JP2000325077A

JP2000325077A - 細胞融合方法

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Publication number: JP2000325077A
Application number: JP2000061944A
Authority: JP
Inventors: Koji Itagaki; 康治板垣; Masao Kishi; 昌生岸; Makoto Takakura; 良高倉; Tomoko Sudo; 朋子須藤; Yoshio Imamura; 美生今村; Morimasa Tanimoto; 守正谷本; Naohiko Kajima; 直彦鹿島
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-07
Publication date: 2000-11-28

Abstract

(57)【要約】【課題】新規な細胞融合方法の提供。【解決手段】細胞をポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）及びジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液で浸
漬処理した後、電気パルス法により除核卵子と融合させ
ることを特徴とする、細胞融合方法。【効果】効率のよい細胞融合方法が提供され、クロー
ン動物あるいはトランスジェニック動物等を作製する方
法として有用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞、特に乳腺由
来細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びジメチ
ルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液で処理した後、電気
パルス法により除核卵子と細胞融合することを特徴とす
る、細胞融合方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】核移植は、ある１個の細胞の核を他の細
胞に移植する操作であり、この操作により核を供与する
細胞（核体）１個を、核を除いた卵子（除核卵子）に細
胞融合させ核移植胚を作製し、これを体内又は体外培養
し、さらに受胚雌の子宮に移植することで産子を得るこ
とができる。この技術を用いることにより、同一遺伝情
報を持つ複数の個体（クローン動物）を得ることが可能
となる。家畜における核移植（Nuclear transplantatio
n)は、1986年、S.M.Willadsen がヒツジにおいて8 -16
細胞期の受精卵を、未受精卵から核を除去した細胞質に
移植し、電気的な細胞融合方法によって初めて成功した
(Nature,320,63-65,1986) 。ウシでは、1987年、R.S.Pr
ather らが同様の方法で成功している(Biology of Repr
oduction 37,859-866,1987) 。以来、核移植については
多数の報告がある。しかしながら、この方法では、受精
卵を核体に用いることから数に限りがある。そこで、よ
り多くのクローン動物を得るため、一度に大量の核体を
供給できる培養細胞を利用する試みがなされてきた。19
93年、M.M.Simsらはウシ胚盤胞期受精卵の内部細胞塊を
27日間培養後、これを用いて核移植を行い、産子を得る
ことに成功した(Proceeding of the National Academy
of Science USA,90,6143-6147,1993) 。さらに1996年に
はK.H.S.Campbellらはヒツジにおいてembryonic disc由
来の培養細胞(継代6-13代) を血清飢餓状態にし、この
細胞を核移植することにより、産子の獲得に成功した(N
ature,380,64-66,1996) 。又、1997年にはI.Wilmutらが
ヒツジにおいて培養した乳腺細胞及び線維芽細胞を血清
飢餓状態にし、同様に産子を獲得した(Nature,385,810-
813,1997) 。しかしながらこの場合、得られた頭数は乳
腺細胞では２７７個の核移植胚から１頭（発生率：0.4
%）、胎児線維芽細胞の場合で１７２個から３頭（発生
率：1.7%）と、非常に少なく、確立した技術とは言えな
い状況であった。その後、多くの研究者が同様の方法で
体細胞クローン動物を作出する試みを行った結果、複数
のクローン産子が得られている（Nature,394,368-373,1
998 、Science,282,2095-2098,1998、Theriogenology,5
1,216,1999）。しかし、そこで使用される体細胞の多く
は線維芽細胞、卵管由来細胞、あるいは卵丘細胞等であ
り、乳腺細胞を用いたクローン動物はI.Wilmutらが作出
したクローンヒツジ『ドリー』以降、得られていない。
この原因として、線維芽細胞等と比較して乳腺細胞では
融合率、発生率が低いこと等が挙げられる(Nature,385,
810-813,1997) 。

