CN101310014A - 制备永久人细胞系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备永久人细胞系的方法，其中用允许至少一种细胞转化因子表达的序列和允许至少一种重组多肽表达的序列同时转染分离的原代人细胞。

Description

制备永久人细胞系的方法

本发明涉及一种制备永久人细胞系的方法，其中用允许至少一种细胞转化因子表达的序列和允许至少一种重组多肽表达的序列同时转染分离的原代人细胞。

用于治疗、诊断或技术目的的重组多肽在细胞培养(体外)中的制备，通常在稳定、持久或永久性建立的、其中编码所述多肽的核酸整合到细胞染色体DNA中的细胞系(所谓生产细胞系)中实施。这些生产细胞系尤其必须展现两种特征性质：首先，它们必须持久(永久性)地在细胞培养中生长并且能够增殖，其次，它们必须表达编码期望多肽的基因，而该多肽随后能够从细胞或者从培养上清液中分离。除了细菌之外，特别地，使用酵母和植物细胞、动物细胞来制备重组多肽。当前全部治疗用蛋白质中大约60-70％是在哺乳动物细胞中制备的(Wurm，Nat.Biotechnology 22，1393-1398，2004)。生产细胞的制备通常开始于已经被永生化或转化，在细胞培养中永久生长和增殖的细胞系，例如来源于动物的CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、NS0(小鼠骨髓瘤)细胞或人HEK293(人胚胎肾)细胞或PER.C6细胞。这些细胞系同时已经商品化，它们是从原代细胞通过培养生成的，实质上是作为通过遗传操作的生产细胞建立方法的第一步；或者是从自然肿瘤分离的。

在产生实际的生产细胞的情况下，一方面，通过转染将编码重组多肽的核酸(所谓转基因)与必要的转录调控元件一同转移到这些已经建立的细胞系中，另一方面，转移第二表达盒，该表达盒具有编码选择标记的基因，其基因产物为细胞提供特定的选择优势。基因转移后在没有选择试剂的培养基中培育细胞数天，然后给培养基提供合适的选择试剂。在选择试剂的存在下，只有摄取了用于转染的核酸并表达选择标记的细胞方可生存和生长。常用的选择标记有新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和二氢叶酸还原酶(DHFR)(Wurm，Nat.Biotechnology 22：1393-1398，2004；Wurm and Jordan，309-333 in：Makrides(Eds.)，Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells，Elsevier，Amsterdam，2003)。相应地分别在含有选择试剂，例如新霉素或潮霉素等抗生素，和含有合成糖皮质素甲氨蝶呤的培养基中进行选择。对于经过选择过程后存活并增殖的、具有选择标记和转基因的细胞(即所谓转化体)，一般随后加以个体化(individualised)(克隆)以保证培养物中所有的细胞是遗传上同一的，并将具有最佳产率的期望生产细胞系与生产力较差的细胞系分开。

取决于制备过程，可能不但在选择期中，而且在后来克隆细胞的生长过程中均必须向培养基中加入选择试剂，以保证生产细胞系的遗传稳定性。期望多肽的基因(转基因)和选择标记的基因通常整合到细胞基因组的相同位点中。如果在随后的细胞扩增中或制备期中没有选择压力，则会发生细胞丧失选择标记-也随之丧失期望多肽的转基因-的危险。通过持续添加选择试剂来防止这种危险。

从生物体或组织取出后投入细胞培养的原代动物和人细胞通常只能短期生长并经过少数几次传代。人细胞特别适于制备人生物治疗剂，因为与其它生物哺乳动物或动物细胞相反，它们可表达具有真实的翻译后修饰模式的复杂多肽。与在非人生产系统中生产相比，在使用人细胞生产的情况下，复杂的重组蛋白的糖基化模式(即分子内糖残基的结构和构象)会更好地重现真实人多肽的模式。该糖基化模式在很多时候对于多肽的重要性质例如生物学活性、稳定性、溶解性和免疫原性而言具有决定性的重要性。

从患者的肿瘤组织分离了可用于表达重组多肽的、持久建立的人细胞系(永久人细胞系)(例如HeLa细胞)。但是，出于安全性相关的考虑，同时由于它们的遗传不稳定性，这样的细胞不适合应用于人体的治疗用多肽的工业生产。除了极少的例外(例如所谓HaCaT细胞)，自发永生化的人细胞系事实上是不可得到的。相反，用特定病毒基因产物转化原代组织而产生的永久人细胞系则适用于生物技术生产的目的。通过表达DNA病毒的转化性多肽，可以将原代细胞转化为永久生长的细胞。转化的机制需要病毒编码的基因产物与在细胞分裂调控中起作用的细胞蛋白(所谓肿瘤抑制基因产物)相互作用。由此，细胞周期的停滞(G0/G1期)被打断，细胞进入S期，导致细胞的失控增殖(Helt&Falloway，Carcinogenesis 24：159-169，2003)。此类具转化性的、由病毒编码的基因产物的例子有猿猴病毒40(SV40)的T抗原、人乳头瘤病毒(HPV)的E6/E7或者腺病毒的E1A/E1B。这些病毒蛋白质的转化机制是类似的：T抗原、E6和E1A使细胞视网膜母细胞瘤蛋白家族(pRb)的基因产物失活，T抗原、E7和E1B使细胞肿瘤抑制蛋白p53失活(zurHausen，J.Natl.Cancer Inst，92，690-698，2000；Ludlow，FASEB J.7：866-871，1993；Moran，FASEB J.7，880-885，1993的综述)。如此转化的这些细胞系变得可以永久培养，特别适用于生物技术生产目的。

迄今为止只有极少数人细胞类型已被腺病毒E1基因区域所转化。其中包括人胚胎肾组织的神经元细胞(HEK293)(Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59-74，1977)、人胚胎视网膜细胞(EP 833 934 B1)和人羊水细胞(EP 1 230354 B1)。

