WO2014017482A1 - 多能性幹細胞の評価方法 - Google Patents

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WO2014017482A1
WO2014017482A1 PCT/JP2013/069907 JP2013069907W WO2014017482A1 WO 2014017482 A1 WO2014017482 A1 WO 2014017482A1 JP 2013069907 W JP2013069907 W JP 2013069907W WO 2014017482 A1 WO2014017482 A1 WO 2014017482A1
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WO
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colony
function
cell density
good
colonies
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/069907
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English (en)
French (fr)
Inventor
慎一 五味
成則 尾▲崎▼
智瑛 倉員
伸 川真田
直希 西下
ちえみ 竹中
Original Assignee
東京エレクトロン株式会社
公益財団法人先端医療振興財団
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/98—Detection or correction of errors, e.g. by rescanning the pattern or by human intervention; Evaluation of the quality of the acquired patterns
    • G06V10/993—Evaluation of the quality of the acquired pattern
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/698—Matching; Classification
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating pluripotent stem cells based on a nuclear staining pattern. Specifically, the quality of pluripotent stem cell colonies is evaluated based on the cell density distribution in colonies formed by pluripotent stem cells. Regarding the method.
  • Pluripotent stem cells are widely used in various fields such as tissue differentiation research, drug testing and regenerative medicine because of their differentiation pluripotency capable of differentiating into any tissue.
  • tissue differentiation research drug testing and regenerative medicine because of their differentiation pluripotency capable of differentiating into any tissue.
  • iPS cells since the establishment of iPS cells, research in this field has been remarkably developed, and various efforts for realizing regenerative medicine have been made all over the world.
  • pluripotent stem cells are easy to differentiate, and once differentiated, there is a possibility of losing pluripotency. Therefore, pluripotent stem cells are cultured while maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells. Therefore, maintaining an undifferentiated state is one of the most important factors in culturing pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells that have started differentiation are removed.
  • one of the most problematic problems is the removal of pluripotent stem cells that have started to differentiate. If removal of cells that have started differentiation is insufficient, it may induce the differentiation of surrounding cells and adversely affect the entire cultured cell.
  • the differentiation state of pluripotent stem cells is determined by skilled technicians. This is because it is difficult to make a judgment if you do not follow. For this reason, there is a limit to the large-scale preparation of pluripotent stem cells.
  • the present inventors have found that the differentiation state of colonies formed by pluripotent stem cells can be evaluated based on the difference in the nuclear staining pattern of pluripotent stem cells.
  • the present inventors have found that the differentiation state of a pluripotent stem cell colony can be evaluated based on the cell density in the colony formed by the pluripotent stem cell in adhesion culture.
  • a method for evaluating the quality of pluripotent stem cell colonies based on nuclear staining images of pluripotent stem cells (2) The method according to (1) above, wherein the quality of the colony is evaluated based on a nuclear staining pattern obtained from a nuclear staining image of pluripotent stem cells. (3) The method according to (1) above, wherein the quality of the colony is evaluated based on the cell density obtained from the nuclear staining image of pluripotent stem cells. (4) The method according to (3), wherein the quality of the colony is evaluated based on the cell density in the central part of the colony and, in some cases, the cell density in the peripheral part.
  • the fitting function created in advance is A fitting function (f good function) representing a convex shape, and / or A fit function (f bad function) that represents a concave shape at the center of the colony and a convex shape at the periphery.
  • the position of the straight line passing through the center of the colony is the horizontal axis (X axis) of the plane orthogonal coordinate system, and the cell density is the vertical axis (Y axis).
  • the method according to (6) above which creates a graph.
  • the fitting function created in advance is at least two types of fitting functions including an f good function and an f bad function.
  • the f bad function is (Condition B1) Converge in the limits of x ⁇ ⁇ and x ⁇ ⁇ , (Condition B2) Within a colony, it becomes 0 or more for any real number x, and (Condition B3) The method according to (7) or (8) above, wherein any one, two or all conditions selected from having one minimum value and two maximum values in a colony are satisfied.
  • the f bad function is The method according to any one of (7) to (9), wherein (11) The f good function is (Condition G1) Converge in the limits of x ⁇ ⁇ and x ⁇ ⁇ , (Condition G2) 0 or more for any real number x in the colony, and (Condition G3) One, two or all conditions selected from having one local maximum in the colony The method according to any one of (7) to (10) above. (12) wherein f good function, The method according to any one of (6) to (11), wherein (13) Evaluating the quality of colonies using as an index the degree of deviation between at least one kind of approximate curve obtained by curve fitting and the cell density distribution of the colonies to be evaluated, (5) to (12) The method according to any one.
  • the present invention is advantageous in that the quality of colonies of pluripotent stem cells can be evaluated without staining by skilled technicians by performing staining.
  • the present invention is also advantageous in that the quality of a pluripotent stem cell colony can be evaluated by comparing cell densities estimated from nuclear staining images.
  • the present invention is further advantageous in that the step after obtaining a nuclear staining image of a colony of pluripotent stem cells can be fully automated.
  • FIG. 1 is a diagram showing a nuclear staining image of an iPS cell colony.
  • FIG. 1 left shows a phase contrast microscopic image of an iPS cell colony
  • FIG. 1 right shows a nuclear staining image of the iPS cell colony by DAPI.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of a method for measuring a cell density in a colony.
  • FIG. 2A shows an example of a method for measuring cell density along a straight line passing through the center of the colony.
  • the grid interval is 100 ⁇ m
  • the cell density is estimated from the number of nuclei in each square.
  • FIG. 2B shows the resulting cell density distribution. The numbers in the grids of the grid in FIG.
  • FIG. 3 is a graph showing the obtained cell density distribution.
  • 3A shows the cell density distribution of colonies formed by excellent iPS cells
  • FIG. 3B shows the cell density distribution of colonies formed by bad iPS cells
  • FIG. 3C shows surrounding cells without removal. Shows a trapezoidal cell density distribution of good colonies formed by iPS cells that do not adversely affect the cell.
  • the vertical axis represents the number of nuclei per 100 ⁇ m ⁇ 100 ⁇ m ( ⁇ 100 cells / mm 2 )
  • the horizontal axis represents the position on the measured straight line ( ⁇ 100 ⁇ m).
  • FIG. 4 is a diagram showing a cell density distribution converted into a grayscale image.
  • FIG. 4A is an example of a grayscale image obtained from the cell density distribution of excellent colonies
  • FIG. 4B is an example of a grayscale image obtained from the cell density distribution of good colonies
  • FIG. It is an example of the gray scale image obtained from the cell density distribution of a bad colony.
  • FIG. 5 is a diagram showing the cell density in the center of the colony arranged in descending order.
  • FIG. 6 is a diagram showing a result of curve fitting of a fit function to a cell density distribution of colonies formed by pluripotent stem cells. 6A shows a curve fit of f good (x) for the good colonies
  • FIG. 6B is a diagram showing a curve fit of f good (x) for bad colonies.
  • FIG. 7 is a diagram in which ⁇ 2 / NDF obtained by curve fitting f good (x) to each colony is arranged in ascending order.
  • FIG. 8 is a diagram showing colonies arranged in descending order of the maximum value of f good (x).
  • FIG. 9 is a diagram showing a curve fit of f bad (x) for a good colony (FIG. 9A) and a bad colony (FIG. 9B).
  • FIG. 10 is a diagram obtained by plotting each colony on a graph based on the parameters with the parameter A as the horizontal axis and the parameter B as the vertical axis.
  • pluripotent stem cell used in the present invention means a cell having the ability to differentiate into cells derived from any of the three germ layers, and is particularly limited as long as it is a pluripotent stem cell that forms a colony by adhesion culture. It can be used without.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are not particularly limited, but can preferably be mammalian pluripotent stem cells such as primate cells and rodent cells, and more preferably humans, monkeys, and mice. Rat, guinea pig, hamster, rabbit, cat, dog, sheep, pig, cow or goat pluripotent stem cell, more preferably human pluripotent stem cell.
  • pluripotent stem cells used in the present invention, embryonic stem cells (ES cells), inducible pluripotent stem cells (iPS cells or induced pluripotent stem cells), Muse cells (Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell), embryonic Examples include pluripotent stem cells such as tumor cells (EC cells) or embryonic germ stem cells (EG cells), preferably ES cells or iPS cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells or induced pluripotent stem cells induced pluripotent stem cells
  • Muse cells Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell
  • embryonic stem cells such as tumor cells (EC cells) or embryonic germ stem cells (EG cells), preferably ES cells or iPS cells.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are preferably mammalian ES cells or iPS cells, such as humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows or Goat ES cells or iPS cells, more preferably ES cells or iPS cells such as primates or rodents, and further preferably human ES cells or human iPS cells.
  • feeder cells may or may not be used.
  • pluripotent stem cells can be evaluated for each colony. That is, according to the present invention, pluripotent stem cells can be evaluated by evaluating the differentiation state of pluripotent stem cells for each colony (that is, by evaluating the quality of a colony for each colony). .
  • a good colony is a colony evaluated that does not include cells that have started differentiation (consisting of undifferentiated cells), and a poor colony is evaluated to include cells that have started differentiation. It is a colony.
  • the quality of the pluripotent stem cell colony can be evaluated by observing a nuclear staining image of the pluripotent stem cell, specifically, (A) performing nuclear staining of pluripotent stem cell colonies; and (Ba) evaluating the quality of the colony based on the nuclear staining pattern obtained from the nuclear staining image of pluripotent stem cells, or (Bb) It can be carried out by evaluating the quality of the colony based on the cell density obtained from the nuclear staining image of pluripotent stem cells.
  • the cell density or cell density distribution of the colony is calculated from the nuclear staining image, and then (B-1) evaluating the quality of the colony based on the cell density in the central part of the colony and, in some cases, the cell density in the peripheral part thereof; (B-2) evaluating the quality of the colony based on the obtained cell density distribution, or (B-3) Performing a curve fit on the cell density distribution of the colony to be evaluated with at least one type of fit function prepared in advance for the cell density distribution of the colony, and evaluating the quality of the colony Can do.
  • the steps (Ba) and (BB) after nuclear staining can be fully automated.
  • a method for evaluating the quality of a pluripotent stem cell colony based on a difference in nuclear staining pattern is provided. This method can be carried out by the steps (A) and (Ba).
  • Evaluation of the quality of pluripotent stem cell colonies based on differences in nuclear staining patterns can be performed as follows. That is, pluripotent stem cells that have formed colonies on the culture surface can be subjected to nuclear staining. According to the present invention, nuclear staining can be performed using various nuclear staining agents well known to those skilled in the art.
  • Nuclear stains well known to those skilled in the art include, but are not limited to, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), Hoechst 33258, Hoechst 33342, SYTO TM, propidium iodide (PI), TO -PRO TM -3 iodide, TOTO-3 iodide, ethidium bromide, and the like can be used.
  • Nuclear staining may be performed on dead cells, but is preferably performed on live cells. For staining, methods well-known to those skilled in the art can be used. However, when living cells are stained, it is preferable to select a staining agent or staining method with low cytotoxicity. For example, in the case of DAPI, nuclear staining can be performed by incubating the cells for about 15 minutes in PBS containing 1 ⁇ g / mL DAPI.
  • a colony formed by a pluripotent cell judged by an expert to be visually good has a nuclear staining image that is almost uniform throughout the colony (good) or compact.
  • a colony formed by a pluripotent stem cell that shows a dark staining pattern (excellent) at the center and is judged to have started differentiation (bad) shows a thin staining pattern at the center and a dark staining pattern at the periphery.
  • the entire colonies formed by pluripotent stem cells are almost uniform or show a staining pattern with a deep center.
  • a colony can be evaluated as a good colony, and a colony showing a staining pattern with a thin central part and a dark peripheral part can be evaluated as a poor colony.
