JP4188241B2 - 細胞分化を制御するプロモーター - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、哺乳類細胞において分化を調節するための特異的調節プロモーターの使用に関する。

発明の背景
組織や臓器の損傷を治療するための移植療法の重要性の認識および理解が拡がりつつある。臓器移植は広く実施されているが、個々の細胞移植を元にした治療法は未だ比較的臨床開発の初期段階にある。

例えば、損傷を受けた脳への適当な細胞の移植は、損傷によって引き起こされたあらゆる感覚的、運動的、行動的もしくは精神的欠損を改善もしくは補正し得るという認識が進みつつある。

細胞ベースの治療法は有用であるため、移植用の十分な細胞を得ることができる。これを支える一手段は、未分化の細胞を繰り返し細胞が分裂し成長することのできる条件下で培養することである。未分化の細胞を用いる際の一つの難点は、未調節の細胞分裂を、患者への移植前もしくは移植直後に停止させて、移植部位における制御不能な細胞の成長を妨げなければならないということである。

移植のための適当な細胞を提供する様々な技術が開発された。神経系の移植に関しては、移植前に、細胞分裂が起こることを許容する培養条件下で未分化の胎児の細胞を維持し、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏで分化を誘導する一つの手法がある。

Reynolds and Weiss, Science, 1992;255:1707は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成体マウスの脳細胞の増殖を誘導するための上皮成長因子（ＥＧＦ）の使用を開示している。適切な条件下で、この細胞は誘導され、正常細胞や神経細胞に分化することができると考えられる。

国際特許出願ＷＯ−Ａ−９４／１６０５９は、細胞を少なくとも１つの栄養因子を添加した無血清培地中で培養することによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代神経培養細胞を維持するための技術を開示している

国際特許出願ＷＯ−Ａ−９７／１０３２９は、条件的に不死化させた細胞系を用いた別の技術を開示している。この細胞系は、不死化している温度感受性癌遺伝子を含み、許容条件下において、神経上皮幹細胞を未分化の状態で維持する。移植時に癌遺伝子はより高いヒトの体温（３７℃）により停止に切り替わり、細胞は損傷の修復に必要な細胞の種類に分化する。癌遺伝子を用いる利点は、細胞が移植まで未分化の状態で維持され、移植の時点で特定の損傷に応答して細胞が損傷を受けたもしくは失われた細胞の形質へ分化することである。ＵＳ ５６８８６９２もまた、非ＤＮＡ結合、温度感受性Ｔ抗原を発現する細胞について開示している。

ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）は中間径フィラメントタンパク質である。ネスチンの発現は、中枢神経系における幹細胞や前駆細胞のマーカーとして広く用いられている。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるネスチンのダウンレギュレーションは、神経幹細胞の分化と相関している。

発明の要約
本発明は、ネスチンの発現を制御する調節因子が、癌遺伝子でトランスフェクトした細胞における発現を調節することに利用できるという理解をもとにしている。

本発明の第１の態様によると、組み替え構築物は、ネスチン遺伝子の第２イントロン、もしくはその機能的断片のエンハンサーエレメントに作動可能に結合された、条件的に誘導可能な癌遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。

第２の態様によると、細胞は上で定義された構築物を含む。

第３の態様によると、本発明の構築物は細胞を条件的に不死化させるために利用される。

第４の態様によると、本発明の細胞は細胞の損失もしくは損傷によって引き起こされた疾病を治療するための移植用の薬剤を製造する際に利用される。

該エンハンサーは、ホスト細胞が未分化状態であるときに機能的であり、そのため細胞増殖が癌遺伝子の活動によって進行する。細胞環境が非許容条件、例えば高温に切り替わると、癌遺伝子は発現しない、もしくは弱い発現となり、細胞は分化する。エンハンサーはまた、分化に対して機能的ではなく、このことが癌遺伝子の無秩序な発現を抑制する機構を提供する。

本発明の説明
本発明は、移植療法に適し、および移植時まで不死である細胞の調製方法を開示する。

一般的に、細胞内に含まれる遺伝的構築物の調製を含む細胞の調製は当業者に知られた通常の技術をもとにしている。適当な方法はSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、およびAusubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons Inc.にも開示されている。

