PT1948789E - Processo para a preparação de linhas de células humanas permanentes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE LINHAS DE CÉLULAS HUMANAS PERMANENTES"

Descrição A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma linha de células humanas permanente, no qual células humanas primárias isoladas são transfectadas simultaneamente com uma sequência que permite a expressão de pelo menos um factor transformante celular e uma sequência que permite a expressão de pelo menos um polipeptideo recombinante. A produção de polipeptideos recombinantes com fins terapêuticos, diagnósticos ou técnicos em culturas celulares (in vitro) é efectuada em regra em linhas de células estáveis, estabelecidas de forma duradoura ou permanente, nas quais os ácidos nucleicos que codificam o polipeptideo estão integrados no ADN cromossomal da célula (chamadas linhas celulares produtoras). As linhas celulares produtoras devem apresentar em especial duas propriedades características: primeiro devem poder crescer e multiplicar-se de forma duradoura (permanentes) em cultura celular e, segundo, devem expressar o gene que codifica o polipeptideo desejado, que pode depois ser isolado da célula ou do sobrenadante da cultura. Além de bactérias, leveduras e células vegetais, são especialmente utilizadas células animais para a produção de polipeptídeos recombinantes. Cerca de 60 a 70% de todas as proteínas 2 terapêuticas são actualmente produzidas em células de mamífero (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004). A preparação das células de produção deriva normalmente de linhas de células já imortalizadas ou transformadas, que crescem e se multiplicam de forma duradoura em culturas celulares, como por exemplo células animais de CHO (ovários de hamster chinês), BHK (rim de hamster bebé), NSO (mieloma de rato) ou HEK293 humano (rim embrionário humano) ou células PER.C6. Estas linhas de células, que também se encontram disponíveis comercialmente, quase como primeira fase do processo de estabelecimento das células produtoras, foram geradas por manipulação genética das células primárias em cultura ou isoladas de um tumor natural.

Durante a obtenção das células produtoras propriamente ditas, transferiu-se por transfecção nestas linhas de células já estabelecidas, por um lado os ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo recombinante (o chamado transgene) com os elementos reguladores da transcrição necessários, por outro lado uma segunda cassete de expressão com um gene que codifica um marcador de selecção e cujo produto genético das células consegue uma certa vantagem de selecção. Poucos dias após a transferência genética, durante a qual as células são cultivadas num meio de cultura sem reagente de selecção, adiciona-se ao meio um reagente de selecção adequado. Na presença do reagente de selecção sobrevivem e crescem apenas as células que incorporaram os ácidos nucleicos utilizados para a transfecção e que expressam o marcador da selecção. Marcadores de selecção utilizados com frequência são o gene da resistência à neomicina, o gene da resistência à higromicina e a di-hidrofolase reductase (DHFR) (Wurm, Nat. 3

Biotechnology 22:1393-1398, 2004; Wurm e Jordan, 309-333 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdão, 2003). A selecção é assim efectuada em meio de cultura com os reagentes de selecção tal como os antibióticos enomicina ou higromicina ou o glucocorticóide sintético metotrexato. As células com o marcador de selecção e o transgene, que sobrevivem ao processo de selecção e se multiplicam (chamados transformantes), são normalmente isoladas (clonadas) para assegurar que todas as células na cultura são geneticamente idênticas e para separar as linhas de células produtoras desejadas com as melhores taxas de produção de linhas das células não tão boas produtoras.

Conforme o processo de preparação e em determinadas circunstâncias, os reagentes de selecção devem ser adicionados ao meio não só durante a fase de selecção como posteriormente durante o cultivo das células clonadas, para assegurar a estabilidade genética das células produtoras. O gene para o polipeptideo desejado (transgene) e o gene para o marcador de selecção estão normalmente integrados na mesma posição no genoma celular. Em caso ausência da pressão de selecção durante a expansão posterior das células ou durante a fase de produção existe o perigo de as células perderem o marcador de selecção, e consequentemente também o transgene para o polipeptideo desejado. Este problema é evitado com a adição continua do reagente de selecção. Células animais e humanas primárias que são cultivadas após colheita do organismo ou tecido normalmente apenas crescem por períodos curtos poucas passagens. As células humanas são especialmente apropriadas para a preparação de 4 compostos bioterapêuticos, porque exprimem polipeptídeos complexos, ao contrário de outras células de mamífero ou células animais, com modelos de modificação pós-translacionais. 0 modelo de glicosilação de proteínas recombinantes complexas, portanto a estrutura e disposição do resíduo açúcar na molécula, no caso de uma preparação em células humanas, reproduz substancialmente melhor o modelo do polipeptídeo humano autêntico do que no caso de uma preparação de sistemas de produção não-humanos. Este modelo de glicosilação reveste-se frequentemente de um significado decisivo para as propriedades do polipeptídeo como a actividade biológica, estabilidade, solubilidade e imunogenidade.

Linhas de células humanas estabelecidas de forma duradoura (linhas de células humanas permanentes), que podem ser utilizadas para a expressão de polipeptídeos recombinantes, foram isoladas a partir de tecidos tumorais de doentes (por exemplo células HeLa). Porém, por motivos de segurança e devido à sua instabilidade genética, estas células não são adequadas para uma produção a nível industrial de polipeptídeos terapêuticos destinados a utilização em seres humanos, linhas de células humanas imortalizadas espontâneas são praticamente não existem à disposição com poucas excepções (por exemplo as chamadas células HaCaT). Em contrapartida, são adequadas para produção biotecnológica as linhas de células humanas permanentes que foram geradas por transformação de tecidos primários por meio de produtos genéticos virais específicos. Através da expressão de polipeptídeos transformadores de ADN-vírus é possível transformar células primárias em células de crescimento permanente. 0 mecanismo 5 de transformação requer a interacção do produto genético com codificação virai com proteínas celulares, que participam na regulação da mitose (designados produtos de genes supressores tumorais). Deste modo rompe-se uma paragem do ciclo celular (fase G0/G1) e as células passam para a fase S, o que conduz a uma proliferação descontrolada das células (Helt e Falloway, Carcinogenesis 24:159-169, 2003). Constituem exemplos destes produtos genéticos com codificação virai transformadores o antigénio T do vírus Simian 40 (SV40), E6/E7 do papilomavírus humano (HPV) ou E1A/E1B de Adenovírus. Estas proteínas virais são equiparáveis quanto ao respectivo mecanismo de tranformação: Antigénio T, E6 e EIA inactivam produtos genéticos da família das proteínas retinoblastoma celulares (pRb) e antigénio T, E7 e E1B inactivam o imunossupressor tumoral celular p53 (resumido em: zur Hausen, J. Natl. Cacer Inst, 92, 690-698, 2000; Ludlow, FASEB J. 7: 866-871, 1993; Moran, FASEB J. 7, 880-885, 1993) . As linhas de células transformadas deste modo tornam-se assim cultiváveis de forma duradoura e são especialmente adequadas para produção biotecnológica.

Muito poucos tipos de células humanas foram até hoje transformadas com a região genética EI do adenovírus. Entre estas contam-se as células neuronais em tecido renal embriónico humano HEK293) (Graham et al., J. Gen. Virai. 36: 59-74, 1977), células da retina embrionais humanas (EP 833 934 Bl) e amniócitos humanos (EP 1 230 354 Bl). O processo descrito para a preparação de de linhas de células produtoras à base das linhas de células imortalizadas ou transformadas existentes tem desvantagens de várias perspectivas. A adição de antibióticos, compostos 6 de quimioterapia ou outros reagentes de selecção ao meio de cultura durante a fase de selecção e em determinadas circunstâncias mesmo na fase de expansão antes da produção aumenta os custos do processo de produção. Por meio de análises dispendiosas no processo de produção, bem como do produto final é ainda necessário assegurar e confirmar que o produto final produzido não contém qualquer resíduo dos reagentes de selecção. Significa isto mais exigências sobre o controlo de qualidade para assegurar a segurança do preparado terapêutico. Alguns dos reagentes de selecção utilizados afectam ainda a qualidade ou estabilidade clonal das células produtoras. A adição continua de metotrexato como reagente de selecção na cultura, por exemplo, suspende nalgumas linhas de células produtoras o efeito do fenotipo "estável" das células no que se refere à sua produtividade. Estudos genéticos revelaram porém que a presença deste reagente promove a heterogenidade citogenética das célula, o que é indesejável da perspectiva dos requisitos reguladores do processo de autorização(Wurm et al., Dev. Biol. Stand. 76:69-82, 1992; Kim e Lee, Biotechnol. Bioeng. 64:741-749, 1999) . Uma outra desvantagem do método clássico de geração de linhas de células produtoras pode ser observada no facto de existir apenas uma escolha muito limitada de linhas celulares de partida permanentes (por exemplo, CHO, ΒΗΚ, HEK293). Todas estas células foram já cultivadas e guardadas ao longo de vários anos, por inúmeras passagens antes do respectivo desenvolvimento em linhas de células produtoras. Este procedimento implica sempre o risco, para além da modificação genética necessária para a imortalização inicial, de acrescentar muitas outras aberrações cromossómicas e mutações genéticas 7 que tornam as células de partida animais ou humanas "naturais" diferentes. As consequências possíveis destas modificações quanto a aspectos de segurança e/ou tecnologia da produção no âmbito da produção por engenharia genética de proteínas recombinantes não foram ainda investigadas em profundidade.

