JP5816415B2 - 細胞評価装置、インキュベータ、プログラム、および、培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞評価装置、インキュベータ、プログラム、および、培養方法に関する。

細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、再生医療分野では、インビトロで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、細胞の培養状態を的確に評価することが不可欠となる。一例として、特許文献１には、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が開示されている。

特開２００７−１９５５３３号公報

しかしながら、上記の従来技術では、評価対象の各細胞に予めマーカーを導入する前処理が必要となるため非常に煩雑である。そのため、比較的簡易な手法で細胞の培養状態を精度よく評価することがなお要請されている。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、その目的は、比較的簡易な手法で細胞を評価することができる細胞評価装置、インキュベータ、プログラム、および、培養方法を提供することにある。

この発明は上述した課題を解決するためになされたもので、培養容器内で培養される複数の細胞が時系列に撮像されている複数の画像を読み込む画像読込部と、前記画像に含まれる各々の前記細胞について、前記細胞の異なる複数の形態的な特徴を示す複数の異なる特徴量を前記画像からそれぞれ求める特徴量演算部と、前記細胞について評価する対象となる特性を、前記特徴量により評価することが適しているか否かを、各々の前記複数の画像に対応する前記特徴量のそれぞれについて、判定する特徴量判定部と、前記特徴量に対しての前記特徴量判定部による判定結果が、前記時系列において連続しているか否かを、前記特徴量のそれぞれについて判定する連続性判定部と、前記特徴量演算部により求められた特徴量と前記連続性判定部による判定結果とを組み合わせて、前記細胞における前記特性を評価するための計算モデルを構築する計算モデル構築部と、を備えていることを特徴とする細胞評価装置である。

また、この発明は、細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、上記に記載の細胞評価装置と、を備えることを特徴とするインキュベータである。

また、この発明は、コンピュータを、上記に記載の細胞評価装置として機能させることを特徴とするプログラムである。

また、この発明は、上記に記載の細胞評価装置により推測された特性に基づき、前記培養容器内で培養されている細胞の培養条件を変更することを特徴とする細胞の培養方法である。

この発明によれば、比較的簡易な手法で細胞を評価することができる。

この発明の第１の実施形態によるインキュベータの概要を示すブロック図である。 図１のインキュベータの正面図である。 図１のインキュベータの平面図である。 図１のインキュベータによる観察動作の一例を示す流れ図である。 第１の実施形態によるインキュベータのＣＰＵ４２が、計算モデルを生成する場合の処理の一例を示す流れ図である。 本実施形態で用いられる各特徴量の概要を示す図である。 「骨にならなかった細胞」と「骨になった細胞」との一例を示す図である。 特徴量判定部４５による判定結果の一例を示す表である。 ＡＮＮの概要を示す図である。 ＦＮＮの概要を示す図である。 ＦＮＮにおけるシグモイド関数を示す図である。 第１の実施形態によるインキュベータのＣＰＵ４２が、細胞を評価する場合の処理の一例を示す流れ図である。 この発明の第２の実施形態によるインキュベータの概要を示すブロック図である。 第２の実施形態によるインキュベータのＣＰＵ４２が、計算モデルを生成する場合の処理の一例を示す流れ図である。 特徴量の経時的変化の例を示すヒストグラムである。 正常な細胞群をタイムラプス観察した顕微鏡画像を示す図である。 正常な細胞にがん細胞を混在した細胞群をタイムラプス観察した顕微鏡画像を示す図である。 第２の実施形態によるインキュベータのＣＰＵ４２が、細胞を評価する場合の処理の一例を示す流れ図である。 筋芽細胞の培養状態例を示す図である。 筋芽細胞の培養時における「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムを示す図である。 筋芽細胞の培養時における「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムを示す図である。 実施例の第１の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフを示す図である。 実施例の第２の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフを示す図である。 本実施形態による細胞評価装置を用いた細胞の培養方法を示すフローチャートである。

＜第１の実施形態＞
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。図１は、第１の実施形態による細胞評価装置を含むインキュベータの概要を示すブロック図である。また、図２，図３は、第１の実施形態のインキュベータの正面図および平面図である。

第１の実施形態のインキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。

まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図２，図３での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。

恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。

また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。

ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図３の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対象となる細胞が培地とともに収容されている。

観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。

ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。

試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３５が内蔵されている。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得できる。

容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。

図３に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。

また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。

次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、インキュベータ１１の制御装置４１が収納されている。

制御装置４１は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２および容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。

一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケンスで取得した画像に基づいて、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。

次に、制御装置４１の構成について説明する。この制御装置４１は、ＣＰＵ４２および記憶部４３を有している。

記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３には、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとが記憶されている。さらに、記憶部４３には、ＣＰＵ４２によって実行されるプログラムが記憶されている。

なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器ごとにそれぞれ管理データが生成される。

ＣＰＵ４２は、特徴量演算部４４と、特徴量判定部４５と、連続性判定部４６と、計算モデル構築部４７と、推定部４８とを備えている。このＣＰＵ４２は、たとえば、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。なお、ＣＰＵ４２は、プログラムの実行によって、特徴量演算部４４と、特徴量判定部４５と、連続性判定部４６と、計算モデル構築部４７と、推定部４８としてそれぞれ機能してもよい。また、ＣＰＵ４２は、画像読込部５０と画像入力部５１とを備えている。

画像読込部５０は、培養容器内で培養される複数の細胞が時系列に撮像されている複数の画像を記憶部４３から読み込む。また、この画像読込部５０は、記憶部４３から画像を読込む場合、この画像に撮像されている細胞についての情報も読込む（または、入力される）。この細胞についての情報とは、学習する対象となる情報のことであり、たとえば、各画像に対応するＭＳＣ細胞が骨となったか否かを示す情報のことである。

特徴量演算部４４は、画像に含まれる各々の細胞について、細胞の異なる複数の形態的な特徴を示す複数の異る特徴量を画像からそれぞれ求める。

特徴量判定部４５は、細胞について評価する対象となる特性を、特徴量により評価することが適しているか否かを、各々の複数の画像に対応する特徴量のそれぞれについて、判定する。すなわち、特徴量判定部４５は、後述する計算モデルを構築する場合に、特徴量を用いることが適切であるか否かを、特徴量毎に判定する。ここでいう特徴量とは、たとえば、時系列において連続して測定された測定値のうち、１回分の測定値のことである。

連続性判定部４６は、特徴量に対しての特徴量判定部４５による判定結果が、時系列において連続しているか否かを、特徴量のそれぞれについて判定する。すなわち、特徴量判定部４５は、特徴量判定部４５後述する計算モデルを構築する場合に、特徴量を用いることが適切であると判定されたことが、時系列において連続しているか否かを、特徴量毎に判定する。

計算モデル構築部４７は、特徴量演算部４４により求められた特徴量と連続性判定部４６による判定結果とを組み合わせて、細胞における特性を評価するための計算モデルを構築する。計算モデル構築部４７は、たとえば、教師付き学習により計算モデルを求める。なお、この計算モデルは、細胞における特性を評価した結果を、評価情報として出力する。

また、計算モデル構築部４７は、たとえば、計算モデルを構築する場合に、連続性判定部４６による判定結果に基づいて、特徴量の中から計算モデルを構築する特徴量を抽出し、当該抽出した特徴量に基づいて、計算モデルを構築する。

また、この計算モデル構築部４７は、たとえば、計算モデルを構築する場合に、連続性判定部４６による判定結果に基づいて、特徴量に重み付けをして計算モデルを構築する。

画像入力部５１には、評価対象となる細胞の画像であって、培養容器内で培養される複数の細胞が時系列に撮像されている画像が入力される。たとえば、評価対象となる細胞の画像が予め記憶部４３に記憶されており、この画像入力部５１は、評価対象となる細胞の画像を記憶部４３から読み出す。

推定部４８は、画像入力部５１に入力された画像を、計算モデル構築部４７により構築された計算モデルに入力して、評価情報を算出し、算出した評価情報を出力する。これにより、推定部４８は、評価対象となる細胞に対しての特性を推測する。

なお、推定部４８から出力される評価情報は、たとえば、評価対象となる細胞を培養した場合、「骨になるか否か」という定性的な情報であってもよいし、「骨になる確率が何％である」という定量的な情報であってもよい。これら評価情報の違いは、計算モデル構築部４７により構築される計算モデルに依存する。

本実施形態による細胞評価装置は、上述した特徴量演算部４４と、特徴量判定部４５と、連続性判定部４６と、計算モデル構築部４７と、推定部４８と、画像読込部５０と、画像入力部５１とを含めて構成されている。

