CN101792776B

CN101792776B - 一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途

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Publication number: CN101792776B
Application number: CN2009100457143A
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 周向军; 张琪; 彭新荣; 李琳芳; 吴孟超
Original assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd; Oriental Hepatobiliary Surgery Hospital Second Military Medical University Of Chinese Pla
Current assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd; Oriental Hepatobiliary Surgery Hospital Second Military Medical University Of Chinese Pla
Priority date: 2009-02-01
Filing date: 2009-02-01
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2029-02-01
Also published as: CN101792776A

Abstract

本发明提供一类用于诱导多能性干细胞(iPS cell)的重组腺病毒载体及其诱导多能性干细胞的方法。该类重组腺病毒载体的特征在于该重组腺病毒载体中的纤毛头基因是B亚群腺病毒纤毛头基因，且其中同时可操作地连接有Sox2和Oct4基因表达盒。在体外感染哺乳动物特别是人的终末分化细胞或成体干细胞，异位表达OCT4和SOX2，同时在调节表观遗传的小分子药物的协同作用下高效快速的将其诱导为多能性干细胞，人多能性干细胞可用于细胞替代疗法治疗疾病，其他哺乳动物多能性干细胞可用于制备转基因动物和动物疾病模型。

Description

一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途

发明领域

本发明涉及基因工程和干细胞学领域技术。尤其是涉及一种带修饰的腺病毒载体和目的基因表达盒的重组腺病毒，该重组腺病毒能诱导哺乳类动物细胞为多能性干细胞(induced pluripotent stemcell)。

背景技术

胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cell)来自发育到囊胚阶段的胚胎的内细胞团，是一组具有自我复制能力(self-renewing)的全能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。胚胎干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。人胚胎干细胞最为深远的潜在用途可能是生产细胞和组织，胚胎干细胞经刺激后可发展为特化的细胞，通过细胞替代疗法治疗许多疾病，例如帕金森氏病、Alzheimer’s病(痴呆症)、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎等。

尽管人胚胎干细胞有着巨大的医学应用潜力，由于人胚胎干细胞来自人胚胎，所以其研究不可避免地引发伦理道德问题以及各种争议。这些问题主要包括人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德，应用潜力是否会引起伦理及法律问题。

1996年7月5日出生的“多莉”羊是首例克隆成功的哺乳动物，证明高度分化的体细胞具有遗传的全能性，可以逆转到没有分化的状态，并成功发育成个体。重新编程的可行性为人类研究多能干细胞而不涉及伦理道德问题提供了一种思路。

诱导多能干细胞

日本京都大学的Yamanaka等研究发现利用逆转录病毒将c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2这4个转录因子基因整合入小鼠成纤维细胞可以获得成体细胞诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cell)，即多能性干细胞。这类细胞类似胚胎干细胞，具有胚胎干细胞的很多生理生化特性，例如，可以在体外快速增殖并稳定传代；并可持续表达胚胎干细胞的标志蛋白Oct4，Sox2，SSEA-1和Nanog；持续具有碱性磷酸酶活性；裸鼠皮下注射有成瘤性；体内体外分化实验证明可分化为三胚层；小鼠和大鼠的多能性干细胞还可获得嵌合鼠等。继小鼠之后，用逆转录病毒将c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2这4个转录因子基因整合入人成纤维细胞可以获得人的iPS细胞。与此同时，用慢病毒将Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因整合入人成纤维细胞也获得了多能性干细胞。

从高度分化的体细胞诱导产生多能性干细胞，有广泛的应用前景，例如，多能性干细胞可以用于建立体外疾病模型，进行药物筛选和细胞替代疗法等，而且，将体细胞转化为有胚胎干细胞特性的细胞系后，那么一种高度分化的体细胞就可可能转变为另一种高度分化的体细胞。以往可以通过体细胞核移植对体细胞进行去分化，或者通过与胚胎细胞融合的方式对体细胞进行重编程。但这两种方法都面临着伦理道德，技术瓶颈，效率低下等诸多难题。

因为多能性干细胞的研究有可能避免诸多的伦理问题，因此，全世界许多实验室也投入了iPS细胞的研究工作，并且成功将多种细胞诱导为多能性干细胞，如成纤维细胞、终末期分化的淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞和属于成体干细胞的神经干细胞。诱导多能性干细胞所使用的基因也从最初的四个减为三个(Oct4+Sox2+Klf4或Oct4+Sox2+Nanog或Oct4+Sox2+Esrrb)或两个(Oct4+Sox2或Oct4+Klf4)。

虽然这项研究有着极为诱人的前景，要使其成为现实，尚有许多工作和技术挑战等着我们去解决。首先在诱导方法上，诱导多能性干细胞多用的是逆转录病毒和慢病毒载体，然而逆转录病毒和慢病毒载体避免不了外源基因的整合。这种整合使转录因子在细胞内长期表达，会引起细胞突变和癌变的风险，阻碍了多能性干细胞在临床上的应用。

诱导多能性干细胞还可以用腺病毒作为载体。腺病毒是一种双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛(Fiber)以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用(Gall JG等，J Virol.1998Dec；72：10260-4；Sakurai F等，Curr Gene Ther.2007Aug；7：229-38)。

腺病毒与其它载体相比，具有如下优势：(1)腺病毒的36kb双链DNA易于以基因重组技术操作；(2)腺病毒可有效转导分裂期和非分裂期细胞，并指导高水平的蛋白质表达；(3)在细胞中以游离状态存在，不整合到靶细胞基因组，不会引起插入突变，无致癌性；(4)感染范围广，可感染不同类型细胞，包括上皮、成纤维、内皮、基质细胞，这些细胞来源可以是人、灵长类、其他哺乳类及啮齿类动物；(5)滴度高(可以达到10¹²VP/ml)，稳定性好，储藏和运送方便，易于进行规模化生产和运输。

诱导多能干细胞转录因子

在诱导多能性干细胞所选用的基因中，Oct4(Octamer-4)是POU家族的转录因子，是植入前胚胎发育的重要调节因子，是哺乳动物多能性细胞维持多能状态的关键调控因子，是细胞多能性的标志，该基因的序列可以获自GenBANK NM_002701。

Sox2(sex determining region Y-box 2)基因属于SoxB1家族，在未分化的胚胎干细胞、胚胎癌细胞中表达，而随着其分化表达下调。Sox2的表达虽然不局限于多能性细胞，但它对早期胚胎发育和抑制分化也十分重要，缺乏Sox2的胚胎无法形成上胚层(epiblast)，在胚胎干细胞中阻断Sox2的功能造成胚胎干细胞的分化。该基因的序列可以获自GenBANK NM_003106。

Klf4(Krüppel-like factors 4)是一种新发现的真核锌指蛋白转录因子，它是Kruppel样转录因子家族的成员之一。Klf4具有癌基因和肿瘤抑制基因的双重特性。Klf4过表达可以维持Oct4的表达而抑制胚胎干细胞的分化。它也可协同Oct4和Sox2调节某些基因的转录。

c-Myc是一种原癌基因，其主要作用是促进细胞增殖，在某些成体干细胞维持自我更新中起一定作用。过表达持续活化形式的c-Myc的小鼠ES细胞，在撤去生长因子后仍维持了自我更新和细胞全能性；而c-Myc功能缺失后，小鼠ES细胞失去全能性并开始分化为中胚层和原始内胚层细胞。

Nanog的转录受Oct4/Sox2复合物的调节，Nanog缺乏将导致细胞自发地向原始内胚层细胞分化。全基因组分析发现，在小鼠和人类的ES细胞中，Oct4、Sox2和Nanog共同调控着许多靶基因，其中很多基因的产物是对发育至关重要的转录因子，Oct4、Sox2和Nanog三个转录因子共同形成了ES细胞的多能性核心调控系统，其中涉及了自调节和前馈等多种机制。

Lin28是一个高度保守的RNA结合蛋白，受miRNA调节，通过结合mRNA和多核糖体促进翻译效率。在许多物种中是一种控制多种细胞发育的负调控基因。在人类和小鼠ES细胞中，Lin28的表达随着ES细胞的分化而下降。