【０００３】しかしながら、トランスジェニック動物を
作出する場合、線維芽細胞では、例えばヒト遺伝子を導
入し乳腺で発現させて乳中に目的物質を分泌させる際、
遺伝子の導入は確認できても、導入した遺伝子の発現レ
ベルを確認することはできない。一方、乳腺細胞では、
導入した遺伝子の発現レベルを核移植前に予めin vitro
で確認することができるため、効率的に目的物質の生産
性が高い動物を作出することが可能である。初乳由来の
乳腺細胞を利用する場合、上記した利点の他に、細胞の
採取時に生体を傷つけることがなく、線維芽細胞等の混
入もないため目的とする乳腺細胞のみを確実に得ること
ができるという点がある。実際に、生体を傷つけること
により採取する方法で細胞を提供した動物が死亡した例
があり、乳腺細胞、とりわけ生体を傷つけずに採取でき
る乳由来の乳腺細胞を用いたクローン動物作出法の確立
は不可欠であり、その過程において、乳腺細胞の分離、
培養の効率化、移植した乳腺細胞の融合率、発生率の向
上が重要である。

【０００４】核移植における細胞融合方法としては、電
気パルス法が一般的に広く用いられている。その際、電
気パルスをかける時点で核を供与する細胞が、それを受
容する卵子と接していることが融合するための条件とな
る。そこで、接着性を高めるためにフィトヘマグルチニ
ン（ＰＨＡ）等が用いられている（Biology of Reprodu
ction,50,935-939,1994 ）。しかしながら、乳腺細胞に
おいてはＰＨＡ等を利用しても、融合率の向上は認めら
れない。この理由として、線維芽細胞等と比べてトリプ
シン処理によって単離後、再び培養容器の底面等に接着
するまでに要する時間が長いこと、あるいは細胞膜の形
状の違い等が挙げられる。この原因は、接着するために
必要となるコラーゲン等の細胞外マトリックスの種類や
量、分泌されるまでの時間等の違いや細胞膜を構成する
成分の質的、量的な違いに起因することが考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
状況に鑑み鋭意研究を重ねた結果、乳から分離した乳腺
細胞等の細胞を培養後、除核した体外培養由来の除核卵
子への核移植に先立って、ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液に浸
漬処理することによって、融合率を飛躍的に向上できる
ことを見出した。即ち本発明は、細胞をポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）及びジメチルスルフォキシド（ＤＭ
ＳＯ）で処理した後、電気パルス法により融合させるこ
とを特徴とする、細胞融合方法を提供することを課題と
する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、乳腺細胞等の
細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びジメチル
スルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液で処理した後、電気パ
ルス法により融合させることを特徴とする、細胞融合方
法に関する。詳しくは、哺乳動物の乳から分離した乳腺
由来細胞等を、必要に応じて血清飢餓培養した後、ＰＥ
Ｇ及びＤＭＳＯ溶液に浸漬し、洗浄後、除核卵子の囲卵
腔内に１個ずつ注入し、電気パルス法によって細胞融合
することを特徴とする細胞融合方法に関する。又、ＰＥ
Ｇを１０〜８０％、ＤＭＳＯを１〜２０％濃度で使用す
ることを特徴とする細胞融合方法に関する。本発明によ
り、効率のよい細胞融合方法が提供され、クローン動物
あるいはトランスジェニック動物等を作製する方法とし
て有用である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明において対象となる細胞
は、動物細胞であれば特に限定されないが、好ましくは
乳由来細胞、特に好ましくは乳腺上皮細胞等の乳腺由来
細胞を用いる。又、動物種、使用する乳についても限定
されないが、好ましくは分娩後７日以内、特に好ましく
は１日以内に採取したウシの初乳が挙げられる。例え
ば、ウシの初乳から分離した乳腺上皮細胞を常法に従い
培養し、必要に応じて継代培養を行う。細胞の継代数も
特に限定されるものではない。移植に使用する細胞は、
通常コンフルエントに至るまで培養する場合が多いが、
不可欠な要件ではない。又、必要に応じて、コンフルエ
ントに至った細胞を５％以下、好ましくは１％のウシ胎
児血清を含む培地、特にＤＭＥＭを用いて５日間以上、
特に好ましくは６日間培養する（血清飢餓培養）。次い
でトリプシン処理により細胞を培養容器から剥がし単離
する。このようにして単離した細胞をＰＥＧ及びＤＭＳ
Ｏ溶液で浸漬処理する。又、通常の培養、すなわち血清
を添加した培地を用いた培養、あるいは血清飢餓培養後
に細胞を単離し、これらを一旦凍結保存後に融解し、耐
凍剤を除去してからＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液で浸漬処理
しても良い。

