CN104017777A

CN104017777A - 用于治疗视网膜疾病的试剂盒

Info

Publication number: CN104017777A
Application number: CN201410007027.3A
Authority: CN
Inventors: 李瑶琛; 阴正勤
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2014-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2014-09-03

Abstract

本发明公开了用于治疗视网膜疾病的试剂盒。本发明所提供的用于治疗视网膜疾病试剂盒及药物，其特征在于：有效成分为可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。采用本发明所提供的试剂盒治疗视网膜疾病时，不需要多次注射，经视网膜下腔注射可以最大化地激活视网膜内源性干细胞，并促进内源性干细胞分化为视网膜神经元。

Description

用于治疗视网膜疾病的试剂盒

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，尤其涉及用于治疗视网膜疾病的试剂盒。

背景技术

任何影响视网膜正常功能所造成的眼部疾病被称为视网膜疾病，如视网膜色素变性（RP）、其它遗传性视网膜变性、糖尿病视网膜病（DR）、视网膜血管闭塞、视网膜脱离、视网膜撕裂、年龄相关性黄斑变性（AMD）等。这些疾病都可以影响视觉信息的处理，并明显影响到病人的视功能，严重的则可以导致视盲。其中，湿性和干性年龄相关性黄斑变性是造成发达国家老年人视盲的首要原因，是由视网膜色素上皮细胞（RPE）功能失调引起。此外，RP代表的遗传性视网膜变性，以光感受器细胞和RPE的破坏为主要病变特点、视盲为结局。与中枢神经系统疾病类似,由视网膜或视神经变性疾病引起的视盲，尚无有效治疗手段。然而，近年来伴随干细胞研究的兴起，干细胞移植使视网膜再生及功能重建已成为研究热点。这一策略代表了全新的治疗选择，为盲人重见光明带来了希望，具有广泛的应用前景。干细胞移植治疗分别包括了外源性干细胞移植治疗与内源性干细胞激活治疗两种策略。

但是，在我们前期分别利用视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜前体干细胞（RPC）的移植研究中，我们首先发现外源性的干细胞在进入新的微环境（niche）中缺乏维持其自我更新的能力，从而在数量上难以达到修复病损视网膜的目的；其次，外源性干细胞的来源、免疫排斥、迁移分化及与宿主细胞整合的不确定性等一直是外源性干细胞治疗中难以解决的问题。这些因素都极大地制约了外源性干细胞移植的临床治疗应用。

激活内源性干细胞并使之定向分化是视网膜疾病治疗的发展方向。1985年，学者Sarthy发现哺乳动物视网膜损伤后Müller细胞重新进入细胞周期，并且体外也能存活。2003年，Fischer&Reh用NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸受体）特异性损伤视网膜内核层细胞，随后内核层有大量细胞增殖，这些增殖的细胞表达Müller细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）及视网膜祖细胞标记，如bHLH转录因子CASH-1，同源转录因子PAX6和CHX10，表明这些具有祖细胞特性的细胞源于Müller细胞，意即在哺乳动物视网膜的Müller细胞中确实包含了一定数量的干细胞。但是在哺乳动物视网膜中，Müller细胞在正常情况下无法重新进入细胞周期开始逆分化，只有在一些急性损伤的情况下，如：应用NMDA造成小鼠视网膜神经节细胞和无长突细胞死亡、应用MNU造成大鼠视网膜光感受器细胞死亡或是应用激光造成小鼠视网膜急性损伤后，少数视网膜Müller细胞可重新进入细胞周期并逆分化为视网膜前体细胞。此外，我们也对慢性视网膜色素变性（RCS大鼠）病变过程中Müller细胞的逆分化进行了详尽的研究并发现：尽管内源性干细胞可以被激活、逆分化，但是这个过程是一个瞬时即逝的，同样，病变、缺损部位很快被胶质瘢痕所填补。理论上，干/祖细胞可以源源不断的增生，并且在正确信号的刺激下，干/祖细胞可以分化为各种类型的细胞；然而，实际上这种自发的再生根本不足以修复受损视网膜的结构与功能，而是以胶质瘢痕为结局。

因此，如果希望将内源性干/祖细胞活化的特性应用于临床，必须增强内源性干细胞的活化。研究者发现，多种生长因子或细胞因子，如胰岛素（insulin）、碱性纤维母细胞生长因子（bFGF），胶质源性生长因子（GDNF），或脑源性神经营养因子（BDNF）能刺激Müller细胞重新进入分裂周期和去分化,其中部分细胞分化为无长突细胞,表达无长突细胞特异性标志物钙视网膜蛋白（Calretinin）,NeuN,Prox1和GAD67-GFP等。在我们的前期实验中，我们将BDNF注射进入视网膜下腔或将BDNF与视网膜干细胞联合注入视网膜下腔，结果显示：BDNF不仅可以延长对内源性干细胞的激活时间，而且延长了供体干细胞在宿主的存活时间。

