JP2010004887A - ヒト人工染色体(hac)ベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト21番染色体断片を含み、長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されているヒト人工染色体(HAC)ベクター及びその作製方法。ヒト人工染色体ベクターを用いた外来DNAの導入方法、外来DNA発現細胞の作製方法及びタンパク質の製造方法。
【選択図】なし
Description
従来、外来遺伝子を発現させるためのベクターを構築するという目標と、一方で細胞内での自律複製分配に必要な構造を特定するという生物学的側面から、動物細胞を宿主としたヒト人工染色体(Human Artificial Chromosome;以下、「HAC」ともいう)の構築が試みられてきた。HAC構築のアプローチには(A)ボトムアップアプローチ、(B)自然発生染色体断片の利用、及び(C)トップダウンアプローチ(天然の染色体をトリミング)の3種がある。
大腸菌や酵母では自律複製/分配に必要なDNA配列が特定されており、宿主細胞内で一定のコピー数が維持される人工染色体が構築されている(BACないしYAC)。同様の発想から、クローン化された配列既知のDNA断片を動物細胞に導入してアセンブルするという、ボトムアップアプローチによるHAC構築が試みられてきた。ヒト染色体セントロメアの構成要素であるアルフォイド配列約100kbを含むYAC由来の薬剤耐性遺伝子とヒトのテロメア配列を付加し、ヒト線維肉腫細胞株HT1080に導入した例が報告されている(Ikennoら,Nature Biotech.(USA),第16巻,p.431-439,1998年)。薬剤耐性細胞株では自律複製/分配が可能な人工染色体が構築されていたが、導入したDNA配列そのものが細胞に保持されているのではなく増幅による再構成が生じており、細胞に保持される配列構造は明らかでない。
またHACを構築することが目的であって、外来遺伝子の挿入を検討するには至っていない。
染色体はそれ自身が遺伝子の集合体であり、自律複製・分配に必要な要素を備えている。YACなど既存のクローニングベクターの容量を超えるMb単位の巨大遺伝子を導入する目的で、一本の染色体又はその断片を遺伝子導入のツールとして利用することは、微小核細胞融合法により実現されている。マウス胚幹細胞に抗体遺伝子を含むヒト14番、2番、22番染色体断片を移入し、キメラ個体が作製できること、移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現すること、ヒト染色体断片がキメラ個体で安定に保持されること、生殖系列を経て次世代伝達可能なことが示された(Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133-143,1997年;Tomizukaら,P.N.A.S.(USA),第97巻,p.722-727,2000年)。この例では、発現させたい遺伝子がのっている染色体そのものをベクターとして利用することの有効性が示された。しかし目的とする遺伝子毎に染色体改変を行うことは現実的でない。染色体断片のベクターとしての利点を生かしなおかつその汎用性を高めるには、基本骨格となる染色体ベクターを用意し、これに目的とする遺伝子を簡便に挿入できることが望ましい。
染色体自然断片を細胞に移入する場合、目的の遺伝子以外にも移入した染色体断片からその他多くの遺伝子が同時に発現することになる。マウスES細胞の実験では、ヒト染色体ごとに安定性が異なること、導入した染色体断片が大きいほどこれを保持する細胞のキメラ個体中での寄与率が下がることが知られている。余分な遺伝子の発現は染色体断片を保持する宿主細胞の増殖を妨げると推測される。そこで染色体改変によって余分な遺伝子を取り除くことで、移入染色体断片の保持率が上がると考えられる。
上述したようなベクターとしてのHAC構築と並んで重要なことは、HACに目的の遺伝子を導入する方法の確立である。しかし前述の如く現時点ではHAC構築自体が途上の段階であり、外来遺伝子の導入については薬剤耐性遺伝子のランダム挿入が示されている程度で、詳細な検討はなされていないのが現状である。
本発明は、その第1の態様において、長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト21番染色体断片又はヒト14番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクターを提供する。
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;並びに
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ。
(d)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト21番染色体又はヒト14番染色体に外来DNAを挿入するステップ。
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(g)融合した受容細胞において外来DNAの導入を確認するステップ。
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(g)融合した受容細胞において外来DNAを発現する細胞を選択するステップ。
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体にタンパク質をコードする外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;
(g)融合した受容細胞を培地中で培養するステップ;並びに
(h)得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本明細書中、「ヒト人工染色体ベクター」又は「HACベクター」とは、ヒト染色体に基づいて作製された人工染色体を指す。
本HACベクターは、上述したようにヒト21番染色体又はヒト14番染色体に基づいて作製する。本HACベクターの作製には、以下の(a)〜(c)のステップが含まれる:
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;並びに
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ。
本HACベクターの作製においては、ヒト染色体(例えばヒト21番染色体又はヒト14番染色体)を保持する細胞を用意する。そのような細胞としては、ヒト21番染色体又はヒト14番染色体のみを保持し、かつその後の操作のために相同組換え率の高いものが好ましい。従って本発明においてはまずこれらの条件を満たすような細胞を作製する。
HACベクターの作製においては、ヒト染色体を保持する細胞において、当該染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する。染色体の削除は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えばWO00/10383号に記載されている人工テロメア配列との置換(テロメアトランケーション)により行うことが好ましい。長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、例えば、ヒト染色体を保持する細胞において、人工テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に人工テロメア配列の挿入されたクローンを取得した後、テロメア・トランケーションによる欠失変異体を得るというものである(Itzhakiら、Nature Genet.,2:283-287, 1992;及びBrownら、P.N.A.S., 93:7125,1996を参照されたい)。ここで染色体の所望の位置とは、削除対象の長腕遠位又は短腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換・挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される(テロメアトランケーション)。所望の位置は、ターゲティングベクターを構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができ、例えば長腕遠位を削除する場合には、ヒト21番染色体上の21q11領域内、好ましくはAL163204(GenBank登録番号)の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位が切断、削除される(例えば、黒岩ら、Nucleic Acid Research, 26:3447, 1998)。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト21番染色体上の21P領域内、好ましくはAL163201(GenBank登録番号)の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のHACベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
本HACベクターの作製においては、ヒト21番染色体又はヒト14番染色体に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。このステップ(c)は、上記ステップ(b)の前又は後のいずれで行ってもよく、これらの順番は特に限定されない。すなわち、ヒト21番染色体又はヒト14番染色体において、長腕遠位及び/又は長腕遠位を削除した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入してもよいし、あるいは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入した後で長腕遠位及び/又は長腕遠位を削除してもよい。
上記HACベクターの作製において、部位特異的組換え酵素の存在下にて外来DNAを挿入するステップ(d)を行うことにより、本HACベクターに外来DNAを導入することができる。このステップ(d)は、上述したステップ(c)の後に行うものであるが、ステップ(b)との順序は特に限定されず、ステップ(b)の前又は後に行うことができる。従って、ステップ(b)〜(d)の順序は明細書に記載する順序に限定されないことに留意されたい。
Cre酵素によるloxP配列間の部位特異的組換えは、線状染色体と環状インサート(外来DNA)の場合は挿入反応が起こるが、線状染色体同士では相互転座の反応が起きる。これを利用すれば環状インサートにクローニングできないMb単位以上の染色体断片を本HACベクターに導入することができる(Kuroiwaら,Gene Ther. 9:708, 2002)。
本明細書の実施例に記載する方法においては、本HACベクターへの外来DNAの挿入は、薬剤耐性遺伝子の再構成を指標としたポジティブ選別を利用している(組換え体のポジティブ選別に関しては、WO00/10383号を参照されたい)。これに代わって、チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系などのネガティブ選別により、インサート挿入体(外来DNAが挿入されたもの)を得ることも可能である。この場合、挿入する環状DNAにはloxP配列のみが含まれていればよい。ゲノムプロジェクトで用いられたBACライブラリーはloxP配列を含んでいるので、このようなネガティブ選別の系が確立できれば配列既知のゲノムクローンを本HACベクターに容易に挿入することが可能になる。
本発明において好ましく用いられるloxP配列はP1ファージに由来する野生型の配列であり、Cre酵素によるHACベクター上のloxP配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。本明細書に記載する実施例においては、Cre酵素を一過性に発現させ、薬剤耐性の獲得を指標に部位特異的な組換え体を選別することにより構成的な挿入体が得られた。一度環状インサートが挿入されると、HACベクター上に2つのloxP配列が残る。このため再度Cre酵素を発現させると逆反応(環状インサートの切り出し)が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するなどのさらなるHACベクターの改変は困難となる。一方、塩基置換を行った変異loxP配列の組み合わせによっては、反応方向及び反応の特異性を限定できるとの報告がある(Hoessら,Nucleic Acids Res., 14:1986;Arakiら,Nucleic Acids Res., 25:868, 1997;Leeら,Gene, 216:55, 1998)。このような変異loxP配列を用いることで、上述した逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築可能である。
αグロビン遺伝子トランスジェニックマウスを用いて宿主染色体上にランダムに挿入された遺伝子のコピー数とmRNA発現量の関係を解析した報告(Sharpeら、Proc Natl Acad Sci USA,90:11262,1993)では、発現量と導入遺伝子コピー数との間に相関は認められない。これは、トランスジェニック動物系統により導入遺伝子の発現量が大きく異なり、また導入した遺伝子のコピー数に比例しない発現が起こるポジション効果と呼ばれる現象によるものであると考えられ、トランスジェニック動物における遺伝子導入においては頻繁に起こる現象である。また、導入遺伝子のポジション効果を排除して比較するため外来DNAの挿入位置を予め宿主染色体上に導入したloxPサイトに確定しCre−loxP組換え反応によりプラスミドベクターから目的のDNAユニットを導入するトランスジェニックマウスの報告(Garrickら、Nature Genet., 18:56, 1998)があるが、ここでもコピー数依存的発現制御は実現されていない。
本HACベクター又は外来DNAを含む本HACベクターを保持する細胞から、それらのベクターをその他の細胞へ移入することができる。移入先となる細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞(哺乳動物細胞)などが挙げられる。本発明においては、無傷の状態でヒト染色体を移入可能であることが知られているチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いることが好ましい(WO00/10383号参照)。CHO細胞は、効率良くミクロセルを形成することが知られており(例えば、Koiら、SCIENCE 260:361, 1993)、これにより本HACベクターをCHO細胞からさらに別の細胞(CHO細胞以外の細胞)へ移入することも可能である。また、本発明においては、本HACベクターを多分化能を有する細胞に移入することも可能である。「多分化能を有する細胞」とは、所定の操作により、特定の細胞又は組織に分化可能な細胞を意味する。例えば、宿主胚への注入又は集合胚形成などの操作を行うことによって、キメラ動物の2種類以上の細胞又は組織に分化可能な細胞、具体的には、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、胚性腫瘍細胞(EC細胞)などが含まれる。また、例えば、増殖因子(例:トランスフォーミング増殖因子;TGF)などを添加した誘導培地における培養により、骨細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化可能な細胞、具体的には、体性幹細胞(例:間葉系間細胞)などが含まれる。
4.HACベクターの用途
本発明の目的は、ベクターという基本ツールとその利用技術の提供であり、学術研究から産業に至る非常に幅広い領域に波及効果をもたらすことが期待される。《1》宿主染色体に挿入されず独立して維持される(宿主遺伝子の変異やがん化の懸念がない)、《2》一定のコピー数で長期間安定に保持される(過剰発現、発現消失の懸念がない)、《3》導入可能なDNAの長さの制限がない(正常な発現制御を保証するDNAエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能である)、という本HACベクターの特徴は、従来のベクターで不可能であった多くのことを可能にすると想像される。本HACベクターの用途としては、限定するものではないが主要なものを挙げると、《1》動物培養細胞における遺伝子機能解析用ベクター、《2》ヒト疾患遺伝子治療用ベクター、《3》ヒト臓器幹細胞、胚幹細胞(ES細胞)への遺伝子導入用ベクター、《4》遺伝子導入動物作製用ベクター(例:ヒト疾患モデル動物作製、KO動物と組み合わせた特定遺伝子のヒト化)、などが考えられる。以下に、本HACベクターの用途の一例として、(1)外来DNAの受容細胞への導入、(2)外来DNAを発現する細胞の作製、(3)タンパク質の製造、(4)遺伝子機能解析用ベクター、(5)幹細胞への遺伝子導入用ベクター、(6)培養フィーダー作製用ベクター、及び(7)ヒト疾患治療用ベクターを説明する。
