KR100801764B1 - 세포의 조건부 불멸화 - Google Patents

Abstract

재조합 또는 유전적으로 처리된 포유동물 세포는 조건부 유도성 종양 유전자와 텔로머라제 복합체의 서브-유니트를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 재조합 세포들은 손실 또는 손상된 세포들을 대치하기 위한 치료법에 유용하다.

Description

세포의 조건부 불멸화{CONDITIONAL IMMORTALISATION OF CELL}

본 발명은 치료적 적용을 위한 포유동물 세포의 불멸화에 관한 것이다.

조직과 기관의 손상을 치료하기 위한 이식법의 중요성에 대한 인식과 이해가 증가하고 있다. 기관이식이 널리 실행되고 있는 반면, 개개의 세포 이식을 기초로하는 치료는 비교적 여전히 의학개발의 초기단계에 있다.

예를 들면, 알맞는 세포를 손상된 뇌에 이식시킴으로써 손상에 의한 어느 감각, 운동, 행동 또는 심리적 결핍을 개선 또는 정정할 수 있다는 인식이 자라고 있다.

세포-기준 치료법을 유용하게 하기 위해서는 이식용 세포들을 충분히 얻을 수 있어야 한다. 이것을 확실히 하는 하나의 방법은 세포 분열과 성장이 반복되는 것을 허용하는 조건하에서 미분화된 세포들을 배양하는 것이다. 미분화된 세포를 사용하는 어려움 중 하나는, 이식 부위에서의 제어되지 않는 성장을 방지하기 위하여, 환자에게 이식하기 전이나 이식 도중 통제되지 않는 세포 분열이 정지되어야 한다는 것이다.

이식에 알맞는 세포들을 제공하기 위한 여러가지 다양한 기술들이 개발되고 있다. 신경이식에 관하여, 하나의 접근법은 세포 분열이 일어나는 것을 허용하는 배양 조건하에서 미분화 태아 세포를 유지하고, 그 결과 이식 전에 인비트로에서 분화를 유도하는 것이다.

레오날드 및 와이즈(Reynolds and Weiss, Science 1992;255:1707)는 성인 마우스 뇌 세포의 인비트로 증식을 유도하기 위한 표피성장인자(EGF)의 사용을 기재하고 있다. 알맞는 조건하에서, 세포들이 성상세포들과 뉴런들로 분화되도록 유도될 수 있다고 생각되었다.

국제 특허 출원 WO-A-94/16059호는 적어도 하나의 영양 인자가 첨부된 무혈청 배지에서 세포를 배양함에 의해 인비트로에서 일차 뉴런성 세포배양을 유지하는 기술을 기재하고 있다.

국제 특허 출원 WO-A-97/10329호는 조건부 불멸화된 세포계를 사용하는, 선택적 기술을 기재하고 있다. 이 세포계는, 허용 조건하에서 신경상피 줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 불멸화 온도-민감 종양유전자로 구성된다. 이식 후, 종양유전자는 체온(37 ℃) 이상의 온도에 의해 끊어지며 세포들은 손상을 수리하기 위해 요구되는 세포형으로 분화된다. 종양유전자를 사용하는 장점은 세포가 이식할 때까지 미분화 상태로 유지된다는 것으로, 이식 시점에서 세포는 특정 손상에 대한 반응으로서 손상 또는 손실된 세포의 표현형으로 분화된다. US 5688692호는 또한 비-DNA 결합, 온도-민감 T 항원을 발현하는 세포들을 기재한다.

그러나, 비록 종양유전자를 발현하는 인간 세포들은 연장된 수명을 가질 수 있어도, 이들도 여전히 분열을 멈추고 결과적으로 위기(crisis, 세포괴사)를 겪게 된다.

인간 텔로머라제의 촉매적 서브-유니트의 외인성 복사(copy)의 혼합에 의해 텔로머라제 활성을 재구성함으로써 인간 세포들이 불멸화될 수 있다는 것이 제안되어졌다(Bodnar et al., Science, 1998; 279:249-252). 텔로머라제는 염색체 말단에서 발견되는 텔로머들을 유지하는 작용을 하며, 세포 증식동안 텔로머들의 점진적 단화(shortening)는 노화를 야기하며, 그러므로 재구성 텔로머라제는 세포들을 불멸화시킨다고 믿어진다. 인간 텔로머라제는 여러 다양한 세포형의 불멸화에 사용되어 오고 있다.