Assim, o objectivo da presente invenção consiste em apresentar um processo mais fácil, económico e mais seguro do ponto de vista toxicológico para a preparação de linhas de células humanas permanentes para a produção de polipeptídeos revombinantes.

Este objectivo foi atingido por meio do objecto definido nas reivindicações.

As figuras seguintes esclarecem a presente invenção. A fig. 1 mostra um esquema da estrutura do plasmídeo pGS119 para expressão das funções genéticas EI e da proteína estrutural virai pIX do serotipo 5 de Adenovírus. A fig. 2 mostra uma representação esquemática da estrutura do plasmídeo pGS116 para expressão de um cADN da antitripsina alfa 1 humana (hAAT) sob o controlo do promotor do vírus da citomegalia (CMV). A fig. 3 mostra o resultado de um Western Blot para expressão das proteínas EIA e E1B de Ad5 em sete linhas de células produtoras baseadas em amniócitos permanentes diferentes para antitripsina alfa 1 humana. A fig. 4 mostra o resultado de um Western Blot para expressão de antitripsina alfa 1 humana (hAAT) em sete linhas de células produtoras baseadas em amniócitos 8 permanentes diferentes. A, hAAT segregado das células no sobrenadante da cultura; B, hAAT intracelular. A f ig. 5 mostra uma representação esquemática da quantidade de antitripsina alfa 1 humana (hAAT) expressa pelas linhas de células produtoras seleccionadas no sobrenadante da cultura (ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay) . A, quantidade de hAAT na passagem 5 dos clones celulares individuais; B, estabilidade da expressão ao longo de várias passagens nos clones celulares seleccionados. A fig. 6 mostra o resultado de um Western Blot para glicosilação de antitripsina alfa 1 humana (hAAT) de linhas de células produtoras baseadas em amniócitos. 0 termo "amniócitos" tal como presentemente utilizado, refere-se, num sentido lato, a todas as células existentes no líquido amniótico e, por exemplo obtidas por punção do liquido amniótico. São originários do âmnio ou dos tecidos fetais em contacto com o líquido amniótico. Foram descritas três classes principais de amniócitos que se distinguem com base em critérios morfológicos: Células fibroblásticas (células F) , células epitelóides (células E) e células do líquido amniótico (Amniotic Fluid Cells, células AF) (Hohn et al., Pediat. Res. 8:746-754, 1974). As células AF constituem o tipo predominante. Como fonte de células amniócitos podem ser células de punções do líquido amniótico (amniocenteses), que são, por exemplo submetidas a um diagnóstico citogenético. Podem também servir de fontes de células amniócitos as células de colheita de líquido amniótico efectuada no caso de uma quantidade de 9 líquido amniótico excessiva durante a gravidez (poli-hidramnio, poli-hidramnia). 0 termo "cassete de expressão" refere-se em especial a uma molécula de ácido nucleico ou uma área de uma molécula de ácido nucleico, que contém um elemento regulador situado antes da região codificadora ou um promotor, uma região codificadora ou um quadro de leitura aberta, bem como um elemento de terminação da transcrição situado depois da região codificadora. 0 elemento regulador situado antes da região codificadora ou o promotor pode ser um promotor constitutivo, isto é activador da transcrição permanente (por exemplo promotor CMV) ou um promotor regulável, isto é activador e/ou desactivador (por exemplo, promotor regulável da tetraciclina). A região codificadora da cassete de expressão pode ser um quadro de leitura aberta integral, tal como no caso de um cADN com um codão de partida no terminal 5'e um codão de paragem no terminal 3'. A região codificadora pode consistir numa disposição genómica ou combinada de novo de exões codificadores e intrões intermediários, não-codificadores. A região codificadora da cassete de expressão pode ser constituída também por vários quadros de leitura aberta separados entre si pelo chamado IRES (Internai Ribosome Entry Sites). 0 termo "linhas de células permanentes" tal como presentemente utilizado designa células modificadas geneticamente de forma que consigam continuar a desenvolver-se de forma permanente em cultura de células nas condições de cultura adequadas. Estas células são também designadas células imortalizadas. 10 10 0 termo "polipeptídeo" ou "polipeptídeo recombinante", tal como presentemente utilizado, designa peptídeos de pelo menos 2 aminoácidos. O polipeptídeo pode ser modificado co-translacional e/ou pós-translacional, por exemplo mediante a anexação de resíduos açúcar ou modificação de resíduos aminoácido. O polipeptídeo pode ser linear, circular ou ramificado. Além disso, o polipeptídeo pode consistir em mais do que uma cadeia de aminoácidos, podendo as cadeias incorporar estruturas espaciais mais ou menos complexas (por exemplo estrutura secundária, terciária, quaternária) em condições intramoleculares e/ou intermoleculares. Se o polipeptídeo consiste numa cadeia de aminoácidos, esta pode também incorporar estruturas espaciais mais ou menos complexas mediante condições intramoleculares. Os polipeptídeos podem ser polipeptídeos farmacologicamente ou imunologicamente activos ou polipeptídeos utilizados para fins diagnósticos. O termo "células primárias", tal como presentemente utilizado, refere-se a células obtidas por colheita directa de um organismo ou um tecido e aplicadas em cultura. As células primárias possuem apenas um tempo de vida muito limitado. As células primárias podem ser por exemplo amniócitos, células neuronais ou células da retina. O termo "linhas de células produtoras", tal como presentemente utilizado refere-se a linhas de células permanentes, que foram geneticamente modificadas mediante a introdução de um transgene que codifica o polipeptídeo que se deseja produzir. O termo "marcador de selecção", tal como presentemente utilizado ,refere-se a um marcador genético que confere às 11 células nas condições de selecção uma vantagem reguladora. Estas condições de selecção podem ser constituídas por exemplo pela presença de um composto de quimioterapia ou um antibiótico ou um outro citotóxico ou uma substância influenciadora do crescimento no meio. Marcadores de selecção utilizados frequentemente são o gene da resistência à neomicina, o gene da resistência à higromicina e di-hidrofolato reductase. 0 termo "transfecção", tal como presentemente utilizado designa qualquer processo adequado para incorporar o(s) ácido(s) nucleico(s) mencionado nas células. Podem-se citar a título de exemplo o método do fosfato de cálcio clássico, a electroporação, sistemas lipossomais de qualquer tipo e combinações destes processos. 0 termo "transgene", tal como presentemente utilizado, designa a sequência de ácidos nucleicos codificadora de um polipeptídeo recombinante.

Um objecto da presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma linha de células humana permanente, no qual são transfectadas células humanas primárias isoladas com uma molécula de ácido nucleico ou pelo menos duas moléculas de ácido nucleico diferentes, apresentando a molécula de ácido nucleico uma sequência que permite a expressão de pelo menos um factor transformante celular e a expressão de um polipeptídeo recombinante, e caso sejam transfectadas pelo menos duas moléculas de ácido nucleico diferentes, uma primeira molécula de ácidos nucleicos apresenta uma sequência que permite a expressão de pelo menos um factor transformante celular e uma segunda molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência que 12 permite a expressão de pelo menos um polipeptídeo recombinante.

As células humanas primárias utilizadas no processo da presente invenção são obtidas por colheita directa do organismo ou um tecido colhido do organismos e são cultivadas. De preferência, estas células humanas primárias, que podem ser facilmente convertidas em linhas de células humanas permanentes mediante expressão com factores transformantes celulares, são especialmente amniócitos.

