WO2011068159A1 - 多能性幹細胞の製造のための核酸 - Google Patents

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WO2011068159A1
WO2011068159A1 PCT/JP2010/071585 JP2010071585W WO2011068159A1 WO 2011068159 A1 WO2011068159 A1 WO 2011068159A1 JP 2010071585 W JP2010071585 W JP 2010071585W WO 2011068159 A1 WO2011068159 A1 WO 2011068159A1
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WO
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nucleic acid
cells
vector
cell
gene
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PCT/JP2010/071585
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竜嗣 榎
章子 岩本
Original Assignee
タカラバイオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid for producing a pluripotent stem cell having the ability to differentiate into various cells, and a method for producing a pluripotent stem cell using the nucleic acid.
  • Pluripotent stem cells that can differentiate into all cell lineages of an organism have the potential to differentiate into any type of cell and to produce any type of tissue, organ, etc. Therefore, it is expected to be applied to a new treatment method (regenerative medicine) in which the cells are used to regenerate and compensate for lost cells in an organism. Furthermore, it has applicability as a research tool in the fields of embryology, molecular biology, and pharmacy.
  • embryonic stem cells As pluripotent stem cells, embryonic stem cells (ES cells), which are cell lines established from the inner cell mass of an early embryo at a stage called a blastocyst, are known. However, human ES cells produced by destroying human embryos are often opposed from an ethical point of view, and the research is often limited.
  • pluripotent stem cells induced pluripotent stem cells
  • IPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cell is produced by artificially introducing a gene involved in acquiring or maintaining the totipotency of a cell into a somatic cell.
  • Non-Patent Document 1 introduces human iPS cells by introducing genes encoding four polypeptides of OCT4, SOX2, c-MYC, and KLF4, respectively, and expressing these polypeptides individually in the cells. A method of making is disclosed. In addition, other researchers have reported that human iPS cells were produced by the same operation using genes encoding four kinds of polypeptides of OCT4, SOX2, NANOG, and LIN28 (non-patented). Reference 2). However, not all somatic cells into which these genes have been introduced are induced into iPS cells, and only a part of them (0.02% or less of the total number of cells) is actually induced into iPS cells. Only.
  • Non-patent Document 3 an attempt has been made to add a drug that inhibits DNA methylation to the medium.
  • c-MYC is an oncogene, and when applied to medical treatment, the risk of canceration of the introduced cells is inevitable. For this reason, attempts have been made to induce iPS cells except for c-MYC, but in that case, the induction efficiency is further reduced (0.001% or less of the total number of cells). Thus, the iPS cell production technology has not yet been established.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing pluripotent stem cells, and to promote research and utilization of the cells.
  • ES cell-like cells that is, stem cells that retain pluripotency frequently and safely among many nuclear reprogramming factor candidates.
  • the inventors have found a combination of nuclear reprogramming factors that can be induced to stably produce pluripotent stem cells with high efficiency, and have completed the present invention.
  • a coding region for a MYC family gene comprising each coding region of a gene encoding four nuclear reprogramming factors of OCT4, KLF4, SOX2, and LIN28 interconnected via a sequence encoding a self-cleaving peptide
  • a nucleic acid without a region [2] The nucleic acid according to [1], comprising each coding region of OCT4, KLF4, SOX2, and LIN28 genes in order from the 5 ′ end, [3] The nucleic acid according to [1], further comprising a coding region of a NANOG gene connected via a sequence encoding a self-cleaving peptide, [4] The nucleic acid according to [3], comprising each coding region of OCT4, KLF4, SOX2, LIN28 and NANOG genes in order from the 5 ′ end, [5] The nucleic acid according to any one of [1] to [4], wherein the self-clea
  • a vector comprising the nucleic acid according to any one of [1] to [5], [7] A cell comprising the nucleic acid according to any one of [1] to [5] or the vector according to [6], [8] A method for producing pluripotent stem cells comprising the step of introducing the nucleic acid according to any one of [1] to [5] or the vector according to [6] into a somatic cell, and [ 9] The method according to [8], wherein the step of introducing a nucleic acid or a vector is performed in the presence of fibronectin or a fibronectin fragment. About.
  • the pluripotent stem cells have the ability to differentiate into desired cells, and are used for basic research and medical treatment. Very useful in applied research.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a nucleic acid prepared in the example.
  • nuclear reprogramming factor means a factor involved in nuclear reprogramming among factors related to differentiation, development, proliferation, etc. expressed in ES cells and the like. Many candidates for nuclear reprogramming factors have been reported. For example, Cell, Vol. 126, pages 663-676, 2006 describes 24 candidate nuclear reprogramming factors. Non-Patent Document 2 describes 14 types of nuclear reprogramming factor candidates.
  • self-cleaving peptide means a peptide sequence with a cleavage activity that occurs between two amino acid residues in the peptide sequence itself. For example, for 2A peptides or 2A-like peptides, cleavage occurs between the glycine and proline residues on these peptides. This is caused by a “ribosome skip mechanism” in which normal peptide bond formation does not occur between the glycine and proline residues during translation and does not affect downstream translation. Such ribosome skip mechanisms are known in the art and are used for the expression of multiple proteins encoded by a single messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • coding region refers to a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence found in a polypeptide resulting from translation of an mRNA molecule.
  • somatic cell refers to a cell other than a germ cell among cells constituting an organism. In these somatic cells, reprogramming occurs by contacting with a nuclear reprogramming factor to acquire pluripotency.
  • nucleic acid and vector of the present invention includes the coding regions of genes encoding four nuclear reprogramming factors of OCT4, KLF4, SOX2 and LIN28, but includes the coding region of the MYC family gene. And a nucleic acid comprising a sequence encoding a self-cleaving peptide between the coding regions of the respective genes.
  • the order of the coding regions of the genes encoding the four nuclear reprogramming factors is not particularly limited as long as pluripotent stem cells can be induced. For example, in order from the 5 ′ end of the nucleic acid, OCT4, KLF4, Nucleic acids containing the coding regions of SOX2 and LIN28 genes are preferred.
  • the nucleic acid of the present invention may further contain a coding region of the NANOG gene. That is, it includes a coding region of a gene encoding five nuclear reprogramming factors of OCT4, KLF4, SOX2, LIN28 and NANOG, and a coding region of a self-cleaving peptide between the coding regions of each nuclear reprogramming factor Nucleic acids are also included in the present invention.
  • the order of the coding regions of the genes encoding the five nuclear reprogramming factors is not particularly limited as long as pluripotent stem cells can be induced.
  • OCT4, KLF4, SOX2 in order from the 5 ′ end of the nucleic acid.
  • a nucleic acid containing each coding region of LIN28 and NANOG genes is preferred.
  • the nucleic acid of the present invention is transcribed as one mRNA in somatic cells.
  • the polypeptide translated from the transcribed mRNA is cleaved within the self-cleaving peptide.
  • the self-cleaving peptide is a 2A peptide
  • the ribosome does not link a specific single peptide bond within the 2A peptide, and the 5A of the 2A peptide sequence.
  • the polypeptide encoded on the “terminal side” and the polypeptide encoded on the 3 ′ terminal side are translated as different polypeptides.
  • the nuclear reprogramming factors encoded by the nucleic acids of the present invention occur as separate polypeptides. Therefore, the plurality of nuclear reprogramming factors encoded by the nucleic acid of the present invention are all expressed with substantially the same number of molecules (equal amount) without lacking one kind.
  • the base sequence of each coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor used in the nucleic acid of the present invention can be obtained from registration information of NCBI (National Biotechnology Information Center).
  • NCBI National Biotechnology Information Center
  • a person skilled in the art can obtain a base sequence encoding from the N-terminal to the C-terminal of the mature protein or preproprotein of the nuclear reprogramming factor based on the base sequence included in the registration information.
  • a primer is designed based on the base sequence, and a DNA fragment encoding a nuclear reprogramming factor can be prepared by PCR or the like using a human cDNA library as a template.
  • the wild-type gene coding region can be used as the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor used in the nucleic acid of the present invention. Furthermore, the existence of a plurality of variants (variants) has been reported in the nuclear reprogramming factor, and the coding regions of these variants can also be used in the present invention. It is a base sequence in which one or several, preferably 1-9, more preferably 1-6 bases are artificially substituted, deleted, added or inserted into the base sequence of the coding region of the wild type gene. In addition, a base sequence encoding a polypeptide having the same function as the nuclear reprogramming factor encoded by the wild type can also be used.
  • OCT4 is a transcription factor belonging to the POU family and has been reported as a pluripotency maintenance or undifferentiation marker.
  • the coding region of the OCT4 gene contained in the nucleic acid of the present invention is RefSeq Acc. No. NM_002701.4.
  • the coding region of the OCT4 gene is the base sequence represented by base numbers 1 to 1081 of SEQ ID NO: 8.
