacttacac caaagatttc catgcattgt atgttgcgat cagtgcagtt acctttatag 1020
cagtaaccat cttctgagca tggtgtccca tcttgcagat aagtgtcatc tgggcaaatg 1080
tatttagtcc cattacagta ctctggaaga tcacatatgt tctggatagg tctgcagagt 1140
gtcccagaag gactgtaagt gcaatttgca cagcataatt ctttatcaca aatgctacca 1200
ggtgttaacc tgcaatcatt tccacagcag ggatctgaat aacatgcctt ttgggagcca 1260
cagtcacact gctcatcgtt atctactttg aagtttccac aaaacttata agtcaatgat 1320
gtattataat aaacatgacg gtcatagaaa agacatggca tcagaccagg agtattaagt 1380
atgttgctta tctctgcaag ggaacaattg ctgaaagcat ctgttaattg aggatgtctg 1440
aacataatgc aggtgttcct tctctggcag acacagtacc cctcatcata ttttaagcct 1500
aaactccttc caacacgatt ggttattata ggagataaaa ataaaggatt tcgatcatat 1560
ttaccaatac aaattagggc taaggaagaa catatactcc tctcagctgg attaacctgg 1620
ttatcttgtg gcccatactt attaagtaaa actcctgcat caggcttaaa tttattataa 1680
aagactgaca catagtaatt ataagccgac cctcctggaa ctgcaaactc aagtcgaaat 1740
ggatcagaat tggtgtacac agtcatgaga aagacatagt accgcatatg aagattggtc 1800
agataggtgt ccattaaact aatgacttga aacaaatacc caacagtaga tgaaagtttg 1860
tcacctgcag cagaattata tacagaattg gttgcttgaa agtggccttt tatagcagct 1920
ggatgtgtag cgtagttctt actagatatt ctgggagctc catctgcata ttccaatctg 1980
gaggagggag aacctgtatt atggctccag tgcttccatg cattcatagg ccctgtgtca 2040
tcagactcag atactatctg agaaacaagg tgttcaaagc tctgtgaatc attgaggggt 2100
ttgatttcat aggtaaggtc atctaacttc atgacccctg acaggccccc ataacaagta 2160
tccacagtga ccatggattg tgggatcccc tccaggtagc caatatagta acaatctaca 2220
ggaaaaaagg ggtaatccat ctgtaaggct ccttggtcat cttgagttgt cagcaacaag 2280
tgtctgggcc aaatgagtgt ctttctccgc aggtggatga tatgtctctg gccccgaaaa 2340
tgcaagctat atgagagcag tctttgtgct tgaagtcctt tggtatggta gatctccttc 2400
cgaggaataa ccacctccga tgagatgtaa cgccaagtag gatggccttg agaacaccag 2460
actggaacca ggaggagcag ccagagtgca aatagcaaga ggaggaccct ggggaccaca 2520
ggtctttcca ctagcctcat gccccaggtc agagataaca tcctgggtgg agctaaatcc 2580
ctctgctgtg gccactgcct ggtctagaaa atactgacag aggactaaaa acctcctcag 2640
gctcccaacc taagtggtta cccagacaac tggagttagg taacagtcac tgggtgtggc 2700
aggaattgag tctgaatgtg ttagctgagg ttgaggttaa atattgtcaa aagggatgtc 2760
tataaatgtg cctggacaag aaaagtcaga agcagcaagg agtgtctctg acaggctcaa 2820
tcctttcttt tctttttttg aagttcaaaa tatcatttcc acgtgaatgt atttggttcc 2880
cagtgtgact ctgggtctct ttctaggagt caatatttct ttatatcttg gctcatgttt 2940
ctcacagttg ttctaatttc ttgttttgtt ttgtttgttt gtttgaacgt tagtagtaaa 3000
tactgtctat attagccttt tagctataaa tgattgtttt tatttcttct aatcatattt 3060
tgtttgagtt ttggttaaac tatttacaaa tgagtttttt ttttttcctt ttgggtgttg 3120
ctcgaaagtt tggagctttc tgttaatatt gtgttgttat ttttccaata ttattagacc 3180
tgagaattct atctgggtac ctgtgaactc tagaattttt aaaaattcca tctcttggga 3240
acattacctc tgaccccgtc tgaggccgaa gtggctgtcc ccctccaacc tttagtatct 3300
ttctttcctg actattggga tttcttcaag caatcaggct gatgggttct cagcagtgag 3360
accagtagac tgccggtatg aacgtcgaag agactgccac acactccagg ttcatcaaca 3420
gtgctttcgc gtctcttact tttgtagaag gaaaagcagc ctctgagtta tctccaagaa 3480
atcattaatg aaagagttaa aagatgggta tcacccggag ttcatgacaa gccctggctc 3540
agacacgtga gcaaggtcta cagccccaaa gataggctgc cctgcaacat gtatttataa 3600
gatagaagaa aaaaatgggt ggttggaggg ttgatcaact tacttcctct caaacatata 3660
tatctcatct aagtgtgcag gggaaaactc tgtaggacta ctgggattgt tattatcatt 3720
attattatta ttattattat tattattatt attattatta ttaacttaag gcattttatt 3780
agatattttc ttcatttagt tttcaaatgt tatccccgga acctcctata ctctctccct 3840
gccctgctcc ccaacccacc cactcctaca tcctggccct ggcattcccc tatactgtgg 3900
cagatgatct tcgtaagacc aagagccttt cctcccattg atggcctact aggctatcct 3960
cttttacata tgcaactaga gtcacagctc tggggaggta ttgcttagtt catattgttt 4020
ttcctcctat agggttgcag atccctttag ctccttgggt actttctcta gctcctccat 4080
tgggggccct gtgttccatc caatagatga ctgtgagcat ccacttctgt atttgccagg 4140
tattggcatg gatcttactg caccttctga actctctaag cagctttcct ggtcacctcc 4200
aggagcctca tgaataagtc tctgcttccc ccttgtggct atgagcatta ctgcacctga 4260
tacaccctgc agcttcctag ggaagaggga ggaagtggct tggcccctgt ctggttaagg 4320
taagaggaga taaatccctt ctcatgaatt agggtgagaa gggtcatgtg ctctatcatt 4380
ggtgaccaac ttggggacat gggcttatac agtcatcact ctgaggctct gtgtaccacc 4440
agactgaact cccatatcct acatgcacat aggacaacac caagtagaag gaggttttag 4500
gactaaactg aaggacagag atggggtttc taaacaacta gggagtgcca gggccagcct 4560
ctctaaccac tataggacac tatggagtct ggttacaaag agagattact caaggtcctt 4620