上述分别基于现有永生化细胞系和转化细胞系的生产细胞系制备方法从不同方面带来了缺陷。在制备之前，在选择期间，可能还在扩增期间向培养基添加抗生素、化疗剂或其它选择试剂，会增加制备方法的成本。除此之外，还需要在分析制备过程中进行繁重的分析工作，并对终产物进行分析，来确保和证实经过纯化和调制(confectioned)的终产物没有保留任何残余的选择试剂。这就对质量控制提出了进一步的要求，以保证治疗用制剂的安全性。另外，一些已被应用的选择试剂分别对生产细胞的质量和克隆稳定性显示影响。例如，在一些生产细胞系中，向培养物中连续添加甲氨蝶呤作为选择试剂，可以使细胞在其生产能力上维持被施予的“稳定”表型。但是，遗传分析已经显示，这种试剂的存在可增加细胞的细胞遗传异质性，这是人们所不希望的，尤其是对于认证过程的监管要求而言(Wurm etal.，Dev.Biol.Stand.76：69-82，1992；Kim and Lee，Biotechnol.Bioeng.64：741-749，1999)。经典的生产细胞系产生方法的另一个缺陷体现在这一事实，作为生成方法的基础的现有永久性起始细胞系的选择是极为有限的(例如CHO，BHK，HEK293)。所有这些细胞在被开发成生产细胞系之前都已经历多年培养和无数次传代并被保存。这些操作总是带有这样的危险，即除了最初永生化必需的遗传改变之外还积累其它染色体异常和遗传修饰，使它们越来越不像各自的“天然”动物和人起始细胞。这些变化对于重组蛋白基因工程的安全性相关和/或生产技术方面可能造成的后果至今还没有得到详细的分析。

因此，作为本发明基础的问题是提供一种更简单、更划算，并且在毒性方面更为安全的方法，来制备用于生产重组多肽的永久人细胞系。

该问题通过专利权利要求中定义的主题来解决。

下面的附图说明了本发明。

图1示意性地显示用于表达E1基因功能及腺病毒血清型5病毒结构蛋白pIX的质粒pGS119之组成(assembly)。

图2示意性地显示用于在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下表达人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)cDNA的质粒pGS 116之组成。

图3显示在7种不同的基于羊水细胞的人α1-抗胰蛋白酶永久性生产细胞系中针对Ad5 E1A和E1B蛋白表达的Western印迹结果。

图4显示在7种不同的基于羊水细胞的永久性生产细胞系中针对人α1-抗胰蛋白酶蛋白(hAAT)表达的Western印迹结果。A，从细胞分泌到培养上清液中的hAAT；B，细胞内的hAAT。

图5示意性地显示培养上清液中由选定的生产细胞系所表达的人α1-抗胰蛋白酶蛋白(hAAT)的量(ELISA，酶联免疫吸附测定)。A，各个细胞克隆第5代中的hAAT的量；B，选定的细胞克隆中经过数次传代的稳定性。

图6显示针对来自基于羊水细胞的生产细胞系的人α1-抗胰蛋白酶蛋白的糖基化的Western印迹分析结果。

本文所用的术语“羊水细胞”以最广泛的意义涉及存在于羊水(amnioticliquor)中，并可通过羊膜腔穿刺术(amniocentesis)获得的所有细胞。它们或者来源于羊膜，或者来自与羊水接触的胎儿组织。已经描述了可以根据形态学标准加以区分的三类主要的羊水细胞：成纤维细胞样细胞(F细胞)、上皮样细胞(E细胞)和羊膜液细胞(AF细胞)(Hohn et al.，Pediat.Res.8：746-754，1974)。AF细胞是主要的细胞类型。来自羊膜腔穿刺(例如为细胞遗传学诊断而进行的)的细胞可充当羊水细胞的来源。此外，对于妊娠中采取的羊膜腔穿刺的细胞，如果羊水的量高于平均(羊水过多(polyhydramnion，hydramnios))，可以作为羊水细胞的来源。

术语“表达盒”，具体地分别涉及这样的核酸分子和核酸分子之区域，其分别含有：位于编码区域之前的调控元件或者启动子、编码区域和可读框、和位于编码区域之后的转录终止元件。分别位于编码区域之前的调控元件和启动子可以是组成型的，即为永久性地活化转录的启动子(例如CMV启动子)，或者为可调控的启动子，即可以被开启和/或关闭的启动子(例如四环素可调控的启动子)。表达盒的编码序列可以是连续的可读框，如同5’端具有起始密码子、3’端具有终止密码子的cDNA那样。编码区域可以由编码外显子及间插的非编码内含子的基因组排列或者新组合的排列所构成。但是，表达盒的编码区域可以由数个可读框构成，它们之间由所谓IRE(内部核糖体进入位点)隔开。

术语“永久细胞系”(permanent cell lines)，如本文所用的，涉及以这样的方式被遗传修饰，使其可以在细胞培养中于稳定的培养条件下永久持续生长的细胞。这样的细胞又称为永生化(immotalized)细胞。

术语“多肽”或者“重组多肽”，如本文所用的，涉及由至少2个氨基酸组成的肽。多肽可以受到共翻译修饰和/或后翻译修饰，例如通过附接糖残基或通过修饰氨基酸残基而修饰。多肽可以是线性、环状或分枝的。另外，多肽可由多于一条氨基酸链组成，其中这些链可以通过分子内和/或分子间键而形成或多或少的复杂三维结构(例如二级、三级、四级结构)。如果多肽是由一条氨基酸链构成的，它也可以通过分子内键形成或多或少的复杂三维结构。多肽可以是药理学或免疫学活性的多肽，或者是用于诊断目的的多肽。

术语“原代细胞”，如本文所用的，涉及通过直接从生物体或组织移出并置于培养中而获得的细胞。原代细胞仅显示很有限的寿命。原代细胞可以是例如羊水细胞、神经元细胞或视网膜细胞。

术语“生产细胞系”(production cell lines)，如本文所用的，涉及通过导入编码待生产的期望多肽的转基因而被遗传修饰的永久细胞系。

术语“选择标记”(selection marker)，如本文所用的，涉及为细胞提供在选择条件下生长的优势的遗传标记。所述的选择条件可以是，例如，培养基中化学治疗剂或抗生素或者其它细胞毒性物质或生长干扰物质的存在。常用的选择标记是新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和二氢叶酸还原酶。

术语“转染”(transfection)，如本文所用的，涉及任何适于将述及的核酸导入细胞中的方法。作为例子，包括经典的磷酸钙法、电穿孔、任何类型的脂质体系统，以及这些方法的组合。

术语“转基因”，如本文所用的，涉及编码重组多肽的核酸序列。

本发明的一个方面涉及一种制备永久人细胞系的方法，其中用一种核酸分子或者至少两种不同的核酸分子转染分离的原代人细胞，并且在转染一种核酸分子的情况下，核酸分子显示允许至少一种细胞转化因子表达和重组多肽表达的序列；在转染至少两种不同核酸分子的情况下，第一种核酸分子显示允许至少一种细胞转化因子表达的序列，第二种核酸分子显示允许至少一种重组多肽表达的序列。