Os factores transformantes celulares podem antigénio T de SV40 (N°. Acesso Genbank J02400), produto genético E6 e E7 de HPV (por exemplo, HPV16, N° . Acesso Genbank K02718) e produto genético EIA e E1B de adenovirus humanos (por exemplo serotipo adenovirus humano 5, N°. Acesso Genbank X02996) . Caso forem utilizadas sequências de ácidos nucleicos para o produto genético E6 e E7 no processo de acordo com a presente invenção, as células humanas primárias têm de ser transfectadas com as sequências para ambos os produtos genéticos. Caso forem utilizadas sequências de ácidos nucleicos para o produto genético EIA e E1B no processo de acordo com a presente invenção, as células humanas primárias têm de ser transfectadas com as sequências para ambos os produtos genéticos. Durante a expressão com um HPV natural podem ser expressos E6 e E7 de uma transcrição ARN. 0 mesmo se aplica para a expressão de EIA e E1B de um adenovirus natural Os factores transformantes celulares como por exemplo a função genética EI adenoviral provocam a imortalização ou a transformação e portanto a possibilidade de cultura duradoura das células. Células humanas primárias não-transfectadas morrem naturalmente na cultura o mais tardar passadas algumas semanas, enquanto as células transfectadas, devido ao efeito imortalizante, por exemplo produto genético El, se desenvolvem até se tornarem colónias de células com fenotipo identificável. A transferência dos factores transformantes celulares essencial para a imortalização das células assume assim, no processo de acordo com a presente invenção, a função de um marcador de selecção, que permite o isolamento das linhas de células sem pressão de selecção química externa adicional, linhas essas que exprimem um ou 13 vários polipeptídeos recombinantes diferentes. A presente invenção refere-se assim especialmente a um processo para a preparação de uma linha de células humana permanente sem transfecção de um marcador de selecção.

As sequências de ácidos nucleicos para a expressão dos factores transformantes celulares encontram-se sob a forma de cassetes de expressão.

As cassetes de expressão podem conter promotores homólogos ou sequências de terminação da transcrição, por exemplo o promotor EIA natural e os locais de poliadenilação EIA naturais para a expressão da função genética EIA adenoviral. Esta operação pode ser atingida contendo as moléculas de ácido nucleico utilizadas na transfecção fragmentos do respectivo genoma virai, por exemplo do genoma adenoviral com as funções genéticas mencionadas, por exemplo EIA, E1B. As cassetes de expressão para os factores transformantes celulares podem também conter promotores heterólogos que não ocorrem naturalmente com a região codificadora utilizada ou sequências de terminação transcricionais. Servem de promotores heterólogos por exemplo o promotor CMV (citomegalovirus) (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdão, 2003), Promotor EF-Ια- (Kim et al., Gene 91:217-223, 1990), Promotor CAG (um promotor hibrido do Immediate Early-Enhancer do citomegalovirus humano e um promotor Huhn β-actina com primeiro intrão) (Niwa et al., Gene 108:193-199,1991), Promotor humano ou murino pgk- (fosfoglicerato quinase) (Adra et al., Gene 60:65-74, 1987), Promotor RSV (Vírus Sarcoma Rous) (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdão, 2003) ou Promotor SV40 (Vírus Simian 40) 14 (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdão, 2003) . Podem servir de locais de poliadenilação, por exemplo as sequências de poliadenilação do antigénio T grande de SV40 (N° acesso Genbank J02400) ou do gene G-CSF (factor estimulante do crescimento da colónia de granulócitos, granulocyte colony stimulating factor) (Mizushima e Na-gata, Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990) Do mesmo modo, algumas das cassetes de expressão podem conter o elemento regulador homólogo dos factores transformantes e outros elementos reguladores heterólogos. Deste modo, por exemplo a cassete de expressão EIA pode apresentar um promotor heterólogo, a cassete de expressão E1B pode apresentar um promotor homólogo ou vice-versa ou ambas as cassetes de expressão podem conter um promotor heterólogo.

Também as sequências de ácidos nucleicos para a expressão de pelo menos um polipeptídeo recombinante se encontram em pelo menos uma cassete de expressão, correspondendo o tipo e a selecção dos promotores e as sequências de terminação transcricionais aos factores transformantes celulares anteriormente mencionados.

As sequências de ácidos nucleicos dos factores transformantes celulares e do polipeptídeo recombinante, incluindo o elemento regulador específico podem encontrar-se numa ou várias moléculas de ácidos nucleicos diferentes.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, as sequências dos factores transformantes celulares, incluindo os respectivos elementos reguladores, por exemplo as funções genéticas E6 e E7 ou as funções genéticas EIA e E1B ou o factor transformante celular, por exemplo o antigénio T de SV40, encontram-se numa molécula de ácidos nucleicos e as sequências do polipeptídeo recombinante, incluindo o elemento regulador encontram-se numa segunda molécula de ácidos nucleicos diferente da primeira molécula de ácidos nucleicos. 15

Numa outra forma de realização preferida, as sequências dos factores transformantes E6 e E7 ou EIA e E1B, incluindo respectivos elementos reguladores, encontram-se também em diferentes moléculas de ácidos nucleicos. A sequência do polipeptídeo recombinante, incluindo os elementos reguladores, pode encontrar-se neste caso numa terceira molécula de ácido nucleico diferente da primeira e segunda molécula de ácido nucleico ou na primeira ou segunda molécula de ácido nucleico contendo a sequência de um dos factores transformantes celulares.

Numa forma de realização preferida, as células humanas primárias são transfectadas com uma primeira molécula de ácido nucleico, contendo a cassete de expressão das funções genéticas EIA e E1B e uma segunda molécula de ácido nucleico diferente da primeira molécula de ácido nucleico que apresenta a cassete de expressão do polipeptídeo recombinante. Nesta forma de realização, a primeira molécula de ácido nucleico contém a cassete de expressão EIA contendo um promotor heterólogo e o elemento de terminação da transcrição e a unidade da transcrição E1B contém o promotor homólogo e o elemento de terminação da transcrição homólogo. Numa forma de realização especialmente preferida, a primeira molécula de ácido nucleico contém a sequência de nucleótidos do serotipo 5 do adenovírus do nucleótido 505 ao nucleótido 4079. Numa outra forma de realização especialmente preferida, a primeira molécula de ácido nucleico contém a sequência de nucleótidos do serotipo 5 do adenovírus do nucleótido 505 ao nucleótido 3522. Numa outra forma de realização especialmente preferida, a primeira molécula de ácido nucleico contém a sequência de nucleótidos do serotipo 5 do adenovírus do nucleótido 1 ao nucleótido 4344, correspondendo ao ADN adenoviral nas células HEK293 (Louis et al., Virology 233:423-429, 1997).. 16 A presença do promotor próprio E1B e da sequência de poliadenilação própria E1B (Nucl. 4037-4070) deverá conduzir a uma transcrição e expressão óptima de E1B nesta forma de realização. Uma outra vantagem reside no facto de a porção de sequência entre o codão de paragem de para ligação El do local de poliadenilação de E1B conter a função genética pIX adenoviral. O polipeptídeo pIX, uma proteina estrutural virai, actua como activador da transcrição em vários promotores virais e celulares, como por exemplo o promotor timidina quinase e o promotor beta-globina. O efeito activador da transcrição do polipeptídeo pIX expresso na célula pode conduzir, nas linhas celulares produtoras de acordo com a presente invenção, a um aumento das taxas de expressão do polipeptídeo recombinante no caso de a sequência codificadora do polipeptídeo recombinante estas sob o controlo de um dos promotores anteriormente mencionados.

