JP2010004887A - ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター - Google Patents

ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター Download PDF

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Abstract

【課題】細胞中で安定に保持され、大きなサイズの外来遺伝子を簡便に挿入し、細胞に導入することができるヒト人工染色体ベクター及びその作製方法の提供。
【解決手段】長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト２１番染色体断片を含み、長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されているヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター及びその作製方法。ヒト人工染色体ベクターを用いた外来ＤＮＡの導入方法、外来ＤＮＡ発現細胞の作製方法及びタンパク質の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクター及びその作製方法に関する。また本発明は、ヒト人工染色体ベクターを用いた外来ＤＮＡの導入方法及び外来ＤＮＡ発現細胞の作製方法に関する。さらに本発明は、タンパク質の製造方法に関する。
哺乳動物細胞に外来遺伝子を導入発現させるためのベクターは、基礎生命科学研究において必須のツールであるばかりでなく、その成果の産業（例：医薬品の大量生産）や医療（例：遺伝子治療）における実用化の際に重要な役割を果たしてきた。１９７０年代後半以降の遺伝子工学技術の進展は、大腸菌や酵母における特定の遺伝子ＤＮＡ断片の単離と増幅（遺伝子クローニング）を容易にした。従来、哺乳動物細胞への遺伝子導入には、クローン化ＤＮＡが用いられてきた。実際には、発現させたい遺伝子（ｃＤＮＡ）のコード領域に哺乳動物細胞で機能し得るプロモーターやポリＡ付加部位などを連結した人工的な発現ユニットを作製するか、あるいはコード領域に加えて、本来のプロモーターやポリＡ付加部位等を含むゲノムＤＮＡ断片などを含む、大腸菌のプラスミド（最長２０ｋｂ程度：環状）、コスミド（最長４０ｋｂ程度：環状）、細菌人工染色体（ＢＡＣ；最長２００ｋｂ：環状）、酵母人工染色体（ＹＡＣ；最長１Ｍｂ：直鎖状）を環状で又は線状化して作製し、それらを細胞にトランスフェクション又はインジェクションすることが汎用されている。導入されたベクターＤＮＡが哺乳動物由来の複製起点を含まない場合、ベクターは細胞に導入された後複製することができず、細胞の分裂に伴って失われていくため、導入遺伝子の発現は一過性となる。一方、複製起点を含む場合は細胞内で一時的に多コピー化するが、細胞分裂に伴う娘細胞への分配が均等になされないため、選択圧がない場合には次第に失われていく。よってこの場合も発現は一過性となる。薬剤耐性遺伝子を同時に導入し、薬剤による選択圧をかけることによって導入遺伝子を構成的に発現する細胞株を選別することは可能だが、その場合、導入された遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれる（インテグレーション）。この組み込みは、導入遺伝子及び宿主染色体の両方に影響を与える。宿主染色体にとっては、遺伝子が破壊される可能性がある（Pravtchevaら，Genomics（USA），第30巻，p.529-544，1995年）。導入される遺伝子にとっては、コピー数が制御されない、不活性化される（Garrickら，Nature Genet.（USA），第18巻，p.56-59，1998年）、組み込まれた宿主染色体上の制御配列の影響を受ける（Dobieら，P.N.A.S.（USA），第93巻，p.6659-6664，1996年；Alamiら，Hum. Mol. Genet.（UK），第9巻，p.631-636，2000年）、などの問題点が残る。このため宿主染色体を破壊することなく、一定コピー数の遺伝子が導入可能な方法の開発が望まれる。このような問題点を解決するための一つの方法は、ヒトを含む動物細胞を宿主として自律複製／分配が可能な人工染色体を構築し、これをベクターとして動物細胞に遺伝子を導入することである。
（１）ヒト人工染色体（ＨＡＣ）の構築
従来、外来遺伝子を発現させるためのベクターを構築するという目標と、一方で細胞内での自律複製分配に必要な構造を特定するという生物学的側面から、動物細胞を宿主としたヒト人工染色体（Human Artificial Chromosome；以下、「ＨＡＣ」ともいう）の構築が試みられてきた。ＨＡＣ構築のアプローチには（Ａ）ボトムアップアプローチ、（Ｂ）自然発生染色体断片の利用、及び（Ｃ）トップダウンアプローチ（天然の染色体をトリミング）の３種がある。
（Ａ）ボトムアップアプローチ
大腸菌や酵母では自律複製／分配に必要なＤＮＡ配列が特定されており、宿主細胞内で一定のコピー数が維持される人工染色体が構築されている（ＢＡＣないしＹＡＣ）。同様の発想から、クローン化された配列既知のＤＮＡ断片を動物細胞に導入してアセンブルするという、ボトムアップアプローチによるＨＡＣ構築が試みられてきた。ヒト染色体セントロメアの構成要素であるアルフォイド配列約１００ｋｂを含むＹＡＣ由来の薬剤耐性遺伝子とヒトのテロメア配列を付加し、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０に導入した例が報告されている（Ikennoら，Nature Biotech.（USA），第16巻，p.431-439，1998年）。薬剤耐性細胞株では自律複製／分配が可能な人工染色体が構築されていたが、導入したＤＮＡ配列そのものが細胞に保持されているのではなく増幅による再構成が生じており、細胞に保持される配列構造は明らかでない。
またＨＡＣを構築することが目的であって、外来遺伝子の挿入を検討するには至っていない。
（Ｂ）自然発生断片の利用
染色体はそれ自身が遺伝子の集合体であり、自律複製・分配に必要な要素を備えている。ＹＡＣなど既存のクローニングベクターの容量を超えるＭｂ単位の巨大遺伝子を導入する目的で、一本の染色体又はその断片を遺伝子導入のツールとして利用することは、微小核細胞融合法により実現されている。マウス胚幹細胞に抗体遺伝子を含むヒト１４番、２番、２２番染色体断片を移入し、キメラ個体が作製できること、移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現すること、ヒト染色体断片がキメラ個体で安定に保持されること、生殖系列を経て次世代伝達可能なことが示された（Tomizukaら，Nature Genet.（USA），第16巻，p.133-143，1997年；Tomizukaら，P.N.A.S.（USA），第97巻，p.722-727，2000年）。この例では、発現させたい遺伝子がのっている染色体そのものをベクターとして利用することの有効性が示された。しかし目的とする遺伝子毎に染色体改変を行うことは現実的でない。染色体断片のベクターとしての利点を生かしなおかつその汎用性を高めるには、基本骨格となる染色体ベクターを用意し、これに目的とする遺伝子を簡便に挿入できることが望ましい。
このような目標のもと、染色体自然断片を利用して外来遺伝子を発現させる試みが報告されている。ヒト１番染色体由来の放射線染色体断片（５．５Ｍｂ）をベクターとし、ＩＬ−２遺伝子（ｃＤＮＡ）又はＣＦＴＲ遺伝子（ヒトゲノムＤＮＡ）の導入と機能発現が報告されている（Guiducciら、Hum. Mol. Genet.（UK），第8巻，p.1417-1424，1999年；Auricheら、EMBO Rep.（UK），第2巻，p.102-107，2002年参照。宿主はハムスター線維芽細胞（ＣＨＯ）を用いている。この断片化されたミニ染色体への目的遺伝子の導入には、アルフォイドＤＮＡを併用してヒト１番染色体セントロメア領域への挿入を期待しているが、詳細な挿入位置及びコピー数は特定されていない。ＩＬ−２依存性のマウスリンパ芽球細胞はＩＬ−２ミニ染色体を保持するＣＨＯ細胞との細胞融合によりＩＬ−２非依存的に増殖可能となり、機能相補が認められた。また、ＣＦＴＲミニ染色体を保持するＣＨＯ細胞では、ｃＡＭＰ刺激による塩素イオン放出が認められ、ＣＦＴＲ阻害剤の添加によりその塩素イオン放出が抑制された。これらは染色体断片をベクターとして外来遺伝子を挿入・発現するための系を示したが、構造が明らかでなく、外来ＤＮＡの挿入が制御されていないという問題が残っている。
放射線雑種細胞由来の染色体断片（２〜３Ｍｂ）はハムスター細胞において安定に保持され、ヒト１番染色体セントロメアと長腕の一部及びＳＤＨＣ（succinate dehydrogenase complex, subunit C）遺伝子を含む。ＳＤＨＣ領域での相同組換えによりＧ４１８耐性遺伝子が挿入された。マウス細胞（Ｌ及び３Ｔ３）を用いてＸ線細胞融合を行い、Ｇ４１８耐性雑種細胞を得た（Auら，Cytogenet. Cell Genet.（スイス），第86巻，p.194-203，1999年）。このＨＡＣは、染色体自然断片を利用しているためその構造は明らかでない。外来遺伝子を部位特異的にＨＡＣに導入するために相同組換えを用いたが、導入効率が低く汎用性は低い。微小核細胞融合法は用いていないので、目的の染色体断片以外にも宿主染色体が共存する。染色体をベクターとして外来遺伝子を発現するという発想を提示するにすぎない。
また、染色体自然断片（環状）にｌｏｘＰサイトをランダム挿入し、薬剤耐性遺伝子（ｈｐｒｔ）の再構成を指標に外来遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）を挿入した例が報告されている（Voetら，Genome Res.（USA），第11巻，p.124-136，2001年）。この環状染色体はヒト２０番染色体のセントロメアと１番染色体の一部（ｐ２２領域）を含むが、自然断片のため、配列は特定されていない。外来遺伝子をＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる部位特異的組換えにより導入しているが、染色体上へのｌｏｘＰ挿入はランダムであり、その構成は不明である。一方で微小核融合によるマウスＥＳ細胞への移入、キメラ個体の作製、子孫伝達が示されている。染色体自然断片を利用した点、及びｌｏｘＰサイトの挿入位置がランダムであるという点を除いて、人工染色体に目的遺伝子を挿入する手法は簡便ではあるが、患者（軽度の精神発達遅滞）由来の異常染色体を利用したことは安全性の点で問題が残り、実用的とはいえない。
（Ｃ）トップダウンアプローチ
染色体自然断片を細胞に移入する場合、目的の遺伝子以外にも移入した染色体断片からその他多くの遺伝子が同時に発現することになる。マウスＥＳ細胞の実験では、ヒト染色体ごとに安定性が異なること、導入した染色体断片が大きいほどこれを保持する細胞のキメラ個体中での寄与率が下がることが知られている。余分な遺伝子の発現は染色体断片を保持する宿主細胞の増殖を妨げると推測される。そこで染色体改変によって余分な遺伝子を取り除くことで、移入染色体断片の保持率が上がると考えられる。
染色体の一部を削除する方法として、クローン化したテロメア配列を相同組換えにより導入し、染色体を短縮する技術（テロメアトランケーション）が報告されている（Itzhakiら，Nature Genet.（USA），第2巻，p.283-287，1992年）。しかし多くの動物種の体細胞は相同組換えの頻度が極端に低いため、組換え体の取得には多大な労力を要する。これに対し高頻度に相同組換えを起こすニワトリ細胞株ＤＴ４０を染色体改変の宿主として利用することで、効率的な染色体改変が可能になった（Kuroiwaら，Nucleic Acids Res.（UK），第26巻，p.3447-8，1998年）。ヒトＸ染色体を微小核細胞融合法によってＤＴ４０細胞株に移入し、テロメアトランケーションを行った例が報告されている（Millsら，Hum. Mol. Genet.（UK），第8巻，p.751-761，1999年）。短腕及び長腕の削除により２．４Ｍｂの線状ミニ染色体が構築された。ミニ染色体はハムスター、ヒト細胞でも安定に保持されたが、コピー数の変化が見られた。ＨＡＣの安定性を確認しているにすぎず、これに外来の遺伝子を導入してベクターとして利用するには至っていない。
またハムスター細胞を宿主としてヒトＹ染色体をテロメアトランケーションにより短縮し、宿主細胞中で安定に保持される約４Ｍｂのミニ染色体を構築した例も報告されている（Hellerら，P.N.A.S.（USA），第93巻，p.7125-7130，1996年）。このミニ染色体を微小核細胞融合法によりマウスＥＳ細胞に移入したが、不安定であった。染色体再構成によってマウスセントロメア配列を取り込んだ派生ミニ染色体がＥＳ細胞中で安定性を獲得したため（Shenら，Hum. Mol. Genet.（UK），第6巻，p.1375-1382，1997年）、キメラマウスを作製したところ、生殖系列伝達が確認された（Shenら，Curr. Biol.（UK），第10巻，p.31-34，2000年）。キメラ染色体がマウス個体で保持されることは示されたが、その構造は染色体再構成のため不明であり、さらに外来遺伝子の導入及び発現については検討されていない。
（２）ＨＡＣへの外来遺伝子の挿入
上述したようなベクターとしてのＨＡＣ構築と並んで重要なことは、ＨＡＣに目的の遺伝子を導入する方法の確立である。しかし前述の如く現時点ではＨＡＣ構築自体が途上の段階であり、外来遺伝子の導入については薬剤耐性遺伝子のランダム挿入が示されている程度で、詳細な検討はなされていないのが現状である。
ヒト抗体重鎖遺伝子を保持するマウスを作製する目的で単離されたヒト１４番染色体由来の自然断片ＳＣ２０は、マウスでの安定性と生殖系列伝達が確認されている。これにＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを利用し、相互転座によってＭｂ単位の染色体領域（抗体軽鎖遺伝子を含むヒト２番及び２２番染色体領域）をクローニングする方法（染色体クローニング）が確立された（Kuroiwaら, Nature Biotech.（USA）, 第18巻，p.1086-1090, 2000年）。この場合も、不要な遺伝子を含まず構造が明らかなＨＡＣ構築が目標だが、抗体遺伝子のように他のクローニングベクター（ＹＡＣなど）の容量を超えた巨大遺伝子への適用で効果が発揮される。
いずれにしても、１）構造が明らかであり、不要な遺伝子が除去されている、２）培養細胞、個体で安定に維持される、３）外来ＤＮＡを簡便に導入可能、という条件を満たすＨＡＣベクター系は現在までに構築されていない。
本発明は、細胞中で安定に保持され、大きなサイズの外来遺伝子を簡便に挿入し、細胞に導入することができるヒト人工染色体ベクター及びその作製方法を提供することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するために、１）動物細胞を宿主として、余分な遺伝子を含まず安定に保持される染色体ベクターを構築すること、２）染色体ベクターにクローニングサイトを付与し、目的の遺伝子をクローニングサイトにカセット方式で挿入して発現させる系を構築することを課題として鋭意研究を行った。すなわち、ヒト２１番染色体の長腕から既知の遺伝子を削除した改変染色体を得、この改変染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞の長期継代培養における安定性を確認した後、この改変染色体上の長腕近位にｌｏｘＰ配列とｈＣＭＶプロモーターを部位特異的に挿入し、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによりＧＦＰ遺伝子を改変染色体に導入したところ、ＧＦＰの発現を確認することができた。その結果より、本発明者は、ヒト２１番染色体断片に基づいて構築したＨＡＣベクターにより上記課題を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の概要は以下の通りである。
本発明は、その第１の態様において、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト２１番染色体断片又はヒト１４番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクターを提供する。
本発明の一実施形態において、前記ヒト２１番染色体断片のサイズは、約２〜１６Ｍｂであり、好ましくは約２〜６Ｍｂである。
また本発明の一実施形態において、前記ヒト２１番染色体の長腕遠位は、例えば２１ｑ１１領域内で削除され、好ましくはＡＬ１６３２０４において削除される。
さらに本発明の一実施形態において、前記ヒト２１番染色体の短腕遠位は、例えば２１ｐ領域内で削除され、好ましくはＡＬ１６３２０１において削除される。
本発明の別の実施形態において、前記ヒト１４番染色体断片のサイズは、約２０Ｍｂであり、好ましくは約１９Ｍｂ以下であり、さらに好ましくは１８Ｍｂ以下である。
また本発明の別の実施形態において、前記ヒト１４番染色体の長腕遠位は、例えば１４ｑ領域内において削除され、好ましくはＡＬ１５７８５８において削除され、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０において削除される。
また、前記ヒト１４番染色体の短腕遠位は、例えば１４ｐ領域内において削除され、好ましくは１４ｐ１２領域内において削除され、さらに好ましくはＯＲ４Ｈ１２、ＯＲ４Ｑ４、ＲＮＲ２、ＯＲ４Ｌ１、ＲＮＵ６Ｃ、ＦＤＰＳＬ３、Ｋ１２Ｔ、Ｃ１４ｏｒｆ５７、ＯＲ６Ｓ１、Ｍ１９５、ＯＲ４Ｋ１４、ＭＧＣ２７１６５、ＬＣＨ、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｅ２、Ｈ１ＲＮＡ、ＡＴＰ５Ｃ２、ＯＲ１１Ｈ６、及びＯＲ４Ｍ１からなる群より選択されるいずれか１の位置において削除される。
さらなる実施形態において、本発明に係るヒト人工染色体ベクターは、前記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されている。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト２１番染色体の長腕近位のＡＬ１６３２０３、又はヒト１４番染色体の長腕近位のＡＬ１５７８５８より近位に、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０における前記削除位置より近位に、又はヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位に挿入されている。また好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＬｏｘＰ配列である。
本発明の別の実施形態においては、前記長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除が人工テロメア配列との置換によるものである。
また本発明は、その第２の態様において、以下のステップを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法を提供する：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；並びに
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ。
本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）においては、前記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する細胞として相同組換え効率の高いものを用いる。好ましい実施形態においては、相同組換え効率の高い細胞はニワトリＤＴ４０細胞由来のものである。
また本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）においては、ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除を人工テロメア配列との置換により行う。好ましい実施形態においては、ヒト２１番染色体の長腕遠位をＡＬ１６３２０４において削除し、短腕遠位をＡＬ１６３２０１において削除する。また別の好ましい実施形態においては、ヒト１４番染色体の長腕遠位を１４ｑ領域で削除し、短腕遠位を１４ｐ１２領域内において削除する。またさらに好ましい実施形態においては、ヒト１４番染色体の長腕遠位をＡＬ１５７８５８、より好ましくはＡＬ５１２３１０において削除し、短腕遠位をＯＲ４Ｈ１２、ＯＲ４Ｑ４、ＲＮＲ２、ＯＲ４Ｌ１、ＲＮＵ６Ｃ、ＦＤＰＳＬ３、Ｋ１２Ｔ、Ｃ１４ｏｒｆ５７、ＯＲ６Ｓ１、Ｍ１９５、ＯＲ４Ｋ１４、ＭＧＣ２７１６５、ＬＣＨ、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｅ２、Ｈ１ＲＮＡ、ＡＴＰ５Ｃ２、ＯＲ１１Ｈ６、及びＯＲ４Ｍ１からなる群より選択されるいずれか１の位置において削除する。
さらに本発明の一実施形態において、ステップ（ｃ）においては、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がＬｏｘＰ配列である。
さらなる態様において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト２１番染色体の長腕近位のＡＬ１６３２０３、ヒト１４番染色体のＡＬ１５７８５８より近位に、さらに好ましくはＡＬ５１２３１０における前記削除位置より近位に、又はヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位に挿入することができる。
さらに本発明は、その第３の態様において、上記作製方法により得られる、ヒト人工染色体ベクターを提供する。
また第４の態様において、本発明は、上記ヒト人工染色体ベクターを保持する細胞を提供する。
本発明はさらに、その第５の態様において、上記作製方法において、以下のステップ（ｄ）をさらに含むことを特徴とする、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法を提供する：
（ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ。
また第６の態様において、本発明は、上記作製方法により得られる、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターである。
さらに第７の態様において、本発明は、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞を提供する。
本発明はさらに、その第８の態様において、上記外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞を含む医薬組成物を提供する。かかる場合、外来ＤＮＡは、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）、などをコードする遺伝子とすることができる。
また本発明は、その第９の態様において、以下のステップを含む、外来ＤＮＡを受容細胞に導入する方法を提供する：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡの導入を確認するステップ。
本発明の一実施形態において、上記受容細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、並びに間質系幹細胞及び組織幹／前駆細胞であってもよい。
さらに本発明は、その第１０の態様において、以下のステップを含む、外来ＤＮＡを発現する細胞の作製方法を提供する：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡを発現する細胞を選択するステップ。
本発明の一実施形態において、上記受容細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、並びに間質系幹細胞及び組織幹／前駆細胞であってもよい。
またさらに本発明は、その第１１の態様において、以下のステップを含む、タンパク質の製造方法を提供する：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｇ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｈ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本発明の一実施形態において、上記タンパク質としては、例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、第八因子、第九因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）、などが挙げられる。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中、「ヒト人工染色体ベクター」又は「ＨＡＣベクター」とは、ヒト染色体に基づいて作製された人工染色体を指す。
また本明細書中、「ヒト染色体」とは、ヒト細胞由来の天然のＤＮＡとタンパク質との複合体を指す。正常なヒト染色体は２３種（雄は２４種）４６本存在し、それぞれ約５０〜３００Ｍｂの長さのＤＮＡを含むことが知られている。また「ヒト染色体断片」とは、独立染色体として安定に複製及び分配が可能な染色体の部分断片を指し、断片の大きさは通常１Ｍｂ以上だが、それ以下の場合もある。
本明細書中、染色体に関して「長腕」及び「短腕」とは、染色体上のセントロメア両側の腕（アーム）を指し、その長さに応じて長腕（ｑ）及び短腕（ｐ）と称される。またヒト染色体に関して「長腕遠位」及び「長腕近位」とは、長腕上のセントロメアから遠い位置（すなわちテロメア側）にある領域（遠位）及びセントロメアに近接する領域（近位）を意味する。具体的には、ヒト２１番染色体の場合には長腕遠位はＡＬ１６３２０４よりもテロメア側、長腕近位はＡＬ１６３２０３よりもセントロメア側であり、またヒト１４番染色体の場合には長腕遠位はＡＬ１３２６４２よりもテロメア側、長腕近位はＡＬ１５７８５８よりもセントロメア側である。さらに「短腕遠位」及び「短腕近位」とは、短腕上のセントロメアから遠い位置にある領域（遠位）及びセントロメアに近接する領域（近位）を意味する。具体的には、ヒト２１番染色体の場合には短腕遠位及び短腕近位はＡＬ１６３２０１において境界があり、またヒト１４番染色体の場合にはリボソーマルＲＮＡ領域において境界がある。
本明細書中、「部位特異的組換え酵素」及び「部位特異的組換え酵素の認識部位」とは、ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象に関して用いられる用語であり、それぞれその部位特異的に組換えを起こす酵素及び該酵素により認識される部位を指す。
本明細書中、「人工テロメア配列」とは、人工的に付加させたテロメア配列を指す。本発明においては例えばテロメアトランケーションによる人工テロメア配列の付加を行いうる。
本明細書中、「外来ＤＮＡ」とは、対象とする細胞にとって外部から導入されるＤＮＡを指し、物質生産及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列（例えばプロモーター配列）などをコードするＤＮＡを意味し、同種又は異種のいずれでもよい。
本明細書中、「供与細胞」及び「受容細胞」とは、ヒト人工染色体ベクターを移入又は導入する場合に、最初に該ベクターを保持する細胞（供与細胞）と、供与細胞から該ベクターが移入される細胞（受容細胞）を指す。
ヒト２１番染色体長腕遠位をテロメアトランケーションにより短縮削除する方法の概要を示す図である。 ピューロマイシン耐性ＤＴ４０株においてヒト２１番染色体長腕遠位が削除されたことを示すＰＣＲ解析の結果を示す図である。 ピューロマイシン耐性ＤＴ４０株において長腕遠位が削除されたこと、すなわち人工テロメア配列が部位特異的に導入されたことを示すサザンブロット解析の結果を示す写真である。 図４ａ及びｂは、ピューロマイシン耐性ＤＴ４０株において長腕遠位が削除されたことを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。図４ａはＤＴ４０細胞に保持されているヒト２１番染色体（矢印）を示し、図４ｂは長腕を削除したヒト２１番染色体断片（矢印）を示す。 長腕遠位を削除したヒト２１番染色体の長腕近位にｌｏｘＰ配列を部位特異的に挿入する方法の概要を示す図である。 ブラストサイジン耐性ＤＴ４０株において相同組換え体（ヒト２１番染色体上にｌｏｘＰ配列が部位特異的に導入された株）を選別するためのサザンブロット解析（Ａ）及びＰＣＲ解析（Ｂ）の結果を示す写真である。 図７ａ及びｂは、ブラストサイジン耐性ＣＨＯ−Ｋ１株においてヒト２１番染色体（断片）が保持されていることを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。図７ａはテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト２１番染色体を示し、図７ｂは長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片を示す。 ヒト２１番染色体長腕近位のｌｏｘＰ配列にＧＦＰコンストラクトを部位特異的に挿入する方法の概要を示す図である。 Ｇ４１８耐性ＣＨＯ−Ｋ１株におけるＧＦＰ発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真である。 Ｇ４１８耐性ＣＨＯ−Ｋ１株では、ｌｏｘＰ配列で部位特異的組換えが起きたことを示すサザンブロット解析の結果を示す写真である。 ヒト２１番染色体短腕遠位をテロメアトランケーションにより短縮削除する方法の概要を示す図である。 ハイグロマイシン耐性ＤＴ４０株においてヒト２１番染色体短腕遠位が削除されたことを示すＰＣＲ解析の結果を示す図である。 ハイグロマイシン耐性ＤＴ４０株において短腕遠位が削除されたこと、すなわち人工テロメア配列が部位特異的に導入されたことを示すサザンブロット解析の結果を示す写真である。 ハイグロマイシン耐性ＤＴ４０株において短腕遠位が削除されたこと、すなわち人工テロメア配列が部位特異的に導入されたことを示すＰＣＲ解析の結果を示す写真である。 図１５ａ及びｂは、ハイグロマイシン耐性ＤＴ４０株において短腕遠位が削除されたことを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。図１５ａはＤＴ４０細胞に保持されている長腕を削除したヒト２１番染色体（矢印）を示し、図１５ｂは長腕及び短腕を削除したヒト２１番染色体断片（矢印）を示す。 ＫＨ２１Ｅ細胞培養上清中に産生されたヒトＥＰＯが組換え体ヒトＥＰＯタンパク質（ｒｈＥＰＯ）と同様の細胞増殖活性を保持する結果を示す図である。 ブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０細胞株においてヒト２１番染色体断片（矢印）が保持されていることを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。 図１８ａ及びｂは、Ｇ４１８耐性ＨＴ１０８０株におけるＧＦＰ発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真（図１８ａ）及び位相差顕微鏡写真（図１８ｂ）である。 Ｇ４１８又はハイグロマイシン耐性Ｅ１４株においてヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターが移入されたことを示すＰＣＲ解析の結果を示す図である。 図２０ａ及びｂは、薬剤耐性Ｅ１４細胞株においてヒト２１番染色体断片が保持されていることを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。図２０ａは長腕遠位を削除した染色体断片（矢印）を示し、図２０ｂはさらに短腕遠位を削除した染色体断片（矢印）を示す。 薬剤耐性ｈｉＭＳＣ細胞株においてヒト２１番染色体断片（矢印）が保持されていることを示すＦＩＳＨ解析の結果を示す写真である。 図２２ａ及びｂは、ＨＡＣ移入ＥＳ細胞をインビトロで神経細胞に分化誘導した際に、ＧＦＰ発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真（図２２ａ）及び抗βチューブリン抗体で染色した蛍光顕微鏡写真（図２２ｂ）である。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００２年１０月４日に出願された日本国特許出願第２００２−２９２８５３号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、ヒト人工染色体ベクター（以下、「本ＨＡＣベクター」ともいう）に関するものであり、該ＨＡＣベクターは、ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に基づいて作製され、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト２１番染色体断片又はヒト１４番染色体を含むことを特徴とするものである。
ヒト２１番染色体は、セントロメア領域を除く長腕全体及び短腕の一部について塩基配列が公共のデータベース上に公開されている（例えば、http://hgp.gsc.riken.go.jp/chr21/index.html（Riken Genomic Sciences Center, Human Genome Research Group）を参照されたい）。このような配列情報を利用することで、後述する人工テロメア配列やｌｏｘＰ配列などを相同組換えによって部位特異的に挿入することが可能となる。また、長腕遠位の削除によって約４８Ｍｂの２１番染色体が１／３の約１６Ｍｂとなり、また長腕遠位及び短腕遠位の削除によって最終的には約２Ｍｂの、既知遺伝子を含まないＨＡＣベクターが構築できる。
以前にマウスＥＳ細胞へヒト２１番染色体を移入し、キメラマウスを作製した実験では、移入した染色体の部分断片が次世代に伝達した。宿主細胞の機能を阻害する遺伝子を含んだ移入染色体領域が排除された結果、安定化したと考えられている（Kazukiら，J. Hum. Genet., 46:600, 2001）。一方ヒトＹ染色体の場合、マウスＥＳ細胞中では不安定であったが、セントロメアの構成要素であるアルフォイドＤＮＡをマウス染色体から取り込むことによって安定化が起きたと報告されている（Shenら，Hum. Mol. Genet., 6:1375, 1997）。これらのことから、雑種細胞中でのヒト染色体の安定性は染色体毎に異なり、安定性にはセントロメアが関与すると考えられる。先の実験でヒト２１番染色体のセントロメア（大きさは約２Ｍｂと考えられている：Triowellら, Hum. Mol. Genet., 2:1639-1649, 1993；Wangら、Genome Res. 9: 1059-1073, 1999）はマウス細胞／個体中でも機能することが示されているので、セントロメア領域を含むヒト２１番染色体断片に基づいて作製した本ＨＡＣベクターは、雑種細胞中で安定に保持されることが期待できる。
また同様に、ヒト１４番染色体の配列情報に関しても一部について塩基配列が公共のデータベース上に公開されている。さらにヒト１４番染色体由来の自然断片（ＳＣ２０；Tomizukaら，P.N.A.S.，97：722-727，2000年）に加工を加えたＨＡＣベクターにおいてもヒト２１番染色体の場合と同様の縮小化が可能であると考えられる。ＳＣ２０は、ヒト１４番染色体の長腕遠位及び長腕近位の多くの部分を欠失していることが報告されている（Tomizukaら，P.N.A.S.，97：722-727，2000年；Kuroiwaら, Nature Biotech.（USA）, 第18巻，p.1086-1090, 2000年）。具体的には、ＳＣ２０は、ヒト１４番染色体長腕のテロメア配列からＡＬ１３７２２９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）を含む領域、及びこれよりさらにセントロメア側のＡＬ１２１６１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）からＡＬ１５７８５８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のテロメア側から２４−２６ｋｂまでを含む領域を保持している。また、ＡＬ１３７２２９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）とＡＬ１２１６１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）間の領域、及びＡＬ１５７８５８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）のテロメア側２４−２６ｋｂからセントロメア間の領域を欠失している。一方、ヒト１４番染色体の短腕領域は保持されている。このＳＣ２０はヒト細胞を含む細胞株やマウス個体において安定に維持され（Shinoharaら, Chromosome Res., 8:713-725, 2000）、ＳＣ２０のリボソーマルＲＮＡ領域（ヒト１４番染色体短腕部に位置する）にｌｏｘＰ部位を挿入した改変ＳＣ２０においてもその安定性は保たれていた（Kuroiwaら, Nature Biotech.（USA）, 第18巻，p.1086-1090, 2000年）。さらに、それ自身は不安定なヒト２２番染色体断片由来の約１０Ｍｂの染色体領域を、その改変ＳＣ２０のｌｏｘＰ部位に転座させたＨＡＣもまた、マウスＥＳ細胞やマウス個体で安定であった。ＳＣ２０の問題点は、１４番染色体１４ｑ３２領域の遺伝子を複数含んでいることであるが、本明細書に記載された方法でＳＣ２０を縮小化することにより、様々な細胞種で安定に維持され、かつ余分な遺伝子を含まないＨＡＣベクターを得ることができる。
