ES2250105T3 - Anticuerpos policlonales humanos de animales transgenicos no humanos. - Google Patents
Anticuerpos policlonales humanos de animales transgenicos no humanos.Info
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Abstract
Una composición de antisuero policlonal de un animal transgénico no humano que reconoce específicamente un inmunógeno, en la que dicha composición de antisuero comprende principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de una región variable (V), en la que (i) dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, y en la que (ii) dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica.
Description
Anticuerpos policlonales humanos de animales
transgénicos no humanos.
El campo de esta invención es antisuero
policlonal sustancialmente humano para el tratamiento profiláctico y
terapéutico de seres humanos.
La terapia de enfermedades infecciosas causadas
por bacterias, hongos, virus y parásitos está basada en gran medida
en la quimioterapia. Sin embargo, la emergencia de organismos
resistentes a fármacos requiere el continuo desarrollo de nuevos
antibióticos. Al mismo tiempo, el control de infecciones está
amenazado por la emergencia de nuevos patógenos. El número creciente
de individuos inmunocomprometidos debido a malnutrición, SIDA,
terapias médicas del cáncer, enfermedades autoinmunes y transplante
de órganos reduce la eficacia de la terapia de antibióticos y
aumenta la dificultad de controlar las infecciones.
Las terapias de pacientes con malignidades y
cáncer están también basadas en la quimioterapia. Sin embargo,
muchas de estas terapias son ineficaces y la mortalidad de los
pacientes enfermos es alta. Los avances en la tecnología de
anticuerpos monoclonales han proporcionado pocas mejoras debido a la
inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales y a su falta de
potencia. Las respuestas anti-idiotípicas de
anticuerpos en pacientes que experimentan terapia de anticuerpos
monoclonales pueden hacer ineficaz la terapia de anticuerpos.
La terapia del rechazo resistente a esteroides de
órganos transplantados requiere el uso de reactivos biológicos
(preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales) que
inviertan la respuesta aloinmune continua en el receptor del
transplante. Sin embargo, la inmunogenicidad de las preparaciones de
anticuerpos puede hacer ineficaz dicha terapia y evitar la reversión
del rechazo. Como consecuencia, puede rechazarse un órgano
transplantado. De forma similar, las terapias de anticuerpos de
pacientes con enfermedad autoinmune son de éxito limitado debido a
la inmunogenicidad de las preparaciones de anticuerpos. Aunque la
humanización de los anticuerpos reduce la inmunogenicidad, la
eficacia de dichos anticuerpos está limitada por las respuestas
anti-idiotípicas de anticuerpos y la falta de
potencia de los anticuerpos monoclonales. Han de desarrollarse
reactivos no inmunogénicos potentes para la modulación de las
respuestas inmunes.
La terapia de anticuerpos policlonales para el
tratamiento de enfermedades infecciosas se introdujo al final del
siglo pasado. En los años 30, se utilizaba la terapia de suero para
el tratamiento de infecciones bacterianas y víricas, incluyendo
neumonía, meningitis, escarlatina, tos ferina, carbunco, botulismo,
gangrena, tétanos, brucelosis, disentería, tularemia, difteria,
sarampión, poliomielitis, paperas y varicela. Sin embargo, la
administración sistémica de suero animal causaba fiebres,
escalofríos y reacciones alérgicas. La enfermedad sérica aparecía en
10-50% de los individuos tratados.
El potencial de uso de anticuerpos en el
tratamiento de una variedad de indicaciones es muy alto. La
capacidad de unirse específicamente a una entidad diana proporciona
diversas oportunidades de secuestrar y destruir la entidad. Sin
embargo, como se demostró anteriormente, ha habido muchos
impedimentos para el uso de anticuerpos heterólogos y humanizados.
Las limitaciones de los anticuerpos monoclonales añaden el
impedimento adicional de una afinidad reducida. Por tanto, existe
una necesidad apremiante de encontrar modalidades alternativas que
proporcionen protección frente a enfermedades infecciosas y
malignidades o la inmunomodulación de receptores de transplantes y
pacientes de enfermedades autoinmunes.
Las terapias basadas en anticuerpos de
enfermedades infecciosas se revisaron recientemente por A.
Casadevall y M.D. Scharff, Clinical Infectious
Diseases 1995, 150-161.
El uso de anticuerpos para el tratamiento del
cáncer y malignidades se revisó recientemente por C. Botti,
A. Marinetti, S. Nerini-Molteni y L.
Ferrari, Int. J. Biol. Markers 1997;
12(4): 141-147; D.R. Anderson, A.
Grillo-López, C. Varns y K.S.
Chambers, Biochem. Soc. Trans. 1997;
25(2): 705-708; C. Renner, L.
Trumper y M. Pfreundschuh, Leukemia
1997; 11, supl. 2: S55-59; B. Bodey,
S.E. Siegel y H.E. Kaiser, Anticancer Res.
1996; 16(2): 661-674.
El uso de preparaciones de anticuerpos
policlonales para el tratamiento del rechazo de transplantes se
revisó recientemente por N. Bonnefoy-Berard y
J.P. Revillard, J. Heart Lung Transplant 1996;
15(5); 435-442; C. Colby, C.A.
Stoukides y T.R. Spitzer, Ann. Pharmacother.
1996; 30(10): 1164-1174; M.J.
Dugan, T.E. DeFor, M. Steinbuch y A.H.
Filipovich, Ann. Hematol. 1997, 75
(1-2): 41-46.