UTF1(undifferentiated embryonic cell transcription factor1)是多能相关转录因子，在胚胎和新生睾丸，生殖母细胞强表达。

Esrrb(Estrogen-related receptor beta)编码与雌激素受体氨基酸序列相似的核受体，属于细胞核激素受体家族的类固醇激素受体。其一相似蛋白是小鼠胎盘发育所必需的。Esrrb对维持胚胎干细胞自我更新起重要作用。

小分子药物

DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine，5-azaC)被用于处理诱导多能性干细胞过程中产生的部分重编程的细胞，发现其能将其转化到完全重编程状态。随后一些可促进基因转录或有利于维持干细胞多能性的小分子药物被用于诱导多能性干细胞，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)和丙戊酸(valproic acid，VPA)，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294，钙激动剂BayK8644，丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂PD0325901和糖原合成酶-3(GSK-3)抑制剂CHIR99021等。

发明内容

本发明提供一种能高效诱导哺乳类细胞为多能干细胞的重组腺病毒，及其诱导方法和用途。

本发明提供的诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体主要由腺病毒载体、B亚群腺病毒纤毛蛋白基因和含诱导多能性干细胞的基因Oct4和Sox2表达盒构成。其特征在于：该腺病毒载体为C型腺病毒，其腺病毒纤毛头氨基酸序列为腺病毒B亚型腺病毒纤毛头氨基酸序列所替代；目的基因表达盒序列为至少包含OCT4和SOX2基因的表达盒核苷酸序列，该重组腺病毒能诱导哺乳类动物的细胞成为多能性干细胞。

人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(A至F)。目前常用的腺病毒载体来源于人的2型及5型腺病毒，在血清学分类上均属C亚群。C亚群腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体即CAR。但是，在人体多数细胞并不表达CAR受体，因此用这类腺病毒转染体细胞，效率很低。

为达提高腺病毒载体对多数人体细胞的高效感染，本发明的技术方案为：在现在的C型腺病毒载体的基础上，其纤毛头受体结合位置改造成了B亚群腺病毒的纤毛头。所述腺病毒B亚型腺病纤毛头的氨基酸序列可以是但不限于下述之一：11型腺病纤毛头的氨基酸序列，35型腺病毒纤毛头的氨基酸序列。

构建含B亚群腺病毒纤毛蛋白基因的重组腺病毒载体载体的方法为：首先，人工合成B亚群腺病毒纤毛头的核苷酸序列。合成序列经酶切后，与pCLON9载体连接，构建成pCLON9-FB。pCLON9-FB经酶切，回收片段与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3载体在感受态大肠杆菌BJ5183内进行同源重组得到含B亚群腺病毒纤毛头的含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-FB。该质粒与含5型腺病毒左臂和目的基因的穿梭质粒共转染HEK293A细胞重组出含B亚群腺病毒纤毛蛋白基因的重组腺病毒载体。

B亚群腺病毒包括3型、7型、11型、16型、35型、50型腺病毒。B亚群腺病毒感染细胞主要以CD46分子为吸附受体(Fleischli C等，J Gen Virol.2007Nov；88：2925-34；Pache L等，Virology.2008Jun5；375：573-9；Pache L等，J Virol.2008Aug；82：7923-31)。CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎表达在除了红细胞以外所有人外周血细胞和人体细胞表面。

在本发明的一个实施方案中，C亚群腺病毒为5型腺病毒，其纤毛头受体结合位置改造成了B亚群腺病毒的11型腺病毒的纤毛头。

在本发明的又一个实施方案中，C亚群腺病毒为5型腺病毒，其纤毛头受体结合位置改造成了B亚群腺病毒的35型腺病毒的纤毛头。

腺病毒的组织嗜向性主要由其纤毛决定。因此，本发明所述重组腺病毒载体载体仍具有B亚群腺病毒的感染特性，细胞受体从CAR变成了CD46，能有效感染低表达CAR受体的细胞。原有的感染吸附受体的改变，使该类重组病毒可以感染哺乳动物尤其是人的大多数细胞，例如皮肤成纤维细胞，成纤维细胞和淋巴细胞等，对造血细胞、白血病细胞、间充质干细胞和树突状细胞有很高的感染效率，而且基因表达水平也大为提高，将该重组腺病毒载体连接上报告基因EGFP后发现，该重组载体对人体成纤维细胞的感染能力可以达到70％以上，极显著高于常规的C型腺病毒载体。

在本发明的一个实施方案中，该类重组腺病毒载体基因组还携带了可诱导多能性干细胞的转录因子基因Oct4和Sox2。

在胚胎发育过程中，从受精卵开始到桑葚胚阶段的细胞都表达Oct4。随着胚胎发育的成熟，Oct4在各种成熟组织中都失去表达，只在具有多能性或全能性的生殖细胞中还维持一定量的表达。Oct4基因敲除的小鼠只能发育到类似囊胚的阶段，然而该囊胚ICM中的细胞不具有发育全能性，只能形成滋养外胚层。

Oct4具有一个保守的DNA结合结构域-POU结合域。Oct4含有家族的保守区——N端和C端各有一个脯氨酸富集区，它们是Oct4因子的转录活性区。Oct4因子能特异地识别八聚体序列，通过结合到八聚体上调节基因的转录。

Sox2最早被发现就是在胚胎细胞中被鉴定出来。在胚胎发生中，Sox2蛋白的表达一直持续了整个着床前的发育阶段。在体外，Sox2在未分化的胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达，而随着其分化表达下调。

多种方法均可获得哺乳动物的Oct4和Sox2基因。以人为例，首先从Genbank中获得人Oct4和Sox2的cDNA全序列，用2A序列将Oct4和Sox2连接，并在上下游设计合适酶切位点，人工合成OCT4-2A-SOX2全序列DNA。将合成的DNA经酶切连入上述含5型腺病毒左臂的穿梭质粒。将含有Oct4和Sox2基因和B亚群腺病毒纤毛蛋白基因的重组腺病毒载体转染人成纤维细胞，对重组载体进行Oct4和Sox2蛋白表达的Westernblot检测，鉴定结果为重组腺病毒载体载体可高效转染人成纤维细胞，并高量表达Oct4和Sox2蛋白。

在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是其他可以诱导体细胞为多能性干细胞的基因，包括但不限于：Klf4，Nanog，Lin28。

锌指蛋白Klf4在干细胞中与STAT3途径相关，并与Oct4和Sox2相互作用，活化ES细胞中的主要启动子Leftyl。Klf4过表达可以维持Oct4的表达而抑制ES细胞的分化。它也可协同Oct4和Sox2调节某些基因的转录。

Nanog蛋白是一种具有阻碍分化作用的同源异型框转录因子，对于维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力很重要，并且在早期将要分化成胚胎干细胞的胚胎中Nanog也有表达。

Lin28在许多物种中是一种控制多种细胞发育的负调控基因。Lin28的许多功能还不被完全揭示，只是在干细胞中，它能提高间叶细胞恢复过程中的重编程频率。

在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是能促进细胞增殖的基因，包括但不限于：c-Myc。

c-Myc是继p53之后最为受人瞩目的原癌基因，其主要作用是促进细胞增殖。它与人类基因组有25,000个结合位点。它的N端可以与TRRAP、TIP48相作用，影响组蛋白乙酰化酶、ATP酶的作用，而C端含有螺旋一环一螺旋(HLH)及亮氨酸拉链结构域，在与Max蛋白形成稳定的复合物后与DNA序列(CACA/GTG)相结合，调节基因的表达。此外c-Myc在某些成体干细胞维持自我更新中起一定作用。c-Myc是LIF/STAT3和WNT信号通路的一个主要的下游基因，而两条信号通路在多能性的维持具有起重要作用。

在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是降低p53表达的p53 siRNA和OCT4下游基因UTF1。

据报道，重编程因子KIF4可能通过p53抑制起作用。虽然下调p53的表达不能完全替代KLF4的作用，但联合使用p53 siRNA可提高诱导多能性干细胞的效率。p53表达沉默可以促进成纤维细胞的永生化，而p53 siRNA对抗细胞凋亡，影响细胞的衰老过程。c-MYC可激活p53通路诱导细胞的凋亡。UTF1是OCT4/SOX2复合体的下游因子，在胚胎干细胞高表达，分化启动后表达下调。虽然UTF1在重编程中不能替代OCT4的作用，但联合使用可以提高碱性磷酸酶阳性的诱导多能干细胞克隆的出现。UTF1具有组蛋白样特性，作为稳定的染色质相关转录抑制子起作用，可能利于细胞从分化状态向多能状态转换(Denget al.，2008)。

