JP7096054B2

JP7096054B2 - 幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する方法、分化判定装置、及び分化判定プログラム

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Publication number: JP7096054B2
Application number: JP2018077429A
Authority: JP
Inventors: 友美角野; 豊彦山内
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2018-04-13
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2022-07-05
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Also published as: JP2019180331A

Description

本発明は、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する方法に関する。本発明はまた、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する分化判定装置、及び分化判定プログラムにも関する。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞は、多種類の組織の細胞に分化する能力を有しており、再生医療、創薬、疾患の解明等への応用が可能なものとして注目されている。幹細胞の分化度を非侵襲で判定する方法が、特許文献１に開示されている。

特開２０１５－１４６７４７号公報

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞は、様々な組織の細胞に分化する能力を持つが、分化誘導時に特定の細胞への分化しやすさ（分化指向性）が、細胞株ごとに異なることが知られている。現状、幹細胞が目的の組織の細胞に分化したか否かを判定するためには、幹細胞を分化誘導し、長期間（例えば、２０～３０日間）の培養を経たうえで、目的の組織の細胞に分化したか否かを確認する必要がある。また、分化誘導の過程で目的の組織の細胞に分化したか否かを判定しようとする場合には、遺伝子又はタンパク質等のマーカーの発現を確認するなどの侵襲的な方法に依る必要がある。

特許文献１に開示される方法は、幹細胞の細胞厚さが分化細胞の細胞厚さよりも大きいという知見に基づくものである。特許文献１に開示される方法によれば、例えば、培養状態の悪化により未分化状態の維持ができなくなる等の分化傾向の発生を、細胞厚さの減少として捉えることができる。しかしながら、分化傾向の発生は、必ずしも目的の組織の細胞に分化したことを表すものではないため、特許文献１に開示される方法では、目的の組織の細胞に分化したか否かを短期間で判定するには充分ではなかった。

本発明は、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを非侵襲かつ短期間で判定できる方法の提供を目的とする。本発明はまた、当該方法に好適に使用できる分化判定装置及び分化判定プログラムの提供も目的とする。

本発明者らは、幹細胞が目的細胞へ分化したとき（すなわち、未分化マーカーの消失、及び／又は目的細胞特有のマーカーの発現）、細胞厚さが急激に増大することを見出した。しかも、この細胞厚さの増大は、分化誘導を開始した初期段階で生じることも見出した。本発明は、この新規な知見に基づくものである。

本発明は、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する方法であって、幹細胞の目的細胞への分化を誘導する誘導工程と、誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する判定工程を備える、方法を提供する。

本発明に係る分化判定方法は、幹細胞が目的細胞へ分化したときに、細胞厚さが急激に増大するという知見に基づき、誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化を指標として目的細胞へ分化したか否かを判定するものである。本発明に係る分化判定方法によれば、非侵襲かつ短期間での判定が可能となる。

判定工程は、式（１）で表される細胞厚さの１日あたり変化率に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する工程であってもよい。

［式（１）中、記号「＾」はべき乗を示し、ｔ１≠ｔ２である。］
これにより、判定の精度がより一層向上する。

判定工程はまた、式（２）で表される細胞厚さの傾きに基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する工程であってもよい。
細胞厚さの傾き＝２４×（ｔ１時間後の細胞厚さ－ｔ２時間後の細胞厚さ）／（ｔ１－ｔ２）…（２）
［式（２）中、ｔ１≠ｔ２である。］
これにより、判定の精度がより一層向上する。

本発明に係る分化判定方法において、細胞厚さは、細胞コロニーの一部領域又は全体の平均細胞厚さであってもよい。これにより、判定の精度がより一層向上する。

本発明に係る分化判定方法において、細胞厚さは、光学的厚さであってもよい。

本発明に係る分化判定方法において、幹細胞は、多能性幹細胞であってもよい。

本発明はまた、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する分化判定装置であって、分化誘導後の経過時間データ、及びその時点における細胞の細胞厚さデータを取得する取得手段と、取得した複数の経過時間データ及び細胞厚さデータから、細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出する算出手段と、算出した指標を閾値と比較する比較手段と、比較した結果に基づき、目的細胞へ分化した、又は目的細胞へ分化していないと判定する判定手段と、を備える、分化判定装置を提供する。当該分化判定装置は、細胞の反射干渉顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段を更に備えるものであってもよい。第２の取得手段を更に備えることにより、コロニー単位での判定をより簡便に行うことができる。