以下に、本ＨＡＣベクターの作製、ベクターへの外来ＤＮＡの挿入、及び本ＨＡＣベクターの用途について記載する。
１．ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製
本ＨＡＣベクターは、上述したようにヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に基づいて作製する。本ＨＡＣベクターの作製には、以下の（ａ）〜（ｃ）のステップが含まれる：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；並びに
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ。
ここで、上記ステップ（ｂ）と（ｃ）の順序は特に限定されない。
ステップ（ａ）：ヒト染色体を保持する細胞の作製
本ＨＡＣベクターの作製においては、ヒト染色体（例えばヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体）を保持する細胞を用意する。そのような細胞としては、ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体のみを保持し、かつその後の操作のために相同組換え率の高いものが好ましい。従って本発明においてはまずこれらの条件を満たすような細胞を作製する。
ヒト染色体を保持する細胞は、例えば、ヒト単一染色体を保持する公知のマウスＡ９雑種細胞ライブラリーからヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持するクローンを選択し、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウスＡ９雑種細胞ライブラリーは、薬剤耐性遺伝子で標識されたヒト単一染色体を保持するものであり、例えば、ＷＯ００／１０３８３号、Tanabe, H.ら（Chromosome Res., 8: 319-334, 2000）などに記載されている。またヒト２１番染色体及びヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞は、Japanese Collection of Research Bioresources（ＪＣＲＢ）にそれぞれ登録番号ＪＣＲＢ２２２１（細胞名Ａ９（Ｈｙｇｒｏ２１））及びＪＣＲＢ２２１４（細胞名Ａ９（Ｈｙｇｒｏ１４））として登録されており、その詳細な情報・培養法なども入手可能である。
上述のようにして入手したマウスＡ９雑種細胞に保持されるヒト染色体を、相同組換え率の高い細胞に移入する。ここで「相同組換え率の高い細胞」とは、その細胞において相同組換え操作を行った際に、相同組換えの頻度が高い細胞を指し、そのような細胞としては、例えば、ニワトリＤＴ４０細胞（Diekenら, Nature Genetics, 12:174-182, 1996）、マウスＥＳ細胞（相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，1995）、などが挙げられる。特に、操作の簡便性などの点から、本発明においてはニワトリＤＴ４０細胞を利用することが好ましい。
染色体の移入は、当技術分野で公知の染色体移入法に従って行うことができる。例えば、所望の染色体を１本だけ導入する手法として、Koiら（Koiら, Jpn. J. Cancer Res., 80: 413-418, 1973）に記載されているミクロセル法が挙げられる。この手法は、ある種の細胞において紡錘体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、これを受容細胞と融合することにより、少数の染色体を導入するというものである。このミクロセル法を利用してヒト染色体を移入する具体的な操作手順に関しては、例えばＷＯ９７／０７６７１号及びＷＯ００／１０３８３号を参照されたい。以上のようにしてヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する細胞を作製することができる。
あるいは、本発明においては、全長のヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体ではなく、天然に部分断片化した染色体、例えばヒト１４番染色体の部分断片（ＳＣ２０）を保持する細胞を使用することも可能である。ＳＣ２０染色体断片を保持するニワトリＤＴ−４０細胞（ＳＣ２０）は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００１年５月９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５８３が与えられている。
ステップ（ｂ）：ヒト染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除
ＨＡＣベクターの作製においては、ヒト染色体を保持する細胞において、当該染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除する。染色体の削除は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えばＷＯ００／１０３８３号に記載されている人工テロメア配列との置換（テロメアトランケーション）により行うことが好ましい。長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、例えば、ヒト染色体を保持する細胞において、人工テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に人工テロメア配列の挿入されたクローンを取得した後、テロメア・トランケーションによる欠失変異体を得るというものである（Itzhakiら、Nature Genet.,2:283-287, 1992；及びBrownら、P.N.A.S., 93:7125,1996を参照されたい）。ここで染色体の所望の位置とは、削除対象の長腕遠位又は短腕遠位の切断位置であり、この位置に人工テロメア配列が相同組換えにより置換・挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される（テロメアトランケーション）。所望の位置は、ターゲティングベクターを構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができ、例えば長腕遠位を削除する場合には、ヒト２１番染色体上の２１ｑ１１領域内、好ましくはＡＬ１６３２０４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位が切断、削除される（例えば、黒岩ら、Nucleic Acid Research, 26:3447, 1998）。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト２１番染色体上の２１Ｐ領域内、好ましくはＡＬ１６３２０１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のＨＡＣベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また例えばヒト１４番染色体の長腕配列をＳＣ２０よりもさらにセントロメア側に削除する場合、ＡＬ１５７８５８領域の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、削除することができる。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト１４番染色体上の１４ｐ領域内、好ましくは１４ｐ１２領域内、さらに好ましくはＯＲ４Ｈ１２、ＯＲ４Ｑ４、ＲＮＲ２、ＯＲ４Ｌ１、ＲＮＵ６Ｃ、ＦＤＰＳＬ３、Ｋ１２Ｔ、Ｃ１４ｏｒｆ５７、ＯＲ６Ｓ１、Ｍ１９５、ＯＲ４Ｋ１４、ＭＧＣ２７１６５、ＬＣＨ、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｅ２、Ｈ１ＲＮＡ、ＡＴＰ５Ｃ２、ＯＲ１１Ｈ６、又はＯＲ４Ｍ１（米国National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のオンラインゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI））の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のＨＡＣベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また例えばインタクトなヒト１４番染色体の長腕配列を削除する場合には、１４ｑ領域内、好ましくはＡＬ５１２３１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、削除することができる。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト１４番染色体上の例えば１４ｐ領域内、好ましくは１４ｐ１２領域内、さらに好ましくはＯＲ４Ｈ１２、ＯＲ４Ｑ４、ＲＮＲ２、ＯＲ４Ｌ１、ＲＮＵ６Ｃ、ＦＤＰＳＬ３、Ｋ１２Ｔ、Ｃ１４ｏｒｆ５７、ＯＲ６Ｓ１、Ｍ１９５、ＯＲ４Ｋ１４、ＭＧＣ２７１６５、ＬＣＨ、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｅ２、Ｈ１ＲＮＡ、ＡＴＰ５Ｃ２、ＯＲ１１Ｈ６、又はＯＲ４Ｍ１（米国National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のオンラインゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI））の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のＨＡＣベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
上述のようにして、長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片を形成させ、それを保持する細胞が得られる。このような染色体のサイズの縮小化により、細胞における安定性を達成することができる。また、本ＨＡＣベクターを保持する細胞、及び後述する本ＨＡＣベクターが導入される細胞の機能・増殖などに悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を除去することができる。
ステップ（ｃ）：部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入
本ＨＡＣベクターの作製においては、ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。このステップ（ｃ）は、上記ステップ（ｂ）の前又は後のいずれで行ってもよく、これらの順番は特に限定されない。すなわち、ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体において、長腕遠位及び／又は長腕遠位を削除した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入してもよいし、あるいは部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入した後で長腕遠位及び／又は長腕遠位を削除してもよい。
当技術分野においては、ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組換えを起こす現象が知られており、本発明においてはそのような酵素及び認識部位の系を利用する。例えば、そのような系としては、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムが知られている（例えば、Sauer, B.ら, P.N.A.S., 85:5166-5170, 1988を参照されたい）。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１由来の３８ＫＤのタンパク質であり、リコンビナーゼのＩｎｔ（インテグラーゼ）ファミリーに属するものである。この酵素は、約３４ｂｐの認識部位ｌｏｘＰ配列を認識して、この部位で特異的にＤＮＡの組換えを起こす。またこのｌｏｘＰ配列の方向性によって、２つのｌｏｘＰ配列間のＤＮＡの欠失又は転座が生じることが知られている。またその他の、特異的な配列を認識して組換え反応を起こす系としては、出芽酵母由来のレコンビナーゼＦＬＰ（Broachら，Cell, 21:501-508, 1980）、ファージｐｈｉＣ３１由来のインテグラーゼ（Thorpeら，P.N.A.S., 95:5505-5510, 1998）などがあり、哺乳動物細胞でもこれらの酵素によるＤＮＡ組換え反応が起きることが報告されている（Kochら，Gene, 249:135-144, 2000；Thyagarajanら，Mol. Cell. Biol., 21:3926-3934, 2000）。
ヒト染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に、上記部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するには、公知の遺伝子組換え手法、例えば相同組換え法を利用することができる。部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入位置は、当業者であれば、必須ではない遺伝子の位置などを考慮して適宜設定することができる。例えば、ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位又は短腕近位の任意の位置に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。かかる挿入位置としては、例えば、ヒト２１番染色体については長腕近位のＡＬ１６３２０３などが挙げられ、またヒト１４番染色体については長腕近位のＡＬ１５７８５８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）より近位、さらに好ましくは長腕近位のＡＬ５１２３１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号）における前記削除位置より近位、又はヒト１４番染色体の短腕近位の１４ｐ１２領域内における前記削除位置より近位などが挙げられる。
その後、後述する外来ＤＮＡの導入手法に従ってリポーター遺伝子を導入し、その発現を確認することによって、ヒト染色体上に挿入した認識部位の位置の適否を確認することができる。
上記例示した認識部位のうち１種類を１つ又は複数挿入してもよいし、あるいは、異なる系の認識部位を複数挿入してもよい。後述するように、本ＨＡＣベクターは、部位特異的組換え酵素の認識部位を有するため、外来ＤＮＡを部位特異的に導入することが可能であり、さらに、認識部位の設定により外来ＤＮＡの導入位置を決定できるため、外来ＤＮＡの導入位置が一定となり位置効果（position effect）をうけることもない。また外来ＤＮＡの導入操作も簡便となる。さらに異なる系の認識部位を複数挿入することによって、複数の外来ＤＮＡを逐次挿入することもできる。
上述のようにしてヒト染色体を改変して作製した本ＨＡＣベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位の他、プロモーター、薬剤耐性遺伝子などのベクター構築において一般的に挿入される配列又はエレメントが挿入されていてもよい。そのような配列又はエレメントは、上述したように相同組換え法を利用して本ＨＡＣベクターの所望の位置に挿入することができる。
さらに本発明者は、上述のように作製した本ＨＡＣベクター（ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体）を保持する細胞を、選択薬剤を含まない培地で長期にわたり継代培養し、経時的にＨＡＣベクターの保持率をＦＩＳＨ法により検定したところ、本ＨＡＣベクターは宿主細胞（例えばＤＴ４０細胞及びＣＨＯ細胞）において安定に保持されることを確認することができた。
２．ＨＡＣベクターへの外来ＤＮＡの導入（ステップ（ｄ））
上記ＨＡＣベクターの作製において、部位特異的組換え酵素の存在下にて外来ＤＮＡを挿入するステップ（ｄ）を行うことにより、本ＨＡＣベクターに外来ＤＮＡを導入することができる。このステップ（ｄ）は、上述したステップ（ｃ）の後に行うものであるが、ステップ（ｂ）との順序は特に限定されず、ステップ（ｂ）の前又は後に行うことができる。従って、ステップ（ｂ）〜（ｄ）の順序は明細書に記載する順序に限定されないことに留意されたい。
外来ＤＮＡとは、対象とする細胞にとって外部から導入されるＤＮＡを指し、遺伝子及びその他の機能配列などをコードするＤＮＡである。本発明において導入対象となる外来ＤＮＡとしては、物質生産及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列などをコードするＤＮＡであれば特に限定されない。その他の機能配列とは、遺伝子が発現するために機能する配列を指し、例えば、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列などが挙げられる。
外来ＤＮＡの導入は、上記挿入されている部位特異的組換え酵素の系を利用して行う。例えば、Ｃｒｅ酵素の認識部位であるｌｏｘＰ配列と外来ＤＮＡを保持するターゲティングベクターを構築する。続いて本ＨＡＣベクター（ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体）を保持する細胞において、Ｃｒｅ酵素を細胞内で発現させることにより、ｌｏｘＰ配列と人工テロメア配列に挟まれた領域と、上記ターゲティングベクターとの部位特異的組換えにより、外来ＤＮＡを本ＨＡＣベクター上に挿入させることができる（黒岩ら, Nature Biotech., 18:1086, 2000）。
本ＨＡＣベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位（ｌｏｘＰ配列）を保持する環状ＤＮＡが挿入できる。このため大腸菌を宿主としたプラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣや、酵母を宿主とした環状ＹＡＣなど既存のベクターによりクローン化されたＤＮＡを挿入することができる。またヒト染色体に基づいて作製されていることから、本ＨＡＣベクターに導入可能な外来ＤＮＡのサイズの上限は１００ｋｂオーダーまで拡張され、従来発現実験に用いられてきたプラスミドベクターに組み込まれたｃＤＮＡだけではなく、遺伝子の発現制御領域を含むゲノムＤＮＡも導入可能である。
例えば、本ＨＡＣベクターに外来ＤＮＡを挿入して構築された、外来ＤＮＡを含むＨＡＣベクターは、その挿入によって安定構造が変化する可能性、さらに外来ＤＮＡを含むＨＡＣベクター全体の大きさが不利に大きくなる可能性も考えられるので、導入（挿入）する外来ＤＮＡの大きさは、通常約１０Ｍｂ〜約１ｋｂ、好ましくは約３Ｍｂ〜約２ｋｂ、さらに好ましくは約１Ｍｂ〜約３ｋｂとしうる。
従来のｃＤＮＡ強制発現ベクターを用いた遺伝子導入法では、過剰発現による細胞毒性や増殖抑制などの副作用が生じ、導入遺伝子を恒常的に発現する細胞株が得られない例が多い。この問題点を克服し、生理的な発現パターンを保ちながらなおかつ発現を人工的に制御するには、テトラサイクリンなどを利用した遺伝子発現誘導系の適用が望ましい。導入可能なインサートサイズが大きく、一定のコピー数が安定に保持されるという本ＨＡＣベクターの特徴はこのような目的に適っている。
組織特異的／生理的な遺伝子発現は、遺伝子をコードするゲノム領域からの転写、転写産物の編集、核外への輸送、翻訳の各段階で制御を受ける。一つの遺伝子に対して複数のプロモーターがあって転写開始点が異なったり、スプライシングにバリエーションが生じることで、組織特異的なアイソフォームが発現することが知られている。クローン化ｃＤＮＡは一つの遺伝子に由来する複数の転写産物バリアントの１つにすぎない。生理的な遺伝子発現を再現するためには、ゲノムＤＮＡとして制御配列を含んだ遺伝子領域を導入することが望ましい。本ＨＡＣベクターの利用はこのような目的に適うものである。
ヒト２１番染色体断片を保持するマウスＥＳ細胞からキメラ個体を作製したところ、次世代伝達が確認されたことから、ヒト２１番染色体のセントロメアはマウス細胞及び個体中で複製分配保持されると考えられる（Kazukiら，J. Hum. Genet., 46:600, 2001）。そのため、本ＨＡＣベクターもまたマウス個体中で安定に保持される可能性が高い。
ヒトゲノムプロジェクトでは、ゲノムＤＮＡはＢＡＣクローンとして単離され、塩基配列が決定された。このため公開されているデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）では、塩基配列はＢＡＣ単位でも登録されている。遺伝子機能解析の１手段としてトランスジェニックマウスの作製がある。本ＨＡＣベクターをプラットフォームとしてＢＡＣを挿入することで、位置効果を受けることなく常に同一条件で遺伝子の発現を解析することが可能になる。多くのＢＡＣベクターはｌｏｘＰ配列を保持しているため、本ＨＡＣベクターへの挿入をネガティブ選別する系を用いれば、塩基配列既知のＢＡＣを本ＨＡＣベクターにカセット形式で簡便に挿入できると考えられる。
上述した以外にも、本ＨＡＣベクターへの外来ＤＮＡの導入手法及び導入の利点があり、以下にそのいくつかを例示する。
（１）相互転座による染色体部分断片の導入
Ｃｒｅ酵素によるｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換えは、線状染色体と環状インサート（外来ＤＮＡ）の場合は挿入反応が起こるが、線状染色体同士では相互転座の反応が起きる。これを利用すれば環状インサートにクローニングできないＭｂ単位以上の染色体断片を本ＨＡＣベクターに導入することができる（Kuroiwaら，Gene Ther. 9:708, 2002）。
（２）挿入体選別法
本明細書の実施例に記載する方法においては、本ＨＡＣベクターへの外来ＤＮＡの挿入は、薬剤耐性遺伝子の再構成を指標としたポジティブ選別を利用している（組換え体のポジティブ選別に関しては、ＷＯ００／１０３８３号を参照されたい）。これに代わって、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系などのネガティブ選別により、インサート挿入体（外来ＤＮＡが挿入されたもの）を得ることも可能である。この場合、挿入する環状ＤＮＡにはｌｏｘＰ配列のみが含まれていればよい。ゲノムプロジェクトで用いられたＢＡＣライブラリーはｌｏｘＰ配列を含んでいるので、このようなネガティブ選別の系が確立できれば配列既知のゲノムクローンを本ＨＡＣベクターに容易に挿入することが可能になる。
（３）複数インサートの挿入
本発明において好ましく用いられるｌｏｘＰ配列はＰ１ファージに由来する野生型の配列であり、Ｃｒｅ酵素によるＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。本明細書に記載する実施例においては、Ｃｒｅ酵素を一過性に発現させ、薬剤耐性の獲得を指標に部位特異的な組換え体を選別することにより構成的な挿入体が得られた。一度環状インサートが挿入されると、ＨＡＣベクター上に２つのｌｏｘＰ配列が残る。このため再度Ｃｒｅ酵素を発現させると逆反応（環状インサートの切り出し）が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するなどのさらなるＨＡＣベクターの改変は困難となる。一方、塩基置換を行った変異ｌｏｘＰ配列の組み合わせによっては、反応方向及び反応の特異性を限定できるとの報告がある（Hoessら，Nucleic Acids Res., 14:1986；Arakiら，Nucleic Acids Res., 25:868, 1997；Leeら，Gene, 216:55, 1998）。このような変異ｌｏｘＰ配列を用いることで、上述した逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築可能である。
（４）コピー数依存的発現制御
αグロビン遺伝子トランスジェニックマウスを用いて宿主染色体上にランダムに挿入された遺伝子のコピー数とｍＲＮＡ発現量の関係を解析した報告（Sharpeら、Proc Natl Acad Sci USA,90:11262,1993）では、発現量と導入遺伝子コピー数との間に相関は認められない。これは、トランスジェニック動物系統により導入遺伝子の発現量が大きく異なり、また導入した遺伝子のコピー数に比例しない発現が起こるポジション効果と呼ばれる現象によるものであると考えられ、トランスジェニック動物における遺伝子導入においては頻繁に起こる現象である。また、導入遺伝子のポジション効果を排除して比較するため外来ＤＮＡの挿入位置を予め宿主染色体上に導入したｌｏｘＰサイトに確定しＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え反応によりプラスミドベクターから目的のＤＮＡユニットを導入するトランスジェニックマウスの報告（Garrickら、Nature Genet., 18:56, 1998）があるが、ここでもコピー数依存的発現制御は実現されていない。
一方、チロシナーゼゲノム領域を導入したＹＡＣを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいて、導入したゲノム領域のコピー数依存的なチロシナーゼ発現が認められたが（Schedlら、Nature, 362:258-261, 1993）、生理的発現制御領域を含むゲノムを用いる点でポジション効果の影響を受けないと考えられ、本発明のような生理的制御領域を含まない人工的な遺伝子発現ユニットのみを多コピー化して発現させるものではない。また、各種のエピソームベクターは、宿主染色体と独立に存在し外来ＤＮＡ挿入位置も決まっているが、細胞内でのベクター自身のコピー数を厳密に制御するには至っていない（Morlinoら、ppl Environ Microbiol.、 65:4808-4013, 1999；Cooperら、Proc Natl Acad Sci USA., 94:6450-6455, 1997）。
本発明においては、実施例９に示すとおり、目的遺伝子（ＥＰＯを使用）の発現ユニットを多コピー連結して並列配置し、ＨＡＣベクター上の決まった位置（ｌｏｘＰサイト）に導入することにより、宿主染色体に変異を与えることなくコピー数依存的発現制御を行なうことができる。
従って、本発明の方法により、外来ＤＮＡとして多コピーの目的遺伝子を所望の細胞に導入し、該細胞において該目的遺伝子をコピー数依存的に発現させることが可能であると共に、該細胞を用いて作出したトランスジェニック動物においては、ポジション効果を受けることなく従来困難であったコピー数依存的な目的遺伝子の発現を達成することが可能となる。
３．ＨＡＣベクターの細胞への移入
本ＨＡＣベクター又は外来ＤＮＡを含む本ＨＡＣベクターを保持する細胞から、それらのベクターをその他の細胞へ移入することができる。移入先となる細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞（哺乳動物細胞）などが挙げられる。本発明においては、無傷の状態でヒト染色体を移入可能であることが知られているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いることが好ましい（ＷＯ００／１０３８３号参照）。ＣＨＯ細胞は、効率良くミクロセルを形成することが知られており（例えば、Koiら、SCIENCE 260:361, 1993）、これにより本ＨＡＣベクターをＣＨＯ細胞からさらに別の細胞（ＣＨＯ細胞以外の細胞）へ移入することも可能である。また、本発明においては、本ＨＡＣベクターを多分化能を有する細胞に移入することも可能である。「多分化能を有する細胞」とは、所定の操作により、特定の細胞又は組織に分化可能な細胞を意味する。例えば、宿主胚への注入又は集合胚形成などの操作を行うことによって、キメラ動物の２種類以上の細胞又は組織に分化可能な細胞、具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）などが含まれる。また、例えば、増殖因子（例：トランスフォーミング増殖因子；ＴＧＦ）などを添加した誘導培地における培養により、骨細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化可能な細胞、具体的には、体性幹細胞（例：間葉系間細胞）などが含まれる。
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ＥＳ細胞とも称され、未分化性（全能性）を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物の初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、ＥＧ細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約８．５日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。
また、ヒトを対象とした遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、ガン化などを避けるための安全性の観点から、不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましいとされている。不死化細胞やガン化細胞への染色体移入例は、ヒト及びその他の動物で数多くあるが、正常体細胞への染色体移入例は、ウシにおいて胎仔正常繊維芽細胞への移入（Kuroiwaら、Nature Biotech., 20:889, 2002）が報告されているものの、ヒトにおいては少なくとも検索キー；ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｈｕｍａｎ，ｎｏｒｍａｌ，ｐｒｉｍａｒｙ ｏｒ ｓｏｍａｔｉｃ，ｃｅｌｌ，で米国National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のオンライン文献データベースＰｕｂＭｅｄ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?db=PubMed）をサーチする限りにおいて該当するものは見当たらない。これらのことから、ヒト正常体細胞への染色体移入が困難であるという認識が一般的であった。
本発明においては、実施例１３及び１４に示すとおり、ヒト１４番染色体由来断片又はヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞への移入が可能であることが初めて示された。また、本発明の方法により、繊維芽細胞以外のヒト正常体細胞へのヒト１４番染色体由来断片又はヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターの移入が可能である。さらに、本発明の方法に従って作製されたヒト染色体由来ＨＡＣベクターであれば、ヒト１４番染色体又はヒト２１番染色体に制限されることなく、ヒト正常体細胞に移入することが可能である。
ＨＡＣベクターの細胞への移入は、ミクロセル法を利用して行うことができる。ミクロセル法は、上記「１．ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製」の項に記載のように行うことができる。
また、本ＨＡＣベクターの細胞への移入について、最初に用意したヒト染色体を保持する細胞から、ヒト染色体への改変を行うステップの前、ステップの間、又はステップの後のいずれの段階においてもヒト染色体（ＨＡＣベクター）を他の細胞へ移入することが可能である。
４．ＨＡＣベクターの用途
本発明の目的は、ベクターという基本ツールとその利用技術の提供であり、学術研究から産業に至る非常に幅広い領域に波及効果をもたらすことが期待される。《１》宿主染色体に挿入されず独立して維持される（宿主遺伝子の変異やがん化の懸念がない）、《２》一定のコピー数で長期間安定に保持される（過剰発現、発現消失の懸念がない）、《３》導入可能なＤＮＡの長さの制限がない（正常な発現制御を保証するＤＮＡエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能である）、という本ＨＡＣベクターの特徴は、従来のベクターで不可能であった多くのことを可能にすると想像される。本ＨＡＣベクターの用途としては、限定するものではないが主要なものを挙げると、《１》動物培養細胞における遺伝子機能解析用ベクター、《２》ヒト疾患遺伝子治療用ベクター、《３》ヒト臓器幹細胞、胚幹細胞（ＥＳ細胞）への遺伝子導入用ベクター、《４》遺伝子導入動物作製用ベクター（例：ヒト疾患モデル動物作製、ＫＯ動物と組み合わせた特定遺伝子のヒト化）、などが考えられる。以下に、本ＨＡＣベクターの用途の一例として、（１）外来ＤＮＡの受容細胞への導入、（２）外来ＤＮＡを発現する細胞の作製、（３）タンパク質の製造、（４）遺伝子機能解析用ベクター、（５）幹細胞への遺伝子導入用ベクター、（６）培養フィーダー作製用ベクター、及び（７）ヒト疾患治療用ベクターを説明する。
（１）外来ＤＮＡの受容細胞への導入
本ＨＡＣベクターは、細胞中で外来ＤＮＡを挿入したり、外来ＤＮＡが挿入されたＨＡＣベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来ＤＮＡを所望の受容細胞に導入することができる。外来ＤＮＡの受容細胞への導入には、例えば以下のステップが含まれる：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡの導入を確認するステップ。
ステップ（ａ）〜（ｄ）は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ（ｅ）及び（ｆ）においては、ヒト染色体を保持する供与細胞から、ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体断片を移入する。移入対象となるヒト染色体は、ステップ（ｂ）〜（ｄ）における染色体の改変前、改変ステップの途中、又は改変後のものとすることができる。従って、例えばステップ（ｄ）においてヒト染色体に外来ＤＮＡを挿入する前に、ヒト染色体を保持する供与細胞から、ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体を移入してもよい。その後、ステップ（ｄ）の外来ＤＮＡの挿入操作を受容細胞において行って、外来ＤＮＡが挿入されたヒト染色体を受容細胞に保持させることもできる。これらのステップは他の順序で行うこともでき、ステップ（ｄ）〜（ｆ）の順序は、上記順序に限定されない。
ミクロセル法は、上記「１．ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの作製」の項に記載のように行うことができる。ここで用いる受容細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞、特に哺乳動物細胞（例えばマウス細胞、ヒト細胞など）が好ましい。また、上述したような多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、並びに間質系幹細胞及び組織幹／前駆細胞などを受容細胞として用いることも可能である。
続いて、ステップ（ｇ）においては、受容細胞に外来ＤＮＡが導入（移入）されているか否かを確認する。この確認は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば、外来ＤＮＡの制限酵素部位に対応するプローブを用いたサザンブロット解析などにより、外来ＤＮＡの導入を確認することができる。
本ＨＡＣベクターを用いることにより、大きなサイズの外来ＤＮＡを細胞に導入し、安定に保持させることが可能となる。
（２）外来ＤＮＡを発現する細胞の作製
本ＨＡＣベクターは、上述したように、細胞中で外来ＤＮＡを挿入したり、外来ＤＮＡが挿入されたＨＡＣベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来ＤＮＡを発現する細胞を作製することもできる。外来ＤＮＡを発現する細胞の作製には、例えば以下のステップが含まれる：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
（ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡを発現する細胞を選択するステップ。
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ（ｇ）においては、受容細胞において外来ＤＮＡの発現を確認し、外来ＤＮＡを発現する細胞を選択する。外来ＤＮＡの発現の確認は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば、外来ＤＮＡに対応するプローブを用いたノーザン・ブロット法などが挙げられる。
本ＨＡＣベクターを用いることにより、大きなサイズの外来ＤＮＡを発現する細胞を作製することが可能となる。
（３）タンパク質の製造
本ＨＡＣベクターを利用することにより、上述したように、外来ＤＮＡを細胞に導入することや、外来ＤＮＡを発現する細胞を作製することができるため、当該外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。タンパク質の製造には、例えば以下のステップが含まれる：
（ａ）ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
（ｂ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
（ｃ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
（ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
（ｅ）上記ヒト２１番染色体又はヒト１４番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
（ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
（ｇ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
（ｈ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ（ｇ）では、ステップ（ｆ）で融合した受容細胞を培地中で培養する。受容細胞を培養するための培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、上記受容細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば適切な培地を選択し、また必要により適宜修正を加えて培地を調製することができる。また、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件、温度、ｐＨ、培養期間なども適宜設定する。
培養後、ステップ（ｈ）に記載するように、得られる培養物からタンパク質を採取する。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。培養終了後、該培養物よりタンパク質を採取するには、通常のタンパク質精製手段等を用いて得ることが出来る。例えば、細胞内に生産された場合は、常法により細胞を超音波破壊処理、磨砕処理、加圧破砕等によりタンパク質を抽出する。必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。また、培養上清に生産された場合は、培養液そのものを用いることが出来る。そして、この溶液を濾過、遠心分離等を行い固形部分を除去し、必要によりプロトタミン処理等により核酸を除去する。
次いで、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、粗タンパク質溶液を得る。該タンパク質溶液を各種クロマトグラフィー、電気泳動等にかけて精製酵素標品を得る。例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過、イオン交換体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、又はこれらを組合せることにより、精製された目的のタンパク質を得ることが出来る。しかし、上記培養法、精製法は一例であって、これに限定されるものではない。
本発明において、製造対象となるタンパク質は、製造が望まれるタンパク質であれば特に限定されるものではないが、一例としては、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）などが挙げられる。このような製造対象のタンパク質をコードする遺伝子（すなわち外来ＤＮＡ）は、例えば公の遺伝子データベースなどを利用してその配列情報を入手することができる。
（４）遺伝子機能解析用ベクター
本ＨＡＣベクターに挿入した外来ＤＮＡは、細胞中でコピー数依存的かつ安定的に発現されるため、本ＨＡＣベクターは、遺伝子機能を解析するために利用することができる。
標的遺伝子をコードする塩基配列の一部に相補的な配列からなる二本鎖ＲＮＡ（double-stranded RNA；ｄｓＲＮＡ）を発現させることにより標的遺伝子の発現を抑制する手法、ＲＮＡ干渉が知られている（例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関しては、Elbashirら、Nature, 411:494, 2001；McCaffreyら、Nature, 418:38, 2002を参照。また、Shinagawa, T.ら、Genes & Development, 17:1340-1345, 2003も参照）。ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを遺伝子発現誘導系とともにＨＡＣベクター上に導入することにより、標的遺伝子のコンディショナルな機能抑制が可能である。また、遺伝子発現誘導系に替えてゲノム領域を利用することで組織特異的／生理的な部位での機能抑制が可能である。
また、目的分子による作用効果を解析しようとする場合に、その目的分子の用量依存性を指標として解析する手法がある。この手法において、本発明に従って目的分子をコードする遺伝子の発現ユニットのコピー数を変えてＨＡＣベクター上へ導入し、細胞等（組織、個体も含む）に移入することにより、該細胞等におけるコピー数依存的発現制御に基づいて用量依存性解析を行なうことが可能である。また、遺伝子発現制御のために発現誘導系やゲノム領域を利用することでコンディショナル又は組織特異的／生理的な機能解析が可能である。
（５）幹細胞への遺伝子導入用ベクター
本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、実施例２０及び２１に示したように胚性幹（ＥＳ）細胞又は間葉系幹細胞（Mesenchimal Stem Cell；ＭＳＣ）への遺伝子導入用ベクターとして利用することができる。そして上記ＨＡＣベクターはＥＳ細胞又はＭＳＣにおいて長期間安定に存在できる。
実施例２０及び２１に示したように、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターを保持するＭＳＣから分化誘導した組織細胞においてはＨＡＣベクターが安定に保持される。また、ヒト２１番染色体断片を保持するマウスＥＳ細胞からキメラ個体を作製すると、該染色体断片が次世代伝達すること及び組織中のＥＳ細胞から分化した細胞においてヒト２１番染色体断片が保持されていることが確認されたことから（Kazukiら、J. Hum. Genet., 46:600, 2000）、本発明の方法により作製したＨＡＣベクター移入ＥＳ細胞から分化誘導した組織細胞においてもＨＡＣベクターが安定に保持されると考えられる。
また近年、様々な組織の幹細胞及び骨髄由来の多能性細胞が同定されている（横田ら、実験医学（増刊）、１９巻１５号、２００１年、羊土社、岡野ら、実験医学（増刊）、２１巻８号、２００３年、羊土社、Liら、Nature Med., online:31 August 2003, doi:10.1038/nm925）。本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、組織幹／前駆細胞、例えば骨髄、血液、神経、筋肉、肝臓、膵臓、皮膚、内耳などに由来する多能性幹／前駆細胞、への遺伝子導入用ベクターとして利用可能である。
さらに、ＥＳ細胞、ＭＳＣ、及び組織幹／前駆細胞のヒト臨床応用を考える場合、治療処置に必要な量の細胞を増幅し、所望の分化状態で提供することが求められる。従来では、多分化能を保持したまま幹細胞だけを大量に増幅することは容易ではなく、課題の一つとなっている（日野ら、実験医学、１９巻１５号増刊：１０、２００１、羊土社）。例えば、造血幹細胞や神経幹細胞を生体組織から採取し培養すると、幹細胞だけでなく幹細胞から分化した前駆細胞や成熟細胞も同時に増幅されるため、臨床用途には好ましくない（岡野 榮之、実験医学、１９巻１５号増刊：８０−９０、２００１、羊土社）。
本発明においては、多分化能保持に関わる因子、例えばマウスＥＳ細胞では、活性化型Ｓｔａｔ３，Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの転写因子（Niwaら、Genes Dev., 12:2048, 1998；Matsudaら、EMBO J., 18:4261, 1999；Niwaら、Nature Genet., 24:373, 2000；Mitsuiら、Cell, 113:631, 2003；Chambersら、Cell, 113:643, 2003）をコードするＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製し幹細胞へ移入することにより、宿主染色体を変異させることなく多分化能を保持しかつ簡便に幹細胞を増幅させるために利用することが可能である。
また、幹細胞の分化制御においては、関与する分子の発現量のコントロールが重要な要素になっている。例えば、マウスＥＳ細胞における上記Ｏｃｔ−３／４による分化制御においてその発現量が生理的発現レベルを１００％とした場合は未分化状態を維持するが、５０％以下の場合は栄養外胚葉に分化し、また１５０％以上では原始内胚葉に分化する（Niwaら、Nature Genet., 24:373, 2000）。このような発現レベルの変化により分化を制御する場合には、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターに遺伝子発現ＯＮ／ＯＦＦ誘導系（例えばテトラサイクリンによる発現誘導系）を導入することにより、厳密な発現量のコントロールが可能となる。
また、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターに遺伝子発現ＯＮ／ＯＦＦ誘導系（例えばテトラサイクリンによる発現誘導系）と分化誘導因子とを組み合わせて導入することにより、多分化能保持状態と分化誘導状態を切替えることが可能である。
幹細胞による組織再生を行う場合、移植細胞又はドナー由来の再生組織は、長期間（望ましくは生涯）にわたりレシピエント個体の一部となり機能する。それ故にガン化などの生理的制御の逸脱をドナー細胞に誘発する原因（例えば遺伝子変異）を与える操作は極力避けることが望ましい。本ＨＡＣベクターは、宿主染色体と独立に存在できることから、遺伝子導入を宿主染色体に変異を与えずに行なうことができる。また実施例１３、１４、１８及び１９に示すとおり、ヒト細胞中で安定に存在できることから、長期間にわたり安定に目的分子を発現することができる。
本発明の方法に従って、分化させた組織で生理的に発現する遺伝子のゲノム領域又は組織特異的発現制御領域を含むゲノム配列下に目的の遺伝子を融合したＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製し、上記ＨＡＣベクターを移入した幹細胞を用いることにより、再生した組織において生理的／組織特異的に目的分子を発現することが可能である。
また、本発明の方法により作製したＨＡＣベクターを保持する幹細胞を分化誘導した後、導入遺伝子の発現が必要なければＨＡＣベクターは不用となる場合がある。分化誘導後にＨＡＣベクター脱落クローンを、方法を特に限定するものではないが例えば選択培養における薬剤耐性を指標にして選別することにより、不用となったＨＡＣベクターを排除することが可能である。
（６）培養支持フィーダー細胞作製用ベクター
細胞培養法の一つとして、培養器底面に付着性細胞を敷き詰めた培養支持フィーダー細胞上に目的の細胞を播種し共培養する方法が知られている（日本生化学会編、新生化学実験講座１４発生分化老化、1９９２年、東京化学同人）。例えば造血前駆細胞を増殖させる場合には、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒなどの必要な因子をそれぞれ例えば組換え体タンパク質として準備し、培養液に添加して培養する（Uedaら、J Clin Invest., 105:1013-1021, 2000）。従来法により培養添加物の遺伝子を培養支持フィーダー細胞へ導入することが可能であるが、宿主染色体へのランダム挿入による変異・ポジション効果、発現不活化、多コピー発現ユニット並列による下流遺伝子発現の減弱などにより、全ての因子について望みの発現量を制御して供給することは困難と考えられる。本発明の方法によりこれらの必要因子をコードするＤＮＡ全て（又は一部）を導入したＨＡＣベクターを作製し、培養支持フィーダー細胞へ移入することにより、組換え体タンパク質などを後から加えることなく単なる共培養だけで簡便に必要な因子を全て補給することが可能である。また、遺伝子発現誘導系を利用することでこれら因子のコンディショナルな発現制御が可能である。
（７）ヒト疾患治療用ベクター
ヒト疾患治療用のベクターは、ウイルス性及び非ウイルス性ベクターが従来から各種研究されているが、免疫反応の惹起、導入ＤＮＡサイズの限界、宿主染色体挿入変異、低導入効率・低発現効率、発現量制御が困難（金田 安史、臨床免疫、３９巻：５５１−５５８、２００３年、科学評論社、小澤 敬也編、遺伝子治療、１９９７年、羊土社）など、様々な課題が指摘されている。いずれのベクターにも共通する課題として、「望ましい発現量を、望ましいタイミングで制御する」ことが求められている。
ＨＡＣベクターを用いた遺伝子細胞治療の戦略として、《１》１次的に欠損している酵素やタンパク質の補充、《２》２次的に減少している代謝産物を補充する対症療法、《３》細胞に新機能を付加し、細胞の生存を高める方法（例えば改変細胞を用いる組織再生において、ＨＡＣベクターはゲノムを導入することにより生理的／組織特異的遺伝子発現制御を行なうことが可能である。またこれにより過剰発現又は発現不足による機能障害などの副作用を回避することができる。）、《４》Ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎの形で進行する変性疾患の障害をくいとめる方法（例えばパーキンソン病におけるＧＤＮＦ補充治療）などが挙げられる。
すなわち、本ＨＡＣベクターは、ヒト疾患治療用ベクターとして使用することが可能であり、治療用の外来ＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを細胞へ移入後、その細胞を患者に投与するための医薬組成物として調製することが可能である。また、かかるヒト疾患治療用ベクターは、疾患の治療のみならず、疾患の予防にも使用することが可能である。
適用範囲を特に限定するものではないが、以下にヒト疾患治療用ベクターとしての適用例を示す。
（Ａ）テロメラーゼの利用
遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、その安全性観点から不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましい。しかし正常体細胞は、一定回数分裂すると増殖・分裂が止まりやがて死滅する、すなわち老化することが知られている（井出 利憲、実験医学、１６巻１８号増刊：１８―２４、１９９８、羊土社）。治療効果を長期間持続させるために、治療用細胞は一定期間、望ましくは罹患者の生涯を通して維持されることが必須である。染色体末端に存在する繰返し配列テロメアの修復酵素であるテロメラーゼは、正常細胞内で過剰発現させることにより細胞老化時に認められるテロメア短縮を抑制し、細胞の寿命を延長できることが知られている（Ｂｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：３４９−３５２，１９９８）。またテロメラーゼは、細胞内で過剰発現させても不死化又はガン化を導くものではないことが示されている（真貝 洋一、実験医学、１６巻１８号増刊：２５−３０、１９９８、羊土社、Jiangら、Nature Gent., 21:111-114, 1999）。それゆえ、本発明の方法によりヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）をコードする遺伝子をＨＡＣベクター上に導入し標的となる細胞へ移入することにより、ＨＡＣ移入細胞の寿命を延長し、不死化又はガン化させることなく治療効果を長期間持続させることが可能である。また、遺伝子発現制御を発現誘導系やゲノム領域を利用することにより、コンディショナル又は組織特異的／生理的なテロメラーゼ発現が可能である。
（Ｂ）自己抗体生成の抑制
組換え体タンパク質製剤を開発する場合、投与時の自己抗体（活性中和抗体）の生成が障害となっている（Ｌｉら、Ｂｌｏｏｄ，９８：３２４１−３２４８，２００１）。患者への投与方法を特に限定するものではないが、本発明の方法により作製した目的タンパク質をコードするゲノムを導入したＨＡＣベクターを、ヒト細胞、例えば産生組織の正常ヒト細胞へ移入後、これを患者へ移植する。該患者においてＨＡＣベクターから目的タンパク質を生理的／組織特異的に発現・供給することにより、患者における自己抗体生成の抑制が可能である。
（Ｃ）免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクター
再発白血病に対する治療法として、移植片対白血病反応により移植リンパ球が腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞として白血病細胞を攻撃することを応用したドナーリンパ球輸注療法（Kolbら、Blood, 76:2462, 1990）が知られている。上記療法の副作用として、移植細胞がレシピエント組織を攻撃し障害を与える移植片対宿主病が知られているが、これに対するひとつの対処法として、ドナーリンパ球へのレトロウイルスによる薬剤誘導性の自殺遺伝子導入及び薬剤投与によるドナーリンパ球の除去が行われている（小野寺ら、ゲノム医学，３巻：４５，２００３，メディカルレヴュー社）。上記方法の場合、ドナーリンパ球の染色体に変異を与える危険性が残る。
本発明の方法により作製したＨＡＣベクターは、宿主染色体に変異を与えない免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクターとして利用することが可能である。また、抗腫瘍活性促進を目的とした治療、例えばリンパ腫におけるＣＤ４０リガンドによる免疫活性化療法（加藤ら、ゲノム医学，３巻：５３，２００３，メディカルレヴュー社）など、における遺伝子導入用ベクターとしても利用することが可能である。
（Ｄ）モノクロナール完全ヒト抗体補充
近年ヒト抗体産生マウスを利用した、完全ヒトモノクロナール抗体医薬品の創製が試みられている（石田ら、Ｂｉｏベンチャー、２巻：４４、２００２、羊土社、Moriら，Cell Death and Differentiation, in press, 2003，Proceedings of American Association for Cancer Reserach, Volume 44, 2nd Edition, July 2003, p1285, #6422）。しかし、これを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なＴＰＯ投与のため病院への通院が必要となり患者のＱＯＬの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法により作製したＨＡＣベクター上に、目的の抗体を産生するハイブリドーマから単離した目的抗体をコードするゲノム領域を導入し、例えば患者造血幹細胞やＢ細胞へ上記ＨＡＣベクターを移入後、患者へ再移植することにより、完全ヒト抗体を生理的発現制御により補充・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｅ）単一遺伝性疾患における欠損補充
（Ｅ−１）血友病
血友病Ａは、血液凝固第８因子の変異、血友病Ｂは血液凝固第９因子の変異が原因となって起こる、伴性劣性遺伝性出血疾患である。治療法として第８又は第９因子濃縮製剤投与による補充療法が有効であるが、出血後投与では重篤な合症が生じること、濃縮製剤への病原体混入の可能性、反復投与による自己抗体（活性中和抗体）の発生、常時出血への対処準備による患者ＱＯＬの低下、高額な医療費など課題は多く、遺伝子治療法による解決が期待されている。従来ベクターによる臨床遺伝子治療研究が行われているが、十分な発現を長期間持続できず有意な治療効果を得るに至っていない。また、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを直接投与する臨床研究において被験者の精液中にベクター遺伝子が検出され生殖細胞への遺伝子導入の危険性が指摘されている（望月ら、ゲノム医学，３巻：２５，２００３，メデイカルレヴュー社）。第８因子をコードする遺伝子は、全長ゲノムで約１．５Ｍｂ、ｃＤＮＡで約７ｋｂにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長ｃＤＮＡの導入は可能であるが発現量の低下が、またＡＡＶベクターでは、導入ＤＮＡサイズが約４．９ｋｂ以下に限られるため全長遺伝子を導入できないことが課題となっている。
本発明の方法により血液凝固第８因子又は第９因子をコードするＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、罹患者への移植により補充することが可能である。また、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記血液凝固第８因子又は第９因子のゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、該細胞の罹患者への移植により、生理的組織特異的発現により該因子を補充することが可能である。
（Ｅ−２）Ｘ−ＳＣＩＤ（Ｘ連鎖重症複合免疫不全症）
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、液性及び細胞性免疫が先天的に障害される疾患である。ＳＣＩＤの約半数がＸ連鎖のＸ−ＳＣＩＤであり、その原因はインターロイキン２ファミリーの受容体が共有する共通γ鎖の変異であることが知られている。治療法として、造血幹細胞移植が行われているが、液性免疫の回復は不十分で免疫グロブリンの定期的投与が必要となる。そこで造血幹細胞へ共通γ鎖を導入し移植する遺伝子細胞治療法による解決が期待されている。１９９９年からレトロウイルスにより共通γ鎖を導入した造血幹細胞移植の臨床研究が行われていたが、近年フランスにおいて移植細胞の白血病化が複数例報告された（Hacein-Bey-Abinaら、N Engl J Med., 348:255, 2003；Marshallら、Science, 299:320, 2003）。何れのケースも遺伝子導入細胞染色体中の原ガン遺伝子の一つであるＬＭＯ２遺伝子領域にベクター配列挿入変異が認められ、ＬＭＯ２活性化と腫瘍化との関連が疑われている（久米ら、ゲノム医学，３巻：９，２００３，メデイカルレヴュー社）。
本発明の方法により共通γ鎖をコードするＤＮＡを導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして上記ＨＡＣベクターを遺伝子導入用ベクターに用いることにより宿主染色体へのベクター配列挿入変異の危険を回避することが可能である。また、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、ヒト細胞（例えばヒト骨髄由来正常造血幹細胞）へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現による共通γ鎖の欠損機能相補を行うことが可能である。
（Ｅ−３）デイシェンヌ型筋ジストロフィー；ＤＭＤ
デイシェンヌ型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異によるジストロフィンの機能欠損が原因である、Ｘ連鎖劣性単一遺伝子性疾患の一つである（Hoffmanら、Cell, 51:919, 1987）。ＤＭＤの治療は、ジストロフィンが細胞骨格タンパク質であるため直接投与による補充は不可能であり、遺伝子治療法が期待されている。
ジストロフィン遺伝子は、全長ゲノムで約２．３Ｍｂ、ｃＤＮＡで１４ｋｂにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長ｃＤＮＡの導入は可能であるが発現量の低下が課題となっている（Liuら、Mol. Ther., 4:45, 2001;DelloRussoら,Proc Natl Acad Sci USA, 97:12979, 2002）。またＡＡＶベクターでは、導入ＤＮＡサイズが約４．９ｋｂ以下に限られるため全長遺伝子を導入できず、また骨格筋への遺伝子導入実験において免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められた（Yuasaら、Gene Therapy, 9:1576, 2002）、などの課題が存在する。
遍在的な発現を誘導するＣＭＶプロモーター制御下にジストロフィンミニ遺伝子を導入したＡＡＶベクターによる骨格筋への遺伝子導入実験においては、免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められたが、プロモーターとして骨格筋特異的なＭＣＫプロモーターを使用することにより上記免疫応答が改善された（Yuasaら、Gene Ther., 9:1576, 2002）。このことから、ジストロフィンの発現には生理的組織特異的発現が必要であることが示唆される。
本発明の方法によりジストロフィンをコードするゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、ヒト細胞（特に限定するものではないが例えば自家ヒト正常筋芽細胞）へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現によるジストロフィン補充を行うことが可能である。
（Ｅ−４）適用対象疾患を特に限定するものではないが、例えば以下に示す単一性遺伝子疾患；α―１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ）、慢性肉芽腫症、家族性高コレステロール症、ファンコーニ貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ、白血球接着欠損症、Ｃａｎａｖａｎ病、脳梁萎縮、ファブリー病、筋萎縮性側索硬化症などにおいて、本発明の方法により原因遺伝子を導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、欠損分子の補充・相補を行うことが可能である。なお、疾患原因遺伝子情報については、米国National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のオンライン文献データベースＰｕｂＭｅｄ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi?db=PubMed）又はOMIMTM- Online Mendelian Inheritance in ManTM（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM）を参照されたい。
（Ｆ）その他疾患
（Ｆ−１）トロンボポイエチン（Thrombopoietin；ＴＰＯ）は、血小板産生制御及び造血幹／前駆細胞の増殖を担う因子であり、例えば再生不良性貧血などの血液疾患、化学療法後の造血回復などへの適用が期待されている。しかし、ＴＰＯ組換え体タンパク質投与時の活性中和抗体生成が医薬品開発の障害となっている（Ｌｉら、Ｂｌｏｏｄ，９８：３２４１−３２４８，２００１）。従って、ＴＰＯを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なＴＰＯ投与のため病院への通院が必要となり患者のＱＯＬの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法によりＴＰＯゲノムを導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的／組織特異的にＴＰＯを発現・供給することにより、自己抗体生成を抑制することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし、患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｆ−２）エリスロポイエチン（Erythropoietin；ＥＰＯ）は、赤血球増殖因子であり、例えば糖尿病や腎疾患における腎性貧血などの治療薬として市販されている。慢性疾患（例えば糖尿病による腎性貧血など）では定期的なＥＰＯ投与のため病院への通院が必要であり患者のＱＯＬの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。本発明の実施例１４に示したように、ＥＰＯ ｃＤＮＡ導入したＨＡＣベクターをヒト正常繊維芽細胞へ移入し患者へ移植することにより、該患者においてＥＰＯを発現・供給することが可能である。また、本発明の方法により、ＥＰＯゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的／組織特異的にＥＰＯを発現・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし、患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｆ−３）パーキンソン病
パーキンソン病は、中脳黒質緻密部ドーパミン合成細胞の進行性の変性脱落により運動機能が障害される神経疾患である。治療法の一つとして、欠損したドーパミン補充を目的としたＬ−ＤＯＰＡ投与法があるが、中等以上の症状では薬効が減弱することや副作用による患者のＱＯＬ制限・投与量減少などの課題が存在する。これら課題は、ドーパミン濃度が線状体内で一定しないこと及び投与したＬ−ＤＯＰＡが線状体以外で作用することに起因するため、線状体での一定したドーパミンの生理的発現が求められる（武田ら、メデイカルサイエンスダイジェスト、２９巻：２０、２００３年、ニュー・サイエンス社）。現在、ドーパミン合成に関わる酵素３種類を各々導入したＡＡＶベクターによる遺伝子治療研究がなされているが、いずれも生理的発現制御を行うまでには至っていない。また、ドーパミン合成細胞の変性脱落抑制を目的とした治療法にＧＤＮＦ（Grial-cell Derived Neuronal Factor）投与があるが、被殻下にカテーテル留置による持続投与で効果が認められた（Gillら、Nature Med., 9:589, 2003）一方で感染の危険性や患者のＱＯＬ制限などが課題となっている。ＡＡＶベクターによる遺伝子治療研究により動物モデルで効果が示された（Wangら、Gene Ther., 9:381, 2002）が、こちらも生理的発現制御を行うまでには至っていない。
本発明の方法により、ドーパミン合成に関わる酵素群又はＧＤＮＦゲノム領域を導入したＨＡＣベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記ＨＡＣベクターを、ヒト細胞（例えばヒト正常神経幹／前駆細胞）へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現による導入遺伝子産物の補充が可能である。
（Ｆ−４）糖尿病
インスリン依存型糖尿病において、組換え体タンパク質製剤投与による治療が行われている。慢性疾患では定期的な投与のため病院への通院が必要であり、患者のＱＯＬの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。インスリンの血中濃度は至適範囲がせまいため、多すぎても少なすぎても副作用が生じ、時には生命の危険に至る場合がある。また、遺伝子治療の研究がなされているが、体内におけるインスリン濃度のコントロールが課題となっている（森谷ら、蛋白質 核酸 酵素、４０巻：２７６４、１９９５、共立出版）。
本発明の方法によりインスリンゲノムを導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的／組織特異的に発現・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし患者のＱＯＬを向上させることが可能である。
（Ｆ−５）適用対象疾患を特に限定するものではないが、例えば脳腫瘍、末梢動脈疾患（虚血など）、慢性間接リュウマチ、動脈再狭窄、肘部トンネル症候群、冠動脈疾患、アルツハイマー病、潰瘍、骨盤骨折、腎疾患、悪性腫瘍、などにおいて、本発明の方法に従って、疾患治癒に必要と考えられる物質をコードする遺伝子を導入したＨＡＣベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、欠損分子の補充・相補を行うことが可能である。
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ヒト２１番染色体長腕遠位の削除によるＨＡＣベクターの作製
（１）テロメア短縮のためのコンストラクト構築
ヒト２１番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクター（ターゲティングベクター）は、ＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｐｕｒｏ（Kuroiwa, Nucleic Acids Res.,26:3447, 1998）を用いた。ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト２１番染色体長腕遠位の塩基配列（登録番号ＡＬ１６３２０４）から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するための、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
#21telF1：5'- CGCGGATCCAGAGAGAGCCTGGAATGCCTGGTAGTGT（配列番号１）
#21telR1：5'- CGCGGATCCCCAGTGCCCTGAGATCTTGTGATTTCTC（配列番号２）
ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞は、同染色体を保持するマウスＡ９雑種細胞（Shinohara, Hum Mol Genet, 10: 1163, 2001）を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるＤＴ４０はJapanese Collection of Research Bioresources（ＪＣＲＢ）に登録番号ＪＣＲＢ２２２１として登録されており、入手可能である。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約１×１０８個のＡ９（＃２１ｎｅｏ）細胞からミクロセルを調製した。２５ｃｍ２遠心用フラスコ（コースター）１２本に細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＡ９（＃２１ｎｅｏ）細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（１０％ ＣＳ，０．０５μｇ／ｍｌ Ｇ４１８，ＤＭＥＭ）中で７２時間培養して微小核を誘導した。実施例において、ＤＭＥＭはインビトロジェン製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温（３４℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ，シグマ）に懸濁して回収し、フィルターで濾過して精製した。精製したミクロセルは１０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Phytohemaggulutinin-P，シグマ）を含むＤＭＥＭ４ｍｌに再懸濁した。ＤＴ４０細胞は、５０μｇ／ｍｌのポリＬリジン（Poly-L-Lysine，シグマ）でコーティングした６穴クラスター（ヌンク）の２穴に１×１０８個を播種した後１時間静置し、あらかじめ底面に付着させておく。これにミクロセル懸濁液を加え３分間静置したのち上清を除き、５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ロッシュダイアグノスティクス）で１分間処理した。融合細胞を無血清ＤＭＥＭ１２ｍｌに懸濁し、６穴プレートの４穴に播いて２４時間培養した後、１．５μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で約２週間選択培養し、出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。
