WO2004031385A1 - ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター - Google Patents

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WO2004031385A1
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cell
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Mitsuo Oshimura
Motonobu Katoh
Kazuma Tomizuka
Yoshimi Kuroiwa
Minoru Kakeda
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a human artificial chromosome (HAC) vector and a production method thereof.
  • the present invention also relates to a method for introducing foreign DNA using a human artificial chromosome vector and a method for producing foreign DNA-expressing cells.
  • the present invention relates to a method for producing a protein.
  • Vectors for introducing and expressing foreign genes in mammalian cells are not only an essential tool in basic life science research, but also in the resulting industries (eg mass production of pharmaceuticals) and medicine (eg gene therapy). It has played an important role in practical application. Advances in genetic engineering since the late 1970s have facilitated the isolation and amplification (gene cloning) of specific gene DNA fragments in E. coli and yeast. Traditionally, cloned DNA has been used for gene transfer into mammalian cells.
  • an artificial expression unit in which a promoter capable of functioning in mammalian cells and a poly-A addition site are linked to the coding region of the gene (cDNA) to be expressed, or in addition to the coding region Escherichia coli plasmids (up to 20 kb: circular), cosmids (up to 40 kb: circular), bacterial artificial chromosomes (BAC; up to 200 kb), including genomic DNA fragments including the original promoter and poly A addition site It is widely used to produce yeast artificial chromosomes (YAC; longest 1Mb: linear) in a circular or linear form, and transfer or inject them into cells.
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • the introduced vector DNA does not contain a mammalian origin of replication, the vector cannot be replicated after being introduced into the cell, and is lost as the cell divides. become transient.
  • the origin of replication when included, multiple copies are temporarily made in the cell, but since it is not evenly distributed to the daughter cells accompanying cell division, it is gradually lost in the absence of selective pressure. Therefore, also in this case, the expression is transient. It is possible to select a cell line that constitutively expresses the transgene by simultaneously introducing a drug resistance gene and applying selective pressure by the drug. In this case, the introduced gene is integrated into the host cell chromosome. (Integration) This integration affects both the transgene and the host chromosome.
  • One method for solving such problems is to construct an artificial chromosome that can replicate / distribute autonomously using animal cells containing baboons as hosts, and introduce genes into animal cells using this as a vector. That is.
  • HAC Human Artificial Chromosome
  • the purpose is to construct a HAC, and the insertion of foreign genes has not been studied.
  • a chromosome itself is a collection of genes and has the elements necessary for autonomous replication and distribution.
  • the use of a single chromosome or fragment thereof as a gene transfer tool for the purpose of introducing a large Mb-unit gene that exceeds the capacity of existing cloning vectors such as YAC is realized by the micronucleus fusion method.
  • Human embryonic stem cells can be transfected with human chromosomes 14, 22, and 22 containing antibody genes to produce chimeric individuals, the transferred antibody genes can function in individuals, and human chromosome fragments can be expressed as quinula. It has been shown to be stably maintained in individuals and to be transmitted to the next generation via the germ line (Tomizuka et al., Nature Genet.
  • Chromosome fragment derived from radiohybrid cells (2-3 Mb) is stably retained in hamster cells and contains human chromosome 1 centromere, part of its long arm and SDHC (succinate dehydrogenase complex, subunit 0 gene) G418 resistance gene was inserted by homologous recombination in the SDHC region X-ray cell fusion was performed using mouse cells (L and 3 T 3) to obtain G 4 18 resistant hybrid cells (All et al., Cytogenet. Cell Genet. (Switzerland), 86, p.194-203, 1999) The structure of this HA C is not clear because it uses a natural chromosome fragment.
  • Homologous recombination was used for introduction into HAC, but introduction efficiency is low and versatility is not used Micronuclear cell fusion method is not used, so the host chromosome coexists in addition to the target chromosome fragment.
  • telomere trancheon As a method for deleting a part of a chromosome, a technique for shortening a chromosome by introducing a cloned telomeric sequence by homologous recombination (telomere trancheon) has been reported (I tzhaki et al., Nature Gene t. (USA), Volume 2, p. 283-287, 1992). However, since somatic cells of many animal species have extremely low frequency of homologous recombination, it takes a lot of labor to obtain recombinants.
  • the chicken cell line DT40 which undergoes high-frequency homologous recombination, can be used as a chromosome modification host to enable efficient chromosome modification (Kuroiwa et al., Ucleic Acids Res. ( UK), 26th, p. 3447-8, 1998). It has been reported that human X chromosome was transferred to DT40 cell line by micronucleus fusion method and telomere truncation was performed (Mills et al., Hum. Mol. Genet. (UK), Volume 8). , P. 751-761, 1999). A 2.4 Mb linear minichromosome was constructed by deletion of the short and long arms. The minichromosomes were stably retained in Hams and human cells, but copy number changes were observed. Only the stability of H A C has been confirmed, and a foreign gene has not been introduced into it for use as a vector.
  • hamster cells are used as hosts for human Y chromosome telomere truncation.
  • An example of the construction of a minichromosome of about 4 Mb that is shortened and stably maintained in the host cell has also been reported (Heller et al., PNAS (USA), No. 93, p.7125-7130, 1996).
  • This minichromosome was transferred to mouse ES cells by the micronucleus fusion method, but was unstable. Because a mini-chromosome incorporating a mouse centromeric sequence by chromosome rearrangement has acquired stability in ES cells (Shen et al., Hum. Mol. Genet. (UK), Vol. 6, p.
  • HAC as a vector as described above, it is important to establish a method for introducing a target gene into HAC.
  • the construction of HAC itself is in the process of development, and the introduction of foreign genes has only been shown to be random insertion of drug resistance genes, and no detailed study has been made.
  • the natural fragment S C 20 derived from human chromosome 14 isolated for the purpose of producing a mouse carrying the human antibody heavy chain gene has been confirmed to be stable and germline transmitted in the mouse.
  • Cre (1 o XP) system was used to establish a method (chromosomal cloning) for cloning Mb-unit chromosomal regions (human chromosomes 2 and 22 including antibody light chain genes) by reciprocal translocation.
  • HAC HAC that does not contain unnecessary genes and has a clear structure, but it is effective when applied to large genes that exceed the capacity of other cloning vectors (such as YAC) such as antibody genes. Demonstrated. In any case, 1) the structure is clear, unnecessary genes have been removed, 2) stable maintenance in cultured cells and individuals, and 3) easy introduction of foreign DNA.
  • the H AC vector system has not been constructed so far. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a human artificial chromosome vector that is stably retained in a cell, can easily insert a large foreign gene, and can be introduced into the cell, and a method for producing the same.
  • the present inventor has 1) constructing a chromosome vector that does not contain extra genes and is stably maintained using animal cells as a host, and 2) a chromosome vector.
  • a modified chromosome obtained by deleting a known gene from the long arm of human chromosome 21 was obtained, and after confirming the stability of DT 40 hybrid cells retaining this modified chromosome in long-term subculture,
  • the 1 o xP sequence and hCMV promoter were inserted site-specifically into the proximal long arm and the GFP gene was introduced into the modified chromosome using the CreZ 1 o xP system, the expression of GFP could be confirmed.
  • the present inventor has found that the above problems can be achieved by using a HAC vector constructed based on the human chromosome 21 fragment, and has completed the present invention. That is, the outline of the present invention is as follows.
  • a human artificial chromosome vector characterized in that it comprises a human chromosome 21 fragment or a human chromosome 14 fragment from which the distal long arm and / or the distal short arm are deleted. I will provide a.
  • the size of the human 21 chromosome fragment is about 2 to 16 Mb, preferably about 2 to 6 Mb.
  • the distal long arm of human chromosome 21 is deleted, for example, in the 21 Q 11 region, preferably deleted in AL 1 6 3204.
  • the distal short arm of human chromosome 21 is deleted, for example, in the 21 p region, preferably deleted in A L 163201.
  • the size of human chromosome 14 fragment is about 2
  • 0 Mb preferably about 19 Mb or less, more preferably 18 Mb or less. It is below.
  • the distal long arm of human chromosome 14 is deleted, for example, in the 14Q region, preferably deleted in AL 1 5 7 8 5 8 and more preferably AL 5 Deleted at 1 2 3 1 0.
  • the distal short arm of human chromosome 14 is deleted, for example, in the 14 p region, preferably deleted in the 14 p 12 region, and more preferably OR 4 H 12, OR 4 Q 4, RNR 2, OR4L l, RNU6 C, FDP SL 3, K 1 2 T, C 14 orf 5 7, OR 6 S l, M 1 9 5, OR 4 1 4, MGC 2 7 1 6 5, LCH, OR 1 0G3, OR4K3, OR4E2, H1 RNA, ATP5C2, ORllH6, and OR4M1 are deleted at any one position selected from the group.
  • the human artificial chromosome vector according to the present invention comprises a recognition site for a site-specific recombinase on the long arm proximal and / or short arm proximal of human chromosome 1 or human chromosome 14.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is AL 1 6 3 20 3 proximal to the long arm of human 21 chromosome 1 or AL 1 5 7 proximal to the long arm of human chromosome 14.
  • Proximal to 8 5 more preferably, proximal to the deletion position in AL 5 1 2 3 10, or in the 14 p 1 2 region proximal to the short arm of human chromosome 14 Inserted proximal to the deletion position.
  • the site-specific recombinase is a Cre enzyme, and the recognition site for the site-specific recombinase is a L o x P sequence.
  • the long arm distal and Z or short arm distal deletion is by replacement with an artificial telomere sequence.
  • a method for producing a human artificial chromosome vector comprising the following steps:
  • a cell having high homologous recombination efficiency is used as a cell having the human chromosome 21 or human chromosome 14.
  • the cells with high homologous recombination efficiency are derived from chicken DT0 cells.
  • step (b) the deletion of the long arm distal and the Z or distal short arm of human chromosome 21 or human chromosome 14 is performed by substitution with an artificial telomere sequence.
  • the distal long arm of human 21 is deleted in AL 163204 and the distal short arm is deleted in AL 1 6320 1.
  • the long arm distal position of human chromosome 14 is deleted in the 14Q region, and the short arm distal is deleted in the 14p12 region.
  • the long arm distal of human chromosome 14 is deleted in AL 1 57 858, more preferably AL 51 2310, and the short arm distal is OR 4 H 1 2, OR 4 Q 4, RNR.
  • the site-specific recombinase is a Cre enzyme, and the recognition site for the site-specific recombinase is a LoxP sequence.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is, for example, AL 1 63203 proximal to the long arm of human chromosome 21, proximal to AL 1 57858 of human chromosome 14, more preferably AL 5123 1 It can be inserted proximal to the deletion position at 0, or proximal to the deletion position in the 14p12 region near the short arm of human chromosome 14.
  • the present invention in its third aspect, provides a human artificial chromosome vector obtained by the above production method.
  • the present invention provides a cell that retains the human artificial chromosome vector.
  • the present invention further provides a method for producing a human artificial chromosome vector containing foreign DNA, characterized in that the method further comprises the following step (d):
  • the present invention is a human artificial chromosome vector comprising exogenous DNA obtained by the production method described above.
  • the present invention provides a cell retaining a human artificial chromosome vector containing foreign DNA.
  • the present invention further provides, in an eighth aspect thereof, a pharmaceutical composition comprising cells that retain the human artificial chromosome vector containing the foreign DNA.
  • exogenous DNA is erythropoietin (EP ⁇ ), thrombopoietin (TPO), blood coagulation factor, von Willebrand factor (VWF), dystrophin, dopamine synthase, insulin, insulin-like growth factor (IGF) ), Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), antibody, telomerase, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte 'macrophage colony-stimulating factor, immune globulin, growth hormone, interleukin 2, interleukin 3, interleukin 4, Interleukin 5, Interleukin 6, Interleukin 7, Interleukin 8, Interleukin 9, Interleukin 1 0, Interleukin 1 1, Interleukin 1 2, Interleukin 1 5, CD 40 ligand, interferon, adenosine A-1 antitrypsin
  • the recipient cell is an animal cell, preferably a mammalian animal cell.
  • the recipient cells may be multipotent cells such as embryonic stem cells (ES cells), stromal stem cells and tissue stem Z precursor cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • stromal stem cells stromal stem cells
  • tissue stem Z precursor cells tissue stem Z precursor cells.
  • the recipient cell is an animal cell, preferably a mammalian animal cell.
  • the recipient cells may be multipotent cells such as embryonic stem cells (ES cells), stromal stem cells and tissue stem / progenitor cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • stromal stem cells tissue stem / progenitor cells.
  • the present invention still further provides, in the first aspect, a method for producing a protein comprising the following steps:
  • the protein includes, for example, erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), blood coagulation factor, eighth factor, ninth factor, von Willebrand factor (VWF), Mouth fins, dopamine synthase, insulin, insulin-like growth factor (IGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), antibody, telomerase, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte / macrophage colony stimulus Factor, Immunoglobulin, Growth Hormone, Interleukin 2, Interleukin 3, Interleukin 4, Interleukin 5, Interleukin 6, Interleukin 7, Interleukin 8, Interleukin 8, Interleukin 9, Interleukin Leukin 1 0, Interleukin 1 1, Interleukin 12, Interloy Kin 15, CD40 ligand, Inferione Ferron, adenosine deaminase, ⁇ _1 antitrypsin, ornithine transc
  • EPO erythro
  • human artificial chromosome vector or “HAC vector” refers to an artificial chromosome prepared based on a human chromosome.
  • human chromosome refers to a complex of a natural DNA derived from a human cell and a protein. There are 23 normal human chromosomes (46 for males) and 46, each of which is known to contain about 50-300 Mb of DNA.
  • a “human chromosome fragment” is a part of a chromosome that can be stably replicated and distributed as an independent chromosome. This refers to a fractional fragment, usually 1 Mb or larger, but sometimes smaller.
  • long arm and “short arm” with respect to the chromosome refer to the arm (arm) on both sides of the centrum on the chromosome, and the long arm (Q) and short arm ( P).
  • distal long arm and proximal long arm are the region on the long arm that is far from the centromere (ie, the telomere side) and the region that is close to the centromere (near) Meaning).
  • the long arm distal is the telomeric side than AL 1 6 3 2 0 4 and the long arm proximal is the centromeric side than AL 1 6 3 2 0 3
  • the long arm is distant from the AL 1 3 2 6 4 2 and the proximal long arm is the centromere from the AL 1 5 7 8 5 8.
  • distal short arm and proximal short arm mean a region on the short arm far from the center (distal) and a region close to the centromere (near).
  • distal and short arm positions are bounded by AL 1 6 3 2 0 1
  • liposomal RNA There is a boundary in the region.
  • site-specific recombinase and “recognition site of site-specific recombinase” mean that a certain enzyme recognizes a specific recognition site and specifically sets a DNA group at that recognition site. It is a term used for a phenomenon that causes recombination, and refers to an enzyme that causes recombination in a site-specific manner and a site recognized by the enzyme.
  • artificial telomere sequence refers to an artificially added telomere sequence.
  • an artificial telomere sequence can be added by telomere truncation.
  • foreign DNA refers to DNA introduced from the outside into the target cell, and genes and other functions that are desired to be expressed for substance production and functional modification or functional analysis. This means DNA that codes a sequence (for example, a promoter sequence) and may be of the same type or a different type.
  • donor cell and “receptor cell” refer to a cell (donor cell) that first holds the vector when a human artificial chromosome vector is transferred or introduced, and the vector from the donor cell. A cell into which one is transferred (receptor cell).
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for shortening the distal long arm of human chromosome 21 by telomere truncation.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a PCR analysis showing that the distal long arm of human chromosome 21 was deleted in puromycin-resistant DT 40 strain.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Southern blot analysis showing that the distal long arm was deleted in the puromycin-resistant DT 40 strain, that is, the artificial telomere sequence was introduced site-specifically.
  • FIGS. 4 a and b are photographs showing the results of FISH analysis showing that the distal long arm was deleted in the puromycin resistant strain DT40.
  • Figure 4a shows the human chromosome 21 (arrow) retained in DT 40 cells
  • Figure 4b shows the human chromosome 21 fragment (arrow) with the long arm removed.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of a method for site-specific insertion of a 1 oxP sequence proximal to the long arm of human chromosome 21 from which the distal long arm is deleted.
  • FIGS. 7 a and b are photographs showing the results of FI SH analysis showing that human chromosome 21 (fragment) is retained in the blastcidin-resistant CHO-K1 strain.
  • Figure 7a shows the full length human chromosome 21 before telomere truncation
  • Figure 7b shows the human 21 chromosome fragment with the long arm distal removed.
  • FIG. 8 is a diagram showing an outline of a method for site-specific insertion of a GFP construct into the 1 o XP sequence proximal to the long arm of human chromosome 21.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph showing GFP expression in G418 resistant CHO-K1 strain.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of Southern plot analysis showing that site-specific recombination occurred in the 1 o x P sequence in the G 418 resistant C H 2 O-K 1 strain.
  • Fig. 11 shows that the short arm of chromosome 21 is shortened by telomere truncation. It is a figure which shows the outline
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of PCR analysis showing that the short arm distal position of human chromosome 21 was deleted in hygromycin-resistant DT 40 strain.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of Southern plot analysis showing that the distal short arm was deleted in the hygromycin-resistant DT40 strain, that is, the artificial telomere sequence was introduced site-specifically.
  • FIG. 14 is a photograph showing the results of PCR analysis showing that the distal short arm was deleted in the hygromycin resistant DT 40 strain, that is, the artificial telomere sequence was introduced site-specifically.
  • Figures 15a and b are photographs showing the results of FISH analysis showing that the distal short arm was deleted in the hygromycin resistant DT40 strain.
  • Figure 15a shows human chromosome 21 (arrow) with the long arm retained in the DT40 cell
  • figure 15b shows human 21 chromosome fragment with the long arm and short arm deleted (arrow). Indicates.
  • Fig. 16 shows the results of human EPO produced in KH21 E cell culture supernatant retaining the same cell growth activity as that of recombinant human EPO protein (rhEPO).
  • Figure 17 is a photograph showing the results of a FISH analysis showing that the human chromosome 21 fragment (arrow) is retained in the blasticidin-resistant HT 1080 cell line.
  • FIGS. 18 a and b are a fluorescence micrograph (FIG. 18 a) and a phase contrast micrograph (FIG. 18 b) showing the state of GFP expression in the G 418 resistant HT 1080 strain.
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of a PCR analysis showing that a human 21st chromosome-derived HAC vector has been transferred into G418 or hygromycin-resistant E14 strain.
  • FIGS. 20 a and b are photographs showing the results of FISH analysis showing that the human chromosome 21 fragment is retained in the drug resistant E14 cell line.
  • Figure 20a shows a chromosomal fragment (arrow) with the distal long arm removed
  • Figure 20b shows a chromosomal fragment (arrow) with the distal short arm removed.
  • Figure 21 is a photograph showing the results of FI SH analysis showing that the human 21 chromosome fragment (arrow) is retained in the drug-resistant hi MS C cell line.
  • Figures 22a and b show fluorescence micrographs showing the appearance of GFP expression when HAC-transfected ES cells were induced to differentiate into neurons in vitro ( Figure 22a) and fluorescence stained with antitubular 3 antibody. This is a photomicrograph (Fig. 22b).
  • the present invention relates to a human artificial chromosome vector (hereinafter also referred to as “the present HAC vector”).
  • the HAC vector is prepared based on human chromosome 21 or human chromosome 14 and has a long arm. It contains human chromosome 21 fragment or human chromosome 14 with distal and Z or distal short arm deleted.
  • telomere sequence For human chromosome 21, the nucleotide sequence of the entire long arm and a part of the short arm excluding the centromeric region is published on public databases (for example, http://hgp.gsc.riken.go.jp/ chr21 / index.html (see Riken Genomic Sciences Center: Human Genome Research Group). By using such sequence information, it becomes possible to insert an artificial telomere sequence or a 1 o XP sequence described later in a site-specific manner by homologous recombination. In addition, deletion of the distal long arm results in approximately 48 Mb of chromosome 21 becoming approximately 16 Mb of 1Z3, and the removal of the distal long arm and distal short arm eventually results in approximately 2 Mb. HAC vectors that do not contain genes can be constructed.
  • SC 20 is a region containing AL 1 37 2 2 9 (Gen Bank accession number) from the long arm telomeric sequence of human chromosome 14 and further centromeric AL 1 2 It holds the region from 24 to 26 kb from the telomere side of AL 1 5 7 8 5 8 (Gen Bank registration number) to 1 6 1 2 (Gen Bank registration number). Also, the area between AL 1 3 7 22 9 (Ge n Bank registration number) and AL 1 2 1 6 1 2 (Ge n Bank registration number), and AL 1 5 7 8 5 8 (G en Bank registration number) ) The region between centromeres from the telomere side 24-26 kb is deleted. On the other hand, the short arm region of human chromosome 14 is retained.
  • SC 20 is stably maintained in cell lines including human cells and mouse individuals (Shinohara et al., Chromosome Res., 8: 713-725, 2000), and the liposomal R ⁇ region of SC 20 (human 14 In the modified SC 20 with the XP site inserted into the short arm of chromosome # 1)
  • its stability was maintained (Kuroiwa et al., Nature Biotech. (USA), Vol. 18, p. 1086-1090, 2000).
  • HAC in which about 10 Mb of chromosomal region derived from the unstable human chromosome 22 fragment is translocated to the 1 o XP site of the modified SC 20 is also used in mouse ES cells and mouse individuals. And stable.
  • SC 20 contains multiple genes for the chromosome 14 14 Q 32 region, but by reducing SC 20 using the methods described herein, various cell types can be obtained. Thus, it is possible to obtain a HAC vector that is stably maintained and does not contain extra genes.
  • This HAC vector is prepared based on human chromosome 21 or human chromosome 14 as described above.
  • the creation of this HAC vector includes the following steps (a) to (c):
  • this HAC vector For the preparation of this HAC vector, prepare cells that have human chromosomes (for example, human chromosome 21 or human chromosome 14). Such cells are preferably those that retain only human chromosome 21 or human chromosome 14 and have a high homologous recombination rate for subsequent manipulation. Therefore, in the present invention, firstly, cells satisfying these conditions are prepared.
  • a cell having a human chromosome can be selected by selecting a clone having human chromosome 21 or human chromosome 14 from a known mouse A9 hybrid cell library having a single mouse chromosome. It can be prepared by transferring to cells with a high homologous recombination rate.
  • the mouse A9 hybrid cell library holds a human single chromosome labeled with a drug resistance gene.
  • WO 00Z1 0 3 8 3 Tanabe, H. et al. (Ciiromosome Res., 8 ⁇ : 319-334, 2000).
  • mouse A 9 hybrid cells carrying human chromosome 1 and human chromosome 14 are registered in the Japanese Collection of Research Bioresources (J CRB) respectively with the registration number J CRB 2 22 1 (cell name A 9 (Hy gro 2 1))) and JCRB 2 2 14 (cell name A 9 (Hygro 14)), and detailed information and culture methods are available.
  • J CRB Japanese Collection of Research Bioresources
  • a cell having a high homologous recombination rate refers to a cell having a high frequency of homologous recombination when homologous recombination operation is carried out in the cell.
  • DT 40 cells Dieken et al., Nature Genetics, 12: 174-182, 1996), mouse ES cells (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Yui Getting, Yodosha, 1995), and the like.
  • Chromosome transfer can be performed according to chromosome transfer methods known in the art.
  • chromosome transfer methods known in the art.
  • Koi et al. Koi et al.
  • microcells induced by drugs that inhibit spindle formation in certain cells are isolated and fused with recipient cells to introduce a small number of chromosomes. See, for example, W09 7/0 7 6 71 and WO O 0/1 0 3 8 3 for specific procedures for transferring human chromosomes using this microcell method.
  • Human 2 chromosome 1 or human 14 dye as above Cells that retain color bodies can be produced.
  • a cell that retains a naturally fragmented chromosome such as a partial fragment of human chromosome 14 (SC 20)
  • SC 20 a cell that retains a naturally fragmented chromosome, such as a partial fragment of human chromosome 14
  • the DT-40 cell (SC 20) which retains the SC 20 chromosome fragment, is an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, 1st 6th). Was deposited internationally on May 9, 1980 and has been given the accession number F ERM BP-7 5 8 3.
  • Chromosome deletion can be performed by a method known in the art, and is preferably performed, for example, by substitution (telomere truncation) with an artificial telomere sequence described in WOO 0/100383. .
  • the specific procedure for deleting the long arm distal and Z or short arm distal is, for example, by constructing a targeting vector that holds an artificial telomeric sequence in a cell that holds a human chromosome, and homologous recombination To obtain a deletion mutant by telomere truncation after obtaining a clone in which an artificial telomere sequence is inserted at a desired position on the chromosome (Itzhaki et al., Nature Genet., 2: 283-287, 1992; and Brown et al., PNAS, 93: 7125, 1996).
  • the desired position of the chromosome is the cutting position of the distal long arm or distal short arm to be deleted, and the artificial telomere sequence is replaced and inserted by homologous recombination at this position, and the long arm distal Or the distal short arm is removed (telomere truncation).
  • the desired position can be appropriately set by designing the target sequence when constructing the targeting vector. For example, when deleting the distal long arm, 2 1 q 1 1 on human 21 A target sequence is designed in the region, preferably based on the base sequence of AL 1 6 3 204 (Gen Bank registration number), so that telomere truncation occurs on the telomere side of the target sequence. In the region where the target sequence is set.
  • the target sequence when deleting the distal part of the short arm, should be designed based on the base sequence of AL 16320 1 (Genbank registration number), preferably in the 21P region on rabbit chromosome 21. Can do.
  • the design of the target sequence is not limited to the above-mentioned region, and those skilled in the art can appropriately design so as to produce a desired HAC vector.
  • a target sequence is designed based on the base sequence of the AL 1 57858 region, and the telomere truncation is located on the telomere side of the target sequence.
  • the target sequence can be designed based on the base sequence.
  • the design of the target sequence is not limited to the above-described region, and those skilled in the art can appropriately design so as to produce a desired HAC vector.
  • the target sequence when deleting the long arm sequence of an intact human chromosome 14, is preferably based on the base sequence of 14Q region, preferably AL 5 1 231 0 (Gen nbank registration number).
  • AL 5 1 231 0 Gene nbank registration number
  • deleting the distal short arm for example, within the 14 p region on human chromosome 14, preferably within the 14 pl 2 region, more preferably OR 4H 1 2, ⁇ R4Q4, RNR 2, OR4L l , RNU6C, FDPSL3, K12T, C 14o rf 57, OR6 S l, M 19 5, OR 4 K 14, MGC27165, LCH, OR 10 G 3, OR 4 K 3 ⁇ R4E2, H1RNA, ATP 5C2, 0R11H6, or OR4M1 ( US National Center for Biotechnology Information (NCBI) online genome database (ttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ ⁇ view / maps.cgi?
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the target sequence can be designed based on the base sequence of The design of the target sequence is not limited to the above-described region, and those skilled in the art can appropriately design so as to produce a desired HAC vector.
  • a human chromosome fragment from which the long arm distal end and / or the short arm distal end is deleted is formed, and a cell retaining it is obtained. Such reduction in chromosome size can achieve cell stability.
  • a site-specific recombinase recognition site is inserted into human chromosome 21 or human chromosome 14.
  • This step (c) may be performed either before or after the step (b), and the order of these is not particularly limited. That is, in human chromosome 21 or human chromosome 14, the recognition site for the site-specific recombinase may be inserted after deleting the distal long arm and / or the distal long arm, or the site After inserting the recognition site for the specific recombinase, the distal long arm and / or the distal long arm may be deleted.
  • an enzyme recognizes a specific recognition site and specifically causes DNA recombination at the recognition site.
  • such an enzyme and a recognition site are known.
  • Use the system for example, such a system is known as the C re / 1 o XP system (eg Sauer, B. et al., PNAS, 85: 5166 -5170, 1988).
  • Cre is a 38 KD protein derived from pacteriophage P1 and belongs to the Int (integrase) family of recombinases. This enzyme recognizes the approximately 34 bp recognition site 1 o XP sequence and causes DNA recombination specifically at this site.
  • This direction of the 1 o XP sequence is known to cause DNA deletion or translocation between two 1 o XP sequences.
  • Other systems that recognize specific sequences and cause recombination reactions include budding yeast-derived recombinase FLP (Broach et al., Cell, 21: 501-508, 1980) and phage phi C 3 1-integrated (Thorpe et al., PNAS, 95: 5505-55 10, 1998), and it has been reported that DNA recombination reactions occur in mammalian cells (Koch et al., Gene, 249: 135). -144, 2000; Thyagaraj an et al., Mol. Cell. Biol., 21: 3926-3934, 2000).
  • a known gene recombination method for example, homologous recombination method is used. be able to.
  • a person skilled in the art can appropriately set the insertion position of the recognition site for the site-specific recombinase in consideration of the position of a gene that is not essential.
  • a recognition site for a site-specific recombinase is inserted into any position of the human 21 chromosome or the human 14 chromosome at either the proximal position of the long arm or proximal position of the short arm.
  • Such insertion positions include AL 1 6 3 2 03, which is proximal to the long arm for human chromosome 21, and AL 1 57 8 5 8, which is proximal to the long arm for human chromosome 14. (Ge nB ank registration number) more proximal, more preferably proximal to the long arm proximal to the deletion position in AL 5 1 2 3 1 0 (Ge nB ank registration number) or near the short arm of human chromosome 14 For example, the position proximal to the deletion position in the 14 p 12 region of the position.
  • One or more of the recognition sites exemplified above may be inserted, or a plurality of recognition sites of different systems may be inserted.
  • this HAC vector has a site-specific recombination enzyme recognition site.
  • the introduction position of foreign DNA can be determined by setting the recognition site, the introduction position of the foreign DNA is constant, and there is no position effect.
  • foreign DNA can be introduced easily.
  • multiple foreign DNAs can be inserted sequentially by inserting multiple recognition sites of different systems.
  • this HAC vector which has been prepared by modifying the human chromosome as described above, is generally inserted in vectors such as promoters and drug resistance genes. Sequence or element may be inserted. Such sequences or elements can be inserted into the desired location of the HA vector using homologous recombination methods as described above.
  • the present inventor subcultured cells retaining the HAC vector (human chromosome 21 or human chromosome 14) prepared as described above in a medium not containing a selective agent for a long period of time. Furthermore, when the retention rate of the HAC vector was tested by the FI SH method, it was confirmed that the HAC vector was stably maintained in the host cells (for example, DT40 cells and CHO cells).
  • the host cells for example, DT40 cells and CHO cells.
  • step (d) foreign DNA can be introduced into this HAC vector by performing step (d) of inserting foreign DNA in the presence of a site-specific recombinase.
  • step (d) is performed after step (c) described above, but the order with step (b) is not particularly limited, and can be performed before or after step (b). Therefore, it should be noted that the order of steps (b) to (d) is not limited to the order described in the specification.
  • Foreign DNA refers to DNA introduced from the outside into the target cell, and is the DNA that encodes genes and other functional sequences.
  • the foreign DNA to be introduced in the present invention is not particularly limited as long as it encodes a gene desired to be expressed for substance production, functional modification or functional analysis, and other functional sequences.
  • Other functional sequences are for gene expression For example, promoters, enhancers, signal sequences, etc.
  • the exogenous DNA is introduced using the inserted site-specific recombinase system.
  • a targeting vector is constructed that holds a 1 o xP sequence that is a recognition site for the Cre enzyme and foreign DNA.
  • a cell holding this HAC vector human 21 chromosome 1 or human chromosome 14
  • the region between the 1 o XP sequence and the artificial telomere sequence The exogenous DNA can be inserted into the HAC vector by site-specific recombination with the above-mentioned targeting vector (Kuroiwa et al., Nature Biotech., 18: 1086, 2000).
  • circular DNA carrying the recognition site ( ⁇ sequence) of the site-specific recombinase can be inserted.
  • the HAC vector containing foreign DNA constructed by inserting foreign DNA into this HAC vector has the possibility of changing the stable structure due to its insertion.
  • the size of the foreign DNA to be introduced (inserted) is usually about 10 Mb to about 1 kb, preferably about 3 Mb to about 2 kb, more preferably about It can be 1 Mb to about 3 kb.
  • cDNA compulsory expression vectors there are many cases in which cell lines that constantly express the transgene cannot be obtained due to side effects such as cytotoxicity and growth inhibition caused by overexpression. In order to overcome this problem and maintain the physiological expression pattern and to artificially control the expression, it is desirable to apply a gene expression induction system using tetracycline or the like.
  • the HAC vector features that the insert size that can be introduced is large and that a certain number of copies can be maintained stably are suitable for such purposes.
  • Tissue-specific z-physiological gene expression is controlled at each stage of transcription from the genomic region encoding the gene, editing of the transcript, export to the nucleus, and translation. It is known that tissue-specific isoforms are expressed when there are multiple promoters for one gene and transcription initiation sites are different, or variations occur in splicing. Cloned cDNA is just one of several transcript variants from a single gene. In order to reproduce physiological gene expression, it is desirable to introduce a gene region containing regulatory sequences as genomic DNA. The use of this HA C vector is suitable for this purpose.
  • Site-specific recombination between 1 o XP sequences by Cre enzyme causes an insertion reaction in the case of linear chromosomes and circular inserts (foreign DNA). A translocation reaction occurs. If this is used, it cannot be cloned into a circular insert.
  • the insertion of exogenous DNA into this HAC vector utilizes positive selection using reconstitution of drug resistance genes as an index (positive selection of recombinants).
  • positive selection of recombinants for details, see WO 00Z10383.
  • negative selection such as thymidine kinase / ganciclovir system.
  • the circular DNA to be inserted only needs to contain the 1 o XP sequence.
  • the BAC library used in the Genome Project contains 1 o XP sequences, so if such a negative selection system can be established, genomic clones with known sequences can be easily inserted into the HAC vector. Become.
  • the 1 o XP sequence preferably used in the present invention is a wild type sequence derived from the P 1 phage, and the insertion reaction of the circular insert into the 1 ox P sequence on the HAC vector by Cre enzyme is reversible. is there.
  • constitutive inserts were obtained by transiently expressing the Cre enzyme and selecting site-specific recombinants using drug resistance as an indicator. .
  • the Cre enzyme is expressed again, a reverse reaction (circular insert excision) may occur, making it difficult to further modify the HAC vector, such as inserting the insert secondarily.
  • the insertion position of the foreign DNA was determined in advance in the 1 o XP site introduced into the host chromosome, and the plasmid vector was obtained from the Cre-1 ox P recombination reaction.
  • the plasmid vector was obtained from the Cre-1 ox P recombination reaction.
  • the expression unit of the target gene (using EPO) is ligated in multiple copies and arranged in parallel, and introduced at a predetermined position (1 ox P site) on the HAC vector. Copy without mutating the host chromosomes. One-number-dependent expression control can be performed.
  • the method of the present invention it is possible to introduce multiple copies of a target gene as a foreign DNA into a desired cell, and to express the target gene in the cell in a copy number-dependent manner.
  • the transgenic animal produced in this way it is possible to achieve the copy number-dependent expression of the target gene, which has been difficult in the past, without being affected by the position effect.
  • the cell to be transferred to is not particularly limited, and examples thereof include animal cells (mammalian cells).
  • animal cells mammalian cells
  • CHO cells are known to efficiently form microcells (for example, Koi et al., SCIENCE 260: 361, 1993), which makes this HAC vector different from CHO cells (cells other than CH0 cells). It is also possible to transfer to.
  • the HAC vector can also be transferred to a multipotent cell.
  • the “cell having multipotency” means a cell that can be differentiated into a specific cell or tissue by a predetermined operation.
  • cells that can be differentiated into two or more types of cells or tissues of a chimeric animal such as embryonic stem cells (ES cells) Sexual germ cells (EG cells), embryonic tumor cells (EC cells), etc. are included.
  • ES cells embryonic stem cells
  • EG cells sexual germ cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • TGF transforming growth factor
  • mesenchymal cells Example: mesenchymal cells.
  • embryonic stem cell is also referred to as an ES cell, and means a cultured cell derived from an early embryo characterized by being able to proliferate while maintaining undifferentiated (totipotent) .
  • embryonic stem cells are not present inside blastocysts in the early embryos of animals. It is a cell line established by culturing cells of inner cell mass, which are differentiated stem cells, and continuing to proliferate while maintaining an undifferentiated state.
  • the “embryonic germ cell” is also called an EG cell, and means a cultured cell derived from a primordial germ cell characterized by having approximately the same ability as the embryonic stem cell.
  • Embryonic germ cells should be grown several days to several weeks after fertilization, for example, in the case of mice, primordial germ cells obtained from embryos that have passed about 8.5 days, and continue to proliferate while remaining undifferentiated. An established cell line. In addition, it is considered desirable to use normal cells rather than immortalized cells as a material for gene cell therapy and tissue regeneration therapy for humans from the viewpoint of safety to avoid canceration. ing. There are many examples of chromosomal transfer to immortalized cells and cancerous cells in humans and other animals.
  • a human chromosome 14-derived fragment or a human chromosome 21-derived HAC vector can be transferred to human normal fibroblasts.
  • the method of the present invention enables transfer of human chromosome 14-derived fragments or human chromosome 21-derived H A C vectors to human normal somatic cells other than fibroblasts.
  • the human chromosome-derived HAC vector produced according to the method of the present invention can be transferred to chick normal somatic cells without being restricted to human chromosome 14 or human chromosome 21.
  • Transfer of HAC vectors to cells can be performed using the microcell method.
  • the microcell method can be carried out as described in the section “1. Production of a human artificial chromosome (HAC) vector” above.
  • human cells can be used at any stage before, during, or after the step of modifying human chromosomes from the cells that originally prepared human chromosomes.
  • Chromosomes (HAC vectors) can be transferred to other cells.
  • the object of the present invention is to provide a basic tool called Vector 1 and its utilization technology, and it is expected to have a ripple effect in a very wide range of fields from scientific research to industry.
  • There is no restriction on the length of the DNA that can be introduced there is no restriction on the length of DNA that can be introduced at the same time). It is envisioned that it will be able to do many things that were impossible with the first vector.
  • the main uses of this HAC vector include, but are not limited to: (1) Vectors for analyzing gene functions in animal cultured cells, (2) Human disease gene therapy vectors, (3) Human organ stem cells, Vectors for the introduction of genes into embryonic stem cells (ES cells), 4 Vectors for the production of transgenic animals (eg, human disease model animals, humanization of specific genes combined with KO animals), etc. It is done. Examples of applications of this HAC vector are as follows: (1) introduction of foreign DNA into recipient cells, (2) production of cells that express foreign DNA, (3) protein production, (4) gene function analysis Vectors, (5) vectors for gene transfer into stem cells, (6) vectors for preparing culture feeders, and (7) vectors for treating human diseases.
  • This HAC vector can be used to introduce foreign DNA into cells or to introduce foreign DNA.
  • the transferred HAC vector can be transferred to other cells, so that foreign DNA can be introduced into desired recipient cells.
  • Introduction of foreign DNA into recipient cells includes, for example, the following steps:
  • Steps (a) to (d) can be performed as described above, and the order in which the steps are performed is not limited to this.
  • the chromosome fragment is transferred from the donor cell holding the rabbit chromosome to the recipient cell using the microcell method.
  • Human chromosomes to be transferred can be those before, during or after the modification of chromosomes in steps (b) to (d).
  • the chromosome may be transferred from the donor cell holding the human chromosome to the recipient cell using the microcell method. Thereafter, the foreign DNA can be inserted into the recipient cell in step (d), and the recipient chromosome can hold the human chromosome into which the foreign DNA has been inserted.
  • the microcell method can be performed as described in “1. Preparation of human artificial chromosome (HAC) vector” above.
  • the recipient cells used here are not particularly limited, but animal cells, particularly mammalian cells (eg, mouse cells, human cells, etc.) are preferred. It is also possible to use cells having multipotency as described above, such as embryonic stem cells (ES cells), stromal stem cells, tissue stem Z precursor cells, and the like as recipient cells.
  • step (g) it is confirmed whether or not foreign DNA has been introduced (transferred) into the recipient cell.
  • This confirmation can be performed by a method known in the art. For example, introduction of foreign DNA can be confirmed by Southern blot analysis using a probe corresponding to the restriction enzyme site of foreign DNA. .
  • this HAC vector can insert foreign DNA in a cell, or transfer a HAC vector into which a foreign DNA has been inserted, into another cell. Can also be produced. Production of cells expressing foreign DNA includes, for example, the following steps:
  • Steps (a) to (f) A step of selecting cells expressing foreign DNA in the fused recipient cells. Steps (a) to (f) can be performed as described above, and the order in which the steps are performed is not limited to this.
  • step (g) confirm the expression of foreign DNA in the recipient cells, and select cells that express the foreign DNA. Confirmation of the expression of the foreign DNA can be carried out by a technique known in the art, such as the Northern blot method using a probe corresponding to the foreign DNA.
  • Steps (a) to (f) can be performed as described above, and the order in which the steps are performed is not limited to this.
  • the recipient cells fused in step (f) are cultured in a medium.
  • the medium for culturing the recipient cells contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and any medium can be used as long as the above recipient cells can be cultured efficiently.
  • a person skilled in the art can select an appropriate medium and prepare a medium with appropriate modifications if necessary.
  • aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, temperature, pH, culture period, etc. are set appropriately.
  • “Culture” means not only the culture supernatant but also cultured cells or cell disruptions.
  • the protein is extracted by ultrasonic disruption treatment, polishing treatment, pressure crushing, etc., by a conventional method. Add a protease inhibitor if necessary.
  • the culture solution itself can be used. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc. to remove the solid portion, and if necessary, nucleic acid is removed by prototamine treatment or the like.
  • the protein solution is subjected to various chromatography, electrophoresis, etc. to obtain a purified enzyme preparation. For example, gel filtration using cefadex, ultragel or biogel, ion exchange chromatography, electrophoresis using polyacrylamide gel, fractionation method using affinity mouthmatography, reverse phase chromatography, etc. By selecting or combining these, a purified target protein can be obtained. But on The culture method and the purification method are examples, and are not limited thereto.
  • the protein to be produced is not particularly limited as long as it is a protein that is desired to be produced.
  • E PO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • VWF Von Willebrand factor
  • dystrophin dopamine synthase
  • insulin insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor binding protein
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • telomerase granulocyte colony stimulation Factor
  • granulocyte / macrophage colony monostimulating factor immunoglobulin, growth hormone, interleukin 2, interoral kinkin 3, interleukin 4, interleukin 5, interleukin 6, interleukin 7, interleukin 8, in Evening leukin 9, interleukin 10, interleukin 1 1, yn evening leukin 1 2, yn evening leukin 1 5, CD 40 ligand, interferon, adenosine deaminase, ⁇ _1 anti-lips
  • this HAC vector can be used to analyze gene functions.
  • Target gene expression by expressing double-stranded RNA (ds RNA) consisting of a sequence complementary to part of the base sequence encoding the target gene RNA interference is known, a technique that suppresses (see, eg, Elbashir et al., Nature, 411: 494, 2001; McCaffrey 3 ⁇ 4> Nature, 418: 38, 2002 for short interfering RNA (siRNA)) See also Shinagawa, T. et al., Genes & Development, 17: 1340-1345, 2003).
  • siRNA short interfering RNA
  • the expression number of the gene encoding the target molecule is changed and the number of copies is introduced into the HAC vector and transferred to a cell or the like (including tissues and individuals).
  • a dose-dependent analysis can be performed based on copy number-dependent expression control.
  • conditional or tissue-specific / physiological functional analysis is possible by using an expression induction system or genomic region for gene expression control.
  • the HAC vector prepared by the method of the present invention is used as a vector for gene transfer into embryonic stem (ES) cells or mesenchymal stem cells (MS C). Can be used.
  • the HAC vector can be stably present in ES cells or MSC for a long period of time.
  • the HAC vector is stably maintained in tissue cells induced to differentiate from MSCs that retain the HAC vector prepared by the method of the present invention.
  • the chromosome 21 fragment is transmitted in the next generation and human 21 chromosome fragment is differentiated in cells differentiated from ES cells in the tissue. Since it was confirmed that it was retained (Kazuki et al., J. Hum. Genet., 46: 600, 2000), in tissue cells induced to differentiate from ES cells transfected with the HAC vector prepared by the method of the present invention. It is considered that the HAC vector is stably maintained.
  • the HA C vector prepared by the method of the present invention can be used for tissue stem Z progenitor cells such as bone marrow, blood, nerve, muscle, liver, kidney, skin, inner ear, etc. It can be used as a vector for gene transfer.
  • hematopoietic stem cells and neural stem cells are collected from living tissue and cultured, not only stem cells but also progenitor cells and mature cells differentiated from stem cells are amplified at the same time, which is not preferable for clinical use (Tatsuyuki Konno, Experimental Medicine, 1 9 Volume 1 No. 5: 8 0-90, 2 0 0 1, Yodosha).
  • factors involved in maintaining pluripotency include transcription factors (Niwa et al., Genes Dev., 12: 2048 , 1998; Matsuda et al., EMBO J., 18: 4261, 1999; Niwa et al., Nature Genet., 24: 373, 2000; Mitsui et al., Cell, 113: 631, 2003; Chambers et al., Cell, 113: 643, 2003 ) Can be used to maintain the pluripotency and to easily amplify the stem cells without mutating the host chromosome. is there.
  • controlling the expression level of the molecules involved is an important factor in controlling the differentiation of stem cells.
  • the expression level is 100% physiological expression level, the undifferentiated state is maintained. Differentiates into germ layers, and above 1550% differentiates into primitive endoderm (Niwa et al., Nature Genet., 24: 373, 2000).
  • the method of the present invention is used. By introducing a gene expression ONZOFF induction system (for example, an expression induction system using tetracycline) into the prepared HAC vector, the expression level can be strictly controlled.
  • a gene expression ON / OF F induction system for example, an expression induction system using tetracycline
  • a differentiation inducing factor for example, an expression induction system using tetracycline
  • tissue regeneration by stem cells the transplanted cells or donor-derived regenerated tissue functions as a part of the recipient individual for a long period of time (preferably a lifetime). Therefore, it is desirable to avoid as much as possible the operation that causes a cause (eg, gene mutation) that induces a Dna cell to deviate from physiological control such as canceration.
  • this HAC vector can exist independently of the host chromosome, gene transfer can be performed without mutating the host chromosome. Further, as shown in Examples 13, 14, 18 and 19, it can stably exist in human cells, so that the target molecule can be stably expressed over a long period of time.
  • a HAC vector in which a DNA fused with a target gene is introduced under a genomic sequence containing a genomic region or a tissue-specific expression control region that is physiologically expressed in a differentiated tissue is obtained.
  • stem cells that have been prepared and transferred with the above-mentioned HAC vector it is possible to express the target molecule specifically in physiological Z tissue in the regenerated tissue.
  • the HAC vector may be unnecessary if expression of the transgene is not required.
  • the HAC vector-deleted clone after differentiation induction is not particularly limited, but it is possible to eliminate unnecessary HAC vectors by selecting, for example, drug resistance in selective culture as an index. .
  • a culture additive gene into a culture support feeder cell by conventional methods, but mutation / position effect by random insertion into the host chromosome, expression inactivation, downstream gene expression by paralleling multiple copy expression units It is considered difficult to control and supply the desired level of expression for all factors due to such factors as attenuation.
  • a HAC vector into which all (or part of) the DNA encoding these necessary factors has been introduced is prepared and transferred to a culture support feeder cell, so that recombinant proteins and the like can be obtained later. All necessary factors can be easily replenished by simple co-culture without adding.
  • conditional expression control of these factors is possible by using a gene expression induction system.
  • Viral and non-viral vectors have been studied in various ways for the treatment of baboon diseases.
  • the induction of immune response the limit of the introduced DNA size, host chromosome insertion mutation, low introduction efficiency
  • Low expression efficiency difficult to control expression level (Yoshifumi Kaneda, Clinical Immunity, 39: 551-558, 2003, Science Review, Takaya Ozawa, Gene Therapy, 1997, Yodosha) etc. Issues have been pointed out.
  • As an issue common to all vectors there is a need to “control the desired expression level at the desired timing”.
  • the strategy for gene cell therapy using the HAC vector is as follows: (1) supplementation of primary missing enzymes and proteins, (2) symptomatic treatment of supplementing secondary decreased metabolites, (3) new cells A method to add functions and increase cell survival (for example, in tissue regeneration using modified cells, the HAC vector is a physiological Z It is possible to control tissue-specific gene expression. This can also avoid side effects such as dysfunction due to overexpression or underexpression. ), (4) A method of eliminating a disorder of a degenerative disease that progresses in the form of gain function (for example, GDNF supplementation treatment in Parkinson's disease).
  • the HAC vector can be used as a human disease treatment vector, and a pharmaceutical composition for administering a cell to a patient after transferring the HAC vector into which the foreign DNA for treatment has been introduced into the cell. It can be prepared as a product.
  • human disease treatment vectors can be used not only for disease treatment but also for disease prevention.
  • normal somatic cells are known to proliferate and divide after a certain number of divisions, and eventually die, that is, to age (Ide Toshinori, Experimental Medicine, Vol. 16, No. 8, No. 8: 1 8-24, 1 9 98, Yodosha).
  • telomerase a repair enzyme of repetitive telomere located at the end of the chromosome, can suppress the shortening of telomeres observed during cellular senescence and prolong cell life by overexpression in normal cells ( B odnar et al., Science, 279: 349-352, 1 998). It has also been shown that telomerase does not lead to immortalization or canceration even when overexpressed in cells (Maikai Hiroshi, Experimental Medicine, Vol. 16, No. 18, Special Issue: 25-30, 1 998 Yodosha, Jiang et al., Nature Gent., 21: 111-114, 1999).
  • the production of autoantibodies active neutralizing antibodies
  • the method of administration to the patient is not particularly limited, the HAC vector introduced with the genome encoding the target protein prepared by the method of the present invention is transferred to a chick cell, for example, a normal human cell of the production tissue. This is transplanted to the patient.
  • a chick cell for example, a normal human cell of the production tissue.
  • donor lymphocyte infusion therapy As a treatment for relapsed leukemia, donor lymphocyte infusion therapy (Kolb et al., Blood, 76: 2462, applying transplanted lymphocytes to attack leukemia cells as tumor-specific cytotoxic T cells by graft-versus-leukemia response) 1990) is known.
  • graft-versus-host disease in which transplanted cells attack and damage the recipient tissue, is known.
  • One countermeasure against this is drug-inducibility of donor lymphocytes by retroviruses.
  • Donor lymphocytes have been removed by suicide gene transfer and drug administration (Onodera et al., Genomic Medicine, 3:45, 2003, Medical Review) In the above method, the donor lymphocytes are mutated. There is a risk that
  • the HAC vector produced by the method of the present invention can be used as a vector for gene transfer in immunity gene cell therapy that does not mutate the host chromosome. It can also be used as a vector for gene transfer in therapies aimed at promoting antitumor activity, such as immunostimulation therapy with CD40 ligand in lymphoma (Kato et al., Genomic Medicine, 3:53, 2003, Medical Review). Use Is possible
  • a genomic region encoding a target antibody isolated from a hybridoma that produces the target antibody is introduced onto the HAC vector prepared by the method of the present invention, and the above HAC vector is transferred to, for example, a patient's hematopoietic stem cell or B cell. Later, by re-implantation to the patient, it is possible to supplement and supply fully human antibodies under physiological expression control. It is also possible to improve the patient's QOL by reducing the number of regular visits.
  • Hemophilia A is a cognate recessive hereditary bleeding disorder caused by a blood coagulation factor 8 mutation
  • hemophilia B is a blood coagulation factor 9 mutation.
  • Replacement therapy by administration of factor 8 or factor 9 concentrates is effective as a treatment, but post-hemorrhage administration may cause serious symptoms, possibility of pathogen contamination in concentrates, autoantibodies by repeated administration ( There are many problems such as the occurrence of active neutralizing antibodies), the patient's QOL due to preparation for coping with hemorrhage at all times, and high medical costs.