카운터 등(Counter et al., PNAS (USA), 1998; 95(25): 4723-14728))은 또한 텔로머라제 촉매적 서브-유니트(hTERT)의 전위발현이 세포 불멸화로 위기를 넘어 노화 세포가 증식되도록 배치되는 것을 허용함을 기재한다. 연구된 세포들은 SV40 T-항원을 발현하는 종양유전자를 사용하여 변형되었다. 그러나, 발명자들은 hTERT 발현 자체가 세포 불멸화에 충분할 것이며, hTERT의 활성이 종양 진행에 있어서 치명적인 단계일 수 있음을 결론 지었다. 그러므로, 이 문헌의 일반적인 내용은 hTERT 변형 세포들이 불멸이라는 것이다. 이것은 상기 세포들이 이식 치료법에 사용하기에 적당하지 않다는 것을 의미한다.

그러므로, 상기 기재된 많은 기술들이 유용한 반면, 이식 전에는 불멸성을 유지하지만, 이식시에는 불멸성을 손실하는 세포를 얻는 방법이 여전히 요구된다.

본 발명은, 조건부-유도성 종양유전자로 형질전환된 세포와 적어도 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트가 허용 조건하에서는 불멸이지만, 비-허용 조건하에서는 불멸성이 손실된다는 인식에 기초하고 있다.

본 발명의 제 1 면에 따르면, 재조합 또는 유전공학적으로 처리된 포유동물 세포는 조건부-유도가능 또는 온도-민감 종양유전자, 및 적어도 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 제 2 면에 따르면, 재조합 폴리뉴클레오티드 구조물은 적어도 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트를 암호화하는 유전자, 및 조건부-유도가능 또는 온도-민감 종양유전자로 이루어진다.

본 발명의 제 3 면에 따르면, 포유동물 세포를 불멸화하는 방법은, 증식된 포유동물 세포 내에서, 조건부-유도된 종양유전자와 텔로머라제 유전자의 촉매적 서브-유니트를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 혼합하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 제 4 면에 따르면, 본 발명의 세포는 치료, 특히 세포 손실 또는 손상과 관련된 질병의 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들면, 신경상피 줄기세포들은 뇌 손상과 관련된 질병, 예를 들면 알츠하이머의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 세포들은 높은 수준의 안정성을 유지하며 비-허용 온도에서 불멸이 아님이 발견되었다.

세포들은 선행 기술을 기초로 텔로머라제 활성의 재구성 때문에 불멸로 남아있다고 예상되므로, 상기 발견은 놀랍고 중요하다. 그러나, 비록 텔로머라제를 암호화하는 유전자가 구성성분을 이루지만, 텔로머라제는 불멸성을 유지하는 작용은 하지 않는것 같다. 조건부 제한의 유지와 증가된 안정성은 본 발명의 세포들을 이식용 세포계를 유도하도록 순차적으로 계대배양되는데 알맞게 한다.

도 1은 hTERT와 SV40 라지 T-항원을 암호화하는 온도-민감 종양유전자 모두를 함유하는 폴리뉴클레오티드 구조물의 개략도이다.

도 2는 도 1과 다른 순서로 hTERT와 종양유전자를 갖는 대체 구조물의 개략도이다.

본 발명은 이식치료법에 알맞고 최대 이식 시간까지 불멸인 세포들을 제조하는 방법을 기재한다.

세포들은 조건부-유도 가능 종양유전자의 존재를 필요로 한다. "조건부-유도가능"이라는 용어는 종양유전자와 관련하여 사용되며, 그의 발현은 특정 조건하에서 조절될 수 있다. 종양유전자는 소위 허용가능 조건이 적용되면 발현된다. 예를 들면, 몇몇 종양유전자들은 온도-민감성이며 그들 주변 온도가 오직 특정치 이하일 때만 발현된다. 본 발명의 한 구현예에서, 사용되는 종양유전자는 비-DNA 결합, 온도-민감, SV 40 라지 T-항원 유전자(U19tsA58)의 돌연변이체이다. 적절한 대체물들이 또한 알려져 있으며, 이들은 폴리오마 T-항원의 종양 유전자를 포함한다.

