KR20050048666A - 인간 인공 염색체(ｈａｃ) 벡터 - Google Patents

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모토노부 가토
카즈마 토미즈까
요시미 쿠로이와
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Abstract

본 발명은 인간 인공 염색체(HAC) 벡터 및 그 제작 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 인공 염색체 벡터를 이용한 외래 DNA의 도입 방법 및 외래 DNA 발현 세포의 제작 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

인간 인공 염색체(ＨＡＣ) 벡터{HUMAN ARTIFICIAL CHROMOSOME(HAC) VECTOR}
본 발명은 인간 인공 염색체(HAC) 벡터 및 그 제작 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 인공 염색체 벡터를 이용한 외래 DNA의 도입 방법 및 외래 DNA 발현 세포의 제작 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
포유 동물 세포에 외래 유전자를 도입 발현시키기 위한 벡터는 기초 생명 과학 연구에 있어서 필수적인 툴(tool)일 뿐만 아니라, 그 성과의 산업(예: 의약품의 대량 생산)이나 의료(예: 유전자 치료)에 있어서의 실용화시에 중요한 역할을 해 왔다. 1970년대 후반 이후의 유전자 공학 기술의 진전은 대장균이나 효모에 있어서 특정 유전자 DNA 단편(斷片)의 단리(單離)와 증폭(유전자 클로닝)을 용이하게 하였다. 종래, 포유 동물 세포에의 유전자 도입에는 클론화 DNA가 사용되어 왔다. 실제로는, 발현시키고자 하는 유전자(cDNA)의 코드 영역에 포유 동물 세포에서 기능할 수 있는 프로모터나 폴리 A 부가 부위 등을 연결한 인공적인 발현 유닛을 제작하거나, 또는 코드 영역에 부가하여 본래의 프로모터나 폴리 A 부가 부위 등을 포함하는 게놈 DNA 단편 등을 포함하는, 대장균의 플라스미드(최장 20kb 정도: 환상), 코스미드(최장 40kb 정도: 환상), 세균 인공 염색체(BAC; 최장 200kb: 환상), 효모 인공 염색체(YAC; 최장 1Mb: 직쇄상)을 환상 또는 선상화하여 제작하고, 이들을 세포에 트랜스펙션 또는 인젝션하는 것이 범용되고 있다. 도입된 벡터 DNA가 포유 동물 유래의 복제 기점을 포함하지 않는 경우, 벡터는 세포에 도입된 후 복제할 수 없으며 세포가 분열함에 따라 소실되어 가기 때문에, 도입 유전자의 발현은 일과성으로 된다. 한편, 복제 기점을 포함하는 경우는 세포내에서 일시적으로 다수 카피화하지만, 세포 분열에 따른 딸세포에의 분배가 균등하게 이루어지지 않기 때문에 선택압이 없는 경우에는 점차로 소실되어 간다. 따라서, 이 경우도 발현은 일과성으로 된다. 약제 내성 유전자를 동시에 도입하여, 약제에 의한 선택압을 가함으로써 도입 유전자를 구성적으로 발현하는 세포주를 선별하는 것은 가능하지만, 이 경우 도입된 유전자는 숙주 세포의 염색체에 병합(인테그레이션)된다. 이 병합은 도입 유전자 및 숙주 염색체의 양쪽에 영향을 준다. 숙주 염색체에 있어서는 유전자가 파괴될 가능성이 있다(Pravtcheva 등, Genomics(USA), 제30권, p.529-544, 1995년). 도입되는 유전자에 있어서는 카피수가 억제되지 않고 불활성화되고(Garrick 등 Nature Genet. (USA) 제18권, p56-59, 1998년), 병합된 숙주 염색체 상의 제어 서열의 영향을 받는(Dobie 등, P.N.A.S(USA), 제93권, p.6659-6664, 1996년; Alami 등, Hum. Mol. Genet. (UK), 제9권, p.631-636, 2000년) 등의 문제점이 남는다. 이 때문에, 숙주 염색체를 파괴하지 않고 일정 카피수의 유전자를 도입할 수 있는 방법의 개발이 요망된다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 한 방법은, 인간을 포함한 동물 세포를 숙주로 하여 자율 복제/분배가 가능한 인공 염색체를 구축하고, 이것을 벡터로 하여 동물 세포에 유전자를 도입하는 것이다.
(1) 인간 인공 염색체(HAC)의 구축
종래, 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터를 구축한다는 목표와, 한편으로 세포내에서의 자율 복제 분배에 필요한 구조를 특정한다는 생물학적 측면에서, 동물 세포를 숙주로 한 인간 인공 염색체(Human Artificial Chromosome; 이하, "HAC"라고도 함)의 구축이 시도되어 왔다. HAC 구축의 어프로치에는 (A) 보텀업(bottom-up) 어프로치, (B) 자연 발생 염색체 단편의 이용, 및 (C) 톱다운(top-down) 어프로치(천연의 염색체를 트리밍)의 3종이 있다.
(A) 보텀업 어프로치
대장균이나 효모에서는 자율 복제/분배에 필요한 DNA 서열이 특정되어 있으며, 숙주 세포내에서 일정한 카피수가 유지되는 인공 염색체가 구축되어 있다(BAC 내지 YAC). 동일한 발상으로부터, 클론화된 서열의 이미 알려진 DNA 단편을 동물 세포에 도입하여 조립하는 보텀업 어프로치에 의한 HAC 구축이 시도되어 왔다. 인간 염색체 센트로미어(centromere)의 구성 요소인 알포이드(alphoid) 배열 약 100kb를 포함하는 YAC 유래의 약제 내성 유전자와 인간의 텔로미어 서열을 부가하고, 인간 섬유 육종 세포주 HT1080에 도입한 예가 보고되어 있다(Ikenno 등, Nature Biotech. (USA), 제16권, p.431-439, 1998년). 약제 내성 세포주에서는 자율 복제/분배가 가능한 인공 염색체가 구축되어 있었지만, 도입한 DNA 서열 그 자체가 세포에 유지되어 있는 것이 아니라 증폭에 의한 재구성이 발생하여, 세포에 유지되는 서열 구조는 명확하지 않다.
또한, HAC를 구축하는 것이 목적이고 외래 유전자의 삽입을 검토하는 데에는 이르러 있지 않다.
(B) 자연 발생 단편의 이용
염색체는 그 자신이 유전자의 집합체이고, 자율 복제·분배에 필요한 요소를 구비하고 있다. YAC 등 기존 클로닝 벡터의 용량을 넘는 Mb 단위의 거대 유전자를 도입할 목적으로 하나의 염색체 또는 그 단편을 유전자 도입의 툴로서 이용하는 것은, 미소핵세포 융합법에 의해 실현되고 있다. 마우스 배(胚) 줄기 세포에 항체 유전자를 포함하는 인간 14번, 2번, 22번 염색체 단편을 이입하여 키메라 개체를 제작할 수 있다는 것, 이입된 항체 유전자가 개체 중에서 기능 발현된다는 것, 인간 염색체 단편이 키메라 개체에서 안정되게 보유되는 것, 생식 계열을 거쳐서 차세대에 전달 가능하다는 것이 밝혀졌다(Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년; Tomizuka 등, P.N.A.S. (USA), 제97권, p.722-727, 2000년). 이 예에서는, 발현시키고자 하는 유전자가 실려 있는 염색체 그 자체를 벡터로서 이용하는 것의 유효성이 밝혀졌다. 그러나, 목적하는 유전자마다 염색체 개변을 행하는 것은 현실적이지 않다. 염색체 단편의 벡터로서의 이점을 살리고 아울러 그 범용성을 높이기 위해서는, 기본 골격이 되는 염색체 벡터를 준비하고, 이것에 목적으로 하는 유전자를 간편하게 도입할 수 있는 것이 바람직하다.
이와 같은 목표하에서, 염색체 자연 단편을 이용하여 외래 유전자를 발현시키는 시도가 보고되어 있다. 인간 1번 염색체 유래의 방사선 염색체 단편(5.5Mb)을 벡터로 하고, IL-2 유전자(cDNA) 또는 CFTR 유전자(인간 게놈 DNA)의 도입과 기능 발현이 보고되어 있다(Guiducci 등, Hum. Mol. Genet. (UK), 제8권, p.1417-1424, 1999년; Auriche 등, EMBO Rep.(UK), 제2권, p.102-107, 2002년 참조). 숙주는 햄스터 섬유아세포(CHO)를 이용하고 있다. 이 단편화된 미니 염색체로의 목적 유전자의 도입에는 알포이드 DNA를 병용하여 인간 1번 염색체 센트로미어 영역으로의 삽입을 기대하고 있지만, 상세한 삽입 위치 및 카피수는 특정되어 있지 않다. IL-2 의존성의 마우스 임파 아구(芽球) 세포는, IL-2 미니 염색체를 보유하는 CHO 세포와의 세포 융합에 의해 IL-2 비의존적으로 증식 가능해지고 기능 상보가 나타났다. 또한, CFTR 미니 염색체를 보유하는 CHO 세포에서는, cAMP 자극에 의한 염소 이온 방출이 나타나고, CFTR 저해제의 첨가에 의해 그 염소 이온 방출이 억제되었다. 이들은 염색체 단편을 벡터로 하여 외래 유전자를 삽입·발현하기 위한 계를 나타내었으나, 구조가 명확하지 않고 외래 DNA의 삽입이 제어되어 있지 않다는 문제가 남아 있다.
방사선 잡종 세포 유래의 염색체 단편(2∼3Mb)은 햄스터 세포에 있어서 안정적으로 유지되고, 인간 1번 염색체 센트로미어와 장완(長腕)의 일부 및 SDHC(succinate dehydrogenase complex, subunit C) 유전자를 포함한다. SDHC 영역에서의 상동 재조합에 의해 G418 내성 유전자가 삽입되었다. 마우스 세포(L 및 3T3)를 이용하여 X선 세포 융합을 행하고, G418 내성 잡종 세포를 얻었다(Au 등, Cytogenet. Cell Genet. (스위스), 제86권, p.194-203, 1999년). 이 HAC는 염색체 자연 단편을 이용하고 있기 때문에 그 구조는 명확하지 않다. 외래 유전자를 부위 특이적으로 HAC에 도입하기 위하여 상동 재조합을 이용하였지만, 도입 효율이 낮아 범용성은 낮다. 미소핵세포 융합법은 이용하고 있지 않으므로, 목적하는 염색체 단편 이외에도 숙주 염색체가 공존한다. 염색체를 벡터로 하여 외래 유전자를 발현한다는 발상을 제시한 것에 불과하다.
또한, 염색체 자연 단편(환상)에 loxP 사이트를 랜덤 삽입하고, 약제 내성 유전자(hprt)의 재구성을 지표로 외래 유전자(하이그로마이신 내성 유전자)를 삽입한 예가 보고되어 있다(Voet 등, Genome Res. (USA), 제11권, p.124-136, 2001년). 이 환상 염색체는 인간 20번 염색체의 센트로미어와 1번 염색체의 일부(p22 영역)을 포함하지만, 자연 단편이므로 배열은 특정되어 있지 않다. 외래 유전자를 Cre/loxP 시스템에 의한 부위 특이적 재조합으로 도입하고 있지만, 염색체 상으로의 loxP 삽입은 랜덤이고 그 구성은 불명확하다. 한편으로 미소핵 융합에 의한 마우스 ES 세포로의 이입, 키메라 개체의 제작, 자손 전달이 나타나 있다. 염색체 자연 단편을 이용한 점, 및 loxP 사이트의 삽입 위치가 랜덤이라는 점을 제외하고, 인공 염색체에 목적 유전자를 삽입하는 수법은 간편하기는 하지만, 환자(경도의 정신 발달 지체) 유래의 이상 염색체를 이용한 것은 안전성 면에서 문제가 남고 실용적이라고는 할 수 없다.
(C) 톱다운 어프로치
염색체 자연 단편을 세포에 이입하는 경우, 목적 유전자 이외에도 이입한 염색체 단편으로부터 그 밖의 많은 유전자가 동시에 발현하게 된다. 마우스 ES 세포의 실험에서는, 인간 염색체마다 안정성이 상이하다는 것, 도입한 염색체 단편이 클수록 이것을 유지하는 세포의 키메라 개체 중에서의 기여율이 떨어진다는 것이 알려져 있다. 여분의 유전자의 발현은 염색체 단편을 유지하는 숙주 세포의 증식을 막는다고 추측된다. 따라서, 염색체 개변에 의해 여분의 유전자를 제거함으로써, 이입 염색체 단편의 보유율이 올라간다고 생각된다.
염색체의 일부를 삭제하는 방법으로서, 클론화된 텔로미어 서열을 상동 재조합에 의해 도입하고, 염색체를 단축하는 기술(텔로미어 트런케이션(truncation))이 보고되어 있다(Itzhaki 등, Nature Genet. (USA), 제2권, p.583-287, 1992년). 그러나, 많은 동물종의 체세포는 상동 재조합의 빈도가 극단적으로 낮기 때문에, 재조합체의 취득에는 다대한 노력을 요한다. 이에 비하여 높은 빈도로 상동 재조합을 일으키는 닭 세포주 DT40을 염색체 개변의 숙주로 이용함으로써, 효율적인 염색체 개변이 가능해졌다(Kuroiwa 등, Nucleic Acids Res. (UK), 제26권, p.3447-8, 1998년). 인간 X 염색체를 미소핵세포 융합법에 의해 DT40 세포주에 이입하고, 텔로미어 트런케이션을 행한 예가 보고되어 있다(Mills 등, Hum. Mol. Genet. (UK), 제8권, p.751-761, 1999년). 단완(短腕) 및 장완(長腕)의 삭제에 의해 2.4Mb의 선상 미니 염색체가 구축되었다. 미니 염색체는 햄스터, 인간 세포에서도 안정되게 유지되었지만, 카피수의 변화가 나타났다. HAC의 안정성을 확인한 것에 불과하고, 여기에 외래의 유전자를 도입하여 벡터로서 이용하는 데에는 이르러 있지 않다.
또한, 햄스터 세포를 숙주로 하여 인간 Y 염색체를 텔로미어 트런케이션으로 단축하고, 숙주 세포 중에서 안정되게 유지되는 약 4Mb의 미니 염색체를 구축한 예도 보고되어 있다(Heller 등, P.N.A.S. (USA), 제93권, p.7125-7130, 1996년). 이 미니 염색체를 미소핵세포 융합법에 의해 마우스 ES 세포에 이입했지만, 불안정하였다. 염색체 재구성에 의해 마우스 센트로미어 서열을 도입한 파생 미니 염색체가 ES 세포 중에서 안정성을 획득했기 때문에(Shen 등, Hum. Mol. Genet. (UK), 제6권, p.1375-1382, 1997년) 키메라 마우스를 제작한 바, 생식 계열 전달이 확인되었다(Shen 등, Curr. Biol. (UK), 제10권, p.31-34, 2000년). 키메라 염색체가 마우스 개체에서 유지되는 것으로 나타났지만 그 구조는 염색체 재구성 때문에 불명확하고, 게다가 외래 유전자의 도입 및 발현에 대해서는 검토되어 있지 않다.
(2) HAC로의 외래 유전자의 삽입
상술한 바와 같은 벡터로서의 HAC 구축과 병행하여 중요한 것은, HAC에 목적 유전자를 도입하는 방법의 확립이다. 그러나, 상술한 바와 같이 현시점에서는 HAC에 구축 자체가 진행중인 단계이고, 외래 유전자의 도입에 대해서는 약제 내성 유전자의 랜덤 삽입이 드러나 있는 정도로서 상세한 검토는 이루어지고 있지 않는 것이 현실정이다.
인간 항체 중쇄(重鎖) 유전자를 보유하는 마우스를 제작할 목적으로 단리된 인간 14번 염색체 유래의 자연 단편 SC20은, 마우스에서의 안정성과 생식 계열 전달이 확인되어 있다. 이것에 Cre/loxP 시스템을 이용하고, 상호 전좌에 의해 Mb 단위의 염색체 영역(항체 경쇄(輕鎖) 유전자를 포함하는 인간 2번 및 22번 염색체 영역)을 클로닝하는 방법(염색체 클로닝)이 확립되었다(Kuroiwa 등, Nature Biotech. (USA), 제18권, p.1086-1090, 2000년). 이 경우도, 불필요한 유전자를 포함하지 않고 구조가 명확한 HAC 구축이 목표였지만, 항체 유전자와 같이 다른 클로닝 벡터(YAC 등)의 용량을 초과한 거대 유전자로의 적용에서 효과가 발휘된다.
어느 것으로 하더라도, 1) 구조가 명확하며 불필요한 유전자가 제거되어 있고, 2) 배양 세포, 개체에서 안정적으로 유지되며, 3) 외래 DNA를 간편하게 도입 가능하다는 조건을 만족하는 HAC 벡터계는 현재까지 구축되어 있지 않다.
도 1은 인간 21번 염색체 장완 원위를 텔로미어 트런케이션에 의해 단축 삭제하는 방법의 개요를 도시한 도면이다.
도 2는 푸로마이신(puromycin) 내성 DT40주에 있어서 인간 21번 염색체 장완 원위가 삭제된 것을 나타낸 PCR 해석의 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 푸로마이신 내성 DT40주에 있어서 장완 원위가 삭제된 것, 즉 인공 텔로미어 서열이 부위 특이적으로 도입된 것을 나타낸 서던 블롯(Southern Blot) 해석의 결과를 도시한 사진이다.
도 4a 및 도 4b는 푸로마이신 내성 DT40주에 있어서 장완 원위가 삭제된 것을 나타낸 FISH 해석의 결과를 도시한 사진이다. 도 4a는 DT40 세포에 유지되어 있는 인간 21번 염색체(화살표)를 도시하고, 도 4b는 장완을 삭제한 인간 21번 염색체 단편(화살표)을 도시한다.
도 5는 장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체의 장완 근위에 loxP 서열을 부위 특이적으로 삽입하는 방법의 개요를 도시한 도면이다.
도 6a 및 도 6b는 블라스트사이딘(blasticidin) 내성 DT40주에 있어서 상동 재조합체(인간 21번 염색체 상에 loxP 서열이 부위 특이적으로 도입된 주)를 선별하기 위한 서던 블롯 해석(A) 및 PCR 해석(B)의 결과를 도시한 사진이다.
도 7a 및 도 7b는 블라스트사이딘 내성 CHO-K1주에 있어서 인간 21번 염색체(단편)가 유지되어 있는 것을 도시한 FISH 해석의 결과를 도시한 사진이다. 도 7a는 텔로미어 트런케이션을 행하기 전의 전장(全長)의 인간 21번 염색체를 도시하고, 도 7b는 장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 단편을 도시한다.
도 8은 인간 21번 염색체 장완 근위의 loxP 서열에 GFP 콘스트럭트를 부위 특이적으로 삽입하는 방법의 개요를 도시한 도면이다.
도 9는 G418 내성 CHO-K1주에 있어서 GFP 발현의 모습을 도시한 형광 현미경 사진이다.
도 10은 G418 내성 CHO-K1주에서는 loxP 서열에서 부위 특이적 재조합이 일어난 것을 나타낸 서던 블롯 해석의 결과를 도시한 사진이다.
도 11은 인간 21번 염색체 단완 원위를 텔로미어 트런케이션에 의해 단축 삭제하는 방법의 개요를 도시한 도면이다.
도 12는 하이그로마이신(Hygromycin) 내성 DT40주에 있어서 인간 21번 염색체 단완 원위가 삭제된 것을 나타낸 PCR 해석의 결과를 도시한 도면이다.
도 13는 하이그로마이신 내성 DT40주에 있어서 단완 원위가 삭제된 것, 즉 인공 텔로미어 서열이 부위 특이적으로 도입된 것을 나타낸 서던 블롯 해석의 결과를 도시한 사진이다.
도 14는 하이그로마이신 내성 DT40주에 있어서 단완 원위가 삭제된 것, 즉 인공 텔로미어 서열이 부위 특이적으로 도입된 것을 나타낸 PCR 해석의 결과를 도시한 사진이다.
도 15a 및 도 15b는 하이그로마이신 내성 DT40주에 있어서 단완 원위가 삭제된 것을 나타낸 FISH 해석의 결과를 도시한 사진이다. 도 15a는 DT40 세포에 유지되어 있는 장완을 삭제한 인간 21번 염색체(화살표)를 나타내고, 도 15b는 장완 및 단완을 삭제한 인간 21번 염색체 단편(화살표)을 도시한다.
도 16은 KH21E 세포 배양 상청(上淸) 중에 생산된 인간 EPO가 재조합체 인간 EPO 단백질(rhEPO)와 동일한 세포 증식 활성을 유지하는 결과를 도시한 도면이다.
도 17은 블라스트사이딘 내성 HT1080 세포주에 있어서 인간 21번 염색체 단편(화살표)이 유지되어 있는 것을 나타낸 FISH 해석의 결과를 도시한 사진이다.
도 18a 및 도 18b는 G418 내성 HT1080주에 있어서 GFP 발현의 모습을 도시한 형광 현미경 사진(도 18a) 및 위상차 현미경 사진(도 18b)이다.
도 19는 G418 또는 하이그로마이신 내성 E14주에 있어서 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터가 이입된 것을 나타낸 PCR 해석 결과를 도시한 도면이다.
도 20a 및 도 20b는 약제 내성 E14 세포주에 있어서 인간 21번 염색체 단편이 유지되어 있는 것을 나타낸 FISH 해석의 결과를 도시한 사진이다. 도 20a는 장완 원위를 삭제한 염색체 단편(화살표)을 도시하고, 도 20b는 또한 단완 원위를 삭제한 염색체 단편(화살표)를 도시한다.
도 21은 약제 내성 hiMSC 세포주에 있어서 인간 21번 염색체(화살표)가 유지되어 있는 것을 나타낸 FISH 해석의 결과를 도시한 사진이다.
도 22a 및 도 22b는 HAC 이입 ES 세포를 인 비트로(in vitro)에서 신경 세포로 분화 유도했을 때에, GFP 발현의 모습을 도시한 형광 현미경 사진(도 22a) 및 항β튜불린(tubulin) 항체로 염색한 형광 염색체 사진(도 22b)이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본원은 2002년 10월 4일에 출원된 일본 특허출원 제2002-292853호의 우선권을 주장하는 것으로, 상기 특허출원의 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명은 인간 인공 염색체 벡터(이하, "본 HAC 벡터"라고도 함)에 관한 것이고, 이 HAC 벡터는 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 기초하여 제작되며, 장완 원위 및(또는) 단완 원위가 삭제된 인간 21번 염색체 단편 또는 인간 14번 염색체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
인간 21번 염색체는 센트로미어 영역을 제외한 장완 전체 및 단완의 일부에 대한 염기 서열이 공공의 데이터베이스 상에 공개되어 있다(예를 들면, http://hgp.gsc.riken.go.jp/chr21/index.html(Riken Genomic Sciences Center, Human Genome Research Group을 참조하기 바람). 이와 같은 서열 정보를 이용함으로써, 후술하는 인공 텔로미어 서열이나 loxP 서열 등을 상동 재조합에 의해 부위 특이적으로 삽입하는 것이 가능해진다. 또한, 장완 원위의 삭제에 의해 약 48Mb의 21번 염색체가 1/3인 약 16Mb로 되고, 또한 장완 원위 및 단완 원위의 삭제에 의해 최종적으로는 약 2Mb의 이미 알려진 유전자를 포함하지 않는 HAC 벡터를 구성할 수 있다.
이전에 마우스 ES 세포에 인간 21번 염색체를 이입하여 키메라 마우스를 제작한 실험에서는, 이입한 염색체의 부분 단편이 차세대에 전달되었다. 숙주 세포의 기능을 저해하는 유전자를 포함하는 이입 염색체 영역이 배제된 결과, 안정화되었다고 생각되고 있다(Kazuki 등, J. Hum. Genet., 46:600, 2001). 한편 인간 Y 염색체의 경우 마우스 ES 세포 중에서는 불안정하였으나, 센트로미어의 구성요소인 알포이드 DNA를 마우스 염색체로부터 도입함으로써 안정화가 일어났다고 보고되어 있다(Shen 등, Hum. Mol. Genet., 6:1375, 1997). 이러한 것들로부터, 잡종 세포 중에서의 인간 염색체의 안정성은 염색체마다 상이하고, 안정성에는 센트로미어가 관여한다고 생각된다. 앞서의 실험에서 인간 21번 염색체의 센트로미어(크기는 약 2Mb라고 생각되고 있다: Triowell 등, Hum. Mol. Genet., 2:1639-1649, 1993; Wang 등, Genome Res. 9:1059-1073, 1999)는 마우스 세포/개체 중에서도 기능한다는 것이 드러나 있으므로, 센트로미어 영역을 포함하는 인간 21번 염색체 단편에 기초하여 제작한 본 HAC 벡터는 잡종 세포 중에서 안정적으로 유지되는 것을 기대할 수 있다.
또한 마찬가지로, 인간 14번 염색체의 서열 정보에 관해서도 일부에 대한 염기 서열이 공공의 데이터베이스 상에 공개되어 있다. 또한, 인간 14번 염색체 유래의 자연 단편(SC20; Tomizuka 등, P.N.A.S., 97:722-727, 2000년)에 가공을 가한 HAC 벡터에 있어서도 인간 21번 염색체의 경우와 동일한 축소화가 가능하다고 생각된다. SC20은 인간 14번 염색체의 장완 원위 및 장완 근위의 많은 부분을 결실하고 있다는 것이 보고되어 있다(Tomizuka 등, P.N.A.S., 97:722-727, 2000년; Kuroiwa 등, Nature Biotech. (USA), 제18권, p.1086-1090, 2000년). 구체적으로는, SC20은 인간 14번 염색체 장완의 텔로미어 서열로부터 AL137229(GenBank 등록번호)를 포함하는 영역, 및 이에 따라 더욱 센트로미어측의 AL121612(GenBank 등록번호)로부터 AL157858(GenBank 등록번호)의 텔로미어측에서 24-26kb까지를 포함하는 영역을 유지하고 있다. 또한, AL137229(GenBank 등록번호)와 AL121612(GenBank 등록번호) 사이의 영역, 및 AL157858(GenBank 등록번호)의 텔로미어측 24-26kb로부터 센트로미어 사이의 영역을 결실하고 있다. 한편, 인간 14번 염색체의 단완 영역은 유지되어 있다. 이 SC20은 인간 세포를 포함하는 세포주나 마우스 개체에 있어서 안정적으로 유지되고(Shinohara 등, Chromosome Res., 8:713-725, 2000), SC20의 리보좀 RNA 영역(인간 14번 염색체 단완부에 위치함)에 loxP 부위를 삽입한 개변 SC20에 있어서도 그 안정성은 유지되어 있었다(Kuroiwa 등, Nature Biotech. (USA), 제18권, p.1086-1090, 2000년). 또한, 그 자신은 불안정한 인간 21번 염색체 단편 유래의 약 10Mb의 염색체 영역을, 그 개변 SC20의 loxP 부위에 전좌시킨 HAC 또한, 마우스 ES 세포나 마우스 개체에서 안정되었다. SC20의 문제점은 14번 염색체 14q32 영역의 유전자를 복수개 포함하고 있다는 것이지만, 본 명세서에 기재된 방법으로 SC20을 축소화함으로써 여러가지 세포종에서 안정적으로 유지되고, 아울러 여분의 유전자를 포함하지 않는 HAC 벡터를 얻을 수 있다.
이하에 본 HAC 벡터의 제작, 벡터로의 외래 DNA의 삽입, 및 본 HAC 벡터의 용도에 관하여 기재한다.
1. 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제작
본 HAC 벡터는 상술한 바와 같이 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 기초하여 제작한다. 본 HAC 벡터의 제작에는 이하의 (a)∼(c)의 단계가 포함된다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계; 및
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계.
여기서, 상기 단계 (b)와 (c)의 순서는 특히 한정되지 않는다.
단계 (a): 인간 염색체를 보유하는 세포의 제작
본 HAC 벡터에 제작에 있어서는, 인간 염색체(예를 들면, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체)를 보유하는 세포를 준비한다. 이와 같은 세포로서는, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체만을 보유하고 아울러 그 후의 조작을 위하여 상동 재조합율이 높은 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 있어서는 먼저 이들 조건을 만족하는 세포를 제작한다.
인간 염색체를 보유하는 세포는 예를 들면, 인간 단일 염색체를 보유하는 공지의 마우스 A9 잡종 세포 라이브러리로부터 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 클론을 선택하고, 그 염색체를 상동 재조합율이 높은 세포에 이입함으로써 제작할 수 있다. 마우스 A9 잡종 세포 라이브러리는 약제 내성 유전자로 표지된 인간 단일 염색체를 보유하는 것이고, 예를 들면 WO00/10383호, Tanabe, H. 등(Chromosome Res., 8:319-334, 2000)에 기재되어 있다. 또한, 인간 21번 염색체 및 인간 14번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포는 Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)에 각각 등록번호 JCRB2221 (세포명 A9(Hygro21) 및 JCRB2214(세포명 A9(Hygro14))로서 등록되어 있으며, 그 상세한 정보·배양법 등도 입수 가능하다.
상술한 바와 같이 하여 입수한 마우스 A9 잡종 세포에 유지되는 인간 염색체를, 상동 재조합율이 높은 세포에 이입한다. 여기서 "상동 재조합율이 높은 세포"라는 것은, 그 세포에 있어서 상동 재조합 조작을 행했을 때에 상동 재조합의 빈도가 높은 세포를 가리키고, 그와 같은 세포로서는 예를 들면, 닭 DT40 세포(Dieken 등, Nature Genetics, 12:174-182, 1996), 마우스 ES 세포(相澤 愼一, 바이오매뉴얼 시리즈 8, 진 타겟팅, 양토사, 1995) 등을 들 수 있다. 특히, 조작의 간편성 등의 점에서, 본 발명에 있어서는 닭 DT40 세포를 이용하는 것이 바람직하다.
염색체의 이입은 본 기술 분야에서 공지의 염색체 이입법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 원하는 염색체를 1개만 도입하는 수법으로서 Koi 등(Koi 등, Jpn. J. Cancer Res., 80:413-418, 1973)에 기재되어 있는 마이크로셀법이 예시된다. 이 수법은 어떤 종의 세포에 있어서 방추체 형성을 저해하는 약제에 의해 유도되는 마이크로셀을 분리하고, 이것을 수용 세포와 융합함으로써, 소수의 염색체를 도입한다는 것이다. 이 마이크로셀법을 이용하여 인간 염색체를 이입하는 구체적인 조작 순서에 관해서는, 예를 들면 WO97/07671호 및 WO00/10383호를 참조하기 바란다. 이상과 같이 하여 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 세포를 제작할 수 있다.