El uso de terapias de anticuerpos policlonales
para enfermedades autoinmunes se ha descrito por W.
Cendrowski, Boll. Ist Sieroter Milan, 1997;
58(4): 339-343; L.K. Kastrukoff, D.R.
McLean y T.A. McPherson, Can. J. Neurol. Sci.
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Walker, M.M. Hoehn y N. Kashiwagi, J.
Neurol. Sci. 1976; 29 (2-4):
303-309.
La depleción de células grasas utilizando
preparaciones de anticuerpos se ha descrito por L. De Clercq,
J. Mourot, C. Genart, V. Davidts y C.
Boone, J. Anim. Sci. 1997; 75(7):
1791-1797; J.T. Wright y G.J. Hausman,
Obes. Res. 1995; 3(3):
265-272.
La clonación de animales a partir de células se
ha descrito por T. Wakayama, A.C.F. Perry, M.
Zuccotti, K.R. Johnson y R. Yanagachi,
Nature 1998, 394: 369-374; J.B.
Cibelli, S.L. Stice, P.J. Golueke, J.J.
Kane, J. Jerry, C. Blackwell, A. Ponce de
León y J.M. Robl, Science 1998; 280:
1256-1258; J.B. Cibelli, S.L. Stice,
P.J. Golueke, J.K. Kane, J. Jerry, C.
Blackwell, F. Abel de León y J. Robl, Nature
Biotechnology 1998; 16: 642-646; A.E.
Schnieke, A.J. Kind, W.A. Ritchie, K.
Mycock, A.R. Scott, M. Ritchie, I.
Wilmut, A. Colman A. y K.H. Campbell,
Science 1997; 278 (5346): 2130-2133;
K.H. Campbell, J. McWhir, W.A. Ritchie e I.
Wilmut, Nature 1996; 380 (6569):
64-66.
La producción de anticuerpos a partir de animales
transgénicos se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.814.318,
5.545.807 y 5.570.429. Se ejemplifica la recombinación homóloga de
hospedadores mamíferos quiméricos en la patente de EE.UU. nº
5.416.260. Se describe un método para introducir ADN en un embrión
en la patente de EE.UU. nº 5.567.607. Se describe el mantenimiento y
la expansión de células madre embrionarias en la patente de EE.UU.
nº 5.453.357.
Además, los documentos EP A 1288229, así como WO
A 00/26373 se refieren principalmente a la producción de antisuero
utilizando una translocación de inmunoglobulina humana o humanizada
en animales no conversores de genes. Los loci de inmunoglobulina
humana descritos en estas referencias no contienen secuencias de
codificación de Ig humana múltiples flanqueadas/separadas por
secuencias múltiples no de codificación derivadas de animales.
Además, los loci de inmunoglobulina humana o humanizada descritos en
estas referencias no soportan la conversión génica y, por lo tanto,
dan como resultado la expresión de anticuerpos que contienen una
región variable codificada por un solo segmento de gen V, incluso en
animales conversores de genes. El documento WO 00/31141 se refiere a
anticuerpos humanizados específicos del antígeno de superficie de
HPV pre-S1, que muestran una afinidad de unión
similar al anticuerpo monoclonal de ratón y mostraron
inmunogenicidades reducidas, ya que tienen menos restos
aminoacídicos derivados de ratón.
Se proporcionan anticuerpos policlonales de un
antígeno específico y un animal transgénico no humano, que
comprenden loci de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada
genéticamente alterados o al menos una porción de loci de
inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana. Se utiliza un
método que emplea la modificación por etapas de un animal doméstico
en el que el repertorio de anticuerpos se diversifica principalmente
mediante conversión génica (por ejemplo, conejos, ovejas, cerdos,
vacas). El método implica el reemplazo mediante recombinación
homóloga de elementos endógenos de los loci de inmunoglobulina por
las correspondientes contrapartidas humanas, en particular, el
reemplazo de uno o varios exones que codifican regiones constantes
de cadena pesada y ligera y uno o varios elementos de región
variable, incluyendo el proximal al locus de la región D. En
animales, cuando la diversidad de anticuerpos se genera
predominantemente mediante conversión génica, el reemplazo de la
región V más proximal a la región D por un elemento de la región V
humana da como resultado la expresión del elemento V humano en la
mayoría de las inmunoglobulinas. Esta ingeniería genética es seguida
por la crianza de hospedadores de la misma especie y la selección de
un hospedador que sea capaz de responder a la inmunización con la
producción de antisuero sustancialmente humano con glicosilación de
hospedador, teniendo la inmunoglobulina al menos una porción
funcional de la cadena pesada humana. Los animales que expresan las
inmunoglobulinas de secuencia proteica sustancialmente humana se
utilizan para la generación de preparaciones de anticuerpos
policlonales mediante inmunización con inmunógenos de interés,
particularmente, inmunógenos que inician la producción de
anticuerpos que tienen actividad terapéutica. Después de la
purificación del antisuero, dicho antisuero puede utilizarse, por sí
mismo o en combinación, con otros reactivos para la depleción de
reactivos infecciosos, células malignas, cánceres, células diana
indeseables o inmunomodulación.
