JP6071007B2 - 観察画像撮影評価装置および方法並びにプログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞を撮影して観察画像を取得し、その観察画像を評価する観察画像撮影評価装置および方法並びにプログラムに関するものである。

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。

幹細胞は、細胞培養装置内に設定された培養容器内の足場材（培養床）に播種され、足場材上において培地（培養液）を養分として増殖し、増殖した幹細胞同士が密集結合を繰り返しながら幹細胞コロニーとして成長する。

この幹細胞の成長過程においては、一旦ある組織に分化を開始した幹細胞は、途中で別の組織に変化・成長させることができないので、未分化状態を保持させたまま十分な数まで幹細胞を増殖させ、その後の過程で目的の組織の細胞に分化させることは、生産性の観点で重要である。

また、幹細胞コロニーの未分化性の高い領域のみを切り出して別の培養容器に移植し、継代を行うことがあるが、この継代の際には、未分化の幹細胞のみを抽出する必要がある。すなわち、幹細胞の培養に際しては、幹細胞の分化・未分化を適切に判定する必要がある。

そこで、たとえば特許文献１および特許文献２では、幹細胞を経時的に撮像し、その観察画像の経時的な変化を捉えることで未分化・分化の判定を行うことが提案されている。

また、特許文献３では、幹細胞の数や核小体の数など数十種の特徴量を用いて幹細胞の未分化・分化の判定を行うことが提案されている。

また、上述したような幹細胞の未分化・分化の評価に限らず、たとえば幹細胞を心筋や皮膚などの目的の組織に分化誘導した後の細胞や、がん細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の培養状態を評価する方法も提案されている。

特開２０１２−９５６２７号公報 特開２０１１−２２９４１０号公報 特許第４８５２８９０号公報

しかしながら、特許文献１から特許文献３に記載のように幹細胞の未分化・分化の判定を行う際、幹細胞は、播種開始からその成長にともなって幹細胞の分布状態や幹細胞コロニーの形状などが変化するため、同一の撮影方法によって観察画像を撮影したのでは、幹細胞の未分化・分化を判定する際に用いる特徴量を適切に取得することができない場合がある。

具体的には、たとえば、幹細胞の培養条件によっては、幹細胞コロニーが成熟した際、幹細胞コロニーが３次元方向に積層化する場合がある。このように積層化した場合において、位相差顕微鏡によって観察画像を撮影すると、積層化された幹細胞からの回折光成分と屈折光成分との重ね合せを生じ、１つの幹細胞からの回折光を分離できず、かつ像全体の光強度が増してしまうため、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞のミクロな特徴を計測できなくなる。

本発明は、上記の問題に鑑み、細胞が成熟し、上述したような積層化が生じた場合においても、細胞を適切に評価することができる観察画像を撮影する観察画像撮影評価装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。

本発明の観察画像撮影評価装置は、細胞を撮影して観察画像を取得する撮影部と、観察画像を評価する細胞評価部と、細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部とを備え、撮影部が、成熟度に関連する情報に基づいて、観察画像の撮影方法を変更するものであることを特徴とする。

また、本発明の観察画像撮影評価装置においては、撮影部を、細胞への照明方法を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、位相差顕微鏡による撮影と微分干渉顕微鏡による撮影とを変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、光学系の撮像条件を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、光学系の光学倍率を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、光学系の露光光量を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、照明光の波長を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、撮像素子の撮像条件を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するとできる。

また、撮影部を、撮像素子の露光時間を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、撮像素子の解像度を変更することによって観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、撮影部を、細胞の培養条件に基づいて、観察画像の撮影方法を変更するものとできる。

また、細胞評価部を、観察画像の撮影方法の変更に応じて、観察画像の評価方法を変更するものとできる。

本発明の観察画像撮影評価方法は、細胞を撮影して観察画像を取得し、その観察画像を評価する際、細胞の成熟度に関連する情報を取得し、その取得した成熟度に関連する情報に基づいて、観察画像の撮影方法を変更することを特徴とする。

本発明の観察画像撮影評価プログラムは、コンピュータを、細胞を撮影して観察画像を取得する撮影部を制御する制御部と、観察画像を評価する細胞評価部と、細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部として機能させる観察画像撮影評価プログラムであって、制御部が、成熟度に関連する情報に基づいて、撮影部における観察画像の撮影方法を変更するものであることを特徴とする。

本発明の観察画像撮影評価装置および方法並びにプログラムによれば、細胞を撮影して観察画像を取得し、その観察画像を評価する際、細胞の成熟度に関連する情報を取得し、その成熟度に関連する情報に基づいて、観察画像の撮影方法を変更するようにしたので、細胞が成熟して積層化が生じた場合においても、位相差顕微鏡による撮影から厚み方向の計測能が高い微分干渉顕微鏡による撮影へ撮影方法を変更するようにすれば、厚みや外形特徴量を効率よく撮影することができ、細胞の未分化・分化などの状態を適切に評価することができる。

