CN107858374A - 促神经元轴突再生的高表达tsp‑1干细胞制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及神经康复组织工程技术领域。具体而言，本发明公开了一种TSP‑1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：一、构建携带TSP‑1的腺病毒载体：用双酶切法制备pHBAd‑MCMV‑GFP载体和TSP‑1目的片段，将目的基因与载体pHBAd‑MCMV‑GFP连接，用测序法鉴定pHBAd‑MCMV‑GFP‑TSP‑1，保证了外源基因序列的正确性；二、TSP‑1腺病毒转染BMSCs，获得TSP‑1基因修饰骨髓间充质干细胞。本发明选择了TSP‑1基因修饰的骨髓间充质干细胞，加快移植后的神经康复组织工程神经元的恢复和突起的再生，加快损伤局部神经元回路的重建。

Description

促神经元轴突再生的高表达TSP-1干细胞制备和应用
技术领域
本发明涉及神经康复组织工程技术领域，尤其涉及用于治疗脊髓损伤的促进轴突再生的高表达TSP-1干细胞制备和应用。
背景技术
随着我国经济的不断发展，由于交通意外、高处坠落等原因导致的急性脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)患者正逐年上升，如我国天津近年来统计其发生率为23.7人/100万，平均年龄：46.0±14.2岁，呈进行性增加趋势。脊髓损伤多见于青壮年，并且常导致患者感觉、运动、反射与括约肌功能障碍，特别是颈髓损伤，甚至遗留永久性的残疾，大多数患者需要长期住院治疗和康复，给家庭和社会带来了沉重的负担。因此，脊髓损伤后的功能保护和康复已成为目前世界各国研究的热点和难点。
国内外研究表明，损伤局部突触丧失、轴突再生抑制是脊髓损伤后功能恢复的一个难题和治疗靶点。脊髓受外力打击时，脊髓损伤的主要病理变化包括上下行传导束中断、损伤节段突触丧失、残存轴突脱髓鞘。其中传导束损伤，神经回路中断是造成功能损伤的主要原因。
目前已知影响脊髓损伤后的功能修复的因素有：(1)损伤局部神经营养因子缺乏。(2)存在髓鞘的轴突再生抑制物(包括：髓鞘相关糖蛋白，Nogo-A，少突胶质细胞髓鞘糖蛋白)。(3)胶质细胞瘢痕(包括空洞的形成和硫酸软骨素蛋白多糖)。(4)胶质细胞分泌PDGF，与NgR1受体结合后，使RhoA活化，直接引起Rho激酶(Rock)的活化而使LIM激酶激活，进而使cofilin发生磷酸化，从肌动蛋白单体上解离，导致神经元突起末端生长锥的萎缩并最终导致生长锥塌陷。因此找到一种能有效对抗上述抑制因素的治疗方法，同时能替代损伤、死亡的神经元，促进轴突生长及重建神经元突触回路，无疑将有利于保护脊髓组织，减少进一步损伤，同时促进残存脊髓的结构重建与功能康复，为广大脊髓损伤患者带来福音。
随着当前组织和基因工程技术的飞速发展，为脊髓损伤的再生与修复提供了新的思路和方法。经相关基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，使损伤轴突再生、突触重建和恢复脊髓部分功能成为可能，而间充质干细胞，特别是骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)除了具有干细胞的一般特性外，还具有取材方便、不涉及伦理问题、易于外源基因转染及稳定表达、免疫原性弱、可进行自体移植、尚未发现致瘤性等诸多优点，在医学上被认为是一种细胞替代治疗及基因治疗的理想靶细胞，尤其是在神经系统损伤修复领域，有着良好的应用前景。
目前，BMSCs在脊髓损伤中的应用也有了很大的进展，BMSCs损伤局部移植后大鼠运动功能显著改善，同时BMSCs与损伤神经元共培养发现可明显减轻神经元凋亡和保护残存神经元的突触。BMSCs移植治疗SCI，由于轴突生长抑制的微环境没有解决，因此在移植后在突触重建和轴突再生方面仍不令人满意。
血小板反应素(TSP-1)可显著促进轴突的生长和突触的形成。血小板反应素-1(thrombospondin，TSP-1)就是一种促突触形成活性蛋白成分，通过调节突触相关蛋白的转运与细胞分布而诱导生长锥生长方式的改变，促进脑和脊髓的突触形成和发育。以往研究认为TSP-1主要存在于血小板α颗粒及细胞外基质中。但是近年的研究证实TSP-1并非血小板所特有，许多组织如肾脏、心脏、软骨和脑中都有TSP-1基因产物的表达，是许多不同组织细胞外间质的重要成分，并参与了多种病理生理过程。新近研究表明，TSP-1基因敲除小鼠在脑中风后突触的形成和轴突的生长明显受限。唐氏综合征患者脑内胶质细胞TSP-1分泌亦有所减少，可能抑制突触的形成并参与胶质细胞的病变。