  • miR-470 which is a microRNA (miRNA) that suppresses the expression of the target gene by inhibiting the degradation and translation of mRNA. It suppresses the expression of the target gene.
  • mutations may be introduced into the coding region of the OCT4 gene.
  • the coding region of the OCT4 gene into which mutations as shown in Table 2 of the Examples below are introduced can be used.
  • base numbers 393 to 413 base sequence of SEQ ID NO: 9 in the coding region of OCT4 gene represented by base numbers 1 to 1081 of SEQ ID NO: 8 are replaced with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • KLF4 is a transcription factor that functions as a tumor suppressor or carcinogen.
  • the coding region of the KLF4 gene contained in the nucleic acid of the present invention is RefSeq Acc. No. NM_004235.3.
  • the coding region of the KLF4 gene is the base sequence represented by base numbers 1147 to 2556 of SEQ ID NO: 8.
  • SOX2 belongs to the Sox (SRY-related HMG box) gene family, and is a transcription factor composed of an HMG domain having a DNA binding ability and a transcription activation domain.
  • the coding region of the SOX2 gene contained in the nucleic acid of the present invention is RefSeq Acc. No. It is shown in NM_003106.2.
  • the coding region of the SOX2 gene is the base sequence represented by base numbers 2623 to 3573 of SEQ ID NO: 8.
  • the miR-134 target sequence is present in the coding region of the mouse SOX2 gene, as in the case of OCT4. In order to prevent miRNA expression inhibition after gene introduction, mutations may be introduced into the coding region of the SOX2 gene.
  • the coding region of the SOX2 gene into which mutations such as those shown in Table 2 of Examples below are introduced can be used.
  • This mutation coding region includes the nucleotide sequence of nucleotide numbers 3242 to 3263 (the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11) shown in SEQ ID NO: 12 in the coding region of the SOX2 gene represented by nucleotide numbers 2623 to 3573 of SEQ ID NO: 8. It has been replaced with an array.
  • LIN28 is an RNA binding protein that selectively suppresses let-7 miRNA processing.
  • the coding region of the LIN28 gene contained in the nucleic acid of the present invention is RefSeq Acc. No. NM_024674.4.
  • the coding region of the LIN28 gene is the base sequence represented by base numbers 3640 to 4266 of SEQ ID NO: 8.
  • NANOG is a homeobox transcription factor.
  • the coding region of the NANOG gene contained in the nucleic acid of the present invention is RefSeq Acc. No. It is shown in NM_0244865.2.
  • the coding region of the NANOG gene is the base sequence represented by base numbers 4336 to 5253 of SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acid of the present invention is characterized by not containing a MYC family gene. Since the MYC family gene that is an oncogene is not included, somatic cells can be reprogrammed more safely by the nuclear reprogramming factor expressed from the nucleic acid of the present invention.
  • MYC family genes include c-MYC, N-MYC, and L-MYC [Journal of Cell Science (J. Cell Sci.), 119, 208-216, 2006].
  • the code region of c-MYC is RefSeq Acc. No.
  • the code area of NM_002467 and N-MYC is RefSeq Acc. No.
  • the code area of NM_005378 and L-MYC is RefSeq Acc. No. NM_005376.
  • the self-cleaving peptide used for the nucleic acid of the present invention can be obtained from the 2A or 2A-like sequence of the virus.
  • 2A peptide (F2A) derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV)
  • 2A peptide (E2A) derived from equine rhinitis A virus (ERAV)
  • E2A equine rhinitis A virus
  • P2A porcine teschovirus
  • TaV Thosea assignavirus
  • T2A having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • P2A having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be used.
  • the 2A peptide was reviewed in Expert Opinion on Biological Therapy, Vol. 5, pages 627-638, 2005.
  • the nucleic acid of the present invention may contain a plurality of “base sequences encoding self-cleaving peptides”. These may encode self-cleaving peptides having the same amino acid sequence, or may encode self-cleaving peptides having different amino acid sequences. Even if the same amino acid sequence encodes a self-cleaving peptide, the base sequences may be different. Furthermore, the base sequence may be modified in accordance with the codon usage of the cell in which the nucleic acid of the present invention is expressed. For example, the sequence may be modified into a sequence encoding T2A having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5 and a sequence encoding P2A having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleic acid of the present invention is a gene that can serve as a marker for confirming the expression of a nuclear reprogramming factor (for example, a gene encoding a factor related to drug resistance, a gene encoding a reporter enzyme, a gene encoding a fluorescent protein, etc.) Code regions.
  • a nuclear reprogramming factor for example, a gene encoding a factor related to drug resistance, a gene encoding a reporter enzyme, a gene encoding a fluorescent protein, etc.
  • the nucleic acid of the present invention can be used by linking to another nucleic acid so that it can be expressed under the control of an appropriate promoter.
  • an appropriate promoter any of those that constitutively promote expression and those that are induced by a drug or the like (for example, tetracycline or doxorubicin) can be used.
  • a nucleic acid containing a promoter or other regulatory elements cooperating with the transcription start site for example, an enhancer sequence or a terminator sequence, may be linked.
  • a gene that can serve as a marker for confirming the expression of the nucleic acid may be incorporated. .
  • the nucleic acid of the present invention can be used by inserting it into a vector for introduction into somatic cells.
  • the vector into which the nucleic acid of the present invention is inserted is not particularly limited, and an appropriate one can be selected from known vectors and used. For example, either a method using a viral vector or a method using a non-viral vector can be used in the present invention. Regarding the details of these vectors, many documents have already been published, and these vectors can be appropriately selected from these documents and used.
  • the above viral vectors are not particularly limited, and are generally known viral vectors used for gene transfer methods, such as retroviral vectors (including oncoretroviral vectors, lentiviral vectors, and pseudotype vectors), adeno Viral vectors, adeno-associated virus vectors, simian virus vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used. Particularly preferably, an oncoretrovirus vector, a lentivirus vector or an adenovirus vector can be used. As the above-mentioned viral vector, those lacking replication ability are preferable so that they cannot self-replicate in infected cells.
  • the non-viral vector is not particularly limited, and a known non-viral vector used in gene transfer methods, for example, a plasmid vector can be used.
  • the method for producing pluripotent stem cells of the present invention comprises a step of introducing the nucleic acid or vector of the present invention described in (1) above into a somatic cell.
  • This method can produce pluripotent stem cells with higher efficiency compared to the conventional method of simultaneously introducing a plurality of types of nucleic acids or vectors into somatic cells, and is about the same as that of cells into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced. 0.1-2% is induced in pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells produced by the method of the present invention have a very small number of copies of the introduced nucleic acid or vector, and when the introduced nucleic acid or vector is integrated into the chromosome, its safety is dramatically improved. To do.
  • a cell population containing pluripotent stem cells can be produced with a small amount of nucleic acid or a small amount of vector, which is extremely useful.
  • the somatic cell used in the method of the present invention is not particularly limited, and any somatic cell can be used.
  • somatic cells such as fibroblasts, preadipocytes, hepatocytes, blood cells, skin keratinocytes, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and neural stem cells can be used.
  • the somatic cells may be collected from living organisms or established as cell lines. When it is desired to transplant the prepared pluripotent stem cell or a cell differentiated from the cell into a living body, it is preferable to induce the pluripotent stem cell from a somatic cell collected from the living body itself.
  • the step of introducing a nucleic acid or vector into a somatic cell can be appropriately operated depending on the somatic cell and the vector to be used.
  • a non-viral vector When a non-viral vector is used, it can be introduced by a method using a carrier such as liposome or ligand-polylysine, a calcium phosphate method, an electroporation method, a particle gun method, or the like.
  • the substance which improves introduction efficiency can also be used in the case of nucleic acid or vector introduction. Examples of substances that improve the introduction efficiency include substances that have an activity of binding to viral vectors, such as fibronectin or fibronectin fragments.
  • a fibronectin fragment having a heparin binding site for example, a fragment commercially available as Retronectin (registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
  • Retronectin registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.
  • the present invention is not particularly limited, the aforementioned substances are particularly suitable for gene transfer using a retroviral vector or a lentiviral vector.
  • polybrene which is a synthetic polycation having an effect of improving the infection efficiency of retrovirus cells
  • polybrene which is a synthetic polycation having an effect of improving the infection efficiency of retrovirus cells
  • the present inventors As a result of improving the induction efficiency of pluripotent stem cells compared to the case of using polybrene, it was found that pluripotent stem cells can be obtained at a high frequency. That is, one aspect of the present invention includes a step of introducing the nucleic acid or vector of the present invention into a somatic cell in the presence of a functional substance having an activity of binding to a retrovirus.
  • a method for producing a stem cell is provided.
  • a functional substance having an activity to bind to a retrovirus there is no particular problem as long as it is a substance having the activity.
  • fibronectin fibroblast growth factor, type V collagen, fragment of the above polypeptide , Polylysine, DEAE-dextran and the like.