＜第１の実施形態における観察動作の例＞
次に、図４の流れ図を参照しつつ、第１の実施形態におけるインキュベータ１１での観察動作の一例を説明する。この図４は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する動作例を示している。

ステップＳ１０１：ＣＰＵ４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ＹＥＳ側）、ＣＰＵ４２はＳ１０２に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。

ステップＳ１０２：ＣＰＵ４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。

ステップＳ１０３：ＣＰＵ４２は、観察ユニット２２に対して細胞の顕微鏡画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、ＬＥＤ光源３５を点灯させて培養容器１９を照明するとともに、撮像装置３４を駆動させて培養容器１９内の細胞の顕微鏡画像を撮像する。

このとき、撮像装置３４は、記憶部４３に記憶されている管理データに基づいて、ユーザーの指定した撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点）に基づいて顕微鏡画像を撮像する。例えば、培養容器１９内の複数のポイントを観察する場合、観察ユニット２２は、試料台３１の駆動によって培養容器１９の位置を逐次調整し、各々のポイントでそれぞれ顕微鏡画像を撮像する。なお、Ｓ１０３で取得された顕微鏡画像のデータは、制御装置４１に読み込まれるとともに、ＣＰＵ４２の制御によって記憶部４３に記録される。

ステップＳ１０４：ＣＰＵ４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、ＣＰＵ４２は、観察シーケンスを終了してＳ１０１に処理を戻す。

この図４の流れ図を用いた説明により、インキュベータ１１により観察された時系列の画像データが、記憶部４３に記憶される。

＜第１の実施形態における培養状態評価処理＞
次に図５を用いて、上述した図４の処理により記憶部４３に記憶された画像データを用いて、制御装置４１が、細胞を評価する計算モデルを構築する一例について説明する。ここでは、一例として、培養容器１９をタイムラプス観察して取得した複数の顕微鏡画像を用いて、培養容器１９の培養細胞において、葉系幹細胞（以下、ＭＳＣ細胞とする）が分化して、骨となるか否かを、制御装置４１が推定する場合について説明する。

また、ここでは、図４の処理において、培養容器１９のタイムラプス観察は、培養開始から０．３３日目（８時間）経過後を初回として、０．３３日おきに１３．６７日目まで行われているものとして説明する。また、ここでは、複数の培養容器１９がそれぞれタイムラプス観察されており、上記のサンプルの顕微鏡画像が記憶部４３に記憶されているものとして説明する。なお、制御装置４１は、同じ培養容器１９の複数ポイント（例えば５点観察または培養容器１９の全体）を同じ観察時間帯で撮影した複数の顕微鏡画像を、タイムラプス観察の１回分の画像として扱うようにしてもよい。

また、当該タイムラプス観察されたＭＳＣ細胞については、骨となるか否かが既知となっているものとする。これは、たとえば、培養容器１９でタイムラプス観察されたＭＳＣ細胞が、任意の実験により、骨となるか否かを調べられていてもよい。この任意の実験は、本実施形態によるタイムラプス観察が終了した後に行われる実験であってもよい。

そして、制御装置４１には、培養容器１９毎のＭＳＣ細胞の画像と、当該培養容器１９で培養されたＭＳＣ細胞が骨となったか否かを示す情報とが、培養容器１９毎に入力されるものとする。なお、ＭＳＣ細胞が骨となったか否かを示す情報は、インキュベータ１１により観察された時系列の画像データと関連付けられて、記憶部４３に記憶されていてもよい。

ステップＳ２０１：ＣＰＵ４２は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。なお、ステップＳ２０１でのＣＰＵ４２は、各画像に対応するＭＳＣ細胞が骨となったか否かを示す情報もこの時点で取得するものとする。

ステップＳ２０２：ＣＰＵ４２は、上記のサンプルの顕微鏡画像（ステップＳ２０１）のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、ステップＳ２０２でのＣＰＵ４２は、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。

ステップＳ２０３：ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４は、処理対象の顕微鏡画像（ステップＳ２０２）について、画像内に含まれる細胞を抽出する。例えば、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、特徴量演算部４４は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出するとともに、輪郭追跡処理によってエッジで囲まれた閉空間を細胞と推定する。これにより上記の顕微鏡画像から個々の細胞を抽出することができる。

ステップＳ２０４：ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４は、ステップＳ２０３で画像から抽出した各々の細胞について、細胞の異なる複数の形態的な特徴を示す複数の異る特徴量を画像からそれぞれ求める。このステップＳ２０４において、ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４は、上述した複数の異る特徴量として、１６種類の特徴量を、ステップＳ２０３で画像から抽出した各々の細胞について求めるものとする。

ステップＳ２０５：ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４は、処理対象の顕微鏡画像（ステップＳ２０２）について、各細胞の１６種類の特徴量（ステップＳ２０４）をそれぞれ記憶部４３に記録する。

ステップＳ２０６：ＣＰＵ４２は、全ての顕微鏡画像が処理済み（全てのサンプルの顕微鏡画像で各細胞の特徴量が取得済みの状態）であるか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ４２はステップＳ２０９に処理を移行させる。一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２はステップＳ２０２に戻って、未処理の他の顕微鏡画像を処理対象として上記動作を繰り返す。

ステップＳ２０９：ＣＰＵ４２の特徴量判定部４５は、細胞について評価する対象となる特性を、特徴量により評価することが適しているか否かを、各々の複数の画像に対応する特徴量のそれぞれについて、判定する。

ステップＳ２１０：ＣＰＵ４２の連続性判定部４６は、特徴量に対しての特徴量判定部４５による判定結果が、時系列において連続しているか否かを、特徴量のそれぞれについて判定する。

ステップＳ２１１：ＣＰＵ４２の計算モデル構築部４７は、特徴量演算部４４により求められた特徴量と連続性判定部４６による判定結果とを組み合わせて、細胞における特性を評価するための計算モデルを構築する。

ステップＳ２１２：ＣＰＵ４２の計算モデル構築部４７は、ステップＳ２１１で構築して求めた計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。以上で、図５の説明を終了する。

＜図５のステップＳ２０４：ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４による処理の詳細＞
次に、図６を用いて、図５のステップＳ２０４におけるＣＰＵ４２の特徴量演算部４４による処理について詳細に説明する。この特徴量演算部４４は、各細胞について以下の１６種類の特徴量をそれぞれ求める。

・Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ（図６の（ａ）参照）「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」は、注目する細胞の面積を示す値である。例えば、特徴量演算部４４は、注目する細胞の領域の画素数に基づいて「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値を求めることができる。

・Ｈｏｌｅ ａｒｅａ（図６の（ｂ）参照）「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、注目する細胞内のＨｏｌｅの面積を示す値である。ここで、Ｈｏｌｅは、コントラストによって、細胞内における画像の明るさが閾値以上となる部分（位相差観察では白に近い状態となる箇所）を指す。例えば、細胞内小器官の染色されたリソソームなどがＨｏｌｅとして検出される。また、画像によっては、細胞核や、他の細胞小器官がＨｏｌｅとして検出されうる。なお、特徴量演算部４４は、細胞内における輝度値が閾値以上となる画素のまとまりをＨｏｌｅとして検出し、このＨｏｌｅの画素数に基づいて「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を求めればよい。

・ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ（図６の（ｃ）参照）「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値で除した値である（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ＝Ｈｏｌｅ ａｒｅａ／Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ）。この「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、細胞の大きさにおける細胞内小器官の割合を示すパラメータであって、例えば細胞内小器官の肥大化や核の形の悪化などに応じてその値が変動する。

・Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ（図６の（ｄ）参照）「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」は、注目する細胞の外周の長さを示す値である。例えば、特徴量演算部４４は、細胞を抽出するときの輪郭追跡処理により「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の値を取得することができる。

・Ｗｉｄｔｈ（図６の（ｅ）参照）「Ｗｉｄｔｈ」は、注目する細胞の画像横方向（Ｘ方向）での長さを示す値である。

・Ｈｅｉｇｈｔ（図６の（ｆ）参照）「Ｈｅｉｇｈｔ」は、注目する細胞の画像縦方向（Ｙ方向）での長さを示す値である。

・Ｌｅｎｇｔｈ（図６の（ｇ）参照）「Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を横切る線のうちの最大値（細胞の全長）を示す値である。

・Ｂｒｅａｄｔｈ（図６の（ｈ）参照）「Ｂｒｅａｄｔｈ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」に直交する線のうちの最大値（細胞の横幅）を示す値である。

・Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ（図６の（ｉ）参照）「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の長さを示す値である。特徴量演算部４４は、下式（１）により「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の値を求める。

但し、本明細書の式において「Ｐ」はＰｅｒｉｍｅｔｅｒの値を示す。同様に「Ａ」はＴｏｔａｌ Ａｒｅａの値を示す。

・Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ（図６の（ｊ）参照）「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の幅（Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈと直交する方向の長さ）を示す値である。特徴量演算部４４は、下式（２）により「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」の値を求める。

・Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ（図６の（ｋ）参照）「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」は、注目する細胞の円形度（細胞の丸さ）を示す値である。特徴量演算部４４は、下式（３）により「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値を求める。

・Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ（図６の（ｌ）参照）「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」の値を「Ｂｒｅａｄｔｈ」の値で除した値（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ＝Ｌｅｎｇｔｈ／Ｂｒｅａｄｔｈ）であって、注目する細胞の細長さの度合いを示すパラメータとなる。

・Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｍ）参照）「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の内接円の半径を示す値である。

・Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｎ）参照）「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の外接円の半径を示す値である。

・Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｏ）参照）「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の輪郭を構成する全点とその重心点との平均距離を示す値である。

・Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｐ）参照）「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞と同面積の円の半径を示す値である。この「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」のパラメータは、注目する細胞を仮想的に円に近似した場合の大きさを示している。

ここで、ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４は、細胞に対応する画素数に誤差分を加味して上記の各特徴量を求めてもよい。このとき、特徴量演算部４４は、顕微鏡画像の撮影条件（撮影倍率や顕微光学系の収差など）を考慮して特徴量を求めるようにしてもよい。なお、「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」を求めるときには、特徴量演算部４４は、公知の重心演算の手法に基づいて各細胞の重心点を求め、この重心点を基準にして各パラメータを求めればよい。

＜図５のステップＳ２０９とＳ２１０：ＣＰＵ４２の特徴量判定部４５と連続性判定部４６とによる処理の詳細＞
次に、図７と図８とを用いて、図５のステップＳ２０９とＳ２１０とにおけるＣＰＵ４２の特徴量判定部４５と連続性判定部４６とによる処理について詳細に説明する。

特徴量判定部４５は、細胞について評価する対象となる特性を、特徴量により評価することが適しているか否かを、各々の複数の画像に対応する特徴量のそれぞれについて、判定する場合、たとえば、統計的検定により判定する。この統計的検定とは、たとえば、ｔ検定などであり、２組の標本についての平均に有意差があるか否かを検定する場合に用いられる。

特徴量判定部４５は、このような統計的検定を、図７（ａ）に示されるような「骨にならなかった細胞」と、図７（ｂ）に示されるような「骨になった細胞」という、培養した結果が既知である２組の標本についての平均に有意差があるか否かを、特徴量毎に、かつ、時系列毎に検定する。なお、図７（ａ）と図７（ｂ）とにおいて、それぞれの右側と左側との図は、白色と黒色とを互いに反転させた図であり、実質的に同じ図である。

図８には、特徴量判定部４５により、このようにして特徴量毎かつ時系列毎に検定された結果の一例が示されている。この図８の表においては、特徴量（形態の指標）が列とされ、時系列（各観察時間）が行とされている。ここでは特徴量として、上述した１６種類のうちから選択された１１種類が示されている。そして、各特徴量と各時系列とに対応して、この時系列の時刻における特徴量が、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適しているか否かを示す値が示されている。すなわち、各特徴量と各時系列とに対応して、この時系列の時刻における特徴量に対しての、統計的検定値が示されている。

ここでは、統計的検定値が５％（＝０．０５）以下となり、統計的に有意差があると判定された特徴量およびその時系列の時刻に対して、ハッチ（斜線）が付けられている。なお、本実施形態においては、たとえば、統計的検定値が５％以下となる特徴量（その時刻における特徴量）は、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定され、統計的検定値が５％未満となる特徴量（その時刻における特徴量）は、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していないと判定されるものとする。なお、この閾値となる５％という値は、１％であってもよいし、任意に設定されてもよい。

この図８に示されているように、ある特徴量は、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定され、かつ、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定された結果が、時系列において連続している。

たとえば、「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」という特徴量は、経過日数が３．００日目から１３．６７日目において、連続して、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定されている。また、「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」という特徴量は、経過日数が２．００日目から３．００日目、および、３．６７日目から６．６７日目において、連続して、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定されている。

連続性判定部４６は、特徴量に対しての特徴量判定部４５による判定結果が、時系列において連続しているか否かを、特徴量のそれぞれについて判定し、たとえば、「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」という特徴量は、経過日数が３．００日目から１３．６７日目において連続している、と判定する。

なお、特徴量判定部４５により、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定されていると判定される特徴量は、他の特徴量に対比して、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定されていることなる。そして、連続性判定部４６により、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると、連続して判定されていると判定される特徴量は、他の特徴量に対比して、更に、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定されていることなる。

＜図５のステップＳ２１１：ＣＰＵ４２の計算モデル構築部４７による処理の詳細＞
次に、図９から図１１を用いて、図５のステップＳ２１１におけるＣＰＵ４２の計算モデル構築部４７による処理について詳細に説明する。

なお、本実施形態においては、たとえば、図８に示した時系列における特徴量において、全ての時系列における特徴量を計算モデルに用いることも可能であるし、時系列における一部の時刻の特徴量を計算モデルに用いることも可能である。この「時系列における一部の時刻の特徴量」とは、たとえば、「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」という特徴量の経過日数が３．００日目の値、「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」という特徴量の経過日数が３．３３日目の値、・・・「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」という特徴量の経過日数が１３．６７日目の値と、それぞれの値のことである。ここでは、「時系列における一部の時刻の特徴量」を、「指標」として説明する。図８の場合には、測定された経過日数ごとの特徴量それぞれの値が、指標となる。

ここでは、計算モデル構築部４７が、ファジーニューラルネットワーク（Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＦＮＮ）解析によって上記の計算モデルを求める場合について説明する。

また、ここでは、計算モデル構築部４７が、特徴量に基づいて、各々の顕微鏡画像のセットにおいて、がん細胞の数（予測値）を求める場合の計算モデルを求める場合について説明する。なお、ここでは、計算モデル構築部４７が、がん細胞の数（予測値）を求める場合の計算モデルを構築する場合について説明しているが、骨となるか否かを評価する場合の計算モデルを構築する場合でも、計算モデルの構築方法は同様である。

ＦＮＮとは、人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＡＮＮ）とファジィ推論とを組み合わせた方法である。このＦＮＮでは、ファジイ推論の欠点であるメンバーシップ関数の決定を人間に頼るという部分を回避すべく、ＡＮＮをファジィ推論に組み込んでその自動決定を行う。

学習機械のひとつであるＡＮＮ（図９参照）は、生体の脳における神経回路網を数学的にモデル化したものであり、以下の特徴を持つ。ＡＮＮにおける学習は、目的の出力値（教師値）をもつ学習用のデータ（入力値：Ｘ）を用いて、バックプロパゲーション（Ｂａｃｋ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：ＢＰ）法により教師値と出力値（Ｙ）との誤差が小さくなるように、ノード（図９において丸で示す）間をつなぐ回路における結合荷重を変え、その出力値が教師値に近づくようにモデルを構築する過程である。このＢＰ法を用いれば、ＡＮＮは学習により自動的に知識を獲得することができる。そして、最終的に学習に用いていないデータを入力することにより、そのモデルの汎用性を評価できる。

従来、メンバーシップ関数の決定は、人間の感覚に頼っていたが、上で述べたようなＡＮＮをファジイ推論に組み込むことで自動的なメンバーシップ関数の同定が可能になる。これがＦＮＮである。ＦＮＮでは、ＡＮＮと同様に、ＢＰ法を用いることによりネットワークに与えられた入出力関係を、結合荷重を変化させることで自動的に同定しモデル化できる。ＦＮＮは、学習後のモデルを解析することでファジィ推論のように人間に理解しやすい言語的なルール（一例として図１０の右下の吹き出しを参照）として知識を獲得できるという特徴をもっている。つまり、ＦＮＮは、その構造、特徴から、細胞の形態的特徴を表した数値のような変数の組み合わせにおける最適なファジィ推論の組み合わせを自動決定し、予測目標に関する推定と、予測に有効な特徴量（指標）の組み合わせを示すルールの生成を同時に行うことができる。

ＦＮＮの構造は、「入力層」、シグモイド関数に含まれるパラメータＷｃ、Ｗｇを決定する「メンバーシップ関数部分（前件部）」、Ｗｆを決定するとともに入力および出力の関係をルールとして取り出すことが可能な「ファジィルール部分（後件部）」、「出力層」の４層から成り立っている（図１０参照）。ＦＮＮのモデル構造を決定する結合荷重にはＷｃ、Ｗｇ、Ｗｆがある。結合荷重Ｗｃは、メンバーシップ関数に用いられるシグモイド関数の中心位置、Ｗｇは中心位置での傾きを決定する（図１１参照）。モデル内では、入力値がファジィ関数により、人間の感覚的に近い柔軟性を持って表現される（一例として図１０の左下の吹き出しを参照）。結合荷重Ｗｆは各ファジイ領域の推定結果に対する寄与を表しており、Ｗｆよりファジィルールを導くことができる。即ち、モデル内の構造はあとから解読でき、ルールとして書き起こすことができる（一例として図１０中右下の吹き出しを参照）。

