JP2016158577A - 細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】撮像画像内に含まれる複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる細胞群検出装置および方法並びにプログラムを提供する。
【解決手段】複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部２０と、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部２１と、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部２２とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、撮像画像内に含まれる細胞コロニーを検出する細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラムに関するものである。

近年、再生医療の分野において、造血幹細胞、ＥＳ(embryonic stem)細胞、ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞、および分化誘導された細胞などを培養して顕微鏡で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の状態を評価する方法が提案されている。

具体的には、たとえば培養された細胞コロニーに対して薬剤を添加し、その細胞コロニーの状態や細胞コロニーの数の増減を観察することによって薬効試験または毒性試験を行ったり、もしくは細胞コロニーの大きさの変化を観察することによって細胞群の成長度を評価したりすることが行われている。

ここで、上述したような細胞コロニーの状態や数を観察して評価を行う際には、細胞コロニーを正確に把握することが重要である。

特開２０１４−０３９５１８号公報 特開２０１１−０２４４８５号公報 特表２００５−５００８０９号公報

ここで、癌細胞やｉＰＳ細胞など細胞は主に平面培養され、仮足により培養容器や足場材に接着した状態で増殖して細胞コロニーを形成するため、細胞コロニーが分割されることは稀である。しかしながら，血球前駆細胞などの一部細胞では浮遊培養を行うため、細胞が仮足によって固定されない。そのため、同一の細胞由来である細胞コロニーが形成途中で分割され、サブコロニーを形成してしまうことがある。

このようにサブコロニーが形成されると、たとえば細胞コロニーの数を計測して評価を行う際、サブコロニーを１つの細胞コロニーとして計測する場合があり、正確な評価を行うことができない。

そこで、たとえば特許文献１には、複数のサブコロニー間の距離および複数のサブコロニーの色成分に基づいて、それらのサブコロニーが同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定する方法が提案されている。

しかしながら、特許文献１に記載の方法のように、サブコロニーの色成分によって判定を行ったのでは、たとえば細胞の種類が特定の色を示さないような細胞である場合には、正確に判定することができない。

なお、特許文献２には、細胞コロニーの領域を検出する際、一部の領域が途切れて検出された場合には、その一部の領域との距離が閾値以下である領域を同一の領域とすることが開示されているが、複数のサブコロニーが同一の細胞コロニーに属するものか否かの判定方法については何も提案されていない。また、特許文献３には、細胞コロニーの色成分に基づいて細胞コロニーの種類を決定することが開示されているが、特許文献３にも、複数のサブコロニーが同一の細胞コロニーに属するものか否かの判定方法については何も提案されていない。

本発明は、上記の事情に鑑み、撮像画像内に含まれる複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる細胞群検出装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。

本発明の細胞コロニー検出装置は、複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部と、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部と、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部とを備えたことを特徴とする。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、複数の細胞群の間の距離が予め設定された距離閾値以下であり、かつ複数の細胞群の成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであると判定することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の培養期間に応じて距離閾値および成熟度閾値の少なくとも１つを変更することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の成長因子の種類または量に応じて距離閾値および成熟度閾値の少なくとも１つを変更することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群の成熟度の差の線形和もしくは非線形和が閾値以下である場合に、同一の細胞コロニーに属するものであると判定することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の培養期間に応じて上記閾値を変更することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の成長因子の種類または量に応じて上記閾値を変更することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞が、造血幹細胞由来の細胞である場合、細胞群統合部は、細胞群の画像の赤色と青色の比率を成熟度として取得することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞が、ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞またはＥＳ(embryonic stem)細胞である場合、細胞群統合部は、細胞群の分化度または未分化度を成熟度として取得することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、分化度または未分化度を示す特徴量として細胞群の細胞密度または平均核細胞質比を取得することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、複数の細胞の中に複数種類の細胞が含まれる場合、複数の細胞群が同じ種類の細胞の細胞群であるか否かを判定し、その判定結果と複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に応じて、複数の細胞群が同一細胞コロニーに属するものであるか否かを判定することができる。