通过直接从生物体或者分离自生物体的组织移出而获得用于本发明方法的原代人细胞，并投入培养。优选的是可通过细胞转化因子的表达而良好地转化为永久人细胞系的原代人细胞，尤其是羊水细胞、胚胎视网膜细胞和神经元来源的胚胎细胞。

细胞转化因子可以是SV40的T抗原(GeneBank登录号J02400)、HPV的E6和E7基因产物(例如HPV16，GeneBank登录号K02718)、和人腺病毒的E1A和E1B基因产物(例如人腺病毒血清型5，GeneBank登录号X02996)。如果本发明的方法使用E6和E7基因产物的核酸序列，则必须用这两种基因产物的序列转染原代人细胞。如果本发明的方法使用E1A和E1B基因产物的核酸序列，则必须用这两种基因产物的序列转染原代人细胞。在通过天然存在的HPV来进行表达的场合，可以从RNA转录本表达E6和E7。对于通过天然存在的腺病毒表达E1A和E1B也是如此。细胞转化因子(例如腺病毒E1基因功能)导致细胞的永生化或者转化，从而导致它们可持久培养的能力。未转染的原代人细胞在培养中至少经数周后即自然死亡，而转染的细胞则由于永生化活性(例如E1基因产物的永生化活性)而扩增成为表型上可识别的细胞集落。于是，在本发明方法中，细胞转化因子的转移(这种转移对细胞的永生化是至关重要的)就担负了选择标记的功能，该选择标记使得人们能够在没有任何附加的外源化学选择压力的条件下分离细胞系，其中所述细胞系表达一种或多种不同的重组多肽。因此，本发明特别地涉及无需转染选择标记的永久人细胞系制备方法。

用于表达细胞转化因子的核酸序列以表达盒的形式存在。

表达盒可分别含有同源启动子和转录终止序列，例如用于表达腺病毒E1A基因功能的天然E1A启动子和天然E1A聚腺苷酸化位点。如果转染所用的核酸分子含有各自病毒基因组的片段，例如显示所述基因功能的腺病毒基因组的片段，例如E1A、E1B，这是可以实现的。细胞转化因子的表达盒还可含有不与所用编码区或者转录终止序列一起天然存在的异源启动子。可作为异源启动子的有，例如：CMV(巨细胞病毒)启动子(Makrides，9-26in：Makrides(Eds.)，Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells，Elsevier，Amsterdam，2003)、EF-1启动子(Kim et al.，Gene 91：217-223，1990)、CAG启动子(来自人巨细胞病毒立即早期增强子及具有第一内含子的修饰的鸡β肌动蛋白启动子的杂合启动子)(Niwa et al.，Gene 108：193-199，1991)、人或鼠pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子(Adra et al.，Gene 60：65-74，1987)、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子(Makrides，9-26 in：Makrides(Eds.)，Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells，Elsevier，Amsterdam，2003)或者SV40(猿猴病毒40)启动子(Makrides，9-26 in：Makrides(Eds.)，Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells，Elsevier，Amsterdam，2003)。可作为聚腺苷酸化位点的有，例如：SV40大T抗原(GeneBank登录号J02400)的聚腺苷酸化位点或者人G-CSF(粒细胞集落刺激因子)基因的聚腺苷酸化位点(Mizushima and Nagata，Nucl.Acids Res.18：5322，1990)。同样地，有些表达盒可含有用于转化因子的同源调控元件及其它异源调节元件。即，E1A表达盒可以例如显示异源启动子，而E1B表达盒可显示同源启动子，或者相反；或者两个表达盒均显示异源启动子。

用于表达至少一种重组多肽的核酸序列也存在于至少一种表达盒中，其中启动子和转录终止序列的种类和选择与上述用于细胞转化因子的那些对应。

细胞转化因子和重组多肽的核酸序列，包括各自的调控元件，可以存在于一个核酸分子上或者数个不同的核酸分子上。在本发明一个优选的实施方案中，包括各自调控元件的细胞转化因子的序列，例如E6和E7基因功能或者E1A和E1B基因功能，或者细胞转化因子例如SV40的T抗原的序列，存在于一个核酸分子上，而包括调控元件的重组多肽的序列存在于不同于前一核酸分子的第二个核酸分子上。在另一个优选的实施方案中，细胞转化因子E6与E7，以及E1A与E1B的序列，包括其各自的调控元件，存在于不同的核酸分子上。在此情况下，包括调控元件的重组多肽序列可以存在于不同于上述第一个和第二个核酸分子的第三个核酸分子上，或者可以存在于第一个或第二个核酸分子上，构成(comprising)所述细胞转化因子之一的序列。在一个优选的实施方案中，用含有E1A和E1B基因功能之表达盒的第一种核酸分子和显示重组多肽之表达盒的第二种核酸分子转染原代人细胞，其中第二种核酸分子不同于第一种核酸分子。在这个实施方案中，第一种核酸分子含有E1A表达盒，该表达盒含有异源启动子和同源转录终止元件；而E1B转录单元含有同源启动子和同源转录终止元件。在一个特别优选的实施方案中，第一种核酸分子含有从核苷酸505到核苷酸4079的腺病毒血清型5核苷酸序列。在另一个特别优选的实施方案中，第一种核酸分子含有从核苷酸505到核苷酸3522的腺病毒血清型5核苷酸序列。在另一个特别优选的实施方案中，第一种核酸分子含有从核苷酸1到核苷酸4344的腺病毒血清型5核苷酸序列，对应于HEK293细胞的腺病毒DNA(Louis et al.，Virology 233：423-429，1997)。

在这个实施方式的情况下，E1B启动子和E1B聚腺苷酸化序列(核苷酸4037-4070)的存在可能导致E1B的最优转录和表达。另一个优势在于E1B终止密码子和E1B聚腺苷酸化位点之间的序列区域含有腺病毒pIX基因功能。pIX多肽是一种病毒结构蛋白质，它在不同的病毒和细胞启动子(例如胸苷激酶和β-珠蛋白启动子)上充当转录活化物。如果重组多肽的编码序列处于上面提到的启动子之一的控制下，则细胞中附加表达的pIX多肽的转录活化效应可导致本发明的生产细胞系中重组多肽的表达率(expressionrates)增加。

