JPH09510621A

JPH09510621A - 塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードする組換えアデノウイルス

Info

Publication number: JPH09510621A
Application number: JP7525005A
Authority: JP
Inventors: マルクアビトボル，; マレ，ジヤツク; ミシエルペリコーデ，; フレデリクレバ，; ポールルースタン，; エマニユエルビニユ，
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1994-03-29
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 1997-10-28
Also published as: FR2718150A1; CA2184755A1; FR2718150B1; ZA952563B; WO1995026409A1; US6685934B1; IL113152A0; AU2142595A; EP0753067A1

Abstract

(57)【要約】塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードする異種ＤＮＡ配列を含む組換えアデノウイルス、その調製法、ならびに神経変性性疾患の治療および／または予防のためのその使用。

Description

【発明の詳細な説明】塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードする組換えアデノウイルス本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えアデノウイルスに関する。本発明は更に、それらのベクターの調製法、それらを含む薬剤学的組成物、ならびに特に神経変性性疾患の治療および／または予防のための遺伝子療法におけるそれらの治療的使用にも関する。西欧諸国における寿命増加に伴い、例えばアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、パーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）舞踏病、筋萎縮性側索硬化症などのような神経変性性疾患が定常的に増加している。従って、例えば６５歳以上の人の内の４％がパーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病に冒され、そして７０歳以上の人の１０％、および８０歳以上の人の３０％がアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病に冒されている。一般的にはこれら全ての疾患は中枢神経系内か、もしくはパーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病の症例におけるように単に非常に局在化された構造内での神経細胞の進行性喪失により生じる。近年では、加齢に関連するこの変性のメカニズムを理解するための多大な数の研究プロジェクトが、治療手段および更には予防手段を遺伝子療法を用いて開発する目的で展開されている。栄養因子は、軸索の成長もしくは神経細胞の生存を刺激化する特性を保持するある種の分子である。神経栄養特性を保持する第一の因子、すなわちＮＧＦ（「神経栄養因子」）はおおよそ４０年前に特徴決定が行われた（総説に関しては、Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉａｎｄＡｎｇｅｌｌｅｔｉ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８（１９６８）５３４、を参照されたい）。他の神経栄養因子、特に神経芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（複数）が既に同定されている。神経芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の酸性および塩基性形態が既に同定されており、これらの神経芽細胞増殖因子は、黒質線状体系（ＦｅｒｇｕｓｓｏｎａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ、１９９１Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１３：６９３）を初めとする数々の神経集団における逆行性輸送に供され、かつ中脳のドーパミン作動性ニューロンがインビトロで生存することを可能にする１０、５５８）。ヒトのｂＦＧＦの主要形態は、各々２２．５ｋｄ、２１ｋｄ、および１８ｋｄの分子量を有する（ＰｒａｔｓＨ．、ＫａｇａｈｄＭ．、ＰａｒｔｓＡ．Ｃ．、ＫｌａｇｓｂｒｕｎＭ．、ＬｅｌｉａｓＪ．Ｍ．、ＬｉａｕｚｕｎＰ．、ＣｈａｌｏｎＰ．、ＴａｕｂｅｒＪ．Ｐ．、ＡｍａｌｒｉｃＦ．、ＳｍｉｔｈＪ．Ａ．ａｎｄＣａｐｕｔＤ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６、１８３６−１８４０（１９８９））。塩基性形態ではヒト繊維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ）（複数）は具体的には、遺伝性もしくは後天性の網膜症（これは変性性特性のものである）を予防および／または治療するのに推奨される。同様にそれらは正常な光受容体形態を復活させることが可能である。この目的のためには、ｂＦＧＦが通常は、硝子体内もしくは網膜下の経路により治療予定の部位に直接注入される。しかしながらこの形態の投与は完全に満足のゆくものではない。従ってｂＦＧＦの腫瘍形成性特性を考慮すると、それらが身体の所望される領域内に本質的に確実に局在化するようにさせることが重要である。それらを一般的経路により注入する場合には、ｂＦＧＦが血液循環内へ拡散するのを確実に防ぐことは可能でない。本発明の特定の目的は、この問題に対する有利な解答を提供することである。