CN104762318B - 人凝血因子viii基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法。本发明构建了针对性的原位修复治疗,针对性地修复这种类型的F8突变,并且联合应用TALEN技术在血友病病人特异的iPSCs中验证了这种原位修复策略。这是国际上第一个针对内含子22倒位这种常见HA突变的原位修复策略。原位修复策略导入的序列是精确的定点导入,相对安全,不存在现有技术中的不确定性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法。
背景技术
血友病A(Hemophilia A,HA)是最常见的X连锁出血性遗传病,发病率较高,重型血友病具有致残致死性,尚无根治方法。HA一直被学术界认为是最有可能通过基因治疗治愈的遗传病之一,其病因是由于人凝血因子VIII基因(以下简称F8)缺陷而导致人凝血因子VIII蛋白(FVIII)含量不足或功能缺陷,从而引起凝血功能障碍,在出生男婴中的发病率约为1/5000。HA的主要症状为自发性出血或创伤后出血不止。关节反复出血常可致残,重型血友病(FVIII<1%,约占血友病患者的50%-60%)患者甚至可能由于颅内出血而危及生命。目前针对该病主要使用含FVIII的血浆制品行替代治疗,早期的血浆制品存在病毒污染(艾滋病病毒、丙型肝炎病毒等)等问题,工艺改进后以及重组的FVIII制品价格昂贵,由于FVIII在血浆中的半衰期只有12小时,因此血友病患者常需终身反复输注,这给患者及家庭带来了沉重的经济及心理负担。另外,一部分HA患者会由于反复输注而产生FVIII抑制性抗体,导致替代治疗无效。
基因治疗作为一种全新的治疗方式,为类似血友病这样的严重单基因遗传病带来了新的希望。而血友病也一直被学术界认为是最有可能实现基因治疗的遗传病之一。基因治疗最理想的方式是原位修复,即在缺陷基因的原位点通过同源重组的途径进行精确的基因修复。这样修复的好处是显而易见的:不仅保留了基因的完整性,同时还保留了基因的调控元件,修复后的基因能够像正常人的一样发挥作用,但是该方法对技术要求较高。另一种基因治疗方式是基因替代,就是将带有启动子的治疗基因随机或者定点整合到缺陷细胞中,从而达到治疗的目的。由于技术的限制,目前进行的绝大部分基因治疗研究都是采用基因替代策略。
F8于1984年被成功克隆,该基因长达186kb,包含26个外显子,是已克隆的最大基因之一。其cDNA长达9kb,这对目前的载体系统是一个比较大的挑战。即使是采用广泛使用的B区缺失策略,编码序列也有约4.5kb,这直接导致使用常规的基因治疗手段,很难达到较高的治疗基因整合效率。这是导致目前HA的基因治疗研究未取得突破的一个原因。血友病B(hemophilia B,HB)的发病率只有HA的约四分之一,但是目前已有较有效的针对HB的基因治疗研究,一定程度上是因为人凝血因子IX基因(F9)的编码序列只有1.4kb,比较易于操作。
F8的突变类型非常多,至今人类突变数据库(The Human Gene MutationDatabase,HGMD)记录的突变种类已有2800多种,包括错义突变、无义突变、小片段缺失与插入等。Lakich等在1993年发现,约有45%的重型患者为22号内含子倒位型突变。机制如图1所示,F8的22号内含子内部含有两个转录的基因,A基因和B基因。在F8基因外部,位于X染色体的远端还有两个与A基因高度同源的拷贝。在男性减数分裂过程中,F8基因内的A基因可能与F8外的任何一个A基因配对,从而导致同源重组介导的倒位发生,中间倒位的片段长达0.6Mb,直接导致F8基因被完全破坏,进而导致患者呈现重型HA的表型。
从图1我们可以发现,该倒位对F8的直接结果是导致22号内含子以后的部分与前一部分完全分开。另外虽然牵涉了大片段的倒位,但是F8前22个外显子以及启动子区域是完全保留的,而通过比对我们发现后面4个外显子的编码序列仅有627bp。