Se proporcionan métodos para la producción de
antisuero sustancialmente humano en un hospedador heterólogo
mediante la inmunización del hospedador con un inmunógeno. En
particular, se proporciona una composición de antisuero policlonal
de un animal transgénico no humano que reconoce específicamente un
inmunógeno, en la que dicha composición de antisuero comprende
principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden
al menos una porción de una región constante de cadena pesada
humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas
por fragmentos de más de un gen de región variable (V), (i) en la
que dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen
específicamente a dicho inmunógeno, y (ii) en la que dicho animal
transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos
principalmente mediante conversión génica. El hospedador se
caracteriza por ser al menos sustancialmente incapaz de producir
antisuero endógeno y capaz de producir principalmente antisuero
polipeptídico sustancialmente humano tras la exposición a una
sustancia inmunogénica; y por retener su capacidad de transposición
de los locus de inmunoglobulina y recombinación de las regiones V,
(D_{H}), J y C produciendo antisuero de proteína sustancialmente
humano, que incluye al menos una región constante de inmunoglobulina
humana y/o al menos un elemento de región variable (V) humana. Son
de interés particular las regiones constantes de las subclases
C\alpha o C\gamma, incluyendo cualquiera de las subclases 1, 2,
3 y 4. Los fragmentos de ADN que codifican regiones constantes y
elementos variables humanos se integran en el genoma mediante
recombinación homóloga y reemplazan los elementos endógenos
correspondientes.
Pueden emplearse diversos animales,
particularmente animales domésticos, que pueden proporcionar
volúmenes razonables de antisuero. Los animales son generalmente de
al menos 1 kg, preferiblemente 2 kg, y pueden ser de 5 kg o más
cuando son adultos, sin embargo, pueden utilizarse animales menores
según sea apropiado. También el periodo de gestación debería ser
menor de 12 meses, estando habitualmente en el intervalo de 1 a 4
meses. Los animales ilustrativos incluyen lagomorfos, por ejemplo,
conejos, animales ovino, bovino, canino, felino, equino y similares,
excluyendo múridos. Los animales son aquellos en que la
diversificación del repertorio de anticuerpos se realiza
principalmente mediante conversión génica (concretamente, conejos,
cerdos, ovejas, vacas). En estos animales, el reemplazo del elemento
de la región V proximal a la región D por un elemento de región V
humana dará como resultado la expresión del elemento de región V
humana en la mayoría de las inmunoglobulinas. El enfoque de
ingeniería genética descrito de la invención en cuestión es
sustancialmente más sencillo que otros enfoques que se han realizado
con ratones. Sin embargo, en ratones, la diversificación del
repertorio de anticuerpos se realiza principalmente mediante
transposición génica.
Las células hospedadoras, por ejemplo,
fibroblastos, queratinocitos, miocitos, hepatocitos, células
epiteliales u otras células que pueden hacerse crecer y expandirse
en cultivo y no tienen un genoma transpuesto, se transforman (se
modifican genéticamente) mediante la introducción de fragmentos de
ADN en las células, donde los fragmentos se integran en el genoma
hospedador. La introducción puede ser mediante una variedad de
métodos, incluyendo ADN desnudo, transfección con un vector vírico,
fusión, biolística, liposomas, etc. El método particular se
seleccionará según el fin de la introducción del ADN y la eficacia
de la integración. Los loci de cadena ligera y pesada de
inmunoglobulina funcionales se modifican mediante recombinación
homóloga, reemplazando al menos una porción de la región constante
de cadena pesada del hospedador por al menos una porción funcional
de la región constante de cadena pesada humana y, si se desea,
análogamente la región constante de cadena ligera del hospedador por
una región constante de cadena ligera humana. Es también de
particular interés el reemplazo de la región V más proximal a la
región D por un elemento de región V humana. De este modo, aunque
algunas porciones de la inmunoglobulina sean secuencias de
hospedador, no es probable que el antisuero cause una fuerte
respuesta inmune a la vista de la gran variedad de regiones
variables en el antisuero. En animales en los que la diversidad de
anticuerpos se genera principalmente mediante conversión génica, el
reemplazo de la región V más proximal a la región D por un elemento
de región V humana da como resultado la expresión del elemento V
humano en la mayoría de las inmunoglobulinas. Para el reemplazo de
regiones constantes, es de particular interés incluir al menos 2 de
los 3 dominios C_{H1}, C_{H2} y C_{H3} de la región constante,
incluyendo particularmente C_{H3}. En la medida en que dicho
antisuero pueda funcionar en un hospedador, particularmente un
hospedador inmunocomprometido, es atractivo el número reducido de
etapas para conseguir hospedadores que produzcan dicho
antisuero.
Para la integración en un sitio predeterminado,
se preparan constructos que incluyen, secuencialmente, el fragmento
de ADN para integración y un primer gen marcador limitado por
secuencias homólogas de al menos aproximadamente 30 nt y un segundo
gen marcador, con lo que la integración homóloga da como resultado
la pérdida del segundo gen marcador. Al tener el segundo gen
marcador que proporciona selección negativa, se seleccionan
negativamente las células con el segundo gen marcador y se retiran
de la mezcla celular; al tener el primer gen marcador que
proporciona selección positiva, se retienen las células que tienen
el primer gen marcador, utilizando un medio al que el segundo gen
marcador sea sensible. De esta manera, se reducen aquellas células
en las que el constructo se integra aleatoriamente. Al seguir con un
medio selectivo del primer gen marcador, se reducirán las células
que no retienen el primer gen marcador. De este modo, las células
restantes deberían ser aquellas que tienen recombinación homóloga.
Deseablemente, las células están en un estado de proliferación
rápida, en lugar de un estado de no proliferación. Al emplear un
medio de crecimiento tal como RPMI1640 o DMEM, suplementado con FCS
y factores de crecimiento, puede inducirse un ciclo de
crecimiento.