由于TSP-1为多结构域分子，故其效应多种多样，最重要的是TSP-1可通过调节其他细胞因子，而间接引起生物学行为的改变，尤其TSP-l与L-TGF-β1的LAP区域结合，可改变LAP的空间构型，使TGF-β1上与受体结合的位点暴露，从而激活TGF-β1成为A-TGF-β1。研究表明TGF-β可通过促星形胶质细胞活化及轴突生长，从而促进脊髓损伤后的修复。TGF-β1通过磷酸化Smad2，调节Cdh1-APC/SnoN信号，从而影响神经元轴突的生长，并促进雪旺细胞增殖及轴突髓鞘形成。在中枢神经系统TGF-β1亦可刺激星形胶质细胞产生和释放碱性成纤维生长因子等多种因子而促进神经元存活和分化。对主动脉内皮细胞的研究表明，TSP-1还可以通过FAK依赖的信号通路灭活RhoA而使黏着斑分解。而RhoA正是脊髓损伤后释放的髓鞘轴突再生抑制物发挥作用的关键信号通路的蛋白。此外作为神经元发育和再生的一个标记蛋白生长相关蛋白43(growth—associated protein 43，GAP-43)是一种胞膜磷酸蛋白质，可以作为损伤脊髓组织脊髓神经元的再生和修复的标记蛋白，其表达增加提示损伤段脊髓轴突再生和突触重建。本课题组先前研究已经证实GAP-43对于神经系统发育过程中的轴突生长和突触形成具有重要作用，可作为研究的一个标记蛋白；如参考文献Zhou J,Wang L,Ling S,Zhang X.Expression changes of growth-associated protein-43(GAP-43)andmitogen-activated protein kinase phosphatase-1(MKP-1)and in hippocampus ofstreptozotocin-induced diabetic cognitive impairment rats.Exp Neurol.2007；206(2):201-8。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于治疗脊髓损伤的促进轴突再生高表达TSP-1的细胞制备和应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下的步骤：
一、构建携带TSP-1的腺病毒载体：
1)、用双酶切法制备pHBAd-MCMV-GFP载体和TSP-1目的片段；
2)、将目的基因与载体pHBAd-MCMV-GFP在16℃连接过夜，得pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1；
3)、用测序法鉴定pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1，保证了外源基因序列的正确性；
所述测序法为：将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1测序结果与NCBI中TSP-1基因比对，检测有无核苷酸的突变、缺失或者移位；选用与NCBI中序列完全相同的克隆子；
二、TSP-1腺病毒转染BMSCs：
取第3代大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，细胞以1×106/孔密度接种于10cm培养皿中，正常培养，24h细胞贴壁稳定后，准备进行转染；
所述转染为：将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1用3ml高糖无血清培基稀释，以MOI为50计算所需病毒液的量为5μL，再加入5μL浓度为2mg/ml的Polybrene，振荡混匀后，加入移除培养基的培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内孵育6h；孵育结束后，吸除病毒液和无血清培养基，加入含血清的完全细胞培养液10ml继续培养48h，获得TSP-1基因修饰骨髓间充质干细胞。
作为本发明的TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法的改进：步骤一的2)包括如下步骤：
①、目的基因TSP-1与载体pHBAd-MCMV-GFP，16℃连接过夜，结束后置于4℃冰箱备用；载体连接体系如下：酶切后片段2μL，酶切后载体pHBAd-MCMV-GFP 100-200ng；
②、-70℃冰箱取出感受态细胞DH5a悬液100μl，室温下解冻，融化后立即置于冰上；向其中加入5μL连接产物，并在管上做好相应的标记，混匀混合物，冰上放置30分钟；
③、42℃水浴中热激90秒，热激过程中不要移动离心管，热激后置于冰上3-5分钟，向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，吸打混匀后于37℃，220rpm摇床振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；
抗生素抗性通过外源性转入；
④、将上述菌液摇匀后，离心，去除900μl上清，余下培养基吸打混匀后取100μl涂布于含抗生素(例如为抗氨芐青霉素抗生素)的筛选平板上；
⑤、平板正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时；得pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1。
本发明还同时提供了利用上述方法制备的TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的用途：与氧糖剥夺处理过的VSC4.1共培养，BMSCs+TSP-1促进了VSC4.1的轴突再生。
本发明涉及神经康复组织工程技术领域，该细胞模型以BMSCs作为转染细胞，TSP-1基因进行转染修饰。
为了解决神经康复组织工程中神经元损伤严重以及突起生长抑制，而单纯的BMSCs移植治疗SCI仅能减轻神经元凋亡，并不能解除突起生长抑制；因此，本发明的目的是提供TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法。本发明选择了TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞，加快移植后的神经康复组织工程神经元的恢复和突起的再生，加快损伤局部神经元回路的重建。