또한, 세포들은 적어도 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 필요로 한다. 본 명세서에서 "외인성"이라는 용어는, 천연적으로 발생하는 외인성 폴리뉴클레오티드와 구별하여, 정상적인 의미로서 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트는 역전사 효소와 같은 작용을 하는 효소로서, 당업계에 공지되어 있다. 인간 서브-유니트는 GB-A-2317891에 기재되어 있다.

종양유전자와 텔로머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 DNA 또는 세포를 형질도입/감염시키기 위한 레트로바이러스성 벡터 또는 구조물에 포함될 수 있다. 두 성분들은 하나의 벡터로 병합되거나 또는 각각 독립된 벡터에 포함될 수 있다. 본 발명의 벡터들 또는 구조물들은 DNA의 전사를 개시하는 알맞는 프로모터 영역과 형질도입/감염을 겪은 이들 세포들을 확인하는데 사용되는 선택적 마커를 추가로 포함할 수 있다.

발현의 조절은 당업자들에게 알려진 방법으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 조절은 긴 터미날 반복(LTR) 프로모터를 사용하여 수행될 수 있다. 대체할 수 있는 프로모터들은 당업자들에게 명백할 것이다. 예를 들면, 조절은 시토메갈로바이러스 (CMV)프로모터를 사용하여 수행될 수 있다. CMV 프로모터는 매우 강한 프로모터이며, 세포들이 신경세포, 예를 들면, 신경상피 줄기세포일 때 바람직하다.

알맞는 구조물을 세포에 도입하는 방법이 당업자들에게 알려져 있다.

어떠한 포유동물 세포도 본 발명에 사용될 수 있다.

예를 들면, 세포는 신경상피 세포일 수 있고, 다리, 심장 및 기타 기관의 맥관재생에 사용될 수 있다. 바람직하게, 세포는 인간 체세포, 예를 들면 인간 신경상피 줄기세포이며, 이것은 특정 세포형으로 분화될 수 있다. 특히 바람직한 세포는 세포 손실 또는 손상을 치료하고 행동 또는 심리적 결핍을 정정하기 위한 신경이식에 사용되는 인간 신경상피 줄기세포일 수 있다. 선택적으로, 세포는 분화된 세포이며, 예를 들면 랑게르한스섬의 β세포일 수 있다. 추가의 세포가 포함될 수 있으나, 내분비선, 망막세포, 시상세포, 간세포, 조골세포 및 파골세포, 근원세포 및 케라티노사이트로부터 얻을 수 있는 세포들로 한정되는 것은 아니다.

바람직하게, 종양유전자와 텔로머라제는 초기 배양기 동안, 보통 초기 10 세포 분열내에 세포에 혼입된다. 종양 유전자와 텔로머라제의 혼입 순서는, 비록 텔로머라제가 우선 도입되는 것이 바람직하지만, 본 발명의 성공에 결정적이지는 않다. 이것은 놀랍게도 텔로머라제를 먼저 도입하는 것이 디포이드(dipoid) 세포계를 얻는데 더 나은 보장을 제공한다는 것을 발견하였기 때문이다.

형질도입 또는 감염된 세포들은 당업자들에게 알려진 조건하에서 배양될 수 있다. 세포들은 스트레스가 없는 조건하에서 배양되는 것이 바람직하다. 당업자는 종래의 배양기술을 기초로 각각 특정 세포형에 알맞는 조건을 판단할 수 있을 것이다.

본 발명은 도면을 참조로하여 하기의 실시예에서 더욱 상세히 설명될 것이다. 실시예들은 적당한 인간 세포를 온도-민감 종양유전자와 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트로 형질도입함에 의해, 세포 배양이 적당한 배지에서 계대배양될 때 안정성을 유지하는 것이 가능함을 나타낸다.