Después de haber transformado o transfectado las
células, se ponen las células en un medio selectivo según el
marcador empleado, habitualmente un gen de resistencia a antibiótico
o el gen tk. Se expanden las células en cultivo y después se clonan.
En las células individuales en los clones, puede después examinarse
la modificación genética deseada. Convenientemente, puede utilizarse
PCR para identificar que ha tenido lugar la modificación, deleción o
integración deseada.
Las modificaciones genéticas pueden ser una
modificación sencilla o, si se desea, después de la expansión de
células que tienen la primera modificación, las células pueden
someterse después a una segunda modificación. Por ejemplo, después
de reemplazar las regiones constantes de cadena pesada, pueden
reemplazase las regiones constantes de cadena ligera.
Cuando aparece una modificación individual, puede
utilizarse un solo marcador para selección positiva y utilizarse
repetidamente el mismo marcador. Cuando se generan dos o más
modificaciones en la misma célula, deberían utilizarse diferentes
marcadores de selección positiva para seleccionar independientemente
en cada etapa. Como ya se indicó, existen numerosos genes de
resistencia a antibióticos, dichos genes pueden utilizarse en
combinación, permitiendo la selección en cada etapa. Los genes
útiles para selección incluyen neo, tet, cam, tk, pen, mtx, etc.
Después de haber modificado las células hospedadoras y demostrado
que tienen la modificación deseada, pueden fusionarse después las
células con células unitarias de transferencia nuclear enucleadas,
por ejemplo, oocitos o células madre embriónicas, células que son
totipotentes y capaces de formar un neonato funcional. La fusión se
realiza según técnicas convencionales que están bien establecidas.
Véase, por ejemplo, Cibelli et al., Science (1998),
280: 1256. Como alternativa, la enucleación de oocitos y la
transferencia nuclear pueden realizarse mediante microcirugía
utilizando pipetas de inyección. (Véase, por ejemplo, Wakayama et
al., Nature (1998) 394: 369). Las células huevo
funcionales resultantes se cultivan después en un medio apropiado y
se transfieren a recipientes sincronizados.
Otro método para producir células unitarias de
transferencia nuclear es introducir constructos de ADN que
comprenden transgenes humanos en huevos fertilizados. Los huevos
pueden expandirse después proporcionando células madre embriónicas,
en las que se examina la modificación genética deseada y la
posterior transferencia embriónica a madres de crianza, donde los
huevos se llevan a término, y en los neonatos resultantes se examina
el genotipo modificado.
Los hospedadores mutados resultantes pueden
utilizarse entonces para criar con otros hospedadores mutados. Por
ejemplo, pueden criarse hospedadores con un locus de inmunoglobulina
de cadena pesada alterada con hospedadores que tienen un locus de
inmunoglobulina de cadena ligera alterada para criar un hospedador
capaz de producir inmunoglobulinas polipeptídicas sustancialmente
humanas. Los hermanos hemicigóticos que contienen los dos genes
mutados se crían después para producir hermanos homocigóticos. La
homocigosidad puede determinarse fácilmente por la ausencia de las
secuencias génicas indeseadas. Después de cada crianza, se ensaya en
el hospedador la presencia de la modificación genética en sus
células, particularmente las células germinales, y puede criarse una
generación adicional, habitualmente no más de tres generaciones,
para asegurar que la modificación se mantiene establemente a lo
largo de generaciones sucesivas. Puede analizarse en los genomas de
las diversas progenies el mantenimiento de las modificaciones
genéticas o, según sea apropiado, puede analizarse en la progenie el
cambio biológico que generó la modificación genética.
Una vez se ha generado el hospedador, puede
utilizarse ahora el hospedador para producir antisuero en una
variedad de condiciones. Dependiendo del uso del antisuero, pueden
utilizarse antígenos, inmunógenos que comprenden un hapteno unido
covalentemente a un antígeno, organismos, por ejemplo, virus y
organismos unicelulares vivos, atenuados o muertos, fragmentos de
organismos, orgánulos, células, particularmente células humanas o
fragmentos de células, o similares. Por tanto, el antisuero puede
dirigirse a un antígeno, una molécula orgánica pequeña o una célula,
pudiendo ser las diversas entidades endógenas o exógenas al
hospedador humano. La composición de inmunización puede
administrarse de cualquier manera conveniente, con o sin un
coadyuvante, y puede administrarse según un esquema predeterminado.
La afinidad por la composición de inmunización puede monitorizarse
después, y recogerse el antisuero cuando el antisuero tenga la
especificidad y afinidad deseadas. La afinidad del antisuero será
generalmente de al menos aproximadamente 10^{-7}, habitualmente al
menos aproximadamente 10^{-8}, preferiblemente al menos
aproximadamente 10^{-9} o mayor.
Para algunas aplicaciones, pueden utilizarse
hospedadores en los que el elemento V proximal a las regiones D se
ha reemplazado por diversos elementos de región V humana. De este
modo, se obtendrán diferentes respuestas inmunes al mismo inmunógeno
por los diferentes hospedadores, pudiendo estar proporcionando la
región de secuencia variable diferentes alelos como resultado de la
conversión génica. Los antisueros de los diferentes hospedadores
pueden mezclarse para proporcionar un repertorio más amplio de
anticuerpos. Pueden emplearse hasta 10 o más hospedadores
diferentes, dependiendo del antígeno de interés.