  • Conventional gene therapy research has been conducted with vector, but sufficient expression cannot be sustained for a long period of time, and a significant therapeutic effect has not been achieved.
  • AAV Arus vector
  • the gene encoding factor 8 spans about 1.5 Mb for the full-length genome and about 7 kb for cDNA.
  • Full-length cDNA can be introduced with non-viral and adenoviral vectors, but the expression level is reduced, and with AAV vectors, the introduced DNA size is limited to about 4.9 kb or less. The inability to do so is an issue.
  • an HAC vector into which DNA encoding blood coagulation factor 8 or factor 9 has been introduced can be produced.
  • the administration method to a patient is not particularly limited, but the above-mentioned HAC vector can be supplemented by, for example, transferring to a human cell and then transplanting to the affected person.
  • the administration method to the patient is not particularly limited, the HAC vector into which the above-described blood coagulation factor 8 or factor 9 genomic region has been introduced is transferred to, for example, a human cell, and then the patient suffering from the cell
  • the factor can be supplemented by physiological tissue-specific expression.
  • SCID Severe combined immunodeficiency disease
  • X_S CID X-linked X_S CID
  • the cause is a common chain mutation shared by receptors in the Inleukin 2 family.
  • hematopoietic stem cell transplantation is performed, but recovery of humoral immunity is insufficient, and regular administration of immunoglobulin is necessary. Therefore, a solution by gene cell therapy in which a common chain is introduced into hematopoietic stem cells and transplanted is expected. Since 1999, clinical studies have been conducted on hematopoietic stem cell transplantation in which a common chain is introduced by retrovirus.
  • the method of the present invention it is possible to prepare a HAC vector introduced with DNA that codes for a common strand.
  • the above HAC vector as a vector for gene introduction, it is possible to avoid the risk of mutation of vector sequence insertion into the host chromosome.
  • the administration method to the patient is not particularly limited, the above-mentioned HAC vector is transferred to a human cell (for example, a normal hematopoietic stem cell derived from human bone marrow) and transplanted to a diseased patient. It is possible to ask for the complement of the defective function of the common ⁇ chain by expression. (E-3) Dischenne muscular dystrophy; DMD
  • the dystrophin gene covers approximately 2.3 Mb for the full-length genome and 14 kb for cDNA.
  • full-length cDNA can be introduced, but reduction of the expression level is a challenge (Liu et al., Mol. Ther., 4:45, 2001; DelloRusso et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 12979, 2002).
  • the size of the introduced DNA is limited to about 4.9 kb or less in AAV vector, the full-length gene cannot be introduced, and an immune reaction is induced in the skeletal muscle gene introduction experiment, resulting in decreased expression of the introduced gene product. Recognized issues (Yuasa et al., Gene Therapy, 9: 1576, 2002) exist.
  • an HAC vector into which a genomic region encoding dystrophin is introduced By the method of the present invention, it is possible to prepare an HAC vector into which a genomic region encoding dystrophin is introduced.
  • the administration method to the patient is not particularly limited, but the above HAC vector is transferred to human cells (for example, but not limited to autologous human normal myoblasts) and transplanted to the affected person.
  • human cells for example, but not limited to autologous human normal myoblasts
  • dystrophin supplementation by physiological tissue-specific expression can be performed.
  • E-4 Although the target disease is not particularly limited, for example, the following monogenic diseases: 1 1 Antitrypsin deficiency, cystic fibrosis (CFTR), chronic granulomatosis, familial Hypercholesterolemia, Fanko 12 anemia, Gouache disease, Han Yue syndrome, Ornithine trans-force rubamylase deficiency, Purine nucleotide phosphorylase deficiency, ADA—SC ID, Leukocyte adhesion deficiency, Can
  • the HAC vector into which the causative gene is introduced by the method of the present invention is prepared in avan disease, corpus callosum atrophy, Fabry disease, amyotrophic lateral sclerosis, etc., and the administration method to the patient is not particularly limited.
  • NCB I National Center for Biotechnology Information
  • TPO Thrombopoietin
  • the HAC vector into which the TPO genome is introduced by the method of the present invention is prepared and the administration method to the patient is not particularly limited, it is transferred to a human cell, for example, a production tissue cell, and physiological Z tissue-specific It is possible to suppress the production of autoantibodies by expressing and supplying TPO. In addition, the above can reduce the number of regular visits and improve the patient's quality of life.
  • EPO Erythropoietin
  • the HAC vector having the EPO genomic region introduced therein is prepared by the method of the present invention, and the administration method to the patient is not particularly limited, but it is transferred to human cells, for example, cells of the production tissue. It is possible to express and supply EPO specifically to physiological Z tissue. In addition, the above can reduce the number of regular visits and improve the patient's QOL. (F— 3) Parkinson's disease
  • Parkinson's disease is a neurological disorder in which motor function is impaired by progressive degeneration of dopamine-synthesizing cells in the substantia nigra substantia nigra.
  • L-DO PA administration for the purpose of supplementing deficient dopamine.
  • problems such as the reduction of QOL, patient QOL limitation due to side effects, and dose reduction. These problems are caused by the fact that dopamine concentrations are not constant in the linear body and that L-DOP A that is administered acts outside the linear body. Therefore, a constant physiological expression of dopamine in the linear body is required. (Takeda et al., Medical Science Digest, 29:20, 2003, New Science).
  • an HAC vector into which an enzyme group involved in dopamine synthesis or a GDNF genomic region has been introduced.
  • the administration method to the patient is not particularly limited, but the above-mentioned HAC vector is transferred to human cells (eg, human normal neural stem Z progenitor cells) and transplanted to the affected person. Supplementation of transgene product by tissue-specific expression is possible. (F-4) Diabetes
  • the target disease is not particularly limited, but for example, brain tumor, peripheral arterial disease (ischemia, etc.), chronic indirect rheumatism, arterial restenosis, elbow tunnel syndrome, coronary artery disease, Alzheimer's disease, ulcer, In pelvic fractures, kidney diseases, malignant tumors, etc.
  • a HAC vector into which a gene encoding a substance considered to be necessary for disease healing is prepared according to the method of the present invention, and the method of administration to patients is
  • it is possible to supplement and complement the defective molecule by, for example, transferring it to human cells and transplanting it into a patient.
  • PBS-TELZPuro (Kuroiwa, Nucleic Acids Res., 26: 3447, 1998) was used as a telomeric lan- guage vector (targeting vector) for deleting the distal long arm of human 21 chromosome.
  • a target sequence for insertion of a telomere truncation vector was designed from the base sequence of the long arm of human chromosome 21 (registration number AL 163204) obtained from Gen B ank overnight.
  • the sequence of the primer oligonucleotide to which the restriction enzyme BamHI recognition sequence is added for PCR amplification is shown below:
  • DT40 cells were seeded for 1 hour after seeding 1 X 10 8 cells in 2 holes of 6-hole cluster 1 (Nung) coated with 50 gZm 1 of poly L lysine (Poly_L_Lysine, Sigma) Pre-attach to the bottom.
  • the microcell suspension was added to the mixture, allowed to stand for 3 minutes, the supernatant was removed, and the cells were treated with 50% (w / v) polyethylene glycol 150 ( ⁇ Shudiagnostakes) for 1 minute.
  • the above DT40 hybrid cells are cultured, and puregene DNA Isolation kit (Gentra System) was used to extract genomic DNA.
  • This genomic DNA was used as a saddle type, and the target sequence for recombination was amplified by PCR using the above primer.
  • the thermal cycler used GeneAmp9700 (Applied Biosystems) went.
  • the Taa polymerase is LA Tad (Takara Shuzo).
  • the reaction condition is 95 ° C for 2 minutes and then denaturation 95. C 30 seconds, annealing / elongation 68 ° C 6 minutes 35 cycles.
  • the amplified product was digested with the restriction enzyme BamHI (Nibonbon Gene), and the approximately 5 kb DNA fragment with a protruding end was separated by agarose gel electrophoresis and purified. This was cloned into the BamHI site of the PBS—TEL / Puro plasmid.
  • the final PB S—TELZPuro construct size is approximately 10.6 kb.
  • Figure 1 shows the telomere transcription vector, the target sequence, and the chromosomal allele resulting from homologous recombination.
  • PBS-TELZPuro construct was converted to linearized DNA by digestion with restriction enzyme Eco RI and introduced into DT40 hybrid cells carrying human chromosome 21.
  • the DT 40 hybrid cells 1 X 1 0 7 were suspended in PBS of 0. 75 m 1, having conducted the electronics Bok Robore one Deployment using Gene Pulser (Bio-Rad) under 25 ig DNA present.
  • a capacitor of 25 ⁇ F was applied at 750 V and discharged using an electrorevolution cell with a distance of 4 mm between the electrodes.
  • Electoporation cells were suspended in DMEM medium (manufactured by Impitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (FB S), 1% chicken serum (Ch S), and 50 2-mercaptoethanol.
  • Puromycin-resistant strain Genome DN A is a cocoon-type gene and STS marker (D 2 1 S 26 5, CBR, SIM 2, D 2 1 S 26 8, D 2 1 S 26 6, D 2 1 S 1 2 5 9) was detected by PCR.
  • Other gene primer oligonucleotide sequences designed on the basis of nucleotide sequences obtained from the Ge nBank database are shown below:
  • PRED65F 5'-GCCTGGCATCTTCCTCAATA (SEQ ID NO: 3)
  • PRED65R 5'- TTGCATGCCTGTGGTACTGT (SEQ ID NO: 4)
  • PRED3F 5'-TCACAATCATGGGCTTTGAA (SEQ ID NO: 5)
  • PRED3R 5'-CACGCAACCATTTGTTCATT (SEQ ID NO: 6) Approximately 0.1 g of genomic DNA is used as a saddle, and the PRED 3 gene located at the proximal position of the cleavage site by homologous recombination is selected from PCR amplification (Innis et al., Supra) was carried out for a total of three types of markers, D 2 1 S 2 6 5 marker and D 2 1 S 2 6 6 marker, located at the same position. If the distal long arm is removed by telomere truncation, it is expected to retain the P RED 3 gene and not the D 2 1 S 2 6 5 marker and D 2 1 S 2 66 marker.
  • the Resistance 3 Expected amplification results in 24 clones out of 54 clones. These 24 clones were subjected to PCR amplification with the remaining 7 markers to confirm the retention region of human chromosome 21.
  • Figure 2 shows the representative results.
  • Figure 2 shows a schematic chromosomal map based on the G band image of human 21st chromosome on the left side, and shows which band the marker is located on.
  • P The marker that detected the expected amplification product by CR was a garden, and the marker that was not detected was indicated by mouth.
  • DT 40 (# 2 1) is the cell prior to telomere truncation.
  • a probe was set within the target sequence for homologous recombination (Fig. 1).
  • the probe used was the oligonucleotide primer pair shown below, amplified by PCR using the genomic DNA of DT40 hybrid cells carrying human 21st chromosome as a saddle, and then the PCR amplified fragment was isolated and purified.
  • FI SH analysis was performed using the human specific probe Cot 1 (Gibco B RL) according to the method described in Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 1994).
  • FI SH experimental protocol Matsubara et al.
  • shortened human chromosome 21 was detected in most of the observed mitotic figures.
  • a typical FI SH image is shown in Figures 4a and b.
  • the white arrow indicates the full length human chromosome 21 before telomere truncation
  • Fig. 4b the white arrow indicates the human chromosome 21 fragment from which the distal long arm has been deleted.
  • D the host From the relative size of the chromosome of T40 cells, it was confirmed that human chromosome 21 was shortened.
  • P S F l (Lifetech) was used as the basic plasmid for inserting the 1 ⁇ X ⁇ sequence into the human artificial chromosome (HAC) prepared in Example 1.
  • the base sequence of the long arm of human 21 which is the Lo x P insertion site was obtained from the Gen B ank database (registration number AL 1 6 3 20 3).
  • the sequence of the primer oligonucleotide used to amplify the two target sequences for homologous recombination is shown below:
  • the blasticidin resistance gene used for selection of homologous recombinants is a fragment of about 1.3 kb by digestion with restriction enzymes Xho I (Tibbon Gene) and Sail (Tibbon Gene) from PC MV / B sd (Invitrogen). And was cloned into the Xho I size of the above-mentioned p SF 1 construct.
  • the final pSF1 construct is approximately 12.4 kb in size.
  • Evening Fig. 5 shows the ingbetakuta, the target sequence, and the chromosomal allele resulting from homologous recombination.
  • the pSF1 construct was linearized by digestion with the restriction enzyme Ap a I (Nibbon Gene) and introduced into the DT40 strain (DT40 (# 2 1) puro-339), which carries human chromosome 21 with the distal long arm deleted. .
  • DT40 hybrid cells were suspended in 0.75 ml PBS in 1 ⁇ 10 7, and electoporation was performed using a gene pulser (BioRad) in the presence of 10 / ig DNA.
  • a capacitor with a capacitance of 25 F was applied at 750 V, and discharged using an electrovole- tion cell with a distance between electrodes of 4 mm.
  • Southern blot analysis was performed to screen for homologous recombinants.
  • a probe was set outside the target sequence for homologous recombination.
  • the probe used was the oligonucleotide primer pair described below, and amplified, isolated and purified by PCR using genomic DNA of DT 40 hybrid cells carrying human chromosome 21 as a saddle.
  • 21L0X4869F 5'- GTTGCAGAAAAGTAGACTGTAGCAA (SEQ ID NO: 1 3)
  • 21LOX5682R 5'- TCTAAGGAACAAATCTAGGTCATGG (SEQ ID NO: 14)
  • About 10 g of genomic DNA extracted from the blasticidin resistant clone was digested with the restriction enzyme Xbal (Nibonbon Gene), and Southern plot analysis was performed (FIGS. 6A and B).
  • the probe was labeled with 32 P, and the signal was detected with an image analyzer BAS 2 00 (Fuji Photo Film).
  • the first lane from the left is the 1 o human before introduction of the XP site 2 DT 40 strain carrying chromosome 1
  • the second lane is the host DT 40 cell line
  • the 3rd and subsequent lanes indicate brassine-saidin resistant DT40 strain.
  • restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 7.6 kb for the homologous recombinant and 8.5 kb for the wild type (non-recombinant), and a total of 3 clones from the blastcidin resistant strain 8 2 (# We found homologous recombinants 6 0, # 7 8, and # 7 9).
  • oligo primer pairs were designed on the chromosome and on the targeting vector, respectively. The position is indicated by an arrow in FIG. Its sequence is shown below: Left455F: 5'-GGGCTAGCCATTAAAGCTGA (SEQ ID NO: 15)
  • Left638R 5'- AAAGGGAATAAGGGCGACAC (SEQ ID NO: 1 6)
  • Rightll52R 5'-GTCAATTCACTAATTCCTATTCCCAGT (SEQ ID NO: 1 8) Genomic DNA was extracted from candidate clones found by Southern blot analysis and subjected to PCR, and the size predicted from the base sequence (left (A) 3, 2 8 3 bp And right side (B) 3, 1 1 4 bp) amplification product was confirmed. The results are shown in Figure 6B.
  • Chromosome donor cells obtained in Examples 1 and 2 with the distal long arm deleted and inserted with 1 o XP sequence 2 DT 40 cells carrying the HAC vector based on chromosome 1 (DT 4 0 (# 2 1) bsd— 7 9) was used.
  • a chromosome recipient cell a Chinese hamster-derived cell line CH ⁇ _K1 (obtained from ATC C, registration number J CRB 9 0 1 8) was used.
  • microcells were prepared from about 10 9 DT 40 (# 2 1) bsd-79 cells.
  • DT 40 (# 2 1) bsd— 79 cells cultured to a cell density of about 60-70% saturation contain culture medium containing colcemid (0.075 / X gZm1, demecorsin, Wako Pure Chemical Industries)
  • Micronuclei were induced by culturing for 12 to 15 hours in (10% FBS, lC Ch S, 50 xM2 monomercaptoethanol, DMEM). The cells were collected by centrifugation, resuspended in serum-free DMEM, and seeded onto two 25 cm 2 centrifuge flasks (coaster) 1 previously coated with poly L-lysine.
  • F I SH analysis was performed using a human specific probe C o t 1 (Gibco BRL) according to the method described in Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 1994). Brass 1 and two of the CHO strains resistant to cidine (CHO (# 2 1) bsd 79-1 and CHO (# 21) bsd 79-3) were analyzed. Abbreviated chick chromosome 21 was detected. Typical F I SH images are shown in Figs. 7a and b. Fig. 7a shows the full length human chromosome 21 before telomere truncation, and Fig. 7b shows the human chromosome 21 fragment without the long arm.
  • the obtained blasticidin-resistant CHO strain retains the human chromosome 21 fragment (HAC vector 1) with the long arm distal part deleted and the 1 o xP sequence inserted. It was confirmed to do.
  • a human CHO cell (CHO (# 21) that retains the HAC vector based on chromosome 1 obtained in Example 3 with the long arm removed and inserted with a 1 o xP sequence. bs d- 79-1) was used.
  • the human fibrosarcoma cell line HT 1 080 (obtained from ATCC, registration number CCL-1 2 1) was used as the chromosome recipient cell.
  • a microcell was prepared from about 10 7 CHO (# 2 1) bsd- 79-1 cells. That is, CHO (# 21) bsd— 79— was cultured in six 25 cm 2 centrifuge flasks (coaster) until the cell density reached 60-70% saturation.
  • Microcells were collected by suspending them in serum-free medium (DMEM), and purified by filtration through a filter. Purified micronucleated cells were added to a 6 cm-diameter dish in which HT 1080 cells were cultured to 80% saturation, and fused with a PEG solution. After 48 hours, the cells were dispersed by trypsin treatment and cultured in a selective medium (10% CS, DMEM) containing blasticidin (8 ng / m 1). After about 2 weeks of selective culture, drug-resistant colonies that emerged were isolated and subjected to further analysis. A total of 12 plus-cidin resistant HT 1080 strains were obtained from two micronucleus cell fusions.
  • DMEM serum-free medium
  • the transferred chromosome was confirmed by PCR amplification of the blasticidin resistance gene.
  • the sequence of the oligonucleotide primer used is shown below.
  • Bsd2687F 5'-CAACAGCATCCCCATCTCTG (SEQ ID NO: 19)
  • Bsd2891R 5'-GCTCAAGATGCCCCTGTTCT (SEQ ID NO: 20)
  • Chromosome analysis was performed by Giemsa staining according to the method described in Kuroki et al. (Cell engineering handbook, Yotsuya, 1992). About 20 metaphase chromosome images of 4 strains of HT 1 080 resistant to blasticidin (HT 1 080 (# 21) bsd 79-l-3, 6, 1 1, 14) were analyzed. In the blasticidin resistant strain, the parent strain HT 1 080 is not recognized, and the smaller size of the 21st chromosome. Two chromosomes were observed. From the above experiments (1) and (2), the obtained blasticidin-resistant HT 1 0 80 strain was obtained by deleting the distal long arm and inserting the 1 o XP sequence. AC vector) was confirmed.
  • the non-selective medium for human cell lines was DMEM supplemented with 10% CS, and the selective culture medium was supplemented with 4 g / m 1 of blasticidin.
  • the chicken cell line was seeded with 1.5 X 10 7 cells in a 10 cm diameter dish, and after 1 day, the cells were counted and seeded again with 1.5 X 10 7 cells in a 10 cm diameter dish. .
  • Human cell lines were seeded 5. 0 X 1 0 5 cells in 1 0 cm-diameter dish were plated again 5. 0 X 1 0 5 cells 10 cm diameter Dates shoe by counting the cells after 3 days.
  • the cell lines were collected 21 days, 42 days, 63 days, 84 days, 105 days and 1 26 days after the start of culture, and human cell lines were collected 10 days and 20 days later, and chromosome samples were prepared. .
  • Human chromosome 21 fragment was stably maintained in DT 40 cells even when the number of divisions exceeded 200 under non-selective culture conditions. In addition, when 100 chromosome images at metaphase were observed and the number of human chromosomes per cell was counted, one was recognized without exception. On the other hand, the HT 1080 cell line is still being cultured, but at this time (number of divisions: 22), the chromosomal chromosome 21 fragment is stably maintained under selective culture conditions. In addition, observation of the chromosome image at the middle stage of cleavage revealed one or two chromosome parts per cell.
  • a GFP expression plasmid containing 1 oxP sequence was prepared, and the recombinase was transiently expressed to insert it into the artificial chromosome by site-specific recombination between the 1 oxP sequences. did.
  • the selection of recombinant inserts was based on the acquisition of G 4 18 resistance (reconstruction of promoter-division type neo gene expression unit).
  • GFP expression vector P EGF P— C 1 (Clontech) was digested with restriction enzymes Gb LII and BamHI (Nibbon Gene) to isolate / purify a 4.7 kb DNA fragment, and DNA Ligation Kit Ver Self-circularized by .2 (Takara Shuzo).
  • a recombinant plasmid was isolated by transformation of E. coli DH5 ⁇ to obtain a plasmid (P EGF P — C I A) from which 51 bp was deleted from GbLI to BamHI within the multiple cloning site.
  • This P EGF P—C 1 ⁇ was used as a cage, and the expression unit of the EGF P gene was amplified by PCR.
  • the sequence of the primer oligonucleotide prepared based on the base sequence (accession number U 5 5 7 6 3) obtained from the database of Gen Bank is shown below: EcoGFP5: 5 'One GGCCGAATTCCGTATTACCGCCATGCAT (SEQ ID NO: 2 1 )
  • BamGFP3 5 'one CCGGGATCCCACAACTAGAATGCAGTG (SEQ ID NO: 2 2) Both ends of the amplified EG FP gene expression unit were digested with restriction enzymes Eco RI and BamHI (Nibbon Gene) to form overhanging ends, h A plasmid vector equipped with a CMV probe motor was cloned into EcoRI / BamHI site of PBS 2 26 (Lifetech). (2) Transfection and isolation of G 4 18 resistant clones
  • the CHO cell (CH ⁇ (# 2 1) bsd 7 9-1) retaining the HAC vector derived from human 21 chromosome 1 prepared in Example 3 was trypsinized, and 5 X 1 0 6 cells were treated with 0.8 m 1 In phosphate buffer (PBS). 1 0 ig PBS 2 2 6 Electroporation was performed using Gene Pulser (Bio-Rad) in the presence of ZEGFP plasmid and 20 g of Cre enzyme expression vector PBS 1 85 (Lifetech). A capacitor having a capacitance of 25 F was applied at 750 V and discharged using an electroporation cell having a distance between electrodes of 4 mm.
  • PBS phosphate buffer
  • F 1 2 10 Omm tissue culture plastic dish (Falcon) containing Eagle F 12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (hereinafter referred to as F 1 2; manufactured by Invitrogen). Sowing. Two days later, the medium was replaced with a medium containing 800 g / m 1 of G 41 8 (GENETICIN, Sigma) 8 ng / m 1 of Blasticidin S Hydrochloride (Funakoshi). 2 resistant colonies after three weeks appeared, the frequency was 20 per CHO cell 5 X 1 0 6. Colonies were isolated and expanded for further analysis.
  • FBS fetal bovine serum
  • Southern plot analysis was performed to confirm homologous recombinants. Southern plot analysis was performed on about 5 / g genomic DNA treated with restriction enzymes EcoRI or BamHI (Nibonbon Gene) using G418 resistant gene and a part of GFP gene as probes.
  • GFP probe an 849 bp fragment obtained by digesting plasmid PEGFP-C 1 (Clontech) with restriction enzymes Nhe I and Gb LII (Nibonbon Gene) was used.
  • G418 resistant gene plasmid pSV2ne0 was deleted with restriction enzymes Gb LII and SmaI (Nibonbon Gene), and a fragment of 1 000 bp was prepared and used.
  • Figure 10 shows an example of the result.
  • Figure 10 shows Eco RI digested DNA Is detected by the neo probe.
  • Lane 1 shows the DT40 strain before insertion of the insert, and lane 2 and later shows the G418 resistant DT40 strain.
  • a 5.7 kb signal is detected in the allele before insertion, and a 6.9 kb signal in the allele after insertion.
  • telomere truncation vector for deleting the distal short arm of human 21 was constructed by modifying PBS—TEL / Puro (Kuroiwa, Nucleic Acids Res., 26: 3447, 1998).
  • PBS The puromycin-resistant gene expression unit from TEL / Puro 1.
  • the target sequence for telomere truncation vector insertion was designed from the base sequence of the long arm of human chromosome 21 (registration number AL163201) obtained from the GenBank database.
  • the sequence of the primer oligonucleotide to which the restriction enzyme SpeI or BamHI is added for PCR amplification is shown below: Spe31203: 5'-GCACTAGTCTGGCACTCCTGCATAAACA (SEQ ID NO: 23)
  • Bam36192 5′-CTAAGGATCCATTTCAGCCTGTGGGAATCA (SEQ ID NO: 24) Human 2
  • the target sequence was amplified by PCR using genomic DNA extracted from the DT40 hybrid cell holding chromosome 1 as a truncated form. This is the restriction enzyme S pe I and B am After digestion with HI (two-bon gene), an approximately 5 kb DNA fragment having a protruding end was separated by agarose gel electrophoresis and purified. This was cloned into the XbaI / BamHI site of the PBS—TELZHygro plasmid. The final PBS—TEL / Hy gro construct size is approximately 5.8 kb.
  • the telomere transcription vector, the target sequence, and the chromosomal allele resulting from homologous recombination are shown in FIG. Isolation of transfection and hygromycin-resistant cucumbers
  • PBS—TE L / Hy gro construct was linearized by digestion with restriction enzyme BamHI (Nibbon Gene), and the long arm distal part was removed and human 2 chromosome 1 incorporating the 1 ox P site It was introduced into the retained DT 40 hybrid cells (DT 40 (# 2 1) bsd 79). DT 4 0 hybrid cells 1 x 1 0 7 0. 7 51111? The sample was suspended in 83 and electroporation was performed using Gene Pulser (Bio-Rad) in the presence of 25 g DNA. A capacitor with a capacitance of 25 F was applied at 7500 V and discharged using an electrification position cell with a distance between electrodes of 4 mm.
  • BamHI Nick Gene
  • DMEM medium Invitrogen
  • FBS fetal bovine serum
  • C h S chicken serum
  • 2-mercaptoethanol 50% 2-mercaptoethanol. 9 Seeded in 5 6-hole clusters (Falcon). Two days later, hygromycin-B (Wako Pure Chemical Industries) was added to a final concentration of 1.5 mgZm 1. Resistant colonies appeared after 2-3 weeks. A total of 63 drug-resistant colonies were isolated and expanded from a total of two transfections, and further analysis was performed.
  • PCR analysis was performed as a primary screening for selecting homologous recombinants from hygromycin resistant DT40 strain.
  • Genomic DNA extracted from a hygromycin-resistant strain of approximately 0.1 / ig is a saddle type and is located proximal to the short arm of human chromosome 1.
  • a TS marker (p CHB, D 21 S 1 88, D 21 S 275) was amplified.
  • Figure 12 shows the representative results.
  • Figure 12 shows a schematic chromosomal map based on the G-band image of human chromosome 21 on the left, and the band where marker 1 is located.
  • DT40 For the hygromycin-resistant strain DT40, the marker that detected the amplification product expected by PCR was indicated, and the marker that was not detected was indicated by mouth.
  • DT40 (# 21) is a cell prior to telomere truncation. If the distal short arm is removed by telomere truncation, it is expected to retain D 2 1 S 275 and not D 21 S 1 88 and p CHB. 45 strains that did not amplify any of D 2 1 S 1 88 or p CHB were selected and subjected to Southern blot analysis.
  • a probe was set within the target sequence for homologous recombination.
  • the probe used was a pair of oligonucleotide primers shown below, and was amplified, isolated and purified by PCR using genomic DNA of a DT40 hybrid cell carrying human 21st chromosome as a saddle.
  • a sequence containing the recombination target site was amplified by PCR.
  • the primer-oligonucleotide sequences set up on human 2 chromosome 1 and the sunset-getting vector are shown below: Hyg968: 5'- AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC (SEQ ID NO: 27)
  • F I SH analysis was performed using a human specific probe C o t 1 (Gibco BRL) according to the method described in Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 1994). As a result, shortened human chromosome 21 was detected in most of the observed mitotic figures (Figs. 15a and b).
  • Example 7 Insertion of EPO gene into HAC vector derived from human 21 chromosome 1
  • human EPO gene derived from human 21st chromosome 1 HAC vector insert As described in Examples 1 to 4, a human chromosome 21-derived HAC vector in which the distal long arm was deleted by telomere truncation and a 1 o XP site was introduced proximal to the long arm was prepared.
  • a human EPO expression plasmid containing 1 o XP sequence is prepared and inserted into an artificial chromosome by site-specific recombination between 1 o XP sequences by transiently expressing Cre recombinase. It was. Selection of recombinant inserts was based on the acquisition of G418 resistance (reconstruction of a promoter-partitioned neo gene expression unit).
  • SV40polyANpl 5 '-CGG GAT CCC G AGC GAG ACA TGA TAA GAT ACA TTG ATG -3' (SEQ ID NO: 29)
  • SV40polyARpl 5' ⁇ GGA AGA TCT TCC TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG-3, (SEQ ID NO: 30)
  • primers were prepared based on the base sequence of plasmid vector pSTNeoB (Kato et al., Cell Struct Fund, 12: 575-580, 1987).
  • CMVN 3 5'- CGG AAT TCC GGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT TAT TAA TAG -3 '(sequence number 3 1)
  • CMVRpl 5'- CGG GAT CCC GGG TGT CTT CTA TGG AGG TCA AAA CAG -3 '(SEQ ID NO: 3 2)
  • hEPORpl 5'-CGC TCG AGC GCT ATC TGT CCC CTG TCC TGC AGG-3, (SEQ ID NO: 34)
  • primers were prepared based on the nucleotide sequence obtained from Gen Bank (accession number 1 05 3 9 7). Both ends of SV poly A-added subunits PCR amplified using SV40polyANpl (SEQ ID NO: 29) and SV40polyARpl (SEQ ID NO: 30) with pS Tneo B as a saddle type restriction enzyme B amH I and B g 1 II (Takara Shuzo) ) To create a protruding end, and cloned into the BamHI site of pBS226 (Lifetech), a plasmid vector with ⁇ sequences and hCMV promoter. This was designated as pBS226-pA.
  • CMVNp3 SEQ ID NO: 3 1
  • CMVRpl SEQ ID NO: No. 3 2
  • the ends of the CMV promoter unit amplified with PCR were digested with restriction enzymes Eco RI and BamHI (Takara Shuzo) to form protruding ends, and pBS 2 2 6— pA Eco RI — Cloned between B amHI I sites. This was designated as p LN l.
  • the human E PO coding region was amplified by PCR using hEPONpl (SEQ ID NO: 3 3) and hEPORpl (SEQ ID NO: 3 4) using human E PO cDNA as a truncated form. Digested with ol (Takara Shuzo) to form a protruding end, and cloned between the BamHI and Xhol sites of pLNl. This was designated as p LN l—E PO. (2) Transfection and isolation of G4 18 resistant clones
  • the CHO cells (CHO (# 2 1) bsd 7 9-1) carrying the HAC vector derived from human chromosome 21 prepared in Example 3 were trypsinized, and 5 X 10 6 cells were treated with 0.8 m 1. Suspended in Hank's balanced salt solution (HB SS). Using Gene Pulser (Bio-Rad) in the presence of 10 g of the pLN l _E P ⁇ vector prepared in (1) above and 10 g of the Cre enzyme expression vector pBS 1 8 5 (Lifetech) We performed electro volation. A capacitor having a capacitance of 50 F was applied at 45 V and discharged using an electrovolu- lation cell having a distance between electrodes of 4 mm.
  • HB SS Hank's balanced salt solution
  • the biological activity of the produced human EPO was analyzed using the proliferation activity of human leukemia cell line UT 7- EPO cells (obtained from Dr. Norio Komatsu, Jichi Medical University) showing human EPO-dependent proliferation as an index.
  • Two cultures of KH2 1 E cells (# 02 and # (1 8))
  • the culture supernatants of EPH final concentrations of 0.0 1, 0, 1, 1, 5, 20, 100 m based on the quantitative values in Table 2
  • the cell proliferation measurement kit Cell Titer 96 AQueous On e S o 1 ution Cell Proliferation Assay (promega) was used to analyze cell proliferation.
  • the transferred chromosomes were confirmed by PCR and FISH analysis for each clone of the KH 21 E cells prepared in (2) of Example 7.
  • FI SH analysis was performed using the human-specific probe Cot 1 (Gibco BRL) according to the method described in Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 11994). The expected amplification for all markers in the PCR analysis (1) above. Of these clones, 8 clones were analyzed, and a shortened human chromosome 21 was detected in most of the observed mitotic images. The results are shown in Table 3.
  • the clone KH 21 in Table 3 represents CH cells (CHO (# 2 1) bsd 79-1) carrying the HA 21 vector-derived HAC vector prepared in Example 3. Table 3
  • Example 9 Insertion of multiple EPO genes into human 2 chromosome 1-derived HAC vector
  • human 21 chromosome 1-derived HAC vector Multiple human EPO genes were inserted into one.
  • a human EP ⁇ expression plasmid containing 1 oxP sequence is prepared and inserted into an artificial chromosome by site-specific recombination between 1 o XP sequences by transiently expressing Cre recombinase. It was. Recombinant insert selection is based on the acquisition of G418 resistance (reconstruction of a pro-segmented neo gene expression unit).
  • EPOnF primer (SEQ ID NO: 35) is Eco RI, Ap al, M 1 It has a restriction enzyme recognition sequence for uI and a 5 'partial sequence of the CMV promoter, and was prepared based on the single nucleotide sequence of the CMV promoter of pBS226.
  • the SVpAR primer (SEQ ID NO: 36) has a restriction enzyme recognition sequence for Eco RI and B c 1 I and a sequence complementary to the 3 ′ side of the SV40 poly A addition unit in order from the 5 ′ side. Yuichi It was prepared based on the base sequence of pSTneoB (Kato et al., Cell Struct Funct, 12:57 5 -580, 1987).
  • a addition unit PCR amplification was carried out with KOD—Plus— (Toyobo) using EPOnF (SEQ ID NO: 35) and SVpAR (SEQ ID NO: 36) primers.
  • KOD—Plus— Toyobo
  • EPOnF SEQ ID NO: 35
  • SVpAR SEQ ID NO: 36
  • the thermal cycler Gene Amp 9700 (Applied Biosystems) was used. PCR cycle is 94 ° C for 2 minutes followed by denaturation 94 ° C for 15 seconds, annealing 60 ° C for 30 seconds, and extension 68 ° C for minutes 9 There were 30 cycles of 0 seconds.
  • Both ends of the obtained DNA fragment were digested with restriction enzyme Eco RI (Takara Shuzo) to form overhanging ends and cloned into the plasmid vector pLN 1 _E PO Eco RI site.
  • the base sequence of the cloned insert DNA fragment is analyzed with a DNA sequencer (PRI SM3 700, Applied Biostems) and corresponds to the base sequence of pLN1-EPO used for the cage type. It was confirmed that it was the same as the part.
  • a plasmid vector in which two copies of CMV promoter, human EP0 gene and SV40 poly A addition unit were arranged in the forward direction was designated as pLN1-EPO2.
  • the plasmid vector pLNl-EP02 prepared in (1) above was digested with XbaI (Takara Shuzo), linearized, and then blunted with KOD polymerase (Toyobo). After digestion with Takara Shuzo, an insert DNA fragment containing 2 copies of CMV promoter, human EP gene and SV40 poly A addition unit was obtained.
  • Ap a I was obtained by digesting plasmid vector pLN 1—EP 0 2 with M 1 u I (Takara Shuzo), blunting with KO D polymerase (Toyobo), and digesting with Ap al (Takara Shuzo). The blunt-ended DNA fragment was cloned between M 1 u I sites.
  • a plasmid vector containing 4 copies of this human EP gene was designated as P LN 1 -E P04.
  • the CHO cell (CHO (# 2 1) bsd 7 9-1) retaining the human 21st chromosome 1-derived HAC vector prepared in Example 3 was trypsinized, and 5 X 10 6 cells were treated with 0.8 m 1.
  • Hanks balanced salt solution HB SS
  • F 1 2 5 cells of 48-well tissue culture plastic plate (Falcon) containing Eagle F 12 medium supplemented with 10% fetal calf serum (FB S) (hereinafter referred to as F 1 2; manufactured by Invitrogen) Sowing. Two days later, the medium was replaced with a medium containing 800 g / m 1 of G 41 8 (GENET ICIN, Invitrogen) and 8 g / m 1 of blasticidin (B 1 asticidin S Hydrochloride, Funakoshi). After 2 to 3 weeks, resistant colonies appeared, the frequency of which was 14 per CHO cell 5 X 10 6 when pLN 1 _E PO 2 was used, and 24 when pLN 1-EP04 was used. It was a piece. Colonies were isolated and expanded for further analysis. These cells are hereinafter referred to as cells prepared using pLN 1 -E PO 2 as KH 21 E 2 cells, and cells prepared using pLN 1-EP04 as KH2 1 E 4 cells.
  • Recombinant inserts were selected based on whether or not they were inserted into the 1 o XP sequence site on the human chromosome 21-derived HAC vector on the human EPO gene donor vector-derived sequence and HAC. Primers were designed on the vector and confirmed by PCR amplification. In addition, the number of copies of the inserted human EP ⁇ gene was confirmed by designing the primers on the plasmid vector PBS226 and the HAC vector, and by PCR amplification.
  • oligonucleotide primer used for PCR amplification SVpANpl: 5'-TTTTCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA _3, (SEQ ID NO: 37)
  • This primer is a plasmid vector p S Tn eo B (Kato) Et al., Based on the base sequence of Ce 1 1 S nestt Funct, 12: 575-580, 1987).
  • Neo Rp2 5'-AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC-3, (SEQ ID NO: 38) It was prepared based on the base sequence of the gene.
  • This primer was prepared based on the base sequence of the plasmid vector p B S226 (Lifetech).
  • PLN 1 -EP02 or p LN 1 — SVpANpl primer designed in the SV40 poly
  • a addition sequence region derived from EPO 4 vector and pSF 1 derived neomycin resistance gene on HAC vector PCR amplification was performed using NeoRp2 primer (SEQ ID NO: 38).
  • the neo gene is derived from the SV40 poly
  • the region containing 2 copies of the pLNl—EPO 2 vector-derived CMV promoter, human EPO gene, and SV40 poly A additional sequence up to 1 o XP sequence and 1 o XP from pSF 1 Amplification of about 3.8 kbp including the sequence to a part of the neo gene is expected. As a result, the expected amplification was confirmed in all clones.
  • G 41 8 / blastcidin-resistant KH 2 1 E 4 cells 6 clones out of 24 clones, each with 1 x 10 5 cells and 10% FBS-added 800 g / m 1 G 41 8 And 8 g / m 1 of brassicidal saidine.
  • 2 ml of F12 medium was seeded in a plastic dish (Falcon) for 6-well tissue culture. After reaching confluence, replace with 2 ml of F 1 2 medium supplemented with 10% FBS for 6 days Cultured and the supernatant was collected.
  • the human EPO EL ISA kit (Qu antikine I VD Hum an EPO I mmu noassay, R & D systems), was quantified human EPO in the culture supernatant at 2 X 1 0 one 5 dilution. The results are shown in Table 5.
  • Table 5 The human EPO EL ISA kit (Qu antikine I VD Hum an EPO I mmu noassay, R & D systems), was quantified human EPO in the culture supernatant at 2 X 1 0 one 5 dilution. The results are shown in Table 5. Table 5
  • G 41 8 / blastoidin-resistant KH 2 1 E cell 5 clone which is isolated in Example 7, and retains one copy of the human EPO gene on the chromosome 21-derived HAC vector 6-well tissue containing 800 ml / ml 1 G4 18 and 8 xg / ml 1 blasticidin containing 2 ml 1 x 10 5 cells each with 10% FBS It was seed
  • Example 10 Distal long arm and distal short arm deleted human 2 Insertion of EPO gene into HAC vector derived from chromosome 1
  • the human EPO gene is inserted into the human 21st chromosome-derived HAC vector.
  • remove the distal long arm by telomere placement remove the distal long arm by telomere placement, introduce 1 o XP size 1 proximal to the long arm, and distal the short arm by telomere transpiration
  • a HAC vector derived from human chromosome 1 was deleted.
  • a human EPO expression plasmid containing 1 o XP sequence was prepared and inserted into an artificial chromosome by site-specific recombination between 1 ox P sequences by transiently expressing Cre recombinase. did. Selection of recombinant inserts was based on the acquisition of G418 resistance (reconstruction of promoter-splitting type neo gene expression unit).
  • FBS fetal bovine serum
  • F 12 Eagle's F 12 medium
  • PCR amplification was performed (see (3) of Example 6 and Fig. 12). Since the short arm distal to the short arm of human chromosome 1 has been deleted, p CHB and D 2 1 S 1 87 markers are not retained, but D 2 1 S 2 7 5 is retained. Is expected to. As a result, the expected amplification was observed in 15 clones.
  • H4EC15 50/100 17/6 33/87 0/6 0/1 0/0 94
  • H4EC16 50/100 5/11 45 /-0 / — 0 /-0 /-One
  • H4EC18 50/100 1/7 49/89 0/4 0 0 93
  • HAC vector derived from human chromosome 21 obtained in Example 17 with the distal long arm deleted and the 1 o xP sequence inserted and the distal short arm removed by telomere transcription CH cells that hold: CHO # 2 1 hyg 4 and CHO # 21 hy g 8 (hereinafter referred to as H 4 cell and H 8 cell, respectively) were used.
  • Mouse A 9 cells (Oshimura et al., Environ. Health Perspect. 93:57, 1991, accession number JCRB 02 1 1) were used as chromosome recipient cells.
  • microcells were prepared from about 10 7 H4 cells.
  • H 4 or H 8 cells cultured to 24 to 25 cm 2 centrifuge flasks (NUNC) to a cell density of about 60-70% saturation were treated with corsamide (0.1 g / ml, demecorsin, Wako Pure Chemical Industries).
  • corsamide 0.1 g / ml, demecorsin, Wako Pure Chemical Industries.
  • Micronuclei were induced by culturing in B S, 800 g / m 1 G41 8, F 1 2) for 5 days. After removing the medium, the cytochalasin B (DME) that has been pre-heated (37 ° C)
  • centrifuge flask with 10 mg / ml, Sigma) solution in M
  • a centrifuge flask was placed in a heart vessel and centrifuged at 34 ° C, 8, '000 rpm for 1 hour.
  • the microcell was suspended and collected in serum-free medium (DMEM), and purified by filtration using SW I NNEX-25 (Millipore) equipped with a filter (Whatman) with a pore size of 8 lim, 5 m, and 3 zm.
  • the purified microcell was resuspended in 2 ml of DM EM containing 50 X gZm 1 of phytohemagglutinin-P (Difco).
  • Purified micronucleated cells were added to a 25 cm 2 culture flask (Falcon) in which mouse A 9 cells were cultured to 90% saturation, and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes, and then P EG 1 in DMEM. 000 (final concentration 50% (W / V), sigma) and DMS O (final concentration 7% (W / V), sigma) were dissolved and filtered with a pore size 0.22 xm filter (Sartorius). Fusion took 1 minute. After culturing in DMEM medium containing 10% FBS for 48 hours, the cells were dispersed by trypsin treatment and seeded on two 48-well tissue culture plastic plates (Falcon).
  • A9 ⁇ cells Two days later, it was replaced with a selective medium (10% FBS, DMEM) containing blasticidin (4 g / ml) or hygromycin (700 mg / ml, Invitrogen). After about 3 weeks of selective culture, the emerged drug-resistant colonies were isolated for further analysis. 22 drug-resistant colonies were obtained from 7 micronucleus cell fusions. The cells obtained above are hereinafter referred to as A9 ⁇ cells.
  • PCR amplification was performed for (3) and Fig. 2).
  • the HAC vector transfer is expected to retain the P RED 65 and P RED 3 genes and not the D 21 S 265 marker. As a result, the expected amplification was observed in 20 clones.
  • STS Maichikichi (pCHB, D) is located near the short arm of human 2 chromosome 1. 2 1 S 1 87, D 2 1 S 27 5) The previous PCR amplification was performed (see (3) of Example 6, Fig. 12). Human 2 Chromosome proximal to the short arm and the distal short arm deleted, so it is predicted that the p € 118 and 02 1 S 1 87 markers are not retained, but the D 2 1 S 27 5 marker is retained. Is done. As a result, the expected amplification in 18 clones was confirmed.
  • the shortened human chromosome 21 was transferred to mouse A9 cells based on the relative size of the host mouse A9 cell chromosome.
  • the two cell clones obtained above will be referred to as A9 ⁇ 11 and 89 ⁇ 12 cells.
  • Example 1 2 Transfer of HAC vector derived from human 21st chromosome containing human EPO gene inserted into mouse A9 cells (1) Micronucleus cell fusion and isolation of drug resistant clones
  • a chromosome donor cell As a chromosome donor cell, one copy of the human EPO gene obtained in Example 10 was inserted, the long arm distal part was deleted, 1 o XP sequence was inserted, and then the short arm distal part was obtained by telomere truncation.
  • a clone H4 EC10, C15, or C16 cell
  • Mouse A9 cells (Oshimura et al., Environ. Health Perspect. 93:57, 1991, registration number JCRB 0 2 1 1) were used as chromosome recipient cells.
  • microcells were prepared from about 10 8 H4 EC 15 or C 16 cells. That is, H 4 EC 15 or C 16 cells cultured to 24 to 25 cm 2 centrifuge flasks (Nunks) to a cell density of about 60 to 70% saturation were treated with colcemid (0.1 ng / m 1, Micronuclei were induced by culturing in a culture solution (20% FBS, 800 zg / m 1 G41 8, F 1 2) containing demecorsin and Wako Pure Chemicals) for 4 days.
  • the purified microcell was resuspended in DMEM 2m 1 containing 50 g / m 1 or 100 ⁇ g / m 1 of phytohemaglutinin P (Difco).
  • Purified micronucleated cells were added to a 25 cm 2 culture flask (Falcon) in which mouse A 9 cells were cultured to 90% saturation, and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes, then in DMEM Dissolve P EG 100 00 (final concentration 50% (W / V), Sigma) and DMS ⁇ (final concentration 7% (WZV), Sigma) and filter with pore size 0.2 filter (Sartorius) The resulting solution was fused for 1 minute.
  • Drug resistance genes present on human chromosome 21-derived HAC vectors ie hygromycin resistance gene (short arm distal), blasticidin resistance gene and neomycin resistance gene (long arm proximal) in the presence of selective drugs It was confirmed whether or not the region containing each drug resistance gene was retained using as an index whether or not it functions.
  • the cell density was about 60-70% saturation in each well of the 6-well tissue culture plate.
  • G 41 8 600 Mg / m 1) Or selection containing blasticidin (6 ng / m 1)
  • the cells were cultured in a medium (10% FBS, DMEM). After rinsing twice with PBS (Invitrogen), the cells were cultured in a culture solution containing blasticidin and hygromycin (700 g / m 1) and G 418 for 1 week or 10 days.
  • the results are shown in Table 12.
  • FI SH analysis was performed using the human-specific probe Cot 1 (Gibco BRL) according to the method described in Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 1994). Analysis of 7 clones that showed the expected amplification in all markers in the (2-1) PCR analysis described above revealed that human chromosome 21 was shortened in most of the observed mitotic figures. The results are shown in Table 13. Table 13
  • Recombinant inserts are selected based on whether or not they have been inserted into the 1 o XP sequence site on the human chromosome 21-derived HAC vector, with the 1 o xP sequence site in between. Primers were designed above and on the HAC vector and confirmed by PCR amplification.
  • Neo Rp2 primer SEQ ID NO: 38
  • M13RV primer SEQ ID NO: 39
  • the above-mentioned ⁇ E cell clone retains the human 21 chromosome 1-derived HAC vector into which the insert DNA containing the CMV promoter, human EP ⁇ gene and SV40 poly A additional sequence has been inserted. It was confirmed.
  • the expression of the human EPO gene is based on the human EPO protein produced in the culture supernatant by enzyme-linked immunosorbent assay (EL I SA method). Was quantified.
  • DMEM medium containing 4 mg of G41 8 and 6 g / m1 of blasticidin with 10% FBS supplemented with 1 X 10 5 cells each for 4 clones of isolated ⁇ E cells 1 was seeded on a 6-well tissue culture plastic plate (Falcon). After reaching the confluence, the medium was replaced with 2 ml of F 1 2 medium supplemented with 10% FBS, and cultured for 4 or 5 days, and the supernatant was collected. Human EPO in the culture supernatant was quantified without dilution using a human EPO EL I SA kit (Quantikine IVD Human EPO Iunoassay, R & D system). The results are shown in Table 14. Table 14
  • the human ⁇ concentration in the culture supernatant was higher than the detection limit concentration of the above human EPO ELISA kit (Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R & D System).
  • mouse A 9 cell (CI 1-SC 20 cell, Tomizuka et al., Nature Genet. (USA), pp. 133-143, 1997, carrying human chromosome 14 fragment (SC 20).
  • human normal fibroblast HFL-1 obtained from RIKEN Cell Materials Development Office, registration number RCB 052 1. was used.
  • microcells were prepared from about 10 7 cells. That is,
  • Microcells were collected by suspending them in serum-free medium (D MEM), and purified by filtration using SW I NNEX-25 (Millipore) equipped with a filter (Potman) with a pore size of 8 zm, 5 rn, 3 im.
  • the purified microcell was resuspended in 2 ml of DMEM containing 50 ag / m 1 of phytohemagglutinin-P (Difco).
  • Purified micronucleated cells were added to a 25 cm 2 culture flask (palcon) in which H FL-1 cells were cultured to 90% saturation, and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes, and then PEG 1 in DMEM.
  • Dissolve 500 final concentration 45% (W / V), Roche Diagnostax) and DMS 0 (final concentration 10% (W / V), sigma), bore size 0.2 2 / zm filter (Sartorius ) was fused with the solution sterilized by filtration for 1 minute.
  • the cells were dispersed by trypsin treatment and seeded on one 48-well tissue culture plastic plate (Falcon) coated with collagen I.
  • Micronucleus cell fusion (suspension method) and isolation of drug-resistant clones Microcells were prepared and purified as described in (1-1) above, and resuspended in 6 ml of DMEM.
  • HF L-1 cells were cultured at 1 7 5 cm 2 culture flasks up to 90% saturation (Falcon), was dispersed by trypsin treatment and resuspended in DMEM7m 1 were washed twice with DMEM .
  • the transferred chromosome was confirmed by PCR amplification of the neo gene present on S C 20.
  • the sequence of the oligonucleotide primer used is shown below:
  • C 1 1-SC 20 cells cultured to a cell density of about 80-90% saturation in two 25 cm 2 centrifuge flasks (Nunk) 1 were colcemid (0.05 / 2 g / m 1, de Micronuclei were induced by culturing in a culture solution (20% FBS, 800 Mg / m 1 G 418, DMEM) containing mecorsin and Wako Pure Chemical Industries, Ltd. for 48 hours. After removing the culture medium, fill the centrifuge flask with the cytochalasin B (10 gZm 1, Sigma in DMEM) that has been kept warm (37 ° C) in advance, and place the centrifuge flask in the acrylic centrifuge container.
  • cytochalasin B 10 gZm 1, Sigma in DMEM
  • Microcells were recovered by suspending them in serum-free medium (DMEM), and purified by filtration using SWI NNEX-25 (Millipore) equipped with a filter of 8 m, 5 / im, 3 m (pore size). Purified microcells were resuspended in DMEM 2m 1 containing 50 ag / m 1 phytohemagglutinin P (Difco). Purified micronucleated cells were added to a 25 cm 2 culture flask (Falcon) in which HUC-F 2 cells were cultured to 90% saturation, and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes, and then PEG in DMEM.