本発明は更に、コンピューターを、分化誘導後の経過時間データ、及びその時点における細胞の細胞厚さデータを取得する取得手段、取得した複数の経過時間データ及び細胞厚さデータから、細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出する算出手段、算出した指標を閾値と比較する比較手段、及び比較した結果に基づき、目的細胞へ分化した、又は目的細胞へ分化していないと判定する判定手段、として機能させるための分化判定プログラムを提供する。当該分化判定プログラムは、コンピュータを、細胞の反射干渉顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段として更に機能させることを含むものであってもよい。

本発明に係る分化判定プログラムは、当該分化判定プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体として提供されてもよい。

本発明によれば、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを非侵襲かつ短期間で判定できる方法の提供が可能となる。本発明に係る分化判定方法は、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを短期間（例えば、分化誘導の開始から４～５日）で判定できるため、時間及び労力を大幅に節約することができる。本発明に係る分化判定方法はまた、非侵襲で判定できるため、判定した細胞をそのまま下流工程で使用することができる。

分化誘導後の細胞の細胞厚さ（光学的厚さ）の経時変化を概略的に示す説明図である。一実施形態に係るサイトメーターの構成図である。一実施形態に係る分化判定装置のハードウェア的構成を示す概要図である。一実施形態に係る分化判定装置の機能的構成を示す概要図である。一実施形態に係る分化判定方法のフローチャートである。反射干渉顕微鏡画像の一例を示す図である。図６の反射干渉顕微鏡画像から抽出したコロニー領域を示す図である。定量位相顕微鏡画像の一例を示す図である。定量位相顕微鏡画像には、反射干渉顕微鏡画像から抽出したコロニー領域の輪郭線が重ね合わされている。（Ａ）ＫｈＥＳ－１株の平均光学的厚さの測定結果を示すグラフである。（Ｂ）ＫｈＥＳ－１株の各マーカーの発現の測定結果を示すグラフである。（Ｃ）ＫｈＥＳ－３株の平均光学的厚さの測定結果を示すグラフである。（Ｄ）ＫｈＥＳ－３株の各マーカーの発現の測定結果を示すグラフである。（Ａ）平均光学的厚さの１日あたり変化率を示すグラフである。（Ｂ）平均光学的厚さの傾きを示すグラフである。（Ａ）光学的厚さ最高点の光学的厚さの１日あたり変化率を示すグラフである。（Ｂ）光学的厚さ最高点の周囲２５×２５ピクセルの範囲の平均光学的厚さの１日あたり変化率を示すグラフである。

以下、場合により図面を参照しつつ、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は適宜省略する。

〔分化判定方法〕
本発明に係る方法は、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する方法（単に「分化判定方法」ともいう。）であって、当該分化判定方法は、幹細胞の目的細胞への分化を誘導する誘導工程と、誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する判定工程を備える。

本発明に係る分化判定方法は、幹細胞が目的細胞へ分化したとき、細胞厚さが急激に増大するという新規知見に基づく。まず、図１を参照しながら、この新規知見について説明する。

図１は、分化誘導後の細胞の細胞厚さ（光学的厚さ）の経時変化を概略的に示す説明図である。図１中、領域Ｓは、未分化状態の幹細胞に対応する領域である。領域Ｔは、分化誘導により分化傾向を示した細胞に対応する領域である。領域Ｕは、目的細胞へ分化した細胞に対応する領域である。未分化状態の幹細胞（領域Ｓ）に対して、目的細胞への分化を誘導すると、まず光学的厚さが減少する傾向を示す（領域Ｔ）。次いで、分化誘導後、比較的初期段階（分化誘導開始から約４～５日後）で細胞の光学的厚さが急激に増大しピークを示す（領域Ｕ）。この変化（急激な増大）と連動して、未分化マーカー（例えば、Ｎａｎｏｇ）が消失し、目的細胞特有のマーカーが発現するようになる。つまり、領域Ｕにおける光学的厚さの急激な増大は、幹細胞が目的細胞へ分化したことを示している。なお、幹細胞が目的細胞へ分化しなかった場合、領域Ｕでは、細胞の細胞厚さの急激な増大は生じず、図１に示すようなピークは出現しない。