Las preparaciones de anticuerpos se obtienen
fraccionando sangre de animales modificados por ingeniería genética
que expresan inmunoglobulinas de secuencia humana. Puede prepararse
una fracción de inmunoglobulina concentrada mediante cromatografía
(afinidad, intercambio iónico, permeación sobre gel, etc.),
precipitación selectiva con sales tales como sulfato de amonio,
disolventes orgánicos tales como etanol o polímeros tales como
polietilenglicol.
Los anticuerpos fraccionados pueden disolverse o
diluirse en medios no tóxicos no pirógenos adecuados para
administración intravenosa a seres humanos, por ejemplo, solución
salina tamponada estéril. En algunas aplicaciones, las preparaciones
de anticuerpos pueden aplicarse directamente al epitelio. Para
dichas aplicaciones, los anticuerpos fraccionados pueden disolverse
en un gel soluble en agua tal como gelatina KY y similares.
Las preparaciones de anticuerpos utilizadas para
administración se caracterizan generalmente por contener una
población de anticuerpos policlonales que tienen concentraciones de
inmunoglobulina de 0,1 a 100 mg/ml, más habitualmente de 1 a 10
mg/ml. La preparación de anticuerpos puede contener inmunoglobulinas
de diversos isotipos. Como alternativa, la preparación de
anticuerpos puede contener anticuerpos de sólo un isotipo, o una
serie de isotipos seleccionados.
En la mayoría de los casos, la preparación de
anticuerpos consistirá en inmnoglobulinas no modificadas. Como
alternativa, la fracción de inmunoglobulina puede someterse a
tratamiento tal como digestión enzimática (por ejemplo, con pepsina,
papaína, plasmina, glicosidasas, nucleasas, etc.), calentamiento,
etc., y/o fraccionarse adicionalmente.
Las preparaciones de anticuerpo se administran
generalmente al sistema vascular, convenientemente por vía
intravenosa mediante inyección o infusión a través de un catéter
implantado en una vena apropiada. La preparación de anticuerpos se
administra a una velocidad apropiada, generalmente en el intervalo
de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, más
habitualmente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 6
horas, según la velocidad a la que el líquido pueda aceptarse por el
paciente. La administración de la dosificación eficaz puede tener
lugar en una sola infusión o en una serie de infusiones. Pueden
administrarse infusiones repetidas una vez al día, una vez a la
semana, una vez al menos o una vez cada tres meses, dependiendo de
la semivida de la preparación de anticuerpos y de la indicación
clínica. Para aplicaciones sobre superficies epiteliales, las
preparaciones de anticuerpo se aplican a la superficie necesitada de
tratamiento en una cantidad suficiente para proporcionar el
resultado final pretendido, y pueden repetirse en caso
necesario.
Las preparaciones de anticuerpos encuentran uso
por su capacidad de unirse a y neutralizar entidades antigénicas en
tejidos del cuerpo humano que causan enfermedades o que desencadenan
respuestas inmunes indeseadas o anormales. Una "entidad
antigénica" se define en la presente memoria por abarcar
cualquier molécula soluble o unida a la superficie celular,
incluyendo proteínas, así como células u organismos causantes de
enfermedades infecciosas o agentes que son al menos capaces de
unirse a un anticuerpo y preferiblemente son también capaces de
estimular una respuesta inmune.
La administración de una preparación de
anticuerpos frente a un agente infeccioso como monoterapia o en
combinación con quimioterapia da como resultado la eliminación de
partículas infecciosas. Una sola administración de anticuerpos
reduce el número de partículas infecciosas generalmente de 10 a 100
veces, más habitualmente más de 1.000 veces. De forma similar, la
terapia con anticuerpos en pacientes con enfermedades malignas como
monoterapia o en combinación con quimioterapia reduce el número de
células malignas generalmente de 10 a 100 veces, o más de 1.000
veces. La terapia puede repetirse durante un periodo extendido de
tiempo para asegurar la eliminación completa de partículas
infecciosas, células malignas, etc. En algunos casos, la terapia con
preparaciones de anticuerpos continuará durante periodos extendidos
de tiempo en ausencia de cantidades detectables de partículas
infecciosas o células indeseables. De forma similar, el uso de
terapia de anticuerpos para la modulación de las respuestas inmunes
puede consistir en administraciones únicas o múltiples de
anticuerpos terapéuticos. La terapia puede continuarse durante
periodos extendidos de tiempo en ausencia de cualquier síntoma de
enfermedad.
El tratamiento en cuestión puede emplearse junto
con quimioterapia a dosificaciones suficientes para inhibir
enfermedades infecciosas o malignidades. En pacientes con enfermedad
autoinmune o receptores de transplantes, la terapia de anticuerpos
puede emplearse junto con terapia inmunosupresiva a dosificaciones
suficientes para inhibir las reacciones inmunes.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Se integran los exones que codifican elementos de
región constante y elementos de región variable humanas en el genoma
de fibroblastos de conejo mediante recombinación homóloga. Se
transfectan los fibroblastos de conejo con diversos constructos de
ADN linealizados que contienen elementos de locus de inmunoglobulina
humana. Se seleccionan las células transfectadas exitosamente y se
utilizan para la clonación de conejos.