agcactgatt acagagcata tctcagatgc cttctgctga ccagatgtat ctttgcataa 4680
tctgcctatc cagattcaga aaattgatgc cacatagcca agtggacttt caggaacaga 4740
cgatttaaaa acaggcagag agatgtgaga gaaaggagaa ggagagagag aagggagagg 4800
gagagaagag agagggagac ggagaaggaa agagggagaa ggagaaggag agaaggggca 4860
tggacagagg gagggacaga aggagagagg agatagagag ggggataagg aagaaaggag 4920
ggagggagag agagagaagg ctaagtcttt ccatacctgg gtcccaatac ctcttataac 4980
ccaagcacat ggtttcagat atcacaatgc ggttgggata tagataactg taaatacttg 5040
tgaaaataat ggggctgaga tctggggttt tcatgatagt ttcaaagtca ctgtactgac 5100
taaaaccttc cactggccca tctccagctt gttaatctga gggtatcaaa tttcccacta 5160
agtgtgttta gaaagatctc cacctttttg ccctagtctt ccagtgcccc acctacgttc 5220
tggtctccca catctgatgt cttctcagtg attctggccc tgcctgctcc acagctacaa 5280
accccttcct ataatgagct ctgtgctgag ccatcatcct gaatcaatcc accttaagca 5340
gatgttttgc ttatttttcc tgtgtccata ctacagagga agggtaggca tgtagaagct 5400
gaggcatctc atctcactct aagcaccctc agtctctaaa tgtgcccctt tgtttccagc 5460
agttcagcct caagcatctt ttattcactc gtcttagagg gacacatgtg ctgtagtgtt 5520
ataagatgaa atttaaagca ttagttattc ccaacaagcc aattaaacaa gccaaaaaca 5580
ttcatcagtc attcccatgg aacctctgaa gcatcttcct gctctaacct tgagtttcct 5640
agggctgctg tgggatcaca ggagctgtcc tgtttaccag cctatcctgt cccacgggat 5700
tcagttatta gtgggtgcga gggggaccgc aaacctggaa gaaaatggga ttggaagaga 5760
aaagagaaac gaagaccaag tagatctttt cctatcaagg tcttcgttta ttaggctgag 5820
gtgcctggtg taaagcatgc atcgcgggga ataggaaggg gtcgaggggg aattttacaa 5880
agaacaaaga agcgggcatc tgctgacatg agggccgaag tcaggctcca ggcagcgg 5938
SEQUENCE LISTING
<110> Biocytogen Pharmaceuticals（Beijing）Co., Ltd.
<120> GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS WITH HUMANIZED
IMMUNOGLOBULIN LOCUS
<130> 1
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gccaaggaat ttaaaagggg attgaaagca a 31
<210> 2
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gccctccatg tacagcttca tgtgc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
actgggcttg tcgagacaga gaaag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccacagcccg atctacttgg ctttt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcaaggtttt gactaagcgg agcac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgacgcatgt gttttatcgg tctgt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gtgcctgaca cgtgctacga gattt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ttcaacaata agcagggcca gaggg 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tcaaagtcaa tttcctcagc gaggct 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agggagggaa tggaatgagg gtgat 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ccatgtgacc cattcgagtg tcctg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ttgtgagggc tcaagttcag tgcat 25
<210> 13
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gccaaggaat ttaaaagggg attgaaagca a 31
<210> 14
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cgagagctgt ggagagaaag gcaaa 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tatgtcctgc gggtaaatag ctgcg 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
agggagggaa tggaatgagg gtgat 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ccatgtgacc cattcgagtg tcctg 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
cttaccattt gcggtgcctg gtttc 25
<210> 19
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
tcaaagtcaa tttcctcagc gaggct 26
<210> 20
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
aggaattgta tcccataggc tagcacgt 28
<210> 21
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gacgacgtga ccctgttcat cagc 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ccacagcccg atctacttgg ctttt 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gcaaggtttt gactaagcgg agcac 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
cactagtctc gtgcagatgg acagc 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gttagaagac ttcctctgcc ctcgg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
ttgtgagggc tcaagttcag tgcat 25
<210> 27
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
caggtscagc tggtrcagtc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
agggatccag agttccaggt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
cagrtcacct tgaaggagtc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
saggtgcagc tggtggagtc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