本HACベクターは、細胞中で外来DNAを挿入したり、外来DNAが挿入されたHACベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来DNAを所望の受容細胞に導入することができる。外来DNAの受容細胞への導入には、例えば以下のステップが含まれる:
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(g)融合した受容細胞において外来DNAの導入を確認するステップ。
本HACベクターは、上述したように、細胞中で外来DNAを挿入したり、外来DNAが挿入されたHACベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来DNAを発現する細胞を作製することもできる。外来DNAを発現する細胞の作製には、例えば以下のステップが含まれる:
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(g)融合した受容細胞において外来DNAを発現する細胞を選択するステップ。
本HACベクターを利用することにより、上述したように、外来DNAを細胞に導入することや、外来DNAを発現する細胞を作製することができるため、当該外来DNAによりコードされるタンパク質を製造することができる。タンパク質の製造には、例えば以下のステップが含まれる:
(a)ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体にタンパク質をコードする外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体又はヒト14番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;
(g)融合した受容細胞を培地中で培養するステップ;並びに
(h)得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本HACベクターに挿入した外来DNAは、細胞中でコピー数依存的かつ安定的に発現されるため、本HACベクターは、遺伝子機能を解析するために利用することができる。
本発明の方法により作製したHACベクターは、実施例20及び21に示したように胚性幹(ES)細胞又は間葉系幹細胞(Mesenchimal Stem Cell;MSC)への遺伝子導入用ベクターとして利用することができる。そして上記HACベクターはES細胞又はMSCにおいて長期間安定に存在できる。
細胞培養法の一つとして、培養器底面に付着性細胞を敷き詰めた培養支持フィーダー細胞上に目的の細胞を播種し共培養する方法が知られている(日本生化学会編、新生化学実験講座14発生分化老化、1992年、東京化学同人)。例えば造血前駆細胞を増殖させる場合には、SCF、Flt3L、TPO、IL−6、sIL−6Rなどの必要な因子をそれぞれ例えば組換え体タンパク質として準備し、培養液に添加して培養する(Uedaら、J Clin Invest., 105:1013-1021, 2000)。従来法により培養添加物の遺伝子を培養支持フィーダー細胞へ導入することが可能であるが、宿主染色体へのランダム挿入による変異・ポジション効果、発現不活化、多コピー発現ユニット並列による下流遺伝子発現の減弱などにより、全ての因子について望みの発現量を制御して供給することは困難と考えられる。本発明の方法によりこれらの必要因子をコードするDNA全て(又は一部)を導入したHACベクターを作製し、培養支持フィーダー細胞へ移入することにより、組換え体タンパク質などを後から加えることなく単なる共培養だけで簡便に必要な因子を全て補給することが可能である。また、遺伝子発現誘導系を利用することでこれら因子のコンディショナルな発現制御が可能である。
ヒト疾患治療用のベクターは、ウイルス性及び非ウイルス性ベクターが従来から各種研究されているが、免疫反応の惹起、導入DNAサイズの限界、宿主染色体挿入変異、低導入効率・低発現効率、発現量制御が困難(金田 安史、臨床免疫、39巻:551−558、2003年、科学評論社、小澤 敬也編、遺伝子治療、1997年、羊土社)など、様々な課題が指摘されている。いずれのベクターにも共通する課題として、「望ましい発現量を、望ましいタイミングで制御する」ことが求められている。
遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、その安全性観点から不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましい。しかし正常体細胞は、一定回数分裂すると増殖・分裂が止まりやがて死滅する、すなわち老化することが知られている(井出 利憲、実験医学、16巻18号増刊:18―24、1998、羊土社)。治療効果を長期間持続させるために、治療用細胞は一定期間、望ましくは罹患者の生涯を通して維持されることが必須である。染色体末端に存在する繰返し配列テロメアの修復酵素であるテロメラーゼは、正常細胞内で過剰発現させることにより細胞老化時に認められるテロメア短縮を抑制し、細胞の寿命を延長できることが知られている(Bodnarら、Science,279:349−352,1998)。またテロメラーゼは、細胞内で過剰発現させても不死化又はガン化を導くものではないことが示されている(真貝 洋一、実験医学、16巻18号増刊:25−30、1998、羊土社、Jiangら、Nature Gent., 21:111-114, 1999)。それゆえ、本発明の方法によりヒトテロメラーゼ(hTERT)をコードする遺伝子をHACベクター上に導入し標的となる細胞へ移入することにより、HAC移入細胞の寿命を延長し、不死化又はガン化させることなく治療効果を長期間持続させることが可能である。また、遺伝子発現制御を発現誘導系やゲノム領域を利用することにより、コンディショナル又は組織特異的/生理的なテロメラーゼ発現が可能である。
組換え体タンパク質製剤を開発する場合、投与時の自己抗体(活性中和抗体)の生成が障害となっている(Liら、Blood,98:3241−3248,2001)。患者への投与方法を特に限定するものではないが、本発明の方法により作製した目的タンパク質をコードするゲノムを導入したHACベクターを、ヒト細胞、例えば産生組織の正常ヒト細胞へ移入後、これを患者へ移植する。該患者においてHACベクターから目的タンパク質を生理的/組織特異的に発現・供給することにより、患者における自己抗体生成の抑制が可能である。
再発白血病に対する治療法として、移植片対白血病反応により移植リンパ球が腫瘍特異的細胞傷害性T細胞として白血病細胞を攻撃することを応用したドナーリンパ球輸注療法(Kolbら、Blood, 76:2462, 1990)が知られている。上記療法の副作用として、移植細胞がレシピエント組織を攻撃し障害を与える移植片対宿主病が知られているが、これに対するひとつの対処法として、ドナーリンパ球へのレトロウイルスによる薬剤誘導性の自殺遺伝子導入及び薬剤投与によるドナーリンパ球の除去が行われている(小野寺ら、ゲノム医学,3巻:45,2003,メディカルレヴュー社)。上記方法の場合、ドナーリンパ球の染色体に変異を与える危険性が残る。
近年ヒト抗体産生マウスを利用した、完全ヒトモノクロナール抗体医薬品の創製が試みられている(石田ら、Bioベンチャー、2巻:44、2002、羊土社、Moriら,Cell Death and Differentiation, in press, 2003,Proceedings of American Association for Cancer Reserach, Volume 44, 2nd Edition, July 2003, p1285, #6422)。しかし、これを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なTPO投与のため病院への通院が必要となり患者のQOLの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
(E−1)血友病
血友病Aは、血液凝固第8因子の変異、血友病Bは血液凝固第9因子の変異が原因となって起こる、伴性劣性遺伝性出血疾患である。治療法として第8又は第9因子濃縮製剤投与による補充療法が有効であるが、出血後投与では重篤な合症が生じること、濃縮製剤への病原体混入の可能性、反復投与による自己抗体(活性中和抗体)の発生、常時出血への対処準備による患者QOLの低下、高額な医療費など課題は多く、遺伝子治療法による解決が期待されている。従来ベクターによる臨床遺伝子治療研究が行われているが、十分な発現を長期間持続できず有意な治療効果を得るに至っていない。また、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを直接投与する臨床研究において被験者の精液中にベクター遺伝子が検出され生殖細胞への遺伝子導入の危険性が指摘されている(望月ら、ゲノム医学,3巻:25,2003,メデイカルレヴュー社)。第8因子をコードする遺伝子は、全長ゲノムで約1.5Mb、cDNAで約7kbにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長cDNAの導入は可能であるが発現量の低下が、またAAVベクターでは、導入DNAサイズが約4.9kb以下に限られるため全長遺伝子を導入できないことが課題となっている。
重症複合免疫不全症(SCID)は、液性及び細胞性免疫が先天的に障害される疾患である。SCIDの約半数がX連鎖のX−SCIDであり、その原因はインターロイキン2ファミリーの受容体が共有する共通γ鎖の変異であることが知られている。治療法として、造血幹細胞移植が行われているが、液性免疫の回復は不十分で免疫グロブリンの定期的投与が必要となる。そこで造血幹細胞へ共通γ鎖を導入し移植する遺伝子細胞治療法による解決が期待されている。1999年からレトロウイルスにより共通γ鎖を導入した造血幹細胞移植の臨床研究が行われていたが、近年フランスにおいて移植細胞の白血病化が複数例報告された(Hacein-Bey-Abinaら、N Engl J Med., 348:255, 2003;Marshallら、Science, 299:320, 2003)。何れのケースも遺伝子導入細胞染色体中の原ガン遺伝子の一つであるLMO2遺伝子領域にベクター配列挿入変異が認められ、LMO2活性化と腫瘍化との関連が疑われている(久米ら、ゲノム医学,3巻:9,2003,メデイカルレヴュー社)。
デイシェンヌ型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異によるジストロフィンの機能欠損が原因である、X連鎖劣性単一遺伝子性疾患の一つである(Hoffmanら、Cell, 51:919, 1987)。DMDの治療は、ジストロフィンが細胞骨格タンパク質であるため直接投与による補充は不可能であり、遺伝子治療法が期待されている。
(F−1)トロンボポイエチン(Thrombopoietin;TPO)は、血小板産生制御及び造血幹/前駆細胞の増殖を担う因子であり、例えば再生不良性貧血などの血液疾患、化学療法後の造血回復などへの適用が期待されている。しかし、TPO組換え体タンパク質投与時の活性中和抗体生成が医薬品開発の障害となっている(Liら、Blood,98:3241−3248,2001)。従って、TPOを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なTPO投与のため病院への通院が必要となり患者のQOLの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
パーキンソン病は、中脳黒質緻密部ドーパミン合成細胞の進行性の変性脱落により運動機能が障害される神経疾患である。治療法の一つとして、欠損したドーパミン補充を目的としたL−DOPA投与法があるが、中等以上の症状では薬効が減弱することや副作用による患者のQOL制限・投与量減少などの課題が存在する。これら課題は、ドーパミン濃度が線状体内で一定しないこと及び投与したL−DOPAが線状体以外で作用することに起因するため、線状体での一定したドーパミンの生理的発現が求められる(武田ら、メデイカルサイエンスダイジェスト、29巻:20、2003年、ニュー・サイエンス社)。現在、ドーパミン合成に関わる酵素3種類を各々導入したAAVベクターによる遺伝子治療研究がなされているが、いずれも生理的発現制御を行うまでには至っていない。また、ドーパミン合成細胞の変性脱落抑制を目的とした治療法にGDNF(Grial-cell Derived Neuronal Factor)投与があるが、被殻下にカテーテル留置による持続投与で効果が認められた(Gillら、Nature Med., 9:589, 2003)一方で感染の危険性や患者のQOL制限などが課題となっている。AAVベクターによる遺伝子治療研究により動物モデルで効果が示された(Wangら、Gene Ther., 9:381, 2002)が、こちらも生理的発現制御を行うまでには至っていない。
インスリン依存型糖尿病において、組換え体タンパク質製剤投与による治療が行われている。慢性疾患では定期的な投与のため病院への通院が必要であり、患者のQOLの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。インスリンの血中濃度は至適範囲がせまいため、多すぎても少なすぎても副作用が生じ、時には生命の危険に至る場合がある。また、遺伝子治療の研究がなされているが、体内におけるインスリン濃度のコントロールが課題となっている(森谷ら、蛋白質 核酸 酵素、40巻:2764、1995、共立出版)。
(1)テロメア短縮のためのコンストラクト構築
ヒト21番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクター(ターゲティングベクター)は、PBS−TEL/Puro(Kuroiwa, Nucleic Acids Res.,26:3447, 1998)を用いた。GenBankデータベースより得たヒト21番染色体長腕遠位の塩基配列(登録番号AL163204)から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをPCR増幅するための、制限酵素BamHIの認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
#21telF1:5'- CGCGGATCCAGAGAGAGCCTGGAATGCCTGGTAGTGT(配列番号1)
#21telR1:5'- CGCGGATCCCCAGTGCCCTGAGATCTTGTGATTTCTC(配列番号2)
PBS−TEL/Puroコンストラクトを制限酵素EcoRI消化により線状化DNAとし、ヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞に導入した。DT40雑種細胞1×107を0.75mlのPBSに懸濁し、25μg DNA存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに750Vで印加し電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を、10%牛胎仔血清(FBS)、1%ニワトリ血清(ChS)及び50μM 2−メルカプトエタノールを添加したDMEM培地(インビトロジェン製)に懸濁し、96穴クラスター(ファルコン)2枚に播種した。2日後に終濃度0.3μg/mlとなるようピューロマイシン(Puromycin dihydrochloride,シグマ)を加えた。2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はDT40雑種細胞1×107あたり平均17.8個であった。20回のトランスフェクションから合計356の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(3−1)PCR解析
ピューロマイシン耐性株ゲノムDNAを鋳型としてヒト21番染色体上に存在する遺伝子及びSTSマーカー(D21S265,CBR,SIM2,D21S268,D21S266,D21S1259)の存在をPCR法により検出した。
PRED65R:5'- TTGCATGCCTGTGGTACTGT(配列番号4)
PRED3F:5'- TCACAATCATGGGCTTTGAA(配列番号5)
PRED3R:5'- CACGCAACCATTTGTTCATT(配列番号6)
相同組換えの標的配列内にプローブを設定した(図1)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅し、その後PCR増幅断片を単離及び精製した。
#21qtelR:5’- CACCTGCACAATGGCTCAAC(配列番号8)
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。代表的なFISH像を図4a及びbに示す。図4aにおいて白矢印はテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト21番染色体を、図4bにおいて白矢印は長腕遠位を削除したヒト21番染色体断片を示している。宿主であるDT40細胞の染色体との相対的な大きさから、ヒト21番染色体が短縮したことが確認された。
(1)loxP挿入のためのコンストラクト構築