上記ＤＴ４０雑種細胞を培養し、細胞からPuregene DNA Isolation kit（Gentra System社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をＰＣＲ法により増幅した。鋳型として約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用し、Innisら（ＰＣＲ実験マニュアル，HBJ出版局，1991）に従い、サーマルサイクラーはGeneAmp9700（Applied Biosystems社）を使用してＰＣＲを行った。TaqポリメラーゼはLA Taq（宝酒造）を用い、反応条件は、９５℃２分の後、変性９５℃３０秒、アニーリング／伸長６８℃６分を３５サイクル行った。増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で消化して、突出末端をもつ約５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これをＰＢＳ−ＴＥＬ／ＰｕｒｏプラスミドのＢａｍＨＩサイトにクローニングした。最終的なＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｐｕｒｏコンストラクトのサイズは約１０．６ｋｂである。テロメアトランケーションベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図１に示した。
（２）トランスフェクション及びｐｕｒｏ耐性クローンの単離
ＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｐｕｒｏコンストラクトを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化により線状化ＤＮＡとし、ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞に導入した。ＤＴ４０雑種細胞１×１０７を０．７５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、２５μｇ ＤＮＡ存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに７５０Ｖで印加し電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を、１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ニワトリ血清（ＣｈＳ）及び５０μＭ ２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地（インビトロジェン製）に懸濁し、９６穴クラスター（ファルコン）２枚に播種した。２日後に終濃度０．３μｇ／ｍｌとなるようピューロマイシン（Puromycin dihydrochloride，シグマ）を加えた。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＤＴ４０雑種細胞１×１０７あたり平均１７．８個であった。２０回のトランスフェクションから合計３５６の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（３）相同組換え体の選別とテロメア短縮の確認
（３−１）ＰＣＲ解析
ピューロマイシン耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２１番染色体上に存在する遺伝子及びＳＴＳマーカー（Ｄ２１Ｓ２６５，ＣＢＲ，ＳＩＭ２，Ｄ２１Ｓ２６８，Ｄ２１Ｓ２６６，Ｄ２１Ｓ１２５９）の存在をＰＣＲ法により検出した。
これらのＳＴＳマーカーのプライマーオリゴヌクレオチドの配列は米国National Center for Biotechnology InformationのオンラインデータベースUniSTS（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists）において閲覧可能である。上記６種のＳＴＳマーカーの登録番号は順にＵｎｉＳＴＳ：７６２２３，４５６４１，５４１２４，２２６２５，５４２６６，５３７４６である。その他にＧｅｎＢａｎｋデータベースより入手した塩基配列をもとに設計した遺伝子プライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
PRED65F：5'- GCCTGGCATCTTCCTCAATA（配列番号３）
PRED65R：5'- TTGCATGCCTGTGGTACTGT（配列番号４）
PRED3F：5'- TCACAATCATGGGCTTTGAA（配列番号５）
PRED3R：5'- CACGCAACCATTTGTTCATT（配列番号６）
約０．１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型として、はじめに上記８種のうち相同組換えによる切断部位の近位に位置するＰＲＥＤ３遺伝子と、遠位に位置するＤ２１Ｓ２６５マーカー及びＤ２１Ｓ２６６マーカーの計３種についてＰＣＲ増幅（Innisら，前記）を行った。テロメアトランケーションにより長腕遠位が削除された場合、ＰＲＥＤ３遺伝子を保持しＤ２１Ｓ２６５マーカー及びＤ２１Ｓ２６６マーカーを保持しないことが予想される。耐性３５４クローンのうち２４クローンにおいて予想される増幅結果が得られた。これら２４クローンについては残る７種のマーカーによるＰＣＲ増幅を行い、ヒト２１番染色体の保持領域を確認した。以上の代表的な結果を図２に示す。図２には、左側にヒト２１番染色体のＧバンド像に基づく模式的な染色体地図を、またマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した。３種のピューロマイシン耐性ＤＴ４０株について、ＰＣＲにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは■で、検出されなかったマーカーを□で示した。ＤＴ４０（＃２１）は、テロメアトランケーションを行う前の細胞である。
（３−２）サザンブロット解析
相同組換えの標的配列内にプローブを設定した（図１）。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、その後ＰＣＲ増幅断片を単離及び精製した。
#21qtelF：5’- TCACAGCCAGCAGAGGATTC（配列番号７）
#21qtelR：5’- CACCTGCACAATGGCTCAAC（配列番号８）
１次スクリーニングで得た２４クローンから抽出したゲノムＤＮＡ約１０μｇを制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により消化し、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.,1994）に記された方法でサザンブロット解析を行った。３２Ｐにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）により検出した。代表的な結果を図３に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で１３．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で９．０ｋｂであり、候補クローン２４のうち、２クローンが相同組換え体であることを確認した。
（３−３）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。代表的なＦＩＳＨ像を図４ａ及びｂに示す。図４ａにおいて白矢印はテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト２１番染色体を、図４ｂにおいて白矢印は長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片を示している。宿主であるＤＴ４０細胞の染色体との相対的な大きさから、ヒト２１番染色体が短縮したことが確認された。
以上の実験より、得られたピューロマイシン耐性の２株が長腕削除により短縮したヒト２１番染色体を保持することが確かめられた。
〔実施例２〕ＨＡＣベクターにおけるヒト２１番染色体長腕近位へのｌｏｘＰ配列の挿入
（１）ｌｏｘＰ挿入のためのコンストラクト構築
実施例１で作製したヒト人工染色体（ＨＡＣ）にｌｏｘＰ配列を挿入するための基本プラスミドには、ｐＳＦ１（ライフテック）を用いた。ＬｏｘＰ挿入部位であるヒト２１番染色体長腕近位の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースより得た（登録番号ＡＬ１６３２０３）。相同組換えの２つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
#21qEcoF：5'- CCGGAATTCCTCTGGGTTTCTGGTGAAGC（配列番号９）
#21qEcoR：5'- CCGGAATTCTGTAGATCCTGCCATTGTGG（配列番号１０）
#21qBaF：5'- CGCGGATCCTTGGCTCCAAAAGGTACCAC（配列番号１１）
#21qBaR：5'- CGCGGATCCCTATCCTCGCCACTGTGTCC（配列番号１２）
ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として２つの標的配列をＰＣＲにより増幅した。それぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）ないしＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で消化して、突出末端をもつ約３ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これらをｐＳＦ１プラスミドのＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩサイトにクローニングした。相同組換え体の選別に用いるブラストサイジン耐性遺伝子は、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ（インビトロジェン）より制限酵素ＸｈｏＩ（ニッポンジーン）及びＳａｌＩ（ニッポンジーン）消化により約１．３ｋｂの断片として切り出し、上記ｐＳＦ１コンストラクトのＸｈｏＩサイトにクローニングした。
最終的なｐＳＦ１コンストラクトのサイズは約１２．４ｋｂである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図５に示した。
（２）トランスフェクション及びｂｓｒ耐性クローンの単離
ｐＳＦ１コンストラクトを制限酵素ＡｐａＩ（ニッポンジーン）消化により線状化し、長腕遠位を削除したヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０株（ＤＴ４０（＃２１）ｐｕｒｏ−３３９）に導入した。ＤＴ４０雑種細胞を１×１０７を０．７５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、１０μｇ ＤＮＡ存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに７５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ニワトリ血清（ＣｈＳ）、５０μＭ ２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地（インビトロジェン製）に懸濁し、９６穴クラスター（ファルコン）３枚に播種した。２日後に終濃度８μｇ／ｍｌとなるようブラストサイジン（Blasticidin S Hydrochloride、フナコシ）を加えた。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＤＴ４０雑種細胞１×１０７あたり平均５．８個であった。１４回のトランスフェクションで得た計８２のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（３）相同組み換え体の選別
（３−１）サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの標的配列の外側にプローブを設定した。プローブは次に記すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した。
21LOX4869F：5'- GTTGCAGAAAAGTAGACTGTAGCAA（配列番号１３）
21LOX5682R：5'- TCTAAGGAACAAATCTAGGTCATGG（配列番号１４）
ブラストサイジン耐性クローンから抽出したゲノムＤＮＡ約１０μｇを制限酵素ＸｂａＩ（ニッポンジーン）により消化し、サザンブロット解析を行った（図６Ａ及びＢ）。プローブは３２Ｐにより標識し、シグナルはイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）により検出した。図６Ａにおいて左から１番目のレーンはｌｏｘＰサイトを導入する前のヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０株、２番目のレーンは宿主のＤＴ４０細胞株、３番目以降のレーンはブラストサイジン耐性ＤＴ４０株を示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で７．６ｋｂ、野生型（非組換え体）で８．５ｋｂであり、ブラストサイジン耐性株８２から合計３クローン（＃６０，＃７８，＃７９）の相同組換え体を見出した。
（３−２）ＰＣＲ解析
左右２つの標的配列（図５中、それぞれＡ及びＢで示す）に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図５中に矢印で示した。その配列を以下に示す：
Left455F：5'- GGGCTAGCCATTAAAGCTGA（配列番号１５）
Left638R：5'- AAAGGGAATAAGGGCGACAC（配列番号１６）
Right958F：5'- GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTA（配列番号１７）
Right1152R：5'- GTCAATTCACTAATTCCTATTCCCAGT（配列番号１８）
サザンブロット解析により見出した候補クローンからゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行い、塩基配列から予想されるサイズ（左側（Ａ）３，２８３ｂｐ及び右側（Ｂ）３，１１４ｂｐ）の増幅産物を与えることを確認した。結果を図６Ｂに示す。
以上の（１）〜（３）の実験により、得られたブラストサイジン耐性ＤＴ４０細胞８２株のうち３株が、相同組換えによりｌｏｘＰ配列が挿入されたヒト２１番染色体部分断片（ＨＡＣベクター）を保持することが確かめられた。
〔実施例３〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのハムスター細胞株への移入
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例１及び２で得られた、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入したヒト２１番染色体に基づくＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０細胞（ＤＴ４０（＃２１）ｂｓｄ−７９）を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣより入手，登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。
はじめに約１０９個のＤＴ４０（＃２１）ｂｓｄ−７９細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＤＴ４０（＃２１）ｂｓｄ−７９細胞をコルセミド（０．０７５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（１０％ＦＢＳ，１％ＣｈＳ，５０μＭ ２−メルカプトエタノール，ＤＭＥＭ）中で１２〜１５時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、予めポリＬ−リジンでコーティングした２５ｃｍ２遠心用フラスコ（コースター）１２本に藩種した。３７℃１時間静置することで細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、フィルターで濾過して精製した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を８０％飽和の状態まで培養した６ｃｍ径ディッシュに精製した微小核細胞を加えＰＥＧ溶液で融合した。４８時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、ブラストサイジン（８μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ，Ｆ１２）で培養した。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。１２回の微小核細胞融合から計４株のブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を得た。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ法
移入染色体の確認をＰＣＲ法により行った。ヒト２１番染色体長腕近位のマーカーＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子（実施例１の（３）参照）の検出を試みた。ブラストサイジン耐性のＣＨＯ細胞４株のすべてにおいて、２種のマーカー配列の増幅を確認した。
（２−２）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。ブラストサイジン耐性のＣＨＯ株のうちの２株（ＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ７９−１及びＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ７９−３）について解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。代表的なＦＩＳＨ像を図７ａ及びｂに示す。図７ａにおいてテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト２１番染色体を、図７ｂは長腕遠位を削除したヒト２１番染色体断片を示している。宿主であるＣＨＯ細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト２１番染色体がＣＨＯ細胞に移入されたことが確認された。
以上の（１）及び（２）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＣＨＯ株は長腕遠位を削除しｌｏｘＰ配列を挿入したヒト２１番染色体部分断片（ＨＡＣベクター）を保持することが確かめられた。
〔実施例４〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのヒト細胞株への移入、及びヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターの培養細胞における安定性の確認
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例３で得られた、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入したヒト２１番染色体に基づくＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ−７９−１）を用いた。染色体受容細胞としてはヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣより入手，登録番号ＣＣＬ−１２１）を用いた。はじめに約１０７個のＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ−７９−１細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（コースター）６本に細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ−７９−１細胞をコルセミド（０．０７５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（１０％ＦＢＳ，８μｇ／ｍｌブラストサイジン，Ｆ１２）中で４８時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、フィルターで濾過して精製した。ＨＴ１０８０細胞を８０％飽和の状態まで培養した６ｃｍ径ディッシュに精製した微小核細胞を加えＰＥＧ溶液で融合した。４８時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、ブラストサイジン（８μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＣＳ ，ＤＭＥＭ）で培養した。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。２回の微小核細胞融合から計１２のブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株を得た。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ法
移入染色体は，ブラストサイジン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を次に示す。
Bsd2687F：5'- CAACAGCATCCCCATCTCTG（配列番号１９）
Bsd2891R：5'- GCTCAAGATGCCCCTGTTCT（配列番号２０）
ブラストサイジン耐性のＨＴ１０８０細胞１２株のすべてににおいて、耐性遺伝子配列の増幅を確認した。
（２−２）染色体解析
染色体解析は、黒木ら（細胞工学ハンドブック，羊土社，１９９２）に記された方法に従い、ギムザ染色により行った。ブラストサイジン耐性のＨＴ１０８０株のうち４株（ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ７９−１−３，６，１１，１４）について約２０の分裂中期染色体像を解析した。ブラストサイジン耐性株では、親株のＨＴ１０８０には認められず、内在の２１番染色体よりサイズの小さいミニ染色体が観察された。
以上の（１）及び（２）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株は長腕遠位を削除しｌｏｘＰ配列を挿入したヒト２１番染色体部分断片（ＨＡＣベクター）を保持することが確かめられた。
（３）非選択培養条件下での長期継代培養
長腕遠位を削除したヒト２１番染色体の培養細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。用いたのは先に記載したニワトリ細胞株（ＤＴ４０（＃２１）ｂｓｄ−７９）、ヒト細胞株（ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ７９−１−３，６，１１，１４）である。ニワトリ細胞株用の非選択培養液は１０％ＦＢＳ，１％ＣｈＳ，５０μＭ ２−メルカプトエタノールを加えたＤＭＥＭであり、選択培養液はこれにブラストサイジン８μｇ／ｍｌ（ＤＴ４０（＃２１）ｂｓｄ−７９の場合）を添加した。ヒト細胞株用の非選択培養液は１０％ＣＳを加えたＤＭＥＭであり、選択培養液はこれにブラストサイジン４μｇ／ｍｌを添加した。ニワトリ細胞株は１．５×１０７細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、１日後に細胞を計数して再び１．５×１０７細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種した。ヒト細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、３日後に細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種した。ニワトリ細胞株は培養開始から２１日、４２日、６３日、８４日、１０５日及び１２６日後に、ヒト細胞株は１０日及び２０日後にそれぞれ細胞を回収し、染色体標本を作製した。
（４）染色体解析
ニワトリ細胞における人工染色体の検出は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いたＦＩＳＨ法により行った。間期核５００個においてヒト染色体を有無を観察し、保持率を算出した。ヒト細胞における人工染色体の検出は、黒木ら（細胞工学ハンドブック，羊土社，１９９２）に記された方法に従いギムザ染色法により行った。分裂中期染色体像２０個においてミニ染色体の有無を観察して保持率を算出し、４クローンの平均値を出した。その結果を表１に示す。
Figure 2010004887
ヒト２１番染色体部分断片は、ＤＴ４０細胞内では非選択培養条件下で分裂回数２００回を越えても安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像１００個を観察して細胞あたりのヒト染色体数を数えたところ、例外なく１本が認められた。一方ＨＴ１０８０細胞株の培養は継続中であるが、現時点（分裂回数２２回）ではヒト２１番染色体部分断片は選択培養条件で安定に保持されている。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２本の染色体部分が認められた。
以上の（３）及び（４）の実験により、ヒト２１番染色体の長腕遠位を削除した部分断片はＤＴ４０細胞株及びＨＴ１０８０細胞株において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
〔実施例５〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへのＧＦＰ遺伝子挿入
図８に、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへＧＦＰ遺伝子を挿入する方法を示した。実施例１〜４に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にｌｏｘＰサイトを導入したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを用意した。一方でｌｏｘＰ配列を含むＧＦＰ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。
（１）ｌｏｘＰ配列を含むＧＦＰ発現プラスミドの構築
ＧＦＰ発現ベクターＰＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）を制限酵素ＧｂＬＩＩ及びＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で消化して４．７ｋｂのＤＮＡ断片を単離／精製し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）により自己環状化した。大腸菌ＤＨ５αの形質転換により組換えプラスミドを単離し、マルチクローニングサイト内のＧｂＬＩＩからＢａｍＨＩまでの５１ｂｐを欠失したプラスミド（ＰＥＧＦＰ−Ｃ１Δ）を得た。このＰＥＧＦＰ−Ｃ１Δを鋳型とし、ＥＧＦＰ遺伝子の発現ユニットをＰＣＲにより増幅した。
ＧｅｎＢａｎｋのデータベースより入手した塩基配列（アクセッション番号Ｕ５５７６３）をもとに作製したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
EcoGFP5：5' - GGCCGAATTCCGTATTACCGCCATGCAT（配列番号２１）
BamGFP3：5' - CCGGGATCCCACAACTAGAATGCAGTG（配列番号２２）
増幅したＥＧＦＰ遺伝子の発現ユニットの両端を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で消化して突出末端とし、ｌｏｘＰ配列とｈＣＭＶプロモーターを備えたプラスミドベクターＰＢＳ２２６（ライフテック）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。
（２）トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
実施例３で作製したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ７９−１）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのリン酸バッファー（ＰＢＳ）に懸濁した。１０μｇのＰＢＳ２２６／ＥＧＦＰプラスミドと２０μｇのＣｒｅ酵素発現ベクターＰＢＳ１８５（ライフテック）存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに７５０Ｖで印加し電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグルＦ１２培地（以下Ｆ１２という；インビトロジェン製）を含む１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）１０枚に播種した。２日後に８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（GENETICIN，シグマ）と８μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Blasticidin S Hydrochloride，フナコシ）を含む培地と置き換えた。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＣＨＯ細胞５×１０６あたり２０個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（３）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＧＦＰ遺伝子の発現
単離したＧ４１８／ブラストサイジン耐性ＣＨＯ株を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果１９クローンでＧＦＰの発現が確認された。代表的な蛍光顕微鏡像を図９に示す。
（４）相同組換え体の確認
相同組換え体を確認するため、サザンブロット解析を行った。サザンブロット解析はＧ４１８耐性遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の一部をプローブとして、制限酵素ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で処理した約５μｇのゲノムＤＮＡに対して行った。ＧＦＰプローブはプラスミドＰＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＧｂＬＩＩ（ニッポンジーン）により消化して得た８４９ｂｐの断片を調製して用いた。Ｇ４１８耐性遺伝子のプローブはプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏを制限酵素ＧｂＬＩＩ及びＳｍａＩ（ニッポンジーン）により消化し、１０００ｂｐの断片を調製して用いた。プローブは３２Ｐにより標識し、シグナルはイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム）により検出した。図１０にその結果の一例を示す。図１０ではＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡをｎｅｏプローブによって検出している。レーン１はインサート挿入前のＤＴ４０株、レーン２以降はＧ４１８耐性ＤＴ４０株を示す。挿入前のアレルでは５．７ｋｂ、挿入後のアレルでは６．９ｋｂのシグナルが検出される。
以上の（１）〜（４）の実験より、解析したＧ４１８耐性株１９株のうち１８株で相同組換えのアレルが検出された。このうち５株では相同組換えのアレルに加えて組換え前のアレルが、１株でランダム挿入のアレルが検出された。したがって目的とする組換え体が得られた頻度は１２／１９（６３％）となる。
〔実施例６〕ヒト２１番染色体短腕の削除
（１）テロメア短縮のためのコンストラクト構築
ヒト２１番染色体の短腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクターはＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｐｕｒｏ（Kuroiwa, Nucleic Acids Res.,26:3447, 1998）を改変して構築した。ＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｐｕｒｏよりピューロマイシン耐性遺伝子の発現ユニット１．７ｋｂを制限酵素ＮｏｔＩの断片として取り除き、末端をT4 DNA Polymerase（DNA Blunting kit，宝酒造）により平滑化した（ＰＢＳ−ＴＥＬベクター）。PGKhygro/ΔLT20を制限酵素ＣｌａＩ及びＳｍａＩ（ニッポンジーン）により消化し、ＰＧＫプロモーター制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを１．８ｋｂの断片として単離・精製し、ＰＢＳ−ＴＥＬベクターにクローニングした（ＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｈｙｇｒｏ）。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースより得たヒト２１番染色体長腕近位の塩基配列（登録番号ＡＬ１６３２０１）から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをＰＣＲ増幅するための、制限酵素ＳｐｅＩないしＢａｍＨＩの認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
Spe31203 : 5'- GCACTAGTCTGGCACTCCTGCATAAACA（配列番号２３）
Bam36192 : 5'- CTAAGGATCCATTTCAGCCTGTGGGAATCA（配列番号２４）
ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として標的配列をＰＣＲにより増幅した。これを制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）で消化して、突出末端をもつ約５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これをＰＢＳ−ＴＥＬ／ＨｙｇｒｏプラスミドのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩサイトにクローニングした。最終的なＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｈｙｇｒｏコンストラクトのサイズは約５．８ｋｂである。テロメアトランケーションベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図１１に示した。
（２）トランスフェクション及びハイグロマイシン耐性クローンの単離
ＰＢＳ−ＴＥＬ／Ｈｙｇｒｏコンストラクトを制限酵素ＢａｍＨＩ（ニッポンジーン）により消化して線状化し、長腕遠位を削除してｌｏｘＰサイトを組み込んだヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞（ＤＴ４０（＃２１）ｂｓｄ７９）に導入した。ＤＴ４０雑種細胞１×１０７を０．７５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、２５μｇ ＤＮＡ存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量２５μＦのコンデンサに７５０Ｖで印加し電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ニワトリ血清（ＣｈＳ）及び５０μＭ ２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地（インビトロジェン製）に懸濁し、９６穴クラスター（ファルコン）５枚に播種した。２日後に終濃度１．５ｍｇ／ｍｌとなるようハイグロマイシン（Hygromycin-B，和光純薬）を加えた。２〜３週間後には耐性コロニーが出現した。計２回のトランスフェクションから合計６３個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（３）相同組換え体の選別とテロメア短縮の確認