【０００８】使用するＰＥＧの分子量は特に限定されな
いが、２００〜８，０００程度の分子量のものが好まし
い。ＰＥＧの濃度は特に限定されないが、好ましくは１
０〜８０％、特に好ましくは４０〜６０％であり、リン
酸緩衝液等を用いて溶液を調製すればよい。又、ＤＭＳ
Ｏの濃度も特に限定されないが、好ましくは１〜２０％
である。又、ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液のｐＨについても
特に限定されないが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０に
調整する。浸漬処理時間についても特に限定されない
が、好ましくは６０分間程度浸漬処理を行う。浸漬処理
の後、使用したＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液の１０倍量以上
の培養液（ＤＭＥＭ等）で希釈し、遠心分離によって細
胞を分離する。得られた細胞を、雌ウシ屠体卵巣から採
取し、体外にて成熟培養後、１０〜３０時間、好ましく
は１９〜２０時間経過した未受精卵から核染色体物質を
除去して調製した除核卵子の囲卵腔内に注入用ピペット
にて挿入後、細胞融合液中で保持用ピペットにて誘導
し、微小（１００〜１５０μｍ）な電極を用いて１０〜
５０V/mm、１０〜５０マイクロ秒、１回以上の電気パル
ス、好ましくは２４V/mm、２０マイクロ秒、１回の電気
パルスにより、挿入した細胞と除核卵子を融合する。こ
の方法により、細胞の融合率が飛躍的に高まり、融合後
さらに化学合成培地、好ましくはウシ血清あるいはウシ
血清アルブミンを含む修正合成卵管液培地で０〜１５日
間、好ましくは７日間in vitroで培養することにより、
胚盤胞まで効率よく発生させることができる。

【０００９】

【実施例】以下の実施例をもって、本発明をより詳細に
説明する。

【００１０】

【実施例１】初乳からの乳腺上皮細胞の分離及び培養分娩後７日以内、好ましくは１日以内に採取した初乳５
００mlを滅菌したｐＨ７．０のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
で２倍に希釈後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ以下、５
分間）した。このＰＢＳによる洗浄操作を３回以上繰り
返し、得られた沈殿を１５％濃度のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）と通常の１０倍濃度の抗生物質（ペニシリン（明治
製菓社）２，５００ｕｎｉｔｓ／ml、ゲンタマイシン
（シグマ社）５００μg ／ml、ストレプトマイシン（明
治製菓社）１０mg／ml、ポリミキシンＢ（シグマ社）５
００ｕｎｉｔｓ／ml、ファンギゾン（ギブコBRL社）２
５μg／ml）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ、ギブコBRL社）に懸濁した。この懸濁液を初代培
養用フラスコ（プライマリア、ファルコン社、２５c
m²）に入れて２４〜４８時間、３７℃、５％ＣＯ₂存在
下で培養した。次いで通常濃度の抗生物質と１０％濃度
のＦＣＳを含むＤＭＥＭに交換して、さらに培養を続け
た。その結果、７〜１４日間の培養で乳腺上皮細胞のコ
ロニーが観察され、以後、活発な増殖が認められた。コ
ンフルエントに至るまで培養後、継代培養を繰り返し、
核移植に使用するもの以外は、常法に従って液体窒素中
で凍結保存した。

【００１１】

【実施例２】細胞の血清飢餓培養実施例１で得られた乳腺上皮細胞を、コンフルエント状
態まで増殖培地（１０％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭ）
で培養した。培養後、培地を捨て、ＰＢＳで細胞を３回
洗浄した後、血清制限培地でさらに培養した。血清制限
培地には、１％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭを用い、６
日間培養した。

【００１２】

【実施例３】除核卵子の調製ウシ屠体卵巣から小卵胞を吸引して、卵子卵丘細胞複合
体を採取し、１０％濃度のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、
０．０２ＡＵ／ml濃度の卵胞刺激ホルモン（デンカ製薬
社）、１μg ／ml濃度のエストラジオール１７β（シグ
マ社）、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム（ナカライテ
スク社）、及び１％抗菌・抗真菌剤（ペニシリン、スト
レプトマイシン、アンフォテリシンＢ）を含むｍ−１９
９中で、３９℃、５％ＣＯ₂、９５％空気及び飽和湿度
下で１９〜２０時間成熟培養した。次いで、卵子の卵丘
細胞を、１mg／ml濃度のヒアルロニダーゼ（シグマ社）
を含み１０％濃度のＦＣＳを含むリン酸緩衝液（ＦＣＳ
−ＰＢＳ）中で、ボルテックスミキサーで５分間攪拌す
ることにより、あるいはピペッティング操作を行うこと
により除去した。卵子を５μg ／mlサイトカラシンＢ
（シグマ社）を含むＦＣＳ−ＰＢＳ中で、顕微操作によ
り第１極体とともに周辺の細胞質を一部吸引し、５μg
／ml濃度のヘキスト３３３４２（シグマ社）に３分間浸
漬後、蛍光顕微鏡下で数秒間観察し、染色体の見られな
かった卵子を除核卵子とした。