本発明の観察画像撮影評価装置の一実施形態を用いた細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 幹細胞の成熟度および培養条件に応じた未分化・分化の評価方法の一例を示す表 幹細胞の成熟度および培養条件に応じた未分化・分化の評価方法の一例を示す表 幹細胞の成熟度および培養条件に応じた未分化・分化の評価方法の一例を示す表 播種初期の幹細胞の観察画像の一例を示す図 播種後から数日経過した段階の幹細胞の観察画像の一例を示す図 播種後、１週間経過した段階の幹細胞の観察画像の一例を示す図 播種後、１週間経過した段階の幹細胞の観察画像の一例を示す図 幹細胞コロニーが平面方向に延びて成長した場合の観察画像の一例を示す図 図１に示す細胞培養観察システムの作用を説明するためのフローチャート 観察領域の一例を示す図 幹細胞の成熟度に応じた撮影方法の一例を示す表 幹細胞コロニーが積層化した状態を示す図 図１３の観察画像の撮影対象である幹細胞コロニーを露光時間を短くして撮影した観察画像を示す図 相対的に短い波長の照明光によって撮影した位相差像を示す図 相対的に長い波長の照明光によって撮影した位相差像を示す図

以下、本発明の観察画像撮影評価装置および方法並びにプログラムの一実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。本発明は、細胞の観察画像の撮影方法に特徴を有するものであるが、まず、本発明の観察画像撮影評価装置の一実施形態を備えた細胞培養観察システムの全体構成について説明する。図１は、細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図である。

細胞培養観察システムは、図１に示すように、細胞培養装置１と、撮影装置２と、観察画像評価装置３と、ディスプレイ４と、入力装置５とを備えている。なお、本実施形態においては、撮影装置２が撮影部に相当し、撮影装置２と、観察画像評価装置３における細胞評価部３１および成熟度情報取得部３３とから観察画像撮影評価装置が構成されている。

幹細胞培養装置１は、細胞の培養を行うための装置である。培養対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋、肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。細胞培養装置１内には、培養対象の幹細胞を培地に播種した培養容器が複数収容されている。そして、細胞培養装置１は、ステージ１０と搬送部１１と制御部１２とを備えている。

ステージ１０は、撮影装置２による撮影対象の培養容器が設置されるものである。また、搬送部１１は、細胞培養装置１内の所定位置に収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養容器を選択し、その選択した培養容器をステージ１０まで搬送するものでる。また、制御部１２は、細胞培養装置１全体を制御するものであり、上述したステージ１０や搬送部１１の動作以外に、細胞培養装置１内の温度、湿度およびＣＯ_２濃度などの環境条件を制御するものである。なお、温度、湿度およびＣＯ_２濃度を調整するための構成については、公知な構成を用いることができる。

撮影装置２は、ステージ１０に設置された培養容器内における細胞を含む観察領域の観察画像を撮影するものである。撮影装置２は、観察画像を結像して取得するための光学系２０と、光学系２０を制御する制御部２２とを備えている。

光学系２０は、位相差顕微鏡と微分干渉顕微鏡とを備えたものである。そして、培養容器内における幹細胞の培養の成熟度に応じて、位相差顕微鏡による観察画像の撮影と微分顕干渉微鏡による観察画像の撮影とが切り替えられる。なお、これらの顕微鏡による撮影の切り替えについては、後で詳述する。

これらの顕微鏡は、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）センサやＣＣＤ（charge-coupled device）センサなどの撮像素子２１を備えており、この撮像素子２１から細胞を撮像した観察画像が出力される。

制御部２２は、撮影装置２全体を制御するものであるが、特に、本実施形態においては、制御部２２は、上述した位相差顕微鏡による観察画像の撮影と微分干渉顕微鏡による観察画像の撮影との切り替え、光学系２０の光学倍率、撮像素子２１の露光時間や解像度、光学系２０に設けられた照明光源の露光光量や照明光の波長の切り替えなどを制御するものである。そして、制御部２２は、観察画像評価装置３における制御部３５から出力された制御信号に基づいて、細胞の成熟度に応じて撮影方法を変更するものであるが、その詳細は後で述べる。なお、位相差顕微鏡による観察画像の撮影と微分顕干渉微鏡による観察画像の撮影との切り替えについては、たとえば、培養容器の設置位置を位相差顕微鏡の撮影位置と微分干渉顕微鏡の撮影位置とに切り替えるようにすればよい。

観察画像評価装置３は、コンピュータに対して本発明の観察画像撮影評価プログラムの一実施形態がインストールされたものである。

観察画像評価装置３は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに観察画像撮影評価プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置を有する制御部３５によって実行されることによって、図１に示すような観察画像取得部３０、細胞評価部３１、成熟度情報取得部３３および表示制御部３４が動作する。

観察画像取得部３０は、撮影装置２において観察画像を取得して記憶するものである。また、観察画像取得部３０は、取得した観察画像を細胞評価部３１と表示制御部３４に出力するものである。

細胞評価部３１は、観察画像取得部３０によって取得された観察画像に基づいて、細胞の状態などを評価するものであり、本実施形態においては、幹細胞の未分化・分化を評価するものである。

細胞評価部３１は、観察画像から種々の特徴量を取得する特徴量取得部３２を備え、この特徴量取得部３２によって取得された特徴量に基づいて、幹細胞の未分化・分化を評価するものである。また、細胞評価部３１は、幹細胞の成熟度や幹細胞の培養条件に応じて、幹細胞の未分化・分化の評価方法を変更するものである。ここで、評価方法の変更とは、未分化・分化を評価する際に用いる評価基準の変更や、複数の評価基準を用いて未分化・分化の評価を行う場合における各評価基準に対する重み付けの変更などのことをいう。