Os polipeptídeos recombinantes podem ser proteínas terapêuticas como por exemplo antitripsina alfa 1 ou factores do crescimento como eritropoietina ou interleuquina 2. A antitripsina alfa 1 (hAAT) é um inibidor da proteinase, que inibe elastase e outras proteinases e no caso de deficiência congénita de hAAT, que provoca graves lesões nos pulmões e fígado, é terapeuticamente eficaz. No caso da eritropoietina, é um importante factor de crescimento para eritrócitos (glóbulos vermelhos), eficaz como eritropoiético em caso de anemia bem como em doentes sujeitos a transplantes. A interleuquina-2 (II-2) conta-se entre os mensageiros celulares do sistema imunitário e reveste-se de grande significado no caso da activação da resposta imunitária celular, por exemplo no caso de tumor. 17

Entre os polipeptídeos terapeuticamente eficazes contam-se também factores de coagulação do sangue, como por exemplo o factor VIII e o factor IX, aplicado em doentes hemofílicos com transtornos da coagulação. 0 polipeptídeo recombinante do processo de acordo com a presente invenção pode ser uma hormona. Hormonas preparados por meios biotecnológicos são aplicadas em terapias de substituição no caso de doentes com transtornos hormonais. Constituem exemplos a hormona insulina de controlo do nivel de glicemia, da qual dependem tantos doentes com diabetes mellitus, a somatotropina (hormona do crescimento) para o tratamento do nanismo e factores gonadotrópicos tais como hormona foliculo-estimulante (FSH) ou hormona luteinisante (LH) para o tratamento de problemas de fertilidade. 0 polipeptídeo recombinante pode ser um anticorpo recombinante que pode ser aplicado com fins terapêuticos ou diagnósticos. Anticorpos contra o factor de necrose do tumor alfa (TNF-α) são aplicados em doentes com artrite reumatóide, anticorpos contra o receptor celular do factor de crescimento da epiderme (EGFR) no caso de doentes oncológicos. Os anticorpos utilizados para diagnóstico podem ser, por exemplo, componentes de conjuntos de diagnóstico comerciais, baseados em processos como ensaio imunoabsorvente com ligação enzimática (Enzymelinked Immuno Sorbent Assay, ELISA) ou radio imuno ensaio (Radio Immuno Sorbent Assay, RIA). Nestes testes, os anticorpos destinam-se a detectar os antigénios de agentes infecciosos, como por exemplo o vírus da hepatite B humana.

Os anticorpos ou imunoglobulina (Ig) são constituídos por uma cadeia pesada ou leve, que consiste em regiões ou domínios variáveis e constantes. As sequências de ácidos 18 nucleicos das moléculas de ácidos nucleicos transfectada para a expressão de um anticorpo podem conter duas cassetes de expressão diferentes, codificando uma a cadeia leve e a outra a cadeia pesada da molécula de imunoglobulina. Após expressão das duas cadeias nas células de acordo com a presente invenção estas agregam-se numa molécula de anticorpo activa. As cassetes de expressão das duas cadeias podem então encontrar-se em moléculas de ácido nucleico separadas ou na mesma molécula de ácido nucleico. As sequências codificadoras para a cadeia leve e pesada podem, porém, encontrar-se dentro da mesma cassete de expressão e ser separadas por uma sequência IRES (internai ribosome entry site, sítios de entrada de ribossoma internos), os quais proporcionam uma expressão tanto da cadeia pesada como da cadeia leve. As sequências codificadoras para as cadeias leve e pesada podem encontrar-se principalmente dentro das mesmas cassetes de expressão e ser separadas por uma sequência que codifica um sítio de clivagem enzimático para uma proteinase (por exemplo trombina) , que é então simultaneamente expressa na célula e cliva o polipeptídeo precursor da sequência de cadeia leve e sequência de cadeia pesada na cadeia live e cadeia pesada activa.

Anticorpos recombinantes codificados pela sequência de ácidos nucleicos nas células de acordo com a presente invenção podem também ser constituídos por fragmentos de um anticorpo em vez das cadeias completas leves e pesadas. Os anticorpos chamados de cadeia simples (scFv, single chain variable fragments) consistem nos domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve que são ligados por uma sequência de aminoácidos (o chamado ligante), que proporciona uma mobilidade livre de ambos os domínios. Com 19 a aglomeração intramolecular dos dois domínios é criada uma estrutura de ligação dos antigénios gue corresponde ao domínio variável de uma molécula de imunoglobulina. Anticorpos de cadeia simples biespecíficos (bis.scFv) consistem em duas disposições de cadeia simples destas dos domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que, por seu lado, interligados por uma sequência de ligação e são móveis um em relação ao outro; estas moléculas podem ligar simultaneamente a dois locais de ligação antigénicos (epítopos) e ligar assim duas estruturas moleculares não covalentes. Diabodies biespecíficos consistem em duas cadeias simples expressas em separado, que contêm domínios variáveis de uma cadeia leva e uma cadeia pesada, em separado ligados apenas por um ligante muito curto ou sem ligante. 0 ligante curto ou ausente impede a aglomeração intramolecular, a aglomeração intramolecular de um domínio pesado ou leve variável é criada uma molécula activa com duas valências de ligação-

Os polipeptídeos recombinantes codificados pelas moléculas de ácidos nucleicos transfectadas no presente processo podem ser proteínas virais, bacterianas ou parasitárias que devem ser produzidas para uma utilização como agente de inoculo (vacina) profilático ou terapêutico-Neste contexto podem ser tanto polipeptídeos estruturais como polipeptídeos activos reguladores ou enzimáticos de vírus, bactérias ou parasitas. Proteínas virais poderão ser, por exemplo antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBV Surface Antigen) ou a proteína estrutural Ll do papilomavírus humanos. As proteínas bacterianas utilizadas após a expressão nas ilhotas de células produtoras para a preparação de vacinas, são por exemplo 20

Escherichia coli (ETFC) ou proteínas de ligação da transferina (Transferrin binding proteins, Tbp A e B) de Neisseria gonorrhoeae. Polipeptídeo de parasitas gue podem ser codificados pelas moléculas de ácido nucleico transfectadas pelo presente processo são, por exemplo proteínas de superfície de merozoitos (Merozoite Surface Protein, MSP) de Malariaerregers Plasmodium falciparum ou Glutationa S-transferase (GST) de Schistosoma japonicum.

Os polipeptídeos recombinantes codificados pelas moléculas de ácido nucleico transfectadas pelo presente processo podem ser um ou vários polipeptídeos virais gue servem de factores de replicação e permitem uma replicação episomal, isto é independente dos cromossomas de moléculas de ácidos nucleicos introduzidas tardiamente, por transfecção, na linha celular, na linha celular humana. As moléculas de ácido nucleico introduzidas tardiamente na linha celular por transfecção contêm um elemento genético chamado origem da replicação (ori, "origin of replication"), ao qual liga(m) o(s) polipeptídeo(s) que actua(m) como factor de replicação e iniciam assim a replicação da molécula de ácido nucleico episomal. A replicação episomal das moléculas de ácido nucleico, em especial de ADN plasmídico, em células provoca uma intensa multiplicação do número de cópias das moléculas de ácido nucleico transfectadas e, consequentemente, um aumento da expressão de um polipeptídeo recombinante codificado nesta molécula, bem como o respectivo rendimento ao longo de muitas mitoses. O antigénio T do virus Simian 40 (SV40) constitui um factor de replicação virai destes, o qual inicia a respectiva replicação após ligação a uma sequência designada por origem de replicação SV40 (SV40 ori, origin 21 of replication) na molécula de ácido nucleico, por exemplo o ADN plasmídico. A proteína EBNA-1 do vírus Epstein-Barr (Ebstein Barr Vírus Nuclear Antigen-1) identifica uma origem de replicação indicada ori-P e catalisa a replicação extracromossomal da molécula de ácidos nucleicos possuidora de ori-P.

Os polipeptídeos recombinantes codificados pelas moléculas de ácido nucleico transfectadas pelo presente processo podem ainda ser proteínas virais que permitem uma produção de vectores de transferência genéticos virais recombinantes nas linhas celulares. Estas proteínas virais mencionadas também factores de complementação são expressas na linha celular e constituem os componentes enzimáticos ou estruturais necessários para a produção dos vectores de transferência genética, que não são codificados na molécula de ácido nucleico do vector de transferência genética. Nestes vectores de transferência genética são eliminadas várias funções Contam-se entre os vectores de transferência genética cujos factores de complementação podem ser codificados pelo processo de incorporação de transgene descrito, por exemplo os vectores à base de adenovírus, vírus associados a adenovirus (AAV) ou herpesvírus. Os factores de complementação expressos na linha celular podem também complementar vírus eliminados ou recombinantes na sua produção que não contêm um gene a transferir e portanto não mimetizam vectores de transferência genética, sendo antes utilizados por exemplo como vacina.