在本发明的又一个实施方案中，所携带的基因还可以是细胞核激素受体基因：Esrrb。

Esrrb是Klf2、Klf4和Klf5的靶基因之一，Esrrb同时又调控 Klf4和Klf5。Esrrb可激活Oct4的转录，维持胚胎干细胞的自我更新和多能性。在诱导多能细胞重编程中，Esrrb可替代Klf4。

本发明提供的一类重组腺病毒载体载体，其携带的诱导多能性干细胞所必需的基因可以是一个干细胞相关，也可以是多个干细胞相关基因的不同组合，因为一些细胞本身就可表达上述的一个或多个转录因子，例如，成纤维细胞可表达c-Myc和Klf4，已经证实诱导鼠和人的成纤维细胞为多能性干细胞时，外源的c-Myc不是必需的，但是缺乏c-Myc时细胞的重编程过程可能会变缓(Nakagawa et al.，2008；Wernig et al.，2008)。

神经祖细胞也表达Sox2和c-Myc，其表达量可稍高于胚胎干细胞，因此仅用Oct4/Klf4组合诱导人神经祖细胞也可获得多能性干细胞。

在本发明的又一个实施方案中，重组腺病毒载体所携带的干细胞相关基因还可以来源于小鼠，大鼠，牛，羊或其他哺乳动物。因此，该重组腺病毒载体还可应用于诱导其它哺乳动物的多能性干细胞。

在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体的转录因子基因表达盒中编码序列的启动子可以选自以下之一，但不限于：(a)延伸因子EF-1α启动子、增强子及其突变体序列；(b)泛素基因Ubi启动子、增强子及其突变体序列；(c)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；(d)人巨细胞病毒(hCMV)启动子、增强子及其突变体序列；(e)鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子、增强子及其突变体序列。

启动子活性随细胞类型不同而不同，诱导多能性细胞的基因应选用在大多数细胞中具有活性的启动子，特别是在胚胎干细胞中有较强活性的启动子。在现有慢病毒载体和逆转录病毒载体介导的诱导多能性细胞的报道中几乎都采用了EF1α启动子。以腺病毒载体感染人胚胎干细胞转导绿色荧光蛋白基因的实验表明，EF1α启动子在胚胎干细胞有较强活性，而CMV启动子在胚胎干细胞中感染后3天即被关闭。

在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体的携带多个可诱导多能性干细胞的基因之间可以但不限于下列方式之一连接：(a)多核糖体进入位点(IRES)序列连接；(b)口蹄疫病毒2A序列连接； (c)连接肽(linker)连接。

诱导多能干细胞的一个重要问题是多个干细胞相关基因在靶细胞内的同时表达，采取多个载体共转染的方法则对于一个具体的细胞来讲同时被转染的效率不高。将诱导所需基因同时插入到一个具有高容量、广感染谱和高感染效率的载体上将大大提高诱导效率。本发明将多个多能性相关的基因连接后连入一个重组腺病毒载体，下列方式可以是下列方法之一，但不限于这些连接方法：IRES序列连接；2A序列连接；linker连接。连接后的干细胞相关基因可以受共同受启动子调控，同时在一个细胞内表达，细胞诱导效率大为提高。

在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞的方法是：将该重组腺病毒载体一次或多次感染细胞。

腺病毒在宿主细胞是非整合表达，一次感染后表达持续时间短，而成体细胞重编程为多能性干细胞需要外源多能性相关转录因子持续存在10-12天，转染一次不足以启动内源干细胞相关的转录因子表达。采取每2-3天感染一次，多次感染有助于提高效率。

在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞时，感染复数(Multiplicity Of Infection，MOI)为30-100，此处MOI为病毒PFU(plaque forming unit)与细胞的倍数。MOI过低，感染效率低，MOI过高，细胞死亡增加。

在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞时，哺乳动物体细胞接种密度约为5×10⁴个/mL，细胞接种密度过低，细胞可能过快凋亡而不利于下一步的去分化，细胞接种密度过大，细胞会很快长满培养瓶，会阻碍细胞克隆的生长，而且过密的细胞铺叠在一起有可能造成假克隆。最优化的细胞密度一般要参照细胞的倍增时间而定。饲养层细胞密度为5×10⁴个/mL。

在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞，可以在之前、同时和/或之后使用小分子药物，小分子药物包括但不限于丙戊酸(valproic acid，VPA)、BIX 01294、 5-氮杂胞苷(5-azaC)、5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)和Bayk8644。

在诱导多能性干细胞过程中使用促进基因活化、利于基因转录和的小分子药物可以缩短诱导时间，提高诱导效率。如DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素和丙戊酸，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX01294，钙激动剂BayK8644，丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂PD0325901和糖原合成酶-3(GSK-3)抑制剂CHIR99021。多种小分子药物的联合使用，效果可更明显。

在本发明的又一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞，可以在之前、同时和/或之后使用维持胚胎干细胞多能性和增殖的细胞因子，包括但不限于LIF、bFGF、EGF、SU5402、PD184352、PD0325901和CHIR99021。

用干细胞相关基因诱导产生多能性干细胞时联合应用小分子药物组合可以减少转录因子的数目，并促进细胞重编程过程。而且小分子的应用使重编程的过程更为简单。在小分子药物的协同作用下只需转入Oct4和Sox2就可将成纤维细胞诱导为多能性干细胞。转入基因的减少简化了操作，同时也减少了插入突变。

在本发明的又一个实施方案中，提供了该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞后的传代培养方法。

在诱导小鼠细胞为多能性干细胞时，新分离的克隆可以立即应用酶消化法传代，然而，对于其他哺乳动物来说，这一点比较困难。以人为例，人多能性干细胞在单细胞时很难增殖，多能性干细胞样的克隆出现后，要进行扩增多能性干细胞，分离传代多能性干细胞的方法主要为机械分离法。机械分离多能性干细胞，并将其传至铺有新饲养层或可替代饲养层的基质胶上进行传代和增殖。在细胞多次使用机械法传代扩增后，才可以应用消化法传代。人多能性干细胞也更易于分化，因此在初始几次的传代过程中，需不断除去分化细胞，避免其扩增从而代替了多能性干细胞。

一般的，胚胎干细胞培养液可以应用于培养iPS细胞，促进胚胎干细胞增殖的培养液也可以促进iPS细胞的增殖。本发明在培养人iPS 过程中使用人胚胎干细胞培养液。培养液既要满足被转染细胞的营养需求，也应能维持多能性干细胞的去分化状态。因此，培养液应由体细胞培养液转换为干细胞培养液的时间根据多能性干细胞出现的时间而定。

在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞，这些多能性干细胞具有了多潜能细胞的生长特性和生化特性，具体表现为：细胞出现胚胎干细胞样的形态特征，形成三维的细胞克隆；持续表达干细胞相关转录因子：Oct4，Sox2和Nanog等；生长速度加快；在多次传代后仍可保持自我更新的能力；表达碱性磷酸酶活性；可分化为来源于三胚层的各种细胞；裸鼠皮下注射形成畸胎瘤。

在本发明的一个实施方案中，该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞，人多能性干细胞可用于临床治疗的细胞替代疗法和化妆品应用；哺乳动物多能性干细胞可用于制作转基因动物和动物疾病模型。

本发明的优点是本发明的重组腺病毒载体即传承了腺病毒载体不整合，可感染静止期和非静止期细胞等优点。同时具有感染谱广，感染效率高，避免了一般腺病毒载体感染效率低，感染细胞范围窄，感染细胞后出现多能性干细胞的时间长等缺点。

另一方面，本发明的重组腺病毒载体将多个诱导多能性干细胞的基因连接在一起，整合入一个重组腺病毒载体载体构建为整合载体，避免了多个载体同时转染，转染效率高，对细胞损伤小，转染方法更为简单。