本実施形態の細胞評価部３１は、幹細胞の播種初期の段階と、幹細胞の播種後、数日経過した段階と、幹細胞の播種後、１週間経過した段階との３段階に区分された成熟度に応じて、未分化・分化の評価方法を変更するものである。

幹細胞の成熟度に関連する情報は、細胞の成熟度の段階を示す情報であれば如何なる情報でもよく、たとえばタイマによって計測された培養期間を成熟度に関連する情報として取得することができる。また、培養期間に限らず、たとえば細胞画像内の細胞コロニー領域の画像情報を解析し、細胞コロニーの大きさや、細胞コロニー内の細胞数または細胞コロニーよりも小さい単位面積当たりの細胞数を計測し、その計測した細胞数が多いほど成熟度が進んでいるものとして成熟度に関連する情報として取得するようにしてもよい。細胞コロニーの大きさとしては、細胞コロニーの面積、周囲長、最大径などを取得することができる。

また、たとえば細胞コロニー領域の画像の輝度や、均一性や粗さなどのテクスチャを成熟度に関連する情報として取得するようにしてもよい。たとえば撮像対象の細胞が幹細胞である場合には、その成熟度が進行すると幹細胞の密集度が高くなり、さらに幹細胞が積層されて、画像の輝度が次第に高くなる。したがって、輝度が高いほど成熟度が進行しているといえる。

また、成熟度が進行して上述したように幹細胞が増殖して積層された状態となった場合、画像の均一性が高くなり、また凹凸の少ない滑らかな画像となる。したがって、画像の均一性が高い、または画像が滑らかであるほど成熟度が進行しているといえる。画像の均一性や滑らかさの特徴量の取得方法については、既に公知な手法を用いることができる。

また、成熟度に関連する情報として、幹細胞コロニーの形状の特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると幹細胞コロニーの形状は次第に円形に近づいた後、周辺部分の分化が進行してエッジの複雑度が大きくなる。したがって、このような幹細胞コロニーの形状の変化の特徴量を成熟度に関連する特徴量として取得することができる。

また、成熟度に関連する情報として、幹細胞コロニーの厚さの特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると幹細胞コロニーは次第に厚くなっていく。したがって、このような幹細胞コロニーの厚さの特徴量を成熟度に関連する特徴量として取得することができる。幹細胞コロニーの厚さについては、別途設けられた計測装置によって計測するようにしてもよいし、ユーザが入力装置５を用いて設定入力するようにしてもよい。

また、上述した成熟度に関連する情報として、細胞の継代数をユーザが入力装置５を用いて設定入力するようにしてもよい。

成熟度情報取得部３３は、上述したような細胞の成熟度に関連する情報を取得し、この情報から細胞の成熟度の段階を取得するものである。

また、本実施形態においては、上述したように成熟度を３段階に区分するようにしたが、３段階に限らず、２段階や４段階以上に区分してもよい。また、各段階の間隔についても、培養条件などに応じて種々の間隔を設定することができる。

また、本実施形態の細胞評価部３１は、培養条件として、異種細胞を用いた培養であるか否かの条件と、播種方法がコロニー単位で播種を行うコロニー播種であるかまたは幹細胞単位で播種を行うシングルセル播種であるかの条件とを取得するものである。

幹細胞の培養を行う場合、培養対象の幹細胞とは異なる種類の異種細胞を用いる場合がある。そして、異種細胞を用いた培養の場合と、異種細胞なしの培養とでは、幹細胞の成長の仕方が異なる。また、幹細胞の培養を行う際には、途中で培地交換および薬剤添加を行う場合があり、この場合、異種細胞を用いた培養であるか異種細胞なしの培養であるか、さらには培養途中の幹細胞の状態によって、交換する培地の種類や薬剤の種類が異なり、このような培養条件によっても幹細胞の成長の仕方が変化するため、未分化・分化の評価基準を変更した方が好ましい。

そこで、本実施形態の細胞評価部３１は、異種細胞を用いた培養であるか否かの条件と、培地交換および薬剤添加を行うか否かの条件を取得し、これらの条件に応じて未分化・分化の評価方法を変更するものである。なお、さらに途中交換される培地の種類や添加される薬剤の種類の条件も取得し、これらの条件に応じて未分化・分化の評価方法を変更するようにしてもよい。

また、幹細胞の培養を行う場合、幹細胞の播種方法として、コロニー単位で播種を行うコロニー播種と、幹細胞単位で播種を行うシングルセル播種とがある。そして、コロニー播種の場合とシングルセル播種の場合とでは、未分化・分化を評価する際に用いられる特徴量を抽出するための画像処理が異なっていたり、また、幹細胞の成長の仕方も異なるので未分化・分化の評価基準を変更した方が好ましい。したがって、本実施形態の細胞評価部３１は、播種方法の条件を取得し、その取得した播種方法の条件に応じて未分化・分化の評価方法を変更するものである。

なお、上述したような培養条件については、ユーザが入力装置５を用いて設定入力し、細胞評価部３１が、その入力された培養条件を取得するようにすればよい。また、培養条件は、上述したような培養条件に限らず、たとえば培地や足場の種類の情報など、幹細胞の成長の進行に影響を及ぼすようなその他の培養条件を用いるようにしてもよい。