실시예 1

1. 포유동물 엽간 섬유아세포(HNF)와 포유동물 미세혈관 내피(MMVE)세포의 분리:

포유동물 엽간 섬유아세포(HNF)와 포유동물 미세혈관 내피(MMVE)세포의 배양물을, 동의하에 성형 수술(유방축소술)중인 환자에게서 얻은 정상 유방조직으로 제 조하였다. 엽간섬유아세포의 배양물을 Atherton 등의 J. Cell Sci., 107:2931-2939에 기재된 바와 같이 제조하였고, 10% 태아 송아지 혈청과 항생물질들(페니실린/스트렙토마이신)이 첨가된 둘베코 변형 이이글 배지에서 유지시켰다. 미세혈관의 내피세포를 Drake & Lock, Human Reprod., 1992; 6:1156-1159에 기재된 바에 따라, 트롬보모듈린에 대한 QBEND-40 마우스 모노크로날 항체를 사용하여, 일차 배양의 면역자성분류로 분리하였다. 내피 배양을 실시하고 EGM-2 배지(Biowhittaker)에서 유지시켰다.

2. 노화시까지의 세포의 인비트로 배양

대조로서, 노화점을 결정하기 위해 세포 제제를 배양하였다. 세포들을 EGM-2에서 배양하였을 때, 10 ~ 16 개체군의 배양수명이 배가되었음을 발견하였다. 세포질에서 과립형 입자들의 축적물과 별도로, 다른 노화 세포들은 유사핵분열이 전혀 없다는 점을 제외하고, 그들의 초기-단계 복사물과 닮았다.

3. tsA58-U19의 형질도입 및 위기(crisis)까지 연장된 성장

다양한 개개의 공여균의 세포 제제물들을, 개체군 배가 6-9 사이에서 계속 증식하는 동안, Neo-r 유전자를 함유하는 pZIP 벡터 중에서 SV-40 T-항원 유전자의 tsA58-U19(Almazan and MaKay, Brain Res., 1992;579(s): 234-245) 배가 재조합 돌연변이체로 형질도입하였다. 형질도입은 스탬프스 등(Stamps et al., Int. J. Cancer, 1994; 57(6):865-874)에 기재된 바와 같이, 헬퍼 바이러스-프리 양종향성 레트로바이러스성 패키징 시스템 (amphotropic retroviral packaging system: PA317, 클론 8)을 사용하여 실시하였다. 바이러스 흡수(uptake)를 향상시키기 위해 보조약으로서 폴리브렌 8 ㎍/㎖ 를 사용하였다.

형질도입 주기는 제네테신(geneticin) 0.25 ㎎/㎖로 선택 후 10 ~ 25 % 로 변하였다. tsA58에 대한 허용 온도(33.5 ℃)로 전달 후, 이들 배양물들을 1:4의 분 비에서 33 ~ 56의 개체군 배가를 위해 추가 계대접종 하였다. 이 시간 동안 모든 세포들은 36.5 ℃ 이상에서 거의 또는 전혀 성장없이 온도-민감성이 강하게 남아있었다. 그러나 모든 경우, 성장은 비정상 유사분열 및 병리를 나타내는 크기와 핵 이종 혼성을 포함한 비정상 세포 형태의 출현과 함께 결국 멈추었다. 총 10⁸ 이상의 세포를 '동시' 불멸화의 단일예의 관찰없이, 위기점까지 계대접종하였다. 포유동물 상피세포와 대조로, 이것은 위기를 유지하는 5 x 10⁶ 세포 중 약 1의 빈도수로 반복적으로 불멸화한다.