実施例1で作製したヒト人工染色体(HAC)にloxP配列を挿入するための基本プラスミドには、pSF1(ライフテック)を用いた。LoxP挿入部位であるヒト21番染色体長腕近位の塩基配列はGenBankデータベースより得た(登録番号AL163203)。相同組換えの2つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
#21qEcoR:5'- CCGGAATTCTGTAGATCCTGCCATTGTGG(配列番号10)
#21qBaF:5'- CGCGGATCCTTGGCTCCAAAAGGTACCAC(配列番号11)
#21qBaR:5'- CGCGGATCCCTATCCTCGCCACTGTGTCC(配列番号12)
pSF1コンストラクトを制限酵素ApaI(ニッポンジーン)消化により線状化し、長腕遠位を削除したヒト21番染色体を保持するDT40株(DT40(#21)puro−339)に導入した。DT40雑種細胞を1×107を0.75mlのPBSに懸濁し、10μg DNA存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに750Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%牛胎仔血清(FBS)、1%ニワトリ血清(ChS)、50μM 2−メルカプトエタノールを添加したDMEM培地(インビトロジェン製)に懸濁し、96穴クラスター(ファルコン)3枚に播種した。2日後に終濃度8μg/mlとなるようブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride、フナコシ)を加えた。2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はDT40雑種細胞1×107あたり平均5.8個であった。14回のトランスフェクションで得た計82のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(3−1)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの標的配列の外側にプローブを設定した。プローブは次に記すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した。
21LOX5682R:5'- TCTAAGGAACAAATCTAGGTCATGG(配列番号14)
左右2つの標的配列(図5中、それぞれA及びBで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図5中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
Left638R:5'- AAAGGGAATAAGGGCGACAC(配列番号16)
Right958F:5'- GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTA(配列番号17)
Right1152R:5'- GTCAATTCACTAATTCCTATTCCCAGT(配列番号18)
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例1及び2で得られた、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入したヒト21番染色体に基づくHACベクターを保持するDT40細胞(DT40(#21)bsd−79)を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(ATCCより入手,登録番号JCRB9018)を用いた。
(2−1)PCR法
移入染色体の確認をPCR法により行った。ヒト21番染色体長腕近位のマーカーPRED65及びPRED3遺伝子(実施例1の(3)参照)の検出を試みた。ブラストサイジン耐性のCHO細胞4株のすべてにおいて、2種のマーカー配列の増幅を確認した。
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。ブラストサイジン耐性のCHO株のうちの2株(CHO(#21)bsd79−1及びCHO(#21)bsd79−3)について解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。代表的なFISH像を図7a及びbに示す。図7aにおいてテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト21番染色体を、図7bは長腕遠位を削除したヒト21番染色体断片を示している。宿主であるCHO細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト21番染色体がCHO細胞に移入されたことが確認された。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例3で得られた、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入したヒト21番染色体に基づくHACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)bsd−79−1)を用いた。染色体受容細胞としてはヒト線維肉腫細胞株HT1080(ATCCより入手,登録番号CCL−121)を用いた。はじめに約107個のCHO(#21)bsd−79−1細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(コースター)6本に細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したCHO(#21)bsd−79−1細胞をコルセミド(0.075μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(10%FBS,8μg/mlブラストサイジン,F12)中で48時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、フィルターで濾過して精製した。HT1080細胞を80%飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュに精製した微小核細胞を加えPEG溶液で融合した。48時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、ブラストサイジン(8μg/ml)を含む選択培地(10%CS ,DMEM)で培養した。約2週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。2回の微小核細胞融合から計12のブラストサイジン耐性HT1080株を得た。
(2−1)PCR法
移入染色体は,ブラストサイジン耐性遺伝子のPCR増幅により確認した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を次に示す。
Bsd2891R:5'- GCTCAAGATGCCCCTGTTCT(配列番号20)
ブラストサイジン耐性のHT1080細胞12株のすべてににおいて、耐性遺伝子配列の増幅を確認した。
染色体解析は、黒木ら(細胞工学ハンドブック,羊土社,1992)に記された方法に従い、ギムザ染色により行った。ブラストサイジン耐性のHT1080株のうち4株(HT1080(#21)bsd79−1−3,6,11,14)について約20の分裂中期染色体像を解析した。ブラストサイジン耐性株では、親株のHT1080には認められず、内在の21番染色体よりサイズの小さいミニ染色体が観察された。
長腕遠位を削除したヒト21番染色体の培養細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。用いたのは先に記載したニワトリ細胞株(DT40(#21)bsd−79)、ヒト細胞株(HT1080(#21)bsd79−1−3,6,11,14)である。ニワトリ細胞株用の非選択培養液は10%FBS,1%ChS,50μM 2−メルカプトエタノールを加えたDMEMであり、選択培養液はこれにブラストサイジン8μg/ml(DT40(#21)bsd−79の場合)を添加した。ヒト細胞株用の非選択培養液は10%CSを加えたDMEMであり、選択培養液はこれにブラストサイジン4μg/mlを添加した。ニワトリ細胞株は1.5×107細胞を10cm径ディッシュに播種し、1日後に細胞を計数して再び1.5×107細胞を10cm径ディッシュに播種した。ヒト細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、3日後に細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種した。ニワトリ細胞株は培養開始から21日、42日、63日、84日、105日及び126日後に、ヒト細胞株は10日及び20日後にそれぞれ細胞を回収し、染色体標本を作製した。
ニワトリ細胞における人工染色体の検出は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いたFISH法により行った。間期核500個においてヒト染色体を有無を観察し、保持率を算出した。ヒト細胞における人工染色体の検出は、黒木ら(細胞工学ハンドブック,羊土社,1992)に記された方法に従いギムザ染色法により行った。分裂中期染色体像20個においてミニ染色体の有無を観察して保持率を算出し、4クローンの平均値を出した。その結果を表1に示す。
図8に、ヒト21番染色体由来HACベクターへGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例1〜4に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にloxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを用意した。一方でloxP配列を含むGFP発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
GFP発現ベクターPEGFP−C1(クロンテック)を制限酵素GbLII及びBamHI(ニッポンジーン)で消化して4.7kbのDNA断片を単離/精製し、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造)により自己環状化した。大腸菌DH5αの形質転換により組換えプラスミドを単離し、マルチクローニングサイト内のGbLIIからBamHIまでの51bpを欠失したプラスミド(PEGFP−C1Δ)を得た。このPEGFP−C1Δを鋳型とし、EGFP遺伝子の発現ユニットをPCRにより増幅した。
GenBankのデータベースより入手した塩基配列(アクセッション番号U55763)をもとに作製したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
BamGFP3:5' - CCGGGATCCCACAACTAGAATGCAGTG(配列番号22)
実施例3で作製したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)bsd79−1)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのリン酸バッファー(PBS)に懸濁した。10μgのPBS226/EGFPプラスミドと20μgのCre酵素発現ベクターPBS185(ライフテック)存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに750Vで印加し電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%牛胎児血清(FBS)を添加したイーグルF12培地(以下F12という;インビトロジェン製)を含む100mm組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)10枚に播種した。2日後に800μg/mlのG418(GENETICIN,シグマ)と8μg/mlのブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride,フナコシ)を含む培地と置き換えた。2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はCHO細胞5×106あたり20個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
単離したG418/ブラストサイジン耐性CHO株を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果19クローンでGFPの発現が確認された。代表的な蛍光顕微鏡像を図9に示す。
相同組換え体を確認するため、サザンブロット解析を行った。サザンブロット解析はG418耐性遺伝子及びGFP遺伝子の一部をプローブとして、制限酵素EcoRIないしBamHI(ニッポンジーン)で処理した約5μgのゲノムDNAに対して行った。GFPプローブはプラスミドPEGFP−C1(クロンテック)を制限酵素NheI及びGbLII(ニッポンジーン)により消化して得た849bpの断片を調製して用いた。G418耐性遺伝子のプローブはプラスミドpSV2neoを制限酵素GbLII及びSmaI(ニッポンジーン)により消化し、1000bpの断片を調製して用いた。プローブは32Pにより標識し、シグナルはイメージアナライザーBAS2000(富士写真フィルム)により検出した。図10にその結果の一例を示す。図10ではEcoRI消化したDNAをneoプローブによって検出している。レーン1はインサート挿入前のDT40株、レーン2以降はG418耐性DT40株を示す。挿入前のアレルでは5.7kb、挿入後のアレルでは6.9kbのシグナルが検出される。
(1)テロメア短縮のためのコンストラクト構築
ヒト21番染色体の短腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクターはPBS−TEL/Puro(Kuroiwa, Nucleic Acids Res.,26:3447, 1998)を改変して構築した。PBS−TEL/Puroよりピューロマイシン耐性遺伝子の発現ユニット1.7kbを制限酵素NotIの断片として取り除き、末端をT4 DNA Polymerase(DNA Blunting kit,宝酒造)により平滑化した(PBS−TELベクター)。PGKhygro/ΔLT20を制限酵素ClaI及びSmaI(ニッポンジーン)により消化し、PGKプロモーター制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを1.8kbの断片として単離・精製し、PBS−TELベクターにクローニングした(PBS−TEL/Hygro)。
Bam36192 : 5'- CTAAGGATCCATTTCAGCCTGTGGGAATCA(配列番号24)
PBS−TEL/Hygroコンストラクトを制限酵素BamHI(ニッポンジーン)により消化して線状化し、長腕遠位を削除してloxPサイトを組み込んだヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞(DT40(#21)bsd79)に導入した。DT40雑種細胞1×107を0.75mlのPBSに懸濁し、25μg DNA存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに750Vで印加し電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%牛胎仔血清(FBS)、1%ニワトリ血清(ChS)及び50μM 2−メルカプトエタノールを添加したDMEM培地(インビトロジェン製)に懸濁し、96穴クラスター(ファルコン)5枚に播種した。2日後に終濃度1.5mg/mlとなるようハイグロマイシン(Hygromycin-B,和光純薬)を加えた。2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。計2回のトランスフェクションから合計63個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(3−1)PCR解析
ハイグロマイシン耐性DT40株から相同組換え体を選別するための1次スクリーニングとしてPCR解析を行った。ハイグロマイシン耐性株より抽出したゲノムDNA約0.1μgを鋳型としてヒト21番染色体の短腕近位に位置するSTSマーカー(pCHB,D21S188,D21S275)を増幅した。その代表的な結果を図12に示す。図12には、左側にヒト21番染色体のGバンド像に基づく模式的な染色体地図を、またマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した。ハイグロマイシン耐性DT40株について、PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは■で、検出されなかったマーカーを□で示した。DT40(#21)は、テロメアトランケーションを行う前の細胞である。テロメアトランケーションにより短腕遠位が削除された場合、D21S275を保持し、D21S188及びpCHBを保持しないことが予想される。D21S188ないしpCHBのいずれかを増幅しない45株を選別し、サザンブロット解析を行った。