また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞群の画像の赤色と青色の比率に基づいて、細胞群の種類を判定することができる。

また、細胞群統合部による細胞コロニーの検出結果を出力する出力部を備えることができる。

本発明の細胞コロニー検出方法は、複数の細胞を撮像した撮像画像を取得し、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出し、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出することを特徴とする。

本発明の細胞コロニー検出プログラムは、複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部と、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部と、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する統合部としてコンピュータを機能させることを特徴とする。

本発明の細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラムによれば、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出し、その複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、その複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出するようにしたので、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる。

本発明の細胞コロニー検出装置の一実施形態を用いた細胞コロニー観察システムの概略構成を示すブロック図 細胞群間の距離の計測を説明するための図 細胞群間の距離および成熟度の差の閾値判定方法を説明するための図 細胞群間の距離および成熟度の差の線形和に基づく判定方法を説明するための図 細胞群間の距離および成熟度の差の非線形和に基づく判定方法を説明するための図 細胞コロニーの検出結果の一例を示す図 本発明の細胞コロニー検出装置の一実施形態を用いた細胞コロニー観察システムの作用を説明するためのフローチャート 赤芽球系の細胞と骨髄芽球系の細胞が共培養された場合の判定方法を説明するための図 細胞群の輪郭が不明瞭な撮像画像の一例を示す図 撮像画像から検出された細胞画素の一例を示す図 細胞画素密度の算出方法を説明するための図 細胞画素毎に設定されたカーネル関数とそのカーネル関数に基づいて算出された確率密度関数の一例を示す模式図 撮像画像内における複数の細胞画素をミーンシフト法によってクラスタリングした結果を模式的に示す図

以下、本発明の細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた細胞コロニー観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の細胞コロニー観察システムの概略構成を示すブロック図である。

本実施形態の細胞コロニー観察システムは、図１に示すように、顕微鏡装置１と、細胞コロニー検出装置２と、表示装置３と、入力装置４とを備えている。

顕微鏡装置１は、培養容器内で培養された複数の細胞からなる細胞群の画像を撮像するものである。顕微鏡装置１としては、位相差顕微鏡装置、明視野顕微鏡装置、微分干渉顕微鏡装置および蛍光観察顕微鏡装置などを用いることができる。顕微鏡装置１は、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子を備えており、撮像素子によって撮像された撮像画像は細胞コロニー検出装置２に入力される。

撮像対象の細胞としては、たとえば骨髄および臍帯血に含まれ、浮遊培養される造血幹細胞および血球前駆細胞などがある。ただし、これらに限らず、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などでもよい。

細胞コロニー検出装置２は、入力された撮像画像に含まれる細胞コロニーを検出するものであり、コンピュータに対して本発明の細胞コロニー検出プログラムの一実施形態がインストールされたものである。

細胞コロニー検出装置２は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞コロニー検出プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような細胞画像取得部２０、細胞群検出部２１、細胞群統合部２２および表示制御部２３が動作する。細胞コロニー検出プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ（Compact Disc Read Only Memory）等の記録媒体に記憶されたものでもよいし、インターネット等のネットワークを介して配布されたものでもよい。

細胞画像取得部２０は、顕微鏡装置１によって撮像された細胞群の撮像画像を取得して記憶するものである。本実施形態においては、細胞群の外形および色の特徴などが判別できれば良いので、顕微鏡装置１の光学倍率を等倍〜４倍程度として撮像された細胞画像を取得する。

細胞群検出部２１は、撮像画像内に含まれる個々の細胞群を検出するものである。本実施形態において検出される細胞群には、本来、１つの細胞コロニーとして成長すべき細胞群であるが、細胞コロニーの形成途中で分割されてしまった複数の細胞群が含まれる。細胞群は、細胞コロニーよりも小さい単位の細胞群であって、サブコロニーともいう。

細胞群検出部２１は、たとえば、撮像画像を２値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞群を自動的に検出するものである。また、細胞群の検出方法については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。また、たとえば細胞群を形成する細胞が１つにまとまらずに散在しているような場合には、カーネル密度推定を用いた方法で細胞群を検出することが有効である。なお、カーネル密度推定を用いた方法については、後で詳述する。