caggtgcagc tgcaggagtc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
gargtgcagc tggtgcagtc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
caggtacagc tgcagcagtc 20
<210> 34
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
tcacacacta cagcttccac cacaa 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
cggggaaaag tcgactctag aacgg 25
<210> 36
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
actgcattct agttgtggtt tgtcca 26
<210> 37
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
ggcctggaaa actcagctat ccttt 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
aaggtgactc tgcaatcagc ctctg 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
tcatctacag ccacaacgtg agcag 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
cccatgtaca ggttccgcat gaact 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
ctccgtccgc ttttatttcc cctgt 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
gttataacac ggggagtgcg tgtgc 25
<210> 43
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 30
<210> 44
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
gcaacggcta caatcaacag catcc 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
tgggtctggg acagacttca ctctc 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
aaggtgactc tgcaatcagc ctctg 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
tcatctacag ccacaacgtg agcag 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
cccatgtaca ggttccgcat gaact 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
ctccgtccgc ttttatttcc cctgt 25
<210> 50
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
ccaagcttac gagggggaag acatttggga a 31
<210> 51
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
cataagatct cgmcatccrg wtgacccagt 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
ctaacactca ttcctgttga agctcttgac 30
<210> 53
<211> 7795
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
gggatgacag attctctgtt cagtgcactc agggtctgcc tccacgagaa tcaccatgtc 60
ctttctcaag actgtgttct gtgcagtgcc ctgtcagtgg aaatctggag agcatgcttc 120
catgagcttg tgagtagtat atctagtaag ccatggcttt gtgttaatgg tgatgttcta 180
catatcagtt ctctggctta ataatgaggt gatgattcta tgttcctgta acgcttcctc 240
aactgggtcc taagtctttc ttcactccat ctattcctct aaggaatgat cctgaaaatc 300
ccatcacaaa ctataggaga tgggaaccat caaaaaacac agtgacaaag aggtgggaac 360
gcatcagggt tcaggaacca tattttaaaa agatatcgta aataacttct taaaagagat 420
atagacaaat ctccattaat acggagacca gaggcctaag gctaagaacc aatggtggct 480
caaggtctcc tgctacccga ggagcaaacg tagagcagtt tctaatgatt tatttaaaat 540
atagaatcaa aagtaccagt ttgcaatttt gaaagattta tttcagcaat gcaacaacat 600
caggtggtgc cgagtccaac acgtcttatg tcccatgata taaacaaagg ccatccagaa 660
ctgtggactg gagttctacc ttgtccccta atgacattca gatttttttt ccattctctt 720
tatcttagag gagacagggg gctaactcat tttacttgtc ctttgcttgt tcttgccaag 780
aacgtaaagc agcttgcaag tcttcaaacc taaatatctt agtaactcct acacgagtgg 840
caatgccaaa gagcagtgca acaaagagga agtaaatacg accaaagagt attcttaaat 900
acactactgg ctctaggttc tgttttatta tgcgcctttg aaccggaggg gacccactgt 960
ctatgctccc actgtgtccc tcttctttgc actttggagg gctccaacca aaatggcaat 1020
ggcaattccg acgattgtta cacactcctc tgaaattgca tttttctggg gtgcagtcat 1080
aacccaaacg agataaactt ccattgcaag ctcctcgatc acagaactta ccccttgaac 1140
acggggtacc atgtctcacc aatccagcat ctgctgtttc tgtcccacga tgttcatcaa 1200
gcccaaagca ggtaacccca gagataaccg attgatggaa tgaaacatgt tcttgcaaaa 1260
atggaagatt ggtgacattg gtacactgca accttccaca cagcttgtcc tgatcagcac 1320
aagcattgaa tgtgaggctt tcttctgctc tagtacaatg cccaaatcga aaccgttgtt 1380
tgttgatgtc atagcactta atattagcat tcttagcact tacaccaaag atttccatgc 1440
attgtatgtt gcgatcagtg cagttacctt tatagcagta accctcttct gagcatggtg 1500
tcccatcttg cagataagtg tcatctgggc aaatgaactt agagccacta cagtactctg 1560
gaagatcaca tatgttctgg ataggtctgc agagtgtccc agaaggactg taagtgcaat 1620
ttgcacagca taattcttta tcacaaatgc taccaggtgt taacctgcaa tcatttccac 1680
agcagggatc tgaataacat gccttttggg agccacagtc acactgctca ttgttatcta 1740
ctttgaagtt tccacaaaac ttataagtca atgatgtatt ataataaaca tgacggtcat 1800
agaaaagaca tggcatcaga tcaggagtat taagtatgtt gcttatctct gcaagggaac 1860
aattgctgaa agcatctgtt aattgaggat ttttgaacat gatgcaggtg ttccttctct 1920
ggcagataca gtacccctca tcatgtttta ggcctaaact ccttccaaca cgattggtta 1980
ttataataga taaaaataaa ggatttcgac catgttgacc aagacaaatt agggctgagg 2040