  • the quality of the pluripotent stem cell colony can be evaluated from the nuclear staining pattern of the colony formed by the pluripotent stem cell in the adhesion culture.
  • a pattern recognition algorithm known to those skilled in the art is used, such pattern similarity evaluation can be performed by automatic processing.
  • the present invention it is possible to evaluate pluripotent stem cell colonies based on cell density or cell density distribution, assuming that the nuclear staining pattern reflects the difference in cell density. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for evaluating the quality of a pluripotent stem cell colony based on the cell density or cell density distribution of the pluripotent stem cell. This method can be carried out by the steps (A) and (Bb).
  • the cell density can be estimated by measuring the number of nuclei in a nuclear staining image of pluripotent stem cells, assuming that the number of cells is equal to the number of nuclei observed.
  • the cell density at the center of the colony can be determined as the number of nuclei per fixed area observed at the center.
  • the cell density distribution is not limited to the following, but for example, a colony can be divided into a grid and obtained as the number of cell nuclei in each grid of the grid (FIGS. 2A and 2B).
  • the cell density distribution may be acquired so as to cover the entire colony, but it is not always necessary to cover the entire colony, and at least one region in the central portion, preferably one region in the central portion and one region in the periphery thereof. It is only necessary that the cell density can be calculated. However, in order to improve the accuracy of evaluation, it is preferable that the number of cell density measurement regions is large.
  • the cell density distribution is continuously distributed along a straight line passing through the central part of a colony formed by pluripotent cells. Is preferably used for evaluation (eg, FIGS. 2A and 2B).
  • the number of cell nuclei may be measured visually, but can be calculated automatically using image analysis software such as ImageJ provided by the National Institutes of Health (NIH). .
  • the quality of the colony can be evaluated by performing the step (b-1) as the step (Bb) after performing the step (A). That is, the evaluation method of the present invention performs nuclear staining of pluripotent stem cell colonies, and then calculates the cell density of the colonies to obtain the cell density at the center of the colony and, in some cases, the cell density at the periphery thereof. This can be done by evaluating the quality of the colony.
  • Evaluation of the quality of the colony based on the cell density in the central part of the colony can be performed as follows. That is, the quality of a pluripotent stem cell colony can be evaluated by measuring the cell density in one region of the central part of the colony and comparing the size between the colonies. Specifically, a colony having a high cell density in the center can be evaluated as a good colony, and a colony having a low cell density in the center can be evaluated as a bad colony. At the time of evaluation, a threshold value is set, and whether or not the colony is good or bad can be evaluated (ie, determined) depending on whether or not the threshold value is exceeded. Specifically, colonies whose cell density in the central part exceeds the threshold value can be evaluated.
  • the colony is a good colony, and a colony having a threshold value or less can be determined to be a bad colony.
  • a threshold value or less can be determined to be a bad colony.
  • the threshold when the threshold is set high, the contamination rate of defective colonies decreases, but the recovery rate of good colonies tends to decrease.
  • the threshold when the threshold is set low, the recovery rate of good colonies increases, but there is a tendency that the mixing rate of defective colonies also increases. Therefore, those skilled in the art can appropriately set the threshold based on the recovery rate of good colonies and the contamination rate of bad colonies.
  • the threshold value used for the evaluation of the quality of the colony according to the present invention is not particularly limited, but can be, for example, 20 to 50 ( ⁇ 100 / mm 2 ), for example, 35 to 40 ( ⁇ 100 / mm 2). For example, 35 ( ⁇ 100 / mm 2 ) or 40 ( ⁇ 100 / mm 2 ).
  • evaluation of the quality of the colony based on the cell density in the central part of the colony and the cell density in the peripheral part thereof can be performed as follows. That is, pluripotent stem cells can also be evaluated from the cell density of at least one region in the central part of the colony and at least one region in the periphery thereof. Specifically, a colony having a low cell density in the central part and a high cell density in the peripheral part can be evaluated as a bad colony, and the cell density in the central part is higher than the cell density in the peripheral part. A colony equivalent to a high colony or a cell density in the peripheral portion can be evaluated as a good colony. Those skilled in the art will appreciate that these cell density-based assessments can be automated.
  • the “center” of the colony is, for example, when the colony is regarded as a circle, the radius is 3/4, preferably 2/3, more preferably 1/2, and even more preferably, the radius of the colony. , 1/3, most preferably a region inside a concentric circle with a radius of 1/4.
  • the “peripheral part” means a peripheral part of the central part of the colony and is inside the colony.
  • the “peripheral part” is the outside of the central part of the colony when the colony is regarded as a circle, and the radius is 1/4, 1/3, 1/2, 2/3 or 3 of the radius of the colony. A region outside the concentric circles with a radius of / 4 and inside the colony.
  • the “peripheral part” may be a ring-shaped region, for example, a radius of 1/4 to 3/4, 1/3 to 2/3, or 1/2 to 2/3 of the radius of the colony.
  • the equation of the circle can be obtained by curve fitting with respect to the colony outline by the least square method.
  • the “central part” (or “one region of the central part”) of the colony is preferably one point in the central part of the colony.
  • One point of the central part of the colony may be one point obtained based on a certain rule, and is not particularly limited, but can be obtained as the center of the colony, for example, the center of the circle.
  • the quality of the colony can be evaluated by performing the step (b-2) as the step (Bb). That is, the evaluation method of the present invention is performed by performing nuclear staining of a pluripotent stem cell colony, then calculating the cell density distribution of the colony, and evaluating the quality of the colony based on the obtained cell density distribution. be able to.
  • Evaluation of the quality of the colony based on the cell density distribution of the colony can be performed as follows. That is, pluripotent stem cells can be evaluated by calculating the density distribution of cells along a straight line passing through the central part of the colony and comparing the density distribution between the colonies. The comparison of the cell density distribution can be performed based on, for example, a visually expressed cell density distribution pattern.
  • the method of visually expressing the cell density distribution pattern is not particularly limited, and examples thereof include a method of graphing the cell density distribution or a method of converting the cell density distribution into a gray scale image or a color image.
  • the graphing of the cell density distribution is not particularly limited.
  • the cell density is the vertical axis (Y axis), and the straight line passing through the center of the colony is the horizontal axis (X axis).
  • the cell density distribution can be converted into a grayscale image or a color image by converting the cell density corresponding to the color and / or gradation.
  • the cell density is 0, white ( Black)
  • the maximum value of the cell density is black (white)
  • the gradation can be set according to the cell density, and converted into a grayscale image of 1 to 32 bits, preferably 8 to 16 bits. .
  • the quality of pluripotent stem cells can be evaluated by visual observation or automatic processing based on the similarity of the patterns.
  • pattern similarity is evaluated by automatic processing, a pattern recognition algorithm known to those skilled in the art can be used.
  • the quality of the colony can be evaluated by the step (b-3) as the step (Bb). That is, in the evaluation method of the present invention, nuclear staining of pluripotent stem cell colonies is performed, then the cell density distribution of the colonies is calculated, and at least one type of fit function prepared in advance with respect to the cell density distribution of the colonies is calculated.
  • the quality of the colony can be evaluated based on an approximate curve obtained by curve fitting with respect to the cell density distribution.
  • the fitting function created in advance includes parameters for curve fitting, and can be created to represent the cell density distribution of colonies judged good and / or bad by skilled technicians. it can.
  • the obtained at least one fit function is curve-fitted to the cell density distribution of the colony to be evaluated, thereby obtaining an approximate curve for the cell density distribution of each colony.
  • a fit function or approximate curve can be appropriately created by those skilled in the art with reference to the shape of the cell density distribution.
  • the number of parameters in the fit function is not particularly limited, but may be about 2 to 10, for example.
  • the curve fit can be performed using, for example, a least square method.
  • the position of a straight line passing through the center of the colony is the horizontal axis (X axis) of the plane orthogonal coordinate system, and the cell density is the vertical axis
  • a fit function (f good function) representing a convex shape can be cited (see FIG. 6A).
  • the “convex shape” means a convex shape in which a curved graph is represented by a good colony cell density distribution (for example, FIGS. 3A and 3C).
  • An example of a function of a convex shape is not limited to, for example, monotonously increased when x is less than x a, takes a maximum value at a certain real number x a, include monotonically decreasing function when x is greater than x a It is done.
  • Maximum value means that the value of f (x a) that satisfies f (x a) ⁇ f ( x) at x in the vicinity of x a (x a is any real number).
  • the f good function preferably shows a good fitting for a good colony but does not show a good fitting for a bad colony.
  • the fitting function for the cell density distribution of a colony determined to be defective by a skilled engineer is a fitting function (f bad function) that shows a concave shape at the center of the colony and a convex shape at the periphery. (See FIG. 9B). That is, the graph of the f bad function indicates a shape in which one concave shape is sandwiched between two convex shapes.
  • the “concave shape” means a concave shape represented by a cell density distribution (for example, FIG. 3B) in the central part of the colony.
  • An example of a concave function is not particularly limited, for example, a function x monotonously decreases when less than x b, takes a minimum value at some real x b, x increases monotonically when greater than x b, namely And a function that takes only one minimum value in the center of the colony or in the whole area of x ( xb is an arbitrary real number).
  • Minimum value means that the value of f (x b) satisfying f (x b) ⁇ f ( x) at any x in the vicinity of x b. Therefore, in the f bad function, x may be a constant value within a certain range, and the constant value may take one maximum value or minimum value.
  • the f bad function is created so that x represents a constant value in a certain range and the constant value represents a maximum value or a minimum value.
  • the f bad function preferably shows a good fitting for a bad colony but does not show a good fitting for a good colony.
  • pluripotent cells can be evaluated by using a fit function for the cell density distribution of colonies formed by pluripotent stem cells.
  • the fit function created in advance has a fitting function (X) with the position of a straight line passing through the center of the colony as the horizontal axis (X axis) of the plane orthogonal coordinate system and the cell density as the vertical axis (Y axis).
  • a fitting function (f good function) representing a convex shape and / or a concave shape at the center of the colony and a convex shape at the periphery thereof
  • a method for evaluating the quality of a pluripotent stem cell colony which is at least one type of fit function comprising a fitting function (f bad function).
  • the fit function used for the evaluation may be one type, but is preferably two or more types, more preferably, one or more types of colonies judged to be good by a skilled technician by a skilled technician.
  • One or more types of colonies determined to be defective can be a total of two or more types. Therefore, according to the present invention, the fitting function created in advance represents a fitting function (f good function) representing a convex shape function, a concave shape at the center of the colony, and a convex shape at the periphery thereof.
  • fitting functions including a fitting function (f bad function) (where the position of a straight line passing through the center of the colony is the horizontal axis (X axis) of the plane orthogonal coordinate system, and the cell density is the vertical axis.
  • f bad function fitting function
  • a graph of a fit function is created as (Y-axis)
  • a method for evaluating the quality of a pluripotent stem cell colony is provided.
  • the cell density distribution need not be considered for cells outside the colony. Therefore, it is sufficient that the fit function shows a good approximation at least within the colony.
  • the f good function and the f bad function may be a function that converges to a constant value, a function that diverges, or a function that oscillates in the region outside the colony.
  • the behavior of the function outside the colony affects the analysis. In some cases, it is preferable to perform analysis after removing the area outside the colony. In this case, for example, the measured value of the cell density is 10 or less, 5 or less, or 3 or less ( ⁇ 100 / mm 2 ).
  • the region can be determined as a region outside the colony and excluded.
  • the f good function or the f bad function of the present invention is preferably always 0 or more and takes a value of 0 or close to 0 outside the colony. It can be created to represent a cell density distribution. Any of the above methods can reduce the adverse effect of the analysis due to the area outside the colony.
  • the f good function is preferably a function representing a convex shape, and the following condition: (Condition G1) Converge in the limits of x ⁇ ⁇ and x ⁇ ⁇ , (Condition G2) 0 or more for any real number x in the colony, and (Condition G3) One, two or all conditions selected from having one local maximum in the colony More preferably, it can be created so as to satisfy all the conditions.