또는, 본 발명에 있어서는 전장의 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체가 아니라, 천연적으로 부분 단편화된 염색체, 예를 들면 인간 14번 염색체의 부분 단편(SC20)을 보유하는 세포를 사용하는 것도 가능하다. SC20 염색체 단편을 보유하는 닭 DT40 세포(SC20)는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 중앙 제6)에 2001년 5월 9일자로 국제 기탁되어, 수탁번호 FERM BP-7583이 부여되어 있다.
단계 (b): 인간 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위의 삭제
HAC 벡터의 제작에 있어서는, 인간 염색체를 보유하는 세포에 있어서 당해 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제한다. 염색체의 삭제는 본 기술 분야에서 공지의 방법에 의해 행할 수 있으며, 예를 들면 WO00/10383호에 기재되어 있는 인공 텔로미어 서열과의 치환(텔로미어 트런케이션)에 의해 행하는 것이 바람직하다. 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하기 위한 구체적인 순서는 예를 들면, 인간 염색체를 보유하는 세포에 있어서 인공 텔로미어 서열을 보유하는 표적화 벡터를 구축하고, 상동 재조합에 의해 염색체 상의 원하는 위치에 인공 텔로미어 서열이 삽입된 클론을 취득한 후, 텔로미어 트런케이션에 의한 결실 변이체를 얻는다는 것이다(Itzhaki 등, Nature Genet., 2:283-287, 1992; 및 Brown 등, P.N.A.S., 93:7125, 1996을 참조하기 바람). 여기서, 염색체의 원하는 위치라는 것은 삭제 대상인 장완 원위 또는 단완 원위의 절단 위치이고, 이 위치에 인공 텔로미어 서열이 상동 재조합에 의해 치환·삽입되어, 장완 원위 또는 단완 원위가 삭제된다(텔로미어 트런케이션). 원하는 위치는 표적화 벡터를 구축할 때에 표적 서열의 설계에 의해 적절히 설정할 수 있으며, 예를 들면 장완 원위를 삭제하는 경우에는 인간 21번 염색체 상의 21q11 영역내, 바람직하게는 AL163204(GenBank 등록번호)의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계하고, 그 표적 서열보다도 텔로미어측에 있어서 텔로미어 트런케이션이 일어나도록 함으로써, 표적 서열을 설정한 영역에 있어서 장완 원위가 절단, 삭제된다(예를 들면, 黑岩 등, Nucleic Acid Research, 26:3447, 1998). 또한 예를 들면, 단완 원위를 삭제하는 경우에는 인간 21번 염색체 상의 21P 영역내, 바람직하게는 AL163201(GenBank 등록번호)의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계할 수 있다. 표적 서열의 설계는 상술한 영역에 한정되지 않고, 원하는 HAC 벡터를 제작하도록 당업자라면 적절히 설계하는 것이 가능하다.
또한 예를 들면, 인간 14번 염색체의 장완 서열을 SC20보다도 더욱 센트로미어측으로 삭제하는 경우, AL157858 영역의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계하고, 그 표적 서열보다도 텔로미어측에 있어서 텔로미어 트런케이션이 일어나도록 함으로써, 표적 서열을 설정한 영역에 있어서 장완 원위를 절단, 삭제할 수 있다. 또한 예를 들면, 단완 원위를 삭제하는 경우에는 인간 14번 염색체 상의 14p 영역내, 바람직하게는 14p12 영역내, 더욱 바람직하게는 OR4H12, OR4Q4, RNR2, OR4L1, RNU6C, FDPSL3, K12T, C14orf57, OR6S1, M195, OR4K14, MGC27165, LCH, OR10G3, OR4K3, OR4E2, H1RNA, ATP5C2, OR11H6 또는 OR4M1(미국 National Center Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 게놈 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum＆CHR=14＆BEG=0.00＆ENI))의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계할 수 있다. 표적 서열의 설계는 상술한 영역에 한정되지 않고, 원하는 HAC 벡터를 제작하도록 당업자라면 적절히 설계하는 것이 가능하다.
또한 예를 들면, 인택트(intact)한 인간 14번 염색체의 장완 서열을 삭제하는 경우에는 14q 영역내, 바람직하게는 AL512310(GenBank 등록번호)의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계하고, 그 표적 서열보다도 텔로미어측에 있어서 텔로미어 트런케이션이 일어나도록 함으로써, 표적 서열을 설정한 영역에 있어서 장완 원위를 절단, 삭제할 수 있다. 또한 예를 들면, 단완 원위를 삭제하는 경우에는 인간 14번 염색체 상의 예를 들면 14p 영역내, 바람직하게는 14p12 영역내, 더욱 바람직하게는 OR4H12, OR4Q4, RNR2, OR4L1, RNU6C, FDPSL3, K12T, C14orf57, OR6S1, M195, OR4K14, MGC27165, LCH, OR10G3, OR4K3, OR4E2, H1RNA, ATP5C2, OR11H6 또는 OR4M1(미국 National Center Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 게놈 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum＆CHR=14＆BEG=0.00＆ENI))의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계할 수 있다. 표적 서열의 설계는 상술한 영역에 한정되지 않고, 원하는 HAC 벡터를 제작하도록 당업자라면 적절히 설계하는 것이 가능하다.
상술한 바와 같이 하여, 장완 원위 및(또는) 단완 원위가 삭제된 인간 염색체 단편을 형성시키고, 이것을 보유하는 세포를 얻을 수 있다. 이와 같은 염색체 사이즈의 축소화에 의해, 세포에 있어서의 안정성을 달성할 수 있다. 또한, 본 HAC 벡터를 보유하는 세포, 및 후술하는 본 HAC 벡터가 도입되는 세포의 기능·증식 등에 악영향을 주지 않도록, 악영향을 미친다고 추정되는 염색체 영역을 제거할 수 있다.
단계 (c): 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위의 삽입
본 HAC 벡터의 제작에 있어서는, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입한다. 이 단계 (c)는 상기 단계 (b)의 전 또는 후 어디에서 행해도 무방하고, 이들의 순서는 특히 한정되지 않는다. 즉, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 있어서, 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제한 후에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입할 수도 있고, 또는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입한 후에 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제할 수도 있다.
본 기술 분야에 있어서는, 어떤 효소가 특정의 인식 부위를 인식하여 특이적으로 그 인식 부위에서 DNA의 재조합을 일으키는 현상이 알려져 있으며, 본 발명에 있어서는 그와 같은 효소 및 인식 부위의 계를 이용한다. 예를 들면, 그와 같은 계로서는 Cre/loxP 시스템이 알려져 있다(예를 들면, Sauer, B. 등, P.N.A.S., 85:5166-5170, 1998을 참조하기 바람). Cre는 박테리오 파지 P1 유래의 38KD의 단백질이고, 리콤비나아제의 Int(인테그라제) 패밀리에 속하는 것이다. 이 효소는 약 34bp의 인식 부위 loxP 서열을 인식하여, 이 부위에서 특이적으로 DNA의 재조합을 일으킨다. 또한, 이 loxP 서열의 방향성에 의해, 2개의 loxP 서열간의 DNA의 결실 또는 전좌가 발생한다는 것이 알려져 있다. 또한, 그 외에 특이적인 서열을 인식하여 재조합 반응을 일으키는 계로서는 출아 효모 유래의 리콤비나아제 FLP(Broach 등, Cell, 21:501-508, 1980), 파지 phiC31 유래의 인테그라제(Thorpe 등, P.N.A.S., 95:5505-5510, 1998) 등이 있으며, 포유 동물 세포에서도 이들 효소에 의한 DNA 재조합 반응이 일어난다는 것이 보고되어 있다(Koch 등, Gene, 249:135-144, 2000; Thyagarajan 등, Mol. Cell. Biol., 21:3926-3934, 2000).
인간 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 상기 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하기 위해서는, 공지의 유전자 재조합 수법, 예를 들면 상동 재조합법을 이용할 수 있다. 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위의 삽입 위치는, 당업자라면 필수가 아닌 유전자의 위치 등을 고려하여 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 또는 단완 근위의 임의의 위치에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입한다. 이러한 삽입 위치로서는 예를 들면, 인간 21번 염색체에 대해서는 장완 근위의 AL163203 등이 예시되고, 또한 인간 14번 염색체에 대해서는 장완 근위의 AL157858(GenBank 등록번호)보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완 근위의 AL512310(GenBank 등록번호)에 있어서의 상기 삭제 위치보다 근위, 또는 인간 14번 염색체의 단완 근위의 14p12 영역내에 있어서의 상기 삭제 위치보다 근위 등을 들 수 있다.
그 후, 후술하는 외래 DNA의 도입 수법에 따라서 리포터 유전자를 도입하고 그 발현을 확인함으로써, 인간 염색체 상에 삽입한 인식 부위 위치의 적부(適否)를 확인할 수 있다.
상기 예시한 인식 부위 중 1종류를 1개 또는 복수개 삽입할 수도 있고, 또는 상이한 계의 인식 부위를 복수개 삽입할 수도 있다. 후술하는 바와 같이, 본 HAC 벡터는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 갖기 때문에 외래 DNA를 부위 특이적으로 도입하는 것이 가능하고, 게다가 인식 부위의 설정에 의해 외래 DNA의 도입 위치를 결정할 수 있기 때문에 외래 DNA의 도입 위치가 일정해지고 위치 효과(position effect)를 받지도 않는다. 또한, 외래 DNA의 도입 조작도 간편해진다. 게다가 상이한 계의 인식 부위를 복수개 삽입함으로써, 복수개의 외래 DNA를 순차적으로 삽입할 수도 있다.
상술한 바와 같이 하여 인간 염색체를 개변하여 제작한 본 HAC 벡터에는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위 외에 프로모터, 약제 내성 유전자 등 벡터 구축에 있어서 일반적으로 삽입되는 서열 또는 요소가 삽입되어 있을 수도 있다. 이와 같은 서열 또는 요소는 상술한 바와 같이 상동 재조합법을 이용하여 본 HAC 벡터의 원하는 위치에 삽입할 수 있다.
또한, 본 발명자는 상술한 바와 같이 제작한 본 HAC 벡터(인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체)를 보유하는 세포를 선택 약제를 포함하지 않은 배지에서 장기간에 걸쳐서 계대 배양하고, 경시적으로 HAC 벡터의 보유율을 FISH법에 의해 검정한 바, 본 HAC 벡터는 숙주 세포(예를 들면, DT40 세포 및 CHO 세포)에 있어서 안정되게 보유된다는 것을 확인할 수 있었다.
2. HAC 벡터로의 외래 DNA 도입(단계 (d))
상기 HAC 벡터의 제작에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에 외래 DNA를 삽입하는 단계 (d)를 행함으로써, 본 HAC 벡터에 외래 DNA를 도입할 수 있다. 이 단계 (d)는 상술한 단계 (c) 후에 행하는 것이지만, 단계 (b)와의 순서는 특히 한정되지 않고 단계 (b)의 전 또는 후에 행할 수 있다. 따라서, 단계 (b)∼(d)의 순서는 명세서에 기재하는 순서에 한정되지 않는다는 것에 유의하기 바란다.
외래 DNA라는 것은 대상으로 하는 세포에게 있어서 외부로부터 도입되는 DNA를 가리키고, 유전자 및 그 밖의 기능 서열 등을 코드하는 DNA이다. 본 발명에 있어서 도입 대상이 되는 외래 DNA로서는 물질 생산 및 기능 개변 또는 기능 분석 등을 위하여 발현시키는 것이 요망되는 유전자, 및 그 밖의 기능 서열 등을 코드하는 DNA이라면 특히 한정되지 않는다. 그 밖의 기능 서열이라는 것은 유전자가 발현되기 위하여 기능하는 서열을 가리키고, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 시그널 서열 등을 들 수 있다.
외래 DNA의 도입은 상기 삽입되어 있는 부위 특이적 재조합 효소의 계를 이용하여 행한다. 예를 들면, Cre 효소의 인식 부위인 loxP 서열과 외래 DNA를 보유하는 표적화 벡터를 구축한다. 계속하여 본 HAC 벡터(인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체)를 보유하는 세포에 있어서 Cre 효소를 세포내에서 발현시킴으로써, loxP 서열과 인공 텔로미어 서열 사이에 끼워진 영역과 상기 표적화 벡터와의 부위 특이적 재조합으로 외래 DNA를 본 HAC 벡터 상에 삽입시킬 수 있다(黑岩 등, Nature Biotech., 18:1086, 2000).
본 HAC 벡터에는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위(loxP 서열)를 보유하는 환상 DNA를 삽입할 수 있다. 이 때문에, 대장균을 숙주로 한 플라스미드, BAC, PAC이나 효모를 숙주로 한 환상 YAC 등 기존의 벡터에 의해 클론화된 DNA를 삽입할 수 있다. 또한 인간 염색체에 기초하여 제작되어 있기 때문에, 본 HAC 벡터에 도입 가능한 외래 DNA의 사이즈의 상한은 100kb 오더까지 확장되고, 종래 발현 실험에 이용되어 온 플라스미드 벡터에 병합된 cDNA뿐만 아니라, 유전자의 발현 제어 영역을 포함하는 게놈 DNA도 도입 가능하다.
예를 들면, 본 HAC 벡터에 외래 DNA를 삽입하여 구축된 외래 DNA를 포함하는 HAC 벡터는, 그 삽입에 의해 안정 구조가 변화할 가능성, 게다가 외래 DNA를 포함하는 HAC 벡터 전체의 크기가 불리하게 커질 가능성도 생각되므로, 도입(삽입)하는 외래 DNA의 크기는 통상 약 10Mb∼약 1kb, 바람직하게는 약 3Mb∼약 2kb, 더욱 바람직하게는 약 1Mb∼약 3kb로 할 수 있다.
종래의 cDNA 강제 발현 벡터를 이용한 유전자 도입법에서는, 과잉 발현에 의한 세포 독성이나 증식 억제 등의 부작용이 생기고, 도입 유전자를 항상적으로 발현하는 세포주가 얻어지지 않는 예가 많다. 이 문제점을 극복하고, 생리적인 발현 패턴을 유지하면서 아울러 발현을 인공적으로 제어하기 위해서는, 테트라사이클린(tetracycline) 등을 이용한 유전자 발현 유도계의 적용이 바람직하다. 도입 가능한 인서트 사이즈가 크고, 일정한 카피수가 안정적으로 유지되는 본 HAC 벡터의 특징은 이와 같은 목적에 적합하다.
조직 특이적/생리적인 유전자 발현은 유전자를 코드하는 게놈 영역으로부터의 전사, 전사 산물의 편집, 핵 밖으로의 전송, 번역의 각 단계에서 제어를 받는다. 1개의 유전자에 대하여 복수개의 프로모터가 있어서 전사 개시점이 다르거나, 스플라이싱(splicing)에 변이가 발생함으로써, 조직 특이적인 이소형(isoform)이 발현된다는 것이 알려져 있다. 클론화 cDNA는 1개의 유전자에 유래하는 복수개의 전사 산물 변이체(variant)의 하나에 불과하다. 생리적인 유전자 발현을 재현하기 위해서는, 게놈 DNA로서 제어 서열을 포함하는 유전자 영역을 도입하는 것이 바람직하다. 본 HAC 벡터의 이용은 이와 같은 목적에 적합한 것이다.
인간 21번 염색체 단편을 보유하는 마우스 ES 세포로부터 키메라 개체를 제작했더니, 차세대 전달이 확인되었기 때문에, 인간 21번 염색체의 센트로미어는 마우스 세포 및 개체 중에서 복제 분배 유지된다고 생각된다(Kazuki 등, J. Hum. Genet., 46:600, 2001). 이 때문에, 본 HAC 벡터도 또한 마우스 개체 중에서 안정적으로 보유될 가능성이 높다.
인간 게놈 프로젝트에서는, 게놈 DNA가 BAC 클론으로 단리되어 염기 서열이 결정되었다. 이 때문에 공개되어 있는 데이터베이스(GenBank 등)에서는 염기 서열은 BAC 단위로도 등록되어 있다. 유전자 기능 해석의 1수단으로서 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 제작이 있다. 본 HAC 벡터를 플랫폼으로 하여 BAC를 삽입함으로써, 위치 효과를 받지 않고 항상 동일 조건에서 유전자의 발현을 해석하는 것이 가능해진다. 많은 BAC 벡터는 loxP 서열을 보유하고 있기 때문에, 본 HAC 벡터에의 삽입을 네거티브 선별하는 계를 이용하면 염기 서열이 이미 알려진 BAC를 본 HAC 벡터에 카세트 형식으로 간편하게 삽입할 수 있다고 생각된다.
상술한 이외에도, 본 HAC 벡터로의 외래 DNA의 도입 수법 및 도입의 이점이 있으며, 이하에 그 몇가지를 예시한다.
(1) 상호 전좌에 의한 염색체 부분 단편의 도입
Cre 효소에 의한 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합은, 선상 염색체와 환상 인서트(외래 DNA)의 경우는 삽입 반응이 일어나지만 선상 염색체끼리에서는 상호 전좌 반응이 일어난다. 이것을 이용하면 환상 인서트에 클로닝할 수 없는 Mb 단위 이상의 염색체 단편을 본 HAC 벡터에 도입할 수 있다(Kuroiwa 등, Gene Ther. 9:708, 2002).
(2) 삽입체 선별법
본 명세서의 실시예에 기재하는 방법에 있어서는, 본 HAC 벡터로의 외래 DNA의 삽입은 약제 내성 유전자의 재구성을 지표로 한 포지티브 선별을 이용하고 있다(재조합체의 포지티브 선별에 관해서는, WO00/10383호를 참조하기 바람). 이것 대신에, 티미딘 키나아제(thymidine kinase)/간시클로비르(ganciclovir)계 등의 네거티브 선별에 의해 인서트 삽입체(외래 DNA가 삽입된 것)를 얻는 것도 가능하다. 이 경우, 삽입하는 환상 DNA에는 loxP 서열만이 포함되어 있어도 무방하다. 게놈 프로젝트에서 이용된 BAC 라이브러리는 loxP 서열을 포함하고 있으므로, 이와 같은 네거티브 선별의 계를 확립할 수 있으면 서열을 이미 알고 있는 게놈 클론을 본 HAC에 용이하게 삽입하는 것이 가능해진다.
(3) 복수 인서트의 삽입
본 발명에 있어서 바람직하게 이용되는 loxP 서열은 P1 파지에 유래하는 야생형의 서열이고, Cre 효소에 의한 HAC 벡터 상의 loxP 서열로의 환상 인서트의 삽입 반응은 가역적이다. 본 명세서에 기재하는 실시예에 있어서는, Cre 효소를 일과성으로 발현시키고 약제 내성의 획득을 지표로 부위 특이적인 재조합체를 선별함으로써 구성적인 삽입체가 얻어졌다. 한번 환상 인서트가 삽입되면, HAC 벡터 상에 2개의 loxP 서열이 남는다. 이 때문에, 재차 Cre 효소를 발현시키면 역반응(환상 인서트의 절출)이 일어날 가능성도 있으며, 이차적으로 인서트를 삽입하는 등의 더 한층의 HAC 벡터의 개변은 곤란해진다. 한편, 염기 치환을 행한 변이 loxP 서열의 조합에 따라서는 반응 방향 및 반응의 특이성을 한정할 수 있다는 보고가 있다(Hoess 등, Nucleic Acids Res., 14:1986; Araki 등, Nucleic Acids Res., 25:868, 1997; Lee 등, Gene, 216:55, 1998). 이와 같은 변이 loxP 서열을 이용함으로써, 상술한 역반응을 일으키지 않고 복수개의 환상 인서트를 순차적으로 삽입하는 계도 구축 가능하다.
(4) 카피수 의존적 발현 제어
α글로빈 유전자 트랜스제닉 마우스를 이용하여 숙주 염색체 상에 랜덤하게 삽입된 유전자의 카피수와 mRNA 발현량의 관계를 해석한 보고(Sharpe 등, Proc Natl Acad Sci USA, 90:11262, 1993)에서는, 발현량과 도입 유전자 카피수 간에 상관 관계는 보이지 않는다. 이것은 트랜스제닉 동물 계통에 의해 도입 유전자의 발현량이 크게 달라지고, 또한 도입한 유전자의 카피수에 비례하지 않는 발현이 일어나는 위치 효과라 불리우는 현상에 의한 것이라고 생각되고, 트랜스제닉 동물에 있어서의 유전자 도입에서는 빈번하게 일어나는 현상이다. 또한, 도입 유전자의 위치 효과를 배제하여 비교하기 위해 외래 DNA의 삽입 위치를 미리 숙주 염색체 상에 도입한 loxP 사이트에 확정하고 Cre-loxP 재조합 반응에 의해 플라스미드 벡터로부터 목적하는 DNA 유닛을 도입하는 트랜스제닉 마우스의 보고(Garrick 등, Nature Genet., 18:56, 1998)가 있지만, 여기에서도 카피수 의존적 발현 제어는 실현되어 있지 않다.
한편, 티로시나아제(tyrosinase) 게놈 영역을 도입한 YAC를 이용하여 제작한 트랜스제닉 마우스에 있어서, 도입한 게놈 영역의 카피수 의존적인 티로시나아제 발현이 보였지만(Schedl 등, Nature, 362:258-261, 1993), 생리적 발현 제어 영역을 포함하는 게놈을 이용하는 점에서 위치 효과의 영향을 받지 않는다고 생각되고, 본 발명과 같은 생리적 제어 영역을 포함하지 않는 인공적인 유전자 발현 유닛만을 다수 카피화하여 발현시키는 것은 아니다. 또한, 각종의 에피좀 벡터는 숙주 염색체와 독립적으로 존재하고 외래 DNA 삽입 위치도 정해져 있지만, 세포내에서의 벡터 자신의 카피수를 엄밀하게 제어하는데에는 이르러 있지 않다(Morlino 등, ppl Environ Microbiol., 65:4808-4013, 1999; Cooper 등, Proc Natl Acad Sci USA., 94:6450-6455, 1997).
본 발명에 있어서는 실시예 9에 나타낸 바와 같이, 목적 유전자(EPO를 사용)의 발현 유닛을 다수 카피 연결하여 병렬 배치하고 HAC 벡터 상의 정해진 위치(loxP 사이트)에 도입함으로써, 숙주 염색체에 변이를 주지 않고 카피수 의존적 발현 제어를 행할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 의해 외래 DNA로서 다수 카피의 목적 유전자를 원하는 세포에 도입하고, 이 세포에 있어서 상기 목적 유전자를 카피수 의존적으로 발현시키는 것이 가능함과 아울러, 이 세포를 이용하여 만들어낸 트랜스제닉 동물에 있어서는 위치 효과를 받지 않고 종래에는 곤란하였던 카피수 의존적인 목적 유전자의 발현을 달성하는 것이 가능해진다.
3. HAC 벡터의 세포로의 이입
본 HAC 벡터 또는 외래 DNA를 포함하는 본 HAC 벡터를 보유하는 세포로부터, 이들 벡터를 그 이외의 세포로 이입할 수 있다. 이입처가 되는 세포는 특히 한정되는 것은 아니지만, 동물 세포(포유 동물 세포) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 상처가 없는 상태에서 인간 염색체를 이입 가능하다는 것이 알려져 있는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 이용하는 것이 바람직하다(WO00/10383호 참조). CHO 세포는 효율성 좋게 마이크로셀을 형성한다는 것이 알려져 있으며(예를 들면, Koi 등, SCIENCE 260:361, 1993), 이에 따라 본 HAC 벡터를 CHO 세포로부터 또 다른 세포(CHO 세포 이외의 세포)로 이입하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명에 있어서는 본 HAC 벡터를 다분화능을 갖는 세포에 이입하는 것도 가능하다. "다분화능을 갖는 세포"라는 것은 소정의 조작에 의해 특정 세포 또는 조직으로 분화 가능한 세포를 의미한다. 예를 들면, 숙주 배(胚)로의 주입 또는 집합 배(胚) 형성 등의 조작을 행함으로써 키메라 동물의 2종류 이상의 세포 또는 조직으로 분화 가능한 세포, 구체적으로는 배성(胚性) 줄기 세포(ES 세포), 배성 생식 세포(EG 세포), 배성 종양 세포(EC 세포) 등이 포함된다. 또한 예를 들면, 증식 인자(예: 형질전환 증식 인자; TGF) 등을 첨가한 유도 배지에서의 배양에 의해 뼈 세포, 연골 세포 또는 지방 세포로 분화 가능한 세포, 구체적으로는 체성 줄기 세포(예: 간엽계 줄기 세포) 등이 포함된다.
본 명세서 중에서 사용되는 "배성 줄기 세포"라는 것은 ES 세포라고도 불리어지며, 미분화성(전능성)을 유지한 채 증식 가능한 것을 특징으로 하는 초기 배 유래의 배양 세포를 의미한다. 즉, 배성 줄기 세포는 동물의 초기 배(胚) 중의 배반포(胚盤胞) 내부에 존재하는 미분화 줄기 세포인 내부 세포괴의 세포를 배양하고, 미분화 상태를 유지한 채로 계속하여 증식하도록 수립된 세포주이다. 또한 "배성 생식 세포"라는 것은 EG 세포라고도 불리어지며, 상기 배성 줄기 세포와 거의 동등한 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 원시 생식 세포 유래의 배양 세포를 의미한다. 배성 생식 세포는 수정후 수일∼수주간, 예를 들면 마우스의 경우에는 약 8.5일을 경과한 배(胚)에서 얻은 원시 생식 세포를 배양하여, 미분화 상태를 유지한 채로 계속하여 증식하도록 수립된 세포주이다.
또한, 인간을 대상으로 한 유전자 세포 치료나 조직 재생 치료에 있어서 재료가 되는 세포는, 암화(癌化) 등을 피하기 위한 안전성의 관점에서 불사화(不死化) 세포가 아니라 정상 세포를 이용하는 것이 바람직하다고 일컬어지고 있다. 불사화 세포나 암화 세포로의 염색체 이입예는 인간 및 그 밖의 동물에서 다수 있지만, 정상 체세포로의 염색체 이입예는 소에 있어서 태자(胎仔) 정상 섬유아세포로의 이입(Kuroiwa 등, Nature Biotech., 20:889, 2002)이 보고되어 있지만, 인간에 있어서는 적어도 검색 키; Chromosome, transfer, human, normal, primary or somatic, cell로 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 문헌 데이터베이스 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/entrez/query.fcgi?d b=PubMed)를 서치하는 한에 있어서 해당하는 것은 찾지 못하였다. 이로부터, 인간 정상 체세포로의 염색체 이입은 곤란하다는 인식이 일반적이었다.
본 발명에 있어서는 실시예 13 및 14에 나타낸 바와 같이, 인간 14번 염색체 유래 단편 또는 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포로의 이입이 가능하다는 것을 최초로 밝혔다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 섬유아세포 이외의 인간 정상 체세포로의 인간 14번 염색체 유래 단편 또는 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 이입이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에 따라서 제작된 인간 염색체 유래 HAC 벡터라면, 인간 14번 염색체 또는 인간 21번 염색체에 제한되지 않고 인간 정상 체세포로 이입하는 것이 가능하다.
HAC 벡터의 세포로의 이입은 마이크로셀법을 이용하여 행할 수 있다. 마이크로셀법은 상기 "1. 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제작"의 항에 기재한 바와 같이 행할 수 있다.
또한 본 HAC 벡터의 세포로의 이입에 관하여, 최초로 준비한 인간 염색체를 보유하는 세포로부터, 인간 염색체로의 개변을 행하는 단계의 전, 단계 중, 또는 단계의 후의 어느 단계에 있어서도 인간 염색체(HAC 벡터)를 다른 세포에 이입하는 것이 가능하다.
4. HAC 벡터의 용도
본 발명의 목적은 벡터라는 기본 툴과 그 이용 기술의 제공이고, 학술 연구에서 산업에 이르는 매우 폭넓은 영역에 파급 효과를 가져오리라는 것이 기대된다. ① 숙주 염색체에 삽입되지 않고 독립하여 유지된다(숙주 유전자의 변이나 암화의 염려가 없다), ② 일정한 카피수로 장기간 안정적으로 보유된다(과잉 발현, 발현 소실의 염려가 없다), ③ 도입 가능한 DNA의 길이의 제한이 없다(정상적인 발현 제어를 보증하는 DNA 요소를 포함하는 유전자나 복수 유전자를 동시에 도입 가능함)라는 본 HAC 벡터의 특징은, 종래의 벡터에서 불가능하였던 많은 것을 가능하게 한다고 상상된다. 본 HAC 벡터의 용도로서는, 한정되는 것은 아니지만 주요한 것을 들자면, ① 동물 배양 세포에 있어서 유전자 기능 해석용 벡터, ② 인간 질환 유전자 치료용 벡터, ③ 인간 장기 줄기 세포, 배(胚) 줄기 세포(ES 세포)로의 유전자 도입용 벡터, ④ 유전자 도입 동물 제작용 벡터(예: 인간 질환 모델 동물 제작, KO 동물과 조합한 특정 유전자의 인간화) 등이 고려된다. 이하에, 본 HAC 벡터의 용도의 일례로서 (1) 외래 DNA의 수용 세포로의 도입, (2) 외래 DNA를 발현하는 세포의 제작, (3) 단백질의 제조, (4) 유전자 기능 해석용 벡터, (5) 줄기 세포로의 유전자 도입용 벡터, (6) 배양 피더 제작용 벡터, 및 (7) 인간 질환 치료용 벡터를 설명한다.
(1) 외래 DNA의 수용 세포로의 도입
본 HAC 벡터는 세포 중에서 외래 DNA를 삽입하거나 외래 DNA가 삽입된 HAC 벡터를 다른 세포에 이입하거나 할 수 있기 때문에, 외래 DNA를 원하는 수용 세포에 도입할 수 있다. 외래 DNA의 수용 세포로의 도입에는 예를 들면, 이하의 단계가 포함된다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계;
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(g) 융합한 수용 세포에 있어서 외래 DNA의 도입을 확인하는 단계.
단계 (a)∼(d)는 상술한 바와 같이 행할 수 있으며, 단계를 행하는 순서는 이에 한정되지 않는다.