また、細胞群検出部２１は、上述したように細胞群を撮像画像から自動的に検出するのではなく、たとえば表示装置３に表示された撮像画像上において、ユーザがマウスなどの入力装置４を用いて細胞群を指定した信号を取得することによって細胞群を検出するようにしてもよい。

細胞群統合部２２は、細胞群検出部２１によって検出された複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、その複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、その複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出するものである。

具体的には、たとえば図２に示すように撮像画像Ｐ内に、細胞群ＳＣ１〜ＳＣ５が存在する場合、細胞群統合部２２は、細胞群ＳＣ１〜ＳＣ５のそれぞれについて、他の細胞群との距離を計測する。図２では、細胞群ＳＣ１と細胞群ＳＣ２との距離Ｄ１、細胞群ＳＣ２と細胞群ＳＣ４との距離Ｄ２、細胞群ＳＣ４と細胞群ＳＣ３との距離Ｄ３、および細胞群ＳＣ３と細胞群ＳＣ５との距離Ｄ４を示している。

ただし、実際は、たとえば細胞群ＳＣ１については、他の全ての細胞群ＳＣ２〜ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ２については、他の全ての細胞群ＳＣ１，ＳＣ３〜ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ３については、他の全ての細胞群ＳＣ１〜ＳＣ２，ＳＣ４〜ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ４については、他の全ての細胞群ＳＣ１〜ＳＣ３，ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ５については、他の全ての細胞群ＳＣ１〜ＳＣ４との距離が計測される。細胞群間の距離は、たとえば２つの細胞群の重心位置間の距離を計測するようにすればよい。ただし、重心位置間の距離に限らず、たとえば２つの細胞群間の最短距離を計測するようにしてもよい。

また、細胞群統合部２２は、撮像画像Ｐ内に存在する細胞群ＳＣ１〜ＳＣ５のそれぞれについて成熟度を算出する。成熟度とは、細胞群の成熟度合いを表す指標である。成熟度としては、たとえば培養対象の細胞群が造血幹細胞由来の細胞であり、赤芽球系の細胞である場合には、各細胞群の画像の平均Ｒ／Ｂ比率を用いることができる。Ｒ／Ｂ比率とは、画像の赤色成分と青色成分の比率である。赤芽球系の細胞は、成熟が進むにつれてヘモグロビンが増加して赤色成分が増加する。したがって、平均Ｒ／Ｂ比率を成熟度として用いることができる。

また、培養対象の細胞群が造血幹細胞由来の細胞であり、最終的に白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球およびマクロファージなど）に成長する骨髄芽球系の細胞である場合には、各細胞群の画像の輝度値を成熟度として用いることができる。骨髄芽球系の細胞は、成熟が進むにつれて積層して暗い画像となる。したがって、輝度値を成熟度として用いることができる。

また、培養対象の細胞群がｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞および分化誘導された細胞など透明な細胞である場合には、各細胞群の分化度または未分化度を成熟度として用いることができる。分化度または未分化度を示す特徴量としては、細胞群の細胞密度または平均核細胞質比を用いることができる。分化度が進むほど細胞が遊走するので細胞密度は小さくなり、平均核細胞質比も小さくなる。逆に、未分化度が高いほど細胞密度は大きくなり、平均核細胞質比も大きくなる。

なお、分化度または未分化度を示す特徴量としては、細胞密度および平均核細胞質比に限らず、たとえば各細胞群に含まれる細胞の数、細胞の移動速度および細胞の移動距離などを用いるようにしてもよい。また、ｉＰＳ細胞などの幹細胞は、成熟度が進行すると密集度が高くなり、さらに幹細胞が積層されて、画像の輝度が次第に高くなる。各細胞群の画像の輝度を成熟度として用いるようにしてもよい。また、成熟度として、各細胞群の形状の特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると細胞群の形状は次第に円形に近づいた後、周辺部分の分化が進行してエッジの複雑度が大きくなる。したがって、細胞群の形状の変化の特徴量を成熟度として用いることができる。なお、成熟度としては、上記に挙げたものに限らず、その他の公知なものを用いることができる。