【００１３】

【実施例４】細胞融合条件の検討ＰＥＧ溶液への浸漬処理による除核卵子との細胞融合条
件の検討を行った。即ち、実施例２で得られた乳腺上皮
細胞をＰＢＳで３回洗浄後、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂・
６Ｈ₂Ｏ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含まないハンクス平
衡塩類緩衝液に溶解した０．２５％濃度のトリプシンを
含む１ｍＭＥＤＴＡ・４Ｎａ液（ギブコBRL社）を用
いて、３７℃、１０分間処理し、単離した細胞を、ＰＢ
Ｓで分子量１，４５０のＰＥＧ（シグマ社）を５０％濃
度に溶解し、さらに５％濃度となるようにＤＭＳＯ（シ
グマ社）を添加した後、ｐＨを８．０に調整したＰＥＧ
及びＤＭＳＯ溶液で、１、５、１０、１５、３０分間そ
れぞれ浸漬処理後、１％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭを
ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液の１０倍量添加し、ピペッティ
ング操作にて攪拌後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ以
下、５分間）した。このようにして得られた細胞を、Ｐ
ＨＡを含むｍ−１９９中で顕微操作により１個ずつ実施
例３の方法で除核した除核卵子の囲卵腔内に注入し、細
胞質に接着して核移植胚を作製した。細胞融合は、顕微
操作が可能な微小電極と細胞融合装置を用いて、チンマ
ーマン融合液中で、２４Ｖ／ｍｍの直流電流を２０マイ
クロ秒で１回の電気パルスにより行った。結果を表１に
示す。この結果、ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液への浸漬処理
を１〜１５分間、特に５〜１０分間行うことにより、細
胞の融合率を高めることができることが明らかとなっ
た。

【００１４】

【表１】

【００１５】

【実施例５】ＰＥＧの分子量の違いによる融合率への影
響実施例４と同様にして調製した乳腺上皮細胞を、ＰＢＳ
に５０％濃度となるように溶解し、ｐＨを８．０に調整
した分子量２００、４００、１，４５０、８，０００、
２０，０００のＰＥＧ、及び５％濃度のＤＭＳＯを含む
ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液それぞれに５分間浸漬処理後、
１％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭをＰＥＧ及びＤＭＳＯ
溶液の１０倍量添加し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ以
下、５分間）した。このようにして得られた細胞を実施
例４で示した方法で除核卵子の囲卵腔内に注入し、細胞
融合した。結果を表２に示す。この結果、ＰＥＧの分子
量は、好ましくは２００〜８，０００のものを使用する
ことにより、融合率を高めることができることが明らか
となった。

【００１６】

【表２】

【００１７】

【実施例６】ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液のｐＨの違いによ
る融合率への影響実施例４と同様にして調製した乳腺上皮細胞を、ＰＢＳ
で５０％濃度となるように溶解し、ｐＨを６．０、７．
０、８．０、９．０に調整した分子量１，４５０のＰＥ
Ｇ及び１０％濃度のＤＭＳＯを含むＰＥＧ及びＤＭＳＯ
溶液それぞれに５分間浸漬処理後、１％濃度のＦＣＳを
含むＤＭＥＭをＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液の１０倍量添加
し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ以下、５分間）した。
このようにして得られた細胞を実施例４で示した方法で
除核卵子の囲卵腔内に注入し、細胞融合した。結果を表
３に示す。この結果、ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液のｐＨは
６．０〜９．０、好ましくは８．０に調整したものを使
用することにより、融合率を高めることができることが
明らかとなった。