采用可大量增殖的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为TSP-1稳定表达的细胞载体，对脊髓损伤后神经元轴突的生长以及再生，重建损伤局部神经元回路有着显著的促进作用。
本发明证明高表达TSP-1的BMSCs可以促进神经元轴突的再生。
本发明由于采用了上述的技术方案，选择了TSP-1基因修饰BMSCs，达到较为长期、高效、局部的效果，避免了直接应用生长因子时可能发生的过量反应和全身性毒副作用。采用这一策略，不仅可以获取具有旺盛生理功能的种子细胞，而且利用腺病毒载体还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白利于组织构建。本发明可以加快移植后的神经康复组织工程神经元的恢复和突起的再生，加快损伤局部神经元回路的重建。
本发明所得的TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞TSP-1-BMSCs的使用方式可参照现有的BMSCs的使用方法。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为双酶切获得的TSP-1片段。
Lane1：TSP-1双酶切产物；Lane2：DNA Marker(Marker从上至下依次为：1000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2000bp,1000bp,500bp)。
图2 TSP-1单克隆鉴定PCR产物；Lane1～7：重组质粒的TSP-1单克隆鉴定PCR产物，Lane8：GeneRay 1kb DNA Marker(从上至下依次为：12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。
图3为重组质粒DNA测序结果。通过对照验证调取的TSP-1基因序列，证明没有碱基的突变、缺失、移码。
图4出毒细胞的形态；
A：转染前 293细胞状态；B：TSP-1重组腺病毒包装293细胞。
图5为Western Blot结果。Western Blot结果：TSP-1蛋白的表达。
图6为转染后的BMSCs中GFP表达图。左为正常BMSCs光镜图；中为转染空载体对照腺病毒的BMSCs荧光图，右为转染TSP-1腺病毒的BMSCs荧光图。
图7为OGD处理的运动神经元VSC4.1与转染后的BMSCs共培养，神经元突起的生长情况。A、B、C分别是Control组的GAP-43、DAPI、GAP-43和DAPI叠加；D、E、F分别是OGD+BMSCs组的GAP-43、DAPI、GAP-43和DAPI叠加；G、H、I分别是OGD+TSP-1-BMSCs组的GAP-43、DAPI、GAP-43和DAPI叠加；J是有轴突细胞的百分比的统计图，OGD+TSP-1-BMSCs组、OGD+BMSCs组与Control组相比，###P<0.01；OGD+TSP-1-BMSCs组与OGD+BMSCs组相比***P<0.01。
图8为OGD处理的运动神经元VSC4.1与转染后的BMSCs共培养，神经元突起的生长因子GAP-43蛋白的表达情况。A是GAP-43的免疫印迹检测结果；B是GAP-43的免疫印迹检测结果统计图，OGD+TSP-1-BMSCs组、OGD+BMSCs组与Control组相比，###P<0.01；OGD+TSP-1-BMSCs组与OGD+BMSCs组相比**P<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、携带TSP-1的腺病毒载体的构建：
1.1腺病毒载体的构建
1.1.1合成目的基因TSP-1序列：
该序列如SEQ ID NO:1所示。
1.1.2目的基因片段的纯化
将步骤1.1.1所合成的目的基因序列，用Not I和EcoR I双酶切基因获得TSP-1片段，在37℃条件下酶切3小时，酶切体系如下：
酶切完成后胶回收，切下目的片段，利用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)(Gel-Spin DNA Extraction Kit)回收目的片段，具体方法如下：
1)DNA电泳(建议使用TAE缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳)结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段。仔细将胶块中无DNA部分去除掉。
2)含DNA的琼脂糖胶块装入1.5ml离心管，估算其体积。加入500μl(<150μl凝胶)或3～4倍(>150μl凝胶)凝胶体积的Buffer PS(溶胶结合液)。
3)离心管置于50～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混悬震荡10sec，至琼脂糖凝胶完全溶解，室温放置5min冷却。
4)将少于700μl融化胶液转移至插入套管的离心柱内，于台式离心机上高速离心1min，弃去套管内废液，再将离心柱插入套管。
5)多于700μl的剩余融化胶液，加入同一离心柱内，重复步骤4。