（３−１）ＰＣＲ解析
ハイグロマイシン耐性ＤＴ４０株から相同組換え体を選別するための１次スクリーニングとしてＰＣＲ解析を行った。ハイグロマイシン耐性株より抽出したゲノムＤＮＡ約０．１μｇを鋳型としてヒト２１番染色体の短腕近位に位置するＳＴＳマーカー（ｐＣＨＢ，Ｄ２１Ｓ１８８，Ｄ２１Ｓ２７５）を増幅した。その代表的な結果を図１２に示す。図１２には、左側にヒト２１番染色体のＧバンド像に基づく模式的な染色体地図を、またマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した。ハイグロマイシン耐性ＤＴ４０株について、ＰＣＲにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは■で、検出されなかったマーカーを□で示した。ＤＴ４０（＃２１）は、テロメアトランケーションを行う前の細胞である。テロメアトランケーションにより短腕遠位が削除された場合、Ｄ２１Ｓ２７５を保持し、Ｄ２１Ｓ１８８及びｐＣＨＢを保持しないことが予想される。Ｄ２１Ｓ１８８ないしｐＣＨＢのいずれかを増幅しない４５株を選別し、サザンブロット解析を行った。
（３−２）サザンブロット解析
相同組換えの標的配列内にプローブを設定した。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト２１番染色体を保持するＤＴ４０雑種細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅、単離、精製した。
#21p91203：5'- CTGGCACTCCTGCATAAACA（配列番号２５）
#21p91976：5'- TCTGTGTTCCCCTTCTCTGA（配列番号２６）
ハイグロマイシン耐性株から抽出したゲノムＤＮＡ約１０μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ニッポンジーン）により消化し、サザンブロット解析を行った。塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で５．８ｋｂ、野生型（非組換え体）で１．９ｋｂであり、１次スクリーニングで見出した候補４５クローンのうち２クローンが相同組換え体であることを確認した（図１３）。
（３−３）ＰＣＲ法
組換えの標的部位を夾んだ配列をＰＣＲにより増幅した。ヒト２１番染色体上とターゲティングベクター上に設定したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
Hyg968：5'- AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC（配列番号２７）
#21p96705：5'- AGTTAGCCTACCTTTTGGCCATCC（配列番号２８）
増幅産物のサイズは５．９ｋｂであり、これを制限酵素ＮｓｉＩにより消化すると、１．４ｋｂ、２．６ｋｂ及び１．９ｋｂの断片が生じると予想される（図１１）。サザンブロット解析で相同組換えアレルが確認された２クローンでのみＰＣＲ増幅が認められ、制限酵素消化による部分断片の生成を確認した（図１４）。
（３−４）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。その結果観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された（図１５ａ及びｂ）。
以上の（１）〜（３）の実験より、得られたハイグロマイシン耐性６３株のうち２株が短腕削除により短縮したヒト２１番染色体を保持することが確かめられた。
〔実施例７〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへのＥＰＯ遺伝子挿入
実施例５に記載のＧＦＰ遺伝子の場合と同様にして、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへヒトＥＰＯ遺伝子を挿入する。実施例１〜４に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にｌｏｘＰサイトを導入したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを用意した。一方でｌｏｘＰ配列を含むヒトＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。
（１）ｌｏｘＰ配列を含むヒトＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯの構築
プラスミド構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
SV40polyANp1：5'- CGG GAT CCC TCG AGC GAG ACA TGA TAA GAT ACA TTG ATG -3’（配列番号２９）
SV40polyARp1：5'- GGA AGA TCT TCC TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG -3’（配列番号３０）
これらのプライマーは、プラスミドベクターｐＳＴｎｅｏＢ（加藤ら、Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987）の塩基配列を基にして作製した。
CMVNp3：5'- CGG AAT TCC GGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT TAT TAA TAG -3'（配列番号３１）
CMVRp1：5'- CGG GAT CCC GGG TGT CTT CTA TGG AGG TCA AAA CAG -3’（配列番号３２）
これらのプライマーは、ｐＢＳ２２６のＣＭＶプロモーター塩基配列を基にして作製した。
hEPONp1：5'-CGG GAT CCC GGC CAC CAT GGG GGT GCA CGA ATG TC -3’（配列番号３３）
hEPORp1：5'-CGC TCG AGC GCT ATC TGT CCC CTG TCC TGC AGG -3’（配列番号３４）
これらのプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列（アクセッション番号Ｉ０５３９７）を基に作製した。
ｐＳＴｎｅｏＢを鋳型としてSV40polyANp1（配列番号２９）及びSV40polyARp1（配列番号３０）を用いてＰＣＲ増幅したＳＶポリＡ付加ユニットの両端を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ（宝酒造）で消化して突出末端とし、ｌｏｘＰ配列とｈＣＭＶプロモーターを備えたプラスミドベクターｐＢＳ２２６（ライフテック）のＢａｍＨＩサイトにクローニングした。これをｐＢＳ２２６-ｐＡとした。
次に、ｐＢＳ２２６を鋳型としてCMVNp3（配列番号３１）及びCMVRp1（配列番号３２）を用いてＰＣＲ増幅したＣＭＶプロモーターユニットの両端を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造）で消化して突出末端とし、ｐＢＳ２２６−ｐＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイト間へクローニングした。これをｐＬＮ１とした。
最後に、ヒトＥＰＯｃＤＮＡを鋳型としてhEPONp1（配列番号３３）及びhEPORp1（配列番号３４）を用いてＰＣＲ増幅したヒトＥＰＯコード領域の両端を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造）で消化して突出末端とし、ｐＬＮ１のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイト間へクローニングした。これをｐＬＮ１−ＥＰＯとした。
（２）トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
実施例３で作製したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ７９−１）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。上記（１）で作製したｐＬＮ１−ＥＰＯベクター１０μｇとＣｒｅ酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ライフテック）１０μｇの存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグルＦ１２培地（以下Ｆ１２という；インビトロジェン製）を含む４８穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）４枚に播種した。２日後に８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（GENETICIN、インビトロジェン）と８μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Blasticidin S Hydrochloride，フナコシ）を含む培地と置き換えた。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＣＨＯ細胞５×１０６あたり２８個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。この細胞を以後ＫＨ２１Ｅ細胞と称する。
（３）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＥＰＯ遺伝子の発現
ヒトＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
単離したＧ４１８／ブラストサイジン耐性ＫＨ２１Ｅ細胞１９クローン中６クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と８μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＦ１２培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、６日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを定量した。その結果を表２に示す。
Figure 2010004887
以上の結果から、６クローン全てにおいてヒトＥＰＯの発現が確認された。
（４）ＫＨ２１Ｅ細胞により産生されたヒトＥＰＯの生物活性
産生されたヒトＥＰＯの生物活性について、ヒトＥＰＯ依存的増殖を示すヒト白血病細胞株ＵＴ７-ＥＰＯ細胞（自治医科大学 小松 則夫 先生より入手）の増殖活性を指標にして解析した。ＫＨ２１Ｅ細胞の２株（＃Ｃ２及び＃Ｃ１８）について培養上清を表２の定量値を基にＥＰＯ終濃度０．０１，０．１，１，５，２０，１００ｍＩＵ／ｍｌとなるように加えた１０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ培地（インビトロジェン製）０．１ｍｌをいれた９６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）にＵＴ７-ＥＰＯ細胞５×１０３を播種した。３日間培養後、細胞増殖測定キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ，プロメガ）により細胞増殖を解析した。
その結果を図１６に示す。２クローンの培養上清を添加した場合、ともに組換え体ヒトＥＰＯタンパク質（ｒｈＥＰＯ；キリンビール）添加時と同様の用量依存的な吸光度の増加が認められた（図１６、Ｃ２及びＣ８）。
以上の結果から、培養上清中に産生されたヒトＥＰＯは、組換え体ヒトＥＰＯタンパク質と同等の生物活性を保持することが確認された。
〔実施例８〕ＫＨ２１Ｅ細胞の移入染色体の確認
本実施例においては、実施例７の（２）において作製されたＫＨ２１Ｅ細胞の各クローンについて、ＰＣＲ及びＦＩＳＨ解析により移入染色体の確認を行った。
（１）ＰＣＲ解析
ｌｏｘＰサイト近傍に位置するヒト２１番染色体長腕近位のマーカーＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子と遠位に位置するＤ２１Ｓ２６５マーカー（実施例１の（３）、図２参照）についてＰＣＲ増幅を行った。ｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応によるヒトＥＰＯ遺伝子挿入体は、ＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子を保持しＤ２１Ｓ２６５マーカーを保持しないことが予想される。その結果、Ｇ４１８耐性ＣＨＯ細胞２２クローンのうち２１クローンにおいて予想された増幅が認められた。上記の２１クローンに対して、ヒト２１番染色体の短腕近位に位置するＳＴＳマーカー（ｐＣＨＢ，Ｄ２１Ｓ１８７，Ｄ２１Ｓ２７５）につきＰＣＲ増幅を行った（実施例６の（３）、図１２参照）。ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターの短腕は残してあるので、全てのマーカーが保持されていることが予想される。その結果、１５クローンにおいて予想された増幅が認められた。
（２）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。上記（１）のＰＣＲ解析において全てのマーカーで予想される増幅を示したクローンのうち、８クローンについて解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。その結果を表３に示す。尚、表３中のクローンＫＨ２１は、実施例３で作製したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ７９−１）を表す。
Figure 2010004887
以上より、宿主であるＣＨＯ細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト２１番染色体がＣＨＯ細胞に移入されたことが確認された。
以上の（１）及び（２）の実験から、得られたＧ４１８耐性ＣＨＯ株（ＫＨ２１Ｅ細胞）は長腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
〔実施例９〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへの複数ＥＰＯ遺伝子挿入
本実施例においては、実施例７に記載のヒトＥＰＯ遺伝子の場合と同様にして、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへ複数のヒトＥＰＯ遺伝子を挿入した。実施例１〜４に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にｌｏｘＰサイトを導入したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを用意した。一方でｌｏｘＰ配列を含むヒトＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。
（１）ｌｏｘＰ配列を含む２コピーヒトＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ２の構築
プラスミド構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
EPOnF：5'- GGA ATT CCG GGC CCA CGC GTG ACA TTG ATT ATT GA -3’（配列番号３５）
SVpAR：5'- GGA ATT CCT GAT CAT AAT CAG CCA TAC CAC ATT TG -3’（配列番号３６）
EPOnFプライマー（配列番号３５）は、５'側から順にＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ、ＭｌｕＩの制限酵素認識配列及びＣＭＶプロモーターの５'側部分配列を有し、ｐＢＳ２２６のＣＭＶプロモーター塩基配列を基にして作製した。SVpARプライマー（配列番号３６）は、５'側から順にＥｃｏＲＩ、ＢｃｌＩの制限酵素認識配列及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットの３'側部分相補鎖配列を有し、プラスミドベクターｐＳＴｎｅｏＢ（加藤ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ，１２:５７５−５８０， １９８７）の塩基配列を基にして作製した。
実施例７にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ（宝酒造）で消化して得たＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットを含むＤＮＡ断片を鋳型として、EPOnF（配列番号３５）及びSVpAR（配列番号３６）プライマーを用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）にてＰＣＲ増幅を行った。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲサイクルは、９４℃２分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、及び伸長６８℃分９０秒を３０サイクル行った。得られたＤＮＡ断片の両端を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化して突出末端とし、プラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯのＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。クローン化されたインサートＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（ＰＲＩＳＭ３７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析し、鋳型に用いたｐＬＮ１−ＥＰＯ塩基配列の相当する部分と同一であることを確認した。得られたクローンのうち、ＣＭＶプロモーター及びヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットが順方向に２コピー並んでいるプラスミドベクターをｐＬＮ１−ＥＰＯ２とした。
（２）ｌｏｘＰ配列を含む４コピーヒトＥＰＯ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ４の構築
上記（１）にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ２をＸｂａＩ（宝酒造）で消化して直鎖化した後、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）にて平滑末端化し、ＡｐａＩ（宝酒造）で消化してＣＭＶプロモーター及びヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットを２コピー含むインサート用ＤＮＡ断片を得た。プラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ２をＭｌｕＩ（宝酒造）で消化した後ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡）にて平滑末端化し、ＡｐａＩ（宝酒造）で消化して出来たＡｐａＩ−平滑末端化ＭｌｕＩサイト間へ上記のインサート用ＤＮＡ断片をクローニングした。このヒトＥＰＯ遺伝子を４コピー含むプラスミドベクターをｐＬＮ１−ＥＰＯ４とした。
（３）トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
実施例３で作製したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｂｓｄ７９−１）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。上記（１）又は（２）で作製したｐＬＮ１−ＥＰＯ２ベクター又はｐＬＮ１−ＥＰＯ４ベクター１０μｇとＣｒｅ酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ライフテック）１０μｇの存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグルＦ１２培地（以下Ｆ１２という；インビトロジェン製）を含む４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）５枚に播種した。２日後に８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ、インビトロジェン）と８μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，フナコシ）を含む培地と置き換えた。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＣＨＯ細胞５×１０６あたり、ｐＬＮ１−ＥＰＯ２を用いた場合には１４個、ｐＬＮ１−ＥＰＯ４を用いた場合には２４個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。これらの細胞を以後、ｐＬＮ１−ＥＰＯ２を用いて作製した細胞はＫＨ２１Ｅ２細胞、ｐＬＮ１−ＥＰＯ４を用いて作製した細胞はＫＨ２１Ｅ４細胞と称する。
（４）ヒトＥＰＯ遺伝子組換え挿入体の確認
組換え挿入体の選別は、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにヒトＥＰＯ遺伝子供与ベクター由来配列上及びＨＡＣベクター上にプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅により確認した。また、挿入されたヒトＥＰＯ遺伝子のコピー数を、プラスミドベクターｐＢＳ２２６上のプライマーとＨＡＣベクター上にプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅により確認した。
以下にＰＣＲ増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示す：
SVpANp1：5'- TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA -3’（配列番号３７）
このプライマーは、プラスミドベクターｐＳＴｎｅｏＢ（加藤ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ，１２:５７５−５８０， １９８７）の塩基配列を基にして作製した。
Neo Rp2：5'- AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC -3’（配列番号３８）
このプライマーは、プラスミドベクターｐＳＦ１（ライフテック）のｎｅｏ遺伝子の塩基配列を基にして作製した。
M13RV：5'- CAG GAA ACA GCT ATG AC -3’（配列番号３９）
このプライマーは、プラスミドベクターｐＢＳ２２６（ライフテック）の塩基配列を基にして作製した。
ｐＬＮ１−ＥＰＯ２又はｐＬＮ１−ＥＰＯ４ベクター由来のＳＶ４０ポリＡ付加配列領域に設計したSVpANp1プライマー（配列番号３７）及びＨＡＣベクター上のｐＳＦ１由来のネオマイシン耐性遺伝子中に設計したNeo Rp2プライマー（配列番号３８）を用いてＰＣＲ増幅を行った。組換え挿入体の場合は、ｐＬＮ１−ＥＰＯ２又はｐＬＮ１−ＥＰＯ４ベクター由来のＳＶ４０ポリＡ付加配列からｌｏｘＰ配列までとｐＳＦ１由来のｌｏｘＰ配列からｎｅｏ遺伝子の一部までを含む約１．０ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、ＫＨ２１Ｅ２細胞６クローン及びＫＨ２１Ｅ４細胞６クローン全てにおいて予想される増幅が確認された
以上より、上記の１２クローンは全てｌｏｘＰ配列への組換え挿入体であることが確認された。
次に、ＫＨ２１Ｅ２細胞６クローンについて、Neo Rp2プライマー（配列番号３８）及びプラスミドベクターｐＢＳ２２６由来のM13RVプライマー（配列番号３９）を用いてＰＣＲ増幅を行った。組換え挿入体の場合は、ｐＬＮ１−ＥＰＯ２ベクター由来のＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子、及びＳＶ４０ポリＡ付加配列を２コピー含む領域からｌｏｘＰ配列までとｐＳＦ１由来のｌｏｘＰ配列からｎｅｏ遺伝子の一部までを含む約３．８ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、全てのクローンにおいて予想される増幅が確認された。
以上より、上記のＫＨ２１Ｅ２細胞６クローンには、ＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加配列を含むインサートＤＮＡが２コピー挿入されていることが確認された。
（５）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＥＰＯ遺伝子の発現
ヒトＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
（５−１）ＫＨ２１Ｅ２細胞におけるＥＰＯ遺伝子の発現
単離したＧ４１８／ブラストサイジン耐性ＫＨ２１Ｅ２細胞１４クローン中６クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と８μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＦ１２培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、６日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを２×１０−５希釈にて定量した。その結果を表４に示す。
Figure 2010004887
（５−２）ＫＨ２１Ｅ４細胞におけるＥＰＯ遺伝子の発現
また、単離したＧ４１８／ブラストサイジン耐性ＫＨ２１Ｅ４細胞２４クローン中６クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と８μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＦ１２培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、６日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを２×１０−５希釈にて定量した。その結果を表５に示す。
Figure 2010004887
（５−３）ＫＨ２１Ｅ細胞におけるＥＰＯ遺伝子の発現
また、比較対照用として、実施例７において単離した、ヒトＥＰＯ遺伝子をヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上に１コピー保持するＧ４１８／ブラストサイジン耐性ＫＨ２１Ｅ細胞５クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と８μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＦ１２培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、６日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｒ＆Ｄシステム）により、細胞培養上清中のヒトＥＰＯを定量した。その結果を表６に示す。ただし、Ｃ１及びＣ４は１×１０−４希釈にて、Ｃ９、Ｃ１１及びＣ２０は１×１０−５希釈にて定量した。
Figure 2010004887
以上の表４〜６の結果から、ＫＨ２１Ｅ２細胞６クローン及びＫＨ２１Ｅ４細胞６クローン全てにおいてヒトＥＰＯの発現が確認された。またヒトＥＰＯの発現は、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへ挿入したヒトＥＰＯ遺伝子のコピー数と相関したことから、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターは挿入した遺伝子のコピー数依存的に発現制御出来ることが明らかになった。
〔実施例１０〕長腕遠位及び短腕遠位削除ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへのＥＰＯ遺伝子挿入
実施例７に記載のヒトＥＰＯ遺伝子の場合と同様にして、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへヒトＥＰＯ遺伝子を挿入する。実施例１〜４及び６に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にｌｏｘＰサイトを導入し、かつテロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを用意した。一方でｌｏｘＰ配列を含むヒトＥＰＯ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。
（１）トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
後述する実施例１７で作製したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞２株：ＣＨＯ＃２１ｈｙｇ４及びＣＨＯ＃２１ｈｙｇ８（以後それぞれＨ４細胞及びＨ８細胞と称する）に対しトリプシン処理を行い、それぞれ５×１０６細胞を０．８ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。実施例７（１）で作製したｐＬＮ１−ＥＰＯベクター１０μｇとＣｒｅ酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ライフテック）１０μｇの存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグルＦ１２培地（以下Ｆ１２という；インビトロジェン製）を含む４８穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）５枚に播種した。２日後に８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ、インビトロジェン）及び８μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，フナコシ）を含む選択培地と置き換えた。２〜３週間後にはＧ４１８耐性及びブラストサイジン耐性コロニーが出現し、Ｈ４細胞又はＨ８細胞を宿主としたそれぞれから２４個ずつコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。これらの細胞を以後、Ｈ４を用いて作製した細胞はＨ４Ｅ細胞、Ｈ８を用いて作製した細胞はＨ８Ｅ細胞と称する。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
ｌｏｘＰサイト近傍に位置するヒト２１番染色体長腕近位のマーカーＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子と遠位に位置するＤ２１Ｓ２６５マーカー（実施例１の（３）、図２参照）についてＰＣＲ増幅を行った。ｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応によるヒトＥＰＯ遺伝子挿入体は、ＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子を保持しＤ２１Ｓ２６５マーカーを保持しないことが予想される。その結果、Ｈ４Ｅ細胞２２クローンのうち２１クローンにおいて予想された増幅が認められた。これら２１クローンに対して、ヒト２１番染色体の短腕近位に位置するＳＴＳマーカー（ｐＣＨＢ，Ｄ２１Ｓ１８７，Ｄ２１Ｓ２７５）につきＰＣＲ増幅を行った（実施例６の（３）、図１２参照）。ヒト２１番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、ｐＣＨＢ及びＤ２１Ｓ１８７マーカーを保持せず，Ｄ２１Ｓ２７５マーカーを保持することが予測される。その結果、１５クローンにおいて予想された増幅が認められた。
（２−２）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。上記（２−１）のＰＣＲ解析において全てのマーカーについて予想される増幅を示したクローンのうち、６クローンについて解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。その結果を表７に示す。以上より、宿主であるＣＨＯ細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト２１番染色体がＣＨＯ細胞に移入されたことが確認された。
Figure 2010004887
以上の（２−１）及び（２−２）の実験から、得られたＧ４１８耐性及びブラストサイジン耐性ＣＨＯ株は長腕遠位及び短腕遠位を削除しｌｏｘＰ配列を挿入したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
（３）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＥＰＯ遺伝子の発現
ヒトＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
（３−１）Ｈ４Ｅ細胞におけるＥＰＯ遺伝子の発現
単離したＧ４１８及びブラストサイジン耐性Ｈ４Ｅ細胞２４クローン中１０クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と８μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＦ１２培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、６日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを定量した。その結果を表８に示す。
Figure 2010004887
（３−２）Ｈ８Ｅ細胞におけるＥＰＯ遺伝子の発現
また、単離したＧ４１８及びブラストサイジン耐性Ｈ８Ｅ細胞２４クローン中６クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した８００μｇ／ｍｌのＧ４１８と８μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＦ１２培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、６日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを定量した。その結果を表９に示す。
Figure 2010004887
以上の表８及び９結果から、Ｈ４Ｅ細胞１０クローン及びＨ８Ｅ細胞６クローン全てにおいてヒトＥＰＯの発現が確認された。
〔実施例１１〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのマウスＡ９細胞への移入
（１）微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例１７で得られた、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞：ＣＨＯ＃２１ｈｙｇ４及びＣＨＯ＃２１ｈｙｇ８（以後それぞれＨ４細胞及びＨ８細胞と称する）を用いた。染色体受容細胞としてはマウスＡ９細胞（Oshimuraら、Environ. Health Perspect. 93:57, 1991，登録番号ＪＣＲＢ０２１１）を用いた。はじめに約１０７個のＨ４細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）２４本に細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＨ４又はＨ８細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，８００μｇ／ｍｌＧ４１８，Ｆ１２）中で５日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Phytohemaggulutinin-P，Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。マウスＡ９細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え、３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１０００（終濃度５０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）及びＤＭＳＯ（終濃度７％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過した溶液で１分間かけて融合した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）２枚に播種した。２日後にブラストサイジン（４μｇ／ｍｌ）又はハイグロマイシン（７００μｇ／ｍｌ、インビトロジェン）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）と置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。７回の微小核細胞融合から２２個の薬剤耐性コロニーを得た。上記で得られた細胞を以後Ａ９Δ細胞と称する。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