  • the “convergence function” is a constant value, preferably a value that is sufficiently small so as not to adversely affect the analysis (for example, a value of 15 or less, 10 or less, 5 or less, 1 or less, or 0 ( ⁇ 100 / mm 2 )).
  • f good function that satisfies all of the above conditions G1 to G3 and represents a convex shape
  • a function for example, a trapezoidal function that has a constant function value at the center of the colony and exhibits a maximum value. ) Can also be suitably used.
  • an f good function that satisfies all of the above conditions G1 to G3 and represents a convex shape is preferably a function f good (x) of the following formula: (In the formula, A 0 , A 1 , a 1 , a 2 , x 0 and x 1 are parameters, and x is a variable.) It is.
  • f good functions can be preferably used particularly for determining the quality of iPS cell colonies.
  • the f bad function represents a concave shape at the center of the colony and a convex shape at the periphery thereof (that is, one concave area is sandwiched between two convex areas.
  • the following conditions (Condition B1) Converge in the limits of x ⁇ ⁇ and x ⁇ ⁇ , (Condition B2) Within a colony, it becomes 0 or more for any real number x, and (Condition B3) It can be created so as to satisfy any one, two or all conditions selected from having one minimum value and two maximum values in the colony, more preferably all conditions Can be created to meet.
  • an f bad function that expresses a concave shape at the center of the colony, expresses a convex shape at the periphery thereof, and satisfies all of the above conditions B1 to B3 is preferably a function f bad (x ): (In the formula, A 0 , A 1 , a 1 , a 2 , b 1 , b 2 , x 1 and x 2 are parameters, and x is a variable.) It is.
  • These fbad functions can be preferably used particularly for determining the quality of iPS cell colonies.
  • the quality of the pluripotent stem cell colony based on the approximate curve in step (b-3) can be evaluated as follows.
  • the quality of sex stem cell colonies can be evaluated.
  • the goodness of curve fitting can be evaluated using the degree of deviation between at least one kind of approximate curve and the cell density distribution of the colony to be evaluated as an index. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for evaluating the quality of colonies using as an index the degree of deviation between at least one kind of approximate curve and the cell density distribution of the colonies to be evaluated.
  • the degree of deviation between the approximate curve and the cell density distribution of the colony to be evaluated can be evaluated using methods well known to those skilled in the art, and may be evaluated visually. You may evaluate using a mathematical method.
  • the quality of the pluripotent stem cells can be determined by comparing the magnitudes of the parameters using the number of parameters in the formula.
  • the average of the sum of squares of the difference between the actual measurement value and the approximate curve is used, and the size of the pluripotent stem cell is compared. Good or bad may be evaluated. The average of the sum of squares of the difference between ⁇ 2 / NDF and the actually measured value and the approximate curve tends to be smaller as the deviation of the curve fit is smaller.
  • the average magnitude of the sum of squares of the difference between ⁇ 2 / NDF or the actually measured value and the approximate curve can be used to evaluate the quality of pluripotent stem cell colonies.
  • the quality of pluripotent stem cell colonies can be determined using either the f good function or the f bad function, or using both the f good function and the f bad function. Can be evaluated.
  • pluripotent stem cells may be evaluated using the good curve fit for each function as an index as described above, or parameters set from these functions may be evaluated as an index. .
  • the maximum value of f good function, the maximum value of f bad function, the minimum value of f bad function, the maximum value of the measured values and the measured The minimum value can be mentioned.
  • Pluripotent stem cells may be evaluated using any one of these parameters as an index, or may be evaluated as an index by combining two or more of these parameters.
  • the parameters can be set and combined so that the difference in the shape of the approximate curve graph between the good colonies and the bad colonies can be extracted.
  • the approximate curve of the cell density distribution of defective colonies shows a characteristic concave shape in the central part of the colonies. Therefore, in the evaluation, it is preferable to set parameters so that the characteristic concave shape can be compared with the cell density distribution of defective colonies.
  • the cell density in the central part of the colony that reflects the characteristic concave shape Or an approximate value based on the f bad function can be set as a useful parameter for an evaluation index of colony quality.
  • a combination of parameters for example, any one or more of the maximum value of the f good function in the colony, the maximum value of the f bad function and the maximum value of the actual measurement value, and the minimum value or the actual measurement value of the f bad function in the colony
  • a combination with one or more of the minimum values can be mentioned.
  • other parameter combinations include a combination of two or more parameters selected from the group consisting of the maximum value of the f good function, the maximum value of the f bad function, and the minimum value of the f bad function in the colony.
  • the sum, difference, product or ratio of two or more parameters can be taken to further emphasize the difference between good and bad colonies.
  • a new parameter can be created from the sum, difference, product or ratio of two or more parameters, and can be used for evaluation in combination with other parameters.
  • a more specific example of how to combine parameters is not particularly limited, (I) The value closer to the actual measurement value among the values of the f good function and the f bad function at the center of the colony, (Ii) the difference between the f good function and the f bad function at the center of the colony, (Iii) difference between the maximum measured value in the colony and the minimum measured value in the center of the colony, (Iv) The difference between the maximum value and the minimum value of the f bad function in the colony, or (v) a combination of some or all of the above (i) to (iv) can be used. If the parameter (i) is used as an index, the larger the value, the better the colony.
  • the quality of the colony may be evaluated by combining some or all of them as in (v).
  • the quality of the pluripotent stem cell colony can be evaluated using any of the above (i) to (vi).
  • Other specific examples of how to combine the parameters are not particularly limited. For example, (vi) the product or sum of the maximum value and the minimum value of the f bad function in the colony can be used.
  • a threshold value is set for each parameter, and the quality of the colony is evaluated (ie, judged) depending on whether or not the threshold value is exceeded. You can also. For example, when evaluating with the sum of (ii) to (iv), a threshold value is set. If the threshold value is less than or equal to the threshold value, the colony is determined to be good. By determining, the quality of the pluripotent stem cell colony can be evaluated. Specifically, using f good (x) and f bad (x) as the f good function and f bad function, respectively, the threshold is set to 40 to 45, and those below the threshold are determined as good colonies.
  • a threshold value can be similarly set for the parameter (i). For example, when the threshold value (i) is set to 35 to 45, good colonies exceeding the threshold value among the good colonies (the most Undifferentiated). Those skilled in the art can appropriately set these thresholds in accordance with a desired cell recovery rate and a defective cell contamination rate.
  • the parameters (i) to (vi) are parameters set so as to cause a difference between a good colony and a bad colony based on the cell density distribution pattern. As long as there is a difference between the colonies, various parameters can be set and used in addition to the parameters (i) to (vi).
  • the present invention in the evaluation of the quality of a pluripotent stem cell colony, (Ba) evaluating the quality of the colony based on the nuclear staining pattern obtained from the nuclear staining image, and (Bb) Evaluating the quality of colonies based on the cell density or cell density distribution obtained from the nuclear staining image can be fully automated by a computer or the like. Therefore, the present invention provides an automatic determination program for the quality of a pluripotent stem cell colony for causing a computer to execute the step (Ba) and / or the step (Bb) of the present invention.
  • a program for automatically determining the quality of a pluripotent stem cell colony based on a nuclear staining image of a pluripotent stem cell (Ba) judging the quality of the colony based on the nuclear staining pattern obtained from the nuclear staining image of pluripotent stem cells, or (Bb)
  • the quality of the colony is determined based on the cell density at the central part of the colony and, in some cases, the cell density at the peripheral part thereof.
  • a program for causing a computer to execute the method of the present invention is provided.
  • the present invention also provides a computer-readable recording medium that records the program of the present invention.
  • the program of the present invention may be recorded on a recording medium such as a flexible disk or a CD-ROM and read by a computer for execution.
  • the recording medium is not limited to a removable medium such as a magnetic disk or an optical disk, but may be a fixed recording medium such as a hard disk device or a memory.
  • the program of the present invention may be distributed via a communication line (including wireless communication) such as the Internet. Further, the program may be distributed in a state where the program is encrypted, modulated or compressed, and stored in a recording medium via a wired line such as the Internet or a wireless line.
  • Example 1 Indicator for determining pass / fail of iPS cells
  • parameters that can be used as an index for determining pass / fail of iPS cells were examined.
  • nuclear staining of cells was performed.
  • human iPS cells established strain by Kawasada Laboratory, Cell Evaluation Group, Advanced Medical Promotion Foundation
  • Culturing was performed under two conditions: on-feeder conditions using a feeder and feeder-less conditions.
  • SNL cells manufactured by DS Pharma Biomedical, product number: EC07032801 were used as feeder cells.
  • the medium is a medium for human ES cell culture (Dulbecco's modified Eagle medium / nutrient mixture F-12 Ham (manufactured by Sigma Aldrich, product number: D6421), 500 mL, knockout serum substitute (manufactured by Invitrogen, product number) : 10828-028) 125 mL, non-essential amino acid solution (manufactured by Sigma-Aldrich, product number: M7145) 5 mL, 200 mM L-glutamine (manufactured by Invitrogen, product number: 25030-081) 6.25 mL, 0.1 M 2-mercapto PBS with ethanol added (product of Invitrogen, product number: 21985) 500 ⁇ L, bFGF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, product number: 064-04541) final concentration 5 ng / mL.
  • human ES cell culture Dulbecco's modified Eagle medium / nutrient mixture F-12 Ham (man
  • a medium in which bFGF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number: 064-04541) final concentration of 5 ng / mL was used was added to roCell, product number: RCHEMD006, and the cells were seeded in a normal culture dish.
  • nuclear staining was performed to measure the cell density, and the cells were stained in a 4% paraformaldehyde-phosphate buffer solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number: 163-20145).
  • the fixative was removed, washed twice with PBS, and treated with DAPI (0.1 ⁇ g / mL in PBS) at 25 ° C. for 15 minutes.
  • the stained cells were washed three times with PBS, and then observed with an inverted phase contrast microscope IX81 (Olympus) equipped with a 4 ⁇ objective lens and a 10 ⁇ eyepiece.
  • the nuclei of the colonies of iPS cells were well stained.
  • the colonies of iPS cells take a form in which the cells are three-dimensionally overlapped.
  • the nuclei of almost all cells in the colonies were clearly stained (FIG. 1).
  • the observed iPS cell colonies were also evaluated by the conventional method. Specifically, the observed iPS cell colony is visually evaluated based on a phase contrast microscopic image, and the compact iPS cell colony (excellent colony) that is considered to be the best, iPS cell colony that has started differentiation that is considered to be unfavorable ( Bad colonies), but not classified into either, but were classified into three types of iPS cell colonies (good colonies) that do not have an adverse effect such as differentiation on surrounding cells without being removed. Thereafter, the quality of each iPS cell colony was evaluated against the nuclear staining pattern.
  • the obtained staining pattern tended to show a darkened staining image in the center of the colony in the excellent colony, but in the poor colony, it was dark in the periphery of the colony and lightly stained in the center. There was a tendency to see images. Further, as a typical staining pattern of good colonies, a stained image in which the entire colony was dyed relatively uniformly was observed.
  • the cell density distribution obtained along the centerline across the colony was represented in a bar graph (FIGS. 3A-C).
  • the graph was created with the position ( ⁇ m) of the straight line passing through the center of the colony as the horizontal axis (X axis) of the plane orthogonal coordinate system and the cell density ( ⁇ 100 cells / mm 2 ) as the vertical axis (Y axis).
  • Example 2 Determination of quality of colonies based on cell density distribution in iPS cell colonies
  • iPS cell colonies were obtained by obtaining and comparing gray scale images from the numerical values of the cell density distribution obtained in Example 1. The quality was judged.
  • the matching rate was 91.9% (34 colonies out of 37 colonies) when discriminated by a skilled engineer based on the phase difference image and when discriminated by converting the cell density distribution into a gray scale image. was consistent).