6)向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)700μl，高速离心1min，弃去废液，将离心柱插入套管。
7)向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)200μl，高速离心1～2min。此步骤可省略，直接进行步骤8。
8)高速离心1～2min后，小心取出离心柱，不要沾上套管内的废液。弃去套管。
9)将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer(洗脱液)，不要触及硅胶膜；室温放置2～5min，高速离心1min，即得纯化的DNA溶液。
10)获得的DNA溶液，可直接应用于后续实验中，或保存于-20℃备用。
图1为双酶切获得的TSP-1片段。根据图1，可得知：成功获得了TSP-1基因片段。
1.1.3目的基因(TSP-1)与pEASY-T1载体连接
将目的基因(步骤1.1.2所得的双酶切后的TSP-1片段，即，酶切后片段)与载体pHBAd-MCMV-GFP(即，酶切后载体)在16℃连接过夜，得到重组基因pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1,连接结束后置于4℃冰箱备用。
载体连接体系如下：
1.1.4 TSP-1与pHBAd-MCMV-GFP载体连接产物转化
1)从-70℃冰箱中取100μl感受态细胞DH5a悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
2)加入步骤1.1.3所得的质粒DNA溶液(含量不超过1μg，体积不超过10μl，较佳为5μL)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
3)42℃水浴中热击90秒，热激过程中不要移动离心管，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，吸打混匀后于37℃，220rpm摇床振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5)将上述菌液摇匀后，离心，去除900μl上清，余下培养基吸打混匀后取100μl涂布于含抗生素(例如为抗氨芐青霉素抗生素)的筛选平板上。
6)平板正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
1.1.5 TSP-1与pHBAd-MCMV-GFP连接产物检测
1.1.5.1重组质粒提取和纯化
1)取过夜培养菌150ml菌液(即，取用150ml的步骤1.1.4所得的转化后连接产物)，装入合适的离心瓶中，5000g于4℃离心10min沉淀菌体，完全弃除上清。
2)加入5ml Buffer I，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。细菌悬液移入50ml离心管中。
3)加入5ml Buffer II，轻轻颠倒离心管8次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明。
4)加入5ml Buffer III，立即颠倒离心管8次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置10～15min。
5)上述裂解液于4℃12,000-16,000g离心15min，小心吸出上清，移入新的50ml离心管中。
6)加入10ml异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。冰上放置15min。
7)于4℃15000g离心10min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入0.5mlBuffer I，完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5ml离心管中，室温放置10～20min。
8)质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2min，上清移入新的1.5ml离心管中。
9)0.5ml质粒粗提液中加入100μl Buffer IV(杂质清除液A)，轻轻混匀，12,000g离心2min，将上清液转移至新的离心管中。
10)再加入100μl Buffer IV(杂质清除液A)，轻轻混匀，12,000g离心5min，将上清液转移至新的离心管中。
11)加入70μl Buffer V(杂质清除液B)，轻轻混匀，12,000g离心5min，将上清液转移至新的离心管中。
12)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min。12,000g室温离心10min，弃去上清液，用70％乙醇1ml轻轻洗涤，弃去液体，室温倒置凉干5min。
13)0.5ml TE溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)
14)加入200μlBufferVI(杂质清除液C)，混匀后冰上放置10～30min，12,000g室温离心10min，弃去上清液，轻轻加入1ml 70％乙醇洗涤两次，室温倒置凉干5～10min使乙醇完全蒸发。