Se hacen superovular conejas Dutch Belton maduras
mediante inyección subcutánea de hormona estimulante de folículo
(FSH) cada 12 horas (0,3 mg x 2 y 0,4 mg x 4). Se induce la
ovulación mediante la administración intravenosa de 0,5 mg de
hormona luteinizante (LH) 12 horas después de la última inyección de
FSH. Se recuperan los oocitos mediante lavado oviductal 17 horas
después de la inyección de LH. Se enuclean mecánicamente los oocitos
16-19 horas después de la maduración. Se evalúa la
retirada cromosómica con tinción con bisBENZIMIDE (HOECHST 33342,
Sigma, St. Louis, MO) bajo luz ultravioleta. Se fusionan los oocitos
enucleados con fibroblastos en división activa utilizando un pulso
eléctrico de 180 V/cm durante 15 \mus (Electrocell Manipulator
200, Genetronics, San Diego, CA). Después de 3-5
horas, se activan químicamente los oocitos con ionóforo de calcio (6
\muM) durante 4 min (nº 407952, Calbiochem, San Diego, CA) y
6-dimetilaminopurina 2 mM (DMAP, Sigma) en medio CR2
(Specialty Media, Lavalett, NJ) con albúmina de suero bovino 3 mg/ml
(exenta de ácidos grasos, Sigma) durante 3 horas. Después de la
activación, se lavan los embriones con medio de cultivo de embrión
de hámster (HECM)-Hepes cinco veces y posteriormente
se cultivan en medio CR2 que contiene 3 mg/ml de BSA exenta de
ácidos grasos durante 7 días a 37,8ºC y 5% de CO_{2} en el aire.
Se transfieren después los embriones a recipientes sincronizados. Se
analiza en la progenie mediante PCR un segmento del transgén.
Se inmunizan por vía intramuscular conejos
modificados por ingeniería genética (como se describe anteriormente)
con antígeno de superficie de hepatitis B purificado (HBsAg) (10
\mug en coadyuvante incompleto de Freund) el día 0 y el día 14. El
día 28, se toma sangre a los animales de la oreja y se prepara
suero. Se recubren placas ELISA (NUNC, Dinamarca) con HBsAg 1
\mug/ml en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, se bloquean los sitios de unión disponibles mediante
incubación con leche desecada desnatada al 1% (NFM) en PBS (300
\mul/pocillo). Se diluye el suero de conejo en PBS/1% de NFM y se
añade a los pocillos recubiertos. Después de una incubación de 1
hora, se lavan las placas 3 veces con PBS/0,05% de Tween 20 y se
detecta la Ig unida utilizando Ig de cabra
anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano
picante. Se detecta el anticuerpo de cabra conjugado utilizando
diclorhidrato de o-fenilendiamina (Sigma) a 1 mg/ml.
Se detiene la reacción colorimétrica mediante la adición de una
solución de HCl 1 M y se mide la absorbancia a 490 nm. Como control,
se utiliza suero de conejos no inmunizados. El suero de conejos no
inmunizados no reacciona con HBsAg. A una dilución de 1:100, la
densidad óptica medida en pocillos no recubiertos y recubiertos con
HBsAg está por debajo de 0,4. En contraposición, el suero de conejos
inmunizados contiene anticuerpos sustancialmente humanos reactivos
con HBsAg. A una dilución de suero de 1:100, la densidad óptica
medida es 2,8. Tras una dilución posterior del suero, la densidad
óptica medida se reduce a 0,2 (a una dilución de 25.600). No pueden
detectarse anticuerpos reactivos con un conjugado de
IgG-HRP de cabra anti-conejo. Esto
demuestra que los conejos modificados por ingeniería genética
producen anticuerpos anti-HBsAg sustancialmente
humanos después de inmunización.
Se marca con 0,1 mCi de ^{51}Cr en 100 \mul
de PBS durante 1 h a 37ºC una estirpe celular de carcinoma hepático
humano que expresa HBsAg. Se incuban 2.000 células marcadas con
^{51}Cr con suero de conejos modificados por ingeniería genética
que expresan inmunoglobulina anti-HBsAg (véase
anteriormente). Después de 2 horas a 37ºC, se determina la
liberación de ^{51}Cr en el sobrenadante midiendo la radiactividad
utilizando un contador de centelleo. Para la determinación de la
liberación máxima, se añade Triton X100 al 1%. Se calcula el grado
de lisis celular de la siguiente manera: % de lisis= CPM
experimentales \pm CPM espontáneas / CPM totales \pm CPM
espontáneas. La incubación de las células marcadas con suero
(diluido 1:30) de conejos no inmunizados no da como resultado la
lisis celular (<10%). Sin embargo, la incubación de células con
suero de conejos inmunizados causa un 80% de lisis celular. La
inactivación del complemento en el suero mediante tratamiento
térmico (56ºC durante 30 minutos) vuelve inactivo el suero de
conejos inmunizados. Estos resultados demuestran que los anticuerpos
sustancialmente humanos producidos mediante conejos modificados por
ingeniería genética se unen a células positivas de HBsAg y causan
una lisis dependiente del complemento.
Se purifica inmunoglobulina sustancialmente
humana del suero de conejos modificados por ingeniería genética
mediante precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de
intercambio iónico. Se inyectan ratones SCID con un millón de
células de carcinoma hepático humano que expresan HBsAg.
Posteriormente, se inyectan por vía peritoneal 25 \mug de
inmunoglobulina una vez al día. Los animales tratados con
anticuerpos aislados a partir de suero de conejo no inmunizado
mueren después de aproximadamente 60 días. Esto es similar a
receptores no tratados de células de carcinoma hepático. En
contraposición, los ratones tratados con anticuerpos aislados a
partir de suero de conejo inmunizado sobreviven durante más de 150
días. Esto demuestra que los anticuerpos humanos producidos en
conejos modificados por ingeniería genética son capaces de eliminar
células de carcinoma humano de ratones SCID.