本発明は、インビボかつ局在化様式でｂＦＧＦの治療的活性量を輸送するための特に有効なベクターの開発に関し、そのことにより所望されない副作用を回避することが可能となる。本発明は治療剤としてｂＦＧＦを投与するのに特に有利である。より詳細には本発明は、インビボかつ局在化様式で、ｂＦＧＦをコードする特異的遺伝子の治療的活性量を神経系内に輸送するのに特に有効なベクターを開発することに関する。同時係属中である国際特許出願（ＰＣＴ）第９３／０２５１９号では、外来性遺伝子をインビボで神経系内に輸送するため、および対応する蛋白質を発現させるためのベクターとしてアデノウイルスを利用することが可能であることが証明されている。より具体的には本発明は、塩基性神経芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に特に適しかつ有効な新規の構築物に関する。より詳細には本発明は、ｂＦＧＦもしくはその誘導体の内の一つをコードするＤＮＡ配列を含む組換えアデノウイルス、その調製法、ならびに神経変性性疾患を治療および／または予防するためのその使用に関する。従って本出願は、ｂＦＧＦをコードする配列を含む組換えアデノウイルスを構築すること、およびそれらのアデノウイルスをインビボで投与することが可能であること、ならびにその投与により具体的には網膜症の治療のための神経系におけるインビボでのｂＦＧＦの治療的活性量の安定かつ局在化発現を、細胞変性効果を全く伴うことなく達成することが可能になることを証明している。従って本発明の最初の主題は、塩基性神経芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）もしくはその誘導体の内の一つの全てもしくは活性部分をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む欠陥組換えアデノウイルスである。本発明の範囲内で産生される塩基性神経芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）はヒトｂＦＧＦもしくは動物のｂＦＧＦであり得る。具体的にはそれはラットのｂＦＧＦであり得る。ｂＦＧＦをコードし、かつ本発明の範囲内で用いられるＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、あるいは例えば一つもしくは複数のイントロンが挿入されているｃＤＮＡを含んでなるハイブリッド構築物であり得る。合成配列もしくは半合成配列も関与する配列であり得る。ｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡが利用されることが特に有利である。本発明の一つの好ましい態様に従うと、その配列はｂＦＧＦをコードするｇＤＮＡ配列である。この配列が用いられる場合には、ヒト細胞内で改善された発現を達成することが可能となる。通常では本発明に従うアデノウイルスベクター内への取り込み前に、ＤＮＡ配列は例えば、適切な制限部位の挿入の目的では特に部位特異的突然変異誘発により有利な改変を受けるが、この理由は従来の技術に記載される配列が本発明に従って用いられるようには構築されてはおらず、かつ実質的レベルの発現を取得する目的では事前の適応化が必要であることが判明することがあるためである。本発明の意味の範疇では、ｂＦＧＦの誘導体は、改変により取得され、かつｂＦＧＦの生物学的特性（栄養効果および／または分化効果）の内の少なくとも一つを保持する産物をコードするいずれかの配列を意味するものと理解されている。改変は、いずれかの突然変異、置換、欠失、添加、もしくは遺伝子的および／または化学的性質の改変を意味するものと理解されている。これらの改変は当業者に知られる技術を用いて実施することができる（例えば、以下の一般的分子生物学的技術を参照されたい）。本発明の意味の範疇内では、誘導体は核酸ライブラリーからのハイブリダイゼーションにより、天然の配列もしくはそれらの断片をプローブとして用いて取得することもできる。これらの誘導体は具体的には、それらの結合部位に対する多大な親和性を有する分子、インビボでの改善された発現をもたらす配列、プロテアーゼに対して一層強力な耐性を示す分子、ならびにより大きな治療効果およびさほど顕著でない副作用か、もしくは恐らくは新規の生物学的特質を有する分子である。一層具体的に引用されることがあるこれらの好ましい誘導体は、天然の変異体、一つもしくは複数の残基が既に置換されている分子、検討中の結合部位との相互作用に関与しないかもしくは僅かな程度にのみ関与するかあるいは所望されない活性を発現する領域を削除することにより既に取得されている誘導体、ならびに天然の配列と比較した際に例えば分泌シグナルおよび／または連結ぺプチドのような追加的残基を含む誘導体である。本発明の一つの好ましい態様に従うと、ｂＧＦＧもしくはその誘導体の内の一つをコードするＤＮＡ配列は、合成ｂＦＧＦが感染化細胞の分泌経路に向かうことを可能にさせる分泌シグナルをも含む。この方法では、合成されたｂＦＧＦは細胞外区画内に有利に放出され、かつそのためそのレセプターを活性化することができる。しかしながらこのシグナルは異種分泌シグナルもしくは人工的分泌シグナルでさえもあり得る。このようなことが可能であるからには、分泌シグナルはｂＦＧＦに属する天然のシグナルであると有利である。具体的にはそれ自体のペプチドシグナルを有するラットｂＦＧＦの事例がこれに相当するであろう。一方でヒトｂＦＧＦはそのようなシグナルは有さない。ｂＦＧＦもしくはその誘導体の内の一つの全体もしくは部分をコードするＤＮＡ配列は、標的細胞内での発現が調節予定のｂＦＧＦの発現を可能にさせるアンチセンス配列であってもよい。この異種ＤＮＡ配列がｂＦＧＦｍＲＮＡの翻訳を制御することが可能なアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を含むことが好ましい。アンチセンス配列は、ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列の全体もしくは単に一部分であることができ、かつこの配列は本発明に従うベクター内の逆方向に挿入される。ｂＦＧＦをコードする配列が、具体的には網膜細胞を初めとする神経細胞内で発現されることを可能にするシグナルの制御下に置かれることが有利である。