  • Micronucleus cell fusion (suspension method) and isolation of drug-resistant clones Microcells were prepared and purified in the same manner as (1_1) above and resuspended in 6 ml of DMEM.
  • HUC- F 2 cells are cultured in 1 75 cm 2 culture flask (Falcon) until 90% saturation, dispersed by trypsin treatment, washed twice with DMEM and resuspended in 7 ml of DMEM did.
  • the above HUC-F 2 cell suspension is overlaid on the above microcell suspension, centrifuged, the supernatant is removed, the pellet is suspended by tapping, 0.5 ml of PEG 1 500 (final concentration 50% (WZV ) And Roche Diagnostix) were added and fused in 120 seconds.
  • PEG 1 500 final concentration 50% (WZV ) And Roche Diagnostix
  • Add DMEM 5m 1 at a rate of 1 m 1/1 min add DMEM 5m 1 and let stand at 37 ° C for 10 minutes, then centrifuge and resuspend in ⁇ medium containing 10% FBS to treat with collagen I 48-hole tissue culture Two plastic plates (Falcon) for sowing were sown.
  • the transferred chromosome was confirmed by PCR amplification of the neo gene present on S C20. That is, using the 421F primer (SEQ ID NO: 40) and 778R primer (SEQ ID NO: 41), PCR amplification was performed on the G41 8 resistant cell 7 clone obtained in (2-1) and (2 — 2) above. went.
  • the HAC vector transfer is expected to retain the neo gene. As a result, the expected amplification was confirmed in all clones. From the above experiment, it was confirmed that the obtained G41 8 resistant HUC-F 2 strain retained SC 20.
  • SC 20 transfer to normal human fibroblast HF-19 Micronucleus fusion and isolation of drug resistant clones.
  • A9 cells (CI1-SC20 cells, Tomizuka et al., Nature Genet. (USA), Vol. 16, p.133-143, 1997) were used.
  • human normal fibroblast HF-1 9 obtained from RIKEN Cell Materials Development Office, registration number RCB 021
  • Microcells were prepared from the beginning to about 1 0 7 cells. That is,
  • Microcell in serum-free medium D It was suspended in MEM) and collected, and purified by filtration using SW I NNEX-25 (Millipore) equipped with a filter size (Kutman) with a pore size of 8 um, 5 rn, 3 / im.
  • the purified microcell was resuspended in DMEM2m1 containing 50 ag / m1 of phytohemagglutinin P (Difco).
  • a chromosome donor cell As a chromosome donor cell, one copy of the human EPO gene obtained in Example 10 was inserted, the long arm distal part was deleted and 1 o XP sequence was inserted, and then the short arm distal part was removed by telomere truncation. By deleting and transiently expressing Cre recombinase, the human EPO gene is inserted by site-specific recombination between 1 o XP sequences and the human C21-derived HAC vector is retained. Among the cells, a clone (H4E C10 cell) having a high ability to form micronuclei was used.
  • microcells were prepared from about 1 0 8 H4 EC 1 0 cells. That is, H4E C 10 cells cultured on 48 25 cm 2 centrifuge flasks (NUNC) to a cell density of 60-70% saturation contain colcemid (0.lg Zm 1, demecorsin, Wako Pure Chemical Industries) Micronuclei were induced by culturing in liquid (20% FBS, 800 zg / m 1 G41 8, F 1 2) for 4 days.
  • NUNC centrifuge flasks
  • the purified microcell was resuspended in 2 ml DMEM containing 50 ng / m 1 phytohemagglutinin P (Difco).
  • Dissolve 1 500 final concentration 45% (W / V), Roche Diagnostax) and DMSO (final concentration 10% (W / V), sigma), pore size 0.22 m filter (colander) Fused with a solution sterilized by filtration with Trius for 1 minute.
  • HCAE cells After culturing in DMEM medium containing 20% FBS for 48 hours, the cells were dispersed by trypsin treatment and seeded on one 48-well tissue culture plastic plate (Falcon) coated with collagen I. Two days later, the medium was replaced with a selective medium (20% FBS, DMEM) containing G41 8 (300 gZm 1) or blasticidin (6 g / m 1). The selective culture was performed for about 3 weeks. The emerged drug-resistant colonies were isolated for further analysis. Three drug-resistant colonies were obtained from 5 micronucleated cell fusions. The above cells are called HCAE cells.
  • a chromosome donor cell 1 copy of the human EP ⁇ gene obtained in Example 12 Insert the 1 o xP sequence after removing the distal long arm, then remove the distal short arm by telomere truncation, and transiently express the Cre recombinase.
  • clones of mouse A9 cells that carry the human AC1 vector derived from human chromosome 1 and inserted with the human EPO gene by site-specific recombination between sequences clones with high micronucleation ability ( ⁇ 51 or ⁇ ) 5 cells) were used.
  • a chromosome recipient cell human normal fibroblast HFL-1 (obtained from Cell Materials Development Department, RIKEN, registration number RCB 052 1) was used.
  • Microcells were prepared from the beginning to about 1 0 7 cells. That is, 2 ⁇ 5 1 or ⁇ 5 cells were cultured in 2 25 cm 2 centrifuge flasks (Nunk) 1 to a cell density of about 80-90% saturation, and colcemid (0.1 / ig / m 1, demecorsin, sum Micronuclei were induced by culturing in a medium containing 20% FBS, 600 g / m 1 G41 8, DMEM for 72 hours.
  • cytochalasin B 10 g / m 1, Sigma in DMEM
  • DMEM serum-free medium
  • SWI NNEX-25 Microcells were recovered by suspending them in serum-free medium (DMEM), and purified by filtration using SWI NNEX-25 (Millipore) equipped with a filter (Manzmann) with a pore size of 8 im, 5 urn, 3 m.
  • the purified microcell was resuspended in DMEM 2m 1 containing 50 g / m 1 of Phytohemagglutinin P (Difco).
  • DMEM 2m 1 containing 50 g / m 1 of Phytohemagglutinin P (Difco).
  • Dissolve EG 1 500 final concentration 45% (W / V), Roche Diagnostax) and DMS ⁇ (final concentration 10% (WZ V), Sigma
  • a pore size 0.22 / 1 m filter ( Fused with a solution sterilized by filtration with Sartorius for 1 minute.
  • the sequence of the oligonucleotide primer used for PCR amplification is shown below.
  • primers were prepared based on the base sequence of the plasmid vector pS Tneo B (Kato et al., Cel 1 Str trct Funct, 12: 575-580, 1987).
  • PCR amplification was performed using 1291F primer (SEQ ID NO: 42) and 1667R primer (SEQ ID NO: 43).
  • SEQ ID NO: 42 1291F primer
  • SEQ ID NO: 43 1667R primer
  • amplification of about 0.4 kbp including a part of the neo gene is expected.
  • the expected amplification was confirmed in all 5 clones of ⁇ cells.
  • EPO gene expression is based on the enzyme-linked immunosorbent assay (EL ISA method) of human EPO protein produced in the culture supernatant. ).
  • ⁇ 51—1, ⁇ 5—1, ⁇ 5—2, ⁇ 5—3, and ⁇ E 5-4 are those in which EPOELISA kit (Quantikine IVD Human EPO I (Unounoassay, R & D system).
  • the human telomerase (hTERT) gene has a coding region of 3399 bp and contains sequences rich in G and C in the 5 'region. Difficulties were predicted. Therefore, the code area 3 (l ⁇ 800 bp; hereinafter referred to as 5'h TERT, 679 ⁇ : L 993 bp; hereinafter referred to as M—XhTRET, 195 2 ⁇ 3 3 3 9 bp; hereinafter 3
  • the base sequence position was divided into the start codon ATG (A is represented as 1), and after PCR amplification and cloning, the hT ERT gene was cloned by linking each region. . The method is shown below.
  • the sequence of the primer oligonucleotide used to construct the plasmid vector is shown below:
  • hTERT Fw6 5'- CTG CTG CGC ACG TGG GAA G-3 '(SEQ ID NO: 44)
  • hTERT Rv6 5'_ GGT CTG GCA GGT GAC ACC AC -3, (SEQ ID NO: 45)
  • hTERT Fwl 5'-GAA GAT CTT CAT CGA TCG GCC ACC ATG CCG CGC GC -3 '(sequence number 4 6)
  • hTERT Rv7 5'-TCA CTC GGT CCA CGC GTC CT -3, (SEQ ID NO: 4 7)
  • HL-6 0 cDNA (Ma rathon -R eadyc DNA, CLONT E CH) lng as a saddle, 1ITERT FW6 (SEQ ID NO: 44) and hTERT Rv6 (SEQ ID NO: 45) at a final concentration of 0. T aq (Takara Shuzo Co., Ltd.) PCR amplification was performed in a reaction mixture of 5 0 1 using 2.5 units. As the thermal cycler, Gene Amp 9600 (Applied Biosyst em s) was used.
  • PCR cycle is 10 minutes after 98 ° C, denaturation 98 ° C 30 seconds, annealing and stretching 72 minutes, 5 minutes 3 cycles, modification 98 ° C 30 seconds, annealing And elongation 70 ° C for 5 minutes was performed in 2 cycles, denaturation at 98 ° C for 30 seconds, annealing and elongation at 68 ° C for 5 minutes at 35 cycles.
  • PCR cycle is 98 ° C for 10 minutes, followed by denaturation 98 ° C for 30 seconds, annealing and extension 72 ° C for 5 minutes for 3 cycles, denaturation 98.
  • the plasmid vector pLN1-EPO is digested with XhoI (Takara Shuzo), then blunted at both ends with KOD DNA polymerase (Toyobo), and further digested with BamHI (Takara Shuzo).
  • a DNA fragment for 5'hTERT insert was cloned into the BamHI single blunt end site obtained by removing E. coli.
  • XL-10 Go 1 d S TRATAGENE
  • the base sequence of the cloned 5 'hTERT insert DNA fragment was analyzed with a DNA sequencer (PRISM3700, Applied Biosysterns) and the corresponding part of the base sequence obtained from GenBank. It was confirmed that it was the same.
  • the plasmid vector obtained from the above was designated as pLNl_5'hTERT. (1 1 2) Cloning of M—XhTERT
  • the sequence of the primer-oligonucleotide used to construct the plasmid vector is shown below:
  • hTERT Fw8-2 5'- AGT GCC AGC CGA AGT CTG CC -3 '(SEQ ID NO: 48)
  • hTERT 5' XhoIRv3 5'- GCA GCT GAA CAG TGC CTT C -3 '(SEQ ID NO: 49)
  • hTERT Fw8-1 5′-AGG ACG CGT GGA CCG AGT GA -3 ′ (SEQ ID NO: 50)
  • HL-60 cDNA (Ma ratho n e eddy cDNA, CLONT ECH) 0.25 ng in a saddle type, hTERT Fw8-2 (SEQ ID NO: 48) and hTERT 5 'XhoIRv3 (SEQ ID NO: 49) to a final concentration of 0. LA TaQ (Takara Shuzo) 2.5 Using 5 units, PCR amplification was performed in 25 1 reaction solution. The PCR cycle was performed at 98 ° C for 5 minutes, followed by 98 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 90 seconds for 40 cycles.
  • hTERT Fw8-1 (SEQ ID NO: 50) and hTERT 5 'XhoIRv3 (SEQ ID NO: 49) are each at a final concentration of 0.4 M, and LA T aq (Takara Shuzo) 2 PCR amplification was performed with 25 1 reactions using 5 units.
  • G en eAmp 9700 (Applied Biosyst ems) was used.
  • the PCR cycle is 98 ° C after 5 minutes, followed by denaturation 98. C 15 seconds, annealing 55 ° C 30 seconds, and extension 72 ° C 90 seconds were performed in 40 cycles. As a result, a DNA fragment of about 1.2 kb was obtained.
  • Plasmid vector pLN 1—EPO 2 was cloned into M 1 u I-Xho I site.
  • XL-1 O Gold (STR AT AGENE) was used as the host E. coli.
  • the base sequence of the cloned M-XhTE RT insert DNA fragment is the same as the base sequence obtained from GenBank after square analysis using a DNA sequencer (PR ISM 3700, Applied Biosysterns). It was confirmed that it was the same as the part to be.
  • the plasmid vector obtained from the above was designated as pLN l- ⁇ -XhTERT.
  • the primer oligonucleotide sequences used to construct the plasmid vector are shown below:
  • hTERT 3 XhoIFw2: 5'- ATG GAC TAC GTC GTG GGA GCC AGA -3, (SEQ ID NO: 5 3)
  • hTERT Rvl 5'- GTC GAC GCT AGC TCA GTC CAG GAT GGT CTT GAA GT -3 (sequence number 54)
  • HL-60 cDNA (Malatho n-Re a dy cDNA, C LONT ECH) 0.Lng is a saddle type, hTERT 3 'XhoIFw2 (SEQ ID NO: 53) and API (SEQ ID NO: 51) are each brought to a final concentration of 0 Then, KCR-P lus- (Toyobo) 0.5 unit was used for PCR amplification in a 25 ⁇ 1 reaction solution.
  • the thermal cycler used was a Gene Amp 9700 (Ap p lie e Bios y s t ern s).
  • PCR cycle was performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation 94 ° C for 15 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 3 minutes for 30 cycles. Furthermore, using this PCR product 11 as a saddle, hTERT 3 'XhoIFw (SEQ ID NO: 52) and hTERT Rvl (SEQ ID NO: 54) were each at a final concentration of 0.3 M, KOD—P lus — (Toyobo) 0 PCR amplification was performed in a 25/2/1 reaction using 5 units.
  • PCR cycle was carried out at 98 ° C for 5 minutes, followed by denaturation 98 ° C for 15 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 90 seconds for 40 cycles. As a result, a DNA fragment of about 1.4 kb was obtained.
  • hTERT insert D The base sequence of the NA fragment was analyzed with a DNA sequencer (PR I SM3700, Applied Biosystems), and was identical to the corresponding part of the base sequence obtained from GenBank, and pLN l— CMV promoter on EPO It was confirmed that it was inserted in the direction opposite to the transcription direction.
  • the plasmid vector obtained above was designated as pLN1-3'hTERT.
  • the plasmid vector prepared in Example 9 (1) pLN 1—CMV promoter obtained by digesting EPO2 with EcoRI, DNA fragment containing human EPO gene and SV40 poly A addition unit The plasmid vector prepared in Example 11 was cloned into the EcoRI site of pLN l-hTERT. This is pLN 1 _EPO_hTERT. (3) 2-copy human EP ⁇ and hTERT expression plasmid p containing 1 o xP sequence
  • CMV promoter human EPO gene and SV40 poly, obtained by digestion with RI
  • a DNA fragment containing 2 copies of the A addition unit was cloned into the EcoRI site of the plasmid vector pLN l-hTERT prepared in (1) above. This is called pLN l—EPO 2—hTERT.
  • the human EPO gene and the hTERT gene are inserted into the HAC vector derived from human chromosome 21.
  • the distal long arm was removed by telomere truncation
  • the 1 o XP rhinoceros was introduced proximal to the long arm
  • the distal short arm was removed by telomere truncation.
  • One HAC vector derived from human chromosome 1 was prepared.
  • Example 1 Human 21 obtained from chromosome 1 Mouse A 9 cells ( ⁇ 9 ⁇ 12 cells) carrying the HAC vector derived from chromosome 1 are mixed with a single plastic plate (Falcon) for 6-well tissue culture. However, the cells were cultured in a selective medium (10% FBS, DMEM) containing blasticidin (4 / ig / m 1) until about 60 to 70% saturation. In the presence of pLNl-EPO-hTERT vector 1 and Cre enzyme expression vector PBS 1 8 5 (Lifetech) prepared in (2) of Example 15 5, Fu gene 6 (Roche Diagnostics) Transfection was carried out according to the attached protocol. Incubate for 48 hours and then disperse with trypsin treatment.
  • a 9 ⁇ 1 cells were obtained from a selective medium (DMEM supplemented with 10% FBS) containing G41 8 (600 g / m 1) and seeded on 5 plastic wells (Falcon) for 48-well tissue culture. Resistant colonies appeared after 2 to 3 weeks, and the frequency was 4 per 9 9 12 cells 5 X 10 fi . As a result of isolation and further culture of the colony, one colony grew. The obtained cells are hereinafter referred to as A 9 ⁇ 1 cells.
  • PCR amplification was performed for (3) and Fig. 2).
  • the human EPO gene insert by site-specific recombination between 1 o XP sequences is expected to retain the PRED 65 and P RED 3 genes.
  • the expected amplification was observed.
  • PCR amplification was performed on the STS marker located at the proximal side of the short arm of human 21 chromosome (see (3) in Example 6, Fig. 12). Since the short arm distal of human 2 chromosome 1 has been deleted proximally and distally, it is predicted to retain the D 2 1 S 2 75 marker. As a result, the expected amplification was confirmed.
  • Each drug resistance index is based on whether the drug resistance gene present on the HAC vector derived from human chromosome 1, ie, the hygromycin resistance gene (short arm distal) and the plastosidine resistance gene function in the presence of the selected drug. It was confirmed whether the region containing the gene was retained.
  • Recombinant inserts are selected from the human EPO gene donor vector with the 1 ox P sequence site between the 2 o chromosome 1-derived HAC vector and the 1 o XP sequence site. Primers were designed on the sequence and on the HAC vector and confirmed by PCR amplification.
  • PCR amplification was performed using the Neo Rp2 primer (SEQ ID NO: 3 8) shown in Example 9 (4) and the M13RV primer (SEQ ID NO: 3 9) derived from the plasmid vector pBS226. went.
  • the region containing the CMV promoter derived from the pLN l-EPO vector, the human EP ⁇ gene, and the SV40 poly A additional sequence up to 1 o XP sequence and 1 o XP sequence derived from pSF1
  • An amplification of about 2.3 kbp including a portion of the ne 0 gene is expected. As a result, the expected amplification was confirmed.
  • the A9 ⁇ 1 cells described above retain the HAC vector derived from human chromosome 21 into which the insert DNA containing the CMV promoter, human EPO gene, and SV40 poly A addition sequence has been inserted.
  • ⁇ 9 ⁇ 1 cells hold the HAC vector derived from human chromosome 1 with the long and short arms deleted.
  • a DT40 cell harboring a HAC vector based on human chromosome 21 obtained in Example 6 as a chromosome donor cell, with the long arm distal part deleted and the 1 o xP sequence inserted, and the short arm distal part removed. (# 21) hyg 4) was used.
  • a chromosome recipient cell a Chinese hamster-derived cell line CHO—K 1 (obtained from ATCC, registration number J CRB 90 1 8) was used. Acquisition of microcells and fusion with CHO cells were performed in the same manner as in Example 3 (1). As a result of the fusion performed a total of 4 times, a total of 5 hygromycin-resistant CHO strains were obtained approximately 2 weeks after the start of selective culture.
  • the sequence sandwiching the recombination target site was amplified by PCR (see (3-3) in Example 6, Fig. 12). Amplification products were obtained only in the two strains CHO # 2 1 hyg4 and 8, and the generation of the expected partial fragment was confirmed by digestion with the restriction enzyme NsiI.
  • FI SH analysis is described in Matsubara et al. (FI SH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994). According to the method described above, human-specific probe Cot 1 (Gibco BR L) was used. Analysis of two of the CHO strains resistant to hygromycin (CHO # 21 hy g 4 and CH ⁇ # 21 hy g 8) revealed that human chromosome 21 was shortened in most of the observed mitotic figures. was detected. Based on the relative size of the host CHO cell chromosome, it was confirmed that the shortened chromosome 21 was transferred to the CHO cell.
  • the obtained hygromycin-resistant CHO strain had human long chromosome 1 deleted, the 1 o xP sequence inserted, and the short arm distal deleted. It was confirmed to retain a partial fragment (HAC vector).
  • a chromosome donor cell retain the HAC vector based on human chromosome 21 obtained in Example 17 and with the distal long arm deleted, the 1 o xP sequence inserted, and the distal short arm removed.
  • CHO cells (CHO (# 2 1) hyg 4 and CHO (# 21) hyg 8) were used.
  • the human fibrosarcoma cell line HT 1080 (obtained from ATCC, registration number CCL-1 2 1) was used as the chromosome recipient cell. Acquisition of microcells and fusion with HT10 80 cells were performed as in Example 4 (1).
  • the transferred chromosomes were confirmed by PCR amplification of the brass ⁇ cydin resistance gene (see Example 4 (2-1)) and the hygromycin resistance gene.
  • Used oligonucleotide The sequence of the isolated primer is as follows:
  • HygroF 5'-GCGAAGAATCTCGTGCTTTC (SEQ ID NO: 5 5)
  • Hygro 5'- ATAGGTCAGGCTCTCGCTGA (SEQ ID NO: 56)
  • the blasticidin-resistant gene was confirmed to be amplified in all of the blasticidin-resistant HT10 80 strains. On the other hand, amplification of hygromycin resistance gene was confirmed in 5 out of 7 strains derived from CHO (# 2 1) hy g 4 and 2 out of 30 strains derived from CHO (# 2 1) hy g 8.
  • 5.0 X 10 5 cells were seeded in 10 cm dishes, and after 3 days, the cells were counted and 5.0 X 10 again. Five cells were seeded on a 10 cm diameter dish.
  • the chick cell line cells were collected at population doubling numbers 25, 50 and 100, respectively, and chromosome samples were prepared.
  • the partial fragment of human chromosome 21 was stably maintained in HT 1080 cells at the number of divisions of 100. In addition, observation of metaphase chromosomes revealed one or two partial chromosomes per cell. Based on the experiments in (3) and (4) above, the partial fragment of human chromosome 21 from which the long arm distal part was deleted and the partial fragment from which the short arm distal part was further deleted were not selected in the HT 1080 cell line It was revealed that the cells were stably maintained under the culture conditions and the copy number per cell was maintained.
  • Example 1 Human HT 1 080 cell line carrying the HAC vector derived from human chromosome 1 prepared in Example 8 (HT 1080 (# 2 1) bsd 79— 1-6, 14, HT 1 080 (# 2 1) bsd — H4— 1, 6, HT 1080 (# 2 1) bsd— H8 — 2) was trypsinized, seeded with 4 ⁇ 10 5 cells per well of a 6-well cluster (Nunk) and cultured for 1 day.
  • a sequence containing the target site of recombination was amplified by PCR.
  • the sequences of primer oligonucleotides set on pB S226 and pSF1 plasmids are shown below.
  • CMVneo689 5'- GCCATCCACGCTGTTTTGAC (SEQ ID NO: 57)
  • CMVneo910 5'- GCATCAGAGCAGCCGATTGT (SEQ ID NO: 58)
  • any 7 strains were selected from the G41 8 resistant HT 1 0 80 cell lines, and subcultured under the conditions without addition of a selective drug.
  • expression of the GFP gene was confirmed in all clones.
  • the gene inserted into the HAC vector derived from human chromosome 21 can be stably expressed without being attenuated by the position effect of the insertion site, that is, the HAC vector. It was confirmed that the upper gene insertion site is not a heterochromatin region.
  • Example 5 As a chromosome donor cell, the long arm distally obtained in Example 5 was deleted, and 1 oxP sequence was introduced. 2 Chromosome derived from Chromosome Chromosome 1 (# 2 1) A qGFP 7—2) and human AC from which the long arm distant obtained in Example 17 was deleted, the 1 o XP sequence was introduced, and the short arm distal was deleted CHO cells carrying the vector (CHO (# 2 1) Hy g 8) were used. Mouse ES cell line ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 14 (Hooper et al., Nature, 326: 292, 1987) was used as a recipient cell.
  • the culture method of E14 is the primary culture of mouse embryos treated with mitomycin C as vegetative cells in accordance with the method described in (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Jinen-getting, Yodosha, 1 9 9 5). Cells (Invitrogen) were used. First about 1 0 8 microcells from the donor cell was prepared in the total volume 5 m 1 DMEM It was suspended in. About 10 7 E 14 were washed 3 times with DMEM, suspended in 5 ml of DMEM, combined with the microcell, and centrifuged at 1250 rpm for 10 minutes to remove the supernatant.
  • CHO (# 2 1) When CHO (# 2 1) ⁇ q GF P 7-2 is used as donor cell after 24 hours 3 00 gZml of G41 8 (GENETICIN, Sigma), CHO (# 2 1) Hy g 8 as donor cell 1 50 g / m 1 of hygromycin-B (Wako Pure Chemical Industries) was added, and the medium was changed every day. After 1 week to 1 0 days resistant colonies appeared, but the frequency was 2-5 1 0 7 per E 14 cells. Its colonies were isolated growth Nigoshi suspended in storage medium 5 X 1 0 7 per lm l (for ES cell medium + 1 0% DMS O (Sigma)) and stored frozen at one 8 0 ° C . At the same time to prepare about 1 0 6 cells or et genomic DNA for each resistant strain (Puregene DNA Isolation Kit (G entra S ystem Co.)).
  • the transferred chromosome and the retention region were confirmed by PCR amplification.
  • the following primer oligonucleotides were newly set:
  • FIG. 20a and b Human chromosome fragments were observed in 1 out of 5 strains (E 14 (# 2 1) neo 1) of the G4 18 resistant strain derived from CHO (# 2 1) ⁇ q GFP 7-2. Human chromosome fragments were observed in both strains resistant to hygromycin derived from CHO (# 2 1) Hy g 8.
  • mice ES cell lines E 14 (# 2 1) neol, E 14 (# 2 1) Hy gl, and E 14 (# 2 1) Hy g 2 prepared in (3) above were used.
  • Non-selective media for mouse ES cells are 18.2% FBS (Invitrogen), 3.5 g / 1 glucose (Sigma), 0.1 2 5 mM M EM non-essential amino acid (Invitrogen), l OO OUZm l LIF (ESG R0, Wako Pure Chemical Industries), 0. ImM 2 -DMEM with mercaptoethanol (Sigma).
  • the mouse ES cell line was seeded with 1 ⁇ 10 7 cells on vegetative cells in a 10 cm dish, and 2 days later, 1Z15 was seeded on vegetative cells in a 10 cm dish. Cells were collected 14, 28, and 42 days after the start of the culture, and chromosomal specimens were prepared.
  • HAC vector derived from chick chromosome 21 in mouse ES cells was carried out according to the method described in Matsubara et al. (FI SH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994). Human-specific probe Cot 1 (Gibco BRL) The FI SH analysis method was used. Retention rate was calculated by observing the presence or absence of human chromosome fragments in 20 metaphase images. The results are shown in Table 19. Long-term subculture was performed in triplicate for each strain, and the average retention was shown. Table 19
  • Partial fragments of the long segment of human 21 deleted from human chromosome 1 showed a tendency to decrease with long-term subculture under non-selective conditions.
  • the partial fragment in which both the long arm and the short arm were deleted from human chromosome 21 was stably retained without decreasing even when the number of divisions exceeded 75.
  • the number of copies of the chromosome fragment per cell at the start of the long-term subculture was 1, and no increase in the copy number was observed.
  • the number of copies of chromosome fragments per cell 2 was dominant at the start of long-term subculture, the number of copies slightly decreased.
  • Chromosome recipient cells include human bone marrow-derived mesenchymal stem cell line hi MS C established by human hTERT gene and human papillovirus E 6ZE 7 gene (obtained from Professor Shinya Toguchida, Kyoto University, Okamoto et al., Biochem. Biophys. Res. Comfflun., 295: 354, 2002).
  • the hi MS C strain was cultured using DMEM medium supplemented with 10% FBS.
  • microcells were prepared from about 10 7 CH 0 (# 2 1) hyg 4/8 cells. That is, CHO (# 2 1) hyg 4/8 cells cultured in 6 25 cm 2 centrifuge flasks (coasters) to a cell density of about 60 to 70% saturation were treated with colcemid (0.0.75). / 2 g / m 1, demecorsin, Wako Pure Chemical) (10% FBS, 8 g / m 1 blasticidin, F 12) was cultured for 48 hours to induce micronuclei.
  • cytochalasin B (10 / igZm 1, Sigma in DMEM) that has been kept warm (37 ° C) in a centrifuge flask, and place it in an acrylic centrifuge container. was inserted and centrifuged at 34 ° C., 8, 0 00 rpm, for 1 hour.
  • Microcells were collected by suspending them in serum-free medium (DMEM), and purified by filtration through a filter. Purified micronucleated cells were added to hi MS C cells cultured in a 6 cm dish to 80% saturation, and fused with PEG solution.
  • the transferred chromosome was confirmed by PCR amplification of the blasticidin resistance gene (see Example 4 (2-1)) and the hygromycin resistance gene (see Example 18 (2-1)). Both plastosidine resistance gene and hygromycin resistance gene were tested. Amplification was confirmed in all 5 blastcidin-resistant HT10 80 strains searched.
  • the rabbit cell line As for the rabbit cell line, 5.0 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 10 cm dish, and after 3 days, the cells were counted and again seeded with 5.0 ⁇ 10 5 cells in a 10 cm dish.
  • human cell lines cells were collected at population doubling numbers of 15, 40, and 90 from the beginning of culture, and chromosome samples were prepared.
  • Human 2 Chromosome fragment 1 was stably maintained in hi MS C cells at 90 divisions.
  • observation of the metaphase chromosome image revealed one copy of a partial chromosome fragment per cell.
  • the human 21st chromosome-derived HAC vector is stably maintained in the non-selective culture conditions in the hi MS C cell line, and the number of copies per cell is maintained. It became clear that.
  • Example 21 Human mesenchymal stem cells transfected with the human 21-derived HAC vector prepared in Example 1 were induced to differentiate according to the method of Okamoto et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 354, 2002) The ability to differentiate into bone, cartilage and adipocytes was examined.
  • Example 2 The human mesenchymal stem cell line (hi MS C (# 2 1) bsd -H 8-1) and its parent line (hi MS C) were used.
  • Induction culture is 10% FBS in DMEM 1 zM dexamethasone (Sigma), 0.2 mM Indomethacin (Sigma), 10/1 g / m1 Insulin (Sigma), 0.5 mM -3 days in induction medium supplemented with methylxanthine (Sigma). Maintenance culture was performed for 2 days in a maintenance medium in which 10 g / m 1 insulin (Roche) was added to DMEM containing 10% FBS. (4) Tissue staining
  • Human 2 Mesenchymal stem cell line hi MS C (# 21) bsd— H8—1 transfected with HAC vector derived from chromosome 1 is induced to differentiate into bone, cartilage, and adipocytes, similar to the parent strain hi MS C. Positive for specific tissue staining. From the results of the above experiments (1) to (4), mesenchymal stem cells transfected with the human 21-chromosome-derived HAC vector maintain pluripotency into bone, cartilage, and adipocytes. It was confirmed.
  • a mouse A 9 cell line (hereinafter referred to as A9 / SC 20, which carries human chromosome 14 fragment SC 20 (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000). ) was used.
  • A9 / SC 20 which carries human chromosome 14 fragment SC 20 (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000).
  • CMK6.4 the force quizal ES cell line CMK6.4 (Suemori et al., Dev. Dyn. 222, 273-279, 2001) was used.
  • CMK6.4 culture was performed according to the method described by Suemori et al. (Supra).
  • the composition of the medium is DMEM / F 12 (SI GMA D-6421), 20% KSR (Knock out serum replacement, GI BCO BRL), non-essential amino acid solution (x 100, SI GMA M 7 145), And an L-glutamine solution (X 100, SIG MA M 7522).
  • ⁇ 5 x 10 6 C MK 6.4 cells were dispersed in ⁇ Lippsin solution (0.25% trypsin, 20% KSR), washed twice with DME M and suspended in 5 ml DMEM Then, together with the microcell, the supernatant was removed by centrifugation at 1500 rpm for 7 minutes.
  • the 1: 1.4 PEG solution used for fusion was prepared by dissolving lg PEG (SI GMA) in 1.2 ml DMEM and adding 0.2 ml DMSO (SI GMA). The precipitate was loosened by tapping and preincubated at 37 ° C. 1: 1.
  • the picked-up drug-resistant ES cell colonies were seeded on 4 well plates previously seeded with G418-resistant vegetative cells, and further cultured in the presence of 50 X g / m 1 of G418 for 10 days. As a result, surviving ES cell colonies were picked up again, seeded on 4 well plates previously seeded with vegetative cells, and cultured for 10 days under non-selective conditions.
  • the proliferated ES cells were positive for alkaline phosphatase staining (Suemori et al., Supra), indicating that they remained undifferentiated. Furthermore, confirmation of introduced chromosome retention using genomic DNA extracted according to a standard method was performed as follows.
  • Neo gene pSTneoB, Tomizuk et al., Nature Genet. 16, 133-143, 1997) contained in the human chromosome 14 fragment was detected by the PCR method using the drug-resistant strain genomic DNA as a saddle type.
  • the base sequence of the primer-oligonucleotide used is shown below.
  • the reaction conditions were about 0.1 g of genomic DNA in a saddle shape, Ta Q polymerase using evening color ExTaQ, a reaction at 94 ° C for 5 minutes, and then 94 ° C 1 5 seconds, 59 ° C 1 5 seconds and 72 ° C 20 seconds 3 to 5 cycles It was.
  • neoF TGAATGAACTGCAGGACGAG (SEQ ID NO: 61)
  • neoR ATACTTTCTCGGCAGGAGCA (SEQ ID NO: 62)
  • pST neo B amplification that indicates the presence of the Neo gene
  • pST neo B a result of PCR analysis of one G41 8 resistant monkey ES cell clone obtained A product was detected.
  • Mouse ES cells produced in Example 20 and carrying the human chromosome 21 HAC vector into which the GFP gene was inserted were induced to undergo neuronal differentiation and examined for the ability to differentiate into neurons.
  • the mouse ES cell line E 14 (# 2 1) ne o 1 described in Example 20 was used as the mouse ES cell.
  • E 14 (# 21) neo 1 cells were seeded on mitomycin C-treated primary mouse embryo cells (Invitrogen) in a 100 mm diameter plastic dish for tissue culture, and DMEM containing 20% FBS ( Invitrogen) 2 mM L monoglutamate (impitrogen), 0, 2 mM 2-mercaptoethanol (Sigma), ImM sodium pyruvate (Invitrogen), 0. ImM MEM non-essential amino acids, 1000 U / ml LIF (Wako Pure) The cells were cultured in a medium supplemented with a drug.
  • Mouse bone marrow-derived PA 6 cells which are vegetative cells for inducing differentiation, were cultured in a medium in which 2 mM L-glutamic acid (Invitrogen) was added to ⁇ (impitrogen) containing 10% FBS.
  • the 1 ⁇ 10 3 GFP-expressing ES cells sorted in (1) above were suspended in a differentiation-inducing medium containing no serum and LIF and seeded on PA6 cells in a slide chamber (Nunk).
  • the medium for differentiation induction is 10% knockout serum replacement (Invitrogen) 'G-MEM (Invitrogen) in 2mM L-Glutamic acid (Invitrogen), 0,2mM 2-Mercaptoethanol (Sigma), 1 mM Sodium pyruvate (Invitrogen), 0. ImM MEM non-essential amino acid added.
  • the cells were cultured for 10 days, fixed with 4% paraformaldehyde, and expressed specifically in neurons. 3) Immunostained with an antibody against tubulin (TUJ 1, Berkeley Ant Body Company) and observed under a confocal fluorescence microscope. The expression of GFP was confirmed in cells that extended the protrusions and displayed neuronal morphology and stained with anti-] 3 tubulin antibody.
  • a human artificial chromosome (HAC) vector is provided.
  • This HAC vector is stably maintained in the cell because its overall size is reduced and unnecessary genes are deleted.
  • this HAC vector is constructed based on the human chromosome, it is possible to insert a large foreign DNA.
  • foreign DNA can be easily introduced in a cassette format, and the introduction position can be set appropriately. The position effect is not received from.
  • a large foreign DNA can be introduced into cells and expressed.
  • this HAC vector can be used for production of the protein by high expression of the gene encoding the desired protein, analysis of in vivo function of a gene or protein of unknown function, and cloning of large size DNA. It is useful in fields related to genetic engineering. Sequence listing free text
  • SEQ ID NOs: 1 to 62 synthetic oligonucleotide

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Abstract

本発明は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター及びその作製方法に関する。また本発明は、ヒト人工染色体ベクターを用いた外来ＤＮＡの導入方法及び外来ＤＮＡ発現細胞の作製方法に関する。さらに本発明は、タンパク質の製造方法に関する。

Description

明 細 書 ヒト人工染色体 （HAC) ベクター 技術分野
本発明は、 ヒト人工染色体 （HAC) ベクター及びその作製方法に関する。 ま た本発明は、 ヒト人工染色体べクタ一を用いた外来 DNAの導入方法及び外来 D N A発現細胞の作製方法に関する。 さらに本発明は、 タンパク質の製造方法に関 する。 背景技術
哺乳動物細胞に外来遺伝子を導入発現させるためのベクターは、 基礎生命科学 研究において必須のツールであるばかりでなく、 その成果の産業 (例：医薬品の 大量生産） や医療 （例：遺伝子治療） における実用化の際に重要な役割を果たし てきた。 1970年代後半以降の遺伝子工学技術の進展は、 大腸菌や酵母におけ る特定の遺伝子 DNA断片の単離と増幅 （遺伝子クロ一ニング） を容易にした。 従来、 哺乳動物細胞への遺伝子導入には、 クローン化 DNAが用いられてきた。 実際には、 発現させたい遺伝子 （cDNA) のコード領域に哺乳動物細胞で機能 し得るプロモーターやポリ A付加部位などを連結した人工的な発現ユニットを作 製するか、 あるいはコード領域に加えて、 本来のプロモーターやボリ A付加部位 等を含むゲノム DNA断片などを含む、大腸菌のプラスミド（最長 20 k b程度： 環状） 、 コスミド （最長 40 kb程度：環状） 、 細菌人工染色体 （BAC ;最長 200 kb ：環状） 、 酵母人工染色体 （YAC ；最長 1Mb ：直鎖状） を環状で 又は線状化して作製し、 それらを細胞にトランスフエクシヨン又はィンジェクシ ヨンすることが汎用されている。 導入されたべクタ一 DNAが哺乳動物由来の複 製起点を含まない場合、 ベクターは細胞に導入された後複製することができず、 細胞の分裂に伴って失われていくため、導入遺伝子の発現は一過性となる。一方、 複製起点を含む場合は細胞内で一時的に多コピー化するが、 細胞分裂に伴う娘細 胞への分配が均等になされないため、選択圧がない場合には次第に失われていく。 よってこの場合も発現は一過性となる。 薬剤耐性遺伝子を同時に導入し、 薬剤に よる選択圧をかけることによって導入遺伝子を構成的に発現する細胞株を選別す ることは可能だが、 その場合、 導入された遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込ま れる （インテグレーション） 。 この組み込みは、 導入遺伝子及び宿主染色体の両 方に影響を与える。 宿主染色体にとっては、 遺伝子が破壊される可能性がある (Pravtchevaら， Genomics (USA) ， 第 30巻， .529-544, 1995年） 。 導入され る遺伝子にとっては、 コピー数が制御されない、 不活性化される （Garrick ら， Nature Genet. (USA) , 第 18巻， p.56- 59， 1998年） 、 組み込まれた宿主染色体 上の制御配列の影響を受ける (Dobieら， P. N. A. S. (USA)，第 93巻， p.6659-6664, 1996年； Alami ら， Hum. Mol. Genet. (UK) ， 第 9巻， p.63卜 636, 2000年） 、 などの問題点が残る。 このため宿主染色体を破壊することなく、 一定コピー数の 遺伝子が導入可能な方法の開発が望まれる。 このような問題点を解決するための 一つの方法は、 ヒ卜を含む動物細胞を宿主として自律複製/分配が可能な人工染 色体を構築し、 これをベクターとして動物細胞に遺伝子を導入することである。
(1) ヒト人工染色体 （HAC) の構築
従来、 外来遺伝子を発現させるためのベクターを構築するという目標と、 一方 で細胞内での自律複製分配に必要な構造を特定するという生物学的側面から、 動. 物細胞を宿主としたヒト人工染色体 （Human Artificial Chromosome；以下、 「H AC」 ともいう） の構築が試みられてきた。 HAC構築のアプローチには （A) ボトムアップアプローチ、 （B) 自然発生染色体断片の利用、 及び （C) トップ ダウンアプローチ (天然の染色体をトリミング) の 3種がある。
(A) ボトムアップアプローチ
大腸菌や酵母では自律複製/分配に必要な DN A配列が特定されており、 宿主 細胞内で一定のコピー数が維持される人工染色体が構築されている （B ACない し YAC) 。 同様の発想から、 クローン化された配列既知の DNA断片を動物細 胞に導入してアセンブルするという、 ボトムアップアプローチによる H AC構築 が試みられてきた。 ヒ卜染色体セントロメァの構成要素であるアルフォイド配列 約 100 k bを含む YAC由来の薬剤耐性遺伝子とヒトのテロメァ配列を付加し、 ヒト線維肉腫細胞株 HT 1 080に導入した例が報告されている （Ikenno ら， Nature Biotech. (USA) , 第 16巻， .431-439, 1998年) 。 薬剤耐性細胞株では 自律複製/分配が可能な人工染色体が構築されていたが、 導入した DN A配列そ のものが細胞に保持されているのではなく増幅による再構成が生じており、 細胞 に保持される配列構造は明らかでない。
また H ACを構築することが目的であって、 外来遺伝子の挿入を検討するには 至っていない。
(B) 自然発生断片の利用
染色体はそれ自身が遺伝子の集合体であり、 自律複製 ·分配に必要な要素を備 えている。 Y ACなど既存のクローニングベクターの容量を超える Mb単位の巨 大遺伝子を導入する目的で、 一本の染色体又はその断片を遺伝子導入のツールと して利用することは、 微小核細胞融合法により実現されている。 マウス胚幹細胞 に抗体遺伝子を含むヒト 14番、 2番、 22番染色体断片を移入し、 キメラ個体 が作製できること、 移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現すること、 ヒト染 色体断片がキヌラ個体で安定に保持されること、 生殖系列を経て次世代伝達可能 なことが示された （Tomizuka ら， Nature Genet. (USA) ， 第 16巻， p.133 - 143, 1997年； Tomizukaら， P. N. A. S. (USA) , 第 97巻， p.722 - 727， 2000年） 。 この 例では、 発現させたい遺伝子がのつている染色体そのものをべクタ一として利用 することの有効性が示された。 しかし目的とする遺伝子毎に染色体改変を行うこ とは現実的でない。 染色体断片のベクターとしての利点を生かしなおかつその汎 用性を高めるには、 基本骨格となる染色体ベクターを用意し、 これに目的とする 遺伝子を簡便に挿入できることが望ましい。
このような目標のもと、 染色体自然断片を利用して外来遺伝子を発現させる試 みが報告されている。 ヒト 1番染色体由来の放射線染色体断片 （5. 5Mb) を ベクターとし、 I L一 2遺伝子 （c DNA) 又は CFTR遺伝子 （ヒトゲノム D NA)の導入と機能発現が報告されている（Guiducci ら、 Hum. Mol. Genet. (UK) , 第 8巻， ρ· 1417-1424, 1999年； Auriclieら、 EMBO Rep. (UK)，第 2巻， p.102-107, 2002年参照。 宿主はハムスター線維芽細胞 （CHO) を用いている。 この断片化 されたミニ染色体への目的遺伝子の導入には、 アルフォイド DNAを併用してヒ 卜 1番染色体セン卜ロメァ領域への挿入を期待しているが、 詳細な挿入位置及び コピー数は特定されていない。 I L一 2依存性のマウスリンパ芽球細胞は I L— 2ミニ染色体を保持する CHO細胞との細胞融合により I L一 2非依存的に増殖 可能となり、 機能相補が認められた。 また、 CFTRミニ染色体を保持する CH O細胞では、 c AMP刺激による塩素イオン放出が認められ、 CFTR阻害剤の 添加によりその塩素イオン放出が抑制された。 これらは染色体断片をベクターと して外来遺伝子を挿入 ·発現するための系を示したが、 構造が明らかでなく、 外 来 D N Aの揷入が制御されていないという問題が残つている。
放射線雑種細胞由来の染色体断片'（2〜 3 Mb) はハムスター細胞において安 定に保持され、 ヒ ト 1番染色体セントロメァと長腕の一部及び S DH C (succinate dehydrogenase complex, subunit 0 遺伝子を含む。 SDHC領域 での相同組換えにより G418耐性遺伝子が挿入された。 マウス細胞 （L及び 3 T 3 ) を用いて X線細胞融合を行い、 G 4 1 8耐性雑種細胞を得た （All ら， Cytogenet. Cell Genet. (スイス） ， 第 86巻， p.194- 203, 1999年） 。 この HA Cは、 染色体自然断片を利用しているためその構造は明らかでない。 外来遺伝子 を部位特異的に H ACに導入するために相同組換えを用いたが、 導入効率が低く 汎用性は低い。 微小核細胞融合法は用いていないので、 目的の染色体断片以外に も宿主染色体が共存する。 染色体をべクタ一として外来遺伝子を発現するという 発想を提示するにすぎない。
また、 染色体自然断片 （環状） に 1 o xPサイトをランダム挿入し、 薬剤耐性 遺伝子（hp r t) の再構成を指標に外来遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子） を挿入した例が報告されている（Voet ら， Genome Res. (USA),第 11巻， p.124-136, 2001年） 。 この環状染色体はヒト 20番染色体のセントロメァと 1番染色体の一 部 （p 22領域） を含むが、 自然断片のため、 配列は特定されていない。 外来遺 伝子を C r e/ 1 o x Pシステムによる部位特異的組換えにより導入しているが、 染色体上への 1 o X P挿入はランダムであり、 その構成は不明である。 一方で微 小核融合によるマウス E S細胞への移入、 キメラ個体の作製、 子孫伝達が示され ている。 染色体自然断片を利用した点、 及び 1 o x Pサイトの挿入位置がランダ ムであるという点を除いて、 人工染色体に目的遺伝子を挿入する手法は簡便では あるが、 患者 （軽度の精神発達遅滞） 由来の異常染色体を利用したことは安全性 の点で問題が残り、 実用的とはいえない。
( C ) トップダウンアプローチ
染色体自然断片を細胞に移入する場合、 目的の遺伝子以外にも移入した染色体 断片からその他多くの遺伝子が同時に発現することになる。 マウス E S細胞の実 験では、 ヒト染色体ごとに安定性が異なること、 導入した染色体断片が大きいほ どこれを保持する細胞のキメラ個体中での寄与率が下がることが知られている。 余分な遺伝子の発現は染色体断片を保持する宿主細胞の増殖を妨げると推測され る。 そこで染色体改変によって余分な遺伝子を取り除くことで、 移入染色体断片 の保持率が上がると考えられる。
染色体の一部を削除する方法として、 クローン化したテロメァ配列を相同組換 えにより導入し、 染色体を短縮する技術 (テロメアトランケ一シヨン） が報告さ れている （I tzhaki ら， Nature Gene t. (USA) ， 第 2巻， p. 283- 287， 1992年） 。 しかし多くの動物種の体細胞は相同組換えの頻度が極端に低いため、 組換え体の 取得には多大な労力を要する。 これに対し高頻度に相同組換えを起こすニヮトリ 細胞株 D T 4 0を染色体改変の宿主として利用することで、 効率的な染色体改変 が可能になった (Kuroiwa ら， uc le ic Ac ids Res. (UK) , 第 26卷, p. 3447-8, 1998 年） 。 ヒト X染色体を微小核細胞融合法によって D T 4 0細胞株に移入し、 テロメアトランケーシヨンを行った例が報告されている （Mi l l s ら， Hum. Mol. Genet. (UK) ， 第 8巻， p. 751-761， 1999年） 。 短腕及び長腕の削除により 2 . 4 M bの線状ミニ染色体が構築された。 ミニ染色体はハムス夕一、 ヒト細胞でも 安定に保持されたが、 コピー数の変化が見られた。 H A Cの安定性を確認してい るにすぎず、 これに外来の遺伝子を導入してベクターとして利用するには至って いない。
またハムスター細胞を宿主としてヒト Y染色体をテロメアトランケーシヨンに より短縮し、 宿主細胞中で安定に保持される約 4 Mbのミニ染色体を構築した例 も報告されている (Heller ら， P. N. A. S. (USA) , 第 93卷， p.7125-7130, 1996 年） 。 このミニ染色体を微小核細胞融合法によりマウス E S細胞に移入したが、 不安定であった。 染色体再構成によってマウスセントロメァ配列を取り込んだ派 生ミニ染色体が E S細胞中で安定性を獲得したため （Shenら， Hum. Mol. Genet. (UK) ， 第 6巻， p.1375 - 1382， 1997年） 、 キメラマウスを作製したところ、 生 殖系列伝達が確認された （Shenら， Curr. Biol. (UK) ， 第 10巻， p.31- 34, 2000 年） 。 キメラ染色体がマウス個体で保持されることは示されたが、 その構造は染 色体再構成のため不明であり、 さらに外来遺伝子の導入及び発現については検討 されていない。
(2) HACへの外来遺伝子の挿入
上述したようなベクターとしての H AC構築と並んで重要なことは、 HACに 目的の遺伝子を導入する方法の確立である。 しかし前述の如く現時点では H AC 構築自体が途上の段階であり、 外来遺伝子の導入については薬剤耐性遺伝子のラ ンダム挿入が示されている程度で、詳細な検討はなされていないのが現状である。 ヒト抗体重鎖遺伝子を保持するマウスを作製する目的で単離されたヒト 1 4番 染色体由来の自然断片 S C 2 0は、 マウスでの安定性と生殖系列伝達が確認され ている。 これに C r e/ 1 o X Pシステムを利用し、 相互転座によって Mb単位 の染色体領域 （抗体軽鎖遺伝子を含むヒト 2番及び 22番染色体領域） をクロー ニングする方法（染色体クローニング）が確立された（Kuroiwaら， Nature Biotech.