此外，本发明的重组腺病毒载体还可以通过小分子药物的协助，将感染细胞的转录因子可减少为2个，降低了转染外源基因的负面影响。

不仅如此，本发明的重组腺病毒载体还可以从患者或不同个体的血液或皮肤取材，体外培养细胞后，进行诱导iPS细胞，从而建立来自不同个体的干细胞库，并将这些细胞用于自体的细胞替代疗法。应用自体的皮肤、血液或其他组织产生干细胞，再进行细胞替代疗法，避免了不同个体的免疫排斥反应。

附图简述

图1：含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒载体pCLON9-F11的构建流程。

图2：腺病毒包装质粒pPE3的构建流程。

图3：含11型腺病毒纤毛头核苷酸序列的5型腺病毒右臂质粒pPE3-F11构建流程。

图4：携带人OCT4-2A-SOX2-2A-NANOG的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328-OSN和携带人OCT4-2A-KLF4-2A-SOX2的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328-OKS构建流程。

图5：启动子EF1α调控EGFP的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328-EGFP和启动子CMV调控EGFP的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC315-EGFP构建流程。

图6：重组腺病毒载体1-6号亚克隆Ad5/F11-OSN感染293细胞OCT4和SOX2蛋白表达的Western blot检测，证明1-6号重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN能在感染细胞表达目的蛋白。

图7：重组腺病毒载体Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP感染人胚胎干细胞后4天，Ad5/F11-CMV-EGFP感染的人胚胎干细胞已无荧光，Ad5/F11-EF-EGFP感染的人胚胎干细胞仍有荧光，证明启动子EF1α在胚胎干细胞比启动子CMV活性更强。

图8：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN前的人成纤维细胞。

图9：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN后5天的人成纤维细胞，添加不同小分子药物的克隆出现情况，添加5-azaC(2μM)+VPA(2mM)+BIX(1μM)的组比5-azaC(2μM)+BIX(1μM)组和5-azaC(2μM)组出现克隆早，克隆数目多。

图10：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN后10天的人成纤维细胞，出现典型胚胎干细胞样克隆。

图11：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样克隆碱性磷酸酶检测呈阳性。

图12：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样克隆转录因子Oct4表达的免疫荧光检测呈阳性。

图13：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样克隆转录因子Sox2表达的免疫荧光检测呈阳性。

图14：转染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN后10天的人成纤维细胞，胚胎干细胞样克隆转录因子Nanog表达的免疫荧光检测呈阳性。

图15：从人发根毛囊分离培养角质细胞，3天后细胞从发根毛囊长出。

图16：人发根毛囊分离培养的角质细胞感染Ad5/F11-OSN后3天出现胚胎干细胞样克隆。

具体实施方式

本发明以腺病毒Ad5/F11携带人OCT4-2A-SOX2-2A-NANOG基因作为例证，对本发明加以进一步具体说明。贯穿本申请，引用了各种专利和专利出版物，目的是为了描述本发明领域的发展状态。下面的实施例不是为了限制本发明专利要求的范围，只是为了示例某些实施方案。在示例性方法中本领域技术人员所想到的任何变更将落入本发明的范围。

实施例1：现以5型腺病毒载体为例，说明含Ad11腺病毒纤毛的头编码序列的腺病毒右臂质粒pPE3-F11的构建

第一步：合成(TAKARA)含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列(序列来源：NC_011212，GenBANK)如SEQ ID NO：3所示，命名Ad5F11，其中：(1)第232-365位碱基：5型腺病毒纤毛蛋白tail序列；(2)第364-1212位碱基：11型腺病毒纤毛蛋白shaft、knob序列；(3)其余碱基：5型腺病毒基因组序列，见Microbix Biosystems公司的pBHGloxdeltaE1，3Cre序列。

第二步：合成VT176序列(SEQ ID NO：4)和VT177序列(SEQ ID NO：5)，构建pCLON9载体。Ad5F11序列经PacI+HindIII酶切，回收2656bp片段，与pCLON9/PacI+HindIII酶切的载体连接，经酶切和测序鉴定确认，正确者命名为pCLON9-F11。构建流程如图1所示。

第三步：pCLON9-F11经HindIII+AatII酶切，回收5916bp片段。

第四步：人工合成ADP序列(TAKARA)，序列见SEQ ID NO：6，如图2所示，构建腺病毒包装质粒pPE3。pPE3载体经PacI酶切，回收线性化载体。

第五步：pCLON9-F11/HindIII+AatII 4微升，pPE3/PacI 2微升，共同转化感受态大肠杆菌BJ5183(Qbiogene公司)。铺板培养，挑取克隆进行酶切鉴定，正确者命名为pPE3-F11。经大样质粒提取纯化，保存于深低温冰箱中。pPE3-F11构建流程如图3所示。

实施例2：pDC328-OSN和pDC328-OKS构建

第一步：合成EF1α启动子序列(TAKARA)，序列见SEQ ID NO：7。

第二步：合成的EF1用XbaI+SalI双酶切，回收600bp片段。

第三步：pDC315载体(购自Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，含有5型腺病毒左臂E1区1417至2344bp序列片段，及反向末端重复序列)经XbaI+SalI双酶切，回收3345bp片段。

第四步：将第三步和第四步回收的片段连接，经酶切和测序(Invitrogen)鉴定确认，正确者命名该载体为pDC328。

第五步：人工合成OCT4-2A-SOX2-2A-NANOG序列(TAKARA)，序列来源：OCT4 NM_002701；SOX2 NM_033106；NANOG NM_024865，GenBank。序列如SEQ ID NO：8所示，其中：(1)第14-1093位碱基为OCT4编码序列；(2)第1162-2113位碱基为SOX2编码序列；(3)第2169-3087位碱基为NANOG编码序列；(4)第1100-1157和2120-2183位碱基为2A序列。人工合成OCT4-2A-KLF4-2A-SOX2序列(TAKARA)，序列来源：KLF4 NM_004235，GenBank。序列如SEQ ID NO：9所示，其中(1)第14-1093位碱基为OCT4编码序列；(2)第1162-2674位碱基为KLF4编码序列；(3)第2750-3703位碱基为SOX2编码序列；(4)第1100-1157和2680-2744位碱基为2A序列。

第六步：合成的OCT4-2A-SOX2-2A-NANOG和OCT4-2A-KLF4-2A-SOX2经BamHI+SalI双酶切，分别回收3106bp片段和3706bp片段。

第七步：pDC328质粒经BamHI+SalI双酶切，回收3921bp片段。

第八步：将第六步回收的片段分别与第七步回收的片段连接，经酶切和测序(Invitrogen)鉴定确认，正确者分别命名载体为pDC328-OSN和pDC328-OKS。

pDC328-OSN和pDC328-OKS构建流程如图4所示。

实施例3：pDC328-EGFP和pDC315-EGFP的构建

第一步：合成EGFP序列(TAKARA)，序列见SEQ ID NO：10。

第二步：合成的EGFP经EcoRI+SalI双酶切，回收726bp片段。

第三步：pDC328和pDC315经EcoRI+SalI双酶切，分别回收3897bp和3883bp片段。

第四步：第二步回收的片段分别与pDC328和pDC315酶切回收片段连接，酶切鉴定正确者分别命名为pDC328-EGFP和pDC315-EGFP。

pDC328-EGFP和pDC315-EGFP构建流程如图5所示。

实施例4：Ad5/F11-OSN、Ad5/F11-OKS、Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP重组腺病毒的细胞内重组及扩增纯化

本发明提供一类含11型腺病毒纤毛基因的至少携带OCT4和SOX2基因的重组腺病毒载体，是在HEK293人胚胎肾细胞内重组完成的。HEK293细胞株购于加拿大Microbix Biosystems公司，该细胞由剪切的5型腺病毒DNA转化，含5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率，通过细胞内重组产生具有感染力的腺病毒。