人体中FVIII由肝脏分泌,主要是肝血窦内皮细胞(endothelial cells,ECs)。这类细胞由于取材难度以及增殖能力的限制,并不适合直接用来进行基因打靶。而人诱导多潜能干细胞由于具有无限增殖能力以及多向分化潜能,非常适合用于验证这种修复策略。最近国际上在iPSCs诱导方面取得了一些突破性进展,比如北京大学的邓宏魁实验室建立了仅使用小分子化合物成功诱导出了小鼠iPSCs。这种技术完全避免了病毒感染和其它转基因诱导的使用,大大地提高了iPSCs的安全性。虽然这些前沿性技术现在还仅仅在小鼠细胞实现,但是纵观干细胞的发展史,我们有理由相信在不久的将来很有可能会出现相对安全的人iPSCs诱导技术,届时iPSCs在再生医学以及基因治疗领域的应用将翻开新的篇章。
进两年兴起的类转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)TALENs是一种人工核酸酶,与上一代人工核酸酶锌指酶(zinc finger nucleases,ZFNs)相比,具有易于设计以及较高的有效率等特点。TALENs与ZFNs类似,可以特异性切割DNA产生双链断裂(double strand break,DSB)。由于细胞修复DSB主要是通过不精确的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)机制修复,所以目前TALEN被广泛用来做基因敲除。另一方面,DSB可以激活位点附近的同源重组(homologous recombination)活性,在打靶载体存在的情况下,可提高基因打靶效率达3个数量级之多。
目前针对血友病的基因治疗研究都是采用基因替代的方法,就是将一个完整的外源人凝血因子VIII基因(F8基因)表达框导入到缺陷细胞内,从而发挥作用替代缺陷的基因,而缺陷的基因本身并没有得到修复。针对突变基因最理想的策略是原位修复,HA当中最常见的突变类型是22号内含子倒位型突变,约有45%的重度HA患者的都这种突变类型,开发一种针对这种突变的原位修复方法对疾病的研究是很有意义的。目前在其他基因的原位修复研究中,一般是针对点突变的修复,还没有针对F8基因22号内含子倒位突变的原位修复策略。
如上所述,目前还没有针对22号内含子倒位型F8突变的原位修复策略。如果把范围扩大的话,目前HA的基因治疗研究倒是有不少,都是使用的随机整合策略。这种策略是一种比较粗放的基因治疗方式,就是使用一个质粒来转染F8缺陷的细胞,这个质粒包含了F8的整个编码序列以及一个启动子序列。F8表达框有一定几率整合到基因组中,从而表达FVIII蛋白发挥作用。其缺点有:
a.F8很大,编码序列为8kb左右,即使是一种B区缺失的版本也有4k多,再加上启动子序列,那么这个质粒很大,一般来说质粒越大,构建也越麻烦,整合效率也很低。
而我们的策略最终整合的片段只有627bp的编码序列和一个polyA信号,总长为893bp,技术上非常容易实现;
b.如果基因随机整合到基因组中,基因的表达可能会受到位置效应的影响,有可能表达效率低,甚至不能表达。
我们的策略是原位修复,就是将原来的突变的基因修复,这样可以在基因原有的启动子以及调控元件下,像正常人的那样表达;
c.如果质粒整合到其他内源性基因则有可能破坏内源性基因或者激活原来不表达的有害基因,从而导致不好的后果。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足,提供一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法。
为了达到上述目的,本发明提供的技术方案为:
本发明提供了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒,所述质粒序列如SEQ ID NO.29所示,命名为质粒F8-22-PGK-Neo。
本发明还提供了一种构建上述质粒的试剂盒,所述试剂盒包括序列如SEQ IDNO.7至SEQ ID NO.18所示的引物。
本发明还提供了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复试剂盒,所述试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.28所示的引物。所述试剂盒中还包括质粒F8-22-PGK-Neo。