단계 (e) 및 (f)에 있어서는, 인간 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀법을 이용하여 수용 세포에 당해 염색체 단편을 이입한다. 이입 대상이 되는 인간 염색체는 단계 (b)∼(d)에 있어서의 염색체의 개변전, 개변 단계의 도중, 또는 개변 후의 것으로 할 수 있다. 따라서 예를 들면, 단계 (d)에 있어서 인간 염색체에 외래 DNA를 삽입하기 전에, 인간 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀법을 이용하여 수용 세포에 당해 염색체를 이입해도 무방하다. 그 후, 단계 (d)의 외래 DNA의 삽입 조작을 수용 세포에 있어서 행하여, 외래 DNA가 삽입된 인간 염색체를 수용 세포에 유지시킬 수도 있다. 이들 단계는 다른 순서로 행할 수도 있고, 단계 (d)∼(f)의 순서는 상기 순서에 한정되지 않는다.
마이크로셀법은 상기 "1. 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제작"의 항에 기재한 바와 같이 행할 수 있다. 여기서 사용하는 수용 세포는 특히 한정되는 것은 아니지만 동물 세포, 특히 포유 동물 세포(예를 들면 마우스 세포, 인간 세포 등)가 바람직하다. 또한, 상술한 바와 같은 다분화능을 갖는 세포, 예를 들면 배성 줄기 세포(ES 세포), 및 간질계 줄기 세포 및 조직 줄기/전구 세포 등을 수용 세포로서 이용하는 것도 가능하다.
계속하여 단계 (g)에 있어서는, 수용 세포에 외래 DNA가 도입(이입)되어 있는지의 여부를 확인한다. 이 확인은 본 기술 분야에서 공지의 수법에 의해 행할 수 있으며, 예를 들면 외래 DNA의 제한 효소 부위에 대응하는 프로브를 이용한 서던 블롯 해석 등에 의해 외래 DNA의 도입을 확인할 수 있다.
본 HAC 벡터를 이용함으로써, 큰 사이즈의 외래 DNA를 세포에 도입하고 안정적으로 보유시키는 것이 가능해진다.
(2) 외래 DNA를 발현하는 세포의 제작
본 HAC 벡터는 상술한 바와 같이, 세포 중에 외래 DNA를 삽입하거나 외래 DNA가 삽입된 HAC 벡터를 다른 세포에 이입하거나 할 수 있기 때문에, 외래 DNA를 발현하는 세포를 제작할 수도 있다. 외래 DNA를 발현하는 세포의 제작에는 예를 들면, 이하의 단계가 포함된다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계;
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(g) 융합한 수용 세포에 있어서 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택하는 단계.
단계 (a)∼(f)는 상술한 바와 같이 행할 수 있으며, 단계를 행하는 순서는 이것에 한정되지 않는다.
단계 (g)에 있어서는, 수용 세포에 있어서 외래 DNA의 발현을 확인하고 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택한다. 외래 DNA의 발현 확인은 본 기술 분야에서 공지의 수법에 의해 행할 수 있으며, 예를 들면 외래 DNA에 대응하는 프로브를 이용한 노던 블롯법 등을 들 수 있다.
본 HAC 벡터를 이용함으로써, 큰 사이즈의 외래 DNA를 발현하는 세포를 제작하는 것이 가능해진다.
(3) 단백질의 제조
본 HAC 벡터를 이용함으로써, 상술한 바와 같이 외래 DNA를 세포에 도입하는 것이나 외래 DNA를 발현하는 세포를 제작할 수 있기 때문에, 당해 외래 DNA에 의해 코드되는 단백질을 제조할 수 있다. 단백질의 제조에는 예를 들면, 이하의 단계가 포함된다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계;
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 발현하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 단백질을 코드하는 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계;
(g) 융합한 수용 세포를 배지 중에서 배양하는 단계; 및
(h) 얻어지는 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계.
단계 (a)∼(f)는 상술한 바와 같이 행할 수 있으며, 단계를 행하는 순서는 이것에 한정되지 않는다.
단계 (g)에서는, 단계 (f)에서 융합한 수용 세포를 배지 중에서 배양한다. 수용 세포를 배양하기 위한 배지는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 상기 수용 세포의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지라면 천연 배지, 합성 배지의 어느 것을 이용해도 되고, 당업자라면 적절한 배지를 선택하고 또한, 필요에 따라 적절히 수정을 가하여 배지를 조제할 수 있다. 또한, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건, 온도, pH, 배양 기간 등도 적절히 설정한다.
배양 후, 단계 (h)에 기재하는 바와 같이 얻어진 배양물로부터 단백질을 채취한다. "배양물"이라는 것은 배양 상청 외에 배양 세포 또는 세포의 분쇄물의 어느 것이나 의미하는 것이다. 배양 종료후 이 배양물로부터 단백질을 채취함에 있어서는, 통상의 단백질 정제 수단 등을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들면 세포내에 생산된 경우에는 통상의 방법에 의해 세포를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리, 가압 파쇄 등에 의해 단백질을 추출한다. 필요에 따라서 프로테아제 저해제를 첨가한다. 또한, 배양 상청에 생산된 경우에는 배양액 그 자체를 이용할 수 있다. 또한, 배양 상청에 생산된 경우에는 배양액 그 자체를 이용할 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심 분리 등을 행하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 프로타민 처리 등에 의해 핵산을 제거한다.
다음으로, 이것에 유안(硫安), 알콜, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고, 침전물을 채취하여 조단백질 용액을 얻는다. 이 단백질 용액을 각종 크로마토그래피, 전기 영동 등을 실시하여 정제 요소 표본을 얻는다. 예를 들면 세파덱스, 울트라겔 또는 바이오겔 등을 이용하는 겔 여과, 이온 교환체 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드겔 등을 이용하는 전기 영동법, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 이용하는 분획법을 적절히 선택하거나 이들을 조합함으로써, 정제된 목적 단백질을 얻을 수 있다. 그러나 상기 배양법, 정제법은 일례이고 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 제조 대상으로 되는 단백질은 제조가 요망되는 단백질이라면 특히 한정되는 것은 아니지만, 일례로서는 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 폰 빌브랜드 인자(vWF), 디스트로핀, 도파민 합성 효소, 인슐린, 인슐린 유사 증식 인자(IGF), 인슐린 유사 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로머라제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구·마크로파지 콜로니 자극 인자, 면역 글로불린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD 40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린뉴클레오티드 포스포릴라제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(oncostatin M), Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 증식 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴(angiopoietin), 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈(activin), 형질전환(transforming) 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt) 등이 예시된다. 이와 같은 제조 대상의 단백질을 코드하는 유전자(즉, 외래 DNA)는 예를 들면 공공의 유전자 데이터베이스 등을 이용하여 그 서열 정보를 입수할 수 있다.
(4) 유전자 기능 해석용 벡터
본 HAC 벡터에 삽입한 외래 DNA는 세포 중에서 카피수 의존적이면서 아울러 안정적으로 발현되기 때문에, 본 HAC 벡터는 유전자 기능을 해석하기 위하여 이용할 수 있다.
표적 유전자를 코드하는 염기 서열의 일부에 상보적인 서열로 이루어지는 2개쇄 RNA(double-stranded RNA; dsRNA)를 발현시킴으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 수법, RNA 간섭이 알려져 있다(예를 들면, 단쇄 간섭 RNA(siRNA)에 관해서는 Elbashir 등, Nature, 411:494, 2001; McCaffrey 등, Nature, 418:38, 2002를 참조. 또한, Shinagawa, T. 등, Genes ＆ Development, 17:1340-1345, 2003도 참조). dsRNA를 코드하는 DNA를 유전자 발현 유도계와 함께 HAC 벡터 상에 도입함으로써, 표적 유전자의 콘디셔널한 기능 억제가 가능하다. 또한, 유전자 발현 유도계를 대신하여 게놈 영역을 이용함으로써 조직 특이적/생리적인 부위에서의 기능 억제가 가능하다.
또한, 목적 분자에 의한 작용 효과를 해석하고자 하는 경우에, 그 목적 분자의 용량 의존성을 지표로 하여 해석하는 수법이 있다. 이 수법에 있어서, 본 발명에 따라 목적 분자를 코드하는 유전자의 발현 유닛의 카피수를 바꾸어 HAC 벡터 상에 도입하고 세포 등(조직, 개체도 포함)에 이입함으로써, 이 세포 등에 있어서의 카피수 의존적 발현 제어에 기초하여 용량 의존성 해석을 행하는 것이 가능하다. 또한, 유전자 발현 제어를 위하여 발현 유도계나 게놈 영역을 이용함으로써 콘디셔널 또는 조직 특이적/생리적인 기능 해석이 가능하다.
(5) 줄기 세포로의 유전자 도입용 벡터
본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터는 실시예 20 및 21에 나타낸 바와 같이, 배성 줄기(ES) 세포 또는 간엽계 줄기 세포(Mesenchimal Stem Cell; MSC)로의 유전자 도입용 벡터로서 이용할 수 있다. 그리고, 상기 HAC 벡터는 ES 세포 또는 MSC에 있어서 장기간 안정적으로 존재할 수 있다.
실시예 20 및 21에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터를 보유하는 MSC로부터 분화 유도한 조직 세포에 있어서는 HAC 벡터가 안정적으로 보유된다. 또한, 인간 21번 염색체 단편을 보유하는 마우스 ES 세포로부터 키메라 개체를 제작하면 상기 염색체 단편이 차세대에 전달된다는 것, 및 조직 중의 ES 세포로부터 분화한 세포에 있어서 인간 21번 염색체 단편이 유지되어 있다는 것이 확인되었으므로(Kazuki 등, J. Hum. Genet., 46:600, 2000), 본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터 이입 ES 세포로부터 분화 유도한 조직 세포에 있어서도 HAC 벡터가 안정적으로 보유된다고 생각된다.
또한 최근, 여러가지 조직의 줄기 세포 및 골수 유래의 다능성 세포가 동정되어 있다(橫田 등, 실험 의학(증간), 19권 15호, 2001년, 양토사, 岡野 등, 실험 의학(증간), 21권 8호, 2003년, 양토사, Li 등, Nature Med., online:31 August 2003, doi:10.1038/nm925). 본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터는 조직 줄기/전구 세포, 예를 들면 골수, 혈액, 신경, 근육, 간장, 췌장, 피부, 내이(內耳) 등에서 유래하는 다능성 줄기/전구 세포로의 유전자 도입용 벡터로서 이용 가능하다.
또한 ES 세포, MSC, 및 조직 줄기/전구 세포의 인간 임상 응용을 고려하는 경우, 치료 처치에 필요한 양의 세포를 증폭하여 원하는 분화 상태에서 제공하는 것이 요구된다. 종래에는, 다분화능을 유지한 채 줄기 세포만을 대량으로 증폭하는 것이 용이하지 않아 과제의 하나로 되어 있다(日野 등, 실험 의학, 19권 15호 증간:10, 2001, 양토사). 예를 들면, 조혈 줄기 세포나 신경 줄기 세포를 생체 조직에서 채취하고 배양하면, 줄기 세포뿐만 아니라 줄기 세포에서 분화한 전구 세포나 성숙 세포도 동시에 증폭되기 때문에 임상 용도로는 바람직하지 않다(岡野 榮之, 실험 의학, 19권 15호 증간:80-90, 2001, 양토사).
본 발명에 있어서는 다분화능 유지에 관한 인자, 예를 들면 마우스 ES 세포에서는 활성화형 Stat3, Oct-3/4, Nanog 등의 전사 인자(Niwa 등, Genes Dev.12:2048, 1998; Matsuda 등, EMBO J., 18:4261, 1999; Niwa 등, Nature Genet., 24:373, 2000; Mitsui 등, Cell, 113:631, 2003; Chambers 등, Cell, 113:643, 2003)를 코드하는 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제작하고 줄기 세포에 이입함으로써, 숙주 염색체를 변이시키지 않고 다분화능을 유지하면서 아울러 간편하게 줄기 세포를 증폭시키기 위하여 이용하는 것이 가능하다.
또한, 줄기 세포의 분화 제어에 있어서는 관여하는 분자의 발현량 조절이 중요한 요소로 되어 있다. 예를 들면, 마우스 ES 세포의 상기 Oct-3/4에 의한 분화 제어에 있어서 그 발현량이 생리적 발현 수준을 100%로 한 경우는 미분화 상태를 유지하지만 50% 이하의 경우는 영양 외태엽으로 분화하고, 또한 150% 이상에서는 원시 내태엽으로 분화한다(Niwa 등, Nature Genet., 24:373, 2000). 이와 같은 발현 수준의 변화에 의해 분화를 제어하는 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터에 유전자 발현 ON/OFF 유도계(예를 들면, 테트라사이클린에 의한 발현 유도계)를 도입함으로써 엄밀한 발현량 조절이 가능해진다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터에 유전자 발현 ON/OFF 유도계(예를 들면, 테트라사이클린에 의한 발현 유도계)와 분화 유도 인자를 조합하여 도입함으로써, 다분화능 유지 상태와 분화 유도 상태를 전환하는 것이 가능하다.
줄기 세포에 의한 조직 재생을 행할 경우, 이식 세포 또는 도너 유래의 재생 조직은 장기간(바람직하게는 생애)에 걸쳐 레시피언트(recipient) 개체의 일부로 되어 기능한다. 이 때문에, 암화 등의 생리적 제어의 일탈을 도너 세포에 유발하는 원인(예를 들면, 유전자 변이)를 부여하는 조작은 극력 회피하는 것이 바람직하다. 본 HAC 벡터는 숙주 염색체와 독립하여 존재할 수 있기 때문에, 유전자 도입을 숙주 염색체에 변이를 주지 않고 행할 수 있다. 또한 실시예 13, 14, 18 및 19에 나타낸 바와 같이 인간 세포 중에서 안정적으로 존재할 수 있기 때문에, 장기간에 걸쳐서 안정되게 목적 분자를 발현할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서, 분화시킨 조직에서 생리적으로 발현되는 유전자의 게놈 영역 또는 조직 특이적 발현 제어 영역을 포함한 게놈 서열하에 목적 유전자를 융합한 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제작하고, 상기 HAC 벡터를 이입한 줄기 세포를 이용함으로써, 재생한 조직에 있어서 생리적/조직 특이적으로 목적 분자를 발현하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터를 보유하는 줄기 세포를 분화 유도한 후 도입 유전자의 발현이 필요하지 않으면, HAC 벡터는 사용하지 않는 경우가 있다. 분화 유도후에 HAC 벡터 탈락 클론을, 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 예를 들면, 선택 배양에 있어서의 약제 내성을 지표로 하여 선별함으로써 사용하지 않게 된 HAC 벡터를 배제하는 것이 가능하다.
(6) 배양 지지 피더 세포 제작용 벡터
세포 배양법의 하나로서, 배양기 저면에 부착성 세포를 깔아 채운 배양 지지 피더 세포 상에 목적하는 세포를 파종하여 공배양하는 방법이 알려져 있다(일본 생화학회편, 신생 화학 실험 강좌 14 발생 분화 노화, 1992년, 동경 화학 동인). 예를 들면, 조혈 전구 세포를 증식시키는 경우에는 SCF, Flt3L, TPO, IL-6, sIL-6R 등의 필요한 인자를 각각 예를 들어 재조합체 단백질로서 준비하고, 배양액에 첨가하여 배양한다(Ueda 등, J Clin Invest., 105:1013-1021, 2000). 종래법에 의해 배양 첨가물의 유전자를 배양 지지 피더 세포에 도입하는 것이 가능하지만, 숙주 염색체로의 랜덤 삽입에 의한 변이·포지션 효과, 발현 불활화, 다수 카피 발현 유닛 병렬에 의한 하류 유전자 발현의 감약 등에 의해 모든 인자에 대하여 원하는 발현량을 제어하여 공급하는 것은 곤란하다고 생각된다. 본 발명의 방법에 의해 이들 필요 인자를 코드하는 DNA 전체(또는 일부)를 도입한 HAC 벡터를 제작하고 배양 지지 피더 세포에 이입함으로써, 재조합체 단백질 등을 나중에 부가하지 않고 단순한 공배양만으로 간편하게 필요한 인자를 모두 보급하는 것이 가능하다. 또한, 유전자 발현 유도계를 이용함으로써 이들 인자의 콘디셔널한 발현 제어가 가능하다.
(7) 인간 질환 치료용 벡터
인간 질환 치료용의 벡터는 바이러스성 및 비바이러스성 벡터가 종래부터 각종 연구되고 있지만, 면역 반응의 야기, 도입 DNA 사이즈의 한계, 숙주 염색체 삽입 변이, 저도입 효율·저발현 효율, 발현량 제어의 곤란(金田 安史, 임상 면역, 39권:551-558, 2003년, 과학 평론사, 小澤 敬也 편집, 유전자 치료, 1997년, 양토사) 등의 여러가지 과제가 지적되고 있다. 어떠한 벡터에도 공통하는 과제로서, "바람직한 발현량을, 바람직한 타이밍으로 제어하는" 것이 요구되고 있다.
HAC 벡터를 이용한 유전자 세포 치료의 전략으로서, ① 1차적으로 결손된 효소나 단백질의 보충, ② 2차적으로 감소되어 있는 대사 산물을 보충하는 대증 요법, ③ 세포에 신기능을 부가하고 세포의 생존을 높이는 방법(예를 들면, 개변 세포를 이용한 조직 재생에 있어서 HAC 벡터는 게놈을 도입함으로써 생리적/조직 특이적 유전자 발현 제어를 행하는 것이 가능하다. 또한, 이에 의해 과잉 발현 또는 발현 부족에 따른 기능 장해 등의 부작용을 회피할 수 있다), ④ 기능 획득(Gain of function)의 형태로 진행하는 변성 질환의 장해를 저지하는 방법(예를 들면, 파킨슨병에 있어서의 GDNF 보충 치료) 등을 들 수 있다.
즉, 본 HAC 벡터는 인간 질환 치료용 벡터로서 사용하는 것이 가능하고, 치료용의 외래 DNA를 도입한 HAC 벡터를 세포에 이입한 후 그 세포를 환자에게 투여하기 위한 의약 조성물로서 제조하는 것이 가능하다. 또한, 이러한 인간 질환 치료용 벡터는 질환의 치료뿐만 아니라, 질환의 예방에도 사용하는 것이 가능하다.
적용 범위를 특히 한정하는 것은 아니지만, 이하에 인간 질환 치료용 벡터로서의 적용예를 나타낸다.
(A) 텔로머라제의 이용
유전자 세포 치료나 조직 재생 치료에 있어서 재료가 되는 세포는, 그 안전성 관점에서 불사화 세포가 아니라 정상 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 그러나 정상 체세포는 일정 횟수 분열하면 증식·분열이 멈추어 결국에는 사멸, 즉 노화된다고 알려져 있다(井出 利憲, 실험 의학, 16권 18호 증간:18-24, 1998, 양토사). 치료 효과를 장기간 지속시키기 위하여, 치료용 세포는 일정 기간, 바람직하게는 병에 걸린 환자의 생애를 통해 유지되는 것이 필수이다. 염색체 말단에 존재하는 반복 서열 텔로미어의 수복 효소인 텔로머라제는, 정상 세포내에서 과잉 발현시킴으로써 세포 노화시에 보여지는 텔로미어 단축을 억제하고 세포의 수명을 연장할 수 있다는 것이 알려져 있다(Bodnar 등, Science, 279:349-352, 1998). 또한, 텔로머라제는 세포내에서 과잉 발현시키더라도 불사화 또는 암화를 유도하는 것은 아니라는 것이 드러나 있다(眞貝 洋一, 실험 의학, 16권 18호 증간:25-30, 1998, 양토사, Jiang 등, Nature Gent., 21:111-114, 1999). 이 때문에, 본 발명의 방법에 의해 인간 텔로머라제(hTERT)를 코드하는 유전자를 HAC 벡터 상에 도입하고 표적이 되는 세포에 이입함으로써, HAC 이입 세포의 수명을 연장하고 불사화 또는 암화시키지 않고 치료 효과를 장기간 지속시키는 것이 가능하다. 또한, 유전자 발현 제어를 발현 유도계나 게놈 영역을 이용함으로써 콘디셔널 또는 조직 특이적/생리적인 텔로머라제 발현이 가능하다.
(B) 자기 항체 생성의 억제
재조합체 단백질 제제를 개발하는 경우, 투여시의 자기 항체(활성 중화 항체)의 생성이 장해로 되어 있다(Li 등, Blood, 98:3241-3248, 2001). 환자에의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 의해 제작한 목적 단백질을 코드하는 게놈을 도입한 HAC 벡터를 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 정상 인간 세포에 이입한 후, 이것을 환자에게 이식한다. 이 환자에게 있어서 HAC 벡터로부터 목적 단백질을 생리적/조직 특이적으로 발현·공급함으로써, 환자에 있어서 자기 항체 생성의 억제가 가능하다.
(C) 면역 유전자 세포 요법에 있어서 유전자 도입용 벡터
재발 백혈병에 대한 치료법으로서, 이식편 대 백혈병 반응에 의해 이식 임파구가 종양 특이적 세포 상해성 T세포로서 백혈병 세포를 공격하는 것을 응용한 도너 임파구 수주(輸注) 요법(Kolb 등, Blood, 76:2462, 1990)이 알려져 있다. 상기 요법의 부작용으로서 이식 세포가 레시피언트 조직을 공격하여 장해를 주는 이식편 대 숙주병이 알려져 있지만 이것에 대한 하나의 대처법으로서, 도너 임파구로의 레트로 바이러스에 의한 약제 유도성 자살 유전자 도입 및 약제 투여에 의한 도너 임파구의 제거가 행해지고 있다(小野寺 등, 게놈 의학, 3권:45, 2003, 메디컬 리뷰사). 상기 방법의 경우, 도너 임파구의 염색체에 변이를 줄 위험성이 남는다.
본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터는, 숙주 염색체에 변이를 주지 않는 면역 유전자 세포 요법에 있어서의 유전자 도입용 벡터로서 이용하는 것이 가능하다. 또한, 항종양 활성 촉진을 목적으로 한 치료, 예를 들면 임파종에 있어서 CD40 리간드에 의한 면역 활성화 요법(加藤 등, 게놈 의학, 3권:53, 2003, 메디컬 리뷰사) 등에 있어서 유전자 도입용 벡터로서도 이용하는 것이 가능하다.
(D) 모노클로날 완전 인간 항체 보충
최근, 인간 항체 생산 마우스를 이용한, 완전 인간 모노클로날 항체 의약품의 창제가 시도되고 있다(石田 등, Bio 벤처, 2권:44, 2002, 양토사, Mori 등, Cell Death and Differentiation, in press, 2003, Proceedings of American Association for Cancer Research, Volume 44, 2nd Edition, July 2003, p1285, #6422). 그러나 이것을 만성 질환에 적용하는 경우에는, 정기적인 TPO 투여를 위해 병원에 통원해야 하고 환자의 QOL 장해가 되는 것이 예측된다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 방대한 비용이 들고, 그 결과 고액의 의료비 부담이 생긴다는 것도 과제의 하나로 되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 제작한 HAC 벡터 상에 목적 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 단리된 목적 항체를 코드하는 게놈 영역을 도입하고, 예를 들면 환자 조혈 줄기 세포나 B 세포에 상기 HAC 벡터를 이입한 후 환자에게 재이식함으로써, 완전 인간 항체를 생리적 발현 제어에 의해 보충·공급하는 것이 가능하다. 또한, 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 줄이고 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(E) 단일 유전성 환자에 있어서의 결손 보충
(E-1) 혈우병
혈우병 A는 혈액 응고 제8 인자의 변이, 혈우병 B는 혈액 응고 제9 인자의 변이가 원인이 되어 일어나는 반성 열성 유전성 출혈 질환이다. 치료법으로서 제8 또는 제9 인자 농축 제제의 투여에 의한 보충 요법이 유효하지만, 출혈후 투여에서는 중대한 합병증이 생기는 것, 농축 제제에의 병원체 혼입의 가능성, 반복 투여에 따른 자기 항체(활성 중화 항체)의 발생, 상시 출혈에의 대처 준비에 따른 환자 QOL의 저하, 고액의 의료비 등 문제가 많아 유전자 치료법에 의한 해결이 기대되고 있다. 종래 벡터에 의한 임상 유전자 치료 연구가 행해지고 있지만, 충분한 발현을 장기간 지속할 수 없으며 유의한 치료 효과를 얻는데는 이르러 있지 않다. 또한, 레트로 바이러스 및 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터를 직접 투여하는 임상 연구에 있어서 피험자의 정액 중에 벡터 유전자가 검출되어 생식 세포로의 유전자 도입의 위험성이 지적되고 있다(望月 등, 게놈 의학, 3권:25, 2003, 메디컬 리뷰사). 제8 인자를 코드하는 유전자는 전장 게놈으로서 약 1.5Mb, cDNA로서 약 7kb에 이른다. 비바이러스 벡터나 아데노 바이러스 벡터에서는, 전장 cDNA의 도입은 가능하지만 발현량의 저하가, 또한 AAV 벡터에서는 도입 DNA 사이즈가 약 4.9kb이하로 한정되기 때문에 전장 유전자를 도입할 수 없다는 것이 과제로 되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 혈액 응고 제8 인자 또는 제9 인자를 코드하는 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제작하는 것이 가능하다. 그리고, 환자로의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만, 상기 HAC 벡터를 예를 들면 인간 세포에 이입한 후, 병에 걸린 환자에게 이식하여 보충하는 것이 가능하다. 또한, 환자로의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만, 상기 혈액 응고 인자 제8 인자 또는 제9 인자의 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 예를 들면 인간 세포에 이입한 후, 상기 세포를 병에 걸린 환자에게 이식하여, 생리적 조직 특이적 발현에 의해 상기 인자를 보충하는 것이 가능하다.
(E-2) X-SCID(X 연쇄 중증 복합 면역 부전증)
중증 복합 면역 부전증(SCID)은 액성 및 세포성 면역에 선천적으로 장애가 있는 질환이다. SCID의 약 반수가 X 연쇄 X-SCID이고, 그 원인은 인터루킨 2패밀리의 수용체가 공유하는 공통 γ쇄의 변이라는 것이 알려져 있다. 치료법으로서 조혈 줄기 세포 이식이 행해지고 있지만, 액성 면역의 회복은 불충분하고 면역 글로불린의 정기적 투여가 필요하게 된다. 따라서, 조혈 줄기 세포로 공통 γ쇄를 도입하여 이식하는 유전자 세포 치료법에 의한 해결이 기대되고 있다. 1999년부터 레트로 바이러스에 의해 공통 γ쇄를 도입한 조혈 줄기 세포 이식의 임상 연구가 행해지고 있지만, 최근 프랑스에서는 이식 세포의 백혈병화가 다수 보고되었다(Hacein-Bey-Abina 등, N Engl J Med., 348:255, 2003; Marshall 등, Science, 299:320, 2003). 어느 경우나 유전자 도입 세포 염색체 중의 발암 유전자의 하나인 LMO2 유전자 영역에 벡터 서열 삽입 변이가 나타나고, LMO2 활성화와 종양화간의 관련이 의심되고 있다(久米 등, 게놈 의학, 3권:9, 2003, 메디컬 리뷰사).
본 발명의 방법에 의해 공통 γ쇄를 코드하는 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제작하는 것이 가능하다. 그리고, 상기 HAC 벡터를 유전자 도입용 벡터에 이용함으로써 숙주 염색체로의 벡터 서열 삽입 변이의 위험을 회피하는 것이 가능하다. 또한, 환자로의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만, 상기 HAC 벡터를 인간 세포(예를 들면, 인간 골수 유래 정상 조혈 줄기 세포)에 이입하고 병에 걸린 환자에게 이식함으로써, 생리적 조직 특이적 발현에 의한 공통 γ쇄의 결손 기능 상보를 행하는 것이 가능하다.
(E-3) 듀센형 근육 이영양증(Duchenne's muscular dystrophy);DMD
듀센형 근육 이영양증은 디스트로핀(dystrophin) 유전자의 변이에 의한 디스트로핀의 기능 결손이 원인인 X 연쇄 열성 단일 유전자성 질환의 하나이다(Hoffman 등, Cell, 51:919, 1987). DMD의 치료는 디스트로핀이 세포 골격 단백질이기 때문에 직접 투여에 의한 보충은 불가능하여, 유전자 치료법이 기대되고 있다.
디스트로핀 유전자는 전장 게놈으로서 약 2.3Mb, cDNA로서 14kb에 이른다. 비바이러스 벡터나 아데노 바이러스 벡터에서는, 전장 cDNA의 도입은 가능하지만 발현량의 제어가 과제로 되어 있다(Liu 등, Mol. Ther., 4:45, 2001; DelloRusso 등, Proc Natl Acad Sci USA, 97:12979, 2002). 또한, AAV 벡터에서는 도입 DNA 크기가 약 4.9kb 이하로 제한되기 때문에 전장 유전자를 도입할 수 없으며, 또한 골격근으로의 유전자 도입 실험에 있어서 면역 반응이 초래되고 도입 유전자 산물의 발현 저하가 보여지는(Yuasa 등, Gene Therapy, 9:1576, 2002) 등의 과제가 존재한다.
편재적인 발현을 유도하는 CMV 프로모터 제어하에 디스트로핀 미니 유전자를 도입한 AAV 벡터에 의한 골격근으로의 유전자 도입 실험에 있어서는, 면역 반응이 초래되고 도입 유전자 산물의 발현 저하가 보여졌지만, 프로모터로서 골격근 특이적인 MCK 프로모터를 사용함으로써 상기 면역 반응이 개선되었다(Yuasa 등, Gene Ther., 9:1576, 2002). 이것로부터, 디스트로핀의 발현에는 생리적 조직 특이적 발현이 필요하다는 것이 시사된다.
본 발명의 방법에 의해 디스트로핀을 코드하는 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 제작하는 것이 가능하다. 그리고, 환자에게의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만, 상기 HAC 벡터를 인간 세포(특히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 자가 인간 정상 근육 아세포)에 이입하고 병에 걸린 환자에게 이식함으로써, 생리적 조직 특이적 발현에 의한 디스트로핀 보충을 행하는 것이 가능하다.