No caso de vectores de transferência genética à base de adenovírus é possível exprimir nas células de acordo com a presente invenção, por exemplo as funções genéticas pIX, 22 Ε2, Ε3 e/ou E4. A eliminação da função genética correspondente no genoma do vector aumenta a segurança dos vectores e aumenta a respectiva capacidade de aceitação de sequências de ácidos nucleicos estranhos. A função genética pIX é uma proteína estrutural, isto é um componente do capsídeo do vírus. As funções genéticas virais E2, E3 e E4 codificam na fase precoce da multiplicação virai polipeptideos reguladores expressos. Vectores adenovirais da primeira geração são apenas eliminados em Ei e/ou E3. Os vectores adenovirais da segunda geração não possuem ainda as funções genéticas E2 e/ou E4. Linhas celulares que complementam várias funções genéticas virais, estariam em melhor posição para complementar a geração de vectores de transferência genética designados vectores "Gutless" ou vectores adenovirais de maior capacidade que já não possuem qualquer funções genéticas codificadoras, mas apenas as sequências designadas como repetições terminais (ITRs, Inverted Terminal Repeats) para a replicação do vector-ácido nucleico

Os ácidos nucleicos transfectados para as células humanas primárias pelo presente processo podem ainda codificar um polipeptídeo receptor localizado principalmente na superfície da célula e que é responsável pela infecção das células por um vírus ou pela transdução das células por um vector de transferência genética virai. Foi identificado o receptor coxsackie e adenovírus CAR como receptor virai para a fase inicial da infecção de células com o serotipo 2 ou 5 de adenovírus, das quais a maioria do vectores adenovirais convencionais são derivados (Bergelson et al., Science 275:1320-1323, 1997). A expressão suficiente de CAR na superfície constitui um pré-requisito 23 para que uma célula seja adequada como célula produtora para vectores de transferência genética adenoviral. Numa forma de realização preferida o polipeptídeo recombinante é o receptor Coxsackie e Adenovirus (CAR). A sobreexpressão do polipeptídeo receptor pode melhorar claramente a capacidade infecciosa e a eficiência de produção destas células quanto a vectores adenovirais. Além disso, a molécula de ácido nucleico pode ainda codificar, para além de CAR, receptores secundários ou receptores de internalização, como por exemplo determinadas integrinas que promovem a penetração de vírus ou vectores de transferência genética nas células e respectiva expressão adicional durante a preparação de células produtoras para vectores adenovirais

As moléculas de ácido nucleico utilizadas no presente processo para transfecção de células humanas primárias que codificam o pelo menos um polipeptídeo recombinante ou as moléculas de ácido nucleico que codificam os factores transformantes celulares podem conter "Matrix Attachment Regions" (MARs). Estes elementos genéticos também designados "Scaffold Attachment Regions" (SARs) desempenham um papel na regulação da expressão genética, uma vez que estão associados a unidades transcricionais e elementos reguladores no genoma. MARs têm a capacidade de proteger genes estranhos introduzidos numa célula contra

Mediante transfecção simultânea de células humanas primárias com sequências de ácidos nucleicos expressáveis contendo moléculas de ácidos nucleicos para um factor transformante celular ou dois factores funcionais ligados entre si e uma sequência de ácidos nucleicos expressável de pelo menos um polipeptídeo recombinante os autores da 24 presente invenção conseguiram gerar linhas de células humanas para produção de polipeptideos recombinantes sem adição de reagentes de selecção. A presente invenção refere-se assim ainda a um processo para a preparação de uma linha de células humanas permanente para a expressão de pelo menos um polipeptídeo desejado, de preferência sem transfecção de um marcador de selecção. A presente invenção refere-se ainda às células humanas permanentes preparadas pelo processo de acordo com a presente invenção. As células podem ser empregues, entre outros fins para a produção de polipeptídeo terapêuticos, factores de coagulação do sangue e factores do crescimento, hormonas e anticorpos, bem como polipeptídeos virais, bacterianos ou parasitários para utilização como vacina. Além disso, as células de acordo com a presente invenção podem ser empregues na produção de proteínas relevantes em termos de diagnóstico, como por exemplo antigénios virais, bacterianos ou parasitários ou anticorpos específicos correspondentes. Além disso, as células de acordo com a presente invenção podem ser empregues para a produção de proteínas relevantes em termos técnicos ou industriais, por exemplo de enzimas para a catálise de processos de síntese técnicos ou para decomposição de poluentes. As células de acordo com a presente invenção podem expressar um ou mesmo vários polipeptídeos recombinantes diferentes. 0 número dos polipeptídeos que podem ser expressos depende de quantas sequências de ácidos nucleicos diferentes codificadoras dos polipeptídeos recombinantes são transfectadas nas células com o processo de acordo com a presente invenção. A intensidade da expressão de um transgene numa célula produtora depende de forma decisiva da região genómica onde 25 se integra o transgene após introdução na célula. Enquanto nalguns locais do genoma celular a expressão do transgene é desactivada passado um periodo relativamente curto, noutros locais, os chamados "Hot Spots" da transcrição, a cassete de expressão permanece durante bastante tempo activo com elevada eficiência transcricional. A manutenção do fenotipo transformado nas células permanentes preparadas de acordo com a presente invenção requer a expressão constante do factor transformante celular. Nas células humanas permanentes também o local de integração da cassete de expressão correspondente num "Hot Spot" da transcrição se encontra no genoma celular. Um outro aspecto da presente invenção refere-se assim a um processo para a preparação de uma célula humana permanente, abrangendo ainda a molécula de ácido nucleico que apresenta a sequência para o(s) factor(es) transformante(s) celular(es) as sequências de reconhecimento de uma enzima de recombinação específica da sequência. Numa etapa seguinte, é possível introduzir nas linhas de células humanas permanentes, com expressão simultânea da recombinase correspondente, mais uma cassete de expressão para um transgene, que contém igualmente uma sequência ou sequências de identificação recombinase correspondente (s) . Este facto conduz a uma integração da cassete de expressão no "Hot Spot" específico e consequentemente a uma expressão elevada muito duradoura do transgene. Do modo descrito, é possível empregar linhas de células produtoras criadas, com eficiência de produção comprovadamente elevada, para gerar células produtoras muito eficientes para um outro transgene. Um outro aspecto do presente trabalho refere-se ao isolamento destes Hot Spots específicos mediante análise da sequência dos locais 26 de integração e respectiva utilização em vectores de expressão. Assim consegue-se o isolamento de sequências Hot Spot de células humanas até hoje desconhecidas. Mediante recombinação homóloga, é possível integrar nestas sequências cassetes de expressão específicas. Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma linha de células humana permanente, apresentando ainda a molécula de ácido nucleico que possui a sequência que permite a expressão de um polipeptídeo recombinante uma ou várias sequências de identificação recombinase, por exemplo as sequências de identificação recombinase podem encontrar-se nos terminais 5' e 3' de cada sequência. Neste caso, o polipeptídeo recombinante pode ser um gene relator, isto é um gene cujo produto genético pode ser facilmente detectado e determinado quantitativamente. Depois da selecção de uma linha de células estável com expressão forte da proteína relatora, isto é do produto genético codificado pelo gene relator, é possível introduzir na célula, numa segunda fase, uma molécula de ácido nucleico abrangendo uma cassete de expressão para um outro polipeptídeo recombinante mediante transfecção. A cassete de expressão contém igualmente sequências de identificação da mesma enzima de recombinação. Depois de uma expressão rápida da recombinase, é criada uma nova linha de células produtora com uma eficiência de produção igualmente elevada mediante a excisão do original e integração do novo no polipeptídeo recombinante transfectado na célula. Este processo acelera o moroso processo de selecção de linhas de células produtoras boas expressoras. Constituem exemplos de recombinases e sequências de identificação correspondentes: 27

Cre-recombinase e sequência de identificação loxP do bacteriófago Pl, integrase e sequência de identificação attB/attP do bacteriófago OC31, ou Flp-recombinase e sequência de identificação frt de leveduras (Groth et al., PNAS 97: 5995-6000, 2000; Araki et al., Nucl. Acids Res. 25: 868-872, 1997; 0'Gorman et al., Science 251: 1351-1355, 1991). Frequentemente, não são mais vantajosas as sequências de identificação propriamente ditas para uma integração eficiente, mas sim "pseudo" lox (Araki et al., Nucl. Acids Res. 25:868-872, 1997) oder "pseudo" att (Thyagarajan et al., Mol. Cell Biol. 21: 3926-3934, 2001).

Os exemplos seguintes esclarecem a invenção e não devem ser consideradas como limitantes. Excepto em caso de indicação em contrário foram empregues os métodos padrão da biologia molecular, tal como descritos por exemplo por Sambrook et al. , 1989, Molecular cloning: A Laboratory

Manual 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. 1. Clonagem

Plasmídeo pSTK146 0 plasmídeo pSTK146 foi descrito pormenorizadamente na EP 1 230 354 Bl e abrange o promotor fosfoglicerato quinase de murino (pgk), sequências serotipo 5 de adenovírus (Ad5), nucleótidos (nt.) 505 a 3522 e o sinal de splicing e poliadenilação de SV40.