4. h-TERT의 형질도입 및 조건부 성장을 유지하는 순차적 불멸화

ts T 항원 시스템(MMVE-2)으로 형질도입된 하나의 공여균으로부터의 초기-계대 세포를 추가로 pBabe 벡터(Morgenstern and Land, Nucleic Acids Research, 1990: 18:3587-3596)중의 인간 텔로머라제 유전자의 촉매적 서브-유니트의 전장 cDNA 복사로, 인간 양종향성 계대 시스템(TE-FLY)을 사용하여, 히그로마이신 B-내성 유전자와 함께 형질도입하였다. 표적 인간세포계(EJ 부낭 암종 세포)에 히그로마이신 내성의 전이를 기초로 한 최고의 역가에 대해, 미리 선택된 일련의 4개의 클론된 패키징계를 사용하였다. 각각은, 폴리브렌 8 ㎍/㎖의 존재하에 MMVE-2 ts T 세포를 복제시 형질전환하는데 사용되었다. 25 ㎍/㎖의 히그로마이신 B로의 선택 후, 성공적인 형질도입이 관찰되었다.

놀랍게도, 형질도입된 세포들이 노화를 극복하는 것으로 나타났고, 어떠한 명백한 위기 또는 증식률의 변화없이, 40주 동안 33.5 ℃에서 증식을 계속하는 것으로 나타났다. 세포들은 일정 속도로 >100 개체군 배가되고, 기능적으로 불멸화되는 것으로 나타난다.

33.5, 36.5 및 39.5 ℃에서 복제 배양에 의한 온도 민감성에 대해 시험하였을 때, hTERT 형질도입된 MMVE-2 tsT세포들은, 놀랍게도 초기 계배 tsT 단독 세포 만큼 민감하였다. 예상과 반대로, 36.5 ℃에서 거의 성장하지 않고 39.5 ℃에서는 성장이 없으며, 즉 세포들은 조건부 불멸화되었다. 모든 배양은 b-FGF, VEGF, IGF-2 및 헤파린 뿐만 아니라 2% FCS를 포함한, 다양한 내피-특이 성장 인자들을 함유하는, 따라서 서브-최적 또는 '스트레스' 성장 조건하의 세포시험을 피할 수 있는 EGM-2 매질에서 실시하였다.

온도-유발 성장 억제의 비가역 정도를 결정하기 위해, 39.5 ℃에서 다양한 기간 동안 성장억제 후, 최적 조건하에서(33.5 ℃, 산소 5%) 콜로니 형성 효율(CE)을 결정하는 클론유전성조사를 사용하여 섬유아세포 배양을 분석하였다. 비-허용 온도에서 시간에 비례하여, 대부분의 배양에서 CE에서 실제적인 감소가 일어났다. HMF 배양중 하나에서는, 예를 들면, 39.5 ℃에서 14일 후 CE는 대부분의 콜로니들이 작아지고 퇴화되면서 대조치의 <5% 까지 떨어졌다. 이 결과는 형질도입 세포들의 진행성 비가역성을 설명하며 이것은 열충격의 비-특이 효과보다는 T-항원의 열 불활성 때문으로 보인다.

또한, 세포들이 T항원의 불활성화 후 생화학적 노화를 겪는가를 확인하기 위해, 노화-활성화 산 β-갈락토시다제에 대해 배양물을 착색함으로써 세포들을 시험하였다. 39.5 ℃에서 4 ~ 8일 후, 모든 섬유아세포 배양물은 양성 세포 수의 변화(1 ~ 10%)를 나타낸 반면, 33.5 ℃에서 해당 배양물에서는 양성 세포들이 검출되지 않았다. 이것은 세포의 53%가 양성인 HMF 섬유아세포 T-항원의 병리 배양물과 대조된다. 이것은 불멸화된 세포는 성장을 유지하기 위해 T-항원에 의존하며, T-항원의 비활성화는 세포 성장의 비가역 정지를 일으키며, 노화가 시작됨을 설명한다.

또한, 레트로바이러스 유전자 형질도입의 순서 및 시간이 생성 세포의 염색체의 상태에 영향을 미치는가를 결정하기 위해 세포 배양액을 핵형화하였다. 염색체(46)의 이배수 또는 거의 이배수 형식수가 MMVE와 HMF 세포 모두에서 관찰되었고; 우선 hTERT를 갖는 초기상(즉, 초기 10 세포분열 이내)동안 양쪽 유전자를 도입함으로써 유도 되었다. 초기에 종양 유전자를 갖는 초기기 동안 양쪽 유전자들이 도입될 때, 세포들은 거의 이배수 및 거의 사배수 양식을 갖는 이형식 핵형을 갖는 것으로 나타났다. 이것은 놀라운 발견이며 이배수 세포들을 초기 텔로머라제의 촉매적 서부유니트를 세포에 삽입하는 것을 선택함으로써 더욱 효과적으로 제조할 수 있음을 나타낸다.