gagaacatat actcctctca gctggattaa cagcatcatc tcctggcgaa ttcttgttaa 2100
ttatagctcc tgcatcaggc ctaaaatgag cataaaatac tctctcatag aaagtatgag 2160
cctgccctcc tggaactcga aaatcttgtg aaaatggatc agcctcggta tacacagtca 2220
tgagaaagac atagtaccgc atatgaagat tggtcagata ggtgtccatt aaactaatga 2280
ctttaaacaa atactcaaca gtagatgaaa gtttgtcacc tccagaagca ctatatacag 2340
aatgggttgc ttgaaagtgg ccttttatag cagctggatg tgtagcgtaa ttcttactag 2400
atagtctggg agctccatct gcatattcca atctggagga gggagaacct gtattatggc 2460
tccagtgctt ccatgcattc ataggccctg tgtcatcaga ctcagatact atctgagaaa 2520
caaggtgttc aaagctctgt gaatcattga ggggtttgat ttcataggta aggttatcca 2580
actttatgac ccctgacagg cccccataac aagtatccac agtgaccatg gattgcagga 2640
tcccctccag gtagccaata tagtaacaat ctacaggaaa aaaggggtac tccatctgta 2700
aggctccttg gtcatcttga gttgtcagca acaagtgtct gggccaaatg agtgtctttc 2760
tccgcaggtg gatgatatgt ctctggcccc gaaaacgcaa gctatacgag agcagtcttt 2820
gtgcttgaag tcctttggta tggtagatct ccttccgagg aataaccacc tccgatgaga 2880
tgtaacgcca agtgggatgg ccttgagaac accagactgg aaccaggagg agcagccaga 2940
gtgcaaatag caagaggagg accctgggga ccacaggtct ttccactagc ctcatgcccc 3000
aggtcagaga taacatcctg ggtggagcta actccctctg ctgtggccac tgcctggtct 3060
agaaaatact gacagaggac taaaaacctc ctcaggctcc caacctaagt ggttacccag 3120
acaactggag ttaggtaaca gtcactgggt gtggcaggaa ttgagtctga atgtgttagc 3180
tgaggttgag gttaaatatt gtcaaaaggg atgtctataa atgtgcctgg acaagaaaag 3240
tcagaagcag caaggagtgt ctctgacagg ctcaatcctt tcttttcttt ttttgaagtt 3300
caaaatatca tttccacgtg aatgtatttg gttcccagtg tgactctggg tctctttcta 3360
ggagtcaata tttctttata tcttggctca tgtttttcac agttgttcta acttcttgtt 3420
ttgttttgtt tgtttgtttg tttgaaagtt agaagtaaat actgtctata ttagcctttt 3480
agctataaat gattgttttt atttcttcta atcatgtttt gtttgagttt tggttaaact 3540
atttacaaat gagttttttt tttccttttg ggtgttgctc gaaagtttgg agctttctgt 3600
taatattgtg ttgttgtttc tccaatatta ttagacctga gaattctacc tgggtacctg 3660
tgaactccag aatttttaaa aattccatct cttgggaaca ttatctctga ccccgtctga 3720
ggccgaagtg gctgtccccc tccaaccttt agtatctttc tttcctgact attgggattt 3780
cttcaagcaa tcaggctgat gggttctcag cagtgagacc agtagactgt cggtatgaac 3840
gtcgaagagt ctgccacaca ctccgggttc atcaacagtg ctttcgcgtc tcttactttt 3900
gtagaaggaa atgcagcctc tgagttttct ccaagaaatc attgatgaaa gggtgaaaag 3960
atgggtatca cccggagttc atgacaagcc ctggctcaga cacgtgagca aggtctacag 4020
ccccaaagat aggctgccct gcaacatgta tttataagat aggagaaaaa aatgggtagt 4080
tggagggttg atcaacttac ttcctctcaa acatatatat ctcatctaag tgtgcagggg 4140
aaaactctgt agaactactg ggatacctgc tcacccccag gagcctcatg aataagtctc 4200
tgcttctgcc ttgtagccat gagcattact gcacctgata cccctgcagc ttcctaggga 4260
agagggagga agtgacttgg cccctgtctg gttaaggtaa gaggagataa atcccttctc 4320
attgattagg gtgagagggg tcatgtgctc tatcattggt gacccagttg ggacatgggt 4380
ttataccaaa gtcatcactc tgaggttctg tgtaccacca ggctgaactc ccatatccta 4440
catggacata ggacaacacc aagcagaagg aggttttagg actaaactga aggacagaga 4500
tgcggtttct aaacaactag ggagtgccag ggccagcctc tctaaccact ataggacact 4560
gtggagtctg gttacaaaga gagattactc aaggtcctta gcactgatta cagagcatat 4620
ctcagatgcc ttctgctgac cagatgtatc tttgcataat ctgcctatcc agattcagaa 4680
aattgatgcc acatagccaa gtggactttc aggaacagac gatttaaaaa caggcagaga 4740
gatgtgagag aaaggagaag gagagagaga agggagaggg agagaagaga gagggagacg 4800
gagaaggaaa gagggagaag gagaaggaga gaaggggcat ggacagaggg agggacagaa 4860
ggagagagga gatagagagg gggataagga agaagggagg gagggagaga gagagaaggc 4920
taagtctttc catacctggg tcccaatacc tcttataacc caagcacatg gtttcacata 4980
tcacaatgcg gttgggatat agataactgt aaatacttgt gaaaataatg gggctgagat 5040
ctggggtttt catgatagtt tcaaagtcac cgtactgact aaaaccttcc actggcccat 5100
ctccagcttc ctaatctgag ggtatcaaat ttcccactaa gtgtgtttag aaagatctcc 5160
acctttttgc ccttgtcttc cagtgcccca cctacgttct ggtctcccac atctgatgtc 5220
ttctcagtga ttctggccct gcctgctcca cagctacaaa ccccttccta taatgagctc 5280
tgtgctgagc catcatcctg aatcaatcca ccttaagcag atgttttgct tatttttcct 5340
gtgtccatac tacagaggaa aggtaggcat gtagaagctg aagcatctca cctcattcca 5400
agcaccctca gtctctaaat gtgccccctt gtttccagaa gtgcaacctc aagcatcttt 5460
tattcattca tcttagaggg ccacatgtgc tgtagtgtta taagatgaaa tttaaagcat 5520
taattattcc taacaagcca attaaacaag ccaaaaacat tcatcagtca ttcccatgga 5580
acctctgaag catcttcctg ctctaacctt gggttttcca gggctgctct gggatcacag 5640
gagctgtcct gtctaccagc catataaagg cagacctatc agaattacac cagacttctc 5700