  • a functional substance having a binding site in a retrovirus derived from the substance can be used in the present invention.
  • the fibronectin fragment those having a heparin-II binding region in the molecule are suitable, and such a fragment is also described in, for example, WO 97/18318.
  • Retronectin (registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.) is exemplified as a recombinant fibronectin fragment having a heparin-II binding region. Further, substances functionally equivalent to these functional substances, for example, functional substances having a heparin-binding site can also be used. In addition, a mixture of the functional substance, a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, and the like can be used.
  • a functional substance having an activity to bind to a retrovirus may be used in combination with a functional substance having an activity to bind to a target cell, that is, a somatic cell into which a nucleic acid or vector is to be introduced.
  • a functional substance having target cell binding activity may be used in combination.
  • the functional substance having the target cell binding activity is not particularly limited, and examples thereof include a substance having a ligand that binds to the target cell.
  • the ligand include cell adhesive proteins (fibronectin, laminin, collagen, etc.) or fragments thereof, hormones, cytokines, antibodies to cell surface antigens, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, glycoproteins or glycolipids Examples include chains and metabolites of target cells.
  • the functional substance is immobilized on a suitable solid phase, for example, a container (plate, petri dish, flask, bag, etc.) used for cell culture or a carrier (microbeads, etc.). Used in state.
  • a suitable solid phase for example, a container (plate, petri dish, flask, bag, etc.) used for cell culture or a carrier (microbeads, etc.). Used in state.
  • feeder cells used for ES cell culture can be used as appropriate.
  • primary cultured cells of mouse 14-15 day embryonic fibroblasts, STO cells that are fibroblast-derived cell lines, etc. Can be used cells treated with drugs such as mitomycin C or radiation.
  • culture of somatic cells into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced is preferably carried out on feeder cells, ES cell culturing methods that do not use feeder cells have also been reported and can be used in the present invention.
  • pluripotent stem cells can be produced from somatic cells.
  • a known medium that can be used for ES cells or iPS cells can be used for the culture.
  • the cell After introducing the nucleic acid or vector of the present invention into a somatic cell, the cell is preferably cultured for a time sufficient for the somatic cell to acquire pluripotency and proliferate.
  • the culture density of somatic cells after introduction of the nucleic acid or vector of the present invention is preferably continued at a cell density of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cells / mL per dish for cell culture, for example.
  • a normal somatic cell culture medium is used, for example, for 1 to 12 days. Preferably, it can be cultured for 2 to 10 days. Thereafter, the medium may be replaced with a medium for ES cells and cultured, for example, for 5 to 40 days, preferably 10 to 35 days.
  • the somatic cells into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced have acquired pluripotency, for example, markers unique to undifferentiated cells, such as alkaline phosphatase (ALP), SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 , E-cadherin and the like can be easily determined.
  • markers unique to undifferentiated cells such as alkaline phosphatase (ALP), SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 , E-cadherin and the like can be easily determined.
  • ALP alkaline phosphatase
  • SSEA-3 SSEA-3
  • SSEA-4 ABCG-2
  • E-cadherin E-cadherin and the like
  • a somatic cell having a DNA in which a marker gene such as GFP is incorporated downstream of the promoter of an ES cell-specific expression gene it is possible to identify a pluripotent stem cell using the expression of the marker gene as an index.
  • the acquisition of pluripotency can also be determined by colony formation.
  • a colony is usually a cell population of 500 to 1000 cells and is known to exhibit a characteristic appearance, so that a colony formed by proliferation of pluripotent stem cells can be easily identified.
  • a pluripotent stem cell line from which cells having no pluripotency have been removed can be established by isolating colonies of the pluripotent stem cells thus obtained and performing cloning.
  • PCR was performed with PrimeSTAR (registered trademark) MAX PreMix (manufactured by Takara Bio Inc.) using a cDNA synthesized from Human Brain PolyA + RNA (manufactured by Clontech) as a template and a primer pair corresponding to the gene of each nuclear reprogramming factor.
  • the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.5 kbp for KLF4 and about 1 kbp for SOX2 was extracted and purified.
  • NM_002701.4 OCT4 gene
  • NM_024674.4 LIN28 gene
  • NM_0244865.2 NANOG gene
  • T2A and P2A The 2A peptide sequences, T2A and P2A derived from Thesea assigna virus and Porcine teschovirus-1 were obtained from publicly known literature (Nature Biotechnology, Vol. 22, No. 5, pp. 589-94, 2004).
  • the amino acid sequence of T2A is shown in SEQ ID NO: 1.
  • T2A four different base sequences optimized for human codons were designed and named T2A1, T2A2, T2A3 and T2A4, respectively.
  • the respective base sequences are shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 4, and 5.
  • the amino acid sequence of P2A is shown in SEQ ID NO: 6, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • DNA fragments having the base sequences of T2A1, T2A2, T2A3, T2A4 and P2A were respectively synthesized.
  • pDON5-hOKSLN (T2A) was prepared by replacing the P2A fragment of pDON5-hOKSLN with a T2A4 fragment.
  • the structure of each inserted DNA fragment is shown in FIG.
  • the base sequence of the insert fragment of pDON5-hOKSLN (T2A) is shown in SEQ ID NO: 8.
  • Preparation Example 2 Construction of MicroRNA Avoidance Type iPS Cell Inducing Plasmid MicroRNA (miRNA) is RNA that suppresses target gene expression by inhibiting messenger RNA degradation and translation. There are miR-470 and miR-134 target sites in the coding region of the mouse OCT4 gene and mouse SOX2 gene, respectively, and the expression of these target genes is suppressed in differentiated cells. It has been reported that these miRNA target regions are also conserved in human OCT4 and SOX2 genes (Nature, 455, 1124-8, 2008). In order to prevent miRNA expression inhibition after gene introduction, mutations were introduced into regions encoding OCT4 and SOX2.
  • Mutation was introduced by PCR using a plasmid vector containing a DNA fragment encoding 1.1 kbp OCT4 obtained by PCR amplification and a DNA fragment encoding about 1 kbp SOX2 as a template, and using a mutation introduction primer having a mutation sequence. And obtained by transforming E. coli with the PCR product.
  • the DNA fragments after mutagenesis are described as OCT4mt and SOX2mt.
  • OCT4mt the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the DNA fragment encoding OCT4 is mutated to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • SOX2mt the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the DNA fragment encoding SOX2 is mutated to the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • OCT4mt and SOX2mt encode a polypeptide sequence having the same amino acid sequence as the original OCT4 and SOX2.
  • Table 2 shows the nucleotide sequences before and after mutagenesis. In Table 2, the base into which the mutation is introduced is shown in lower case letters.
  • a DNA fragment comprising the 5 ′ end in the order shown in Table 3 was prepared in the same manner as in Preparation Example 1, and inserted into the retroviral vector pDON-5 DNA.
  • pDON5-hOKSLmt and pDON5-hOKSLNmt were constructed.
  • Retroviral Vector G3Thi cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were treated with 10F-DMEM [10% fetal bovine serum (manufactured by Invitrogen) at 5 ⁇ 10 5 cells / mL. And 50 U / ml penicillin / 50 mg / ml streptomycin (Nacalai) -containing D-MEM (Sigma)], 4 mL of the suspension was seeded on a 6 cm collagen-coated dish (Iwaki), and CO at 37 ° C. The cells were cultured for 24 hours in 2 incubators.
  • 10F-DMEM 10% fetal bovine serum (manufactured by Invitrogen) at 5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • 4 mL of the suspension was seeded on a 6 cm collagen
  • OPTI-MEM manufactured by Invitrogen
  • 10 ⁇ L of TransIT (registered trademark) -293 manufactured by Takara Bio Inc.
  • 2 ⁇ g of pGP plasmid manufactured by Takara Bio Inc.
  • 1 ⁇ g of pE-Ampho plasmid Teakara Bio Inc.
  • 2 ⁇ g of each of the recombinant plasmids prepared in Preparation Examples 1 and 2 were added and mixed, and the mixture was further allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • This mixed solution was added to the above G3Thi cells and the culture was continued.
  • the mixture was replaced with 4 mL of 10F-DMEM medium. After further culturing for 24 hours, the virus-containing medium was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m filter to prepare a virus solution containing a retrovirus vector. The virus solution was stored frozen at ⁇ 80 ° C. and dissolved at room temperature when used.
  • retroviral vectors pDON-5 OCT3 / 4-SOX2, LIN28, and NANOG are used to translate OCT4 and SOX2 into polycistronic through IRES (Internal Ribosome Entry Site) derived from Encephalomyocarditis virus.
  • retroviral vector pDON-5 LIN28-NANOG for translation into polycistronic and the human iPS Cell Generation (registered trademark) Vector Set (manufactured by Takara Bio Inc.) consisting of the retroviral vector pDON-5 KLF4 expressing KLF4 It was. In the control, each virus was mixed at 3.55 ⁇ 10 9 copies / mL. Table 4 shows the name of the vector and the name of each virus solution.