そして、細胞群統合部２２は、上記のようにして取得した細胞群間の距離と、細胞群間の成熟度の差に基づいて、複数の細胞群が１つの細胞コロニーに属するものであるか否かを判定する。

具体的には、細胞群統合部２２は、細胞群間の距離が予め設定された距離閾値以下であって、かつ細胞群間の成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定し、これらの細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する。すなわち、細胞群間の距離と成熟度の差が、図３に示す斜線の範囲内にある場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定する。

なお、上記距離閾値および成熟度閾値は、細胞群統合部２２に予め記憶されるものであるが、これらの閾値を培養期間に応じて変更するようにしてもよい。すなわち、培養期間が経過すると細胞群の成熟が進み、また細胞群間の距離も大きくなっていくことが考えられるため、培養期間毎に異なる距離閾値および成熟度閾値を記憶しておき、培養期間に応じた距離閾値および成熟度閾値を用いるようにしてもよい。なお、培養期間の情報については、ユーザが入力装置４を用いて設定入力するようにしてもよいし、細胞群統合部２２に培養期間を計測するタイマを設けておき、細胞コロニーの検出処理を行う際に、そのタイマによって計測された培養期間を取得するようにしてもよい。また、距離閾値および成熟度閾値の両方を変更するのではなく、いずれか一方のみを変更するようにしてもよい。

また、細胞群の成熟の進行度は、培養期間だけでなく、成長因子の種類または量に応じて異なる。したがって、細胞群を培養する際に添加する成長因子の種類毎に距離閾値および成熟度閾値を記憶しておき、成長因子の種類に応じた距離閾値および成熟度閾値を用いるようにしてもよい。また、細胞を培養する際に添加する成長因子の量毎に異なる距離閾値および成熟度閾値を記憶しておき、成長因子の量に応じた距離閾値および成熟度閾値を用いるようにしてもよい。なお、成長因子の種類または量の情報については、ユーザが入力装置４を用いて設定入力するようにすればよい。また、距離閾値および成熟度閾値の両方を変更するのではなく、いずれか一方のみを変更するようにしてもよい。

なお、距離閾値および成熟度閾値については、目視による細胞コロニーの検出結果と、細胞群統合部２２による細胞コロニーの検出結果との差が最小となるように事前に取得するようにすればよい。

また、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かの判定方法としては、上記の方法に限らず、たとえば細胞群間の距離と成熟度の差との線形和を算出し、その線形和が予め設定された閾値以下である場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。具体的には、細胞群間の距離と成熟度の差とが、図４に示す線形関数で規定される斜線の範囲に含まれる場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。

また、線形和に限らず、細胞群間の距離と成熟度の差との非線形和を算出し、その非線形和が予め設定された閾値以下である場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。具体的には、細胞群間の距離と成熟度の差とが、図５に示す非線形関数で規定される斜線の範囲に含まれる場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。

また、上述したように細胞群間の距離と成熟度の差の線形和または非線形和に基づいて判定する場合にも、培養期間、成長因子の種類または量に応じて閾値を変更するようにしてもよい。

また、上述した線形関数または非線形関数を、培養期間、成長因子の種類または量に応じて変更するようにしてもよい。さらに、培養する細胞群の細胞の種類に応じて線形関数または非線形関数を変更するようにしてもよい。なお、この場合も、線形関数および非線形関数については、目視による細胞コロニーの検出結果と、細胞群統合部２２による細胞コロニーの検出結果との差が最小となるように事前に取得するようにすればよい。

そして、細胞群統合部２２は、たとえば同一の細胞コロニーに属するものであると判定された複数の細胞群に対して同じ識別情報などを付加することによって統合して１つの細胞コロニーとして検出する。細胞群統合部２２における細胞コロニーの検出結果は、表示制御部２３に出力される。

表示制御部２３は、細胞群統合部２２における細胞コロニーの検出結果を表示装置３に表示させるものである。具体的には、たとえば図６に示すように、１つの細胞コロニーに属する細胞群を点線で囲んだ範囲Ｃ１０，Ｃ２０を撮像画像上に重ねて表示させるものである。なお、本実施形態では、表示制御部２３が、出力部に相当するものである。