요약하면, 본 발명의 결과는, 놀랍게도, 텔로머라제 촉매 서브-유니트를 암호화하는 전장 유전자와 온도-민감 종양 유전자로 이루어진 세포들이 성장을 위해 조건부로 남아있음, 즉 세포들이 고온에서 불멸화되지 않음을 나타낸다.

상기 결과는 온도 민감 종양유전자와 촉매적 텔로머라제 서브-유니트의 분리 된 형질도입이 오직 온도 민감 종양 유전자만을 포함하는 세포들과 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있음을 설명한다.

비록 분리 형질도입이 양호한 결과를 나타나지만, 종양 유전자와 텔로머라제 암호화 유전자 모두를 갖는 적당한 벡터를 구성하는 것이 더 쉬울 수 있다.

실시예 2

본 실시예는 SV40 초기영역의 비-DNA 결합 돌연변이체(U19tsA58); 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트 hTERT(cDNA) (Counter et al., PNAS, 1998; 95(25):14723-14728); 및 G418에 대한 내성을 암호화하는, 우성적으로 작용하는 선택가능한 네오마이신 포스포트란스퍼라제 내성 마커(Neo)(Clontech)에서 유도된 내열성이 없는 T-항원을 공동-발현하는 알맞는 발현 벡터의 제조를 설명한다. 최종구성물은 레트로바이러스 발현 벡터, pBabe(Morgenstern 및 Land, Supra)를 기초로 하는 고적가 모로니 마우스 백혈병 바이러스(Mo MuLV)에서 조립된다. 레트로바이러스 생활주기는 SV40 초기영역을 오직 라지 T 항원만을 만드는 바이러스로 전환시키는데 사용되었다. 모든 구조물들은 앰피실린 선택에 의해 rec A-숙주(MC1061의 JS4-rec A-유도체)에서 조립하였다.

벡터의 두 변형물을 구성하였다:

구조물 1

이 구조물을 도 1에 나타내었다. Mo MuLV LTR을 사용하여 hTERT를 구동하였고, SV40 초기 프로모터는 U19tsA58과 Neo 모두를 구동하는데 사용하였다. 내부 리보솜 도입부위(IRES)는 성숙핵 리보솜에 의한 해독의 재시작을 유도하기 위해 U19tsA58과 네오 유전자(네오 유전자의 프레임에 융합)사이에 통합된다.

구조물 2

이 구조물을 도 2에 나타내었다. U19tsA58을 구동시키는데 Mo MuLV LTR을 사용하였고, SV40 초기 프로모터는 hTERT 와 Neo를 구동하는데 사용하였다. IRES 서열을 hTERT와 Neo사이에 삽입하였다.

클로닝 전략

각 벡터를 세개의 구획에서 조립하였다. pBabe Neo-hTERT(pCI-Neo-hTERT에서 삭제된 hTERT, R.A. Weinberg, Whitehead Institute 제공), 및 pBabe-Neo U19tsA58(여기서, U19tsA58 은 레트로바이러스 전사에 대해 센스배향으로 삽입된다) 벡터들이 각각 구조 1과 2의 앞-말단을 제조하는데 사용되었다.

IRES와 프레임 중의 그의 융합물을 Neo 유전자에 클로닝하는 것은 클로닝 벡터 pPolyIII-I(D. Kioussis, MRC, Mill Hill로 부터 얻음)에서 실행되었다. pPolyIII-I는 6 뉴클레오티드 서열을 인식하는 제한 효소에 대한 많은 부위를 포함하는 라지 폴리 링커를 함유하므로, 유전자 서열을 구성하는데 유용한 벡터이다. 세번째 성분은 벡터 pBabe Puro(퓨로마이신 제한부위를 갖는 pBabe)로부터 클론하였다.