  • Example 3 Judgment of colony quality based on cell density at the center of an iPS cell colony
  • a good iPS cell colony tends to have a higher cell density at the center, whereas a poor iPS cell Colonies tended to have a low cell density in the center. Therefore, in this example, whether the quality of the iPS cell colony can be determined was examined by comparing the cell density at the center of the iPS cell colony.
  • the cell density at the center of each colony was obtained from the cell density distribution obtained in Example 2, and the size was compared.
  • a threshold value ( ⁇ 100 cells / mm 2 ) is provided for the cell density at the central part of the colony.
  • a pass / fail judgment was made.
  • the threshold value of the cell density in the central part of the colony is 55 ( ⁇ 100 cells / mm 2 )
  • the recovery rate of excellent colonies is 50% (5 colonies out of 10)
  • the contamination rate of bad colonies is 0%. (0 colonies out of 17 colonies)
  • the threshold is 35 ( ⁇ 100 cells / mm 2 )
  • the recovery rate of excellent colonies is 70% (2 colonies in 10 colonies), and the contamination rate of bad colonies is 11.8. % (2 out of 17 colonies).
  • Example 4 Judgment of pass / fail of iPS cell colony using approximate expression for cell density distribution
  • a fit function is created for the cell density distribution, and pass / fail judgment of iPS cell colony is performed using the obtained fit function. We investigated whether it was possible.
  • a convex function specifically, a trapezoidal fit function was created and used for evaluation as a fit function for excellent colonies and a cell density distribution of good colonies.
  • a trapezoidal fit function an f good function that well represents the shape of the cell density distribution of a good colony: An example of using is shown.
  • f good (x) was curve fitted to each of the cell density distributions of the 37 colonies obtained in Example 2 using the least square method. As a result, in good colonies and good colonies, f good (x) showed a good fitting to the measured value of the cell density distribution (FIG. 6A). On the other hand, in bad colonies, f good (x) did not show good fitting (FIG. 6B).
  • Example 5 Pass / Fail Judgment of iPS Cell Colonies Using Multiple Fit Functions for Cell Density Distribution
  • a fit function for bad colonies was further used. The quality of the iPS cell colony was determined.
  • Example 2 the cell density distribution of 20 cases obtained in Example 1 was analyzed.
  • the above-mentioned f good (x) is used as a fit function for excellent colonies and good colonies, and as a fit function for bad colonies, an f bad function that well represents the shape of the cell density distribution of bad colonies: Was used.
  • the above-mentioned f good (x) and f bad (x) were curve fitted to all the colonies, and the following parameters were calculated for each colony. Specifically, the parameter A was set to a value close to the actual measurement value among the values of f good (x) and f bad (x) in the central part of the colony. Parameter A is expected to show a greater value for better iPS cell colonies.
  • Parameter B is (difference between f good (x) and f bad (x) in the central part of the colony) + (difference between the maximum value of the actual value measured in the colony and the minimum value of the actual value in the central part of the colony) + (The difference between the maximum value and the minimum value of f bad (x) in the colony).
  • Parameter B is expected to show a larger value for a poor iPS cell colony that has started to differentiate.
  • the parameters A and B are calculated for each iPS cell colony, and each colony is plotted on the graph with the parameter A as the horizontal axis and the parameter B as the vertical axis.
  • excellent colonies, good colonies, and bad colonies are clearly identified.
  • Fig. 10 when parameter B is used as an index, it is possible to discriminate between good colonies and good colonies and bad colonies.
  • parameter A is used as an index, excellent colonies and good colonies are classified. It was found that it can be discriminated (FIG. 10). Specifically, in this example, by setting parameter B to 46, the contamination rate of defective colonies could be reduced to 0, and 90% of good colonies and good colonies could be recovered. Further, by setting the parameter A to 40, it was possible to discriminate 100% between good colonies and good colonies.
  • Example 1 the determination based on the phase difference image and the determination based on the cell density do not always match.
  • a skilled engineer uses an index other than the cell density as a determination index, but according to the present embodiment, based on only the cell density by utilizing an approximate expression. Even with the judgment, it was possible to judge the quality of the cells with high accuracy.
  • the method of the present embodiment can be applied to automatic determination of cell quality by a computer, and is useful as a method for automating judgment based on experience that has been conventionally performed.

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Abstract

［課題］本発明は、熟練した技術者の判断によらず、簡便に多能性幹細胞の分化状態、すなわち、良否を判断する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、分化を開始した多能性幹細胞の自動判別に応用できる方法を提供することを目的とする。 ［解決手段］多能性幹細胞の核染色パターンの差異に基づいて多能性幹細胞の良否を評価する方法。

Description

多能性幹細胞の評価方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１２－１６２７３７（出願日：２０１２年７月２３日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、核染色パターンに基づいて多能性幹細胞を評価する方法に関し、詳細には、多能性幹細胞が形成するコロニー内の細胞密度分布に基づいて多能性幹細胞コロニーの良否を評価する方法に関する。
　多能性幹細胞は、あらゆる組織に分化しうるその分化多能性ゆえに、組織分化の研究、薬物試験および再生医療などの様々な分野で幅広く用いられている。特にｉＰＳ細胞の樹立以降、この分野における研究の発展は著しく、再生医療実現に向けた様々な取り組みが世界中でなされている。
　ところで、多能性幹細胞は、分化しやすく、一度分化してしまうと多能性を失う可能性があるため、多能性幹細胞の培養は、多能性幹細胞の未分化状態の維持しながら行う必要があり、未分化状態の維持は、多能性幹細胞の培養において最も重要な要素の一つであるといえる。
　未分化状態を維持するためには、分化を阻害する薬剤の使用や、分化を開始した多能性幹細胞の除去などが行われる。多能性幹細胞の大量調製において、最も大きな障害となりうる問題の一つは、分化を開始した多能性幹細胞の除去である。分化を開始した細胞の除去が不十分な場合には、周囲の細胞の分化を誘導して培養細胞全体に悪影響を及ぼす可能性があるが、多能性幹細胞の分化状態は、熟練した技術者によらなければ判断が難しいからである。このようなことから、多能性幹細胞の大量調製には自ずと限界がある。
　そのため、少なくとも熟練した技術者の判断に依らずに多能性幹細胞の分化状態を確認する方法の開発や、分化を開始した多能性幹細胞を自動判別できる方法の開発が望まれていた。この点で、臭気センサを利用した幹細胞の多分化能の喪失の検出法などが開発されているが複雑で大がかりな装置が必要であり（特許文献１）、簡便な方法の開発が依然望まれている。
特開２０１０－２４６４４１号公報
　本発明は、熟練した技術者の判断によらず、簡便に多能性幹細胞の分化状態（すなわち、コロニーの良否）を評価する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、多能性幹細胞の分化状態を自動判別できる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、多能性幹細胞の核染色パターンの差異に基づいて多能性幹細胞が形成するコロニーの分化状態を評価できることを見出した。本発明者らは特に、接着培養において多能性幹細胞が形成するコロニー内の細胞密度に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの分化状態を評価できることを見出した。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）多能性幹細胞の核染色像に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法。
（２）多能性幹細胞の核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（３）多能性幹細胞の核染色像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（４）コロニー中心部の細胞密度と、場合によってはその周辺部の細胞密度とに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（３）に記載の方法。
（５）コロニー内の細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価する、上記（３）に記載の方法。
（６）コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットすることによりそのコロニーの良否を評価する、上記（５）に記載の方法。
（７）予め作成したフィット関数が、
　凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および／または、
　コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）
　を含んでなる少なくとも１種類のフィット関数である（但し、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数のグラフを作成する）、上記（６）に記載の方法。