本発明の細胞は、条件的に誘導可能な癌遺伝子が存在することを必要とする。癌遺伝子と関連して本明細書で用いられる「条件的に誘導可能な」という語は、癌遺伝子の発現がある条件下で調節されることである。癌遺伝子は、いわゆる許容条件が適用される際に発現する。例えば、ある癌遺伝子は温度感受性であり、その環境の温度がある値より低いときにのみ発現する。よって該癌遺伝子は調節されていないため、環境条件依存的にオンおよびオフに切り替わることができる。本発明の一つの具体例において用いた癌遺伝子は、ＤＮＡ非結合型、温度感受性の、ＳＶ−４０大型Ｔ抗原遺伝子変異体（U19tsA58）である。適切な代替物も知られており、ポリオーマＴ抗原の癌遺伝子を含む。

「条件的に誘導可能な」癌遺伝子の他の調製方法は、当業者によく知られており、例えば、様々な形態のエストロジェン受容体（ＥＲ）遺伝子とのｃ−ｍｙｃ癌遺伝子の融合物を含む。一つの例（Littlewood et al. Nucleic Acids Res., 1995; 23(10): 1686-90）において、ヒトｃ−ｍｙｃ癌遺伝子は４−ヒドロキシタモキシフェン応答性変異ネズミエストロジェン受容体（ｍｙｃ−ＥＲｔａｍ）と融合している。融合タンパク質は、４−ヒドロキシタモキシフェンが存在するときのみ活性化される。

癌遺伝子は、細胞を形質導入する／感染させるために用いられる組み替えＤＮＡもしくはレトロウイルスベクターもしくは構築物に含まれる。「ベクター」および「構築物」という語は、本明細書中でほぼ同一の意味で用いられる。本明細書中の該ベクターもしくは構築物はさらにネスチン遺伝子の第二イントロンのエンハンサーエレメントを含む。該エンハンサーおよび癌遺伝子は作動可能に結合されているため、該エンハンサーは該癌遺伝子の発現を制御することができる。よって該エンハンサーは癌遺伝子配列の上流に位置することが好ましい。

エンハンサーは、ヒトのエンハンサーに相当することが好ましい。さらに好ましい具体例において、エンハンサーはヒトネスチン遺伝子の第二イントロンの３’部分の７１４ｂｐもしくは３７４ｂｐいずれかのエンハンサーエレメントである。これらはLothian et al, Exp. Cell Res., 1999; 248: 509-519.において同定されている。適切なエンハンサーはまた、Yasorsky et al, Developmental Biology, 1999; 205: 309-321 and Muller et al, Development, 1998; 125(16): 3087-3100に開示されている。これらの文献それぞれの内容は参照として本明細書に組み込まれる。

エンハンサーエレメントの機能的な断片もまた、本発明の範囲内である。「機能的な断片」という語は、エンハンサーの一部が、依然として調節の効果を与えることのできる状態で存在することを意味する。「断片」という語の使用は、エンハンサーの配列の置換もしくは付加を含む。例えば、エンハンサーの調節の効果を与える能力を変えることなく一塩基置換が行われても良い。適切な断片は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてエンハンサー配列の相補鎖にハイブリダイズし、また調節の効果を与えることができる。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、２０μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃にて一晩インキュベートした後、フィルターを０．１ｘＳＳＣ中で６５℃にて洗浄することである。

細胞はまた、タンパク質レベルで調節可能なシステムを用いるものであってもよい。Ｍｙｃ−ＥＲｔａｍ構築物は、４−ヒドロキシタモキシフェン応答性変異ネズミエストロジェン受容体と融合したヒトｃ−Ｍｙｃタンパク質である。この融合タンパク質は、４−ヒドロキシタモキシフェンが存在するときのみ活性化される。さらなる調節エレメントであるＮｅｓ７１４／ｔｋもしくはＮｅｓ３７４／ｔｋは、ｍｙｃ−ＥＲｔａｍ遺伝子の上流に位置する。遺伝子およびタンパク質発現調節の二重制御は、細胞の不死化の厳格な制御を促進する。

細胞はまた、少なくともテロメラーゼ複合体の触媒サブユニットをコードする外来性のポリヌクレオチドを含んでもよい。「外来性の」という語は、本明細書中では通常の文脈で用いられ、細胞に導入されたポリヌクレオチドを意味し、本来的に存在する内在性ポリヌクレオチドと区別する。テロメラーゼ複合体の触媒サブユニットは逆転写酵素のように働く酵素であり、当業者に知られている。ヒトサブユニットはＧＢ−Ａ−２３１７８９１に開示されている。さらなる調節エレメントが存在していてもよい。例えば、さらなるプロモーターが構築物上に配置されていてもよい。プロモーターは、テロメラーゼ遺伝子の発現を調節するために存在していてもよく、癌遺伝子の発現を援助するために構築物の一部として存在していてもよい。