相同組換えの標的配列内にプローブを設定した。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した。
#21p91976:5'- TCTGTGTTCCCCTTCTCTGA(配列番号26)
組換えの標的部位を夾んだ配列をPCRにより増幅した。ヒト21番染色体上とターゲティングベクター上に設定したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
Hyg968:5'- AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC(配列番号27)
#21p96705:5'- AGTTAGCCTACCTTTTGGCCATCC(配列番号28)
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。その結果観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された(図15a及びb)。
実施例5に記載のGFP遺伝子の場合と同様にして、ヒト21番染色体由来HACベクターへヒトEPO遺伝子を挿入する。実施例1〜4に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にloxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを用意した。一方でloxP配列を含むヒトEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
プラスミド構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
SV40polyANp1:5'- CGG GAT CCC TCG AGC GAG ACA TGA TAA GAT ACA TTG ATG -3’(配列番号29)
SV40polyARp1:5'- GGA AGA TCT TCC TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG -3’(配列番号30)
これらのプライマーは、プラスミドベクターpSTneoB(加藤ら、Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987)の塩基配列を基にして作製した。
CMVRp1:5'- CGG GAT CCC GGG TGT CTT CTA TGG AGG TCA AAA CAG -3’(配列番号32)
これらのプライマーは、pBS226のCMVプロモーター塩基配列を基にして作製した。
hEPORp1:5'-CGC TCG AGC GCT ATC TGT CCC CTG TCC TGC AGG -3’(配列番号34)
これらのプライマーは、GenBankより入手した塩基配列(アクセッション番号I05397)を基に作製した。
実施例3で作製したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)bsd79−1)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。上記(1)で作製したpLN1−EPOベクター10μgとCre酵素発現ベクターpBS185(ライフテック)10μgの存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%牛胎児血清(FBS)を添加したイーグルF12培地(以下F12という;インビトロジェン製)を含む48穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)4枚に播種した。2日後に800μg/mlのG418(GENETICIN、インビトロジェン)と8μg/mlのブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride,フナコシ)を含む培地と置き換えた。2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はCHO細胞5×106あたり28個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。この細胞を以後KH21E細胞と称する。
ヒトEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
(4)KH21E細胞により産生されたヒトEPOの生物活性
産生されたヒトEPOの生物活性について、ヒトEPO依存的増殖を示すヒト白血病細胞株UT7-EPO細胞(自治医科大学 小松 則夫 先生より入手)の増殖活性を指標にして解析した。KH21E細胞の2株(#C2及び#C18)について培養上清を表2の定量値を基にEPO終濃度0.01,0.1,1,5,20,100mIU/mlとなるように加えた10%FBSを添加したIMDM培地(インビトロジェン製)0.1mlをいれた96穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)にUT7-EPO細胞5×103を播種した。3日間培養後、細胞増殖測定キット(CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,プロメガ)により細胞増殖を解析した。
本実施例においては、実施例7の(2)において作製されたKH21E細胞の各クローンについて、PCR及びFISH解析により移入染色体の確認を行った。
loxPサイト近傍に位置するヒト21番染色体長腕近位のマーカーPRED65及びPRED3遺伝子と遠位に位置するD21S265マーカー(実施例1の(3)、図2参照)についてPCR増幅を行った。loxP配列間の部位特異的組換え反応によるヒトEPO遺伝子挿入体は、PRED65及びPRED3遺伝子を保持しD21S265マーカーを保持しないことが予想される。その結果、G418耐性CHO細胞22クローンのうち21クローンにおいて予想された増幅が認められた。上記の21クローンに対して、ヒト21番染色体の短腕近位に位置するSTSマーカー(pCHB,D21S187,D21S275)につきPCR増幅を行った(実施例6の(3)、図12参照)。ヒト21番染色体由来HACベクターの短腕は残してあるので、全てのマーカーが保持されていることが予想される。その結果、15クローンにおいて予想された増幅が認められた。
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。上記(1)のPCR解析において全てのマーカーで予想される増幅を示したクローンのうち、8クローンについて解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。その結果を表3に示す。尚、表3中のクローンKH21は、実施例3で作製したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)bsd79−1)を表す。
本実施例においては、実施例7に記載のヒトEPO遺伝子の場合と同様にして、ヒト21番染色体由来HACベクターへ複数のヒトEPO遺伝子を挿入した。実施例1〜4に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にloxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを用意した。一方でloxP配列を含むヒトEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
プラスミド構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
EPOnF:5'- GGA ATT CCG GGC CCA CGC GTG ACA TTG ATT ATT GA -3’(配列番号35)
SVpAR:5'- GGA ATT CCT GAT CAT AAT CAG CCA TAC CAC ATT TG -3’(配列番号36)
上記(1)にて作製したプラスミドベクターpLN1−EPO2をXbaI(宝酒造)で消化して直鎖化した後、KODポリメラーゼ(東洋紡)にて平滑末端化し、ApaI(宝酒造)で消化してCMVプロモーター及びヒトEPO遺伝子及びSV40ポリA付加ユニットを2コピー含むインサート用DNA断片を得た。プラスミドベクターpLN1−EPO2をMluI(宝酒造)で消化した後KODポリメラーゼ(東洋紡)にて平滑末端化し、ApaI(宝酒造)で消化して出来たApaI−平滑末端化MluIサイト間へ上記のインサート用DNA断片をクローニングした。このヒトEPO遺伝子を4コピー含むプラスミドベクターをpLN1−EPO4とした。
実施例3で作製したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)bsd79−1)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。上記(1)又は(2)で作製したpLN1−EPO2ベクター又はpLN1−EPO4ベクター10μgとCre酵素発現ベクターpBS185(ライフテック)10μgの存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%牛胎児血清(FBS)を添加したイーグルF12培地(以下F12という;インビトロジェン製)を含む48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)5枚に播種した。2日後に800μg/mlのG418(GENETICIN、インビトロジェン)と8μg/mlのブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride,フナコシ)を含む培地と置き換えた。2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はCHO細胞5×106あたり、pLN1−EPO2を用いた場合には14個、pLN1−EPO4を用いた場合には24個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。これらの細胞を以後、pLN1−EPO2を用いて作製した細胞はKH21E2細胞、pLN1−EPO4を用いて作製した細胞はKH21E4細胞と称する。
組換え挿入体の選別は、ヒト21番染色体由来HACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにヒトEPO遺伝子供与ベクター由来配列上及びHACベクター上にプライマーを設計し、PCR増幅により確認した。また、挿入されたヒトEPO遺伝子のコピー数を、プラスミドベクターpBS226上のプライマーとHACベクター上にプライマーを設計し、PCR増幅により確認した。
SVpANp1:5'- TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA -3’(配列番号37)
このプライマーは、プラスミドベクターpSTneoB(加藤ら、Cell Struct Funct,12:575−580, 1987)の塩基配列を基にして作製した。
このプライマーは、プラスミドベクターpSF1(ライフテック)のneo遺伝子の塩基配列を基にして作製した。
このプライマーは、プラスミドベクターpBS226(ライフテック)の塩基配列を基にして作製した。
以上より、上記の12クローンは全てloxP配列への組換え挿入体であることが確認された。
ヒトEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
単離したG418/ブラストサイジン耐性KH21E2細胞14クローン中6クローンについて、各々1×105細胞を10%FBS添加した800μg/mlのG418と8μg/mlのブラストサイジンを含むF12培地2mlをいれた6穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え、6日間培養し上清を回収した。ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム)により、培養上清中のヒトEPOを2×10−5希釈にて定量した。その結果を表4に示す。
また、単離したG418/ブラストサイジン耐性KH21E4細胞24クローン中6クローンについて、各々1×105細胞を10%FBS添加した800μg/mlのG418と8μg/mlのブラストサイジンを含むF12培地2mlをいれた6穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え、6日間培養し上清を回収した。ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム)により、培養上清中のヒトEPOを2×10−5希釈にて定量した。その結果を表5に示す。
また、比較対照用として、実施例7において単離した、ヒトEPO遺伝子をヒト21番染色体由来HACベクター上に1コピー保持するG418/ブラストサイジン耐性KH21E細胞5クローンについて、各々1×105細胞を10%FBS添加した800μg/mlのG418と8μg/mlのブラストサイジンを含むF12培地2mlをいれた6穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え、6日間培養し上清を回収した。ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム)により、細胞培養上清中のヒトEPOを定量した。その結果を表6に示す。ただし、C1及びC4は1×10−4希釈にて、C9、C11及びC20は1×10−5希釈にて定量した。
実施例7に記載のヒトEPO遺伝子の場合と同様にして、ヒト21番染色体由来HACベクターへヒトEPO遺伝子を挿入する。実施例1〜4及び6に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にloxPサイトを導入し、かつテロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト21番染色体由来HACベクターを用意した。一方でloxP配列を含むヒトEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
後述する実施例17で作製したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞2株:CHO#21hyg4及びCHO#21hyg8(以後それぞれH4細胞及びH8細胞と称する)に対しトリプシン処理を行い、それぞれ5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。実施例7(1)で作製したpLN1−EPOベクター10μgとCre酵素発現ベクターpBS185(ライフテック)10μgの存在下でジーンパルサー(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%牛胎児血清(FBS)を添加したイーグルF12培地(以下F12という;インビトロジェン製)を含む48穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)5枚に播種した。2日後に800μg/mlのG418(GENETICIN、インビトロジェン)及び8μg/mlのブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride,フナコシ)を含む選択培地と置き換えた。2〜3週間後にはG418耐性及びブラストサイジン耐性コロニーが出現し、H4細胞又はH8細胞を宿主としたそれぞれから24個ずつコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。これらの細胞を以後、H4を用いて作製した細胞はH4E細胞、H8を用いて作製した細胞はH8E細胞と称する。
(2−1)PCR解析
loxPサイト近傍に位置するヒト21番染色体長腕近位のマーカーPRED65及びPRED3遺伝子と遠位に位置するD21S265マーカー(実施例1の(3)、図2参照)についてPCR増幅を行った。loxP配列間の部位特異的組換え反応によるヒトEPO遺伝子挿入体は、PRED65及びPRED3遺伝子を保持しD21S265マーカーを保持しないことが予想される。その結果、H4E細胞22クローンのうち21クローンにおいて予想された増幅が認められた。これら21クローンに対して、ヒト21番染色体の短腕近位に位置するSTSマーカー(pCHB,D21S187,D21S275)につきPCR増幅を行った(実施例6の(3)、図12参照)。ヒト21番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、pCHB及びD21S187マーカーを保持せず,D21S275マーカーを保持することが予測される。その結果、15クローンにおいて予想された増幅が認められた。