本発明に係る分化判定方法は、この新規知見を利用するものであり、例えば、領域Ｕにおける細胞の光学的厚さの急激な増大の有無、領域Ｕにおける細胞の光学的厚さのピークの有無といった、分化誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定するものである。

（誘導工程）
誘導工程は、幹細胞の目的細胞への分化を誘導する工程である。誘導工程は、例えば、幹細胞を目的細胞へ分化誘導させ得る物質の共存下で幹細胞を培養する方法等、常法に従い実施することができる。

幹細胞の目的細胞への分化を誘導させ得る物質は、目的細胞の種類に応じて、公知の物質から適宜選択することができる。具体的には、例えば、ＬＤＮ１９３１８９（４－［６－［４－（１－ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン二塩酸塩）共存下で多能性幹細胞を培養することで、神経細胞への分化を誘導することができる。

培養培地には、分化促進剤を添加してもよい。分化促進剤としては、例えば、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド）を挙げることができる。

幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞であってもよく、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、脂肪幹細胞、皮膚幹細胞及び肝幹細胞等の体性幹細胞であってもよい。幹細胞は、ヒト、マウス、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等の幹細胞であってもよい。

（判定工程）
判定工程では、誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する。

「誘導後の細胞」は、幹細胞、目的細胞への分化途上の細胞、目的細胞等を含む。

「細胞厚さ」は、「細胞の物理長」又は「細胞の光路長」を意味する。「光路長」は、「位相差」又は「光学的厚さ」と同義であり、「屈折率差」に「物理長（物理的厚さ）」を乗じたものである（光路長＝屈折率差×物理長）。「屈折率差」とは細胞（細胞内）の屈折率と細胞外（例えば、培養液）の屈折率との差をいう。

「細胞厚さ」は、例えば、単一細胞の細胞厚さであってもよく、細胞コロニーの一部領域又は全体の平均細胞厚さであってもよい。細胞コロニーの一部領域の平均細胞厚さとする場合は、細胞コロニー内で最も細胞厚さが大きい点を含む領域を採用するのが好ましい。

細胞コロニーの一部領域又は全体の平均細胞厚さは、例えば、細胞コロニーの一部領域又は全体に亘り細胞厚さを面積分した値を当該細胞コロニーの一部領域又は全体の面積で割った値としてもよい（単位面積あたりの細胞厚さとなる）。細胞コロニーの面積は、例えば、反射干渉顕微鏡（ＩＲＭ）像を撮像し、ＩＲＭ像を二値化して細胞が接着した培養基材と細胞が接着していない培養基材とを見分けることで測定することができる。

目的細胞に分化したか否かは、分化誘導後の初期段階（例えば、分化誘導開始から１～７日後、２～６日後、３～６日後、又は４～５日後）で細胞の細胞厚さが急激に増大したか否かにより判定することができる。すなわち、分化誘導後の初期段階で細胞の細胞厚さが急激に増大した場合、幹細胞が目的細胞に分化したと判定することができる。

判定工程は、例えば、誘導後の経過時間データ、及びその時点における誘導後の細胞の細胞厚さデータを、誘導後の経過時間が異なる複数の時点で取得する取得ステップと、取得した複数の経過時間データ、及びその時点における細胞厚さデータから、誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出する算出ステップと、算出した指標を閾値と比較する比較ステップと、比較した結果に基づき、幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する判定ステップと、を含むものであってよい。

「細胞厚さデータ」は、細胞厚さと相関するデータであればよく、例えば、光路長データであってよい。物理長データは、「屈折率差」を別途求めることで、光路長データから算出することもできる。光路長データは、例えば、定量位相顕微鏡、位相差顕微鏡により細胞を撮像することで、「位相差」又は「光学的厚さ」として得ることができる。

「誘導後の細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標」としては、例えば、下記式（１）で表される細胞厚さの１日あたり変化率、及び下記式（２）で表される細胞厚さの傾き等が挙げられる。

［式（１）中、記号「＾」はべき乗を示し、ｔ１≠ｔ２である。］
細胞厚さの傾き＝２４×（ｔ１時間後の細胞厚さ－ｔ２時間後の細胞厚さ）／（ｔ１－ｔ２）…（２）
［式（２）中、ｔ１≠ｔ２である。］