  • Example 1 Induction of iPS cells-1 (1) Immobilization of retronectin on culture plate Retronectin (Takara Bio) diluted with phosphate buffered water solution (PBS) so that each well of a non-treatment 12-well culture plate (Becton Dickinson) has a concentration of 20 ⁇ g / mL. 1 mL of the solution was added, and fixed at 4 ° C. overnight or at room temperature for 2 hours. Thereafter, the solution was removed from each well, washed once with PBS, and stored at 4 ° C. until subjected to each experiment.
  • PBS phosphate buffered water solution
  • Each well 20000 Cells was seeded on the feeder cells and cultured overnight. The next day, the supernatant was removed on the 7th day of culture, and medium for ES cells [80% D-MEM / F-12 (Invitrogen), 20% KnockOut Serum Replacement (Invitrogen), 4 ng / mL human basic FGF] (CALBIOCHEM), 1 ⁇ Non-essential amino acids solution (Lonza), 2 mM L-Glutamine (Lonza), 110 ⁇ M 2-mercaptoethanol (Invitrogen), 50 U / mL penicillin / 50 mg / mL streptomycin 2 mL of each well was added, and the culture was continued until the 28th day of culture. During this time, the medium was changed every two days.
  • a vector (2A vector) holding a gene encoding a fusion polypeptide in which nuclear reprogramming factors are connected by a 2A peptide is a conventional condition (IRES vector) in which a vector using IRES is mixed.
  • IPS cells were induced approximately twice as efficiently as (A) (Comparison between conditions F and D).
  • iPS cell induction efficiency increased nearly twice as compared with the virus having the original sequence (comparison between Condition D and Dmt).
  • Example 1- (1) First gene transfer with retroviral vector Immobilization of retronectin on the culture plate was performed in the same manner as in Example 1- (1). Gene transfer using retronectin was performed in the same manner as in Example 1- (2) using virus solutions B, D and F shown in Table 4. At this time, a virus-coated plate for the second gene transfer was simultaneously prepared, and PBS containing 1% buminate was added instead of the cell suspension, and stored at 4 ° C.
  • the gene transfer by polybrene was performed by the following method. Specifically, human skin fibroblasts suspended in 10F-DMEM at a concentration of 4 ⁇ 10 4 cells / mL were seeded in 1 well each in a 12-well culture plate 1 day before culturing and cultured for 1 day.
  • the supernatant is removed from the cell culture plate, and 1 mL of a preparation solution in which polybrene (hexadimethrin bromide; manufactured by Aldrich) is added to virus solutions B, D, and F so as to have a final concentration of 8 ⁇ g / mL is added to each well.
  • the culture was started (culture day 0).
  • Example 3 Comparison of viral load It became clear that iPS cells could be efficiently induced by using the 2A vector. Therefore, iPS cell induction with a smaller amount of virus was attempted.
  • Retronectin was immobilized on a culture plate in the same manner as in Example 1- (1). Gene transfer by retronectin was performed twice using the virus solution D or F shown in Table 4 in the same manner as in Example 2- (1) and (2). However, as for the viral load, two conditions of 3.55 ⁇ 10 9 copies / mL or 3.55 ⁇ 10 8 copies / mL were set.
  • Example 4 Comparison of Retronectin and Polybrene-2 In addition to the retrial of Example 2, the genes used were examined.
  • Retronectin was immobilized on a culture plate in the same manner as in Example 1- (1). Gene transfer using retronectin or polybrene was performed twice using the virus solutions A, B, Bmt, C, D, Dmt and F shown in Table 4 in the same manner as in Examples 2- (1) and (2). .
  • iPS cells can be induced much more efficiently when retronectin is used compared to infection with polybrene.
  • the efficiency was higher when 5 genes were used than when 4 or 3 genes were used, suggesting that LIN28 is more important than Nanog in the case of 4 genes. It was again confirmed that the miRNA mutation increases the induction efficiency of iPS cells.
  • Example 5 Examination of OKSLN (T2A) Vector Pluripotent stem cells were induced using a vector in which the coding regions of LIN28 and NANOG genes were linked with the T2A4 fragment instead of the P2A fragment used in Examples 1 to 4. Furthermore, the number of virus freezes was also examined.
  • Retronectin was immobilized on a culture plate in the same manner as in Example 1- (1). Gene transfer with retronectin or polybrene was performed once using the virus solutions D, E and F shown in Table 4 by the same method as in Example 2- (2). The virus solution E of the same lot was freeze-thawed 1 to 5 times at ⁇ 80 ° C. For virus solutions D and F, a virus frozen once was used.
  • pDON5-hOKSLN T2A induced pluripotent stem cells very efficiently, similar to pDON5-hOKSLN (P2A). It was again confirmed that pluripotent stem cells could be induced much more efficiently when retronectin was used than when infected with polybrene. Furthermore, it was shown that the virus solution containing pDON5-hOKSLN (T2A) does not significantly reduce the induction efficiency of pluripotent stem cells even if it is frozen up to 5 times, and is very practical.
  • Example 6 Measurement of Provirus Copy Number Among the pluripotent stem cells induced in Examples 1 and 4, pluripotent stem cell colonies induced under conditions D and F using retronectin were respectively collected under a microscope. And cloned by passage into 24-well plates. Each clone was subjected to expansion culture, and then genomic DNA was extracted.
  • Genomic extraction A pluripotent stem cell clone that became confluent in one well of a 6-well plate was treated with an ES cell detachment solution (20% Knockout Serum Replacement, 1 mM CaCl2, 0.1 mg / mL Collagenase IV, 0.25% The genome was extracted using a PUREGENE DNA Purification kit (manufactured by QIAGEN).
  • the 2A vector was able to induce pluripotent stem cells, although the number of DNA fragments inserted into the genome was smaller than that of the IRES vector.
  • the low copy number of DNA fragments integrated into the genome is extremely useful in terms of safety.
  • the present invention provides a nucleic acid for efficiently producing pluripotent stem cells.
  • the nucleic acid is used in a method for efficiently and safely producing pluripotent stem cells, and is extremely useful in basic research, medical application research fields, and the like.
  • SEQ ID NO: 1 T2A peptide fragment
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of T2A1 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of T2A2 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence of T2A3 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence of T2A4 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 6 P2A peptide fragment
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide sequence of P2A DNA fragment
  • SEQ ID NO: 8 Nucleotide sequence of pDON-hOKSLN (T2A) insertion fragment
  • SEQ ID NO: 9 Nucleotide sequence for a portion of native OCT4 gene.
  • SEQ ID NO: 10 Nucleotide sequence for a portion of mutant OCT4 gene.
  • SEQ ID NO: 11 Nucleotide sequence for a portion of native SOX2 gene.
  • SEQ ID NO: 12 Nucleotide sequence for a portion of mutant SOX2 gene.