(E-4) 적용 대상 질환을 특히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 이하에 나타낸 단일성 유전자 질환; α-1 안티트립신 결손증, 낭포성 섬유증(CFTR), 만성 육아종증, 가족성 고콜레스테롤증, 판코니(Fanconi) 빈혈, 고세병(Gaucher`s disease), 헌터 증후군(Hunter syndrome), 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결손증, 푸린뉴클레오티드 포스포릴라제, ADA-SCID, 백혈구 접착 결손증, 카나반(Canavan) 병, 뇌량 위축, 파브리병(Fabry disease), 근위축성 측삭 경화증 등에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 원인 유전자를 도입한 HAC 벡터를 제작하고, 환자로의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 예를 들면, 인간 세포에 이입하여 환자에게 이식하는 등에 의해, 결손 분자의 보충·상보를 행하는 것이 가능하다. 더구나, 질환 원인 유전자 정보에 대해서는 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 문헌 데이터베이스 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nhi.g ov/entrez/query.fcgi?db=PubMed) 또는 OMIMTM-Online Mendelian Inheritance in ManTM(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)을 참조하기 바란다.
(F) 기타 질환
(F-1) 트롬보포이에틴(Thrombopoietin;TPO)은 혈소판 생산 제어 및 조혈 줄기/전구 세포의 증식을 담당하는 인자이고, 예를 들면 재생 불량성 빈혈 등의 혈액 질환, 화학 요법후의 조혈 회복 등에의 적용이 기대되고 있다. 그러나, TPO 재조합체 단백질 투여시의 활성 중화 항체 생성이 의약품 개발의 장애가 되고 있다(Li 등, Blood, 98:3241-3248, 2001). 따라서, TPO를 만성 질환에 적용하는 경우에는 정기적인 TPO 투여를 위해 병원에 통원할 필요가 있고, 환자의 QOL의 장해로 되는 것이 예측된다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 방대한 비용이 들고, 그 결과 고액의 의료비 부담이 생기는 것도 과제의 하나로 되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 TPO 게놈을 도입한 HAC 벡터를 제작하고, 환자에게의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 세포로 이입하여 생리적/조직 특이적으로 TPO를 발현·공급함으로써, 자기 항체 생성을 억제하는 것이 가능하다. 또한, 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 줄이고 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(F-2) 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO)은 적혈구 증식 인자이고, 예를 들면 당뇨병이나 신질환에 있어서의 신성(腎性) 빈혈 등의 치료약으로서 시판되고 있다. 만성 질환(예를 들면, 당뇨병에 의한 신성 빈혈 등)에서는 정기적인 EPO 투여를 위해 병원으로의 통원이 필요하고 환자의 QOL의 장해로 되고 있다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 방대한 비용이 들고, 그 결과 고액의 의료비 부담이 발생하는 것도 과제의 하나로 되고 있다. 본 발명의 실시예 14에 나타낸 바와 같이 EPO, cDNA를 도입한 HAC 벡터를 인간 정상 섬유아세포에 이입하여 환자에게 이식함으로써, 상기 환자에 있어서 EPO를 발현·공급하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 EPO 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 제작하고, 환자로의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 세포에 이입하고, 생리적/조직 특이적으로 EPO를 발현·공급하는 것이 가능하다. 또한, 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 줄이고 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(F-3) 파킨슨병
파킨슨병은 중뇌 흑질 치밀부 도파민 합성 세포의 진행성 변성 탈락에 의해 운동 기능이 저해되는 신경 질환이다. 치료법의 하나로서 결손된 도파민 보충을 목적으로 하는 L-DOPA 투여법이 있지만, 중등 이상의 증상에서는 약효가 감소되는 것이나 부작용에 의한 환자의 QOL 제한·투여량 감소 등의 과제가 존재한다. 이들 과제는 도파민 농도가 선상체(線狀體) 내에서 일정하지 않다는 것, 및 투여한 L-DOPA가 선상체 이외에서 작용하는 것에 기인하기 때문에, 선상체에서의 일정한 도파민의 생리적 발현이 요구된다(武田 등, 메디컬 사이언스 다이제스트, 29권:20, 2003년, 뉴 사이언스사). 현재, 도파민 합성에 관한 효소 3종류를 각각 도입한 AAV 벡터에 의한 유전자 치료 연구가 이루어지고 있지만, 모두 생리적 발현 제어를 행하는 데에는 이르러 있지 않다. 또한, 도파민 합성 세포의 변성 탈락 제어를 목적으로 한 치료법에 GDNF(Grial-cell Derived Neuronal Factor) 투여가 있지만, 피각 아래에 카테테르 유치에 의한 지속 투여로 효과가 보여진(Gill 등, Nature Med., 9:589, 2003) 한편으로, 감염 위험성이나 환자의 QOL 제한 등이 과제로 되고 있다. AAV 벡터에 의한 유전자 치료 연구에 의해 동물 모델에서 효과가 나타났지만(Wang 등, Gene Ther., 9:381, 2002), 이들도 생리적 발현 제어를 행하는 데에는 이르러 있지 않다.
본 발명의 방법에 의해, 도파민 합성에 관한 효소군 또는 GDNF 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 제작하는 것이 가능하다. 그리고, 환자로의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 상기 HAC 벡터를 인간 세포(예를 들면, 인간 정상 신경 줄기/전구 세포)에 이입하고 병에 걸린 환자에게 이식함으로써, 생리적 조직 특이적 발현에 의한 도입 유전자 산물의 보충이 가능하다.
(F-4) 당뇨병
인슐린 의존형 당뇨병에 있어서, 재조합체 단백질 제제 투여에 의한 치료가 행해지고 있다. 만성 질환에서는 정기적인 투여를 위해 병원으로 통원할 필요가 있고 환자의 QOL의 장해로 되고 있다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 방대한 비용이 들고, 그 결과 고액의 의료비 부담이 발생하는 것도 과제의 하나로 되고 있다. 인슐린의 혈중 농도는 적합한 범위가 좁기 때문에 너무 많아도 너무 적어도 부작용이 생기고, 때로는 생명의 위험에 이르는 경우가 있다. 또한, 유전자 치료 연구가 행해지고 있지만 체내에 있어서의 인슐린 농도의 조절이 과제로 되고 있다(森谷 등, 단백질 핵산 효소, 40권:2764, 1995, 공립 출판).
본 발명의 방법에 의해 인슐린 게놈을 도입한 HAC 벡터를 제작하고, 환자에게의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 세포에 이입하여, 생리적/조직 특이적으로 발현·공급하는 것이 가능하다. 또한, 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 줄이고, 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(F-5) 적용 대상 질환을 특히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 뇌종양, 말초 동맥 질환(허혈 등), 만성 관절 류마티스, 동맥 재협착, 주부관 증후군(Cubital Tunnel Syndrome), 관동맥 질환, 알츠하이머병, 궤양, 골반 골절, 신질환, 악성 종양 등에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 질환 치료에 필요하다고 여겨지는 물질을 코드하는 유전자를 도입한 HAC 벡터를 제작하고, 환자에게의 투여 방법을 특히 한정하는 것은 아니지만 예를 들면, 인간 세포에 이입하여 환자에게 이식하는 등에 의해, 결손 분자의 보충·상보를 행하는 것이 가능하다.
본 발명은 세포 중에서 안정되게 유지되고, 큰 사이즈의 외래 유전자를 간편하게 삽입하며, 세포에 도입할 수 있는 인간 인공 염색체 벡터 및 그 제작 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위하여, 1) 동물 세포를 숙주로 하여 여분의 유전자를 포함하지 않고 안정되게 유지되는 염색체 벡터를 구축하는 것, 2) 염색체 벡터에 클로닝 사이트를 부여하고 목적 유전자를 클로닝 사이트에 카세트 방식으로 삽입하여 발현시키는 계를 구축하는 것을 과제로 하여 심도깊게 연구를 행하였다. 즉, 인간 21번 염색체의 장완로부터 이미 알려진 유전자를 삭제한 개변 염색체를 얻고, 이 개변 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포의 장기 계대 배양에 있어서의 안정성을 확인한 후, 이 개변 염색체 상의 장완 근위에 loxP 서열과 hCMV 프로모터를 부위 특이적으로 삽입하고, Cre/loxP 시스템에 의해 GFP 유전자를 개변 염색체에 도입하여, GFP의 발현을 확인할 수 있었다. 그 결과로부터, 본 발명자는 인간 21번 염색체 단편에 기초하여 구축한 HAC 벡터로 상기 과제를 달성할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 개요는 이하와 같다.
본 발명은 그 제1 양태에 있어서, 장완 원위 및(또는) 단완 원위가 삭제된 인간 21번 염색체 단편 또는 인간 14번 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 인간 21번 염색체 단편의 사이즈는 약 2∼16Mb이고, 바람직하게는 약 2∼6Mb이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 인간 21번 염색체의 장완 원위는 예를 들면 21q11 영역내에서 삭제되고, 바람직하게는 AL163204에서 삭제된다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 인간 21번 염색체의 단완 원위는 예를 들면 21p 영역내에서 삭제되고, 바람직하게는 AL163201에서 삭제된다.
본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 상기 인간 14번 염색체 단편의 사이즈는 약 20Mb이고, 바람직하게는 약 19Mb이하이며, 더욱 바람직하게는 18Mb이하이다.
또한, 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 상기 인간 14번 염색체의 장완 원위는 예를 들면 14q 영역내에서 삭제되고, 바람직하게는 AL157858에서 삭제되며, 더욱 바람직하게는 AL512310에서 삭제된다.
또한, 상기 인간 14번 염색체의 단완 원위는 예를 들면 14p 영역내에서 삭제되고, 바람직하게는 14p12 영역내에서 삭제되며, 더욱 바람직하게는 OR4H12, OR4Q4, RNR2, OR4L1, RNU6C, FDPSL3, K12T, C14orf57, OR6S1, M195, OR4K14, MGC27165, LCH, OR10G3, OR4K3, OR4E2, H1RNA, ATP5C2, OR11H6 및 OR4M1으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 위치에서 삭제된다.
또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 인간 인공 염색체 벡터는 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입되어 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 인간 21번 염색체의 장완 근위의 AL163203, 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위의 AL157858보다 근위에, 더욱 바람직하게는 AL512310에 있어서의 상기 삭제 위치보다 근위에, 또는 인간 14번 염색체의 단완 근위의 14p12 영역내에 있어서의 상기 삭제 위치보다 근위에 삽입되어 있다. 또한 바람직한 실시 형태에 있어서는, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다.
본 발명의 다른 실시 형태에 있어서는, 상기 장완 원위 및(또는) 단완 원위의 삭제가 인공 텔로미어 서열과의 치환에 의한 것이다.
또한, 본 발명은 그 제2 양태에 있어서, 이하의 단계를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 제작 방법을 제공한다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계; 및
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 단계 (a)에 있어서는 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 세포로서 상동 재조합 효율이 높은 것을 이용한다. 바람직한 실시 형태에 있어서는, 상동 재조합 효율이 높은 세포는 닭 DT40 세포 유래의 것이다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 단계 (b)에 있어서는 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위의 삭제를 인공 텔로미어 서열과의 치환으로 행한다. 바람직한 실시 형태에 있어서는, 인간 21번 염색체의 장완 원위를 AL163204에서 삭제하고, 단완 원위를 AL163201에서 삭제한다. 또한, 다른 바람직한 실시 형태에 있어서는, 인간 14번 염색체의 장완 원위를 14q 영역에서 삭제하고, 단완 원위를 14p12 영역내에서 삭제한다. 또한, 더욱 바람직한 실시 형태에 있어서는, 인간 14번 염색체의 장완 원위를 AL157858, 더욱 바람직하게는 AL512310에서 삭제하고, 단완 원위를 OR4H12, OR4Q4, RNR2, OR4L1, RNU6C, FDPSL3, K12T, C14orf57, OR6S1, M195, OR4K14, MGC27165, LCH, OR10G3, OR4K3, OR4E2, H1RNA, ATP5C2, OR11H6 및 OR4M1으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 위치에서 삭제한다.
또한, 본 발명의 한 실시 형태에 있어서, 단계 (c)에 있어서는 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다.
또 다른 양태에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 예를 들면 인간 21번 염색체의 장완 근위의 AL163203, 인간 14번 염색체의 AL157858보다 근위에, 더욱 바람직하게는 AL512310에 있어서의 상기 삭제 위치보다 근위에, 또는 인간 14번 염색체의 단완 근위의 14p12 영역내에 있어서의 상기 삭제 위치보다 근위에 삽입할 수 있다.
또한 본 발명은 그 제3 양태에 있어서, 상기 제작 방법에 의해 얻어지는 인간 인공 염색체 벡터를 제공한다.
또한 제4 양태에 있어서, 본 발명은 상기 인간 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 그 제5 양태에 있어서, 상기 제작 방법에 있어서 이하의 단계 (d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 제작 방법을 제공한다:
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에서 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계.
또한 제6 양태에 있어서, 본 발명은 상기 제작 방법에 의해 얻어지는 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터이다.
또한 제7 양태에 있어서, 본 발명은 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 그 제8 양태에 있어서, 상기 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 이러한 경우, 외래 DNA는 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 폰 빌브랜드 인자(von Willebrand factor; vWF), 디스트로핀(dystrophin), 도파민 합성 효소, 인슐린, 인슐린 유사 증식 인자(IGF), 인슐린 유사 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로머라제(telomerase), 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구·마크로파지 콜로니 자극 인자, 면역 글로불린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD 40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린뉴클레오티드 포스포릴라제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(oncostatin M), Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 증식 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴(angiopoietin), 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈(activin), 형질전환(transforming) 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt) 등을 코드하는 유전자로 할 수 있다.
또한 본 발명은 그 제9 양태에 있어서, 이하의 단계를 포함하는 외래 DNA를 수용 세포에 도입하는 방법을 제공한다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계;
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(g) 융합한 수용 세포에 있어서 외래 DNA의 도입을 확인하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 수용 세포는 동물 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포이다. 또한, 상기 수용 세포는 다분화능을 갖는 세포, 예를 들면 배성(胚性) 줄기 세포(ES 세포), 및 간질계 줄기 세포 및 조직 줄기/전구 세포일 수 있다.
또한 본 발명은 그 제10 양태에 있어서, 이하의 단계를 포함하는 외래 DNA를 발현하는 세포의 제작 방법을 제공한다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계;
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 발현하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(g) 융합한 수용 세포에 있어서 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 수용 세포는 동물 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포이다. 또한, 상기 수용 세포는 다분화능을 갖는 세포, 예를 들면 배성 줄기 세포(ES 세포), 및 간질계 줄기 세포 및 조직 및(또는) 전구 세포일 수도 있다.
또한 본 발명은 그 제11 양태에 있어서, 이하의 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법을 제공한다:
(a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계;
(c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(d) 부위 특이적 재조합 효소의 발현하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 단백질을 코드하는 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계;
(g) 융합한 수용 세포를 배지 중에서 배양하는 단계; 및
(h) 얻어지는 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 단백질로서 예를 들면, 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 제8 인자, 제9 인자, 폰 빌브랜드 인자(von Willebrand factor; vWF), 디스트로핀(dystrophin), 도파민 합성 효소, 인슐린, 인슐린 유사 증식 인자(IGF), 인슐린 유사 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로머라제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구·마크로파지 콜로니 자극 인자, 면역 글로불린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD 40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린뉴클레오티드 포스포릴라제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(oncostatin M), Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 증식 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴(angiopoietin), 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈(activin), 형질전환 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt) 등들 들 수 있다.
본 발명에 관한 용어의 정의는 이하와 같다.
본 명세서에서, "인간 인공 염색체 벡터" 또는 "HAC 벡터"라는 것은 인간 염색체를 기초로 하여 제작된 인공 염색체를 가리킨다.
또한, 본 명세서에서 "인간 염색체"라는 것은 인간 세포 유래의 천연 DNA와 단백질의 복합체를 가리킨다. 정상적인 인간 염색체는 23종(남자는 24종) 46개가 존재하고, 각각 약 50∼300Mb 길이의 DNA를 포함한다는 것이 알려져 있다. 또한, "인간 염색체 단편"이라는 것은 독립 염색체로서 안정적으로 복제 및 분배가 가능한 염색체의 부분 단편을 가리키고, 단편의 크기는 통상 1Mb 이상이지만 그 이하의 경우도 있다.
본 명세서에서, 염색체에 관하여 "장완" 및 "단완"이라는 것은 염색체 상의 센트로미어 양측의 완(암)을 가리키고, 그 길이에 따라서 장완(q) 및 단완(p)이라 불리어진다. 또한, 인간 염색체에 관하여 "장완 원위" 및 "장완 근위"라는 것은 장완 상의 센트로미어로부터 먼 위치(즉, 텔로미어측)에 있는 영역(원위) 및 센트로미어에 근접하는 영역(근위)를 의미한다. 구체적으로는, 인간 21번 염색체의 경우에는 장완 원위는 AL163204보다도 텔로미어측, 장완 근위는 AL163203보다도 센트로미어측이고, 또한 인간 14번 염색체의 경우에는 장완 원위는 AL132642보다도 텔로미어측, 장완 근위는 AL157858보다도 센트로미어측이다. 또한, "단완 원위" 및 "단완 근위"라는 것은 단완 상의 센트로미어로부터 먼 위치에 있는 영역(원위) 및 센트로미어에 근접하는 영역(근위)를 의미한다. 구체적으로는, 인간 21번 염색체의 경우에는 단완 원위 및 단완 근위는 AL163201에 있어서 경계가 있으며, 또한 인간 14번 염색체의 경우에는 리보좀 RNA 영역에 있어서 경계가 있다.
본 명세서에서 "부위 특이적 재조합 효소" 및 "부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위"라는 것은, 어느 효소가 특정의 인식 부위를 인식하여 특이적으로 그 인식 부위에서 DNA의 재조합을 일으키는 현상에 관하여 이용되는 용어이고, 각각 그 부위 특이적으로 재조합을 일으키는 효소 및 이 효소에 의해 인식되는 부위를 가리킨다.
본 명세서에서 "인공 텔로미어 서열"이라는 것은, 인공적으로 부가시킨 텔로미어 서열을 가리킨다. 본 발명에서 예를 들면, 텔로미어 트런케이션에 의한 인공 텔로미어 서열의 부가를 행할 수 있다.
본 명세서에서 "외래 DNA"라는 것은, 대상으로 하는 세포에게 있어서 외부로부터 도입되는 DNA를 가리키고, 물질 생산 및 기능 개변 또는 기능 분석 등을 위하여 발현시키는 것이 바람직한 유전자 및 그 밖의 기능 서열(예를 들면, 프로모터 서열) 등을 코드하는 DNA를 의미하고, 동종 또는 이종의 어느 것일 수 있다.
본 명세서에서 "공여 세포" 및 "수용 세포"라는 것은, 인간 인공 염색체 벡터를 이입 또는 도입하는 경우에 최초로 상기 벡터를 보유하는 세포(공여 세포)와, 공여 세포로부터 상기 벡터가 이입되는 세포(수용 세포)를 가리킨다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 인간 21번 염색체 장완 원위의 삭제에 의한 HAC 벡터의 제작
(1) 텔로미어 단축을 위한 콘스트럭트 구축
인간 21번 염색체의 장완 원위를 삭제하기 위한 텔로미어 트런케이션 벡터(표적화 벡터)는 PBS-TEL/Puro(Kuroiwa, Nucleic Acids Res., 26:3447, 1998)을 이용하였다. GenBank 데이터베이스에서 얻은 인간 21번 염색체 장완 원위의 염기 서열(등록번호 AL163204)로부터, 텔로미어 트런케이션 벡터 삽입의 표적 서열을 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한, 제한 효소 BamHI의 인식 배열을 부가한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포는 상기 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(Shinohara, Hum Mol Genet, 10:1163, 2001)를 염색체 공여 세포로 하여 마이크로셀법에 의해 조제하였다. 염색체 수용 세포인 DT40은 Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)에 등록번호 JCRB2221로서 등록되어 있으며, 입수 가능하다. 이하에 조제법의 개략을 기술한다.
먼저 약 1×108개의 A9(#21neo) 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 25㎠ 원심용 플라스크(코스터) 12개에 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 A9(#21neo) 세포를 코르세미드(0.05㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(10% CS, 0.05㎍/㎖ G418, DMEM) 중에서 72시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 실시예에 있어서, DMEM은 인비트로진제의 것을 사용하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(34℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM, 시그마)에 현탁하여 회수하고, 필터로 여과하여 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 10㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Phytohemagglutinin-P, 시그마)를 포함하는 DMEME 4㎖에 재현탁하였다. DT40 세포는 50㎍/㎖의 폴리 L 리신(Poly-L-Lysine, 시그마)으로 코팅한 6공 클러스터(눈크)의 2공에 1×108개를 접종한 후 1시간 정치하고, 미리 저면에 부착시켜 둔다. 이것에 마이크로셀 현탁액을 가하고 3분간 정치한 후 상청을 제거하고, 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(로쉐 다이어그노스틱스)으로 1분간 처리하였다. 융합 세포를 무혈정 DMEM 12㎖에 현탁하고, 6공 플레이트의 4공에 접종하여 24시간 배양한 후, 1.5㎍/㎖의 G418을 포함하는 배지에서 약 2주간 선택 배양하고, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하였다.
상기 DT40 잡종 세포를 배양하고, 세포로부터 Puregene DNA Isolation kit(Gentra System사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머를 이용하여 재조합의 표적 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 주형으로서 약 0.1㎍의 게놈 DNA를 사용하고, Innis 등(PCR 실험 매뉴얼, HBJ 출판국, 1991)에 따라서, 서멀 사이클러는 GeneAmp9700(Applied Biosystems사)를 사용하여 PCR을 행하였다. Taq 폴리머라제는 LA Taq(다카라 주조)를 이용하고, 반응 조건은 95℃에서 2분후, 변성 95℃ 30초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 35사이클 행하였다. 증폭 산물을 제한 효소 BamHI(닛폰 진)으로 분해하여, 돌출 말단을 갖는 약 5kb의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 정제하였다. 이것을 PBS-TEL/Puro 플라스미드의 BamHI 부위에 클로닝하였다. 최종적인 PBS-TEL/Puro 콘스트럭트의 사이즈는 약 10.6kb이다. 텔로미어 트런케이션 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립유전자(allele)를 도 1에 도시하였다.
(2) 트랜스펙션 및 puro 내성 클론의 단리
PBS-TEL/Puro 콘스트럭트를 제한 효소 EcoRI 분해에 의해 선상화 DNA로 하고, 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포에 도입하였다. DT40 잡종 세포 1×107을 0.75㎖의 PBS에 현탁하고, 25㎍ DNA 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션(electroporation)을 행하였다. 용량 25㎌의 콘덴서에 750V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우 태자 혈청(FBS), 1% 닭 혈청(ChS) 및 50μM 2-메르캅토에탄올을 첨가한 DMEM 배지(인비트로진제)에 현탁하고, 96공 클러스터(파르콘) 2장에 접종하였다. 2일후에 최종 농도 0.3㎍/㎖로 되도록 푸로마이신(Puromycin dihydrochloride, 시그마)을 첨가하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 DT40 잡종 세포 1×107당 평균 17.8개였다. 20회의 트랜스펙션으로부터 합계 356의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(3) 상동 재조합체의 선별과 텔로미어 단축의 확인
(3-1) PCR 확인
푸로마이신 내성주 게놈 DNA를 주형으로 하여 인간 21번 염색체 상에 존재하는 유전자 및 STS 마커(D21S265, CBR, SIM2, D21S268, D21S266, D21S1259)의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다.
이들 STS 마커의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열은 미국 National Center for Biotechnology Information의 온라인 데이터베이스UniSTS(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists)에서 열람 가능하다. 상기 6종의 STS 마커의 등록번호는 UniSTS:76223, 45641, 54124, 22625, 54266, 53746이다. 그 밖에 GenBank 데이터베이스에서 입수한 염기 서열을 기초로 설계한 유전자 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
약 0.1㎍의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 먼저 상기 8종 중에서 상동 재조합에 의한 절단 부위의 근위에 위치하는 PRED3 유전자와, 원위에 위치하는 D21S265 마커 및 D21S266 마커의 합계 3종에 대하여 PCR 증폭(Innis 등, 상기)을 행하였다. 텔로미어 트런케이션에 의해 장완 원위가 삭제된 경우, PRED3 유전자를 보유하고 D21S265 마커 및 D21S266 마커를 유지하지 않을 것으로 예상된다. 내성 354 클론 중에서 24 클론에 있어서 예상되는 증폭 효과가 얻어졌다. 이들 24 클론에 대해서는 남은 7종의 마커에 의한 PCR 증폭을 행하고, 인간 21번 염색체의 유지 영역을 확인하였다. 이상의 대표적인 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에는, 좌측에 인간 21번 염색체의 G밴드 상에 의거한 모식적인 염색체 지도를, 또한 마커에 대해서는 어느 밴드에 위치하는가를 나타내었다. 3종의 푸로마이신 내성 DT40주에 대하여, PCR에 의해 기대되는 증폭 산물이 검출된 마커는 ■로, 검출되지 않은 마커를 □로 나타내었다. DT40(#21)은 텔로미어 트런케이션을 행하기 전의 세포이다.
(3-2) 서던 블롯 해석
상동 재조합의 표적 서열내에 프로브를 설정하였다(도 1). 프로브는 이하에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 그 후 PCR 증폭 단편을 단리 및 정제하였다.
1차 스크리닝에서 얻은 24클론으로부터 추출한 게놈 DNA 약 10㎍을 제한 효소 KpnI(다카라 주조)에 의해 분해하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc.,1994)에 기술된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 32P에 의해 표식한 프로브가 하이브리다이즈한 시그널을, 이미지 애널라이저 BAS2000(후지 사진 필름)에 의해 검출하였다. 대표적인 결과를 도 3에 도시한다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는 상동 재조합체에서 3.6kb, 야생형(비재조합체)에서 9.0kb이고, 후보 클론 24 중에서, 2 클론이 상동 재조합체이라는 것을 확인하였다.
(3-3) 형광 조직내(in situ) 하이브리다이제이션(FISH)
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤(秀潤)사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 그 결과, 관찰한 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 대표적인 FISH상을 도 4a 및 도 4b에 도시한다. 도 4a에 있어서 백색 화살표는 텔로미어 트런케이션을 행하기 전의 전체 길이의 인간 21번 염색체를, 도 4b에 있어서 백색 화살표는 장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 단편을 나타내고 있다. 숙주인 DT40 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 인간 21번 염색체가 단축되었다는 것이 확인되었다.
이상의 실험으로부터, 얻어진 푸로마이신 내성의 2주가 장완 삭제에 의해 단축된 인간 21번 염색체를 보유한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 2] HAC 벡터에 있어서의 인간 21번 염색체 장완 근위에의 loxP 서열의 삽입
(1) loxP 삽입을 위한 콘스트럭트 구축
실시예 1에서 제작한 인간 인공 염색체(HAC)에 loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는, pSF1(라이프테크)을 이용하였다. LoxP 삽입 부위인 인간 21번 염색체 장완 근위의 염기 서열은 GenBank 데이터베이스에서 얻었다(등록번호 AL163203). 상동 재조합의 2개의 표적 서열의 증폭에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 표적 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 각각을 제한 효소 EcoRI(닛폰 진) 내지 BamHI(닛폰 진)으로 분해하여, 돌출 말단을 갖는 약 3kb의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 정제하였다. 이들은 pSF1 플라스미드의 EcoRI 내지 BamHI 부위에 클로닝하였다. 상동 재조합체의 선별에 이용하는 블라스트사이딘 내성 유전자는 pCMV/Bsd(인비트로진)으로부터 제한 효소 Xhol(닛폰 진) 및 SalI(닛폰 진) 분해에 의해 약 1.3kb의 단편으로서 절단하고, 상기 pSF1 콘스트럭트의 Xhol 부위에 클로닝하였다.
최종적인 pSF1 콘스트럭트의 사이즈는 약 12.4kb였다. 표적화 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립유전자를 도 5에 도시하였다.
(2) 트랜스펙션 및 bsr 내성 클론의 단리
pSF1 콘스트럭트를 제한 효소 ApaI(닛폰 진) 분해에 의해 선상화하고, 장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40주(DT40(#21) puro 339)에 도입하였다. DT40 잡종 세포를 1×107을 0.75㎖의 PBS에 현탁하고, 10㎍ DNA 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션을 행하였다. 용량 25㎌의 콘덴서에 750V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우태자 혈청(FBS), 1% 닭 혈청(ChS) 및 50μM 2-메르캅토에탄올을 첨가한 DMEM 배지(인비트로진제)에 현탁하고, 96공 클러스터(파르콘) 3장에 접종하였다. 2일후에 최종 농도 8㎍/㎖로 되도록 블라스트사이딘(Blasticidin S Hydrochloride, 후나코시)을 첨가하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 DT40 잡종 세포 1×107당 평균 5.8개였다. 14회의 트랜스펙션에서 얻은 합계 82의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(3) 상동 재조합체의 선별
(3-1) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 표적 서열의 외측에 프로브를 설정하였다. 프로브는 다음에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭, 단리, 정제하였다.
블라스트사이딘 내성 클론으로부터 추출한 게놈 DNA 약 10㎍을 제한 효소 XbaI(닛폰 진)에 의해 분해하고, 서던 블롯 해석을 행하였다(도 6a 및 도 6b 참조). 프로브는 32P에 의해 표식하고, 시그널은 이미지 애널라이저 BAS2000(후지 사진 필름)에 의해 검출하였다. 도 6a에 있어서 좌로부터 1번째의 레인은 loxP 부위를 도입하기 전의 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40주, 2번째의 레인은 숙주인 DT40 세포주, 3번째 이후의 레인은 블라스트사이딘 내성 DT40주를 나타낸다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는 상동 재조합체에서 7.6kb, 야생형(비재조합체)에서 8.5kb이고, 블라스트사이딘 내성주 82로부터 합계 3클론(#60, #78, #79)의 상동 재조합체를 발견하였다.
(3-2) PCR 해석
좌우 2개의 표적 서열(도 5에서, 각각 A 및 B를 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 두고 염색체 상과 표적화 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 5에서 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타낸다:
서던 블롯 해석에 의해 발견한 후보 클론으로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR을 행하고, 염기 서열로부터 예상되는 사이즈(좌측(A)3,283bp 및 좌측(B)3,114bp)의 증폭 산물을 주는 것을 확인하였다. 결과를 도 6b에 도시한다.
이상의 (1)∼(3)의 실험에 의해, 얻어진 블라스트사이딘 내성 DT40 세포 82주 중에서 3주가, 상동 재조합에 의해 loxP 서열이 삽입된 인간 21번 염색체 부분 단편(HAC 벡터)을 유지하는 것이 확실해졌다.