式（１）及び式（２）中、ｔ１及びｔ２は、誘導後の経過時間を示しており、ｔ１＞ｔ２であってもよく、ｔ１＜ｔ２であってもよい（変化率及び傾きの符号が反転するのみである）。細胞の光学的厚さが急激に増大するのは、分化誘導後の初期段階であることから、ｔ１及びｔ２は、１２時間後～１６８時間後の範囲内であることが好ましく、３６時間後～１５６時間後の範囲内であることがより好ましく、６０時間後～１４４時間後の範囲内であることが更に好ましく、８４時間後～１３６時間後の範囲内であることが更により好ましい。

また、判定の精度がより高まることから、ｔ１及びｔ２の差の絶対値は、６時間以上３２時間以下であることが好ましく、８時間以上２４時間以下であることがより好ましく、１０時間以上１６時間以下であることが更に好ましい。

閾値は、目的細胞の種類、ｔ１及びｔ２の差の絶対値等に応じて適宜設定することができる。例えば、多能性幹細胞の神経細胞への分化を誘導した場合であって、ｔ１及びｔ２の差の絶対値を約１２時間とした場合の式（１）で表される細胞厚さの変化率（細胞厚さの１日あたり変化率）の閾値の絶対値は、２．５倍／日とすることができる。細胞厚さの１日あたり変化率の絶対値が２．５倍／日以上となった場合に、多能性幹細胞が神経細胞に分化したと判断することができる。また、例えば、ｔ１及びｔ２の差の絶対値を約１２時間とした場合の式（２）で表される細胞厚さの傾きの閾値の絶対値は、１００ｎｍ／日とすることができる。細胞厚さの傾きの閾値の絶対値が１００ｎｍ／日以上となった場合に、多能性幹細胞が神経細胞に分化したと判断することができる。

〔分化判定装置〕
一実施形態において、分化判定装置は、光路長測定装置と組み合わせてサイトメーターとして使用される。光路長測定装置としては、例えば、定量位相顕微鏡、位相差顕微鏡を使用できる。

図２は、一実施形態に係るサイトメーターの構成図である。図２に示すサイトメーター１は、主に、反射干渉顕微鏡の光学系及び定量位相顕微鏡の光学系を組み合わせた顕微鏡システムＡ、及び分化判定装置Ｄにより構成される。顕微鏡システムＡは、定量位相顕微鏡の光学系のみで構成されていてもよい。なお、顕微鏡システムＡが反射干渉顕微鏡の光学系を更に備えることで、細胞コロニーの一部領域又は全体の面積を併せて測定できる。

（定量位相顕微鏡）
定量位相顕微鏡の光学系は、光の入射側に、図示しない光出射部からの照射光Ｈ０（レーザ光）を導く光ファイバＢの出射側端面Ｂ１に臨ませたレンズＡ２と、このレンズＡ２を透過する照射光Ｈ０を反射する反射部Ａ３を具備する。一方、定量位相顕微鏡の光学系の光の出射側には、光干渉部Ａ７で生成される干渉縞（図示せず、以下同様）を撮像して画像とするＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃが設けられる。

顕微鏡Ａは、測定試料Ｓを支持する試料台Ａ４、対物レンズＡ５、反射部Ａ６、光干渉部Ａ７を少なくとも備える顕微鏡本体Ａ１を具備する。図２に示すように、顕微鏡本体Ａ１は、反射干渉顕微鏡の光学系Ａ８を更に備えていてもよい。

試料台Ａ４は、例えば、中央に光を透過可能な光透過部Ａ４１を備えるとともに、上向き面に測定試料Ｓを載置可能な載置面Ａ４２を有する略板状のものである。載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で上方から光を照射することにより、測定試料Ｓを透過した光（被測定光Ｈ１）が光透過部Ａ４１を透過して対物レンズＡ５に向かうようにしている。なお、光透過部Ａ４１は、例えばガラス等の光を透過可能な部材より形成したものであってもよいし、単なる孔であってもよい。対物レンズＡ５は、例えば、操作部（図示しない）の操作に基づいて、入射してくる被測定光Ｈ１をその操作に係る所定の倍率で拡大させて平行光として出射するものである。反射部Ａ６は、例えば全反射型のミラーであって、対物レンズＡ５からの被測定光Ｈ１を全反射させて光干渉部Ａ７に導入できるようにしている。光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、この光分離素子Ａ７１が出射する被測定光Ｈ１（Ｈ１ａ、Ｈ１ｂ）を収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５とを具備するものである。ここで、光分離素子Ａ７１は、回折格子を用いて構成したものである。さらには、光分離素子Ａ７１は、偏光方向が互いに異なる２つの光に分離する偏光分離素子であってもよい。その場合、光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、偏光方向が互いに異なる２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４と、この空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４と、この半波長板Ａ７４により偏光方向を揃えられた物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５と、を具備するものである。もしくは、空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４に代えて偏光子を配して物体光Ｈ３と参照光Ｈ４の偏光方向を揃えてもよい。