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。上記(2−1)のPCR解析において全てのマーカーについて予想される増幅を示したクローンのうち、6クローンについて解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。その結果を表7に示す。以上より、宿主であるCHO細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト21番染色体がCHO細胞に移入されたことが確認された。
ヒトEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
単離したG418及びブラストサイジン耐性H4E細胞24クローン中10クローンについて、各々1×105細胞を10%FBS添加した800μg/mlのG418と8μg/mlのブラストサイジンを含むF12培地2mlをいれた6穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え、6日間培養し上清を回収した。ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム)により、培養上清中のヒトEPOを定量した。その結果を表8に示す。
また、単離したG418及びブラストサイジン耐性H8E細胞24クローン中6クローンについて、各々1×105細胞を10%FBS添加した800μg/mlのG418と8μg/mlのブラストサイジンを含むF12培地2mlをいれた6穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え、6日間培養し上清を回収した。ヒトEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム)により、培養上清中のヒトEPOを定量した。その結果を表9に示す。
(1)微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例17で得られた、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞:CHO#21hyg4及びCHO#21hyg8(以後それぞれH4細胞及びH8細胞と称する)を用いた。染色体受容細胞としてはマウスA9細胞(Oshimuraら、Environ. Health Perspect. 93:57, 1991,登録番号JCRB0211)を用いた。はじめに約107個のH4細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)24本に細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したH4又はH8細胞をコルセミド(0.1μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,800μg/mlG418,F12)中で5日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemaggulutinin-P,Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。マウスA9細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え、37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)及びDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過した溶液で1分間かけて融合した。10%FBSを含むDMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)2枚に播種した。2日後にブラストサイジン(4μg/ml)又はハイグロマイシン(700μg/ml、インビトロジェン)を含む選択培地(10%FBS ,DMEM)と置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。7回の微小核細胞融合から22個の薬剤耐性コロニーを得た。上記で得られた細胞を以後A9Δ細胞と称する。
(2−1)PCR解析
上記(1)において得られたコロニーのうち21クローンについて解析した。loxPサイト近傍に位置するヒト21番染色体長腕近位のマーカーPRED65及びPRED3遺伝子と遠位に位置するD21S265マーカー(実施例1の(3)、図2参照)についてPCR増幅を行った。HACベクター移入体は、PRED65及びPRED3遺伝子を保持しD21S265マーカーを保持しないことが予想される。その結果、20クローンにおいて予想された増幅が認められた。
ヒト21番染色体由来HACベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子(短腕遠位)及びブラストサイジン耐性遺伝子(長腕近位)が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。上記(2−1)のPCR解析において全てのマーカーで予想される増幅を示し、上記(2−2)においてブラストサイジン耐性かつハイグロマイシン耐性を示した2クローンについて解析したところ、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。その結果を表11に示す。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例10で得られた、ヒトEPO遺伝子を1コピー挿入した、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞のうち微小核形成能が高いクローン(H4E C10又はC15又はC16細胞)を用いた。染色体受容細胞としては、マウスA9細胞(Oshimuraら、Environ.Health Perspect. 93:57, 1991,登録番号JCRB0211)を用いた。はじめに約108個のH4EC15又はC16細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)24本に細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したH4E C15又はC16細胞をコルセミド(0.1μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,800μg/mlG418,F12)中で4日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/ml又は100μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemaggulutinin−P,Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。マウスA9細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え、37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1000(終濃度50%(W/V)、シグマ)及びDMSO(終濃度7%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過した溶液で1分間かけて融合した。10%FBSを含むDMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)2枚に播種した。2日後にブラストサイジン(6μg/ml)又はG418(600μg/ml)を含む選択培地(10%FBS ,DMEM)と置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。12回の微小核細胞融合から39個のG418耐性コロニーを得た。上記で得られた細胞を以後AΔE細胞と称する。
(2−1)PCR解析
上記(1)において得られたコロニーのうち25クローンについて解析した。loxPサイト近傍に位置するヒト21番染色体長腕近位のマーカーPRED65及びPRED3遺伝子と遠位に位置するD21S265マーカー(実施例1の(3)、図2参照)についてPCR増幅を行った。loxP配列間の部位特異的組換え反応によるヒトEPO遺伝子挿入体は、PRED65及びPRED3遺伝子を保持しD21S265マーカーを保持しないことが予想される。その結果、24クローンにおいて予想された増幅が認められた。これら24クローンに対して、ヒト21番染色体の短腕近位に位置するSTSマーカー(pCHB,D21S187,D21S275)につきPCR増幅を行った(実施例6の(3)、図12参照)。ヒト21番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、pCHB及びD21S187マーカーを保持せず、D21S275マーカーを保持することが予測される。その結果、19クローンにおいて予想された増幅が確認された。
ヒト21番染色体由来HACベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子(短腕遠位)、ブラストサイジン耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子(長腕近位)が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。上記(2−1)のPCR解析において全てのマーカーで予想される増幅を示した7クローンについて解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。その結果を表13に示す。
組換え挿入体の選別は、ヒト21番染色体由来HACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにヒトEPO遺伝子供与ベクター由来配列上及びHACベクター上にプライマーを設計し、PCR増幅により確認した。
ヒトEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
以上より、上記のAΔE細胞は、ヒトEPOタンパク質を産生することが確認された。
(1)ヒト正常繊維芽細胞HFL−1へのSC20移入
(1−1)微小核細胞融合(プレート法)と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、ヒト14番染色体断片(SC20)を保持するマウスA9細胞(C11−SC20細胞、Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133-143,1997年)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。はじめに約107個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養したC11−SC20細胞をコルセミド(0.05μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,800μg/mlG418,DMEM)中で48時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemaggulutinin-P,Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。HFL−1細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1500(終濃度45%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)及びDMSO(終濃度10%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過滅菌した溶液で1分間かけて融合した。15%FBSを含むDMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)1枚に播種した。2日後にG418(300μg/ml)を含む選択培地(15%FBS ,DMEM)に置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。3回の微小核細胞融合から21個のG418耐性コロニーを得た。
上記(1−1)と同様にしてミクロセルを調製及び精製し、6mlのDMEMに再懸濁した。HFL−1細胞を90%飽和の状態まで175cm2培養用フラスコ(ファルコン)にて培養し、トリプシン処理にて分散した後、DMEMで2回洗浄しDMEM7mlに再懸濁した。上記ミクロセル懸濁液に上記HFL−1細胞懸濁液を重層し遠心後、上清を除きペレットをタッピングにて懸濁し、0.5mlのPEG1500(終濃度50%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)を加え、120秒間にて融合した。DMEM5mlを1ml/1分の速度で加え、さらにDMEM5ml加えて37℃10分間静置後、遠心し15%FBSを含むDMEM培地に再懸濁してコラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)2枚に播種した。2日後にG418(300μg/ml)を含む選択培地(15%FBS,F12)に置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。1回の微小核細胞融合から2個のG418耐性コロニーを得た。
(1−3−1)PCR解析
移入染色体は,SC20上に存在するneo遺伝子のPCR増幅により確認した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す:
421F:5'- TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA -3’(配列番号40)
778R:5'- AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC -3’(配列番号41)
これらのプライマーは、プラスミドベクターpSTneoB(加藤ら、Cell Struct Funct,12:575−580, 1987)の塩基配列を基にして作製した。
染色体解析は、黒木ら(細胞工学ハンドブック,羊土社,1992)に記された方法に従い、ギムザ染色にて行った。G418耐性のHFL−1細胞のうち2クローンについて分裂中期染色体像を解析した。その結果、G418耐性株では、親株のHFL−1には認められず、内在の14番染色体よりサイズの小さいミニ染色体が観察された。
(2−1)微小核細胞融合(プレート法)と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、ヒト14番染色体断片(SC20)を保持するマウスA9細胞(C11−SC20細胞、Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133-143,1997年)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HUC−F2(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0436)を用いた。はじめに約107個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養したC11−SC20細胞をコルセミド(0.05μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,800μg/mlG418,DMEM)中で48時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。HUC−F2細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1500(終濃度45%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)又はPEG1000(終濃度45%(W/V)、シグマ)、及びDMSO(終濃度10%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過滅菌した溶液で1分間かけて融合した。10%FBSを含むαMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)1枚に播種した。2日後にG418(400μg/ml)を含む選択培地(10%FBS ,αMEM)に置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。4回の微小核細胞融合から8個のG418耐性コロニーを得た。