また、本実施形態では、上述したように細胞コロニーの検出結果を点線の範囲で表示装置３に表示させるようにしたが、これに限らず、たとえば細胞群統合部２２において、検出された細胞コロニーの数を計測し、表示制御部２３が、その細胞コロニーの数を表示装置３に表示させるようにしてもよい。

入力装置４は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。

次に、本実施形態の細胞群観察システムの作用について、図７に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、顕微鏡装置１によって複数の細胞群の画像が撮像され、その撮像画像が、細胞コロニー検出装置２の細胞画像取得部２０によって取得される。（Ｓ１０）。

細胞画像取得部２０によって取得された撮像画像は細胞群検出部２１に入力され、細胞群検出部２１は、撮像画像内に含まれる複数の細胞群を検出する（Ｓ１２）。

細胞群検出部２１による複数の細胞群の検出結果は細胞群統合部２２に入力され、細胞群統合部２２は、細胞群間の距離を計測し、かつ各細胞群の成熟度を取得する（Ｓ１４，Ｓ１６）。そして、細胞群統合部２２は、細胞群間の距離および成熟度の差に基づいて、それらの細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合には、それらの細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する（Ｓ１８）。

細胞群統合部２２における細胞コロニーの検出結果は表示制御部２３に出力され、表示制御部２３は、細胞コロニーの検出結果を表示装置３に表示させる（Ｓ２０）。

上記実施形態の細胞コロニー観察システムによれば、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出し、その複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、その複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出するようにしたので、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる。

なお、上記実施形態においては、培養対象の細胞が単一の種類であることを想定して説明したが、複数種類の細胞群が共培養される状態も考えられる。たとえば、造血幹細胞を培養した場合、赤芽球系の細胞と骨髄芽球系の細胞とが共培養される状態が考えられる。このような場合、たとえば、上述したように細胞群の成熟度として平均Ｒ／Ｂ比率を用いた場合、赤芽球系の細胞群と骨髄芽球系の細胞群とで、平均Ｒ／Ｂ比率の差が小さい場合が起こり得る。

具体的には、たとえば骨髄芽球系の細胞群Ｒ１〜Ｒ３の平均Ｒ／Ｂ比率が図８に示す大きさであり、赤芽球系の細胞群Ｒ４〜Ｒ６の平均Ｒ／Ｂ比率が図８に示す大きさである場合、骨髄芽球系の細胞群Ｒ３と赤芽球系の細胞群Ｒ４とは、それぞれ異なる種類の細胞群であるにも関わらず、平均Ｒ／Ｂ比率の差が小さい。したがって、骨髄芽球系の細胞群Ｒ３と赤芽球系の細胞群Ｒ４の平均Ｒ／Ｂ比率の差とこれらの細胞群間の距離とに基づいて同一の細胞コロニーに属する細胞群であるか否かを判定した場合、これらの細胞群間の距離が閾値以下である場合には、これらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定され、誤判定を発生してしまう。

そこで、このような誤判定を防止するため、細胞群統合部２２が、細胞群間の距離および成熟度の差に基づく判定の前に、複数の細胞群が同じ種類の細胞群であるか否かの判定を行うようにしてもよい。具体的には、各細胞群の平均Ｒ／Ｂ比率と予め設定された平均Ｒ／Ｂ比率の閾値とを比較し、平均Ｒ／Ｂ比率が閾値以上である細胞群は、赤芽球系の細胞群であると判定し、平均Ｒ／Ｂ比率が閾値未満である細胞群は、骨髄芽球系の細胞群であると判定する。