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Abstract

　本発明により、自己切断ペプチドをコードする配列を介して相互に接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８の４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含み、かつＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まない核酸、当該核酸を含むベクター、当該核酸又はベクターを含む細胞、ならびに体細胞に前記核酸又は前記ベクターを導入する工程を包含することを特徴とする多能性幹細胞の製造方法が提供される。

Description

多能性幹細胞の製造のための核酸
　本発明は、種々の細胞への分化能力を保持した多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）を製造するための核酸、及び当該核酸を使用する多能性幹細胞の製造方法に関する。
　なお、本願は、２００９年１２月３日出願の日本国特許出願第２００９－２７５０３２号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９－２７５０３２号の全内容を本願に組み込むものである。
　生物体のすべての細胞系列に分化可能な多能性幹細胞は、任意のタイプの細胞に分化し、また、任意のタイプの組織、器官等を生みだす潜在的能力を有している。そのため、当該細胞を使用して、生物体において失われた細胞を再生し補うという新しい治療法（再生医療）に応用することが期待されている。更に、発生学、分子生物学、薬学分野における研究ツールとしても利用可能性を有している。
　多能性幹細胞として、胚盤胞と呼ばれる段階の初期胚の内部細胞塊から樹立される細胞株である胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）が知られている。しかしながら、ヒト胚を破壊して作製されるヒトＥＳ細胞は、倫理的観点からの反対も多く、その研究が制限されるケースも少なくない。
　これらＥＳ細胞の問題点を解消するため、胚を使用することなく体細胞に人為的に遺伝子を導入して誘導される細胞株である多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞：例えば非特許文献１）が開発された。当該細胞は、細胞の全能性の獲得又は維持に関与する遺伝子を人為的に体細胞に導入することにより作製される。現在、その作製手法及び利用方法に関して、盛んに研究が進められている。
　前記の非特許文献１には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ及びＫＬＦ４の４種のポリペプチドをそれぞれコードする遺伝子を導入し、これらポリペプチドを細胞内で個別に発現させることによってヒトｉＰＳ細胞を作製する方法が開示されている。また、他の研究者からは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４種のポリペプチドをコードする遺伝子を用いた同様の操作によって、ヒトｉＰＳ細胞を作製したとの報告がなされている（非特許文献２）。しかし、これらの遺伝子を導入されたすべての体細胞がｉＰＳ細胞に誘導されることはなく、実際にはその一部のみ（総細胞数の０．０２％以下）がｉＰＳ細胞へと誘導されるに過ぎない。この効率を向上させるため、ＤＮＡのメチル化を阻害する薬剤を培地に添加することが試みられている（非特許文献３）。また、ｃ－ＭＹＣはがん遺伝子であり、医療への応用を行う際には、導入された細胞のがん化のリスクが不可避である。そのため、ｃ－ＭＹＣを除いてｉＰＳ細胞を誘導する試みがなされているが、その場合、誘導効率はさらに低下する（総細胞数の０．００１％以下）。このように、ｉＰＳ細胞作製技術は未だ確立したとはいえない状況にある。
セル（Ｃｅｌｌ）、第１３１巻、８６１－８７２頁、２００７年 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３１８巻、１９１７－１９２０頁、２００７年 ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７０５６、２００８年
　多能性幹細胞の利用を図るためには、当該細胞を効率よく製造する手法の開発が急務である。本発明の目的は、多能性幹細胞を効率よく製造するための方法を提供し、当該細胞の研究ならびに利用を促進することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、多くの核初期化因子の候補の中から、ＥＳ細胞様の細胞、すなわち多能性を保持した幹細胞を高頻度でかつ安全に誘導し、多能性幹細胞を高効率で安定して製造できる核初期化因子の組合せを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］自己切断ペプチドをコードする配列を介して相互に接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８の４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含み、かつＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まない核酸、
［２］５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８遺伝子の各コード領域を含む、［１］記載の核酸、
［３］自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域をさらに含む、［１］記載の核酸、
［４］５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子の各コード領域を含む、［３］記載の核酸、
［５］自己切断ペプチドが、Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド及びｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチドからなる群より選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の核酸、
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の核酸を含むベクター、
［７］［１］～［５］のいずれかに記載の核酸又は［６］記載のベクターを含む細胞、
［８］［１］～［５］のいずれかに記載の核酸又は［６］記載のベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法、ならびに
［９］核酸又はベクターを導入する工程がフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下で実施される、［８］記載の方法、
に関する。
　本発明の核酸を使用することにより、多能性幹細胞を効率よく製造することが可能であり、当該多能性幹細胞は所望の細胞への分化能を有しており、基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。
図１は、実施例において作製した核酸の構造を示す図である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本明細書において「核初期化因子」とは、ＥＳ細胞などで発現している分化、発生、増殖などに関係する因子のうち、核の初期化（リプログラミング）に関与する因子を意味する。核初期化因子となる候補は、多数報告されている。例えば、セル（Ｃｅｌｌ）、第１２６巻、６６３－６７６頁、２００６年には、２４種の核初期化因子の候補が記載されている。非特許文献２には、１４種の核初期化因子の候補が記載されている。
　本明細書において「自己切断ペプチド」とは、ペプチド配列自体の中の２つのアミノ酸残基の間に生じる切断活性を伴うペプチド配列を意味する。例えば、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドでは、切断はこれらのペプチド上のグリシン残基とプロリン残基との間で生じる。これは、翻訳の間に、グリシン残基とプロリン残基との間の正常なペプチド結合の形成が行われない「リボソームスキップ機構」によって生じ、下流の翻訳には影響することはない。かかるリボソームスキップ機構は当該分野において知られており、そして１分子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされる複数のタンパク質の発現のために使用される。
　本明細書において「コード領域」とは、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果生じるポリペプチドに見られるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。
　本明細書において「体細胞」とは、生物を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の細胞のことを示す。これら体細胞では、核初期化因子を接触させることにより、リプログラミングが起こり、多能性を獲得する。
（１）本発明の核酸及びベクター
　本発明の核酸は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８の４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含むが、ＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まず、かつ、それぞれの遺伝子のコード領域の間に自己切断ペプチドをコードする配列を含む核酸である。前記４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域の順は、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて特に限定はないが、例えば、核酸の５’末端から順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８遺伝子の各コード領域を含む核酸が好ましい。
　本発明の１つの態様として、本発明の核酸はＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域をさらに含み得る。すなわち、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧの５種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含み、かつそれぞれの核初期化因子のコード領域の間に自己切断ペプチドのコード領域を含む核酸も、本発明に含まれる。前記５種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域の順も、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて特に限定はないが、例えば、核酸の５’末端から順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子の各コード領域を含む核酸が好ましい。
　本発明の核酸は、体細胞内で１つのｍＲＮＡとして転写される。転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドは、自己切断ペプチド内において切断される。例えば、自己切断ペプチドが２Ａペプチドである場合、本発明の核酸から転写されたｍＲＮＡが翻訳される時に、リボソームは２Ａペプチド内において特定の１カ所のペプチド結合を連結せず、２Ａペプチド配列の５’末端側にコードされるポリペプチドと３’末端側にコードされるポリペプチドとを別のポリペプチドとして翻訳する。結果、本発明の核酸にコードされる核初期化因子は、別々のポリペプチドとして生じる。
　したがって、本発明の核酸がコードする複数の核初期化因子は、１種も欠けることなく、すべてがほぼ同じ分子数（等量）で発現する。
　本発明の核酸に使用される核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域は、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）の登録情報からその塩基配列を入手することができる。当業者であれば、登録情報に含まれる塩基配列に基づき、核初期化因子の成熟タンパク質又はプレプロタンパク質のＮ末端からＣ末端までをコードする塩基配列を入手することができる。次に、前記塩基配列に基づいてプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲなどにより核初期化因子をコードするＤＮＡフラグメントを調製することができる。
　本発明の核酸に使用される核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域には、野生型遺伝子のコード領域が使用できる。更に、前記核初期化因子には複数の変異型（バリアント）の存在が報告されており、これらの変異型遺伝子のコード領域も本発明に使用できる。野生型遺伝子のコード領域の塩基配列に人為的に１個又は数個、好ましくは１～９個、より好ましくは１～６個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列であって、野生型がコードする核初期化因子と同様の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列も使用できる。
　ＯＣＴ４は、ＰＯＵファミリーに属する転写因子で、多能性の維持又は未分化マーカーとして報告されている。本発明の核酸に含まれるＯＣＴ４遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４に示される。例えば、ＯＣＴ４遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号１～１０８１に示される塩基配列である。
　また、マウスＯＣＴ４遺伝子のコード領域には、ｍＲＮＡの分解、及び翻訳の阻害によって標的遺伝子の発現を抑制するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ－４７０の標的配列が存在し、分化した細胞においてこれらの標的遺伝子の発現を抑制している。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、ヒトＯＣＴ４遺伝子においても保存されていることが報告されている。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐために、ＯＣＴ４遺伝子のコード領域に変異を導入してもよい。例えば、下記実施例の表２に示されるような変異を導入したＯＣＴ４遺伝子のコード領域が使用できる。この変異コード領域は、配列番号８の塩基番号１～１０８１に示されるＯＣＴ４遺伝子のコード領域のうち、塩基番号３９３～４１３（配列番号９の塩基配列）が配列番号１０に示される塩基配列に置換されている。
　ＫＬＦ４は、腫瘍抑制因子又は発癌因子として機能する転写因子である。本発明の核酸に含まれるＫＬＦ４遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４２３５．３に示される。例えば、ＫＬＦ４遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号１１４７～２５５６に示される塩基配列である。
　ＳＯＸ２は、Ｓｏｘ（ＳＲＹ－ｒｅｌａｔｅｄ　ＨＭＧ　ｂｏｘ）遺伝子ファミリーに属し、ＤＮＡ結合能を持つＨＭＧドメイン及び転写活性化ドメインからなる転写因子である。本発明の核酸に含まれるＳＯＸ２遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３１０６．２に示される。例えば、ＳＯＸ２遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号２６２３～３５７３に示される塩基配列である。