구조물 1

A. IRES:Neo의 클로닝

Neo 서열을 pLXSN(Clontech) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 구조물의 전장을 최소로 유지하기 위해, 오직 Neo 암호화 영역(pLXSN의 2066 bp-2860 bp)만을 사용 하였다. 노보겐 벡터 pCITE-1으로부터 586 bp IRES(뇌심근염 바이러스(EMC) RNA 5'비-암호화 영역)를 이용할 수 있다. EMC의 개시영역은 pCITE-1의 2918 부위에 Bal I 클로닝 부위 및 2925에 Nco I 부위를 갖고, 이것은 프레임에 이종 서열을 삽입하는데 사용될 수 있다.

그들 자신의 AUG가 부족한 이종 서열을 2915-2917에서 프레임 중에서 바이러스 AUG에 병합시키는 것이 제안되지만, 그러나 BalI로 절단하는 것은 이종 서열의 AUG 다음에 일차 코돈의 시작에서 G를 생산한다. 이것은 AUG 다음의 첫번째 염기가 A인 Neo 서열과 양립할 수 없다. 상기 문제를 해결하기 위해, pLXSN으로부터 Neo 서열을 증폭하는데 사용되는 5' Neo 프라이머는 염기 2918과 2929 사이에 IRES 서열을 재생하도록 고안된다.

정 Neo 프라이머(SEQ ID.NO. 1)

Neo 서열의 3' 말단을 pPolyIII-I에 삽입하기 위해, Sal I 부위와 Cla I 부위(pPolyIII-I에서 pBabe로 클로닝하기 위해)를 포함하도록 3' PCR 프라이머를 고안하였다.

역 Neo 프라이머(SEQ ID. NO. 2)

그러므로, Eco RI과 Bal I를 갖는 pCITE-1에서 IRES를 절단하고 pPolyIII-I의 Eco RI와 Bal I 부위에 서열을 결찰시키는 것이 가능하였다. 그 다음, Neo 서열을 상기의 정 및 역 Neo 프라이머를 사용한 pLXSN 벡터로부터 증폭하였고 PR 산물의 3' 영역을, pPolyIII-I-IRES의 Bal I 및 Sal I으로 결찰시키기 전에 Sal I 프라이머로 절단하였다.

B. U19tsA58의 삽입

U19tsA58을 Bam HI 소화에 의해 pZip-U19tsA58(P. Jat of Ludwig Institute for Cancer Research에서 제공)에서 절단하고, 레트로바이어스 전사에 대한 센스 배열에서 pPolyIII-I-IRES: Neo의 Bam HI 부위로 삽입시켰다.

C. 최종 구조물

최종 구조물을 다음의 세 부분 결찰로 생성하였다:

(ⅰ)Sfi I Cla I 소화에 의해 pPolyIII-I-U19tsA58-IRES: Neo로부터 절단된 U19tsA58-IRES-Neo;

(ⅱ)Sfi I와 요구되는 좌측절 Not I로 소화된, 벡터 pBabe-Noe-hTERT로부터 제공된 구조물의 앞; 및

(ⅲ)Cla I과 요구되는 벡터의 우측 Not I으로 소화된, 벡터 pBabe-Puro로부터 얻은, pBS ori-함유 단편.

최종 구조물을 도 1에 나타내었다.

구조물 2

A. pPolyIII-I-hTERT-IRES:Neo

hTERT cDNA와 IRES:Neo를 pPolyIII-I로 암호화하기 위해, pBabe Neo-hTERT를 우선 Sal I로 소화시켰고, 이것은 hTERT의 3' 말단을 절단한다. hTERT의 클로닝 부위는 Eco RI (5')과 Sal I(3')이지만, hTERT는 pPolyIII-I의 Sal I부위로 암호화될 수 없는데, 이것은 IRES:Neo의 3' 말단에 대한 클로닝 부위이기 때문이다. 그러므로, hTERT 서열은 우선 Eco RI로 pBabe Neo-hTERT로부터 cDNA서열을 삭제하기 전의 초기의 무딘-말단이다. pPolyIII-I-IRES:Neo는 Eco RI로 절단되고, 무디어지고 및 Sal I로 절단되어 IRES:Neo를 삭제한다. hTERT와 IRES:Neo는 그 후 3' hTERT와 5' IRES:Neo 사이에 무딘 말단 결찰에서 연결되는 pPolyIII-I의 Eco RI와 Sal I 부위로 암호화된다.