上記(1−1)と同様にしてミクロセルを調製及び精製し、6mlのDMEMに再懸濁した。HUC−F2細胞を90%飽和の状態まで175cm2培養用フラスコ(ファルコン)にて培養し、トリプシン処理にて分散した後、DMEMで2回洗浄しDMEM7mlに再懸濁した。上記ミクロセル懸濁液に上記HUC−F2細胞懸濁液を重層し遠心後、上清を除きペレットをタッピングにて懸濁し、0.5mlのPEG1500(終濃度50%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)を加え、120秒間にて融合した。DMEM5mlを1ml/1分の速度で加え、さらにDMEM5ml加えて37℃10分間静置後、遠心し10%FBSを含むαMEM培地に再懸濁してコラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)2枚に播種した。2日後にG418(400μg/ml)を含む選択培地(10%FBS ,αMEM)に置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。1回の微小核細胞融合から6個のG418耐性コロニーを得た。
移入染色体は,SC20上に存在するneo遺伝子のPCR増幅により確認した。すなわち、上記(2−1)及び(2−2)で得られたG418耐性細胞7クローンについて、421Fプライマー(配列番号40)及び778Rプライマー(配列番号41)を用いたPCR増幅を行った。HACベクター移入体は、neo遺伝子を保持することが予想される。その結果、全てのクローンにおいて予想された増幅が確認された。以上の実験から、得られたG418耐性HUC−F2株はSC20を保持することが確かめられた。
染色体供与細胞として、ヒト14番染色体断片(SC20)を保持するマウスA9細胞(C11−SC20細胞、Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133-143,1997年)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HF−19(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0210)を用いた。はじめに約107個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養したC11−SC20細胞をコルセミド(0.05μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,800μg/mlG418,DMEM)中で48時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemaggulutinin−P,Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。HF−19細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1500(終濃度45%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)及びDMSO(終濃度10%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過滅菌した溶液で1分間かけて融合した。10%FBSを含むαMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)1枚に播種した。2日後にG418(400μg/ml)を含む選択培地(10%FBS ,αMEM)に置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。1回の微小核細胞融合から1個のG418耐性コロニーを得た。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
(1−1)染色体供与細胞としてヒト21番染色体由来HACベクター保持CHO細胞を用いた微小核細胞融合
染色体供与細胞として、実施例10で得られた、ヒトEPO遺伝子を1コピー挿入した、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりヒトEPO遺伝子を挿入した、ヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞のうち微小核形成能が高いクローン(H4E C10細胞)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。はじめに約108個のH4E C10細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)48本に細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したH4E C10細胞をコルセミド(0.1μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,800μg/mlG418,F12)中で4日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。HFL−1細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1500(終濃度45%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)及びDMSO(終濃度10%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過滅菌した溶液で1分間かけて融合した。20%FBSを含むDMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)1枚に播種した。2日後にG418(300μg/ml)又はブラストサイジン(6μg/ml)を含む選択培地(20%FBS ,DMEM)に置き換えた。約3週間の選択培養を行った。出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。5回の微小核細胞融合から3個の薬剤耐性コロニーを得た。上記の細胞をHCΔE細胞と称する。
染色体供与細胞として、実施例12で得られた、ヒトEPO遺伝子を1コピー挿入した、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりヒトEPO遺伝子を挿入した、ヒト21番染色体由来HACベクターを保持するマウスA9細胞のうち微小核形成能が高いクローン(AΔ51又はAΔE5細胞)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。はじめに約107個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養したAΔ51又はAΔE5細胞をコルセミド(0.1μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%FBS,600μg/mlG418,DMEM)中で72時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Phytohemaggulutinin−P,Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。HFL−1細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)に精製した微小核細胞を加え37℃にて15分間静置した後、DMEM中にPEG1500(終濃度45%(W/V)、ロシュダイアグノステイクス)及びDMSO(終濃度10%(W/V)、シグマ)を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター(ザルトリウス)にて濾過滅菌した溶液で1分間かけて融合した。20%FBSを含むDMEM培地にて48時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)1枚に播種した。2日後にG418(300μg/ml)又はブラストサイジン(6μg/ml)を含む選択培地(20%FBS,DMEM)に置き換えた。約3週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。10回の微小核細胞融合から27個の薬剤耐性コロニーを得た。上記の細胞を以後HΔE細胞と称する。
移入染色体の確認は、ヒト21番染色体由来HACベクター上のneo遺伝子の有無を指標にしてPCR増幅により確認した。
1291F:5'- CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG -3’(配列番号42)
1667R:5'- ATT TGC ACT GCC GGT AGA ACT -3’(配列番号43)
これらのプライマーは、プラスミドベクターpSTneoB(加藤ら、Cell Struct Funct,12:575−580, 1987)の塩基配列を基にして作製した。
ヒトEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
(1)loxP配列を含むhTERT発現プラスミドpLN1−hTERTの構築
ヒトテロメラーゼ(hTERT)遺伝子は、コード領域3399bpであり、5’側領域にG及びCが豊富な配列を含むため、コード領域の両端に設計したプライマーで全長をPCR増幅するには困難が予測された。それゆえ、コード領域を3つ(1〜800bp;以後5’hTERTと称する、679〜1993bp;以後M−XhTRETと称する、1952〜3339bp;以後3’hTRETと称する。ただし塩基配列位置は開始コドンATGのAを1として表した)に分けてそれぞれPCR増幅及びクローニングした後、各領域を連結する方法でhTERT遺伝子をクローニングした。以下にその方法を示す。
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
hTERT Fw6:5'- CTG CTG CGC ACG TGG GAA G -3’(配列番号44)
hTERT Rv6:5'- GGT CTG GCA GGT GAC ACC AC -3’(配列番号45)
hTERT Fw1:5'- GAA GAT CTT CAT CGA TCG GCC ACC ATG CCG CGC GC -3’(配列番号46)
hTERT Rv7:5'- TCA CTC GGT CCA CGC GTC CT -3’(配列番号47)
これらのプライマーは、GenBankより入手した塩基配列(アクセッション番号NM003219)を基に作製した。
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
hTERT Fw8-2:5'- AGT GCC AGC CGA AGT CTG CC -3’(配列番号48)
hTERT 5’XhoIRv3:5'- GCA GCT GAA CAG TGC CTT C -3’(配列番号49)
hTERT Fw8-1:5'- AGG ACG CGT GGA CCG AGT GA -3’(配列番号50)
これらのプライマーは、GenBankより入手した塩基配列(アクセッション番号NM003219)を基に作製した。
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
AP1:5'- CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC -3’(配列番号51)
このプライマーは、Marathon−Ready cDNA(CLONTECH)添付のものを使用した。
hTERT 3’XhoIFw2:5'- ATG GAC TAC GTC GTG GGA GCC AGA -3’(配列番号53)
hTERT Rv1:5'- GTC GAC GCT AGC TCA GTC CAG GAT GGT CTT GAA GT -3’(配列番号54)
これらのプライマーは、GenBankより入手した塩基配列(アクセッション番号NM003219)を基に作製した。
上記(1−3)にて得られたプラスミドベクターpLN1−3’hTERTを鋳型として、hTERT 3’XhoIFw(配列番号52)及びhTERT Rv1(配列番号54)をそれぞれ終濃度0.3μMにて、KOD−Plus−(東洋紡)0.5ユニットを用いて50μlの反応液にてPCR増幅を行った。サーマルサイクラーはGeneAmp9700(Applied Biosystems)を使用した。PCRサイクルは、94℃2分の後、変性94℃15秒、アニーリング60℃30秒、及び伸長68℃2分を30サイクル、にて行った。その結果、約1.4kbのDNA断片を得た。
実施例9(1)にて作製したプラスミドベクターpLN1−EPO2をEcoRI消化して得られたCMVプロモーター、ヒトEPO遺伝子及びSV40ポリA付加ユニットを含むDNA断片を、実施例11にて作製したプラスミドベクターpLN1−hTERTのEcoRIサイトへクローニングした。これをpLN1−EPO−hTERTとする。
実施例9(1)にて作製したプラスミドベクターpLN1−EPO2をEcoRI消化して得られたCMVプロモーター、ヒトEPO遺伝子及びSV40ポリA付加ユニットを2コピー含むDNA断片を、上記(1)にて作製したプラスミドベクターpLN1−hTERTのEcoRIサイトへクローニングした。これをpLN1−EPO2−hTERTとする。
実施例9(2)にて作製したプラスミドベクターpLN1−EPO4をEcoRI消化して得られたCMVプロモーター、ヒトEPO遺伝子及びSV40ポリA付加ユニットを4コピー含むDNA断片を、上記(1)にて作製したプラスミドベクターpLN1−hTERTのEcoRIサイトへ転写順方向に4コピー並ぶようにクローニングした。これをpLN1−EPO4−hTERTとする。
実施例7に記載のヒトEPO遺伝子の場合と同様にして、ヒト21番染色体由来HACベクターへヒトEPO遺伝子及びhTERT遺伝子を挿入する。実施例1〜4及び6に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にloxPサイトを導入し、テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト21番染色体由来HACベクターを用意した。一方でloxP配列を含むヒトEPO及びhTERT発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。
実施例11にて得られたヒト21番染色体由来HACベクターを保持するマウスA9細胞(A9Δ12細胞)を6ウェル組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)1枚にて細胞密度が60〜70%飽和程度までブラストサイジン(4μg/ml)を含む選択培地(10%FBS ,DMEM)で培養した。実施例15の(2)で作製したpLN1−EPO−hTERTベクター及びCre酵素発現ベクターpBS185(ライフテック)の存在下、Fugene6(ロシュダイアグノステイクス)を用いて添付のプロトコールに従ってトランスフェクションを行った。48時間培養した後トリプシン処理にて分散し、6ウェル分を一つにまとめてG418(600μg/ml)を含む選択培地(10%FBSを添加したDMEM)に懸濁し、48穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)5枚に播種した。2〜3週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はA9Δ12細胞5×106あたり4個であった。コロニーを単離してさらに培養した結果、1個のコロニーが増殖した。上記の得られた細胞を以後A9ΔET1細胞と称する。
(2−1)PCR解析
A9ΔET1細胞について解析した。loxPサイト近傍に位置するヒト21番染色体長腕近位のマーカーPRED65及びPRED3遺伝子(実施例1の(3)、図2参照)についてPCR増幅を行った。loxP配列間の部位特異的組換え反応によるヒトEPO遺伝子挿入体は、PRED65及びPRED3遺伝子を保持することが予想される。その結果、予想された増幅が認められた。次に、ヒト21番染色体の短腕近位に位置するSTSマーカーD21S275につきPCR増幅を行った(実施例6の(3)、図12参照)。ヒト21番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、D21S275マーカーを保持することが予測される。その結果、予想された増幅が確認された。
ヒト21番染色体由来HACベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子(短腕遠位)及びブラストサイジン耐性遺伝子が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