15)加适量TE(200～500μl)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡以辅助溶解)，即为提取纯化好的重组质粒。
1.1.5.2重组质粒DNA的双酶切
质粒提取结束后，按以下体系37℃酶切4h，1.2％琼脂糖凝胶检测；
酶切体系为：
2ul 重组质粒DNA
1ul Not I
1ul EcoR I
2ul 10×buffer
14ul H2O
20ul volume
图2为TSP-1单克隆鉴定PCR产物。根据图2，可得知：成功获得了TSP-1基因与载体的重组基因。
1.1.6 DNA测序及序列分析
将酶切和PCR检测为阳性的克隆子测序，将测序结果与NCBI中TSP-1基因比对，检测有无核苷酸的突变、缺失或者移位。通过BLAST，与NCBI中序列完全相同的克隆子，扩大培养，保存菌液。
图3为重组质粒DNA测序结果。根据图3，可得知：重组质粒中的TSP-1序列与已知的TSP-1序列一致。
1.2 293细胞培养及病毒包装
37℃、5％CO2培养293T细胞，待细胞粘合度达到90％时，利用LipofiterTM转染试剂进行转染。
1.2.1铺细胞：
转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置37℃含5％CO2的培养箱中培养过夜。
1.2.2转染
待细胞生长至底面积70～80％时，取重组腺病毒载体质粒TSP-1过表达及骨架质粒pHBAd-BHG，用LipofiterTM转染试剂进行转染。具体步骤为：
a.转染前2小时更换完全培养基。取2ug重组腺病毒载体质粒TSP-1(上述步骤.1.5.2所得)过表达，4ug骨架质粒pHBAd-BHG。用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
b.取15ul的LipofiterTM，用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
c.将两者(步骤a所得物和步骤b所得物)混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5％CO2的培养箱中培养。
注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。
1.2.3换液
转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。
1.2.4收毒(P1)：
每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。
1.2.5冻融：
打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为Ad-TSP-1过表达第一代毒种(P1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。
1.2.6扩增：
从P1代病毒上清(约3ml左右)中取2ml感染一个10cm的细胞培养皿的细胞(细胞密度保证90％以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，作为毒种保留。
1.2.7收毒(P2)：
病毒扩增两天后待所有细胞脱落，即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15ml离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于－80℃保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。
图4出毒细胞的形态。根据图4，可得知：细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑，表示细胞正在出毒。
实施例2、携带TSP-1的腺病毒转染骨髓间充质干细胞
2.3 TSP-1基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞
2.3.1取第3代大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，细胞以1×106/孔密度接种于10cm培养皿中，正常培养(培养基为DMEM，加双抗，加百分之十的FBS，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下培养)，24h细胞贴壁稳定后，准备进行转染；将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1和pHBAd-MCMV-GFP分别用3ml高糖无血清培基稀释，以MOI为50计算所需病毒液的量为5μL，再加入5μL浓度为2mg/ml的Polybrene，振荡混匀后，加入移除培养基的培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内孵育6h；孵育结束后，吸除病毒液和无血清培养基，加入含血清的完全细胞培养液10ml继续培养48h，获得TSP-1基因修饰骨髓间充质干细胞TSP-1-BMSCs。
2.3.2转染48h后，细胞分别用来荧光显微镜观察和蛋白免疫印迹(Western Blot)的来检测目的基因TSP-1的蛋白的表达，β-action作为内参；
