JP2022173309A - 増殖予測方法、増殖予測装置およびプログラム - Google Patents
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Abstract
Description
本願の発明者らは、細胞培養実験を繰り返すことにより、間葉系幹細胞を培養する場合、培養を開始してから5日目の細胞の形態情報と、培養を開始してから15日目の細胞の増殖度合いと、の間に強い相関があることを確認した。そこで、発明者らは、上記知見を応用し、第1時点の細胞の形態情報に基づいて、第1時点よりも後の第2時点に所望の量の細胞が得られるか否かを判定する予測手法を開発した。
まず、細胞の増殖度合いを予測するための判別式の決定方法について説明する。判別式とは、第1時点における細胞群(コロニー)の形態情報が特定された際に、第1時点よりも後の第2時点に細胞が所望の量に増殖しているか否かを予測するための判断基準のことである。判別式は、例えば、培養を開始して5日目(96時間経過してから24時間以内)の間葉系幹細胞の形態情報と培養を開始して15日目(336時間経過してから24時間以内)の間葉系幹細胞の個数情報とに基づいて算出される。
上述したとおり、第1時点において、間葉系幹細胞の細胞群であるコロニーごとに間葉系幹細胞の形態情報に基づいて指標が算出される。また、計測する細胞の形態情報としては、間葉系幹細胞の長さを表す長さパラメータおよび間葉系幹細胞の密度を表す密度パラメータがあった。以下に、長さパラメータおよび密度パラメータの算出方法を詳細に説明する。
図3は、細胞の平均的な長さが異なるコロニーを複数示す図である。図3に示すように、培養途中の細胞の長さは、均一でなく、まちまちである。本願の発明者らは、細胞の長さが一定水準よりも短いものの割合が高いと、その後の細胞の増殖度合いが高いことを見出した。そこで、コロニーに含まれる細胞の長さの目安となる長さパラメータを将来の細胞の増殖度合いを予測するための指標とし、以下のように算出することとした。
長軸の長さ=2×√2×√{M0,2+M2,0+√[(M0,2-M2,0)2+4×M1,1 2]}×A ここで、M2,0、 M0,2、 M1,1 、Aはそれぞれ、画像X方向の二次モーメント、画像Y方向の二次モーメント、相乗モーメント、画像解像度により求められる数値、であり、以下の式で算出する。
M2,0 = Σ(x-x’)2÷N+(1÷12)
M0,2 = Σ(y-y’)2÷N+(1÷12)
M1,1 = Σ{(x-x’)×(y-y’)}÷N+(1÷12)
なお、細胞領域とは、細胞が写った位相差画像をフィルタ処理した後、さらに画像を2値化して得られる2値化画像において、白い画素で表される一つ一つの閉領域のことである(2値化画像において黒い画素はバックグラウンド)。
x、yは細胞領域に含まれるピクセルの座標を示す。
x’、y’は細胞領域に含まれるピクセルの重心位置の座標を示す。
Nは細胞領域に含まれるピクセル数を示す。
Aは、画像の1ピクセルに対応する実際の長さである。例えば、対象とする画像が1ピクセル=4μmである場合、A=4となる。
図5は、細胞の平均的な密度が異なるコロニーを複数示す図である。図5に示すように、培養途中の細胞の密度は、均一でなく、まちまちである。本願の発明者らは、増殖中の細胞群は、細胞の密度と増殖率とに相関があることを見出した。したがって、発明者らは細胞の密度を培養状態の評価指標として求めることにより、増殖率を精度よく予測できると考えた。本実施形態では、一つの細胞の周辺にどれぐらいの数の細胞(周辺細胞)が位置するかを密度の基準とする。このようにすると、コロニー全体の大きさと関係なく密度パラメータの値が定まるため、細胞の密集度合いを適切に反映し、細胞の増殖度合いを予測するのに良好な指標となる。
[増殖予測装置の構成]
図8は、実施例1の増殖予測装置1の構成を概略的に示す図である。増殖予測装置1は、記録部2と制御部3と表示部4と顕微鏡5とを備える。顕微鏡5は、例えば、撮影部6を有する倒立顕微鏡であり、培養中の細胞を撮影して画像を制御部3へ送信することができる。また、顕微鏡5が有するステージは、増殖予測装置1からの指示信号によって制御されることができ、撮影部6は複数の位置から培養中の細胞を撮影することができる。
図9は、実施例1の増殖予測装置1が実行する処理のフローを示すフローチャートである。処理のフローの各ステップにおける増殖予測装置1の動作は以下のとおりである。