上記（１）において得られたコロニーのうち２１クローンについて解析した。ｌｏｘＰサイト近傍に位置するヒト２１番染色体長腕近位のマーカーＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子と遠位に位置するＤ２１Ｓ２６５マーカー（実施例１の（３）、図２参照）についてＰＣＲ増幅を行った。ＨＡＣベクター移入体は、ＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子を保持しＤ２１Ｓ２６５マーカーを保持しないことが予想される。その結果、２０クローンにおいて予想された増幅が認められた。
次に、ヒト２１番染色体の短腕近位に位置するＳＴＳマーカー（ｐＣＨＢ，Ｄ２１Ｓ１８７，Ｄ２１Ｓ２７５）につきＰＣＲ増幅を行った（実施例６の（３）、図１２参照）。ヒト２１番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、ｐＣＨＢ及びＤ２１Ｓ１８７マーカーを保持せず，Ｄ２１Ｓ２７５マーカーを保持することが予測される。その結果、１８クローンにおいて予想された増幅が確認された。
（２−２）薬剤選択培養
ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子（短腕遠位）及びブラストサイジン耐性遺伝子（長腕近位）が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
上記（２−１）において予想される増幅を示した９クローンについて、６ウェル組織培養用プレート（ファルコン）各ウェルにて細胞密度が６０〜７０％飽和程度までブラストサイジン（４μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）で培養した。ＰＢＳ（インビトロジェン）で２回リンスした後、ハイグロマイシン（７００μｇ／ｍｌ）のみ、又はブラストサイジン（４μｇ／ｍｌ）及びハイグロマイシン（７００μｇ／ｍｌ）を含む培養液で１週間培養した。その結果を表１０に示す。
Figure 2010004887
以上より、全てのクローンにおいてブラストサイジン及びハイグロマイシン耐性を確認した。
（２−３）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。上記（２−１）のＰＣＲ解析において全てのマーカーで予想される増幅を示し、上記（２−２）においてブラストサイジン耐性かつハイグロマイシン耐性を示した２クローンについて解析したところ、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。その結果を表１１に示す。
Figure 2010004887
以上より、宿主であるマウスＡ９細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト２１番染色体がマウスＡ９細胞に移入されたことが確認された。以後上記で得られた細胞２クローンをＡ９Δ１１及びＡ９Δ１２細胞と称する。
以上の（２−１）から（２−３）の実験より、得られたブラストサイジン及びハイグロマイシン耐性の２株が長腕及び短腕を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
〔実施例１２〕マウスＡ９細胞へのヒトＥＰＯ遺伝子を挿入したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター移入
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例１０で得られた、ヒトＥＰＯ遺伝子を１コピー挿入した、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞のうち微小核形成能が高いクローン（Ｈ４Ｅ Ｃ１０又はＣ１５又はＣ１６細胞）を用いた。染色体受容細胞としては、マウスＡ９細胞（Oshimuraら、Environ.Health Perspect. 93:57, 1991，登録番号ＪＣＲＢ０２１１）を用いた。はじめに約１０８個のＨ４ＥＣ１５又はＣ１６細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）２４本に細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＨ４Ｅ Ｃ１５又はＣ１６細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，８００μｇ／ｍｌＧ４１８，Ｆ１２）中で４日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ，Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。マウスＡ９細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え、３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１０００（終濃度５０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）及びＤＭＳＯ（終濃度７％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過した溶液で１分間かけて融合した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）２枚に播種した。２日後にブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）又はＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）と置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。１２回の微小核細胞融合から３９個のＧ４１８耐性コロニーを得た。上記で得られた細胞を以後ＡΔＥ細胞と称する。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
上記（１）において得られたコロニーのうち２５クローンについて解析した。ｌｏｘＰサイト近傍に位置するヒト２１番染色体長腕近位のマーカーＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子と遠位に位置するＤ２１Ｓ２６５マーカー（実施例１の（３）、図２参照）についてＰＣＲ増幅を行った。ｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応によるヒトＥＰＯ遺伝子挿入体は、ＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子を保持しＤ２１Ｓ２６５マーカーを保持しないことが予想される。その結果、２４クローンにおいて予想された増幅が認められた。これら２４クローンに対して、ヒト２１番染色体の短腕近位に位置するＳＴＳマーカー（ｐＣＨＢ，Ｄ２１Ｓ１８７，Ｄ２１Ｓ２７５）につきＰＣＲ増幅を行った（実施例６の（３）、図１２参照）。ヒト２１番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、ｐＣＨＢ及びＤ２１Ｓ１８７マーカーを保持せず、Ｄ２１Ｓ２７５マーカーを保持することが予測される。その結果、１９クローンにおいて予想された増幅が確認された。
（２−２）薬剤選択培養
ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子（短腕遠位）、ブラストサイジン耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子（長腕近位）が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
上記（２−１）において予想される増幅を示したうち７クローンについて、６ウェル組織培養用プレート各ウェルにて細胞密度が６０〜７０％飽和程度までＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）又はブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）で培養した。ＰＢＳ（インビトロジェン）で２回リンスした後、ブラストサイジン及びハイグロマイシン（７００μｇ／ｍｌ）及びＧ４１８を含む培養液で１週間又は１０日間培養した。その結果を表１２に示す。
Figure 2010004887
以上より、７クローンにおいてブラストサイジン及びハイグロマイシン及びＧ４１８の三重薬剤耐性を確認した。
（２−３）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。上記（２−１）のＰＣＲ解析において全てのマーカーで予想される増幅を示した７クローンについて解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。その結果を表１３に示す。
Figure 2010004887
以上より、宿主であるマウスＡ９細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト２１番染色体がマウスＡ９細胞に移入されたことが確認された。
以上の（２−１）から（２−３）の実験より、得られた上記ＡΔＥ細胞が、ヒトＥＰＯ遺伝子を挿入し長腕及び短腕を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
（３）ヒトＥＰＯ遺伝子組換え挿入体の確認
組換え挿入体の選別は、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにヒトＥＰＯ遺伝子供与ベクター由来配列上及びＨＡＣベクター上にプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅により確認した。
ＡΔＥ細胞１２クローンについて、実施例９（４）に示したNeo Rp2プライマー（配列番号３８）及びプラスミドベクターｐＢＳ２２６由来のM13RVプライマー（配列番号３９）を用いてＰＣＲ増幅を行った。組換え挿入体の場合は、ｐＬＮ１−ＥＰＯベクター由来のＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ付加配列を含む領域からｌｏｘＰ配列までとｐＳＦ１由来のｌｏｘＰ配列からｎｅｏ遺伝子の一部までを含む約２．３ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、１２クローン全てにおいて予想される増幅が確認された。
以上より、上記のＡΔＥ細胞クローンは、ＣＭＶプロモーター及びヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加配列を含むインサートＤＮＡをコピー挿入されたヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確認された。
（４）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＥＰＯ遺伝子の発現
ヒトＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
単離したＡΔＥ細胞４クローンについて、各々１×１０５細胞を１０％ＦＢＳ添加した６００μｇ／ｍｌのＧ４１８と６μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＤＭＥＭ培地２ｍｌをいれた６穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）に播種した。コンフレント到達後、１０％ＦＢＳを添加したＦ１２培地２ｍｌに置き換え、４日間又は５日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを希釈なしにて定量した。その結果を表１４に示す。
Figure 2010004887
ＡΔＥ５１、ＡΔＥ４、ＡΔＥ１８は、培養上清中のヒトＥＰＯ濃度が上記ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，Ｒ＆Ｄシステム）の検出限界濃度以上であった。
以上より、上記のＡΔＥ細胞は、ヒトＥＰＯタンパク質を産生することが確認された。
〔実施例１３〕ヒト正常繊維芽細胞へのヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０）移入
（１）ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１へのＳＣ２０移入
（１−１）微小核細胞融合（プレート法）と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、ヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウスＡ９細胞（Ｃ１１−ＳＣ２０細胞、Tomizukaら，Nature Genet.（USA），第16巻，p.133-143，1997年）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。はじめに約１０７個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養したＣ１１−ＳＣ２０細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，８００μｇ／ｍｌＧ４１８，ＤＭＥＭ）中で４８時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Phytohemaggulutinin-P，Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。ＨＦＬ−１細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１５００（終濃度４５％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）及びＤＭＳＯ（終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過滅菌した溶液で１分間かけて融合した。１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）１枚に播種した。２日後にＧ４１８（３００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１５％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）に置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。３回の微小核細胞融合から２１個のＧ４１８耐性コロニーを得た。
（１−２）微小核細胞融合（サスペンション法）と薬剤耐性クローンの単離
上記（１−１）と同様にしてミクロセルを調製及び精製し、６ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁した。ＨＦＬ−１細胞を９０％飽和の状態まで１７５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）にて培養し、トリプシン処理にて分散した後、ＤＭＥＭで２回洗浄しＤＭＥＭ７ｍｌに再懸濁した。上記ミクロセル懸濁液に上記ＨＦＬ−１細胞懸濁液を重層し遠心後、上清を除きペレットをタッピングにて懸濁し、０．５ｍｌのＰＥＧ１５００（終濃度５０％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）を加え、１２０秒間にて融合した。ＤＭＥＭ５ｍｌを１ｍｌ／１分の速度で加え、さらにＤＭＥＭ５ｍｌ加えて３７℃１０分間静置後、遠心し１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に再懸濁してコラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）２枚に播種した。２日後にＧ４１８（３００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１５％ＦＢＳ，Ｆ１２）に置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。１回の微小核細胞融合から２個のＧ４１８耐性コロニーを得た。
（１−３）移入染色体の確認
（１−３−１）ＰＣＲ解析
移入染色体は，ＳＣ２０上に存在するｎｅｏ遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す：
421F：5'- TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA -3’（配列番号４０）
778R：5'- AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC -3’（配列番号４１）
これらのプライマーは、プラスミドベクターｐＳＴｎｅｏＢ（加藤ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ，１２:５７５−５８０， １９８７）の塩基配列を基にして作製した。
上記（１−１）及び（１−２）で得られたＧ４１８耐性細胞１２クローンについて、421Fプライマー（配列番号４０）及び778Rプライマー（配列番号４１）を用いたＰＣＲ増幅を行った。ＨＡＣベクター移入体は、ｎｅｏ遺伝子を保持することが予想される。その結果、全てのクローンにおいて予想された増幅が確認された。
（１−３−２）染色体解析
染色体解析は、黒木ら（細胞工学ハンドブック，羊土社，１９９２）に記された方法に従い、ギムザ染色にて行った。Ｇ４１８耐性のＨＦＬ−１細胞のうち２クローンについて分裂中期染色体像を解析した。その結果、Ｇ４１８耐性株では、親株のＨＦＬ−１には認められず、内在の１４番染色体よりサイズの小さいミニ染色体が観察された。
以上の（１−３−１）及び（１−３−２）の実験から、得られた上記のＧ４１８耐性ＨＦＬ−１株はＳＣ２０を保持することが確かめられた。
（２）ヒト正常繊維芽細胞ＨＵＣ−Ｆ２へのＳＣ２０移入
（２−１）微小核細胞融合（プレート法）と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、ヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウスＡ９細胞（Ｃ１１−ＳＣ２０細胞、Tomizukaら，Nature Genet.（USA），第16巻，p.133-143，1997年）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＵＣ−Ｆ２（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０４３６）を用いた。はじめに約１０７個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養したＣ１１−ＳＣ２０細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，８００μｇ／ｍｌＧ４１８，ＤＭＥＭ）中で４８時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。ＨＵＣ−Ｆ２細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１５００（終濃度４５％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）又はＰＥＧ１０００（終濃度４５％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）、及びＤＭＳＯ（終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過滅菌した溶液で１分間かけて融合した。１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）１枚に播種した。２日後にＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，αＭＥＭ）に置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。４回の微小核細胞融合から８個のＧ４１８耐性コロニーを得た。
（２−２）微小核細胞融合（サスペンション法）と薬剤耐性クローンの単離
上記（１−１）と同様にしてミクロセルを調製及び精製し、６ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁した。ＨＵＣ−Ｆ２細胞を９０％飽和の状態まで１７５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）にて培養し、トリプシン処理にて分散した後、ＤＭＥＭで２回洗浄しＤＭＥＭ７ｍｌに再懸濁した。上記ミクロセル懸濁液に上記ＨＵＣ−Ｆ２細胞懸濁液を重層し遠心後、上清を除きペレットをタッピングにて懸濁し、０．５ｍｌのＰＥＧ１５００（終濃度５０％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）を加え、１２０秒間にて融合した。ＤＭＥＭ５ｍｌを１ｍｌ／１分の速度で加え、さらにＤＭＥＭ５ｍｌ加えて３７℃１０分間静置後、遠心し１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地に再懸濁してコラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）２枚に播種した。２日後にＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，αＭＥＭ）に置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。１回の微小核細胞融合から６個のＧ４１８耐性コロニーを得た。
（２−３）移入染色体の確認
移入染色体は，ＳＣ２０上に存在するｎｅｏ遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。すなわち、上記（２−１）及び（２−２）で得られたＧ４１８耐性細胞７クローンについて、421Fプライマー（配列番号４０）及び778Rプライマー（配列番号４１）を用いたＰＣＲ増幅を行った。ＨＡＣベクター移入体は、ｎｅｏ遺伝子を保持することが予想される。その結果、全てのクローンにおいて予想された増幅が確認された。以上の実験から、得られたＧ４１８耐性ＨＵＣ−Ｆ２株はＳＣ２０を保持することが確かめられた。
（３）ヒト正常繊維芽細胞ＨＦ−１９へのＳＣ２０移入：微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、ヒト１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウスＡ９細胞（Ｃ１１−ＳＣ２０細胞、Tomizukaら，Nature Genet.（USA），第16巻，p.133-143，1997年）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦ−１９（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０２１０）を用いた。はじめに約１０７個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養したＣ１１−ＳＣ２０細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，８００μｇ／ｍｌＧ４１８，ＤＭＥＭ）中で４８時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ，Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。ＨＦ−１９細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１５００（終濃度４５％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）及びＤＭＳＯ（終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過滅菌した溶液で１分間かけて融合した。１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）１枚に播種した。２日後にＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，αＭＥＭ）に置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。１回の微小核細胞融合から１個のＧ４１８耐性コロニーを得た。
〔実施例１４〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのヒト正常繊維芽細胞への移入
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
（１−１）染色体供与細胞としてヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター保持ＣＨＯ細胞を用いた微小核細胞融合
染色体供与細胞として、実施例１０で得られた、ヒトＥＰＯ遺伝子を１コピー挿入した、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応によりヒトＥＰＯ遺伝子を挿入した、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞のうち微小核形成能が高いクローン（Ｈ４Ｅ Ｃ１０細胞）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。はじめに約１０８個のＨ４Ｅ Ｃ１０細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）４８本に細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＨ４Ｅ Ｃ１０細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，８００μｇ／ｍｌＧ４１８，Ｆ１２）中で４日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。ＨＦＬ−１細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１５００（終濃度４５％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）及びＤＭＳＯ（終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過滅菌した溶液で１分間かけて融合した。２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）１枚に播種した。２日後にＧ４１８（３００μｇ／ｍｌ）又はブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（２０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）に置き換えた。約３週間の選択培養を行った。出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。５回の微小核細胞融合から３個の薬剤耐性コロニーを得た。上記の細胞をＨＣΔＥ細胞と称する。
（１−２）染色体供与細胞としてヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター保持マウスＡ９細胞を用いた微小核細胞融合
染色体供与細胞として、実施例１２で得られた、ヒトＥＰＯ遺伝子を１コピー挿入した、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入した後テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応によりヒトＥＰＯ遺伝子を挿入した、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するマウスＡ９細胞のうち微小核形成能が高いクローン（ＡΔ５１又はＡΔＥ５細胞）を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号ＲＣＢ０５２１）を用いた。はじめに約１０７個の細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（ヌンク）１２本に細胞密度が８０〜９０％飽和程度まで培養したＡΔ５１又はＡΔＥ５細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ，６００μｇ／ｍｌＧ４１８，ＤＭＥＭ）中で７２時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を装着したＳＷＩＮＮＥＸ−２５（ミリポア）を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは５０μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンＰ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ，Ｄｉｆｃｏ）を含むＤＭＥＭ２ｍｌに再懸濁した。ＨＦＬ−１細胞を９０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２培養用フラスコ（ファルコン）に精製した微小核細胞を加え３７℃にて１５分間静置した後、ＤＭＥＭ中にＰＥＧ１５００（終濃度４５％（Ｗ／Ｖ）、ロシュダイアグノステイクス）及びＤＭＳＯ（終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ０．２２μｍフィルター（ザルトリウス）にて濾過滅菌した溶液で１分間かけて融合した。２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて４８時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンＩコート処理した４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）１枚に播種した。２日後にＧ４１８（３００μｇ／ｍｌ）又はブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（２０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ）に置き換えた。約３週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。１０回の微小核細胞融合から２７個の薬剤耐性コロニーを得た。上記の細胞を以後ＨΔＥ細胞と称する。
（２）移入染色体の確認
移入染色体の確認は、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上のｎｅｏ遺伝子の有無を指標にしてＰＣＲ増幅により確認した。
以下にＰＣＲ増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示す。
1291F：5'- CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG -3’（配列番号４２）
1667R：5'- ATT TGC ACT GCC GGT AGA ACT -3’（配列番号４３）
これらのプライマーは、プラスミドベクターｐＳＴｎｅｏＢ（加藤ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ，１２:５７５−５８０， １９８７）の塩基配列を基にして作製した。
1291Fプライマー（配列番号４２）及び1667Rプライマー（配列番号４３）を用いてＰＣＲ増幅を行った。上記ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持する場合は、ｎｅｏ遺伝子の一部を含む約０．４ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、ＨΔＥ細胞５クローン全てにおいて予想される増幅が確認された。
以上より、上記のＨΔＥ細胞は、上記ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確認された。
（３）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＥＰＯ遺伝子の発現
ヒトＥＰＯ遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるヒトＥＰＯタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）により定量した。
単離したブラストサイジン耐性ＨＣΔＥ細胞３クローン及びＧ４１８又はブラストサイジン耐性ＨΔＥ細胞８クローンについて、２０％ＦＢＳ添加した３００μｇ／ｍｌのＧ４１８又は６μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含むＤＭＥＭ培地０．５ｍｌをいれた４８穴組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）に播種し、２日間又は３日間又は４日間培養し上清を回収した。ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，Ｒ＆Ｄシステム）により、培養上清中のヒトＥＰＯを希釈なしにて定量した。その結果を表１５に示す。
Figure 2010004887
ＨΔＥ５１−１、ＨΔＥ５−１、ＨΔＥ５−２、ＨΔＥ５−３、ＨΔＥ５−４は、培養上清中のヒトＥＰＯ濃度が上記ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Quantikine IVD Human EPO Immunoassay，Ｒ＆Ｄシステム）の検出限界濃度以上であった。
以上より、上記のＨＣΔＥ細胞及びＨΔＥ細胞クローンは、ヒトＥＰＯタンパク質を産生することが確認された。
〔実施例１５〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへのＥＰＯ及びヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子挿入用ベクターの構築
（１）ｌｏｘＰ配列を含むｈＴＥＲＴ発現プラスミドｐＬＮ１−ｈＴＥＲＴの構築
ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子は、コード領域３３９９ｂｐであり、５’側領域にＧ及びＣが豊富な配列を含むため、コード領域の両端に設計したプライマーで全長をＰＣＲ増幅するには困難が予測された。それゆえ、コード領域を３つ（１〜８００ｂｐ；以後５’ｈＴＥＲＴと称する、６７９〜１９９３ｂｐ；以後Ｍ−ＸｈＴＲＥＴと称する、１９５２〜３３３９ｂｐ；以後３’ｈＴＲＥＴと称する。ただし塩基配列位置は開始コドンＡＴＧのＡを１として表した）に分けてそれぞれＰＣＲ増幅及びクローニングした後、各領域を連結する方法でｈＴＥＲＴ遺伝子をクローニングした。以下にその方法を示す。
（１−１）５’ｈＴＥＲＴのクローニング
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
hTERT Fw6：5'- CTG CTG CGC ACG TGG GAA G -3’（配列番号４４）
hTERT Rv6：5'- GGT CTG GCA GGT GAC ACC AC -3’（配列番号４５）