これらのシグナルが異種発現シグナル、すなわち天然の状態でｂＦＧＦを発現させる原因となるものとは異なるシグナルであることが好ましい。具体的にはそれらは他の蛋白質もしくは合成配列を発現させる原因となる配列であり得る。具体的にはそれらは、真核生物もしくはウイルスの遺伝子からのプロモーター配列であり得る。例えばそれらは、感染が希望される細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。同様にそれらは、利用されるアデノウイルスを初めとするウイルスのゲノムからのプロモーター配列であり得る。これに関しては例えばプロモーターＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶＬＴＲなどを引用することができる。更にこれらの発現配列は、活性化用もしくは調節用の配列、あるいは組織特異的発現を可能にする配列の添加により改変することができる。従って、特異的もしくは主に神経細胞において活性を示し、その結果、このウイルスが実際に神経細胞に感染した際にはこのＤＮＡ配列のみが発現され、かつその効果のみを生じる発現シグナルを利用することが特に有利であり得る。これに関して引用することができるプロモーターの例は、ニューロン特異的エノラーゼのプロモーター、ＧＦＡＰのプロモーター、ならびにより具体的にはロドプシンおよびチロシナーゼのプロモーターである。最初の具体的態様では本発明は、ヒトの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）をコードするｃＤＮＡ配列をＲＳＶＬＴＲプロモーターの制御下に含む欠陥組換えアデノウイルスに関する。本発明は更に、ヒトの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）をコードするｃＤＮＡ配列をロドプシンプロモーターもしくはチロシナーゼプロモーターの制御下に含む欠陥組換えアデノウイルス、ならびにラットの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードするｃＤＮＡ配列をロドプシンプシンプロモーターもしくはチロシナーゼプロモーターの制御下に含む欠陥組換えアデノウイルスにも関する。他の具体的態様では本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードするｇＤＮＡ配列をＲＳＶＬＴＲプロモーターの制御下に含む欠陥組換えアデノウイルスに関する。従って本出願人は、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲプロモーターの使用によりｂＦＧＦが具体的には中枢神経系における神経系の細胞内で長期間にわたり、かつ実質的レベルで発現されることが可能になることを証明した。ある好ましい態様では更に、本発明は、神経栄養性因子ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を、それが主に神経系において発現されることを可能にするプロモーターの制御下に含む欠陥組換えアデノウイルスに関する。本発明の実施のための特に好ましい態様は、ＩＴＲ配列、包膜化配列、および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードするＤＮＡ配列を、発現が主に神経系内で生じることを可能にするプロモーターの制御下に含み、かつＥ１遺伝子と、遺伝子Ｅ２、Ｅ４、およびＬ１〜Ｌ５の内の少なくとも一つとが非機能性である欠陥組換えアデノウイルスである。本発明に従う欠陥アデノウイルスは、標的細胞内では自律的に複製することが不可能なアデノウイルスである。従って一般的には、本発明の範囲内で利用される欠陥アデノウイルスのゲノムは、感染細胞内での前記ウイルスの複製に必要な少なくとも一つの配列が欠失している。これらの領域は、除去するか（全部もしくは部分的に）、あるいは非機能的にさせるか、あるいは他の配列、具体的にはｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列により置換することができる。本発明の欠陥ウイルスがウイルス粒子を包膜化させるのに必要なそれ自体のゲノムの配列を保持することが好ましい。先に記載したように、本発明に従う欠陥組換えウイルスのゲノムが、ＩＴＲ配列、包膜化配列、非機能性Ｅ１遺伝子、および非機能性型の少なくとも一つの遺伝子Ｅ２、Ｅ４、およびＬ１〜Ｌ５を含むことが更に一層好ましい。構造および特性を幾分異にする様々な血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型の内では、本発明の範囲内では、タイプ２もしくはタイプ５のヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）、あるいは動物起源のアデノウイルス（フランス特許出願公開第９３０５９５４号を参照されたい）の使用が好ましいものとして挙げられる。本発明の範囲内で利用することができ、かつ引用することができる動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Ｍａｖｌ，．Ｂｅａｒｄｅｔａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類、および更にサル（例えば、ＳＡＶ）起源のアデノウイルスである。動物起源のアデノウイルスがイヌのアデノウイルス、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス［例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎもしくはＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）株］であることが好ましい。ヒトもしくはイヌ起源、あるいはそれらの混合物のアデノウイルスが本発明の範囲内で利用されることが好ましい。