（８）予め作成したフィット関数が、ｆｇｏｏｄ関数とｆｂａｄ関数とを含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である、上記（７）に記載の方法。
（９）ｆｂａｄ関数が、
（条件Ｂ１）ｘ→－∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
（条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）前記ｆｂａｄ関数が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 である、上記（７）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ｆｇｏｏｄ関数が、
（条件Ｇ１）ｘ→－∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
（条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、上記（７）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記ｆｇｏｏｄ関数が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 である、上記（６）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する、上記（５）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線から抽出したパラメータを指標としてコロニーの良否を評価する、上記（５）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値からなる群から選択される１以上のパラメータである、上記（１４）に記載の方法。
（１６）２つのパラメータの和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）２つのパラメータの和、差、積または比の値と、別の２つのパラメータの組み合わせにおける２パラメータの和、差、積または比の値との、和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、上記（１６）に記載の方法。
（１８）パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値およびｆｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２以上のパラメータである、上記（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）
（i）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の値のうち実測値に近い方の値、
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との差、または
（v）上記の（i）～（iv）の一部若しくは全部の組み合わせ
を用いて評価する、上記（１７）に記載の方法。
（２０）
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄおよびｆｂａｄの差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、および、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄの最大値と極小値との差
の和が閾値以下の場合には、コロニーを良好と判定し、閾値を超えた場合には、コロニーを不良と判定する、上記（１９）に記載の方法。
（２１）上記（１）～（２０）のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
（２２）上記（２１）に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
（２３）上記（２１）に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
（２４）上記（２３）に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞のコロニーの良否の自動判定システム。
　本発明は、染色を行うことにより、熟練した技術者によらなくても、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価できる点で有利である。本発明はまた、核染色像から推定される細胞密度を比較することにより、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価できる点で有利である。本発明はさらに、多能性幹細胞のコロニーの核染色像を得た後の工程は、全自動化が可能である点で有利である。
図１は、ｉＰＳ細胞コロニーの核染色像を示す図である。図１左は、ｉＰＳ細胞コロニーの位相差顕微鏡像を示し、図１右は、ＤＡＰＩによるｉＰＳ細胞コロニーの核染色像を示す。 図２は、コロニー内の細胞密度を測定する方法の一例を示す図である。図２Ａは、コロニーの中心部を通る直線に沿った細胞密度の計測法の一例を示す。図２Ａでは、グリッドの間隔は１００μｍであり、各マス目内の核の数により細胞密度が推定される。図２Ｂは、得られた細胞密度の分布を示す。図２Ｂのグリッドのマス目内の数字は、図２Ａの対応するマス目内の核の数を示している。 図３は、得られた細胞密度分布をグラフに表した図である。図３Ａは、優良なｉＰＳ細胞が形成するコロニーの細胞密度分布を示し、図３Ｂは、不良なｉＰＳ細胞が形成するコロニーの細胞密度分布を示し、図３Ｃは、除去しなくても周囲の細胞に悪影響を与えないｉＰＳ細胞が形成する良好なコロニーの台形型の細胞密度分布を示す。図３Ａ～Ｃは、いずれも縦軸は１００μｍ×１００μｍ当りの核の数（×１００細胞／ｍｍ２）を示し、横軸は、測定した直線上の位置（×１００μｍ）を示す。 図４は、グレースケール画像に変換した細胞密度分布を示す図である。図４Ａは、優良なコロニーの細胞密度分布から得られたグレースケール画像の例であり、図４Ｂは、良好なコロニーの細胞密度分布から得られたグレースケール画像の例であり、図４Ｃは、不良なコロニーの細胞密度分布から得られたグレースケール画像の例である。 図５は、コロニーの中心部の細胞密度を大きい順に並べて示した図である。 図６は、多能性幹細胞が形成するコロニーの細胞密度分布に対してフィット関数をカーブフィットした際の結果を示す図である。図６Ａは、良好なコロニーに対するｆｇｏｏｄ（ｘ）のカーブフィットを示し、図６Ｂは、不良なコロニーに対するｆｇｏｏｄ（ｘ）のカーブフィットを示す図である。 図７は、各コロニーにｆｇｏｏｄ（ｘ）をカーブフィットして得られるχ２／ＮＤＦを小さい順に並べて示した図である。 図８は、ｆｇｏｏｄ（ｘ）の最大値の大きい順にコロニーを並べて示した図である。 図９は、良好なコロニー（図９Ａ）および不良なコロニー（図９Ｂ）に対するｆｂａｄ（ｘ）のカーブフィットを示す図である。 図１０は、パラメータＡを横軸とし、パラメータＢを縦軸として、各コロニーをパラメータに基づいてグラフ上にプロットして得た図である。
発明の具体的な説明
　本発明で用いられる「多能性幹細胞」は、三胚葉のいずれの由来の細胞にも分化する能力を有する細胞を意味し、接着培養によりコロニーを形成する多能性幹細胞であれば、特に制限無く用いることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、霊長類細胞や齧歯類細胞などの哺乳類の多能性幹細胞とすることができ、より好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはヤギの多能性幹細胞とすることができ、さらに好ましくは、ヒトの多能性幹細胞とすることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。従って、本発明で用いられる多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳類のＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ若しくはヤギのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類若しくは齧歯類などのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。本発明によれば、フィーダー細胞は用いても用いなくてもよい。
　本発明において多能性幹細胞の評価は、コロニー毎に行うことができる。すなわち、本発明によれば、多能性幹細胞の評価は、コロニー毎に多能性幹細胞の分化状態を評価することにより（すなわち、コロニー毎にコロニーの良否を評価することにより）行うことができる。ここで、良好なコロニーは、分化を開始した細胞を含まない（未分化の細胞から構成される）と評価されるコロニーであり、不良なコロニーは、分化を開始した細胞を含むと評価されるコロニーである。
　本発明によれば、多能性幹細胞のコロニーの良否の評価は、多能性幹細胞の核染色像を観察することにより行うことができ、具体的には、
（Ａ）多能性幹細胞コロニーの核染色を行うこと、および、
（Ｂ－ａ）多能性幹細胞の核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価すること、または、
（Ｂ－ｂ）多能性幹細胞の核染色像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を評価すること
　により行うことができる。
　上記工程（Ｂ－ｂ）は、核染色像からコロニーの細胞密度または細胞密度分布を算出し、次いで、
　　（ｂ－１）コロニー中心部の細胞密度と、場合によっては、その周辺部の細胞密度とに基づいて、コロニーの良否を評価すること、
　　（ｂ－２）得られた細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価すること、若しくは、
　　（ｂ－３）コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットして、コロニーの良否を評価すること
　により行うことができる。
　本発明によれば、核染色後の工程（Ｂ－ａ）および工程（Ｂ－ｂ）は、全自動化することができる。
　本発明によれば、核染色パターンの差異に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法が提供される。この方法は前記工程（Ａ）および工程（Ｂ－ａ）により行うことができる。
　核染色パターンの差異に基づく多能性幹細胞のコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、培養表面上でコロニーを形成した多能性幹細胞は、核染色を行うことができる。本発明によれば、核染色は、当業者に周知の様々な核染色剤を用いて行うことができる。当業者に周知の核染色剤としては、特に限定されないが、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＳＹＴＯ（商標）、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３イオダイド、ＴＯＴＯ－３イオダイドおよびエチジウムブロマイドなどを用いることができる。核染色は、死細胞に対して行っても良いが、生細胞に対して行うことが好ましい。染色は、当業者に周知の方法を用いることができるが、生細胞に対して行う場合は、細胞毒性の低い染色剤または染色方法を選択することが好ましい。例えば、ＤＡＰＩであれば、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含有するＰＢＳ中で細胞を１５分ほどインキュベートすれば核染色を行うことができる。
　核染色されたコロニーは、位相差顕微鏡法や蛍光顕微鏡法などの顕微鏡法により観察することができる。本発明によれば、熟練者が目視により良好（未分化である）と判断する多能性細胞が形成するコロニーは、核染色像がコロニーの全体でほぼ均一な染色パターン（良好）か、コンパクトかつ中心で濃い染色パターン（優良）を示し、分化を開始している（不良）と判断する多能性幹細胞が形成するコロニーは、中心部が薄く、かつその周辺部が濃い染色パターンを示す。従って、この知見に基づけば、例えば、多能性幹細胞が形成するコロニーの核染色パターンに基づいて、多能性幹細胞が形成するコロニーの全体がほぼ均一であるか、中心が濃い染色パターンを示すコロニーを良好なコロニーであると評価し、中心部が薄く、その周辺部が濃い染色パターンを示すコロニーを不良なコロニーであると評価することができる。このように、接着培養中の多能性幹細胞が形成するコロニーの核染色パターンから多能性幹細胞のコロニーの良否の評価を行うことができる。本発明では、当業者に知られたパターン認識のアルゴリズムを用いれば、このようなパターンの類似性評価を自動処理により行うことが可能である。
　本発明によれば、核染色パターンが、細胞密度の差を反映しているとして、細胞密度または細胞密度分布に基づいて多能性幹細胞のコロニーの評価を行うことができる。従って、本発明によれば、多能性幹細胞の細胞密度または細胞密度分布に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否の評価方法が提供される。この方法は前記工程（Ａ）および工程（Ｂ－ｂ）により行うことができる。
　本発明において細胞密度は、細胞数は観察される核の数と等しいと仮定することにより、多能性幹細胞の核染色像において核の数を計測することにより推定することができる。例えば、コロニーの中心部の細胞密度は、適宜、中心部で観察される一定面積当りの核の数として求めることができる。
　本発明において細胞密度分布は、以下に限定されないが、例えば、コロニーをグリッド状に分割して、グリッドの各マス目内の細胞核の数として取得することができる（図２ＡおよびＢ）。細胞密度分布は、コロニー全体を網羅するように取得してもよいが、かならずしも全体を網羅する必要はなく、少なくとも中心部の１領域、好ましくは、中心部の１領域およびその周辺部の１領域での細胞密度を算出することができればよい。ただし、評価の精度を向上させるためには、細胞密度の測定領域数は多い方が好ましく、例えば、多能性細胞が形成するコロニーの中心部を通る直線上に沿って連続的に細胞密度分布を取得し評価に用いることが好ましい（例えば、図２ＡおよびＢ）。細胞核の数の測定は、目視にて行ってもよいが、米国国立衛生学研究所（ＮＩＨ；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）により提供されるＩｍａｇｅＪなどの画像解析ソフトウェアを用いれば自動で算出することができる。
　本発明の評価方法では、工程（Ａ）を行った後に、工程（Ｂ－ｂ）として工程（ｂ－１）を行うことでコロニーの良否を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法は、多能性幹細胞コロニーの核染色を行い、次いで、コロニーの細胞密度を算出し、コロニー中心部の細胞密度と、場合によっては、その周辺部の細胞密度とに基づいて、コロニーの良否を評価することにより行うことができる。
　コロニー中心部の細胞密度に基づくコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、コロニーの中心部の１領域における細胞密度を測定し、コロニー間でその大小を比較することにより、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。具体的には、中心部の細胞密度が高いコロニーを良好なコロニーであると評価し、中心部の細胞密度が低いコロニーを不良なコロニーであると評価することができる。評価の際には、閾値を定めて、閾値を超えるか否かにより、コロニーの良否を評価（すなわち、判定）することもでき、具体的には、中心部の細胞密度が閾値を超えるコロニーを良好なコロニーであると判定し、閾値以下であるコロニーを不良なコロニーであると判定することができる。本発明によれば、閾値を高く設定すると、不良なコロニーの混入率は低減するが、良好なコロニーの回収率も低減する傾向がみられる。また、閾値を低く設定すると、良好なコロニーの回収率は増加するが、不良なコロニーの混入率も増加する傾向が見られる。従って、当業者であれば、良好なコロニーの回収率および不良なコロニーの混入率に基づいて適宜閾値を設定することができる。本発明によるコロニーの良否の評価に用いられる閾値は、特に限定されないが、例えば、２０～５０個（×１００／ｍｍ２）とすることができ、例えば、３５～４０個（×１００／ｍｍ２）とすることができ、例えば、３５個（×１００／ｍｍ２）または４０個（×１００／ｍｍ２）とすることができる。