（反射干渉顕微鏡）
反射干渉顕微鏡の光学系Ａ８は、載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で下方から光を照射することにより、測定試料Ｓで反射した光（被測定光Ｈ１）を測定する。反射干渉顕微鏡の光学系は、光の入射側に、光源（図示せず）からの照射光（レーザ光）を導く光ファイバＢ２の出射側端面Ｂ３に臨ませたバンドパスフィルタＡ８４及び開口スリットＡ８３と、このバンドパスフィルタＡ８４及び開口スリットＡ８３を透過する照射光を反射する反射部Ａ８１（例えば、ビームスプリッタ）を具備する。光源は、白色ＬＥＤ等で構成される。一方、反射干渉顕微鏡の光学系の光の出射側には、対物レンズＡ５及び反射部Ａ８１からの被測定光Ｈ１を反射させて集光レンズＡ８５に導く、反射部Ａ８２（例えば、ダイクロイックミラー）と、集光レンズＡ８５で収束された被測定光を撮像して画像とするＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃ１が設けられる。

（分化判定装置）
分化判定装置Ｄの構成について説明する。図３は、一実施形態に係る分化判定装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図であり、図４は、一実施形態に係る分化判定装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。

図３に示すように、分化判定装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵＤ１１、ＲＯＭＤ１２及びＲＡＭＤ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、例えば撮像装置Ｃ等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７などを含む通常のコンピュータとして構成される。後述する分化判定装置Ｄの各機能は、ＣＰＵＤ１１、ＲＯＭＤ１２、ＲＡＭＤ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵＤ１１の制御の下で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させるとともに、主記憶装置Ｄ１２及びＤ１３、並びに補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。

図４に示すように、分化判定装置Ｄは、機能的構成要素として、取得手段Ｄ１、算出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５を備える。

取得手段Ｄ１は、撮像装置Ｃで撮影した定量位相顕微鏡像から細胞の細胞厚さデータ（光路長データ）を取得するものである。取得手段Ｄ１はまた、定量位相顕微鏡像を撮像した時点の分化誘導後の経過時間データを取得する。経過時間データは、撮像装置Ｃから取得してもよいし、入力デバイスＤ１４等から入力された経過時間データを主記憶装置Ｄ１２若しくはＤ１３、又は補助記憶装置Ｄ１７等から取得してもよい。取得手段Ｄ１はまた、撮像装置Ｃ１で撮影した反射干渉顕微鏡像データ又はこれを二値化したデータを取得するものとしても機能する。算出手段Ｄ２は、取得した複数の経過時間データ及び細胞厚さデータから、上述の細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出するものである。比較手段Ｄ３は、算出した指標を閾値と比較するものである。閾値は、分化判定装置Ｄの補助記憶装置Ｄ１７等に予め格納されているものを読み出してもよい。判定手段Ｄ４は、比較した結果に基づき、目的細胞へ分化したか否かを判定するものである。表示手段Ｄ５は、判定した結果を表示するものである。

〔分化判定プログラム〕
分化判定プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段Ｄ１、算出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５として機能させるものである。コンピュータに分化判定プログラムを読み込ませることにより、コンピュータは分化判定装置Ｄとして動作する。分化判定プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。

（分化判定方法）
分化判定装置Ｄにより行われる分化判定方法について説明する。図５は分化判定方法のフローチャートである。分化判定装置Ｄにより行われる分化判定方法により、幹細胞が目的細胞に分化したか否かの判定を定量的且つ自動的に精度高く行うことができる。