取得部31が培養している細胞の画像を顕微鏡5から取得し続け、算出部32が各細胞にコロニーIDを付与する。
算出部32が、取得部31が第1時点において取得した画像を用いて、第1時点の間葉系幹細胞の培養状態に基づいて、間葉系幹細胞の将来の増殖状態を予測するための指標をコロニーごとに算出する。また、算出部32が第1時点における各コロニーに含まれる細胞の個数をカウントする。
予測部33が、算出部32が算出した指標と細胞の個数と予め決定しておいた判別式とに基づいて、上記第1時点よりも後の第2時点の間葉系幹細胞の増殖状態をコロニーごとに予測する。
実施例1に係る増殖予測装置1では、算出部32は各コロニーの長さパラメータを決定し、予測部33は、各コロニーの細胞の個数と長さパラメータとに基づいて、将来の細胞の増殖度合いを予測した。これに対して、実施例2に係る増殖予測装置1では、算出部32は各コロニーの密度パラメータを決定し、予測部33は、各コロニーの細胞の個数と密度パラメータとに基づいて、将来の細胞の増殖度合いを予測する。
実施例1および2の説明において、増殖予測装置1は、予め決定された判別式を用いて将来の細胞の増殖度合いを決定した。増殖予測装置1は、判別式を決定する判別式決定部をさらに有してもよい。判別式決定部は、例えば、[判別式]の欄で説明したのと同様の手順で判別式を決定する。
本開示の予測手法を支持する実験例を以下に記述する。
実験では、人口膝関節置換術時に採取した滑膜組織を培養することとした。まず、滑膜組織をcollagenase処理し、得られた1000個の有核細胞を6 well plateに播種した。滑膜組織を6 well plateに3時間かけて接着させ、増殖培地(αMEM, 10%FBS, 1% Antibiotic)を交換し、タイムラプス顕微鏡を用いて経過を観察した。タイムラプス顕微鏡においては、6時間ごとに14日間継続的に滑膜組織の培養状態を撮影し続け、計50万枚の画像を得た。
上記の説明では、同一の間葉系幹細胞を起源とする間葉系幹細胞の集合を一つのコロニーとして定義した。このコロニーの定義の場合、培養開始後から細胞の分裂をトラッキングし続ける必要がある。以下に、単一時点における画像に基づいてコロニーを定義する方法を説明する。
上記の説明では、第1時点の細胞の個数と長さパラメータと第2時点の細胞の個数との組み合わせの集合、または、第1時点の細胞の個数と密度パラメータと第2時点の細胞の個数との組み合わせの集合を用いて、判別式を決定した。
Claims (9)
- 第1時点の間葉系幹細胞の培養状態に基づいて、前記間葉系幹細胞の将来の増殖状態を予測するための指標を算出する算出ステップと、
前記第1時点よりも後の第2時点において前記間葉系幹細胞の増殖状態が基準値に達していると予測されるか否かを判別するために用いる判別式を決定するステップと、
前記指標と前記判別式とに基づいて、前記第2時点の前記間葉系幹細胞の増殖状態を予測する予測ステップと、
を含み、
前記指標は、前記間葉系幹細胞の細胞群であるコロニーごとに前記間葉系幹細胞の形態情報に基づいて算出され、
前記指標は、前記コロニー内における前記間葉系幹細胞の密度を表す密度パラメータに基づいて算出され、
前記判別式を決定するステップにおいては、前記第1時点において各前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の個数と前記第1時点において各前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の密度をプロットしたプロット空間上において、前記第2時点において前記基準値を充足すると予測されるものと充足しないと予測されるものへ各前記コロニーを区分する境界面を定義する数式を特定することにより、前記判別式を決定し、
前記判別式を決定するステップにおいては、前記第1時点における前記プロットのうち前記第2時点において前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の個数が前記基準値以上であるものと前記基準値未満であるもののうち少なくともいずれかをラベルづけすることにより、前記数式を特定する
増殖予測方法。 - 前記形態情報は、前記間葉系幹細胞の長さを表す長さパラメータである、
請求項1に記載の増殖予測方法。 - 前記長さパラメータは、前記コロニーに含まれる前記間葉系幹細胞の個数に対する、長軸が所定の長さ以下の前記間葉系幹細胞の個数として算出される、