本发明还提供了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复方法,所述方法是采用人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复试剂盒将人凝血因子VIII基因23-26号外显子的编码序列及polyA信号通过同源重组的方式添加到人凝血因子VIII基因22号外显子和22号内含子的交界处,将22号内含子倒位型突变的人凝血因子VIII基因遗传信息补全。具体包括如下步骤:
(1)构建TALENs表达质粒;
(2)构建质粒F8-22-PGK-Neo;
(3)用TALENs表达质粒和质粒F8-22-PGK-Neo转染人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的人诱导多潜能干细胞中进行原位修复。
下面对本发明作进一步说明:
本发明试剂盒所涉及的引物如表1所示:
表1
(1)TALENs表达质粒的构建
①使用美国哈佛医学院Keith Joung实验室建立的“REAL Assembly TALEN Kit”体系构建TALEN。该体系包含32个TALE单体质粒,4个TALEN表达质粒,且每个TALEN表达质粒上还有一个半TALE模块。使用ZiFiT软件设计好TALEN后就使用该体系逐级构建。构建的流程就是通过体系里携带单体的质粒构建成二联体,再从二联体构建成四连体,以此递进最终构建成大概16联体左右的中间质粒;
②要完成每一步的连接,需将待连接的两个质粒先行酶切。两个质粒(按连接后上下游顺序)可使用的内切酶组合有两种选择,分别为上游质粒:BsaI+BamHI,下游质粒:BbsI+BamHI(连接后使用上游质粒作为骨架);或者上游质粒:XbaI+BsaI,下游质粒:XbaI+BbsI(连接后使用下游质粒作为骨架)。两种方案构建的质粒序列是完全一致的,本研究中多采用第一种方案。
由于酶切上游质粒时BsaI和BamHI的识别序列距离较近,所以分两步酶切,首先配制如下体系:
37℃酶切过夜后再加入0.2μl BamHI继续酶切4h,酶切体系置PCR仪上65℃×20min终止酶切备用。
下游酶切可以在一个体系里同时双酶切:
37℃酶切过夜后置PCR仪上65℃×20min终止酶切备用。
③连接。由于在构建多条TALENs时往往会同时做数十个连接,而且对于前几步连接,酶切掉的片段都很小(每个TALE模块只有约100bp)所以如果每个酶切产物都要切胶回收的话工作量是非常大的而且难以操作。所以我们设计了一个折衷的方案。以第一步单体连接成二联体为例,上游只切成了骨架和一个12bp的小片段,下游切成了骨架和一个约100bp的TALE片段,每个片段两端的粘性末端都不同,均不存在自连。我们的做法是直接将上下游的酶切产物混合后使用一个PCR纯化柱进行纯化。在上述4条酶切产生的片段里,PCR纯化柱理论上可以弃去12bp的小片段,只剩下上下游骨架和下游质粒产生的TALE片段。上下游骨架都是可能和游离的TALE片段连接成完整的环状质粒,其机会理论上是均等的,而我们要的是前者。如上面酶切体系,我们上下游质粒酶切的量分别为100ng和30ng,这样理论上产生的两种环状质粒的比例应为10:3,可以保证一半以上都是我们要的质粒,我们每个连接挑取3个菌落进行鉴定,基本上可以保证能够获得连接成功的菌落。事实证明我们的设计是可行的。
两部分混合后以PCR纯化,用17.5μl ddH2O溶解纯化产物,配制连接体系:
16℃水浴连接2h后取5-10μl转化感受态细胞;
④培养过夜后挑取菌落,每个菌落在EP管中以500μl液体LB以280rpm×37℃×2h,之后取1μl做菌液PCR,剩余继续摇菌,PCR体系如下:
热循环条件如图22所示。
PCR完成后取5μl产物琼脂糖凝胶电泳分析,理论上连接成功的二联体的产物大小应比300bp稍大,而单体的PCR产物应比200bp稍大,连接成功的菌液移至15ml离心管中以3-5m液体LB继续培养,晚上可提取质粒并在晚上10-11点左右继续进行酶切过夜,以备第二天进行二联体连接四联体使用;