但是，这类方法的缺点在于:外源性营养性因子的作用是短暂的，若反复视网膜下腔或玻璃体腔内注射，易造成眼内感染，严重的如视网膜感染、脱离等并发症，且挽救的光感受器是否还有功能，还是个问题。

MircoRNA是近来发现并已经成为研究热点的一类重要的非编码RNA，它参与了发育、寿命、细胞增殖、分化、信号通路、凋亡、新陈代谢和应激反应等多种基础生物进程，因此在干细胞的更新分化、体细胞性状与数量的维持、甚至肿瘤细胞的恶性增生等生物学过程中都具有重要的调控作用。MircoRNA通过与靶位点结合，快速有效地降解靶基因mRNA或抑制靶蛋白的翻译。为了明确有效的内源性干细胞激活调控因子，我们利用MircoRNA芯片，分析并比较了视网膜色素变性（RCS）大鼠与其对照大鼠间的差异MircoRNA表达。基因芯片筛查结果发现，出生后15天或30天的RCS大鼠变性早期（P15，P30）其Let-7MircoRNA家族分子Let-7c、Let-7e和Let-7i较对照组大鼠表达增加，特别是Let-7e和Let-7i分别增加了4和12倍。我们的原位杂交也证实了这一结果。提示：Let-7e和Let-7i的高表达可能阻碍了视网膜变性早期Müller细胞的去分化和增殖。

Let-7家族是一种重要的miRNA调控子。其基因组有多种序列。人类有13种前体序列，最终形成10种成熟序列。各研究已证实Let-7家族中各成员在不同的细胞有不同的功能。虽然其具体功能不详，但它们能调控细胞周期进程和细胞增殖。受到调控的基因包括细胞命运决定基因、致癌基因和细胞周期调控子。Let-7基因敲除或低表达能刺激细胞周期、DNA合成和细胞分裂。斑马鱼视网膜损伤后，Let-7a和Let-7f miRNA表达降低，Müller细胞去分化为祖细胞，促进视网膜再生和修复。此外，Let-7家族是高度失调的miRNA。RNA结合蛋白Lin28是Let-7家族的上游分子，通过结合到Let-7miRNA前体分子结构域末端，从而阻碍Let-7miRNA的转录并抑制其活性。Lin28有两个同源亚型，序列和结构高度保守，对Let-7家族都能选择性抑制。

发明内容

在本发明中发现，与对照大鼠相比，RCS大鼠Lin28A的表达不仅没有降低，反而略有升高；相反，Lin28B的表达仅在RCS大鼠刚睁眼时（P15）有升高，此后明显降低。RT-PCR证实，Lin28B表达较对照组增加，随后明显降低。这提示：在哺乳动物视网膜内Lin28B（而不是Lin28A）对Let-7家族的Let7e和Let7i具有负性调控作用。

根据以上发现，本发明提供一种用于治疗视网膜疾病的试剂盒，其特征在于：包括可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。

所述腺病毒的制备方法制备过程如下：

（1）构建穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG；

（2）将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞，包装产生所述腺病毒。

所述试剂盒还包含用于悬浮所述腺病毒的缓冲液，所述缓冲液的配方为：30g蔗糖，8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，1L ddH₂O，PH值为7.4。

本发明的另一目的是提供一种治疗视网膜疾病的药物，其有效成分为：可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。

所述腺病毒为：将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞，包装产生所得。

所述药物为悬浮剂，悬浮剂为所述腺病毒悬浮于缓冲液中，所述缓冲液的配方为：30g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，1L ddH₂O，PH值为7.4。

为了避免多种生长因子或细胞因子短暂的作用以及由于反复玻璃体腔内注射造成视网膜感染、脱离等并发症，本发明构建了Lin28B过表达腺病毒，经视网膜下腔注射可以最大化地激活视网膜内源性干细胞，不需要多次注射。本发明优势是：

（1）因为短暂关闭或者开放信号通路传导是调控Müller细胞增殖去分化的一种新的重要方式。当视网膜下腔注射Adeno/Lin28B腺病毒后，可短暂地开放Lin28B所控制的信号传导通路。

（2）视网膜再生需要Müller细胞去分化后再横向分化。与腺相关病毒AAV或慢病毒不同，腺病毒不整合到宿主基因组，不会长期持续表达，因此感染的Müller细胞短暂去分化后可以随即转分化为视网膜神经元，而不是维持在干细胞状态。如果Müller细胞始终处于干细胞/祖细胞状态，则会引起功能性Kir通道下调，膜去极化，碳酸酐酶和CRALBP下调，GS下调引起谷氨酸清除障碍，破坏胶质-神经元相互作用，以及酸碱、离子、渗透压平衡，导致细胞水肿，谷氨酸中毒，神经元过度兴奋，最终引起神经元变性。

（3）体外研究发现Lin28A和Lin28B持续过表达作用类似于原癌基因，可引起细胞恶变。而短暂的Lin28B表达可以避免细胞恶变。

（4）腺病毒载体已经成为各类细胞短期基因表达的重要工具。它的优势还包括制备容易，滴度高，在休眠和活化细胞均能高效转染，短期基因表达水平高，而不整合到基因组引起突变。