Plasmídeo pGS119 (Fig.l) O plasmídeo pGS 119 contém o promotor pgk de murino, sequências nt. Ad5 505-3522 contendo toda a região El, o 28 sinal de splicing e poliadenilação 3' de SV40 e a região pIX de Ad5 (nt. 3485-4079).

As sequências pIX Ad5 são originárias do plasmideo pXCl (Microbix Biosystems Inc, N° catálogo PD-01-03), que contêm sequências de Ad5 nt. 22-5790. Com ajuda deste plasmideo e do iniciador p9.3485-3504 (CTGGCTCGAGCTC- T AGC GAT GAAGAT ACAG; SEQ ID NO:l) e p9.4079-4060 (GCTGCTCGAGCACTTGCTTGATCCAAATCC; SEQ ID NO:2) as sequências genéticas ad5 nt 3485-4079 foram amplificadas por reacção em cadeia de polimerase (PCR) , clivadas com Xhol (cada local de clivagem Xhol localizado nos iniciadores) e introduzido no local de clivagem de pSTKl46.

Plasmideo pGS122

O plasmideo pGS122 contém sequências Ad5 bp 1-4344. Numa primeira fase isolaram-se sequências Ad5 nt 356-3826 mediante digestão com Sacll de pXCl (Microbix Biosystems Inc, Katalog-Nr. PD-01-03) e introduziram-se no local de clivagem Sacll de pSTK31 (contém um local de clivagem Pmel seguido das sequências Ad5 bp 1-440, em pBluescript). O plasmideo pGS120 criado foi linearizado com pBstEII e o fragmento BstEII de pXCl contendo as sequências Ad5 bp 1914-5185 foi introduzido (pGS121). Dois oligonucleótidos Ad5_4297-4344.PX (GC- TGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGT

AGCAAGC T GAT T GCCAGT T T AAAC; SEQ ID NO:3) e Ad5_4344-4297 (TCGAGTTT AAACTGGCAATCAGCTTGCTACTGAAAGACATTTTTAGGCACCACGCCCAGCT; SEQ ID NO:4) foram hibridados em cadeia dupla. 0 plasmideo pGS121 foi digerido com Afel e Xhol e o oligonucleót ido anteriormente mencionado foi introduzido. A sequência do oligonucleótido foi escolhida de forma a manter o local de 29 clivagem Afel no terminal 5' durante a introdução em pGS121 e no terminal 3' um local de clivagem Pmel é seguido do local de clivagem Xhol regenerado. Assim, no pGS122, as sequências Ad5 são flanqueadas directamente por cada um local de clivagem Pmel.

Plasmídeo pGS124 0 plasmídeo pGS124 contém o promotor SV40 e a sequência genética do antigénio T SV40. Mediante digestão de ADN SV40 com BamPII e Kpnl cortou-se um fragmento de 3 kb do genoma SV40 e introduziu-se em pBluescript, digestão com BamHI e Kpnl. 0 plasmideo pGS124 exprimiu assim o antigénio T SV40. plasmídeos pGS116 (Fig. 2), pGS129, pGS131, pGS132, pGS133

Os plasmídeos pGS116, pGS129, pGS131, pGS132 e pGS133 expressas a antitripsina alfa 1 humana (hAAT) sob o controlo de diferentes promotores. 0 plasmídeo pGS116 (fig. 2) contém o promotor precoce do vírus da citomegalia humana (CMV) seguido de um local dador de splicing/aceitador de splicing, do cADN hAAT e o local de poliadenilação SV40 (poliA) . As sequências CMV e SV40 são originárias do plasmídeo ρΟΜνβ (BD Clontech, Nç catálogo 6177-1). 0 gene β-galactosidase em pCMVB foi removido por digestão com Notl seguida de reacção de preenchimento da cadeia secundária 5' e substituído pelo cADN hAAT que foi isolado mediante digestão com EcoRI do plasmídeo Ad/PGK-hAAT (Kay et al., Hepatology 21:815-819, 1995) . 0 plasmídeo pGS129 contém o cADN hAAT anteriormente descrito sob o controlo do promotor humano para o factor de 30 alongamento EF-lá. Mediante digestão de pGS116 com Xhol e EcoRI seguida de reacção de preenchimento da cadeia secundária 5' removeu-se o promotor CMV de pGS116 e substituiu-se por um fragmento de 1,3 kb contendo o promotor EF-loí. O plasmídeo pGS131 contém o cADN hAAT sob o controlo de um promotor híbrido constituído pelo intensificador CMV e o promotor β-actina Huhn (promotor CAG). Mediante digestão de pGS116 com Xhol e EcoRI seguida de reacção de preenchimento da cadeia secundária 5' trocou-se o promotor CMV pelo promotor CAG 1,1. 0 plasmídeo pGS132 contém o cADN hAAT sob o controlo do promotor do sarcomavírus Roux (RSV). O promotor CAG em pGS 116 foi removido por digestão de restrição com Xhol e EcoRI seguido de reacção de preenchimento da cadeia secundária 5' e substituído pelo promotor RSV de 0,58 kb.

No plasmídeo pGS133 a expressão do cADN hAAT é controlada pelo anterior promotor do vírus Simian 40 (SV40) . Por meio de digestão com Xhol e EcoRI seguida de reacção de preenchimento da cadeia secundária 5' removeu-se o promotor CMV e substituiu-se pelo promotor SV40 de 0,23 kb.

Plasmídeo pGS126 O plasmídeo pGS126 contém os seguintes elementos: a cassete de expressão Elconstituída pelo promotor pgk, sequências Ad5 nt. 505-3522, SV40 poliA, a cassete de expressão pIX constituída por sequências Ad5 nt. 3485-4079 e a cassete de expressão hAAT constituída pelo promotor CMV, hAAT-cDNA, SV40 poliA. Mediante a digestão do plasmídeo pGS116 (vide le) com EcoRI e HindIII, seguida de 31 reacção de preenchimento isolaram-se as cassetes de expressão hAAT e introduziram-se no plasmídeo pGS119 (ver lb), após digestão com BamHI e reacção de preenchimento da cadeia secundária 5'. 0 plasmídeo pGS26 expressa assim Ad5 EI e proteína pIX e hAAT.

Plasmídeo pGS123 0 plasmídeo pGS123 contém para além da cassete de

expressão hAAT a região associada à matriz (MAR). Esta MAR está localizada num fragmento EcoRI/Spel de 2085 bp da região intrão do locus do gene para AAT humano (N° acesso GenBank K02212). Este fragmento encontra-se clonado em pBluesccript (pGS58) e foi introduzido no local de clivagem EcoRI após reacção de preenchimento da cadeia secundária 5' de pGS116 (ver le).

Plasmídeo pGS127 O plasmídeo pGS127 contém o promotor CMV, o cADN da eritropoietina humana (Epo) e a sequência poliA SV40. Com ajuda de uma digestão com Notl removeu-se o gene β-galactosidase de ρΟΜνβ e substituiu-se por Epo-cADN. 2. Verofocação da construção a) Análise da sequência A integridade de todos os plasmídeos anteriormente descritos foi verificada por digestão de restrição. Além disso, a sequência correcta do fragmento adenoviral em pGS119, pGS122 e pGS126 foi confirmada por análise da sequência, não se encontraram alterações na sequência em comparação com a sequência Ad5 de tipo selvagem. b) Expressão

Os plasmídeos pGS116, pGS129, pGS131, pGS132, pGS133, pGS123 e pGS126 foram transfectados em células HEK293 e a 32 expressão e secreção de antitripsina alfa 1 humana (hAAT foi comprovada no sobrenadante mediante ELISA (ver capítulo 6b) .

Os plasmídeos pGS119 e pGS122 foram transfectados em células HeLa e a expressão da proteína EIA foi analisada com Western Blot recorrendo a um anticorpo monoclonal (ver capítulo 6a). 0 plasmídeo pGS124 foi transfectado em células HeLa e HEK293 e a expressão do antigénio T foi analisado com Western Blot e um anticorpo monoclonal (Abcam, Cambridge, Reino Unido).

Cultura das células

Linhas de células

Os reagentes de cultura celular foram fornecidos pela empresa Invitrogen GmbH excepto quando indicado em contrário. As células HEK293 e HeLa foram cultivadas em meio de Eagle modificado (MEM) com 10% de soro de bovino fetal (FCS) , lx penicilina/estreptomicina a 37 °C, 95% de humidade e 5% de CO2.