⑤每一步PCR鉴定正确的菌落都应送测序确定正确,测序使用引物TAL-Modu-F。由于在这个酶切连接过程中出现错误的几率极小,并且构建TALEN要进行至少5轮酶切,因此可以PCR鉴定正确后直接进行下一步的连接,同时送测序,不必等测序出结果后才进行下一步;
⑥以此类推再由二联体连接到四联体,最终连接到十六联体左右,后面由于连接的模块较多,测序的时候需双向引物才能测通,使用测序引物为TAL-Modu-F和TAL-Modu-R;
⑦将最终的串联的TALE序列连接到TALEN表达质粒上。
酶切最终串联TALE的中间质粒,配制酶切体系如下:
37℃酶切6-8h。
酶切TALEN表达质粒(JSD70、JSD71、JSD74、JSD78),配制酶切体系如下,使用Frementas的BsmBI进行单酶双酶切位点的酶切:
37℃酶切6-8h。
将上述两部分酶切产物琼脂糖凝胶电泳,切胶回收片段,TALE模块质粒回收约2kb的模块片段以10μl ddH2O溶解,TALEN表达质粒回收线性化质粒以22μl ddH2O溶解并测浓度。
连接上述两个片段,配制连接体系:
16℃水浴连接2h后取5-10μl转化感受态细胞;
⑧培养过夜后挑取菌落,每个菌落在EP管中以500μl液体LB以280rpm×37℃×2h,之后取1μl做菌液PCR,剩余继续摇菌,PCR体系如下:
热循环条件如图23所示。
⑨PCR完成后取5μl产物琼脂糖凝胶电泳分析,理论上连接成功的TALEN对应的的产物大小应接近2kb,视总的TALE模块数而稍有不同。连接成功的菌液移至15ml离心管中以3-5ml液体LB继续培养,送测序使用引物TALEN-F和TALEN-R,测序正确后即可大量提取质粒备用。
注意:1.所有使用的内切酶均需事先验证酶切效果,并且要保证过夜酶切也无星活性作用,否则整个构建过程无法进行;2.前述连接时不进行切胶纯化而直接将酶切产物混合用于连接的操作只限于TALEN构建的前几步,到后面四联体连八联体以及八联体连接十六联体时阳性率会逐渐降低,这时需要酶切并切胶纯化后再行连接。但是这时连接的反应数是很少的,完全可以接受。另外到后面连接的模块数多的时候,菌液PCR的延伸时间需适当延长;3.无论是前面连接TALE模块的菌液PCR还是后面的TALEN成品的菌液PCR,当检测片段比较大时PCR产物会不特异,这是只需关注有无需要的片段即可,这个PCR的可信度是完全可以保证的;4.在连接过程中有很小的概率会出现连接后BamHI酶切位点突变一个碱基,同样如果用XbaI进行酶切连接也会出现XbaI酶切位点突变一个碱基,出现的概率大概在几十分之一以下。但是一旦出现就无法按照原来的体系进行再下一步的连接,这时只需将酶切体系换成另一种即可(详见第②步),并且置换酶切体系后会将前面突变的酶切位点置换成正常的序列。因此在TALEN构建过程中每一步都一定要仔细看测序结果,特别是酶切位点的位置。
(2)原位修复质粒F8-22-PGK-Neo的构建
①扩增5′和3′同源臂,使用H9的gDNA作为模板:
热循环条件如图24所示。
5′同源臂使用引物为F8-5-F+F8-5-R,产物为806bp。
3′同源臂使用引物为F8-3-F+F8-3-R,产物为929bp。
PCR产物取少量跑胶确认扩增效率后全部进行胶回收,然后使用LA-Taq加A,再行PCR纯化后T连,转化,挑取菌落后测序,测序正确的菌落小量提取质粒并取少量稀释至1ng/μl,备下步使用;
②Overlap PCR连接5′同源臂、F8Exon23-26+pA以及3′同源臂这三段。
配制上述三段的PCR体系:
热循环条件如图25所示。
扩增5′同源臂使用的引物为F8-5-F+F8-Exon22-OVR;扩增3′同源臂的引物为F8-intron22-OVF+F8-3-R,模板使用第一步的T连质粒。F8中间片段使用pHrnF8作为模板,引物为F8-Exon23-OVF+F8-PA-OVR,产物大小为939bp。
将PCR产物全部琼脂糖凝胶电泳后,切取目的条带并根据其亮度尽量将三个片段的物质的量比值调整为1:1:1左右,混合后行PCR纯化,以适量ddH2O溶解。
配制overlap PCR体系:
先按图26所示条件进行热循环:
上述热循环完成后加入overlap引物F8-5-F+F8-3-R,继续按图27所示热循环反应。