[실시예 3] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 햄스터 세포주에의 이입
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서 실시예 1 및 2에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입한 인간 21번 염색체에 의거한 HAC 벡터를 보유하는 DT40 세포(DT40(#21)bsd-79)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 챠이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(ATCC에서 입수, 등록번호 JCRB9018)을 이용하였다.
먼저 약 109개의 DT40(#21)bsd-79 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 DT40(#21)bsd-79 세포를 코르세미드(0.075㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(10% FBS, 1% ChS, 50μM 2-메르캅토에탄올, DMEM) 중에서 12∼15시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수하여 무혈청 DMEM에 재현탁하고, 미리 폴리 L-리신으로 코팅한 25㎠ 원심용 플라스크(코스터) 12개에 접종하였다. 37℃ 1시간 정치함으로써 세포가 부착된 뒤에 배양액을 제거하고, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM, 시그마)에 현탁하여 회수하고, 필터로 여과하여 정제하였다. CHO-K1 세포를 80% 포화 상태까지 배양한 6㎝ 직경 디쉬에 정제한 미소핵 세포를 가하고 PEG 용액으로 융합하였다. 48시간 후에 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 블라스트사이딘(8㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, F12)에서 배양하였다. 약 2주간의 선택 배향 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 12회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 4주의 블라스트사이딘 내성 CHO주를 얻었다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR법
이입 염색체의 확인을 PCR법에 의해 행하였다. 인간 21번 염색체 장완 근위의 마커 PRED65 및 PRED3 유전자(실시예 1의 (3) 참조)의 검출을 시도하였다. 블라스트사이딘 내성의 CHO 세포 4주 모두에 있어서, 2종의 마커 서열의 증폭을 확인하였다.
(2-2) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH)
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 블라스트사이딘 내성의 CHO주 중에서 2주(CHO(#21)bsd79-1 및 CHO(#21)bsd79-3)에 대하여 해석한 바, 어느것이나 관찰한 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 대표적인 FISH상을 도 7a 및 도 7b에 도시한다. 도 7a에서는 텔로미어 트런케이션을 행하기 전의 전체 길이의 인간 21번 염색체를, 도 7b에서는 장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 단편을 나타내고 있다. 숙주인 CHO 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 단축된 인간 21번 염색체가 CHO 세포에 이입된 것이 확인되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험으로부터, 얻어진 블라스트사이딘 내성 CHO주는 장완 원위를 삭제하고 loxP 서열을 삽입한 인간 21번 염색체 부분 단편(HAC 벡터)을 유지한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 4] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 인간 세포주에의 이입, 및 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 배양 세포에 있어서의 안정성의 확인
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 실시예 3에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입한 인간 21번 염색체에 의거한 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)bsd-79-1)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 섬유 육종 세포주 HT1080(ATCC에서 입수, 등록번호 CCL-121)를 이용하였다. 먼저 약 107개의 CHO(#21)bsd-79-1 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(코스터) 6개에 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 CHO(#21)bsd-79-1 세포를 코르세미드(0.075㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(10% FBS, 8㎍/㎖ 블라스트사이딘, F12) 중에서 48시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM, 시그마)에 현탁하여 회수하고, 필터로 여과하여 정제하였다. HT1080 세포를 80% 포화 상태까지 배양한 6㎝ 직경 디쉬에 정제한 미소핵 세포를 가하고 PEG 용액으로 융합하였다. 48시간 후에 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 블라스트사이딘(8㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% CS, DMEM)에서 배양하였다. 약 2주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 2회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 12주의 블라스트사이딘 내성 HT1080주를 얻었다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR법
이입 염색체는 블라스트사이딘 내성 유전자의 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 인간 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 다음에 나타낸다.
블라스트사이딘 내성의 HT1080 세포 12주 모두에 있어서, 내성 유전자 서열의 증폭을 확인하였다.
(2-2) 염색체 해석
염색체 해석은 黑木 등(세포 공학 핸드북, 양토사, 1992)에 기술된 방법에 따라서, 김사 염색에 의해 행하였다. 블라스트사이딘 내성의 HT1080주 중에서 4주(HT1080(#21)bsd79-1-3,6,11,14)에 대하여 약 20의 분열 중기 염색체상을 해석하였다. 블라스트사이딘 내성주에서는, 신주의 HT1080에는 보이지 않는, 내재의 21번 염색체보다 사이즈가 작은 미니 염색체가 관찰되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험으로부터, 얻어진 블라스트사이딘 내성 HT1080주는 장완 원위를 삭제하고 loxP 서열을 삽입한 인간 21번 염색체 부분 단편(HAC 벡터)을 유지하는 것이 확실해졌다.
(3) 비선택 배양 조건하에서의 장기 계대 배양
장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체의 배양 세포에 있어서의 안정성을 확인하기 위하여, 비선택 조건하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 이용한 것은 앞서 기재한 닭 세포주(DT40(#21)bsd-79), 인간 세포주(HT1080(#21)bsd79-1-3,6,11,14)이다. 닭 세포주용의 비선택 배양액은 10% FBS, 1% ChS, 50μM 2-메르캅토에탄올을 가한 DMEM이고, 선택 배양액은 이것에 블라스트사이딘 8㎍/㎖(DT40(#21)bsd-79의 경우)를 첨가하였다. 인간 세포주용의 비선택 배양액은 10% CS를 가한 DMEM이고, 선택 배양액은 이것에 블라스트사이딘 4㎍/㎖을 첨가하였다. 닭 세포주는 1.5×107 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하고, 1일후에 세포를 계수하여 재차 1.5×107 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하였다. 인간 세포주는 5.0×105 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하고, 3일후에 세포를 계수하여 재차 5.0×105 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하였다. 닭 세포주는 배양 개시로부터 21일, 42일, 63일, 84일, 105일 및 126일후에, 인간 세포주는 10일 및 20일후에 각각 세포를 회수하고, 염색체 표본을 제작하였다.
(4) 염색체 해석
닭 세포에 있어서의 인공 염색체의 검출은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 FISH법에 의해 행하였다. 간기핵(間期核) 500개에 있어서 인간 염색체의 유무를 관찰하고, 보유율을 산출하였다. 인간 세포에 있어서의 인공 염색체의 검출은 黑木 등(세포 공학 핸드북, 양토사, 1992)에 기술된 방법에 따라서, 김사 염색법에 의해 행하였다. 분열 중기 염색체상 20개에 있어서 미니 염색체의 유무를 관찰하여 보유율을 산출하고, 4클론의 평균값을 내었다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
인간 21번 염색체 부분 단편은 DT40 세포내에서는 비선택 배양 조건하에서 분열 횟수 200회를 넘어도 안정되게 보유되고 있었다. 또한, 분열 중기의 염색체상 100개를 관찰하여 세포당의 인간 염색체수를 세어본 바, 예외없이 1개가 보였다. 한편, HT1080 세포주의 배양은 계속중이지만, 현시점(분열 횟수 22회)에서는 인간 21번 염색체 부분 단편은 선택 배양 조건에서 안정되게 보유되고 있다. 또한, 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 염색체 부분이 보여졌다.
이상의 (3) 및 (4)의 실험에 의해, 인간 21번 염색체의 장완 원위를 삭제한 부분 단편은 DT40 세포주 및 HT1080 세포주에 있어서 비선택 배양 조건에서 안정되는데 유지되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되고 있다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 5] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에의 GFP 유전자 삽입
도 8에, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 GFP 유전자를 삽입하는 방법을 도시하였다. 실시예 1∼4에 기재된 바와 같이, 텔로미어 트런케이션에 의해 장완 원위를 삭제하고, 장완 근위에 loxP 부위를 삽입한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 준비하였다. 한편으로 loxP 서열을 포함하는 GFP 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입하기로 하였다. 재조합 삽입체의 선별은 G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다.
(1) loxP 서열을 포함하는 GFP 발현 플라스미드의 구축
GFP 발현 벡터 PEGFP-C1(클론테크)을 제한 효소 GbLII 및 BamHI(닛폰 진)으로 분해하여 4.7kb의 DNA 단편을 단리/정제하고, DNA Ligation Kit Ver.2(다카라 주조)에 의해 자기 환상화하였다. 대장균 DH5α의 형질 전환에 의해 재조합 플라스미드를 단리하고, 멀티 클로닝 부위내의 GbLII로부터 BamHI까지의 51bp를 결실한 플라스미드(PEGFP-C1Δ)를 얻었다. 이 PEGFP-C1Δ를 주형으로 하고, EGFP 유전자의 발현 유닛을 PCR에 의해 증폭하였다.
GenBank의 데이터베이스로부터 입수한 염기 서열(수탁 번호 U55763)을 기초로 제작한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
증폭된 EGFP 유전자의 발현 유닛의 양단을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI(닛폰 진)으로 분해하여 돌출 말단으로 하고, loxP 서열과 hCMV 프로모터를 구비한 플라스미드 벡터 PBS226(라이프테크)의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
(2) 트랜스펙션 및 G418 내성 클론의 단리
실시예 3에서 제작한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)bsd79-1)을 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8㎖의 인산 버퍼(PBS)에 현탁하였다. 10㎍의 PBS226/EGFP 플라스미드와 20㎍의 Cre 효소 발현 벡터 PBS185(라이프테크) 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션을 행하였다. 용량 25㎌의 콘덴서에 750V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우태아 혈청(FBS)을 첨가한 이글 F12 배지(이하 F12라고 함; 인비트로진제)를 포함하는 100㎜ 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘) 10장에 접종하였다. 2일후에 800㎍/㎖의 G418(GENETICIN, 시그마)과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘(Blasticidin S Hydrochlroide, 후나코시)을 포함하는 배지로 치환하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 CHO 세포 5×106당 20개였다. 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(3) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 GFP 유전자의 발현
단리된 G418/블라스트사이딘 내성 CHO주를 형광 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과, 19클론에서 GFP의 발현이 확인되었다. 대표적인 형광 현미경상을 도 9에 도시한다.
(4) 상동 재조합체의 확인
상동 재조합체를 확인하기 위하여, 서던 블롯을 행하였다. 서던 블롯 해석은 G418 내성 유전자 및 GFP 유전자의 일부를 프로브로 하여, 제한 효소 EcoRI 내지 BamHI(닛폰 진)으로 처리한 약 5㎍의 게놈 DNA에 대하여 행하였다. GFP 프로브는 플라스미드 PEGFP-C1(클론테크)을 제한 효소 NheI 및 GbLII(닛폰 진)에 의해 분해하여 얻은 849bp의 단편을 조제하여 이용하였다. G418 내성 유전자의 프로브는 플라스미드 pSV2neo를 제한 효소 GbLII 및 SmaI(닛폰 진)에 의해 분해하고, 1000bp의 단편을 조제하여 사용하였다. 프로브는 32P에 의해 표식하고, 시그널은 이미지 애널라이저 BAS2000(후지 사진 필름)에 의해 검출하였다. 도 10에 그 결과의 일례를 도시한다. 도 10에서는, EcoRI 분해한 DNA를 neo 프로브에 의해 검출하고 있다. 레인 1은 인서트 삽입전의 DT40주, 레인 2 이후는 G418 내성 DT40주를 나타낸다. 삽입전의 대립유전자에서는 5.7kb, 삽입후의 대립유전자에서는 6.9kb의 시그널이 검출된다.
이상의 (1)∼(4)의 실험으로부터, 해석한 G418 내성주 19주 중에서 18주에서 상동 재조합의 대립유전자가 검출되었다. 이 중에서 5주에서는 상동 재조합의 대립유전자에 더하여 재조합 전의 대립유전자가, 1주에서는 랜덤 삽입의 대립유전자가 검출되었다. 따라서, 목적으로 하는 재조합체가 얻어진 빈도는 12/19(63%)로 된다.
[실시예 6] 인간 21번 염색체 단완의 삭제
(1) 텔로미어 단축을 위한 콘스트럭트 구축
인간 21번 염색체의 단완 원위를 삭제하기 위한 텔로미어 트런케이션 벡터(표적화 벡터)는 PBS-TEL/Puro(Kuroiwa, Nucleic Acids Res., 26:3447, 1998)을 개변하여 구축하였다. PBS-TEL/Puro로부터 푸로마이신 내성 유전자의 발현 유닛 1.7kb를 제한 효소 NotI의 단편으로서 빼내고, 말단을 T4 DNA Polymerase (DNA Blunting kit, 다카라 주조)에 의해 평활화하였다(PBS-TEL 벡터). PGKhygro/ΔLT20을 제한 효소 ClaI 및 SmaI(닛폰 진)에 의해 분해하고, PGK 프로모터 제어하의 하이그로마이신 내성 유전자 발현 유닛을 1.8kb의 단편으로서 단리·정제하고, PBS-TEL 벡터에 클로닝하였다(PBS-TEL/Hygro).
GenBank 데이터베이스에서 얻은 인간 21번 염색체 장완 근위의 염기 서열(등록번호 AL163201)로부터, 텔로미어 트런케이션 벡터 삽입의 표적 서열을 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한, 제한 효소 SpeI 내지 BamHI의 인식 서열을 부가한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 표적 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 이것을 제한 효소 SpeI 및 BamHI(닛폰 진)으로 분해하여, 돌출 말단을 갖는 약 5kb의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 정제하였다. 이것을 PBS-TEL/Hygro 플라스미드의 XbaI/BamHI 부위에 클로닝하였다. 최종적인 PBS-TEL/Hygro 콘스트럭트의 사이즈는 약 5.8kb이다. 텔로미어 트런케이션 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립유전자를 도 11에 도시하였다.
(2) 트랜스펙션 및 하이그로마이신 내성 클론의 단리
PBS-TEL/Hygro 콘스트럭트를 제한 효소 BamHI(닛폰 진)에 의해 분해하여 선상화하고, 장완 원위를 삭제하여 loxP 부위를 병합한 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포(DT40(#21)bsd79)에 도입하였다. DT40 잡종 세포 1×107을 0.75㎖의 PBS에 현탁하고, 25㎍ DNA 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션을 행하였다. 용량 25㎌의 콘덴서에 750V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우태자 혈청(FBS), 1% 닭 혈청(ChS) 및 50μM 2-메르캅토에탄올을 첨가한 DMEM 배지(인비트로진제)에 현탁하고, 96공 클러스터(파르콘) 5장에 접종하였다. 2일후에 최종 농도 1.5㎎/㎖로 되도록 하이그로마이신(Hygromycin-B, 와코 순야쿠)을 첨가하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되었다. 합계 2회의 트랜스펙션으로부터 합계 63개의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(3) 상동 재조합체의 선별과 텔로미어 단축의 확인
(3-1) PCR 확인
하이그로마이신 내성 DT40으로부터 상동 재조합체를 선별하기 위한 1차 스크리닝으로서 PCR 해석을 행하였다. 하이그로마이신 내성주에서 추출한 게놈 DNA 약 0.1㎍을 주형으로 하여 인간 21번 염색체의 단완 근위에 위치하는 STS 마커(pCHB, D21S188, D21S275)를 증폭하였다. 그 대표적인 결과를 도 12에 도시한다. 도 12에는, 좌측에 인간 21번 염색체의 G밴드 상에 의거한 모식적인 염색체 지도를, 또한 마커에 대해서는 어느 밴드에 위치하는가를 도시하였다. 하이그로마이신 내성 DT40주에 대하여, PCR에 의해 기대되는 증폭 산물이 검출된 마커는 ■로, 검출되지 않은 마커를 □로 나타내었다. DT40(#21)은 텔로미어 트런케이션을 행하기 전의 세포이다. 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위가 삭제된 경우, D21S275를 유지하고, D21S188 및 pCHB를 유지하지 않을 것으로 예상된다. D21S188 내지 pCHB의 어느 것도 증폭하지 않는 45주를 선별하고, 서던 블롯 해석을 행하였다.
(3-2) 서던 블롯 해석
상동 재조합의 표적 서열내에 프로브를 설정하였다. 프로브는 이하에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭, 단리, 정제하였다.
하이그로마이신 내성주에서 추출한 게놈 DNA 약 10㎍을 제한 효소 HindIII(닛폰 진)에 의해 분해하고, 서던 블롯 해석을 행하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는 상동 재조합체에서 5.8kb, 야생형(비재조합체)에서 1.9kb이고, 1차 스크리닝에서 발견한 후보 45 클론 중에서, 2 클론이 상동 재조합체이라는 것을 확인하였다(도 13).
(3-3) PCR법
재조합의 표적 부위를 사이에 둔 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 인간 21번 염색체 상 및 표적화 벡터 상에 설정한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다:
증폭 산물의 사이즈는 5.9kb이고, 이것을 제한 효소 NsiI에 의해 분해하면, 1.4kb, 2.6kb 및 1.9kb의 단편이 생긴다고 예상된다(도 11). 서던 블롯 해석에서 상동 재조합 대립유전자가 확인된 2클론에서만 PCR 증폭이 보여지며, 제한 효소 분해에 의해 부분 단편이 생성됨을 확인하였다(도 14).
(3) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH)
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 그 결과, 관찰한 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다(도 15a 및 도 15b).
이상의 (1)∼(3)의 실험으로부터, 얻어진 하이그로마이신 내성 63주 중에서 2주가 단완 삭제에 의해 단축된 인간 21번 염색체를 보유한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 7] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에의 EPO 유전자 삽입
실시예 5에 기재된 GFP 유전자의 경우와 마찬가지로 하여, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 EPO 유전자를 삽입한다. 실시예 1∼4에 기재된 바와 같이, 텔로미어 트런케이션에 의해 장완 원위를 삭제하고, 장완 근위에 loxP 부위를 삽입한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 준비하였다. 한편으로 loxP 서열을 포함하는 인간 EPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입하기로 하였다. 재조합 삽입체의 선별은 G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다.
(1) loxP 서열을 포함하는 인간 EPO 발현 플라스미드 pLN1-EPO의 구축
플라스미드 구축에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
이들 프라이머는 플라스미드 벡터 pSTneoB(加藤 등, Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987)의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
이들 프라이머는 pBS226의 CMV 프로모터 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
이들 프라이머는 GenBank에서 입수한 염기 서열(수탁 번호 I05397)을 기초로 제작하였다.
pSTneoB를 주형으로 하여 SV40polyANpl(서열 번호 29) 및 SV40polyARp1(서열 번호 30)을 이용하여 PCR 증폭한 SV 폴리 A 부가 유닛의 양단을 제한 효소 BamHI 및 BglII(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, loxP 서열과 hCMV 프로모터를 구비한 플라스미드 벡터 pBS226(라이프테크)의 BamHI 부위에 클로닝하였다. 이것을 pBS226-pA로 하였다.
다음으로, pBS226을 주형으로 하여 CMVNp3(서열 번호 31) 및 CMVRp1(서열 번호 32)를 이용하여 PCR 증폭한 CMV 프로모터 유닛의 양단을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, pBS226-pA의 EcoRI-BamHI 부위 사이로 클로닝하였다. 이것을 pLN1로 하였다.
최후에, 인간 EPOcDNA를 주형으로 하여 hEPONp1(서열 번호 33) 및 hEPORp1(서열 번호 34)을 이용하여 PCR 증폭한 인간 EPO 코드 영역의 양단을 제한 효소 BamHI 및 XhoI(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, pLN1의 BamHI-XhoI 부위 사이로 클로닝하였다. 이것을 pLN1-EPO로 하였다.
(2) 트랜스펙션 및 G418 내성 클론의 단리
실시예 3에서 제작한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)bsd79-1)을 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8㎖의 행스 평형 염 용액(Hank's balanced salt solution;HBSS)에 현탁하였다. 상기 (1)에서 제작한 pLN1-EPO 벡터 10㎍과 Cre 효소 발현 벡터 pBS185(라이프테크) 10㎍의 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션을 행하였다. 용량 500㎌의 콘덴서에 450V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우태아 혈청(FBS)을 첨가한 이글 F12 배지(이하 F12라고 함; 인비트로진제)를 포함하는 48공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘) 4장에 접종하였다. 2일후에 800㎍/㎖의 G418(GENETICIN, 시그마)과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘(Blasticidin S Hydrochlroide, 후나코시)을 포함하는 배지로 치환하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 CHO 세포 5×106당 28개였다. 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다. 이 세포를 이후 KH21E 세포라고 부른다.
(3) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 EPO 유전자의 발현
인간 EPO 유전자의 발현은 배양 상청 중에 생산되는 인간 EPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
단리된 G418/블라스트사이딘 내성 KH21E 세포 19 클론 중에서 6 클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 800㎍/㎖의 G418과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 F12 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트(confluent) 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 6일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 정량하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
이상의 결과로부터, 6 클론 전부에 있어서 인간 EPO의 발현이 확인되었다.
(4) KH21E 세포에 의해 생산된 인간 EPO의 생물 활성
생산된 인간 EPO의 생물 활성에 대하여, 인간 EPO 의존적 증식을 나타낸 인간 백혈병 세포주 UT7-EPO 세포(自治 의과 대학 小松 則夫 선생에게서 입수)의 증식 활성을 지표로 하여 해석하였다. KH21E 세포의 2주(#C2 및 #C18)에 대하여 배양 상청을 표 2의 정량값을 기초로 EPO 최종 농도 0.01, 0.1, 1, 5, 20, 100mIU/㎖로 되도록 가한 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지(인트로비젼제) 0.1㎖를 넣은 96공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 UT7-EPO 세포 5×103을 접종하였다. 3일간 배양후, 세포 증식 측정 키트(CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, 프로메가)에 의해 세포 증식을 해석하였다.
그 결과를 도 16에 도시한다. 2클론의 배양 상청을 첨가한 경우, 모두 재조합체 인간 EPO 단백질(rhEPO;기린 비루) 첨가시와 동일한 용량 의존적인 흡광도의 증가가 보여졌다(도 16, C2 및 C8).
이상의 결과로부터, 배양 상청 중에 생산된 인간 EPO는 재조합체 인간 EPO 단백질과 동등한 생물 활성을 유지하는 것이 확인되었다.
[실시예 8] KH21E 세포의 이입 염색체의 확인
본 실시예에 있어서는, 실시예 7의 (2)에 있어서 제작된 KH21E 세포의 각 클론에 대하여, PCR 및 FISH 해석에 의해 이입 염색체의 확인을 행하였다.
(1) PCR 해석
loxP 부위 근방에 위치하는 인간 21번 염색체 장완 근위의 마커 PRED65 및 PRED3 유전자와 원위에 위치하는 D21S265 마커(실시예 1의 (3), 도 2 참조)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다. loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 EPO 유전자 삽입체는 PRED65 및 PRED3 유전자를 보유하고 D21S265 마커를 유지하지 않을 것으로 예상된다. 그 결과, G418 내성 CHO 세포 22클론 중에서 21클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다. 상기의 21클론에 대하여, 인간 21번 염색체의 단완 근위에 위치하는 STS 마커(pCHB, D21S187, D21S275)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다(실시예 6의 (3), 도 12 참조). 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 단완은 남아 있으므로, 모든 마커가 유지되어 있을 것으로 예상된다. 그 결과, 15클론에 있어서 예상된 증폭이 확인되었다.
(2) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH) 해석
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 상기 (1)의 PCR 해석에 있어서 모든 마커에서 예상되는 증폭을 나타낸 클론 중에서, 8클론에 대하여 해석한 바, 어느것이나 관찰한 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 한편, 표 3 중의 클론 KH21은 실시예 3에서 제작한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)bsd79-1)를 나타낸다.
이상으로부터, 숙주인 CHO 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 단축된 인간 21번 염색체가 CHO 세포에 이입된 것이 확인되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 CHO주(KH21E 세포)는 장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 9] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에의 복수 EPO 유전자 삽입
본 실시예에 있어서는, 실시예 7에 기재된 인간 EPO 유전자의 경우와 마찬가지로 하여, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 복수의 인간 EPO 유전자를 삽입하였다. 실시예 1∼4에 기재된 바와 같이, 텔로미어 트런케이션에 의해 장완 원위를 삭제하고, 장완 근위에 loxP 부위를 삽입한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 준비하였다. 한편으로 loxP 서열을 포함하는 인간 EPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입하기로 하였다. 재조합 삽입체의 선별은 G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다.
(1) loxP 서열을 포함하는 2카피 인간 EPO 발현 플라스미드 pLN1-EPO2의 구축
플라스미드 구축에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다
EPOnF 프라이머(서열 번호 35)는 5'측에서부터 차례로 EcoRI, ApaI, MluI의 제한 효소 인식 서열 및 CMV 프로모터의 5'측 부분 서열을 가지며, pBS226의 CMV 프로모터 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다. SVpAR 프라이머(서열 번호 36)는 5'측에서부터 차례로 EcoRI, BclI의 제한 효소 인식 서열 및 SV40 폴리 A 부가 유닛의 3'측 부분 상보쇄 서열을 가지며, 플라스미드 벡터 pSTneoB(加藤 등, Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987)의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
실시예 7에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-EPO를 EcoRI 및 XbaI(다카라 주조)에 의해 분해하여 얻은 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 유닛을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하여, EPOnF(서열 번호 35) 및 SVpAR(서열 번호 36) 프라이머를 이용하여, KOD-Plus-(東洋紡)에 의해 PCR 증폭을 행하였다. 서멀 사이클러는 GeneAmp9700(Appplied Biosystems)를 사용하였다. PCR 사이클은 94℃ 2분후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 30초, 및 신장 68℃ 90초를 30사이클 행하였다. 얻어진 DNA 단편의 양단을 제한 효소 EcoRI(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, 플라스미드 벡터 pLN1-EPO의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 클론화된 인서트 DNA 단편의 염기 서열은 DNA 시퀀서(PRISM3700, Applied Biosystems)로 해석하고, 주형으로 이용한 pLN1-EPO 염기 서열의 상당하는 부분과 동일하다는 것을 확인하였다. 얻어진 클론 중에서, CMV 프로모터 및 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 유닛이 순방향으로 2카피 나란해 있는 플라스미드 벡터를 pLN1-EPO2로 하였다.
(2) loxP 서열을 포함하는 4카피 인간 EPO 발현 플라스미드 pLN1-EPO4의 구축
상기 (1)에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-EPO2를 XbaI(다카라 주조)에 의해 분해하여 직쇄화한 후, KOD 폴리머라제(東洋紡)에 의해 평활 말단화하고, ApaI(다카라 주조)에 의해 분해하여 CMV 프로모터 및 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 유닛을 2카피 포함하는 인서트용 DNA 단편을 얻었다. 플라스미드 벡터 pLN1-EPO2를 MluI(다카라 주조)에 의해 분해한 후 KOD 폴리머라제(東洋紡)에 의해 평활 말단화하고, ApaI(다카라 주조)에 의해 분해하여 만든 ApaI-평활 말단화 MluI 부위 사이로 상기의 인서트용 DNA 단편을 클로닝하였다. 이 인간 EPO 유전자를 4카피 포함하는 플라스미드 벡터를 pLN1-EPO4로 하였다.
(3) 트랜스펙션 및 G418 내성 클론의 단리
실시예 3에서 제작한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)bsd79-1)를 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8㎖의 행스 평형 염 용액(HBSS)에 현탁하였다. 상기 (1) 또는 (2)에서 제작한 pLN1-EPO2 벡터 또는 pLN1-EPO4 벡터 10㎍과 Cre 효소 발현 벡터 pBS185(라이프테크) 10㎍의 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션을 행하였다. 용량 500㎌의 콘덴서에 450V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우태아 혈청(FBS)을 첨가한 이글 F12 배지(이하 F12라고 함; 인비트로진제)를 포함하는 48공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘) 5장에 접종하였다. 2일후에 800㎍/㎖의 G418(GENETICIN, 시그마)과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘(Blasticidin S Hydrochlroide, 후나코시)을 포함하는 배지로 치환하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 CHO 세포 5×106당, pLN1-EPO2를 이용한 경우는 14개, pLN1-EPO4를 이용한 경우는 24개였다. 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다. 이들 세포를 이후 pLN1-EPO2를 이용하여 제작한 세포는 KH21E2 세포로, pLN1-EPO4를 이용하여 제작한 세포는 KH21E4 세포라고 부른다.
(4) 인간 EPO 유전자 재조합 삽입체의 확인
재조합 삽입체의 선별은, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지의 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 인간 EPO 유전자 공여 벡터 유래 서열 상 및 HAC 벡터 상에 프라이머를 설계하고, PCR 증폭에 의해 확인하였다. 또한, 삽입된 인간 EPO 유전자의 카피수를, 플라스미드 벡터 pBS226 상의 프라이머와 HAC 벡터 상에 프라이머를 설계하고, PCR 증폭에 의해 확인하였다.
이하에 PCR 증폭에 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 나타낸다:
이 프라이머는 플라스미드 벡터 pSTneoB(加藤 등, Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987)의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
이 프라이머는 플라스미드 벡터 pSF1(라이프테크)의 neo 유전자의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
이 프라이머는 플라스미드 벡터 pBS226(라이프테크)의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
pLN1-EPO2 또는 pLN1-EPO4 벡터 유래의 SV40 폴리 A 부가 서열 영역에 설계한 SVpANpl 프라이머(서열 번호 37) 및 HAC 벡터 상의 pSF1 유래의 네오마이신 내성 유전자 중에 설계한 Neo Rp2 프라이머(서열 번호 38)를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. 재조합 삽입체의 경우는 pLN1-EPO2 또는 pLN1-EPO4 벡터 유래의 SV40 폴리 A 부가 서열로부터 loxP 서열까지와 pSF1 유래의 loxP 서열로부터 neo 유전자의 일부까지를 포함하는 약 1.0kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, KH21E2 세포 6클론 및 KH21E4 세포 6클론 모두에 있어서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이상으로부터, 상기의 12클론은 모두 loxP 서열에의 재조합 삽입체이라는 것이 확인되었다.
다음으로, KH21E2 세포 6클론에 대하여, Neo Rp2 프라이머(서열 번호 38) 및 플라스미드 벡터 pBS226 유래의 M13RV 프라이머(서열 번호 39)를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. 재조합 삽입체의 경우는 pLN1-EPO2 벡터 유래의 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자, 및 SV40 폴리 A 부가 서열을 2카피 포함하는 영역으로부터 loxP 서열까지와 pSF1 유래의 loxP 서열로부터 neo 유전자의 일부까지를 포함하는 약 3.8kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 모든 클론에 있어서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이상으로부터, 상기의 KH21E2 세포 6클론에는 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 서열을 포함하는 인서트 DNA가 2카피 삽입되어 있다는 것이 확인되었다.