(USA) , 第 18巻， p.1086- 1090, 2000年） 。 この場合も、 不要な遺伝子を含ま ず構造が明らかな H AC構築が目標だが、 抗体遺伝子のように他のクロ一ニング ベクター（Y ACなど）の容量を超えた巨大遺伝子への適用で効果が発揮される。 いずれにしても、 1) 構造が明らかであり、 不要な遺伝子が除去されている、 2) 培養細胞、 個体で安定に維持される、 3) 外来 DNAを簡便に導入可能、 と いう条件を満たす H ACベクター系は現在までに構築されていない。 発明の開示
本発明は、 細胞中で安定に保持され、 大きなサイズの外来遺伝子を簡便に挿入 し、 細胞に導入することができるヒト人工染色体べクタ一及びその作製方法を提 供することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するために、 1) 動物細胞を宿主として、 余分な遺 伝子を含まず安定に保持される染色体べクタ一を構築すること、 2) 染色体べク 夕一にクローニングサイトを付与し、 目的の遺伝子をクローニングサイ卜にカセ ット方式で挿入して発現させる系を構築することを課題として鋭意研究を行った。 すなわち、ヒト 21番染色体の長腕から既知の遺伝子を削除した改変染色体を得、 この改変染色体を保持する DT 40雑種細胞の長期継代培養における安定性を確 認した後、 この改変染色体上の長腕近位に 1 o xP配列と hCMVプロモーター を部位特異的に挿入し、 C r eZ 1 o xPシステムにより GFP遺伝子を改変染 色体に導入したところ、 GFPの発現を確認することができた。 その結果より、 本発明者は、 ヒト 21番染色体断片に基づいて構築した H ACベクタ一により上 記課題を達成することができることを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明の概要は以下の通りである。
本発明は、 その第 1の態様において、 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除され たヒト 21番染色体断片又はヒト 14番染色体断片を含むことを特徴とするヒト 人工染色体べクタ一を提供する。
本発明の一実施形態において、 前記ヒト 2 1番染色体断片のサイズは、 約 2〜 1 6Mbであり、 好ましくは約 2〜6Mbである。
また本発明の一実施形態において、 前記ヒト 21番染色体の長腕遠位は、 例え ば 21 Q 1 1領域内で削除され、 好ましくは AL 1 6 3204において削除され る。
さらに本発明の一実施形態において、 前記ヒト 21番染色体の短腕遠位は、 例 えば 2 1 p領域内で削除され、好ましくは A L 163201において削除される。 本発明の別の実施形態において、 前記ヒト 14番染色体断片のサイズは、 約 2
0 Mbであり、 好ましくは約 1 9 Mb以下であり、 さらに好ましくは 1 8 Mb以 下である。
また本発明の別の実施形態において、 前記ヒト 14番染色体の長腕遠位は、 例 えば 14 Q領域内において削除され、 好ましくは AL 1 5 7 8 5 8において削除 され、 さらに好ましくは AL 5 1 2 3 1 0において削除される。
また、 前記ヒト 14番染色体の短腕遠位は、 例えば 1 4 p領域内において削除 され、 好ましくは 14 p 1 2領域内において削除され、 さらに好ましくは OR 4 H 1 2、 OR 4 Q 4, RNR 2、 OR4L l、 RNU6 C、 FDP S L 3、 K 1 2 T、 C 14 o r f 5 7、 OR 6 S l、 M 1 9 5、 OR 4 1 4, MGC 2 7 1 6 5、 LCH、 OR 1 0 G 3、 OR4K3、 OR 4 E 2 , H 1 RNA、 AT P 5 C 2、 OR l l H6、 及び O R 4 M 1からなる群より選択されるいずれか 1の位 置において削除される。
さらなる実施形態において、 本発明に係るヒト人工染色体ベクターは、 前記ヒ ト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異 的組換え酵素の認識部位が挿入されている。 好ましい実施形態においては、 部位 特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒト 2 1番染色体の長腕近位の A L 1 6 3 20 3、 又はヒト 14番染色体の長腕近位の AL 1 5 7 8 5 8より近位に、 さらに好 ましくは AL 5 1 2 3 1 0における前記削除位置より近位に、 又はヒト 14番染 色体の短腕近位の 14 p 1 2領域内における前記削除位置より近位に挿入されて いる。 また好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素で あり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が L o x P配列である。
本発明の別の実施形態においては、 前記長腕遠位及び Z又は短腕遠位の削除が 人工テロメァ配列との置換によるものである。 また本発明は、 その第 2の態様において、 以下のステップを含むヒト人工染色 体ベクターの作製方法を提供する ：
(a)ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体の長腕遠位及び/又は短腕 遠位を削除するステップ；並びに (c) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び/又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ。
本発明の一実施形態において、 ステップ （a) においては、 前記ヒト 21番染 色体又はヒト 14番染色体を保持する細胞として相同組換え効率の高いものを用 いる。 好ましい実施形態においては、 相同組換え効率の高い細胞はニヮトリ DT 0細胞由来のものである。
また本発明の一実施形態において、 ステップ （b) においては、 ヒト 21番染 色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕遠位の削除を人工テロメァ 配列との置換により行う。 好ましい実施形態においては、 ヒト 2 1番染色体の長 腕遠位を AL 163204において削除し、 短腕遠位を AL 1 6320 1におい て削除する。 また別の好ましい実施形態においては、 ヒト 14番染色体の長腕遠 位を 14 Q領域で削除し、 短腕遠位を 14 p 12領域内において削除する。 また さらに好ましい実施形態においては、 ヒト 14番染色体の長腕遠位を AL 1 57 858、 より好ましくは AL 51 2310において削除し、 短腕遠位を OR 4 H 1 2、 OR 4 Q 4, RNR 2、 〇R4L 1、 RNU6 C、 FDP SL 3、 K 1 2 T、 C 14 o r f 57、 OR 6 S l、 M 1 95、 OR 4 K 14、 MGC 27 1 6 5、 LCH、 OR 1 0 G 3 , 〇R4K3、 OR4E 2、 H 1 RNA、 AT P 5 C 2、 OR 1 1 H 6 , 及び OR 4M 1からなる群より選択されるいずれか 1の位置 において削除する。
さらに本発明の一実施形態において、 ステップ （C ) においては、 部位特異的 組換え酵素が C r e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が L o xP配 列である。
さらなる態様において、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 例えばヒト 2 1 番染色体の長腕近位の AL 1 63203、 ヒト 14番染色体の AL 1 57858 より近位に、 さらに好ましくは AL 5123 1 0における前記削除位置より近位 に、 又はヒト 14番染色体の短腕近位の 14 p 1 2領域内における前記削除位置 より近位に揷入することができる。 さらに本発明は、 その第 3の態様において、 上記作製方法により得られる、 ヒ ト人工染色体ベクターを提供する。
また第 4の態様において、 本発明は、 上記ヒト人工染色体ベクターを保持する 細胞を提供する。 本発明はさらに、 その第 5の態様において、 上記作製方法において、 以下のス テツプ （d) をさらに含むことを特徴とする、 外来 DNAを含むヒト人工染色体 ベクターの作製方法を提供する ：
(d) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト 21番染色体又はヒト 14番染 色体に外来 DN Aを揷入するステップ。
また第 6の態様において、 本発明は、 上記作製方法により得られる、 外来 DN Aを含むヒト人工染色体べクタ一である。
さらに第 7の態様において、 本発明は、 外来 DNAを含むヒト人工染色体べク ターを保持する細胞を提供する。
本発明はさらに、 その第 8の態様において、 上記外来 DN Aを含むヒト人工染 色体べクタ一を保持する細胞を含む医薬組成物を提供する。 かかる場合、 外来 D NAは、 エリスロポイエチン （EP〇） 、 トロンポポイエチン （TPO) 、 血液 凝固因子、 フォンヴィルブランド因子 ( V W F ) 、 ジストロフィン、 ドーパミン 合成酵素、 インスリン、 インスリン様増殖因子 （ I GF) 、 インスリン様増殖因 子結合タンパク質 （I GFBP) 、 抗体、 テロメラーゼ、 顆粒球コロニ一刺激因 子、顆粒球 'マクロファージコロニー刺激因子、 免疫グロプリン、成長ホルモン、 インターロイキン 2、 インターロイキン 3、 インターロイキン 4、 インターロイ キン 5、 ィン夕ーロイキン 6、 インターロイキン 7、 インタ一ロイキン 8、 イン ターロイキン 9、 ィンタ一ロイキン 1 0、 ィン夕一ロイキン 1 1、 インターロイ キン 1 2、 インタ一ロイキン 1 5、 C D 40リガンド、 インターフェロン、 アデ ノシンデァミナーゼ、 a— 1アンチトリプシン、 オル二チントランスカルバミラ ーゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、 成長抑制因子 （G I F) 、 腫瘍壊死 因子 （TNF) 、 白血病阻害因子 （L I F) 、 オンコスタチン M、 F 1 t 3リガ ンド（F 1 t 3 L)、スト口一マ由来因子（SDF)、幹細胞増殖因子（S CF)、 繊維芽細胞増殖因子（FGF) 、 上皮増殖因子 （EGF) 、 血管形成誘導因子 （V EGF)、アンジォポイエチン、神経成長因子（NGF)、骨形成因子（BMP)、 ァクチビン、 トランスフォ一ミング増殖因子 （TGF) 、 ウィント （Wn t) 、 などをコードする遺伝子とすることができる。 また本発明は、 その第 9の態様において、 以下のステップを含む、 外来 DNA を受容細胞に導入する方法を提供する ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び Z又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト 21番染色体又はヒト 14 番染色体に外来 DNAを揷入するステップ；
(e) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
(g) 融合した受容細胞において外来 DNAの導入を確認するステップ。 本発明の一実施形態において、 上記受容細胞は、 動物細胞、 好ましくは哺乳動 物細胞である。 また、 上記受容細胞は、 多分化能を有する細胞、 例えば胚性幹細 胞 （ES細胞） 、 並びに間質系幹細胞及び組織幹 Z前駆細胞であってもよい。 さらに本発明は、 その第 1 0の態様において、 以下のステップを含む、 外来 D NAを発現する細胞の作製方法を提供する ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ； (b) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び/又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14 番染色体に外来 DNAを挿入するステップ；
(e) 上記ヒト 21番染色体又はヒ卜 14番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
(g) 融合した受容細胞において外来 DNAを発現する細胞を選択するステツ プ。
本発明の一実施形態において、 上記受容細胞は、 動物細胞、 好ましくは哺乳動 物細胞である。 また、 上記受容細胞は、 多分化能を有する細胞、 例えば胚性幹細 胞 （ES細胞） 、 並びに間質系幹細胞及び組織幹/前駆細胞であってもよい。 またさらに本発明は、 その第 1 1の態様において、 以下のステップを含む、 夕 ンパク質の製造方法を提供する ：
(a) ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 21番染色体又はヒ卜 14番染色体の長腕近位及び Z又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト 21番染色体又はヒト 14 番染色体にタンパク質をコードする外来 DNAを揷入するステップ；
(e) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ； (g) 融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
(h) 得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本発明の一実施形態において、 上記タンパク質としては、 例えば、 エリスロボ イエチン （EPO) 、 トロンポポイエチン （TPO) 、 血液凝固因子、 第八因子、 第九因子、 フォンヴィルブランド因子 ( V W F ) 、 ジス卜口フィン、 ドーパミン 合成酵素、 インスリン、 インスリン様増殖因子 （ I GF) 、 インスリン様増殖因 子結合タンパク質 （I GFBP) 、 抗体、 テロメラ一ゼ、 顆粒球コロニー刺激因' 子、顆粒球 ·マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロプリン、成長ホルモン、 インターロイキン 2、 インターロイキン 3、 インターロイキン 4、 インターロイ キン 5、 ィン夕一ロイキン 6、 インターロイキン 7、 ィン夕ーロイキン 8、 イン 夕一ロイキン 9、 ィンタ一ロイキン 1 0、 インターロイキン 1 1、 インターロイ キン 12、 インタ一ロイキン 1 5、 CD40リガンド、 イン夕一フエロン、 アデ ノシンデァミナーゼ、 α_ 1アンチトリプシン、 オル二チントランスカルバミラ ーゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、 成長抑制因子 (G I F) 、 腫瘍壊死 因子 (TNF) 、 白血病阻害因子 (L I F) 、 オンコス夕チン M、 F 1 t 3リガ ンド（F 1 t 3 L)、ストローマ由来因子（SDF)、幹細胞増殖因子（S CF)、 繊維芽細胞増殖因子（FGF) 、 上皮増殖因子（EGF) 、 血管形成誘導因子 （V EGF)、 アンジォボイエチン、神経成長因子 (NGF)、骨形成因子 (BMP)、 ァクチビン、 トランスフォーミング増殖因子 (TGF) 、 ウィント （Wn t) 、 などが挙げられる。 本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中、 「ヒト人工染色体ベクター」 又は 「HACベクター」 とは、 ヒト 染色体に基づいて作製された人工染色体を指す。
また本明細書中、 「ヒト染色体」 とは、 ヒト細胞由来の天然の DNAとタンパ ク質との複合体を指す。正常なヒト染色体は 23種（雄は 24種） 46本存在し、 それぞれ約 50〜300Mbの長さの DNAを含むことが知られている。また「ヒ ト染色体断片」 とは、 独立染色体として安定に複製及び分配が可能な染色体の部 分断片を指し、 断片の大きさは通常 1 M b以上だが、 それ以下の場合もある。 本明細書中、 染色体に関して 「長腕」 及び 「短腕」 とは、 .染色体上のセント口 メァ両側の腕 （アーム） を指し、 その長さに応じて長腕 （Q ) 及び短腕 （P ) と 称される。 またヒ卜染色体に関して 「長腕遠位」 及び 「長腕近位」 とは、 長腕上 のセントロメァから遠い位置 （すなわちテロメァ側） にある領域 （遠位） 及びセ ントロメァに近接する領域 （近位） を意味する。 具体的には、 ヒト 2 1番染色体 の場合には長腕遠位は A L 1 6 3 2 0 4よりもテロメァ側、 長腕近位は A L 1 6 3 2 0 3よりもセントロメァ側であり、 またヒト 1 4番染色体の場合には長腕遠 位は A L 1 3 2 6 4 2よりもテロメァ側、 長腕近位は A L 1 5 7 8 5 8よりもセ ントロメァ側である。 さらに 「短腕遠位」 及び 「短腕近位」 とは、 短腕上のセン トロメァから遠い位置にある領域 （遠位） 及びセントロメァに近接する領域 （近 位） を意味する。 具体的には、 ヒト 2 1番染色体の場合には短腕遠位及び短腕近 位は A L 1 6 3 2 0 1において境界があり、 またヒト 1 4番染色体の場合には リポソ一マル R N A領域において境界がある。
本明細書中、 「部位特異的組換え酵素」 及び 「部位特異的組換え酵素の認識部 位」 とは、 ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位で D N A の組換えを起こす現象に関して用いられる用語であり、 それぞれその部位特異的 に組換えを起こす酵素及び該酵素により認識される部位を指す。
本明細書中、 「人工テロメァ配列」 とは、 人工的に付加させたテロメァ配列を 指す。 本発明においては例えばテロメアトランケーシヨンによる人工テロメァ配 列の付加を行いうる。
本明細書中、 「外来 D N A」 とは、 対象とする細胞にとって外部から導入され る D N Aを指し、 物質生産及び機能改変又は機能分析などのために発現させるこ とが望まれる遺伝子及びその他の機能配列 （例えばプロモーター配列） などをコ —ドする D N Aを意味し、 同種又は異種のいずれでもよい。
本明細書中、 「供与細胞」 及び 「受容細胞」 とは、 ヒト人工染色体ベクターを 移入又は導入する場合に、 最初に該ベクタ一を保持する細胞 （供与細胞） と、 供 与細胞から該ベクタ一が移入される細胞 （受容細胞） を指す。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト 2 1番染色体長腕遠位をテロメアトランケーシヨンにより短縮削 除する方法の概要を示す図である。
図 2は、 ピューロマイシン耐性 DT 40株においてヒト 21番染色体長腕遠位 が削除されたことを示す P CR解析の結果を示す図である。
図 3は、ピューロマイシン耐性 DT 40株において長腕遠位が削除されたこと、 すなわち人工テロメァ配列が部位特異的に導入されたことを示すサザンブロット 解析の結果を示す写真である。
図 4 a及び bは、 ピューロマイシン耐性 DT 40株において長腕遠位が削除さ れたことを示す F I SH解析の結果を示す写真である。 図 4 aは DT 40細胞に 保持されているヒト 21番染色体 （矢印） を示し、 図 4 bは長腕を削除したヒト 21番染色体断片 （矢印） を示す。
図 5は、 長腕遠位を削除したヒ卜 2 1番染色体の長腕近位に 1 oxP配列を部 位特異的に揷入する方法の概要を示す図である。
図 6 A及び Bは、 ブラストサイジン耐性 DT 40株において相同組換え体 （ヒ ト 2 1番染色体上に 1 o xP配列が部位特異的に導入された株） を選別するため のサザンプロット解析 （A) 及び PCR解析 （B) の結果を示す写真である。 図 7 a及び bは、 ブラストサイジン耐性 CHO— K 1株においてヒト 21番染 色体（断片）が保持されていることを示す F I SH解析の結果を示す写真である。 図 7 aはテロメアトランケーシヨンを行う前の全長のヒト 2 1番染色体を示し、 図 7 bは長腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体断片を示す。
図 8は、 ヒト 21番染色体長腕近位の 1 o X P配列に GF Pコンストラクトを 部位特異的に挿入する方法の概要を示す図である。
図 9は、 G418耐性 CHO— K 1株における GFP発現の様子を示す蛍光顕 微鏡写真である。
図 10は、 G 41 8耐性 C H O— K 1株では、 1 o x P配列で部位特異的組換 えが起きたことを示すサザンプロット解析の結果を示す写真である。
図 1 1は、 ヒト 21番染色体短腕遠位をテロメアトランケーシヨンにより短縮 削除する方法の概要を示す図である。
図 12は、 ハイグロマイシン耐性 DT 40株においてヒト 2 1番染色体短腕遠 位が削除されたことを示す P C R解析の結果を示す図である。
図 13は、 ハイグロマイシン耐性 DT40株において短腕遠位が削除されたこ と、 すなわち人工テロメァ配列が部位特異的に導入されたことを示すサザンプロ ット解析の結果を示す写真である。
図 14は、 ハイグロマイシン耐性 DT 40株において短腕遠位が削除されたこ と、 すなわち人工テロメァ配列が部位特異的に導入されたことを示す P C R解析 の結果を示す写真である。
図 1 5 a及び bは、 ハイグロマイシン耐性 DT 40株において短腕遠位が削除 されたことを示す F I SH解析の結果を示す写真である。 図 1 5 aは DT40細 胞に保持されている長腕を削除したヒト 21番染色体 （矢印） を示し、 図 1 5 b は長腕及び短腕を削除したヒト 2 1番染色体断片 （矢印） を示す。
図 1 6は、 KH21 E細胞培養上清中に産生されたヒト E P〇が組換え体ヒト EPOタンパク質 （r hEPO) と同様の細胞増殖活性を保持する結果を示す図 である。
図 1 7は、 ブラストサイジン耐性 HT 1080細胞株においてヒト 21番染色 体断片 （矢印） が保持されていることを示す F I SH解析の結果を示す写真であ る。
図 1 8 a及び bは、 G 41 8耐性 HT 1 080株における GF P発現の様子を 示す蛍光顕微鏡写真 （図 1 8 a) 及び位相差顕微鏡写真 （図 1 8 b) である。 図 1 9は、 G41 8又はハイグロマイシン耐性 E 14株においてヒト 2 1番染 色体由来 H ACベクターが移入されたことを示す P CR解析の結果を示す図であ る。
図 20 a及び bは、 薬剤耐性 E 14細胞株においてヒト 21番染色体断片が保 持されていることを示す F I S H解析の結果を示す写真である。 図 20 aは長腕 遠位を削除した染色体断片 （矢印） を示し、 図 20 bはさらに短腕遠位を削除し た染色体断片 （矢印） を示す。 図 2 1は、 薬剤耐性 h i MS C細胞株においてヒト 2 1番染色体断片 （矢印） が保持されていることを示す F I SH解析の結果を示す写真である。
図 22 a及び bは、 H AC移入 ES細胞をインビトロで神経細胞に分化誘導し た際に、 GFP発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真 （図 22 a) 及び抗) 3チューブ リン抗体で染色した蛍光顕微鏡写真 （図 22 b) である。 発明の実施をするための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2002年 10月 4日に出願された 日本国特許出願第 2002- 292853号の優先権を主張するものであり、 上 記特許出願の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。 本発明は、 ヒト人工染色体ベクター (以下、 「本 H ACベクター」 ともいう） に関するものであり、 該 HACベクタ一は、 ヒト 21番染色体又はヒト 14番染 色体に基づいて作製され、 長腕遠位及び Z又は短腕遠位が削除されたヒト 21番 染色体断片又はヒト 14番染色体を含むことを特徴とするものである。
ヒト 21番染色体は、 セントロメァ領域を除く長腕全体及び短腕の一部につい て塩基配列が公共のデータベース上に公開されている （例えば、 http://hgp. gsc. riken. go. jp/chr21/index. html (Riken Genomic Sciences Center: Human Genome Research Group) を参照されたい） 。 このような配列情報を利用す ることで、 後述する人工テロメァ配列や 1 o X P配列などを相同組換えによって 部位特異的に挿入することが可能となる。 また、 長腕遠位の削除によって約 48 M bの 21番染色体が 1Z3の約 16Mbとなり、 また長腕遠位及び短腕遠位の 削除によつて最終的には約 2 M bの、 既知遺伝子を含まない H A Cベクターが構 築できる。
以前にマウス E S細胞ヘヒト 2 1番染色体を移入し、 キメラマウスを作製した 実験では、 移入した染色体の部分断片が次世代に伝達した。 宿主細胞の機能を阻 害する遺伝子を含んだ移入染色体領域が排除された結果、 安定化したと考えられ ている （Kazuki ら， J. Hum. Genet., 46:600, 2001) 。 一方ヒト Y染色体の場合、 マウス E S細胞中では不安定であつたが、 セントロメァの構成要素であるアルフ オイド DN Aをマウス染色体から取り込むことによって安定化が起きたと報告さ れている （Shenら， Hum. Mol. Genet. , 6:1375, 1997) 。 これらのことから、 雑 種細胞中でのヒ卜染色体の安定性は染色体毎に異なり、 安定性にはセントロメァ が関与すると考えられる。 先の実験でヒト 2 1番染色体のセントロメァ （大きさ は約 2Mbと考えられている ·· Triowell ら， Hum. Mol. Genet. , 2:1639-1649, 1993 ; Wangら、 Genome Res. 9: 1059-1073, 1999) はマウス細胞 Z個体中でも機 能することが示されているので、 セントロメァ領域を含むヒト 2 1番染色体断片 に基づいて作製した本 HACベクタ一は、 雑種細胞中で安定に保持されることが 期待できる。
また同様に、 ヒ卜 1 4番染色体の配列情報に関しても一部について塩基配列が 公共のデ一夕ベース上に公開されている。 さらにヒト 14番染色体由来の自然断 片 （S C 20 ； Tomizukaら， P. N. A. S.， 97： 722-727, 2000年） に加工を加えた HACベクタ一においてもヒト 2 1番染色体の場合と同様の縮小化が可能である と考えられる。 S C 20は、 ヒト 1 4番染色体の長腕遠位及び長腕近位の多くの 部分を欠失していることが報告されている（Tomizukaら， P. N. A. S. , 97:722-727, 2000年； Kuroiwaら, Nature Biotech. (USA) , 第 18巻， p.1086- 1090， 2000年）。 具体的には、 S C 2 0は、 ヒト 1 4番染色体長腕のテロメァ配列から AL 1 37 2 2 9 (G e n B a n k登録番号） を含む領域、 及びこれよりさらにセントロメ ァ側の AL 1 2 1 6 1 2 (Ge nB a n k登録番号） から AL 1 5 7 8 5 8 (G e n B a n k登録番号） のテロメァ側から 24— 26 k bまでを含む領域を保持 している。 また、 AL 1 3 7 22 9 (Ge n B a n k登録番号） と AL 1 2 1 6 1 2 (Ge nB a n k登録番号） 間の領域、 及び AL 1 5 7 8 5 8 (G e n B a n k登録番号） のテロメァ側 24 - 2 6 k bからセントロメァ間の領域を欠失し ている。 一方、 ヒト 14番染色体の短腕領域は保持されている。 この S C 2 0は ヒト細胞を含む細胞株やマウス個体において安定に維持され （Shinohara ら， Chromosome Res. , 8:713-725, 2000) 、 S C 20のリポソ一マル R Ν Α領域 （ヒ ト 14番染色体短腕部に位置する） に 1 0 X P部位を挿入した改変 S C 20にお いてもその安定性は保たれていた （Kuroiwaら， Nature Biotech. (USA) , 第 18 巻， p.1086 - 1090， 2000 年） 。 さらに、 それ自身は不安定なヒト 22番染色体断 片由来の約 1 0 Mbの染色体領域を、 その改変 S C 20の 1 o X P部位に転座さ せた HACもまた、 マウス E S細胞やマウス個体で安定であった。 S C 20の問 題点は、 1 4番染色体 14 Q 32領域の遺伝子を複数含んでいることであるが、 本明細書に記載された方法で S C 20を縮小化することにより、 様々な細胞種で 安定に維持され、 かつ余分な遺伝子を含まない H A Cベクターを得ることができ る。
以下に、 本 HACベクタ一の作製、 ベクターへの外来 DNAの挿入、 及び本 H ACベクターの用途について記載する。
1. ヒト人工染色体 （HAC) ベクターの作製
本 HACベクタ一は、 上述したようにヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体 に基づいて作製する。 本 HACベクタ一の作製には、 以下の （a) 〜 （c) のス テツプが含まれる ：
(a)ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒ卜 14番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕 遠位を削除するステップ；並びに
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び/又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ。
ここで、 上記ステップ （b) と （c) の順序は特に限定されない。 ステップ （a) ： ヒト染色体を保持する細胞の作製
本 HACベクタ一の作製においては、 ヒト染色体 （例えばヒト 2 1番染色体又 はヒト 1 4番染色体） を保持する細胞を用意する。 そのような細胞としては、 ヒ ト 2 1番染色体又はヒ卜 1 4番染色体のみを保持し、 かつその後の操作のために 相同組換え率の高いものが好ましい。 従って本発明においてはまずこれらの条件 を満たすような細胞を作製する。 ヒ卜染色体を保持する細胞は、 例えば、 ヒ卜単一染色体を保持する公知のマウ ス A9雑種細胞ライブラリ一からヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持 するクローンを選択し、 その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することに より作製することができる。 マウス A9雑種細胞ライブラリ一は、 薬剤耐性遺伝 子で標識されたヒト単一染色体を保持するものであり、 例えば、 WO 00Z1 0 3 8 3号、 Tanabe, H.ら （Ciiromosome Res. , 8·: 319-334, 2000) などに記載され ている。 またヒト 2 1番染色体及びヒト 14番染色体を保持するマウス A 9雑種 細胞は、 Japanese Collection of Research Bioresources (J CRB) にそれぞ れ登録番号 J CRB 2 22 1 (細胞名 A 9 (Hy g r o 2 1 ) ) 及び J CRB 2 2 14 (細胞名 A 9 (Hy g r o 14) ) として登録されており、 その詳細な情 報 ·培養法なども入手可能である。
上述のようにして入手したマウス A '9雑種細胞に保持されるヒト染色体を、 相 同組換え率の高い細胞に移入する。 ここで 「相同組換え率の高い細胞」 とは、 そ の細胞において相同組換え操作を行った際に、 相同組換えの頻度が高い細胞を指 し、 そのような細胞としては、 例えば、 ニヮトリ DT 40細胞 （Diekenら， Natu re Genetics, 12:174-182, 1996) 、 マウス E S細胞 （相沢慎一， バイオマニュ アルシリーズ 8， ジーン夕一ゲティング， 羊土社， 1995) 、 などが挙げられる。 特に、 操作の簡便性などの点から、 本発明においてはニヮトリ DT40細胞を利 用することが好ましい。 染色体の移入は、当技術分野で公知の染色体移入法に従って行うことができる。 例えば、 所望の染色体を 1本だけ導入する手法として、 Koi ら （Koi ら， Jpn. J. Cancer Res. , 80: 413-418, 1973)に記載されているミクロセル法が挙げられる。 この手法は、 ある種の細胞において紡錘体形成を阻害する薬剤により誘導される ミクロセルを分離し、 これを受容細胞と融合することにより、 少数の染色体を導 入するというものである。 このミクロセル法を利用してヒト染色体を移入する具 体的な操作手順に関しては、 例えば W09 7/0 7 6 7 1号及び WO O 0/1 0 3 8 3号を参照されたい。 以上のようにしてヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染 色体を保持する細胞を作製することができる。
あるいは、 本発明においては、 全長のヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体 ではなく、天然に部分断片化した染色体、例えばヒト 14番染色体の部分断片（S C 20) を保持する細胞を使用することも可能である。 S C 2 0染色体断片を保 持するニヮトリ DT— 40細胞 （S C 2 0) は、 独立行政法人 産業技術総合研 究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) に 2 0 0 1年 5月 9日付けで国際寄託され、 受託番号 F ERM B P - 7 5 8 3 が与えられている。 ステップ （b) ： ヒト染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除
HACベクターの作製においては、 ヒト染色体を保持する細胞において、 当該 染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する。 染色体の削除は、 当技術分野 で公知の方法により行うことができ、 例えば WO O 0/ 1 0 3 83号に記載され ている人工テロメァ配列との置換 (テロメアトランケーシヨン) により行うこと が好ましい。 長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、 例 えば、 ヒト染色体を保持する細胞において、 人工テロメァ配列を保持するターゲ ティングベクタ一を構築し、 相同組換えにより染色体上の所望の位置に人工テロ メァ配列の挿入されたクローンを取得した後、 テロメァ · トランケーシヨンによ る欠失変異体を得るというものである （Itzhakiら、 Nature Genet. , 2:283-287, 1992；及び Brownら、 P.N. A. S.， 93:7125, 1996を参照されたい） 。 ここで染色 体の所望の位置とは、 削除対象の長腕遠位又は短腕遠位の切断位置であり、 この 位置に人工テロメァ配列が相同組換えにより置換 ·挿入されて、 長腕遠位又は短 腕遠位が削除される （テロメアトランケーシヨン） 。 所望の位置は、 ターゲティ ングベクタ一を構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができ、 例 えば長腕遠位を削除する場合には、 ヒト 2 1番染色体上の 2 1 q 1 1領域内、 好 ましくは AL 1 6 3 204 (G e n B a n k登録番号） の塩基配列に基づいて標 的配列を設計し、 その標的配列よりもテロメァ側においてテロメアトランケ一シ ョンが起こるようにすることによって、 標的配列を設定した領域において長腕遠 位が切断、 削除される （例えば、 黒岩ら、 Nucleic Acid Research, 26:3447, 19 98) 。 また例えば短腕遠位を削除する場合には、 ヒ卜 21番染色体上の 21 P領 域内、 好ましくは AL 16320 1 (Ge nB a n k登録番号） の塩基配列に基 づいて標的配列を設計することができる。 標的配列の設計は、 上述した領域に限 定されず、 所望の HACベクタ一を作製するように当業者であれば適宜設計する ことが可能である。
また例えばヒト 14番染色体の長腕配列を S C 20よりもさらにセントロメァ 側に削除する場合、 AL 1 57858領域の塩基配列に基づいて標的配列を設計 し、 その標的配列よりもテロメァ側においてテロメアトランケーシヨンが起こる ようにすることによって、 標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、 削 除することができる。 また例えば短腕遠位を削除する場合には、 ヒト 14番染色 体上の 14 p領域内、 好ましくは 14 p 1 2領域内、 さらに好ましくは OR 4 H 1 2、 OR 4 Q 4, RNR 2、 OR4L l、 RNU6 C、 FDPSL 3、 K 1 2 T、 C 14 o r i 57、 OR 6 S l、 M 1 95、 OR4K 14、 MGC 27 1 6 5、 LCH、 〇R 10 G3、 OR4K3、 OR4E 2、 H 1 RNA、 ATP 5 C 2、 OR 1 1 H 6、 又は OR 4M 1 (米国 National Center for Biotechnology Information (NCB I ) のオンラインゲノムデ一夕べ一ス (http://www. ncbi. n lm. nih. gov/mapview/maps. c g i ? ORG=hum&CHR= 14&BEG= 0. OO&ENI) )の塩基配列に基 づいて標的配列を設計することができる。 標的配列の設計は、 上述した領域に限 定されず、 所望の HACベクタ一を作製するように当業者であれば適宜設計する ことが可能である。
また例えばインタク卜なヒト 14番染色体の長腕配列を削除する場合には、 1 4 Q領域内、 好ましくは AL 5 1 231 0 (Ge nB a n k登録番号） の塩基配 列に基づいて標的配列を設計し、 その標的配列よりもテロメァ側においてテロメ アトランケーシヨンが起こるようにすることによって、 標的配列を設定した領域 において長腕遠位を切断、 削除することができる。 また例えば短腕遠位を削除す る場合には、 ヒト 14番染色体上の例えば 14 p領域内、 好ましくは 14 p l 2 領域内、 さらに好ましくは OR 4H 1 2、 〇R4Q4、 RNR 2、 OR4L l、 RNU6C、 FDPSL3、 K12T、 C 14o r f 57、 OR6 S l、 M 19 5、 OR 4 K 14, MGC27165、 LCH、 OR 10 G 3 , OR 4 K 3 〇 R4E2、 H1RNA、 ATP 5C2、 0R11H6、 又は OR4M1 (米国 Na tional Center for Biotechnology Information (N C B I )のオンラインゲノム データべ一ス ( ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/卿 view/maps. cgi?ORG=kim&CHR=l 4&BEG=0. OO&ENI) ) の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。 標 的配列の設計は、 上述した領域に限定されず、 所望の HACベクターを作製する ように当業者であれば適宜設計することが可能である。 上述のようにして、 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片 を形成させ、 それを保持する細胞が得られる。 このような染色体のサイズの縮小 化により、 細胞における安定性を達成することができる。 また、 本 HACベクタ 一を保持する細胞、 及び後述する本 HACベクタ一が導入される細胞の機能 ·増 殖などに悪影響を与えないように、 悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を除 去することができる。 ステップ （c) ：部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入
本 HACベクタ一の作製においては、 ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体 に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。 このステップ （c) は、 上記ス テツプ （b) の前又は後のいずれで行ってもよく、 これらの順番は特に限定され ない。 すなわち、 ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体において、 長腕遠位及 び/又は長腕遠位を削除した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を揷入しても よいし、 あるいは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入した後で長腕遠位及び /又は長腕遠位を削除してもよい。
当技術分野においては、 ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認 識部位で DN Aの組換えを起こす現象が知られており、 本発明においてはそのよ うな酵素及び認識部位の系を利用する。 例えば、 そのような系としては、 C r e / 1 o X Pシステムが知られている (例えば、 Sauer, B.ら， P. N. A. S. , 85:5166 -5170, 1988を参照されたい） 。 C r eはパクテリオファージ P 1由来の 3 8 K Dのタンパク質であり、 リコンビナーゼの I n t (ィンテグラーゼ) ファミリー に属するものである。 この酵素は、 約 34 b pの認識部位 1 o X P配列を認識し て、 この部位で特異的に DNAの組換えを起こす。 またこの 1 o X P配列の方向 性によって、 2つの 1 o X P配列間の DNAの欠失又は転座が生じることが知ら れている。 またその他の、 特異的な配列を認識して組換え反応を起こす系として は、出芽酵母由来のレコンビナーゼ FLP (Broachら， Cell, 21:501-508, 1980)、 ファージ p h i C 3 1由来のインテグラ一ゼ (Thorpeら， P. N. A. S. , 95:5505-55 10, 1998) などがあり、 哺乳動物細胞でもこれらの酵素による DNA組換え反応 が起きることが報告されている （Kochら， Gene, 249:135-144, 2000； Thyagaraj anら, Mol. Cell. Biol., 21:3926-3934, 2000) 。
ヒ卜染色体の長腕近位及び Z又は短腕近位に、 上記部位特異的組換え酵素の認 識部位を挿入するには、 公知の遺伝子組換え手法、 例えば相同組換え法を利用す ることができる。 部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入位置は、 当業者であれ ば、 必須ではない遺伝子の位置などを考慮して適宜設定することができる。 例え ば、 ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体の長腕近位又は短腕近位の任意の位 置に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。 かかる挿入位置としては、 例 えば、ヒト 2 1番染色体については長腕近位の AL 1 6 3 2 03などが挙げられ、 またヒト 14番染色体については長腕近位の A L 1 57 8 5 8 (Ge nB a n k 登録番号） より近位、 さらに好ましくは長腕近位の AL 5 1 2 3 1 0 (Ge nB a n k登録番号） における前記削除位置より近位、 又はヒト 14番染色体の短腕 近位の 1 4 p 1 2領域内における前記削除位置より近位などが挙げられる。
その後、 後述する外来 DN Aの導入手法に従ってリボー夕一遺伝子を導入し、 その発現を確認することによって、 ヒト染色体上に挿入した認識部位の位置の適 否を確認することができる。
上記例示した認識部位のうち 1種類を 1つ又は複数挿入してもよいし、 あるい は、 異なる系の認識部位を複数挿入してもよい。 後述するように、 本 HACべク 夕一は、 部位特異的組換え酵素の認識部位を有するため、 外来 DNAを部位特異 的に導入することが可能であり、 さらに、 認識部位の設定により外来 DN Aの導 入位置を決定できるため、 外来 DNAの導入位置が一定となり位置効果 （positi on effect) をうけることもない。 また外来 D N Aの導入操作も簡便となる。 さら に異なる系の認識部位を複数挿入することによって、 複数の外来 DNAを逐次挿 入することもできる。
上述のようにしてヒト染色体を改変して作製した本 HACベクターには、 部位 特異的組換え酵素の認識部位の他、 プロモー夕一、 薬剤耐性遺伝子などのべクタ —構築において一般的に挿入される配列又はエレメントが挿入されていてもよい。 そのような配列又はエレメントは、 上述したように相同組換え法を利用して本 H ACベクタ一の所望の位置に揷入することができる。
さらに本発明者は、 上述のように作製した本 HACベクター （ヒト 21番染色 体又はヒト 14番染色体） を保持する細胞を、 選択薬剤を含まない培地で長期に わたり継代培養し、 経時的に HACベクタ一の保持率を F I SH法により検定し たところ、 本 HACベクタ一は宿主細胞 （例えば DT40細胞及び CHO細胞） において安定に保持されることを確認することができた。
2. H ACベクターへの外来 DN Aの導入 (ステップ (d) )
上記 HACベクタ一の作製において、 部位特異的組換え酵素の存在下にて外来 DNAを挿入するステップ （d) を行うことにより、 本 HACベクターに外来 D N Aを導入することができる。 このステップ (d) は、 上述したステップ (c) の後に行うものであるが、 ステップ (b) との順序は特に限定されず、 ステップ (b) の前又は後に行うことができる。 従って、 ステップ （b) 〜 （d) の順序 は明細書に記載する順序に限定されないことに留意されたい。
外来 DNAとは、 対象とする細胞にとって外部から導入される DN Aを指し、 遺伝子及びその他の機能配列などをコードする DNAである。 本発明において導 入対象となる外来 DNAとしては、 物質生産及び機能改変又は機能分析などのた めに発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列などをコードする D NAであれば特に限定されない。 その他の機能配列とは、 遺伝子が発現するため に機能する配列を指し、 例えば、 プロモーター、 ェンハンサー、 シグナル配列な どが挙げられる。
外来 DN Aの導入は、 上記挿入されている部位特異的組換え酵素の系を利用し て行う。 例えば、 C r e酵素の認識部位である 1 o xP配列と外来 DNAを保持 するターゲティングベクターを構築する。 続いて本 HACベクタ一 （ヒト 2 1番 染色体又はヒト 14番染色体） を保持する細胞において、 C r e酵素を細胞内で 発現させることにより、 1 o X P配列と人工テロメァ配列に挟まれた領域と、 上 記夕ーゲティングベクターとの部位特異的組換えにより、 外来 DNAを本 HAC ベクタ一上に挿入させることができる（黒岩ら， Nature Biotech. , 18:1086, 2000)。 本 HACベクターには、 部位特異的組換え酵素の認識部位 （ Ι ο χΡ配列） を 保持する環状 DNAが挿入できる。 このため大腸菌を宿主としたプラスミド、 B
AC、 PACや、 酵母を宿主とした環状 YACなど既存のベクタ一によりクロ一 ン化された DN Aを挿入することができる。 またヒト染色体に基づいて作製され ていることから、 本 H ACベクターに導入可能な外来 DN Aのサイズの上限は 1 00 k bオーダ一まで拡張され、 従来発現実験に用いられてきたプラスミドべク 夕一に組み込まれた cDN Aだけではなく、 遺伝子の発現制御領域を含むゲノム DNAも導入可能である。
例えば、 本 HACベクタ一に外来 DNAを揷入して構築された、 外来 DNAを 含む HACベクタ一は、 その挿入によって安定構造が変化する可能性、 さらに外 来 DN Aを含む H ACベクター全体の大きさが不利に大きくなる可能性も考えら れるので、導入（挿入）する外来 DNAの大きさは、通常約 10Mb〜約 1 kb、 好ましくは約 3 M b〜約 2 k b、さらに好ましくは約 1 M b〜約 3 k bとしうる。 従来の c DNA強制発現ベクターを用いた遺伝子導入法では、 過剰発現による 細胞毒性や増殖抑制などの副作用が生じ、 導入遺伝子を恒常的に発現する細胞株 が得られない例が多い。 この問題点を克服し、 生理的な発現パターンを保ちなが らなおかつ発現を人工的に制御するには、 テトラサイクリンなどを利用した遺伝 子発現誘導系の適用が望ましい。 導入可能なインサートサイズが大きく、 一定の コピー数が安定に保持されるという本 HACべクターの特徴はこのような目的に 適つてレ る。 組織特異的 z生理的な遺伝子発現は、 遺伝子をコードするゲノム領域からの転 写、 転写産物の編集、 核外への輸送、 翻訳の各段階で制御を受ける。 一つの遺伝 子に対して複数のプロモーターがあって転写開始点が異なったり、 スプライシン グにバリエーシヨンが生じることで、 組織特異的なアイソフォームが発現するこ とが知られている。 クローン化 c DNAは一つの遺伝子に由来する複数の転写産 物バリアントの 1つにすぎない。 生理的な遺伝子発現を再現するためには、 ゲノ ム DNAとして制御配列を含んだ遺伝子領域を導入することが望ましい。 本 HA Cベクタ一の利用はこのような目的に適うものである。
ヒ卜 21番染色体断片を保持するマウス E S細胞からキメラ個体を作製したと ころ、 次世代伝達が確認されたことから、 ヒト 21番染色体のセントロメァはマ ウス細胞及び個体中で複製分配保持されると考えられる （Kazuki ら， J. Hum. Genet. , 46:600, 2001) 。 そのため、 本 HACベクターもまたマウス個体中で安 定に保持される可能性が高い。
ヒトゲノムプロジェクトでは、ゲノム DNAは B ACクローンとして単離され、 塩基配列が決定された。 このため公開されているデ一夕ベース （Ge nB a n k など） では、 塩基配列は B AC単位でも登録されている。 遺伝子機能解析の 1手 段としてトランスジエニックマウスの作製がある。 本 HACベクターをプラット フォームとして BACを挿入することで、 位置効果を受けること < ^. 件で遺伝子の発現を解析することが可能になる。 多くの B ACベクターは 1 o x P配列を保持しているため、 本 HACベクターへの揷入をネガティブ選別する系 を用いれば、 塩基配列既知の B ACを本 HACベクターにカセット形式で簡便に 挿入できると考えられる。 上述した以外にも、 本 H ACベクタ一への外来 DN Aの導入手法及び導入の利 点があり、 以下にそのいくつかを例示する。
(1) 相互転座による染色体部分断片の導入
C r e酵素による 1 o X P配列間の部位特異的組換えは、 線状染色体と環状ィ ンサート （外来 DNA) の場合は挿入反応が起こるが、 線状染色体同士では相互 転座の反応が起きる。 これを利用すれば環状ィンサ一トにクローニングできない
Mb単位以上の染色体断片を本 H ACベクターに導入することができる（Kuroiwa ら， Gene Ther. 9:708, 2002) 。 (2) 挿入体選別法
本明細書の実施例に記載する方法においては、 本 H ACベクターへの外来 DN Aの挿入は、 薬剤耐性遺伝子の再構成を指標としたポジティブ選別を利用してい る （組換え体のポジティブ選別に関しては、 WO 00Z10383号を参照され たい） 。 これに代わって、 チミジンキナーゼ /ガンシクロビル系などのネガティ ブ選別により、 インサート挿入体 （外来 DNAが挿入されたもの） を得ることも 可能である。 この場合、 挿入する環状 DNAには 1 o X P配列のみが含まれてい ればよい。 ゲノムプロジェクトで用いられた BACライブラリ一は 1 o X P配列 を含んでいるので、 このようなネガティブ選別の系が確立できれば配列既知のゲ ノムクローンを本 H ACベクターに容易に挿入することが可能になる。
(3) 複数インサートの挿入
本発明において好ましく用いられる 1 o X P配列は P 1ファージに由来する野 生型の配列であり、 C r e酵素による HACベクター上の 1 o x P配列への環状 ィンサ一トの挿入反応は可逆的である。 本明細書に記載する実施例においては、 C r e酵素を一過性に発現させ、 薬剤耐性の獲得を指標に部位特異的な組換え体 を選別することにより構成的な挿入体が得られた。 一度環状インサートが挿入さ れると、 HACベクタ一上に 2つの 1 o X P配列が残る。 このため再度 C r e酵 素を発現させると逆反応 （環状インサートの切り出し） が起きる可能性もあり、 二次的にインサートを挿入するなどのさらなる H A Cベクターの改変は困難とな る。 一方、 塩基置換を行った変異 1 ο X P配列の組み合わせによっては、 反応方 向及び反応の特異性を限定できるとの報告がある（Hoessら， Nucleic Acids Res. , 14:1986 ; Araki ら， Nucleic Acids Res., 25:868, 1997 ; Leeら， Gene, 216:55, 1998) 。 このような変異 1 o xP配列を用いることで、 上述した逆反応を起こさ ず、 複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築可能である
(4) コピー数依存的発現制御
グロビン遺伝子トランスジエニックマウスを用いて宿主染色体上にランダム に挿入された遺伝子のコピー数と mRNA発現量の関係を解析した報告 （Sharpe ら、 Proc Natl Acad Sci USA, 90:11262, 1993) では、 発現量と導入遺伝子コピー数 との間に相関は認められない。 これは、 トランスジエニック動物系統により導入 遺伝子の発現量が大きく異なり、 また導入した遺伝子のコピー数に比例しない発 現が起こるポジション効果と呼ばれる現象によるものであると考えられ、 トラン スジエニック動物における遺伝子導入においては頻繁に起こる現象である。また、 導入遺伝子のポジション効果を排除して比較するため外来 DN Aの挿入位置を予 め宿主染色体上に導入した 1 o X Pサイ卜に確定し C r e— 1 o x P組換え反応 によりプラスミドベクターから目的の DN Aュニッ卜を導入する卜ラン 、ジェニ ックマウスの報告 （Garrick ら、 Nature Genet. , 18:56, 1998) があるが、 ここ でもコピー数依存的発現制御は実現されていない。
一方、 チロシナ一ゼゲノム領域を導入した YACを用いて作製したトランスジ エニックマウスにおいて、 導入したゲノム領域のコピー数依存的なチロシナーゼ 発現が認められたが (Schedl ら、 Nature, 362:258-261, 1993) 、 生理的発現制 御領域を含むゲノムを用いる点でポジション効果の影響を受けないと考えられ、 本発明のような生理的制御領域を含まない人工的な遺伝子発現ュニットのみを多 コピー化して発現させるものではない。 また、 各種のェピソームベクターは、 宿 主染色体と独立に存在し外来 DN A揷入位置も決まっているが、 細胞内でのべク タ一自身のコピー数を厳密に制御するには至っていない（Morlinoら、 ppl Environ Microbiol. 、 65:4808-4013, 1999 ； Cooper ら、 Proc Natl Acad Sci USA. , 94:6450-6455, 1997) 。
本発明においては、 実施例 9に示すとおり、 目的遺伝子 （EPOを使用） の発 現ュニットを多コピー連結して並列配置し、 HACベクター上の決まった位置（ 1 o x Pサイト） に導入することにより、 宿主染色体に変異を与えることなくコピ 一数依存的発現制御を行なうことができる。
従って、 本発明の方法により、 外来 DNAとして多コピーの目的遺伝子を所望 の細胞に導入し、 該細胞において該目的遺伝子をコピー数依存的に発現させるこ とが可能であると共に、 該細胞を用いて作出したトランスジエニック動物におい ては、 ポジション効果を受けることなく従来困難であったコピー数依存的な目的 遺伝子の発現を達成することが可能となる。
3. HACベクタ一の細胞への移入
本 H ACベクター又は外来 DN Aを含む本 H ACベクターを保持する細胞から、 それらのベクタ一をその他の細胞へ移入することができる。移入先となる細胞は、 特に限定されるものではないが、 動物細胞 （哺乳動物細胞） などが挙げられる。 本発明においては、 無傷の状態でヒ卜染色体を移入可能であることが知られてい るチャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞を用いることが好ましい （WOO 0/1 0383号参照） 。 CHO細胞は、 効率良くミクロセルを形成することが 知られており （例えば、 Koi ら、 SCIENCE 260:361, 1993) 、 これにより本 HAC ベクターを CHO細胞からさらに別の細胞 （CH〇細胞以外の細胞） へ移入する ことも可能である。 また、 本発明においては、 本 HACベクターを多分化能を有 する細胞に移入することも可能である。 「多分化能を有する細胞」 とは、 所定の 操作により、 特定の細胞又は組織に分化可能な細胞を意味する。 例えば、 宿主胚 への注入又は集合胚形成などの操作を行うことによって、 キメラ動物の 2種類以 上の細胞又は組織に分化可能な細胞、 具体的には、 胚性幹細胞 （ES細胞） 、 胚 性生殖細胞 （EG細胞） 、 胚性腫瘍細胞 （EC細胞） などが含まれる。 また、 例 えば、 増殖因子 （例： トランスフォーミング増殖因子； TGF) などを添加した 誘導培地における培養により、骨細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化可能な細胞、 具体的には、 体性幹細胞 （例：間葉系間細胞） などが含まれる。
本明細書中で使用される 「胚性幹細胞」 とは、 ES細胞とも称され、 未分化性 (全能性） を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を 意味する。 すなわち胚性幹細胞は、 動物の初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未 分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、 未分化状態を保ったままで増殖し 続けるように樹立された細胞株である。 また 「胚性生殖細胞」 とは、 EG細胞と も称され、 上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖 細胞由来の培養細胞を意味する。 胚性生殖細胞は、 受精後数日〜数週間、 例えば マウスの場合には約 8. 5日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、 未分化 状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。 また、 ヒトを対象とした遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細 胞は、 ガン化などを避けるための安全性の観点から、 不死化細胞ではなく正常細 胞を用いることが望ましいとされている。 不死化細胞やガン化細胞への染色体移 入例は、ヒト及びその他の動物で数多くあるが、正常体細胞への染色体移入例は、 ゥシにおいて胎仔正常繊維芽細胞への移入（Kuroiwaら、 Nature Biotech. , 20:889, 2002) が報告されているものの、 ヒトにおいては少なくとも検索キー； c h r o mo s ome, t r a n s f e r, huma n, n o rma 1 , p r i ma r y o r s o m a t i c, c e l l , で米国 National Center for Biotechnology Information (N C B I ) のオンライ ン文献データベース P u b M e d (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/ Query. fcgi?db=PubMed) をサーチする 限りにおいて該当するものは見当たらない。 これらのことから、 ヒト正常体細胞 への染色体移入が困難であるという認識が一般的であった。
本発明においては、 実施例 1 3及び 14に示すとおり、 ヒト 14番染色体由来 断片又はヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターのヒト正常繊維芽細胞への移入が 可能であることが初めて示された。 また、 本発明の方法により、 繊維芽細胞以外 のヒト正常体細胞へのヒト 14番染色体由来断片又はヒト 21番染色体由来 H A Cベクターの移入が可能である。 さらに、 本発明の方法に従って作製されたヒト 染色体由来 HACベクタ一であれば、 ヒト 14番染色体又はヒト 21番染色体に 制限されることなく、 ヒ卜正常体細胞に移入することが可能である。