組換え挿入体の選別は、ヒト21番染色体由来HACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにヒトEPO遺伝子供与ベクター由来配列上及びHACベクター上にプライマーを設計し、PCR増幅により確認した。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例6で得られた、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入し、短腕遠位を削除したヒト21番染色体に基づくHACベクターを保持するDT40細胞(DT40(#21)hyg4)を用いた。染色体受容細胞としては、チャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(ATCCより入手,登録番号JCRB9018)を用いた。ミクロセルの取得及びCHO細胞との融合は実施例3(1)と同様に行った。計4回の融合を行った結果、選択培養開始後約2週間後に計5株のハイグロマイシン耐性CHO株を得た。
(2−1)PCR法
移入染色体の確認をPCR法により行った。ヒト21番染色体短腕近位のマーカーpCHB、D21S187及びD21S275(実施例6の(3−1)、図12参照)の検出を試みた。ハイグロマイシン耐性のCHO細胞5株のうち2株(CHO#21hyg4及びCHO#21hyg8)において、切断点より近位に位置するD21S275の増幅を確認した。
組換えの標的部位を挟んだ配列をPCRにより増幅した(実施例6の(3−3)、図12参照)。CHO#21hyg4、8の2株でのみ増幅産物が得られ、制限酵素NsiI消化でも予想される部分断片の生成を確認した。
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。ハイグロマイシン耐性のCHO株のうちの2株(CHO#21hyg4及びCHO#21hyg8)について解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。宿主であるCHO細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト21番染色体がCHO細胞に移入されたことが確認された。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例17で得られた、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入し短腕遠位を削除したヒト21番染色体に基づくHACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)hyg4及びCHO(#21)hyg8)を用いた。染色体受容細胞としてはヒト線維肉腫細胞株HT1080(ATCCより入手,登録番号CCL−121)を用いた。ミクロセルの取得及びHT1080細胞との融合は実施例4(1)と同様に行った。CHO(#21)hyg4では1回の微小核細胞融合から計7のブラストサイジン耐性HT1080株、CHO(#21)hyg8では2回の微小核細胞融合から計20のブラストサイジン耐性HT1080株を得た。
(2−1)PCR法
移入染色体は、ブラストサイジン耐性遺伝子(実施例4(2−1)参照)及びハイグロマイシン耐性遺伝子のPCR増幅により確認した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を次に示す:
HygroF:5'- GCGAAGAATCTCGTGCTTTC(配列番号55)
HygroR:5'- ATAGGTCAGGCTCTCGCTGA(配列番号56)
ブラストサイジン耐性遺伝子は、ブラストサイジン耐性HT1080株のすべてにおいて増幅が確認された。一方ハイグロマイシン耐性遺伝子は、CHO(#21)hyg4由来の7株中5株、CHO(#21)hyg8由来の30株中27株において増幅が確認された。
染色体解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いたFISH法により行った。代表的なFISH像を図17に示す。ブラストサイジン耐性株では、親株のHT1080細胞には存在せず、内在の21番染色体よりサイズの小さい染色体断片が観察された。
長腕遠位を削除したヒト21番染色体と、さらに短腕遠位を削除したヒト21番染色体の培養細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例4に記載したヒト細胞株(HT1080(#21)bsd79−1−1,3,6,11,14、HT1080(#21)bsd−H4−1,3,6、HT1080(#21)bsd−H8−4,9,2)を使用した。ヒト細胞株用の非選択培養液は10%CSを加えたDMEMであり、選択培養液はこれにブラストサイジン4μg/mlを添加した。ヒト細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、3日後に細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種した。ヒト細胞株は集団倍加数25,50,100にそれぞれ細胞を回収し染色体標本を作製した。
ヒト細胞における人工染色体の検出は、黒木ら(細胞工学ハンドブック,羊土社,1992)に記された方法に従いギムザ染色法により行った。分裂中期染色体像20個においてミニ染色体の有無を観察して保持率を算出し、5クローンの平均値を出した。その結果を表17に示す。
(1)トランスフェクション及びG418耐性クローンの単離
実施例18で作製したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するヒトHT1080細胞株(HT1080(#21)bsd79−1−6,14、HT1080(#21)bsd−H4−1,6、HT1080(#21)bsd−H8−2)をトリプシン処理し、6ウェルクラスター(ヌンク)の1ウェルあたり4×105細胞を播種し1日間培養した。実施例5(1)で作製したloxP配列を含むGFP発現プラスミド2μgとCre酵素発現ベクターpBS185(ライフテック)1μgを7.5μlのリポソーム溶液(リポフェクトアミン2000、インビトロジェン)と混合して培地に添加し5時間後に培地を交換した。1日培養後トリプシン処理し、10%CSを添加したDMEM培地に懸濁して100mmディッシュ2枚に播種した。翌日400μg/mlのG418(GENETICIN、シグマ)を含む培地と置き換えた。約2週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はHT1080細胞4×105あたり3〜14個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
単離したG418耐性HT1080細胞株を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、21ΔqHACでは21クローン中14クローンにおいて、また21ΔpqHACでは31クローン中28クローンにおいてGFPの発現が確認された。代表的な蛍光顕微鏡像と可視光顕微鏡像を図18a及びbに示す。
相同組換え体を確認するため、組換えの標的部位を夾んだ配列をPCRにより増幅した。pBS226及びpSF1プラスミド上に設定したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
CMVneo910:5'- GCATCAGAGCAGCCGATTGT(配列番号58)
G418耐性HT1080細胞株から任意の7株を選び、選択薬剤非添加の条件で継代培養した。培養開始から1ヶ月後(集団倍加数約30)に蛍光顕微鏡下で観察した結果、いずれのクローンにおいてもGFP遺伝子の発現が確認された。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例5で得られた長腕遠位を削除してloxP配列を導入したヒト21番染色体由来HACベクターにGFP遺伝子を挿入したCHO細胞株(CHO(#21)ΔqGFP7−2)と、実施例17で得られた長腕遠位を削除してloxP配列を導入し短腕遠位を削除したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)Hyg8)を用いた。受容細胞としてはマウスES細胞株E14(Hooperら, Nature, 326 :292, 1987)を用いた。E14の培養方法は(相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8,ジーンターゲッティング、羊土社、1995)に記された方法に従い、栄養細胞としてはマイトマイシンC処理したマウス胚初代培養細胞(インビトロジェン)を用いた。まず約108個の供与細胞からミクロセルを調製し全量5mlのDMEMに懸濁した。約107個のE14をDMEMで3回洗浄し、5mlのDMEMに懸濁した後、ミクロセルとあわせ、1250rpm、10分間遠心して上清を除いた。沈殿をタッピングによりよくほぐし、1:1.4PEG溶液(5g PEG1000(和光純薬)、1mlDMSO(シグマ)を6mlDMEMに溶解)0.5mlを加えて室温で1分30秒静置した後、10mlのDMEMをゆっくりと加えた。直ちに1250rpm、10分間遠心して上清を除き、沈殿を30mlのES細胞用培地に懸濁し、直径100mlの組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)3枚に播種した。24時間後にCHO(#21)ΔqGFP7−2を供与細胞とする場合300μg/mlのG418(GENETICIN、シグマ)、CHO(#21)Hyg8を供与細胞とする場合150μg/mlのハイグロマイシン(Hygromycin-B、和光純薬)加えた培地と交換し、その後毎日培地を交換した。1週間〜10日後には耐性コロニーが出現したが、その頻度はE14細胞107個あたり2〜5個であった。そのコロニーを単離し増殖させ、5×107個あたり1mlの保存用培地(ES細胞用培地+10%DMSO(シグマ))に懸濁し、−80℃にて凍結保存した。同時に各耐性株について約106個の細胞からゲノムDNAを調製した(Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System社))。
移入染色体と保持領域はPCR増幅により確認した。以下に示すプライマーオリゴヌクレオチドを新たに設定した:
#21p76957:5'- ACACTTTTGACAAACACACCAG(配列番号59)
#21p77555:5'- TCAACAATGAAAGGGGATGTC(配列番号60)
これらのプライマーは、GenBankより入手した塩基配列(アクセッション番号AL163201)を基に作製した。解析に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを下記表18に示す:
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体が検出された。代表的なFISH像を図20a及びbに示す。CHO(#21)ΔqGFP7−2由来G418耐性株では5株中1株(E14(#21)neo1)でヒト染色体断片が観察された。CHO(#21)Hyg8由来ハイグロマイシン耐性の2株では、いずれもヒト染色体断片が観察された。このうちE14(#21)Hyg1では2本のヒト染色体断片が、E14(#21)Hyg2では1本のヒト染色体断片が観察された。ヒト染色体の確認された上記3株では、宿主であるマウスの染色体数はいずれも40本で正常であることを確認した。
以上の(2)及び(3)の結果から、得られたG418耐性ないしハイグロマイシン耐性E14株はヒト21番染色体由来HACベクターを保持することが確かめられた。
ヒト21番染色体由来HACベクターのマウスES細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で選択培養を行った。上記(3)で作製したマウスES細胞株E14(#21)neo1、E14(#21)Hyg1、E14(#21)Hyg2を使用した。マウスES細胞用の非選択培養液は18.2%FBS(インビトロジェン)、3.5g/lグルコース(シグマ)、0.125mM MEM非必須アミノ酸(インビトロジェン)、1000U/ml LIF(ESGRO、和光純薬)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(シグマ)を加えたDMEMである。マウスES細胞株は1×107細胞を10cm径ディッシュ中の栄養細胞上に播種し、2日後に1/15を10cm径ディッシュ中の栄養細胞上に播種した。培養開始から14,28,42日後にそれぞれ細胞を回収し、染色体標本を作製した。
マウスES細胞におけるヒト21番染色体由来HACベクターの検出は松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いたFISH解析法により行った。20個の分裂中期像においてヒト染色体断片の有無を観察し、保持率を算出した。その結果を表19に示す。長期継代培養は各株とも3連で行い、保持率としてその平均を示した。
(1)微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例17で得られた、長腕遠位を削除してloxP配列を挿入し短腕遠位を削除したヒト21番染色体に基づくHACベクターを保持するCHO細胞(CHO(#21)hyg4及びCHO(#21)hyg8)を用いた。染色体受容細胞としてはヒトhTERT遺伝子及びヒトパピローマウイルスE6/E7遺伝子により株化したヒト骨髄由来間葉系幹細胞株hiMSC(京都大学、戸口田淳也教授より入手、Okamotoら、 Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 354, 2002)を用いた。hiMSC株は、10%FBSを添加したDMEM培地を用いて培養した。はじめに約107個のCHO(#21)hyg4/8細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(コースター)6本に細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したCHO(#21)hyg4/8細胞をコルセミド(0.075μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(10%FBS,8μg/mlブラストサイジン,F12)中で48時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、フィルターで濾過して精製した。6cm径ディッシュに80%飽和の状態まで培養したhiMSC細胞に、精製した微小核細胞を加えPEG溶液で融合した。48時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、ブラストサイジン(8μg/ml)を含む選択培地(10%CS,DMEM)で培養した。約2週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。CHO(#21)hyg4では1クローン、CHO(#21)hyg8では4クローンのブラストサイジン耐性hiMSC株を得た。
(2−1)PCR法
移入染色体は、ブラストサイジン耐性遺伝子(実施例4(2−1)参照)及びハイグロマイシン耐性遺伝子(実施例18(2−1)参照)のPCR増幅により確認した。ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子ともに検索した5株のブラストサイジン耐性HT1080株のすべてにおいて増幅が確認された。
染色体解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いたFISH法により行った。代表的なFISH像を図21に示す。ブラストサイジン耐性株では、親株のhiMSC細胞には存在せず、内在の21番染色体よりサイズの小さい染色体断片が観察された。
ヒト21番染色体由来HACベクターの、多分化能を持つヒト体幹細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。上記(1)及び(2)で作製したヒト間葉系幹細胞株(hiMSC(#21)bsd−H4−1、hiMSC(#21)bsd−H8−1,2,3,4)を使用した。ヒト細胞株用の非選択培養液は10%FBSを加えたDMEMであり、選択培養液はこれにブラストサイジン4μg/mlを添加した。ヒト細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、3日後に細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種した。ヒト細胞株は培養開始時点から集団倍加数15,40,90にそれぞれ細胞を回収し染色体標本を作製した。
ヒト間葉系幹細胞におけるヒト21番染色体由来HACベクターの検出は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト21番染色体由来アルフォイド特異的プローブp11−4(名古屋大学、舛本寛教授より入手、Ikenoら、Hum. Mol. Genet., 3: 1245, 1994)を用いたFISH法により行った。分裂中期染色体像50個においてミニ染色体上の蛍光シグナルの有無を観察して保持率を算出した。その結果を表20に示す。
実施例21で作製したヒト21番由来HACベクターを移入したヒト間葉系幹細胞をOkamotoら(Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 354, 2002)の方法に従って分化誘導し、骨、軟骨、脂肪細胞への分化能を調べた。実施例21に記載したヒト間葉系幹細胞株(hiMSC(#21)bsd−H8−1)及びその親株(hiMSC)を使用した。