そして、その後、上記実施形態と同様にして、細胞群間の距離および成熟度の差に基づく判定を行うが、この際、細胞群間の距離が距離閾値以下であり、かつ細胞群間の成熟度の差が成熟度閾値以下であったとしても、異なる種類の細胞群であると既に判定されている細胞群同士は、同一の細胞コロニーに属するものではないと判定するようにすればよい。このような判定を行うことによって、上述したような骨髄芽球系の細胞群Ｒ３と赤芽球系の細胞群Ｒ４の誤判定を防止することができる。なお、上記のようにして各細胞群の種類が判定された後は、赤芽球系の細胞群については成熟度として平均Ｒ／Ｂ比率を用い、骨髄芽球系の細胞群については成熟度として輝度を用いて、同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定するようにすればよい。

次に、上記実施形態の細胞コロニー検出装置２の細胞群検出部２１において、カーネル密度推定を用いた方法によって細胞群を検出する場合について説明する。

まず、撮像画像内における細胞群を検出する際、通常、細胞群は円形にまとまって形成される傾向にあるが、上述した赤芽球系の細胞群などの一部の細胞群は、細胞が散在して分布するため細胞群の輪郭が不明瞭である。具体的には、図９の上図に示すように、細胞が円形にひとまとまりに分布していない場合には、複数の細胞群の集まりなのか、１つの細胞群を形成するものであるのか不明瞭である。また、図９の下図に示すように、細胞群と推定される分布の周辺にまばらにしか細胞が分布していない場合にも、細胞群の輪郭が不明瞭である。特に、浮遊培養によって細胞を培養する場合に、細胞群の輪郭が不明瞭になることが多い。

細胞群の輪郭が明瞭である場合、上述したようなパターンマッチングによる検出方法では、適切に細胞群を検出することが難しい場合がある。そこで、カーネル密度推定を用いた方法によって細胞群を検出すれば、上述したような輪郭が不明瞭な細胞群についても、高精度に検出することができる。以下、カーネル密度推定を用いた細胞群の検出方法について、具体的に説明する。

まず、細胞群検出部２１は、撮像画像内に含まれる各細胞を表す画素をそれぞれ検出する。細胞を表す画素（以下、細胞画素という。）は、細胞群とともに培養容器に収容されている培養液を表す画素とは輝度値が異なるため、たとえば大津の２値化法を用いることによって検出する。図１０の上図は、検出された細胞画素の一例を示す図である。図１０の上図における黒い点のそれぞれが細胞画素である。

そして、細胞群検出部２１は、上述したようにして検出した各細胞画素について、その細胞画素を含む予め設定された範囲内の細胞画素数に基づいて、カーネル密度推定に用いられるバンド幅を細胞画素毎にそれぞれ設定し、その細胞画素毎に設定されたバンド幅および細胞画素毎に設定されたカーネル関数に基づいて確率密度関数を計算し、その計算した確率密度関数に基づいて、細胞画素を区分することによって、複数の細胞を複数の細胞群に区分する。以下、より具体的に説明する。

まず、細胞群検出部２１は、各細胞画素について、その細胞画素を含む予め設定された範囲内の細胞画素数をそれぞれ算出する。具体的には、たとえば、図１１に示すように、細胞画素ＣＰの位置を中心として所定の半径の円内に存在する近傍細胞画素ＮＰの数を算出する。図１１に示す例の場合、円内に存在する近傍細胞画素ＮＰは３個である。なお、予め設定された範囲内（図１１の例では円内）に存在する近傍細胞画素ＮＰの数のことを、以下、細胞画素密度という。細胞画素密度を算出する際に用いられる円の大きさは、ユーザが入力装置４を用いて任意に設定可能であるが、たとえば半径約０．６５ｍｍとすればよい。

細胞画素密度が大きいほど中心の細胞画素ＣＰの近傍に同じ細胞群に属する細胞画素が集中して分布していると推定される。また、逆に、細胞画素密度が小さいほど中心の細胞画素ＣＰから広い範囲に亘って同じ細胞群に属する細胞画素が分布していると推定される。