発現の調節は当業者に既知の方法によって実施されてもよい。例えば、長い端部反復（ＬＴＲ）プロモーターを用いて調節を行ってもよい。別のプロモーターは当業者に明らかなものである。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを用いて調節を行ってもよい。ＣＭＶプロモーターは非常に強いプロモーターであり、細胞が神経細胞、例えば神経上皮幹細胞であるときに好ましいであろう。

適切な構築物を細胞へ導入する方法は、当業者に知られている。

あらゆる哺乳類細胞を本発明に用いてもよい。例えば、細胞は内皮細胞でもよく、脚、心臓および他の臓器の血管再生に用いてもよい。好ましくは、細胞はヒトの体細胞、例えば特定の種類の細胞へ分化することのできるヒト上皮幹細胞である。特に好ましい細胞は、細胞の損失もしくは損傷を修復するためのおよび行動的もしくは精神的欠損を補正するための神経移植に用いられる、未分化の（もしくは前駆体の）ヒト神経上皮多能性細胞である。あるいは、細胞は分化した細胞、例えばランゲルハンス島のＢ細胞でもよい。さらに、細胞は、内分泌腺、網膜細胞、膵細胞、蝸牛細胞、肝細胞、骨芽細胞および破骨細胞、筋原細胞またはケラチノサイトから得られるものでもよいが、それらに限定されない。

構築物は、培養初期の間、通常最初の１０回細胞分裂以内に細胞内に組み込まれていることが好ましい。

導入されたもしくは感染した細胞は当業者に知られた条件下で培養してもよい。細胞はストレスのかからない条件下で培養することが好ましい。当業者は、特定の細胞の種類それぞれに適した条件を、通常の培養技術をもとに理解するであろう。

本発明の組み替え細胞を治療に用いてもよい。患者へのデリバリーのための製剤の調製方法は当業者にとって明らかであろう。適切な賦形剤、希釈液等は、細胞をベースにした治療剤の調製における現在の手法に基づけばも明らかであろう。デリバリーのために必要な細胞の量は処置の形態、疾病／損傷の重症度、および処置の期間を通じて複数の薬を投薬する必要性により異なる。しかしながら、当業者は現在の細胞移植療法に基づいて適切な処置を容易に決定することができる。

次の実施例によって本発明をさらに説明する。

この実施例において、神経前駆細胞におけるＮｅｓ７１４／ｔｋおよびＮｅｓ３７４／ｔｋプロモーターの調節を提供する。

Nes714/tkおよびNes374/tkプロモーターは、レポーター遺伝子として働く緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および選択マーカーとして機能するハイグロマイシン耐性遺伝子（Hygro^ｒ）とともに構築した（図１および２参照）。Nes714／tkおよびNes374/tk断片をpNes714/tk-LacZおよびpNes374/tk-LacZ構築物より、Not IおよびHind IIIによる制限酵素消化によって単離した（Lothian et al., Eur. J. Neurosci, 1997; 9: 452-462および上記のLothian, et al., 1999）。pHygEGFP構築物（Clontech）をBgl IIおよびNhe Iで消化し、ＣＭＶプロモーターを除去した。Nes714／tk、Nes374／tkおよびpHygEGFP、３つの断片すべてをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑末端を生成させた。Nes714／tkおよびNes374／tk断片を、pHygEGFPの平滑末端（Bgl IIおよびNhe Iサイト）へ連結することによりpNes714/tk-HygroGFPおよびpNes374/tk-HygroEGFP構築物を得た。