图5为Western Blot检测TSP-1表达的结果；根据图5，可得知：腺病毒转染成功，并且TSP-1基因在BMSCs中成功高表达了。
图6为GFP的表达情况；根据图6，可得知：腺病毒转染成功。
2.4 TSP-1基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞对神经元轴突再生的影响
2.4.1 VSC4.1细胞系的培养基为RPMI1640，作为运动神经元细胞，通过氧糖剥夺来模拟脊髓损伤微环境。采用Trans-well板实现BMSCs与VSC4.1的共培养，提前24h，分别将BMSCs，TSP-1-BMSCs以5×105cell/well的密度接种到Trans-well板的小室内，正常培养过夜；而VSC4.1则5×105cell/well的密度接种于6孔板内，按照OGD模型进行损伤，OGD结束后。分别将含有BMSCs，BMSCs+TSP-1的Trans-well板的小室转移到VSC4.1的6孔板内，添加完全培养基，37℃，5％CO2培养箱正常培养20h。Control组，OGD损伤的VSC4.1加入普通培养基替代BMSCs。共培养20h后，收集下层的VSC4.1，一部分用PBS洗涤三次，每次3min，4％多聚甲醛固定15分钟，用0.3％的Triton X-100和0.1％牛血清白蛋白处理15分钟。随后，用10％正常驴血清封闭30分钟，一抗GAP-43孵育1小时。充分洗涤后，用二异硫氰酸荧光素标记抗体孵育1h，细胞冲洗，用荧光显微镜观察突起的生长情况。另一部分细胞1000rmp离心5min，获得沉淀细胞；加入预冷的PBS重悬，洗涤，1000rmp离心5min，重复一次；每管细胞加入300ul含PMSF的裂解液，冰上孵育20分钟，使细胞充分裂解；将悬液于4℃，14000g离心10mim。上清液移至新的预冷1.5ml Ep管中，该上清液即为VSC4.1的胞内总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，Western Blotting检测GAP-43的表达，以200V(35V/cm gel)进行电泳，Loading Buffer刚跑出胶停止电泳，在冰浴中进行转膜，100V，100min；脱脂牛奶中封闭一个小时，之后加入一抗GAP-43孵育过夜，二抗避光孵育2小时，用OdysseyClx检测蛋白表达。
所得结果如图7和图8所述。图7为神经元突起的生长情况，图8为Western Blot检测GAP-43表达的结果。
根据图7，可得知TSP-1-BMSCs可以促进神经元突起的再生；根据图8，可得知TSP-1-BMSCs可以促进神经元突起的再生。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 促神经元轴突再生的高表达 TSP-1 干细胞制备和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3527
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gaattcatgg agctcctcag gggactaggc gtcctgttcc tgttgcatgt gtgtggaagc 60
aaccgcattc cagagtctgg gggagacaat ggtgtgttcg acatttttga actcattgga 120
ggtgcccgca aggttccggg tcgccgactg gtgaagggcc aagatctatc cagccccgcc 180
ttccggatcg agaatgccaa cctgatcccc cctgtgccag atgacaagtt ccaagaccta 240
ctggacgctg tgtgggccga caaaggcttc atcttcctgg cttccttgag gcagatgaag 300
aagactcggg gcacactcct ggccgtggaa cggaaagaca attctggcca gatcttcagt 360
gtggtctcca atggcaaagc cggcaccctc gatctgagtc tgagcctgcc cgggaagcag 420
caagtggtgt cagtggagga agctctcctg gccactggcc agtggaagag catcacgctg 480
tttgtccaag aagacagggc ccagctctac attgactgtg acaagatgga gagcgcagag 540
ctggatgttc ccatccagag catcttcaca agggatttgg ccaatgtcgc caggctccga 600
gtcgcaaagg gagatgtcaa tgacaatttt cagggggtgc tgcagaatgt gaggtttgtc 660
tttggaacca ccccagaaga cattctcagg aacaaaggct gctccagttc aaccaacgtc 720
cttctcaccc ttgacaacaa cgtggtgaac ggttccagcc ctgccatccg caccaactac 780
atcggccaca aaacaaagga cctccaagcc atctgtggcc tctcctgtga cgaactatcc 840