重组多肽可以是治疗用蛋白，例如人α1抗胰蛋白酶或者生长因子例如红细胞生成素或白细胞介素-2。人α1抗胰蛋白酶(hAAT)是一种蛋白酶抑制剂，它抑制弹性蛋白酶和其它蛋白酶，在导致严重肺和肝损害的遗传性hAAT缺陷中具有治疗活性。红细胞生成素是红细胞(红血球)的重要生长因子，在贫血的场合以及移植患者的场合具有成血(blood forming)活性。白细胞介素-2(Il-2)是免疫系统的一种细胞信使，在细胞免疫应答活化的场合，例如在肿瘤疾病的情况下，其具有显著的重要性。凝血因子，例如治疗具有凝血障碍的血友病患者时使用的因子VIII和IX，也属于治疗活性多肽。根据本发明方法的重组多肽可以是激素。在具有激素性病症的患者的场合，在替代疗法中使用生物技术工程化的激素。例子有：降低血糖的激素胰岛素，许多糖尿病患者依赖于该激素；用于治疗侏儒症的促生长素(somatotropin，growth hormone)，和用于治疗生育障碍的促性腺因子(gonadotrope factors)例如促卵泡激素(FSH)或黄体化激素(LSH)。

重组多肽可以是重组抗体，其可用于治疗或诊断目的。针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的抗体用于类风湿性关节炎患者的场合，针对表皮生长因子细胞受体(EGFR)的抗体用于癌症患者的场合。用于诊断目的的抗体可以是，例如，基于酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫吸附测定(RIA)等方法的商品化诊断试剂盒的组成部分。在这些试验测定法中，抗体用于检测感染原例如人乙型肝炎病毒的抗原。

抗体或者免疫球蛋白(Ig)由重链和轻链构成，重链和轻链各自由可变和恒定区或域构成。用于表达抗体的转染核酸分子的核酸序列可含有两个分别的(separated)表达盒，其中一个编码免疫球蛋白的轻链，另一个编码免疫球蛋白的重链。在本发明的抗体中表达两条链时，这些链组装成活性抗体分子。两条链的表达盒可存在于分别的核酸分子或者相同的核酸分子上。不过，轻链和重链的编码序列可以存在于同一表达盒内并由IRES序列(内部核糖体进入位点)所分隔，该IRES序列可用于实现重链和轻链的同时表达。轻链和重链的编码序列在大体上(in principle)还可以存在于同一表达盒内并由编码蛋白酶(例如凝血酶)酶切位点的序列分隔，所述蛋白酶同时在细胞中表达，将由重链和轻链的序列构成的前体多肽切割成活性的轻链和重链。

由本发明细胞的核酸序列编码的重组抗体还可以由抗体片段，而不是完整的轻链和重链所构成。所谓单链抗体(scFv，单链可变片段)是由一个重链可变域、一个轻链可变域、以及连接这两个域并为它们提供自由运动性的氨基酸序列(所谓“接头”)所构成。这两个域的分子内组装形成抗原结合结构，该结构对应于免疫球蛋白分子的可变区。双特异性单链抗体(bis-scFv)由两个这样的单链组装体构成，组装体由重链和轻链的可变域组成，这些可变域通过连接序列连结并且可以彼此相对运动；这样的分子可以同时结合两个抗原结合位点(表位)从而以非共价方式连接两个分子结构。双特异性双抗体由分别表达的两条单链构成，每条单链由轻链可变域和重链可变域构成，轻链可变域和重链可变域仅由非常短的接头分隔开或者根本没有接头。短接头或者缺少接头抑制分子内组装；通过重链可变域和轻链可变域的分子内组装再一次形成具有两个结合价的活性分子。

在本发明方法中转染的核酸分子所编码的重组多肽可以是要制备用作预防性或治疗性疫苗的病毒蛋白、细菌蛋白或者寄生虫蛋白。这些蛋白可以是来自病毒、细菌或寄生虫的结构性多肽和调控性多肽或酶活性多肽。病毒蛋白可以是，例如，乙肝病毒表面抗原(HBV表面抗原)或者来自人乳头瘤病毒的结构性蛋白L1。考虑在生产细胞系中表达后用于生产疫苗的细菌蛋白有，例如，来自产肠毒素性(enterotoxinogeneous)大肠杆菌(Escherichiacoli)的肠毒素亚单位(ETEC)或来自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的运铁蛋白结合蛋白(Tbp A和B)。来自寄生虫的多肽(这些多肽可以被本发明方法中转染的核酸分子所编码)有例如疟疾致病原恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的裂殖子表面蛋白(MSP)，或者来自日本血吸虫(Schistosomajaponicum)的谷胱甘肽S转移酶(GST)。

本发明方法中转染的核酸分子所编码的重组多肽可以是一种或多种这样的病毒多肽：它们具有复制因子活性，使得随后通过转染导入人细胞系中的核酸分子能够在该细胞系中进行附加型复制，即独立于染色体的复制。随后通过转染导入细胞系中的核酸分子含有称为“复制起点”(ori)的基因元件，充当复制因子的多肽结合该元件，从而起始附加型核酸分子的复制。核酸分子，尤其是质粒DNA在细胞中的附加型复制导致被转移的核酸分子的拷贝数激增，从而增加由该分子编码的重组多肽的表达及其在多次细胞分裂中的维持。这样的病毒复制因子是，例如，猿猴病毒40(SV40)的T抗原，它在结合于核酸分子(例如质粒DNA)上称作SV40复制起点(SV40 ori)的序列时，起始其复制。Epstein-Barr病毒蛋白EBNA-1(Epstein-Barr病毒核抗原-1)识别称为ori-P的复制起点，并催化携带ori-P的核酸分子的染色体外复制。

本发明的方法中转染的核酸分子所编码的重组多肽也可以是用于在细胞系中产生重组病毒基因转移载体的病毒蛋白。这些病毒蛋白，又称为互补因子(complementation factors)，在细胞系中被表达，并且是产生基因转移载体所必需的酶组分或结构组分，这些组分没有被编码在基因转移载体的核酸分子上。在这样的基因转移载体中，往往出于安全考虑而删除某些病毒基因功能。基因转移载体的互补因子可以由通过上述方法导入的转基因所编码；基因转移载体的例子有基于腺病毒、腺伴随病毒(AAV)或者疱疹病毒的载体。细胞系中表达的互补因子还可以在缺失病毒或重组病毒的产生过程中补全这些病毒，这些病毒不含有要转移的基因，因此不充当基因转移载体，而是用作例如疫苗。

在基于腺病毒的基因转移载体的场合，例如基因功能pIX、E2、E3和/或E4可以在本发明的细胞中表达。从载体基因组删除上述各基因功能可提高载体的安全性，并提高其摄取不相关的核酸序列的能力。基因功能pIX是一种腺病毒结构蛋白，即病毒核壳的组分。病毒基因功能E2、E3和E4编码调控性多肽，这些多肽在病毒复制的早期阶段中被表达。第一代的腺病毒载体仅仅删除了E1和/或E3。第二代的腺病毒载体还缺少基因功能E2和/或E4。补全所有病毒基因功能的细胞系大体上可具有补全被称为“无内容”(gutless)载体或称高容量腺病毒载体的一代腺病毒基因转移载体的能力，这些载体不再含有任何编码基因功能，而只具有用于载体核酸复制的序列，这样的序列称为反向末端重复(ITR)。