本発明に従う欠陥組換えアデノウイルスは当業者に知られているいずれかの技術により調製することができる（Ｌｅｖｅｒｏｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５、欧州特許第１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯＪ．３（１９８４）２９１７）。具体的にはそれらのアデノウイルスは、あるアデノウイルスと、中でもｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を保持するプラスミドとの間の相同組換えにより調製することができる。この相同組換えは、前記アデノウイルスとプラスミドとの適切な細胞株内への同時トランスフェクトの後に生じる。用いられる細胞株は、（ｉ）前記因子により形質転換され、そして（ｉｉ）その欠陥アデノウイルスゲノム部分を補うことが可能であり、かつ組換えのいずれかの危険性を回避する目的で組込み形態をとることが好ましい配列を含むことが好ましいはずである。細胞株の例としては、ヒト胎児の腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができ、この細胞株は具体的にはそのゲノム内に組込まれているＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左側部分（１２％）を含む。アデノウイルスに由来するベクターを構築するための手法も既にフランス特許出願公開第９３０５９５４号およびフランス特許出願公開第９３０８５９６号において記載されており、これらの特許出願公開は引用により本明細書に取り込まれる。その後に既に複製を遂げたアデノウイルスを、実施例に詳細に説明される標準的分子生物学的技術を用いて回収および精製する。本発明のベクターの特に有利な特性は、具体的には、利用される構築物（所定のウイルス性領域が欠失している欠陥アデノウイルス）、ｂＦＧＦをコードする配列を発現させるために用いられるプロモーター（好ましくはウイルス性もしくは組織特異的プロモーター）、および前記ベクターを投与する方法の結果として生じ、これらのことにより効果的であり、かつ適切な組織内で生じるｂＦＧＦの発現がもたらされる。従って本発明は、遺伝子療法に直接用いることができ、そしてインビボでのｂＦＧＦの発現を指令するのに特に好適かつ効果的であるウイルス性ベクターを提供する。従って本発明は、神経変性性疾患を治療および／または予防するのに特に有利な新規の研究方法を提供する。本発明は更に、神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物を調製するための既述のアデノウイルスのいずれかの使用にも関する。より具体的には本発明は、パーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、癲癇、血管性痴呆、および更には網膜症の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物の調製のためのこれらのアデノウイルスのいずれかの使用に関する。網膜症はより具体的には、いずれかの中枢性もしくは末梢性網膜変性、あるいはそれらの混合物、ならびに後天性であるかもしくはそうではないいずれかの網膜症、具体的には糖尿病性網膜症であり得る。本発明は更に、先に記載した一つもしくは複数の欠陥組換えアデノウイルスを含む薬剤学的組成物にも関する。これらの薬剤学的組成物は、それらを局所的、経口的、非経口的、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下的、眼内、もしくは経皮的などの経路により投与することを考慮して製剤することができる。本発明の薬剤学的組成物は、投与可能製剤のため、具体的には患者の神経系内に直接実施される注入のために薬剤学的に許容される賦形剤を含むことが好ましい。これらの組成物は具体的には、滅菌等張溶液であるか、もしくは乾式、特に凍結乾燥化組成物であることができ、後者の場合には、それらは場合により滅菌水もしくは生理学的食塩水のそれらへの添加の結果として注入用溶液を作製することができる。患者の神経系内への直接注入が有利であり、それはそのことにより、その治療効果が、冒された組織内に濃縮されることが可能となるためである。患者の中枢神経系内への直接注入は定位注入装置を用いて実施されることが有利である。この理由というのは、そのような装置を用いると高精度で注入部位を標的化することができるということである。これに関しては本発明は更に、神経変性性疾患を治療するための方法に関し、この方法は先に特定される組換えアデノウイルスを患者に投与することを含む。より具体的には本発明は神経変性性疾患を治療するための方法に関し、この方法は先に特定される組換えアデノウイルスの定位投与を含む。注入のために利用される欠陥組換えアデノウイルスの用量は様々なパラメーター、具体的には利用される投与の様式、関与する病理学的所見、および更には所望される治療期間に依存して調節することができる。一般的には本発明に従う組換えアデノウイルスは、１０⁴ｐｆｕ／ｍｌと１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌとの間、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌを含む用量の形態で製剤および投与される。用語ｐｆｕ（「プラーク−形成単位」）はウイルス溶液の感染力に相当し、かつ適切な細胞培養物を感染させ、そしてその後一般的には４８時間後に感染化細胞のプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は刊行物に詳細に記載されている。本発明は更に、先に記載される一つもしくは複数の欠陥組換えアデノウイルスでの感染を受けるいずれかの哺乳類細胞にも関する。より具体的には本発明は、これらのアデノウイルスでの感染を受けるヒト細胞のいずれかの集団に関する。これらの細胞は具体的には、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、網膜実質細胞、内皮細胞、神経膠細胞などであり得る。本発明に従う細胞は初代培養物から取得することができる。これらの細胞を当業者に知られるいずれかの技術により回収し、そしてその後にそれらを、それらが増殖可能な条件下で培養することができる。