(5) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 EPO 유전자의 발현
인간 EPO 유전자의 발현은 배양 상청 중에 생산되는 인간 EPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
(5-1) KH21E2 세포에 있어서의 EPO 유전자의 발현
단리된 G418/블라스트사이딘 내성 KH21E2 세포 14클론 중에서 6클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 800㎍/㎖의 G418과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 F12 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 6일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 2×10-5 희석으로 정량하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
(5-2) KH21E4 세포에 있어서의 EPO 유전자의 발현
또한, 단리된 G418/블라스트사이딘 내성 KH21E4 세포 24클론 중에서 6클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 800㎍/㎖의 G418과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 F12 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 6일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 2×10-5 희석으로 정량하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.
(5-3) KH21E 세포에 있어서의 EPO 유전자의 발현
또한, 비교 대조용으로서, 실시예 7에 있어서 단리된, 인간 EPO 유전자를 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상에 1카피 유지하는 G418/블라스트사이딘 내성 KH21E 세포 5클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 800㎍/㎖의 G418과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 F12 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 6일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 정량하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 다만, C1 및 C4는 1×10-4 희석으로, C9, C11 및 C20은 1×10-5 희석으로 정량하였다.
이상의 표 4∼6의 결과로부터, KH21E2 세포 6클론 및 KH21E4 세포 6클론 전부에 있어서 인간 EPO의 발현이 확인되었다. 또한, 인간 EPO의 발현은 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입한 인간 EPO 유전자의 카피수와 상관이 있기 때문에, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터는 삽입한 유전자의 카피수 의존적으로 발현 제어할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 10] 장완 원위 및 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에의 EPO 유전자 삽입
실시예 7에 기재된 인간 EPO 유전자의 경우와 마찬가지로 하여, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 인간 EPO 유전자를 삽입하였다. 실시예 1∼4 및 6에 기재된 바와 같이, 텔로미어 트런케이션에 의해 장완 원위를 삭제하고, 장완 근위에 loxP 부위를 도입하고, 아울러 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 준비하였다. 한편으로 loxP 서열을 포함하는 인간 EPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입하기로 하였다. 재조합 삽입체의 선별은 G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다.
(1) 트랜스펙션 및 G418 내성 클론의 단리
후술하는 실시예 17에서 제작한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 2주:CHO#21hyg4 및 CHO#21hyg8(이후, 각각 H4 세포 및 H8 세포라고 함)에 대하여 트립신 처리를 행하고, 각각 5×106 세포를 0.8㎖의 행스 평형 염 용액(HBSS)에 현탁하였다. 상기 실시예 7(1)에서 제작한 pLN1-EPO 벡터 10㎍과 Cre 효소 발현 벡터 pBS185(라이프테크) 10㎍의 존재하에서 진 펄서(바이오 라드)를 이용하여 엘렉트로포레이션을 행하였다. 용량 500㎌의 콘덴서에 450V로 인가하고 전극간 거리 4㎜의 엘렉트로포레이션 셀을 이용하여 방전하였다. 엘렉트로포레이션된 세포를, 10% 우태아 혈청(FBS)을 첨가한 이글 F12 배지(이하 F12라고 함; 인비트로진제)를 포함하는 48공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘) 5장에 접종하였다. 2일후에 800㎍/㎖의 G418(GENETICIN, 인비트로진)과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘(Blasticidin S Hydrochlroide, 후나코시)을 포함하는 배지로 치환하였다. 2∼3주후에는 G418 내성 및 블라스트사이딘 내성 콜로니가 출현되고, H4 세포 또는 H8 세포를 숙주로 한 각각으로부터 24개씩 콜로니를 단리하여 증폭시키고, 이후의 해석을 행하였다. 이들 세포를 이후, H4를 이용하여 제작한 세포는 H4E 세포로, H8을 이용하여 제작한 세포는 H8E라고 부른다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR 해석
loxP 부위 근방에 위치하는 인간 21번 염색체 장완 근위의 마커 PRED65 및 PRED3 유전자와 원위에 위치하는 D21S265 마커(실시예 1의 (3), 도 2 참조)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다. loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 EPO 유전자 삽입체는 PRED65 및 PRED3 유전자를 보유하고 D21S265 마커를 유지하지 않을 것으로 예상된다. 그 결과, H4E 세포 22클론 중에서 21클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다. 이들 21클론에 대하여, 인간 21번 염색체의 단완 근위에 위치하는 STS 마커(pCHB, D21S187, D21S275)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다(실시예 6의 (3), 도 12 참조). 인간 21번 염색체의 단완 근위에서 단완 원위를 삭제하고 있으므로, pCHB 및 D21S187 마커를 유지하지 않고, D21S275 마커를 유지할 것으로 예측된다. 그 결과, 15클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다.
(2-2) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH) 해석
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 상기 (2-1)의 PCR 해석에 있어서 모든 마커에서 예상되는 증폭을 나타낸 클론 중에서, 6클론에 대하여 해석한 바, 어느것이나 관찰한 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 이상으로부터, 숙주인 CHO 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 단축된 인간 21번 염색체가 CHO 세포에 이입된 것이 확인되었다.
이상의 (2-1) 및 (2-2)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 및 블라스트사이딘 내성 CHO주는 장완 원위 및 단완 원위를 삭제하고 loxP 서열을 삽입한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 것이 확실해졌다.
(3) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 EPO 유전자의 발현
인간 EPO 유전자의 발현은 배양 상청 중에 생산되는 인간 EPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
(3-1) H4E 세포에 있어서의 EPO 유전자의 발현
단리된 G418 및 블라스트사이딘 내성 H4E 세포 24클론 중에서 10클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 800㎍/㎖의 G418과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 F12 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 6일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 정량하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
(3-2) H8E 세포에 있어서의 EPO 유전자의 발현
또한, 단리된 G418 및 블라스트사이딘 내성 H8E 세포 24클론 중에서 6클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 800㎍/㎖의 G418과 8㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 F12 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 6일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 정량하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
이상의 표 8 및 표 9로부터, H4E 세포 10클론 및 H8E 세포 6클론 전부에 있어서 인간 EPO의 발현이 확인되었다.
[실시예 11] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 마우스 A9 세포에의 이입
(1) 미소핵 세포 융합 및 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 실시예 17에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입한 후 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포:CHO#21hyg4 및 CHO#21hyg8(이후 각각 H4 세포 및 H8 세포라고 함)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 마우스 A9 세포(Oshimura 등, Environ. Health Perspect. 93:57, 1991, 등록번호 JCRB0211)를 이용하였다. 먼저 약 107개의 H4 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 24개에 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 H4 또는 H8 세포를 코르세미드(0.1㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 800㎍/㎖ G418, F12) 중에서 5일간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Phytohemagglutinin-P, Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. 마우스 A9 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 배지 중에 PEG1000(최종 농도 50%(W/V), 시그마) 및 DMSO(최종 농도 7%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 2장에 접종하였다. 2일후에 블라스틴사이딘(4㎍/㎖) 또는 하이그로마이신(700㎍/㎖, 인비트로진)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, DMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 7회의 미소핵 세포 융합으로부터 22개의 약제 내성 콜로니를 얻었다. 상기에서 얻어진 세포를 이후 A9Δ세포라고 부른다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR 해석
상기 (1)에서 얻어진 콜로니 중에서 21클론에 대하여 해석하였다. loxP 부위 근방에 위치하는 인간 21번 염색체 장완 근위의 마커 PRED65 및 PRED3 유전자와 원위에 위치하는 D21S265 마커(실시예 1의 (3), 도 2 참조)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다. HAC 벡터 이입체는 PRED65 및 PRED3 유전자를 보유하고 D21S265 마커를 유지하지 않을 것으로 예상된다. 그 결과, 20클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다.
다음으로, 인간 21번 염색체의 단완 근위에 위치하는 STS 마커(pCHB, D21S187, D21S275)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다(실시예 6의 (3), 도 12 참조). 인간 21번 염색체의 단완 근위에서 단완 원위를 삭제하였으므로, pCHB 및 D21S187 마커를 유지하지 않고, D21S275 마커를 유지할 것으로 예측된다. 그 결과, 18클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다.
(2-2) 약제 선택 배양
인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상에 존재하는 약제 내성 유전자, 즉 하이그로마이신 내성 유전자(단완 원위) 및 블라스트사이딘 내성 유전자(장완 근위)가 선택 약제 존재하에서 기능하는지를 지표로 하여, 각 약제 내성 유전자를 포함하는 영역이 유지되고 있는지를 확인하였다.
상기 (2-1)에 있어서 예상되는 증폭을 나타낸 9클론에 대하여, 6웰 조직 배양용 플레이트(파르콘) 각 웰에서 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 블라스트사이딘(4㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, DMEM)에서 배양하였다. PBS(인비트로진)로 2회 세정한 후, 하이그로마이신(700㎍/㎖)만, 또는 블라스트사이딘(4㎍/㎖) 및 하이그로마이신(700㎍/㎖)을 포함하는 배양액에서 1주간 배양하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
이상으로부터, 모든 클론에 있어서 블라스트사이딘 및 하이그로마이신 내성을 확인하였다.
(2-3) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH) 해석
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 상기 (2-1)의 PCR 해석에 있어서 모든 마커에서 예상되는 증폭을 나타내고, 상기 (2-2)에 있어서 블라스트사이딘 내성 및 하이그로마이신 내성을 나타낸 2클론에 대하여 해석한 바, 관찰된 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
이상으로부터, 숙주인 마우스 A9 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 단축된 인간 21번 염색체가 마우스 A9 세포에 이입된 것이 확인되었다. 이후, 상기에서 얻어진 세포 2클론을 A9Δ11 및 A9Δ12 세포라고 부른다.
이상의 (2-1) 내지 (2-3)의 실험으로부터, 얻어진 블라스트사이딘 및 하이그로마이신 내성의 2주가 장완 및 단완을 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 12] 인간 EPO 유전자를 삽입한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 마우스 A9 세포에의 이입
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 실시예 10에서 얻어진, 인간 EPO 유전자를 1카피 삽입하고, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입한 후 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 중에서 미소핵 형성능이 높은 클론(H4E C10 또는 C15 또는 C16 세포)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 마우스 A9 세포(Oshimura 등, Environ. Health Perspect. 93:57, 1991, 등록번호 JCRB0211)를 이용하였다. 먼저 약 108개의 H4EC15 또는 C16 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 24개에 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 H4E C15 또는 C16 세포를 코르세미드(0.1㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 800㎍/㎖ G418, F12) 중에서 4일간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Phytohemagglutinin-P, Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. 마우스 A9 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 중에 PEG1000(최종 농도 50%(W/V), 시그마) 및 DMSO(최종 농도 7%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 2장에 접종하였다. 2일후에 블라스트사이딘(6㎍/㎖) 또는 G418(600㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, DMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 12회의 미소핵 세포 융합으로부터 39개의 G418 내성 콜로니를 얻었다. 상기에서 얻어진 세포를 이후 AΔE 세포라고 부른다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR 해석
상기 (1)에서 얻어진 콜로니 중에서 25클론에 대하여 해석하였다. loxP 부위 근방에 위치하는 인간 21번 염색체 장완 근위의 마커 PRED65 및 PRED3 유전자와 원위에 위치하는 D21S265 마커(실시예 1의 (3), 도 2 참조)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다. loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 EPO 유전자 삽입체는 PRED65 및 PRED3 유전자를 보유하고 D21S265 마커를 유지하지 않는다는 것이 예상된다. 그 결과, 24클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다. 이들 24클론에 대하여, 인간 21번 염색체의 단완 근위에 위치하는 STS 마커(pCHB, D21S187, D21S275)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다(실시예 6의 (3), 도 12 참조). 인간 21번 염색체의 단완 근위에서 단완 원위를 삭제하였으므로, pCHB 및 D21S187 마커를 유지하지 않고, D21S275 마커를 유지할 것으로 예측된다. 그 결과, 19클론에 있어서 예상된 증폭이 보여졌다.
(2-2) 약제 선택 배양
인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상에 존재하는 약제 내성 유전자, 즉 하이그로마이신 내성 유전자(단완 원위), 및 블라스트사이딘 내성 유전자 및 네오마이신 내성 유전자(장완 근위)가 선택 약제 존재하에서 기능하는지를 지표로 하여, 각 약제 내성 유전자를 포함하는 영역이 유지되고 있는지를 확인하였다.
상기 (2-1)에 있어서 예상되는 증폭을 나타낸 7클론에 대하여, 6웰 조직 배양용 플레이트 각 웰에서 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 G418(600㎍/㎖) 또는 블라스트사이딘(6㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, DMEM)에서 배양하였다. PBS(인비트로진)로 2회 세정한 후, 블라스트사이딘 및 하이그로마이신(700㎍/㎖) 및 G418을 포함하는 배양액에서 1주간 또는 10일간 배양하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
이상으로부터, 7클론에 있어서 블라스트사이딘 및 하이그로마이신 및 G418의 삼중 약제 내성을 확인하였다.
(2-3) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH) 해석
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 상기 (2-1)의 PCR 해석에 있어서 모든 마커에서 예상되는 증폭을 나타낸 7클론에 대하여 해석한 바, 어느것이나 관찰된 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
이상으로부터, 숙주인 마우스 A9 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 단축된 인간 21번 염색체가 마우스 A9 세포에 이입된 것이 확인되었다.
이상의 (2-1) 내지 (2-3)의 실험으로부터, 얻어진 상기 AΔE 세포가, 인간 EPO 유전자를 삽입하고 장완 및 단완을 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유한다는 것이 확실해졌다.
(3) 인간 EPO 유전자 재조합 삽입체의 확인
재조합 삽입체의 선별은, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지의 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 인간 EPO 유전자 공여 벡터 유래 서열 상 및 HAC 벡터 상에 프라이머를 설계하고, PCR 증폭에 의해 확인하였다.
AΔE 세포 12클론에 대하여, 실시예 9(4)에서 나타낸 neo Rp2 프라이머(서열 번호 38) 및 플라스미드 벡터 pBS226 유래의 M13RV 프라이머(서열 번호 39)를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. 재조합 삽입체의 경우는 pLN1-EPO 벡터 유래의 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자, SV40 폴리 A 부가 서열을 포함하는 영역에서 loxP 서열까지와 pSF1 유래의 loxP 서열에서 neo유전자의 일부까지를 포함하는 약 2.3kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 12클론 전부에 있어서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이상으로부터, 상기의 AΔE 세포 클론은 CMV 프로모터 및 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 서열을 포함하는 인서트 DNA가 카피 삽입된 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 것이 확인되었다.
(4) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 EPO 유전자의 발현
인간 EPO 유전자의 발현은 배양 상청 중에 생산되는 인간 EPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
단리된 AΔE 세포 4클론에 대하여, 각각 1×105세포를 10% FBS 첨가한 600㎍/㎖의 G418과 6㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 DMEM 배지 2㎖를 넣은 6공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하였다. 컨플루언트 도달후, 10% FBS를 첨가한 F12 배지 2㎖로 치환하고, 4일간 또는 5일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 희석하지 않고 정량하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
AΔE51, AΔE4, AΔE18은 배양 상청 중의 인간 EPO 농도가 상기 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)의 검출 한계 농도 이상이었다.
이상으로부터, 상기의 AΔE 세포는 인간 EPO 단백질을 생산하는 것이 확인되었다.
[실시예 13] 인간 정상 섬유 아세포에의 인간 14번 염색체 단편(SC20) 이입
(1) 인간 정상 섬유 아세포 HFL-1에의 SC20 이입
(1-1) 미소핵 세포 융합(플레이트법)과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 인간 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 A9 세포(C11-SC20 세포, Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 정상 섬유 아세포 HFL-1(이화학 연구소 세포 재료 개발실에서 입수, 등록번호 RCB0521)을 이용하였다. 먼저 약 107개의 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 12개에 세포 밀도가 80∼90% 포화 정도까지 배양한 C11-SC20 세포를 코르세미드(0.05㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 800㎍/㎖ G418, DMEM) 중에서 48시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Phytohemagglutinin-P, Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. HFL-1 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 배지 중에 PEG1500(최종 농도 45%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스) 및 DMSO(최종 농도 10%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과 멸균한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 15% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 콜라겐 I으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 1장에 접종하였다. 2일후에 G418(300㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(15% FBS, DMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 3회의 미소핵 세포 융합으로부터 21개의 G418 내성 콜로니를 얻었다.
(1-2) 미소핵 세포 융합(서스펜션법)과 약제 내성 클론의 단리
상기 (1-1)과 마찬가지로 하여 마이크로셀을 조제 및 정제하고, 6㎖의 DMEM에 재현탁하였다. HFL-1 세포를 90% 포화 상태까지 175㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에서 배양하고, 트립신 처리에 의해 분산한 후, DMEM에서 2회 세정하고 DMEM 7㎖에 재현탁하였다. 상기 마이크로셀 현탁액에 상기 HFL-1 세포 현탁액을 중층하고 원심분리한 후, 상청을 제거하고 펠렛을 태핑으로 현탁하고, 0.5㎖의 PEG1500(최종 농도 50%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스)를 가하고, 120초간 융합하였다. DMEM 5㎖를 1㎖/1분의 속도로 가하고, 이어서 DMEM 5㎖를 가하여 37℃에서 10분간 정치한 후, 원심분리하고 15% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 재현탁하여 콜라겐 Ⅰ으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 2장에 접종하였다. 2일후에 G418(300㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(15% FBS, F12)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 1회의 미소핵 세포 융합으로부터 2개의 G418 내성 콜로니를 얻었다.
(1-3) 이입 염색체의 확인
(1-3-1) PCR 해석
이입 염색체는 SC20 상에 존재하는 neo 유전자의 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다:
이들 프라이머는 플라스미드 벡터 pSTneoB(加藤 등, Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987)의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
상기 (1-1) 및 (1-2)에서 얻어진 G418 내성 세포 12클론에 대하여, 421F 프라이머(서열 번호 40) 및 778R 프라이머(서열 번호 41)를 이용한 PCR 증폭을 행하였다. HAC 벡터 이입체는 neo 유전자를 보유할 것으로 예상된다. 그 결과, 모든 클론에 있어서 예상된 증폭이 확인되었다.
(1-3-2) 염색체 해석
염색체 해석은 黑木 등(세포 공학 핸드북, 양토사, 1992)에 기술된 방법에 따라서, 김사 염색에 의해 행하였다. G418 내성의 HFL-1 세포 중에서 2클론에 대하여 분열 중기 염색체상을 해석하였다. 그 결과, G418 내성주에서는, 신주의 HFL-1에는 보이지 않는, 내재의 14번 염색체보다 사이즈가 작은 미니 염색체가 관찰되었다.
이상의 (1-3-1) 및 (1-3-2)의 실험으로부터, 얻어진 상기의 G418 내성 HFL-1주는 SC20을 유지하는 것이 확실해졌다.
(2) 인간 정상 섬유 아세포 HUC-F2에의 SC20 이입
(2-1) 미소핵 세포 융합(플레이트법)과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 인간 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 A9 세포(C11-SC20 세포, Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 정상 섬유 아세포 HUC-F2(이화학 연구소 세포 재료 개발실에서 입수, 등록번호 RCB0436)를 이용하였다. 먼저 약 107개의 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 12개에 세포 밀도가 80∼90% 포화 정도까지 배양한 C11-SC20 세포를 코르세미드(0.05㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 800㎍/㎖ G418, DMEM) 중에서 48시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. HUC-F2 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 배지 중에 PEG1500(최종 농도 45%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스) 또는 PEG1000(최종 농도 45%(W/V), 시그마), 및 DMSO(최종 농도 10%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과 멸균한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 10% FBS를 포함하는 αDMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 콜라겐 Ⅰ으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 1장에 접종하였다. 2일후에 G418(400㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, αDMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 4회의 미소핵 세포 융합으로부터 8개의 G418 내성 콜로니를 얻었다.
(2-2) 미소핵 세포 융합(서스펜션법)과 약제 내성 클론의 단리
상기 (1-1)과 마찬가지로 하여 마이크로셀을 조제 및 정제하고, 6㎖의 DMEM에 재현탁하였다. HUC-F2 세포를 90% 포화 상태까지 175㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에서 배양하고, 트립신 처리에 의해 분산한 후, DMEM에서 2회 세정하고 DMEM 7㎖에 재현탁하였다. 상기 마이크로셀 현탁액에 상기 HUC-F2 세포 현탁액을 중층하고 원심분리한 후, 상청을 제거하고 펠렛을 태핑으로 현탁하고, 0.5㎖의 PEG1500(최종 농도 50%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스)을 가하고, 120초간 융합하였다. DMEM 5㎖를 1㎖/1분의 속도로 가하고, 이어서 DMEM 5㎖를 가하여 37℃에서 10분간 정치한 후, 원심분리하고 10% FBS를 포함하는 αMEM 배지에 재현탁하여 콜라겐 Ⅰ으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 2장에 접종하였다. 2일후에 G418(400㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, αMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 1회의 미소핵 세포 융합으로부터 6개의 G418 내성 콜로니를 얻었다.
(2-3) 이입 염색체의 확인
이입 염색체는 SC20 상에 존재하는 neo 유전자의 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 즉 상기 (2-1) 및 (2-2)에서 얻어진 G418 내성 세포 7클론에 대하여, 421F 프라이머(서열 번호 40) 및 778R 프라이머(서열 번호 41)를 이용한 PCR 증폭을 행하였다. HAC 벡터 이입체는 neo 유전자를 보유할 것으로 예상된다. 그 결과, 모든 클론에 있어서 예상된 증폭이 확인되었다. 이상의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 HUC-F2주는 SC20을 유지하는 것이 확실해졌다.
(3) 인간 정상 섬유 아세포 HF-19에의 SC20 이입: 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 인간 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 A9 세포(C11-SC20 세포, Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 정상 섬유 아세포 HF-19(이화학 연구소 세포 재료 개발실에서 입수, 등록번호 RCB0210)을 이용하였다. 먼저 약 107개의 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 12개에 세포 밀도가 80∼90% 포화 정도까지 배양한 C11-SC20 세포를 코르세미드(0.05㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 800㎍/㎖ G418, DMEM) 중에서 48시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Phytohemagglutinin-P, Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. HF-19 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 배지 중에 PEG1500(최종 농도 45%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스) 및 DMSO(최종 농도 10%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과 멸균한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 10% FBS를 포함하는 αMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 콜라겐 Ⅰ으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 1장에 접종하였다. 2일후에 G418(400㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, αMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 1회의 미소핵 세포 융합으로부터 1개의 G418 내성 콜로니를 얻었다.
[실시예 14] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 인간 정상 섬유 아세포에의 이입
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
(1-1) 염색체 공여 세포로서 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 유지 CHO 세포를 이용한 미소핵 세포 융합
염색체 공여 세포로서, 실시예 10에서 얻어진, 인간 EPO 유전자를 1카피 삽입하고, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입한 후 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위를 삭제하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인간 EPO 유전자를 삽입한, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 중에서 미소핵 형성능이 높은 클론(H4E C10 세포)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 정상 섬유 아세포 HFL-1(이화학 연구소 세포 재료 개발실에서 입수, 등록번호 RCB0521)을 이용하였다. 먼저 약 108개의 H4E C10세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 48개에 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 H4E C10 세포를 코르세미드(0.1㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 800㎍/㎖ G418, F12) 중에서 4일간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. HFL-1 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 배지 중에 PEG1500(최종 농도 45%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스) 및 DMSO(최종 농도 10%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과 멸균한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 20% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 콜라겐 Ⅰ으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 1장에 접종하였다. 2일후에 G418(300㎍/㎖) 또는 블라스트사이딘(6㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(20% FBS, DMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 5회의 미소핵 세포 융합으로부터 3개의 약제 내성 콜로니를 얻었다. 상기의 세포를 HCΔE 세포라고 부른다.
(1-2) 염색체 공여 세포로서 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 유지 마우스 A9 세포를 이용한 미소핵 세포 융합
염색체 공여 세포로서, 실시예 12에서 얻어진, 인간 EPO 유전자를 1카피 삽입하고, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입한 후 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위를 삭제하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인간 EPO 유전자를 삽입한, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 마우스 A9 세포 중에서 미소핵 형성능이 높은 클론(AΔ51 또는 AΔE5 세포)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 정상 섬유 아세포 HFL-1(이화학 연구소 세포 재료 개발실에서 입수, 등록번호 RCB0521)을 이용하였다. 먼저 약 107개의 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(눈크) 12개에 세포 밀도가 80∼90% 포화 정도까지 배양한 AΔ51 또는 AΔE5 세포를 코르세미드(0.1㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(20% FBS, 600㎍/㎖ G418, F12) 중에서 72시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm에서 1시간동안 원심분리하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 포어 사이즈 8㎛, 5㎛, 3㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리 포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50㎍/㎖의 피토헤마글루티닌 P(Phytohemagglutinin-P, Difco)를 포함하는 DMEM 2㎖에 재현탁하였다. HFL-1 세포를 90% 포화 상태까지 배양한 25㎠ 배양용 플라스크(파르콘)에 정제한 미소핵 세포를 가하고, 37℃에서 15분간 정치한 후, DMEM 배지 중에 PEG1500(최종 농도 45%(W/V), 로쉐 다이아그노스틱스) 및 DMSO(최종 농도 10%(W/V), 시그마)를 용해하고, 포어 사이즈 0.22㎛ 필터(자르토리우스)에 의해 여과 멸균한 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 20% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 48시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 콜라겐 Ⅰ으로 피복처리한 48공 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 1장에 접종하였다. 2일후에 G418(300㎍/㎖) 또는 블라스트사이딘(6㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(20% FBS, DMEM)로 치환하였다. 약 3주간의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 1회의 미소핵 세포 융합으로부터 27개의 약제 내성 콜로니를 얻었다. 상기의 세포를 이후 HΔE 세포라고 부른다.
(2) 이입 염색체의 확인
이입 염색체의 확인은 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상의 neo 유전자의 유무를 지표로 하여 PCR 증폭에 의해 확인하였다.
이하에 PCR 증폭에 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 나타낸다:
이들 프라이머는 플라스미드 벡터 pSTneoB(加藤 등, Cell Struct Funct, 12:575-580, 1987)의 염기 서열을 기초로 하여 제작하였다.
1291F 프라이머(서열 번호 42) 및 1667R 프라이머(서열 번호 43)를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. 상기 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 경우는 neo 유전자의 일부를 포함하는 약 0.4kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, HΔE 세포 5클론 전부에 있어서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이상으로부터, 상기의 HΔE 세포는 상기 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 것이 확인되었다.
(3) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 EPO 유전자의 발현
인간 EPO 유전자의 발현은 배양 상청 중에 생산되는 인간 EPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
단리된 블라스트사이딘 내성 HCΔE 세포 3클론 및 G418 또는 블라스트사이딘 내성 HΔE 세포 8클론에 대하여, 20% FBS 첨가한 300㎍/㎖의 G418 또는 6㎍/㎖의 블라스트사이딘을 포함하는 DMEM 배지 0.5㎖를 넣은 48공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘)에 접종하고, 2일간 또는 3일간 또는 4일간 배양하고 상청을 회수하였다. 인간 EPO ELSA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)에 의해, 배양 상청 중의 인간 EPO를 희석하지 않고 정량하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다.
HΔE51-1, HΔE5-1, HΔE5-2, HΔE5-3, HΔE5-4는 배양 상청 중의 인간 EPO 농도가 상기 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R＆D 시스템)의 검출 한계 농도 이상이었다.
이상으로부터, 상기의 HCΔE 세포 및 HΔE 세포 클론은 인간 EPO 단백질을 생산하는 것이 확인되었다.
[실시예 15] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터로의 EPO 및 인간 테로머라제(hTERT) 유전자 삽입용 벡터의 구축
(1) loxP 서열을 포함하는 hTERT 발현 플라스미드 pLN1-hTERT의 구축
인간 테로머라제(hTERT) 유전자는 코드 영역 3399bp이고, 5'측 영역에 G 및 C가 풍부한 서열을 포함하기 때문에, 코드 영역의 양단에 설계한 프라이머로 전장을 PCR 증폭하기에는 곤란할 것으로 예측되었다. 이 때문에, 코드 영역을 3개(1∼800bp;이후 5'hTERT라고 하고, 679∼1993bp;이후 M-XhTERT라고 하고, 1952∼3399bp;이후 3'hTERT라고 한다. 다만, 염기 서열 위치는 개시 코든 ATG의 A를 1로서 표시하였다)로 나누어 각각 PCR 증폭 및 클로닝한 후, 각 영역을 연결하는 방법으로 hTERT 유전자를 클로닝하였다. 이하에 그 방법을 나타낸다.
(1-1) 5'hTERT의 클로닝
플라스미드 벡터 구축에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
이들 프라이머는 GenBank에서 입수한 염기 서열(수탁 번호 NM003219)을 기초로 제작하였다.
HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) 1ng를 주형으로 하여, hTERT Fw6(서열 번호 44) 및 hTERT Rv6(서열 번호 45)를 각각 최종 농도 0.4μM로 하여, LA Taq(다카라 주조) 2.5유닛을 이용하여 50㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. 서멀 사이클러는 GeneAmp9600(Applied Biosystems)를 사용하였다. PCR 사이클은 98℃ 10분후, 변성 98℃ 30초, 어닐링 및 신장 72℃ 5분을 3사이클, 변성 98℃ 30초, 어닐링 및 신장 70℃ 5분을 2사이클, 변성 98℃ 30초, 어닐링 및 신장 68℃ 5분을 35사이클로 행하였다. 게다가, 이 PCR 산물 2㎕를 주형으로 하여, hTERT Fw1(서열 번호 46) 및 hTERT Rv7(서열 번호 47)을 각각 최종 농도 0.4μM로 하여, LA Taq(다카라 주조) 2.5유닛을 이용하여 50㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. PCR 사이클은 98℃ 10분후, 변성 98℃ 30초, 어닐링 및 신장 72℃ 5분을 3사이클, 변성 98℃ 30초, 어닐링 및 신장 70℃ 5분을 2사이클, 변성 98℃ 30초, 어닐링 및 신장 68℃ 5분을 35사이클로 행하였다. 그 결과, 약 0.8kb의 DNA 단편을 얻었다.