通过本发明的方法转染到原代人细胞的核酸可以进一步编码受体多肽，该多肽尤其定位于细胞表面，分别负责病毒对细胞的感染和病毒基因转移载体对细胞的转导。作为以腺病毒血清型2或5(最常规的腺病毒载体衍生自这两种血清型)感染细胞的最初步骤所用的病毒受体，鉴定了所谓柯萨奇病毒和腺病毒受体(Coxsackie and adenovirus receptor)，即CAR(Bergelson et al.，Science 275：1320-1323，1997)。CAR在表面上的足量表达是细胞适合用作腺病毒基因转移载体生产细胞的先决条件。在一个优选的实施方案中，重组多肽是柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)。受体多肽的过度表达能够显著改善可感染性(infectibility)，从而显著提高这些细胞对腺病毒载体的生产效率。此外，核酸分子除了CAR之外，还可以编码次级受体(secondary receptors)或者内在化受体(internalizing receptors)，例如某些整联蛋白，它们分别介导细胞对病毒和基因转移载体的摄入，它们的额外表达对于制备腺病毒载体的生产细胞是有利的。

本发明的方法中用于转染原代人细胞的核酸分子(这些核酸分子编码至少一种重组多肽)，或者编码细胞转化因子的核酸分子，可以含有“基质附着区”(matrix attachment regions，MAR)。这些基因元件又称“支架附着区”(scaffold attachment regions，SAR)，在基因表达的调控中起作用，因为它们与基因组中的转录单位和调控元件相关。MAR能够保护整合到细胞中的外来基因不受转染细胞内的转录沉默(muting)或转录关闭(shut-off)的作用，从而提高它们的表达(Girod and Mermod，p.359-379，in S.C.Makrides(Eds.)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.2003.Elsevier，Amsterdam)。

通过以含有如下所述的核酸序列的核酸分子同时转染原代人细胞，发明人成功地制成了用于在不添加选择试剂的情况下生产重组多肽的永久人细胞系，其中所述核酸序列分别是：细胞转化因子和两个功能上关联的因子的可表达核酸序列，以及至少一种重组多肽的可表达核酸序列。由此，本发明进一步涉及一种制备用于表达至少一种期望多肽的永久细胞系的方法，优选不转染选择标记。所述细胞可用于制备治疗用多肽、凝血因子和生长因子、激素和抗体，以及供用作疫苗的病毒多肽、细菌多肽或寄生虫多肽，及其它。另外，根据本发明的细胞可用于制备诊断上有意义的蛋白质，例如病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原或它们各自的特异性抗体。另外，本发明的细胞可用于生产技术上或工业上有意义的蛋白质，例如用于催化技术合成过程或者降解有害物质的酶。本发明的细胞可表达一种或者多种不同的重组多肽。可表达的多肽数目取决于使用本发明方法转染到细胞中的编码重组多肽的不同核酸序列有多少。

生产细胞中转基因表达的强度，关键取决于转基因导入细胞后所整合到的基因组中的区域。  虽然在细胞基因组的某些位点上，转基因的表达在相对较短的时间后即被关闭，但在另一些位点，即所谓转录“热点”(hot spots)上，表达盒在长时间内保持高效率的转录活性。为了维持根据本发明制备的永久细胞中的转化表型，要求细胞转化因子的持续表达。因此，在永久人细胞中，各个表达盒的整合位点处于细胞基因组中的“热点”上。由此，本发明的另外一个方面涉及一种制备永久人细胞的方法，其中，显示细胞转化因子序列的核酸分子进一步包含序列特异性重组酶的识别序列。在后续的步骤中，可以将另外的转基因表达盒整合到永久人细胞系中，而同时表达特定的(respective)重组酶，其中该表达盒还含有一个或多个特定(respective)重组酶识别序列。由此使得该表达盒整合到特定的“热点”中，从而使转基因得以持久高表达。通过所述方式制备的、具有确定的高生产效率的生产细胞系，可以用来快速生成用于另一种转基因的高效生产细胞。本发明的另一个方面涉及通过对整合位点的序列分析来分离这些特定的“热点”，以及它们在表达载体中的用途。藉此可以从人细胞中分离迄今未知的热点序列。可以通过同源重组将特定表达盒整合到这些序列中。

本发明的另一个方面涉及一种制备永久人细胞系的方法，其中展示允许重组多肽表达之序列的核酸分子，除了该重组多肽的表达盒或者该重组多肽的编码序列之外，还显示一个或多个重组酶识别序列。例如，重组酶识别序列可以位于特定(respective)序列的5’末端和3’末端。在此情况下，重组多肽可以是报道基因，即具有易于识别和定量测定的基因表达产物的基因。选择具有报道蛋白(即报道基因编码的基因产物)强表达的稳定细胞系之后，可以通过作为另一步骤的转染将包含另一重组多肽表达盒的核酸分子整合到细胞中。该表达盒也含有同一重组酶的识别序列。在短期表达重组酶后，通过原重组多肽的切除及新转染到细胞中的重组多肽的整合，将生成亦具有高生产效率的新生产细胞系。这种方法缩短了筛选良好表达的细胞系的耗时过程。重组酶及其各自的识别序列例子有：来自噬菌体P1的Cre重组酶和loxP识别序列、来自噬菌体φC31的整合酶和attB/attP识别序列、或来自酵母的Flp重组酶和frt识别序列(Groth et al.，PNAS 97：5995-6000，2000；Araki et al.，Nucl.Acids Res.25：868-872，1997；O′Gorman et al.，Science251：1351-1355，1991)。很多时候，“伪”lox(Araki et al.，Nucl.Acids Res.25：868-872，1997)或“伪”att(Thyagarajan et al.，Mol.Cell Biol.21：3926-3934，2001)而非真实识别序列，对于高效整合是有利的。

下面的实施例举例说明了本发明，不应视为限制性。除非另外指出，使用标准的分子方法，例如Sambrook et al.，1989，Molecular cloning：ALaboratory Manual，2.Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York.中描述的方法。

1.克隆方法

a)质粒pSTK146

质粒pSTK146在EP 1 230 354 B1有详细描述，包含鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子，腺病毒血清型5(Ad5)序列核苷酸(nt.)505至3522，和SV40的剪接和聚腺苷酸化信号。

b)质粒pGS119(图1)