［取得ステップＳ１］
最初に、取得手段Ｄ１が撮像装置Ｃから細胞の光路長データ、及び光路長データを撮像した時点の分化誘導後の経過時間データを取得する。経過時間データは、主記憶装置Ｄ１２若しくはＤ１３、又は補助記憶装置Ｄ１７等から取得してもよい。細胞の細胞厚さが、例えば、細胞コロニーの一部領域又は全体の平均細胞厚さ（単位面積あたりの細胞厚さ）である場合、光路長データを取得した細胞コロニーの反射干渉顕微鏡像を取得手段Ｄ１により取得してもよい。

［算出ステップＳ２］
次に、算出手段Ｄ２が取得した複数の経過時間データ及び細胞厚さデータから、細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出する。細胞の細胞厚さが、例えば、細胞コロニーの一部領域又は全体の平均細胞厚さ（単位面積あたりの細胞厚さ）である場合、光路長データを取得した細胞コロニーの反射干渉顕微鏡像から細胞面積（例えば、細胞コロニー面積）を算出することを含んでもよい。

［比較ステップＳ３］
次に、比較手段Ｄ３が、算出ステップＳ２にて算出した指標と閾値を比較し、その結果を抽出する。比較手段Ｄ３は、補助記憶装置Ｄ１７等に予め格納されている閾値を読み出すことを含んでもよい。

［判定ステップＳ４］
次に、判定手段Ｄ４が、比較ステップＳ３にて抽出した比較の結果に基づき、目的細胞へ分化したか否かを判定する。判定手段Ｄ４は、比較ステップＳ３の比較の結果に基づいて、以下のように判定する。
例えば、指標が、式（１）で表される細胞厚さの変化率、又は式（２）で表される細胞厚さの傾きである場合：
（ｉ）指標の絶対値が閾値の絶対値以上である場合、幹細胞が目的細胞へ分化したと判定する、又は
（ｉｉ）指標の絶対値が閾値の絶対値未満である場合、幹細胞は目的細胞へ分化していないと判定する。

［表示ステップＳ５］
次に、表示手段Ｄ５が、判定ステップＳ４にて判定した結果を表示する。例えば、幹細胞が目的細胞へ分化した、又は幹細胞が目的細胞へ分化していないことが表示手段Ｄ５によって表示される。

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
（ＥＳ細胞の分化誘導培養）
ヒト多能性幹細胞として、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株及びＫｈＥＳ－３株）を使用した。フィーダー細胞上で培養したヒト多能性幹細胞を細胞剥離液（ＣＴＫ溶液）でディッシュから剥離させ、セルストレーナーでコロニーを回収した。回収したコロニーのサイズは４０～１００μｍ程度であった。ポリ－Ｌ－リシン及びラミニン（ＰＬＬ／ＬＭ）をコートしたディッシュに分化誘導培地を添加し、回収したコロニーを播種して約１０日間培養した。分化誘導培地は、Ｎ２Ｂ２７培地（Ｎ２添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＢ２７添加Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍを１：１で混合したもの）に１００ｎＭＬＤＮ１９３１８９（４－［６－［４－（１－ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン二塩酸塩）及び１μＭＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド）を加えたものである。ＬＤＮ１９３１８９は、ＡＬＫ２及びＡＬＫ３阻害物質であり、多能性幹細胞からの神経細胞誘導作用を有する。ＳＢ４３１５４２は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７阻害物質であり、多能性幹細胞の分化を促進する作用を有する。ディッシュは、反射干渉顕微鏡の画像を取得しやすくするために、反射防止コーティングされたディッシュを用いた。

（定量位相顕微鏡画像の取得）
播種後２日目～６日目に１２時間ごとに定量位相顕微鏡と反射干渉顕微鏡を用いてコロニーを撮像し、コロニーの定量位相顕微鏡画像及び反射干渉顕微鏡画像を取得した（各時点ｎ＝４）。各時点における反射干渉顕微鏡画像から、ＩｍａｇｅＪを用いてコロニー領域を抽出した。図６は、取得した反射干渉顕微鏡画像の一例を示す図である。図７は、図５の反射干渉顕微鏡画像から抽出したコロニー領域を示す図である。図８は、取得した定量位相顕微鏡画像の一例を示す図である。図８の定量位相顕微鏡画像には、反射干渉顕微鏡画像から抽出したコロニー領域の輪郭線が重ね合わされている。