　また、コロニー中心部の細胞密度とその周辺部の細胞密度に基づくコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、コロニー中心部の少なくとも１領域とその周辺部の少なくとも１領域の細胞密度から、多能性幹細胞を評価することもできる。具体的には、中心部の細胞密度が低く、その周辺部の細胞密度が高いコロニーを不良なコロニーであると評価することができ、中心部の細胞密度が、その周辺部の細胞密度よりも高いコロニーや周辺部の細胞密度と同等のコロニーを良好なコロニーであると評価することができる。これらの細胞密度に基づく評価は自動化が可能であることは当業者であれば十分理解できるであろう。
　本発明においてコロニーの「中心部」は、例えば、コロニーを円に見立てたときに、半径がコロニーの半径の３／４、好ましくは、２／３、より好ましくは、１／２、さらに好ましくは、１／３、最も好ましくは、１／４の半径の同心円の内部の領域とすることができる。また、「その周辺部」とは、コロニーの中心部の周辺部のことを意味し、コロニーの内部である。例えば、「その周辺部」は、コロニーを円に見立てたときに、コロニー中心部の外側で、半径がコロニーの半径の１／４、１／３、１／２、２／３、または、３／４の半径の同心円の外側であり、かつ、コロニーの内側の領域とすることができる。「その周辺部」はリング状の領域であってもよく、例えば、半径がコロニーの半径の１／４～３／４、１／３～２／３、または１／２～２／３の半径の同心円に挟まれるリング状の領域とすることができる。円の式は、最小二乗法によりコロニーの輪郭に対してカーブフィットすることにより求めることができる。本発明によれば、コロニーの「中心部」（または「中心部の１領域」）は、好ましくはコロニーの中心部の１点である。コロニーの中心部の１点は、ある一定のルールに基づいて求められる１点であれば良く、特に限定されないが、コロニーの中心、例えば、上記円の中心として求めることができる。
　本発明の評価方法では、工程（Ａ）を行った後に、工程（Ｂ－ｂ）として工程（ｂ－２）を行うことでコロニーの良否を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法は、多能性幹細胞コロニーの核染色を行い、次いで、コロニーの細胞密度分布を算出し、得られた細胞密度分布に基づいて、コロニーの良否を評価することにより行うことができる。
　コロニーの細胞密度分布に基づくコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。すなわち、細胞の密度分布をコロニーの中心部を通る直線に沿って算出し、その密度分布をコロニー間で比較することによって多能性幹細胞を評価することができる。細胞密度分布の比較は、例えば、視覚的に表された細胞密度分布のパターンに基づいて行うことができる。視覚的に細胞密度分布のパターンを表す方法としては、特に限定されないが、例えば、細胞密度分布をグラフ化する方法、または、グレースケール画像若しくはカラー画像に変換する方法などを挙げることができる。細胞密度分布のグラフ化は、特に限定されないが、例えば、平面直交座標系において細胞密度を縦軸（Ｙ軸）とし、コロニー中心部を通る直線を横軸（Ｘ軸）として、その分布を、例えば、棒グラフや点グラフとして表すことにより行うことができる。また、細胞密度分布のグレースケール画像またはカラー画像への変換は、細胞密度と色および／または階調とを対応させて変換することにより行うことができ、例えば、細胞密度０の場合を白（黒）とし、細胞密度の最大値を黒（白）として、細胞密度に応じて階調を設定して、１ビット～３２ビット、好ましくは８～１６ビットのグレースケール画像に変換することができる。細胞密度分布を視覚的なパターンに変換した後は、パターンの類似性に基づいて、目視または自動処理により多能性幹細胞の良否を評価することができる。パターンの類似性評価を自動処理により行う場合は、当業者に知られたパターン認識のアルゴリズムを用いることができる。
　本発明の評価方法では、工程（Ａ）を行った後に、工程（Ｂ－ｂ）として工程（ｂ－３）によりコロニーの良否を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法では、多能性幹細胞コロニーの核染色を行い、次いで、コロニーの細胞密度分布を算出し、コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数をコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットして得られる近似曲線に基づいてコロニーの良否を評価することができる。例えば、予め作成したフィット関数は、カーブフィットするためのパラメータを含み、熟練した技術者により良好と判断されたコロニーおよび／または不良と判断されたコロニーの細胞密度分布を表すように作成することができる。その後、得られた少なくとも１種類のフィット関数は、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットすることにより各コロニーの細胞密度分布に対する近似曲線が得られる。このようなフィット関数や近似曲線は、当業者であれば細胞密度分布の形状を参考にして適宜作成することができる。フィット関数中のパラメータ数は、特に限定されないが、例えば、２～１０個程度とすることができる。カーブフィットは、例えば、最小二乗法を用いて行うことができる。
　熟練した技術者により良好と判断されたコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数としては、例えば、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数（ｙ＝ｆ（ｘ））のグラフを作成した場合に、凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）が挙げられる（図６Ａ参照）。本明細書では、「凸形状」とは、曲線のグラフが、良好なコロニーの細胞密度分布（例えば、図３ＡやＣ）により表される凸形状を意味する。凸形状の関数の一例としては、特に限定されないが、例えば、ｘがｘａより小さいときには単調増加し、ある実数ｘａにおいて極大値をとり、ｘがｘａより大きいときには単調減少する関数が挙げられる。極大値は、ｘａの近傍のｘにおいてｆ（ｘａ）≧ｆ（ｘ）を満たすｆ（ｘａ）の値のことを意味する（ｘａは任意の実数である）。したがって、本発明のある態様では、ｆｇｏｏｄ関数は、ｘ＝ｘａの１点において極大値をとる関数だけでなく、ｆｇｏｏｄ関数はｘが一定の範囲で一定値を示し、その一定値が極大値となっている関数、例えば、上底に対応する部分全体で極大値をとる台形型の関数であってもよい。より具体的には、ｆｇｏｏｄ関数としては、例えば、直径１ｍｍのコロニーにおいて、ｘ＝３００μｍ～７００μｍの範囲において一定値を示し、かつその一定値が極大値であり、かつ、ｘ＜３００μｍおよびｘ＞７００μｍの範囲では極大値をとらない関数を挙げることができる。ｆｇｏｏｄ関数は、評価したいコロニーにカーブフィットすると、好ましくは、良好なコロニーに対しては良好なフィッティングを示すが、不良なコロニーに対しては良好なフィッティングを示さない。
　熟練した技術者により不良と判断されたコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数は、コロニーの中心部で凹形状を示し、かつ、その周辺部で凸形状を示すフィット関数（ｆｂａｄ関数）とすることができる（図９Ｂ参照）。すなわち、ｆｂａｄ関数のグラフは、１つの凹形状が２つの凸形状の間に挟まれた形状を示す。本明細書では、「凹形状」とは、コロニー中心部の細胞密度分布（例えば、図３Ｂ）により表される凹形状を意味する。凹形状の関数の一例としては、特に限定されないが、例えば、ｘがｘｂより小さいときには単調減少し、ある実数ｘｂにおいて極小値をとり、ｘがｘｂより大きいときには単調増加する関数、すなわち、コロニーの中心部でまたはｘの全域で１つのみ極小値をとる関数が挙げられる（ｘｂは任意の実数である）。極小値は、ｘｂの近傍の任意のｘにおいてｆ（ｘｂ）≦ｆ（ｘ）を満たすｆ（ｘｂ）の値のことを意味する。従って、ｆｂａｄ関数は、ｘが一定の範囲で一定値を示し、その一定値が１つの極大値または極小値をとってもよい。従って、「コロニー中心部で凹形状であり、かつその周辺部で凸形状である関数」は、一例では、ｘが増加すると共に、単調増加し、あるｘｃで１つ目の極大値をとり、その後単調減少して、あるｘｄで１つの極小値をとり、その後さらに単調増加し、あるｘｅで２つ目の極大値をとり、その後単調減少する関数が挙げられる。また、本発明のある態様では、ｆｂａｄ関数は、ｘが一定の範囲で一定値を示し、その一定値が極大値または極小値となっている関数を表すように作成される。ｆｂａｄ関数は、評価したいコロニーにカーブフィットすると、好ましくは、不良なコロニーに対しては良好なフィッティングを示すが、良好なコロニーに対しては良好なフィッティングを示さない。
　従って、本発明によれば、多能性幹細胞が形成するコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数を用いることにより、多能性細胞を評価することができる。
　すなわち、本発明によれば、予め作成したフィット関数が、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数（ｙ＝ｆ（ｘ））のグラフを作成した場合に、凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および／または、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）を含んでなる、少なくとも１種類のフィット関数である、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法が提供される。評価に用いるフィット関数は、１種類であってもよいが、好ましくは、２種類以上であり、より好ましくは、熟練した技術者により良好と判断されたコロニーについて１種類以上と熟練した技術者により不良と判断されたコロニーについて１種類以上の計２種類以上とすることができる。従って、本発明によれば、予め作成したフィット関数が、凸形状の関数を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）を含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である（ただし、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数のグラフを作成する）、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法が提供される。
　本発明によれば、細胞密度分布は、コロニー外の細胞については考慮する必要が無い。従って、フィット関数は、少なくともコロニー内で良好な近似を示すものであれば十分である。ｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数は、コロニー外の領域では、一定値に収束する関数でも、発散する関数でも、振動する関数でもよいが、関数のコロニー外の領域での挙動により解析に影響が出る場合には、コロニー外の領域を排除してから解析を行うことが好ましく、この場合、例えば、細胞密度の実測値が１０以下、５以下または３以下の値（×１００／ｍｍ２）となる領域をコロニー外の領域と判断して排除することができる。また、近似対象がコロニーの細胞密度であることを考慮すれば、本発明のｆｇｏｏｄ関数またはｆｂａｄ関数は、好ましくは、常に０以上であり、かつコロニー外では０あるいは０に近い値をとる細胞密度分布を表すように作成することができる。上記いずれの方法によっても、コロニー外の領域による解析の悪影響を低減することができる。
　従って、本発明によれば、ｆｇｏｏｄ関数は、好ましくは、凸形状を表す関数であり、かつ、下記条件： 
（条件Ｇ１）ｘ→－∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
（条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たすように作成することができ、より好ましくは、すべての条件を満たすように作成することができる。本明細書では、「収束する関数」は、一定値、好ましくは、解析に悪影響を与えない程度に十分小さい値（例えば、以下、１５以下、１０以下、５以下、１以下の値、または０（×１００／ｍｍ２））に収束する関数である。上記条件Ｇ１～Ｇ３のすべてを満たし、かつ凸形状を表すｆｇｏｏｄ関数としては、例えば、下記式のガウス関数：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 （式中、ａ、ｂおよびｃは、パラメータであり、ｘは変数である。）
とすることができる。上記条件Ｇ１～Ｇ３のすべてを満たし、凸形状を表すｆｇｏｏｄ関数としては、コロニーの中心部において関数値が一定であり、かつ極大値を示すように作成された関数（例えば、台形型の関数）も好適に用いられ得る。また、別の例では、上記条件Ｇ１～Ｇ３のすべてを満たし、かつ凸形状を表すｆｇｏｏｄ関数は、好ましくは、下記式の関数ｆｇｏｏｄ（ｘ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 （式中、Ａ０、Ａ１、ａ１、ａ２、ｘ０およびｘ１はパラメータであり、ｘは変数である。）
である。これらのｆｇｏｏｄ関数は、特にｉＰＳ細胞コロニーの良否の判断に好ましく用いられ得る。
　本発明によれば、ｆｂａｄ関数は、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表す関数（すなわち、２つの凸形状の領域に１つの凹形状の領域が挟まれている関数）であり、好ましくは、下記条件： 
（条件Ｂ１）ｘ→－∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
（条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たすように作成することができ、より好ましくは、すべての条件を満たすように作成することができる。例えば、コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表し、かつ、上記条件Ｂ１～Ｂ３のすべてを満たすｆｂａｄ関数は、好ましくは、下記式の関数ｆｂａｄ（ｘ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
 （式中、Ａ０、Ａ１、ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ｘ１およびｘ２はパラメータであり、ｘは変数である。）
である。これらのｆｂａｄ関数は、特にｉＰＳ細胞コロニーの良否の判断に好ましく用いられ得る。
　本発明によれば、工程（ｂ－３）の近似曲線に基づく多能性幹細胞のコロニーの良否の評価は以下のように行うことができる。
　例えば、本発明の工程（ｂ－３）によれば、カーブフィットにより得られた少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのカーブフィッティングの良好さに基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。一般的に、カーブフィッティングの良好さは、少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標として評価することができる。従って、本発明によれば、少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する方法が提供される。近似曲線と評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれ（近似曲線のフィッティングの良好さ）の程度は、当業者に周知の方法を用いて評価することができ、目視によって評価しても良いが、数学的手法を用いて評価してもよい。数学的手法を用いる場合には、特に限定されないが、近似曲線と評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度の指標として、例えば、χ２／ＮＤＦ（自由度＝フィットしたデータ数－近似式のパラメータ数）を用い、その大小を比較することで多能性幹細胞の良否を判断することができる。あるいは、近似曲線と評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度の指標として、実測値と近似曲線との差の二乗和の平均を用い、その大小を比較することで多能性幹細胞の良否を評価しても良い。χ２／ＮＤＦおよび実測値と近似曲線との差の二乗和の平均は、カーブフィットのずれが少ないほど小さくなる傾向がある。従って、予め作成した少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標として、χ２／ＮＤＦまたは実測値と近似曲線との差の二乗和の平均の大小を用いて、多能性幹細胞コロニーの良否を評価することができる。