质粒pGS119含有鼠pgk启动子、含有整个E1区的Ad5序列nt.505-3522，SV40的3’剪接和聚腺苷酸化信号，和Ad5的pIX区(nt.3485-4079)。

Ad5 pIX基因序列来自含有Ad5序列nt.22-5790的质粒pXC1(MicrobixBiosystems Inc，Catalogue No.PD-01-03)。使用该质粒和引物p9.3485-3504(CTGGCTCGAGCTCTAGCGATGAAGATACAG；SEQ ID NO：1)和p9.4079-4060(GCTGCTCGAGCACTTGCTTGATCCAAATCC；SEQ ID NO：2)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增Ad5基因序列nt.3485-4079，用XhoI切割(每个引物含有一个XhoI限制位点)，并导入pSTK146的XhoI限制位点。

c)质粒pGS122

质粒pGS122含有Ad5序列bp 1-4344。在第一个步骤中，利用SacII消化从pXC 1(Microbix Biosystems Inc，Catalogue No.PD-01-03)分离Ad5序列nt.356-3826，并导入pSTK31的SacII限制位点(含有PmeI限制位点，后续pBluescript中的Ad5序列bp 1-400)。将如此产生的质粒pGS 120用BstEII线性化，然后导入含有Ad5序列bp 1914-5185的来自pXC1的BstEII片段(pGS121)。将两个寡核苷酸：Ad5_4297-4344.PX(GCTGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGTTTAAAC；SEQ ID NO：3)和Ad5_4344-4297(TCGAGTTTAAACTGGCAATCAGCTTGCTACTGAAAGACATTTTTAGGCACCACGCCCAGCT；SEQ ID NO：4)杂交形成双链。用AfeI和XhoI消化质粒pGS121，并将上述寡核苷酸导入。所述寡核苷酸序列的选择使得导入pGS131时5’末端的AfeI限制位点被保留，而在3’末端PmeI限制位点之后跟随再生的XhoI限制位点。这样，pGS122中的Ad5序列就直接侧翼邻接着一个PmeI限制位点。

d)质粒pGS124

质粒pGS124含有SV40启动子和SV40 T抗原的基因序列。通过用BamHI和KpnI消化SV40 DNA，从SV40基因组切出一个3kb片段并将其导入经BamHI和KpnI消化的pBluescript。这样，质粒pGS124表达SV40 T抗原。

e)质粒pGS116(图2)，pGS129，pGS131，pGS132，pGS133

质粒pGS116、pGS129、pGS131、pGS132和pGS133在不同启动子控制下表达人α1抗胰蛋白酶(hAAT)。

质粒pGS116(图2)含有人巨细胞病毒(CMV)早期启动子，后随SV40剪接供体/剪接受体位点，hAAT-cDNA和SV40聚腺苷酸化位点(polyA)。CMV和SV40序列来自质粒pCMVβ(BD Clontech，Catalogue No.6177-1)。通过NotI消化然后进行5’突出端填平反应来删除pCMVβ中的β-半乳糖苷酶基因并代之以hAAT cDNA，该hAAT cDNA是从质粒Ad/PGK-hAAT(Kay et al.，Hepatology 21：815-819，1995)通过EcoRI消化而分离的。

质粒pGS129含有处于人延伸因子EF-1α启动子控制之下的上述hAATcDNA。通过XhoI和EcoRI消化pGS116然后进行5’突出端填平反应来删除pGS116中的CMV启动子并代之以含EF-1α启动子的1.3kb片段。

质粒pGS131含有在由CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子构成的杂合启动子(CAG启动子)控制下的hAAT cDNA。通过用XhoI和EcoRI消化，随后进行5’填平反应，用1.1kb CAG启动子取代CMV启动子。

质粒pGS 132含有在劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子控制下的hAAT cDNA。通过用XhoI和EcoRI消化随后进行5’突出端填平反应删除pGS116中的CAG启动子，并代之以0.58kb RSV启动子。

在质粒pGS 133中，hAAT cDNA的表达受猿猴病毒40(SV40)早期启动子的控制。通过用XhoI和EcoRI消化，随后进行5’突出端填平反应，删除pGS116中的CMV启动子并代之以0.23kb SV40启动子。

f)质粒pGS126

质粒pGS126含有下列元件：由pkg启动子、Ad5序列nt.505-3522、SV40 polyA组成的E1表达盒，由Ad5序列nt.3485-4079组成的pIX表达盒，和由CMV启动子、hAAT cDNA、SV40 polyA组成的hAAT表达盒。通过用EcoRI和HindIII消化pGS116(见1e)然后进行填平反应分离hAAT表达盒，并导入经过BamHI消化和5’突出端填平反应的质粒pGS119(见1b)中。由此，质粒pGS126表达Ad5 E1和pIX蛋白及hAAT。

g)质粒pGS123

质粒pGS123除了hAAT表达盒外，还含有基质相关区(matrix associatedregion，MAR)。该MAR定位于来自人AAT基因座位的内含子区域的2085bp的EcoRI/SpeI片段(GenBank登录号K02212)中。该片段克隆在pBluescript中(pGS58)，并在pGS116 5’突出端填平反应后将其导入EcoRI限制位点中(见1e)。

h)质粒pGS127

质粒pGS 127含有CMV启动子、人红细胞生成素(Epo)cDNA和SV40polyA序列。通过NotI消化从pCMVβ去除β半乳糖苷酶基因并代之以EpocDNA。

2.构建体的验证

a)序列分析

通过限制消化检验上述所有质粒的完整性。此外，通过序列分析证实了pGS119、pGS122和pGS126中腺病毒片段的正确序列；未发现序列相比于Ad5野生型有所改变。

b)表达

将质粒pGS116、pGS129、pGS131、pGS132、pGS133、pGS123和pGS126转染到HEK293细胞中，并利用ELISA(见6b章)检测人α1抗胰蛋白酶(hAAT)的表达和向培养上清液中的分泌。