이 약 0.8kb의 DNA 단편을 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN)을 이용하여 정제한 후, KOD DNA 폴리머라제(東洋紡)로 양단을 평활 말단으로 하고, 게다가 BglII(다카라 주조)에 의해 분해하여 5'측을 돌출 말단으로 하고, 5'hTERT 인서트용 DNA 단편을 얻었다. 그리고, 플라스미드 벡터 pLN1-EPO를 XhoI(다카라 주조)에 의해 분해한 후, KOD DNA 폴리머라제(東洋紡)로 양단을 평활 말단으로 하고, 게다가 BamHI(다카라 주조)에 의해 분해한 인간 EPO 유전자를 제거하여 얻어진 BamHI-평활 말단 부위에 5'hTERT 인서트용 DNA 단편을 클로닝하였다. 숙주 대장균에는 XL-10Gold(STRATAGENE)을 이용하였다. 클론화된 5'hTERT 인서트 DNA 단편의 염기 서열은 DNA 시퀀서(PRISM3700, Applied Biosystems)에 의해 해석하고, GenBank에서 입수한 염기 서열의 상당하는 부분과 동일하다는 것을 확인하였다. 이상에서 얻어진 플라스미드 벡터를 pLN1-5'hTERT로 하였다.
(1-2) M-XhTERT의 클로닝
플라스미드 벡터 구축에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다:
이들 프라이머는 GenBank에서 입수한 염기 서열(수탁 번호 NM003219)을 기초로 제작하였다.
HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) 0.25ng를 주형으로 하여, hTERT Fw8-2(서열 번호 48) 및 hTERT 5' XhoIRv3(서열 번호 49)를 각각 최종 농도 0.4μM로 하여, LA Taq(다카라 주조) 2.5 유닛을 이용하여 25㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. PCR 사이클은 98℃ 5분후, 98℃ 15초·55℃ 30초·72℃ 90초를 40사이클로 행하였다. 게다가, 이 PCR 산물 1㎕를 주형으로 하여, hTERT Fw8-1(서열 번호 50) 및 hTERT 5' XhoIRv3(서열 번호 49)을 각각 최종 농도 0.4μM로 하여, LA Taq(다카라 주조) 2.5유닛을 이용하여 25㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. 서멀 사이클러는 GeneAmp9700(Applied Biosystems)를 사용하였다. PCR 사이클은 98℃ 5분후, 변성 98℃ 15초, 어닐링 55℃ 30초, 및 신장 72℃ 90초를 40사이클로 행하였다. 그 결과, 약 1.2kb의 DNA 단편을 얻었다.
이 약 1.2kb의 DNA 단편을 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN)을 이용하여 정제한 후, MluI 및 XhoI(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, 플라스미드 벡터 pLN1-EPO2의 MluI-XhoI 부위에 클로닝하였다. 숙주 대장균에는 XL-10Gold(STRATAGENE)을 이용하였다. 클론화된 M-XhTERT 인서트 DNA 단편의 염기 서열은 DNA 시퀀서(PRISM3700, Applied Biosystems)에 의해 해석하고, GenBank에서 입수한 염기 서열의 상당하는 부분과 동일하다는 것을 확인하였다. 이상에서 얻어진 플라스미드 벡터를 pLN1-M-XhTERT로 하였다.
(1-3) 3'hTERT의 클로닝
플라스미드 벡터 구축에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다:
이 프라이머는 Marathon-Ready cDNA(CLONTECH) 첨부의 것을 사용하였다.
이들 프라이머는 GenBank에서 입수한 염기 서열(수탁 번호 NM003219)을 기초로 제작하였다.
HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) 0.1ng를 주형으로 하여, hTERT 3'XhoIFw2(서열 번호 53) 및 AP1(서열 번호 51)를 각각 최종 농도 0.3μM로 하여, KOD-Plus-(東洋紡) 0.5 유닛을 이용하여 25㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. 서멀 사이클러는 GeneAmp9700(Applied Biosystems)를 사용하였다. PCR 사이클은 94℃ 2분후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 30초, 및 신장 68℃ 3분을 30사이클로 행하였다. 게다가, 이 PCR 산물 1㎕를 주형으로 하여, hTERT 3'XhoIFw(서열 번호 52) 및 hTERT Rv1(서열 번호 54)을 각각 최종 농도 0.3μM로 하여, KOD-Plus-(東洋紡) 0.5 유닛을 이용하여 25㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. PCR 사이클은 98℃ 5분후, 변성 98℃ 15초, 어닐링 55℃ 30초 및 신장 72℃ 90초를 40사이클로 행하였다. 그 결과, 약 1.4kb의 DNA 단편을 얻었다.
이 약 1.2kb의 DNA 단편을 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN)을 이용하여 정제한 후, XhoI 및 SalI(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, 플라스미드 벡터 pLN1-EPO의 XhoI 부위에 클로닝하였다. 숙주 대장균에는 XL-10Gold(STRATAGENE)를 이용하였다. 클론화된 3'hTERT 인서트 DNA 단편의 염기 서열은 DNA 시퀀서(PRISM3700, Applied Biosystems)에 의해 해석하고, GenBank에서 입수한 염기 서열의 상당하는 부분과 동일하다는 것, 및 pLN1-EPO 상 CMV 프로모터의 전사 방향과 반대 방향으로 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이상에서 얻어진 플라스미드 벡터를 pLN1-3'hTERT로 하였다.
(1-4) 5'hTERT, M-XhTRET 및 3'hTRET 영역의 연결
상기 (1-3)에서 얻어진 플라스미드 벡터 pLN1-3'hTERT를 주형으로 하여, hTERT 3'XhoIFw(서열 번호 52) 및 hTERT Rv1(서열 번호 54)를 각각 최종 농도 0.3μM로 하여, KOD-Plus-(東洋紡) 0.5 유닛을 이용하여 50㎕의 반응액에서 PCR 증폭을 행하였다. 서멀 사이클러는 GeneAmp9700(Applied Biosystems)를 사용하였다. PCR 사이클은 94℃ 2분후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 30초 및 신장 68℃ 2분을 30사이클로 행하였다. 그 결과, 약 1.4kb의 DNA 단편을 얻었다.
이 약 1.4kb의 DNA 단편을 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN)을 이용하여 정제한 후, DNA 시퀀서(PRISM3700)에 의해 해석하고, GenBank에서 입수한 염기 서열의 상당하는 부분과 동일하다는 것을 확인하였다. 다음으로, 이 약 1.4kb의 DNA 단편을 XhoI 및 SalI(다카라 주조)에 의해 분해하여 돌출 말단으로 하고, (1-2)에서 얻어진 플라스미드 벡터 pLN1-M-XhTERT를 MluI 및 XhoI 분해하여 얻어진 M-XhTERT 영역과 함께 플라스미드 벡터 pLN1-EPO2의 MluI-XhoI 부위로부터 인간 EPO 유전자를 포함하는 영역을 제거한 곳으로 클로닝하였다. 숙주 대장균에는 XL-10Gold(STRATAGENE)를 이용하였다.
얻어진 클론의 인서트 DNA 단편의 염기 서열을 DNA 시퀀서(PRISM3700, Applied Biosystems)에 의해 해석하고, M-XhTERT 영역내에 염기 치환점 변이를 가지며, 아울러 3'hTERT 영역은 GenBank에서 입수한 염기 서열의 상당하는 부분과 동일하다는 것, 및 pLN1-EPO 상 CMV 프로모터의 전사 방향과 순방향으로 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이상에서 얻어진 플라스미드 벡터를 EcoRI 및 XhoI에 의해 분해하고, M-XhTERT 영역을 제거한 곳으로, (1-1)에서 얻어진 pLN1-5'hTERT를 EcoRI 및 MluI에 의해 분해하고 돌출 말단화한 CMV 프로모터 및 5'hTERT 영역을, pLN1-M-XhTERT를 MluI 및 XhoI 분해하고 돌출 말단화하여 얻어진 M-XhTERT 영역과 함께 클로닝하였다. 숙주 대장균에는 XL-10Gold(STRATAGENE)를 이용하였다. 이에 따라 얻어진 플라스미드 벡터를 pLN1-hTERT로 하였다.
(2) loxP 서열을 포함하는 인간 EPO 및 hTERT 발현 플라스미드 pLN1-EPO-hTERT의 구축
실시예 9(1)에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-EPO2를 EcoRI 분해하여 얻어진 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 유닛을 포함하는 DNA 단편을, 실시예 11에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-hTERT의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 이것을 pLN1-EPO-hTERT로 한다.
(3) loxP 서열을 포함하는 2카피 인간 EPO 및 hTERT 발현 플라스미드 pLN1-EPO2-hTERT의 구축
실시예 9(1)에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-EPO2를 EcoRI 분해하여 얻어진 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 유닛을 2카피 포함하는 DNA 단편을, 상기 (1)에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-hTERT의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 이것을 pLN1-EPO2-hTERT로 한다.
(4) loxP 서열을 포함하는 4카피 인간 EPO 및 hTERT 발현 플라스미드 pLN1-EPO4-hTERT의 구축
실시예 9(2)에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-EPO4를 EcoRI 분해하여 얻어진 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 유닛을 4카피 포함하는 DNA 단편을, 상기 (1)에서 제작한 플라스미드 벡터 pLN1-hTERT의 EcoRI 부위에 전사 순방향으로 4카피 나란하도록 클로닝하였다. 이것을 pLN1-EPO4-hTERT로 한다.
[실시예 16] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터로의 EPO 및 hTERT 유전자 삽입
실시예 7에 기재된 인간 EPO 유전자의 경우와 마찬가지로 하여, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 인간 EPO 유전자 및 hTERT 유전자를 삽입한다. 실시예 1∼4 및 6에 기재된 바와 같이, 텔로미어 트런케이션(truncation)에 의해 장완 원위를 삭제하고, 장완 근위에 loxP 부위를 삽입하고, 아울러 텔로미어 트런케이션에 의해 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 준비하였다. 한편으로 loxP 서열을 포함하는 인간 EPO 및 hTERT 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입하기로 하였다. 재조합 삽입체의 선별은 G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다.
(1) 트랜스펙션 및 G418 내성 클론의 단리
실시예 11에서 얻어진 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 마우스 A9 세포(A9Δ12 세포)를 6웰 조직 배양용 플라스틱 플레이트(파르콘) 1장에서 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 블라스트사이딘(4㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, DMEM)에서 배양하였다. 실시예 15의 (2)에서 제작한 pLN1-EPO-hTERT 벡터 및 Cre 효소 발현 벡터 pBS185(라이프테크)의 존재하에, Fugene6(로쉐 다이아그노스틱스)를 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라서 트랜스펙션을 행하였다. 48시간 배양한 후 트립신 처리로 분산하고, 6웰분을 하나로 모아서 G418(600㎍/㎖)를 포함하는 선택 배지(10% FBS를 첨가한 DMEM)에 현탁하고, 48공 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘) 5장에 접종하였다. 2∼3주후에는 내성 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 A9Δ12 세포 5×106당 4개였다. 콜로니를 단리하여 더욱 배양한 결과, 1개의 콜로니가 증식되었다. 상기의 얻어진 세포를 이후 A9ΔET1 세포라 부른다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR 해석
A9ΔET1 세포에 대하여 해석하였다. loxP 부위 근방에 위치하는 인간 21번 염색체 장완 근위의 마커 PRED65 및 PRED3 유전자(실시예 1의 (3), 도 2 참조)에 대하여 PCR 증폭을 행하였다. loxP 서열간의 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 EPO 유전자 삽입체는 PRED65 및 PRED3 유전자를 보유하는 것이 예상된다. 그 결과, 예상된 증폭이 확인되었다. 다음으로, 인간 21번 염색체의 단완 근위에 위치하는 STS 마커 D21S275에 대하여 PCR 증폭을 행하였다(실시예 6의 (3), 도 12 참조). 인간 21번 염색체의 단완 근위에서 단완 원위를 삭제하고 있으므로, D21S275 마커를 유지하는 것이 예측된다. 그 결과, 예상된 증폭이 확인되엇다.
(2-2) 약제 선택 배양
인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상에 존재하는 약제 내성 유전자, 즉 하이그로마이신 내성 유전자(단완 원위) 및 블라스트사이딘 내성 유전자가 선택 약제 존재하에서 기능하는지를 지표로 하여, 각 약제 내성 유전자를 포함하는 영역이 유지되고 있는지를 확인하였다.
A9ΔET1 세포에 대하여, 6웰 배양 디쉬(파르콘) 각 웰에서 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 G418(600㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% FBS, DMEM)에서 배양하였다. PBS(기부코 BRL)로 2회 린스한 후, 하이그로마이신(700㎍/㎖, 기부코 BRL)만, 또는 블라스트사이딘(4㎍/㎖)만, 또는 블라스트사이딘 및 하이그로마이신 및 G418을 포함하는 배양액에서 1주간 배양하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
이상으로부터, A9ΔET1 세포가 블라스트사이딘 및 하이그로마이신 및 G418 내성을 갖는 것을 확인하였다.
(2-3) 인간 EPO 유전자 재조합 삽입체의 확인
재조합 삽입체의 선별은 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지의 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 인간 EPO 유전자 공여 벡터 유래 서열 상 및 HAC 벡터 상에 프라이머를 설계하고, PCR 증폭에 의해 확인하였다.
A9ΔET1 세포에 대하여, 실시예 9(4)에서 나타낸 Neo Rp2 프라이머(서열 번호 38) 및 플라스미드 벡터 pBS226 유래의 M13RV 프라이머(서열 번호 39)를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. 재조합 삽입체의 경우는 pLN1-EPO 벡터 유래의 CMV 프로모터, 인간 EPO 유전자, SV40 폴리 A 부가 서열을 포함하는 영역에서 loxP 서열까지와 pSF1 유래의 loxP 서열에서 neo유전자의 일부까지를 포함하는 약 2.3kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 예상되는 증폭이 확인되었다.
이상으로부터, 상기의 A9ΔET1 세포는 CMV 프로모터 및 인간 EPO 유전자 및 SV40 폴리 A 부가 서열을 포함하는 인서트 DNA가 카피 삽입된 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 것이 확인되었다.
이상의 (2-1) 내지 (2-3)의 실험으로부터, A9ΔET1 세포가, 장완 및 단완을 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 17] 단완을 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 햄스터 세포주에의 이입
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서 실시예 6에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입하고, 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체에 의거한 HAC 벡터를 보유하는 DT40 세포(DT4-(#21)hyg4)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 챠이니즘 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(ATCC에서 입수, 등록번호 JCRB9018)를 이용하였다. 마이크로셀의 취득 및 CHO 세포와의 융합은 실시예 3(1)과 마찬가지로 행하였다. 합계 4회의 융합을 행한 결과, 선택 배양 개시후 약 2주후에 합계 5주의 하이그로마이신 내성 CHO주를 얻었다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR법
이입 염색체의 확인을 PCR법에 의해 행하였다. 인간 21번 염색체 단완 근위의 마커 pCHB, D21S187 및 D21S275(실시예 6의 (3-1), 도 12 참조)의 검출을 시도하였다. 하이그로마이신 내성의 CHO 세포 5주 중에서 2주(CHO#21hyg4 및 CHO#21hyg8)에 있어서, 절단점보다 근위에 위치하는 D21S275의 증폭을 확인하였다.
(2-2) PCR법
재조합의 표적 부위를 사이에 둔 서열을 PCR에 의해 증폭하였다(실시예 6의 (3-3), 도 12 참조). CHO#21hyg4, 8의 2주에서만 증폭 산물이 얻어지고, 제한 효소 NsiI 분해에서도 예상되는 부분 단편의 생성을 확인하였다.
(2-3) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH)
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 블라스트사이딘 내성의 CHO주 중에서 2주(CHO(#21)htg4 및 CHO(#21)hyg8)에 대하여 해석한 바, 어느것이나 관찰한 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 숙주인 CHO 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 단축된 인간 21번 염색체가 CHO 세포에 이입된 것이 확인되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험으로부터, 얻어진 하이그로마이신 내성 CHO주는 장완 원위를 삭제하고 loxP 서열을 삽입하고, 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 부분 단편(HAC 벡터)를 유지한다는 것이 확실해졌다.
[실시예 18] 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 인간 세포주에의 이입 및 안정성의 확인
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 실시예 17에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입하고, 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체에 의거한 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)hyg4 및 CHO(#21)hyg8)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 섬유 육종 세포주 HT1080(ATCC에서 입수, 등록번호 CCL-121)를 이용하였다. 마이크로셀의 취득 및 HT1080 세포와의 융합은 실시예 4(1)과 마찬가지로 행하였다. CHO(#21)hyg4에서는 1회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 7의 블라스트사이딘 내성 HT1080주, CHO(#21)hyg8에서는, 2회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 20의 블라스트사이딘 내성 HT1080주를 얻었다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR법
이입 염색체는 블라스트사이딘 내성 유전자(실시예 4(2-1) 참조) 및 하이그로마이신 내성 유전자의 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다:
블라스트사이딘 내성 유전자는 블라스트사이딘 내성 HT1080주 전부에 있어서 증폭이 확인되었다. 한편, 하이그로마이신 내성 유전자는 CHO(#21)hyg4 유래의 7주 중에서 5주, CHO(#21)hyg8 유래의 30주 주에서 27주에 있어서 증폭이 확인되었다.
(2-2) 염색체 해석
염색체 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용한 FISH법에 의해 행하였다. 대표적인 FISH상을 도 17에 도시한다. 블라스트사이딘 내성주에서는, 신주의 HT1080 세포에는 존재하지 않고, 내재의 21번 염색체보다 사이즈가 작은 미니 염색체가 관찰되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험으로부터, 얻어진 블라스트사이딘 내성 HT1080주는 장완 원위를 삭제하고 loxP 서열을 삽입하고, 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 부분 단편(HAC 벡터)를 유지한다는 것이 확실해졌다.
(3) 비선택 배양 조건하에서의 장기 계대 배양
장완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체와, 게다가 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체의 배양 세포에 있어서의 안정성을 확인하기 위하여, 비선택 조건하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 4에 기재한 인간 세포주(HT1080(#21)bsd79-1-1,3,6,11,14, HT1080(#21)bsd-H4-1,3,6, HT1080(#21)bsd-H8-4,9,2)를 사용하였다. 인간 세포주용의 비선택 배양액은 10% CS를 가한 DMEM이고, 선택 배양액은 이것에 블라스트사이딘 4㎍/㎖를 첨가하였다. 인간 세포주는 5.0×105 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하고, 3일후에 세포를 계수하여 재차 5.0×105 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하였다. 인간 세포주는 집단 배가수 25, 50, 100에 각각 세포를 회수하고 염색체 표본을 제작하였다.
(4) 염색체 해석
인간 세포에 있어서의 인공 염색체의 검출은 黑木 등(세포 공학 핸드북, 양토사, 1992)에 기술된 방법에 따라서, 김사(Giemsa) 염색법에 의해 행하였다. 분열 중기 염색체상 20개에 있어서 미니 염색체의 유무를 관찰하여 보유율을 산출하고, 5클론의 평균값을 내었다. 그 결과를 표 17에 나타낸다.
인간 21번 염색체 부분 단편은 HT1080 세포에 있어서 분열 횟수 100회 시점에서 안정되게 보유되고 있었다. 또한, 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 부분 염색체가 확인되었다.
이상의 (3) 및 (4)의 실험에 의해, 인간 21번 염색체의 장완 원위를 삭제한 부분 단편과, 게다가 단완 원위를 삭제한 부분 단편은 HT1080 세포주에 있어서 비선택 배양 조건에서 안정되게 보유되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되고 있다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 19] 인간 세포주에 있어서의 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터로의 GFP 유전자 삽입
(1) 트랜스펙션 및 G418 내성 클론의 단리
실시예 18에서 제작한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 인간 HT1080 세포주(HT1080(#21)bsd79-1-6, 14, HT1080(#21)bsd-H4-1,6, HT1080(#21)bsd-H8-2를 트립신 처리하고, 6웰 클러스터(눈크)의 1웰당 4×105 세포를 접종하고 1일간 배양하였다. 실시예 5(1)에서 제작한 loxP 서열을 포함하는 GFP 발현 플라스미드 2㎍과 Cre 효소 발현 벡터 pBS185(라이프테크) 1㎍을 7.5㎕의 리포솜 용액(리포펙트아민 2000, 인비트로진)과 혼합하여 배지에 첨가하고 5시간후에 배지를 교환하였다. 1일 배양후 트립신 처리하고, 10% CS를 첨가한 DMEM 배지에 현탁하여 100㎜ 디쉬 2장에 접종하였다. 다음날 400㎍/㎖의 G418(GENETICIN, 시그마)를 포함하는 배지와 치환하였다. 약 2주후에, 콜로니가 출현되고, 그 빈도는 HT1080 세포 4×105당 3∼14개였다. 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(2) 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 GFP 유전자의 발현
단리된 G418 내성 HT1080 세포주를 형광 현미경하에서 관찰하였다. 그 결과, 21ΔqHAC에서는 21클론 중에서 14클론에 있어서, 또한, 21ΔpqHAC에서는 31클론 중에서 28클론에 있어서 GFP의 발현이 확인되었다. 대표적인 형광 현미경상과 가시광 현미경상을 도 18a 및 도 18b에 도시한다.
(3) 상동 재조합체의 확인
상동 재조합체를 확인하기 위하여, 재조합의 표적 부위를 사이에 둔 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. pBS226 및 pSF1 플라스미드 상에 설정한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타낸다.
GFP 유전자의 발현에 의하지 않고 모든 G418 내성 클론에서 PCR 증폭이 보여지고, 상동 재조합체라는 것을 확인하였다.
이상 (1)∼(3)의 실험으로부터, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에는 인간 세포주 중에 있어서도 유전자의 삽입이 가능하고, 삽입된 유전자가 발현된다는 것이 확실해졌다.
(4) 장기 계대 배양후의 GFP 유전자의 발현
G418 내성 HT1080 세포주로부터 임의의 7주를 선택하고, 선택 약제 비첨가의 조건에서 계대 배양하였다. 배양 개시로부터 1개월후(집단 배가수 약 30)에 형광 현미경하에서 관찰한 결과, 어느 클론에 있어서도 GFP 유전자의 발현이 확인되었다.
이상의 실험 (4)으로부터, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 삽입된 유전자는 삽입 부위의 위치 효과를 받아서 발현이 감약되지 않고 안정되게 보유된다는 것, 즉 HAC 벡터 상의 유전자 삽입 부위는 헤테로크로마틴 영역이 아니라는 것이 확실해졌다.
[실시예 20] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 마우스 ES 세포주에의 이입 및 안정성의 확인
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 실시예 5에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 도입한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터에 GFP 유전자를 삽입한 CHO 세포주(CHO(#21)ΔqGFP7-2)와, 실시예 17에서 얻어진 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 도입하고 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)hyg8)를 이용하였다. 수용 세포로서는, 마우스 ES 세포주 E14(Hooper 등, Nature, 326:292, 1987)을 이용하였다. E14의 배양 방법은 (相澤 愼一, 바이오매뉴얼 시리즈 8, 진 타게팅, 양토사, 1995)에 기재된 방법에 따라서, 영양 세포로서는 마이토마이신 C 처리한 마우스 배(胚) 초대 배양 세포(인비트로진)을 이용하였다. 먼저, 약 108개의 공여 세포로부터 마이크로셀을 조제하고 전량 5㎖의 DMEM 배지에 현탁하였다. 약 107개의 E14를 DMEM에서 3회 세정하고, 5㎖의 DMEM에 현탁한 후, 마이크로셀과 합쳐서, 1250rpm, 10분간 원심하여 상청을 제거하였다. 침전을 태핑에 의해 잘 풀고, 1:1.4 PEG 용액(5g PEG1000(와코 순야쿠), 1㎖ DMSO(시그마)를 6㎖ DMEM에 용해) 0.5㎖를 가하여 실온에서 1분 30초 정치한 후, 10㎖의 DMEM을 천천히 가하였다. 곧바로 1250rpm, 10분간 원심하여 상청을 제거하고, 침전을 30㎖의 ES 세포용 배지에 현탁하고, 직경 100㎖의 조직 배양용 플라스틱 샤레(파르콘) 3장에 접종하였다. 24시간 후에 CHO(#21)ΔqGFP7-2를 공여 세포로 하는 경우, 300㎍/㎖의 G418(GENETICIN, 시그마), CHO(#21)hyg8을 공여 세포로 하는 경우, 150㎍/㎖의 하이그로마이신(Hygromycin-B, 와코 순야쿠)을 가한 배지와 교환하고, 그 후, 매일 배지를 교환하였다. 1주∼10일후에는 내성 콜로니가 출현되었지만. 그 빈도는 E14 세포 107 당 2∼5개였다. 그 콜로니를 단리하고 증폭시키고, 5×107 개당 1㎖의 보존용 배지(ES 세포용 배지+10% DMSO(시그마))에 현탁하고, -80℃에서 동결 보존하였다. 동시에 각 내성주에 대하여 약 106개의 세포로부터 게놈 DNA를 조제하였다(Puregene DNA Isolation Kit(Gentra System사)).
(2) PCR 해석
이입 염색체와 유지 영역은 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 이하에 나타낸 프라이머 올리고뉴클레오티드를 새롭게 설정하였다:
이들 프라이머는 GenBank에서 입수한 염기 서열(수탁 번호 AL163201)을 기초로 제작하였다. 해석에 이용한 올리고뉴클레오티드를 하기 표 18에 나타낸다:
이상의 결과를 도 19에 도시한다. 얻어진 약제 내성주에서는 어느것이나 이입된 염색체 영역의 일부가 결실되어 있었다.
(3) 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH) 해석
FISH 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용하여 행하였다. 그 결과, 관찰된 분열상의 대부분에 있어서 단축된 인간 21번 염색체가 검출되었다. 대표적인 FISH상을 도 20a 및 도 20b에 도시한다. CHO(#21)ΔqGFP7-2 유래 G418 내성주에서는 5주 중에서 1주(E14(#21)neo1)에서 인간 염색체 단편이 관찰되었다. CHO(#21)hyg8 유래 하이그로마이신 내성의 2주에서는, 어느것이나 인간 염색체 단편이 관찰되었다. 이 중에서 E14(#21)Hyg1에서는 2개의 인간 염색체 단편이, E14(#21)Hyg2에서는 1개의 인간 염색체 단편이 관찰되었다. 인간 염색체가 확인된 상기 3주에서는, 숙주인 마우스의 염색체수는 어느것이나 40개로 정상이라는 것을 확인하였다.
이상의 (2) 및 (3)의 결과로부터, 얻어진 G418 내성 내지 하이그로마이신 내성 E14주는 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 보유한다는 것이 확실해졌다.
(4) 비선택 배양 조건하에서의 장기 계대 배양
인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 마우스 ES 세포에 있어서의 안정성을 확인하기 위하여, 비선택 조건하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 상기 (3)에서 제작한 마우스 ES 세포주 E14(#21)neo1, E14(#21)Hyg1, E14(#21)Hyg2를 사용하였다. 마우스 ES 세포용의 비선택 배양액은 18.2% FBS(인비트로진), 3.5g/ℓ 글루코스(시그마), 0.125mM MEM 비필수 아미노산(인비트로진), 1000U/㎖ LIF(ESGRO, 와코 순야쿠), 0.1mM 2-메르캅토 에탄올(시그마)을 가한 DMEM이다. 마우스 ES 세포주는 1×107 세포를 10㎝ 직경 디쉬 중의 영양 세포 상에 접종하고, 2일후에 1/15를 10㎝ 직경 디쉬 중의 영양 세포 상에 접종하였다. 배양 개시로부터 14, 28, 42일후에 각각 세포를 회수하고, 염색체 표본을 제작하였다.
(5) 염색체 해석
마우스 ES 세포에 있어서의 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 검출은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용한 FISH 해석법에 의하여 행하였다. 20개의 분열 중기상에 있어서 인간 염색체 단편의 유무를 관찰하고, 보유율을 산출하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다. 장기 계대 배양은 각 주 모두 3연(連)으로 행하고, 보유율로서 그 평균을 나타내었다.
인간 21번 염색체로부터 장완 원위를 삭제한 부분 단편은 비선택 조건하에서의 장기 계대 배양에 따라서 감소하는 경향을 나타내었다. 이에 비하여, 인간 21번 염색체로부터 장완 원위, 단완 원위를 함께 삭제한 부분 단편은 분열 횟수 75회를 넘더라도 감소하지 않고 안정되게 보유되고 있었다. 또한, 장기 계대 배양 개시 시점에서 세포당 염색체 단편의 카피수가 1이었던 주에서는, 카피수의 증가는 보이지 않았다. 장기 계대 배양 개시 시점에서 세포당 염색체 단편의 카피수 2가 우성이었던 주에서는, 약간이지만 카피수가 감소하는 경향이 보여졌다.
이상의 (4) 및 (5)의 실험에 의해, 인간 21번 염색체의 장완 원위 및 단완 원위를 삭제한 부분 단편은 마우스 ES 세포주에 있어서 비선택 배양 조건하에서 안정되게 보유된다는 것, 또한 세포당 카피수는 유지되어 있다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 21] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 인간 체간 세포주에의 이입 및 안정성
(1) 미소핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
염색체 공여 세포로서, 실시예 17에서 얻어진, 장완 원위를 삭제하여 loxP 서열을 삽입하고 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체에 의거한 HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(#21)hyg4 및 CHO(#21)hy8)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 인간 hTERT 유전자 및 인간 파필로머(papilloma) 바이러스 E6/E7 유전자에 의해 주화(侏化)된 인간 골수 유래 간엽계 줄기 세포주 hiMSC(교토 대학, 戶口 田渟 교수에게서 입수, Okamoto 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295:354, 2002)를 이용하였다. hiMSC주는 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 먼저, 약 107개의 CHO(#21)hyg4/8 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 즉 25㎠ 원심용 플라스크(코스터) 6개에 세포 밀도가 60∼70% 포화 정도까지 배양한 CHO(#21)hyg4/8 세포를 코르세미드(0.075㎍/㎖, 데메코르신, 와코 순야쿠)를 포함하는 배양액(10% FBS, 8㎍/㎖ 블라스트사이딘, F12) 중에서 48시간 배양하여 미소핵을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 둔 사이토칼라신(cytochalasin) B(DMEM 배지 중에 10㎍/㎖, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 아크릴성 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8000rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 필터로 여과하여 정제하였다. 6㎝ 직경 디쉬에 80% 포화 상태까지 배양한 hiMSC 세포에, 정제한 미소핵 세포를 가하고 PEG 용액으로 융합하였다. 48시간 후에 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 블라스트사이딘(8㎍/㎖)을 포함하는 선택 배지(10% CS, DMEM)에서 배양하였다. 약 2주후의 선택 배양 후, 출현된 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. CHO(#21)hyg4에서는 1클론, CHO(#21)hyg8에서는 4클론의 블라스트사이딘 내성 hiMSC주를 얻었다.