また、特徴量取得部３２は、幹細胞の成熟度や培養条件に対応するそれぞれの評価方法における評価基準に応じた特徴量を取得するものである。

以下、幹細胞の成熟度の各段階および培養条件に対応するそれぞれの評価方法について、図２から図４に示す表を参照しながら詳細に説明する。

まず、培養条件が、異種細胞を用いた培養であり、播種方法がコロニー播種である場合における各成熟度に対応する評価方法を、図２を参照しながら説明する。

まず、幹細胞の成熟度が播種初期である場合には、撮影装置２における位相差顕微鏡を用いて観察画像が撮影され、特徴量取得部３２において、観察画像に対して、異種細胞と幹細胞コロニーとを分離して幹細胞コロニーを抽出する画像処理が施される。異種細胞と幹細胞コロニーとはオーダー単位で大きさが異なるものであるため、エッジ検出やパターンマッチングを行うことによって異種細胞と幹細胞コロニーとを分離して幹細胞コロニーのみを抽出することができる。

そして、この段階では、細胞評価部３１は、抽出された幹細胞コロニーの形状と、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞の均一性を評価基準として未分化・分化の評価を行う。

より具体的には、特徴量取得部３２において、幹細胞コロニーの形状の情報として、外周形状と内部欠陥とが抽出される。幹細胞コロニーは、一般的には、未分化である場合には円形に近く、分化が進むと幹細胞が遊離して円形が崩れた状態となる。したがって、幹細胞コロニーの外周形状の円形度を評価することによって幹細胞コロニーの未分化・分化を評価することができる。また、幹細胞コロニーの内部欠陥とは、分化によって幹細胞コロニーの内部に形成される穴などである。

また、特徴量取得部３２において、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞の分布状態が取得され、個々の幹細胞がどの程度均一に分布しているかの情報が取得される。幹細胞が均一に分布している場合には未分化である可能性が高く、幹細胞が一部に集中して分布したりして不均一である場合には、分化している可能性が高いといえる。

なお、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞の分布状態については、たとえば幹細胞の核小体のパターンを検出して取得するようにしてもよいし、幹細胞間を通過した回折光に起因して発生するハロのパターンを検出することによって取得するようにしてもよい。照明光が幹細胞間を通過する際、回折が起こる。そして、幹細胞間の距離（スリットギャップ）が照明光の波長の整数倍となった場合、回折光（±１次回折光）と直接光（０次回折光）の位相が同調し、高輝度のアーチファクトが発生する。この高輝度のアーチファクトがハロである。

そして、細胞評価部３１は、幹細胞コロニーの外周形状の円形度に関する評価値と、内部欠陥の有無や大きさに関する評価値と、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞の均一性に関する評価値を算出し、これらの評価値にそれぞれ重み付けをして加算することによって、未分化・分化を評価するための最終的な評価値を算出し、その評価値が予め設定された閾値以上である場合には、未分化であると評価し、閾値未満である場合には分化していると評価する。そして、このとき幹細胞の均一性の評価値に対する重み付けの方を、幹細胞コロニーの形状（外周形状および内部欠陥）の評価値に対する重み付けよりも大きくする。

これは、幹細胞の成熟度が播種初期である場合には、図５に示すように、幹細胞コロニーの成熟度が進んでいないため、幹細胞コロニーの外周形状が円形ではなかったり、幹細胞コロニー内の幹細胞間に分化とは無関係な隙間が存在したりする場合がある。したがって、幹細胞コロニーの外形よりも幹細胞の分布の均一性をより重く評価した方が精度よく未分化・分化を評価することができるからである。

次に、幹細胞の成熟度が播種後、数日経過した段である場合には、播種初期段階と同様に、位相差顕微鏡を用いて観察画像が撮影され、特徴量取得部３２において、観察画像に対して幹細胞コロニーを抽出する画像処理が施される。

そして、この段階においても、細胞評価部３１は、抽出された幹細胞コロニーの形状と、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞の均一性を評価基準として未分化・分化の評価を行うが、重み付けが播種初期段階とは異なる。

具体的には、この段階において、細胞評価部３１は、幹細胞の均一性の評価値に対する重み付けの方を、幹細胞コロニーの形状の評価値に対する重み付けよりも大きくするが、このとき幹細胞コロニーの形状の評価値に対する重み付けは、上述した播種初期段階における幹細胞コロニーの形状の評価値に対する重み付けよりも大きくする。

これは、播種後から数日経過した段階では、図６に示すように、幹細胞コロニーの成熟度がある程度進み、幹細胞コロニーの外周形状が円形に近くなり、幹細胞コロニー内の幹細胞の充填度も高くなっていると考えられるため、幹細胞コロニーの形状の評価値に対する重み付けをより大きくした方が、未分化・分化の評価を高精度に行うことができると考えられるからである。

次に、幹細胞の成熟度が播種後、１週間経過した段階である場合には、撮影装置２における位相差顕微鏡ではなく、微分干渉顕微鏡を用いて観察画像が撮影され、特徴量取得部３２において、観察画像に対して、異種細胞と幹細胞コロニーとを分離して幹細胞コロニーを抽出する画像処理が施される。