（免疫染色による確認）
定量位相顕微鏡画像と反射干渉顕微鏡画像を取得後、コロニーを４％パラホルムアルデヒドで固定し、未分化マーカーであるＮａｎｏｇと神経外胚葉マーカーであるＰａｘ６の免疫染色を行った（各時点ｎ＝４）。染色には、抗Ｎａｎｏｇ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及び抗Ｐａｘ６抗体（ミリポア社製）を使用し、各マーカーの蛍光画像を取得した。

（解析及び結果）
定量位相顕微鏡画像から、各時点での平均光学的厚さ（ＡｖｅｒａｇｅＯＰＤ）を求めた。「光学的厚さ」（単位：ｎｍ）は、「細胞の屈折率と細胞外の屈折率の差（屈折率差）」に「物理的厚さ（物理長）」を乗じたものである。実施例１における「平均光学的厚さ」は、抽出したコロニー領域の全領域（領域Ｓ）に亘り光学的厚さＯＰＤ（ｘ，ｙ）を面積分した値を、抽出したコロニー領域の面積（単位：μｍ^２）で除したものである（式（３））。

「平均光学的厚さ」を計算するにあたっては、抽出したコロニー領域の全領域に亘るデジタル画像における光学的厚さの総和を、抽出したコロニー領域のピクセル数（単位：ピクセル）で除したものを用いることができる。光学的厚さ分布を表すデジタル画像ＯＰＤ（ｍ，ｎ）が与えられ、ｍ，ｎは１≦ｍ≦Ｍ，１≦ｎ≦Ｎの整数であり、Ｍ，Ｎはｍ，ｎそれぞれの最大値であるとする。また、コロニー領域の全領域を表すデジタル画像Ｓも同時に与えられたとする。このとき、デジタル画像の１ピクセルに対応する長さをｌ_０とすると、ＯＰＤ（ｘ，ｙ）の領域Ｓ内での面積分は、式（４）：

として計算され、また領域Ｓの面積は、（領域Ｓに含まれるピクセル数）×ｌ_０ ^２と計算される。したがって、ＯＰＤの平均値は、式（５）：

となる。分母と分子の両方に×ｌ_０ ^２があるので打ち消しあって、式（６）：

となる。このようにして、デジタル画像に対して特定の領域における「平均光学的厚さ」を計算することができた。

蛍光画像から、各時点での、抽出したコロニー領域内の核領域における各マーカー（Ｎａｎｏｇ及びＰａｘ６）の輝度値を求めた。

図９（Ａ）は、ＫｈＥＳ－１株の平均光学的厚さの測定結果を示すグラフである。図９（Ｂ）は、ＫｈＥＳ－１株の各マーカーの発現の測定結果を示すグラフである。図９（Ｃ）は、ＫｈＥＳ－３株の平均光学的厚さの測定結果を示すグラフである。図９（Ｄ）は、ＫｈＥＳ－３株の各マーカーの発現の測定結果を示すグラフである。ＫｈＥＳ－１株及びＫｈＥＳ－３株のいずれも、未分化マーカー（Ｎａｎｏｇ）の消失、神経外胚葉マーカー（Ｐａｘ６）の発現時期と、コロニーの平均光学的厚さが上昇した時点が一致した。この結果から、コロニーの平均光学的厚さの上昇（経時変化）を指標として、多能性幹細胞から目的細胞への分化を判断できると考えられる。

〔実施例２：指標〕
実施例１と同様にして、各時点での平均光学的厚さ（ＡｖｅｒａｇｅＯＰＤ）を求めた。求めた平均光学的厚さから、平均光学的厚さの１日あたり変化率（Ｒａｔｅｏｆｃｈａｎｇｅ）、及び平均光学的厚さの傾き（Ｓｌｏｐｅ）を算出した。「１日あたり変化率」は、「（ある時間での平均光学的厚さ／ある時間の１つ前の時間での平均光学的厚さ）＾｛２４／（ある時間－ある時間の１つ前の時間）｝」（記号「＾」はべき乗を示す。）により算出した値である。「傾き」は、「２４×（ある時間の平均光学的厚さ－１つ前の時間での平均光学的厚さ）／（ある時間－ある時間の１つ前の時間）」により算出した値である。