在本发明的研究中，我们以Ad/GFP作为对照、分别以培养的Müller细胞（体外实验）和RCS大鼠为模型（体内实验），观察了Lin28B对Müller细胞的作用。通过一系列体内、外实验证实我们的假说——RNA结合蛋白Lin28B可以最大化地激活Müller细胞增生、逆分化反应并促进逆分化的Müller横向分化为视网膜神经元。

术语界定：

Moi：本领域中moi有多种理解，本发明中采用的术语moi理解为：感染复数，它是一个比值，含义是感染时病毒颗粒与细胞数目的比值）

附图说明

图1为体外Müller细胞感染Ad/Lin28B后细胞的增殖情况。

图2为体外Müller细胞感染Ad/Lin28B后细胞自我更新能力分析结果。

图3为体外Müller细胞感染Ad/Lin28B后的流式细胞周期分析结果。

图4为体外Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记的表达情况。

图5为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后Let7e的表达情况。

其中ONL（视网膜外核层，outer nuclear layer），OPL（视网膜外网层，outer plexiform layer），INL（视网膜内核层，inner nuclear layer），IPL（视网膜内网层，inner plexiform layer）和GCL（视网膜节细胞层，ganglion cell layer）

图6为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后Let7i的表达情况。

图7为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后BrdU阳性细胞数量分析结果。

图8为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记PAX6的表达情况。

图9为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记SOX2的表达情况。

图10为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记Nestin的表达情况。

图11为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记CHX10的表达情况。

图12为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后SOX2,Nestin,CHX10,BrdU,PAX6阳性细胞数量的定量分析结果。

图13为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后锥杆同源框蛋白（Crx）的表达情况。

图14为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后视蛋白（opsin）的表达情况。

图15为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后视网膜紫质（rhodopsin）的表达情况。

图16为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后感光细胞特异性结合蛋白（recoverin）的表达情况。

图17为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后蛋白激酶Cα（PKCα）的表达情况。

图18为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后钙结合蛋白（calbindin）的表达情况。

图19为体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后GFAP的表达情况。

图20为体内注射Ad/Lin28B后RCS大鼠视功能的改善情况。

其中Lin28B意为此眼视网膜下腔注射腺病毒Adeno/Lin28B，Control意为此眼视网膜下腔注射对照腺病毒Adeno/GFP。Lin28B-2w，Lin28B-4w和Lin28B-6w分别为感染Adeno/Lin28B后的2周，4周和6周。Control-2w，Control-4w和Control-6w分别为感染对照腺病毒Adeno/GFP后的2周，4周和6周。

图21.腺病毒穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG的制备流程

图22pAV-MCMV-GFP-3FLAG载体线性化图谱

图23PCR扩增目的片段凝胶电泳图谱

DL2,000DNA Marker：2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

图24pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG的菌落阳性鉴定图

其中：1.阴性对照（H₂O），

2.阴性对照（空载体），

3.DL2,000DNA Marker：2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp4-11挑取的8个转化子。

具体实施方式

实施例1、过表达RNA结合蛋白Lin28B的重组腺病毒的制备制备

步骤（1）制备Lin28B编码基因

人Lin28B编码基因序列：（GenBank:DQ127228.1）

大鼠Lin28B编码基因序列：（NCBI Reference Sequence:XM_001069344.2）

步骤（2）制备腺病毒穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG

包括以下主要步骤：

以化学合成的LIN28B基因为模板PCR扩增目的基因。

表达载体酶切后进行胶回收载体片段。

目的基因与载体片段同源重组后转化E.coli感受态细胞。

用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序验证无误的为腺病毒穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG。克隆进行质粒抽提。

实验流程如图21，详述如下：

实验材料描述：

试剂

仪器

表达载体的线性化，载体图谱见图22。

用EcoR I对表达载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG进行酶切，酶切产物电泳后回收约4.8kb（4770bp）的载体片段。

目的基因扩增

引物设计合成：

LIN28B-EcoR I-F：对于人LIN28B开放阅读框扩增的上游引物是：

CTCAAGCTTCGAATTC ATGTTAGATTGATGCAGAA。

对大鼠LIN28B开放阅读框扩增的上游引物是：

CTCAAGCTTCGAATTC ATGGCCGAAGGAAAACCAG

引物说明：含同源重组序列、EcoR I酶切位点（下划线标记的）、Kozak序列（双下划线标记的），并含有目的基因5’端配对序列用于PCR钓取目的基因。

LIN28B-EcoRI-R对于人LIN28B开放阅读框扩增的下游引物：

CCATGGTGGCGAATTCAGTAATTTTTTTAAACCTC

对于大鼠LIN28B开放阅读框扩增的下游引物是：

CCATGGTGGCGAATTCAGTCTTTTTCCGTTTCTGAATC

引物说明：含同源重组序列、EcoR I酶切位点（下划线标记的），并含有目的基因3’端配对序列用于PCR钓取目的基因。

MCMV-F GGTATAAGAGGCGCGACCAG

引物说明：该引物位于目的基因上游的mCMV启动子中，用于菌落PCR鉴定转化子。

pEGFP-N-3CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG

引物说明：该引物位于目的基因下游EGFP的N端序列中，用于菌落PCR鉴定转化子。

PCR扩增目的基因片段PCR产物大小：986b

PCR反应体系：

PCR引物说明：

Primer（＋）：LIN28B-EcoR I-F

Primer（－）：LIN28B-EcoR I-R

Template：化学合成的LIN28B基因

PCR循环条件：

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图见图23。

目的基因同源重组入表达载体：

同源重组反应体系：

于37℃孵育15min，再50℃孵育15min，立刻转化或冻存于-20℃以后转化。

说明：阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的目的基因片段是GAPDH基因（带有同样的同源重组序列）