　また、マウスＳＯＸ２遺伝子のコード領域には、前記ＯＣＴ４と同様にｍｉＲ－１３４の標的配列が存在する。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐために、ＳＯＸ２遺伝子のコード領域に変異を導入してもよい。例えば、下記実施例の表２に示されるような変異を導入したＳＯＸ２遺伝子のコード領域が使用できる。この変異コード領域は、配列番号８の塩基番号２６２３～３５７３に示されるＳＯＸ２遺伝子のコード領域のうち、塩基番号３２４２～３２６３の塩基配列（配列番号１１の塩基配列）が配列番号１２に示される塩基配列に置換されている。
　ＬＩＮ２８は、ｌｅｔ－７ｍｉＲＮＡプロセシングを選択的に抑制するＲＮＡ結合タンパク質である。本発明の核酸に含まれるＬＩＮ２８遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２４６７４．４に示される。例えば、ＬＩＮ２８遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号３６４０～４２６６に示される塩基配列である。
　ＮＡＮＯＧは、ホメオボックス転写因子である。本発明の核酸に含まれるＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２４８６５．２に示される。例えば、ＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号４３３６～５２５３に示される塩基配列である。
　本発明の核酸は、ＭＹＣファミリー遺伝子を含まないことを特徴とする。がん遺伝子であるＭＹＣファミリー遺伝子を含まないので、本発明の核酸から発現する核初期化因子により、体細胞をより安全にリプログラミングすることができる。ＭＹＣファミリー遺伝子は、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣが含まれる［ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．）、第１１９巻、２０８－２１６頁、２００６年］。例えば、ｃ－ＭＹＣのコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４６７、Ｎ－ＭＹＣのコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５３７８、Ｌ－ＭＹＣのコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５３７６に示される。
　本発明の核酸に使用する自己切断ペプチドは、ウイルスの２Ａ又は２Ａ様配列から得ることが可能である。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ－１）由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）及びＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）から成る群から選択することができる。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＴ２Ａ、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＰ２Ａを使用することができる。２Ａペプチドは、エキスパート　オピニオン　オン　バイオロジカル　セラピー、第５巻、６２７－６３８頁、２００５年に総説されている。
　本発明の核酸は複数の「自己切断ペプチドをコードする塩基配列」を含み得る。これらは、同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよく、異なるアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよい。同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドコードするものであっても、塩基配列がそれぞれ異なっていてもよい。更に、本発明の核酸が発現される細胞のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）に合わせて、塩基配列を改変させてもよい。例えば、配列番号２～５に示される塩基配列を有するＴ２Ａをコードする配列、配列番号７に示される塩基配列を有するＰ２Ａをコードする配列に改変させてもよい。
　更に、本発明の核酸は、核初期化因子の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば、薬剤耐性に関する因子をコードする遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）のコード領域を含みうる。
　本発明の核酸は、適当なプロモーターの制御下で発現されるように別の核酸と連結して使用することができる。プロモーターとしては、構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に本発明の核酸に加えて、当該核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
　本発明の核酸は、体細胞に導入するために、ベクターに挿入して使用することができる。本発明の核酸が挿入されるベクターには特に限定はなく、公知のベクターより適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、又は非ウイルスベクターを使用する方法のいずれもが本発明に使用できる。これらのベクターの詳細についてはすでに多くの文献が公表されており、これら多くの文献より適宜選択して使用すればよい。
　上記のウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びシュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が使用できる。特に好適には、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
　また、上記の非ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知の非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクターが使用できる。
（２）本発明の多能性幹細胞の製造方法。
　本発明の多能性幹細胞の製造方法は、前記（１）に記載する本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該方法は、従来の複数種の核酸又はベクターを同時に体細胞に導入する方法と比べて、多能性幹細胞を高効率で製造することができ、本発明の核酸又はベクターを導入した細胞の約０．１～２％が多能性幹細胞に誘導される。更に、本発明の方法で製造される多能性幹細胞は、導入される核酸又はベクターのコピー数が極めて少なく、導入された核酸又はベクターが染色体に組み込まれる場合、その安全性は飛躍的に向上する。また、本発明の方法によれば、少ない核酸量又は少ないベクター量で多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造でき、極めて有用である。
　本発明の方法に使用される体細胞に特に限定はなく、任意の体細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等の体細胞を使用することができる。前記の体細胞は生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。作製された多能性幹細胞もしくは当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身から採取された体細胞から多能性幹細胞を誘導することが好ましい。
　本発明の方法において、核酸又はベクターを体細胞に導入する工程は、使用する体細胞及びベクターに応じて適宜操作することができる。非ウイルスベクターを使用する場合、リポソーム、リガンド－ポリリジンなどの担体を使用して導入する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などで導入することができる。また、ウイルスベクターを使用する場合、核酸又はベクター導入の際に、導入効率を向上させる物質を用いることもできる。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えば、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えば、レトロネクチン（登録商標、ＣＨ－２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。更に、本発明を特に限定するものではないが、前記の物質は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用する遺伝子導入に特に好適である。
　従来、多能性幹細胞の誘導を目的としたレトロウイルスベクターによる遺伝子導入では、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレンが使用されてきた。本発明者らは、ポリブレンを使用せず、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下で、レトロウイルスベクターを使用して本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入した場合には、ポリブレンを使用した場合と比較して多能性幹細胞の誘導効率が向上する結果、高頻度で多能性幹細胞を取得できることを見出した。すなわち、本発明の１つの態様として、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法が提供される。
　また、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質としては、当該活性を有する物質であれば特に問題はないが、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン、ＤＥＡＥ－デキストラン等が挙げられる。更に、前記物質由来のレトロウイルスに結合部位を有する機能性物質を本発明に使用することができる。フィブロネクチンフラグメントとしては分子内にヘパリン－ＩＩ結合領域を有するものが好適であり、そのようなフラグメントは、例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレットにも記載されている。ヘパリン－ＩＩ結合領域を有する組換えフィブロネクチンフラグメントとしては、レトロネクチン（登録商標、ＣＨ－２９６、タカラバイオ社製）が例示される。また、これらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体等を使用することができる。
　更に、レトロウイルスに結合する活性とともに標的細胞、すなわち核酸又はベクターを導入しようとする体細胞への結合活性を有する機能性物質を併用してもよく、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質及び標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用してもよい。標的細胞結合活性を有する機能性物質にも、特に限定はないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質が挙げられる。該リガンドとしては、細胞接着性のタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）もしくはそのフラグメント、ホルモン、サイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質もしくは糖脂質由来の糖鎖、標的細胞の代謝物等が挙げられる。
　本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば、細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコもしくはバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用される。
　本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する場合、フィーダー細胞上に培養された体細胞に対して導入を行ってもよいが、フィーダー細胞を使用することなく体細胞に導入を行ってもよい。フィーダー細胞としては、ＥＳ細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を適宜使用することができるが、例えば、マウス１４～１５日胚の繊維芽細胞初代培養細胞、繊維芽細胞由来細胞株であるＳＴＯ細胞等をマイトマイシンＣ等の薬剤又は放射線により処理した細胞等を使用することができる。本発明の核酸又はベクターを導入した体細胞の培養はフィーダー細胞上で行うことが好ましいが、フィーダー細胞を使用しないＥＳ細胞の培養方法も報告されており、本発明にて使用することができる。
　本発明の核酸又はベクターを導入した体細胞を適切な条件下で培養することにより、自律的に核のリプログラミングが進行し、体細胞から多能性幹細胞を製造することができる。当該培養には、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に使用可能な公知の培地を使用することができる。本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入した後、体細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり細胞を培養することが好ましい。本発明の核酸又はベクターの導入後の体細胞の培養密度は、例えば、細胞培養用ディッシュあたり１×１０４～１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で培養を継続することが好ましい。
　本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する工程を実施してからＥＳ細胞用の培地に交換するまで、通常の体細胞を培養するための培地を使用して、例えば、１～１２日間、好ましくは２～１０日間培養することができる。その後ＥＳ細胞用培地に培地を交換して、例えば、５～４０日間、好ましくは１０～３５日間培養してもよい。
　本発明の核酸又はベクターを導入した体細胞が多能性を獲得したことは、例えば、未分化細胞に特有のマーカー、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＡＢＣＧ－２、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等を検出することにより容易に判定することができる。マーカーの種類及び判定手段については、公知文献により具体的かつ詳細に説明されている（例えば、セル、第１２６巻、６６３－６７６頁、２００６年、セル、第１３１巻、８６１－８７２頁、２００７年）。ＥＳ細胞特異的発現遺伝子のプロモーター下流にＧＦＰ等のマーカー遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する体細胞を使用した場合は、当該マーカー遺伝子の発現を指標として多能性幹細胞を特定することが可能である。また、一般的に、多能性の獲得はコロニー形成により判定することもできる。コロニーは通常５００～１０００ｃｅｌｌｓの細胞集団であり、特徴的な外観を呈することが知られているので、多能性幹細胞が増殖して形成したコロニーを容易に特定することができる。