　本発明の工程（ｂ－３）によればまた、ｆｇｏｏｄ関数若しくはｆｂａｄ関数のどちらかを用いて、または、ｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の両方を用いて、多能性幹細胞コロニーの良否を評価することができる。評価の際には、上述のようにそれぞれの関数に対するカーブフィットの良好さを指標として、多能性幹細胞を評価しても良いし、これらの関数から設定したパラメータを指標として評価しても良い。例えば、多能性幹細胞を評価するための指標となるパラメータとしては、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値などを挙げることができる。多能性幹細胞は、これらのパラメータのいずれか１つを指標として評価しても良いし、これらのパラメータのうちの２以上を組合せて指標として評価しても良い。パラメータを設定する際、または、組み合わせる際には、例えば、良好なコロニーと不良なコロニーの近似曲線のグラフの形状の違いを抽出できるようにパラメータを設定し、組み合わせることができる。特に、不良なコロニーの細胞密度分布の近似曲線は、コロニー中心部において特徴的な凹形状を示す。従って、評価の際には、不良なコロニーの細胞密度分布に特徴的な凹形状を対比できるようにパラメータを設定することが好ましく、例えば、特徴的な凹形状を反映するコロニー中心部の細胞密度の実測値またはｆｂａｄ関数による近似値は、コロニー良否の評価指標の有用なパラメータとして設定し得る。パラメータの組み合わせとしては、例えば、コロニー内におけるｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値および実測値の最大値のいずれか１以上と、コロニー内におけるｆｂａｄ関数の極小値または実測値の最小値のいずれか１以上との組み合わせを挙げることができる。または、他のパラメータの組み合わせとしては、コロニー内におけるｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値およびｆｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２以上のパラメータの組み合わせを挙げることができる。パラメータを組み合わせた後は、良好なコロニーと不良なコロニーの差異をより強調するように２以上のパラメータの和、差、積または比をとることができる。２以上のパラメータの和、差、積または比から新たなパラメータを作成し、他のパラメータと、組み合わせて評価に用いることもできる。
　本発明の工程（ｂ－３）によれば、パラメータの組み合わせ方のより具体的な例としては、特に限定されないが、
（i）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の値のうち実測値に近い方の値、
（ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の差、
（iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、
（iv）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との差、または
（v）上記（i）～（iv）の一部若しくは全部の組み合わせ
などを用いることができる。（i）のパラメータを指標とすれば、大きいほど良好なコロニーであると評価することができる。（ii）～（iv）のパラメータを指標とすれば、これらのパラメータが大きいほど不良なコロニーであると評価することができる。（i）～（iv）はまた、（v）のように、これらの一部または全部を組み合わせてコロニーの良否を評価しても良い。（v）による評価の一例としては、例えば、（ii）～（iv）の和が大きいほど不良なコロニーであると評価することができる。従って、本発明によれば、特に限定されないが、上記（i）～（vi）のいずれかを用いて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。パラメータの組み合わせ方の他の具体的な例としては、特に限定されないが、例えば、（vi）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との積または和を用いることもできる。（vi）のパラメータを指標とすれば、数値が大きいほど良好なコロニーであると評価することができる。従って、本発明のある態様では、上記（i）～（iv）および（vi）の一部または全部の組み合わせから選択されるパラメータの組み合わせを用いても良い。このように、本発明によれば、適宜設定したパラメータを組み合わせて得られた値の大小関係を指標としても、コロニーの良否を評価することができる。
　本発明の工程（ｂ－３）によれば、評価の際には、それぞれのパラメータに対して閾値を設定し、閾値を超えるか否かにより、コロニーの良否を評価（すなわち、判定）することもできる。例えば、（ii）～（iv）の和により評価する場合には、閾値を設定して、閾値以下の場合には、コロニーを良好と判定し、閾値を超えた場合には、コロニーを不良と判定することにより、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価することができる。具体的には、ｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数として、それぞれｆｇｏｏｄ（ｘ）およびｆｂａｄ（ｘ）を用いて、閾値を４０～４５に設定し、閾値以下のものを良好なコロニーと判定し、閾値を超えたものを不良なコロニーであると判定することができる。（i）のパラメータについても、同様に閾値を設定することができ、例えば、（i）の閾値を３５～４５に設定すると、良好なコロニーのうち、閾値を超えたものを優良なコロニー（最も未分化である）と評価することができる。なお、これらの閾値は当業者であれば、所望の細胞の回収率や不良な細胞の混入率に従って、適宜設定することができる。また、上記（i）～（vi）のパラメータは、細胞密度分布パターンに基づいて良好なコロニーと不良なコロニーとの間で差が生じるように設定したパラメータであるが、良好なコロニーと不良なコロニーとの間で差が生じる限り、上記（i）～（vi）のパラメータに限らず、様々なパラメータを設定し、用いることができる。
　本発明によれば、多能性幹細胞のコロニーの良否の評価において、（Ｂ－ａ）核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価すること、および（Ｂ－ｂ）核染色像から得られた細胞密度または細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価することは、コンピュータ等により全自動化することができる。従って、本発明では、コンピュータに本発明の工程（Ｂ－ａ）および／または工程（Ｂ－ｂ）を実行させるための、多能性幹細胞のコロニーの良否の自動判定プログラムが提供される。すなわち、本発明によれば、多能性幹細胞の核染色画像に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を自動判定するプログラムであって、
（Ｂ－ａ）多能性幹細胞の核染色画像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を判定すること、または、
（Ｂ－ｂ）多能性幹細胞の核染色画像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を判定すること
を含んでなる工程をコンピュータに実行させるためのプログラム
｛ここで、工程（Ｂ－ｂ）は、核染色画像からコロニーの細胞密度または細胞密度分布を算出し、次いで、
　　（ｂ－１）コロニー中心部の細胞密度と、場合によっては、その周辺部の細胞密度とに基づいて、コロニーの良否を判定する、
　　（ｂ－２）得られた細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を判定する、または、
　　（ｂ－３）予め作成したコロニーの細胞密度分布を表す少なくとも１種類のフィット関数から得られた各コロニーの近似曲線に基づいてコロニーの良否を判定する｝が提供される。このように、本発明によれば、本発明の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。本発明によればまた、本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。本発明によればさらに、本発明のプログラムをその内部記録装置に記録したコンピュータまたは多能性幹細胞のコロニーの良否のための自動判定システムが提供される。
　本発明のプログラムは、フレキシブルディスクやＣＤ－ＲＯＭ等の記録媒体に記録し、コンピュータに読み込ませて実行させてもよい。記録媒体は、磁気ディスクや光ディスク等の着脱可能なものに限定されず、ハードディスク装置やメモリなどの固定型の記録媒体でもよい。また、本発明のプログラムを、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して頒布してもよい。さらに、同プログラムを暗号化したり、変調をかけたり、圧縮した状態で、インターネット等の有線回線や無線回線を介して、あるいは記録媒体に収納して頒布してもよい。
実施例１：ｉＰＳ細胞の良否判定の指標
　本実施例では、ｉＰＳ細胞の良否判定の指標として利用しうるパラメータを検討した。本実施例では、まず、細胞の核染色を行った。
　本実施例では、細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人　先端医療振興財団　細胞評価グループ　川真田研究室による樹立株）を用いた。培養は、フィーダーを用いるオンフィーダー条件およびフィーダーレス条件の２条件で行った。フィーダー細胞は、ＳＮＬ細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製、製品番号：ＥＣ０７０３２８０１）を使用した。培地は、オンフィーダー条件では、ヒトＥＳ細胞培養用培地（ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２ハム（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｄ６４２１）５００ｍＬ、ノックアウト血清代替物（インビトロジェン社製、製品番号：１０８２８－０２８）１２５ｍＬ、非必須アミノ酸溶液（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｍ７１４５）５ｍＬ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン（インビトロジェン社製、製品番号：２５０３０－０８１）６．２５ｍＬ、０．１Ｍ　２－メルカプトエタノールを添加したＰＢＳ（インビトロジェン社製、製品番号：２１９８５）５００μＬ、ｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４－０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを用い、フィーダーレス条件では、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００６）にｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４－０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを添加した培地を用いた。細胞を通常の培養皿に播種し、５日後、細胞密度の計測のために、核染色を行った。細胞の核染色は、４％パラホルムアルデヒド－リン酸緩衝溶液（和光純薬工業社製、製品番号：１６３－２０１４５）中で細胞を４℃にて一晩固定した後に、固定液を除去して、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中０．１μｇ／ｍＬ）を用いて２５℃で１５分処理することにより行った。染色された細胞は、ＰＢＳで３回洗浄してから、４倍の対物レンズおよび１０倍の接眼レンズを備えた倒立型位相差顕微鏡ＩＸ８１（オリンパス社製）で観察した。
　すると図１に示されるように、ｉＰＳ細胞のコロニーは核が良好に染色されていた。ｉＰＳ細胞のコロニーは、立体状に細胞が幾重にも重なる形態を取るが、核染色を行うと、コロニー内のほぼすべての細胞の核が明確に染色された（図１）。
　一方で、観察したｉＰＳ細胞コロニーは、従来法によっても評価した。具体的には、位相差顕微鏡像に基づき目視により、観察したｉＰＳ細胞コロニーを、最も良好とされるコンパクトなｉＰＳ細胞コロニー（優良なコロニー）、良好でないとされる分化を開始したｉＰＳ細胞コロニー（不良なコロニー）、どちらにも分類されないが、除去しなくても周囲の細胞に分化などの悪影響を与えないｉＰＳ細胞コロニー（良好なコロニー）の３つのタイプに分類した。その後、核染色パターンと照らし合わせて各ｉＰＳ細胞コロニーの良否の評価を行った。
　その結果、得られた染色パターンは、優良なコロニーでは、コロニーの中心部で濃くなる染色像が見られる傾向があったが、不良なコロニーでは、コロニーの周囲部では濃く、中心部では薄い染色像が見られる傾向があった。また、良好なコロニーの典型的な染色パターンとして、コロニー全体が比較的均一に染まる染色像が観察された。
　これらの染色像のパターンの違いは、細胞密度の違いで表すことができる可能性が考えられたので、細胞密度を測定するため、コロニーの中心部を通る幅２００μｍの長方形を設定し、長方形内を一辺１００μｍの正方形に分割して（図２Ａ）、それぞれの正方形に含まれる細胞数を計数し、細胞密度（×１００細胞／ｍｍ２）として求めた。得られた細胞密度の分布は、図２Ｂに示される通りであった。
　さらなる分析のために、コロニーを横切る中心線に沿って得られた細胞密度分布を棒グラフに表した（図３Ａ～Ｃ）。グラフは、コロニー中心部を通る直線の位置（μｍ）を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度（×１００細胞／ｍｍ２）を縦軸（Ｙ軸）として作成した。
　その結果、優良なコロニーでは、細胞密度は、中心部で高い傾向が見られたが（図３Ａ）、不良なコロニーでは、細胞密度は、周囲部では高く、中心部では低い傾向があった（図３Ｂ）。また、良好なコロニーでは、細胞密度はコロニー全体にわたり均一で、台形型の細胞密度分布を示す傾向があった（図３Ｃ）。このように、異なる３つのタイプのコロニーは、３種類の異なる細胞密度分布パターンを示した。また、優良なコロニーと良好なコロニーとを比較したところ、中心部の細胞密度において優良なコロニーの方が良好なコロニーよりも大きくなる傾向が見られた（図３ＡおよびＣ）。また、観察した２０例のｉＰＳ細胞コロニーはいずれも、上記の図３Ａ～Ｃのいずれかのタイプの細胞密度分布パターンを示した。すなわち、すべてのｉＰＳ細胞コロニーは、コロニー内の細胞密度分布を指標とすることにより、ｉＰＳ細胞コロニーを明確に上記３種類のタイプのコロニーのいずれかに分類できた。
　このことから、核染色によりｉＰＳ細胞コロニーの細胞密度を測定することが可能であること、および、コロニー内の細胞密度分布を指標とすることにより、個々のｉＰＳ細胞コロニーの良否の評価が可能であることが明らかとなった。
実施例２：ｉＰＳ細胞コロニーにおける細胞密度分布に基づくコロニーの良否判定
　本実施例では、実施例１で得られた細胞密度分布の数値からグレースケール画像を取得して比較することにより、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定を行った。