ＦＮＮ解析におけるファジィルールの作成には結合荷重のひとつであるＷｆ値が用いられる。Ｗｆ値が正の値で大きいと、そのユニットは「予測に有効である」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効である」と判断される。Ｗｆ値が負の値で小さいと、そのユニットは「予測に有効でない」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効でない」と判断される。

より具体的な例として、ステップＳ２０９での計算モデル構築部４７は、以下の（Ａ）から（Ｈ）の処理により、上記の計算モデルを求める。

（Ａ）計算モデル構築部４７は、複数の指標のうちから１つの指標を選択する。

（Ｂ）計算モデル構築部４７は、（Ａ）で選択された指標を変数とした計算式により、各々の顕微鏡画像のセットでのがん細胞の数（予測値）を求める。

仮に、１つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値（例えばがん細胞の増加数を示す値）、「Ｘ１」は上記の選択された指標の値、「α」はＸ１に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。このとき、計算モデル構築部４７は、αに任意の値を代入するとともに、Ｘ１に各セットにおける値をそれぞれ代入する。これにより、各セットでのがん細胞の計算値（Ｙ）が求められる。

（Ｃ）計算モデル構築部４７は、各々の顕微鏡画像のセットについて、（Ｂ）で求めた計算値Ｙと、実際のがん細胞の数（教師値）との誤差をそれぞれ求める。なお、上記の教師値は、ステップＳ２０１で読み込んだがん細胞の数の情報に基づいて、計算モデル構築部４７が求めるものとする。

そして、計算モデル構築部４７は、各顕微鏡画像のセットでの計算値の誤差がより小さくなるように、教師付き学習により上記の計算式の係数αを修正する。

（Ｄ）計算モデル構築部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）の処理を繰り返し、上記（Ａ）の指標について、計算値の平均誤差が最も小さくなる計算式のモデルを取得する。

（Ｅ）計算モデル構築部４７は、複数の指標の各指標について、上記（Ａ）から（Ｄ）の各処理を繰り返す。そして、計算モデル構築部４７は、各指標における計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなる指標を、評価情報の生成に用いる（評価情報を計算する計算モデルを構築するために用いる）１番目の指標とする。

（Ｆ）計算モデル構築部４７は、上記（Ｅ）で求めた１番目の指標と組み合わせる２番目の指標を求める。このとき、計算モデル構築部４７は、上記の１番目の指標と残りの１２７の指標とを１つずつペアにしてゆく。次に、計算モデル構築部４７は、各々のペアにおいて、計算式でがん細胞の予測誤差を求める。

仮に、２つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１＋βＸ２」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値、「Ｘ１」は１番目の指標の値、「α」はＸ１に対応する係数値、「Ｘ２」は、選択された指標の値、「β」はＸ２に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。そして、計算モデル構築部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）と同様の処理により、計算値の平均誤差が最も小さくなるように、上記の係数α、βの値を求める。

その後、計算モデル構築部４７は、各々のペアで求めた計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなるペアを求める。そして、計算モデル構築部４７は、平均誤差が最も低くなるペアの指標を、評価情報の生成に用いる１番目および２番目の指標とする。

（Ｇ）計算モデル構築部４７は、所定の終了条件を満たした段階で演算処理を終了する。例えば、計算モデル構築部４７は、指標を増やす前後の各計算式による平均誤差を比較する。そして、計算モデル構築部４７は、指標を増やした後の計算式による平均誤差が、指標を増やす前の計算式による平均誤差より高い場合（または両者の差が許容範囲に収まる場合）には、ステップＳ２０９の演算処理を終了する。

（Ｈ）一方、上記（Ｇ）で終了条件を満たさない場合、計算モデル構築部４７は、さらに指標の数を１つ増やして、上記（Ｆ）および（Ｇ）と同様の処理を繰り返す。これにより、上記の計算モデルを求めるときに、ステップワイズな変数選択によって指標の絞り込みが行われることとなる。

このようにして、計算モデル構築部４７は、一例としては、ＦＮＮ解析によって計算モデルを求めるが、この計算モデルを求める場合に、計算モデル構築部４７は、連続性判定部４６による判定結果に基づいて、特徴量の中から計算モデルを構築する特徴量を抽出し、当該抽出した特徴量に基づいて、計算モデルを構築する。

たとえば上述したように、計算モデル構築部４７は、特徴量判定部４５および連続性判定部４６により、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると、連続して判定されていると判定される特徴量に基づいて、計算モデルを構築する。

ここで、連続性判定部４６により、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると、連続して判定されていると判定される特徴量は、偶然に、または、一過的に、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適していると判定された特徴量に対比して、より、安定して、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適している。

そのため、上述したようにして構築された計算モデルは、細胞を評価する場合の安定性が高くなる。すなわち、計算モデルの頑強性（ロバストネス）が向上する。

また、たとえば、計算モデル構築部４７は、上述した（Ａ）から（Ｅ）の処理により、いずれかの指標を評価情報の生成に用いる１番目の指標とする。このとき、計算モデル構築部４７は、連続性判定部４６による判定結果に基づいて、特徴量の中から計算モデルを構築する特徴量を抽出し、当該抽出した特徴量を、この１番目の指標としてもよい。たとえば、計算モデル構築部４７は、図８を用いて説明した「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」という特徴量の８．００日目の値を、１番目の指標として、計算モデルを構築してもよい。次に、計算モデル構築部４７は、図８を用いて説明した「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」という特徴量の４．６７日目の値を、２番目の指標として、計算モデルを構築してもよい。

この場合も、細胞について評価する対象となる特性を評価することが適している指標を用いて順に計算モデルが構築されるため、連続性判定部４６は、細胞を評価する場合の安定性が高い計算モデルを構築することができる。

また、この場合、計算モデル構築部４７による（Ａ）から（Ｅ）の処理時間（処理の負荷やステップ数）に対比して、特徴量判定部４５と連続性判定部４６とによる上述した処理の処理時間が短い場合には、計算モデルを構築する処理時間を短縮することもできる。

なお、ここでは、計算モデル構築部４７が、ＦＮＮ解析によって上記の計算モデルを求める場合について説明したが、計算モデルを求める方法はＦＮＮ解析に限られるものではない。たとえば、計算モデル構築部４７は、上述した複数の特徴量を説明変量として、細胞の特性を評価する任意の形式の多変量解析により計算モデルを構築してもよい。この多変量解析とは、重回帰分析、判別分析、ロジスティック回帰分析、または、主成分分析などであってもよい。この場合、計算モデル構築部４７は、計算モデルを構築する場合に、連続性判定部４６による判定結果に基づいて、特徴量に重み付けをして計算モデルを構築してもよい。

なお、計算モデル構築部４７は、連続性判定部４６による判定結果に基づいて、特徴量の中から計算モデルを構築する特徴量（指標）を抽出し、当該抽出した特徴量に基づいて、計算モデルを構築する場合に、次のようにして特徴量（指標）を抽出してもよい。

たとえば、連続性判定部４６は、細胞について評価する対象となる特性を特徴量により評価することが適していると特徴量判定部４５により判定されている回数、または、当該判定結果が連続している回数を、特徴量毎に算出する。そして、計算モデル構築部４７は、判定されている回数、または、当該判定結果が連続している回数が多い特徴量（または指標）を、優先して選択してもよい。また、計算モデル構築部４７、このような特徴量（または指標）に対して、より、重みを重くするようにしてもよい。

また、たとえば、連続性判定部４６は、細胞について評価する対象となる特性を特徴量により評価することが、より適していると特徴量判定部４５により判定されている特徴量（または指標）を、優先して選択してもよい。また、計算モデル構築部４７、このような特徴量（または指標）に対して、より、重みを重くするようにしてもよい。なお、ここでいう「より適している」とは、たとえば図８においては、「検定値がより小さい値であること」である。

このようにすることにより、計算モデル構築部４７は、特徴量判定部４５による判定結果と連続性判定部４６による判定結果とに基づいて、計算モデルを構築することにより、より安定した計算モデルを構築することができる。