agcatggtcc tggaactgag gggcctgcgt accatcgtga ccacgctaca ggacagcatt 900
cgcaaagtga cggaagagaa cagagagctg gctagcgagc tgaggcggcc tcccctctgc 960
ttccacaatg gagtccaata caggaacaac gaggagtgga ctgtagatag ttgcacagag 1020
tgtcactgcc agaactcagt taccatctgc aaaaaggtgt cctgtcccat catgccctgc 1080
tccaatgcca cagttcctga tggtgaatgc tgcccacggt gctggcccag tgactctgct 1140
gacgatggct ggtctccctg gtctgagtgg acctcttgct ctgccacctg tggcaatggg 1200
attcagcaac gtggtcgctc ctgtgacagc ctcaacaaca gatgtgaggg ctcttcagta 1260
cagacgagga cctgccacat tcaggagtgc gacaaaagat ttaaacagga tggtggttgg 1320
agtcactggt ccccgtggtc gtcctgttct gtgacctgtg gtgacggtgt gatcacgagg 1380
atccgactct gcaactcccc cagcccccag atgaacggga agccctgtga aggtgaagct 1440
cgggagacca aagcctgcaa gaaggacgcc tgcccaatca atggaggctg gagtccctgg 1500
tcactatggg acatctgctc tgtcacctgt ggaggaggag tacagagacg tagccgactc 1560
tgcaacaacc ccacacccca gtttggaggc aaagactgtg ttggtgatgt gacggaaaat 1620
caagtttgca acaagcagga ctgtccgatt gatggatgcc tgtccaatcc ctgctttgct 1680
ggtgccaagt gtacgagcta tcctgatggt agctggaaat gtggtgcgtg tcctcctggc 1740
tacagtggaa atggtatcca gtgcaaagac gtcgacgagt gcaaagaagt gcctgatgct 1800
tgcttcaatc acaacgggga acatcggtgc aagaacacag atcctggcta caactgcctg 1860
ccctgcccac cacgattcac cggctcacag cccttcggca gaggtgtcga acacgctatg 1920
gccaacaaac aggtgtgcaa accccgaaac ccctgcaccg acgggacaca cgactgcaac 1980
aagaacgcca agtgcaacta cctgggtcac tacagcgacc ccatgtaccg ctgcgagtgc 2040
aagcctggct atgcaggcaa tggcatcatt tgcggagagg acacagacct tgacggctgg 2100
cctaatgaaa acctggtgtg tgtggccaac gcaacctacc actgcaaaaa ggacaactgc 2160
cccaatcttc ccaattcggg gcaggaagac tatgacaagg atgggattgg cgatgcctgt 2220
gatgacgatg atgacaacga caagattcct gatgacaggg acaactgtcc attccattac 2280
aaccctgccc agtatgacta tgacagagat gatgtgggag accgctgtga caattgcccc 2340
tacaaccaca accctgacca ggcagacaca gacaacaatg gggagggaga tgcctgcgct 2400
gtggacatcg atggggatgg aatcctcaat gaacgagaca actgccagta tgtttacaac 2460
gtggatcaga gggacacgga catggatggg gttggagacc agtgtgacaa ctgccccctg 2520
gaacacaatc cagaccagct ggactctgac tcggaccgca taggggacac ctgtgacaac 2580
aatcaggcca tcgatgagga tggccatcag aacaaccttg aaaactgtcc ctatgtgccc 2640
aatgccaacc aggccgacca cgataaagat ggtaaaggag acgcctgtga ccatgacgat 2700
gacaacgacg gcatccctga tgacagagac aactgcaggc tggtgcccaa tcctgaccag 2760
aaggactctg atggtgatgg ccgaggcgat gcctgcaaag acgactttga ccatgacaat 2820