請求項2に記載の増殖予測方法。 - 前記所定の長さは、60マイクロメートルである、
請求項3に記載の増殖予測方法。 - 前記コロニーは、同一の前記間葉系幹細胞を起源とする間葉系幹細胞の集合である、
請求項1に記載の増殖予測方法。 - 前記判別式は、培養を開始して96時間経過してから24時間以内の前記間葉系幹細胞の形態情報と前記培養を開始して336時間経過してから24時間以内の前記間葉系幹細胞の個数情報とに基づいて算出される、
請求項1に記載の増殖予測方法。 - 前記第1時点は、培養を開始して96時間経過してから24時間以内の何れかの時点であり、
前記第2時点は、培養を開始して336時間経過してから24時間以内の何れかの時点である、
請求項1に記載の増殖予測方法。 - 培養している細胞の画像を取得する取得部と、
前記画像に写った、第1時点の間葉系幹細胞の培養状態に基づいて、前記間葉系幹細胞の将来の増殖状態を予測するための指標を算出する算出部と、
前記第1時点よりも後の第2時点において前記間葉系幹細胞の増殖状態が基準値に達していると予測されるか否かを判別するために用いる判別式を決定する判別式決定部と、
前記指標と前記判別式とに基づいて、前記第2時点の前記間葉系幹細胞の増殖状態を予測する予測部と、
を備え、
前記指標は、前記間葉系幹細胞の細胞群であるコロニーごとに前記間葉系幹細胞の形態情報に基づいて算出され、
前記指標は、前記コロニー内における前記間葉系幹細胞の密度を表す密度パラメータに基づいて算出され、
前記判別式決定部は、前記第1時点において各前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の個数と前記第1時点において各前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の密度をプロットしたプロット空間上において、前記第2時点において前記基準値を充足すると予測されるものと充足しないと予測されるものへ各前記コロニーを区分する境界面を定義する数式を特定することにより、前記判別式を決定し、
前記判別式決定部は、前記第1時点における前記プロットのうち前記第2時点において前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の個数が前記基準値以上であるものと前記基準値未満であるもののうち少なくともいずれかをラベルづけすることにより、前記数式を特定する
増殖予測装置。 - 培養している細胞の画像を取得する取得ステップと、
前記画像に写った、第1時点の間葉系幹細胞の培養状態に基づいて、前記間葉系幹細胞の将来の増殖状態を予測するための指標を算出する算出ステップと、
前記第1時点よりも後の第2時点において前記間葉系幹細胞の増殖状態が基準値に達していると予測されるか否かを判別するために用いる判別式を決定するステップと、
前記指標と前記判別式とに基づいて、前記第2時点の前記間葉系幹細胞の増殖状態を予測する予測ステップと、
をコンピュータに実行させ、
前記指標は、前記間葉系幹細胞の細胞群であるコロニーごとに前記間葉系幹細胞の形態情報に基づいて算出され、
前記指標は、前記コロニー内における前記間葉系幹細胞の密度を表す密度パラメータに基づいて算出され、
前記判別式を決定するステップにおいては、前記コンピュータに、
前記第1時点において各前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の個数と前記第1時点において各前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の密度をプロットしたプロット空間上において、前記第2時点において前記基準値を充足すると予測されるものと充足しないと予測されるものへ各前記コロニーを区分する境界面を定義する数式を特定することにより、前記判別式を決定するステップを実行させ、
前記判別式を決定するステップにおいては、前記コンピュータに、前記第1時点における前記プロットのうち前記第2時点において前記コロニーが有する前記間葉系幹細胞の個数が前記基準値以上であるものと前記基準値未満であるもののうち少なくともいずれかをラベルづけすることにより、前記数式を特定するステップを実行させる、
プログラム。
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