JP6133544B2 - ミクロセル保存方法 - Google Patents
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本発明の別の目的は、上記の方法で保存されたミクロセルを用いたミクロセル融合法を提供することである。
(1) 細胞凍結保存液中で凍結された動物細胞由来ミクロセル含有液。
(2) 凍結保存液1mlあたりのミクロセル数が、1×104〜1×109個である、上記(1)に記載の動物細胞由来ミクロセル含有液。
(3) 細胞凍結保存液が、動物細胞の凍結保存に使用可能な血清含有若しくは無血清保存液、セルバンカー(商標)、又は、血清及びジメチルスルホキシドを含有する動物細胞用培地である、上記(1)又は(2)に記載の動物細胞由来ミクロセル含有液。
(4) ミクロセルが外来核酸を含むものである、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の動物細胞由来ミクロセル含有液。
(5) 外来核酸が、有用な遺伝子、遺伝子座若しくはcDNAから選択されるDNAを含む、染色体、染色体断片又は人工染色体である、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の動物細胞由来ミクロセル含有液。
(6) 上記(1)〜(5)のいずれかに記載の動物細胞由来ミクロセル含有液を−20℃〜−270℃で凍結保存することを含む、ミクロセル保存方法。
(7) 上記(1)〜(5)のいずれかに記載の凍結保存された動物細胞由来ミクロセル含有液からミクロセルを融解し、及び、無血清動物細胞用培地で洗浄してミクロセルを回収すること、並びに、前記ミクロセルと受容細胞とを融合し、融合した受容細胞を回収することを含む、凍結保存ミクロセルを用いたミクロセル融合方法。
(8) 無血清動物細胞用培地でのミクロセルの洗浄を2回行う、上記(7)に記載の方法。
<ミクロセル及びその調製>
本発明で使用される「ミクロセル」(microcell)は、細胞を微小核化して作製され、少量の細胞質と1個又は少数の染色体を含む微小核(micronucleus)を含有する細胞である。このミクロセルは細胞と融合させることによって、任意の外来核酸、例えば、有用なDNAを含む、単一の染色体、染色体断片又は人工染色体といったメガベースサイズの核酸、を該受容細胞へ導入することを可能にする。このような融合法は、一般に、ミクロセル融合法又は微小核細胞融合法と呼ばれている。
上記の方法で生成し精製されたミクロセルは、従来、用時調製後すぐに融合に用いられてきたが、本発明では凍結され保存され、そして、必要なときに必要な場所で、凍結保存されたミクロセルを融解し、受容細胞との融合に使用することができる。
ミクロセル融合法は、上記のとおり、目的の外来核酸、例えば染色体又は染色体断片などの巨大核酸、を供与細胞から受容細胞へ移入可能にする技術を提供する。この方法は、供与細胞を微小核化する第1工程、微小核化細胞を脱核する第2工程、ミクロセルを単離精製し凍結保存する第3工程、凍結融解(すなわち、解凍)したミクロセルと受容細胞を融合する第4工程、及び、生存する融合した受容細胞(ミクロセルハイブリッドクローン)を回収する第5工程を包含する。第1工程から第3工程までは、上で説明したとおりである。以下では第4工程及び第5工程について説明する。
PEG法による凍結ミクロセル融合法の最適化(保存期間、洗浄回数の最適化)
(凍結微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離)
ドナー(供与)細胞として、マウスA9細胞(DYS-HAC(完全ジストロフィンゲノム配列を有するヒト人工染色体);Yasuhiro Kazuki et al., Molecular Therapy, 2010, 18(2):386-393)を、10%FBSを添加したDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium-high glucose: シグマ)培地中にて、12本の遠心用フラスコで培養し、コンフルエントになった時点で20%FBS、0.05μg/mlコルセミド(微小核誘導剤)を添加したDMEM培地に交換し、さらに48時間培養し、ミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め、37℃で保温したサイトカラシンB(10μg/ml,シグマ)溶液を12本の遠心用フラスコに満たし、34℃、8000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清DMEM培地に懸濁し、8μm,5μm,3μmフィルターにて精製した。精製後、2000rpm、10分間遠心した。