hTERT Fw1：5'- GAA GAT CTT CAT CGA TCG GCC ACC ATG CCG CGC GC -3’（配列番号４６）
hTERT Rv7：5'- TCA CTC GGT CCA CGC GTC CT -3’（配列番号４７）
これらのプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列（アクセッション番号NM003219）を基に作製した。
ＨＬ−６０ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１ｎｇを鋳型として、hTERT Fw6（配列番号４４）及びhTERT Rv6（配列番号４５）をそれぞれ終濃度０．４μＭにて、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造）２．５ユニットを用いて５０μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲサイクルは、９８℃１０分の後、変性９８℃３０秒、アニ−リング及び伸長７２℃５分を３サイクル、変性９８℃３０秒、アニ−リング及び伸長７０℃５分を２サイクル、変性９８℃３０秒、アニ−リング及び伸長６８℃５分を３５サイクル、にて行った。さらにこのＰＣＲ産物２μｌを鋳型として、hTERT Fw1（配列番号４６）及びhTERT Rv7（配列番号４７）をそれぞれ終濃度０．４μＭにて、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造）２．５ユニットを用いて５０μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲサイクルは、９８℃１０分の後、変性９８℃３０秒、アニ−リング及び伸長７２℃５分を３サイクル、変性９８℃３０秒、アニ−リング及び伸長７０℃５分を２サイクル、変性９８℃３０秒、アニ−リング及び伸長６８℃５分を３５サイクル、にて行った。その結果、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
この約０．８ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）にて両端を平滑末端とし、さらにＢｇｌＩＩ（宝酒造）にて消化して５’側を突出末端とし、５’ｈＴＥＲＴインサート用ＤＮＡ断片を得た。そしてプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯをＸｈｏＩ（宝酒造）にて消化した後、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）にて両端を平滑末端とし、さらにＢａｍＨＩ（宝酒造）にて消化しヒトＥＰＯ遺伝子を除去して得られたＢａｍＨＩ−平滑末端サイトに５’ｈＴＥＲＴインサート用ＤＮＡ断片をクローニングした。宿主大腸菌にはＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いた。クローン化された５’ｈＴＥＲＴインサートＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（ＰＲＩＳＭ３７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析し、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列の相当する部分と同一であることを確認した。以上より得られたプラスミドベクターをｐＬＮ１−５’ｈＴＥＲＴとした。
（１−２）Ｍ−ＸｈＴＥＲＴのクローニング
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
hTERT Fw8-2：5'- AGT GCC AGC CGA AGT CTG CC -3’（配列番号４８）
hTERT 5’XhoIRv3：5'- GCA GCT GAA CAG TGC CTT C -3’（配列番号４９）
hTERT Fw8-1：5'- AGG ACG CGT GGA CCG AGT GA -3’（配列番号５０）
これらのプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列（アクセッション番号ＮＭ００３２１９）を基に作製した。
ＨＬ−６０ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．２５ｎｇを鋳型として、hTERT Fw8-2（配列番号４８）及びhTERT 5’XhoIRv3（配列番号４９）をそれぞれ終濃度０．４μＭにて、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造）２．５ユニットを用いて２５μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲサイクルは、９８℃５分の後、９８℃１５秒・５５℃３０秒・７２℃９０秒を４０サイクル、にて行った。さらにこのＰＣＲ産物１μｌを鋳型として、hTERT Fw8-1（配列番号５０）及びhTERT 5’XhoIRv3（配列番号４９）をそれぞれ終濃度０．４μＭにて、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造）２．５ユニットを用いて２５μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲサイクルは、９８℃５分の後、変性９８℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、及び伸長７２℃９０秒を４０サイクル、にて行った。その結果、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
この約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後、ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造）にて消化して突出末端とし、プラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ２のＭｌｕＩ−ＸｈｏＩサイトへクローニングした。宿主大腸菌には、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いた。クローン化されたＭ−ＸｈＴＥＲＴインサートＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（ＰＲＩＳＭ３７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析し、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列の相当する部分と同一であることを確認した。以上より得られたプラスミドベクターをｐＬＮ１−Ｍ−ＸｈＴＥＲＴとした。
（１−３）３’ｈＴＥＲＴのクローニング
プラスミドベクター構築に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
AP1：5'- CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC -3’（配列番号５１）
このプライマーは、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ(ＣＬＯＮＴＥＣＨ)添付のものを使用した。
hTERT 3’XhoIFw：5'- CCG AGC GTC TCA CCT CGA GGG TGA AGG CAC TGT TC -3’（配列番号５２）
hTERT 3’XhoIFw2：5'- ATG GAC TAC GTC GTG GGA GCC AGA -3’（配列番号５３）
hTERT Rv1：5'- GTC GAC GCT AGC TCA GTC CAG GAT GGT CTT GAA GT -3’（配列番号５４）
これらのプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列（アクセッション番号ＮＭ００３２１９）を基に作製した。
ＨＬ−６０ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．１ｎｇを鋳型として、hTERT 3’XhoIFw2（配列番号５３）及びAP1（配列番号５１）をそれぞれ終濃度０．３μＭにて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）０．５ユニットを用いて２５μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲサイクルは、９４℃２分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、及び伸長６８℃３分を３０サイクル、にて行った。さらにこのＰＣＲ産物１μｌを鋳型として、hTERT 3’XhoIFw（配列番号５２）及びhTERT Rv1（配列番号５４）をそれぞれ終濃度０．３μＭにて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）０．５ユニットを用いて２５μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲサイクルは、９８℃５分の後、変性９８℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、及び伸長７２℃９０秒を４０サイクル、にて行った。その結果、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
この約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後、ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ（宝酒造）にて消化して突出末端とし、プラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯのＸｈｏＩサイトへクローニングした。宿主大腸菌には、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いた。クローン化された３’ｈＴＥＲＴインサートＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（ＰＲＩＳＭ３７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析し、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列の相当する部分と同一であること、及びｐＬＮ１−ＥＰＯ上ＣＭＶプロモーターの転写方向と逆向きに挿入されていることを確認した。以上より得られたプラスミドベクターをｐＬＮ１−３’ｈＴＥＲＴとした。
（１−４）５’ｈＴＥＲＴ、Ｍ−ＸｈＴＲＥＴ及び３’ｈＴＲＥＴ領域の連結
上記（１−３）にて得られたプラスミドベクターｐＬＮ１−３’ｈＴＥＲＴを鋳型として、hTERT 3’XhoIFw（配列番号５２）及びhTERT Rv1（配列番号５４）をそれぞれ終濃度０．３μＭにて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）０．５ユニットを用いて５０μｌの反応液にてＰＣＲ増幅を行った。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲサイクルは、９４℃２分の後、変性９４℃１５秒、アニーリング６０℃３０秒、及び伸長６８℃２分を３０サイクル、にて行った。その結果、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
この約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後、ＤＮＡシーケンサー（ＰＲＩＳＭ３７００、ＡＢＩ）にて解析し、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列の相当する部分と同一であることを確認した。次に、この約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＳａｌＩ（宝酒造）にて消化して突出末端とし、（１−２）にて得られたプラスミドベクターｐＬＮ１−Ｍ−ＸｈＴＥＲＴをＭｌｕＩ及びＸｈｏＩ消化して得られたＭ−ＸｈＴＥＲＴ領域とともにプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ２のＭｌｕＩ−ＸｈｏＩサイトからヒトＥＰＯ遺伝子を含む領域を除去したところへクローニングした。宿主大腸菌には、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いた。
得られたクローンのインサートＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサー（ＰＲＩＳＭ３７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析した結果、Ｍ−ＸｈＴＥＲＴ領域内に塩基置換点変異を持ち、かつ３’ｈＴＥＲＴ領域はＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列の相当する部分と同一であること、及びｐＬＮ１−ＥＰＯ上ＣＭＶプロモーターの転写方向と順方向に挿入されていることを確認した。以上より得られたプラスミドベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて消化し、Ｍ−ＸｈＴＥＲＴ領域を除去したところへ、（１−１）にて得られたｐＬＮ１−５’ｈＴＥＲＴをＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩにて消化し突出末端化したＣＭＶプロモーター及び５’ｈＴＥＲＴ領域を、ｐＬＮ１−Ｍ−ＸｈＴＥＲＴをＭｌｕＩ及びＸｈｏＩ消化し突出末端化して得られたＭ−ＸｈＴＥＲＴ領域とともにクローニングした。宿主大腸菌には、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いた。これにより得られたプラスミドベクターをｐＬＮ１−ｈＴＥＲＴとした。
（２）ｌｏｘＰ配列を含むヒトＥＰＯ及びｈＴＥＲＴ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ−ｈＴＥＲＴの構築
実施例９（１）にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ２をＥｃｏＲＩ消化して得られたＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットを含むＤＮＡ断片を、実施例１１にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ｈＴＥＲＴのＥｃｏＲＩサイトへクローニングした。これをｐＬＮ１−ＥＰＯ−ｈＴＥＲＴとする。
（３）ｌｏｘＰ配列を含む２コピーヒトＥＰＯ及びｈＴＥＲＴ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ２−ｈＴＥＲＴの構築
実施例９（１）にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ２をＥｃｏＲＩ消化して得られたＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットを２コピー含むＤＮＡ断片を、上記（１）にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ｈＴＥＲＴのＥｃｏＲＩサイトへクローニングした。これをｐＬＮ１−ＥＰＯ２−ｈＴＥＲＴとする。
（４）ｌｏｘＰ配列を含む４コピーヒトＥＰＯ及びｈＴＥＲＴ発現プラスミドｐＬＮ１−ＥＰＯ４−ｈＴＥＲＴの構築
実施例９（２）にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ＥＰＯ４をＥｃｏＲＩ消化して得られたＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加ユニットを４コピー含むＤＮＡ断片を、上記（１）にて作製したプラスミドベクターｐＬＮ１−ｈＴＥＲＴのＥｃｏＲＩサイトへ転写順方向に４コピー並ぶようにクローニングした。これをｐＬＮ１−ＥＰＯ４−ｈＴＥＲＴとする。
〔実施例１６〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへのＥＰＯ及びｈＴＥＲＴ遺伝子挿入
実施例７に記載のヒトＥＰＯ遺伝子の場合と同様にして、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへヒトＥＰＯ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を挿入する。実施例１〜４及び６に記載のように、テロメアトランケーションにより長腕遠位を削除し、長腕近位にｌｏｘＰサイトを導入し、テロメアトランケーションにより短腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを用意した。一方でｌｏｘＰ配列を含むヒトＥＰＯ及びｈＴＥＲＴ発現プラスミドを準備し、Ｃｒｅ組換え酵素を一過性に発現させることでｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、Ｇ４１８耐性の獲得（プロモーター分断型のｎｅｏ遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。
（１）トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
実施例１１にて得られたヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するマウスＡ９細胞（Ａ９Δ１２細胞）を６ウェル組織培養用プラスチックプレート（ファルコン）１枚にて細胞密度が６０〜７０％飽和程度までブラストサイジン（４μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）で培養した。実施例１５の（２）で作製したｐＬＮ１−ＥＰＯ−ｈＴＥＲＴベクター及びＣｒｅ酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ライフテック）の存在下、Ｆｕｇｅｎｅ６（ロシュダイアグノステイクス）を用いて添付のプロトコールに従ってトランスフェクションを行った。４８時間培養した後トリプシン処理にて分散し、６ウェル分を一つにまとめてＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）に懸濁し、４８穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）５枚に播種した。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＡ９Δ１２細胞５×１０６あたり４個であった。コロニーを単離してさらに培養した結果、１個のコロニーが増殖した。上記の得られた細胞を以後Ａ９ΔＥＴ１細胞と称する。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ解析
Ａ９ΔＥＴ１細胞について解析した。ｌｏｘＰサイト近傍に位置するヒト２１番染色体長腕近位のマーカーＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子（実施例１の（３）、図２参照）についてＰＣＲ増幅を行った。ｌｏｘＰ配列間の部位特異的組換え反応によるヒトＥＰＯ遺伝子挿入体は、ＰＲＥＤ６５及びＰＲＥＤ３遺伝子を保持することが予想される。その結果、予想された増幅が認められた。次に、ヒト２１番染色体の短腕近位に位置するＳＴＳマーカーＤ２１Ｓ２７５につきＰＣＲ増幅を行った（実施例６の（３）、図１２参照）。ヒト２１番染色体の短腕近位で短腕遠位を削除してあるので、Ｄ２１Ｓ２７５マーカーを保持することが予測される。その結果、予想された増幅が確認された。
（２−２）薬剤選択培養
ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子（短腕遠位）及びブラストサイジン耐性遺伝子が選択薬剤存在下で機能するかを指標として、各薬剤耐性遺伝子を含む領域が保持されているかを確認した。
Ａ９ΔＥＴ１細胞について、６ウェル培養デイッシュ（ファルコン）各ウェルにて細胞密度が６０〜７０％飽和程度までＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ ，ＤＭＥＭ）で培養した。ＰＢＳ（ギブコＢＲＬ）で２回リンスした後、ハイグロマイシン（７００μｇ／ｍｌ、ギブコＢＲＬ）のみ、又はブラストサイジン（４μｇ／ｍｌ）のみ、又はブラストサイジン及びハイグロマイシン及びＧ４１８を含む培養液で１週間培養した。その結果を表１６に示す。
Figure 2010004887
以上よりＡ９ΔＥＴ１細胞がブラストサイジン及びハイグロマイシン及びＧ４１８耐性を有することを確認した。
（２−３）ヒトＥＰＯ遺伝子組換え挿入体の確認
組換え挿入体の選別は、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクター上のｌｏｘＰ配列部位に挿入されたか否かを、ｌｏｘＰ配列部位を挟むようにヒトＥＰＯ遺伝子供与ベクター由来配列上及びＨＡＣベクター上にプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅により確認した。
Ａ９ΔＥＴ１細胞について、実施例９（４）に示したNeo Rp2プライマー（配列番号３８）及びプラスミドベクターｐＢＳ２２６由来のM13RVプライマー（配列番号３９）を用いてＰＣＲ増幅を行った。組換え挿入体の場合は、ｐＬＮ１−ＥＰＯベクター由来のＣＭＶプロモーター、ヒトＥＰＯ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ付加配列を含む領域からｌｏｘＰ配列までとｐＳＦ１由来のｌｏｘＰ配列からｎｅｏ遺伝子の一部までを含む約２．３ｋｂｐの増幅が予想される。その結果、予想される増幅が確認された。
以上より、上記のＡ９ΔＥＴ１細胞は、ＣＭＶプロモーター及びヒトＥＰＯ遺伝子及びＳＶ４０ポリＡ付加配列を含むインサートＤＮＡをコピー挿入されたヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確認された。
以上の（２−１）から（２−３）の実験より、Ａ９ΔＥＴ１細胞が、長腕及び短腕を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
〔実施例１７〕短腕を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのハムスター細胞株への移入
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として実施例６で得られた、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入し、短腕遠位を削除したヒト２１番染色体に基づくＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０細胞（ＤＴ４０（＃２１）ｈｙｇ４）を用いた。染色体受容細胞としては、チャイニーズハムスター由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣより入手，登録番号ＪＣＲＢ９０１８）を用いた。ミクロセルの取得及びＣＨＯ細胞との融合は実施例３（１）と同様に行った。計４回の融合を行った結果、選択培養開始後約２週間後に計５株のハイグロマイシン耐性ＣＨＯ株を得た。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ法
移入染色体の確認をＰＣＲ法により行った。ヒト２１番染色体短腕近位のマーカーｐＣＨＢ、Ｄ２１Ｓ１８７及びＤ２１Ｓ２７５（実施例６の（３−１）、図１２参照）の検出を試みた。ハイグロマイシン耐性のＣＨＯ細胞５株のうち２株（ＣＨＯ＃２１ｈｙｇ４及びＣＨＯ＃２１ｈｙｇ８）において、切断点より近位に位置するＤ２１Ｓ２７５の増幅を確認した。
（２−２）ＰＣＲ法
組換えの標的部位を挟んだ配列をＰＣＲにより増幅した（実施例６の（３−３）、図１２参照）。ＣＨＯ＃２１ｈｙｇ４、８の２株でのみ増幅産物が得られ、制限酵素ＮｓｉＩ消化でも予想される部分断片の生成を確認した。
（２−３）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。ハイグロマイシン耐性のＣＨＯ株のうちの２株（ＣＨＯ＃２１ｈｙｇ４及びＣＨＯ＃２１ｈｙｇ８）について解析したところ、いずれも観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。宿主であるＣＨＯ細胞の染色体との相対的な大きさから、短縮したヒト２１番染色体がＣＨＯ細胞に移入されたことが確認された。
以上の（１）及び（２）の実験から、得られたハイグロマイシン耐性ＣＨＯ株は長腕遠位を削除しｌｏｘＰ配列を挿入し、短腕遠位を削除したヒト２１番染色体部分断片（ＨＡＣベクター）を保持することが確かめられた。
〔実施例１８〕短腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのヒト細胞株への移入及び安定性の確認
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例１７で得られた、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入し短腕遠位を削除したヒト２１番染色体に基づくＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４及びＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ８）を用いた。染色体受容細胞としてはヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣより入手，登録番号ＣＣＬ−１２１）を用いた。ミクロセルの取得及びＨＴ１０８０細胞との融合は実施例４（１）と同様に行った。ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４では１回の微小核細胞融合から計７のブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株、ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ８では２回の微小核細胞融合から計２０のブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株を得た。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ法
移入染色体は、ブラストサイジン耐性遺伝子（実施例４（２−１）参照）及びハイグロマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を次に示す：
HygroF：5'- GCGAAGAATCTCGTGCTTTC（配列番号５５）
HygroR：5'- ATAGGTCAGGCTCTCGCTGA（配列番号５６）
ブラストサイジン耐性遺伝子は、ブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株のすべてにおいて増幅が確認された。一方ハイグロマイシン耐性遺伝子は、ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４由来の７株中５株、ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ８由来の３０株中２７株において増幅が確認された。
（２−２）染色体解析
染色体解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いたＦＩＳＨ法により行った。代表的なFISH像を図１７に示す。ブラストサイジン耐性株では、親株のＨＴ１０８０細胞には存在せず、内在の２１番染色体よりサイズの小さい染色体断片が観察された。
以上の（１）及び（２）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株は長腕遠位を削除しｌｏｘＰ配列を挿入し、短腕遠位を削除したヒト２１番染色体部分断片（ＨＡＣベクター）を保持することが確かめられた。
（３）非選択培養条件下での長期継代培養
長腕遠位を削除したヒト２１番染色体と、さらに短腕遠位を削除したヒト２１番染色体の培養細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例４に記載したヒト細胞株（ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ７９−１−１，３，６，１１，１４、ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ４−１，３，６、ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ８−４，９，２）を使用した。ヒト細胞株用の非選択培養液は１０％ＣＳを加えたＤＭＥＭであり、選択培養液はこれにブラストサイジン４μｇ／ｍｌを添加した。ヒト細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、３日後に細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種した。ヒト細胞株は集団倍加数２５，５０，１００にそれぞれ細胞を回収し染色体標本を作製した。
（４）染色体解析
ヒト細胞における人工染色体の検出は、黒木ら（細胞工学ハンドブック，羊土社，１９９２）に記された方法に従いギムザ染色法により行った。分裂中期染色体像２０個においてミニ染色体の有無を観察して保持率を算出し、５クローンの平均値を出した。その結果を表１７に示す。
Figure 2010004887
ヒト２１番染色体部分断片は、ＨＴ１０８０細胞において分裂回数１００回時点で安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１ないし２本の部分染色体が認められた。
以上の（３）及び（４）の実験により、ヒト２１番染色体の長腕遠位を削除した部分断片と、さらに短腕遠位を削除した部分断片はＨＴ１０８０細胞株において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
〔実施例１９〕ヒト細胞株におけるヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターへのＧＦＰ遺伝子挿入
（１）トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの単離
実施例１８で作製したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するヒトＨＴ１０８０細胞株（ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ７９−１−６，１４、ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ４−１，６、ＨＴ１０８０（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ８−２）をトリプシン処理し、６ウェルクラスター（ヌンク）の１ウェルあたり４×１０５細胞を播種し１日間培養した。実施例５（１）で作製したｌｏｘＰ配列を含むＧＦＰ発現プラスミド２μｇとＣｒｅ酵素発現ベクターｐＢＳ１８５（ライフテック）１μｇを７．５μｌのリポソーム溶液（リポフェクトアミン２０００、インビトロジェン）と混合して培地に添加し５時間後に培地を交換した。１日培養後トリプシン処理し、１０％ＣＳを添加したＤＭＥＭ培地に懸濁して１００ｍｍディッシュ２枚に播種した。翌日４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（GENETICIN、シグマ）を含む培地と置き換えた。約２週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＨＴ１０８０細胞４×１０５あたり３〜１４個であった。コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
（２）ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入されたＧＦＰ遺伝子の発現
単離したＧ４１８耐性ＨＴ１０８０細胞株を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、２１ΔｑＨＡＣでは２１クローン中１４クローンにおいて、また２１ΔｐｑＨＡＣでは３１クローン中２８クローンにおいてＧＦＰの発現が確認された。代表的な蛍光顕微鏡像と可視光顕微鏡像を図１８ａ及びｂに示す。
（３）相同組換え体の確認
相同組換え体を確認するため、組換えの標的部位を夾んだ配列をＰＣＲにより増幅した。ｐＢＳ２２６及びｐＳＦ１プラスミド上に設定したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
CMVneo689:5'- GCCATCCACGCTGTTTTGAC（配列番号５７）
CMVneo910:5'- GCATCAGAGCAGCCGATTGT（配列番号５８）
ＧＦＰ遺伝子の発現によらず全てのＧ４１８耐性クローンでＰＣＲ増幅が認められ、相同組換え体であることを確認した。
以上（１）〜（３）の実験より、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターにはヒト細胞株中においても遺伝子の挿入が可能であり、挿入された遺伝子が発現することが確かめられた。
（４）長期継代培養後のＧＦＰ遺伝子の発現
Ｇ４１８耐性ＨＴ１０８０細胞株から任意の７株を選び、選択薬剤非添加の条件で継代培養した。培養開始から１ヶ月後（集団倍加数約３０）に蛍光顕微鏡下で観察した結果、いずれのクローンにおいてもＧＦＰ遺伝子の発現が確認された。
以上の実験（４）より、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターに挿入された遺伝子は挿入部位の位置効果を受けて発現が減弱することなく安定に発現を維持すること、すなわちＨＡＣベクター上の遺伝子挿入サイトはヘテロクロマチン領域でないことが確かめられた。
〔実施例２０〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのマウスＥＳ細胞株への移入及び安定性の確認
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例５で得られた長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を導入したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターにＧＦＰ遺伝子を挿入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ（＃２１）ΔｑＧＦＰ７−２）と、実施例17で得られた長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を導入し短腕遠位を削除したヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）Ｈｙｇ８）を用いた。受容細胞としてはマウスＥＳ細胞株Ｅ１４（Hooperら, Nature, 326 :292, 1987）を用いた。Ｅ１４の培養方法は（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング、羊土社、１９９５）に記された方法に従い、栄養細胞としてはマイトマイシンＣ処理したマウス胚初代培養細胞（インビトロジェン）を用いた。まず約１０８個の供与細胞からミクロセルを調製し全量５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した。約１０７個のＥ１４をＤＭＥＭで３回洗浄し、５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した後、ミクロセルとあわせ、１２５０ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を除いた。沈殿をタッピングによりよくほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液（５ｇ ＰＥＧ１０００（和光純薬）、１ｍｌＤＭＳＯ（シグマ）を６ｍｌＤＭＥＭに溶解）０．５ｍｌを加えて室温で１分３０秒静置した後、１０ｍｌのＤＭＥＭをゆっくりと加えた。直ちに１２５０ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を除き、沈殿を３０ｍｌのＥＳ細胞用培地に懸濁し、直径１００ｍｌの組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン）３枚に播種した。２４時間後にＣＨＯ（＃２１）ΔｑＧＦＰ７−２を供与細胞とする場合３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（GENETICIN、シグマ）、ＣＨＯ（＃２１）Ｈｙｇ８を供与細胞とする場合１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Hygromycin-B、和光純薬）加えた培地と交換し、その後毎日培地を交換した。１週間〜１０日後には耐性コロニーが出現したが、その頻度はＥ１４細胞１０７個あたり２〜５個であった。そのコロニーを単離し増殖させ、５×１０７個あたり１ｍｌの保存用培地（ＥＳ細胞用培地＋１０％ＤＭＳＯ（シグマ））に懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。同時に各耐性株について約１０６個の細胞からゲノムＤＮＡを調製した（Puregene DNA Isolation Kit（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ社））。