（細胞を価処する場合の処理の例）
次に、図１２の流れ図を用いて、第１の実施形態による細胞評価装置が、評価対象となる細胞に対して評価する場合の処理について説明する。ここでは、評価対象となる複数の顕微鏡画像のデータが、記憶部４３に記憶されているものとして説明する。なお、評価対象の顕微鏡画像は、細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察して取得されたものとする。また、この場合のタイムラプス観察は、図５の例と条件を揃えるために、培養開始から０．３３日目（８時間目）経過後を初回として０．３３日（８時間）おきに１３．６７日目まで行われているものとする。

ステップＳ３０１：ＣＰＵ４２は、評価対象となる複数の顕微鏡画像のデータを、画像入力部５１を介して記憶部４３から読み込む。次に、ＣＰＵ４２の特徴量演算部４４は、読み込んだ評価対象となる複数の顕微鏡画像のデータに対して、図５のステップＳ２０３、ステップＳ２０４、および、ステップＳ２０５の場合と同様に、複数の特徴量を抽出する。

ステップＳ３０２：ＣＰＵ４２の推定部４８は、記憶部４３から計算モデルの情報（図５のステップＳ２１２で記録されたもの）を読み込む。

ステップＳ３０４：ＣＰＵ４２の推定部４８は、ステップＳ３０１で求めた複数の特徴量を、ステップＳ３０２で読み出した計算モデルに代入して演算を行う。そして、ＣＰＵ４２の推定部４８は、上記の演算結果に基づいて、評価対象の顕微鏡画像に対しての評価を示す評価情報を生成する。その後、ＣＰＵ４２の推定部４８は、この評価情報を不図示のモニタ等に表示させる。以上で、図１２の説明を終了する。

このようにして、本実施形態による細胞評価装置は、ＭＳＣ細胞の分化状態を判定するめにアルカリフォスファターゼ染色を行う場合に対比して、細胞の画像のみにより、細胞の分化状態を判定することができる。そのため、本実施形態による細胞評価装置は、比較的簡易な手法で細胞を評価することができる。

また、図１２を用いて説明したように、ＣＰＵ４２の推定部４８は、図５から図１１を用いて説明したような、細胞を評価する場合の安定性が高く、頑強性（ロバストネス）が向上されている計算モデルに基づいて、評価情報を算出する。そのため、本実施形態による細胞評価装置から出力される評価情報は、安定性が高く、頑強性（ロバストネス）が向上されていることになる。たとえば、本実施形態による細胞評価装置は、ＭＳＣ細胞が骨となったか否かを、より安定して評価することができる。

また、本実施形態によれば、制御装置４１は、タイムラプス観察で取得した顕微鏡画像を用いて、特徴量に基づいて細胞を精度よく評価することができる。また、本実施形態の制御装置４１は、ありのままの細胞を評価対象にできるので、例えば医薬品のスクリーニングや再生医療の用途で培養される細胞を評価するときに極めて有用である。

なお、本実施形態では、顕微鏡画像から細胞を評価する例を説明したが、例えば、制御装置４１を、顕微鏡画像からがん細胞の混在率を評価することに用いることや、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の分化誘導の度合いの評価に用いることも可能である。また、本実施形態で求めた評価情報は、評価対象の培養細胞群における分化・脱分化・腫瘍化・活性劣化・細胞のコンタミネーション等の異常検出手段や、評価対象の培養細胞群の品質を工学的に管理するときの手段として用いることができる。

また、本実施形態による細胞評価装置は、画像に基づいて細胞を評価する。そのため、本実施形態による細胞評価装置は、細胞に対して非侵襲に、細胞を評価することができる。よって、細胞を培養しながら、その細胞そのものを撮像した画像に基づいて、細胞を評価することができる。そのため、本実施形態による細胞評価装置は、細胞の培養において、好適である。

＜第２の実施形態＞
次に、図１３を用いて、この発明の第２の実施形態による細胞評価装置を含むインキュベータの構成について説明する。同図において図１の各部に対応する部分には同一の符号を付け、その説明を省略する。なお、ここでは、がん細胞の数（予測値）を求める場合について説明するが、第１の実施形態のように、骨となるか否かについて評価する場合も、同様である。

図１３に示されている第２の実施形態による細胞評価装置を含むインキュベータは、図１に示された第１の実施形態による細胞評価装置を含むインキュベータに対して、更に、度数分布演算部４９を備えている。

この度数分布演算部４９は、特徴量演算部４４により抽出された特徴量について、各々の画像に対応する特徴量の度数分布を、複数の特徴量の種類ごとに生成する。そして、度数分布演算部４９は、特徴量の度数分布を、特徴量として計算モデル構築部４７に出力する。たとえば、度数分布演算部４９は、特徴量の度数分布を、指標として計算モデル構築部４７に出力する。なお、この度数分布演算部４９は、各々の度数分布における度数の区分を、特徴量の種類ごとの標準偏差を用いてそれぞれ正規化してもよい。

そして、計算モデル構築部４７は、第１の実施形態において説明した特徴量演算部４４により求められた特徴量と、度数分布演算部４９により求められた度数分布とを、それぞれ指標として、計算モデルを構築する。すなわち、計算モデル構築部４７は、第１の実施形態において説明した特徴量演算部４４により求められた特徴量という指標と、度数分布演算部４９により求められた度数分布という指標とを、任意に組み合わせて、計算モデルを構築する。

なお、計算モデル構築部４７は、画像間での度数分布の変化に基づいて、計算モデルを構築してもよい。また、計算モデル構築部４７は、画像間での度数分布の差分を用いて、計算モデルを構築してもよい。また、計算モデル構築部４７は、複数の特徴量の種類毎に生成された度数分布の変化の情報に基づいて、計算モデルを構築してもよい。

また、計算モデル構築部４７は、画像の撮影時間および特徴量の種類がそれぞれ異なる複数の度数分布の組み合わせのうちから、計算モデルの構築に用いる度数分布の組み合わせを抽出し、計算モデルを構築してもよい。

次に、図１４を用いて、第２の実施形態による細胞評価装置の動作について説明する。なお、同図において、図５を用いて説明した第１の実施形態による細胞評価装置の動作と同一のステップについては同一のステップ番号を付し、その説明を省略し、相違点のみについて説明する。

この図１４に示されている第２の実施形態による細胞評価装置の動作は、図５に示されている第１の実施形態による細胞評価装置の動作に対比して、ステップＳ２０６とＳ２０９との間に、ステップＳ２０７とＳ２０８とが更に追加されている。

ここでは、培養容器１９のタイムラプス観察は、培養開始から８時間経過後を初回として、８時間おきに７２時間目まで行われている場合について説明する。そのため、細胞評価装置は、培養容器１９および観察ポイントが共通するサンプルの顕微鏡画像について、９枚分（８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，３２ｈ，４０ｈ，４８ｈ，５６ｈ，６４ｈ，７２ｈ）を１セットとして取得することになる。なお、ここでは、複数の培養容器１９がそれぞれタイムラプス観察されており、上記のサンプルの顕微鏡画像が複数セット分、記憶部４３に予め記憶されているものとして説明する。

この図１４の場合、ステップＳ２０６において、ＣＰＵ４２は、全ての顕微鏡画像が処理済み（全てのサンプルの顕微鏡画像で各細胞の特徴量が取得済みの状態）であるか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ４２はステップＳ２０７に処理を移行させる。一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２はステップＳ２０２に戻って、未処理の他の顕微鏡画像を処理対象として上記動作を繰り返す。

ステップＳ２０７：度数分布演算部４９は、各々の顕微鏡画像について特徴量の種類ごとにそれぞれ特徴量の度数分布を求める。したがって、ステップＳ２０７での度数分布演算部４９は、１回の観察で取得される顕微鏡画像に対して１６種類の特徴量の度数分布を求めることとなる。

ステップＳ２０８：計算モデル構築部４７は、特徴量の種類ごとにそれぞれ上記の度数分布の経時的変化を求める。

ステップＳ２０８での計算モデル構築部４７は、１セット分の顕微鏡画像から取得した度数分布（９×１６）のうち、特徴量の種類が同じで撮影時間の異なる２つの度数分布を組み合わせる。一例として、計算モデル構築部４７は、特徴量の種類が同じで撮影時間の異なる９つの度数分布について、８時間目および１６時間目の度数分布と、８時間目および２４時間目の度数分布と、８時間目および３２時間目の度数分布と、８時間目および４０時間目の度数分布と、８時間目および４８時間目の度数分布と、８時間目および５６時間目の度数分布と、８時間目および６４時間目の度数分布と、８時間目および７２時間目の度数分布とをそれぞれ組み合わせる。つまり、１セット分における１種類の特徴量に注目したとき、その特徴量の度数分布につき、計８通りの組み合わせが発生する。

そして、計算モデル構築部４７は、上記８通りの組み合わせについて、以下の式（４）により度数分布の変化量（画像間での度数分布の差分の絶対値を積分したもの）をそれぞれ求める。