この段階においては、幹細胞コロニーの成長が発達し、図７に示すように、積層化する場合がある。このように積層化した場合、積層化された幹細胞からの回折光成分と屈折光成分との重ね合せを生じ、１つの幹細胞からの回折光を分離できず、かつ像全体の光強度が増してしまうため、幹細胞コロニー内の個々の幹細胞のミクロな特徴が位相差顕微鏡では計測できなくなる。したがって、この段階では、上述したように微分干渉顕微鏡によって観察画像を撮影する。

そして、この段階では、細胞評価部３１は、幹細胞コロニーの形状と、幹細胞コロニーの輝度の均一性と、幹細胞コロニーの厚みの均一性を評価基準として未分化・分化の評価を行う。

より具体的には、特徴量取得部３２において、先の段階と同様に、幹細胞コロニーの外周形状と内部欠陥とが抽出される。また、特徴量取得部３２において、幹細胞コロニー内の輝度信号の分布が取得され、その均一性が取得される。また、特徴量取得部３２において、幹細胞コロニーの厚さの均一性が取得される。なお、幹細胞コロニーの厚さについては、たとえば、図示省略したＯＣＴ（Optical Coherence Tomography:光干渉断層計）などの干渉計を用いて計測することができる。

輝度信号や厚さの均一性としては、たとえば輝度信号や厚さの標準偏差を取得するようにしてもよいし、最大値と最小値との差を取得するようにしてもよい。輝度信号や厚さが均一に分布している場合には未分化である可能性が高いといえる。また、周囲と比較して相対的に高輝度または低輝度な部分や、相対的に厚さが大きいまたは小さい部分が一部に集中して分布して不均一である場合には、分化している可能性があるといえる。

そして、細胞評価部３１は、幹細胞コロニーの外周形状の円形度に関する評価値と、外周形状の複数円近似度に関する評価値と、内部欠陥の有無や大きさに関する評価値と、輝度の均一性に関する評価値と、厚みの均一性に関する評価値を算出し、これらの評価値に対してそれぞれ重み付けをして加算することによって、未分化・分化を評価するための最終的な評価値を算出する。なお、複数円近似度とは、幹細胞コロニーの外周形状と、複数の円を結合した複数円結合パターンとの近似度のことをいう。

このとき各評価値に対する重み付けは、円形度に関する評価値を相対的に小さくし、複数円近似度、内部欠陥、輝度の均一性および厚みの均一性に関する評価値を相対的に大きくする。

これは、幹細胞の成熟度が播種後、１週間経過した段階では、図８に示すように、幹細胞コロニー同士が結合し、幹細胞コロニーの外周形状は円形を維持していない場合が多い。したがって、円形度の評価値に対する重み付けを小さくし、その他の複数円近似度に関する評価値などに対応する重み付けを大きくした方が精度よく未分化・分化を評価することができるからである。

以上が、培養条件が、異種細胞を用いた培養であってコロニー播種の場合における各成熟度に対応する評価方法の説明である。

次に、培養条件が、異種細胞を用いた培養であってシングルセル播種の場合における各成熟度に対応する評価方法について、図２を参照しながら説明する。

この場合、幹細胞の成熟度が播種初期段階の評価方法のみが、コロニー播種の場合と異なり、播種後、数日経過した段階の評価方法と、播種後、１週間経過した段階における評価方法は、コロニー播種の場合と同様である。

異種細胞を用いた培養であってシングルセル播種の場合、コロニー播種の場合と同様に、位相差顕微鏡を用いて観察画像が撮影されるが、播種初期段階においては、コロニーが形成されていないので、コロニー播種の場合のようにコロニーを抽出する画像処理を行わない。

そして、コロニー播種の場合と同様に、特徴量取得部３２において、幹細胞コロニーの外周形状と内部欠陥とが抽出されるが、上述したように、この段階においては、コロニーは明確に形成されていない。したがって、特徴量取得部３２は、今後、幹細胞コロニーが形成されると推定される領域を幹細胞の分布状態から特定し、その特定した領域の外周形状と内部欠陥とを抽出する。

また、特徴量取得部３２において、異種細胞および幹細胞の分布状態が取得され、これらの細胞の分布の均一性が取得される。なお、このとき異種細胞と幹細胞との区別をつけるのは困難であるため、両方の細胞についての均一性が取得される。

そして、細胞評価部３１は、幹細胞コロニーの外周形状の円形度に関する評価値と内部欠陥の有無や大きさに関する評価値と、幹細胞および異種細胞の均一性に関する評価値とを算出し、これらの評価値にそれぞれ重み付けをして加算することによって、未分化・分化を評価するための最終的な評価値を算出する。そして、このとき幹細胞の均一性の評価値に対する重み付けの方を、幹細胞コロニーの形状（外周形状および内部欠陥）の評価値に対する重み付けよりも大きくする。

次に、培養条件が、異種細胞なしでの培養であってコロニー播種の場合における各成熟度に対応する評価方法については、図３の上段に示しているが、この場合は、全ての成熟度に対応する評価方法について、異種細胞を用いた培養であってコロニー播種の場合における評価方法と同様である。

次に、培養条件が、異種細胞なしでの培養であってシングルセル播種の場合における各成熟度に対応する評価方法を図３の下段に示す。この場合、幹細胞の成熟度が播種初期である場合の評価方法と、播種後、数日経過した場合の評価方法については、異種細胞を用いた培養であってシングルセル播種の場合における評価方法と同様であり、播種後、１週間経過した段階における評価方法についてのみ異なる。