（２）ＰＣＲ解析
移入染色体と保持領域はＰＣＲ増幅により確認した。以下に示すプライマーオリゴヌクレオチドを新たに設定した：
#21p76957：5'- ACACTTTTGACAAACACACCAG（配列番号５９）
#21p77555：5'- TCAACAATGAAAGGGGATGTC（配列番号６０）
これらのプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋより入手した塩基配列（アクセッション番号ＡＬ１６３２０１）を基に作製した。解析に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを下記表１８に示す：
Figure 2010004887
以上の結果を図１９に示す。得られた薬剤耐性株では、いずれも移入した染色体領域の一部が欠失していた。
（３）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
ＦＩＳＨ解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト２１番染色体が検出された。代表的なＦＩＳＨ像を図２０ａ及びｂに示す。ＣＨＯ（＃２１）ΔｑＧＦＰ７−２由来Ｇ４１８耐性株では５株中１株（Ｅ１４（＃２１）ｎｅｏ１）でヒト染色体断片が観察された。ＣＨＯ（＃２１）Ｈｙｇ８由来ハイグロマイシン耐性の２株では、いずれもヒト染色体断片が観察された。このうちＥ１４（＃２１）Ｈｙｇ１では２本のヒト染色体断片が、Ｅ１４（＃２１）Ｈｙｇ２では１本のヒト染色体断片が観察された。ヒト染色体の確認された上記３株では、宿主であるマウスの染色体数はいずれも４０本で正常であることを確認した。
以上の（２）及び（３）の結果から、得られたＧ４１８耐性ないしハイグロマイシン耐性Ｅ１４株はヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを保持することが確かめられた。
（４）非選択培養条件下での長期継代培養
ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのマウスＥＳ細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で選択培養を行った。上記（３）で作製したマウスＥＳ細胞株Ｅ１４（＃２１）ｎｅｏ１、Ｅ１４（＃２１）Ｈｙｇ１、Ｅ１４（＃２１）Ｈｙｇ２を使用した。マウスＥＳ細胞用の非選択培養液は１８．２％ＦＢＳ（インビトロジェン）、３．５ｇ／ｌグルコース（シグマ）、０．１２５ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン）、１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ、和光純薬）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（シグマ）を加えたＤＭＥＭである。マウスＥＳ細胞株は１×１０７細胞を１０ｃｍ径ディッシュ中の栄養細胞上に播種し、２日後に１／１５を１０ｃｍ径ディッシュ中の栄養細胞上に播種した。培養開始から１４，２８，４２日後にそれぞれ細胞を回収し、染色体標本を作製した。
（５）染色体解析
マウスＥＳ細胞におけるヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターの検出は松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いたＦＩＳＨ解析法により行った。２０個の分裂中期像においてヒト染色体断片の有無を観察し、保持率を算出した。その結果を表１９に示す。長期継代培養は各株とも３連で行い、保持率としてその平均を示した。
Figure 2010004887
ヒト２１番染色体から長腕遠位を削除した部分断片は、非選択条件下での長期継代培養に伴って減少する傾向を示した。これに対してヒト２１番染色体から長腕遠位、短腕遠位をともに削除した部分断片は、分裂回数７５回を超えても減少することなく安定に保持されていた。また長期継代培養開始時点で細胞あたりの染色体断片のコピー数が１であった株では、コピー数の増加はみられなかった。長期継代培養開始時点で細胞あたりの染色体断片のコピー数２が優性であった株では、僅かながらコピー数が減少する傾向がみられた。
以上の（４）及び（５）の実験により、ヒト２１番染色体の長腕遠位及び短腕遠位を削除した部分断片はマウスＥＳ細胞株において非選択培養条件下で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
〔実施例２１〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターのヒト体幹細胞株への移入及び安定性
（１）微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、実施例１７で得られた、長腕遠位を削除してｌｏｘＰ配列を挿入し短腕遠位を削除したヒト２１番染色体に基づくＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４及びＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ８）を用いた。染色体受容細胞としてはヒトｈＴＥＲＴ遺伝子及びヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７遺伝子により株化したヒト骨髄由来間葉系幹細胞株ｈｉＭＳＣ（京都大学、戸口田淳也教授より入手、Okamotoら、 Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 354, 2002）を用いた。ｈｉＭＳＣ株は、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて培養した。はじめに約１０７個のＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４／８細胞からミクロセルを調製した。すなわち、２５ｃｍ２遠心用フラスコ（コースター）６本に細胞密度が６０〜７０％飽和程度まで培養したＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４／８細胞をコルセミド（０．０７５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（１０％ＦＢＳ，８μｇ／ｍｌブラストサイジン，Ｆ１２）中で４８時間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃，８，０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して回収し、フィルターで濾過して精製した。６ｃｍ径ディッシュに８０％飽和の状態まで培養したｈｉＭＳＣ細胞に、精製した微小核細胞を加えＰＥＧ溶液で融合した。４８時間後にトリプシン処理により細胞を分散し、ブラストサイジン（８μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＣＳ，ＤＭＥＭ）で培養した。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ４では１クローン、ＣＨＯ（＃２１）ｈｙｇ８では４クローンのブラストサイジン耐性ｈｉＭＳＣ株を得た。
（２）移入染色体の確認
（２−１）ＰＣＲ法
移入染色体は、ブラストサイジン耐性遺伝子（実施例４（２−１）参照）及びハイグロマイシン耐性遺伝子（実施例１８（２−１）参照）のＰＣＲ増幅により確認した。ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子ともに検索した５株のブラストサイジン耐性ＨＴ１０８０株のすべてにおいて増幅が確認された。
（２−２）染色体解析
染色体解析は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト特異的プローブＣｏｔ１（ギブコＢＲＬ）を用いたＦＩＳＨ法により行った。代表的なＦＩＳＨ像を図２１に示す。ブラストサイジン耐性株では、親株のｈｉＭＳＣ細胞には存在せず、内在の２１番染色体よりサイズの小さい染色体断片が観察された。
以上の（１）及び（２）の実験から、得られたブラストサイジン耐性ｈｉＭＳＣ株は長腕遠位を削除しｌｏｘＰ配列を挿入し、短腕遠位を削除したヒト２１番染色体部分断片（ＨＡＣベクター）を保持することが確かめられた。
（３）非選択培養条件下での長期継代培養
ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターの、多分化能を持つヒト体幹細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。上記（１）及び（２）で作製したヒト間葉系幹細胞株（ｈｉＭＳＣ（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ４−１、ｈｉＭＳＣ（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ８−１，２，３，４）を使用した。ヒト細胞株用の非選択培養液は１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭであり、選択培養液はこれにブラストサイジン４μｇ／ｍｌを添加した。ヒト細胞株は５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種し、３日後に細胞を計数して再び５．０×１０５細胞を１０ｃｍ径ディッシュに播種した。ヒト細胞株は培養開始時点から集団倍加数１５，４０，９０にそれぞれ細胞を回収し染色体標本を作製した。
（４）染色体解析
ヒト間葉系幹細胞におけるヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターの検出は、松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，1994）に記された方法に従い、ヒト２１番染色体由来アルフォイド特異的プローブｐ１１−４（名古屋大学、舛本寛教授より入手、Ikenoら、Hum. Mol. Genet., 3: 1245, 1994）を用いたＦＩＳＨ法により行った。分裂中期染色体像５０個においてミニ染色体上の蛍光シグナルの有無を観察して保持率を算出した。その結果を表２０に示す。
Figure 2010004887
ヒト２１番染色体部分断片は、ｈｉＭＳＣ細胞において分裂回数９０の時点で安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり１コピーの部分染色体断片が認められた。
以上の（３）及び（４）の実験により、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターはｈｉＭＳＣ細胞株において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
〔実施例２２〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを移入したヒト体幹細胞株のインビトロ分化誘導による多分化能の確認
実施例２１で作製したヒト２１番由来ＨＡＣベクターを移入したヒト間葉系幹細胞をOkamotoら（Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 354, 2002）の方法に従って分化誘導し、骨、軟骨、脂肪細胞への分化能を調べた。実施例２１に記載したヒト間葉系幹細胞株（ｈｉＭＳＣ（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ８−１）及びその親株（ｈｉＭＳＣ）を使用した。
（１）骨細胞への分化誘導
ｈｉＭＳＣ細胞を、３×１０３／ｃｍ２の密度で播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に１００ｎＭデキサメタゾン（シグマ）、５０μＭアスコルビン酸２リン酸（シグマ）、１０ｍＭβグリセロリン酸（シグマ）を添加した培地中で２１日間培養した。この間培地は２日毎に交換した。
（２）軟骨細胞への分化誘導
２．５×１０５のｈｉＭＳＣ細胞を１５ｍｌ容のポリプロピレンチューブ（コーニング）に回収し室温で８００ｒｐｍ５分間遠心した。細胞沈殿を、高グルコースＤＭＥＭに１０ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦ−β３（インビトロジェン）、１００ｎＭデキサメタゾン（シグマ）、６μｇ／ｍｌインスリン（ロシュ）、１００μＭアスコルビン酸２リン酸（シグマ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマ）、６μｇ／ｍｌトランスフェリン（シグマ）、０．３５ｍＭプロリン（シグマ）、１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（インビトロジェン）を添加した培地に再懸濁して遠心したのち、細胞塊の状態で２１日間培養した。この間培地は２日毎に交換した。
（３）脂肪細胞への分化誘導
ｈｉＭＳＣ細胞を培養ディッシュに３×１０３／ｃｍ２の密度で播種し、コンフルエントまで培養したのち、誘導／維持培養を３回繰り返した。誘導培養は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに１μＭデキサメタゾン（シグマ）、０．２ｍＭインドメタシン（シグマ）、１０μｇ／ｍｌインスリン（シグマ）、０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（シグマ）を添加した誘導培地で３日間行った。維持培養は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに１０μｇ／ｍｌインスリン（ロシュ）を添加した維持培地で２日間行った。
（４）組織染色
２１日間の培養後、細胞はＰＢＳで２度洗ったのち１０％ホルマリンで固定した。骨細胞分化では５％硝酸銀（ナカライ）、脂肪細胞分化では０．３％オイルレッドＯ（ナカライ）、により染色した。軟骨細胞分化では固定した細胞塊をエタノールにより脱水しキシレンで洗浄したのちパラフィン包埋し、切片をアルシアンブルー（ナカライ）により染色した。
ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを移入した間葉系幹細胞株ｈｉＭＳＣ（＃２１）ｂｓｄ−Ｈ８−１を分化誘導すると、親株のｈｉＭＳＣと同様、骨、軟骨、脂肪細胞に特異的な組織染色に対し陽性であった。
以上の（１）〜（４）の実験結果から、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを移入した間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪細胞への多分化能を維持していることが確かめられた。
〔実施例２３〕カニクイザルＥＳ細胞へのミクロセル法によるヒト１４番染色体断片導入
染色体供与細胞としてはヒト１４番染色体断片ＳＣ２０（Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000）を保持するマウスＡ９細胞株（以下Ａ９／ＳＣ２０、という）を用いた。染色体受容細胞としてはカニクイザルＥＳ細胞株ＣＭＫ６．４（Suemoriら、Dev. Dyn. 222, 273-279, 2001）を用いた。ＣＭＫ６．４の培養は、Suemoriら（前記）に記載された方法に従って実施した。培地の組成は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ Ｄ−６４２１）に、２０％ＫＳＲ（Knock out serum replacement，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、非必須アミノ酸溶液（×１００，ＳＩＧＭＡ Ｍ７１４５）、及びＬグルタミン溶液（×１００，ＳＩＧＭＡ Ｍ７５２２）を添加したものである。まず、清水ら（細胞工学ハンドブック、羊土社、１９９２）の報告した方法に従い、２５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ １５２０９４）２４本（７０〜８０％コンフルーエント）のＡ９／ＳＣ２０細胞からミクロセルを調製した。得られたミクロセルは全量を５ｍｌのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ Ｄ−５７９６）に懸濁した。１〜５×１０６個のＣＭＫ６．４細胞をトリプシン液（０．２５％トリプシン、２０％ＫＳＲ）で分散させた後、ＤＭＥＭで２回洗浄し、５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した後、ミクロセルとあわせ、１５００ｒｐｍ、７分間遠心して上清を除いた。融合に用いる１：１．４ＰＥＧ溶液は、１ｇのＰＥＧ（ＳＩＧＭＡ）を１．２ｍｌのＤＭＥＭに溶解し、０．２ｍｌＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ）を添加することにより調製した。沈殿をタッピングによりよくほぐし、３７℃でプレインキュベートした１：１．４ＰＥＧ溶液１．０ｍｌを加えて室温で２分間静置した後、１０ｍｌのＤＭＥＭをゆっくり加えた。直ちに１５００ｒｐｍ、７分間遠心して上清を除き、沈殿を４ｍｌのＥＳ細胞用培地に懸濁し、あらかじめＧ４１８耐性栄養細胞をまいた直径３５ｍｍの組織培養用プラスチックシャーレ２枚に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。２４時間後、５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を加えた培地と交換し、その後毎日培地交換を行った。１週間から１０日後には薬剤耐性コロニーが出現した。ピックアップされた薬剤耐性ＥＳ細胞コロニーをあらかじめＧ４１８耐性栄養細胞をまいた４ウェルプレートに播種し、５０μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下でさらに１０日間培養を行った。その結果生き残ったＥＳ細胞コロニーを再度ピックアップして、あらかじめ栄養細胞をまいた４ウェルプレートに播種し、非選択条件下でさらに１０日間培養を行った。増殖したＥＳ細胞は、アルカリ性フォスファターゼ染色（Suemoriら、前記）陽性であり、未分化能を維持していることが示された。さらに定法に従って抽出されたゲノムＤＮＡを用いた導入染色体保持確認は以下の通り実施した。
薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト１４番染色体断片に含まれるＮｅｏ遺伝子（ｐＳＴｎｅｏＢ，Tomizukaら, Nature Genet. 16, 133-143, 1997）の存在をＰＣＲ法により検出した。以下に使用したプライマーオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。反応条件は、約０．１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑポリメラーゼとしてはタカラＥｘＴａｑを用い、９４℃５分の反応を１サイクル行った後、９４℃１５秒、５９℃１５秒及び７２℃２０秒を３５サイクル行った。
neoF：TGAATGAACTGCAGGACGAG（配列番号６１）
neoR：ATACTTTCTCGGCAGGAGCA（配列番号６２）
得られたＧ４１８耐性サルＥＳ細胞クローン１種について、ＰＣＲ解析を行った結果、Ｎｅｏ遺伝子（ｐＳＴｎｅｏＢ）の存在を示す、特異的な増幅産物が検出された。これらの実験により、ミクロセル法によるヒト１４番染色体断片ＳＣ２０のカニクイザルＥＳ細胞株への移入が示された。また、カニクイザル、アカゲザル、及びヒトを含む霊長類ＥＳ細胞はその性質が非常に似ていることが知られている（末盛ら、実験医学、Vol.21、No.8、ｐ４６−５１、２００３、羊土社）。よってこの結果は、薬剤耐性マーキングされたヒト染色体（断片）及びヒト人工染色体（ＨＡＣ）を本実施例に記載の方法により、カニクイザルＥＳ細胞を含む霊長類ＥＳ細胞に移入可能であることを示している。
〔実施例２４〕ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを移入したマウスＥＳ細胞株のインビトロ分化誘導による分化能の確認
実施例２０で作製した、ＧＦＰ遺伝子を挿入したヒト２１番染色体ＨＡＣベクターを保持するマウスＥＳ細胞を神経分化誘導し、神経細胞への分化能を調べた。マウスＥＳ細胞は、実施例２０に記載したマウスＥＳ細胞株Ｅ１４（＃２１）ｎｅｏ１を使用した。
（１）ＧＦＰ発現細胞の分取
Ｅ１４（＃２１）ｎｅｏ１細胞は、直径１００ｍｍの組織培養用プラスチックシャーレ中の、マイトマイシンＣ処理したマウス胚初代培養細胞（インビトロジェン）上に播種し、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（インビトロジェン）に２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（インビトロジェン）、０，２ｍＭ ２−メルカプトエタノール（シグマ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ（和光純薬）を添加した培地で培養した。０．１％トリプシン、０．０４％ＥＤＴＡ処理により分散した細胞を培地中に回収してＰＢＳで２回洗った後、１×１０６個／ｍｌになるようＰＢＳに懸濁してセルソーター（ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ、ベックマン・コールター）にかけ、ＧＦＰ発現細胞を分取した。
（２）神経細胞への分化誘導
分化誘導用の栄養細胞であるマウス骨髄由来ＰＡ６細胞は、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ（インビトロジェン）に２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（インビトロジェン）を添加した培地で培養した。上記（１）で分取したＧＦＰ発現ＥＳ細胞１×１０３個を、血清及びＬＩＦを含まない分化誘導用培地に懸濁してスライドチャンバー（ヌンク）中のＰＡ６細胞上に播種した。分化誘導用培地は１０％ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン）を含むＧ−ＭＥＭ（インビトロジェン）に２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（インビトロジェン）、０，２ｍＭ ２−メルカプトエタノール（シグマ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸を添加したものである。１０日間培養した後４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞で特異的に発現するβチューブリンに対する抗体（ＴＵＪ１、Berkeley Antibody Company）により免疫染色し共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。突起を伸長し神経細胞の形態を呈し、抗βチューブリン抗体で染色される細胞においてＧＦＰの発現が確認された。代表的な共焦点蛍光顕微鏡像を図２２ａ及びｂに示す。
以上（１）〜（２）の実験より、ヒト２１番染色体由来ＨＡＣベクターを移入したＥＳ細胞は、神経細胞への分化能を維持していることが確かめられた。
本発明により、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターが提供される。本ＨＡＣベクターは、その全体のサイズが縮小化されかつ不必要な遺伝子が削除されているため細胞中で安定に保持される。また本ＨＡＣベクターは、ヒト染色体に基づいて作製されているため、大きなサイズの外来ＤＮＡを挿入することが可能である。また本ＨＡＣベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されているため、外来ＤＮＡをカセット形式で簡便に導入することができ、またその導入位置を適宜設定することができることから位置効果を受けることもない。さらに本ＨＡＣベクターを用いることによって、大きなサイズの外来ＤＮＡを細胞に導入し、発現させることができる。従って、本ＨＡＣベクターは、所望のタンパク質をコードする遺伝子の高発現による該タンパク質の生産、機能未知の遺伝子又はタンパク質の生体内機能解析、大きなサイズのＤＮＡのクローニングのために使用することができ、遺伝子工学に関連する分野において有用である。
配列番号１〜６２：合成オリゴヌクレオチド

Claims (38)

  1. 長腕遠位及び／又は短腕遠位が削除されたヒト２１番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクター。
  2. ヒト２１番染色体断片が約２〜１６Ｍｂである、請求項１記載のヒト人工染色体ベクター。
  3. ヒト２１番染色体の長腕遠位が２１ｑ１１領域内で削除されている、請求項１又は２記載のヒト人工染色体ベクター。
  4. ヒト２１番染色体の長腕遠位がＡＬ１６３２０４において削除されている、請求項３記載のヒト人工染色体ベクター。
  5. ヒト２１番染色体の短腕遠位が２１ｐ領域内で削除されている、請求項１又は２記載のヒト人工染色体ベクター。
  6. ヒト２１番染色体の短腕遠位がＡＬ１６３２０１において削除されている、請求項５記載のヒト人工染色体ベクター。
  7. ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクター。
  8. 部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である、請求項７記載のヒト人工染色体ベクター。
  9. 部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である、請求項７又は８記載のヒト人工染色体ベクター。
  10. 部位特異的組換え酵素の認識部位がヒト２１番染色体の長腕近位のＡＬ１６３２０３に挿入されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクター。
  11. 長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除が人工テロメア配列との置換によるものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクター。
  12. ヒト人工染色体ベクターの作製方法であって、以下のステップ：
    （ａ）ヒト２１番染色体を保持する細胞を得るステップ；
    （ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；並びに
    （ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
    を含む、上記作製方法。
  13. ステップ（ａ）において、ヒト２１番染色体を保持する細胞が相同組換え効率の高いものである、請求項１２記載の作製方法。
  14. 相同組換え効率の高い細胞がニワトリＤＴ４０細胞由来のものである、請求項１３記載の作製方法。
  15. ステップ（ｂ）において、ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位の削除を人工テロメア配列との置換により行うものである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の作製方法。
  16. ステップ（ｂ）において、ヒト２１番染色体の長腕遠位をＡＬ１６３２０４において削除する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の作製方法。
  17. ステップ（ｂ）において、ヒト２１番染色体の短腕遠位をＡＬ１６３２０１において削除する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の作製方法。
  18. ステップ（ｃ）において、部位特異的組換え酵素がＣｒｅ酵素である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の作製方法。
  19. ステップ（ｃ）において、部位特異的組換え酵素の認識部位がｌｏｘＰ配列である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の作製方法。
  20. 部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト２１番染色体の長腕近位のＡＬ１６３２０３に挿入する、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の作製方法。
  21. 請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の作製方法により得られる、ヒト人工染色体ベクター。
  22. 請求項１〜１１又は２１のいずれか１項に記載のヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
  23. 請求項１２〜２０のいずれか１項に記載された作製方法において、以下のステップ：
    （ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト２１番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
    をさらに含むことを特徴とする、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法。
  24. 請求項２３記載の作製方法により得られる、外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクター。
  25. 請求項２４記載の外来ＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞。
  26. 請求項２５記載の細胞を含む医薬組成物。
  27. 外来ＤＮＡを受容細胞に導入する方法であって、以下のステップ：
    （ａ）ヒト２１番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
    （ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
    （ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
    （ｄ）部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト２１番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
    （ｅ）上記ヒト２１番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
    （ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
    （ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡの導入を確認するステップ；
    を含む、上記導入方法。
  28. 受容細胞が動物細胞である、請求項２７記載の導入方法。
  29. 動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８記載の導入方法。
  30. 受容細胞が多分化能を有する細胞である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の導入方法。
  31. 多分化能を有する細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は間葉系幹細胞若しくは組織幹／前駆細胞である、請求項３０記載の導入方法。
  32. 外来ＤＮＡを発現する細胞の作製方法であって、以下のステップ：
    （ａ）ヒト２１番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
    （ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
    （ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
    （ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体に外来ＤＮＡを挿入するステップ；
    （ｅ）上記ヒト２１番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
    （ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
    （ｇ）融合した受容細胞において外来ＤＮＡを発現する細胞を選択するステップ；
    を含む、上記作製方法。
  33. 受容細胞が動物細胞である、請求項３２記載の導入方法。
  34. 動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項３３記載の導入方法。
  35. 受容細胞が多分化能を有する細胞である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の導入方法。
  36. 多分化能を有する細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は間葉系幹細胞若しくは組織幹／前駆細胞である、請求項３５記載の導入方法。
  37. タンパク質の製造方法であって、以下のステップ：
    （ａ）ヒト２１番染色体を保持する供与細胞を得るステップ；
    （ｂ）上記ヒト２１番染色体の長腕遠位及び／又は短腕遠位を削除するステップ；
    （ｃ）上記ヒト２１番染色体の長腕近位及び／又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ；
    （ｄ）部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト２１番染色体にタンパク質をコードする外来ＤＮＡを挿入するステップ；
    （ｅ）上記ヒト２１番染色体を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ；
    （ｆ）上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
    （ｇ）融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
    （ｈ）得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ；
    を含む、上記製造方法。
  38. タンパク質が、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＣＤ４０リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―１アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子（ＧＩＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ストローマ由来因子（ＳＤＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ウイント（Ｗｎｔ）からなる群より選択されるものである、請求項３７記載の製造方法。
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