　まず、熟練した技術者により判別した、優良なコロニー（１０コロニー）、良好なコロニー（１０コロニー）および不良なコロニー（１７コロニー）の計３７コロニーについて、実施例１と同様の方法により各コロニーの細胞密度分布を取得した。便宜的に、各細胞密度分布から、細胞密度が５０（×１００細胞／ｍｍ２）の場合を白色とし、０（×１００細胞／ｍｍ２）の場合を黒色とした８ビットのグレースケール画像を作成した（図４）。得られたグレースケール画像を目視により比較し、優良なコロニー、良好なコロニーおよび不良なコロニーのいずれかに振り分けた。その結果は表１の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　表１に示されるとおり、位相差画像に基づく熟練した技術者により判別した場合と、細胞密度分布をグレースケール画像化して判別した場合とでは、整合率が９１．９％（３７コロニー中３４コロニーで整合）であった。
　位相差画像に基づく判断と、細胞密度に基づく判断が１００％整合しなかったことから、細胞密度以外の指標が重要であること、および、熟練した技術者は細胞密度以外の指標を判断指標として用いていることが示唆された。一方で、本実施例では、細胞密度にのみ基づく評価を行ったとしても、ある一定の良好な整合率を示したことから、多能性幹細胞コロニーの核染色パターンから細胞密度を推定し、その細胞密度に基づいてコロニーの良否を判断または判定しうることが明らかとなった。
実施例３：ｉＰＳ細胞コロニーの中心部の細胞密度に基づくコロニーの良否判定
　実施例１および２では、良好なｉＰＳ細胞コロニーは、中心部の細胞密度が高い傾向を示し、他方、不良なｉＰＳ細胞コロニーは、中心部の細胞密度が低い傾向を示した。そこで、本実施例では、ｉＰＳ細胞コロニーの中心部の細胞密度を比較することにより、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能であるかを調べた。
　具体的には、本実施例では、実施例２で得られた細胞密度分布から各コロニーの中心部における細胞密度を取得し、その大小の比較を行った。
　その結果、優良なコロニーは、コロニー中心部の細胞密度が最も高く、次いで良好なコロニーの中心部の細胞密度が高く、不良なコロニーの中心部の細胞密度が最も低くなる傾向が見られた（図５）。そのため、コロニー中心部の細胞密度の比較は、ｉＰＳ細胞の良否判定に利用できることが明らかとなった。
　しかしながら、分化を開始したと考えられる不良なコロニーであっても、優良なコロニーよりも細胞密度が高くなる場合が見られた（図５）。そのため、コロニー中心部の細胞密度のみの比較によっては、優良なコロニーと不良なコロニーとを完全に判別することはできなかった。また、良好なコロニーと不良なコロニーとを判別することはほとんどできなかった。この理由として、不良なコロニーの中心部の細胞密度は、分化初期には比較的大きいこと、および細胞密度の低下は必ずしもコロニー中心部から開始されるわけではないことが考えられる。
　次に、コロニー中心部の細胞密度の比較がｉＰＳ細胞の良否判定に利用できる可能性を検証するために、コロニー中心部の細胞密度に閾値（×１００細胞／ｍｍ２）を設けて、コロニーの良否判定を行った。コロニー中心部の細胞密度の閾値を５５（×１００細胞／ｍｍ２）とした場合には、優良なコロニーの回収率は５０％（１０コロニー中５コロニー）、不良なコロニーの混入率は０％（１７コロニー中０コロニー）となり、閾値を３５（×１００細胞／ｍｍ２）とすると、優良なコロニーの回収率は７０％（１０コロニー中２コロニー）、不良なコロニーの混入率は１１．８％（１７コロニー中２コロニー）となった。
　このように、本実施例では、優良なコロニーと不良なコロニーとを判別することは可能であった。特に、優良なコロニーの回収率を５０％（細胞密度の閾値を５５（×１００細胞／ｍｍ２））とすれば、不良なコロニーの混入をほぼ回避することができることが分かった。回収率と混入率の点で改善すべき点があるものの、本実施例は、細胞密度の大小を単純に比較することにより、細胞の良否を判定することが可能であることを示すものであり、細胞密度に基づけば、コンピュータによって細胞の良否を自動判定することができることを意味するものである。
実施例４：細胞密度分布に対する近似式を用いたｉＰＳ細胞コロニーの良否判定
　本実施例では、細胞密度分布に対してフィット関数を作成し、得られたフィット関数を用いてｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能か否かを調べた。
　本実施例では、優良なコロニーと良好なコロニーの細胞密度分布に対するフィット関数としては、凸形状の関数、具体的には、台形型のフィット関数を作成して評価に用いた。本実施例では、台形型のフィット関数として、良好なコロニーの細胞密度分布の形状を良好に表すｆｇｏｏｄ関数：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 を用いた場合の例を示す。
　まず、実施例２で得られた３７コロニーの細胞密度分布のそれぞれに対して、最小二乗法を用いてｆｇｏｏｄ（ｘ）をカーブフィットした。その結果、優良なコロニーおよび良好なコロニーでは、ｆｇｏｏｄ（ｘ）は、細胞密度分布の実測値に対して良好なフィッティングを示した（図６Ａ）。一方で、不良なコロニーでは、ｆｇｏｏｄ（ｘ）は良好なフィッティングは示さなかった（図６Ｂ）。
　そこで、ｆｇｏｏｄ（ｘ）と細胞密度分布の実測値とのずれの大小を指標として、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能かを調べた。具体的には、カーブフィットのずれの大小の指標として、χ２／ＮＤＦ（自由度＝フィットしたデータ数－近似式のパラメータ数）を算出し、コロニー毎に算出されるχ２／ＮＤＦの値の大小を比較することでｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能かを調べた。フィッティングが良好であるほど、χ２／ＮＤＦ値は小さくなることが知られている。
　上述のようにカーブフィットのずれの大小の指標として評価したところ、図７に示されるように、優良なコロニーおよび良好なコロニーは、不良なコロニーと比較して、ｆｇｏｏｄ（ｘ）に対するフィッティングがより良好である傾向が見られた。また、図７からは、χ２／ＮＤＦに閾値を設定して、優良なコロニーの回収率を９０％とした場合には、不良なコロニーが１１．８％混入し、優良なコロニーの回収率を８０％とした場合には、不良なコロニーが５．９％混入し、優良なコロニーの回収率を６０％とした場合には、不良なコロニーが０％混入することが分かった。このことから、χ２／ＮＤＦに閾値を設定することにより、優良なコロニーの回収率と良好なコロニーの混入率を適宜調整することができることが理解できる。
　このように、近似式からのずれの大小を指標として評価した場合にも、ｉＰＳ細胞コロニーの良否判定が可能であることが明らかとなった。
　次に、コロニー毎に上記ｆｇｏｏｄ（ｘ）の最大値を算出し、その大小を比較した。その結果、驚くべきことに、優良なコロニーと良好なコロニーとが明確に区別できることが明らかとなった（図８）。特に、閾値を４０～４５に設定することにより、優良なコロニーと良好なコロニーとを明確に判定することができた（図８）。
　これらの結果から、近似式のカーブフィットがｉＰＳ細胞コロニーの良否判定に有効であることが示された。
実施例５：細胞密度分布に対するフィット関数を複数用いた場合のｉＰＳ細胞コロニーの良否判定
　本実施例では、優良なコロニーおよび良好なコロニーに対するフィット関数に加え、不良なコロニーに対するフィット関数をさらに用いてｉＰＳ細胞コロニーの良否判定を行った。
　本実施例では、実施例１で得られた２０例の細胞密度分布を解析した。優良なコロニーおよび良好なコロニーに対するフィット関数としては、上記ｆｇｏｏｄ（ｘ）を用い、不良なコロニーに対するフィット関数としては、不良なコロニーの細胞密度分布の形状を良好に表すｆｂａｄ関数：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 を用いた。
　ｆｂａｄ（ｘ）を用いてカーブフィットを行ったところ、不良なコロニーの細胞密度分布に対して良好なフィッティングを示した（図９Ｂ）。
　次に、すべてのコロニーに対して、上記ｆｇｏｏｄ（ｘ）およびｆｂａｄ（ｘ）をカーブフィットし、それぞれのコロニーに対して、以下のパラメータを算出した。具体的には、パラメータＡは、コロニー中心部におけるｆｇｏｏｄ（ｘ）およびｆｂａｄ（ｘ）の値のうち、実測値に近い値とした。パラメータＡは、良好なｉＰＳ細胞コロニーほど大きな値を示すと予想される。パラメータＢは、（コロニー中心部におけるｆｇｏｏｄ（ｘ）とｆｂａｄ（ｘ）の差）＋（コロニー内で測定される実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値の差）＋（コロニー内のｆｂａｄ（ｘ）の最大値と極小値の差）とした。パラメータＢは、分化を開始した不良なｉＰＳ細胞コロニーほど大きな値を示すと予想される。
　ｉＰＳ細胞コロニー毎にパラメータＡおよびＢを算出し、パラメータＡを横軸とし、パラメータＢを縦軸として、各コロニーをグラフにプロットした結果、優良なコロニー、良好なコロニーおよび不良なコロニーがそれぞれ明瞭に分離されることが分かった（図１０）。特に、パラメータＢを指標とすると、優良なコロニーや良好なコロニーと不良なコロニーとを判別することが可能であること、並びに、さらにパラメータＡを指標とすると、優良なコロニーと良好なコロニーとを判別することができることが分かった（図１０）。具体的には、本実施例では、パラメータＢを４６とすることで、不良なコロニーの混入率を０とすることができ、かつ、優良なコロニーおよび良好なコロニーを９０％回収できた。また、パラメータＡを４０とすることで、優良なコロニーと良好なコロニーとを１００％判別できた。
　このように、未分化で良好なｉＰＳ細胞コロニーと、分化を開始したｉＰＳ細胞コロニーとは、細胞密度分布を比較することで、明確に判別が可能であることが明らかとなった。
　実施例１によれば、位相差画像に基づく判断と、細胞密度に基づく判断とは、かならずしも整合しない。このことは、熟練した技術者は細胞密度以外の指標を判断指標として用いていることを示唆するものであるが、本実施例によれば、近似式を活用することにより、細胞密度のみに基づく判断によっても、細胞の高精度な良否判定が可能であった。しかも、本実施例の方法は、コンピュータによる細胞の良否の自動判定に適用できるものであり、従来行われてきた経験に基づく判断を自動化するための方法として有用である。

Claims (24)

  1. 　多能性幹細胞の核染色像に基づいて多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法。
  2. 　多能性幹細胞の核染色像から得られた核染色パターンに基づいてコロニーの良否を評価する、請求項１に記載の方法。
  3. 　多能性幹細胞の核染色像から得られた細胞密度に基づいてコロニーの良否を評価する、請求項１に記載の方法。
  4. 　コロニー中心部の細胞密度と、場合によってはその周辺部の細胞密度とに基づいてコロニーの良否を評価する、請求項３に記載の方法。
  5. 　コロニー内の細胞密度分布に基づいてコロニーの良否を評価する、請求項３に記載の方法。
  6. 　コロニーの細胞密度分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの細胞密度分布に対してカーブフィットすることによりそのコロニーの良否を評価する、請求項５に記載の方法。
  7. 　予め作成したフィット関数が、
    　凸形状を表すフィット関数（ｆｇｏｏｄ関数）、および／または、
    　コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆｂａｄ関数）
    　を含んでなる少なくとも１種類のフィット関数である（但し、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、細胞密度を縦軸（Ｙ軸）としてフィット関数のグラフを作成する）、請求項６に記載の方法。
  8. 　予め作成したフィット関数が、ｆｇｏｏｄ関数とｆｂａｄ関数とを含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である、請求項７に記載の方法。
  9. 　ｆｂａｄ関数が、
    （条件Ｂ１）ｘ→－∞およびｘ→∞の極限において収束する、
    （条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
    （条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
    から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　前記ｆｂａｄ関数が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ｆｇｏｏｄ関数が、
    （条件Ｇ１）ｘ→－∞およびｘ→∞の極限において収束する、
    （条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
    （条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
    　から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記ｆｇｏｏｄ関数が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
     である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの細胞密度分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する、請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線から抽出したパラメータを指標としてコロニーの良否を評価する、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値からなる群から選択される１以上のパラメータである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　２つのパラメータの和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　２つのパラメータの和、差、積または比の値と、別の２つのパラメータの組み合わせにおける２パラメータの和、差、積または比の値との、和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
  18. 　パラメータが、コロニー内における、ｆｇｏｏｄ関数の最大値、ｆｂａｄ関数の最大値およびｆｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２以上のパラメータである、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. （i）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の値のうち実測値に近い方の値、
    （ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄ関数およびｆｂａｄ関数の差、
    （iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、
    （iv）コロニーにおけるｆｂａｄ関数の最大値と極小値との差、または
    （v）上記の（i）～（iv）の一部若しくは全部の組み合わせ
    を用いて評価する、請求項１７に記載の方法。
  20. （ii）コロニーの中心部でのｆｇｏｏｄおよびｆｂａｄの差、
    （iii）コロニーにおける実測値の最大値とコロニー中心部における実測値の最小値との差、および、
    （iv）コロニーにおけるｆｂａｄの最大値と極小値との差
    の和が閾値以下の場合には、コロニーを良好と判定し、閾値を超えた場合には、コロニーを不良と判定する、請求項１９に記載の方法。
  21. 　請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
  22. 　請求項２１に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
  23. 　請求項２１に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
  24. 　請求項２３に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞のコロニーの良否の自動判定システム。
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