H ACベクタ一の細胞への移入は、ミクロセル法を利用して行うことができる ミクロセル法は、 上記 「1. ヒト人工染色体 （HAC) ベクタ一の作製」 の項に 記載のように行うことができる。
また、 本 HACベクターの細胞への移入について、 最初に用意したヒト染色体 を保持する細胞から、 ヒト染色体への改変を行うステップの前、 ステップの間、 又はステップの後のいずれの段階においてもヒト染色体 （H ACベクター） を他 の細胞へ移入することが可能である。
4. HACベクタ一の用途
本発明の目的は、 ベクタ一という基本ツールとその利用技術の提供であり、 学 術研究から産業に至る非常に幅広い領域に波及効果をもたらすことが期待される。 ①宿主染色体に挿入されず独立して維持される （宿主遺伝子の変異やがん化の懸 念がない） 、 ②一定のコピー数で長期間安定に保持される （過剰発現、 発現消失 の懸念がない） 、 ③導入可能な DN Aの長さの制限がない （正常な発現制御を保 証する DNAエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能である） 、 という本 HACベクターの特徴は、 従来のベクタ一で不可能であった多くのこと を可能にすると想像される。 本 HACベクタ一の用途としては、 限定するもので はないが主要なものを挙げると、 ①動物培養細胞における遺伝子機能解析用べク 夕一、 ②ヒト疾患遺伝子治療用ベクター、 ③ヒト臓器幹細胞、 胚幹細胞 （E S細 胞） への遺伝子導入用べクタ一、 ④遺伝子導入動物作製用べクタ一 （例： ヒト疾 患モデル動物作製、 KO動物と組み合わせた特定遺伝子のヒト化） 、 などが考え られる。 以下に、 本 HACベクターの用途の一例として、 （1) 外来 DNAの受 容細胞への導入、 （2) 外来 DNAを発現する細胞の作製、 （3) タンパク質の 製造、 （4) 遺伝子機能解析用ベクター、 （5) 幹細胞への遺伝子導入用べクタ ―、 (6) 培養フィーダ一作製用ベクター、 及び （7) ヒト疾患治療用べクタ一 を説明する。
(1) 外来 DN Aの受容細胞への導入
本 HACベクタ一は、 細胞中で外来 DNAを揷入したり、 外来 DNAが揷入さ れた HACベクタ一を他の細胞に移入したりできるため、 外来 DNAを所望の受 容細胞に導入することができる。 外来 DNAの受容細胞への導入には、 例えば以 下のステップが含まれる ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び Z又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト 21番染色体又はヒト 14 番染色体に外来 DN Aを揷入するステップ；
(e) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
(g) 融合した受容細胞において外来 DNAの導入を確認するステップ。 ステップ (a) 〜 (d) は、 上述したように行うことができ、 ステップを行う 順序はこれに限定されない。
ステップ (e) 及び ( f ) においては、 ヒ卜染色体を保持する供与細胞から、 ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体断片を移入する。 移入対象となる ヒト染色体は、 ステップ （b) 〜 （d) における染色体の改変前、 改変ステップ の途中、 又は改変後のものとすることができる。 従って、 例えばステップ （d) においてヒト染色体に外来 DNAを挿入する前に、 ヒト染色体を保持する供与細 胞から、 ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体を移入してもよい。 その 後、 ステップ （d) の外来 DNAの挿入操作を受容細胞において行って、 外来 D N Aが挿入されたヒト染色体を受容細胞に保持させることもできる。 これらのス テツプは他の順序で行うこともでき、 ステップ （d) 〜 （f ) の順序は、 上記順 序に限定されない。 ミクロセル法は、 上記 「1. ヒト人工染色体 （HAC) ベクターの作製」 の項 に記載のように行うことができる。 ここで用いる受容細胞は、 特に限定されるも のではないが、 動物細胞、 特に哺乳動物細胞 （例えばマウス細胞、 ヒト細胞など） が好ましい。 また、上述したような多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（E S細胞） 、 並びに間質系幹細胞及び組織幹 Z前駆細胞などを受容細胞として用い ることも可能である。
続いて、 ステップ （g) においては、 受容細胞に外来 DNAが導入 （移入） さ れているか否かを確認する。 この確認は、 当技術分野で公知の手法により行うこ とができ、 例えば、 外来 DN Aの制限酵素部位に対応するプローブを用いたサザ ンブロット解析などにより、 外来 DNAの導入を確認することができる。
本 H ACベクターを用いることにより、 大きなサイズの外来 DN Aを細胞に導 入し、 安定に保持させることが可能となる。
(2) 外来 DNAを発現する細胞の作製
本 HACベクターは、 上述したように、 細胞中で外来 DNAを挿入したり、 外 来 DN Aが挿入された H ACベクタ一を他の細胞に移入したりできるため、 外来 DN Aを発現する細胞を作製することもできる。 外来 DN Aを発現する細胞の作 製には、 例えば以下のステップが含まれる ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体の長腕近位及びノ又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4 番染色体に外来 DN Aを揷入するステップ；
(e) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ； ( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
(g) 融合した受容細胞において外来 DNAを発現する細胞を選択するステツ プ。 ステップ （a) 〜 （ f ) は、 上述したように行うことができ、 ステップを行う 順序はこれに限定されない。
ステップ ( g) においては、 受容細胞において外来 DNAの発現を確認し、 外 来 DNAを発現する細胞を選択する。 外来 DNAの発現の確認は、 当技術分野で 公知の手法により行うことができ、 例えば、 外来 DNAに対応するプローブを用 いたノーザン ·ブロッ卜法などが挙げられる。
本 H ACベクタ一を用いることにより、 大きなサイズの外来 DN Aを発現する 細胞を作製することが可能となる。
(3) タンパク質の製造
本 HACベクターを利用することにより、 上述したように、 外来 DNAを細胞 に導入することや、 外来 DNAを発現する細胞を作製することができるため、 当 該外来 DNAによりコードされるタンパク質を製造することができる。 タンパク 質の製造には、 例えば以下のステップが含まれる ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒ卜 2 1番染色体又はヒ卜 1 4番染色体の長腕遠位及び/又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒ卜 2 1番染色体又はヒ卜 1 4番染色体の長腕近位及び Z又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4 番染色体にタンパク質をコードする外来 DNAを挿入するステップ；
(e) 上記ヒ卜 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ； ( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
( g ) 融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
( h ) 得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。 ステップ （a ) 〜 （f ) は、 上述したように行うことができ、 ステップを行う 順序はこれに限定されない。
ステップ（g )では、 ステップ（ f )で融合した受容細胞を培地中で培養する。 受容細胞を培養するための培地は、 炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 上記 受容細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地 のいずれを用いてもよく、 当業者であれば適切な培地を選択し、 また必要により 適宜修正を加えて培地を調製することができる。 また、 振盪培養又は通気攪拌培 養等の好気的条件、 温度、 P H、 培養期間なども適宜設定する。
培養後、 ステップ （h ) に記載するように、 得られる培養物からタンパク質を 採取する。 「培養物」 とは、 培養上清のほか、 培養細胞又は細胞の破砕物のいず れをも意味するものである。 培養終了後、 該培養物よりタンパク質を採取するに は、 通常のタンパク質精製手段等を用いて得ることが出来る。 例えば、 細胞内に 生産された場合は、 常法により細胞を超音波破壊処理、 磨碎処理、 加圧破砕等に よりタンパク質を抽出する。必要に応じてプロテア一ゼ阻害剤を添加する。また、 培養上清に生産された場合は、 培養液そのものを用いることが出来る。 そして、 この溶液を濾過、 遠心分離等を行い固形部分を除去し、 必要によりプロトタミン 処理等により核酸を除去する。
次いで、 これに硫安、 アルコール、 アセトン等を添加して分画し、 沈殿物を採 取し、 粗タンパク質溶液を得る。 該タンパク質溶液を各種クロマトグラフィー、 電気泳動等にかけて精製酵素標品を得る。 例えば、 セフアデックス、 ウルトロゲ ル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過、 イオン交換体クロマトグラフィー、 ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、 ァフィ二テイク口マトグラフィ 一、 逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、 又はこれらを組合 せることにより、 精製された目的のタンパク質を得ることが出来る。 しかし、 上 記培養法、 精製法は一例であって、 これに限定されるものではない。
本発明において、 製造対象となるタンパク質は、 製造が望まれるタンパク質で あれば特に限定されるものではないが、 一例としては、 エリスロポイエチン （E PO) 、 トロンポポイエチン （TPO) 、 血液凝固因子、 フォンヴィルブランド 因子 (vWF) 、 ジス卜ロフィン、 ド一パミン合成酵素、 インスリン、 インスリ ン様増殖因子（ I GF) 、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ I GFBP) 、 抗体、 テロメラーゼ、 顆粒球コロニー刺激因子、 顆粒球 ·マクロファージコロニ 一刺激因子、 免疫グロブリン、 成長ホルモン、 インターロイキン 2、 インター口 ィキン 3、 インターロイキン 4、 インタ一ロイキン 5、 インターロイキン 6、 ィ ンターロイキン 7、 インターロイキン 8、 ィン夕ーロイキン 9、 インタ一ロイキ ン 10、インターロイキン 1 1、ィン夕ーロイキン 1 2、ィン夕一ロイキン 1 5、 C D 40リガンド、 ィンターフェロン、 アデノシンデァミナ一ゼ、 α_1アンチ 卜リプシン、 オル二チントランス力ルバミラ一ゼ、 プリンヌクレオチドホスホリ ラ一ゼ、 成長抑制因子 （G I F) 、 腫瘍壊死因子 （TNF) 、 白血病阻害因子 （L I F) 、 オンコス夕チン M、 F 1 t 3リガンド (F 1 t 3 L) 、 スト口一マ由来 因子 （SDF) 、 幹細胞増殖因子 （S CF) 、 繊維芽細胞増殖因子 （FGF) 、 上皮増殖因子（EGF) 、 血管形成誘導因子（VEGF) 、 アンジォポイエチン、 神経成長因子 (NGF) 、 骨形成因子 (BMP) 、 ァクチビン、 トランスフォー ミング増殖因子 （TGF) 、 ウィント （Wn t) などが挙げられる。 このような 製造対象のタンパク質をコードする遺伝子 （すなわち外来 DNA) は、 例えば公 の遺伝子データベースなどを利用してその配列情報を入手することができる。
(4) 遺伝子機能解析用ベクター
本 HACベクターに挿入した外来 DNAは、 細胞中でコピー数依存的かつ安定 的に発現されるため、 本 HACベクタ一は、 遺伝子機能を解析するために利用す ることができる。
標的遺伝子をコードする塩基配列の一部に相補的な配列からなる二本鎖 RN A (double-stranded RNA; d s RNA) を発現させることにより標的遺伝子の発現 を抑制する手法、 RNA干渉が知られている （例えば、 短鎖干渉 RNA (s i R NA) に関しては、 Elbashirら、 Nature, 411:494, 2001； McCaffrey ¾> Nature, 418:38, 2002を参照。また、 Shinagawa, T. ら、 Genes & Development, 17:1340-1345, 2003も参照） 。 d s RNAをコードする DNAを遺伝子発現誘導系とともに HA Cベクタ一上に導入することにより、 標的遺伝子のコンデイショナルな機能抑制 が可能である。 また、 遺伝子発現誘導系に替えてゲノム領域を利用することで組 織特異的/生理的な部位での機能抑制が可能である。
また、 目的分子による作用効果を解析しょうとする場合に、 その目的分子の用 量依存性を指標として解析する手法がある。 この手法において、 本発明に従って 目的分子をコードする遺伝子の発現ュニッ卜のコピー数を変えて HACベクタ一 上へ導入し、 細胞等 （組織、 個体も含む） に移入することにより、 該細胞等にお けるコピー数依存的発現制御に基づいて用量依存性解析を行なうことが可能であ る。 また、 遺伝子発現制御のために発現誘導系やゲノム領域を利用することでコ ンディショナル又は組織特異的/生理的な機能解析が可能である。
(5) 幹細胞への遺伝子導入用べクタ一
本発明の方法により作製した H ACベクターは、 実施例 20及び 2 1に示した ように胚性幹 （ES) 細胞又は間葉系幹細胞 (Mesenchimal Stem Cell； MS C) への遺伝子導入用ベクターとして利用することができる。 そして上記 H ACべク 夕一は E S細胞又は MS Cにおいて長期間安定に存在できる。
実施例 20及び 2 1に示したように、 本発明の方法により作製した H A Cべク 夕一を保持する MS Cから分化誘導した組織細胞においては H ACベクターが安 定に保持される。 また、 ヒト 2 1番染色体断片を保持するマウス ES細胞からキ メラ個体を作製すると、 該染色体断片が次世代伝達すること及び組織中の E S細 胞から分化した細胞においてヒト 2 1番染色体断片が保持されていることが確認 されたことから （Kazuki ら、 J. Hum. Genet., 46:600, 2000) 、 本発明の方法に より作製した H ACベクター移入 E S細胞から分化誘導した組織細胞においても H ACベクターが安定に保持されると考えられる。 また近年、様々な組織の幹細胞及び骨髄由来の多能性細胞が同定されている（横 田ら、 実験医学 （増刊） 、 1 9巻 1 5号、 20 0 1年、 羊土社、 岡野ら、 実験医 学 （増刊） 、 2 1巻 8号、 2 00 3年、 羊土社、 Li ら、 Nature Med.， online :31 August 2003, doi:10.1038/nm925) 。 本発明の方法により作製した HA Cベクタ 一は、 組織幹 Z前駆細胞、 例えば骨髄、 血液、 神経、 筋肉、 肝臓、 塍臓、 皮膚、 内耳などに由来する多能性幹/前駆細胞、 への遺伝子導入用ベクターとして利用 可能である。
さらに、 E S細胞、 MS C、 及び組織幹 Z前駆細胞のヒト臨床応用を考える場 合、 治療処置に必要な量の細胞を増幅し、 所望の分化状態で提供することが求め られる。 従来では、 多分化能を保持したまま幹細胞だけを大量に増幅することは 容易ではなく、課題の一つとなっている （日野ら、実験医学、 1 9巻 1 5号増刊： 1 0、 200 1、 羊土社） 。 例えば、 造血幹細胞や神経幹細胞を生体組織から採 取し培養すると、 幹細胞だけでなく幹細胞から分化した前駆細胞や成熟細胞も同 時に増幅されるため、 臨床用途には好ましくない （阀野 榮之、 実験医学、 1 9 巻 1 5号増刊： 8 0— 90、 2 0 0 1、 羊土社） 。
本発明においては、 多分化能保持に関わる因子、 例えばマウス E S細胞では、 活性化型 S t a t 3，〇c t一 3/4、Na n o gなどの転写因子（Niwaら、 Genes Dev., 12:2048, 1998;Matsudaら、 EMBO J.， 18:4261, 1999;Niwaら、 Nature Genet. , 24:373, 2000;Mitsui ら、 Cell, 113:631, 2003 ; Chambersら、 Cell, 113:643, 2003) をコードする DNAを導入した HACベクターを作製し幹細胞へ移入することに より、 宿主染色体を変異させることなく多分化能を保持しかつ簡便に幹細胞を増 幅させるために利用することが可能である。
また、 幹細胞の分化制御においては、 関与する分子の発現量のコントロールが 重要な要素になっている。 例えば、 マウス E S細胞における上記 O c t— 3/4 による分化制御においてその発現量が生理的発現レベルを 1 00 %とした場合は 未分化状態を維持するが、 5 0 %以下の場合は栄養外胚葉に分化し、また 1 5 0 % 以上では原始内胚葉に分化する （Niwa ら、 Nature Genet., 24:373, 2000) 。 こ のような発現レベルの変化により分化を制御する場合には、 本発明の方法により 作製した HACベクターに遺伝子発現 ONZOFF誘導系 （例えばテトラサイク リンによる発現誘導系） を導入することにより、 厳密な発現量のコントロールが 可能となる。
また、 本発明の方法により作製した H ACベクターに遺伝子発現 ON/OF F 誘導系 （例えばテトラサイクリンによる発現誘導系） と分化誘導因子とを組み合 わせて導入することにより、 多分化能保持状態と分化誘導状態を切替えることが 可能である。 幹細胞による組織再生を行う場合、 移植細胞又はドナー由来の再生組織は、 長 期間 （望ましくは生涯） にわたりレシピエント個体の一部となり機能する。 それ 故にガン化などの生理的制御の逸脱をドナ一細胞に誘発する原因 （例えば遺伝子 変異） を与える操作は極力避けることが望ましい。 本 HACベクタ一は、 宿主染 色体と独立に存在できることから、 遺伝子導入を宿主染色体に変異を与えずに行 なうことができる。 また実施例 13、 14、 1 8及び 1 9に示すとおり、 ヒト細 胞中で安定に存在できることから、 長期間にわたり安定に目的分子を発現するこ とができる。
. 本発明の方法に従って、 分化させた組織で生理的に発現する遺伝子のゲノム領 域又は組織特異的発現制御領域を含むゲノム配列下に目的の遺伝子を融合した D N Aを導入した H ACベクタ一を作製し、 上記 H ACベクターを移入した幹細胞 を用いることにより、 再生した組織において生理的 Z組織特異的に目的分子を発 現することが可能である。
また、 本発明の方法により作製した HACベクターを保持する幹細胞を分化誘 導した後、 導入遺伝子の発現が必要なければ H ACベクターは不用となる場合が ある。 分化誘導後に HACベクター脱落クローンを、 方法を特に限定するもので はないが例えば選択培養における薬剤耐性を指標にして選別することにより、 不 用となった H ACベクターを排除することが可能である。
(6) 培養支持フィーダ一細胞作製用ベクター 細胞培養法の一つとして、 培養器底面に付着性細胞を敷き詰めた培養支持フィ ーダー細胞上に目的の細胞を播種し共培養する方法が知られている （日本生化学 会編、 新生化学実験講座 14発生分化老化、 1992年、 東京化学同人） 。 例えば 造血前駆細胞を増殖させる場合には、 S CF、 F l t 3 L、 TP〇、 I L— 6、 s I L- 6 Rなどの必要な因子をそれぞれ例えば組換え体タンパク質として準備 し、培養液に添加して培養する（Uedaら、 J Clin Invest.， 105:1013-1021, 2000)。 従来法により培養添加物の遺伝子を培養支持フィーダ一細胞へ導入することが可 能であるが、 宿主染色体へのランダム挿入による変異 ·ポジション効果、 発現不 活化、 多コピー発現ユニット並列による下流遺伝子発現の減弱などにより、 全て の因子について望みの発現量を制御して供給することは困難と考えられる。 本発 明の方法によりこれらの必要因子をコードする DNA全て （又は一部） を導入し た H ACベクタ一を作製し、 培養支持フィーダ一細胞へ移入することにより、 組 換え体タンパク質などを後から加えることなく単なる共培養だけで簡便に必要な 因子を全て補給することが可能である。 また、 遺伝子発現誘導系を利用すること でこれら因子のコンディショナルな発現制御が可能である。
(7) ヒト疾患治療用ベクター
ヒ卜疾患治療用のベクターは、 ウィルス性及び非ウィルス性べクタ一が従来か ら各種研究されているが、 免疫反応の惹起、 導入 DNAサイズの限界、 宿主染色 体挿入変異、 低導入効率 ·低発現効率、 発現量制御が困難 （金田 安史、 臨床免 疫、 39巻： 551— 558、 2003年、 科学評論社、 小澤 敬也編、 遺伝子 治療、 1 997年、 羊土社） など、 様々な課題が指摘されている。 いずれのべク 夕一にも共通する課題として、 「望ましい発現量を、 望ましいタイミングで制御 する」 ことが求められている。
HACベクタ一を用いた遺伝子細胞治療の戦略として、 ① 1次的に欠損してい る酵素やタンパク質の補充、 ② 2次的に減少している代謝産物を補充する対症療 法、 ③細胞に新機能を付加し、 細胞の生存を高める方法 （例えば改変細胞を用い る組織再生において、 H ACベクタ一はゲノムを導入することにより生理的 Z組 織特異的遺伝子発現制御を行なうことが可能である。 またこれにより過剰発現又 は発現不足による機能障害などの副作用を回避することができる。 ） 、 ④ Ga i n o f f u n c t i o nの形で進行する変性疾患の障害をくいとめる方法 (例えばパ一キンソン病における GDNF補充治療） などが挙げられる。
すなわち、 本 HACベクターは、 ヒト疾患治療用ベクターとして使用すること が可能であり、 治療用の外来 DNAを導入した HACベクタ一を細胞へ移入後、 その細胞を患者に'投与するための医薬組成物として調製することが可能である。 また、 かかるヒト疾患治療用ベクターは、 疾患の治療のみならず、 疾患の予防に も使用することが可能である。
適用範囲を特に限定するものではないが、 以下にヒト疾患治療用べクタ一とし ての適用例を示す。
(A) テロメラ一ゼの利用
遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、 その安全性観点か ら不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましい。 しかし正常体細胞は、 一定回数分裂すると増殖 ·分裂が止まりやがて死滅する、 すなわち老化すること が知られている （井出 利憲、 実験医学、 1 6巻 1 8号増刊： 1 8— 24、 1 9 98、 羊土社） 。 治療効果を長期間持続させるために、 治療用細胞は一定期間、 望ましくは罹患者の生涯を通して維持されることが必須である。 染色体末端に存 在する繰返し配列テロメァの修復酵素であるテロメラーゼは、 正常細胞内で過剰 発現させることにより細胞老化時に認められるテロメァ短縮を抑制し、 細胞の寿 命を延長できることが知られている （B o d n a rら、 S c i e n c e, 279 : 349 - 352, 1 998) 。 またテロメラーゼは、 細胞内で過剰発現させても 不死化又はガン化を導くものではないことが示されている （真貝 洋ー、 実験医 学、 16巻 1 8号増刊： 25— 30、 1 998、 羊土社、 Jiangら、 Nature Gent. , 21:111-114, 1999) 。 それゆえ、 本発明の方法によりヒトテロメラーゼ （hTE RT) をコードする遺伝子を HACベクター上に導入し標的となる細胞へ移入す ることにより、 H AC移入細胞の寿命を延長し、 不死化又はガン化させることな く治療効果を長期間持続させることが可能である。 また、 遺伝子発現制御を発現 誘導系やゲノム領域を利用することにより、 コンディショナル又は組織特異的/ 生理的なテロメラーゼ発現が可能である。 (B) 自己抗体生成の抑制
組換え体タンパク質製剤を開発する場合、 投与時の自己抗体 （活性中和抗体） の生成が障害となっている （L i ら、 B l o o d, 98 ： 3241 - 3248, 200 1 ) 。 患者への投与方法を特に限定するものではないが、 本発明の方法に より作製した目的タンパク質をコードするゲノムを導入した H ACベクターを、 ヒ卜細胞、 例えば産生組織の正常ヒト細胞へ移入後、 これを患者へ移植する。 該 患者において H A Cベクターから目的タンパク質を生理的/組織特異的に発現， 供給することにより、 患者における自己抗体生成の抑制が可能である。
( C ) 免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクター
再発白血病に対する治療法として、 移植片対白血病反応により移植リンパ球が 腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞として白血病細胞を攻撃することを応用したドナー リンパ球輸注療法 （Kolbら、 Blood, 76:2462, 1990) が知られている。 上記療法 の副作用として、 移植細胞がレシピエント組織を攻撃し障害を与える移植片対宿 主病が知られているが、 これに対するひとつの対処法として、 ドナーリンパ球へ のレトロウイルスによる薬剤誘導性の自殺遺伝子導入及び薬剤投与によるドナー リンパ球の除去が行われている (小野寺ら、 ゲノム医学， 3巻： 45， 2003, メディカルレヴュー社) 上記方法の場合、 ドナーリンパ球の染色体に変異を与 える危険性が残る。
本発明の方法により作製した HACベクターは、 宿主染色体に変異を与えない 免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクターとして利用することが可能で ある。 また、 抗腫瘍活性促進を目的とした治療、 例えばリンパ腫における CD4 0リガンドによる免疫活性化療法（加藤ら、 ゲノム医学， 3巻： 53， 2003, メディカルレヴュー社） など、 における遺伝子導入用ベクターとしても利用する ことが可能である
(D) モノクロナ一ル完全ヒト抗体補充
近年ヒト抗体産生マウスを利用した、 完全ヒトモノクロナール抗体医薬品の創 製が試みられている （石田ら、 B i oベンチャー、 2巻： 44、 200 2、 羊土 社、 Mori ら， Cell Death and Differentiation, in press, 2003, Proceedings of American Association for Cancer Reserach, Volume 44, 2nd Edition, July 2003, P1285, #6422) 。 しかし、 これを慢性疾患へ適用する場合には、 定期的な TP O 投与のため病院への通院が必要となり患者の Q O Lの障害となることが予測され る。 また、 組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、 その結果 として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法により作製した HACベクター上に、 目的の抗体を産生するハイ プリ ドーマから単離した目的抗体をコードするゲノム領域を導入し、 例えば患者 造血幹細胞や B細胞へ上記 H A Cベクタ一を移入後、 患者へ再移植することによ り、 完全ヒト抗体を生理的発現制御により補充 ·供給することが可能である。 ま た上記により定期的な通院治療回数を減らし患者の QOLを向上させることが可 能である。
(E) 単一遺伝性疾患における欠損補充
(E— 1 ) 血友病
血友病 Aは、 血液凝固第 8因子の変異、 血友病 Bは血液凝固第 9因子の変異が 原因となって起こる、 伴性劣性遺伝性出血疾患である。 治療法として第 8又は第 9因子濃縮製剤投与による補充療法が有効であるが、 出血後投与では重篤な合症 が生じること、 濃縮製剤への病原体混入の可能性、 反復投与による自己抗体 （活 性中和抗体） の発生、 常時出血への対処準備による患者 QOLの低下、 高額な医 療費など課題は多く、 遺伝子治療法による解決が期待されている。 従来べクタ一 による臨床遺伝子治療研究が行われているが、 十分な発現を長期間持続できず有 意な治療効果を得るに至っていない。 また、 レトロウイルス及びアデノ随伴ウイ ルス （AAV) ベクターを直接投与する臨床研究において被験者の精液中にべク 夕一遺伝子が検出され生殖細胞への遺伝子導入の危険性が指摘されている （望月 ら、 ゲノム医学， 3巻： 2 5， 200 3, メディカルレヴュー社） 。 第 8因子を コードする遺伝子は、全長ゲノムで約 1. 5Mb、 c DNAで約 7 k bにわたる。 非ウィルスベクターやアデノウイルスベクターでは、 全長 c DN Aの導入は可能 であるが発現量の低下が、 また A A Vベクターでは、 導入 DN Aサイズが約 4. 9 k b以下に限られるため全長遺伝子を導入できないことが課題となっている。 本発明の方法により血液凝固第 8因子又は第 9因子をコードする DN Aを導入 した HACベクターを作製することが可能である。 そして、 患者への投与方法を 特に限定するものではないが、上記 H ACベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、 罹患者への移植により補充することが可能である。 また、 患者への投与方法を特 に限定するものではないが、 上記血液凝固第 8因子又は第 9因子のゲノム領域を 導入した HACベクタ一を、 例えばヒト細胞へ移入後、 該細胞の罹患者への移植 により、 生理的組織特異的発現により該因子を補充することが可能である。
(E— 2) X-S C I D (X連鎖重症複合免疫不全症）
重症複合免疫不全症 （S C I D) は、 液性及び細胞性免疫が先天的に障害され る疾患である。 S C I Dの約半数が X連鎖の X_S C I Dであり、 その原因はィ ン夕ーロイキン 2ファミリ—の受容体が共有する共通ァ鎖の変異であることが知 られている。 治療法として、 造血幹細胞移植が行われているが、 液性免疫の回復 は不十分で免疫グロプリンの定期的投与が必要となる。 そこで造血幹細胞へ共通 ァ鎖を導入し移植する遺伝子細胞治療法による解決が期待されている。 1 9 9 9 年からレトロウイルスにより共通ァ鎖を導入した造血幹細胞移植の臨床研究が行 われていたが、 近年フランスにおいて移植細胞の白血病化が複数例報告された (Hacein- Bey- AMnaら、 N Engl J Med. , 348:255, 2003 ; Marshall ら、 Science, 299:320, 2003) 。 何れのケースも遺伝子導入細胞染色体中の原ガン遺伝子の一つ である L MO 2遺伝子領域にベクター配列挿入変異が認められ、 L MO 2活性化 と腫瘍化との関連が疑われている （久米ら、 ゲノム医学， 3巻： 9, 2 00 3, メディカルレヴュー社） 。
本発明の方法により共通ァ鎖をコ一ドする DN Aを導入した H ACベクターを 作製することが可能である。 そして上記 H ACベクターを遺伝子導入用ベクター に用いることにより宿主染色体へのベクター配列挿入変異の危険を回避すること が可能である。 また、 患者への投与方法を特に限定するものではないが、 上記 H ACベクターを、 ヒト細胞 （例えばヒト骨髄由来正常造血幹細胞） へ移入し、 罹 患者へ移植することにより、 生理的組織特異的発現による共通 τ鎖の欠損機能相 補を佇うことが可能である。 (E- 3) ディシェンヌ型筋ジストロフィー； DMD
ディシェンヌ型筋ジストロフィーは、 ジストロフィン遺伝子の変異によるジス トロフィンの機能欠損が原因である、 X連鎖劣性単一遺伝子性疾患の一つである (Hoffman ら、 Cell, 51:919, 1987) 。 DMDの治療は、 ジストロフィンが細胞 骨格タンパク質であるため直接投与による補充は不可能であり、 遺伝子治療法が 期待されている。
ジストロフィン遺伝子は、 全長ゲノムで約 2. 3Mb、 c DNAで 1 4 k bに わたる。 非ウィルスベクターやアデノウイルスベクタ一では、 全長 c DNAの導 入は可能であるが発現量の低下が課題となっている （Liuら、 Mol. Ther. , 4:45, 2001;DelloRussoら， Proc Natl Acad Sci USA, 97:12979, 2002) 。 また AAVベ クタ一では、 導入 DNAサイズが約 4. 9 k b以下に限られるため全長遺伝子を 導入できず、 また骨格筋への遺伝子導入実験において免疫反応が引き起こされ導 入遺伝子産物の発現低下が認められた（Yuasaら、 Gene Therapy, 9:1576, 2002)、 などの課題が存在する。
遍在的な発現を誘導する CMVプロモータ一制御下にジストロフィンミニ遺伝 子を導入した AAVベクタ一による骨格筋への遺伝子導入実験においては、 免疫 反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められたが、 プロモーターと して骨格筋特異的な MCKプロモータ一を使用することにより上記免疫応答が改 善された （Yuasa ら、 Gene Ther. , 9:1576, 2002) 。 このことから、 ジストロフ ィンの発現には生理的組織特異的発現が必要であることが示唆される。
本発明の方法によりジストロフィンをコードするゲノム領域を導入した HAC ベクターを作製することが可能である。 そして、 患者への投与方法を特に限定す るものではないが、 上記 HACベクターを、 ヒト細胞 （特に限定するものではな いが例えば自家ヒト正常筋芽細胞） へ移入し、 罹患者へ移植することにより、 生 理的組織特異的発現によるジストロフィン補充を行うことが可能である。
(E-4) 適用対象疾患を特に限定するものではないが、 例えば以下に示す単 一性遺伝子疾患； ひ一 1アンチトリプシン欠損症、 嚢胞性繊維症 （CFTR) 、 慢性肉芽腫症、 家族性高コレステロール症、 ファンコ一二貧血、 ゴ一シェ病、 ハ ン夕ー症候群、 オル二チントランス力ルバミラ一ゼ欠損症、 プリンヌクレオチド ホスホリラ一ゼ欠損症、 ADA— SC I D、 白血球接着欠損症、 Can a v an 病、 脳梁萎縮、 フアブリ一病、 筋萎縮性側索硬化症などにおいて、 本発明の方法 により原因遺伝子を導入した HACベクターを作製し、 患者への投与方法を特に 限定するものではないが、 例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによつ て、 欠損分子の補充 ·相補を行うことが可能である。 なお、 疾患原因遺伝子情報 については、 米国 National Center for Biotechnology Information (NCB I) のオンライン文献データベース P u b M e d (http://www. ncbi. nlm. ni . gov/ entrez/query. fcgi?db=PubMed) 又は OMIM™ - Online Mendel ian Inheritance in Man™ (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi?db=OMIM) を参照され たい。
(F) その他疾患
(F- 1 ) トロンボポイエチン （Thrombopoietin； TPO) は、 血小板産生制 御及び造血幹 Z前駆細胞の増殖を担う因子であり、 例えば再生不良性貧血などの 血液疾患、 化学療法後の造血回復などへの適用が期待されている。 しかし、 TP 0組換え体タンパク質投与時の活性中和抗体生成が医薬品開発の障害となってい る （L iら、 B l ood, 98 : 3241— 3248， 2001) 。 従って、 T P〇を慢性疾患へ適用する場合には、 定期的な TP 0投与のため病院への通院が 必要となり患者の QOLの障害となることが予測される。 また、 組換え体タンパ ク質製剤の製造には多大なコストがかかり、 その結果として高額な医療費負担が 生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法により TPOゲノムを導入した HACベクタ一を作製し、 患者へ の投与方法を特に限定するものではないが、 ヒト細胞、 例えば産生組織の細胞、 へ移入し、 生理的 Z組織特異的に TPOを発現 ·供給することにより、 自己抗体 生成を抑制することが可能である。 また上記により定期的な通院治療回数を減ら し、 患者の QOLを向上させることが可能である。
(F- 2) エリスロポイエチン （Erythropoietin； E PO) は、 赤血球増殖因 子であり、 例えば糖尿病ゃ腎疾患における腎性貧血などの治療薬として市販され ている。 慢性疾患 （例えば糖尿病による腎性貧血など） では定期的な EPO投与 のため病院への通院が必要であり患者の QOLの障害となっている。 また、 組換 え体タンパク質製剤の製造には多大なコス卜がかかり、 その結果として高額な医 療費負担が生じることも課題の一つとなっている。 本発明の実施例 14に示した ように、 EPO c DNA導入した HACベクタ一をヒト正常繊維芽細胞へ移入 し患者へ移植することにより、 該患者において EPOを発現 ·供給することが可 能である。 また、 本発明の方法により、 EPOゲノム領域を導入した HACべク 夕一を作製し、 患者への投与方法を特に限定するものではないが、 ヒト細胞、 例 えば産生組織の細胞、 へ移入し、 生理的 Z組織特異的に EPOを発現，供給する ことが可能である。 また上記により定期的な通院治療回数を減らし、 患者の QO Lを向上させることが可能である。 (F— 3) パーキンソン病
パーキンソン病は、 中脳黒質緻密部ドーパミン合成細胞の進行性の変性脱落に より運動機能が障害される神経疾患である。 治療法の一つとして、 欠損したドー パミン補充を目的とした L一 DO P A投与法があるが、 中等以上の症状では薬効 が減弱することや副作用による患者の QOL制限 ·投与量減少などの課題が存在 する。 これら課題は、 ドーパミン濃度が線状体内で一定しないこと及び投与した L-DOP Aが線状体以外で作用することに起因するため、 線状体での一定した ドーパミンの生理的発現が求められる （武田ら、 メディカルサイエンスダイジェ スト、 29卷： 20、 2003年、 ニュー ·サイエンス社） 。 現在、 ドーパミン 合成に関わる酵素 3種類を各々導入した A A Vベクターによる遺伝子治療研究が なされているが、 いずれも生理的発現制御を行うまでには至っていない。 また、 ドーパミン合成細胞の変性脱落抑制を目的とした治療法に GDNF (Grial-cell Derived Neuronal Factor) 投与があるが、 被殻下にカテーテル留置による持続投 与で効果が認められた （Gill ら、 Nature Med., 9:589, 2003) 一方で感染の危険 性や患者の Q〇 L制限などが課題となっている。 A A Vベクターによる遺伝子治 療研究により動物モデルで効果が示された （Wangら、 Gene Ther., 9:381, 2002) が、 こちらも生理的発現制御を行うまでには至っていない。
本発明の方法により、 ドーパミン合成に関わる酵素群又は GDNFゲノム領域 を導入した HACベクターを作製することが可能である。 そして、 患者への投与 方法を特に限定するものではないが、 上記 H ACベクタ一を、 ヒト細胞 （例えば ヒト正常神経幹 Z前駆細胞） へ移入し、 罹患者へ移植することにより、 生理的組 織特異的発現による導入遺伝子産物の補充が可能である。 (F-4) 糖尿病
インスリン依存型糖尿病において、 組換え体タンパク質製剤投与による治療が 行われている。 慢性疾患では定期的な投与のため病院への通院が必要であり、 患 者の QOLの障害となっている。 また、 組換え体タンパク質製剤の製造には多大 なコス卜がかかり、 その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つ となっている。 インスリンの血中濃度は至適範囲がせまいため、 多すぎても少な すぎても副作用が生じ、 時には生命の危険に至る場合がある。 また、 遺伝子治療 の研究がなされているが、 体内におけるィンスリン濃度のコントロールが課題と なっている （森谷ら、 蛋白質 核酸 酵素、 40巻： 2764、 1995、 共立 出版） 。
本発明の方法によりインスリンゲノムを導入した HACベクターを作製し、 患 者への投与方法を特に限定するものではないが、 ヒ卜細胞、 例えば産生組織の細 胞、 へ移入し、 生理的 Z組織特異的に発現 ·供給することが可能である。 また上 記により定期的な通院治療回数を減らし患者の Q〇Lを向上させることが可能で める。
(F— 5) 適用対象疾患を特に限定するものではないが、 例えば脳腫瘍、 末梢 動脈疾患（虚血など）、慢性間接リュウマチ、動脈再狭窄、肘部トンネル症候群、 冠動脈疾患、 アルツハイマー病、 潰瘍、 骨盤骨折、 腎疾患、 悪性腫瘍、 などにお いて、 本発明の方法に従って、 疾患治癒に必要と考えられる物質をコードする遺 伝子を導入した H ACベクターを作製し、 患者への投与方法を特に限定するもの ではないが、 例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、 欠損分子 の補充 ·相補を行うことが可能である。 実施例
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実 施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 ヒト 2 1番染色体長腕遠位の削除による HACベクターの作製 (1) テロメァ短縮のためのコンストラクト構築
ヒト 2 1番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメァ卜ランケーシヨンべク ター（ターゲティングベクター）は、 PB S— TELZPu r o (Kuroiwa, Nucleic Acids Res. , 26:3447, 1998) を用いた。 G e n B a n kデ一夕べ一スより得たヒ ト 21番染色体長腕遠位の塩基配列 （登録番号 AL 163204) から、 テロメ アトランケーシヨンベクター挿入の標的配列を設計した。 これを PC R増幅する ための、 制限酵素 B amH Iの認識配列を付加したプライマ一オリゴヌクレオチ ドの配列を以下に示す：
#21telFl： 5'- CGCGGATCCAGAGAGAGCCTGGAATGCCTGGTAGTGT (配列番号 1 ) #21telRl： 5'- CGCGGATCCCCAGTGCCCTGAGATCTTGTGATTTCTC (配列番号 2 ) ヒト 2 1番染色体を保持する DT 40雑種細胞は、 同染色体を保持するマウス A9雑種細胞 (Shinohara, Hum Mo 1 Genet, 10: 1163, 2001) を染色体供与細胞 としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞である DT 40は Japanese Collection of Research Bioresources (J CRB) に登録番号 J C R B 2 2 2 1 として登録されており、 入手可能である。 以下に調製法の概略を記す。
はじめに約 1 X 1 08個の A 9 (# 2 1 n e o) 細胞からミクロセルを調製し た。 2 5 cm2遠心用フラスコ （コース夕一） 1 2本に細胞密度が 6 0〜 7 0 % 飽和程度まで培養した A9 (# 2 1 n e o) 細胞をコルセミド （0. 0 5 x gZ m l , デメコルシン， 和光純薬) を含む培養液 （1 0 % C S, 0. 0 5 g/m 1 G4 1 8, DMEM) 中で 7 2時間培養して微小核を誘導した。 実施例におい て、 DMEMはインビトロジェン製のものを用いた。 培地を除いた後、 予め保温 (34°C) しておいたサイ卜カラシン B (DMEM中に 1 0 g/m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、ァクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、 34で， 8 0 0 0 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （D MEM, シグマ） に懸濁して回収し、 フィルタ一で濾過して精製した。 精製した ミ ク ロ セル は 1 0 a g / m 1 の フ ィ ト ヘム ァ グルチニ ン P (Phytohemaggulutinin-P, シグマ） を含む DMEM4m 1に再懸濁した。 DT4 0細胞は、 50 gZm 1のポリ Lリジン （Poly_L_Lysine, シグマ） でコ一ティ ングした 6穴クラスタ一 （ヌンク） の 2穴に 1 X 1 08個を播種した後 1時間静 置し、 あらかじめ底面に付着させておく。 これにミクロセル懸濁液を加え 3分間 静置したのち上清を除き、 5 0 % (w/v)ポリエチレングリコール 1 50 0 (□ ッシュダイァグノステイクス） で 1分間処理した。 融合細胞を無血清 DMEM 1 2 m lに懸濁し、 6穴プレートの 4穴に播いて 24時間培養した後、 1. 5 β g 7：011の 41 8を含む培地で約 2週間選択培養し、 出現した薬剤耐性のコロニ 一を単離した。
上記 DT40雑種細胞を培養し、細胞から Puregene DNA Isolation kit (Gentra System社） を用いてゲノム DNAを抽出した。 このゲノム D N Aを鍀型とし、 上 記のプライマ一を用いて組換えの標的配列を P C R法により増幅した。 铸型とし て約 0. 1 gのゲノム DNAを使用し、 Innisら （PCR実験マニュアル， HBJ 出版局， 1991) に従い、 サ一マルサイクラ一は GeneAmp9700 (Appl ied Biosystems 社） を使用して P CRを行った。 Taaポリメラ一ゼは LA Tad (宝酒造） を用い、 反応条件は、 95°C 2分の後、 変性 9 5。C 30秒、 ァニーリング /伸長 68 °C 6 分を 35サイクル行った。 増幅産物を制限酵素 B amH I (二ツボンジーン） で 消化して、 突出末端をもつ約 5 k bの DN A断片をァガロースゲル電気泳動によ り分離し、 精製した。 これを P B S— TEL/P u r oプラスミドの B amH I サイトにクローニングした。 最終的な PB S—TELZPu r oコンストラクト のサイズは約 10. 6 kbである。 テロメアトランケ一シヨンべクタ一、 標的配 列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 1に示した。
(2) トランスフエクション及び p u r o耐性クローンの単離
PB S— TELZPu r oコンストラクトを制限酵素 E c o R I消化により線 状化 DNAとし、 ヒト 21番染色体を保持する DT40雑種細胞に導入した。 D T 40雑種細胞 1 X 1 07を 0. 75m 1の P B Sに懸濁し、 25 i g DNA存 在下でジーンパルサー （バイオラッド） を用いてエレク卜ロボレ一ションを行つ た。 容量 25 μ Fのコンデンサに 750 Vで印加し電極間距離 4 mmのエレクト ロボレ一ションセルを用いて放電した。 エレクト口ポレーションした細胞を、 1 0 %牛胎仔血清 （FB S) 、 1 %ニヮトリ血清 （Ch S) 及び 50 2—メル カプトエタノールを添加した DMEM培地 (ィンピトロジェン製) に懸濁し、 9 6穴クラス夕一 （ファルコン） 2枚に播種した。 2日後に終濃度 0. 3 z g/m 1となるようピュー口マイシン（Puromycin dihydrochloride,シグマ）を加えた。 2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、 その頻度は DT40雑種細胞 1 X 10 7あたり平均 1 7. 8個であった。 20回のトランスフエクシヨンから合計 3 5 6の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。 (3) 相同組換え体の選別とテロメァ短縮の確認
(3 - 1) P CR解析
ピューロマイシン耐性株ゲノム DN Aを铸型としてヒト 2 1番染色体上に存在 する遺伝子及び S T Sマ一カー （D 2 1 S 26 5, CBR, S I M 2 , D 2 1 S 26 8, D 2 1 S 26 6, D 2 1 S 1 2 5 9)の存在を P C R法により検出した。 これらの S T Sマーカーのプライマーオリゴヌクレオチドの配列は米国 National Center for Biotechnology Information のオンライン 5—夕べ一ス UniSTS (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/auery. icgi?db=unists) におレ て 閲覧可能である。 上記 6種の STSマーカーの登録番号は順に Un i STS ： 7 6 2 2 3, 45 64 1 , 541 24, 2 2 6 2 5, 542 66, 5 3 746であ る。 その他に Ge nB a n kデータベースより入手した塩基配列をもとに設計し た遺伝子プライマ一オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
PRED65F： 5'- GCCTGGCATCTTCCTCAATA (配列番号 3 )
PRED65R： 5'- TTGCATGCCTGTGGTACTGT (配列番号 4)
PRED3F： 5'- TCACAATCATGGGCTTTGAA (配列番号 5 )
PRED3R： 5'- CACGCAACCATTTGTTCATT (配列番号 6 ) 約 0. 1 gのゲノム DNAを铸型として、 はじめに上記 8種のうち相同組換 えによる切断部位の近位に位置する PRED 3遺伝子と、 遠位に位置する D 2 1 S 2 6 5マ一カー及び D 2 1 S 2 6 6マーカーの計 3種について P C R増幅 (Innis ら， 前記) を行った。 テロメアトランケ一シヨンにより長腕遠位が削除 された場合、 P RED 3遗伝子を保持し D 2 1 S 2 6 5マ一カー及び D 2 1 S 2 66マーカ一を保持しないことが予想される。 耐性 3 54クローンのうち 24ク ローンにおいて予想される増幅結果が得られた。 これら 24クローンについては 残る 7種のマーカーによる P CR増幅を行い、 ヒト 2 1番染色体の保持領域を確 認した。 以上の代表的な結果を図 2に示す。 図 2には、 左側にヒト 2 1番染色体 の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図を、 またマ一カーについてはどのバン ドに位置するかを示した。 3種のピューロマイシン耐性 DT 40株について、 P CRにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは園で、 検出されなかった マーカ一を口で示した。 DT 40 (# 2 1) は、 テロメアトランケーシヨンを行 う前の細胞である。 (3 - 2) サザンブロット解析
相同組換えの標的配列内にプローブを設定した （図 1) 。 プローブは以下に示 すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、 ヒト 2 1番染色体を保持する DT 4 0雑種細胞のゲノム DNAを铸型として P CRにより増幅し、 その後 PCR増幅 断片を単離及び精製した。
#21atelF： 5， 一 TCACAGCCAGCAGAGGATTC (配列番号 7 )
#2lQtelR： 5' ― CACCTGCACAATGGCTCAAC (配列番号 8 )
1次スクリーニングで得た 24クローンから抽出したゲノム DN A約 1 0 ti g を制限酵素 Kp n l (宝酒造） により消化し、 Ausubel ら （Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンブ ロッ 1、解析を行った。 32 Pにより標識したプローブがハイブリダィズしたシグナ ルを、 イメージアナライザ一 B AS 200 0 (富士写真フィルム) により検出し た。 代表的な結果を図 3に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同 組換え体で 1 3. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 9. O k bであり、 候補クロ ーン 24のうち、 2クローンが相同組換え体であることを確認した。
( 3 - 3 ) 蛍光 i n s i t uハイブリダイゼーシヨン (F I SH)
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1994) に記さ れた方法に従い、ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ B RL)を用いて行った。 その結果、 観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト 2 1番染色体が検出 された。 代表的な F I SH像を図 4 a及び bに示す。 図 4 aにおいて白矢印はテ ロメアトランケ一ションを行う前の全長のヒト 2 1番染色体を、 図 4 bにおいて 白矢印は長腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体断片を示している。 宿主である D T40細胞の染色体との相対的な大きさから、 ヒト 2 1番染色体が短縮したこと が確認された。
以上の実験より、 得られたピューロマイシン耐性の 2株が長腕削除により短縮 したヒト 2 1番染色体を保持することが確かめられた。
〔実施例 2〕 HACベクタ一におけるヒト 2 1番染色体長腕近位への 1 ο χΡ配 列の挿入
(1) 1 ο X Ρ挿入のためのコンストラクト構築
実施例 1で作製したヒト人工染色体 （HAC) に 1 ο X Ρ配列を挿入するため の基本プラスミドには、 p S F l (ライフテック） を用いた。 L o x P挿入部位 であるヒト 2 1番染色体長腕近位の塩基配列は G e n B a n kデータベースより 得た （登録番号 AL 1 6 3 20 3) 。 相同組換えの 2つの標的配列の増幅に用い たプライマ一オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
#21 EcoF： 5'- CCGGAATTCCTCTGGGTTTCTGGTGAAGC (配列番号 9 )
#21qEcoR： 5'- CCGGAATTCTGTAGATCCTGCCATTGTGG (配列番号 1 0 )
#21 BaF： 5'- CGCGGATCCTTGGCTCCAAAAGGTACCAC (配列番号 1 1)
#21qBaR： 5'- CGCGGATCCCTATCCTCGCCACTGTGTCC (配列番号 1 2) ヒト 2 1番染色体を保持する DT40雑種細胞から抽出したゲノム DNAを铸 型として 2つの標的配列を P CRにより増幅した。 それぞれを制限酵素 E c o R I (二ツボンジーン) ないし B amH I (二ツボンジーン) で消化して、 突出末 端をもつ約 3 k bの DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分離し、 精製し た。 これらを p S F 1プラスミドの E c o R Iないし B amH Iサイ トにクロ一 ニングした。 相同組換え体の選別に用いるブラストサイジン耐性遺伝子は、 P C MV/B s d (インビトロジェン） より制限酵素 Xh o I (二ツボンジーン） 及 び S a i l (二ツボンジーン） 消化により約 1. 3 k bの断片として切り出し、 上記 p S F 1コンス卜ラク卜の Xh o Iサイ卜にクロ一ニングした。
最終的な p S F 1コンストラクトのサイズは約 1 2. 4 k bである。 夕一ゲテ イングべクタ一、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 5に 示した。
(2) トランスフエクシヨン及び b s r耐性クローンの単離
p S F 1コンストラクトを制限酵素 Ap a I (二ツボンジーン） 消化により線 状化し、 長腕遠位を削除したヒト 21番染色体を保持する DT40株 （DT40 (# 2 1) p u r o— 339) に導入した。 DT40雑種細胞を 1 X 107を 0. 75m 1の P B Sに懸濁し、 1 0 /i g D N A存在下でジ一ンパルサー（バイオラ ッド） を用いてエレクト口ポレーシヨンを行った。 容量 25 Fのコンデンサに 750 Vで印加し、 電極間距離 4mmのエレクトロボレ一シヨンセルを用いて放 電した。 エレクトロボレ一シヨンした細胞を 1 0 %牛胎仔血清 （FB S) 、 1 % ニヮ卜リ血清 （C h S) 、 5 0 M 2—メルカプトエタノールを添加した D ME M培地 (インビトロジェン製) に懸濁し、 96穴クラスタ一 (ファルコン) 3枚 に播種した。 2 日後に終濃度 8 x g/m l となるようブラス トサイジン (Blasticidin S Hydrochloride, フナコシ） を加えた。 2〜 3週間後には耐性コ ロニーが出現し、 その頻度は DT40雑種細胞 1 X 1 07あたり平均 5. 8個で あった。 14回のトランスフエクションで得た計 82のコロニーを単離して増殖 させ、 以後の解析を行った。 (3) 相同組み換え体の選別
(3 - 1 ) サザンブロッ卜解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行 つた。 相同組換えの標的配列の外側にプローブを設定した。 プローブは次に記す オリゴヌクレオチドプライマー対を用い、 ヒト 21番染色体を保持する DT 40 雑種細胞のゲノム DNAを铸型として P CRにより増幅、 単離、 精製した。
21L0X4869F： 5'- GTTGCAGAAAAGTAGACTGTAGCAA (配列番号 1 3)
21LOX5682R： 5'- TCTAAGGAACAAATCTAGGTCATGG (配列番号 14) ブラストサイジン耐性クローンから抽出したゲノム DNA約 1 0 gを制限酵 素 Xb a l (二ツボンジーン） により消化し、 サザンプロット解析を行った （図 6 A及び B) 。 プローブは32 Pにより標識し、 シグナルはイメージアナライザー B AS 2 0 0 0 (富士写真フィルム） により検出した。 図 6 Aにおいて左から 1 番目のレーンは 1 o X Pサイトを導入する前のヒト 2 1番染色体を保持する DT 4 0株、 2番目のレーンは宿主の DT 4 0細胞株、 3番目以降のレーンはブラス 卜サイジン耐性 DT 4 0株を示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は相 同組換え体で 7. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 8. 5 k bであり、 ブラスト サイジン耐性株 8 2から合計 3クローン （# 6 0， # 7 8， # 7 9) の相同組換 え体を見出した。
(3 - 2) P CR解析
左右 2つの標的配列 （図 5中、 それぞれ A及び Bで示す） に対し、 これらを夾 んで染色体上とターゲティングべク夕一上にそれぞれォリゴヌクレオチドプライ マー対を設計した。 その位置は図 5中に矢印で示した。 その配列を以下に示す： Left455F： 5'- GGGCTAGCCATTAAAGCTGA (配列番号 1 5)
Left638R： 5'- AAAGGGAATAAGGGCGACAC (配列番号 1 6)
Right958F： 5'- GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTA (配列番号 1 7)
Rightll52R： 5'- GTCAATTCACTAATTCCTATTCCCAGT (配列番号 1 8) サザンブロット解析により見出した候補クローンからゲノム DNAを抽出して P CRを行い、 塩基配列から予想されるサイズ （左側 （A) 3， 2 8 3 b p及び 右側 （B) 3 , 1 1 4 b p) の増幅産物を与えることを確認した。 結果を図 6 B に示す。
以上の （1 ) 〜 (3 ) の実験により、 得られたブラストサイジン耐性 DT 4 0 細胞 8 2株のうち 3株が、 相同組換えにより 1 o x P配列が挿入されたヒト 2 1 番染色体部分断片 （HACベクター） を保持することが確かめられた。 〔実施例 3〕 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一のハムスター細胞株への移入