より具体的には繊維芽細胞は、例えばＨａｍ［ＭｅｔｈｏｄｓＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１ａ（１９８０）２５５］により記載される技術を用いて生検から容易に取得することができる。これらの細胞を、アデノウイルスでの感染用に直接利用することができるか、あるいは後続の使用を考慮しての自己バンクを確立する目的で例えば凍結により保存することができる。本発明に従う細胞は例えば、予め確立されているバンクから取得される二次培養物でもあってもよい。その後に培養物中の細胞を、その細胞にｂＦＧＦを産生させる能力を付与する目的で組換えアデノウイルスで感染させる。この感染は当業者に知られる技術を用いてインビトロで実施される。当業者は感染多重度、および適切である場合には感染周期数を調節することができ、これらの調節は特に、用いられる細胞の種類、および所望される細胞当たりのウイルスコピー数に従って実施される。普通ではこれらの段階は、その細胞をインビボで投与することが意図される場合には適切な滅菌条件下で実施されるはずである。当業者は、所望される目的に従って、その細胞を感染するのに用いられる組換えアデノウイルスの用量を調節することができる。インビボ投与について既述される条件をインビトロ感染に適用することができる。本発明は、以前に記載された十分量の欠陥組換えウイルスを含む薬剤学的組成物にも関する。本発明のある好ましい態様に従うと、これらの組成物は網膜症を治療する際の使用に特に非常に適している。具体的にはこの欠陥組換えウイルスを、注入用溶液、点眼剤、眼科用軟膏などの形態で用いることができる。眼への使用に適するこのような製剤のための薬剤学的に許容される賦形剤は具体的には、食塩水溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウムなどか、あるいはそれらの塩の混合物）、ワセリン、液状パラフィンなどである。通常では点眼剤もしくは眼科用軟膏の治療的適用法は、欠陥組換えウイルスの拡散がよくないため、より制約されたものになるかも知れない。眼科的病理学的状態を治療するための使用の際には、本発明に従う欠陥組換えウイルスを様々な様式で投与することができ、それらの方法とは具体的には単回もしくは複式の網膜下注入（これは適切な場合には、硝子体切除術の後に行われる）、もしくは硝子体内注入によるものである。網膜下注入は眼の様々な区画において選択的に実施することができ；具体的にはその注入は、硝子体、前眼房、球後隙内に行うことができる。これら様々な注入様式により、様々な眼の組織、具体的には角膜内皮細胞、光受容体細胞、双極細胞、神経節細胞、もしくは動眼筋の細胞が標的化様式での感染を受けることが可能となる。本発明は更に、既述の一つもしくは複数の欠陥組換えアデノウイルスでの感染を受ける哺乳類細胞を含む移植片、および細胞外マトリックスにも関する。本発明に従う移植片が１０⁵〜１０¹⁰の細胞を含むことが好ましい。その移植片が１０⁶〜１０⁸の細胞を含むことが一層好ましい。より具体的には本発明の移植片内の細胞外マトリックスは、ゲル形成用化合物、および適切な場合には細胞を固着させるための支持体を含む。様々な種類のゲル形成用化合物を、本発明に従う移植片を調製するために利用することができる。このゲル形成用化合物は、ゲルの構造を有するマトリックス内に細胞を封入する目的、および必要とされる場合にはその支持体へのそれらの細胞を固着を促進させる目的で用いられる。従って細胞を固着するための様々な作用物質をゲル形成剤として用いることができ、それらは例えば具体的には、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチンなどである。コラーゲンが本発明の範囲内で用いられるのには好ましい。このコラーゲンは、ヒト、ウシ、もしくはマウス由来のものであり得る。タイプＩコラーゲンが用いられることが一層好ましい。先に記載されるように、本発明に従う組成物は有利なことに細胞を固着させるための支持体を含む。用語「固着させる」は、その支持体への細胞の接着および／または固定化をもたらす、いずれかの形態の生物学的および／または化学的および／または物理学的相互作用を意味する。そうでない場合には細胞は、利用される支持体を被覆するおよび／またはその支持体の内部に浸潤することができる。本発明の範囲内では、固形で無毒性および／または生物適合性の支持体を利用することが好ましいものとして挙げられる。具体的にはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）線維もしくは生物学的起源の支持体を使用することができる。本発明に従う移植片は、身体の様々な部位に移植することができる。具体的にはその移植は、腹膜腔内、皮下組織内（恥骨上部、腸骨窩もしくは鼠径窩など）、臓器、筋肉、腫瘍、中枢神経系内、および更には粘膜下で実施できる。本発明に従う移植片は、それらにより、身体内での治療用産物の放出を調節することが可能になるという点で特に有利であり：第一に、この放出は感染多重度および移植化細胞数により決定される。その後には放出は、その移植片の除去（このことにより、その治療は完璧に停止される）もしくは調節用発現系を用いること（このことにより、その治療用遺伝子の発現を誘導もしくは抑制することが可能となる）のいずれかにより調節することができる。従って本発明は、例えばアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、パーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、およびハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、ならびにＡＬＳ、それに加えて網膜症のような神経変性性疾患の治療もしくは予防の非常に有効な手法を提供する。更に、本発明に従うアデノウイルスベクターは重要な利点を示し、その利点とは具体的に神経細胞を感染する際にはその効率が非常に高いことに関連しており、そのことにより低容量のウイルス懸濁物を用いて感染を達成することが可能となる。