pNes714/tk-HygroGFPおよびpNes374/tk-HygroGFP構築物を、WO-A-９７／１０３２９（内容は本明細書に参照として組み込まれる）に記載のとおりに作成した条件的に不死化させたヒト神経前駆細胞系へトランスフェクトし、３３℃の許容温度において成長させた。次いで、トランスフェクトした細胞をハイグロマイシンで選抜し、pNes714/tk-HygroGFPおよびpNes374/tk-HygroGFP構築物を含むヒト神経前駆細胞系を作成した。分化アッセイを行うために純粋なGFP保持細胞を３７℃（１０％血清を含むもしくは含まない）、および３３℃（対照）で３〜７日間培養した。３７℃にて、ヒト神経前駆細胞系は分化し始め、これらの細胞においてGFPのダウンレギュレーションが観察されたことから、pNes714/tkおよびpNes374/tkプロモーターが、ヒト神経前駆細胞が分化段階に移行する間に調節されたことが示された。従って、pNes714/tkおよびpNes374/tkプロモーターは、分化した細胞でなく神経前駆細胞においてのみ、遺伝子の発現を駆動する誘導プロモーターとして働いている。

最近の研究により、Nes714tk/lacZマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏのＣＮＳにおける発現は観察されないが、ＣＮＳ肝細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養した際にレポーター遺伝子の発現は検出されることが示された（J. Neurosci Res, 2002; 15: 784-794）。nes714 tk-HygroGFPをｉｎ ｖｉｖｏで用いた場合、ＧＦＰのさらなるダウンレギュレーションが期待できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるNes714tk調節の違いにより、記載されたネスチンエンハンサー調節機構の治療的な実用性にさらなる利点が与えられるだろう。

本発明の別の態様において、Nes714/tkおよびNes374/tkプロモーターは、pNes714/tk-LTU19tasA58、pNes374/tk-LTU19tsA58、pNes714/tk-SVU19tsA58、pNes374/tk-SVU19tsA58、pNes714/tk-LTU19tsA58-IRES-C-myc、pNes374/tk-LTU19tsA58-IRES-C-myc、pNes714/tk-LTU19tsA58-IRES-hTERTおよびpNes374/tk-LTU19tsA58-IRES-hTERT、pNes714/tk-myc-ERtamおよびpNes374/tk-myc-ERtam（図３から１２）のような様々なウイルス構築物を構築するために用いられた。これらの構築物に用いられたLTU19tsA58、SVU19tsA58、C-myc、myc-ERtamおよびhTERTの遺伝子は、不死化遺伝子として用いられた。LTU19tsA58は温度感受性大型Ｔ遺伝子を示す。SVU19tsA58は、温度感受性SV40遺伝子を示す。hTERTは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の触媒サブユニットを示す。Myc-ERtamは、４−ヒドロキシタモキシフェン応答性変異エストロジェン受容体ドメインと融合したc-Mycを示す。

該構築物により、調節プロモーターおよび遺伝子もしくは薬剤誘導可能な遺伝子の温度感受性変異の両方を介した遺伝子発現の二重制御が提供される。いくつかの構築物において、２つの遺伝子、例えばLTU19tsA58およびC-mycあるいはLTU19tsA58およびhTERTを用いられた。この場合、LTU19tsA58は不死化遺伝子として働き、C-mycおよびhTERTは染色体を安定化する遺伝子として機能する。