第一步：将上述构建好的含5型腺病毒左臂的穿梭质粒pDC328-OSN、pDC328-OKS、pDC328-EGFP和pDC315-EGFP，分别与含有11型腺病毒Fiber的杂合腺病毒载体右臂质粒pPE3-F11，通过LipoFectamine2000共同转染HEK293细胞。转染具体方法步骤参见Invitrogen公司的LipoFectamine2000试剂盒操作说明书。pPE3-F11含有5型腺病毒右臂，缺失E1区，其重组酶系统Cre/LoxP可以保证病毒的高效重组。在载体共转染后的9-14天，陆续出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化(具体方法参见GeneTransfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press，Clifton，New Jersey)，重组出腺病毒载体。

第二步：重组腺病毒载体的鉴定，以腺病毒E1a基因引物排除野生型腺病毒，以NANOG基因引物鉴定重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN，以KLF4基因引物鉴定重组腺病毒Ad5/F11-OKS，以EGFP基因引物鉴定Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP。腺病毒E1a基因引物：上游引物5’-cggaattcaccatgagacatattatc-3’(SEQ ID NO：11)，下游引物5’-gcgtcgacttatggcctggggcg-3’(SEQ ID NO：12)，扩增片段1005bp。NANOG基因引物：上游引物5’-cagaaggcctcagcacctac-3’(SEQ ID NO：13)，下游引物5’-attgttccaggtctggttgc-3’(SEQID NO：14)，扩增片段111bp。KLF4基因引物：上游引物5’-aagatcaagcaggaggcggtctcttcg-3’(SEQ ID NO：15)，下游引物5’-ttcatgtgtaaggcgaggtggtccgac-3’(SEQ ID NO：16)，扩增片段704bp。EGFP基因引物：上游引物5’-gctctagagaattcaccatggtgagcaagggc-3’(SEQ ID NO：17)，下游引物5’-cgggatccgtcgacttattacctagatccggtgg-3’(SEQ ID NO：18)，扩增片段793bp。鉴定正确的重组腺病毒载体分别命名为Ad5/F11-OSN(CCTCC-V200902，2009年1月9日，中国典型培养物保藏中心)、Ad5/F11-OKS、Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP。

第三步：重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN、Ad5/F11-OKS、Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP在HEK293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，HumanaPress，Clifton，New Jersey)。用TCID50法测得重组腺病毒载体滴度。

实施例5：重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN在293细胞表达蛋白的检测和鉴定

将HEK293细胞按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养，第二天换为无血清DMEM培养液1ml，然后，感染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN，MOI为5，37℃孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入含10％FBS的DMEM培养液培养48小时，裂解细胞作Western blot检测OCT4和SOX2。(图6)

实施例6：Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP感染人胚胎干细胞

以Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP感染人胚胎干细胞，比较不同启动子在胚胎干细胞中的活性。将鼠胚成纤维细胞铺到用0.1％明胶包被的6-孔培养板中，4×10⁵cells/孔。第二天将人胚胎干细胞(美国南加州大学应其龙博士惠赠)铺到饲养细胞上，培养液为含20％血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加4μg/mL的bFGF，1％非必需氨基酸，0.1mM巯基乙醇，1mM谷氨酰胺。第三天换为无血清DMEM/F12，按MOI为50分别加入Ad5/F11-EF-EGFP和Ad5/F11-CMV-EGFP，37℃孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入胚胎干细胞培养液培养。感染后24小时荧光显微镜观察，胚胎干细胞和饲养细胞都发绿色荧光，72小时后感染Ad5/F11-EF-EGFP的孔中胚胎干细胞仍发绿色荧光，饲养细胞荧光消失，而感染Ad5/F11-CMV-EGFP的孔中胚胎干细胞绿色荧光消失，饲养细胞仍有荧光(图7)。实验证明EF1α启动子在胚胎干细胞中比CMV启动子活性更强。

实施例7：用重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN感染人成纤维细胞诱导iPS细胞

第一天：准备待感染细胞

1、接种原代培养人成纤维细胞，以4×10⁵个细胞接种于T-25培养瓶，培养液为DMEM(低糖)，添加10％胎牛血清，1％非必需氨基酸。

2、37℃、5％CO₂孵箱培养过夜(见图8)。

第二天：感染目标细胞

换无血清培养液4ml，然后，感染重组腺病毒载体 Ad5/F11-OSN，MOI为30-100，37℃、5％CO₂孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入含10％FBS添加5-azaC(2μM)、VPA(2mM)和BIX(1μM)的培养液培养。

第四天：第二次感染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN

方法同前。

第五天：铺饲养细胞

饲养细胞的准备参见Wicell的NSCB Technical Support(http://www.wicell.org/index.phpoption＝com_content&task＝section&id＝9&Itemid＝256)，六孔板用0.1％明胶包被后以4×10⁵个鼠胎成纤维细胞/孔铺板。

第六天：将感染后的人成纤维细胞转到饲养细胞上

换为干细胞培养液(含20％血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加4μg/mL的bFGF，1％非必需氨基酸，0.1mM巯基乙醇，1mM谷氨酰胺)，以后每日换液。

经培养4-5天后，有些细胞开始变圆，并聚集成较小的细胞克隆，形成类似于ES细胞的集落形态，随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐增多，细胞集落也长的更大。BIX 01294、VPA和5’-azaC三种小分子联用时比BIX 01294与5’-azaC联用或是单用5’-azaC克隆出现早，克隆数目多(图9)。用吸管小心挑取细胞集落，并接种于新的饲养层上，取一小部分进行碱性磷酸酶和其他干细胞标志物(OCT4、SOX2、NANOG)的检测，剩余细胞继续传代扩增并分批冻存。

转染10天左右的人成纤维细胞，细胞开始出现胚胎干细胞样的形态特征，出现较多的细胞克隆，克隆呈鸟巢状，细胞开始叠加生长，细胞之间的接触抑制性降低。转染后的细胞克隆形成率较高，说明本发明提供的重组腺病毒载体可以高效转导可诱导多能性干细胞，见附图10。3周后挑出克隆进行培养，作干细胞特征检测，包括碱性磷酸酶检测、干细胞多能性标志物检测(OCT4、SOX2、NANOG)、体外分化实验和畸胎瘤形成实验等。

碱性磷酸酶活性主要在胚胎干细胞和一些成体干细胞内表达，在正常的人体细胞内不表达。碱性磷酸酶检测后发现，转染后，可形成克隆的人成纤维细胞具有碱性磷酸酶活性，而未形成克隆的人成纤维细胞染色后，碱性磷酸酶活性为阴性。见附图11。

转录因子Oct4表达的免疫荧光检测。一抗为兔抗人Oct4(稀释度1∶200)，二抗为鼠抗兔FITC(稀释度1∶100)。结果表明，转染10天后，可形成克隆的人成纤维细胞表达干细胞标志的转录因子Oct4。见图12。

转录因子Sox2表达的荧光检测。一抗为兔抗人Sox2(稀释度1∶200)，二抗为鼠抗兔FITC(稀释度1∶100)。结果表明，可形成克隆的人成纤维细胞表达干细胞标志的转录因子Sox2。见图13。

转录因子Nanog表达的荧光检测。一抗为山羊抗人Nanog(稀释度1∶200)，二抗为鼠抗兔FITC(稀释度1∶30)。结果表明，可形成克隆的人成纤维细胞表达干细胞标志的转录因子Nanog。见图14。

实施例8：用重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN感染人毛根角质细胞诱导iPS细胞

从人毛根获取原代角质细胞培养物取材方便，角质细胞诱导iPS细胞的效率高。用75％酒精擦拭拔发处头皮，拔取5-10根头发，选取发根粗，带有白色毛囊的头发，剪下发根用1.2IU/mL Dispase37℃消化3小时，再用0.05％胰蛋白酶(加0.02％EDTA)37℃消化5分钟。终止消化离心收集细胞用人胚胎干细胞培养液培养(含20％血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加4μg/mL的bFGF，1％非必需氨基酸，0.1mM巯基乙醇，1mM谷氨酰胺)。3天后细胞从毛根长出(图15)。

第一天：铺饲养细胞

六孔板用0.1％明胶包被后以4×10⁵个鼠胎成纤维细胞/孔铺板。

第二天：准备待感染细胞

1、接种原代培养人角质细胞到饲养细胞上，以1.5×10⁵个细胞/孔接种于6-孔培养板中，培养液为胚胎干细胞培养液(含20％血清替代物(KSR)的Knockout DMEM，添加4μg/mL的bFGF，1％非必需氨基酸，0.1mM巯基乙醇，1mM谷氨酰胺)。