但し、式（４）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は初期状態の度数分布（８時間目）における１区間分の度数（細胞数）を示す。また、「Ｓａｍｐｌｅ」は、比較対象の度数分布における１区間分の度数を示す。また、「ｉ」は、度数分布の区間を示す変数である。

計算モデル構築部４７は、特徴量の種類ごとに上記演算を行うことで、すべての特徴量についてそれぞれ８通りの度数分布の変化量を取得できる。すなわち、１セット分の顕微鏡画像について、１６種類×８通りで１２８の度数分布の組み合わせをとることができる。ここでは、上記の度数分布の組み合わせの１つを単に「指標」と表記する。なお、ステップＳ２０８での計算モデル構築部４７は、複数の顕微鏡画像のセットにおいて、各指標に対応する１２８の度数分布の変化量をそれぞれ求めることはいうまでもない。

ステップＳ２１１：計算モデル構築部４７は、１２８の指標のうちから、細胞の培養状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、後述するファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、計算モデル構築部４７は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像からがん細胞の数を導出する計算モデルを求める。

＜ステップＳ２０７の一例＞
次に、ステップＳ２０７の一例について詳細に説明する。
ステップＳ２０７において、度数分布演算部４９は、上述したように、各々の顕微鏡画像について特徴量の種類ごとにそれぞれ特徴量の度数分布を求める。したがって、ステップＳ２０７での度数分布演算部４９は、１回の観察で取得される顕微鏡画像に対して１６種類の特徴量の度数分布を求めることとなる。

ここで、度数分布演算部４９は、各々の度数分布において、特徴量の各区分に対応する細胞の数を頻度（％）として求めるものとする。また、ステップＳ２０７での度数分布演算部４９は、上記の度数分布における度数の区分を、特徴量の種類ごとの標準偏差を用いて正規化する。

ここでは一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布での区分を決定する場合を説明する。

まず、度数分布演算部４９は、各々の顕微鏡画像から求めた全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差を算出する。次に、度数分布演算部４９は、上記の標準偏差の値をＦｉｓｈｅｒの式に代入して、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布における度数の区分の基準値を求める。このとき、度数分布演算部４９は、全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差（Ｓ）を４で除するとともに、小数点以下３桁目を四捨五入して上記の基準値とする。なお、本実施形態での度数分布演算部４９は、度数分布をヒストグラムとして図示する場合、２０級数分の区間をモニタ等に描画させるものとする。

一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の標準偏差Ｓが２５９のとき、２５９／４＝６４．７５０から「６４．７５」が上記の基準値となる。そして、注目する画像の「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を求めるとき、度数分布演算部４９は、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値に応じて０値から６４．７５刻みで設定された各クラスに細胞を分類し、各クラスでの細胞の個数をカウントすればよい。

このように、度数分布演算部４９が、特徴量の種類毎に標準偏差で度数分布の区分を正規化するため、異なる特徴量の間でも度数分布の傾向を大局的に近似させることができる。よって、本実施形態では、異なる特徴量間で細胞の培養状態と度数分布の変化との相関を求めることが比較的容易となる。

ここで、図１５（ａ）は、がん細胞の初期混在率が０％のときの「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図１５（ｂ）は、がん細胞の初期混在率が６．７％のときの「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図１５（ｃ）は、がん細胞の初期混在率が２５％のときの「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。

また、図１５（ｄ）は、がん細胞の初期の混在率が０％のときの「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。ただし、この図では理解しやすさのため、ヒストグラムをＦｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ＝323までで省略してある。図１５（ｅ）は、がん細胞の初期の混在率が６．７％のときの「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図１５（ｆ）は、がん細胞の初期の混在率が２５％のときの「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。

ここで、本実施形態において度数分布の経時的変化に注目する理由を説明する。図１６は、正常な細胞群（がん細胞の初期混在率０％）をインキュベータ１１で培養してタイムラプス観察したときの顕微鏡画像をそれぞれ示す。なお、図１６の各顕微鏡画像から求めた「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を示すヒストグラムは、図１５（ａ）で示している。

この場合、図１６の各画像では時間の経過に伴って細胞の数は増加するものの、図１５（ａ）に示す「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」のヒストグラムでは、各画像に対応する度数分布はいずれもほぼ同じ形状を保っている。

一方、図１７は、正常な細胞群に予めがん細胞を２５％混在させたものをインキュベータ１１で培養してタイムラプス観察したときの顕微鏡画像をそれぞれ示す。なお、図１７の各顕微鏡画像から求めた「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を示すヒストグラムは、図１５（ｃ）で示している。

この場合、図１７の各画像では時間の経過に伴って、正常細胞と形状の異なるがん細胞（丸みを帯びた細胞）の比率が増加する。これにより、図１５（ｃ）に示す「ＳｈａｐｅＦａｃｔｏｒ」のヒストグラムでは、時間の経過に応じて各画像に対応する度数分布の形状に大きな変化が現れる。よって、度数分布の経時的変化が、がん細胞の混在と強い相関を有することが分かる。本発明者らは、上記知見に基づいて、度数分布の経時的変化の情報から培養細胞の状態を評価するものである。

＜ステップＳ２１１の一例＞
ここで、第２の実施形態におけるステップＳ２１１で実行される処理の一例について説明する。この場合、ステップＳ２０９での計算モデル構築部４７は、以下の（Ａ）から（Ｈ）の処理により、上記の計算モデルを求める。ここでは、指標として、上述した度数分布の経時的変化の情報を用いた場合について説明する。すなわち、１２８の指標を用いる場合について説明する。

（Ａ）計算モデル構築部４７は、１２８の指標のうちから１つの指標を選択する。

（Ｂ）計算モデル構築部４７は、（Ａ）で選択された指標による度数分布の変化量を変数とした計算式により、各々の顕微鏡画像のセットでのがん細胞の数（予測値）を求める。

仮に、１つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値（例えばがん細胞の増加数を示す値）、「Ｘ１」は上記の選択された指標に対応する度数分布の変化量（ステップＳ２０８で求めたもの）、「α」はＸ１に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。このとき、計算モデル構築部４７は、αに任意の値を代入するとともに、Ｘ１に各セットにおける度数分布の変化量をそれぞれ代入する。これにより、各セットでのがん細胞の計算値（Ｙ）が求められる。

（Ｃ）計算モデル構築部４７は、各々の顕微鏡画像のセットについて、（Ｂ）で求めた計算値Ｙと、実際のがん細胞の数（教師値）との誤差をそれぞれ求める。なお、上記の教師値は、ステップＳ２０１で読み込んだがん細胞の数の情報に基づいて、計算モデル構築部４７が求めるものとする。

そして、計算モデル構築部４７は、各顕微鏡画像のセットでの計算値の誤差がより小さくなるように、教師付き学習により上記の計算式の係数αを修正する。

（Ｄ）計算モデル構築部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）の処理を繰り返し、上記（Ａ）の指標について、計算値の平均誤差が最も小さくなる計算式のモデルを取得する。

（Ｅ）計算モデル構築部４７は、１２８の各指標について、上記（Ａ）から（Ｄ）の各処理を繰り返す。そして、計算モデル構築部４７は、１２８の各指標における計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなる指標を、評価情報の生成に用いる１番目の指標とする。

（Ｆ）計算モデル構築部４７は、上記（Ｅ）で求めた１番目の指標と組み合わせる２番目の指標を求める。このとき、計算モデル構築部４７は、上記の１番目の指標と残りの１２７の指標とを１つずつペアにしてゆく。次に、計算モデル構築部４７は、各々のペアにおいて、計算式でがん細胞の予測誤差を求める。

仮に、２つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１＋βＸ２」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値、「Ｘ１」は１番目の指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、「Ｘ２」は、選択された指標に対応する度数分布の変化量、「β」はＸ２に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。そして、計算モデル構築部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）と同様の処理により、計算値の平均誤差が最も小さくなるように、上記の係数α、βの値を求める。

その後、計算モデル構築部４７は、各々のペアで求めた計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなるペアを求める。そして、計算モデル構築部４７は、平均誤差が最も低くなるペアの指標を、評価情報の生成に用いる１番目および２番目の指標とする。

（Ｇ）計算モデル構築部４７は、所定の終了条件を満たした段階で演算処理を終了する。例えば、計算モデル構築部４７は、指標を増やす前後の各計算式による平均誤差を比較する。そして、計算モデル構築部４７は、指標を増やした後の計算式による平均誤差が、指標を増やす前の計算式による平均誤差より高い場合（または両者の差が許容範囲に収まる場合）には、ステップＳ２０９の演算処理を終了する。