図１は、ネスチンの第２イントロンの７１４ｂｐ断片を含むヒトネスチンプロモーターと、後ろに１６０ｂｐの基本ＨＳＶ ｔｋプロモーターと、レポーター遺伝子、および選択マーカーとして働くHygroEGFP遺伝子を含むpNes714/tk-HygroEGFP構築物を示す。 図２は、ネスチンの第２イントロンの３７４ｂｐ断片を含むヒトネスチンプロモーターと、後ろに１６０ｂｐの基本ＨＳＶ ｔｋプロモーターと、レポーター遺伝子、および選択マーカーとして働くHygroEGFP遺伝子を含むpNes374/tk-HygroEGFP構築物を示す。 図３は、大型Ｔ（Ｌａｒｇｅ Ｔ）遺伝子のU19tsA58変異をネスチンプロモーターNes714/tkによって駆動したpNes714/tk-LTU19tsA58のウイルス構築物であり、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（Long Terminal Repeat LTR）によって駆動され、大型Ｔタンパク質の発現はNes714/tkの調節プロモーターおよび温度感受性遺伝子であるU19tsA58によって制御される。 図４は、大型Ｔ遺伝子のU19tsA58変異をネスチンプロモーターNes374/tkによって駆動したpNes374/tk-LTU19tsA58のウイルス構築物であり、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動され、大型Ｔタンパク質の発現はNes374/tkの調節プロモーターおよび温度感受性遺伝子であるU19tsA58によって制御される。 ＳＶ４０遺伝子のU19tsA58変異をネスチンプロモーターNes714/tkによって駆動したpNes714/tk-SVU19tsA58のウイルス構築物であり、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動され、ＳＶ４０遺伝子の発現はNes714/tkの調節プロモーターによって制御され、温度感受性遺伝子であるU19tsA58は大型Ｔタンパク質の発現を制御する。 図６は、ＳＶ４０遺伝子のU19tsA58変異をネスチンプロモーターNes374/tkによって駆動したpNes374/tk-SVU19tsA58のウイルス構築物であり、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動され、ＳＶ４０遺伝子の発現ははNes374/tkの調節プロモーターによって制御され、温度感受性遺伝子であるU19tsA58は大型Ｔタンパク質の発現を制御する。 図７は、ネスチンプロモーターNes714/tkが変異大型Ｔ遺伝子LTU19tsA58およびＣ−ｍｙｃ遺伝子の両方を駆動する、pNes714/tk-LTU19tsA58-IRES-C-mycのウイルス構築物であり、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）は２つの遺伝子間に位置し、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動される。 図８は、ネスチンプロモーターNes374/tkが変異大型Ｔ遺伝子LTU19tsA58およびＣ−ｍｙｃ遺伝子の両方を駆動する、pNes374/tk-LTU19tsA58-IRES-C-mycのウイルス構築物であり、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）は２つの遺伝子間に位置し、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動される。 図９は、ネスチンプロモーターNes714/tkが変異大型Ｔ遺伝子LTU19tsA58およびｈＴＥＲＴ遺伝子の両方を駆動する、pNes714/tk-LTU19tsA58-IRES-hTERTのウイルス構築物であり、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）は２つの遺伝子間に位置し、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動される。 図１０は、ネスチンプロモーターNes374/tkが変異大型Ｔ遺伝子LTU19tsA58およびｈＴＥＲＴ遺伝子の両方を駆動する、pNes374/tk-LTU19tsA58-IRES-hTERTのウイルス構築物であり、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）は２つの遺伝子間に位置し、ネオマイシン耐性遺伝子は長い端部反復配列（ＬＴＲ）によって駆動される。 図１１は、ネスチンプロモーターpNes714/tkを用いてｃ−ｍｙｃおよびエストロジェン受容体遺伝子ＥＲｔａｍの発現を駆動する、pNes714/tk-myc-ERtamの構築物を示し、そして 図１２は、ネスチンプロモーターpNes374/tkを用いてｃ−ｍｙｃおよびエストロジェン受容体遺伝子ＥＲｔａｍの発現を駆動する、pNes714/tk-myc-ERtamの構築物を示す。

Claims (13)

1. ネスチン遺伝子の第２イントロンのエンハンサーエレメント、もしくは該エンハンサーエレメントの機能的な断片と作動可能に結合された、条件的に誘導可能な癌遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む構築物であって、該エレメントが、ヒトネスチン遺伝子の第２イントロンの３’部分の７１４ｂｐもしくは３７４ｂｐいずれかのエレメントである構築物。
2. さらに癌遺伝子のプロモーターとして働くポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の構築物。
3. プロモーターがＨＳＶ ｔｋプロモーターである請求項２に記載の構築物。
4. さらにテロメラーゼ複合体の触媒サブユニットを含む前記請求項のいずれかに記載の構築物。
5. 癌遺伝子がＳＶ４０大型Ｔ抗原の温度感受性変異体である請求項１に記載の構築物。
6. 癌遺伝子がｃ−ｍｙｃ癌遺伝子を含む請求項１〜５のいずれかに記載の構築物。
7. 前記請求項のいずれかに記載の構築物を含む細胞。
8. 哺乳類の未分化多能性細胞である請求項７に記載の細胞。
9. 未分化、多能性のヒト神経上皮細胞である請求項７もしくは請求項８に記載の細胞。
10. 治療に使用するための請求項７〜９のいずれかに記載の細胞。
11. 条件的に細胞を不死化させるための請求項１〜６のいずれかに記載の構築物の使用。
12. 細胞が請求項８もしくは９において定義される、請求項１１に記載の使用。
13. 細胞の損失もしくは損傷によって引き起こされた疾病を治療するための移植用薬剤の製造における請求項７〜９のいずれかに記載の細胞の使用。

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