구조물 2의 조립체는 세개의 결찰을 포함한다.

(ⅰ) pPolyIII-I-IRES:Neo로부터 Sfi I와 Cla I 부위에서 절단된 hTERT-IRES-Neo;

(ⅱ)Sfi I와 Not I로 소화된, 벡터 pBabe-Neo-U19tsA58로부터 얻은, 구조물 2의 좌측면; 및

(ⅲ)Cla I과 Not I으로 소화된, 벡터 pBabe-Puro로부터 얻은, 구조물 2의 우 측면.

최종 구조물을 도 2에 나타내었다.

구조물의 고안에 관하여, CMV 프로모터로부터 종양 유전자와 hTERT 성분들 모두의 발현을 조절하는 것이 더욱 바람직하다. 이것은 레트로바이러스 벡터에서 CMV 프로모터의 아래방향으로 삽입되는 IRES 서열을 사용하여 성분들을 연결시킴으로써 행해진다.

구조물들은 계대접종 동안 안정성이 향상되는 조건부 불멸화된 세포들을 생성하기 위해 적당한 세포들을 형질도입하는데 사용된다.

본 발명의 재조합 세포들은 치료에 이용될 수 있다. 환자에 투여하기 위한 제제의 제조방법은 당업자들에게 명백할 것이다. 적당한 부형제, 희석제 등은 세포-기재 치료의 제조에 현재의 관행을 기초로 또한 명백할 것이다. 송출에 필요한 세포의 양은 치료형태, 질병/손상의 어려움에 따라 변할 것이며, 치료기간 중 여러 개의 약을 투여하는 것이 필요할 것이다.

그러나, 당업자들은 현재의 세포이식 치료법을 기준으로 알맞는 치료법을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> ReNeuron Limited Ludwig Institute for Cancer Research <120> CONDITIONAL IMMORTALISATION OF CELLS <130> REP06053WO <140> (not yet known) <141> 2000-09-18 <150> 99307405.3 <151> 1999-09-17 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide <400> 1 ccacaaccat gattgaacaa gatg 24 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide <400> 2 ccgtcgacat cgattcagaa gaactcgtca ag 32

Claims (16)

1. 조건부-유도성 종양 유전자와 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 세포.
2. 제 1항에 있어서, 종양 유전자와 외인성 폴리뉴클레오티드가 재조합 벡터에 포함되어 있는 세포.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 종양 유전자가 온도-민감성인 세포.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포가 인간 체세포인 세포.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 기질 섬유아세포 또는 포유동물 미세혈관 세포인 세포.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포가 인간의 줄기 세포인 세포.
7. 제 6항에 있어서, 상기 세포가 신경상피 줄기 세포인 세포.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 종양 유전자가 SV-40 T-항원 유전자의 온도-민감성 돌연변이체를 포함하는 세포.
9. 제 8항에 있어서, 돌연변이체가 tsA58-U19인 세포.
10. 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브-유니트와 조건부-유도성 종양 유전자를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
11. 제 10항에 있어서, 선택가능한 마커 유전자와 프로모터 영역을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
12. 조건부-유도성 종양 유전자와 텔로머라제 복합체의 촉매적 서브- 유니트를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 증식 세포내에 병합시키는 것으로 이루어지는 단리된 포유동물 세포의 불멸화 방법.
13. 제 12항에 있어서, 종양 유전자와 외인성 폴리뉴클레오티드를 초기 10 세포 분열 내에 세포에 병합시키는 방법.
14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 종양 유전자보다 먼저 세포에 도입시키는 방법.
15. 제 1항 또는 제 2항에 따른 세포를 사용하여 세포 손실 또는 손상과 관련된 질병을 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 세포가 신경상피 줄기 세포인 방법.

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