(2) 이입 염색체의 확인
(2-1) PCR법
이입 염색체는 블라스트사이딘 내성 유전자(실시예 4(2-1) 참조) 및 하이그로마이신 내성 유전자(실시예 18(2-1))의 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 블라스트사이딘 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 모두 검색한 5주의 블라스트사이딘 내성 HT1080주 모두에 있어서 증폭이 확인되었다.
(2-2) 염색체 해석
염색체 해석은 松原 등(FISH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 특이적 프로브 Cot1(기부코 BRL)을 이용한 FISH법에 의해 행하였다. 대표적인 FISH상을 도 21에 도시한다. 블라스트사이딘 내성주에서는, 신주의 hiMSC 세포에는 존재하지 않고, 내재의 21번 염색체보다 사이즈가 작은 미니 염색체가 관찰되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험으로부터, 얻어진 블라스트사이딘 내성 hiMSC주는 장완 원위를 삭제하고 loxP 서열을 삽입하고, 단완 원위를 삭제한 인간 21번 염색체 부분 단편(HAC 벡터)를 유지한다는 것이 확실해졌다.
(3) 비선택 배양 조건하에서의 장기 계대 배양
인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의, 다분화능을 갖는 인간 체간 세포에 있어서의 안정성을 확인하기 위하여, 비선택 조건하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 상기 (1) 및 (2)에서 제작한 인간 간엽계 줄기 세포주(HiMSC(#21)bsd-H4-1, HiMSC(#21)bsd-H8-1,2,3,4)를 사용하였다. 인간 세포주용의 비선택 배양액은 10% FBS를 가한 DMEM이고, 선택 배양액은 이것에 블라스트사이딘 4㎍/㎖를 첨가하였다. 인간 세포주는 5.0×105 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하고, 3일후에 세포를 계수하여 재차 5.0×105 세포를 10㎝ 직경 디쉬에 접종하였다. 인간 세포주는 배양 개시 시점에서부터 집단 배가수 15, 40, 90에 각각 세포를 회수하고 염색체 표본을 제작하였다.
(4) 염색체 해석
인간 간엽계 줄기 세포에 있어서의 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터의 검출은 松原 등(FICH 실험 프로토콜, 수윤사, 1994)에 기술된 방법에 따라서, 인간 21번 염색체 유래 알포이드 특이적 프로브 pll-4(나고야 대학, 舞 本寬 교수에게서 입수, Ikeno 등, Hum. Mol. Genet., 3:1245, 1994)를 이용한 FISH법에 의해 행하였다. 분열 중기 염색체상 50개에 있어서 미니 염색체 상의 형광 시그널의 유무를 관찰하여 보유율을 산출하였다. 그 결과를 표 20에 나타낸다.
인간 21번 염색체 부분 단편은 hiMSC 세포에 있어서 분열 횟수 90의 시점에서 안정되게 보유되고 있었다. 또한, 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1카피의 부분 염색체 단편이 보여졌다.
이상의 (3) 및 (4)의 실험에 의해, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터는 hiMSC 세포주에 있어서 비선택 배양 조건에서 안정되게 보유된다는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되어 있다는 것이 밝혀졌다.
[실시예 22] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 이입한 인간 체간 세포주의 인 비트로 분화 유도에 의한 다분화능의 확인
실시예 21에서 제작한 인간 21번 유래 HAC 벡터를 이입한 인간 간엽계 줄기 세포를 Okamoto 등(Biochem. Biophys. Res. Commun., 295: 354, 2002)의 방법에 따라서 분화 유도하고, 뼈, 연골, 지방 세포에의 분화능을 조사하였다. 실시예 21에 기재된 인간 간엽계 줄기 세포주(hiMSC(#21)bsd-H8-1) 및 그 신주(hiMSC)를 사용하였다.
(1) 뼈 세포로의 분화 유도
hiMSC 세포를, 3×103/㎠의 밀도로 접종하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 100nM 덱사메타존(시그마), 50μM 아스코르빈산 2인산(시그마), 10mM β글리세로인산(시그마)을 첨가한 배지 중에서 21일간 배양하였다. 이 동안에 배지는 2일마다 교환하였다.
(2) 연골 세포로의 분화 유도
2.5×105의 hiMSC 세포를 15㎖ 용적의 폴리프로필렌 튜브(코닝)에 회수하고 실온에서 800rpm 5분간 원심하였다. 세포 침전을, 높은 글루코스 DMEM에 10ng/㎖ 인간 TGF-β3(인비트로진), 100nM 덱사메타존(시그마), 6㎍/㎖ 인슐린(로쉐), 100μM 아스코르빈산 2인산(시그마), 1mM 피루빈산 나트륨(시그마), 6㎍/㎖ 트랜스페린(시그마), 0.35mM 프롤린(시그마), 1.25㎎/㎖ 소 혈청 알부민(인비트로진)을 첨가한 배지에 재현탁하여 원심한 후, 세포괴의 상태로 21일간 배양하였다. 이 동안에 배지는 2일마다 교환하였다.
(3) 지방 세포로의 분화 유도
hiMSC 세포를 영양 디쉬에 3×103/㎠의 밀도로 접종하고, 컨플루언트까지 배양한 후, 유도/유지 배양을 3회 반복하였다. 유도 배양은 10% FBS를 포함하는 DMEM에 1μM 덱사메타존(시그마), 0.2mM 인도메타신(시그마), 10㎍/㎖ 인슐린(시그마), 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(시그마)를 첨가한 유도 배지에서 3일간 행하였다. 유지 배양은 10% FBS를 포함하는 DMEM에 10㎍/㎖ 인슐린(로쉐)를 첨가한 유지 배지에서 2일간 행하였다.
(4) 조직 염색
21일간의 배양 후, 세포는 PBS로 2번 세정한 후, 10% 포르말린으로 고정하였다. 뼈 세포 분화에서는 5% 질산은(나카라이), 지방 세포 분화에서는 0.3% 오일 레드 □○(나카라이)에 의해 염색하였다. 연골 세포 분화에서는 고정된 세포괴를 에탄올에 의해 탈수하고 크실렌으로 세정한 후에 파라핀 포매(包埋)하고, 절편을 알시안 블루(alcian blue)(나카라이)에 의해 염색하였다.
인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 이입한 간엽계 줄기 세포주 hiMSC(#21)bsd-H8-1을 분화 유도하면, 신주의 hiMSC와 마찬가지로, 뼈, 연골, 지방 세포에 특이적인 조직 염색에 대하여 양성이었다.
이상의 (1)∼(4)의 실험 결과로부터, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 이입한 간엽계 줄기 세포는 뼈, 연골, 지방 세포에의 다분화능을 유지하고 있다는 것이 확실해졌다.
[실시예 23] 게잡이 원숭이(crab-eating monkey) ES 세포에의 마이크로셀 법에 의한 인간 14번 염색체 단편 도입
염색체 공여 세포로서는 인간 14번 염색체 단편 SC20(Tomizuka 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000)을 유지하는 마우스 A9 세포주(이하 A9/SC20이라 함)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로서는, 게잡이 원숭이 ES 세포주 CMK6.4(Suemori 등, Dev. Dyn. 222, 273-279, 2001)을 이용하였다. CMK6.4의 배양은 Suemori 등(상기)에 기재된 방법에 따라서 실시하였다. 배지의 조성은 DMEM/F12(SIGMAD-6421)에, 20% KSR(Knock out serum replacement, GIBCO BRL), 비필수 아미노산 용액(×100, SIGMA M7145), 및 L 글루타민 용액(×100, SIGMA M7522)를 첨가한 것이다. 먼저, 淸水 등(세포 공학 핸드북, 양토사, 1992)의 보고한 방법에 따라서, 25㎠ 플라스크(Nunc 152094) 24개(70∼80% 컨플루언트)의 A9/SC20 세포로부터 마이크로셀을 조제하였다. 얻어진 마이크로셀은 전량을 5㎖의 DMEM(SIGMA D-5796)에 현탁하였다. 1∼5×106개의 CMK6.4 세포를 트립신액(0.25% 트립신, 20% KSR)에서 분산시킨 후, DMEM에서 2회 세정하고, 5㎖의 DMEM에 현탁한 후, 마이크로셀과 합쳐서, 1500rpm, 7분간 원심하여 상청을 제거하였다. 융합에 이용하는 1:1.4 PEG 용액은 1g의 PEG(SIGMA)를 1.2㎖의 DMEM에 용해하고, 0.2㎖ DMEM(SIGMA)를 첨가함으로써 조제하였다. 침전을 태핑에 의해 잘 풀고, 37℃에서 프리 인큐베이트한 1:1.4 PEG 용액 1.0㎖를 가하여 실온에서 2분간 정치한 후, 10㎖의 DMEM을 천천히 가하였다. 곧바로 1500rpm, 7분간 원심하여 상청을 제거하고, 침전을 4㎖의 ES 세포용 배지에 현탁하고, 미리 G418 내성 영양 세포를 뿌린 직경 35㎜의 조직 배양용 플라스틱 샤레 2장에 접종하고, CO2 인큐베이토(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 24시간후, 50㎍/㎖의 G418을 가한 배지와 교환하고, 그 후 매일 배지 교환을 행하였다. 1주에서 10일후에는 약제 내성 콜로니가 출현되었다. 픽업된 약제 내성 ES 세포 콜로니를 미리 G418 내성 영양 세포를 뿌린 4웰 플레이트에 접종하고, 50㎍/㎖의 G418 존재하에서 다시 10일간 배양을 행하였다. 그 결과, 살아남은 ES 세포 콜로니를 재차 픽업하여, 미리 영양 세포를 뿌린 4웰 플레이트에 접종하고, 비선택 조건하에서 다시 10일간 배양을 행하였다. 증식한 ES 세포는 알칼리성 포스파타아제 염색(Suemori 등, 상기) 양성이고, 미분화능을 유지하고 있다는 것이 드러났다. 게다가, 정법에 따라서 추출된 게놈 DNA를 이용한 도입 염색체 유지 확인은 이하와 같이 실시하였다.
약제 내성주 게놈 DNA를 주형으로 하여 인간 14번 염색체 단편에 포함되는 Neo 유전자(pSTneoB, Tomizuka 등, Nature Genet. 16, 133-143, 1997)의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 이하에 사용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다. 반응 조건은 약 0.1㎍의 게놈 DNA를 주형으로 하고, Taq 폴리머라제로서는 타카라 ExTaq를 이용하고, 94℃ 5분의 반응을 1사이클 행한 후, 94℃ 15초, 59℃ 15초 및 72℃ 20초를 35사이클 행하였다.
얻어진 G418 내성 원숭이 ES 세포 클론 1종에 대하여, PCR 해석을 행한 결과, Neo 유전자(pSTneoB)의 존재를 나타낸, 특이적인 증폭 산물이 검출되었다. 이들 실험에 의해, 마이크로셀 법에 의한 인간 14번 염색체 단편 SC20의 게잡이 원숭이 ES 세포주에의 이입이 드러났다. 또한, 게잡이 원숭이, 히말라야 원숭이(Macaca mulatta), 및 인간을 포함하는 영장류 ES 세포는 그 성질이 매우 유사하다는 것이 알려져 있다(末盛 등, 실험 의학, Vol.21, No.8, p46-51, 2003, 양토사). 따라서, 이 결과는, 약제 내성 마킹된 인간 염색체(단편) 및 인간 인공 염색체(HAC)를 본 실시예에 기재된 방법에 의해, 게잡이 원숭이 ES 세포를 포함하는 영장류 ES 세포에 이입 가능하다는 것을 나타내고 있다.
[실시예 24] 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 이입한 마우스 ES 세포주의 인 비트로 분화 유도에 의한 분화능의 확인
실시예 20에서 제작한, GFP 유전자를 삽입한 인간 21번 염색체 HAC 벡터를 보유하는 마우스 ES 세포를 신경 분화 유도하고, 신경 세포에의 분화능을 조사하였다. 마우스 ES 세포는 실시예 20에 기재한 마우스 ES 세포주 E14(#21)neo1을 사용하였다.
(1) GFP 발현 세포의 분취
E14(#21)neo1 세포는 직경 100㎜의 조직 배양용 플라스틱 샤레 중의, 마이토마이신 C 처리한 마우스 배 초대 배양 세포(인비트로진) 상에 접종하고, 20% FBS를 포함하는 DMEM(인비트로진)에 2mM L-글루타민산(인비트로진), 0,2mM 2-메르캅토에탄올(시그마), 1mM 피루빈산나트륨(인비트로진), 0.1mM MEM 비필수 아미노산, 1000U/㎖ LIF(와코 순야쿠)을 첨가한 배지에서 배양하였다. 0.1% 트립신, 0.04% EDTA 처리에 의해 분산된 세포를 배지 중에 회수하여 PBS로 2회 세정한 후, 1×106개/㎖로 되도록 PBS에 현탁하여 셀 소터(EPICS ELITE, 베트만 콜터)에서 실시하여, GFP 발현 세포를 분취하였다.
(2) 신경 세포로의 분화 유도
분화 유도용의 영양 세포인 마우스 골수 유래 PA6 세포는 10% FBS를 포함하는 αMEM(인비트로진)에 2mM L-글루타민산(인비트로진)을 첨가한 배지에서 배양하였다. 상기 (1)에서 분취한 GFP 발현 ES 세포 1×103개를, 혈청 및 LIF를 포함하지 않는 분화 유도용 배지에 현탁하여 슬라이드 챔버(눈크) 중의 PA6 세포 상에 접종하였다. 분화 유도용 배지는 10% 녹 아웃 혈청 리플레이스먼트(인비트로진)을 포함하는 G-MEM(인비트로진)에 2mM L-글루타민산(인비트로진), 0,2 mM 2-메르캅토에탄올(시그마), 1mM 피루빈산나트륨(인비트로진), 0.1mM MEM 비필수 아미노산을 첨가한 것이다. 10일간 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 신경 세포에서 특이적으로 발현하는 β튜블린에 대한 항체(TUJI, Berkley Antibody Company)에 의해 면역 염색하고 공촛점 형광 현미경하에서 관찰하였다. 돌기를 신장하여 신경 세포의 형태를 취하고, 항β튜블린 항체로 염색되는 세포에 있어서 GFP의 발현이 확인되었다. 대표적인 공촛점 형광 현미경상을 도 22a 및 도 22b에 도시한다.
이상의 (1)∼(2)의 실험으로부터, 인간 21번 염색체 유래 HAC 벡터를 이입한 ES 세포는 신경 세포에의 다분화능을 유지하고 있다는 것이 확실해졌다.
본 발명에 의해, 인간 인공 염색체(HAC) 벡터가 제공된다. 본 HAC 벡터는 그 전체 사이즈가 축분해되고 아울러 불필요한 유전자가 삭제되어 있기 때문에 세포 중에서 안정되게 보유된다. 또한, 본 HAC 벡터는 인간 염색체에 의거하여 제작되어 있기 때문에, 큰 사이즈의 외래 DNA를 삽입하는 것이 가능하다. 또한, 본 HAC 벡터에는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입되어 있기 때문에, 외래 DNA를 카세트 형식으로 간편하게 도입할 수 있으며, 또한 그 도입 위치를 적절히 설정할 수 있기 때문에 위치 효과를 받지도 않는다. 게다가, 본 HAC 벡터를 이용함으로써, 큰 사이즈의 외래 DNA를 세포에 도입하고 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 HAC 벡터는 원하는 단백질을 코드하는 유전자의 고발현에 따른 상기 단백질의 생산, 기능 미지의 유전자 또는 단백질의 생체내 기능 해석, 큰 사이즈의 DNA의 클로닝을 위해 사용할 수 있으며, 유전자 공학에 관련된 분야에 있어서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> Human Artificial Chromosome Vector <130> PH-1899-PCT <150> JP 2002-292853 <151> 2002-10-04 <160> 62 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 cgcggatcca gagagagcct ggaatgcctg gtagtgt 37 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cgcggatccc cagtgccctg agatcttgtg atttctc 37 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 gcctggcatc ttcctcaata 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 ttgcatgcct gtggtactgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 tcacaatcat gggctttgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 cacgcaacca tttgttcatt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 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ttaaagctga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 aaagggaata agggcgacac 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 ggtttgtcca aactcatcaa tgta 24 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 gtcaattcac taattcctat tcccagt 27 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 caacagcatc cccatctctg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 gctcaagatg cccctgttct 20 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 ggccgaattc cgtattaccg ccatgcat 28 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 ccgggatccc acaactagaa tgcagtg 27 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 gcactagtct ggcactcctg cataaaca 28 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 ctaaggatcc atttcagcct gtgggaatca 30 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 ctggcactcc tgcataaaca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 tctgtgttcc ccttctctga 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 aagtactcgc cgatagtgga aacc 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 agttagccta ccttttggcc atcc 24 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 cgggatccct cgagcgagac atgataagat acattgatg 39 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 ggaagatctt cctaatcagc cataccacat ttgtagagg 39 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 cggaattccg gacattgatt attgactagt tattaatag 39 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 cgggatcccg ggtgtcttct atggaggtca aaacag 36 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 cgggatcccg gccaccatgg gggtgcacga atgtc 35 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 cgctcgagcg ctatctgtcc cctgtcctgc agg 33 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 ggaattccgg gcccacgcgt gacattgatt attga 35 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 ggaattcctg atcataatca gccataccac atttg 35 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 tttgcatgtc tttagttcta tgatga 26 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 38 aggtcggtct tgacaaaaag aac 23 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 39 caggaaacag ctatgac 17 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 tttgcatgtc tttagttcta tgatga 26 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 aggtcggtct tgacaaaaag aac 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 ctacccgtga tattgctgaa gag 23 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 atttgcactg ccggtagaac t 21 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 ctgctgcgca cgtgggaag 19 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 ggtctggcag gtgacaccac 20 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 gaagatcttc atcgatcggc caccatgccg cgcgc 35 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 tcactcggtc cacgcgtcct 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 agtgccagcc gaagtctgcc 20 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 gcagctgaac agtgccttc 19 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 aggacgcgtg gaccgagtga 20 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 52 ccgagcgtct cacctcgagg gtgaaggcac tgttc 35 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 53 atggactacg tcgtgggagc caga 24 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 54 gtcgacgcta gctcagtcca ggatggtctt gaagt 35 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 55 gcgaagaatc tcgtgctttc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 56 ataggtcagg ctctcgctga 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 57 gccatccacg ctgttttgac 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 58 gcatcagagc agccgattgt 20 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 59 acacttttga caaacacacc ag 22 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 60 tcaacaatga aaggggatgt c 21 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 61 tgaatgaact gcaggacgag 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 62 atactttctc ggcaggagca 20 1/19

Claims (48)

  1. 장완 원위 및(또는) 단완 원위가 삭제된 인간 21번 염색체 단편 또는 인간 14번 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 인간 21번 염색체 단편 또는 인간 14번 염색체 단편이 약 2 내지 16Mb인 인간 인공 염색체 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 21번 염색체의 장완 원위가 21q11 영역내에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 인간 21번 염색체의 장완 원위가 AL163204에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 21번 염색체의 단완 원위가 21p 영역내에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 인간 21번 염색체의 단완 원위가 AL163201에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 14번 염색체의 장완 원위가 14q 영역내에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 인간 14번 염색체의 장완 원위가 AL157858 또는 AL512310에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 14번 염색체의 단완 원위가 14p 영역내에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 인간 14번 염색체의 단완 원위가, OR4H12, OR4Q4, RNR2, OR4L1, RNU6C, FDPSL3, K12T, C14orf57, OR6S1, M195, OR4K14, MGC27165, LCH, OR10G3, OR4K3, OR4E2, H1RNA, ATP5C2, OR11H6, 및 OR4M1으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에서 삭제되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소인 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체 벡터.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열인 인간 인공 염색체 벡터.
  14. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 인간 21번 염색체의 장완 근위의 AL163203에 삽입되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  15. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 인간 14번 염색체의 장완 근위의 AL157858 또는 AL512310의 상기 삭제 위치보다도 근위에 삽입되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  16. 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 인간 14번 염색체의 단완 근위의 14p12 영역내의 상기 삭제 위치보다도 근위에 삽입되어 있는 인간 인공 염색체 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 장완 원위 및(또는) 단완 원위의 삭제가 인공 텔로미어 서열과의 치환에 의한 것임을 특징으로 하는 인간 인공 염색체 벡터.
  18. 인간 인공 염색체 벡터의 제작 방법으로서,
    (a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 세포를 얻는 단계,
    (b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계, 및
    (c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계를 포함하는 제작 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단계 (a)에서, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 세포가 상동 재조합 효율이 높은 것인 제작 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상동 재조합 효율이 높은 세포가 닭 DT40 세포 유래의 것인 제작 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위의 삭제를 인공 텔로미어 서열과의 치환에 의해 행하는 것인 제작 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 인간 21번 염색체의 장완 원위를 AL163204에서 삭제하는 제작 방법.
  23. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 인간 21번 염색체의 단완 원위를 AL163201에서 삭제하는 제작 방법.
  24. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 인간 14번 염색체의 장완 원위를 AL157858 또는 AL512310에서 삭제하는 제작 방법.
  25. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 인간 14번 염색체의 단완 원위를, OR4H12, OR4Q4, RNR2, OR4L1, RNU6C, FDPSL3, K12T, C14orf57, OR6S1, M195, OR4K14, MGC27165, LCH, OR10G3, OR4K3, OR4E2, H1RNA, ATP5C2, OR11H6, 및 OR4M1으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 위치에서 삭제하는 제작 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서, 부위 특징적 재조합 효소가 Cre 효소인 제작 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열인 제작 방법.
  28. 제18항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 인간 21번 염색체의 장완 근위의 AL163203에 삽입하는 제작 방법.
  29. 제18항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 인간 14번 염색체의 장완 근위의 AL157858 또는 AL512310의 상기 삭제 위치보다도 근위에 삽입하는 제작 방법.
  30. 제18항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 인간 14번 염색체의 단완 근위의 14p12 영역내의 상기 삭제 위치보다도 근위에 삽입하는 제작 방법.
  31. 제18항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 제작 방법에 의해 얻어지는, 인간 인공 염색체 벡터.
  32. 제31항의 인간 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포.
  33. 제18항 내지 제30항 중의 어느 한 항의 제작 방법에 있어서,
    (d) 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에서 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 제작 방법.
  34. 제33항의 제작 방법에 의해 얻어지는, 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터.
  35. 제34항의 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포.
  36. 제35항의 세포를 포함하는 의약 조성물.
  37. 외래 DNA를 수용 세포에 도입하는 방법으로서,
    (a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계,
    (b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계,
    (c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계,
    (d) 부위 특이적 재조합 효소의 존재하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계,
    (e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 조제하는 단계,
    (f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계, 및
    (g) 융합한 수용 세포에서 외래 DNA의 도입을 확인하는 단계를 포함하는 도입 방법.
  38. 제37항에 있어서, 수용 세포가 동물 세포인 도입 방법.
  39. 제38항에 있어서, 동물 세포가 포유 동물 세포인 도입 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 수용 세포가 다분화능을 갖는 세포인 도입 방법.
  41. 제40항에 있어서, 다분화능을 갖는 세포가 배성 줄기 세포(ES 세포) 또는 간엽계 줄기 세포 혹는 조직 줄기/전구 세포인 도입 방법.
  42. 외래 DNA를 발현하는 세포의 제작 방법으로서,
    (a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계,
    (b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계,
    (c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계,
    (d) 부위 특이적 재조합 효소의 발현하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 외래 DNA를 삽입하는 단계,
    (e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 조제하는 단계,
    (f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계, 및
    (g) 융합한 수용 세포에서 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 제작 방법.
  43. 제42항에 있어서, 수용 세포가 동물 세포인 도입 방법.
  44. 제43항에 있어서, 동물 세포가 포유 동물 세포인 도입 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 수용 세포가 다분화능을 갖는 세포인 도입 방법.
  46. 제40항에 있어서, 다분화능을 갖는 세포가 배성 줄기 세포(ES 세포) 또는 간엽계 줄기 세포 또는 조직 줄기/전구 세포인 도입 방법.
  47. 단백질의 제조 방법으로서,
    (a) 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포를 얻는 단계,
    (b) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 원위 및(또는) 단완 원위를 삭제하는 단계,
    (c) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체의 장완 근위 및(또는) 단완 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계,
    (d) 부위 특이적 재조합 효소의 발현하에서 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체에 단백질을 코드하는 외래 DNA를 삽입하는 단계,
    (e) 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 14번 염색체를 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 조제하는 단계,
    (f) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계,
    (g) 융합된 수용 세포를 배지 중에서 배양하는 단계, 및
    (h) 얻어지는 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  48. 제47항에 있어서, 단백질이, 에리스로포이에틴(erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 본 윌브랜드 인자(von Willebrand factor; vWF), 디스트로핀(dystrophin), 도파민(dopamine) 합성 효소, 인슐린, 인슐린 유사 증식 인자(IGF), 인슐린 유사 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로머라제(telomerase), 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구·마크로퍼지 콜로니 자극 인자, 면역글로불린, 성장 호르몬, 인터루킨(interleukin) 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD 40 리간드, 인터페론, 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제(ornithine transcarbamylase), 푸린뉴클레오티드 포스포릴라제(purine-nucleoside phosphorylase), 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온고스타틴 M(oncostatin M), Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마(stroma) 유래 인자(SDF), 줄기 세포 증식 인자(SCF), 섬유 아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴(angiopoietin), 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈(activin), 트랜스포밍(transforming) 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt)로 구성된 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7879840B2 (en) 2005-08-25 2011-02-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US8022058B2 (en) 2000-05-10 2011-09-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
US7718644B2 (en) 2004-01-22 2010-05-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-arrhythmic and heart failure drugs that target the leak in the ryanodine receptor (RyR2) and uses thereof
US8710045B2 (en) 2004-01-22 2014-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the ryanodine receptors
JP2006101705A (ja) * 2004-09-30 2006-04-20 Olympus Corp 細胞内小核の検出方法
ES2679282T3 (es) 2004-10-22 2018-08-23 Revivicor Inc. Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena
JP4646600B2 (ja) * 2004-11-02 2011-03-09 オリンパス株式会社 間葉系幹細胞の培養方法
JP2008054501A (ja) * 2005-01-26 2008-03-13 Tsuneko Okazaki 線状哺乳類人工染色体及びその構築方法
US9139849B2 (en) 2005-04-08 2015-09-22 The United States of America as Represented by the Government of the Department of Health and Human Services Rapid generation of long synthetic centromeric tandem repeats for mammalian artificial chromosome formation
US7704990B2 (en) 2005-08-25 2010-04-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors
JP4895100B2 (ja) * 2006-05-01 2012-03-14 国立大学法人鳥取大学 内在遺伝子を含まないヒト人工染色体ベクター
BRPI0712398A2 (pt) * 2006-05-17 2012-10-16 Pioneer Hi-Bred International minicromossomo artificial de planta, planta de milho, polinucleotìdeo isolado, construção recombinante, planta transgênica de milho e método para produzir uma planta transgênica de milho compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo centrÈmero funcional
CN101535474B (zh) * 2006-07-07 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 人类人工染色体(hac)载体和包含它的人类细胞药物
WO2008153692A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Microrna expression profiling of cerebrospinal fluid
JPWO2010038904A1 (ja) * 2008-09-30 2012-03-01 国立大学法人鳥取大学 外来性核初期化因子またはそれをコードするｄｎａを含まない人工多能性幹細胞およびその作製方法
EP2348827B1 (en) 2008-10-27 2015-07-01 Revivicor, Inc. Immunocompromised ungulates
EP3372687B1 (en) * 2008-11-28 2022-01-12 Anton Bauer Artificial chromosome vector
LT2483305T (lt) 2009-10-01 2016-11-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Daugiakopis galutinis imunoglobulino filtravimas
AU2011204143B2 (en) 2010-01-06 2014-09-18 National University Corporation Tottori University Mouse artificial chromosome vector
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9783601B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
JP6133544B2 (ja) * 2012-03-16 2017-05-24 康宏 香月 ミクロセル保存方法
JP7089878B2 (ja) * 2015-02-09 2022-06-23 キャリージーンズ バイオエンジニアリング 哺乳動物合成染色体の構築をリアルタイムでモニタリングするための、及び哺乳動物合成染色体を生体工学的に操作するための組成物及び方法
CN106318965B (zh) * 2015-06-26 2019-05-07 深圳华大生命科学研究院 人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物
US11898148B2 (en) 2016-04-12 2024-02-13 Carrygenes Bioengineering, Llc Sequential loadings of multiple delivery vectors using a single selectable marker
EP3442598A4 (en) 2016-04-12 2019-11-20 SynPloid Biotek, LLC METHOD FOR GENERATING SYNTHETIC, BIOSYNTHESIGNAL PATHS EXPRESSING CHROMOSOMES AND USES THEREOF
AU2017377068B2 (en) * 2016-12-15 2022-12-08 CarryGenes Bioengineering Methods of cell renewal
WO2019050875A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Synploid Biotek, Llc LINEAR REPORTER SYNTHESIS CHROMOSOMES AND METHODS OF USE
JP7202573B2 (ja) * 2017-11-02 2023-01-12 国立大学法人鳥取大学 哺乳類人工染色体ベクターを利用するタンパク質の高生産方法
WO2019177163A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用
US20210163896A1 (en) 2018-10-10 2021-06-03 National University Corporation Tottori University Method for producing animal cell containing dna of interest using micronucleate cell fusion method
JP7079946B2 (ja) 2018-10-10 2022-06-03 国立大学法人鳥取大学 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
TWI255853B (en) * 1998-08-21 2006-06-01 Kirin Brewery Method for modifying chromosomes
KR100882029B1 (ko) * 2000-11-17 2009-02-09 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람)면역글로블린의 발현

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020209458A1 (ko) * 2019-04-12 2020-10-15 주식회사 휴맵 인공 재조합 염색체 및 이의 이용

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004031385A1 (ja) 2004-04-15
CN1717483A (zh) 2006-01-04
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AU2003271095B2 (en) 2009-06-11
US20060185025A1 (en) 2006-08-17

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