2、37℃、5％CO₂孵箱培养过夜。

第三天：感染目标细胞

换无血清DMEM/F12培养液4ml，然后，感染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN，MOI为30-100，37℃、5％CO₂孵育2小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，加入添加5-azaC(2μM)、VPA(2mM)和BIX(1μM)的胚胎干细胞培养液培养。

第五天：第二次感染重组腺病毒载体Ad5/F11-OSN

方法同前。

第六到十天：以后每日换液。

第十天以后停止添加5-azaC、VPA和BIX。

感染腺病毒载体Ad5/F11-OSN后3天即出现干细胞样克隆(图16)。

序列表

<110>上海东方肝胆外科医院

<120>一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途

<130>IDC090007

<160>17

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>282

<212>PRT

<213>Adllfiber的shaft和knob氨基酸序列

<400>1

Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr Asn

20 25 30

Gly Phe Leu Lys Glu Asn Ile Ser Ala Thr Thr Pro Leu Val Lys Thr

35 40 45

Gly His Ser Ile Gly Leu Pro Leu Gly Ala Gly Leu Gly Thr Asn Glu

50 55 60

Asn Lys Leu Cys Ile Lys Leu Gly Gln Gly Leu Thr Phe Asn Ser Asn

65 70 75 80

Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Val Asn

85 90 95

Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Ile Met Asn Ser Ser Glu Ser Asn Asp

100 105 110

Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr Ala

115 120 125

Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe Asn Met Leu Thr Thr

130 135 140

His Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Thr Gly

145 150 155 160

Asn Leu Leu Thr Arg Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His Lys

165 170 175

Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Gly Phe

180 185 190

Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asp Asn Ser Arg Glu Lys

195 200 205

Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys Tyr Tyr Thr Ala Ser Asp Arg Thr

210 215 220

Ala Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Arg Arg Ala Ile Asn

225 230 235 240

Asp Glu Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp Ser Trp Asn Thr Gly

245 250 255

Asp Ala Pro Glu Val Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser Pro

260 265 270

Phe Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp

275 280

<210>2

<211>280

<212>PRT

<213>Ad35 fiber的shaft和knob氨基酸序列

<400>2

Gly Val Leu Thr Leu Lys Cys Leu Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Lys Val Gly Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Thr Asp

20 25 30

Gly Thr Leu Gln Glu Asn Ile Arg Ala Thr Ala Pro Ile Thr Lys Asn

35 40 45

Asn His Ser Val Glu Leu Ser Ile Gly Asn Gly Leu Glu Thr Gln Asn

50 55 60

Asn Lys Leu Cys Ala Lys Leu Gly Asn Gly Leu Lys Phe Asn Asn Gly

65 70 75 80

Asp Ile Cys Ile Lys Asp Ser Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Ile Asn

85 90 95

Pro Pro Pro Asn Cys Gln Ile Val Glu Asn Thr Asn Thr Asn Asp Gly

100 105 110

Lys Leu Thr Leu Val Leu Val Lys Asn Gly Gly Leu Val Asn Gly Tyr

115 120 125

Val Ser Leu Val Gly Val Ser Asp Thr Val Asn Gln Met Phe Thr Gln

130 135 140

Lys Thr Ala Asn Ile Gln Leu Arg Leu Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Asn

145 150 155 160

Leu Leu Thr Glu Glu Ser Asp Leu Lys Ile Pro Leu Lys Asn Lys Ser

165 170 175

Ser Thr Ala Thr Ser Glu Thr Val Ala Ser Ser Lys Ala Phe Met Pro

180 185 190

Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Thr Thr Thr Arg Asp Ser Glu Asn

195 200 205

Tyr Ile His Gly Ile Cys Tyr Tyr Met Thr Ser Tyr Asp Arg Ser Leu

210 215 220

Phe Pro Leu Asn Ile Ser Ile Met Leu Asn Ser Arg Met Ile Ser Ser

225 230 235 240

Asn Val Ala Tyr Ala Ile Gln Phe Glu Trp Asn Leu Asn Ala Ser Glu

245 250 255

Ser Pro Glu Ser Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr Ser Pro Phe Phe Phe

260 265 270

Ser Tyr Ile Thr Glu Asp Asp Asn

275 280

<210>3

<211>2666

<212>DNA

<213>含5型腺病毒tail序列和11型腺病毒shaft、knob序列的嵌合序列

<400>3

ttaattaaga tcttattccc tttaactaat aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta 60

aaatcagtta gcaaatttct gtccagttta ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag 120

ctctggtatt gcagcttcct cctggctgca aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca 180

gtttcctcct gttcctgtcc atccgcaccc actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc 240

gcaagaccgt ctgaagatac cttcaacccc gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct 300

ccaactgtgc cttttcttac tcctcccttt gtatccccca atgggtttca agagagtccc 360

cctggagttc ttactttaaa atgtttaacc ccactaacaa ccacaggcgg atctctacag 420

ctaaaagtgg gagggggact tacagtggat gacaccaacg gttttttgaa agaaaacata 480

agtgccacca caccactcgt taagactggt cactctatag gtttaccact aggagccgga 540

ttgggaacga atgaaaataa actttgtatc aaattaggac aaggacttac attcaattca 600

aacaacattt gcattgatga caatattaac accttatgga caggagtcaa ccccaccgaa 660

gccaactgtc aaatcatgaa ctccagtgaa tctaatgatt gcaaattaat tctaacacta 720

gttaaaactg gagcactagt cactgcattt gtttatgtta taggagtatc taacaatttt 780

aatatgctaa ctacacacag aaatataaat tttactgcag agctgttttt cgattctact 840

ggtaatttac taactagact ctcatccctc aaaactccac ttaatcataa atcaggacaa 900

aacatggcta ctggtgccat tactaatgct aaaggtttca tgcccagcac gactgcctat 960

cctttcaatg ataattctag agaaaaagaa aactacattt acggaacttg ttactacaca 1020

gctagtgatc gcactgcttt tcccattgac atatctgtca tgcttaaccg aagagcaata 1080

aatgacgaga catcatattg tattcgtata acttggtcct ggaacacagg agatgcccca 1140

gaggtgcaaa cctctgctac aaccctagtc acctccccat ttacctttta ctacatcaga 1200

gaagacgact gagcccaaga ataaagaatc gtttgtgtta tgtttcaacg tgtttatttt 1260

tcaattgcag aaaatttcaa gtcatttttc attcagtagt atagccccac caccacatag 1320

cttatacaga tcaccgtacc ttaatcaaac tcacagaacc ctagtattca acctgccacc 1380

tccctcccaa cacacagagt acacagtcct ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat 1440

atcatgggta acagacatat tcttaggtgt tatattccac acggtttcct gtcgagccaa 1500

acgctcatca gtgatattaa taaactcccc gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc 1560

cagctgctga gccacaggct gctgtccaac ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga 1620

agtccacgcc tacatggggg tagagtcata atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg 1680

cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc 1740

agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc 1800

acagcagcgc accctgatct cacttaaatc agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat 1860

attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga 1920

acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag gtagattaag tggcgacccc tcataaacac 1980

gctggacata aacattacct cttttggcat gttgtaattc accacctccc ggtaccatat 2040

aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg 2100

cccgccggct atacactgca gggaaccggg actggaacaa tgacagtgga gagcccagga 2160

ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac 2220

gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac 2280

aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac actgcaggga agacctcgca cgtaactcac 2340

gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc 2400

gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg atccctactg tacggagtgc gccgagacaa 2460

ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc 2520

tgaagcaaaa ccaggtgcgg gcgtgacaaa cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag 2580

atcgctctgt gtagtagttg tagtatatcc actctctcaa agcatccagg cgccccctgg 2640

cttcgggttc tatgtaaact aagctt 2666

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>引物序列

<400>4

aattgaccgg tctcgagact agtggatccg cggccgcatc tagattaatt a 51

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>引物序列

<400>5

agcttaatta atctagatgc ggccgcggat ccactagtct cgagaccggt c 51

<210>6

<211>1679

<212>DNA

<213>5型腺病毒ADP基因序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1070)..(1070)