具体的には、異種細胞なしでの培養であってシングルセル播種の場合において、播種後、１週間経過した段階では、微分干渉顕微鏡ではなく、位相差顕微鏡を用いて観察画像が撮影され、特徴量取得部３２において、観察画像に対して、異種細胞と幹細胞コロニーとを分離して幹細胞コロニーを抽出する画像処理が施される。

このように、微分干渉顕微鏡でなく、位相差顕微鏡を用いて観察画像を撮影するのは、異種細胞を用いた培養においては、幹細胞コロニーの成長によって、上述したような幹細胞の積層化が発生する場合があるが、異種細胞なしでの培養であってシングルセル播種の場合には、幹細胞が積層化するまでに時間がかかり、１週間程度の期間では、図９に示すように、幹細胞コロニーが平面方向に延びて成長するからである。なお、同じ異種細胞なしの培養であってもコロニー播種の場合には、シングルセル播種の場合よりも幹細胞コロニーの成長が早く、積層化が発生する可能性が高いので、上述したように微分干渉顕微鏡によって観察画像を撮影するようにしている。

そして、細胞評価部３１は、幹細胞コロニーの外周形状の円形度に関する評価値と、外周形状の複数円近似度に関する評価値と、内部欠陥の有無や大きさに関する評価値とにそれぞれ重み付けをして加算し、最終的な未分化・分化の評価対象の評価値を算出し、輝度の均一性に関する評価値と、厚みの均一性に関する評価値とについては考慮しない。各評価値に対する重み付けとしては、異種細胞を用いた培養の場合と同様に、円形度に関する評価値を相対的に小さくし、複数円近似度および内部欠陥に関する評価値を相対的に大きくする。

次に、培養条件が、異種細胞なしでの培養であってシングルセル播種の場合であり、さらに幹細胞の播種後、数日経過前において培地交換および薬剤添加を行う場合における各成熟度に対応する評価方法を図４に示す。

上述した培養条件の場合、播種初期段階の評価方法と、播種後、１週間経過した段階の評価方法とについては、異種細胞なしでの培養であってシングルセル播種の場合であり、培地交換および薬剤添加なしの場合の評価方法と同様である。そして、播種後、数日経過した場合であって、培地交換および薬剤添加した場合には、播種初期段階と同様の評価基準を用いて未分化・分化の評価を行う。これは薬剤添加前の評価方法と同じ評価基準を用いることによって、薬剤添加による効果を評価するためである。

以上が、本実施形態の細胞評価部３１における未分化・分化の評価方法についての説明である。

図１に戻り、表示制御部３４は、観察画像取得部３０によって取得された観察画像をディスプレイ４に表示させたり、細胞評価部３１における未分化・分化の評価結果をディスプレイ４に表示させたりするものである。また、表示制御部３４が、評価結果だけでなく、評価に用いられた特徴量や評価値をディスプレイ４に表示させるようにしてもよい。

制御部３５は、観察画像評価装置３全体を制御するものであるが、成熟度情報取得部３３によって取得された成熟度に関連する情報に応じて、観察画像の撮影方法が変更されるように撮影装置２の制御部２２に対して制御信号を出力するものでもある。

入力装置５は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる操作入力を受け付けるものである。たとえば、入力装置５は、未分化・分化の評価における評価基準の設定や変更を受け付けたり、評価値を算出する際に用いられる重み付けの設定や変更を受け付けたりするものである。

次に、上述した細胞培養観察システムの作用について、図１０に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、細胞培養装置１において、搬送部１１によって、収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養が選択され、その選択された培養容器がステージ１０に設置される（Ｓ１０）。

そして、撮影装置２の位相差顕微鏡または微分干渉顕微鏡によって、培養容器内の幹細胞を含む観察領域の観察画像の撮影が行われる（Ｓ１２）。具体的には、図１１に示すような１０ｃｍ×１０ｃｍの矩形の観察領域を位相差顕微鏡によって４０ショット×４０ショットで撮影して１枚の観察画像を取得する。

そして、撮影装置２によって撮影された観察画像は観察画像評価装置３に出力され、観察画像評価装置３の観察画像取得部３０によって取得される（Ｓ１４）。

また、このとき成熟度情報取得部３３において、たとえば観察画像が撮影された時点における培養期間が成熟度に関連する情報として取得され（Ｓ１６）、ユーザによって入力装置５を用いて培養条件が入力される（Ｓ１８）。

観察画像取得部３０によって取得された観察画像と成熟度情報取得部３３によって取得された成熟度に関連する情報とユーザによって入力された培養条件とが細胞評価部３１に出力され、特徴量取得部３２は、入力された観察画像と成熟度に関連する情報と培養条件に基づいて、成熟度および培養条件に応じた特徴量を取得する（Ｓ２０）。

そして、細胞評価部３１は、特徴量取得部３２によって取得された特徴量に基づいて、幹細胞の成熟度および培養条件に応じた評価方法を用いて、観察画像内の幹細胞の未分化・分化の評価を行う（Ｓ２２）。

細胞評価部３１における未分化・分化の評価結果は表示制御部３４に出力され、表示制御部３４は、入力された未分化・分化の評価結果と観察画像とをディスプレイ４に表示させる。（Ｓ２４）。