Amniócitos primários

Os amniócitos primários foram obtidos segundo métodos de rotina, no âmbito de uma amniocentese, da seguinte forma. Desta punção obtiveram-se 1-2 ml com 5 ml de meio FIO de Ham, 10% FCS, 2% Ultroser G (CytoGen GmbH), lx antibiótico/antimicótico a 37 °C, 95% de humidade relativa e 5% C02 em placas de cultura celular primárias 6 cm (Falcon) . Passados 4 a 6 dias os amniócitos começaram a aderir e adicionaram-se 3 ml de meio fresco mas aditivos (ver acima). Assim que as células aderiram completamente 33 retirou-se o meio e substituiu-se por 5 ml de meio fresco mais aditivos. Paras as passagens seguintes lavaram-se as células confluentes com PBS, dissolveu-se com tripsina (TrypIeSelect, Invitrogen) e transferiu-se em 10 ou 25 ml de meio fresco mais aditivos em placas de 10 cm ou 15 cm.

Transfecção e Transformação de amniócitos primários

Por meio de transfecção de diferentes combinações dos plasmideos anteriormente descritos transfectaram-se amniócitos primários, isolaram-se as linhas de células transformadas e examinou-se a expressão do transgene. Seguidamente passamos a descrever a preparação de linhas de células expressoras de hAAT com ajuda do plasmideo pGS116 e pGS119 de forma detalhada. Outras linhas de células foram preparadas do mesmo modo com as seguintes combinações de ácidos nucleicos: - pSTK146 (contém sequências Ad5 nt. 505 a 3522) e pGS116 (contém a cassete de expressão CMV-hAAT) - pSTK119 (contém sequências Ad5 nt. 505 a 4079) e pGS129 (contém a cassete de expressão EF-la-hAAT) pGS 119 e CAG-hAAT) pGS131 (contém a cassete de expressão pGS 119 e RSV-hAAT) pGS132 (contém a cassete de expressão pGS 119 e SV4 0-hAAT) pGS133 (contém a cassete de expressão pGS 119 e pGS123 (contém a cassete de expressão CMV-hAAT) 34 - pSTK122 (contém sequências Ad5 nt. 1 a 4344) e pGS116 (contém a cassete de expressão CMV-hAAT) - pSTK123 (contém sequências Ad5 nt. 505 a 4079 e a cassete de expressão CMV-hAAT) - pGS119 e pGS127 (contém a cassete de expressão CMV-Epo) - pGS124 (expressa T-Ag) e pGS116

Para a transfecção foram previamente linearizados todos os plasmideos com excepção de pGS122 mediante digestão com as nucleases de restrição adequadas. O plasmídeo pGS122 foi digerido com Pmel antes da transfecção, uma vez que cada local de clivagem Pmel flanqueia as sequências adenovirais em pGS122. Se forem transfectados dois plasmideos utiliza-se 1 pg de cada plasmídeo, no caso de transfecção de apenas um plasmídeo (pGS126) utilizam-se 2 pg. Com todas as combinações de ácidos nucleicos foi possível obter clones de células transformados e isolar clones individuais bem como testá-los. O número de clones de células transformados dependia da molécula de ácido nucleico utilizada que codificava o factor transformante celular. Assim, com a utilização do plasmídeo pGS119 obteve-se de forma surpreendente e inesperada claramente mais clones de células transformados do que com pSTK146. Além disso, a transfecção com moléculas de ácido nucleico com EI como factor transformante celular conduziu claramente a mais clones de células transformados do que a transfecção com moléculas de ácido nucleico que exprimiam o antigénio T de SV40 (pGS124). A expressão do polipeptídeo recombinante dependia, uma vez mais, do promotor utilizado, produzindo a 35 utilização do promotor SV40 em pGS133 a menor taxa de expressão.

Seguidamente passamos a descrever a preparação de linhas de células expressoras de hAAT com ajuda do plasmideo pGS116 e pGS119 de forma detalhada.

Astes da transfecção adaptaram-se amniócitos faseadamente a meio Opti-Pro com 2% de Ultroser. Além disso, as células receberam sempre ao fim de 2-3 dias meio FIO de Ham fresco (com aditivos) mais meio Opti-Pro (com 2% Ultroser) numa proporção de 75:25%, 50:50% 25:75% e 0:100%.

Para a transfecção as células de uma placa de 15 cm com cerca de 80% de confluência foram distribuídas por seis placas de 6 cm, correspondendo a um número de células de 5-7xl05 células por placa. No dia seguinte, as células de 5 placas foram transfectadas com 1 pg pGS116 e pGS119 cada, ambos linearizados com Seal, recorrendo ao reagente de transfecção Effectene (qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Uma placa continuou a ser cultivada sem transfecção, como controlo. No dia seguinte, as células foram lavadas com PBS, soltas com TrypIeSelect e transferidas para uma placa de 15 cm. As células foram cultivadas durante mais 10-15 dias, sendo o meio substituído por meio fresco a cada 3-4 dias. Durante este período, a adição de Ultroser diminuiu em 1%. Passados cerca de 10-15 dias as células atingiram a confluência e foram transferidas para duas placas de 15 cm, como anteriormente descrito.

Isolamento dos clones celulares transformados

Passadas poucas semanas da transfecção, eram visíveis ilhotas de células clonais que se distinguiam claramente, 36 do ponto de vista morfológico, dos amniócitos não transformados. Estas ilhotas foram colhidas e transferidas para placas de 24 poços (corresponde à passagem 1) . As células foram deixadas multiplicar-se e foram transferidas primeiro para placas de 6 cm e depois para placas de 15 cm.

Inicialmente isolaram-se cerca de 40 clones que se distinguiram claramente em parte do ponto de vista morfológico com a continuação da cultura. Alguns destes clones revelaram uma "crise" evidente com uma cultura prolongada, isto é, mostraram um comportamento bastante instável. As experiências adicionais foram limitadas à continuação da cultura e análise de sete clones morfologicamente estáveis. Estes foram designados da seguinte forma: 2AI.2, 2AI.3, 2AI.6. 2AI.12, 2AI.15, 2AI.17, 2AI.18.

Caracterização das linhas de células

Expressão do gene EI (Western Blot) A expressão das proteínas EIA e ElB-21kD em sete linhas de células clonais foram analisadas por Western Blot, recorrendo a anticorpos monoclonais.

Além disso, aplicaram-se em placas 7xl05 células de clones individuais numa placa de 6 poços. Setenta e duas horas depois, as células foram soltas com Tris-soro fisiológico/4mM EDTA, aglomeradas, tomadas em 100 μΐ de Tris-soro fisiológico e lisadas mediante a adição de 30 μΐ 4 x SDS tampão de carga (40% glicerina, 1,4 M mercaptoetanol, 8% SDS, 250 mM Tris/HCl pH 7). Utilizou-se como controlo negativo lisado preparado com o mesmo número de amniócitos primários. Serviu de controlo positivo lisado de células HEK293. Destas misturas proteicas separaram-se 37 por electrof orese de cada 10 μΐ em SDS a 10%-gel de poliacrilamida e transferiu-se para uma membrana de nitrocelulose. As proteínas ligadas à membrana foram tornadas visíveis com um anticorpo anti-ΕΙΑ ou anti-ΕΙΒ de 21 kb (Oncogene Research) e um anticorpo acoplado a HRP anti-ratinho (EIA, Jackson ImmunoResearch Laboratories) ou anti-rato (E1B-21 kD, Oncogene Research) e subsequente incubação com quimioluminescente (ECL, Amersham). Os resultados da Western Blot com EIA e E1B encontram-se representados na fig 3 e revelam que todas as linhas de células examinadas expressam a proteína EIA (3 bandas a 30 - 50 kD) e a proteína E1B 21-kD. A expressão de hAAT (Western Blot) A expressão de hAAT foi examinada intracelularmente (nas linhas de células clonais) ou após secreção (no meio) igualmente com ajuda de análises Western Blot, recorrendo a um anticorpo monoclonal, específico de hAAT. Além disso, aplicaram-se em placas 7xl05 células de clones individuais numa placa de 6 poços. Utilizou-se como controlo negativo o mesmo número de células de um clone preparado por transfecção de amniócitos primários apenas com pGS119. Como controlo positivo utilizaram-se no teste seguinte 50 ng de hAAT purificado de plasma humano.