麻疹法による凍結ミクロセル融合法の最適化(凍結保存液の最適化)
(凍結保存液の有効性の検討)
ミクロセルの凍結保存液の有効性の検討として、実施例1に記載の凍結細胞保存液(「凍結保存液」)で凍結保存したミクロセルおよび、市販の凍結細胞保存液「セルバンカー」(十慈フィールド)で保存したミクロセルを用いて、微小核細胞融合を行った。このときドナー細胞として、21HAC2(ヒト21番染色体由来GFP遺伝子配列を有するヒト人工染色体); Kazukiら, Gene Therapy, 2010, 18:384-393)含有麻疹ウイルス由来のエンベロープタンパクであるところの、ヘマグルニチン(H)タンパク及び、膜融合(F)タンパク発現CHO細胞(Motonobu Katoh et al.,BMC Biotechnol, 2010, 10: 37)を用いた。これらの作用により、ミクロセルがHT1080細胞(上記)と融合する為に、PEG1000溶液での処理を必要とせず、ミクロセルとHT1080細胞を混合培養することで21HAC2がHT1080細胞へと導入される。
また、レシピエント細胞として、2×106個のHT1080細胞を直径6cmの細胞培養皿に培養し、微小核細胞融合に用いた。
麻疹法を用いての非凍結保存ミクロセル融合(従来法)と凍結保存ミクロセル融合(本発明)との効率比較
(凍結保存したミクロセルを用いた場合と従来法との21HAC2導入効率の比較)
上記の試験により、凍結保存したミクロセルでの染色体導入が可能であることと、より有効なミクロセル凍結保存液が示されたため、従来法と比較して、凍結保存したミクロセルを用いた21HAC2導入効率の比較を行った。
Claims (7)
- 動物細胞由来ミクロセル及び動物細胞用培地を含有する、血清含有又は無血清の動物細胞凍結保存液であって、前記動物細胞由来ミクロセルが懸濁している、かつ前記動物細胞凍結保存液が凍結されていることを特徴とする、並びに、前記動物細胞凍結保存液が、前記動物細胞由来ミクロセル及び、(1)セルバンカー(登録商標)又は(2)血清及びジメチルスルホキシドを含有する動物細胞用培地からなることを特徴とする上記動物細胞凍結保存液。
- 動物細胞凍結保存液1mlあたりのミクロセル数が、1×104〜1×109個である、請求項1に記載の動物細胞凍結保存液。
- ミクロセルが外来核酸を含むものである、請求項1又は2に記載の動物細胞凍結保存液。
- 外来核酸が、有用な遺伝子、遺伝子座若しくはcDNAからなる群から選択されるDNAを含む、染色体、染色体断片又は人工染色体である、請求項3に記載の動物細胞凍結保存液。
- 動物細胞由来ミクロセルを、動物細胞用培地を含有するかつ前記ミクロセルを含有しない、血清含有又は無血清の動物細胞凍結保存液に懸濁し、前記動物細胞凍結保存液を−20℃〜−270℃で凍結保存することを含む、但し前記動物細胞凍結保存液が、(1)セルバンカー(登録商標)又は(2)血清及びジメチルスルホキシドを含有する動物細胞用培地である、ミクロセル保存方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の、動物細胞由来ミクロセルを含有するかつ凍結された動物細胞凍結保存液から前記ミクロセルを融解し、及び、無血清動物細胞用培地で洗浄してミクロセルを回収すること、並びに、前記ミクロセルと受容細胞とを融合し、融合した受容細胞を回収することを含む、凍結保存ミクロセルを用いたミクロセル融合方法。
- 無血清動物細胞用培地でのミクロセルの洗浄を2回行う、請求項6に記載の方法。
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