【００１８】

【表３】

【００１９】

【実施例７】凍結後融解した細胞を用いた場合の融合率
への影響実施例２で得られた血清飢餓培養後の乳腺上皮細胞を、
実施例４の方法で単離後、常法に従って１０％濃度のＤ
ＭＳＯ（シグマ社）及び３０％濃度の牛胎児血清(FCS,
JRH バイオサイエンス社)を含むＤＭＥＭ(ギブコBRL社)
1.5 〜2.0 mlに再浮遊させ、−９０℃以下の冷凍庫で
一晩冷却後、液体窒素中で凍結保存した。凍結保存細胞
を３７℃の温湯中で融解後、ＤＭＥＭ 10ml で希釈・遠
心洗浄した。上清除去後の細胞沈殿に、ＰＢＳで５０％
となるように溶解し、pH８．０に調整した分子量１，４
５０のＰＥＧ及び１０％濃度のＤＭＳＯを含むＰＥＧ及
びＤＭＳＯ溶液１mlに攪拌にて再浮遊させ、５分間浸漬
処理後、１％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭをＰＥＧ及び
ＤＭＳＯ溶液の１０倍量添加し、遠心分離（１，０００
ｒｐｍ以下、５分間）した。このようにして得られた細
胞を、実施例４で示した方法で除核卵子の囲卵腔内に注
入し、細胞融合した。ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液で浸漬処
理しなかった乳腺上皮細胞を対照とし、融合率を比較し
た。結果を表４に示す。この結果、ＰＥＧ及びＤＭＳＯ
溶液で処理することにより、血清飢餓培養後、凍結保存
した細胞においても、融合率を高めることができること
が明らかとなった。

【００２０】

【表４】

【００２１】

【実施例８】ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液の発生率に及ぼす
影響実施例４と同様にして調製した乳腺上皮細胞を、ＰＢＳ
で５０％濃度となるように溶解し、ｐＨ８．０に調整し
た分子量１，４５０のＰＥＧ及び１０％濃度のＤＭＳＯ
を含むＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液に５分間浸漬処理後、１
％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭをＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶
液の１０倍量添加し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ以
下、５分間）した。このようにして得られた細胞を実施
例４で示した方法で除核卵子の囲卵腔内に注入し、細胞
融合した。次いで、２０％濃度のＦＣＳを含むＨＥＰＥ
Ｓ緩衝タイロード培地（ＦＣＳ−ＴＬ−ＨＥＰＥＳ）に
１０μg ／ml濃度のシクロヘキシミド（ＣＨＸ）及び５
μg ／ml濃度のサイトカラシンＢを含有させた培地中に
１時間浸漬し、さらに１０μg ／ml濃度のＣＨＸを含む
ＦＣＳ−ＴＬ−ＨＥＰＥＳに４時間浸漬することにより
活性化した。活性化した胚を１０％濃度のＦＣＳ、ある
いは３mg／ml濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む修正合成卵管液培地中で、３９℃、５％ＣＯ₂、９０
％Ｎ₂及び飽和湿度下で７〜８日間培養した。結果を表
５に示す。この結果、ＰＥＧ及びＤＭＳＯ溶液で処理す
ることにより、胚盤胞までの発生率を高めることができ
ることが明らかとなった。

【００２２】

【表５】

【００２３】

【発明の効果】本発明は、細胞をポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）及びジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）
溶液で浸漬処理した後、電気パルス法により細胞融合さ
せることを特徴とする、細胞融合方法に関する。本発明
により、効率のよい細胞融合方法が提供され、クローン
動物あるいはトランスジェニック動物等を作製する方法
として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者今村美生北海道札幌市中央区北４条西13丁目１−27 −402 (72)発明者谷本守正埼玉県川越市笠幡107−28 (72)発明者鹿島直彦北海道千歳市柏陽４丁目９−８Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA10 BA80 DA02 GA03 GA08 GA10 4B033 NG05 NH01 NJ01 4B065 AA90X AA90Y AB04 AC12 BA08 BB31 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞をポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）及びジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液で処
理した後、電気パルス法により除核卵子と細胞融合する
ことを特徴とする、細胞融合方法。
【請求項２】細胞が乳腺由来細胞である、請求項１記
載の方法。
【請求項３】細胞が血清飢餓培養された細胞である、
請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】細胞が血清飢餓培養された後に凍結され
た細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】ＰＥＧの濃度が１０〜８０％である、請
求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】ＤＭＳＯの濃度が１〜２０％である、請
求項１〜５のいずれかに記載の方法。