Resulta evidente por los resultados anteriores
que utilizando conejos modificados por ingeniería genética que
expresan genes de inmunoglobulina sustancialmente humanos, pueden
generarse preparaciones de anticuerpos policlonales contra
antígenos, partículas infecciosas, células cancerosas y similares.
Dichas preparaciones de anticuerpos policlonales pueden utilizarse
para tratar pacientes que padecen una enfermedad infecciosa o una
malignidad. El antisuero puede utilizarse también para modular una
respuesta inmune mediante la eliminación de subpoblaciones
celulares, citocinas o similares. La preparación de anticuerpo
humano tiene una probabilidad sustancialmente reducida de generar
una respuesta inmune en pacientes humanos, comparado con antisuero
heterólogo, tendrá pocos efectos secundarios y puede utilizarse con
seguridad con resultados positivos.
Resultará evidente para un experto en la técnica
que pueden hacerse muchos cambios y modificaciones sin apartarse del
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (35)
1. Una composición de antisuero policlonal de un
animal transgénico no humano que reconoce específicamente un
inmunógeno, en la que dicha composición de antisuero comprende
principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden
al menos una porción de una región constante de cadena pesada
humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas
por fragmentos de más de una región variable (V), en la que (i)
dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente
a dicho inmunógeno, y en la que (ii) dicho animal transgénico no
humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante
conversión génica.
2. La composición de antisuero policlonal según
la reivindicación 1, en la que dicho animal transgénico no humano
comprende al menos una porción de genes de inmunoglobulina de cadena
pesada humana funcional que incluye más de un gen de región V
integrado mediante recombinación homóloga en su genoma.
3. El antisuero policlonal según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende principalmente
moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos dos de
las regiones constantes de cadena pesada humana C_{H1}, C_{H2} y
C_{H3}.
4. El antisuero policlonal según la
reivindicación 3, que comprende principalmente moléculas de proteína
inmunoglobulina que comprenden la región constante de cadena pesada
humana C_{H3}.
5. La composición de antisuero policlonal según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que en el genoma
de dicho animal no humano el gen de la región V proximal a la región
D está reemplazado por un gen de la región V humana.
6. La composición de antisuero policlonal según
la reivindicación 5, que comprende antisueros de diversos animales
no humanos en los que el gen de la región V proximal a la región D
está reemplazado por diferentes genes de la región V humana.
7. La composición de antisuero policlonal según
la reivindicación 6, que comprende antisueros de hasta 10 animales
no humanos diferentes.
8. La composición de antisuero policlonal según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una afinidad
de al menos aproximadamente 10^{-7}.
9. La composición de antisuero policlonales según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una afinidad
de al menos aproximadamente 10^{-8}.
10. La composición de antisuero policlonales
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una
afinidad de al menos aproximadamente 10^{-9}.
11. La composición de antisuero policlonal según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho
animal transgénico no humano es del orden de los lagomorfos.
12. La composición de antisuero policlonal según
la reivindicación 11, en la que dicho animal transgénico no humano
se selecciona del grupo constituido por conejo, animales ovino,
bovino, canino, felino y equino.
13. La composición de antisuero policlonal según
la reivindicación 12, en la que dicho animal transgénico no humano
es un conejo, un cerdo, una oveja o una vaca.
14. Un animal transgénico no humano que pesa al
menos 1 kg, que comprende al menos una porción de genes de
inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional integrada mediante
recombinación homóloga en su genoma, en el que dicha porción de
genes de inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional se
transpone en fase con genes de inmunoglobulina de cadena pesada
endógenos de dicho animal no humano, codificando moléculas de
anticuerpo funcional que comprenden al menos una porción de una
región constante de cadena pesada humana y secuencias aminoacídicas
de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de
región variable (V), en el que dicho animal transgénico no humano
genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante
conversión génica y produce dichas moléculas de anticuerpo funcional
cuando se inmuniza.
15. Un animal transgénico no humano que pesa al
menos 1 kg, que comprende al menos una porción de genes de
inmunoglobulina de cadena ligera humana funcional integrada mediante
combinación homóloga en su genoma, en el que dicha porción de genes
de inmunoglobulina de cadena ligera humana funcional se transpone en
fase con genes de inmunoglobulina de cadena ligera endógenos de
dicho animal no humano, codificando moléculas de anticuerpo
funcional que comprenden al menos una porción de una región
constante de cadena ligera humana y secuencias aminoacídicas de
región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de
región variable (V), en el que dicho animal transgénico no humano
genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante
conversión génica y produce dichas moléculas de anticuerpo funcional
cuando se inmuniza.
16. El animal transgénico no humano según la
reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que dicho animal
transgénico no humano es del orden de los lagomorfos.
17. El animal transgénico no humano según la
reivindicación 14, en el que dicha porción de genes de
inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional comprende al menos
un gen de región constante.
18. El animal transgénico no humano según la
reivindicación 14, en el que dichos genes de región variable
comprenden el gen de región variable proximal a la región D.
19. El animal transgénico no humano según la
reivindicación 15, en el que dicho gen de cadena ligera de
inmunoglobulina humana codifica la cadena \kappa de
inmunoglobulina.