上記実施形態の細胞培養観察システムによれば、幹細胞を撮影した観察画像を取得し、その観察画像を評価する際、幹細胞の成熟度に関連する情報を取得し、その成熟度に関連する情報に基づいて、未分化・分化の評価方法を変更するようにしたので、幹細胞の播種開始からある程度成長が進むまでの各成長段階において、幹細胞の未分化・分化を適切に評価することができる。

また、幹細胞の培養条件に応じて未分化・分化の評価方法を変更するようにしたので、培養条件が異なる場合においても、幹細胞の未分化・分化を適切に評価することができる。

なお、未分化・分化の評価を行う際に用いられる評価基準としては、上述したような幹細胞の均一性や幹細胞コロニーの形状などに限らず、その他、幹細胞の充填度や幹細胞コロニーにおけるハロの発生状態や幹細胞コロニーの境界の明瞭度などを用いるようにしてもよい。

また、上記実施形態の説明においては、播種初期段階および播種後、数日経過後においては、位相差顕微鏡によって観察画像を撮影し、播種後、１週間経過した段階においては、微分干渉顕微鏡によって観察画像を撮影し、すなわち幹細胞の成熟度に応じて撮影装置２における撮影方法を変更するようにしている。また、播種後、１週間経過した段階でも、異種細胞を用いた培養の場合には、微分干渉顕微鏡を用いて観察画像を撮影し、異種細胞なしの培養であってシングルセル播種の場合には、位相差顕微鏡を用いて観察画像を撮影し、すなわち培養条件に応じて撮影装置２における撮影方法を変更するようにしている。

このように成熟度や培養条件に応じて光学系２０の種類を変更して撮影方法を変更するだけでなく、光学系２０の撮像条件や撮像素子の撮像条件を変更して撮影方法を変更するようにしてもよい。なお、位相差顕微鏡から微分干渉顕微鏡への変更は、照明方法の変更ともいえる。

以下、幹細胞の成熟度や培養条件に応じて撮像条件を変更する場合について、図１２に示す表を参照しながら説明する。

まず、播種初期段階および播種初期後、数日経過した段階においては、幹細胞コロニーの外形よりも個々の幹細胞の分布状態をより重く評価するため、光学系２０における光学倍率は、播種初期後、１週間経過した段階における光学倍率よりも高くすることが望ましい。これにより個々の幹細胞を高精度に撮影することができる。一方、播種初期後、１週間経過した段階においては、相対的に光学倍率を低くすることによって、幹細胞コロニーの全体形状を撮影することができるので、幹細胞コロニーの複数円近似度や内部欠陥などを高精度に評価することができる。

また、上記と同様の理由により、播種初期段階および播種初期後、数日経過した段階においては、撮像素子２１の解像度を相対的に高くすることが望ましく、播種初期後、１週間経過した段階においては、解像度を相対的に低くすることが望ましい。なお、解像度の変更については、たとえば互いに解像度の異なる複数の撮像素子２１を切り替えるようにしてもよいし、１つの撮像素子２１から画像信号を読み出す際に、たとえばビニングなどを行うことによってダウンサンプリングするようにしてもよい。

また、播種初期段階および播種初期後、数日経過した段階においては、幹細胞コロニーの外形よりも個々の幹細胞の分布状態をより重く評価するため、個々の幹細胞のエッジやハロなどを高精度に検出するために、撮像素子２１の露光時間は、播種初期後、１週間経過した段階における露光時間よりも長く設定することが望ましい。これにより個々の幹細胞を高精度に撮影することができる。

一方、播種初期後、１週間経過した段階においては、上述したよう幹細胞コロニーの積層化が生じる。そして、積層化された幹細胞からの回折光成分と屈折光成分との重ね合せを生じて像全体の光強度が増してしまうため、図１３に示すように観察画像内において白抜けが生じ、幹細胞コロニーの状態を正確に観察することができない。したがって、播種初期後、１週間経過した段階においては、撮像素子２１の露光時間を相対的に短く設定することが望ましい。図１４は、図１３の観察画像の撮影対象である幹細胞コロニーを露光時間を短くして撮影した観察画像である。

なお、露光時間の変更については、露光回数を変更することによって変更するようにしてもよい。たとえば、播種初期段階および播種初期後、数日経過した段階においては、露光回数を複数回として複数の観察画像を加算し、播種初期後、１週間経過した段階においては、露光回数を１回として観察画像を取得するようにしてもよい。露光回数の変更は、実質的には露光時間の変更に相当するものといえる。

また、上記と同様の理由により、播種初期段階および播種初期後、数日経過した段階においては、光学系２０の光源の露光光量を相対的に大きくすることが望ましく、播種初期後、１週間経過した段階においては、露光光量を相対的に小さくすることが望ましい。

さらに、播種初期段階および播種初期後、数日経過した段階においては、個々の幹細胞のエッジなどを高分解能で撮影する必要があるため、光学系２０の照明光の波長は、播種初期後、１週間経過した段階における照明光の波長よりも短くすることが望ましい。これにより空間分解能を高くすることができる。一方、播種初期後、１週間経過した段階においては、幹細胞コロニーの全体形状を撮影するのでそれほど高い空間分解能は必要ない。また、照明光の波長が短い場合、散乱が強くなるため、幹細胞と幹細胞ではない部分との境界で散乱が発生し、幹細胞コロニーの全体形状の境界がボケてしまう。