<223>n is a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(1072)..(1072)

<223>n is a，c，g，或t

<400>6

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 60

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg 120

gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 180

gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 240

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca 300

aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 360

agtgaattga ccggtctcga gactagtgga tccgcggccg ccgctaccgg acttacatct 420

accacaaata caccccaagt ttctgccttt gtcaataact gggataactt gggcatgtgg 480

tggttctcca tagcgcttat gtttgtatgc cttattatta tgtggctcat ctgctgccta 540

aagcgcaaac gcgcccgacc acccatctat agtcccatca ttgtgctaca cccaaacaat 600

gatggaatcc atagattgga cggactgaaa cacatgttct tttctcttac agtatgatta 660

aatgagacat gattcctcga gtttttatat tactgaccct tgttgcgctt tttttgtgcg 720

tgctccacat tggctaagta atagttaatt aagcttggcg taatcatggt catagctgtt 780

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 840

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 900

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 960

ggggaagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1020

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcgsdn dnatctagaa 1080

aggatctgcg atcgctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 1140

gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga acgggtgcct agagaaggtg gcgcggggta 1200

aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg 1260

tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca 1320

cagctgaagc ttcgaggggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc 1380

cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact 1440

gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc 1500

ccttggagcc tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa 1560

ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg 1620

cctacgaatt cagtactgag ctcactagtg gatccgctag cctcgagggt accgtcgac 1679

<210>7

<211>3112

<212>DNA

<213>人OCT4-2A SOX2-2A-NANOG序列

<400>7

ggatcccgcc accatggcgg gacacctggc ttcggatttc gccttctcgc cccctccagg 60

tggtggaggt gatgggccag gggggccgga gccgggctgg gttgatcctc ggacctggct 120

aagcttccaa ggccctcctg gagggccagg aatcgggccg ggggttgggc caggctctga 180

ggtgtggggg attcccccat gccccccgcc gtatgagttc tgtgggggga tggcgtactg 240

tgggccccag gttggagtgg ggctagtgcc ccaaggcggc ttggagacct ctcagcctga 300

gggcgaagca ggagtcgggg tggagagcaa ctccgatggg gcctccccgg agccctgcac 360

cgtcacccct ggtgccgtga agctggagaa ggagaagctg gagcaaaacc cggaggagtc 420

ccaggacatc aaagctctgc agaaagaact cgagcaattt gccaagctcc tgaagcagaa 480

gaggatcacc ctgggatata cacaggccga tgtggggctc accctggggg ttctatttgg 540

gaaggtattc agccaaacga ccatctgccg ctttgaggct ctgcagctta gcttcaagaa 600

catgtgtaag ctgcggccct tgctgcagaa gtgggtggag gaagctgaca acaatgaaaa 660

tcttcaggag atatgcaaag cagaaaccct cgtgcaggcc cgaaagagaa agcgaaccag 720

tatcgagaac cgagtgagag gcaacctgga gaatttgttc ctgcagtgcc cgaaaccgac 780

actgcagcag atcagccaca tcgcccagca gcttgggctc gagaaggatg tggtccgagt 840

gtggttctgt aaccggcgcc agaagggcaa gcgatcaagc agcgactatg cacaacgaga 900

ggattttgag gctgctgggt ctcctttctc agggggacca gtgtcctttc ctctggcccc 960

agggccccat tttggtaccc caggctatgg gagccctcac ttcactgcac tgtactcctc 1020

ggtccctttc cctgaggggg aagcctttcc ccctgtctcc gtcaccactc tgggctctcc 1080

catgcattca aacgctagcg agggtagagg cagtctgctg acctgcggag acgttgagga 1140

aaaccctggg ccatcaagat ctatgtacaa catgatggag acggagctga agccgccggg 1200

cccgcagcaa acttcggggg gcggcggcgg caactccacc gcggcggcgg ccggcggcaa 1260

ccagaaaaac agcccggacc gcgtcaagcg gcccatgaat gccttcatgg tgtggtcccg 1320

cgggcagcgg cgcaagatgg cccaggagaa ccccaagatg cacaactcgg agatcagcaa 1380

gcgcctgggc gccgagtgga aacttttgtc ggagacggag aagcggccgt tcatcgacga 1440

ggctaagcgg ctgcgagcgc tgcacatgaa ggagcacccg gattataaat accggccccg 1500

gcggaaaacc aagacgctca tgaagaagga taagtacacg ctgcccggcg ggctgctggc 1560

ccccggcggc aatagcatgg cgagtggggt cggggtgggc gccggcctgg gcgcgggcgt 1620

gaaccagcgc atggacagtt acgcgcacat gaacggctgg agcaacggca gctacagcat 1680

gatgcaggac cagctgggct acccgcagca cccgggcctc aatgcgcacg gcgcagcgca 1740

gatgcagccc atgcaccgct acgacgtgag cgccctgcag tacaactcca tgaccagctc 1800

gcagacctac atgaacggct cgcccaccta cagcatgtcc tactcgcagc agggcacccc 1860

tggcatggct cttggctcca tgggttcggt ggtcaagtcc gaggccagct ccagcccccc 1920

tgtggttacc tcttcctccc actccagggc gccctgccag gccggggacc tccgggacat 1980

gatcagcatg tatctccccg gcgccgaggt gccggaaccc gccgccccca gcagacttca 2040

catgtcccag cactaccaga gcggcccggt gcccggcacg gccattaacg gcacactgcc 2100

cctctcacac atgcttaagg ctgaaggtcg aggatcactt ctcacatgtg gcgatgtgga 2160

agagaatccg ggcccttccg gacatatgat gagtgtggac ccagcttgtc cccaaagctt 2220

gccttgcttt gaagcatccg actgtaaaga atcttcacct atgcctgtga tttgtgggcc 2280

tgaagaaaac tatccatcct tgcaaatgtc ttctgctgag atgcctcaca cggagactgt 2340

ctctcctctt ccctcctcca tggatctgct tattcaggac agccctgatt cttccaccag 2400

tcccaaaggc aaacaaccca cttctgcaga gaatagtgtc gcaaaaaagg aagacaaggt 2460

cccagtcaag aaacagaaga ccagaactgt gttctcttcc acccagctgt gtgtactcaa 2520

tgatagattt cagagacaga aatacctcag tctccagcag atgcaagaac tctccaacat 2580

cctgaacctc agctacaaac aggtgaagac ctggttccag aaccagagaa tgaaatctaa 2640

gaggtggcag aaaaacaact ggccgaagaa tagcaatggt gtgacgcaga aggcctcagc 2700

acctacctac cccagcctct actcttccta ccaccaggga tgcctggtga acccgactgg 2760

gaaccttcca atgtggagca accagacctg gaacaattca acctggagca accagaccca 2820

gaacatccag tcctggagca accactcctg gaacactcag acctggtgca cccaatcctg 2880

gaacaatcag gcctggaaca gtcccttcta taactgtgga gaggaatctc tgcagtcctg 2940

catgcagttc cagccaaatt ctcctgccag tgacttggag gctgctttgg aagctgctgg 3000

ggaaggcctt aatgtaatac agcagaccac taggtatttt agtactccac aaaccatgga 3060

tttattccta aactactcca tgaacatgca acctgaagac gtgtgagtcg ac 3112

<210>8

<211>3712

<212>DNA

<213>人OCT4-2A-KLF4-SOX2序列

<400>8

ggatcccgcc accatggcgg gacacctggc ttcggatttc gccttctcgc cccctccagg 60

tggtggaggt gatgggccag gggggccgga gccgggctgg gttgatcctc ggacctggct 120

aagcttccaa ggccctcctg gagggccagg aatcgggccg ggggttgggc caggctctga 180

ggtgtggggg attcccccat gccccccgcc gtatgagttc tgtgggggga tggcgtactg 240

tgggccccag gttggagtgg ggctagtgcc ccaaggcggc ttggagacct ctcagcctga 300