そこで、細胞群検出部２１は、各細胞画素に算出された細胞画素密度に基づいて、各細胞画素に対して、カーネル密度推定に用いられるバンド幅を設定する。具体的には、細胞画素密度が大きいほど、つまり円内に存在する近傍細胞画素ＮＰが多いほどバンド幅を小さくし、細胞画素密度が小さいほど、つまり円内に存在する近傍細胞画素ＮＰが少ないほどバンド幅を大きくする。細胞群検出部２１には、上述したような細胞画素密度とバンド幅との対応関係が設定されたテーブルが予め記憶されており、細胞群検出部２１は、このテーブルを参照して各細胞画素のバンド幅を設定する。なお、細胞画素密度とバンド幅と対応関係については、目視による細胞群の区分結果と、細胞群検出部２１による細胞群の区分結果との差が最小となるように事前に算出するようにすればよい。

次に、細胞群検出部２１は、上述したようにして細胞画素毎に設定されたバンド幅と、細胞画素毎に設定されたカーネル関数に基づいて確率密度関数を計算する。カーネル関数の形状としては、たとえば計算が容易なガウシアンカーネルを用いることが望ましい。ただし、その他のカーネルを用いるようにしてもよい。

図１２は、細胞画素毎に設定されたバンド幅およびカーネル関数を模式的に示す図である。図１２に示す白丸Ｐ１〜Ｐ７が細胞画素を示しており、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に対応して示されているＦ１〜Ｆ８が、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に設定されたカーネル関数である。なお、上述したバンド幅とは、カーネル関数の広がりの幅であり、図１２に示す例では、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に設定されるバンド幅は全て同じにしてあるが、実際には、上述したようにバンド幅は、各細胞画素のそれぞれの細胞画素密度に応じて異なる。また、図１２では、１次元に配列された複数の細胞画素に対してバンド幅およびカーネル関数を設定した図を示しているが、実際には、図１０の上図に示すような２次元状に配列された複数の細胞画素に対してバンド幅およびカーネル関数が設定される。

次いで、細胞群検出部２１は、上述したようにして各細胞画素に設定されたカーネル関数に基づいて、カーネル密度推定法を用いて確率密度関数を計算する。具体的には、下式に基づいて、確率密度関数ｆ（ｘ）を計算する。式中のｎは細胞画素の数であり、ｈはカーネル幅であり、ｘ_ｉは各細胞画素の座標であり、Ｋ（ｘ）はカーネル関数である。図４に示すＦ８は、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に対して設定されたカーネル関数Ｆ１〜Ｆ７に基づいて算出された確率密度関数を模式的に示したものである。また、図１０に示すＦ１０は、図１０の上図に示す撮像画像に対して算出された確率密度関数を模式的に示したものである。

次に、細胞群検出部２１は、上式に基づいて計算した確率密度関数に基づいて、複数の細胞画素を区分することによって、撮像画像内に含まれる複数の細胞を複数の細胞群に区分する。具体的には、細胞群検出部２１は、図１０や図１２に示す確率密度関数上において、同じ山に属する細胞画素が同じ細胞群に属するようにクラスタリングすることによって、複数の細胞群に区分する。クラスタリングの方法としては、たとえばミーンシフト法を用いることができる。具体的には、下式を用いて行うことができる。

上式のＳ_Ｇ（ｘ）を算出することによって、各細胞画素は、カーネル密度推定結果の確率密度関数上の山を登る。そして、収束するまでＳ_Ｇ（ｘ）を計算することによって、各細胞画素は、確率密度関数上の極値に達する。同じ極値に達した細胞画素同士は、確率密度関数上で同じ山に属するため、これらの細胞画素が同じ細胞群に属するものとしてクラスタリングする。なお、ミーンシフト法によるクラスタリングは、既に公知であるため、詳細な説明は省略する。

図１３は、図１０に示した撮像画像内における複数の細胞画素を上述したミーンシフト法によってクラスタリングした結果を模式的に示す図である。図１３に示すＦ１０は、図２に示した確率密度関数Ｆ１０であり、図１３に示すＤ１〜Ｄ５は、確率密度関数上でクラスタリングされた各山を示したものである。そして、図１３の上図におけるＣ１〜Ｃ５は、複数の細胞画素をクラスタリングした結果を示しており、Ｃ１〜Ｃ５のそれぞれの範囲に含まれる細胞画素が、同じ細胞群に属する細胞画素である。具体的には、確率密度関数の山Ｄ１に属する細胞画素が範囲Ｃ１で示されており、山Ｄ２に属する細胞画素が範囲Ｃ２で示されており、山Ｄ３に属する細胞画素が範囲Ｃ３で示されており、山Ｄ４に属する細胞画素が範囲Ｃ４で示されており、山Ｄ５に属する細胞画素が範囲Ｃ５で示されている。すなわち、点線で示される範囲Ｃ１〜Ｃ５の各範囲が、１つの細胞群に属する細胞が分布する範囲を示している。