转化：

1.取一支感受态细胞（每管100μl，-80℃保存）于冰上，待溶解后加入10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2.将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒。

3.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。

4.每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏。

5.取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上（含表达载体相应的抗生素）。

6.倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。

阳性克隆鉴定：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，从中取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定方法如下：

Primer（＋）：MCMV-F

Primer（－）：pEGFP-N-3

阳性克隆得到1127bp的片断，阴性克隆得到167bp的片断PCR反应体系：

PCR仪进行反应，按以下循环条件：

菌落PCR鉴定结果如图24，鉴定结果正确，与预期一致。

接种阳性克隆，保种并分装100ul送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒

阳性克隆测序结果分析:阳性克隆测序结果表明，和预期的序列完全一致，获得穿梭载体pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG。

步骤（3）重组腺病毒的制备

实验材料：

细胞株和质粒：

表1-1细胞株和质粒

Table1-1Cell and Plasmid

注：pBHGloxΔE1,3Cre序列信息可从以下网址下载：

http://www.microbix.com/Plasmid-Sequences/pBHGloxdeltaE13Cre.zip

主要试剂

表2-1试剂

主要仪器设备

表3-1仪器设备

293细胞的培养

1.细胞复苏

准备适当的灭菌培养瓶，标上细胞系名称、传代数和日期；

穿戴好适当的防护设备从液氮罐中取出冻存的细胞，并在密封容器中转移到实验室中；

穿戴防护衣，将细胞从容器中拿出到适当温度中的水浴箱中，用37℃水浴。只浸没冻存管的下半部分，解冻到小瓶中只剩少量冰块，通常1～2min，转移到生物安全柜中；

用70%酒精浸湿的棉花擦拭冻存管的外部，并在酒精灯前打开冻存管；

慢慢的用移液管逐滴移至温育过的培养液中，用以稀释DMSO；

在适当的温度和浓度的CO₂中进行培养；

24h后显微镜观察细胞，如果有必要需进行传代。

2.细胞传代

用倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染；

移去培养瓶中的培养液；

相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可；

按1mL/25cm²表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使其胰蛋白酶覆盖细胞单层，倒出多余的胰蛋白酶；

将培养瓶放回培养箱，放置2～10min；

用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞；

用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶，取出100～200μl用于计数；

将所需数量的细胞移至一个新标记好的含温育过培养液的培养瓶中或者培养板上；选择适当培养条件培养细胞系；

按照细胞系的生长特性重复该步骤，直到细胞状态良好、无污染，可以铺六孔板使用，其余选择冻存。

3.活细胞计数

取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25%的胰酶消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

盖好盖玻片，取一套血球计数槽上，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液（如5滴）到离心管中，加入等体积台盼蓝染液（0.4%），活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤；

将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中；

统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格（每格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目；

计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/mL=（四个大格子细胞数/4）×2×10⁴

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液于染液1：1稀释。

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm³；1mL=1000mm³

4.准备六孔板

选择细胞状态良好、无污染的HEK293细胞，使用细胞传代的方式，均匀铺与六孔板中，保证每孔细胞量相同，应该达到2×10⁶个，隔天细胞长到50～80%左右开始转染。

5.细胞冻存

用倒置显微镜观察细胞，评估细胞密度以及确认无细菌和真菌污染，移去培养瓶中的培养液，用相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可，按1mL/25cm²表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使胰蛋白酶覆盖细胞单层。倒出多余的胰蛋白酶，将培养瓶放回培养箱，放置2～10min，用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞，用少量的含新鲜血清的培养液

重悬细胞以灭活胰蛋白酶。取出100～200μl用于计数。为了冻存后有好的复苏效果，理想细胞的存活率应超过90%。将剩余的细胞150g离心5min，在冻存培养液中，以2-4×10⁶个细胞/mL的密度重悬细胞，吸取1mL细胞悬液转移至标有细胞系名称、传代次数的冻存管中，将冻存管放置冻存盒中放入-80℃冰箱过夜，最后将冷冻的冻存管转移到液氮的气相层内存放，并记录位置。

腺病毒包装过程

1.AdMax腺病毒包装系统简介

AdMax腺病毒包装系统是Frank L.Graham教授建立的，由加拿大microbix公司经销。它的工作原理是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP（或FLP/frt）重组酶系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。这个系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因的表达水平高。