gtgccagaca ttgatgacat ctgtcctgag aatgttgaca tcagtgaaac cgatttccgc 2880
cgattccaga tgattcctct agatcccaaa ggaacctccc aaaatgaccc taactgggtt 2940
gtccgccatc agggcaaaga acttgtccag actgtaaact gtgaccctgg acttgctgta 3000
ggttatgatg agtttaatgc cgtggacttc agtggtacct tcttcatcaa cactgagagg 3060
gatgacgact atgctggctt tgttttcggg taccagtcca gcagccgctt ctacgttgtg 3120
atgtggaaac aagtcaccca gtcctactgg gacaccaacc ccacaagggc tcagggatac 3180
tcaggcctgt ctgtaaaggt tgtaaactcc accactggcc ccggcgagca cctgcggaat 3240
gcactgtggc acacaggaaa cacccctggc caggtgcgca ccctgtggca tgaccctcgt 3300
cacattggct ggaaagattt cactgcatac agatggcgtc tcagccacag gccaaagacc 3360
ggtttgatca gagtggtgat gtatgaagga aagaaaatca tggctgactc aggacccatc 3420
tatgacaaaa cctacgctgg cggtagacta ggcctgttcg tcttctctca agaaatggtg 3480
ttcttctcgg acatgaaata cgagtgccga gactcctaag cggccgc 3527

Claims (3)

1.TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下的步骤：
一、构建携带TSP-1的腺病毒载体：
1)、用双酶切法制备pHBAd-MCMV-GFP载体和TSP-1目的片段；
2)、将目的基因与载体pHBAd-MCMV-GFP在16℃连接，得pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1；
3)、用测序法鉴定pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1，保证了外源基因序列的正确性；
所述测序法为：将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1测序结果与NCBI中TSP-1基因比对，检测有无核苷酸的突变、缺失或者移位；选用与NCBI中序列完全相同的克隆子；
二、TSP-1腺病毒转染BMSCs：
取大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，细胞以1×106/孔密度接种于10cm培养皿中培养，24h细胞贴壁稳定后，准备进行转染；
所述转染为：将pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1用3ml高糖无血清培基稀释，以MOI为50计算所需病毒液的量为5μL，再加入5μL浓度为2mg/ml的Polybrene，振荡混匀后，加入移除培养基的培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内孵育6h；孵育结束后，吸除病毒液和无血清培养基，加入含血清的完全细胞培养液10ml继续培养48h，获得TSP-1基因修饰骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于步骤一的2)包括如下步骤：
①、目的基因TSP-1与载体pHBAd-MCMV-GFP，16℃连接过夜，结束后置于4℃冰箱备用；载体连接体系如下：酶切后片段2μL，酶切后载体pHBAd-MCMV-GFP 100-200ng；
②、-70℃冰箱取出感受态细胞DH5a悬液100μl，室温下解冻，融化后立即置于冰上；向其中加入5μL连接产物，并在管上做标记，混匀混合物，冰上放置30分钟；
③、42℃水浴中热激90秒，热激过程中不要移动离心管，热激后置于冰上3-5分钟，向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，吸打混匀后于37℃，220rpm摇床振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；
④、将上述菌液摇匀后，离心，去除900μl上清，余下培养基吸打混匀后取100μl涂布于含抗生素的筛选平板上；
⑤、平板正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时；得pHBAd-MCMV-GFP-TSP-1。
3.如权利要求1或2所述的方法制备的TSP-1基因修饰的骨髓间充质干细胞的用途：与氧糖剥夺处理过的VSC4.1共培养，BMSCs+TSP-1促进了VSC4.1的轴突再生。
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