上記のようにカーネル密度推定を用いた方法によって細胞群を検出することによって、細胞群を高精度に検出することができる。

１ 顕微鏡装置
２ 細胞コロニー検出装置
３ 表示装置
４ 入力装置
２０ 細胞画像取得部
２１ 細胞群検出部
２２ 細胞群統合部
２３ 表示制御部

Claims (15)

1. 複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部と、
   前記撮像画像内に含まれる複数の前記細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部と、
   複数の前記細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部とを備えたことを特徴とする細胞コロニー検出装置。
2. 前記細胞群統合部が、前記複数の細胞群の間の距離が予め設定された距離閾値以下であり、かつ前記複数の細胞群の成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであると判定する請求項１記載の細胞コロニー検出装置。
3. 前記細胞群統合部が、前記細胞の培養期間に応じて前記距離閾値および前記成熟度閾値の少なくとも１つを変更する請求項２記載の細胞コロニー検出装置。
4. 前記細胞群統合部が、前記細胞の成長因子の種類または量に応じて前記距離閾値および前記成熟度閾値の少なくとも１つを変更する請求項２または３記載の細胞コロニー検出装置。
5. 前記細胞群統合部が、前記複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群の成熟度の差の線形和もしくは非線形和が閾値以下である場合に、同一の細胞コロニーに属するものであると判定する請求項１記載の細胞コロニー検出装置。
6. 前記細胞群統合部が、前記細胞の培養期間に応じて前記閾値を変更する請求項５記載の細胞コロニー検出装置。
7. 前記細胞群統合部が、前記細胞の成長因子の種類または量に応じて前記閾値を変更する請求項５または６記載の細胞コロニー検出装置。
8. 前記細胞が、造血幹細胞由来の細胞であり、
   前記細胞群統合部が、前記細胞群の画像の赤色と青色の比率を前記成熟度として取得する請求項１から７いずれか１項記載の細胞コロニー検出装置。
9. 前記細胞が、ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞またはＥＳ(embryonic stem)細胞であり、
   前記細胞群統合部が、前記細胞群の分化度または未分化度を前記成熟度として取得する請求項１から７いずれか１項記載の細胞コロニー検出装置。
10. 前記細胞群統合部が、前記分化度または未分化度を示す特徴量として前記細胞群の細胞密度または平均核細胞質比を取得する請求項９記載の細胞コロニー検出装置。
11. 前記細胞群統合部が、前記複数の細胞の中に複数種類の細胞が含まれる場合、前記複数の細胞群が同じ種類の細胞の細胞群であるか否かを判定し、該判定結果と前記複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度に応じて、前記複数の細胞群が同一細胞コロニーに属するものであるか否かを判定する請求項１から１０いずれか１項記載の細胞コロニー検出装置。
12. 前記細胞群統合部が、前記細胞群の画像の赤色と青色の比率に基づいて、前記細胞群の種類を判定する請求項１１記載の細胞コロニー検出装置。
13. 前記細胞群統合部による前記細胞コロニーの検出結果を出力する出力部を備えた請求項１から１２いずれか１項記載の細胞コロニー検出装置。
14. 複数の細胞を撮像した撮像画像を取得し、
    前記撮像画像内に含まれる複数の前記細胞からなる細胞群を検出し、
    複数の前記細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出することを特徴とする細胞コロニー検出方法。
15. 複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部と、
    前記撮像画像内に含まれる複数の前記細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部と、
    複数の前記細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する統合部としてコンピュータを機能させることを特徴とする細胞コロニー検出プログラム。