( 1 ) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 1及び 2で得られた、 長腕遠位を削除して 1 o X P配列を挿入したヒ卜 2 1番染色体に基づく HACベクターを保持する DT 4 0細胞 （DT 4 0 (# 2 1 ) b s d— 7 9) を用いた。 染色体受容細胞としては チャイニーズハムスター由来細胞株 CH〇_K 1 (ATC Cより入手， 登録番号 J CRB 9 0 1 8) を用いた。
はじめに約 1 09個の DT 4 0 (# 2 1 ) b s d— 7 9細胞からミクロセルを 調製した。 細胞密度が 6 0〜7 0 %飽和程度まで培養した DT 4 0 (# 2 1 ) b s d— 7 9細胞をコルセミド （0. 0 7 5 /X gZm 1 , デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液（ 1 0 % F B S, l C h S, 5 0 xM 2一メルカプトエタノール， DMEM) 中で 1 2〜1 5時間培養して微小核を誘導した。 遠心分離により細胞 を回収して無血清 DMEMに再懸濁し、 予めポリ L—リジンでコ一ティングした 2 5 c m 2遠心用フラスコ (コースター） 1 2本に藩種した。 3 7°C 1時間静置 することで細胞が付着したのち培養液を除去し、 予め保温 （3 7°C) しておいた サイ 卜カラシン B (DMEM中に 1 0 a g /m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラス コに満たし、 アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、 3 4°C、 8 , 0 0 O r pm、 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁 して回収し、 フィル夕一で濾過して精製した。 CH〇_K 1細胞を 8 0 %飽和の 状態まで培養した 6 cm径ディッシュに精製した微小核細胞を加え P E G溶液で 融合した。 4 8時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、 ブラストサイジン (8 g/m 1 ) を含む選択培地 （1 0 % F B S, F 1 2) で培養した。 約 2週 間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。 1 2回の微小核細胞融合から計 4株のプラストサイジン耐性 CHO株を得た。
(2) 移入染色体の確認
(2 - 1 ) P CR法
移入染色体の確認を P CR法により行った。 ヒト 2 1番染色体長腕近位のマー カー PR ED 65及び PR ED 3遺伝子 （実施例 1の （3) 参照） の検出を試み た。 ブラストサイジン耐性の CHO細胞 4株のすべてにおいて、 2種のマーカ一 配列の増幅を確認した。 (2 - 2) 蛍光 i n s i t uハイブリダイゼーシヨン （F I SH)
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコ一ル， 秀潤社， 1994) に記さ れた方法に従い、ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BR L)を用いて行った。 ブラス 1、サイジン耐性の CHO株のうちの 2株 (CHO (# 2 1) b s d 79 - 1及び CHO (# 21) b s d 79 - 3) について解析したところ、 いずれも観 察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒ卜 21番染色体が検出された。 代表 的な F I SH像を図 7 a及び bに示す。 図 7 aにおいてテロメァトランケーショ ンを行う前の全長のヒト 2 1番染色体を、 図 7 bは長腕遠位を削除したヒト 2 1 番染色体断片を示している。 宿主である CHO細胞の染色体との相対的な大きさ から、 短縮したヒト 21番染色体が CHO細胞に移入されたことが確認された。 以上の (1) 及び （2) の実験から、 得られたブラストサイジン耐性 CHO株 は長腕遠位を削除し 1 o xP配列を挿入したヒト 21番染色体部分断片 （HAC ベクタ一） を保持することが確かめられた。
〔実施例 4〕 ヒト 21番染色体由来 HACベクタ一のヒト細胞株への移入、 及び ヒト 21番染色体由来 HACベクターの培養細胞における安定性の確認
(1) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 3で得られた、 長腕遠位を削除して 1 o xP配 列を揷入したヒト 2 1番染色体に基づく HACベクタ一を保持する CHO細胞 (CHO (# 21) b s d- 79 - 1 ) を用いた。 染色体受容細胞としてはヒト 線維肉腫細胞株 HT 1 080 (ATCCより入手， 登録番号 CCL— 1 2 1) を 用いた。 はじめに約 107個の CHO (# 2 1) b s d— 79— 1細胞からミク ロセルを調製した。 すなわち、 25 cm2遠心用フラスコ （コ一スター） 6本に 細胞密度が 60〜70 %飽和程度まで培養した CHO (# 21) b s d— 79— 1細胞をコルセミド (0. 075 i g/m l , デメコルシン， 和光純薬) を含む 培養液 （10 %FB S, 8 gZm 1プラストサイジン， F 1 2) 中で 48時間 培養して微小核を誘導した。 培地を除いた後、 予め保温 （37°C) しておいたサ イトカラシン B (DMEM中に 10 g/m 1， シグマ） 溶液を遠心用フラスコ に満たし、 アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、 34°C, 8, 000 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁し て回収し、 フィル夕一で濾過して精製した。 HT 1 080細胞を 80 %飽和の状 態まで培養した 6 cm径ディッシュに精製した微小核細胞を加え PEG溶液で融 合した。 48時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、ブラストサイジン（8 n g/m 1 ) を含む選択培地 （10%CS ， DMEM) で培養した。 約 2週間の 選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行った。 2 回の微小核細胞融合から計 1 2のプラス卜サイジン耐性 HT 1080株を得た。
(2) 移入染色体の確認
(2 - 1 ) P C R法
移入染色体は， ブラストサイジン耐性遺伝子の PC R増幅により確認した。 用 いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を次に示す。
Bsd2687F： 5'- CAACAGCATCCCCATCTCTG (配列番号 19)
Bsd2891R： 5'- GCTCAAGATGCCCCTGTTCT (配列番号 20)
ブラストサイジン耐性の HT 1080細胞 1 2株のすべてににおいて、 耐性遺 伝子配列の増幅を確認した。
(2 - 2) 染色体解析
染色体解析は、 黒木ら （細胞工学ハンドブック， 羊土社， 1 992 ) に記され た方法に従い、 ギムザ染色により行った。 ブラストサイジン耐性の HT 1 080 株のうち 4株 （HT 1 080 (# 21) b s d 79 - l - 3, 6， 1 1, 14) について約 20の分裂中期染色体像を解析した。 ブラストサイジン耐性株では、 親株の HT 1 080には認められず、 内在の 2 1番染色体よりサイズの小さいミ 二染色体が観察された。 以上の (1) 及び (2) の実験から、 得られたブラストサイジン耐性 HT 1 0 80株は長腕遠位を削除し 1 o X P配列を挿入したヒ卜 2 1番染色体部分断片 (H ACベクター） を保持することが確かめられた。
(3) 非選択培養条件下での長期継代培養
長腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体の培養細胞における安定性を確認するた めに、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 用いたのは先に記載したニヮトリ 細胞株 （DT40 (# 2 1) b s d— 79) 、 ヒト細胞株 （HT 1080 (# 2 1) b s d 79 - 1 - 3 , 6， 1 1, 14) である。 ニヮトリ細胞株用の非選択 培養液は 1 0 %FB S, 1 % C h S , 50 M 2—メルカプトエタノールを加え た DMEMであり、 選択培養液はこれにブラストサイジン 8 gZm 1 (DT4 0 (# 2 1) b s d— 79の場合） を添加した。 ヒト細胞株用の非選択培養液は 1 0 %C Sを加えた DMEMであり、 選択培養液はこれにブラストサイジン 4 g/m 1を添加した。 ニヮトリ細胞株は 1. 5 X 1 07細胞を 1 0 c m径ディッ シュに播種し、 1日後に細胞を計数して再び 1. 5 X 1 07細胞を 1 0 cm径デ イツシュに播種した。 ヒト細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 cm径ディッシュ に播種し、 3日後に細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05細胞を 10 cm径デイツ シュに播種した。 ニヮトリ細胞株は培養開始から 21日、 42日、 63日、 84 日、 1 05日及び 1 26日後に、 ヒト細胞株は 10日及び 20日後にそれぞれ細 胞を回収し、 染色体標本を作製した。
(4) 染色体解析
ニヮトリ細胞における人工染色体の検出は、 松原ら （F I SH実験プロトコ一 ル， 秀潤社， 1 994) に記された方法に従い、 ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギ ブコ BRL) を用いた F I SH法により行った。 間期核 500個においてヒト染 色体を有無を観察し、保持率を算出した。ヒト細胞における人工染色体の検出は、 黒木ら （細胞工学ハンドブック， 羊土社， 1 992) に記された方法に従いギム ザ染色法により行った。 分裂中期染色体像 20個においてミニ染色体の有無を観 察して保持率を算出し、 4クローンの平均値を出した。 その結果を表 1に示す。 表 1: #21AqHACの安定性
Figure imgf000063_0001
ヒト 21番染色体部分断片は、 D T 40細胞内では非選択培養条件下で分裂回 数 200回を越えても安定に保持されていた。 また分裂中期の染色体像 1 00個 を観察して細胞あたりのヒト染色体数を数えたところ、 例外なく 1本が認められ た。一方 HT 1080細胞株の培養は継続中であるが、 現時点 （分裂回数 22回） ではヒ卜 2 1番染色体部分断片は選択培養条件で安定に保持されている。 また分 裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2本の染色体部分が認 められた。 以上の （3) 及び （4) の実験により、 ヒト 2 1番染色体の長腕遠位を削除し た部分断片は DT 40細胞株及び HT 1 080細胞株において非選択培養条件で 安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明ら かとなつた。 〔実施例 5〕 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターへの GF P遺伝子揷入 図 8に、 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターへ GF P遺伝子を挿入する方法 を示した。 実施例 1〜4に記載のように、 テロメアトランケーシヨンにより長腕 遠位を削除し、 長腕近位に 1 o xPサイトを導入したヒト 21番染色体由来 H A Cベクターを用意した。 一方で 1 o x P配列を含む GF P発現プラスミドを準備 し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させることで 1 o x P配列間の部位特異的 組換え反応により人工染色体に挿入することとした。 組換え挿入体の選別は、 G 4 1 8耐性の獲得 （プロモーター分断型の n e o遺伝子発現ュニットの再構成） を指標とした。
( 1 ) 1 o x P配列を含む GF P発現プラスミドの構築
GF P発現べクタ一 P EGF P— C 1 (クロンテック） を制限酵素 Gb L I I 及び B amH I (二ツボンジーン） で消化して 4. 7 k bの D N A断片を単離/ 精製し、 DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造） により自己環状化した。 大腸菌 DH 5 αの形質転換により組換えプラスミドを単離し、 マルチクローニングサイト内 の Gb L I Iから B amH Iまでの 5 1 b pを欠失したプラスミド （P EGF P — C I A) を得た。 この P EGF P— C 1△を铸型とし、 EGF P遺伝子の発現 ュニッ卜を P CRにより増幅した。
G e n B a n kのデータベースより入手した塩基配列 （ァクセッション番号 U 5 5 7 6 3)をもとに作製したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す: EcoGFP5： 5' 一 GGCCGAATTCCGTATTACCGCCATGCAT (配列番号 2 1 )
BamGFP3： 5' 一 CCGGGATCCCACAACTAGAATGCAGTG (配列番号 2 2) 増幅した EG F P遺伝子の発現ュニットの両端を制限酵素 E c o R I及び B a mH I (二ツボンジーン） で消化して突出末端とし、 1 o X P配列と h C M Vプ 口モーターを備えたプラスミドベクタ一 P B S 2 2 6 (ライフテック） の E c o R I /B amH Iサイ卜にクローニングした。 (2) トランスフエクション及び G 4 1 8耐性クローンの単離
実施例 3で作製したヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを保持する CHO細 胞 ( C H〇 (# 2 1 ) b s d 7 9 - 1 ) をトリプシン処理し、 5 X 1 06細胞を 0. 8m 1のリン酸バッファー （P B S) に懸濁した。 1 0 i gの P B S 2 2 6 ZEGFPプラスミドと 20 gの C r e酵素発現ベクター P B S 1 85 (ライ フテック) 存在下でジーンパルサー (バイオラッド) を用いてエレクト口ポレー シヨンを行った。 容量 25 Fのコンデンサに 7 50 Vで印加し電極間距離 4m mのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。 エレクト口ポレーシヨンし た細胞を 10 %牛胎児血清 （FBS) を添加したイーグル F 1 2培地 （以下 F 1 2という ；ィンビトロジェン製） を含む 10 Omm組織培養用プラスチックシャ —レ （ファルコン） 1 0枚に播種した。 2日後に 800 g/m 1の G 41 8 (GENETICIN, シグマ） 8 n g /m 1 のブラストサイジン (Blasticidin S Hydrochloride, フナコシ） を含む培地と置き換えた。 2〜 3週間後には耐性コロ ニーが出現し、 その頻度は CHO細胞 5 X 1 06あたり 20個であった。 コロニ 一を単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(3) ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一に挿入された GFP遺伝子の発現 単離した G 41 8Zブラストサイジン耐性 CHO株を蛍光顕微鏡下で観察した。 その結果 1 9クローンで GFPの発現が確認された。 代表的な蛍光顕微鏡像を図 9に示す。
(4) 相同組換え体の確認
相同組換え体を確認するため、 サザンプロット解析を行った。 サザンプロット 解析は G41 8耐性遺伝子及び GFP遺伝子の一部をプローブとして、 制限酵素 E c o R Iないし B amH I (二ツボンジーン） で処理した約 5 / gのゲノム D NAに対して行った。 GFPプローブはプラスミド PEGFP—C 1 (クロンテ ック） を制限酵素 Nh e I及び Gb L I I (二ツボンジーン) により消化して得 た 849 b pの断片を調製して用いた。 G41 8耐性遺伝子のプローブはプラス ミド p S V 2 n e 0を制限酵素 Gb L I I及び Sma I (二ツボンジーン） によ り消ィ匕し、 1 000 b pの断片を調製して用いた。プローブは32 Pにより標識し、 シグナルはイメージアナライザー B AS 2000 (富士写真フィルム） により検 出した。 図 1 0にその結果の一例を示す。 図 10では E c o R I消化した DNA を n e oプローブによって検出している。 レーン 1はィンサート挿入前の DT 4 0株、 レーン 2以降は G41 8耐性 DT40株を示す。 挿入前のアレルでは 5. 7 kb、 揷入後のアレルでは 6. 9 k bのシグナルが検出される。
以上の （1) 〜 （4) の実験より、 解析した G 418耐性株 1 9株のうち 1 8 株で相同組換えのアレルが検出された。 このうち 5株では相同組換えのアレルに 加えて組換え前のアレルが、 1株でランダム挿入のアレルが検出された。 したが つて目的とする組換え体が得られた頻度は 1 2/1 9 (63 %) となる。
〔実施例 6〕 ヒト 21番染色体短腕の削除
( 1 ) テロメァ短縮のためのコンストラクト構築
ヒト 2 1番染色体の短腕遠位を削除するためのテロメアトランケーシヨンべク ターは P B S— TEL/P u r o (Kuroiwa, Nucleic Acids Res. , 26:3447, 1998) を改変して構築した。 PB S— TEL/P u r oよりピューロマイシン耐性遺伝 子の発現ュニット 1. 7 k bを制限酵素 No t Iの断片として取り除き、 末端を T4 DNA Polymerase (DNA Blunting kit, 宝酒造） により平滑化した （PB S— T ELベクタ一） 。 PGKhygro/ALT20 を制限酵素 C 1 a I及び Sma I (二ツボン ジーン） により消化し、 PGKプロモーター制御下のハイグロマイシン耐性遺伝 子発現ユニットを 1. 8 k bの断片として単離 .精製し、 PB S— TELベクタ 一にクローニングした （P B S— TE L/Hy g r o) 。
G e n B a n kデータベースより得たヒト 21番染色体長腕近位の塩基配列 （登 録番号 AL 163201 ) から、 テロメアトランケーシヨンベクター挿入の標的 配列を設計した。 これを P CR増幅するための、 制限酵素 S p e Iないし B am H Iの認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す： Spe31203 ： 5'- GCACTAGTCTGGCACTCCTGCATAAACA (配列番号 23)
Bam36192 ： 5'- CTAAGGATCCATTTCAGCCTGTGGGAATCA (配列番号 24) ヒト 2 1番染色体を保持する DT40雑種細胞から抽出したゲノム DNAを铸 型として標的配列を P CRにより増幅した。 これを制限酵素 S p e I及び B am H I (二ツボンジーン) で消化して、 突出末端をもつ約 5 k bの DNA断片をァ ガロースゲル電気泳動により分離し、 精製した。 これを P B S— TELZHy g r oプラスミドの Xb a I /B amH Iサイトにクローニングした。 最終的な P B S— TEL/Hy g r oコンストラクトのサイズは約 5. 8 k bである。 テロ メアトランケ一シヨンベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体 アレルを図 1 1に示した。 トランスフエクション及びハイグロマイシン耐性ク口一ンの単離
P B S— TE L/Hy g r oコンストラクトを制限酵素 B amH I (二ツボン ジーン) により消化して線状化し、 長腕遠位を削除して 1 o x Pサイトを組み込 んだヒト 2 1番染色体を保持する DT 4 0雑種細胞 （DT 4 0 (# 2 1 ) b s d 7 9) に導入した。 DT 4 0雑種細胞 1 X 1 07を 0. 7 51111の？ 83に懸濁 し、 2 5 g DNA存在下でジーンパルサ一 （バイオラッド） を用いてエレクト 口ポレーションを行った。 容量 2 5 Fのコンデンサに 7 5 0 Vで印加し電極間 距離 4mmのエレクト口ポレーシヨンセルを用いて放電した。 エレクト口ポレー シヨンした細胞を 1 0 %牛胎仔血清 （F B S) 、 1 %ニヮトリ血清 （C h S) 及 び 5 0 Μ 2一メルカプトエタノールを添加した DMEM培地（インビトロジェ ン製） に懸濁し、 9 6穴クラスター (ファルコン) 5枚に播種した。 2日後に終 濃度 1. 5mgZm 1 となるようハイグロマイシン （Hygromycin-B, 和光純薬） を加えた。 2〜 3週間後には耐性コロニーが出現した。 計 2回のトランスフエク シヨンから合計 6 3個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行 つた。
(3) 相同組換え体の選別とテロメァ短縮の確認
(3— 1 ) P CR解析
ハイグロマイシン耐性 DT 4 0株から相同組換え体を選別するための 1次スク リーニングとして P CR解析を行った。 ハイグロマイシン耐性株より抽出したゲ ノム DNA約 0. 1 /i gを铸型としてヒト 2 1番染色体の短腕近位に位置する S T Sマーカ一 （p CHB, D 21 S 1 88 , D 21 S 275) を増幅した。 その 代表的な結果を図 12に示す。 図 12には、 左側にヒト 21番染色体の Gバンド 像に基づく模式的な染色体地図を、 またマーカ一についてはどのバンドに位置す るかを示した。 ハイグロマイシン耐性 DT 40株について、 PCRにより期待さ れる増幅産物が検出されたマーカーは園で、 検出されなかったマーカーを口で示 した。 DT40 (# 21 )は、テロメアトランケーシヨンを行う前の細胞である。 テロメアトランケーシヨンにより短腕遠位が削除された場合、 D 2 1 S 27 5を 保持し、 D 21 S 1 88及び p CHBを保持しないことが予想される。 D 2 1 S 1 88ないし p CHBのいずれかを増幅しない 45株を選別し、 サザンブロット 解析を行った。
(3 - 2) サザンプロット解析
相同組換えの標的配列内にプローブを設定した。 プローブは以下に示すオリゴ ヌクレオチドプライマ一対を用い、 ヒト 2 1番染色体を保持する DT 40雑種細 胞のゲノム DNAを錶型として P CRにより増幅、 単離、 精製した。
#21p91203： 5'- CTGGCACTCCTGCATAAACA (配列番号 25)
#21p91976： 5'- TCTGTGTTCCCCTTCTCTGA (配列番号 26) ハイグロマイシン耐性株から抽出したゲノム DN A約 10 a gを制限酵素 H i n d I I I (二ツボンジーン) により消化し、 サザンブロット解析を行った。 塩 基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で 5. 8 kb、 野生型 （非 組換え体） で 1. 9 k bであり、 1次スクリーニングで見出した候補 45クロー ンのうち 2クローンが相同組換え体であることを確認した (図 1 3) 。 (3 - 3) PCR法
組換えの標的部位を夾んだ配列を PCRにより増幅した。 ヒト 2 1番染色体上 と夕ーゲティングベクター上に設定したプライマ—オリゴヌクレオチドの配列を 以下に示す： Hyg968： 5'- AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC (配列番号 27 )
#21p96705： 5'- AGTTAGCCTACCTTTTGGCCATCC (配列番号 28) 増幅産物のサイズは 5. 9 kbであり、 これを制限酵素 N s i Iにより消化す ると、 1. 4 k b、 2. 61^13及び1. 9 k bの断片が生じると予想される （図 1 1) 。 サザンプロット解析で相同組換えアレルが確認された 2クローンでのみ P CR増幅が認められ、制限酵素消化による部分断片の生成を確認した（図 14)。
(3 -4) 蛍光 i n s i t uハイブリダイゼーシヨン （F I SH)
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1994) に記さ れた方法に従い、 ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BR L)を用いて行った。 その結果観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト 21番染色体が検出さ れた （図 1 5 a及び b) 。
以上の （1) 〜 （3) の実験より、 得られたハイグロマイシン耐性 63株のう ち 2株が短腕削除により短縮したヒト 2 1番染色体を保持することが確かめられ た。
〔実施例 7〕 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターへの E PO遺伝子挿入 実施例 5に記載の GF P遺伝子の場合と同様にして、 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクタ一ヘヒト EPO遺伝子を挿入する。 実施例 1〜4に記載のように、 テ ロメアトランケーシヨンにより長腕遠位を削除し、 長腕近位に 1 o X Pサイトを 導入したヒト 21番染色体由来 HACベクタ一を用意した。 一方で 1 o X P配列 を含むヒト EPO発現プラスミドを準備し、 C r e組換え酵素を一過性に発現さ せることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する こととした。 組換え挿入体の選別は、 G41 8耐性の獲得 （プロモータ一分断型 の n e o遺伝子発現ユニットの再構成） を指標とした。
(1) 1 o xP配列を含むヒト EP〇発現プラスミド pLNl— EPOの構築 プラスミド構築に用いたプライマ一オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
SV40polyANpl： 5' - CGG GAT CCC G AGC GAG ACA TGA TAA GAT ACA TTG ATG -3' (配列番号 2 9 )
SV40polyARpl： 5'― GGA AGA TCT TCC TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG - 3， (配列番号 3 0 )
これらのプライマーは、 プラスミドベクタ一 p S T n e o B (加藤ら、 Cell Struct Fund, 12:575-580, 1987) の塩基配列を基にして作製した。
CMVN 3： 5'- CGG AAT TCC GGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT TAT TAA TAG -3' (配 列番号 3 1 )
CMVRpl： 5'- CGG GAT CCC GGG TGT CTT CTA TGG AGG TCA AAA CAG -3' (配列 番号 3 2)
これらのプライマーは、 p B S 2 26の CMVプロモーター塩基配列を基にし て作製した。 hEPONpl： 5'-CGG GAT CCC GGC CAC CAT GGG GGT GCA CGA ATG TC -3' (配列番 号 3 3)
hEPORpl： 5'-CGC TCG AGC GCT ATC TGT CCC CTG TCC TGC AGG - 3， (配列番号 34)
これらのプライマーは、 G e n B a n kより入手した塩基配列 （ァクセッショ ン番号 1 05 3 9 7 ) を基に作製した。 p S Tn e o Bを铸型として SV40polyANpl (配列番号 2 9)及び SV40polyARpl (配列番号 30) を用いて P C R増幅した SVポリ A付加ュニッ卜の両端を制限 酵素 B amH I及び B g 1 I I (宝酒造） で消化して突出末端とし、 Ι ο χ Ρ配 列と h CMVプロモーターを備えたプラスミドベクタ一 p B S 2 26 (ライフテ ック）の B amH Iサイトにクローニングした。これを p B S 2 26- pAとした。 次に、 p B S 2 26を鍀型として CMVNp3 (配列番号 3 1 ) 及び CMVRpl (配列番 号 3 2) を用いて P CR増幅した CMVプロモータ一ュニットの両端を制限酵素 E c o R I及び B amH I (宝酒造） で消化して突出末端とし、 p B S 2 2 6— pAの E c o R I — B amH Iサイト間へクロ一ニングした。 これを p LN lと した。
最後に、ヒト E PO c DNAを铸型として hEPONpl (配列番号 3 3)及び hEPORpl (配列番号 3 4) を用いて P CR増幅したヒト E POコード領域の両端を制限酵 素 B amH I及び Xh o l (宝酒造） で消化して突出末端とし、 p LN lの B a mH I — Xh o Iサイト間へクロ一ニングした。これを p LN l— E POとした。 (2) トランスフエクション及び G4 1 8耐性クローンの単離
実施例 3で作製したヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを保持する CHO細 胞 （CHO (# 2 1 ) b s d 7 9 - 1 ) をトリプシン処理し、 5 X 1 06細胞を 0. 8m 1のハンクス平衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 上記 （1 ) で作製し た p LN l _E P〇ベクタ一 1 0 gと C r e酵素発現ベクター p B S 1 8 5 (ライフテック) 1 0 gの存在下でジーンパルサー (バイオラッド) を用いて エレクトロボレーシヨンを行った。 容量 5 0 0 Fのコンデンサに 4 5 0 Vで印 加し、 電極間距離 4mmのエレクトロボレ一シヨンセルを用いて放電した。 エレ クトロポレーシヨンした細胞を 1 0 %牛胎児血清 （FB S) を添加したイーグル F 1 2培地 （以下 F 1 2という ；インビトロジェン製） を含む 4 8穴組織培養用 プラスチックシャーレ (ファルコン) 4枚に播種した。 2日後に 8 0 0 g/m 1の G 4 1 8 (GENETIC IN, インビトロジェン） と 8 g/m 1のブラストサイジ ン （BlasticidinS Hydrochloride, フナコシ） を含む培地と置き換えた。 2〜3 週間後には耐性コロニーが出現し、 その頻度は CHO細胞 5 X 1 06あたり 2 8 個であった。 コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。 この細胞を以 後 KH 2 1 E細胞と称する。
(3) ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターに挿入された E PO遺伝子の発現 ヒト E P〇遺伝子の発現は、 培養上清中に産生されるヒト E POタンパク質を 酵素結合免疫吸着検定法 （EL I SA法） により定量した。
単離した G 41 8Zブラストサイジン耐性 KH 2 1 E細胞 1 9クローン中 6ク ローンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 800 M g/m 1 の G41 8と 8 z g/m 1のブラストサイジンを含む F 1 2培地 2 m 1をいれた 6穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント 到達後、 1 0 %F B Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え、 6日間培養し上 清を回収した。 ヒト E P O E L I S Aキッ ト （Quant ikine IVD Human EP0 I匪 unoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中のヒト E P〇を定量した。 その 結果を表 2に示す。 表 2
測定値 CM中の EPO濃度
Clone No. (mIU/ml) (IU/ml) (ug/ ml)
C13 16.4 1640 8.2
C15 17.1 1710 8.5
C17 29.5 2950 14.7
C18 41.1 4110 20.5
C21 16.6 1660 8.3
C22 23.9 2390 11.9 以上の結果から、 6クローン全てにおいてヒト E POの発現が確認された。 (4) KH21 E細胞により産生されたヒト EPOの生物活性
産生されたヒト EPOの生物活性について、 ヒト EPO依存的増殖を示すヒト 白血病細胞株 UT 7- EPO細胞（自治医科大学 小松 則夫 先生より入手）の 増殖活性を指標にして解析した。 KH2 1 E細胞の 2株 （#02及び#( 1 8) について培養上清を表 2の定量値を基に EP〇終濃度 0. 0 1， 0. 1, 1， 5, 20, 1 00m I UZm 1となるように加えた 10 %F B Sを添加した I MDM 培地 （インビトロジェン製) 0. lm 1をいれた 96穴組織培養用プラスチック シャーレ (ファルコン) に UT 7- EPO細胞 5 X 1 03を播種した。 3日間培養 後、細胞増殖測定キット（C e l l T i t e r 96 AQu e o u s On e S o 1 u t i o n C e l l P r o l i f e r a t i o n As s a y， プロメ ガ） により細胞増殖を解析した。
その結果を図 1 6に示す。 2クローンの培養上清を添加した場合、 ともに組換 え体ヒト EP〇タンパク質 （r hEPO；キリンビール） 添加時と同様の用量依 存的な吸光度の増加が認められた （図 1 6、 。 2及び 8) 。
以上の結果から、 培養上清中に産生されたヒト E POは、 組換え体ヒト EPO タンパク質と同等の生物活性を保持することが確認された。
〔実施例 8〕 KH 2 1 E細胞の移入染色体の確認
本実施例においては、 実施例 7の （2) において作製された KH 2 1 E細胞の 各クローンについて、 P CR及び F I SH解析により移入染色体の確認を行った。
(1) PCR解析
1 o X Pサイト近傍に位置するヒト 2 1番染色体長腕近位のマ一カー P RED 6 5及び P RED 3遺伝子と遠位に位置する D 2 1 S 2 6 5マ一力一 （実施例 1 の （3) 、 図 2参照） について P CR増幅を行った。 Ι ο χΡ配列間の部位特異 的組換え反応によるヒト E PO遺伝子揷入体は、 PRED 6 5及び P RED 3遺 伝子を保持し D 2 1 S 2 6 5マーカーを保持しないことが予想される。その結果、 G41 8耐性 CHO細胞 22クロ一ンのうち 2 1クローンにおいて予想された増 幅が認められた。 上記の 2 1クローンに対して、 ヒト 2 1番染色体の短腕近位に 位置する S T Sマーカー (p CHB, D 2 1 S 1 8 7 , D 2 1 S 2 7 5 ) にっき P CR増幅を行った （実施例 6の （3) 、 図 1 2参照） 。 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターの短腕は残してあるので、 全てのマーカーが保持されていること が予想される。 その結果、 1 5クローンにおいて予想された増幅が認められた。 (2) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼ一シヨン (F I SH) 解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1 9 94) に 記された方法に従い、 ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BRL) を用いて行 つた。 上記 （1) の P CR解析において全てのマーカーで予想される増幅を示し たクローンのうち、 8クローンについて解析したところ、 いずれも観察した分裂 像のほとんどにおいて短縮したヒト 2 1番染色体が検出された。 その結果を表 3 に示す。 尚、 表 3中のクローン KH 2 1は、 実施例 3で作製したヒト 2 1番染色 体由来 H ACベクタ一を保持する CH〇細胞 （CHO (# 2 1) b s d 79— 1) を表す。 表 3
解析数 細胞あたりの Cot- 1シグナル数 保持率 クローン名 分裂像/間期核 (間期核） 分裂像/間期核
0 1 2 3 4=< %
KH21 50/100 6/12 43/87 0/1 0/0 0/0 88
C1 18/50 0/2 18/40 0/7 0 0/1 96
C2 50/100 4/4 45/96 0/0 0/0 0/0 96
C3 20/50 4/2 16/43 0/5 0 0 96
C4 50/100 0/1 12/37 37/58 0/3 0/1 99
C11 50/100 4/2 40/85 6/13 0/0 0/0 98
C12 50/100 2/2 12/36 33/58 3/2 0/2 98
C13 50/100 0/1 13/35 32/58 0/2 5/4 99
C18 17/41 1/0 6/14 10/25 0 0/2 100 以上より、 宿主である CHO細胞の染色体との相対的な大きさから、 短縮した ヒト 21番染色体が CH〇細胞に移入されたことが確認された。 以上の （1) 及び (2) の実験から、 得られた G 41 8耐性 CHO株 (KH 2 1 E細胞） は長腕遠位を削除したヒト 21番染色体由来 HACベクターを保持す ることが確かめられた。
〔実施例 9〕 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一への複数 EPO遺伝子挿入 本実施例においては、実施例 7に記載のヒト E P O遺伝子の場合と同様にして、 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一へ複数のヒト EPO遺伝子を挿入した。 実 施例 1〜4に記載のように、テロメアトランケーシヨンにより長腕遠位を削除し、 長腕近位に 1 o X Pサイトを導入したヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一を用 意した。 一方で 1 o x P配列を含むヒト EP〇発現プラスミドを準備し、 C r e 組換え酵素を一過性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応 により人工染色体に挿入することとした。 組換え挿入体の選別は、 G418耐性 の獲得 （プロモー夕一分断型の n e o遺伝子発現ユニットの再構成） を指標とし
(1) 1 o X P配列を含む 2コピーヒト EPO発現プラスミド pLNl _EP〇 2の構築
プラスミド構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す： EPOnF： 5'- GGA ATT CCG GGC CCA CGC GTG ACA TTG ATT ATT GA -3' (配列番 号 35)
SVpAR： 5'- GGA ATT CCT GAT CAT AAT CAG CCA TAC CAC ATT TG -3' (配列番 号 36) EPOnF プライマ一 （配列番号 35) は、 5 '側から順に E c o R I、 Ap a l、 M 1 u Iの制限酵素認識配列及び CMVプロモーターの 5'側部分配列を有し、 p B S 226の CM Vプロモータ一塩基配列を基にして作製した。 SVpAR プライマ 一 （配列番号 36) は、 5'側から順に E c o R I、 B c 1 Iの制限酵素認識配列 及び SV40ポリ A付加ュニッ卜の 3'側部分相補鎖配列を有し、プラスミドべク 夕一 p STn e oB (加藤ら、 C e l l S t r u c t Fun c t , 1 2 : 57 5 - 580, 1987 ) の塩基配列を基にして作製した。
実施例 7にて作製したプラスミドベクター p LN 1—E POを E c o R I及び Xb a I (宝酒造） で消化して得た CMVプロモータ一、 ヒト EPO遺伝子及び S V40ポリ A付加ュニットを含む DNA断片を铸型として、 EPOnF (配列番号 3 5 ) 及び SVpAR (配列番号 36 ) プライマーを用いて、 KOD— P l u s— (東 洋紡） にて PC R増幅を行った。 サ一マルサイクラ一は G e n e Amp 9700 (Ap p l i e d B i o s y s t e m s )を使用した。 P C Rサイクルは、 94°C 2分の後、 変性 94 °C 1 5秒、 アニーリング 60 °C 30秒、 及び伸長 68 °C分 9 0秒を 3 0サイクル行った。得られた DNA断片の両端を制限酵素 E c o R I (宝 酒造） で消化して突出末端とし、 プラスミドベクタ一 p LN 1 _E POの E c o R Iサイトにクローニングした。 クローン化されたインサート DNA断片の塩基 配列は、 DNAシーケンサ一 （P R I SM3 7 0 0、 Ap p l i e d B i o s y s t em s ) にて解析し、 錡型に用いた p L N 1— E P〇塩基配列の相当する部 分と同一であることを確認した。 得られたクローンのうち、 CMVプロモーター 及びヒト E P〇遺伝子及び S V4 0ポリ A付加ュニッ卜が順方向に 2コピー並ん でいるプラスミドベクタ一を p LN 1— E P O 2とした。 (2) 1 o x P配列を含む 4コピーヒト E P O発現プラスミド p LN l— E P O 4の構築
上記（ 1 )にて作製したプラスミドベクタ一 p LN l— E P〇 2を Xb a I (宝 酒造） で消化して直鎖化した後、 KODポリメラーゼ （東洋紡） にて平滑末端化 し、 Ap a l (宝酒造） で消化して CMVプロモーター及びヒト E P〇遺伝子及 び SV 4 0ポリ A付加ュニットを 2コピー含むインサート用 DN A断片を得た。 プラスミドベクター p LN 1— E P〇 2を M 1 u I (宝酒造） で消化した後 KO Dポリメラ一ゼ （東洋紡） にて平滑末端化し、 Ap a l (宝酒造） で消化して出 来た Ap a I一平滑末端化 M 1 u Iサイト間へ上記のィンサート用 DN A断片を クローニングした。 このヒト E P〇遺伝子を 4コピー含むプラスミドベクターを P LN 1 —E P04とした。
(3) トランスフエクション及び G4 1 8耐性クローンの単離
実施例 3で作製したヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターを保持する CHO細 胞 （CHO (# 2 1 ) b s d 7 9 - 1 ) をトリプシン処理し、 5 X 1 06細胞を 0. 8m 1のハンクス平衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 上記 （ 1 ) 又は （2 ) で作製した p LN 1—E P02ベクター又は p LN l— E P 04ベクタ一 1 0 /z gと C r e酵素発現べクタ一 p B S 1 8 5 (ライフテック） 1 0 /x gの存在下で ジーンパルサー (バイオラッド） を用いてエレクト口ポレーションを行った。 容 量 500 Fのコンデンサに 450 Vで印加し、 電極間距離 4 mmのエレクトロ ポレーションセルを用いて放電した。 エレクト口ポレーションした細胞を 1 0% 牛胎児血清 （FB S) を添加したイーグル F 1 2培地 （以下 F 1 2という ；イン ビトロジェン製） を含む 48穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） 5枚に播種した。 2日後に 800 g/m 1の G 41 8 (GENET I C I N、 インビトロジェン） と 8 g/m 1のブラストサイジン （B 1 a s t i c i d i n S Hy d r o c h l o r i d e, フナコシ） を含む培地と置き換えた。 2〜 3週間後には耐性コロニーが出現し、 その頻度は CHO細胞 5 X 1 06あたり、 p LN 1 _E PO 2を用いた場合には 14個、 pLN l— EP04を用いた場合 には 24個であった。 コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。 これ らの細胞を以後、 p LN 1 -E PO 2を用いて作製した細胞は KH 21 E 2細胞、 pLN l— EP04を用いて作製した細胞は KH2 1 E 4細胞と称する。
(4) ヒト EPO遺伝子組換え挿入体の確認
組換え揷入体の選別は、 ヒト 21番染色体由来 HACベクター上の 1 o X P配 列部位に挿入されたか否かを、 1 oxP配列部位を挟むようにヒト EPO遺伝子 供与ベクター由来配列上及び HACベクター上にプライマーを設計し、 P C R増 幅により確認した。 また、 挿入されたヒ卜 EP〇遺伝子のコピー数を、 プラスミ ドベクタ一 PB S 226上のプライマーと H ACベクタ一上に.プライマーを設計 し、 P CR増幅により確認した。
以下に P CR増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示す： SVpANpl： 5'- TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA _3， （配列番号 37) このプライマーは、 プラスミドベクター p S Tn e o B (加藤ら、 C e 1 1 S t r u c t F u n c t , 1 2 : 575 - 580, 1 987 ) の塩基配列を基にし て作製した。
Neo Rp2： 5'- AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC - 3， (配列番号 38) このプライマ一は、 プラスミドベクタ一 p S F 1 (ライフテック） の n e o遺 伝子の塩基配列を基にして作製した。
M13RV： 5'- CAG GAA ACA GCT ATG AC -3， (配列番号 39)
このプライマーは、 プラスミドベクター p B S 226 (ライフテック） の塩基 配列を基にして作製した。
PLN 1 -EP02又は p LN 1— E P O 4ベクター由来の S V 40ポリ A付 加配列領域に設計した SVpANplプライマ一 （配列番号 37) 及び HACベクター 上の p S F 1由来のネオマイシン耐性遺伝子中に設計した NeoRp2プライマー（配 列番号 38) を用いて P CR増幅を行った。 組換え揷入体の場合は、 pLN l— E P 02又は p LN 1— E P O 4ベクタ一由来の S V 40ポリ A付加配列から 1 o X P配列までと p S F 1由来の 1 o X P配列から n e o遺伝子の一部までを含 む約 1. 0 k b pの増幅が予想される。 その結果、 KH 21 E 2細胞 6クローン 及び KH21 E 4細胞 6クローン全てにおいて予想される増幅が確認された 以上より、 上記の 1 2クローンは全て 1 o X P配列への組換え揷入体であるこ とが確認された。 次に、 KH2 1 E 2細胞 6クローンについて、 Neo R 2 プライマー （配列番号 38) 及びプラスミドベクタ一 p B S 226由来の M13RVプライマー （配列番号 39) を用いて P CR増幅を行った。 組換え揷入体の場合は、 pLNl— EPO 2ベクター由来の CMVプロモーター、 ヒト EPO遺伝子、 及び SV40ポリ A 付加配列を 2コピ一含む領域から 1 o X P配列までと p S F 1由来の 1 o X P配 列から n e o遺伝子の一部までを含む約 3. 8 k b pの増幅が予想される。 その 結果、 全てのクロ一ンにおいて予想される増幅が確認された。
以上より、 上記の KH 2 1 E 2細胞 6クローンには、 CMVプロモーター、 ヒ ト E P O遺伝子及び S V 40ポリ A付加配列を含むィンサート D N Aが 2コピー 揷入されていることが確認された。 (5) ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターに挿入された E PO遺伝子の発現 ヒト EPO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生されるヒト EPOタンパク質を 酵素結合免疫吸着検定法 （EL I SA法） により定量した。
(5- 1) KH 2 1 E 2細胞における E PO遺伝子の発現
単離した G 41 8 /ブラストサイジン耐性 KH 21 E 2細胞 14クローン中 6 クローンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 800 /1 g/m 1の G41 8と 8 μ g/m 1のブラス 1、サイジンを含む F 1 2培地 2 m 1をいれ た 6穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） に播種した。 コンフレン ト到達後、 10%FB Sを添加した F 1 2培地 2m lに置き換え、 6日間培養し 上清を回収した。 ヒト E PO EL I S Aキット （Qu a n t i k i n e I VD Huma n EPO Immun o a s s ay, R &Dシステム） により、 培養上 清中のヒト EPOを 2 X 10一5希釈にて定量した。 その結果を表 4に示す。 表 4
Figure imgf000079_0001
(5 - 2) KH 2 1 E 4細胞における E P〇遺伝子の発現
また、 単離した G 41 8 /ブラストサイジン耐性 KH 2 1 E 4細胞 24クロー ン中 6クローンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 800 g/m 1の G 41 8と 8 g/m 1のブラス卜サイジンを含む F 12培地 2 m 1 をいれた 6穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コン フレント到達後、 1 0 %FB Sを添加した F 1 2培地 2m lに置き換え、 6日間 培養し上清を回収した。 ヒト EPO EL I S Aキット （Qu a n t i k i n e I VD Hum a n EPO I mmu n o a s s a y , R&Dシステム）により、 培養上清中のヒト EPOを 2 X 1 0一5希釈にて定量した。その結果を表 5に示す。 表 5
Figure imgf000080_0001
(5 - 3) KH 2 1 E細胞における E PO遺伝子の発現
また、 比較対照用として、 実施例 7において単離した、 ヒト EPO遺伝子をヒ ト 2 1番染色体由来 H ACベクター上に 1コピー保持する G 41 8 /ブラストサ ィジン耐性 KH 2 1 E細胞 5クローンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 8 00 g/m 1の G4 1 8と 8 x g/m 1のブラストサイジンを 含む F 1 2培地 2 m 1をいれた 6穴組織培養用プラスチックプレート (フアルコ ン） に播種した。 コンフレント到達後、 1 0 %FB Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え、 6日間培養し上清を回収した。ヒト EPO EL I SAキット（Q u a n t i k i n e I VD Huma n EPO I mm u n o a s s a y, R & Dシステム） により、 細胞培養上清中のヒト E POを定量した。 その結果を表 6 に示す。 ただし、 C 1及び C 4は 1 X 1 0 _4希釈にて、 C 9、 C 1 1及び C 2 0 は 1 X 1 0— 5希釈にて定量した。 表 6
Figure imgf000081_0001
以上の表 4〜 6の結果から、 KH2 1 E 2細胞 6クローン及び KH 2 1 E 4細 胞 6クローン全てにおいてヒト EP〇の発現が確認された。 またヒト E P〇の発 現は、 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターへ挿入したヒト EPO遺伝子のコピ —数と相関したことから、 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターは挿入した遺伝 子のコピー数依存的に発現制御出来ることが明らかになった。
〔実施例 1 0〕 長腕遠位及び短腕遠位削除ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一 への EPO遺伝子挿入
実施例 7に記載のヒト EPO遺伝子の場合と同様にして、 ヒト 2 1番染色体由 来 H ACベクタ一へヒト EPO遺伝子を揷入する。 実施例 1〜 4及び 6に記載の ように、 テロメァ卜ランケーシヨンにより長腕遠位を削除し、 長腕近位に 1 o X Pサイ 1、を導入し、 かつテロメアトランケ一シヨンにより短腕遠位を削除したヒ ト 2 1番染色体由来 HACベクターを用意した。 一方で 1 o X P配列を含むヒト EPO発現プラスミドを準備し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させることで 1 o x P配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。 組換え挿入体の選別は、 G41 8耐性の獲得 （プロモーター分断型の n e o遺伝 子発現ユニットの再構成） を指標とした。
(1) トランスフエクション及び G4 1 8耐性クローンの単離 後述する実施例 1 7で作製したヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターを保持す る CHO細胞 2株： CHO# 2 1 h y g 4及び CH〇# 2 1 h y g 8 (以後それ ぞれ H 4細胞及び H 8細胞と称する） に対しトリプシン処理を行い、 それぞれ 5 X 1 06細胞を 0. 8m 1のハンクス平衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 実施 例 7 ( 1 ) で作製した p LN 1— E P Oベクタ一; I 0 gと C r e酵素発現べク タ一 P B S 1 8 5 (ライフテック） 1 0 gの存在下でジーンパルサー （バイオ ラッド） を用いてエレクト口ポレーシヨンを行った。 容量 5 0 0 Fのコンデン サに 4 5 0 Vで印加し、 電極間距離 4mmのエレクトロポレ一ションセルを用い て放電した。 エレクトロボレ一シヨンした細胞を 1 0 %牛胎児血清 （F B S) を 添加したイーグル F 1 2培地 （以下 F 1 2という ；インビトロジェン製） を含む 4 8六組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） 5枚に播種した。 2日後 に 8 0 0 g/m 1の G 4 1 8 (GENET I C I N、 インビトロジェン） 及び 8 ]i g/m 1のブラストサイジン （B l a s t i c i d i n S Hy d r o c h l o r i d e , フナコシ） を含む選択培地と置き換えた。 2〜 3週間後には G 4 1 8耐性及びブラストサイジン耐性コロニーが出現し、 H4細胞又は H 8細胞を 宿主としたそれぞれから 2 4個ずつコロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を 行った。 これらの細胞を以後、 H 4を用いて作製した細胞は H 4 E細胞、 H 8を 用いて作製した細胞は H 8 E細胞と称する。 (2) 移入染色体の確認
(2 - 1 ) P CR解析
1 o x Pサイト近傍に位置するヒ卜 2 1番染色体長腕近位のマーカー P RED 6 5及び P R ED 3遺伝子と遠位に位置する D 2 1 S 2 6 5マーカー （実施例 1 の （3) 、 図 2参照） について P CR増幅を行った。 Ι ο χ Ρ配列間の部位特異 的組換え反応によるヒト E PO遺伝子挿入体は、 P RED 6 5及び P RED 3遺 伝子を保持し D 2 1 S 2 6 5マーカ一を保持しないことが予想される。その結果、 H4 E細胞 2 2クローンのうち 2 1クローンにおいて予想された増幅が認められ た。 これら 2 1クローンに対して、 ヒト 2 1番染色体の短腕近位に位置する S T Sマ一力一 （p CHB, D 2 1 S 1 8 7 , D 2 1 S 27 5) にっき P CR増幅を 行った （実施例 6の （3) 、 図 1 2参照） 。 ヒト 2 1番染色体の短腕近位で短腕 遠位を削除してあるので、 p CHB及び D 2 1 S 1 87マーカーを保持せず， D 2 1 S 2 7 5マ一力一を保持することが予測される。 その結果、 1 5クローンに おいて予想された増幅が認められた。
(2 - 2) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン (F I SH) 解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコ一ル， 秀潤社， 1 9 94) に 記された方法に従い、 ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BRL) を用いて行 つた。 上記 （2— 1) の P CR解析において全てのマーカーについて予想される 増幅を示したクローンのうち、 6クローンについて解析したところ、 いずれも観 察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト 2 1番染色体が検出された。 その 結果を表 7に示す。 以上より、 宿主である CHO細胞の染色体との相対的な大き さから、短縮したヒト 2 1番染色体が CHO細胞に移入されたことが確認された。 表 7
解析数 細胞あたりの Cot-1シグナル数 保持率 クローン名 分裂像/間期核 (間期核） 分裂像/間期核
0 1 2 3 4=< %
H4EC10 50/100 4/1 45/98 1/1 0/0 0/0 99
H4EC15 50/100 17/6 33/87 0/6 0/1 0/0 94
H4EC16 50/100 5/11 45/- 0/— 0/- 0/- 一
H4EC17 50/100 6/4 42/82 2/14 0/0 0/0 96
H4EC18 50/100 1/7 49/89 0/4 0 0 93
H4EC19 50/100 3/5 46/86 1/5 0/2 0/2 95 以上の （2— 1) 及び (2 - 2) の実験から、 得られた G 4 1 8耐性及びブラ ストサイジン耐性 CHO株は長腕遠位及び短腕遠位を削除し 1 o X P配列を挿入 したヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターを保持することが確かめられた。
(3) ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターに挿入された E P〇遺伝子の発現 ヒト E P O遺伝子の発現は、 培養上清中に産生されるヒト E P Oタンパク質を 酵素結合免疫吸着検定法 （EL I SA法） により定量した。
(3 - 1 ) ^14 £細胞にぉける£?〇遺伝子の発現
単離した G 4 1 8及びブラストサイジン耐性 H 4 E細胞 2 4クローン中 1 0ク ローンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 8 0 0 g/m 1 の G 4 1 8と 8 g/m 1のブラストサイジンを含む F 1 2培地 2 m 1をいれた 6穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント 到達後、 1 0 %F B Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え、 6日間培養し上 清を回収した。ヒト E P〇 EL I S Aキット（Qu a n t i k i n e I VD H uma n E P O I mmu n o a s s a y, R &Dシステム） により、 培養上清 中のヒト E POを定量した。 その結果を表 8に示す。 表 8
Figure imgf000084_0001
(3— 2) H 8 E細胞における E P〇遺伝子の発現