关于AdMax腺病毒包装系统的详情，请登陆网站：http://www.microbix.com/。

2.包装过程（以10cm培养板为例）：

转染前一天，将HEK293细胞接种10cm细胞培养器皿中，控制细胞转染时的密度为70-90%。

转染前一小时取出细胞培养器皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱；

制备转染试剂和质粒的复合物：

a.取1.5ml Ep管一支，加入待转染的病毒载体质粒，用Opti-MEM培养基补齐到500μl，轻轻混匀；

b.取1.5ml Ep管一支，加入35μl Trans-EZ（SunBio）溶液，用Opti-MEM培养基补齐到500μl，轻轻混匀；

c.将Trans-EZ稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成稳定的转染复合体。

取出细胞培养板，将上面得到的DNA-Trans-EZ复合体加入到细胞培养器皿中，做好标记，放回培养箱；

6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜生长培养基培养，如有大量细胞漂起，则不去上清，加入6mL完全培养基，37℃过夜培养，次日换液；三天换一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，病变后纯化获得腺病毒Ad/Lin28B。

实施例2、缓冲液的配方及制备方法

缓冲液的配方为：3%蔗糖溶于1×PBS，即称取3g的蔗糖溶于100ml的1×PBS中，0.2μm的滤器过滤除菌。

其中1×PBS的配制方法为：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4溶于1升的蒸馏水中，PH值为7.4，高压灭菌。

实施例3、体外实验：

1、Ad/Lin28B对Müller细胞自我更新的离体观察

1）制备感染Ad/Lin28B的Müller细胞。

原代Müller细胞培养方法

1.取大鼠（LE鼠种，生后7-10d，8d最佳）双眼球置于muller细胞培养基中过夜（时间不能过长，控制在12小时之内）。

2.取出过夜的眼球组织，置于消化液（胶原酶0.5+胰酶0.25）中37度孵箱1小时，muller培养基终止消化。

3.在显微镜下冰上剥除视网膜组织，置4度培养基清洗一遍，移入EP管内。

4.在EP管内加入muller细胞培养基吹打，不小于100次，轻柔，少气泡。

5.吹打完毕后配平入离心机：1000转，4度，5分钟，弃上清。

再次加入muller细胞培养基（比例为两个网膜加1ml），吹打后接种在6孔板内（每孔种2个网膜即1ml），补足每孔2ml培养基后置于37度孵箱，前48小时禁止移动培养板，第三天观察细胞贴壁情况。注：培养基不可过多，不利贴壁，每孔不多于2ml，待细胞贴壁后每孔补1ml新鲜培养基，第7天需半换液一次，将浮于细胞层表面的玻璃体物质清除干净，约第10-12天，细胞生长旺盛覆盖底部后开始传代。

腺病毒感染Müller细胞方法

取生长至90%融合的第2代传代大鼠Müller细胞,按照常规细胞传代培养将细胞分种至6孔培养板,细胞接种密度为1×10⁶/ml,每个培养皿接种2ml。常规细胞贴壁培养3d后按moi为50分别进行对照腺病毒Ad/GFP和Ad/Lin28B感染。GFP作为报告基因，荧光显微镜(olympus)下观察Müller细胞的GFP表达情况。

2）观察Müller细胞感染Ad/Lin28B后细胞的增殖情况。

取生长至90%融合的第2代传代大鼠Müller细胞,按照常规细胞传代培养将细胞分种至6孔培养板,细胞接种密度为1×10⁶/ml,每个培养皿接种2ml。常规细胞贴壁培养，于第二天按moi为50分别进行对照腺病毒Ad/GFP和Ad/Lin28B感染，感染后的12h更换培养基，以除去病毒。感染后24h，更换干细胞培养基，悬浮培养。于感染后的不同时间点，收集细胞，莱卡倒置显微镜下观察并计数细胞总数。如图2所示，Ad/Lin28B感染的Müller细胞生长倍增时间为0.091h，而对照组（Ad/GFP）需要0.285h。

3）感染Ad/Lin28B后Müller细胞自我更新能力分析。

取生长至90%融合的第2代传代大鼠Müller细胞,按照常规细胞传代培养将细胞分种至6孔培养板,细胞接种密度为1×10⁶/ml,每个培养皿接种2ml。常规细胞贴壁培养，于第二天按moi为50分别进行对照腺病毒Ad/GFP和Ad/Lin28B感染，感染后的12h更换培养基，以除去病毒。感染后24h，更换干细胞培养基，悬浮培养。莱卡倒置显微镜下显示：实验组（Ad/Lin28B）Müller细胞48h后快速分裂，72h形成小的克隆球，120h形成较大的圆形克隆球，至少能在体外传3代。而对照组（Ad/GFP）Müller细胞仅5%左右能传代形成克隆球，多数贴壁生长，形成松散的细胞团。也于上述时间点，收集细胞，计数每孔克隆球的形成个数。