（Ｈ）一方、上記（Ｇ）で終了条件を満たさない場合、計算モデル構築部４７は、さらに指標の数を１つ増やして、上記（Ｆ）および（Ｇ）と同様の処理を繰り返す。これにより、上記の計算モデルを求めるときに、ステップワイズな変数選択によって指標の絞り込みが行われることとなる。

これにより、第１の実施形態の場合と同様に、指標に対応する度数分布の変化量を用いて、第２の実施形態でも計算モデルを構築することができる。なお、第２の実施形態のいては、指標に対応する度数分布の変化量を用いて計算モデルが構築されている。そのため、第２の実施形態による計算モデルは、第１の実施形態による計算モデルに対比して、より精度を高くすることができる。

このようにして、第２の実施形態により、上記の計算モデルの指標として、『「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｌｅｎｇｔｈ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』との３つを用いた場合、がん細胞の予測精度が９３．２％となる計算モデルを得ることができた。

また、上記の計算モデルの指標として、『「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、５６時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、６４時間目の度数分布の組み合わせ』との６つを用いた場合、がん細胞の予測精度が９５．５％となる計算モデルを得ることができた。

なお、上記に説明した図１４のステップＳ２０７の処理においては、度数分布演算部４９は、８時間目を基準として、１種類の特徴値に対して８通りの指標を求め、１６種類の特徴値に対して合計１２８（１６種類×８通り）の指標を求めた。しかし、指標としてはこれに限られるものではなく、評価情報生成部４６は、８時間目、１６時間目、２４時間目、３２時間目、４０時間目、４８時間目、５６時間目、６４時間目、および、７２時間目の各々を基準として、１種類の特徴値に対して３６（＝９×８÷２）通りの指標をそれぞれ求め、１６種類の特徴値に対して合計５７６（１６種類×３６通り）の指標を求めてもよい。
このような基準となる時刻が異なる指標を用いることにより、計算モデル構築部４７は、より予測精度が高い計算モデルを構築することができる。

なお、指標としては、第２の実施形態において説明した度数分布の経時的変化の情報と、第１の実施形態において説明した各時刻ごとの特徴量の値とを、任意に組み合わせてもよい。これにより、計算モデル構築部４７は、より予測精度が高い計算モデルを構築することができる。

次に、図１８の流れ図を用いて、第２の実施形態による細胞評価装置が、評価対象となる細胞に対して評価する場合の処理について説明する。ここでは、図１２を用いて説明した第１の実施形態による細胞評価装置が、評価対象となる細胞に対して評価する場合の処理との相違点のみについて説明する。

この図１８の流れ図においては、図１２の流れ図に対して、ステップＳ３０２とステップＳ３０４との間に、ステップＳ３０３が追加されている。このステップＳ３０３において、計算モデル構築部４７は、特徴量の種類ごとにそれぞれ上記の度数分布の経時的変化を求める。これは、上記に図１４のステップＳ２０８において説明した処理と同様の処理である。ただし、ステップＳ３０３とステップＳ２０８とでは、対象とする画像が異なる。

その後、図１８のステップＳ３０４において、ＣＰＵ４２の推定部４８は、ステップＳ３０１で求めた複数の特徴量と、ステップＳ３０３で求めた度数分布の経時的変化とを、ステップＳ３０２で読み出した計算モデルに代入して演算を行う。これにより、第２の実施形態によるＣＰＵ４２の推定部４８は、複数の特徴量と、度数分布の経時的変化とを指標として、細胞を評価することができる。

なお、図１３の説明においては、度数分布演算部４９は、ＣＰＵ４２に備えられているものとして説明した。しかし、この度数分布演算部４９は、特徴量演算部４４に備えられていてもよい。また、度数分布演算部４９と特徴量演算部４４とは、一体として構成されていてもよい。また、この度数分布演算部４９は、推定部４８に、備えられていてもよい。

＜実施例＞
以下、上記に説明した第１または第２の実施形態の１実施例として、筋芽細胞の分化予測の例を説明する。この筋芽細胞の分化予測は、例えば、心臓病治療の一つとして行われる筋芽細胞シート移植での品質管理や、筋組織の再生治療での品質管理などで応用が期待されている。

筋芽細胞の培養時に血清濃度の低下により培地の成分を変化させると、筋芽細胞から筋管細胞への分化が起こり、筋肉組織を作ることができる。図１９（ａ）は筋芽細胞の培養状態の一例を示し、図１９（ｂ）は筋芽細胞を分化させた状態の例を示している。

また、図２０、図２１は、筋芽細胞の培養時における「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図２０は、筋芽細胞に分化が認められた場合（血清４％）における０時間目および１１２時間目の「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布をそれぞれ示している。図２１は、筋芽細胞に分化が認められない場合（高血清状態）における０時間目および１１２時間目の「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布をそれぞれ示している。なお、図２０、図２１では、０時間目の度数分布をそれぞれ破線で示し、１１２時間目の度数分布をそれぞれ実線で示す。

図２０の２つのヒストグラムを比較すると、両者の形状は大きな変化を示す。一方、図２１の２つのヒストグラムを比較すると、両者の形状にはさほど大きな変化はみられない。そのため、筋芽細胞の分化度（分化する筋芽細胞の混在率）の変化に応じて、ヒストグラムにも変化が生じることが分かる。

ここで、実施例では、第１または第２の実施形態のインキュベータによって、筋芽細胞の７２個のサンプルについてそれぞれ８時間間隔で５日目までタイムラプス観察を行った。そして、制御装置（細胞評価装置）は、以下の２段階の処理によって筋芽細胞の分化予測を行った。

第１段階では、上記の計算モデルの生成処理に準拠して、筋芽細胞の分化の有無を二者択一的に判別する２群判別モデルを制御装置に生成させた。具体的には、制御装置は、観察開始後８時間目から３２時間目までの顕微鏡画像から得られる全指標のうちから指標を選択し、筋芽細胞の分化度を求める第１判定モデルと、第１判定モデルで求めた分化度から閾値で分化の有無を判別する第２判定モデルとを構築した。そして、制御装置は、上記の第１判定モデルおよび第２判定モデルによる判別分析で、７２個のサンプルをそれぞれ分化の有無に応じて２つのグループに分別した。その結果、制御装置は、７２個のサンプルで分化の有無をいずれも正しく判別できた。

第２段階では、上記の計算モデルの生成処理に準拠して、筋芽細胞の５日目（１２０時間目）の分化度を予測する予測モデルを制御装置に生成させた。実施例では、７２個のサンプルのうち、第１段階の処理で「分化する」と判別された４２個のサンプルのみを用いて、制御装置により２種類の予測モデル（第１の予測モデル、第２の予測モデル）を構築した。

第１の予測モデルは、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、４８時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、３２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｌｅｎｇｔｈ」の８時間目、１０４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の８時間目、９６時間目の度数分布の組み合わせ』との５つの指標を用いた予測モデルである。

図２２は、実施例における第１の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフである。図２２の縦軸は、第１の予測モデルが予測した５日目のサンプルの分化度を示している。図２２の横軸は、５日目の時点でサンプルの分化度を熟練者が評価した値（見かけの分化度）を示している。そして、図２２では、１つのサンプル毎に１つの点がグラフ上にプロットされる。なお、図２２において、グラフの右上から左下に延びる直線の近くに点がプロットされるほど、予測の精度が高いこととなる。この第１の予測モデルでは、分化の予測精度（正答率）が９０．５％（誤差±５％）となった。

また、第２の予測モデルは、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、４８時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、３２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（細胞配向性）」の８時間目、１６時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（細胞の向きのバラツキ度）」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』との５つの指標を用いた予測モデルである。

なお、上記の「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」は、各細胞の長軸と画像の水平方向（Ｘ軸）とがなす角度を示す特徴量である。この「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」の値が同じであれば、細胞は同じ方向に配向していることとなる。また、上記の「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」は、フィルタリングにより画像内の細胞をデフォルメした状態で各細胞の角度を数値化し、そのバラツキを算出した特徴量である。この「ＭｏｄｉｆｉｅｄＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」の値は、細胞の角度が多様であるほど大きな値を示す特性をもつ。

図２３は、実施例における第２の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフである。この図２３の見方については、図２２と同様であるので重複説明は省略する。この第２の予測モデルでは、２日目（４８時間目）までの観察結果に基づいて分化の予測を行い、その予測精度が８５．７％（誤差±５％）となった。したがって、本実施例での第２の予測モデルによれば、通常では非常に困難な筋細胞の分化予測を、２日目までの観察結果によって高い精度で定量予測できた。

図２４は、本実施形態の細胞評価装置を用いた細胞の培養方法を説明するためのフローチャートである。本フローチャートでは、増殖させたい所望の細胞が培養されている培養容器１９が、インキュベータ１１のストッカー２１が有する複数の棚のうちのいずれかに、収納されているものとして説明する。