琼脂糖凝胶电泳后切胶回收,三段overlap成功的产物应为2.6kb左右。纯化产物加A尾后T连转化,挑取菌落测序。
③扩增PGK启动子以及Neo-pA并连接。
PGK启动子使用pSICOR-PGK-Puro作为模板,引物使用PGK-F-NHE+PGK-OVR-XbaI,产物大小为692bp。Neo-pA使用pHrnF8作为模板,引物使用NEO-OVF-XbaI+Neo-Lox-R,产物大小为1206bp。PCR产物经切胶纯化,加A尾后T连转化后挑取单菌落测序。测序正确的菌落提取质粒,使用中间的XbaI位点以及T载体骨架上的酶切位点即可将两段连接;
④用NheI线性化F8-22中间质粒,同样用NheI将PGK-Neo-pA切下来,两部分连接即构建完成原位修复质粒F8-22-PGK-Neo,构建完成后Sanger测序验证。
(3)TALENs切割活性检测
操作思路就是在HEK293T细胞瞬时表达TALENs,让其发挥切割作用从而促使细胞通过NHEJ的机制修复DSB,在修复的过程中会产生indels,检测含有indels的等位基因所占的比例即可知道该对TALEN的切割活性。
①转染前一天接种HEK293T细胞,六孔板70-80万/孔,24小时后转染细胞;
②转染前2小时将培养基吸弃,小心精确加入1.5ml MEF培养基;
③转染时的细胞密度应该在80%左右,配制转染液,每个转染孔准备两个EP管,两管都加入250μl OPTI MEM,其中一管加入10μl lipofectamine 2000并混匀,另一管加入两条TALENs并混匀,每侧750ng。室温静置5min后将两管混匀,再在室温静置20min,逐滴将转染液加入到孔板中并摇匀后进行培养;
④转染过夜后换新鲜培养基,转染后48h消化细胞并提取gDNA,使用gDNA作为模板,PCR扩增切割位点附近的序列,体系如下:
热循环条件如图28所示。
取2μl跑胶确定扩增特异后剩余部分行PCR纯化,纯化产物用LA-Taq加A尾后做T连并转化感受态细菌,蓝白筛选培养过夜后每对TALEN组合挑取白色菌落30个,手工提取质粒跑胶确定连上后将阳性菌落全部送测序,测序使用引物SP6。
(4)尿液标本的采集
尿液标本采集自居住在长沙市内的血友病患者,通过湖南省血友病联谊会进行联系,所有患者在采集样本前均被详细告知标本的用途以及实验的目的,采集标本前均需签署《知情同意书》。标本采集过程中一定要保证无菌操作,具体步骤为:
①消毒尿道口。用刚拆封的棉签蘸取70%酒精,擦拭尿道口及周围(排尿过程中可能与尿液接触的范围)。棉签擦拭后即丢入垃圾桶中,更换新的棉签重复上述操作5次(部分志愿者接触酒精时可能有轻微的灼痛感,属正常现象);
②排尿前准备。酒精消毒后可立即采集,也可稍等几秒钟待晾干。消毒后的部位在标本采集完成前不能与任何未消毒的物品接触。准备排尿时小心打开收集瓶的盖子;
③收集尿液。开始排尿,开始的二三十毫升尿液排入便池,然后开始收集中段尿液入收集瓶中,感觉尿液快排完时,最后的一部分排入便池。小心盖上收集瓶的盖子,操作完成。
因为收集的尿液标本应该在100-200毫升,所以最好等尿意比较强烈的时候开始收集。另外在收集尿液的同时抽取外周血5ml在湖南家辉遗传专科医院做F8基因的1号内含子及22号内含子倒位检测,操作按参考文献进行。
(5)尿液细胞的培养及iPS细胞的诱导
尿液细胞培养
①采集的尿液应尽快处理,在无菌室中将标本分装至50ml离心管中,400g室温离心10分钟,小心吸弃上清,留少于1ml残液,将沉淀在残液中重悬后集中到一个50ml离心管中,加入10ml PBS,200g室温离心10分钟。小心吸弃上清,留200μl残液,用1ml初始培基重悬细胞,接种于12孔板的一个孔中(提前用0.1%gelatin包被);
②第二天和第三天各小心加入500μL新鲜的初始培基,从第四天开始,每天用REBM完全培养基半量换液。正常的情况下,接种后3-5天即可看到少数细胞集落,继续培养。待整孔细胞密度达30%-50%或局部特别密时(一般在接种后10天左右),将细胞传代至6孔板中,记为P1,继续以REBM完全培养基培养;