更には、本発明のアデノウイルスでの感染は注入部位に高度に局在化しており、そのことにより近接する脳構造内への拡散の危険性が回避される。それに加え、この治療をヒト、ならびに例えばヒツジ、ウシ（乳牛）、齧歯類、家禽（イヌ、ネコなど）、ウマ、魚類などのようないずれかの動物の両方に適用することができる。本発明は以下の実施例の助けを借りて一層詳細に記載されるであろうが、それらの実施例は説明的および非制限的として見なされるべきである。図面の説明文図１：ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｈｂＦＧＦの概略図一般的分子生物学的技術分子生物学において利用される標準法（例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム密度勾配液中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースもしくはアクリルアミドゲル上での電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムでの蛋白質の抽出、エタノールもしくはイソプロパノールを用いる食塩水培地中でのＤＮＡの沈殿、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）内への形質転換など）は当業者に熟知されており、かつ刊行物に詳細に記載されている［ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ｅｔａｌ．、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ｅｔａｌ．（ｅｄｓ）、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７］。例えばｐＢＲ３２２およびｐＵＣのようなプラスミド、ならびにＭ１３シリーズのファージは市販品起源のものである（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。連結のためにはＤＮＡ断片を、アガロースもしくはアクリルアミドゲル上での電気泳動によりサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールを用いて沈殿させ、そしてその後にファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で供給社の推奨事項に従ってインキュベートすることができる。突出性５’末端は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用い、供給社の説明事項に従って充填することができる。突出性３’末端は、製造業者の推奨事項に従って用いられるファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で破壊される。突出性５’末端はＳ１ヌクレアーゼでの慎重な処理により破壊される。合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いるインビトロでの部位特異的突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施することができる。ＰＣＲ［ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．ａｎｄＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］と称される技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌａｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を用い、製造業者の説明事項に従って実施することができる。ヌクレオチド配列は、Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて確認することができる。実施例実施例１：ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｒｂＦＧＦの構築この実施例は、ＲＳＶＬＴＲを含んでなるプロモーターの制御下にラットｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を含むベクターの構築を記載する。１．１．出発ベクター（ｐＬＴＲＩＸ）：ベクターｐＬＴＲＩＸは具体的には、ＩＴＲおよび包膜化部位を含むＡｄ５アデノウイルスの左側領域、ＲＳＶのＬＴＲプロモーター、ならびにｐＩＸ遺伝子からＥａｇＩ制限部位にまで広がるＡｄ５アデノウイルスの領域（この領域によりインビボで相同組換えが生じることが可能になる）を含む。このベクターはＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）により既に記載されている。１．２．ｒｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列の構築。本発明に従うベクターの産生のためには、ラットｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を以下の要領で構築する：ラットｂＦＧＦおよびそれ自体のペプチドシグナルをコードする配列を含む８２０塩基対の断片を、プラスミドｐＵＣ１３−ｂＦＧＦから、それを酵素ＥｃｏＲＩで消化することにより単離した。その後にこの断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）ベクターの対応部位内にサブクローン化した。１．３．ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｒｂＦＧＦの構築この実施例は、ラットｂＦＧＦ（ＳｈｉｍａｓａｋｉＳ．、ＥｍｏｔｏＮ．、ＫｏｂａＡ．、ＭｅｒｃａｄｏＭ．、ＳｈｉｂａｔａＦ．、ＣｏｏｋｓｅｙＫ．，ＢａｉｒｄＡ．ａｎｄＬｉｎＮ．ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｒａｔｅｏｖａｒｉａｎｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｔｉｓｓｕｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆｉｔｓｍＲＮＡ、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１５７、２５６−２６３、１９８８）をコードする配列をＲＳＶウイルスのＬＴＲの調節下に、ならびに組換えをインビボで生じさせることを可能にするＡｄ５アデノウイルス配列を含むベクターｐＬＴＲＩＸ−ｂＦＧＦの構築法を記載する。ＤｒａＩＩ−ＳａｃＩＩ断片を、実施例１．２．において調製された構築物からの酵素消化により単離した。この断片はｂＦＧＦをコードする配列を含む。この断片を、ＬＭＰ（低融点）アガロースゲル上での電気泳動により単離および精製し、そしてその後にその断片を平滑末端にさせる目的でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した。この断片を次には、ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｒｂＦＧＦを作製する目的でベクターｐＬＴＲＩＸ（実施例１．１．）のＥｃｏＲＶ部位内に挿入した。その後にこのｒｂＦＧＦ挿入断片の全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認した。実施例２：ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｈｂＦＧＦの構築この実施例は、ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を、ＲＳＶＬＴＲを含んでなるプロモーターの制御下に含むベクターの構築法を記載する。ヒトｂＦＧＦをコードする１．６３ｋｂの断片を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶ部位での酵素消化によりプラスミドｐＳＣＴ４０から単離した。その後にこの断片を、ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｈｂＦＧＦを作製する目的で、ベクターｐＬＴＲＩＸ（実施例１．１．）のＳａｌＩ（１０２８）およびＥｃｏＲＶ（１１１９）部位に挿入した（図１）。次には、このｂＦＧＦ挿入断片の全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認した。実施例３．ヒトｂＦＧＦをコードする配列を含む組換えアデノウイルスの構築。ベクターｐＬＴＲＩＸ−ｂＦＧＦを直線化し、そして欠陥アデノウイルスベクターと共にヘルパー細胞（細胞株２９３）（これはアデノウイルスＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトランスで供給する）内に同時トランスフェクトさせた。より詳細に記載すると、アデノウイルスＡｄ−ｂＦＧＦを、突然変異体アデノウイルスＡｄ−ｄｌ１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ３１（１９８２）５４）とベクターｐＬＴＲＩＸ−ｂＦＧＦとの間でのインビボ相同組換えにより、以下のプロトコールに従って取得した：酵素ＣｌａＩで直線化させたプラスミドｐＬＴＲＩＸ−ｂＦＧＦおよびアデノウイルスＡｄ− ｄｌ１３２４を、相同組換えが生じることを可能にさせる目的で、リン酸カルシウムの存在下で細胞株２９３内に同時トランスフェクトさせた。このような様式で作製された組換えアデノウイルスをプラーク精製により選択した。単離後に組換えアデノウイルスのＤＮＡを細胞株２９３内で増幅させ、そのことにより約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を保持する未精製欠陥組換えアデノウイルスを含む培養上清がもたらされた。その後にこのウイルス粒子を密度勾配遠心分離法により精製する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＡＢ 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｈ 21/04 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｎ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/12 ＡＡＭ 7/01 9051−4Ｃ 37/04 ＡＡＡ // Ａ６１Ｋ 47/30 9051−4Ｃ 37/36 ＡＢＬＣ１２Ｐ 21/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ペリコーデ，ミシエルフランス・エフ−28320エクロスヌ・リユドシヤルトル31 (72)発明者レバ，フレデリクフランス・エフ−92160アントニイ・バテイマンフランドル２・リユドシヤトネ49 (72)発明者ルースタン，ポールフランス・エフ−91940レユリ・レジダンスクールデイマンシユ32 (72)発明者ビニユ，エマニユエルフランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ル−ガルー60

Claims