gggcgaagca ggagtcgggg tggagagcaa ctccgatggg gcctccccgg agccctgcac 360

cgtcacccct ggtgccgtga agctggagaa ggagaagctg gagcaaaacc cggaggagtc 420

ccaggacatc aaagctctgc agaaagaact cgagcaattt gccaagctcc tgaagcagaa 480

gaggatcacc ctgggatata cacaggccga tgtggggctc accctggggg ttctatttgg 540

gaaggtattc agccaaacga ccatctgccg ctttgaggct ctgcagctta gcttcaagaa 600

catgtgtaag ctgcggccct tgctgcagaa gtgggtggag gaagctgaca acaatgaaaa 660

tcttcaggag atatgcaaag cagaaaccct cgtgcaggcc cgaaagagaa agcgaaccag 720

tatcgagaac cgagtgagag gcaacctgga gaatttgttc ctgcagtgcc cgaaaccgac 780

actgcagcag atcagccaca tcgcccagca gcttgggctc gagaaggatg tggtccgagt 840

gtggttctgt aaccggcgcc agaagggcaa gcgatcaagc agcgactatg cacaacgaga 900

ggattttgag gctgctgggt ctcctttctc agggggacca gtgtcctttc ctctggcccc 960

agggccccat tttggtaccc caggctatgg gagccctcac ttcactgcac tgtactcctc 1020

ggtccctttc cctgaggggg aagcctttcc ccctgtctcc gtcaccactc tgggctctcc 1080

catgcattca aacgctagcg agggtagagg cagtctgctg acctgcggag acgttgagga 1140

aaaccctggg ccatcaagat ctatggctgt cagcgacgcg ctgctcccat ctttctccac 1200

gttcgcgtct ggcccggcgg gaagggagaa gacactgcgt caagcaggtg ccccgaataa 1260

ccgctggcgg gaggagctct cccacatgaa gcgacttccc ccagtgcttc ccggccgccc 1320

ctatgacctg gcggcggcga ccgtggccac agacctggag agcggcggag ccggtgcggc 1380

ttgcggcggt agcaacctgg cgcccctacc tcggagagag accgaggagt tcaacgatct 1440

cctggacctg gactttattc tctccaattc gctgacccat cctccggagt cagtggccgc 1500

caccgtgtcc tcgtcagcgt cagcctcctc ttcgtcgtcg ccgtcgagca gcggccctgc 1560

cagcgcgccc tccacctgca gcttcaccta tccgatccgg gccgggaacg acccgggcgt 1620

ggcgccgggc ggcacgggcg gaggcctcct ctatggcagg gagtccgctc cccctccgac 1680

ggctcccttc aacctggcgg acatcaacga cgtgagcccc tcgggcggct tcgtggccga 1740

gctcctgcgg ccagaattgg acccggtgta cattccgccg cagcagccgc agccgccagg 1800

tggcgggctg atgggcaagt tcgtgctgaa ggcgtcgctg agcgcccctg gcagcgagta 1860

cggcagcccg tcggtcatca gcgtcagcaa aggcagccct gacggcagcc acccggtggt 1920

ggtggcgccc tacaacggcg ggccgccgcg cacgtgcccc aagatcaagc aggaggcggt 1980

ctcttcgtgc acccacttgg gcgctggacc ccctctcagc aatggccacc ggccggctgc 2040

acacgacttc cccctggggc ggcagctccc cagcaggact accccgaccc tgggtcttga 2100

ggaagtgctg agcagcaggg actgtcaccc tgccctgccg cttcctcccg gcttccatcc 2160

ccacccgggg cccaattacc catccttcct gcccgatcag atgcagccgc aagtcccgcc 2220

gctccattac caaggtcagt cccggggatt tgtagctcgg gctggggagc cctgtgtgtg 2280

ctggccccac ttcgggacac acgggatgat gctcacccca ccttcttcac ccctagagct 2340

catgccaccc ggttcctgca tgccagagga gcccaagcca aagaggggaa gacgatcgtg 2400

gccccggaaa aggaccgcca cccacacttg tgattacgcg ggctgcggca aaacctacac 2460

aaagagttcc catctcaagg cacacctgcg aacccacaca ggtgagaaac cttaccactg 2520

tgactgggac ggctgtggat ggaaattcgc ccgctcagat gaactgacca ggcactaccg 2580

taaacacacg gggcaccgcc cgttccagtg ccaaaaatgc gaccgagcat tttccaggtc 2640

ggaccacctc gccttacaca tgaagaggca ttttcttaag gctgaaggtc gaggatcact 2700

tctcacatgt ggcgatgtgg aagagaatcc gggcccttcc ggacatatga tgtacaacat 2760

gatggagacg gagctgaagc cgccgggccc gcagcaaact tcggggggcg gcggcggcaa 2820

ctccaccgcg gcggcggccg gcggcaacca gaaaaacagc ccggaccgcg tcaagcggcc 2880

catgaatgcc ttcatggtgt ggtcccgcgg gcagcggcgc aagatggccc aggagaaccc 2940

caagatgcac aactcggaga tcagcaagcg cctgggcgcc gagtggaaac ttttgtcgga 3000

gacggagaag cggccgttca tcgacgaggc taagcggctg cgagcgctgc acatgaagga 3060

gcacccggat tataaatacc ggccccggcg gaaaaccaag acgctcatga agaaggataa 3120

gtacacgctg cccggcgggc tgctggcccc cggcggcaat agcatggcga gtggggtcgg 3180

ggtgggcgcc ggcctgggcg cgggcgtgaa ccagcgcatg gacagttacg cgcacatgaa 3240

cggctggagc aacggcagct acagcatgat gcaggaccag ctgggctacc cgcagcaccc 3300

gggcctcaat gcgcacggcg cagcgcagat gcagcccatg caccgctacg acgtgagcgc 3360

cctgcagtac aactccatga ccagctcgca gacctacatg aacggctcgc ccacctacag 3420

catgtcctac tcgcagcagg gcacccctgg catggctctt ggctccatgg gttcggtggt 3480

caagtccgag gccagctcca gcccccctgt ggttacctct tcctcccact ccagggcgcc 3540

ctgccaggcc ggggacctcc gggacatgat cagcatgtat ctccccggcg ccgaggtgcc 3600

ggaacccgcc gcccccagca gacttcacat gtcccagcac taccagagcg gcccggtgcc 3660

cggcacggcc attaacggca cactgcccct ctcacacatg tgataagtcg ac 3712

<210>9

<211>732

<212>DNA

<213>EGFP序列

<400>9

gaattcatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 120

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 180

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 240

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 300

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 360

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 420

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 480

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 540

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 600

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 660

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 720

aagtaagtcg ac 732

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>引物序列

<400>10

cggaattcac catgagacat attatc 26

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>引物序列

<400>11

gcgtcgactt atggcctggg gcg 23

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>引物序列

<400>12

cagaaggcct cagcacctac 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物序列

<400>13

attgttccag gtctggttgc 20

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>引物序列

<400>14

aagatcaagc aggaggcggt ctcttcg 27

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>引物序列

<400>15

ttcatgtgta aggcgaggtg gtccgac 27

<210>16

<211>32

<212>DNA

<213>引物序列

<400>16

gctctagaga attcaccatg gtgagcaagg gc 32

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>引物序列

<400>17

cgggatccgt cgacttatta cctagatccg gtgg 34

Claims

1.一种用于诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体，其是保藏号为CCTCC-V200902、于2009年1月9日保藏在地址是中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心的重组腺病毒载体。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于：该重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞，所述多能性干细胞具有多潜能细胞的生长特性和生化特性，具体表现为：细胞出现胚胎干细胞样的形态特征，形成三维的细胞克隆；持续表达干细胞相关转录因子：Oct4，Sox2和Nanog；细胞生长速度加快；在多次传代后仍可保持自我更新的能力；细胞表达碱性磷酸酶活性；可分化为来源于三胚层的各种细胞；细胞裸鼠皮下注射形成畸胎瘤。

3.使用根据权利要求1所述的重组腺病毒载体诱导哺乳动物体细胞为多能性干细胞的方法，其特征在于：将所述重组腺病毒载体一次或多次感染细胞，所述哺乳动物体细胞为人成纤维细胞。

4.权利要求1或2所述的重组腺病毒载体用于诱导人的细胞为多能干细胞的用途，所述的人的细胞为人成纤维细胞。