将质粒pGS119和pGS122转染到HeLa细胞中，使用单克隆抗体进行Western印迹来分析E1A蛋白的表达。

将质粒pGS124转染到HeLa和HEK293细胞中，使用Western印迹和单克隆抗体(Abcam，Cambridge，UK)来检测T抗原的表达。

3.细胞培养

a)细胞系

除非另有说明，细胞培养试剂获自Invitrogen GmbH公司。HEK293和HeLa细胞在含10％胎牛血清(FCS)、1x青霉素/链霉素的改进的Eagle’sMedium(MEM)中于37℃、95％湿度和5％CO₂的条件下培养。

b)原代羊水细胞

在羊膜穿刺术中根据常规方法获得原代羊水细胞。将这样的羊膜穿刺液(puncture)1-2ml用5ml Ham氏F10培养基、10％FCS、2％Ultroser G(CytoGen GmbH)、1x抗生素/抗真菌剂在37℃、95％湿度和5％CO2的条件下于6cm Primaria细胞培养皿(Falcon)中培养。4-6天后羊膜细胞开始贴壁，添加3ml含添加剂(如上)的新鲜培养基。一旦细胞完全贴壁，即除去培养基并换成5ml加添加剂的新鲜培养基。对于进一步的传代，将汇合的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶(TrypleSelect，Invitrogen)解离，分别转入10和25ml的加有添加剂的新鲜培养基中，分别加入10和25cm皿中。

4.原代羊水细胞的转染和转化

通过转染不同组合的上述质粒来转染原代羊水细胞，分离转化的细胞系并分析其转基因的表达。下面，详细描述使用质粒pGS116和pGS119产生hAAT表达细胞系。以同样方式使用下面的核酸组合产生了其它细胞系：

-pSTK146(含有Ad5序列nt.505-3522)和pGS116(含有CMV-hAAT表达盒)

-pGS119(含有Ad5序列nt.505-4079)和pGS129(含有EF1α hAAT表达盒)

-pGS119和pGS131(含有CAG hAAT表达盒)

-pGS119和pGS32(含有RSV hAAT表达盒)

-pGS119和pGS133(含有SV40 hAAT表达盒)

-pGS119和pGS123(含有CMV hAAT表达盒和MAR序列)

-pGS122(含有Ad5序列nt.1-4344)和pGS116(CMV hAAT表达盒)

-pGS126(含有Ad5序列nt.505-4079和CMV hAAT表达盒)

-pGS119和pGS127(含有CMV-Epo表达盒)

-pGS124(表达T-Ag)和pGS116

为了转染，在转染之前通过用合适的限制性核酸酶消化将除pGS122之外的所有质粒线性化。在转染前用PmeI消化质粒pGS112，因为pGS112中的腺病毒序列分别侧翼邻接一个PmeI限制位点。当转染两种质粒时，每种质粒使用1μg；当只用一种质粒(pGS126)转染时，使用2μg。用所有核酸组合均可以获得转化细胞克隆，并且可以分离和测试单克隆。转化细胞克隆的数目依赖于所用的编码细胞转化因子的核酸分子。因此，使用质粒pGS119时获得的转化细胞克隆令人惊讶且出人意料地显著多于使用pSTK146时获得的转化细胞克隆。此外，使用具有E1作为细胞转化因子的核酸分子进行转化导致转化细胞克隆显著多于用表达SV40 T抗原(pGS124)转染所得的转化细胞克隆。重组多肽的表达则依赖于所用的启动子，其中pGS133中使用SV40导致最低的表达率。

下面，详细描述使用质粒pGS116和pGS119生成表达hAAT的细胞系。

转染之前，使羊水细胞适应于含2％Ultroser的Opti-Pro培养基。为此目的，每2-3天以75∶25％、50∶50％、25∶75％和0∶100％向细胞添加新鲜Ham氏F10培养基(含添加剂)+Opti-Pro培养基(含2％Ultroser)。

对于转染，将一个大约80％汇合的15cm培养皿的细胞分配到6cm培养皿上，相应于每个培养皿5-7×10⁵个细胞的细胞数。第二天，使用转染试剂Effectene(Qiagen)，根据制造商的规程，用1μg的pGS116和pGS119(均经过ScaI线性化)转染5个培养皿上的细胞。对一个培养皿不进行转染，培养用作对照。次日，用PBS洗涤细胞，用TrypleSelect将细胞解离，并转移到15cm培养皿中。将细胞再培养10-15天，其中每3-4天用新鲜培养基更换培养基。在此过程中，Ultroser的添加减少到1％。大约10-15天后，细胞汇合，将它们转移到15cm培养皿中，如上所述。

5.转化细胞克隆的分离

转染后数周，可观察到克隆细胞岛(clonal cell islands)，这些细胞在形态上显著不同于未转化的羊水细胞。挑取这些细胞岛并转移到24孔培养皿上(对应于第1代)。进一步增殖细胞，并将它们先转移到6cm培养皿中，而后转移到15cm培养皿中。

最初，有大约40个克隆被分离，在进一步培养中，它们部分地在形态上彼此显著不同。这些克隆中有一些在长期培养的情况下表现出显著的“危机”，即它们的生长非常不稳定。进一步的实验限于对7个形态上稳定的细胞克隆的进一步培养和分析。这些克隆命名如下：2AI.2、2AI.3、2AI.6、2AI.12、2AI.15、2AI.17、2AI.18。

6.细胞系的表征

a)E1基因的表达(Western印迹)

使用单克隆抗体进行Western印迹分析，在7个克隆细胞系中检测了E1A和E1B 21kD蛋白质的表达。

为此目的，将每个细胞克隆的7×10⁵个细胞各自铺在6孔培养皿上。72小时后，用Tris-盐水/4mM EDTA解离细胞，离心沉淀，重悬在100μl Tris-盐水中，并添加30μl 4x SDS上样缓冲液(40％甘油、1.4M巯基乙醇、8％SDS、250mM Tris/HCl pH 7)加以裂解。作为阴性对照，使用由同样数目的原代羊水细胞制备的裂解物。以HEK293细胞的裂解物作为阳性对照。将这些蛋白质混合物各自取10μl在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。通过分别与抗E1A和抗E1B 21kD抗体(Oncogene Research)一起温育，并分别与HRP偶联的抗小鼠抗体(E1A，Jackson Immunoresearch Laboratories)及抗大鼠抗体(E1B 21kD，OncogeneResearch)一起温育，然后再温育，利用化学发光(ECL，Amersham)使膜结合蛋白可视化。E1A和E1B的Western印迹结果示于图3，其显示，所有被检细胞系均表达E1A蛋白(30-50kD的三个条带)和E1B 21kD蛋白。

b)hAAT表达(Western印迹)

分别在细胞内(克隆细胞系中)和分泌后(培养基中)检测hAAT的表达，检测方式也是使用单克隆hAAT特异性抗体进行Western印迹分析。为此目的，将单个细胞克隆的7×10⁵个细胞分别铺在6孔培养皿上。作为阴性对照，使用相同细胞数的仅用pGS119转染原代羊水细胞而生成的细胞克隆。作为后续测定中的阳性对照，使用50ng来自人血浆的纯化hAAT。