4）感染Ad/Lin28B后Müller细胞的流式细胞周期分析。

取生长至90%融合的第2代传代大鼠Müller细胞,按照常规细胞传代培养将细胞分种至6孔培养板,细胞接种密度为1×10⁶/ml,每个培养皿接种2ml。常规细胞贴壁培养，于第二天按moi为50分别进行对照腺病毒Ad/GFP和Ad/Lin28B感染，感染后的12h更换培养基，以除去病毒。感染后24h，转入干细胞培养基中继续悬浮培养至36h后，收集悬浮的细胞并消化为单个细胞，将各组细胞1000r/min离心，10min，用冷PBS洗涤2次，重悬于70%的乙醇中，4℃保存至实验。执行细胞周期分析时，用冷PBS洗涤2次，PI（Propidium iodide，碘化丙啶）5μl染色，轻轻振荡、混匀，PBS洗涤2次，上机分析。如图3所示，Ad/Lin28B感染的Müller细胞S期细胞数量较对照组（Ad/GFP）明显增多，G1数量则明显降低。

2、离体观察Ad/Lin28B对Müller细胞多分化潜能的影响

实验方法：取生长至90%融合的第2代传代大鼠Müller细胞,按照常规细胞传代培养将细胞分种至6孔培养板,细胞接种密度为1×10⁶/ml,每个培养皿接种2ml。常规细胞贴壁培养，于第二天按moi为50分别进行对照腺病毒Ad/GFP和Ad/Lin28B感染，感染后的12h更换培养基，以除去病毒。感染后24h，更换干细胞培养基，悬浮培养至48h收集克隆球，利用Acutase(Gibco，A11105-01)消化成单个细胞，接种到多聚赖氨酸/层连蛋白包被的载玻片上（poly D-lysin/laminin coated slides）。3天后，4%PFA固定Coverslips上的细胞，PBS洗涤二次，封闭液封闭，行免疫荧光染色，分析以下蛋白的表达，包括波形蛋白（Vimentin），配对盒蛋白-6（Paired box protein-6，PAX6）,Y染色体性别决定区基因盒蛋白（Sex Determining Region Y)-Box2，SOX2）,巢蛋白（Nestin），同源异形盒蛋白（CHX10），胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）并利用溴化去氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)对正在增殖的S期细胞进行标记。

结果显示：体外Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记的表达情况见图4。从图4的结果可见，体外培养纯化的Müller细胞证实表达波形蛋白（Vimentin）。感染Ad/Lin28B后的Müller细胞，干细胞标记表达（PAX6,SOX2,CHX10，Nestin）较对照组增高，胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达显著降低。

实施例4、体内实验视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，Lin28B对RCS大鼠Müller细胞中Let7e和Let7i的负性调控作用

实验材料：腺病毒Ad/Lin28B悬液的浓度：4.7ｘ10¹¹个腺病毒颗粒/ML，悬液所用缓冲液为实施例2所制备的缓冲液。

实验步骤：

（1）经视网膜下腔注射Ad/Lin28B的方法

皇家外科学院大鼠（Royal College of Surgeon rat，RCS rat），简称为RCS-P+大鼠，大鼠为酪氨酸激酶Mertk受体基因突变引起的常染色体隐性遗传病变鼠。在这种病变模型中视网膜色素上皮细胞(RPE)对视细胞外节盘膜的吞噬、消化功能衰退,致使盘膜崩解物残留、堆集形成一层障碍物,导致感光细胞逐渐凋亡。是一个经典的视网膜色素变性模型。

在本实验中，我们应用出生后30天的RCS-P+大鼠，雌雄不限，经外眼和检眼镜检查屈光间质清晰，眼底无改变。予以12h明－暗交替光照，不限食水，室温18～23℃条件下饲养(第三军医大学实验动物中心提供，符合国家医用动物实验标准)。

视网膜下注射对照病毒Ad/GFP与Ad/Lin28B的具体方法是：试验眼(右眼)注射Ad/Lin28B，左眼注射对照病毒Ad/GFP。采用巩膜外路法注射至视网膜下腔：试验动物用0.02ml/50g剂量的速眠新肌肉注射麻醉，麻醉成功后，用氯霉素眼药水洗眼，美多丽滴眼液散瞳。固定鼠的体位，使右眼朝向正上方。滴加表面麻醉剂后铺巾，在2点钟方位用显微有齿镊提起角巩膜緣的球结膜，用显微剪剪开后，钝性分离球结膜及筋膜，注意勿伤血管和肌肉，暴露巩膜。10/0预置缝线在角巩缘后2mm处穿过浅层巩膜，在预置缝线中间用穿刺针与巩膜成近15°水平刺穿巩膜；再用穿刺针在6点钟位的角膜缘处行前房穿刺，放出部分房水，降低眼内压后可见眼球略塌陷。此时用10ul的微量进样器顺巩膜穿刺孔伸入视网膜下腔，缓慢注入病毒，每只眼注射3.0μl病毒悬液。在手术显微镜下见眼底局部视网膜变白，且呈扁平隆起时，证明注射成功。再将预置缝线打结，以防止病毒液体外流，同时作为取材时的标记。