Setenta e duas horas depois, os sobrenadantes da cultura de células foram removidos, as células foram soltas com Tris-soro fisiológico/4mM EDTA, aglomeradas, tomadas em 100 μΐ de Tris-soro fisiológico e lisadas mediante a adição de 30 μΐ 4 x SDS tampão de carga. Para comprovar a presença de hAAT intracelular separaram-se por electroforese 10 μΐ da mistura proteica de células lisadas e tornou-se visível 38 com ajuda de um anticorpo hAAT monoclonal (ICN Biomedicals) e um anticorpo anti-cabra acoplado a HRP (Pierce) com subsequente coloração por quimioluminescência. Para comprovar a presença de hAAT segregado misturaram-se 10 μΐ do meio de cultura com 2x tampão de carga SDS por electroforese e detectou-se como anteriormente descrito. A fig 4A mostra o hAAT segregado das células no sobrenadante da cultura, a expressão intracelular de hAAT encontra-se na fig. 4B. O lisado para a verificação intracelular de hAAT encontra-se concentrado cerca de 20 vezes, ao contrário do sobrenadante da cultura de células. Quer isto dizer que hAAT é segregado com alta eficiência pelas células.

Quantidade e Estabilidade da Expressão de hAAT ao longo de várias Passagens (ELISA) A quantidade de hAAT segregado no meio foi determinado quantitativamente com ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Neste ensaio cultivaram-se em placas 7xl05 células das diferentes linhas clonais numa placa de 6 poços e passadas 72 horas removeu-se o sobrenadante da cultura de células. A quantidade de hAAT foi determinado por meio de ELISA, utilizando anticorpos anti-hAAT policlonais (não acoplados e acoplados a HRP; ICN Biomedicals) . Como controlo utilizou-se hAAT purificado de plasma humano (ICN Biomedicals) . A fig. 5A revela a quantidade de hAAT por célula, expressa na passagem 5 dos clones individuais. A estabilidade da expressão em clones seleccionados ao longo de várias passagens encontra-se representada na fig 5B. As linhas de células investigadas expressam constantemente ao 39 longo de um intervalo de tempo calculado de 20 passagens entre 0,2 e 4 pg de hAAT por célula.

Glicoanálise de hAAT

Uma vez que hAAT é um glicoproteína, investigou-se o grau de glicosilação de hAAT nos clones celulares individuais. Além disso, os clones celulares foram previamente adaptados, faseadamente, a meio Opti-Pro sem Ultroser, o que faz com que as células deixem de aderir e se desenvolvam em suspensão. Para testas se o hAAT segregado no sobrenadante foi glicosilado realizou-se uma digestão com a enzima peptideo-N-glicosidase F (PNGase F) . Esta enzima cliva resíduos de açúcar acoplados a resíduos de asparagina (N-ligados), reduzindo assim o peso molecular da proteína. A partir do sobrenadante dos clones individuais misturou-se 22,5 μΐ com 2,5 μΐ de tampão desnaturante (10 vezes: 5% SDS, 10% β-mercaptoetanol) e desnaturou-se a proteína durante 10 minutos a 100 °C. Em seguida, adicionaram-se às proteínas 3,5 μΐ de tampão de reação G7 (10 vezes: 500 mM Na-fosfato pH 7,5), 3,5 μΐ 10% NP-40 e 3 μΐ PNGase (New England Biolabs; 500 unidades/μΐ) e incubou-se durante 60 minutos a 37 °C. Como controlos, desnaturaram-se 45 ng de hAAT purificado do plasma humano em 25 μΐ de meio Opti-Pro, tal como anteriormente descrito e misturou-se com PNGase F ou H20. As modificações no peso molecular de hAAT foram depois examinadas, tal como descrito em 6b) por meio de análise Western Blot, utilizando um anticorpo monoclonais específico para hAAT. A fig. 6 mostra a alteração do peso molecular após digestão com PNGase F de hAAT, expressa em 4 clones diferentes, ou hAAT purificado de plasma humano. Estas experiências mostram claramente que o hAAT produzido nos clones individuais está glicosilado.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CEVEC Pharmaceuticals GmbH <120> Processo para a preparação de linhas de células humanas permanentes

<130> CMV-011 PCT 40 <140> desconhecido <141> 2006-11-15 <150> DE 10 2005 054 628.5 <151 : > 2005-11-16 <160> 4 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211 : >30 <212> ADN <213> Sequência artif icial <220> <223> Iniciador oligonucleótido <400> 1

ctggctcgag ctctagcgat gaagatacag 30 <210> 2 <211 >30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleótido <400>2 gctgctcgag cacttgcttg atccaaatcc 30 <210> 3 <211 >56 41

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleótido <400>3 gctgggcgtg gtgcctaaaa atgtctttca gtagcaagct gattgccagt ttaaac 56 <210> 4 <211> 61

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleótido <400>4 tcgagtttaa actggcaatc agcttgetac tgaaagacat ttttaggcac cacgcccagc 60 t 61 42

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista dos documentos apresentados pelo requerente destina-se exclusivamente à informação do leitor e não é parte integrante do documento da patente europeia. Embora elaborada com grande cuidado, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição EP 833934 BI [0007] EP 1230354 BI [0007] [0045] DE 102005054628 [0072]

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Lisboa 29/07/2010

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de uma linha de células humanas permanente em que amniócitos isolados com (i) uma molécula de ácido nucleico ou (ii) pelo menos duas moléculas de ácido nucleico diferentes são transfectadas simultaneamente, e caso uma molécula de ácido nucleico seja transfectada, a molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência que permite a expressão de EIA e E1B de adenovirus humano e a expressão de um polipeptídeo recombinante, e caso pelo menos duas das moléculas de ácido nucleico diferentes sejam transferidas, uma primeira molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência que permite a expressão de EIA e E1B de adenovirus humano e uma segunda molécula de ácido nucleico apresenta uma sequência que permite a expressão de pelo menos um polipeptídeo recombinante.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de EIA e E1B de adenovirus humanos inclui os nucleótidos 1 a 4344, 505 a 3522 ou os nucleótidos 505 a 4079 do serotipo 5 do adenovirus humano.

3. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o polipeptídeo recombinante é uma hormona, um factor da coagulação sanguínea, um factor de crescimento, os receptores do vírus Coxsackie e adenovirus (CAR), um anticorpo, um antigénio virai, bacteriano ou parasitário ou factores complementares para a preparação de vírus recombinantes.

4. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que as sequências de EIA se encontram 2 numa molécula de ácido nucleico e as sequências de E1B se encontram numa outra molécula de ácido nucleico.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que as sequências para o polipeptídeo recombinante se encontram numa das duas moléculas de ácido nucleico para EIA e E1B.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que a sequência permite a expressão de EIA e E1B ou de um polipeptídeo recombinante, um promotor heterólogo e/ou um elemento de terminação da transcrição heterólogo.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o promotor é o promotor CMV (citomegalovírus), promotor EF-Ια, promotor CAG, promotor pgk humano ou murino, promotor RSV ou promotor SV40 e o elemento de terminação da transcrição é as sequências de poliadenilação do antigénio T grande SV40 ou gene G-CSF humano.

8. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que a sequência que permite a expressão do polipeptídeo recombinante contém sequências de identificação para recombinases que flanqueiam a sequência codificadora do polipeptídeo recombinante ou a cassete de expressão completa do polipeptídeo recombinante.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que as sequências de identificação são sequências loxP-, attB/attP- ou Frt.

10. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que as moléculas de ácido nucleico transfectadas não apresentam sequências codificadoras de um marcador de selecção. 3

11. Linhas de células humanas permanentes, obtidas segundo um processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, sendo o processo efectuado sem transfecção de um marcador de selecção.

12. Utilização das linhas de células de acordo com a reivindicação 11 para a preparação de um polipeptideo.

13. Utilização das linhas de células de acordo com a reivindicação 11 para a preparação de vectores virais para transferência genética. Lisboa 29/07/2010 1/6 Fig. 1

PROMOTOR pgk 2/6 Fig. 2 Qíli#

sy^o?1

ίδ* HM nn w ui no W 0 ui N 0 UiQ N IS) W UI NO ^ 0 Ul N 0 UIO

—hÂAT 50 ng 5/6 Fig. 5

-0-2AJ.1 2AI.6 —A— 2A1.12 —·— 2 AI, 18 -O- 2 AI. 15 assagem 6/6 Fig.6