accatagact ataaaagcca gaatatcctg gacagatgtt atacagaaac taagagaaca 5760
caaatgccag cccaggctac tatacccagc aaaactctca attaccatcg atgaagaaac 5820
caagatattc cattacaagt ccaaatttac acaatatctt tccataaatc cagccctaca 5880
aaggatagca gatggaaaac tccaacacag gtaggaaaac tacaccctag aaagagcact 5940
aaagtaatca tctttcaaca cactcaaaag aagataacca cacaaacata attccacctc 6000
taacaacaaa aataaagtag gcaacaatca ctattcctta atatctcttt taacatcaat 6060
ggactcaatt ctccaataaa aagacataga ctaacagact gaatacataa acaggacaca 6120
gcattttgct gcataaagca aacacagcgt tacttttttt tttctaaatg acatttttta 6180
ttagatattg tctttattga catttcaaat gttatcccct ttcctggttt accctctgaa 6240
atcccctatc tcctccccct ccccctgctc accaatccac ccactcccac ttccaggccc 6300
tggcaatccc ctatatttgg gcatagagcc ttcacaggac caaggtactc tccttgcatt 6360
gatgaccaac tagtccattc tctgctacaa atgcagctag atctatgagt cccaccatgt 6420
tttcttttgt tggtggtttc atgccaggga gctcttggag tactgattgg ttcatattgt 6480
tgttctccct atggggttac aaaacccttc aacttcttgg gtcctttctc tggctgcctc 6540
attggggacc ttgtgcgaag tccaatggat gactgtgagc atccacttct gtatttgcca 6600
ggcactggca gagcctctca gaagacagct atatcaagat cctggcagca agctcttgtt 6660
ggtatccaca aaagtgtctg gtggttgtct atgggatgga tccccaaagg ggcagtctct 6720
ggatggtcat tccttcagtc tctgttccac actttgtctc tttaactcct tccatgacta 6780
ttttattcct ccctctaaga aggaccgaag tattcatact ttggtcttcc ttcttgaaat 6840
tcatgtgttt tgtgaattgt atctttgata ttccgaactt ctgggctaat atccacttat 6900
cagtgagtga atatcatgtg tgttcttatg tgattgagtt acctcactca ggatgatatc 6960
ctccagaacc atccatttgt ctaagaattt aatgaattca ttgtttttaa tagctgagga 7020
gtactccatt gtgtaaatgt accacatttt ctgtacccat tgttctcttg agggacatct 7080
gggttcttta aagcttctgg acattaaata taaggctgct atggaaatag tggagaatgt 7140
gtccttatta catgttggag catcttctgg gtatatgccc aggagtgcta ttgctggatc 7200
ctctgatagt actatgtcca attttctgag gaactgccaa actgatttac agagtggttg 7260
taccagcttg caattccacc agcaatggag aaatgttccc cttcctccac atcctcacca 7320
acatctgctg tcacctcaat ttgttcttag tgattcagac aggtgtgagg tggaatatca 7380
gggttgtttg gcatttccct gatgactagt gatattgaaa aaaattttaa gtgtttctca 7440
gccattcagt attcttcagt tgagaattca ctgtttagct ctgtactcag gtttttttaa 7500
tagggttatt tggttttctg gagtctaacg tcttgaattc tttctatata ttggatatta 7560
gccctctgtc atatttagga ttggtaaaga tctttcccaa tatgttggct gcctttttgt 7620
gtcctttgcc ttacagaacc tttttaattt tatgaggtcc catttgctaa ttcttcattt 7680
tacagcacaa gccattggtg ttctgttcaa aaatctttcc ccctgaaccc tatcttcgag 7740
gatcttcccc actttctcct ctataagttt cagtgtctct attattgtgc tgagg 7795
<210> 54
<211> 5938
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
tgatgtggga acgcttcagt gttcaggaac catatgattt atttaaaata tagaatcaaa 60
agtaccaatt tgcagttttg aaagatttat tccagtgtaa gcattagcaa tgcaccaaca 120
tcaggtgatt tctgaatcca acacgtctta tgtcctcatg atattaaaaa aaaaaaaagg 180
ccatccagaa ctgtgaactt gagttctacc ttgttcccta ctgacattca gattttcttt 240
tttgcattct ctttatctta caggagacag gaggggaggg ctaactcatt ttactttggc 300
ttgtcccttg ctggtccttg cccagaacgt aaagtagctt gcaagtcttc aaatctaaaa 360
atcttagtaa ctcctacacg agtggcaatg ccaaagagca gtgcaacaaa gaggaagtaa 420
atacgaccaa agagtattct taaatacacc actggctctt gtttttgttt tattgtgtgc 480
ctttgaactg gaggggaccc actgtctatg ctcccactta gtccctcttc tttgcactct 540
ggaggcttcc aaccaaaatg acaatggcaa ttccgatgat tgttacacac tcctctaaaa 600
ctgcattttt ctggggtgca gtcataaccc aaatgagata aacttccact gcaagctcct 660
tgatcacaga acttactttt ggagcagggg gtaccatgtc tcaccattcc agcatctgtt 720
gtttctgtcc cacgatgttc atcaagccca aagcaggtaa acccagagat aatcgattga 780
tggaatgaaa catgttcttg caaatatgga agattggtga cattggtaca ctgcaacctt 840
ccacacagct tgtcctgatc agcacaagca ttgaatgtga ggctttcttc tgctctagta 900
caatgcccaa atcgaaaccg ttgtttgttg atgtcatagc acttaatatt agcattctta 960
gcacttacac caaagatttc catgcattgt atgttgcgat cagtgcagtt acctttatag 1020
cagtaaccat cttctgagca tggtgtccca tcttgcagat aagtgtcatc tgggcaaatg 1080
tatttagtcc cattacagta ctctggaaga tcacatatgt tctggatagg tctgcagagt 1140
gtcccagaag gactgtaagt gcaatttgca cagcataatt ctttatcaca aatgctacca 1200
ggtgttaacc tgcaatcatt tccacagcag ggatctgaat aacatgcctt ttgggagcca 1260
cagtcacact gctcatcgtt atctactttg aagtttccac aaaacttata agtcaatgat 1320
gtattataat aaacatgacg gtcatagaaa agacatggca tcagaccagg agtattaagt 1380
atgttgctta tctctgcaag ggaacaattg ctgaaagcat ctgttaattg aggatgtctg 1440
aacataatgc aggtgttcct tctctggcag acacagtacc cctcatcata ttttaagcct 1500