まず、ステップＳ１２０１において、ＣＰＵ４２は、予め決められた培養条件（例えば所定の温度、湿度等）で細胞を培養するよう温度調整装置１５ａと湿度調整装置１５ｂとを制御する。所定期間経過後、ステップＳ１２０２において、ＣＰＵ４２は、記憶部４３から読み出した本発明の実施形態の細胞評価プログラムを実行し、細胞を評価する。ここで、ＣＰＵ４２は、細胞における特性を評価してもよい。

次に、ステップＳ１２０３において、ＣＰＵ４２は、細胞の評価結果に基づき、培養を中止するか、培養条件を変更するか、または現在の培養条件で培養を続行するか判定する。

次に、ステップＳ１２０４において、ＣＰＵ４２が培養を中止すると判定した場合（ステップＳ１２０４ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２は培養の中止を示す情報を不図示のモニタ等に表示させ、処理を終了する。
一方、ＣＰＵ４２は培養を中止すると判定しなかった場合（ステップＳ１２０４ ＮＯ）、ＣＰＵ４２はステップＳ１２０５の処理に進む。

次に、ステップＳ１２０５において、ＣＰＵ４２が培養条件を変更すると判定した場合（ステップＳ１２０５ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２は、細胞の状態の評価結果と関係付けられた培養条件（例えば所定の温度、湿度等）に変更するよう温度調整装置１５ａと湿度調整装置１５ｂとを制御する（ステップＳ１２０６）。その後、ＣＰＵ４２は、ステップＳ１２０２に処理を戻す。
一方、ＣＰＵ４２が現在の培養条件で培養を続行すると判定した場合（ステップＳ１２０５ ＮＯ）、ＣＰＵ４２はステップＳ１２０７に処理を進める。

次に、ステップＳ１２０７において、ＣＰＵ４２は、予め決められた時間の経過毎に、撮像装置３４により撮像された画像から、細胞が撮像されている画像の領域を細胞ごとに抽出し、この抽出した細胞が撮像されている画像の領域の数すなわち細胞数を計数する。

次に、ステップＳ１２０８において、計数された細胞数が所定の細胞数に到達していない場合（ステップＳ１２０８ ＮＯ）、計数された細胞数に応じた時間が経過した後、ＣＰＵ４２はステップＳ１２０２に処理を戻す。
一方、計数された細胞数が所定の細胞数に到達した場合（ステップＳ１２０８ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２はその細胞の培養が完了した旨を示す情報を、不図示のモニタ等に表示させる。以上で、本フローチャートは、終了する。

以上により、本発明の細胞の培養方法を用いれば、細胞の評価に基づいて動的に培養条件を変更することができるので、所望の細胞を容易に増殖させることができる。

なお、図２４の処理において、ＣＰＵ４２は、判定した結果を表示部などに表示してもよい。そして、ユーザは、この表示部に表示された結果に応じて、培養条件などを変更する情報を、入力部を介してＣＰＵ４２に入力する。このようにして、ＣＰＵ４２は、ユーザにより入力された情報に基づいて、培養条件などを変更してもよい。

＜実施形態の補足事項＞
（１）上記の第１または第２の実施形態では、インキュベータ１１の制御装置４１に細胞評価装置を組み込んだ例を説明したが、本発明の細胞評価装置は、インキュベータ１１から顕微鏡画像を取得して解析を行う外部の独立したコンピュータで構成されていてもよい（この場合の図示は省略する）。

（２）上記の第１または第２の実施形態では、評価情報の計算モデルとその指標を制御装置４１がＦＮＮによって求める例を説明した。しかし、本発明の細胞評価装置は、例えば、重回帰分析などの他の多変量解析によって、評価情報の計算モデルとその指標を求めるものでもよい。

さらに、本発明の細胞評価装置は、複数の計算モデルを組み合わせて、これらの計算モデルによる演算結果の多数決（あるいは重み付け平均）によって、最終的な評価情報を生成するようにしてもよい。この場合には、例えば、混在率の低いデータではＭＲＡが強く、混在率の高いデータにはＦＮＮが強いというように、一方の計算モデルでは精度の低い状況を他のモデルによってカバーすることができ、評価情報の精度をより高めることができる。

（３）また、細胞評価装置は、評価情報の計算モデルを求めるときに、最初に複数の指標を組み合わせでの計算結果を演算し、変数増減法により指標を増減させるようにしてもよい。また、データの精度が高ければ指標を全て用いても良い。

（４）上記の第１または第２の実施形態では、２つの度数分布の差分の絶対値和を用いて、度数分布の変化量を求める例を説明したが、２つの度数分布の差分の二乗和から度数分布の変化量を求めてもよい。また、上記の第１または第２の実施形態で示した計算式はあくまで一例に過ぎず、例えば２次以上のｎ次方程式などであってもよい。

（５）上記の実施形態や実施例に示した特徴量はあくまで一例にすぎず、評価対象の細胞の種類などに応じて他の特徴量のパラメータを採用することも勿論可能である。

なお、図１または図１３における制御装置４１が備える各構成は専用のハードウェアにより実現されるものであってもよく、また、メモリおよびマイクロプロセッサにより実現させるものであってもよい。
なお、この図１または図１３の制御装置４１が備える各構成は専用のハードウェアにより実現されるものであってもよく、また、この制御装置４１が備える各構成はメモリおよびＣＰＵ（中央演算装置）により構成され、制御装置４１が備える各構成の機能を実現するためのプログラムをメモリにロードして実行することによりその機能を実現させるものであってもよい。

また、図１または図１３における制御装置４１が備える各構成の機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより制御装置４１が備える各構成による処理を行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。

また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであっても良い。

以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図するものである。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。

１１…インキュベータ、１５…恒温室、１９…培養容器、２２…観察ユニット、３４…撮像装置、４１…制御装置、４２…ＣＰＵ、４３…記憶部、４４…特徴量演算部、４５…特徴量判定部、４６…連続性判定部、４８…推定部、４９…度数分布演算部、５０…画像読込部、５１…画像入力部

Claims (9)

1. 培養容器内で培養される複数の細胞が時系列に撮像されている複数の画像を読み込む画像読込部と、
   前記画像に含まれる各々の前記細胞について、前記細胞の異なる複数の形態的な特徴を示す複数の異なる特徴量を前記画像からそれぞれ求める特徴量演算部と、
   前記複数の画像に対応する前記特徴量のそれぞれについて、前記細胞の特性を前記特徴量により評価することが適しているか否かを判定する特徴量判定部と、
   前記特徴量に対しての前記特徴量判定部による判定結果が、前記時系列において連続しているか否かを、前記特徴量のそれぞれについて判定する連続性判定部と、
   前記連続性判定部による判定結果に基づいて、前記特徴量演算部により求められた特徴量の中から前記細胞における前記特性を評価するための計算モデルを構築する特徴量を抽出し、当該抽出した特徴量に基づいて、前記計算モデルを構築する計算モデル構築部と、
   を備えていることを特徴とする細胞評価装置。
2. 前記計算モデル構築部は、
   前記計算モデルを構築する場合に、前記連続性判定部による判定結果に基づいて、前記特徴量の中から前記計算モデルを構築する特徴量を抽出し、当該抽出した特徴量に基づいて、前記計算モデルを構築する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞評価装置。
3. 前記計算モデル構築部は、
   前記計算モデルを構築する場合に、前記連続性判定部による判定結果に基づいて、前記特徴量に重み付けをして前記計算モデルを構築する、
   ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞評価装置。
4. 前記特徴量演算部は、前記特徴量として、各々の前記画像に対応する前記特徴量の度数分布を出力する度数分布演算部を有し、
   前記計算モデル構築部は、
   前記特徴量として、前記度数分布演算部により求められた度数分布とを組み合わせて、前記計算モデルを構築する
   ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞評価装置。
5. 評価対象となる細胞の画像であって、前記培養容器内で培養される複数の細胞が時系列に撮像されている画像が入力される画像入力部と、
   前記画像入力部に入力された画像を、前記計算モデル構築部により構築された前記計算モデルに入力して、前記評価対象となる細胞に対しての前記特性を推測する推定部と、
   を備えていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞評価装置。
6. 細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞評価装置と、
   を備えることを特徴とするインキュベータ。
7. コンピュータを、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞評価装置として機能させることを特徴とするプログラム。
8. 請求項５に記載の細胞評価装置により推測された特性に基づき、前記培養容器内で培養されている細胞の培養条件を変更することを特徴とする細胞の培養方法。
9. スクリーニングまたは再生医療に使用される請求項１に記載の細胞評価装置。