20. Un método in vitro para neutralizar
una entidad antigénica en un componente del cuerpo humano,
comprendiendo dicho método: poner en contacto dicho componente del
cuerpo con una composición de antisuero según cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, en el que las moléculas de
proteína inmunoglobulina en la composición de antisuero se unen
específicamente a y neutralizan dicha entidad antigénica.
21. El método según la reivindicación 20, en el
que dicha entidad antigénica es de un organismo que causa una
enfermedad infecciosa.
22. El método según la reivindicación 20, en el
que dicha entidad antigénica es una molécula de superficie
celular.
23. El método según la reivindicación 22, en el
que dicha molécula de superficie celular es de un linfocito o un
adipocito.
24. El método según la reivindicación 20, en el
que dicha entidad antigénica es una citocina humana o una quimiocina
humana.
25. El método según la reivindicación 20, en el
que dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular
sobre una célula cancerosa maligna.
26. El uso de una composición de antisuero según
cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para la
preparación de un medicamento para neutralizar una entidad
antigénica en un componente del cuerpo humano.
27. El uso según la reivindicación 26, en el que
dicha entidad antigénica es de un organismo que causa una enfermedad
infecciosa.
28. El uso según la reivindicación 26, en el que
dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular.
29. El uso según la reivindicación 28, en el que
dicha molécula de superficie celular es de un linfocito o un
adipocito.
30. El uso según la reivindicación 26, en el que
dicha entidad antigénica es una citocina humana o una quimiocina
humana.
31. El uso según la reivindicación 26, en el que
dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular sobre
una célula cancerosa maligna.
32. Un método de producción de un animal
transgénico no humano que comprende al menos una porción de genes de
inmunoglobulina humana funcional integrada mediante recombinación
homóloga en su genoma, en el que dicha porción de genes de
inmunoglobulina humana funcional se transpone en fase con genes de
inmunoglobulina humana endógenos de dicho animal no humano,
codificando moléculas de anticuerpo funcionales que comprenden al
menos una porción de regiones constantes de inmunoglobulina humana,
y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por
fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que dicho
animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos
principalmente mediante conversión génica y produce dichas moléculas
de anticuerpo funcional cuando se inmuniza, comprendiendo dicho
método:
producir un primer animal mutado que comprende
loci de inmunoglobulina de cadena pesada, en el que genes de la
región constante y/o variable están reemplazados por uno o varios
exones del locus de inmunoglobulina de cadena pesada humana mediante
alteración genética de un núcleo celular de dicho animal,
introduciendo dicho núcleo celular en una primera célula unitaria de
transferencia nuclear enucleada, proporcionando una primera célula
madre embriónica, e introduciendo dicha primera célula unitaria de
transferencia nuclear en un hospedador receptor hembra para producir
un primer neonato mutado;
producir un segundo animal mutado que comprende
loci de inmunoglobulina de cadena ligera, en el que genes de la
región constante y/o variable están reemplazados por uno o varios
exones del locus de inmunoglobulina de cadena ligera humana mediante
alteración genética de un núcleo celular de dicho animal,
introduciendo dicho núcleo celular en una segunda célula unitaria de
transferencia nuclear enucleada, proporcionando una segunda célula
madre embriónica, e introduciendo dicha segunda célula unitaria de
transferencia nuclear en un hospedador receptor hembra para producir
un segundo neonato mutado; y
criar hasta la madurez los primer y segundo
neonatos mutados y seleccionar animales capaces de producir
antisueros que comprenden principalmente moléculas de proteína
inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de regiones
constantes de inmunoglobulina humana, y secuencias aminoacídicas de
región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de
región variable (V), en el que (i) dichas moléculas de proteína
inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, (ii) en
el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de
anticuerpos principalmente mediante conversión génica.
33. Un método de producción de un animal
transgénico no humano que pesa al menos 1 kg, que comprende al menos
una porción de genes de inmunoglobulina humana funcional integrada
mediante recombinación homóloga en su genoma, en el que dicha
porción de genes de inmunoglobulina humana funcional se transpone en
fase con genes de inmunoglobulina humana endógenos de dicho animal
no humano, codificando moléculas de anticuerpo funcionales que
comprenden secuencias aminoacídicas de región variable codificadas
por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que
dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de
anticuerpos principalmente mediante conversión génica y produce
dichas moléculas de anticuerpo funcional cuando se inmuniza,
comprendiendo dicho método:
producir un animal mutado que comprende loci de
inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los que genes de la
región constante y/o variable están reemplazados por uno o varios
exones del locus de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera
humana mediante alteración genética de un núcleo celular de dicho
animal, introduciendo dicho núcleo celular en una célula unitaria de
transferencia nuclear enucleada, proporcionando una célula madre
embriónica, e introduciendo dicha célula unitaria de transferencia
nuclear en un hospedador receptor hembra para producir un neonato
mutado; y
criar hasta la madurez los neonatos mutados y
seleccionar animales capaces de producir antisueros que comprenden
principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden
al menos una porción de una región constante de cadena pesada
humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas
por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que
(i) dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen
específicamente a dicho inmunógeno, y (ii) en el que dicho animal
transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos
principalmente mediante conversión génica.
34. El método según la reivindicación 33 o la
reivindicación 34, en el que dicho animal es del orden de los
lagomorfos.
35. El método según la reivindicación 33 o la
reivindicación 34, en el que dicho animal comprende un gen de región
variable proximal a la región D.
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