aaactccttc caacacgatt ggttattata ggagataaaa ataaaggatt tcgatcatat 1560
ttaccaatac aaattagggc taaggaagaa catatactcc tctcagctgg attaacctgg 1620
ttatcttgtg gcccatactt attaagtaaa actcctgcat caggcttaaa tttattataa 1680
aagactgaca catagtaatt ataagccgac cctcctggaa ctgcaaactc aagtcgaaat 1740
ggatcagaat tggtgtacac agtcatgaga aagacatagt accgcatatg aagattggtc 1800
agataggtgt ccattaaact aatgacttga aacaaatacc caacagtaga tgaaagtttg 1860
tcacctgcag cagaattata tacagaattg gttgcttgaa agtggccttt tatagcagct 1920
ggatgtgtag cgtagttctt actagatatt ctgggagctc catctgcata ttccaatctg 1980
gaggagggag aacctgtatt atggctccag tgcttccatg cattcatagg ccctgtgtca 2040
tcagactcag atactatctg agaaacaagg tgttcaaagc tctgtgaatc attgaggggt 2100
ttgatttcat aggtaaggtc atctaacttc atgacccctg acaggccccc ataacaagta 2160
tccacagtga ccatggattg tgggatcccc tccaggtagc caatatagta acaatctaca 2220
ggaaaaaagg ggtaatccat ctgtaaggct ccttggtcat cttgagttgt cagcaacaag 2280
tgtctgggcc aaatgagtgt ctttctccgc aggtggatga tatgtctctg gccccgaaaa 2340
tgcaagctat atgagagcag tctttgtgct tgaagtcctt tggtatggta gatctccttc 2400
cgaggaataa ccacctccga tgagatgtaa cgccaagtag gatggccttg agaacaccag 2460
actggaacca ggaggagcag ccagagtgca aatagcaaga ggaggaccct ggggaccaca 2520
ggtctttcca ctagcctcat gccccaggtc agagataaca tcctgggtgg agctaaatcc 2580
ctctgctgtg gccactgcct ggtctagaaa atactgacag aggactaaaa acctcctcag 2640
gctcccaacc taagtggtta cccagacaac tggagttagg taacagtcac tgggtgtggc 2700
aggaattgag tctgaatgtg ttagctgagg ttgaggttaa atattgtcaa aagggatgtc 2760
tataaatgtg cctggacaag aaaagtcaga agcagcaagg agtgtctctg acaggctcaa 2820
tcctttcttt tctttttttg aagttcaaaa tatcatttcc acgtgaatgt atttggttcc 2880
cagtgtgact ctgggtctct ttctaggagt caatatttct ttatatcttg gctcatgttt 2940
ctcacagttg ttctaatttc ttgttttgtt ttgtttgttt gtttgaacgt tagtagtaaa 3000
tactgtctat attagccttt tagctataaa tgattgtttt tatttcttct aatcatattt 3060
tgtttgagtt ttggttaaac tatttacaaa tgagtttttt ttttttcctt ttgggtgttg 3120
ctcgaaagtt tggagctttc tgttaatatt gtgttgttat ttttccaata ttattagacc 3180
tgagaattct atctgggtac ctgtgaactc tagaattttt aaaaattcca tctcttggga 3240
acattacctc tgaccccgtc tgaggccgaa gtggctgtcc ccctccaacc tttagtatct 3300
ttctttcctg actattggga tttcttcaag caatcaggct gatgggttct cagcagtgag 3360
accagtagac tgccggtatg aacgtcgaag agactgccac acactccagg ttcatcaaca 3420
gtgctttcgc gtctcttact tttgtagaag gaaaagcagc ctctgagtta tctccaagaa 3480
atcattaatg aaagagttaa aagatgggta tcacccggag ttcatgacaa gccctggctc 3540
agacacgtga gcaaggtcta cagccccaaa gataggctgc cctgcaacat gtatttataa 3600
gatagaagaa aaaaatgggt ggttggaggg ttgatcaact tacttcctct caaacatata 3660
tatctcatct aagtgtgcag gggaaaactc tgtaggacta ctgggattgt tattatcatt 3720
attattatta ttattattat tattattatt attattatta ttaacttaag gcattttatt 3780
agatattttc ttcatttagt tttcaaatgt tatccccgga acctcctata ctctctccct 3840
gccctgctcc ccaacccacc cactcctaca tcctggccct ggcattcccc tatactgtgg 3900
cagatgatct tcgtaagacc aagagccttt cctcccattg atggcctact aggctatcct 3960
cttttacata tgcaactaga gtcacagctc tggggaggta ttgcttagtt catattgttt 4020
ttcctcctat agggttgcag atccctttag ctccttgggt actttctcta gctcctccat 4080
tgggggccct gtgttccatc caatagatga ctgtgagcat ccacttctgt atttgccagg 4140
tattggcatg gatcttactg caccttctga actctctaag cagctttcct ggtcacctcc 4200
aggagcctca tgaataagtc tctgcttccc ccttgtggct atgagcatta ctgcacctga 4260
tacaccctgc agcttcctag ggaagaggga ggaagtggct tggcccctgt ctggttaagg 4320
taagaggaga taaatccctt ctcatgaatt agggtgagaa gggtcatgtg ctctatcatt 4380
ggtgaccaac ttggggacat gggcttatac agtcatcact ctgaggctct gtgtaccacc 4440
agactgaact cccatatcct acatgcacat aggacaacac caagtagaag gaggttttag 4500
gactaaactg aaggacagag atggggtttc taaacaacta gggagtgcca gggccagcct 4560
ctctaaccac tataggacac tatggagtct ggttacaaag agagattact caaggtcctt 4620
agcactgatt acagagcata tctcagatgc cttctgctga ccagatgtat ctttgcataa 4680
tctgcctatc cagattcaga aaattgatgc cacatagcca agtggacttt caggaacaga 4740
cgatttaaaa acaggcagag agatgtgaga gaaaggagaa ggagagagag aagggagagg 4800
gagagaagag agagggagac ggagaaggaa agagggagaa ggagaaggag agaaggggca 4860
tggacagagg gagggacaga aggagagagg agatagagag ggggataagg aagaaaggag 4920
ggagggagag agagagaagg ctaagtcttt ccatacctgg gtcccaatac ctcttataac 4980
ccaagcacat ggtttcagat atcacaatgc ggttgggata tagataactg taaatacttg 5040
tgaaaataat ggggctgaga tctggggttt tcatgatagt ttcaaagtca ctgtactgac 5100
taaaaccttc cactggccca tctccagctt gttaatctga gggtatcaaa tttcccacta 5160