（2）Lin28B对Let7e和Let7i的负性调控作用

我们利用丹麦Exiqon公司microRNA芯片（miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR）对出生后15天与30天的RCS-P+大鼠的microRNA表达情况进行筛查，并以相同年龄、相同遗传背景的RCS-P+-rdy+大鼠作为对照。结果显示：microRNA Let7家族成员Let7e和Let7i显著高于对照组。

为了明确Let7e和Let7i的表达升高主要是由于Müller细胞的改变所致，我们执行了联合的视黄醛结合蛋白抗体（CRALBP，成熟Müller细胞的Marker）免疫荧光染色和以Let7e和Let7i为探针进行原位杂交。结果显示：CRALBP阳性信号与增强的Let7e或Let7i共定位，表明Let7e和Let7i在视网膜色素变性大鼠的Müller细胞明显升高。进一步，我们发现Let7分子的调节蛋白Lin28（包括Lin28A与Lin28B）中的Lin28B在RCS-P+大鼠的表达显著降低。

为了明确Lin28B与Let7e或Let7i见得调节关系，我们利用Ad/Lin28B感染Müller细胞，即上调Lin28B在Müller细胞中的表达，检测Let7e或Let7i表达是否可以被下调。因此，Ad/Lin28B与对照病毒Ad/GFP被行视网膜下腔注射（见前述），联合的GS免疫荧光染色和以Let7e和Let7i为探针的原位杂交被再次执行。结果显示：Ad/Lin28B感染后，Müller细胞内Let7e和Let7i的阳性信号强度明显降低，表明Let7e和Let7i的表达明显受到抑制。因此，我们可以得出：Lin28B对Let7e和Let7i具有负性调控作用（见图5和图6）。

2、经视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，Lin28B对RCS大鼠Müller细胞增殖能力的促进作用

为明确Lin28B过表达对Müller细胞增殖的影响，我们执行双标的免疫荧光染色（GS/Brdu）。具体地，Ad/Lin28B与对照病毒Ad/GFP被执行视网膜下腔注射以便Ad/Lin28B上调Müller细胞中Lin28B的表达。于感染后的2周，4周和8周收集样本。在处死动物前2h腹腔注射Brdu（10ug/Kg）。20%乌拉坦腹腔注射(4-5ml/kg)麻醉，麻醉成功后用0.9％生理盐水(200～250ml)灌注，尽量冲洗血液后，再将大鼠用4%多聚甲醛灌注固定。全身组织器官变硬后取材。眼球组织在4%多聚甲醛中固定，10min后去除眼前节。将眼杯移入4%多聚甲醛中4℃2h。10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水。OCT包埋剂包埋眼杯后10μm的厚度进行冰冻切片。

免疫荧光染色方法：

(1)视网膜切片用PBS洗涤3次，每次5min；

(2)用0.5%TritonX-100孵育10min；

(3)加5%山羊血清封闭非特异性结合位点，1h；

(4)弃去血清，滴加抗GS与Brdu抗体，置于湿盒中于4℃过夜；

(5)PBS冲洗，5min×3次；

(6)滴加荧光二抗，湿盒内，室温下孵育1h；

(7)DAPI染核，室温下孵育5min；

(8)PBS漂洗，5min×3次；

(9)抗荧光淬灭封片剂封片，立即荧光显微镜下照相。LEICA荧光显微镜进行图像观察(目镜×10，物镜×20)，或行激光共聚焦显微镜照相。结果显示：体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后BrdU阳性细胞数量分析结果见图7；经视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，BrdU阳性细胞数量显著高于对照组。因此，Ad/Lin28B具有促进Müller细胞增殖的能力。

3、经视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，Lin28B对RCS大鼠Müller细胞逆分化的促进作用

为明确Lin28B过表达对Müller细胞逆分化的影响，我们执行GS与干细胞Markers（PAX6，SOX2，Nestin，CHX10）的双标免疫荧光染色。具体地，Ad/Lin28B与对照病毒Ad/GFP被执行视网膜下腔注射以便Ad/Lin28B上调Müller细胞中Lin28B的表达。于感染后的2周，4周和8周收集样本。20%乌拉坦腹腔注射(4-5ml/kg)麻醉，麻醉成功后用0.9％生理盐水(200～250ml)灌注，尽量冲洗血液后，再将大鼠用4%多聚甲醛灌注固定。全身组织器官变硬后取材。眼球组织在4%多聚甲醛中固定，10min后去除眼前节。将眼杯移入4%多聚甲醛中4℃2h。10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水。OCT包埋剂包埋眼杯后10μm的厚度进行冰冻切片。