　こうして得られた多能性幹細胞のコロニーを単離してクローニングを実施することにより、多能性を有しない細胞が除去された、多能性幹細胞の細胞株を樹立することができる。
　以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。
調製例１　２Ａペプチド連結型ｉＰＳ細胞誘導プラスミドｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＮ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）及びｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）プラスミドの構築
　ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４２３５．３（ＫＬＦ４遺伝子）及びＮＭ＿００３１０６．２（ＳＯＸ２遺伝子）の配列情報より、遺伝子増幅用合成プライマーをそれぞれ合成した。ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社製）より合成したｃＤＮＡを鋳型とし、各核初期化因子の遺伝子に対応するプライマー対を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＭＡＸ　ＰｒｅＭｉｘ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行った。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＫＬＦ４については約１．５ｋｂｐ、ＳＯＸ２については約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを抽出、精製した。また、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４（ＯＣＴ４遺伝子）、ＮＭ＿０２４６７４．４（ＬＩＮ２８遺伝子）、ＮＭ＿０２４８６５．２（ＮＡＮＯＧ遺伝子）の配列情報により、ＯＣＴ４については約１．１ｋｂｐ、ＬＩＮ２８については約０．７ｋｂｐ、ＮＡＮＯＧについては約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。
　Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ及びＰｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１由来の２Ａペプチド配列、Ｔ２Ａ及びＰ２Ａを、公知文献（ネイチャー　バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第５号、５８９－９４頁、２００４年）より得た。Ｔ２Ａのアミノ酸配列を配列番号１に示す。Ｔ２Ａのアミノ酸配列に対して、ヒトのコドンに最適化した４種類の異なる塩基配列を設計し、それぞれＴ２Ａ１、Ｔ２Ａ２、Ｔ２Ａ３及びＴ２Ａ４と命名した。それぞれの塩基配列を配列番号２、３、４及び５に示す。また、Ｐ２Ａのアミノ酸配列を配列番号６に、塩基配列を配列番号７に示す。Ｔ２Ａ１、Ｔ２Ａ２、Ｔ２Ａ３、Ｔ２Ａ４及びＰ２Ａの塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをそれぞれ合成した。
　前記の核初期化因子のコード領域由来のＤＮＡフラグメント及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを用いて、ベクターへのサブクローニング、ＰＣＲ、制限酵素消化及びライゲーション反応を繰り返し、核初期化因子のコード領域及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを５’末端から表１に記載される順に含むＤＮＡフラグメントを調製し、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に挿入し、それぞれｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＮ及びｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）と命名した。更に、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮのＰ２ＡフラグメントをＴ２Ａ４フラグメントに置換したｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）を調製した。各挿入ＤＮＡフラグメントの構造を図１に示す。ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）の挿入フラグメントの塩基配列を配列番号８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
調製例２　マイクロＲＮＡ回避型ｉＰＳ細胞誘導プラスミドの構築
　マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡの分解と翻訳の阻害によって標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡである。マウスＯＣＴ４遺伝子のコード領域にはｍｉＲ－４７０の、マウスＳＯＸ２遺伝子のコード領域にはｍｉＲ－１３４の標的サイトがそれぞれ存在し、分化した細胞においてこれらの標的遺伝子の発現を抑制している。これらのｍｉＲＮＡ標的領域はヒトのＯＣＴ４及びＳＯＸ２遺伝子においても保存されていることが報告されている（ネイチャー、第４５５巻、１１２４－８頁、２００８年）。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐために、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２をコードする領域に変異を導入した。変異の導入は、上記のＰＣＲ増幅により得られた１．１ｋｂｐのＯＣＴ４をコードするＤＮＡフラグメント及び約１ｋｂｐＳＯＸ２をコードするＤＮＡフラグメントを含むプラスミドベクターを鋳型とし、変異配列を有する変異導入プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物により大腸菌を形質転換することにより取得した。変異導入後のＤＮＡフラグメントをＯＣＴ４ｍｔ及びＳＯＸ２ｍｔと記載する。ＯＣＴ４ｍｔでは、ＯＣＴ４をコードするＤＮＡフラグメント中の配列番号９に示される塩基配列が、配列番号１０に示される塩基配列に変異している。また、ＳＯＸ２ｍｔではＳＯＸ２をコードするＤＮＡフラグメント中の配列番号１１に示される塩基配列が、配列番号１２に示される塩基配列に変異している。なお、ＯＣＴ４ｍｔ及びＳＯＸ２ｍｔは、本来のＯＣＴ４及びＳＯＸ２と同一のアミノ酸配列のポリペプチド配列をコードしている。変異導入前後の塩基配列を表２に示す。表２中、変異を導入した塩基を小文字で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＯＣＴ４ｍｔ及びＳＯＸ２ｍｔをコードするＤＮＡフラグメントを使用し、調製例１と同様の方法で、５’末端から表３に記載される順に含むＤＮＡフラグメントを調製し、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＤＮＡに挿入し、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬｍｔ及びｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮｍｔを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
調製例３　レトロウイルスベクターの調製
（１）レトロウイルスベクターの産生
　Ｇ３Ｔｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭ［１０％牛胎児血清（インビトロジェン社製）及び５０Ｕ／ｍｌペニシリン／５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライ社製）含有Ｄ－ＭＥＭ（シグマ社製）］に懸濁し、その４ｍＬを６ｃｍコラーゲンコートディッシュ（イワキ社製）に播種して、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。
　５００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（インビトロジェン社製）に１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３（タカラバイオ社製）を混合し、室温で５分放置後、２μｇのｐＧＰプラスミド（タカラバイオ社製）、１μｇのｐＥ－Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）及び２μｇの調製例１及び２で調製した各組換えプラスミドをそれぞれ加えて混合し、更に１５分間室温で放置した。この混合液を上記のＧ３Ｔｈｉ細胞に添加して培養を継続し、２４時間後に４ｍＬの１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地に交換した。更に２４時間培養を継続した後、ウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過してレトロウイルスベクターを含むウイルス液を調製した。ウイルス液は－８０℃で凍結保存し、使用時に室温にて溶解した。
（２）レトロウイルスベクターの力価測定
　得られたレトロウイルスベクターをＤＮａｓｅＩで処理した後、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｔｉｔｅｒ　Ｓｅｔ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）を用いて１ｍＬ当たりのウイルスＲＮＡコピー数を算出した。
（３）ウイルス液の混合及び希釈
　レトロウイルスは、調製例３－（２）で測定した力価に基づいて、特に記載のない限り３．５５×１０９コピー／ｍＬとなるよう１０Ｆ－ＤＭＥＭにて希釈した。なおコントロールとして、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２をＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ由来のＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｒｉｂｏｓｏｍｅ　Ｅｎｔｒｙ　Ｓｉｔｅ）を介してポリシストロニックに翻訳させるためのレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＯＣＴ３／４－ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧをＩＲＥＳを介してポリシストロニックに翻訳させるためのレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＬＩＮ２８－ＮＡＮＯＧ、及びＫＬＦ４を発現するレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＫＬＦ４からなるＨｕｍａｎ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（登録商標）　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いた。コントロールでは、各ウイルスが３．５５×１０９コピー／ｍＬとなるよう混合した。表４にベクター名と各ウイルス液の名称を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１　ｉＰＳ細胞の誘導－１
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
　ノントリートメント１２穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウェルに２０μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）で希釈したレトロネクチン（タカラバイオ社製）溶液を１ｍＬずつ添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定化を行った。その後、各ウェルより溶液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄の後、各実験に供するまで４℃で保存した。
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　実施例１－（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウェルに表４に示すウイルス液Ｂ、Ｄ、Ｄｍｔ及びＦを１ｍＬずつ添加し、３２℃、２、０００×ｇで２時間遠心した。その後、各ウェルより上清を除去して、１％ブミネート（献血アルブミン、バクスター社製）を含むＰＢＳで１回洗浄後、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を１ｍＬずつ各ウェルに播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。
（３）フィーダー細胞上への播種
　６穴培養プレート（コーニング社製）に終濃度１ｍｇ／ｍＬのゼラチン（シグマ社製）水溶液を各ウェル１ｍＬ添加し、３７℃３０分で固定化した。ここに終濃度１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）で処理したＳＴＯ細胞（ＤＳファーマ社製）を、各ウェル２．５×１０５ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養することによりフィーダー細胞を調製した。実施例１－（２）で作製した培養６日目の遺伝子導入細胞を回収し１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地に懸濁した。各ウェル２００００Ｃｅｌｌｓを前記のフィーダー細胞上に播種し、終夜培養した。翌日、培養７日目に上清を除去し、ＥＳ細胞用培地［８０％　Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（インビトロジェン社製）、２０％　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）、４ｎｇ／ｍＬ　ｈｕｍａｎ　ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、１×Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ社製）、２ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔｈａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ社製）、１１０μＭ　２－メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン］を各ウェル２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間、２日おきに培地を交換した。