agtgtgttta gaaagatctc cacctttttg ccctagtctt ccagtgcccc acctacgttc 5220
tggtctccca catctgatgt cttctcagtg attctggccc tgcctgctcc acagctacaa 5280
accccttcct ataatgagct ctgtgctgag ccatcatcct gaatcaatcc accttaagca 5340
gatgttttgc ttatttttcc tgtgtccata ctacagagga agggtaggca tgtagaagct 5400
gaggcatctc atctcactct aagcaccctc agtctctaaa tgtgcccctt tgtttccagc 5460
agttcagcct caagcatctt ttattcactc gtcttagagg gacacatgtg ctgtagtgtt 5520
ataagatgaa atttaaagca ttagttattc ccaacaagcc aattaaacaa gccaaaaaca 5580
ttcatcagtc attcccatgg aacctctgaa gcatcttcct gctctaacct tgagtttcct 5640
agggctgctg tgggatcaca ggagctgtcc tgtttaccag cctatcctgt cccacgggat 5700
tcagttatta gtgggtgcga gggggaccgc aaacctggaa gaaaatggga ttggaagaga 5760
aaagagaaac gaagaccaag tagatctttt cctatcaagg tcttcgttta ttaggctgag 5820
gtgcctggtg taaagcatgc atcgcgggga ataggaaggg gtcgaggggg aattttacaa 5880
agaacaaaga agcgggcatc tgctgacatg agggccgaag tcaggctcca ggcagcgg 5938
Claims (75)
- 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물로서, 인간 IGHV 유전자, 인간 IGHD 유전자, 및 인간 IGHJ 유전자는 작동 가능하게 연결되고, VDJ 재배열을 겪을 수 있는, 동물.
- 제1항에 있어서, 표 1로부터 선택된 적어도 150개의 인간 IGHV 유전자, 표 2로부터 선택된 적어도 20개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3으로부터 선택된 적어도 5개의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 대상체의 인간 14번 염색체의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 세포의 인간 14번 염색체의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함하는, 동물.
- 제5항에 있어서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 4에서의 하나 이상의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 하나 이상의 마우스 IGHD 유전자, 및/또는 표 6에서의 하나 이상의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함하는, 동물.
- 제5항에 있어서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGHV1-85 유전자에서 시작하여 마우스 IGHJ4 유전자까지 연속 서열의 결실을 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 내인성 IGHM, IGHδ, IGHG3, IGHG1, IGHG2b, IGHG2a, IGHE, 및 IGHA 유전자를 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 동물은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함하고, 비변형 인간 서열은 적어도 800 kb인, 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV1-2까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV6-1까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 IGHD1-1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성인, 동물.
- 제1항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성인, 동물.
- 제1항에 있어서, 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 추가로 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함하는, 동물.
- 제1항에 있어서, 설치류(예를 들어, 마우스)인, 동물.
- 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서
하나 이상의 인간 IGHV 유전자를 포함하는 제1 서열;
내인성 서열을 포함하는 제2 서열; 및
하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 제3 서열을 포함하고,
제1 서열, 제2 서열, 및 제3 서열은 작동 가능하게 연결되는, 유전적으로-변형된 동물. - 제19항에 있어서, 제1 서열은 표 1로부터 선택된 적어도 150개의 인간 IGHV 유전자를 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 제1 서열은 표 2로부터 선택된 적어도 20개의 인간 IGHD 유전자를 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 제1 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열인, 동물.
- 제19항에 있어서, 제1 서열은 적어도 800 kb인, 동물.
- 제19항에 있어서, 제2 서열은 적어도 3 kb인 내인성 서열을 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 제3 서열은 표 2로부터 선택된 적어도 20개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3으로부터 선택된 적어도 5개의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 제3 서열은 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 제3 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열인, 동물.
- 제19항에 있어서, 제3 서열은 적어도 50 kb인, 동물.
- 제19항에 있어서, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함하는, 동물.
- 제29항에 있어서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 4에서의 하나 이상의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 하나 이상의 마우스 IGHD 유전자, 및 표 6에서의 하나 이상의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함하는, 동물.
- 제29항에 있어서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGHV1-85에서 시작하여 마우스 IGHJ4까지 서열의 결실을 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 하나 이상의 내인성 IGHM, IGHδ, IGHG3, IGHG1, IGHG2b, IGHG2a, IGHE, 및 IGHA 유전자를 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성인, 동물.
- 제19항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성인, 동물.
- 제19항에 있어서, 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 추가로 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함하는, 동물.
- 제19항에 있어서, 설치류(예를 들어, 마우스)인, 동물.
- 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함하는, 유전적으로-변형된 비-인간 동물.