72小时后，除去细胞培养上清液，用Tris-盐水/4mM EDTA解离细胞，离心沉淀，重悬于100μl Tris-盐水中，并加入30μl 4x SDS上样缓冲液加以裂解。为检测细胞内hAAT，取裂解细胞的蛋白混合物10μl加以电泳分离，并利用单克隆hAAT抗体(ICN Biomedicals)和HRP偶联的抗山羊抗体(Pierce)及随后进行化学发光染色来可视化。为检测分泌的hAAT，用10μl细胞培养基添加2x SDS上样缓冲液，电泳分离，并如上所述检测。

图4A显示从细胞分泌到培养上清中的hAAT，hAAT的细胞内表达示于图4B。用于hAAT细胞内检测的裂解物相对于细胞培养上清浓缩了大约20倍。这意味着细胞以很高的效率分泌hAAT。

c)在数次传代中hAAT表达的量和稳定性

使用ELISA(酶联免疫吸附反应)方法定量测定分泌到培养基中的hAAT的量。为此目的，将不同克隆细胞系的7×10⁵个细胞分别铺到6孔培养皿中，72小时后除去细胞培养上清液。使用多克隆抗hAAT抗体(未偶联的或者偶联HRP的，ICN Biomedicals)进行ELISA来确定hAAT的量。使用从人血浆纯化的hAAT(ICN Biomedicals)作为对照。图5A显示各个细胞克隆的第5代中表达的每个细胞的hAAT量。图5B显示了选定细胞克隆中表达在数次传代中的稳定性。受检细胞系在大约20代的测试时间段内恒定地每个细胞表达0.2至4pg。

d)hAAT的糖分析(glyco-analysis)

由于hAAT是糖蛋白，考察了各个细胞系中hAAT的糖基化程度。为此目的，预先将细胞克隆逐步适应于不含Ultroser的Opti-Pro培养基中，结果使得细胞不再贴壁而是悬浮生长。为了测试分泌到培养上清液中的hAAT是否为糖基化的，用肽-N-糖苷酶F(PNGase F)酶进行消化。这种酶切去附接于天冬酰胺残基的(N连接的)糖残基，使得蛋白质的分子量减少。取各个细胞克隆的细胞培养上清液22.5μl，加入2.5μl致变性缓冲液(10倍：5％SDS、10％β-巯基乙醇)，100℃ 10分钟使蛋白变性。然后，向蛋白中加入3.5μl G7反应缓冲液(10倍：500mM磷酸钠pH 7.5)、3.5μl 10％NP-40和3μl PNGase F(New England Biolabs；500单位/μl)，在37℃温育60分钟。作为对照，在每种情况下，分别将45ng的来自人血浆的纯化hAAT在25μlOpti-Pro培养基中如上述方式变性，并添加PNAase F和H₂O。随后，通过使用单克隆hAAT特异性抗体进行Western印迹分析，如6b)所述方式检测hAAT分子量的变化。图6分别显示在4种不同细胞克隆中表达的hAAT，以及从人血浆纯化的hAAT经过PNGase F消化后分子量的变化。这些实验清楚地显示，这些单个细胞克隆中合成的hAAT是糖基化的。

<110>塞维克制药有限责任公司(CEVEC Pharmaceuticals GmbH)

<120>制备永久人细胞系的方法

<130>CEV-011

<140>未知

<141>2005-11-16

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>1

ctggctcgag ctctagcgat gaagatacag                30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>2

gctgctcgag cacttgcttg atccaaatcc                30

<210>3

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>3

gctgggcgtg gtgcctaaaa atgtctttca gtagcaagct gattgccagt ttaaac        56

<210>4

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>4

tcgagtttaa actggcaatc agcttgctac tgaaagacat ttttaggcac cacgcccagc    60

t                                                                    61

Claims (15)

1.一种制备永久人细胞系的方法，其中用一种核酸分子或至少两种不同核酸分子转染分离的原代人细胞，并且在转染一种核酸分子的情况下，该核酸分子显示允许至少一种细胞转化因子表达及重组多肽表达的序列；而在转染至少两种不同核酸分子的情况下，第一种核酸分子显示允许至少一种细胞转化因子表达的序列，第二种核酸分子显示允许至少一种重组多肽表达的序列。

2.权利要求1的方法，其中所述原代人细胞是羊水细胞、胚胎视网膜细胞和源自神经元的胚胎细胞。

3.前述任一权利要求的方法，其中所述细胞转化因子是来自SV40的T抗原、来自HPV的E6和E7或者来自人腺病毒的E1A和E1B。

4.权利要求3的方法，其中来自人腺病毒的E1A和E1B的序列包括人腺病毒血清型5的核苷酸1-4344、505-3522或核苷酸505-4079。

5.前述任一权利要求的方法，其中所述重组多肽是：激素；凝血因子；生长因子；柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)；抗体；病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原；或用于产生重组病毒的互补因子。

6.前述任一权利要求的方法，其中，在细胞转化因子是来自HPV的E6和E7的情况下，E6的序列存在于一个核酸分子上，E7的序列存在于另一个不同的核酸分子上；而在细胞转化因子是来自人腺病毒的E1A和E1B的情况下，E1A的序列存在于一个核酸分子上，E1B的序列存在于另一个不同的核酸分子上。

7.权利要求6的方法，其中重组多肽的序列存在于细胞转化因子的两个核酸分子之一上。

8.前述任一权利要求的方法，其中允许细胞转化因子或重组多肽表达的序列显示异源启动子和/或异源转录终止元件。

9.权利要求8的方法，其中所述启动子是CMV(巨细胞病毒)启动子、EF-1α启动子、CAG启动子、人或鼠pgk启动子、RSV启动子或SV40启动子；所述转录终止元件是SV40大T抗原的聚腺苷酸化序列或者人G-CSF基因的聚腺苷酸化序列。

10.前述任一权利要求的方法，其中允许重组多肽表达的序列含有重组酶识别序列，所述识别序列位于所述重组多肽的编码序列或者所述重组多肽的全表达盒的侧翼。

11.权利要求10的方法，其中所述识别序列是loxP、attB/attP或Frt序列。

12.前述任一权利要求的方法，其中所述被转染的核酸分子不显示编码选择标记的序列。

13.能够根据权利要求1-12任一项的方法得到的永久人细胞系。

14.权利要求13的细胞系用于制备多肽的用途。

14.权利要求13的细胞系用于制备病毒基因转移载体的用途。

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