（４）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２８日目にＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によってアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性をもつ細胞を染色した。ＡＰ活性を示しかつヒトＥＳ細胞様の形態を示すｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、核初期化因子を２Ａペプチドで接続した融合ポリペプチドをコードする遺伝子を保持するベクター（２Ａベクター）は、ＩＲＥＳを使用するベクターを混合して用いる従来の条件（ＩＲＥＳベクター）と比べ約２倍の効率でｉＰＳ細胞を誘導した（条件ＦとＤとの比較）。また、ｍｉＲＮＡの標的サイトに変異を導入したウイルスでは、本来の配列をもつウイルスと比べｉＰＳ細胞誘導効率が２倍近く上昇した（条件ＤとＤｍｔとの比較）。
実施例２　遠心レトロネクチン法とポリブレン法の比較
　レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に関して、レトロネクチンあるいはポリブレンを使用する条件で多能性幹細胞の誘導を行い、比較した。
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
　レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１－（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては、表４に示すウイルス液Ｂ、Ｄ及びＦを用いて実施例１－（２）と同様の方法で行った。このとき、２回目の遺伝子導入のためのウイルスコートプレートも同時に調製し、細胞懸濁液の代わりに１％ブミネートを含むＰＢＳを添加し、４℃で保存した。ポリブレンによる遺伝子導入に関しては、以下の方法で行った。すなわち、培養１日前に１２穴培養プレートに、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭで懸濁したヒト皮膚繊維芽細胞を１ｍＬずつ各ウェルに播種し、１日培養した。その後、細胞培養プレートより上清を除去し、ウイルス液Ｂ、Ｄ及びＦに終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレン（ヘキサジメトリン・ブロミド；アルドリッチ社製）をそれぞれ加えた調製液を各ウェルに１ｍＬ添加し、培養を開始した（培養０日目）。
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
　２回目の遺伝子導入を培養１日目に行った。レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては、前日遺伝子導入を行った細胞を剥離し、１０Ｆ－ＤＭＥＭに懸濁した後、実施例２－（１）で調製したウイルスコートプレートの各ウェルに播種した。ポリブレンによる感染については、前日遺伝子導入を行った細胞上清を除去し、実施例２－（１）と同様にポリブレンを混合して調製したウイルス液を添加し、培養を継続した。いずれの感染法においても、翌日上清を除去し１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加して培養を継続した。
（３）フィーダー細胞上への播種
　培養６日目に実施例１－（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。
（５）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２７日目に実施例１－（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、いずれのレトロウイルスベクターの組合わせにおいても、レトロネクチン感染法の方がポリブレン感染法に比べ、飛躍的に効率よくｉＰＳ細胞を誘導することが示された。また従来のＩＲＥＳベクターと比べて、２Ａベクターの方が効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが再度確認された。
実施例３　ウイルス量の比較
　２Ａベクターを用いることによって効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが明らかになったため、更に少量のウイルスによるｉＰＳ細胞誘導を試みた。
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１－（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンによる遺伝子導入は、表４に示すウイルス液Ｄ又はＦを用い、実施例２－（１）及び（２）と同様の方法により２回行った。ただし、ウイルス量については３．５５×１０９コピー／ｍＬあるいは３．５５×１０８コピー／ｍＬの２条件を設定した。
（２）フィーダー細胞上への播種
　培養６日目に実施例１－（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。ただし、フィーダーにはＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を用いた。
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２６日目に実施例１－（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表７に示す。ただし、Ｎ．Ｔで示す条件については試験を行わなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、ウイルス量を減らしても効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。また、従来のＩＲＥＳベクターと比べて、２Ａベクターの方が効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが再度確認された。
実施例４　レトロネクチンとポリブレンの比較－２
　実施例２について再試を行うとともに、使用遺伝子の検討を行った。
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１－（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンもしくはポリブレンによる遺伝子導入は、表４に示すウイルス液Ａ、Ｂ、Ｂｍｔ、Ｃ、Ｄ、Ｄｍｔ及びＦを用い、実施例２－（１）及び（２）と同様の方法により２回行った。
（２）フィーダー細胞上への播種
　培養７日目に実施例１－（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。ただし、フィーダーにはＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を用いた。
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養３１日目に実施例１－（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示すように、ポリブレンによる感染と比べ、レトロネクチンを用いた場合に、はるかに効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが再度確認された。使用遺伝子については、５遺伝子を用いた場合に４遺伝子あるいは３遺伝子を用いた条件と比べ効率がよく、４遺伝子の場合ではＬＩＮ２８の方がＮａｎｏｇより重要であることが示唆された。ｍｉＲＮＡ変異については、ｉＰＳ細胞の誘導効率を上昇させることが再度確認された。
実施例５　ＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）ベクターの検討
　ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域を、実施例１から４で用いたＰ２ＡフラグメントではなくＴ２Ａ４フラグメントにて連結したベクターを用いて、多能性幹細胞を誘導した。更に、ウイルス凍結回数についても検討した。
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１－（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンもしくはポリブレンによる遺伝子導入は、表４に示すウイルス液Ｄ、Ｅ及びＦを用い、実施例２－（２）と同様の方法により１回行った。同一ロットのウイルス液Ｅは、－８０℃にて１～５回凍結融解操作を行った。ウイルス液Ｄ及びＦについては、１回凍結させたウイルスを用いた。
（２）フィーダー細胞上への播種
　培養６日目に実施例１－（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。ただし、フィーダーにはＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を用いた。
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養３０日目に実施例１－（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表９に示す。ただし、Ｎ．Ｔで示す条件については試験を行わなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すように、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）はｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）と同様に、非常に効率よく多能性幹細胞を誘導した。また、ポリブレンによる感染と比べ、レトロネクチンを用いた場合にはるかに効率よく多能性幹細胞を誘導できることが再度確認された。更に、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）を含むウイルス液は、凍結を５回まで行っても多能性幹細胞の誘導効率を大きく低下させることはなく、非常に実用的であることが示された。
実施例６　プロウイルスコピー数の計測
　実施例１及び実施例４で誘導した多能性幹細胞のうち、レトロネクチンを使用した条件Ｄ及びＦで誘導された多能性幹細胞コロニーを顕微鏡下でそれぞれ採取し、２４ウェルプレートに継代することでクローン化した。各クローンは拡大培養を行った後で、ゲノムＤＮＡを抽出した。
（１）ゲノム抽出
　６ウェルプレートの１ウェルにてコンフルエントになった多能性幹細胞クローンを、ＥＳ細胞剥離液（２０％　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ＩＶ、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ）で回収し、ＰＵＲＥＧＥＮＥ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノム抽出を行った。
（２）リアルタイムＰＣＲ
　多能性幹細胞クローンのゲノムに挿入されたプロウイルスコピー数は、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ（登録商標）　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲによって算出した。Ｐｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ，Ｈｕｍａｎ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）に付属のプライマーセット及びＤＮＡコントロール　テンプレートを用いて、実施例６－（１）で抽出したゲノムＤＮＡ２００ｎｇあたりのプロウイルスコピー数及びヒトＩＦＮγコピー数をそれぞれ算出し、（レトロウイルスコピー数）／（ヒトＩＦＮγコピー数）×２によって１細胞あたりの挿入レトロウイルスコピー数を得た。その結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、２ＡベクターはＩＲＥＳベクターと比べて、ゲノムへの挿入ＤＮＡフラグメント数が少ないにもかかわらず、多能性幹細胞を誘導できた。ゲノムに組み込まれたＤＮＡフラグメントのコピー数が少ないことは、安全性の面で極めて有用である。
　本発明により、多能性幹細胞を効率よく製造するための核酸が提供される。当該核酸は、多能性幹細胞を効率よくかつ安全に製造する方法に使用され、基礎研究、医療への応用研究分野等において極めて有用である。
  SEQ ID NO:1:T2A peptide fragment
  SEQ ID NO:2:Nucleotide sequence of T2A1 DNA fragment
  SEQ ID NO:3:Nucleotide sequence of T2A2 DNA fragment
  SEQ ID NO:4:Nucleotide sequence of T2A3 DNA fragment
  SEQ ID NO:5:Nucleotide sequence of T2A4 DNA fragment
  SEQ ID NO:6:P2A peptide fragment
  SEQ ID NO:7:Nucleotide sequence of P2A DNA fragment
  SEQ ID NO:8:Nucleotide sequence of pDON-hOKSLN(T2A) insertion fragment
  SEQ ID NO:9:Nucleotide sequence for a portion of native OCT4 gene.
  SEQ ID NO:10:Nucleotide sequence for a portion of mutant OCT4 gene.
  SEQ ID NO:11:Nucleotide sequence for a portion of native SOX2 gene.
  SEQ ID NO:12:Nucleotide sequence for a portion of mutant SOX2 gene.

Claims (9)

  1. 　自己切断ペプチドをコードする配列を介して相互に接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８の４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含み、かつＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まない核酸。
  2. 　５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８遺伝子の各コード領域を含む、請求項１記載の核酸。
  3. 　自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域をさらに含む、請求項１記載の核酸。
  4. 　５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子の各コード領域を含む、請求項３記載の核酸。
  5. 　自己切断ペプチドが、Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド及びｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチドからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸又は請求項６記載のベクターを含む細胞。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸又は請求項６記載のベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法。
  9. 　核酸又はベクターを導入する工程がフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下で実施される、請求項８記載の方法。
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