また、 単離した G 4 1 8及びブラストサイジン耐性 H 8 E細胞 2 4クローン中 6クローンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 8 0 0 /2 g / m 1の G 4 1 8と 8 g/m 1のブラストサイジンを含む F 1 2培地 2 m 1をい れた 6穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレ ント到達後、 1 0 %F B Sを添加した F 1 2培地 2m 1に置き換え、 6日間培養 し上清を回収した。 ヒト EPO EL I S Aキット （Qu a n t i k i n e I D Human EPO I mmu n o a s s ay, R&Dシステム) により、 養上清中のヒト EP〇を定量した。 その結果を表 9に示す。 表 9
Figure imgf000085_0001
以上の表 8及び 9結果から、 H4E細胞1 0クロ一ン及び H 8 E細胞 6クロ一 ン全てにおいてヒト E POの発現が確認された。 〔実施例 1 1〕 ヒト 21番染色体由来 HACベクタ一のマウス A 9細胞への移入 ( 1 ) 微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 1 7で得られた、 長腕遠位を削除して 1 o xP 配列を挿入した後テロメアトランケ一シヨンにより短腕遠位を削除したヒト 21 番染色体由来 HACベクタ一を保持する CH〇細胞： CHO# 2 1 h y g 4及び CHO# 21 hy g 8 (以後それぞれ H 4細胞及び H 8細胞と称する）を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス A 9細胞（Oshimuraら、 Environ. Heal th Perspect. 93:57, 1991, 登録番号 J C R B 02 1 1 ) を用いた。 はじめに約 107個の H4 細胞からミクロセルを調製した。 すなわち、 25 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 24本に細胞密度が 60〜70 %飽和程度まで培養した H 4又は H 8細胞をコル セミド （0. 1 g/m l , デメコルシン， 和光純薬) を含む培養液 (20 %F
B S, 800 g/m 1 G41 8, F 1 2) 中で 5日間培養して微小核を誘導し た。 培地を除いた後、 予め保温 （37°C) しておいたサイトカラシン B (DME
M中に 1 0 M g/m l , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 アクリル性遠 心容器に遠心用フラスコを揷入し、 34°C， 8, ' 000 r pm, 1時間の遠心を 行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 lim, 5 m、 3 zmのフィルター (ワットマン) を装着した SW I NNEX- 25 (ミリポア） を用いて濾過精製した。 精製したミクロセルは 50 X gZm 1 のフィ トヘムァグルチニン P (Phytohemaggulutinin-P, D i f c o) を含む DM EM 2m lに再懸濁した。 マウス A 9細胞を 90 %飽和の状態まで培養した 25 cm2培養用フラスコ （ファルコン） に精製した微小核細胞を加え、 37°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM中に P EG 1 000 (終濃度 50 % (W/V) 、 シグマ） 及び DMS O (終濃度 7 % (W/V) 、 シグマ） を溶解し、 ポアサイズ 0. 22 xmフィルタ一 （ザルトリウス） にて濾過した溶液で 1分間かけて融合 した。 1 0 % F B Sを含む DMEM培地にて 48時間培養した後、 トリプシン処 理により細胞を分散し、 48穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） 2枚に播種した。 2日後にブラストサイジン (4 g/m l ) 又はハイグロマイ シン (700 M g/m 1、 インビトロジェン） を含む選択培地 ( 1 0 %F B S ， DMEM) と置き換えた。 約 3週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニ 一を単離し、 以後の解析を行った。 7回の微小核細胞融合から 22個の薬剤耐性 コロニーを得た。 上記で得られた細胞を以後 A 9△細胞と称する。
(2) 移入染色体の確認
(2- 1) P CR解析
上記 （1) において得られたコロニーのうち 2 1クローンについて解析した。 1 o xPサイト近傍に位置するヒト 2 1番染色体長腕近位のマーカー P RED 6 5及び P RED 3遺伝子と遠位に位置する D 2 1 S 265マーカー （実施例 1の
(3) 、 図 2参照） について P CR増幅を行った。 H ACベクタ一移入体は、 P RED 65及び P RED 3遣伝子を保持し D 21 S 265マーカーを保持しない ことが予想される。 その結果、 20クローンにおいて予想された増幅が認められ た。
次に、 ヒト 2 1番染色体の短腕近位に位置する STSマ一力一 （pCHB, D 2 1 S 1 87, D 2 1 S 27 5) にっき PC R増幅を行った（実施例 6の （3) 、 図 1 2参照） 。 ヒト 2 1番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、 p €118及び02 1 S 1 87マーカーを保持せず， D 2 1 S 27 5マーカーを保持 することが予測される。 その結果、 1 8クローンにおいて予想された増幅が確認 された。
(2 - 2) 薬剤選択培養
ヒ卜 21番染色体由来 HACベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、 すなわち 八イダロマイシン耐性遺伝子 （短腕遠位） 及びプラストサイジン耐性遺伝子 （長 腕近位） が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、 各薬剤耐性遺伝子を含む 領域が保持されているかを確認した。
上記 （2— 1) において予想される増幅を示した 9クローンについて、 6ゥェ ル組織培養用プレート （ファルコン） 各ゥエルにて細胞密度が 60〜 70 %飽和 程度までブラストサイジン （4 μ g/m 1 ) を含む選択培地 （ 1 0 %F B S , D MEM) で培養した。 PB S (インビトロジェン） で 2回リンスした後、 ハイグ ロマイシン (700 M g/m 1 ) のみ、 又はブラストサイジン (411 g/ 1 ) 及びハイグロマイシン (700 g/m 1 ) を含む培養液で 1週間培養した。 そ の結果を表 1 0に示す。
表 10
クローン名 Brasticiain (Bsd) Hygromycin (Hyg) Bsd + Hyg
A9厶 10 R R R
Α9Δ11 R R R
Α9Δ12 R 一 R
Α9Δ13 R R R
A9厶 111 R R R
Α9Δ113 R R R
A9厶 114 R R R
A9厶 115 R R R
A9厶 116 R R R R;薬剤耐性
一；試験データなし 以以上上よよりり、、 全全ててののククロローーンンににおおいいててブブララスス
Figure imgf000088_0001
55 性性をを確確認認ししたた。。
((22 -- 33)) 蛍蛍光光 ii nn ss ii tt uuハハイイブブリリダダィィゼゼーーシシヨヨンン ((FF II SSHH)) 解解析析
FF II SSHH解解析析はは、、 松松原原らら （（FF II SSHH実実験験ププロロトトココ一一ルル，， 秀秀潤潤社社，， 11 99 9944)) にに 記記さされれたた方方法法にに従従いい、、 ヒヒトト特特異異的的ププロローーブブ CC oo tt 11 ((ギギブブココ BBRRLL)) をを用用いいてて行行 1100 つつたた。。 上上記記 （（22—— 11)) のの PP CCRR解解析析ににおおいいてて全全ててののママーーカカーーでで予予想想さされれるる増増幅幅をを 示示しし、、 上上記記 ((22 -- 22)) ににおおいいててププララスス卜卜ササイイジジンン耐耐性性かかつつハハイイググロロママイイシシンン耐耐性性 をを示示ししたた 22ククロローーンンににつついいてて解解析析ししたたととこころろ、、 観観察察ししたた分分裂裂像像ののほほととんんどどににおおいい てて短短縮縮ししたたヒヒトト 22 11番番染染色色体体がが検検出出さされれたた。。 そそのの結結果果をを表表 11 11にに示示すす。。
15 表 11
Figure imgf000088_0002
以上より、 宿主であるマウス A 9細胞の染色体との相対的な大きさから、 短縮 したヒト 2 1番染色体がマウス A9細胞に移入されたことが確認された。 以後上 記で得られた細胞 2クローンを A 9 Δ 1 1及び八9 Δ 1 2細胞と称する。
20
以上の (2 - 1 ) から (2 - 3) の実験より、 得られたブラストサイジン及び ハイグロマイシン耐性の 2株が長腕及び短腕を削除したヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターを保持することが確かめられた。
25 〔実施例 1 2〕 マウス A 9細胞へのヒト E PO遺伝子を揷入したヒト 2 1番染色 体由来 H ACベクタ一移入 (1) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 1 0で得られた、 ヒト EPO遺伝子を 1コピー 挿入した、 長腕遠位を削除して 1 o X P配列を揷入した後テロメアトランケーシ ョンにより短腕遠位を削除したヒ卜 2 1番染色体由来 HACベクターを保持する CH〇細胞のうち微小核形成能が高いクローン（H4 E C 1 0又は C 1 5又は C 1 6細胞） を用いた。 染色体受容細胞としては、 マウス A9細胞 （Oshimura ら、 Environ. Heal th Perspect. 93:57, 1991， 登録番号 J C R B 0 2 1 1 ) を用いた。 はじめに約 1 08個の H4 E C 1 5又は C 1 6細胞からミクロセルを調製した。 すなわち、 2 5 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 24本に細胞密度が 6 0〜7 0 % 飽和程度まで培養した H 4 E C 1 5又は C 1 6細胞をコルセミド（0. 1 n g/ m 1 , デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （2 0%FB S, 800 z g/m 1 G41 8, F 1 2) 中で 4日間培養して微小核を誘導した。 培地を除いた後、 予め保温（3 7°C)しておいたサイトカラシン B (DMEM中に 1 0 n g/m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 アクリル性遠心容器に遠心用フラスコ を揷入し、 34°C， 8, 0 00 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無 血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 zm、 5 zm、 3 mの フィルタ一 (ヮッ卜マン) を装着した SW I NNEX- 2 5 (ミリポア) を用い て濾過精製した。 精製したミクロセルは 50 g/m 1又は 1 0 0 ^ g/m 1の フィトヘムァグルチニン P (P hy t o h ema g gu l u t i n i n-P, D i f c o) を含む DMEM 2m 1に再懸濁した。 マウス A 9細胞を 9 0 %飽和の 状態まで培養した 2 5 cm2培養用フラスコ （ファルコン） に精製した微小核細 胞を加え、 3 7°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM中に P EG 1 0 0 0 (終濃 度 50 % (W/V) 、 シグマ） 及び DMS〇 (終濃度 7 % (WZV) 、 シグマ） を溶解し、 ポアサイズ 0. 2 フィルター （ザルトリウス） にて濾過した溶 液で 1分間かけて融合した。 1 0 %FB Sを含む DMEM培地にて 48時間培養 した後、 トリプシン処理により細胞を分散し、 48穴組織培養用プラスチックプ レート （ファルコン） 2枚に播種した。 2日後にブラストサイジン （6 g/m 1 ) 又は G4 1 8 (60 0 z g/m 1 ) を含む選択培地 （ 1 0 % F B S ， DME M) と置き換えた。 約 3週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単 離し以後の解析を行った。 1 2回の微小核細胞融合から 39個の G41 8耐性コ ロニ一を得た。 上記で得られた細胞を以後 A△ E細胞と称する。 (2) 移入染色体の確認
(2— 1) PCR解析
上記 （1) において得られたコロニーのうち 25クロ一ンについて解析した。 1 o X Pサイト近傍に位置するヒト 2 1番染色体長腕近位のマーカ一 P RED 6 5及び PR ED 3遺伝子と遠位に位置する D 2 1 S 265マーカー （実施例 1の (3) 、 図 2参照） について P CR増幅を行った。 1 o X P配列間の部位特異的 組換え反応によるヒト E PO遺伝子挿入体は、 PRED 65及び P RED 3遺伝 子を保持し D 21 S 265マ一力一を保持しないことが予想される。 その結果、 24クローンにおいて予想された増幅が認められた。 これら 24クローンに対し て、 ヒト 21番染色体の短腕近位に位置する STSマーカ一 （p CHB, D 2 1 S 1 87, D 2 1 S 27 5) にっき PCR増幅を行った （実施例 6の （3) 、 図 1 2参照） 。 ヒト 21番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、 pC HB及び D 2 1 S 1 87マ一カーを保持せず、 D 2 1 S 275マーカ一を保持す ることが予測される。 その結果、 1 9クローンにおいて予想された増幅が確認さ れた。
(2 - 2) 薬剤選択培養
ヒト 21番染色体由来 HACベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、 すなわち ハイグロマイシン耐性遗伝子 (短腕遠位) 、 ブラストサイジン耐性遺伝子及びネ ォマイシン耐性遺伝子 (長腕近位）が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、 各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
上記 （2— 1) において予想される増幅を示したうち 7クローンについて、 6 ゥエル組織培養用プレート各ゥエルにて細胞密度が 60〜70 %飽和程度まで G 41 8 (600 M g/m 1 ) 又はブラストサイジン (6 n g/m 1 ) を含む選択 培地 （ 1 0 % F B S , DMEM) で培養した。 PB S (インビトロジェン） で 2 回リンスした後、 ブラストサイジン及びハイグロマイシン ( 700 g /m 1 ) 及び G 41 8を含む培養液で 1週間又は 1 0日間培養した。 その結果を表 1 2に 示す。 表 12
Figure imgf000091_0001
R;薬剤耐性
一；試験データなし 以上より、 7クローンにおいてプラストサ- 41 8の三重薬剤耐性を確認した。
(2— 3) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーション （F I SH) 解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1994) に 記された方法に従い、 ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BRL) を用いて行 つた。 上記 （2— 1) の P CR解析において全てのマーカーで予想される増幅を 示した 7クローンについて解析したところ、 いずれも観察した分裂像のほとんど において短縮したヒト 21番染色体が検出された。 その結果を表 1 3に示す。 表 13
解析数 細胞あたりの Cot - 1シ 'グナル翁 保持率 クローン名 分裂像/間期核 (間期核） 分裂像/間期核
0 1 2 3 4=< %
A厶 E51 50/100 1/1 6/11 7/21 15/31 21/36 87
A厶 E52 50/100 6/13 38/80 6/6 0/1 0 99
ΑΔΕ53 50/100 1/4 5/8 3/12 11/33 30/43 96
A厶 E54 50/100 7/7 32/77 9/16 1/0 I/O 86
ΑΔΕ55 50/100 14/39 5/17 6/13 1/16 24/15 72
A厶 E4 48/100 1/9 41/86 4/5 1/0 1/0 91
A厶 E18 50/100 1/4 32/67 17/29 0 0 96 以上より、 宿主であるマウス A9細胞の染色体との相対的な大きさから、 短縮 したヒト 2 1番染色体がマウス A9細胞に移入されたことが確認された。 以上の （2— 1) から （2— 3) の実験より、 得られた上記 ΑΔΕ細胞が、 ヒ ト EPO遺伝子を挿入し長腕及び短腕を削除したヒト 21番染色体由来 HACベ ク夕一を保持することが確かめられた。 (3) ヒト EPO遺伝子組換え挿入体の確認
組換え挿入体の選別は、 ヒト 21番染色体由来 H ACベクター上の 1 o X P配 列部位に挿入されたか否かを、 1 o xP配列部位を挟むようにヒト EPO遺伝子 供与べクタ一由来配列上及び HACベクター上にプライマーを設計し、 P CR増 幅により確認した。
A ΔΕ細胞 12クローンについて、 実施例 9 (4) に示した Neo Rp2プライマ ― (配列番号 38) 及びプラスミドベクタ一 p B S 226由来の M13RVプライマ 一 （配列番号 39) を用いて P CR増幅を行った。 組換え挿入体の場合は、 pL N 1— E POベクター由来の CMVプロモータ一、 ヒト EP〇遺伝子、 SV40 ポリ A付加配列を含む領域から 1 o X P配列までと p S F 1由来の 1 o X P配列 から n e o遺伝子の一部までを含む約 2. 3 k b pの増幅が予想される。 その結 果、 1 2クローン全てにおいて予想される増幅が確認された。 以上より、 上記の ΑΔ E細胞クローンは、 CMVプロモーター及びヒト E P〇 遺伝子及び S V 40ポリ A付加配列を含むィンサ一ト DN Aをコピー挿入された ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクタ一を保持することが確認された。 (4) ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターに挿入された EPO遺伝子の発現 ヒト EPO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生されるヒト EPOタンパク質を 酵素結合免疫吸着検定法 （EL I SA法） により定量した。
単離した ΑΔ E細胞 4クロ一ンについて、 各々 1 X 1 05細胞を 1 0 % F B S 添加した 600 M g/m 1の G41 8と 6 g/m 1のブラストサイジンを含む DMEM培地 2m 1をいれた 6穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン） に播種した。 コンフレン卜到達後、 1 0 %FB Sを添加した F 1 2培地 2m 1に 置き換え、 4日間又は 5日間培養し上清を回収した。 ヒト EPO EL I SAキ ット （Quantikine IVD Human EPO I匪 unoassay, R&Dシステム） により、 培養 上清中のヒト E POを希釈なしにて定量した。 その結果を表 14に示す。 表 14
Figure imgf000093_0001
ΑΔΕ 5 1、 ΑΔΕ4、 ΑΔΕ 1 8は、 培養上清中のヒト ΕΡΟ濃度が上記ヒ ト EPO E L I SAキット （Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D システム） の検出限界濃度以上であった。
以上より、 上記の ΑΔΕ細胞は、 ヒト EP〇タンパク質を産生することが確認 された。
〔実施例 1 3〕 ヒト正常繊維芽細胞へのヒト 14番染色体断片 （SC 20) 移入 (1) ヒト正常繊維芽細胞 HFL— 1への S C 20移入
(1 - 1) 微小核細胞融合 （プレート法） と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 ヒト 14番染色体断片 （S C 20) を保持するマウス A 9細胞 （C I 1— S C 20細胞、 Tomizuka ら， Nature Genet. (USA) ， 第 16 卷， p.133- 143, 1997 年） を用いた。 染色体受容細胞としては、 ヒト正常繊維芽 細胞 HFL— 1 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 RCB 052 1) を用いた。 はじめに約 107個の細胞からミクロセルを調製した。 すなわち、
25 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に細胞密度が 80〜 90 %飽和程度 まで培養した C 1 1— S C 20細胞をコルセミド （0. 05 gZm l , デメコ ルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20 %FB S, 800 g/m 1 G 41 8 , DMEM) 中で 48時間培養して微小核を誘導した。 培地を除いた後、 予め保温 (37。C) しておいたサイ トカラシン B (DMEM中に 1 0 n g/m 1， シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、ァクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、
34°C, 8, 000 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地（D MEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 zm、 5 rn, 3 imのフィルター （ヮ ットマン）を装着した SW I NNEX- 25 (ミリポア）を用いて濾過精製した。 精製したミ ク ロセルは 5 0 a g /m 1 のフィ 卜へムァグルチニン P (Phytohemaggulutinin-P, D i f c o) を含む DMEM 2m lに再懸濁した。 H FL- 1細胞を 90 %飽和の状態まで培養した 25 cm2培養用フラスコ （ファ ルコン） に精製した微小核細胞を加え 37°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM 中に PEG 1 500 (終濃度 45 % (W/V) 、 ロシュダイァグノステイクス) 及び DMS 0 (終濃度 1 0 % (W/V) 、 シグマ） を溶解し、 ボアサイズ 0. 2 2 /zmフィルター (ザルトリウス) にて濾過滅菌した溶液で 1分間かけて融合し た。 1 5 %FB Sを含む DMEM培地にて 48時間培養した後、 トリプシン処理 により細胞を分散し、 コラーゲン Iコート処理した 48穴組織培養用プラスチッ クプレート （ファルコン） 1枚に播種した。 2日後に G41 8 (300 /i g/m 1 ) を含む選択培地 （1 5 %FB S , DMEM) に置き換えた。 約 3週間の選択 培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行った。 3回の 微小核細胞融合から 2 1個の G418耐性コロニーを得た。
(1 - 2) 微小核細胞融合 （サスペンション法） と薬剤耐性クローンの単離 上記 （1— 1) と同様にしてミクロセルを調製及び精製し、 6m lの DMEM に再懸濁した。 HF L— 1細胞を 90 %飽和の状態まで 1 7 5 cm2培養用フラ スコ (ファルコン) にて培養し、 トリプシン処理にて分散した後、 DMEMで 2 回洗浄し DMEM7m 1に再懸濁した。 上記ミクロセル懸濁液に上記 H F L— 1 細胞懸濁液を重層し遠心後、 上清を除きペレットをタッピングにて懸濁し、 0. 5m lの PEG 1 500 (終濃度 50 % (W/V) 、 ロシュダイァグノステイク ス） を加え、 1 20秒間にて融合した。 DMEM 5m 1を 1 m 1 / 1分の速度で 加え、 さらに DMEM 5m 1加えて 37 °C 1 0分間静置後、 遠心し 1 5%FB S を含む DMEM培地に再懸濁してコラーゲン Iコート処理した 48穴組織培養用 プラスチックプレー卜 (ファルコン) 2枚に播種した。 2日後に G41 8 (30 0 g/m 1 ) を含む選択培地 ( 1 5%FB S, F 12) に置き換えた。 約 3週 間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。 1回の微小核細胞融合から 2個の G41 8耐性コロニーを得た。
(1 - 3) 移入染色体の確認
(1一 3— 1 ) P CR解析
移入染色体は， S C 20上に存在する n e o遺伝子の P CR増幅により確認し た。 用いたオリゴヌクレオチドプライマ一の配列を以下に示す：
421F： 5'- TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA _3， （配列番号 40) 778R： 5'- AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC - 3， (配列番号 41 )
これらのプライマーは、 プラスミドベクタ一 p S Tn e o B (加藤ら、 C e l 1 S t r u c t F u n c t , 1 2 : 575 - 580, 1 987 ) の塩基配列を 基にして作製した。 上記 （1— 1) 及び （1一 2) で得られた G 41 8耐性細胞 12クローンにつ いて、 421Fプライマ一 (配列番号 40) 及び 778Rプライマー （配列番号 41) を用いた P CR増幅を行った。 HACベクタ一移入体は、 n e o遺伝子を保持す ることが予想される。 その結果、 全てのクローンにおいて予想された増幅が確認 された。
(1 - 3 - 2) 染色体解析
染色体解析は、 黒木ら （細胞工学ハンドプック， 羊土社， 1992) に記され た方法に従い、 ギムザ染色にて行った。 G41 8耐性の HFL— 1細胞のうち 2 クローンについて分裂中期染色体像を解析した。その結果、 G41 8耐性株では、 親株の HF L _ 1には認められず、 内在の 14番染色体よりサイズの小さいミニ 染色体が観察された。 以上の ( 1 - 3 - 1 ) 及び (1 - 3 - 2) の実験から、 得られた上記の G 41 8耐性 HFL— 1株は S C 20を保持することが確かめられた。
(2) ヒト正常繊維芽細胞 HUC— F 2への S C 20移入
(2 - 1) 微小核細胞融合 （プレート法） と薬剤耐性クローンの単離 染色体供与細胞として、 ヒト 14番染色体断片 （SC 20) を保持するマウス A9細胞 （C 1 1— S C 20細胞、 Tomizuka ら， Nature Genet. (USA) ， 第 16 巻， p.133- 143, 1997 年） を用いた。 染色体受容細胞としては、 ヒト正常繊維芽 細胞 HUC— F 2 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 RCB 04 36) を用いた。 はじめに約 1 07個の細胞からミクロセルを調製した。 すなわ ち、 25 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に細胞密度が 80〜 90 %飽和 程度まで培養した C 1 1 - S C 20細胞をコルセミド （0. 05 /2 g/m 1， デ メコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20 %FB S, 800 M g/m 1 G 41 8, DMEM) 中で 48時間培養して微小核を誘導した。 培地を除いた後、 予め 保温 （37°C) しておいたサイトカラシン B (DMEM中に 10 gZm 1 , シ グマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを 挿入し、 34°C, 8， O O O r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血 清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 m、 5 /im、 3 mのフ ィルター (ヮッ卜マン) を装着した S W I NNEX- 25 (ミリポア) を用いて 濾過精製した。 精製したミクロセルは 50 a g/m 1のフィ トヘムァグルチニン P (D i f c o)を含む DMEM 2m 1に再懸濁した。 HUC— F 2細胞を 90 % 飽和の状態まで培養した 25 cm2培養用フラスコ （ファルコン） に精製した微 小核細胞を加え 37°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM中に P EG 1 500 (終 濃度 45% (W/V) 、 ロシュダイァグノステイクス) 又は P EG 1 000 (終 濃度 45% (W/V) 、 シグマ) 、 及び DMS O (終濃度 10 % (W/V) 、 シ ダマ） を溶解し、 ポアサイズ 0. 22 xmフィルター （ザルトリウス） にて濾過 滅菌した溶液で 1分間かけて融合した。 10 %FB Sを含む αΜΕΜ培地にて 4 8時間培養した後、 トリプシン処理により細胞を分散し、 コラーゲン Iコート処 理した 48穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） 1枚に播種した。 2日後に G41 8 (400 g Zm 1 ) を含む選択培地 （1 0 %FB S , αΜΕ Μ) に置き換えた。 約 3週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単 離し、 以後の解析を行った。 4回の微小核細胞融合から 8個の G41 8耐性コロ 二一を得た。
(2 - 2) 微小核細胞融合 （サスペンション法） と薬剤耐性クローンの単離 上記 （ 1 _ 1 ) と同様にしてミクロセルを調製及び精製し、 6m lの DMEM に再懸濁した。 HUC— F 2細胞を 90 %飽和の状態まで 1 7 5 c m 2培養用フ ラスコ (ファルコン) にて培養し、 トリプシン処理にて分散した後、 DMEMで 2回洗浄し DMEM 7m lに再懸濁した。 上記ミクロセル懸濁液に上記 HU C— F 2細胞懸濁液を重層し遠心後、 上清を除きペレツトをタッピングにて懸濁し、 0. 5m 1の P EG 1 500 (終濃度 50 % (WZV) 、 ロシュダイァグノステ イクス） を加え、 1 20秒間にて融合した。 DMEM 5m 1を 1 m 1 / 1分の速 度で加え、 さらに DMEM 5m 1加えて 37 °C 1 0分間静置後、 遠心し 10 %F B Sを含む αΜΕΜ培地に再懸濁してコラーゲン Iコート処理した 48穴組織培 養用プラスチックプレート （ファルコン） 2枚に播種した。 2日後に G41 8 (4 00 g/m 1 ) を含む選択培地 （1 0%FB S , αΜΕΜ) に置き換えた。 約 3週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行 つた。 1回の微小核細胞融合から 6個の G41 8耐性コロニーを得た。
(2 - 3) 移入染色体の確認
移入染色体は， S C 20上に存在する n e o遺伝子の P C R増幅により確認し た。 すなわち、 上記 （2— 1) 及び （2 _ 2) で得られた G41 8耐性細胞 7ク ローンについて、 421Fプライマー （配列番号 40) 及び 778Rプライマ一 （配列 番号 41) を用いた P CR増幅を行った。 H ACベクター移入体は、 n e o遺伝 子を保持することが予想される。 その結果、 全てのクローンにおいて予想された 増幅が確認された。 以上の実験から、 得られた G41 8耐性 HUC— F 2株は S C 20を保持することが確かめられた。 (3) ヒト正常繊維芽細胞 HF— 1 9への S C 20移入：微小核細胞融合と薬剤 耐性クローンの単離 .
染色体供与細胞として、 ヒト 14番染色体断片 （S C 20) を保持するマウス
A 9細胞 （C I 1—S C 20細胞、 Tomizuka ら， Nature Genet. (USA) ， 第 16 巻， p.133- 143, 1997 年） を用いた。 染色体受容細胞としては、 ヒト正常繊維芽 細胞 HF— 1 9 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 RCB 021
0) を用いた。 はじめに約 1 07個の細胞からミクロセルを調製した。 すなわち、
25 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に細胞密度が 80〜 90 %飽和程度 まで培養した C 1 1— S C 20細胞をコルセミ ド （0. 05 i g/m l , デメコ ルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20%FB S, 800 /2 g/m 1 G41 8 , DMEM) 中で 48時間培養して微小核を誘導した。 培地を除いた後、 予め保温 (37°C) しておいたサイトカラシン B (DMEM中に 1 0 g/m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、ァクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、
34°C, 8， 000 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （D MEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 um, 5 rn, 3 /imのフィルタ一（ヮ ットマン）を装着した SW I NNEX- 25 (ミリポア）を用いて濾過精製した。 精製したミクロセルは 50 a g/m 1のフィ トヘムァグルチニン P (P h y t o h ema g g u l u t i n i n-P, D i f c o) を含む DMEM2m 1に再懸 濁した。 HF— 1 9細胞を 90 %飽和の状態まで培養した 25 cm2培養用フラ スコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え 37°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM中に PEG 1 500 (終濃度 45 % (W/V) 、 ロシュダイァグノステ イクス） 及び DMSO (終濃度 10 % (W/V) 、 シグマ） を溶解し、 ポアサイ ズ 0. 22 mフィル夕一 （ザルトリウス） にて濾過滅菌した溶液で 1分間かけ て融合した。 10 %FBSを含む αΜΕΜ培地にて 48時間培養した後、 トリプ +シン処理により細胞を分散し、 コラーゲン Iコート処理した 48穴組織培養用プ ラスチックプレート （ファルコン） 1枚に播種した。 2日後に G41 8 (400 gZm 1 ) を含む選択培地 （10 %FB S , a MEM) に置き換えた。 約 3週 間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。 1回の微小核細胞 融合から 1個の G41 8耐性コロニーを得た。
〔実施例 14〕 ヒト 21番染色体由来 H ACベクターのヒト正常繊維芽細胞への 移入
(1) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
(1 - 1) 染色体供与細胞としてヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一保持 C
H〇細胞を用いた微小核細胞融合
染色体供与細胞として、 実施例 1 0で得られた、 ヒト EPO遺伝子を 1コピー 挿入した、 長腕遠位を削除して 1 o X P配列を挿入した後テロメアトランケーシ ョンにより短腕遠位を削除し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応によりヒト EPO遺伝子を挿入した、 ヒト 21番染色体由来 H ACベクターを保持する CH〇細胞のうち微小核形成能が高 いクローン （H4E C 10細胞） を用いた。 染色体受容細胞としては、 ヒト正常 繊維芽細胞 HFL— 1 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 RCB 0521 ) を用いた。 はじめに約 1 08個の H4 E C 1 0細胞からミクロセルを 調製した。 すなわち、 25 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 48本に細胞密度が 60〜70%飽和程度まで培養した H4E C 1 0細胞をコルセミ ド （0. l g Zm 1 , デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20 %FB S， 800 z g/ m 1 G41 8， F 1 2)中で 4日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、 予め保温（37V) しておいたサイ トカラシン B (DMEM中に 1 0 /2 g/m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 アクリル性遠心容器に遠心用フラスコ を挿入し、 34°C, 8, 000 r pm， 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無 血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 im、 5 rn, 3 の フィルター (ワットマン） を装着した SW I NNEX- 25 (ミリポア） を用い て濾過精製した。 精製したミクロセルは 50 n g/m 1のフィ トヘムァグルチニ ン P (D i f c o)を含む DMEM 2 m 1に再懸濁した。 HF L— 1細胞を 90 % 飽和の状態まで培養した 25 cm2培養用フラスコ （ファルコン） に精製した微 小核細胞を加え 37°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM中に P EG 1 500 (終 濃度 45% (W/V) 、 ロシュダイァグノステイクス） 及び DM SO (終濃度 1 0 % (W/V) 、 シグマ） を溶解し、 ポアサイズ 0. 22 mフィルタ一 (ザル トリウス） にて濾過滅菌した溶液で 1分間かけて融合した。 20 %FB Sを含む DMEM培地にて 48時間培養した後、 トリプシン処理により細胞を分散し、 コ ラ一ゲン Iコート処理した 48穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン） 1枚に播種した。 2日後に G41 8 (300 gZm 1 ) 又はブラストサイジン (6 g/m 1 ) を含む選択培地 （20%FBS , DMEM) に置き換えた。 約 3週間の選択培養を行った。 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析 を行った。 5回の微小核細胞融合から 3個の薬剤耐性コロニーを得た。 上記の細 胞を HCAE細胞と称する。
(1 -2) 染色体供与細胞としてヒト 21番染色体由来 H ACベクター保持マ ウス A 9細胞を用いた微小核細胞融合
染色体供与細胞として、 実施例 12で得られた、 ヒト EP〇遺伝子を 1コピー 挿入した、 長腕遠位を削除して 1 o xP配列を挿入した後テロメアトランケーシ ョンにより短腕遠位を削除し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させることで 1 0 xP配列間の部位特異的組換え反応によりヒト EPO遺伝子を揷入した、 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクタ一を保持するマウス A 9細胞のうち微小核形成能 が高いクローン （ΑΔ 5 1又は ΑΔΕ 5細胞） を用いた。 染色体受容細胞として は、 ヒト正常繊維芽細胞 HFL— 1 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登 録番号 RCB 052 1 ) を用いた。 はじめに約 1 07個の細胞からミクロセルを 調製した。 すなわち、 2 5 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に細胞密度が 80〜90 %飽和程度まで培養した ΑΔ 5 1又は ΑΔΕ 5細胞をコルセミド（0. 1 /i g/m 1 , デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20 %FB S, 600 g/m 1 G41 8, DMEM) 中で 72時間培養して微小核を誘導した。 培地 を除いた後、 予め保温 （37°C) しておいたサイ トカラシン B (DMEM中に 1 0 g/m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 アクリル性遠心容器に 遠心用フラスコを挿入し、 34°C， 8, 000 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 im、 5 urn, 3 mのフィルター (ヮッ卜マン) を装着した S W I NNEX- 25 (ミ リポア） を用いて濾過精製した。 精製したミクロセルは 50 g/m 1のフイ ト ヘムァグルチニン P (Phy t o h ema g gu l u t i n i n-P, D i f c o) を含む DMEM 2m 1に再懸濁した。 H F L— 1細胞を 90 %飽和の状態ま で培養した 2 5 cm2培養用フラスコ （ファルコン） に精製した微小核細胞を加 え 37°Cにて 1 5分間静置した後、 DMEM中に P EG 1 500 (終濃度 45% (W/V) 、 ロシュダイァグノステイクス) 及び DMS〇 (終濃度 1 0 % (WZ V) 、 シグマ） を溶解し、 ポアサイズ 0. 22 /1 mフィルター (ザルトリウス) にて濾過滅菌した溶液で 1分間かけて融合した。 20%FBSを含む DMEM培 地にて 48時間培養した後、 トリプシン処理により細胞を分散し、 コラーゲン I コート処理した 48穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） 1枚に播 種した。 2日後に G41 8 (300 g/m 1 ) 又はブラストサイジン （6 g /m l ) を含む選択培地 （20%FB S， DMEM) に置き換えた。 約 3週間の 選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行った。 1 0回の微小核細胞融合から 27個の薬剤耐性コロニーを得た。 上記の細胞を以後 ΗΔ E細胞と称する。 (2) 移入染色体の確認
移入染色体の確認は、 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクター上の n e o遺伝子 の有無を指標にして P CR増幅により確認した。
以下に P CR増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマ一の配列を示す。
1291F： 5'- CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG -3， (配列番号 42)
1667R： 5'- ATT TGC ACT GCC GGT AGA ACT -3' (配列番号 43)
これらのプライマーは、 プラスミドベクター p S Tn e o B (加藤ら、 C e l 1 S t r u c t F u n c t , 1 2 : 575- 580, 1 987) の塩基配列を 基にして作製した。
1291Fプライマー （配列番号 42) 及び 1667Rプライマー （配列番号 43) を 用いて P CR増幅を行った。 上記ヒト 21番染色体由来 HACベクターを保持す る場合は、 n e o遺伝子の一部を含む約 0. 4 k b pの増幅が予想される。 その 結果、 ΗΔΕ細胞 5クローン全てにおいて予想される増幅が確認された。
以上より、 上記の ΗΔΕ細胞は、 上記ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一を 保持することが確認された。
(3) ヒト 21番染色体由来 HACベクターに挿入された E PO遺伝子の発現 ヒ卜 EPO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生されるヒト EPOタンパク質を 酵素結合免疫吸着検定法 （EL I SA法） により定量した。
単離したブラストサイジン耐性 H CAE細胞 3クローン及び G 41 8又はブラ ストサイジン耐性 ΗΔΕ細胞 8クローンについて、 20%FB S添加した 300 a g/m 1の G4 1 8又は 6 gZm 1のブラストサイジンを含む D MEM培地 0. 5m 1をいれた 48穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） に播 種し、 2日間又は 3日間又は 4日間培養し上清を回収した。 ヒト EPO EL I SAキット （Quantikine IVDH蘭 anEPO I腿 unoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中のヒト E POを希釈なしにて定量した。 その結果を表 1 5に示す。 表 15
Figure imgf000103_0001
ΗΔΕ 51— 1、 ΗΔΕ 5— 1、 ΗΔΕ 5— 2、 ΗΔΕ 5— 3、 ΗΔ E 5 - 4 は、 培養上清中のヒ ト E P〇濃度が上記ヒ ト E P O E L I S Aキッ ト (Quantikine IVD Human EPO I匪 unoassay, R&Dシステム） の検出限界濃度以 上であった。
以上より、 上記の HCAE細胞及び ΗΔΕ細胞クローンは、 ヒ卜 EPOタンパ ク質を産生することが確認された。
〔実施例 1 5〕 ヒト 21番染色体由来 HACベクターへの E P O及びヒトテロメ ラーゼ （hTERT) 遺伝子揷入用べクタ一の構築
(1) 1 o X P配列を含む hTERT発現プラスミド p LN 1—hTERTの構 築
ヒトテロメラ一ゼ （hTERT) 遺伝子は、 コード領域 3399 b pであり、 5 ' 側領域に G及び Cが豊富な配列を含むため、 コード領域の両端に設計したプ ライマーで全長を P CR増幅するには困難が予測された。 それゆえ、 コード領域 を 3つ （l〜8 0 0 b p；以後 5 ' h TERTと称する、 6 7 9〜： L 9 9 3 b p ； 以後 M— XhTRETと称する、 1 9 5 2〜 3 3 3 9 b p ；以後 3， hTRET と称する。 ただし塩基配列位置は開始コドン AT Gの Aを 1として表した） に分 けてそれぞれ P CR増幅及びクローニングした後、 各領域を連結する方法で hT ERT遺伝子をクロ一ニングした。 以下にその方法を示す。
(1— 1) 5 ' hTERTのクローニング
プラスミドベクタ一構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下 に示す：
hTERT Fw6： 5'- CTG CTG CGC ACG TGG GAA G -3' (配列番号 44)
hTERT Rv6： 5'_ GGT CTG GCA GGT GAC ACC AC -3， (配列番号 45)
hTERT Fwl： 5'- GAA GAT CTT CAT CGA TCG GCC ACC ATG CCG CGC GC -3' (配 列番号 4 6 )
hTERT Rv7： 5'- TCA CTC GGT CCA CGC GTC CT -3， （配列番号 4 7)
これらのプライマ一は、 G e n B a n kより入手した塩基配列 （ァクセッショ ン番号醒 003219) を基に作製した。
HL- 6 0 c DNA (Ma r a t h o n -R e a d y c DNA, CLONT E CH) l n gを銬型として、 1ITERT FW6 (配列番号 44) 及び hTERT Rv6 (配列 番号 4 5) をそれぞれ終濃度 0. にて、 LA T a q (宝酒造） 2. 5ュ ニットを用いて 5 0 1の反応液にて P CR増幅を行った。 サーマルサイクラ一 は G e n e Amp 9 6 0 0 (Ap p l i e d B i o s y s t em s )を使用した。 P CRサイクルは、 9 8 °C 1 0分の後、 変性 9 8 °C 3 0秒、 アニーリング及び伸 長 7 2で 5分を 3サイクル、 変性 9 8 °C 3 0秒、 ァニ—リング及び伸長 7 0 °C 5 分を 2サイクル、 変性 9 8 °C 3 0秒、 ァニーリング及び伸長 6 8 °C 5分を 3 5サ ィクル、 にて行った。 さらにこの P CR産物 2 1を铸型として、 hTERT Fwl (配 列番号 4 6) 及び iiTERTRv7 (配列番号 47) をそれぞれ終濃度 0. 4 ^ Μにて、 L A T a q (宝酒造） 2. 5ユニットを用いて 5 0 1の反応液にて P C R増 幅を行った。 PCRサイクルは、 98°C 10分の後、 変性 98°C30秒、 ァニ— リング及び伸長 72 °C 5分を 3サイクル、 変性 98。C 30秒、 ァニーリング及び 伸長 70°C 5分を 2サイクル、 変性 98 30秒、 アニーリング及び伸長 68 °C 5分を 35サイクル、 にて行った。その結果、約 0. 8 kbのDNA断片を得た。 この約 0. 8 k bの DNA断片を Q I AQU I CK PCR Pu r i f i c a t i o n K i t (Q I AGEN) を用いて精製した後、 KOD DNAポリ メラ一ゼ （東洋紡） にて両端を平滑末端とし、 さらに B g 1 I I (宝酒造） にて 消化して 5 '側を突出末端とし、 5 ' hTERTインサート用 DNA断片を得た。 そしてプラスミドベクター p LN 1—EPOを Xh o I (宝酒造） にて消化した 後、 KOD DNAポリメラーゼ （東洋紡） にて両端を平滑末端とし、 さらに B amH I (宝酒造） にて消化しヒト E PO遺伝子を除去して得られた B amH I 一平滑末端サイトに 5 'hTERTィンサ一ト用 DN A断片をクローニングした。 宿主大腸菌には XL— 10 Go 1 d (S TRATAGENE) を用いた。 クロ一 ン化された 5 ' hTERTインサート DNA断片の塩基配列は、 DNAシ一ケン サー （PR I SM3700、 Ap p l i e d B i o s y s t erns) にて解析 し、 Ge nB a n kより入手した塩基配列の相当する部分と同一であることを確 認した。 以上より得られたプラスミドベクターを pLN l _ 5 ' hTERTとし た。 (1一 2) M— XhTERTのクローニング
プラスミドベクタ一構築に用いたプライマ一オリゴヌクレオチドの配列を以下 に示す：
hTERT Fw8-2： 5'- AGT GCC AGC CGA AGT CTG CC -3' (配列番号 48) hTERT 5' XhoIRv3： 5'- GCA GCT GAA CAG TGC CTT C -3' (配列番号 49) hTERT Fw8-1： 5'- AGG ACG CGT GGA CCG AGT GA -3' (配列番号 50 ) これらのプライマーは、 G e n B a n kより入手した塩基配列 （ァクセッショ ン番号 NM 0032 19) を基に作製した。 HL- 60 cDNA (Ma r a t h o n-R e a dy cDNA, CLONT ECH) 0. 25 n gを鍀型として、 hTERT Fw8- 2 (配列番号 48) 及び hTERT 5' XhoIRv3 (配列番号 49) をそれぞれ終濃度 0. にて、 LA T a Q (宝 酒造） 2. 5ユニットを用いて 25 1の反応液にて P CR増幅を行った。 PC Rサイクルは、 98 °C 5分の後、 98°C 1 5秒 . 55°C 30秒 · 72°C 90秒を 40サイクル、 にて行った。 さらにこの P CR産物 1 1を铸型として、 hTERT Fw8-1 (配列番号 50) 及び hTERT 5' XhoIRv3 (配列番号 49) をそれぞれ終濃 度 0. 4 Mにて、 LA T a q (宝酒造） 2. 5ユニットを用いて 25 1の 反応液にて P CR増幅を行った。 サーマルサイクラ一は G e n eAmp 9700 (Ap p l i e d B i o s y s t ems )を使用した。 P CRサイクルは、 98 °C 5分の後、 変性 98。C 1 5秒、 ァニーリング 55 °C 30秒、 及び伸長 72 °C 90 秒を 40サイクル、 にて行った。 その結果、 約 1. 2 k bの DNA断片を得た。
この約 1. 2 k bの DNA断片を Q I AQU I CK PCR Pu r i f i c a t i o n K i t (Q I AGEN) を用いて精製した後、 M 1 u I及び Xh o I (宝酒造） にて消化して突出末端とし、 プラスミドベクター pLN l— EPO 2の M 1 u I -Xh o Iサイ卜へクローニングした。 宿主大腸菌には、 XL- 1 O Go l d (S TR AT AGENE) を用いた。 クローン化された M -XhTE RTインサート DNA断片の塩基配列は、 DNAシーケンサ一 （PR I SM 37 00、 Ap p l i e d B i o s y s t erns) にて角军析し、 Ge nB a n kよ り入手した塩基配列の相当する部分と同一であることを確認した。 以上より得ら れたプラスミドベクタ一を pLN l— Μ— XhTERTとした。
( 1 - 3 ) 3， hTERTのクロ一ニング
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下 に示す：
API： 5'_ CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC - 3， (配列番号 5 1) このプライマ一は、 M a r a t h o n-Re a dy c DNA (CLONTE C H)添付のものを使用した。 hTERT 3， XhoIFw： 5'- CCG AGC GTC TCA CCT CGA GGG TGA AGG CAC TGT TC - 3' (配列番号 52 )
hTERT 3， XhoIFw2： 5'- ATG GAC TAC GTC GTG GGA GCC AGA -3， (配列番号 5 3)
hTERT Rvl： 5'- GTC GAC GCT AGC TCA GTC CAG GAT GGT CTT GAA GT -3， （配 列番号 54 )
これらのプライマ一は、 G e n B a n kより入手した塩基配列 （ァクセッショ ン番号 NMO 032 1 9) を基に作製した。
HL- 60 cDNA (Ma r a t h o n-Re a dy c DNA, C LONT ECH) 0. l n gを铸型として、 hTERT 3' XhoIFw2 (配列番号 53 ) 及び API (配列番号 51) をそれぞれ終濃度 0. にて、 KOD— P l u s— (東洋 紡） 0. 5ユニットを用いて 25 ^ 1の反応液にて P CR増幅を行った。 サ一マ ルサイクラ一は Ge n e Amp 9700 (Ap p l i e d B i o s y s t ern s ) を使用した。 PCRサイクルは、 94 °C 2分の後、 変性 94 °C 1 5秒、 ァニ —リング 60 °C 30秒、 及び伸長 68 °C 3分を 30サイクル、 にて行った。 さら にこの PC R産物 1 1を鍀型として、 hTERT 3' XhoIFw (配列番号 52 ) 及び hTERT Rvl (配列番号 54) をそれぞれ終濃度 0. 3 Mにて、 KOD— P l u s — (東洋紡） 0. 5ユニットを用いて 25 /2 1の反応液にて P CR増幅を行った。 P C Rサイクルは、 98°C 5分の後、 変性 98°C 1 5秒、 アニーリング 55 °C 3 0秒、 及び伸長 72 °C 90秒を 40サイクル、 にて行った。 その結果、 約 1. 4 k bの DNA断片を得た。
この約 1. 2 k bの DNA断片を Q I AQU I CK PCR Pu r i f i c a t i o n K i t (Q I A G E N) を用いて精製した後、 X h o I及び S a 1 I (宝酒造） にて消化して突出末端とし、 プラスミドベクター pLNl—EPO の Xh o Iサイ卜へクローニングした。宿主大腸菌には、 XL— 10 Go 1 d (S TRATAGENE) を用いた。 クローン化された 3， hTERTインサート D N A断片の塩基配列は、 DN Aシーケンサ一 （PR I SM3700、 Ap p l i e d B i o s y s t erns) にて解析し、 Ge nB a n kより入手した塩基配 列の相当する部分と同一であること、 及び pLN l— E PO上 CMVプロモータ 一の転写方向と逆向きに挿入されていることを確認した。 以上より得られたブラ スミドベクターを p LN 1 - 3 ' hTERTとした。
(1 -4) 5 ' hTERT, M_XhTRET及び 3， hTRET領域の連結 上記 (1 - 3) にて得られたプラスミドベクタ一 p LN 1 - 3 ' hTERTを 铸型として、 hTERT 3' XhoIFw (配列番号 52) 及び hTERT Rvl (配列番号 54) をそれぞれ終濃度 0. 3 ιΜにて、 KOD— P l u s— (東洋紡） 0. 5ュニッ トを用いて 50 1の反応液にて P CR増幅を行った。 サーマルサイクラ一は G e n e Amp 9700 (Ap p l i e d B i o s y s t erns) を使用した。 P CRサイクルは、 94 °C 2分の後、 変性 94°C 1 5秒、 アニーリング 60 °C 30 秒、 及び伸長 68 °C 2分を 30サイクル、 にて行った。 その結果、 約 1. 4 k b の DNA断片を得た。
この約 1. 4 k bの DNA断片を Q I AQU I CK P C R Pu r i f i c a t i o n K i t (Q I A G E N) を用いて精製した後、 D N Aシーケンサ一 (PR I SM3700、 AB I ) にて解析し、 G e n B a n kより入手した塩基 配列の相当する部分と同一であることを確認した。 次に、 この約 1. 4 k bの D NA断片を Xh o I及び S a 1 I (宝酒造） にて消化して突出末端とし、 （1— 2) にて得られたプラスミドベクタ一 pLN l—M— XhTERTを M l u I及 び X h o I消化して得られた M— X h T E R T領域とともにプラスミドベクター pLN l— ΕΡ02の M l u I一 Xh o Iサイトからヒト E P〇遺伝子を含む領 域を除去したところへクローニングした。 宿主大腸菌には、 XL— 1 0 Go I d (S TR ATAGENE) を用いた。
得られたクロ一ンのィンサート DN A断片の塩基配列を DN Aシーケンサ一 (PR I SM3700, Ap p l i e d B i o s y s t erns) にて解析した 結果、 M— XhTERT領域内に塩基置換点変異を持ち、 かつ 3 ' hTERT領 域は Ge nB a n kより入手した塩基配列の相当する部分と同一であること、 及 び p LN 1— E P O上 CMVプロモーターの転写方向と順方向に挿入されている ことを確認した。 以上より得られたプラスミドベクタ一を E c oR I及び Xh o Iにて消化し、 M— XhTERT領域を除去したところへ、 （1— 1) にて得ら れた pLN l— 5 ' hTERTを E c o R I及び M 1 u Iにて消化し突出末端化 した CMVプロモーター及び 5 ' hTERT領域を、 pLN l— M— XhTER Tを M 1 u I及び Xh o I消化し突出末端化して得られた M_XhTERT領域 とともにクローニングした。 宿主大腸菌には、 XL— 1 0 Go I d (STRAT AGENE) を用いた。 これにより得られたプラスミドベクタ一を pLN 1— h TERTとした。
(2) 1 o X P配列を含むヒト EPO及び hTERT発現プラスミド pLN l— ΕΡΟ—hTERTの構築
実施例 9 (1) にて作製したプラスミドベクタ一 p LN 1— E PO 2を E c o R I消化して得られた CMVプロモー夕一、 ヒト EPO遺伝子及び S V40ポリ A付加ュニットを含む DN A断片を、 実施例 1 1にて作製したプラスミドベクタ 一 pLN l— hTERTの E c oR Iサイ卜へクローニングした。 これを pLN 1 _EPO_ hTERTとする。 (3) 1 o xP配列を含む 2コピーヒト EP〇及び hTERT発現プラスミド p