- 제38항에 있어서, 표 7에서의 모든 인간 IGKV 유전자, 및 표 8에서의 모든 인간 IGKJ 유전자를 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 인간 IGKV3D-7에서 시작하여 인간 IGKJ5까지 인간 경쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열을 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 9에서의 하나 이상의 마우스 IGKV 유전자 및 표 10에서의 하나 이상의 마우스 IGKJ 유전자의 결실을 포함하는, 동물.
- 제41항에 있어서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGKV2-137에서 시작하여 마우스 IGKJ5까지 서열의 결실을 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 내인성 IGKC를 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 경쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성인, 동물.
- 제38항에 있어서, 경쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성인, 동물.
- 제38항에 있어서, 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 추가로 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함하는, 동물.
- 제38항에 있어서, 설치류(예를 들어, 마우스)인, 동물.
- 게놈이 하나 이상의 내인성 IGHV, 내인성 IGHD, 및 내인성 IGHJ 유전자의 하나 이상의 인간 IGHV, 인간 IGHD, 및 인간 IGHJ 유전자로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물로서, 인간 IGHV, 인간 IGHD, 및 인간 IGHJ 유전자는 내인성 IGHM, IGHδ, IGHG, IGHE, 및 IGHA 유전자 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결되는, 동물.
- 제50항에 있어서, 하나 이상의 내인성 IGHV, 내인성 IGHD, 및 내인성 IGHJ 유전자가 표 1에서의 적어도 150개의 인간 IGHV 유전자, 표 2에서의 적어도 20개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 적어도 5개의 인간 IGHJ 유전자로 대체되는, 동물.
- 제50항에 있어서, 동물은 마우스이고, 표 4에서의 적어도 180개의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 모든 마우스 IGHD 유전자, 및 표 6에서의 모든 마우스 IGHJ 유전자가 대체되는, 동물.
- 게놈이 하나 이상의 내인성 IGKV 및 내인성 IGKJ 유전자의 하나 이상의 인간 IGKV 및 인간 IGKJ 유전자로의 대체를 포함하는 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물로서, 인간 IGKV 및 인간 IGKJ 유전자는 내인성 IGKC 유전자에 작동 가능하게 연결되는, 동물.
- 제53항에 있어서, 하나 이상의 내인성 IGKV 및 내인성 IGKJ 유전자는 표 7에서의 모든 인간 IGKV 유전자, 및 표 8에서의 모든 인간 IGKJ 유전자로 대체되는, 동물.
- 제53항에 있어서, 동물은 마우스이고, 표 9에서의 모든 마우스 IGKV 유전자 및 표 10에서의 모든 마우스 IGKJ 유전자가 대체되는, 동물.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 중쇄 가변 도메인(예를 들어, 마우스 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하는 핵산 서열을 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌가 결여되는, 동물.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 경쇄 가변 도메인(예를 들어, 마우스 경쇄 가변 도메인)을 인코딩하는 핵산 서열을 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌가 결여되는, 동물.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체를 생산할 수 있는, 동물.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 동물로부터 얻어지는, 세포.
- 제59항에 있어서, 세포는 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자의 재배열로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 발현하는 B 세포이고, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 비-인간 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 세포.
- 제59항에 있어서, 세포는 하나 이상의 인간 IGKV 유전자 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자의 재배열로부터 유래된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 키메라 면역글로불린 경쇄를 발현하는 B 세포이고, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 세포.
- 제59항에 있어서, 배아 줄기(ES) 세포인, 세포.
- 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항체를 제조하는 방법으로서,
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 동물을 항원에 노출시키는 단계;
동물에서 수집된 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계; 및
하이브리도마에 의해 생성된 키메라 항체를 수집하는 단계를 포함하는, 방법. - 제63항에 있어서, 하이브리도마의 게놈을 서열화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 세포의 게놈을 변형시키는 방법으로서,
인간 염색체를 변형시키는 단계;
변형된 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및
변형된 인간 염색체와 내인성 염색체 간의 재조합을 유도하고, 이에 의해 하나 이상의 내인성 유전자를 하나 이상의 인간 유전자로 대체하는 단계를 포함하는, 방법. - 제65항에 있어서, 변형된 인간 염색체는 둘 이상의 외인성 재조합 부위를 포함하는, 방법.
- 제65항에 있어서, 내인성 염색체는 둘 이상의 외인성 재조합 부위를 포함하는, 방법.
- 제65항에 있어서, 표 1로부터 선택된 적어도 150개의 인간 IGHV 유전자, 표 2로부터 선택된 적어도 20개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3으로부터 선택된 적어도 5개의 인간 IGHJ 유전자는 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합되는, 방법.
- 제65항에 있어서, 표 7에서의 적어도 50개의 인간 IGKV 유전자, 및 표 8에서의 적어도 3개의 인간 IGKJ 유전자는 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합되는, 방법.
- 제65항에 있어서, 인간 서열은 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합되고, 인간 서열은 적어도 50 kb인, 방법.
- 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법으로서,
제1항 내지 제58항 중 어느 한 한의 동물을 항원에 노출시키는 단계;
항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 서열화하는 단계; 및
세포에서, 인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과, 그리고 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결하는 단계를 포함하는, 방법. - 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법으로서,
항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계로서, 세포는 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 동물을 항원에 노출시킴으로써 얻어지는 단계;
인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과, 그리고 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결하는 단계; 및
세포에서 핵산을 발현하고, 이에 의해 항체를 얻는 단계를 포함하는, 방법. - 항원에 특이적으로 결합하는 항체 결합 도메인을 인코딩하는 핵산을 얻는 방법으로서,
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및
항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 서열화하는 단계를 포함하는, 방법. - 샘플을 얻는 방법으로서,
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및
동물로부터 샘플을 수집하는 단계를 포함하는, 방법. - 제74항에 있어서, 샘플은 비장 조직, 비장 세포, 또는 B 세포인, 방법.
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