免疫荧光染色方法：

(1)视网膜切片用PBS洗涤3次，每次5min；

(2)用0.5%TritonX-100孵育10min；

(3)加5%山羊血清封闭非特异性结合位点，1h；

(4)弃去血清，滴加抗PAX6，SOX2，Nestin，CHX10抗体，置于湿盒中于4℃过夜；

(5)PBS冲洗，5min×3次；

(6)滴加荧光二抗，湿盒内，室温下孵育1h；

(7)DAPI染核，室温下孵育5min；

(8)PBS漂洗，5min×3次；

(9)抗荧光淬灭封片剂封片，立即荧光显微镜下照相。LEICA荧光显微镜进行图像观察(目镜×10，物镜×20)，或行激光共聚焦显微镜照相。结果显示：体内Müller细胞感染Ad/Lin28B后干细胞标记的表达情况见图8，9，10，11，12；冰冻切片免疫荧光染色结果表明，感染Ad/Lin28B后，被感染细胞的PAX6，SOX2，Nestin，CHX10表达较对照组明显增高。因此，Lin28B促进Müller细胞的逆分化。

4、经视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，Lin28B对逆分化的RCS大鼠Müller细胞向神经元分化的促进作用

为明确Lin28B过表达对逆分化的Müller细胞向神经元分化的影响，我们执行GS与视网膜神经元Markers（Crx,opsin,rhodopsin,recovering,PKCα和calbindin markers）的双标免疫荧光染色。

其中，Crx(锥杆同源框蛋白,Cone-rod homeobox protein)，opsin（视蛋白），rhodopsin（视网膜紫质），recoverin（感光细胞特异性结合蛋白，photoreceptor-specific calcium-binding-protein），PKCα（蛋白激酶Cα以及calbindin（钙结合蛋白）均为视网膜神经元标记物。具体地，Ad/Lin28B与对照病毒Ad/GFP被执行视网膜下腔注射以便Ad/Lin28B上调Müller细胞中Lin28B的表达。于感染后的2周，4周和8周收集样本。20%乌拉坦腹腔注射(4-5ml/kg)麻醉，麻醉成功后用0.9％生理盐水(200～250ml)灌注，尽量冲洗血液后，再将大鼠用4%多聚甲醛灌注固定。全身组织器官变硬后取材。眼球组织在4%多聚甲醛中固定，10min后去除眼前节。将眼杯移入4%多聚甲醛中4℃2h。10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水。OCT包埋剂包埋眼杯后10μm的厚度进行冰冻切片。

免疫荧光染色方法：

(1)视网膜切片用PBS洗涤3次，每次5min；

(2)用0.5%TritonX-100孵育10min；

(3)加5%山羊血清封闭非特异性结合位点，1h；

(5)PBS冲洗，5min×3次；

(6)滴加荧光二抗，湿盒内，室温下孵育1h；

(7)DAPI染核，室温下孵育5min；

(8)PBS漂洗，5min×3次；

(9)抗荧光淬灭封片剂封片，立即荧光显微镜下照相。LEICA荧光显微镜进行图像观察(目镜×10，物镜×20)，或行激光共聚焦显微镜照相。

结果见图13，14，15，16，17，18，19。结果显示：视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，视网膜感染Ad/Lin28B细胞的（GFP阳性细胞）Crx,opsin,rhodopsin,recovering,PKCα和calbindin markers表达增加，且部分Crx,opsin双标阳性细胞跨越OPL迁移到外核层，而GFAP表达降低。因此，Lin28B过表达能促进逆分化的Müller细胞向神经元分化，而抑制其在此选择胶质命运。

5、经视网膜下腔注射Ad/Lin28B后，Lin28B对RCS大鼠视功能的保护和改善视网膜电图（ERG，electroretinogram）被用于检测视功能改善情况，具体方法是：采用RETI-port系统、环形角膜电极和不锈钢针状电极分别记录Ad/Lin28B感染前与感染后不同时间点（2周，4周和6周）的系列暗适应ERG,Ad/GFP感染组与PBS注射组为对照组，比较在刺激光强、刺激频率、体温相同的情况下,两组大鼠ERG a波与b波振幅的改变。结果显示：视网膜下腔注射Ad/Lin28B后RCS大鼠视功能的改善情况见图20。在注射Lin28B腺病毒的28只RCS大鼠中，有18只视功能有改善，而对照组没有变化。a、b波幅值在注射后2周和4周增高，6周时较4周降低，但仍高于对照组，且有统计学差异。a、b波潜时在各时间点没有差异。因此，Lin28B过表达能保护或改善视功能。

Claims

1.一种用于治疗视网膜疾病的试剂盒，其特征在于：包括可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述腺病毒由以下制备方法制备而得：

（1）构建穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG；

（2）将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞，包装产生而得。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，还包含用于悬浮所述腺病毒的缓冲液，所述缓冲液的配方为：30g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，1L ddH₂O，PH值为7.4。

4.一种治疗视网膜疾病的药物，其有效成分为：可过表达RNA结合蛋白Lin28B的腺病毒。

5.根据权利要求4所述的药物，所述腺病毒为：将穿梭质粒pAV-MCMV-Lin28B-GFP-3FLAG与腺病毒基因组质粒pBHG loxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞，包装产生所得。

6.根据权利要求4或5所述的药物，所述药物为悬浮剂，悬浮剂为所述腺病毒悬浮于缓冲液中，所述缓冲液的配方为：30g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，1L ddH₂O，PH值为7.4。