hiMSC細胞を、3×103/cm2の密度で播種し、10%FBSを含むDMEM培地に100nMデキサメタゾン(シグマ)、50μMアスコルビン酸2リン酸(シグマ)、10mMβグリセロリン酸(シグマ)を添加した培地中で21日間培養した。この間培地は2日毎に交換した。
2.5×105のhiMSC細胞を15ml容のポリプロピレンチューブ(コーニング)に回収し室温で800rpm5分間遠心した。細胞沈殿を、高グルコースDMEMに10ng/mlヒトTGF−β3(インビトロジェン)、100nMデキサメタゾン(シグマ)、6μg/mlインスリン(ロシュ)、100μMアスコルビン酸2リン酸(シグマ)、1mMピルビン酸ナトリウム(シグマ)、6μg/mlトランスフェリン(シグマ)、0.35mMプロリン(シグマ)、1.25mg/mlウシ血清アルブミン(インビトロジェン)を添加した培地に再懸濁して遠心したのち、細胞塊の状態で21日間培養した。この間培地は2日毎に交換した。
hiMSC細胞を培養ディッシュに3×103/cm2の密度で播種し、コンフルエントまで培養したのち、誘導/維持培養を3回繰り返した。誘導培養は10%FBSを含むDMEMに1μMデキサメタゾン(シグマ)、0.2mMインドメタシン(シグマ)、10μg/mlインスリン(シグマ)、0.5mM3−イソブチル−1−メチルキサンチン(シグマ)を添加した誘導培地で3日間行った。維持培養は10%FBSを含むDMEMに10μg/mlインスリン(ロシュ)を添加した維持培地で2日間行った。
21日間の培養後、細胞はPBSで2度洗ったのち10%ホルマリンで固定した。骨細胞分化では5%硝酸銀(ナカライ)、脂肪細胞分化では0.3%オイルレッドO(ナカライ)、により染色した。軟骨細胞分化では固定した細胞塊をエタノールにより脱水しキシレンで洗浄したのちパラフィン包埋し、切片をアルシアンブルー(ナカライ)により染色した。
染色体供与細胞としてはヒト14番染色体断片SC20(Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000)を保持するマウスA9細胞株(以下A9/SC20、という)を用いた。染色体受容細胞としてはカニクイザルES細胞株CMK6.4(Suemoriら、Dev. Dyn. 222, 273-279, 2001)を用いた。CMK6.4の培養は、Suemoriら(前記)に記載された方法に従って実施した。培地の組成は、DMEM/F12(SIGMA D−6421)に、20%KSR(Knock out serum replacement,GIBCO BRL)、非必須アミノ酸溶液(×100,SIGMA M7145)、及びLグルタミン溶液(×100,SIGMA M7522)を添加したものである。まず、清水ら(細胞工学ハンドブック、羊土社、1992)の報告した方法に従い、25cm2フラスコ(Nunc 152094)24本(70〜80%コンフルーエント)のA9/SC20細胞からミクロセルを調製した。得られたミクロセルは全量を5mlのDMEM(SIGMA D−5796)に懸濁した。1〜5×106個のCMK6.4細胞をトリプシン液(0.25%トリプシン、20%KSR)で分散させた後、DMEMで2回洗浄し、5mlのDMEMに懸濁した後、ミクロセルとあわせ、1500rpm、7分間遠心して上清を除いた。融合に用いる1:1.4PEG溶液は、1gのPEG(SIGMA)を1.2mlのDMEMに溶解し、0.2mlDMSO(SIGMA)を添加することにより調製した。沈殿をタッピングによりよくほぐし、37℃でプレインキュベートした1:1.4PEG溶液1.0mlを加えて室温で2分間静置した後、10mlのDMEMをゆっくり加えた。直ちに1500rpm、7分間遠心して上清を除き、沈殿を4mlのES細胞用培地に懸濁し、あらかじめG418耐性栄養細胞をまいた直径35mmの組織培養用プラスチックシャーレ2枚に播種し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)で培養した。24時間後、50μg/mlのG418を加えた培地と交換し、その後毎日培地交換を行った。1週間から10日後には薬剤耐性コロニーが出現した。ピックアップされた薬剤耐性ES細胞コロニーをあらかじめG418耐性栄養細胞をまいた4ウェルプレートに播種し、50μg/mlのG418存在下でさらに10日間培養を行った。その結果生き残ったES細胞コロニーを再度ピックアップして、あらかじめ栄養細胞をまいた4ウェルプレートに播種し、非選択条件下でさらに10日間培養を行った。増殖したES細胞は、アルカリ性フォスファターゼ染色(Suemoriら、前記)陽性であり、未分化能を維持していることが示された。さらに定法に従って抽出されたゲノムDNAを用いた導入染色体保持確認は以下の通り実施した。
neoR:ATACTTTCTCGGCAGGAGCA(配列番号62)
実施例20で作製した、GFP遺伝子を挿入したヒト21番染色体HACベクターを保持するマウスES細胞を神経分化誘導し、神経細胞への分化能を調べた。マウスES細胞は、実施例20に記載したマウスES細胞株E14(#21)neo1を使用した。
E14(#21)neo1細胞は、直径100mmの組織培養用プラスチックシャーレ中の、マイトマイシンC処理したマウス胚初代培養細胞(インビトロジェン)上に播種し、20%FBSを含むDMEM(インビトロジェン)に2mM L−グルタミン酸(インビトロジェン)、0,2mM 2−メルカプトエタノール(シグマ)、1mMピルビン酸ナトリウム(インビトロジェン)、0.1mM MEM非必須アミノ酸、1000U/ml LIF(和光純薬)を添加した培地で培養した。0.1%トリプシン、0.04%EDTA処理により分散した細胞を培地中に回収してPBSで2回洗った後、1×106個/mlになるようPBSに懸濁してセルソーター(EPICS ELITE、ベックマン・コールター)にかけ、GFP発現細胞を分取した。
分化誘導用の栄養細胞であるマウス骨髄由来PA6細胞は、10%FBSを含むαMEM(インビトロジェン)に2mM L−グルタミン酸(インビトロジェン)を添加した培地で培養した。上記(1)で分取したGFP発現ES細胞1×103個を、血清及びLIFを含まない分化誘導用培地に懸濁してスライドチャンバー(ヌンク)中のPA6細胞上に播種した。分化誘導用培地は10%ノックアウト血清リプレースメント(インビトロジェン)を含むG−MEM(インビトロジェン)に2mM L−グルタミン酸(インビトロジェン)、0,2mM 2−メルカプトエタノール(シグマ)、1mMピルビン酸ナトリウム(インビトロジェン)、0.1mM MEM非必須アミノ酸を添加したものである。10日間培養した後4%パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞で特異的に発現するβチューブリンに対する抗体(TUJ1、Berkeley Antibody Company)により免疫染色し共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。突起を伸長し神経細胞の形態を呈し、抗βチューブリン抗体で染色される細胞においてGFPの発現が確認された。代表的な共焦点蛍光顕微鏡像を図22a及びbに示す。
Claims (38)
- 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト21番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクター。
- ヒト21番染色体断片が約2〜16Mbである、請求項1記載のヒト人工染色体ベクター。
- ヒト21番染色体の長腕遠位が21q11領域内で削除されている、請求項1又は2記載のヒト人工染色体ベクター。
- ヒト21番染色体の長腕遠位がAL163204において削除されている、請求項3記載のヒト人工染色体ベクター。
- ヒト21番染色体の短腕遠位が21p領域内で削除されている、請求項1又は2記載のヒト人工染色体ベクター。
- ヒト21番染色体の短腕遠位がAL163201において削除されている、請求項5記載のヒト人工染色体ベクター。
- ヒト21番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載のヒト人工染色体ベクター。
- 部位特異的組換え酵素がCre酵素である、請求項7記載のヒト人工染色体ベクター。
- 部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、請求項7又は8記載のヒト人工染色体ベクター。
- 部位特異的組換え酵素の認識部位がヒト21番染色体の長腕近位のAL163203に挿入されている、請求項7〜9のいずれか1項に記載のヒト人工染色体ベクター。
- 長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除が人工テロメア配列との置換によるものである、請求項1〜10のいずれか1項に記載のヒト人工染色体ベクター。
- ヒト人工染色体ベクターの作製方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト21番染色体を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;並びに
(c)上記ヒト21番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
を含む、上記作製方法。 - ステップ(a)において、ヒト21番染色体を保持する細胞が相同組換え効率の高いものである、請求項12記載の作製方法。
- 相同組換え効率の高い細胞がニワトリDT40細胞由来のものである、請求項13記載の作製方法。
- ステップ(b)において、ヒト21番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除を人工テロメア配列との置換により行うものである、請求項12〜14のいずれか1項に記載の作製方法。
- ステップ(b)において、ヒト21番染色体の長腕遠位をAL163204において削除する、請求項12〜15のいずれか1項に記載の作製方法。
- ステップ(b)において、ヒト21番染色体の短腕遠位をAL163201において削除する、請求項12〜16のいずれか1項に記載の作製方法。
- ステップ(c)において、部位特異的組換え酵素がCre酵素である、請求項12〜17のいずれか1項に記載の作製方法。
- ステップ(c)において、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、請求項12〜18のいずれか1項に記載の作製方法。
- 部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト21番染色体の長腕近位のAL163203に挿入する、請求項12〜19のいずれか1項に記載の作製方法。
- 請求項12〜20のいずれか1項に記載の作製方法により得られる、ヒト人工染色体ベクター。
- 請求項1〜11又は21のいずれか1項に記載のヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
- 請求項12〜20のいずれか1項に記載された作製方法において、以下のステップ:
(d)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト21番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
をさらに含むことを特徴とする、外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法。 - 請求項23記載の作製方法により得られる、外来DNAを含むヒト人工染色体ベクター。
- 請求項24記載の外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
- 請求項25記載の細胞を含む医薬組成物。
- 外来DNAを受容細胞に導入する方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト21番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト21番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(g)融合した受容細胞において外来DNAの導入を確認するステップ;
を含む、上記導入方法。 - 受容細胞が動物細胞である、請求項27記載の導入方法。
- 動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項28記載の導入方法。
- 受容細胞が多分化能を有する細胞である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の導入方法。
- 多分化能を有する細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は間葉系幹細胞若しくは組織幹/前駆細胞である、請求項30記載の導入方法。
- 外来DNAを発現する細胞の作製方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト21番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト21番染色体に外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(g)融合した受容細胞において外来DNAを発現する細胞を選択するステップ;
を含む、上記作製方法。 - 受容細胞が動物細胞である、請求項32記載の導入方法。
- 動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項33記載の導入方法。
- 受容細胞が多分化能を有する細胞である、請求項32〜34のいずれか1項に記載の導入方法。
- 多分化能を有する細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は間葉系幹細胞若しくは組織幹/前駆細胞である、請求項35記載の導入方法。
- タンパク質の製造方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト21番染色体を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト21番染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)上記ヒト21番染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(d)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト21番染色体にタンパク質をコードする外来DNAを挿入するステップ;
(e)上記ヒト21番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(f)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;
(g)融合した受容細胞を培地中で培養するステップ;並びに
(h)得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ;
を含む、上記製造方法。 - タンパク質が、エリスロポイエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TPO)、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子(vWF)、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン2、インターロイキン3、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン9、インターロイキン10、インターロイキン11、インターロイキン12、インターロイキン15、CD40リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―1アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子(GIF)、腫瘍壊死因子(TNF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンM、Flt3リガンド(Flt3L)、ストローマ由来因子(SDF)、幹細胞増殖因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管形成誘導因子(VEGF)、アンジオポイエチン、神経成長因子(NGF)、骨形成因子(BMP)、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、ウイント(Wnt)からなる群より選択されるものである、請求項37記載の製造方法。
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