図１０（Ａ）は、平均光学的厚さの１日あたり変化率を示すグラフである。図１０（Ｂ）は、平均光学的厚さの傾きを示すグラフである。図１０に示すとおり、コロニーの平均光学的厚さの経時変化を示す指標として、平均光学的厚さの１日あたり変化率、及び平均光学的厚さの傾きを採用できることが分かる。また、図１０に示す例では、平均光学的厚さの１日あたり変化率を指標とする場合、例えば、２．５倍／日を超えるか否かで目的細胞への分化を判断できる。同様に、図１０に示す例では、平均光学的厚さの傾きを指標とする場合、例えば、１００ｎｍ／日を超えるか否かで目的細胞への分化を判断できる。

〔実施例３：解析領域〕
実施例１と同様にして、定量位相顕微鏡画像を取得した。定量位相顕微鏡画像から、各時点の光学的厚さの最高点を抽出した（光学的厚さ最高点）。次いで、光学的厚さ最高点の周囲２５×２５ピクセルの範囲の平均光学的厚さ（当該範囲内の光学的厚さを積算した値を当該範囲の面積で除したもの）を各時点で求めた。

図１１（Ａ）は、光学的厚さ最高点の光学的厚さの１日あたり変化率を示すグラフである。図１１（Ｂ）は、光学的厚さ最高点の周囲２５×２５ピクセルの範囲の平均光学的厚さの１日あたり変化率を示すグラフである。１日あたり変化率は、実施例２と同様にして算出したものである。図１１に示すとおり、コロニー全領域に亘る平均光学的厚さのみならず、コロニーの一部領域（光学的厚さ最高点、又は光学的厚さ最高点を含む領域）における（平均）光学的厚さを使用した場合でも、（平均）光学的厚さの上昇（経時変化）を指標として、多能性幹細胞から目的細胞への分化を判断できる。

１…サイトメーター、Ａ…顕微鏡システム、Ａ１…顕微鏡本体、Ｂ…光ファイバ、Ｃ…撮像装置、Ｄ…分化判定装置、Ｄ１…取得手段、Ｄ２…算出手段、Ｄ３…比較手段、Ｄ４…判定手段、Ｄ５…表示手段。

Claims

幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する方法であって、
幹細胞の目的細胞への分化を誘導する誘導工程と、
分化誘導開始から１～７日後の細胞の細胞厚さの経時変化に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する判定工程を備える、方法。
前記判定工程は、式（１）で表される細胞厚さの１日あたり変化率に基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する工程である、請求項１に記載の方法。

［式（１）中、記号「＾」はべき乗を示し、ｔ１≠ｔ２である。］
前記判定工程は、式（２）で表される細胞厚さの傾きに基づいて、目的細胞へ分化したか否かを判定する工程である、請求項１に記載の方法。
細胞厚さの傾き＝２４×（ｔ１時間後の細胞厚さ－ｔ２時間後の細胞厚さ）／（ｔ１－ｔ２）…（２）
［式（２）中、ｔ１≠ｔ２である。］
前記細胞厚さは、細胞コロニーの一部又は全体の平均細胞厚さである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞厚さは、光学的厚さである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
幹細胞が目的細胞に分化したか否かを判定する分化判定装置であって、
分化誘導開始から１～７日後の経過時間データ、及びその時点における細胞の細胞厚さデータを取得する取得手段と、
取得した複数の経過時間データ及び細胞厚さデータから、細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出する算出手段と、
算出した指標を閾値と比較する比較手段と、
比較した結果に基づき、目的細胞へ分化した、又は目的細胞へ分化していないと判定する判定手段と、
を備える、分化判定装置。
細胞の反射干渉顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段を更に備える、請求項７に記載の分化判定装置。
コンピュータを、
分化誘導開始から１～７日後の経過時間データ、及びその時点における細胞の細胞厚さデータを取得する取得手段、
取得した複数の経過時間データ及び細胞厚さデータから、細胞の細胞厚さの経時変化と相関する指標を算出する算出手段、
算出した指標を閾値と比較する比較手段、及び
比較した結果に基づき、目的細胞へ分化した、又は目的細胞へ分化していないと判定する判定手段、
として機能させるための分化判定プログラム。
前記コンピュータを、細胞の反射干渉顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段として更に機能させることを含む、請求項９に記載の分化判定プログラム。
請求項９又は１０に記載の分化判定プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。