【特許請求の範囲】１．ｂＦＧＦもしくはその誘導体の内の一つの全部もしくは活性部分をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む欠陥組換えアデノウイルス。２．ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。３．ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求の範囲１に記載のアデノウィルス。４．ＤＮＡ配列がヒトｂＦＧＦをコードすることを特徴とする、請求の範囲１もしくは２に記載のアデノウイルス。５．ＤＮＡ配列がラットｂＦＧＦをコードすることを特徴とする、請求の範囲１もしくは２に記載のアデノウイルス。６．ＤＮＡ配列が、その発現によりｂＦＧＦ遺伝子の発現が調節されることが可能になるアンチセンス配列であることを特徴とする、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。７．ＤＮＡ配列が、ｂＦＧＦｍＲＮＡの翻訳を調節することが可能なアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求の範囲６に記載のアデノウイルス。８．ＤＮＡ配列が、神経細胞内で発現されることを可能にするシグナルの制御下に置かれることを特徴とする、請求の範囲１〜７の内の一つに記載のアデノウイルス。９．発現シグナルが、ウイルス性プロモーターの中、好ましくはプロモーターＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、およびＲＳＶＬＴＲの中から選択されることを特徴とする、請求の範囲８に記載のアデノウイルス。１０．ヒトｂＦＧＦをコードするｇＤＮＡ配列を、ＲＳＶＬＴＲプロモーターの制御下に含む、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。１１．塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）もしくはその誘導体の全部もしくは活性部分をコードするＤＮＡ配列を、それが主に神経細胞内で発現されることを可能にするプロモーターの制御下に含む、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。１２．プロモーターが、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、およびＧＦＡＰプロモーターの中から、そして好ましくはロドプシンおよびチロシナーゼのプロモーターの中から選択されることを特徴とする、請求の範囲１１に記載のアデノウイルス。１３．ヒトｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を、ロドプシンプロモーターもしくはチロシナーゼプロモーターの制御下に含む、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。１４．ラットｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を、ロドプシンプロモーターもしくはチロシナーゼプロモーターの制御下に含む、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。１５．標的細胞内でのそれ自体の複製に必要なそれ自体のゲノムの領域を欠失することを特徴とする、請求の範囲１〜１４の内の一つに記載のアデノウイルス。１６．ＩＴＲ（複数）および一つの包膜化配列を含み、かつＥ１遺伝子と、遺伝子Ｅ２、Ｅ４、およびＬ１〜Ｌ５の内の少なくとも一つとが非機能性であることを特徴とする、請求の範囲１５に記載のアデノウイルス。１７．タイプＡｄ２もしくはＡｄ５のヒトアデノウイルス、あるいはタイプＣＡＶ−２のイヌアデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲１５もしくは１６に記載のアデノウイルス。１８．神経変性性疾患の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物を調製するための、請求の範囲１〜１７の内の一つに記載のアデノウイルスの使用。１９．パーキンソン（Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）病、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、もしくはハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）病、あるいはＡＬＳの治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物を調製するための、請求の範囲１８に記載の使用。２０．網膜症の治療および／または予防が意図される薬剤学的組成物を調製するための、請求の範囲１９に記載の使用。２１．請求の範囲１〜１７の内の一つに記載される一つもしくは複数の欠陥組換えアデノウイルスを含む薬剤学的組成物。２２．注入可能形態であることを特徴とする、請求の範囲２１に記載の薬剤学的組成物。２３．眼への使用に適する形態をとることを特徴とする、請求の範囲２１に記載の薬剤学的組成物。２４．眼への使用に適する点眼剤もしくは眼科用軟膏の形態をとる十分量の欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請求の範囲２３に記載の薬剤学的組成物。２５．１０⁴ｐｆｕ／ｍｌと１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌとの間、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請求の範囲２１〜２４の内の一つに記載の薬剤学的組成物。２６．請求の範囲１〜１７の内の一つに記載される一つもしくは複数の欠陥組換えアデノウイルスでの感染を受ける哺乳類細胞。２７．ヒトの細胞であることを特徴とする、請求の範囲２６に記載の細胞。２８．網膜細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、神経膠細胞、もしくは網膜実質細胞タイプのヒト細胞であることを特徴とする、請求の範囲２７に記載の細胞。２９．請求の範囲２６〜２８に記載される感染化細胞および細胞外マトリックスを含む移植片。３０．細胞外マトリックスが、コラーゲン、ゼラチン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン、およびレクチンから選択されることが好ましいゲル形成用化合物を含むことを特徴とする、請求の範囲２９に記載の移植片。３１．細胞外マトリックスが感染化細胞を固着させるための支持体をも含むことを特徴とする、請求の範囲２９もしくは３０に記載の移植片。３２．支持体が好ましくはポリテトラフルオロエチレン線維でできていることを特徴とする、請求の範囲３１に記載の移植片。