そこで、播種初期後、１週間経過した段階においては、相対的に長い波長の照明光を用いることが望ましい。図１５は、相対的に短い波長の照明光によって撮影した位相差像であり、図１６は、相対的に長い波長の照明光によって撮影した位相差像である。図１５および図１６の矢印は、幹細胞内の微細構造を示しているが、短波長の照明光で撮影した図１５の観察画像の方が、長波長で撮影した図１６の観察画像よりも微細構造が明確なのが分かる。図１５および図１６の楕円は、細胞の境界部分を示しているが、長波長の照明光で撮影した図１６の観察画像の方が、短波長で撮影した図１５の観察画像よりも境界のボケが軽減されているのは分かる。

なお、上記実施形態の説明では、幹細胞の未分化・分化の評価方法について説明したが、幹細胞の未分化・分化に限らず、たとえば分化誘導された細胞の分化度を評価したり、がん細胞の悪性度などの評価方法を成熟度に関連する情報に基づいて決定するようにしてもよい。分化誘導された細胞については、その細胞の種類によって形態的な特徴の変化が異なるので、その形態的な特徴の変化に応じた評価方法を予め設定するようにすればよい。たとえば、心筋コロニーを評価する場合には、培養初期は個々の心筋細胞の分布状態などを評価し、成長が進んで心筋細胞が拍動を始めた段階では、その拍動周期などを評価するようにしてもよい。

また、血管を含む組織を培養する場合には、培養初期は個々の細胞の分布状態などを評価し、成長が進んで血管がある程度形成された段階では、その血管の長さや状態を評価するようにしてもよい。

また、細胞評価部３１は、上述したような細胞の種類の情報を取得し、その細胞の種類と成熟度に関連する情報とに基づいて細胞コロニーの評価方法を決定するようにしてもよい。

また、幹細胞に限らず、分化誘導後の細胞についても、幹細胞と同様に細胞コロニーの成長によって積層化する場合があるので、その成熟度に応じて微分干渉顕微鏡による撮影と、位相差顕微鏡による撮影とを変更するようにしてもよい。

また、分化誘導後の細胞についても、幹細胞の場合と同様に、その成熟度に応じて光学系２０における光学倍率を変更したり、撮像素子２１の解像度を変更したりしてもよい。また、幹細胞の場合と同様に、その成熟度に応じて撮像素子２１の露光時間、光学系２０の光源の露光光量、または光学系２０の照明光の波長を変更するようにしてもよい。

１ 幹細胞培養装置
２ 撮影装置
３ 観察画像評価装置
４ ディスプレイ
５ 入力装置
１０ ステージ
１１ 搬送部
１２ 制御部
２０ 光学系
２１ 撮像素子
２２ 制御部
３０ 観察画像取得部
３１ 細胞評価部
３２ 特徴量取得部
３３ 成熟度情報取得部
３４ 表示制御部
３５ 制御部

Claims (12)

1. 細胞を撮影して観察画像を取得する撮影部と、
   前記観察画像を評価する細胞評価部と、
   前記撮影部よる撮影対象の細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部とを備え、
   前記撮影部が、位相差顕微鏡と微分干渉顕微鏡とを有し、前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記成熟度が進行した場合に、前記位相差顕微鏡による撮影から前記微分干渉顕微鏡による撮影に変更するものである観察画像撮影評価装置。
2. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、光学系の撮像条件を変更するものである請求項１記載の観察画像撮影評価装置。
3. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、光学系の光学倍率を変更するものである請求項２記載の観察画像撮影評価装置。
4. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、光学系の露光光量を変更するものである請求項２または３記載の観察画像撮影評価装置。
5. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、照明光の波長を変更するものである請求項２から４いずれか１項記載の観察画像撮影評価装置。
6. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、撮像素子の撮像条件を変更するものである請求項１から５いずれか１項記載の観察画像撮影評価装置。
7. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、撮像素子の露光時間を変更するものである請求項６記載の観察画像撮影評価装置。
8. 前記撮影部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、撮像素子の解像度を変更するものである請求項６または７記載の観察画像撮影評価装置。
9. 前記撮影部が、前記細胞の培養条件に基づいて、前記観察画像の撮影方法を変更するものである請求項１から８いずれか1項記載の観察画像撮影評価装置。
10. 前記細胞評価部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記観察画像の評価方法を変更するものである請求項１から９いずれか１項記載の観察画像撮影評価装置。
11. 細胞を撮影して観察画像を取得し、該観察画像を評価する際、
    撮影対象の細胞の成熟度に関連する情報を取得し、
    前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記成熟度が進行した場合に、前記位相差顕微鏡による撮影から前記微分干渉顕微鏡による撮影に変更する観察画像撮影評価方法。
12. コンピュータを、細胞を撮影して観察画像を取得する撮影部を制御する制御部と、前記観察画像を評価する細胞評価部と、前記細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部として機能させる観察画像撮影評価プログラムであって、
    前記撮影部が、位相差顕微鏡と微分干渉顕微鏡とを有し、
    前記制御部が、前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記成熟度が進行した場合に、前記位相差顕微鏡による撮影から前記微分干渉顕微鏡による撮影に変更するものである観察画像撮影評価プログラム。