LN 1 -EP02一 hTE RTの構築
実施例 9 (1) にて作製したプラスミドベクター p LN 1— E P〇 2を E c o
R I消化して得られた CMVプロモーター、 ヒト EPO遺伝子及び S V40ポリ
A付加ユニットを 2コピー含む DNA断片を、 上記 （1) にて作製したプラスミ ドベクタ一 pLN l— hTERTの E c oR Iサイトへクローニングした。 これ を pLN l— EPO 2— hTERTとする。
(4) 1 o xP配列を含む 4コピーヒト E PO及び hTERT発現プラスミ p LN 1— EP04— hTERTの構築
実施例 9 (2) にて作製したプラスミ ドベクター p LN 1— E P〇 4を E c o R I消化して得られた CMVプロモーター、 ヒト EPO遺伝子及び SV40ポリ A付加ユニットを 4コピー含む DNA断片を、 上記 （1 ) にて作製したプラスミ ドベクター p LN 1— hTERTの E c oR Iサイトへ転写順方向に 4コピー並 ぶようにクローニングした。 これを p LN l— EP04_hTERTとする。
〔実施例 1 6〕 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクタ一への EP〇及び hTERT 遺伝子挿入
実施例 7に記載のヒト EPO遺伝子の場合と同様にして、 ヒト 2 1番染色体由 来 HACベクタ一へヒト EPO遺伝子及び hTERT遺伝子を挿入する。 実施例 1〜4及び 6に記載のように、 テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除 し、 長腕近位に 1 o X Pサイ卜を導入し、 テロメアトランケ一シヨンにより短腕 遠位を削除したヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一を用意した。 一方で 1 o x P配列を含むヒト E PO及び hTERT発現プラスミドを準備し、 C r e組換え 酵素を一過性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応により 人工染色体に挿入することとした。 組換え挿入体の選別は、 G4 1 8耐性の獲得 (プロモー夕一分断型の n e o遺伝子発現ュニットの再構成） を指標とした。 (1) トランスフエクション及び G4 1 8耐性クローンの単離
実施例 1 1にて得られたヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを保持するマウ ス A 9細胞 （Α9 Δ 1 2細胞） を 6ゥエル組織培養用プラスチックプレート （フ アルコン） 1枚にて細胞密度が 6 0〜7 0 %飽和程度までブラストサイジン （4 /i g/m 1 ) を含む選択培地 （1 0 %FB S , DMEM) で培養した。 実施例 1 5の （2) で作製した p LN l— EPO— hTERTベクタ一及び C r e酵素発 現ベクター P B S 1 8 5 (ライフテック） の存在下、 Fu g e n e 6 (ロシュダ ィァグノステイクス) を用いて添付のプロトコールに従ってトランスフエクショ ンを行った。 48時間培養した後トリプシン処理にて分散し、 6ゥエル分を一つ にまとめて G41 8 (6 0 0 g/m 1 ) を含む選択培地 （1 0 % F B Sを添加 した DMEM) に懸濁し、 48穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） 5枚に播種した。 2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、 その頻度は Α9 Δ 1 2細胞 5 X 1 0 fiあたり 4個であった。 コロニーを単離してさらに培養した結果、 1個のコロニーが増殖した。 上記の得られた細胞を以後 A 9 ΔΕΤ 1細胞と称す る。
(2) 移入染色体の確認
(2 - 1 ) P CR解析
A 9 ΔΕΤ 1細胞について解析した。 1 o X Pサイト近傍に位置するヒト 2 1 番染色体長腕近位のマーカー P R ED 6 5及び P RED 3遺伝子 （実施例 1の
(3) 、 図 2参照） について PCR増幅を行った。 1 o X P配列間の部位特異的 組換え反応によるヒト EPO遺伝子挿入体は、 PRED 6 5及び P RED 3遺伝 子を保持することが予想される。その結果、予想された増幅が認められた。次に、 ヒト 2 1番染色体の短腕近位に位置する S TSマーカ一 D 2 1 S 27 5にっき P C R増幅を行った （実施例 6の （ 3 ) 、 図 1 2参照） 。 ヒト 2 1番染色体の短腕 近位で短腕遠位を削除してあるので、 D 2 1 S 2 7 5マーカーを保持することが 予測される。 その結果、 予想された増幅が確認された。
(2 - 2) 薬剤選択培養
ヒト 2 1番染色体由来 HACベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、 すなわち ハイグロマイシン耐性遺伝子 （短腕遠位） 及びプラストサイジン耐性遺伝子が選 択薬剤存在下で機能するかを指標として、 各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持さ れているかを確認した。
A9 ΔΕΤ 1細胞について、 6ゥエル培養ディッシュ （ファルコン） 各ゥエル にて細胞密度が 6 0〜 7 0 %飽和程度まで G 4 1 8 ( 6 0 0 g Zm 1 ) を含む 選択培地 （1 0 %FB S , DMEM) で培養した。 P B S (ギブコ BRL) で 2 回リンスした後、 ハイグロマイシン （ 7 0 0 g/m l、 ギブコ BRL) のみ、 又はブラス卜サイジン (4 g/m 1 ) のみ、 又はブラストサイジン及びハイグ ロマイシン及び G 4 1 8を含む培養液で 1週間培養した。 その結果を表 1 6に示 す。 表 16
Figure imgf000112_0001
以上より A 9△ E T 1細胞がブラス
8耐性を有することを確認した。
(2 - 3) ヒト EPO遺伝子組換え挿入体の確認
組換え挿入体の選別は、 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクター上の 1 o X P配 列部位に挿入されたか否かを、 1 o x P配列部位を挟むようにヒト EPO遺伝子 供与べクタ一由来配列上及び HACベクター上にプライマーを設計し、 P CR増 幅により確認した。
A9 ΔΕΤ 1細胞について、 実施例 9 (4) に示した Neo Rp2プライマー （配 列番号 3 8) 及びプラスミドベクタ一 p B S 226由来の M13RVプライマー （配 列番号 3 9) を用いて P CR増幅を行った。 組換え揷入体の場合は、 pLN l— E POベクタ一由来の CMVプロモーター、 ヒト EP〇遺伝子、 SV40ポリ A 付加配列を含む領域から 1 o X P配列までと p S F 1由来の 1 o X P配列から n e 0遺伝子の一部までを含む約 2. 3 k b pの増幅が予想される。 その結果、 予 想される増幅が確認された。
以上より、 上記の A9 ΔΕΤ 1細胞は、 CMVプロモーター及びヒト E PO遺 伝子及び S V40ポリ A付加配列を含むィンサート DNAをコピー挿入されたヒ ト 2 1番染色体由来 H ACベクターを保持することが確認された。 以上の （2— 1) から （2— 3) の実験より、 Α9 ΔΕΤ 1細胞が、 長腕及び 短腕を削除したヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを保持することが確かめら れた
〔実施例 1 7〕 短腕を削除したヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターのハムスタ 一細胞株への移入
(1) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例 6で得られた、 長腕遠位を削除して 1 o xP配列 を挿入し、 短腕遠位を削除したヒト 21番染色体に基づく HACベクターを保持 する DT40細胞 （DT40 (# 21) h y g 4) を用いた。 染色体受容細胞と しては、 チャイニーズハムスター由来細胞株 CHO— K 1 (ATCCより入手， 登録番号 J CRB 90 1 8) を用いた。 ミクロセルの取得及び CHO細胞との融 合は実施例 3 (1) と同様に行った。 計 4回の融合を行った結果、 選択培養開始 後約 2週間後に計 5株のハイグロマイシン耐性 CHO株を得た。
(2) 移入染色体の確認
(2 _ 1) P CR法
移入染色体の確認を P CR法により行った。 ヒト 21番染色体短腕近位のマー カー p CHB、 D 2 1 S 1 87及び D 21 S 275 (実施例 6の (3 - 1 ) 、 図 1 2参照) の検出を試みた。 ハイグロマイシン耐性の CH〇細胞 5株のうち 2株 (CH〇# 2 1 hy g 4及び CHO# 21 hy g 8) において、 切断点より近位 に位置する D 21 S 275の増幅を確認した。
(2 -2) P CR法
組換えの標的部位を挟んだ配列を P C Rにより増幅した（実施例 6の（ 3— 3 )、 図 1 2参照） 。 CHO# 2 1 hy g4、 8の 2株でのみ増幅産物が得られ、 制限 酵素 N s i I消化でも予想される部分断片の生成を確認した。
(2 -3) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン (F I SH)
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコ一ル， 秀潤社， 1994) に記さ れた方法に従い、ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BR L)を用いて行った。 ハイグロマイシン耐性の CHO株のうちの 2株 （CHO# 21 hy g 4及び CH 〇# 21 hy g 8) について解析したところ、 いずれも観察した分裂像のほとん どにおいて短縮したヒト 2 1番染色体が検出された。 宿主である CHO細胞の染 色体との相対的な大きさから、 短縮したヒ卜 2 1番染色体が CHO細胞に移入さ れたことが確認された。 以上の （1) 及び （2) の実験から、 得られたハイグロマイシン耐性 CHO株 は長腕遠位を削除し 1 o xP配列を挿入し、 短腕遠位を削除したヒト 2 1番染色 体部分断片 （HACベクター） を保持することが確かめられた。
〔実施例 1 8〕 短腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体由来 HACベクターのヒト 細胞株への移入及び安定性の確認
(1) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 1 7で得られた、 長腕遠位を削除して 1 o xP 配列を揷入し短腕遠位を削除したヒト 21番染色体に基づく HACベクタ一を保 持する CHO細胞 （CHO (# 2 1) h y g 4及び CHO (# 21) h y g 8) を用いた。 染色体受容細胞としてはヒト線維肉腫細胞株 HT 1080 (ATCC より入手， 登録番号 CCL— 1 2 1) を用いた。 ミクロセルの取得及び HT 1 0 80細胞との融合は実施例 4 (1) と同様に行った。 CHO (# 21) h y g 4 では 1回の微小核細胞融合から計 7のブラストサイジン耐性 HT 1080株、 C HO (# 2 1) hy g 8では 2回の微小核細胞融合から計 20のブラストサイジ ン耐性 HT 1080株を得た。 (2) 移入染色体の確認
(2 - 1 ) P CR法
移入染色体は、 ブラス卜サイジン耐性遺伝子 （実施例 4 (2 - 1) 参照） 及び ハイグロマイシン耐性遺伝子の P C R増幅により確認した。 用いたオリゴヌクレ ォチドプライマ一の配列を次に示す：
HygroF： 5'- GCGAAGAATCTCGTGCTTTC (配列番号 5 5)
Hygro ： 5'- ATAGGTCAGGCTCTCGCTGA (配列番号 56)
ブラストサイジン耐性遗伝子は、 ブラストサイジン耐性 HT 1 0 8 0株のすべ てにおいて増幅が確認された。 一方ハイグロマイシン耐性遺伝子は、 CHO (# 2 1) h y g 4由来の 7株中 5株、 CHO (# 2 1) hy g 8由来の 3 0株中 2 7株において増幅が確認された。
(2 - 2) 染色体解析
染色体解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコ一ル， 秀潤社， 1994) に記され た方法に従い、 ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BRL) を用いた F I SH 法により行った。代表的な FISH像を図 1 7に示す。ブラストサイジン耐性株では、 親株の HT 1 0 8 0細胞には存在せず、 内在の 2 1番染色体よりサイズの小さい 染色体断片が観察された。 以上の （1) 及び (2) の実験から、 得られたブラス卜サイジン耐性 HT 1 0 8 0株は長腕遠位を削除し 1 o X P配列を挿入し、 短腕遠位を削除したヒト 2 1 番染色体部分断片 （HACベクタ一） を保持することが確かめられた。 (3) 非選択培養条件下での長期継代培養
長腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体と、 さらに短腕遠位を削除したヒト 2 1 番染色体の培養細胞における安定性を確認するために、 非選択条件下で長期継代 培養を行った。 実施例 4に記載したヒト細胞株 （HT 1 0 80 (# 2 1) b s d 7 9— 1— 1， 3, 6, 1 1 , 14、 HT 1 0 8 0 (# 2 1) b s d— H4— 1 , 3， 6、 HT 1 0 8 0 (# 2 1) b s d— H8— 4, 9, 2) を使用した。 ヒト 細胞株用の非選択培養液は 1 0 %C Sを加えた DMEMであり、 選択培養液はこ れにブラストサイジン 4 g/m 1を添加した。 ヒト細胞株は 5. 0 X 1 05細 胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、 3日後に細胞を計数して再び 5. 0 X 1 0 5細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種した。ヒ卜細胞株は集団倍加数 25, 50, 1 00にそれぞれ細胞を回収し染色体標本を作製した。
(4) 染色体解析
ヒト細胞における人工染色体の検出は、 黒木ら （細胞工学ハンドブック， 羊土 社， 1992) に記された方法に従いギムザ染色法により行った。 分裂中期染色 体像 20個においてミニ染色体の有無を観察して保持率を算出し、 5クローンの 平均値を出した。 その結果を表 1 7に示す。 表 17: #21HACの HT1080細胞における安定性
Figure imgf000116_0001
ヒト 2 1番染色体部分断片は、 HT 1 080細胞において分裂回数 100回時 点で安定に保持されていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あ たり 1ないし 2本の部分染色体が認められた。 以上の （3) 及び （4) の実験により、 ヒト 21番染色体の長腕遠位を削除し た部分断片と、 さらに短腕遠位を削除した部分断片は HT 1 080細胞株におい て非選択培養条件で安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持さ れていることが明らかとなつた。
〔実施例 1 9〕 ヒト細胞株におけるヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一への G F P遺伝子挿入
(1) トランスフエクシヨン及び G 41 8耐性クローンの単離 実施例 1 8で作製したヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを保持するヒト H T 1 080細胞株 （HT 1080 (# 2 1) b s d 79— 1— 6， 14、 HT 1 080 (# 2 1 ) b s d— H4— 1, 6、 HT 1080 (# 2 1) b s d— H8 ― 2) をトリプシン処理し、 6ウェルクラスター (ヌンク) の 1ゥエルあたり 4 X 1 05細胞を播種し 1日間培養した。 実施例 5 (1) で作製した Ι ο χΡ配列 を含む GF P発現プラスミド 2 gと C r e酵素発現ベクター p B S 1 8 5 (ラ ィフテック) 1 i gを 7. 5 a 1のリボソーム溶液 （リボフェクトァミン 200 0、 インビトロジェン） と混合して培地に添加し 5時間後に培地を交換した。 1 日培養後トリプシン処理し、 1 0 %C Sを添加した DMEM培地に懸濁して 1 0 0 mmディッシュ 2枚に播種した。翌日 40 0 g/m 1の G41 8 (GENETIC IN, シグマ） を含む培地と置き換えた。 約 2週間後には耐性コロニーが出現し、 その 頻度は HT 1 080細胞 4 X 1 05あたり 3〜 14個であった。 コロニ一を単離 して増殖させ、 以後の解析を行った。 (2) ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターに挿入された GF P遺伝子の発現 単離した G 41 8耐性 HT 1080細胞株を蛍光顕微鏡下で観察した。 その結 果、 2 1△ QHACでは 21クローン中 14クロ一ンにおいて、 また 21 Δρ ςί HACでは 3 1クロ一ン中 2 8クローンにおいて GF Pの発現が確認された。 代 表的な蛍光顕微鏡像と可視光顕微鏡像を図 1 8 a及び bに示す。
(3) 相同組換え体の確認
相同組換え体を確認するため、 組換えの標的部位を夾んだ配列を P CRにより 増幅した。 p B S 226及び p S F 1プラスミド上に設定したプライマーオリゴ ヌクレオチドの配列を以下に示す。
CMVneo689:5'- GCCATCCACGCTGTTTTGAC (配列番号 57)
CMVneo910:5'- GCATCAGAGCAGCCGATTGT (配列番号 58)
G F P遺伝子の発現によらず全ての G 41 8耐性クローンで P C R増幅が認め られ、 相同組換え体であることを確認した。 以上 （1) 〜 （3) の実験より、 ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターにはヒ ト細胞株中においても遺伝子の挿入が可能であり、 挿入された遺伝子が発現する ことが確かめられた。
(4) 長期継代培養後の GF P遺伝子の発現
G41 8耐性 HT 1 0 8 0細胞株から任意の 7株を選び、 選択薬剤非添加の条 件で継代培養した。 培養開始から 1ヶ月後 （集団倍加数約 3 0) に蛍光顕微鏡下 で観察した結果、いずれのクローンにおいても GF P遺伝子の発現が確認された。 以上の実験 （4) より、 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターに挿入された遺 伝子は挿入部位の位置効果を受けて発現が減弱することなく安定に発現を維持す ること、 すなわち HACベクター上の遺伝子挿入サイトはヘテロクロマチン領域 でないことが確かめられた。
〔実施例 20〕 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一のマウス E S細胞株への移 入及び安定性の確認
(1) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 5で得られた長腕遠位を削除して 1 o x P配列 を導入したヒ卜 2 1番染色体由来 HACベクタ一に GF P遺伝子を挿入した CH O細胞株 （CHO (# 2 1) A qGFP 7— 2) と、 実施例 17で得られた長腕遠 位を削除して 1 o X P配列を導入し短腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体由来 H ACベクターを保持する CHO細胞 （CHO (# 2 1) Hy g 8) を用いた。 受 容細胞としてはマウス E S細胞株 Ε· 1 4 (Hooperら， Nature, 326 :292, 1987) を用いた。 E 14の培養方法は （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8， ジ一 ン夕ーゲッティング、 羊土社、 1 9 9 5) に記された方法に従い、 栄養細胞とし てはマイトマイシン C処理したマウス胚初代培養細胞 （インビトロジェン） を用 いた。 まず約 1 08個の供与細胞からミクロセルを調製し全量 5m 1の DMEM に懸濁した。 約 1 07個の E 1 4を DMEMで 3回洗浄し、 5m lの DMEMに 懸濁した後、 ミクロセルとあわせ、 1 2 5 0 r pm、 1 0分間遠心して上清を除 いた。 沈殿をタッピングによりょくほぐし、 1 : 1. 4 PEG溶液 （5 g PE G 1 000 (和光純薬） 、 1m l DM SO (シグマ） を 6m l DMEMに溶解） 0. 5m 1を加えて室温で 1分 3 0秒静置した後、 1 0 m 1の DMEMをゆつく りと加えた。 直ちに 1 2 50 r pm、 1 0分間遠心して上清を除き、 沈殿を 30 m 1の E S細胞用培地に懸濁し、 直径 1 0 0 m 1の組織培養用プラスチックシャ —レ （ファルコン） 3枚に播種した。 24時間後にCHO (# 2 1 ) Δ q GF P 7 - 2を供与細胞とする場合 3 00 gZm lの G41 8 (GENETICIN、シグマ）、 CHO (# 2 1) Hy g 8を供与細胞とする場合 1 50 g/m 1のハイグロマ イシン （Hygromycin- B、 和光純薬） 加えた培地と交換し、 その後毎日培地を交換 した。 1週間〜 1 0日後には耐性コロニーが出現したが、 その頻度は E 14細胞 1 07個あたり 2〜5個であった。 そのコロニーを単離し増殖させ、 5 X 1 07個 あたり lm lの保存用培地 （E S細胞用培地 + 1 0 %DMS O (シグマ） ） に懸 濁し、 一 8 0°Cにて凍結保存した。 同時に各耐性株について約 1 06個の細胞か らゲノム DNAを調製した （Puregene DNA Isolation Kit ( G e n t r a S y s t e m社) ) 。
(2) P CR解析
移入染色体と保持領域は P CR増幅により確認した。 以下に示すプライマ一ォ リゴヌクレオチドを新たに設定した：
#21p76957： 5'- ACACTTTTGACAAACACACCAG (配列番号 59)
#21p77555： 5'- TCAACAATGAAAGGGGATGTC (配列番号 6 0)
これらのプライマーは、 Ge nB a n kより入手した塩基配列 （ァクセッショ ン番号 AL 1 6 32 0 1 ) を基に作製した。 解析に用いたオリゴヌクレオチドプ ライマーを下記表 1 8に示す： 表 18
Figure imgf000120_0001
以上の結果を図 1 9に示す。 得られた薬剤耐性株では、 いずれも移入した染色 体領域の一部が欠失していた。
( 3 ) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン (F I S H) 解析
F I S H解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1994) に記さ れた方法に従い、ヒト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ B R L)を用いて行った。 その結果、 観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト 2 1番染色体が検出 された。 代表的な F I SH像を図 2 0 a及び bに示す。 CHO (# 2 1 ) Δ q G F P 7— 2由来 G4 1 8耐性株では 5株中 1株 （E 1 4 (# 2 1 ) n e o 1 ) で ヒト染色体断片が観察された。 CH〇 （# 2 1 ) Hy g 8由来ハイグロマイシン 耐性の 2株では、 いずれもヒト染色体断片が観察された。 このうち E 1 4 (# 2 1 ) Hy g 1では 2本のヒト染色体断片が、 E 1 4 (# 2 1 ) Hy g 2では 1本 のヒト染色体断片が観察された。 ヒト染色体の確認された上記 3株では、 宿主で あるマウスの染色体数はいずれも 4 0本で正常であることを確認した。 以上の （2) 及び （3) の結果から、 得られた G4 1 8耐性ないしハイグロマ イシン耐性 E 14株はヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを保持することが確 かめられた。
(4) 非選択培養条件下での長期継代培養
ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターのマウス E S細胞における安定性を確認 するために、 非選択条件下で選択培養を行った。 上記 （3) で作製したマウス E S細胞株 E 14 (# 2 1) n e o l、 E 14 (# 2 1) Hy g l、 E 14 (# 2 1) Hy g 2を使用した。 マウス ES細胞用の非選択培養液は 1 8. 2 %F B S (インビトロジェン） 、 3. 5 g/ 1グルコース （シグマ） 、 0. 1 2 5mM M EM非必須アミノ酸 （インビトロジェン） 、 l O O OUZm l L I F (E S G R0、 和光純薬) 、 0. ImM 2—メルカプトエタノール (シグマ) を加えた DMEMである。 マウス E S細胞株は 1 X 1 07細胞を 1 0 c m径ディッシュ中 の栄養細胞上に播種し、 2日後に 1Z1 5を 1 0 cm径ディッシュ中の栄養細胞 上に播種した。 培養開始から 14, 28, 42日後にそれぞれ細胞を回収し、 染 色体標本を作製した。
(5) 染色体解析
マウス ES細胞におけるヒ卜 2 1番染色体由来 HACベクターの検出は松原ら (F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1994) に記された方法に従い、 ヒト特異 的プロ一ブ C o t 1 (ギブコ BRL) を用いた F I SH解析法により行った。 2 0個の分裂中期像においてヒト染色体断片の有無を観察し、 保持率を算出した。 その結果を表 1 9に示す。 長期継代培養は各株とも 3連で行い、 保持率としてそ の平均を示した。 表 19
Figure imgf000122_0001
ヒト 2 1番染色体から長腕遠位を削除した部分断片は、 非選択条件下での長期 継代培養に伴って減少する傾向を示した。 これに対してヒト 2 1番染色体から長 腕遠位、 短腕遠位をともに削除した部分断片は、 分裂回数 7 5回を超えても減少 することなく安定に保持されていた。 また長期継代培養開始時点で細胞あたりの 染色体断片のコピー数が 1であった株では、 コピー数の増加はみられなかった。 長期継代培養開始時点で細胞あたりの染色体断片のコピ一数 2が優性であった株 では、 僅かながらコピ一数が減少する傾向がみられた。 以上の （4 ) 及び （5 ) の実験により、 ヒ卜 2 1番染色体の長腕遠位及び短腕 遠位を削除した部分断片はマウス E S細胞株において非選択培養条件下で安定に 保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとな つた。
〔実施例 2 1〕 ヒト 2 1番染色体由来 HA Cベクターのヒト体幹細胞株への移入 及び安定性
( 1 ) 微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、 実施例 1 7で得られた、 長腕遠位を削除して 1 o x P 配列を挿入し短腕遠位を削除したヒト 2 1番染色体に基づく H A Cベクターを保 持する CHO細胞 （CHO (# 2 1 ) h y g 4及び C HO (# 2 1 ) h y g 8) を用いた。 染色体受容細胞としてはヒト hTERT遺伝子及びヒトパピロ一マウ ィルス E 6ZE 7遺伝子により株化したヒト骨髄由来間葉系幹細胞株 h i MS C (京都大学、 戸口田淳也教授より入手、 Okamoto ら、 Biochem. Biophys. Res. Comfflun. , 295: 354, 2002) を用いた。 h i MS C株は、 1 0 %FB Sを添加した DMEM培地を用いて培養した。 はじめに約 1 07個の CH〇 （# 2 1 ) h y g 4/ 8細胞からミクロセルを調製した。すなわち、 2 5 cm2遠心用フラスコ （コ —スター） 6本に細胞密度が 6 0〜7 0 %飽和程度まで培養した CHO (# 2 1 ) h y g 4/ 8細胞をコルセミド (0. 0 7 5 /2 g /m 1 , デメコルシン， 和光純 薬） を含む培養液 （1 0 %F B S， 8 g/m 1ブラストサイジン， F 1 2) 中 で 4 8時間培養して微小核を誘導した。 培地を除いた後、 予め保温 （3 7°C) し ておいたサイトカラシン B (DMEM中に 1 0 /i gZm 1， シグマ） 溶液を遠心 用フラスコに満たし、 アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、 3 4°C, 8， 0 0 0 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、フィル夕一で濾過して精製した。 6 cm径ディッシュに 8 0 % 飽和の状態まで培養した h i MS C細胞に、 精製した微小核細胞を加え P EG溶 液で融合した。 4 8時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、 ブラストサイ ジン （8 / g/m l ) を含む選択培地 （1 0 %C S, DMEM) で培養した。 約 2週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行 つた。 CHO (# 2 1 ) h y g 4では 1クローン、 CHO (# 2 1 ) h y g 8で は 4クローンのブラス 1、サイジン耐性 h i MS C株を得た。
(2) 移入染色体の確認
(2— 1 ) P CR法
移入染色体は、 ブラストサイジン耐性遺伝子 （実施例 4 (2 - 1 ) 参照） 及び ハイグロマイシン耐性遺伝子 （実施例 1 8 (2 - 1 ) 参照） の P CR増幅により 確認した。 プラストサイジン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子ともに検 索した 5株のブラストサイジン耐性 HT 1 0 8 0株のすべてにおいて増幅が確認 された。
(2 - 2) 染色体解析
染色体解析は、 松原ら （F I SH実験プロトコ一ル， 秀潤社， 1994) に記され た方法に従い、 ヒト特異的プロ一ブ C o t 1 (ギブコ B R L) を用いた F I S H 法により行った。 代表的な F I S H像を図 2 1に示す。 ブラストサイジン耐性株 では、 親株の h i MS C細胞には存在せず、 内在の 2 1番染色体よりサイズの小 さい染色体断片が観察された。 以上の （1 ) 及び (2) の実験から、 得られたブラストサイジン耐性 h i MS C株は長腕遠位を削除し 1 o x P配列を挿入し、 短腕遠位を削除したヒト 2 1番 染色体部分断片 （H ACベクタ一） を保持することが確かめられた。 (3) 非選択培養条件下での長期継代培養
ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターの、 多分化能を持つヒト体幹細胞におけ る安定性を確認するために、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 上記 （1 ) 及び （2) で作製したヒト間葉系幹細胞株 （h i MS C (# 2 1 ) b s d -H4 — 1、 h i MS C (# 2 1 ) b s d— H 8— 1， 2， 3， 4) を使用した。 ヒト 細胞株用の非選択培養液は 1 0 % F B Sを加えた DMEMであり、 選択培養液は これにブラストサイジン 4 /1 g/m 1を添加した。 ヒ卜細胞株は 5. 0 X 1 05 細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、 3日後に細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種した。 ヒト細胞株は培養開始時点から集 団倍加数 1 5， 4 0， 9 0にそれぞれ細胞を回収し染色体標本を作製した。
(4) 染色体解析
ヒト間葉系幹細胞におけるヒト 2 1番染色体由来 HACベクタ一の検出は、 松 原ら （F I SH実験プロトコール， 秀潤社， 1994) に記された方法に従い、 ヒト 2 1番染色体由来アルフォイド特異的プローブ p 1 1—4 (名古屋大学、 舛本寛 教授より入手、 Ikenoら、 Hum. Mol. Genet., 3: 1245, 1994) を用いた F I SH 法により行った。 分裂中期染色体像 50個においてミニ染色体上の蛍光シグナル の有無を観察して保持率を算出した。 その結果を表 20に示す。 表 20: #21HACの hiMSC細胞における安定性 細胞株 薬剤選択 保持率％
OPDL 15PDL 40PDL 90PDL
HiMSC(#21)-H4-l + 96 92 94 88
― 82 77 65
HiMSC(#21)-H8-l + 100 98 98 95
― 75 73 84
Hi SC(#21)-H8-2 + 87 82 82 80
― 80 77 80
HiMSC(#21)-H8-3 + 100 89 94 90
― 87 88 80
HiMSC(#21)-H8-4 + 89 87 88 90
― 75 77 80 ヒト 2 1番染色体部分断片は、 h i MS C細胞において分裂回数 90の時点で 安定に保持されていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1コピーの部分染色体断片が認められた。 以上の （3) 及び （4) の実験により、 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクター は h i MS C細胞株において非選択培養条件で安定に保持されること、 また細胞 あたりのコピ一数は維持されていることが明らかとなつた。
〔実施例 2 2〕 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを移入したヒト体幹細胞株 のインビトロ分化誘導による多分化能の確認
実施例 2 1で作製したヒト 2 1番由来 HACベクタ一を移入したヒト間葉系幹 細胞を Okamotoら （Biochem. Biophys. Res. Commun.， 295: 354, 2002) の方法 に従って分化誘導し、 骨、 軟骨、 脂肪細胞への分化能を調べた。 実施例 2 1に記 載したヒト間葉系幹細胞株 （h i MS C (# 2 1 ) b s d -H 8 - 1 ) 及びその 親株 （h i MS C) を使用した。
( 1 ) 骨細胞への分化誘導
h i MS C細胞を、 3 X 1 03Zcm2の密度で播種し、 1 0 %F B Sを含む D MEM培地に 1 0 0 nMデキサメタゾン （シグマ） 、 5 0 x Mァスコルビン酸 2 リン酸 （シグマ） 、 1 0mMj3グリセ口リン酸 （シグマ） を添加した培地中で 2 1 日間培養した。 この間培地は 2日毎に交換した。 (2) 軟骨細胞への分化誘導
2. 5 X 1 05の h i MS C細胞を 1 5m l容のポリプロピレンチューブ （コ —ニング） に回収し室温で 8 0 0 r pm 5分間遠心した。 細胞沈殿を、 高ダルコ ース DMEMに 1 0 n g/m 1 ヒト TGF— ) 3 3 (インビトロジェン） 、 1 0 0 nMデキサメタゾン (シグマ) 、 6 a g/m 1インスリン (ロシュ) 、 1 0 0 / Mァスコルビン酸 2リン酸（シグマ） 、 1 mMピルビン酸ナトリウム （シグマ） 、 6 g m 1 トランスフェリン (シグマ) 、 0. 3 5 mMプロリン (シグマ) 、 1. 2 5mg/m 1ゥシ血清アルブミン (インビ卜ロジェン) を添加した培地に 再懸濁して遠心したのち、 細胞塊の状態で 2 1 日間培養した。 この間培地は 2日 毎に交換した。
(3) 脂肪細胞への分化誘導
h i MS C細胞を培養ディッシュに 3 X 1 03Z c m2の密度で播種し、 コンフ ルェン卜まで培養したのち、誘導/維持培養を 3回繰り返した。誘導培養は 1 0 % F B Sを含む DMEMに 1 zMデキサメタゾン （シグマ） 、 0. 2mMインドメ 夕シン (シグマ) 、 1 0 /1 g/m 1インスリン (シグマ) 、 0. 5 mM 3 _イソ プチルー 1ーメチルキサンチン (シグマ) を添加した誘導培地で 3日間行った。 維持培養は 1 0 %F B Sを含む DMEMに 1 0 g/m 1インスリン （ロシュ） を添加した維持培地で 2日間行った。 (4) 組織染色
2 1日間の培養後、 細胞は P B Sで 2度洗ったのち 10 %ホルマリンで固定し た。 骨細胞分化では 5%硝酸銀 （ナカライ） 、 脂肪細胞分化では 0. 3%オイル レツド DO (ナカライ） 、 により染色した。 軟骨細胞分化では固定した細胞塊をェ 夕ノールにより脱水しキシレンで洗浄したのちパラフィン包埋し、 切片をアルシ アンブル一 (ナカライ) により染色した。
ヒト 2 1番染色体由来 H ACベクタ一を移入した間葉系幹細胞株 h i MS C (# 21) b s d— H8— 1を分化誘導すると、 親株の h i MS Cと同様、 骨、 軟骨、 脂肪細胞に特異的な組織染色に対し陽性であった。 以上の （1) 〜 （4) の実験結果から、 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクター を移入した間葉系幹細胞は、 骨、 軟骨、 脂肪細胞への多分化能を維持しているこ とが確かめられた。
〔実施例 23〕 力二クイザル E S細胞へのミクロセル法によるヒト 14番染色体 断片導入
染色体供与細胞としてはヒト 14番染色体断片 S C 20 (Tomizuka ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000) を保持するマウス A 9細胞株 （以下 A9/S C 20, という) を用いた。 染色体受容細胞としては力二クイザル E S 細胞株 CMK6. 4 (Suemori ら、 Dev. Dyn. 222, 273-279, 2001) を用いた。 CMK6. 4の培養は、 Suemori ら （前記） に記載された方法に従って実施した。 培地の組成は、 DMEM/F 1 2 (S I GMA D- 6421 ) に、 20 %KS R (Knock out serum replacement, G I BCO B R L) 、 非必須アミノ酸溶液 （x 1 00, S I GMA M 7 145 ) 、 及び Lグルタミン溶液 (X 1 00 , S I G MA M 7522) を添加したものである。 まず、 清水ら （細胞工学ハンドブッ ク、 羊土社、 1 992) の報告した方法に従い、 2 5 cm2フラスコ (Nu n c 1 52094) 24本 （70〜 80 %コンフル一ェント) の A 9/S C 20細胞 からミクロセルを調製した。 得られたミクロセルは全量を 5m 1の DMEM (S I GMA D— 5796) に懸濁した。 ：！〜 5 X 106個の C MK 6. 4細胞を 卜リプシン液 (0. 25%トリプシン、 20 %KS R) で分散させた後、 DME Mで 2回洗浄し、 5m 1の DMEMに懸濁した後、 ミクロセルとあわせ、 150 0 r pm、 7分間遠心して上清を除いた。融合に用いる 1： 1. 4 PEG溶液は、 l gの PEG (S I GMA) を 1. 2 m 1の DMEMに溶解し、 0. 2ml DM SO (S I GMA) を添加することにより調製した。 沈殿をタッピングによりよ くほぐし、 37°Cでプレインキュべ一卜した 1 ： 1. 4PEG溶液 1. 0mlを 加えて室温で 2分間静置した後、 10m 1の DMEMをゆっくり加えた。 直ちに 1500 r pm、 7分間遠心して上清を除き、 沈殿を 4mlの ES細胞用培地に 懸濁し、 あらかじめ G418耐性栄養細胞をまいた直径 35mmの組織培養用プ ラスチックシャーレ 2枚に播種し、 CO 2インキュベータ一（3 7°C、 5 C02) で培養した。 24時間後、 50 g/m 1の G418を加えた培地と交換し、 そ の後毎日培地交換を行った。 1週間から 10日後には薬剤耐性コロニーが出現し た。 ピックアップされた薬剤耐性 ES細胞コロニーをあらかじめ G418耐性栄 養細胞をまいた 4ゥエルプレートに播種し、 50 X g/m 1の G418存在下で さらに 10日間培養を行った。 その結果生き残った ES細胞コロニーを再度ピッ クアップして、 あらかじめ栄養細胞をまいた 4ゥエルプレートに播種し、 非選択 条件下でさらに 10日間培養を行った。 増殖した ES細胞は、 アルカリ性フォス ファターゼ染色 （Suemori ら、 前記） 陽性であり、 未分化能を維持していること が示された。 さらに定法に従って抽出されたゲノム DNAを用いた導入染色体保 持確認は以下の通り実施した。
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 14番染色体断片に含まれる Ne o 遺伝子 （pSTne oB, Tomizuk ら， Nature Genet. 16, 133-143, 1997) の 存在を P CR法により検出した。 以下に使用したプライマ一オリゴヌクレオチド の塩基配列を示す。 反応条件は、 約 0. 1 gのゲノム DNAを鐯型とし、 Ta Qポリメラーゼとしては夕カラ E xT a Qを用い、 94°C 5分の反応を 1サイク ル行った後、 94 °C 1 5秒、 59 °C 1 5秒及び 72 °C 20秒を 3 5サイクル行つ た。
neoF： TGAATGAACTGCAGGACGAG (配列番号 61 )
neoR： ATACTTTCTCGGCAGGAGCA (配列番号 62 ) 得られた G41 8耐性サル E S細胞クロ一ン 1種について、 PCR解析を行つ た結果、 N e o遺伝子 （p S T n e o B) の存在を示す、 特異的な増幅産物が検 出された。 これらの実験により、 ミクロセル法によるヒト 14番染色体断片 S C 20の力二クイザル E S細胞株への移入が示された。 また、 力二クイザル、 ァカ ゲザル、 及びヒトを含む霊長類 ES細胞はその性質が非常に似ていることが知ら れている （末盛ら、実験医学、 Vol.21、 No.8、 p 46— 5 1、 2003、羊土社）。 よってこの結果は、 薬剤耐性マーキングされたヒト染色体 （断片） 及びヒト人工 染色体 （HAC) を本実施例に記載の方法により、 力二クイザル ES細胞を含む 霊長類 E S細胞に移入可能であることを示している。 〔実施例 24〕 ヒト 2 1番染色体由来 HACベクターを移入したマウス E S細胞 株のインビトロ分化誘導による分化能の確認
実施例 20で作製した、 GF P遺伝子を挿入したヒト 21番染色体 HACべク ターを保持するマウス E S細胞を神経分化誘導し、神経細胞への分化能を調べた。 マウス ES細胞は、 実施例 20に記載したマウス E S細胞株 E 14 (# 2 1) n e ο 1を使用した。
(1) GFP発現細胞の分取
E 14 (# 21) n e o 1細胞は、 直径 100mmの組織培養用プラスチック シャーレ中の、 マイ トマイシン C処理したマウス胚初代培養細胞 （インビトロジ ェン） 上に播種し、 20 %FB Sを含む DMEM (インビトロジェン） に 2 mM L一グルタミン酸 （インピトロジェン） 、 0， 2mM 2—メルカプトエタノー ル （シグマ） 、 ImMピルビン酸ナトリウム （インビトロジェン） 、 0. ImM MEM非必須アミノ酸、 1000 U/m l L I F (和光純薬） を添加した培地 で培養した。 0. 1 %トリプシン、 0. 04%EDTA処理により分散した細胞 を j:咅地中に回収して PB Sで 2回洗った後、 1 X 1 06個 Zm 1になるよう P B Sに懸濁してセルソーター (EP I CS EL I TE、 ベックマン'コールター） にかけ、 GFP発現細胞を分取した。 (2) 神経細胞への分化誘導
分化誘導用の栄養細胞であるマウス骨髄由来 P A 6細胞は、 1 0 % F B Sを含 む αΜΕΜ (インピトロジェン） に 2mM L—グルタミン酸 （インビトロジェ ン） を添加した培地で培養した。 上記 （1) で分取した GFP発現 E S細胞 1 X 1 03個を、 血清及び L I Fを含まない分化誘導用培地に懸濁してスライドチヤ ンバー （ヌンク） 中の PA6細胞上に播種した。 分化誘導用培地は 1 0 %ノック アウト血清リプレースメント （インビトロジェン） 'を含む G— MEM (インビ卜 ロジェン） に 2mM L—グルタミン酸 (インビ卜ロジェン) 、 0 , 2mM 2 —メルカプトエタノール (シグマ) 、 1 mMピルビン酸ナトリウム (インビトロ ジェン） 、 0. ImM MEM非必須アミノ酸を添加したものである。 10日間 培養した後 4%パラホルムアルデヒドで固定し、 神経細胞で特異的に発現する )3 チューブリンに対する抗体 （TUJ 1、 Berkeley Ant i body Company) により免疫 染色し共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。 突起を伸長し神経細胞の形態を呈し、 抗 ]3チューブリン抗体で染色される細胞において GFPの発現が確認された。 代表 的な共焦点蛍光顕微鏡像を図 22 a及び bに示す。 以上 （1) 〜 （2) の実験より、 ヒト 21番染色体由来 HACベクターを移入 した E S細胞は、 神経細胞への分化能を維持していることが確かめられた。 産業上の利用可能性
本発明により、 ヒト人工染色体 （HAC) ベクターが提供される。 本 HACベ クタ一は、 その全体のサイズが縮小化されかつ不必要な遺伝子が削除されている ため細胞中で安定に保持される。 また本 HACベクターは、 ヒト染色体に基づい て作製されているため、大きなサイズの外来 DN Aを挿入することが可能である。 また本 HA Cベクターには、 部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されている ため、 外来 DNAをカセット形式で簡便に導入することができ、 またその導入位 置を適宜設定することができることから位置効果を受けることもない。 さらに本 H ACベクタ一を用いることによって、 大きなサイズの外来 DN Aを細胞に導入 し、 発現させることができる。 従って、 本 HACベクタ一は、 所望のタンパク質 をコードする遺伝子の高発現による該タンパク質の生産、 機能未知の遺伝子又は タンパク質の生体内機能解析、 大きなサイズの DNAのクローニングのために使 用することができ、 遺伝子工学に関連する分野において有用である。 配列表フリーテキスト
配列番号 1〜 62 ：合成ォリゴヌクレオチド

Claims

請 求 の 範 囲
I . 長腕遠位及び Z又は短腕遠位が削除されたヒト 21番染色体断片又はヒト 1 4番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体べクタ一。
2. ヒト 21番染色体断片又はヒト 14番染色体断片が約 2〜1 6Mbである、 請求項 1記載のヒト人工染色体ベクター。
3. ヒト 21番染色体の長腕遠位が 21 q 1 1領域内で削除されている、 請求項 1又は 2記載のヒト人工染色体ベクター。
4. ヒト 2 1番染色体の長腕遠位が AL 163204において削除されている、 請求項 3記載のヒト人工染色体べクタ一。
5. ヒト 21番染色体の短腕遠位が 21 p領域内で削除されている、 請求項 1又 は 2記載のヒト人工染色体べクタ一。
6. ヒト 21番染色体の短腕遠位が AL 1 63201において削除されている、 請求項 5記載のヒト人工染色体ベクター。
7. ヒト 14番染色体の長腕遠位が 14 Q領域内において削除されている、 請求 項 1又は 2記載のヒト人工染色体べクタ一。
8. ヒト 14番染色体の長腕遠位が A L 1 57858又は A L 51 231 0にお いて削除されている、 請求項 7記載のヒト人工染色体べクタ一。
9. ヒト 14番染色体の短腕遠位が 14 p領域内において削除されている、 請求 項 1又は 2記載のヒト人工染色体ベクター。
10. ヒト 14番染色体の短腕遠位が、 OR4H 12、 OR4Q4、 RNR 2、 OR4L l、 RNU6 C、 FDP SL 3、 K 1 2T、 C 14 o r f 57、 OR 6 S 1、 M1 95、 OR4K14、 MGC 27 1 65、 LCH、 OR 10 G 3 , OR4K3、 〇R4 E 2、 H 1 RNA、 ATP 5 C 2 , OR 1 1 H 6 , 及び〇 R 4M 1からなる群より選択される少なくとも 1の位置において削除されて いる、 請求項 9記載のヒト人工染色体ベクター。
I I . ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び Z又は短腕近位に 部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されていることを特徴とする、 請求項 1〜 10のいずれか 1項に記載のヒト人工染色体ベクター。
1 2. 部位特異的組換え酵素が C r e酵素である、 請求項 1 1記載のヒ卜人工染 色体ベクター。
1 3. 部位特異的組換え酵素の認識部位が 1 o xP配列である、 請求項 1 1又は 1 2記載のヒト人工染色体べクタ一。
14. 部位特異的組換え酵素の認識部位がヒト 2 1番染色体の長腕近位の AL 1 63203に揷入されている、 請求項 1 1〜 1 3のいずれか 1項に記載のヒト 人工染色体ベクター。
1 5. 部位特異的組換え酵素の認識部位がヒ卜 14番染色体の長腕近位の AL 1 57 8 58又は AL 5 1 23 1 0の前記削除位置よりも近位に挿入されてい る、 請求項 1 1〜1 3のいずれか 1項に記載のヒト人工染色体べクタ一。
1 6. 部位特異的組換え酵素の認識部位がヒ卜 14番染色体の短腕近位の 14 p 1 2領域内の前記削除位置よりも近位に挿入されている、 請求項 1 1〜1 3の いずれか 1項に記載のヒト人工染色体べクタ一。
1 7. 長腕遠位及び Z又は短腕遠位の削除が人工テロメァ配列との置換によるも のである、 請求項 1〜 1 6のいずれか 1項に記載のヒト人工染色体ベクター。
1 8. ヒ卜人工染色体ベクターの作製方法であって、 以下のステップ：
(a)ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及びノ又は短腕 遠位を削除するステップ；並びに
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び/又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
を含む、 上記作製方法。
1 9. ステップ （a) において、 ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持 する細胞が相同組換え効率の高いものである、 請求項 1 8記載の作製方法。
20. 相同組換え効率の高い細胞がニヮトリ DT 40細胞由来のものである、 請 求項 1 9記載の作製方法。
2 1. ステップ （b) において、 ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体の長腕 遠位及び/又は短腕遠位の削除を人工テロメァ配列との置換により行うもの である、 請求項 1 8〜20のいずれか 1項に記載の作製方法。
2 2. ステップ （b) において、 ヒト 2 1番染色体の長腕遠位を AL 1 6 3 2 0
4において削除する、 請求項 1 8〜2 1のいずれか 1項に記載の作製方法。
2 3. ステップ （b) において、 ヒト 2 1番染色体の短腕遠位を AL 1 6 3 2 0
1において削除する、 請求項 1 8〜2 1のいずれか 1項に記載の作製方法。
24. ステップ （b) において、 ヒト 14番染色体の長腕遠位を AL 1 57 8 5
8又は AL 5 1 2 3 1 0において削除する、 請求項 1 8〜2 1のいずれか 1項 に記載の作製方法。
2 5. ステップ（b) において、 ヒト 1 4番染色体の短腕遠位を、 OR 4H 1 2、 OR 4 Q 4, RNR 2、 OR 4L l、 RNU 6 C、 FDP S L 3、 K 1 2 T、 C 14 o r f 5 7、 OR 6 S l、 M 1 95、 OR 4K 14、 MGC 2 7 1 6 5、 LCH、 OR 1 0 G 3、 OR4K3、 OR4 E 2、 H 1 RNA、 ATP 5 C 2 , OR 1 1 H6、 及び OR 4M 1からなる群より選択される少なくとも 1の位置 において削除する、 請求項 1 8〜2 1のいずれか 1項に記載の作製方法。
26. ステップ （c) において、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素である、 請 求項 1 8〜 2 5のいずれか 1項に記載の作製方法。
2 7. ステップ （c) において、 部位特異的組換え酵素の認識部位が 1 o xP配 列である、 請求項 1 8〜26のいずれか 1項に記載の作製方法。
2 8. 部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト 2 1番染色体の長腕近位の AL 1 6 3 2 0 3に挿入する、 請求項 1 8〜2 7のいずれか 1項に記載の作製方法。
2 9. 部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト 1 4番染色体の長腕近位の AL 1 57 8 58又は AL 5 1 2 3 1 0の前記削除位置よりも近位に挿入する、 請求 項 1 8〜 2 7のいずれか 1項に記載の作製方法。
30. 部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト 1 4番染色体の短腕近位の 1 4 p 1 2領域内の前記削除位置よりも近位に挿入する、 請求項 1 8〜 27のいずれ か 1項に記載の作製方法。
3 1. 請求項 1 8〜3 0のいずれか 1項に記載の作製方法により得られる、 ヒト 人工染色体ベクター。
32. 請求項 31記載のヒト人工染色体べクタ一を保持する細胞。
33. 請求項 1 8〜30のいずれか 1項に記載された作製方法において、 以下の ステップ：
(d) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染 色体に外来 DN Aを揷入するステップ；
をさらに含むことを特徴とする、 外来 DN Aを含むヒト人工染色体べクタ一の 作製方法。
34. 請求項 33記載の作製方法により得られる、 外来 DNAを含むヒト人工染 色体ベクター。
35. 請求項 34記載の外来 DNAを含むヒト人工染色体べクタ一を保持する細 胞。
36. 請求項 35記載の細胞を含む医薬組成物。
37. 外来 DNAを受容細胞に導入する方法であって、 以下のステップ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒ卜 14番染色体の長腕近位及び Z又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14 番染色体に外来 DNAを挿入するステップ；
(e) 上記ヒト 21番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
(f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
(g) 融合した受容細胞において外来 DNAの導入を確認するステップ； を含む、 上記導入方法。
38. 受容細胞が動物細胞である、 請求項 37記載の導入方法。
3 9. 動物細胞が哺乳動物細胞である、 請求項 3 8記載の導入方法。
40. 受容細胞が多分化能を有する細胞である、 請求項 3 7〜 3 9のいずれか 1 項に記載の導入方法。
4 1. 多分化能を有する細胞が胚性幹細胞 （ES細胞） 又は間葉系幹細胞若しく は組織幹/前駆細胞である、 請求項 40記載の導入方法。
42. 外来 DNAを発現する細胞の作製方法であって、 以下のステップ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒ卜 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体の長腕近位及び Z又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4 番染色体に外来 DN Aを挿入するステップ；
(e) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 1 4番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
(g) 融合した受容細胞において外来 DNAを発現する細胞を選択するステツ プ；
を含む、 上記作製方法。
43. 受容細胞が動物細胞である、 請求項 42記載の導入方法。
44. 動物細胞が哺乳動物細胞である、 請求項 43記載の導入方法。
45. 受容細胞が多分化能を有する細胞である、 請求項 42〜44のいずれか 1 項に記載の導入方法。
46. 多分化能を有する細胞が胚性幹細胞 （E S細胞） 又は間葉系幹細胞若しく は組織幹 Z前駆細胞である、 請求項 40記載の導入方法。
47. タンパク質の製造方法であって、 以下のステップ：
(a) ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞を得るステ ップ；
(b) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕遠位及び Z又は短腕 遠位を削除するステップ；
(c) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体の長腕近位及び/又は短腕 近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
(d) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト 21番染色体又はヒト 14 番染色体にタンパク質をコードする外来 DNAを挿入するステップ；
(e) 上記ヒト 2 1番染色体又はヒト 14番染色体を保持する供与細胞からミ クロセルを調製するステップ；
( f ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
(g) 融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
(h) 得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ；
を含む、 上記製造方法。
48. タンパク質が、 エリスロポイエチン （EPO) 、 トロンポポイエチン （T PO) 、 血液凝固因子、 フォンヴィルブランド因子 （vWF) 、 ジストロフィ ン、 ド一パミン合成酵素、 インスリン、 インスリン様増殖因子 （I GF) 、 ィ ンスリン様増殖因子結合タンパク質 （ I GFBP) 、 抗体、 テロメラ一ゼ、 顆 粒球コロニ一刺激因子、 顆粒球 .マクロファージコロニ一刺激因子、 免疫グロ ブリン、 成長ホルモン、 インターロイキン 2、 インターロイキン 3、 インター ロイキン 4、インタ一ロイキン 5、インタ一ロイキン 6、イン夕一ロイキン 7、 インタ一ロイキン 8、 インタ一ロイキン 9、 インタ一ロイキン 10、 インター ロイキン 1 1、 インターロイキン 12、 インタ一ロイキン 1 5、 CD40リガ ンド、インターフェロン、アデノシンデァミナ一ゼ、 α— 1アンチトリプシン、 オル二チントランス力ルバミラーゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラ一ゼ、 成 長抑制因子 （G I F) 、 腫瘍壊死因子 （TNF) 、 白血病阻害因子 （L I F) 、 オンコス夕チン M、 F 1 t 3リガンド （ F 1 t 3 L ) 、 ス卜ローマ由来因子 (S DF) 、 幹細胞増殖因子 （S CF) 、 繊維芽細胞増殖因子 （FGF) 、 上皮増 殖因子 （EGF) 、 血管形成誘導因子 （VEGF) 、 アンジォボイエチン、 神 経成長因子 （NGF) 、 骨形成因子 （BMP) 、 ァクチビン、 トランスフォー ミング増殖因子 （TGF) 、 ウィント （Wn t) からなる群より選択されるも のである、 請求項 47記載の製造方法。
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