③P1的细胞在6孔板中接近汇合时(如果细胞量不足可待扩增至P2-P3),传代细胞,计数后在六孔板中接种60000细胞每孔,接种两个孔即可,第二天就可进行诱导。同时冻存一部分,冻60000-80000每管。剩余细胞可继续传代扩增。
iPS细胞的诱导
诱导过程中需进行两次逆转录病毒感染,将第一次病毒感染的时间定义为d0。
①d(-3)下午6点接种HEK293T细胞于六孔板中,计数70-80万细胞/孔,使用的HEK293T必须确保没有支原体污染;
②d(-2)包装病毒。下午4点将昨天准备的293T换1.5ml DMEM完全培养基,2小时后开始转染操作,此时细胞密度应为80%左右。配制磷酸钙转染液:
先加水至EP管中,再加质粒混匀,再加入2M CaCl2混匀,最后加入2×HBS用力吹打,产生气泡。吹打的次数可作为一个摸索条件,一般25次左右,但也跟吹打力度有关。不换Tip直接将转染液逐滴加到细胞上,尽量使转染液能加入到孔的所有区域;
③d(-1)上午将昨天转染的293T每孔小心换2ml新鲜DMEM完全培养基(转染后11-14h);下午在六孔板中每孔接种60000待诱导细胞,接种两个孔即可。d0,即前一天换液后24-36h,给六孔板中的上皮细胞更换2ml新鲜的REGM新鲜培养基,此时密度应为30%左右。收集包含逆转录病毒的HEK293T细胞培养上清,用0.45μm针式过滤器过滤后加入到上皮细胞的孔中。待诱导的孔加Oct4、Sox、Klf4和c-Myc四种病毒上清,对照的孔中只加含GFP的病毒上清,并在体系中加入终浓度为8μg/ml的polybrene以增加感染效率。HEK293T细胞每孔再加入2ml新鲜的DMEM完全培养基;
④感染过夜后将病毒上清换为REGM以促进细胞恢复。下午第二次收集病毒上清再感染一次操作如前,使用后的293T不再继续培养。d2上午将病毒上清吸弃,换为REGM培养基。d3-d5每天换液,d3可通过观察对照孔的GFP效率来判断病毒包装及感染效率,正常应接近100%。d3或d4开始可看到部分细胞发生形态变化,细胞变小,形态变成多边形且扁平,核质比增大同时有成团聚集生长趋势,增殖速度变快,随着培养的继续形态变化会逐渐增强,与GFP孔细胞的密度和形态形成强烈对比;
⑤一般在d4-d5可转移到MEF上,预判第二天细胞会接近汇合时准备MEF,第二天用0.05%trypsin或accutase消化细胞并计数。接种细胞至10cm dish,每个皿接种10万或20万细胞,以ES/DFBS 1:1培养基进行培养,每天换液;
⑥隔天加入VPA至终浓度1mM,连续加7天。从这一天(d6开始)开始可以见到培养皿里有大量的小克隆出现,克隆表明平整边界清楚,折光度高且细胞核质比高。但是随着培养的继续从d9开始这些小克隆开始逐渐分化或死亡;
⑦从d16开始可看到一些ES形态的克隆逐渐长大,有些是单独形成的,有些是从之前分化的克隆中间长出来的,待克隆长到一个10倍物镜视野时即可用巴斯德管挑取后用于扩增及鉴定。
(6)MEF的准备
MEF取自13.5天的胎鼠,培养iPS细胞以CF-1小鼠的效果最好。
①分离组织前一天准备好足够的灭菌手术器械,分离组织在超净工作台内进行。颈椎脱臼法处死孕鼠,用70%酒精充分消毒孕鼠腹部后将其腹部朝上置于超净工作台内。用止血钳从腹部下方夹住并提起后用大剪刀将表皮连同腹壁剪一个开口。从开口向两侧、向上剪开腹壁以暴露子宫;
②用另一个灭菌的止血钳夹住两个子宫中间的部分,一边提起一边用剪刀剪开多余的系带,最终将一串子宫的两端分离,将子宫移至含双抗的PBS中标记子宫数量后移至无菌室内;
③将子宫用PBS漂洗后分离胎鼠。用弯口眼科剪刺入子宫,一次性刺破子宫和胎膜,将胎鼠分离出来并移至另一盘干净的PBS中;
④使用弯口镊子和弯口眼科剪去除胎鼠头部以及红色的内脏团,尽量去除干净。将剩余组织在新鲜的PBS中漂洗数次以尽量去除血液及组织液,洗至PBS基本无血色且无胶体倾向时将组织块移至一个50ml离心管的管口。用大tip吸掉多余的液体,将离心管稍向下倾斜,使组织块聚集于管口。用弯口眼科剪剪碎组织,大概需连续剪5min左右。剪完后加10ml预温的0.05%trypsin/EDTA重悬组织块后置于37℃培养箱消化,每5min拿出来摇匀一下,并在中途再补充5ml 0.05%trypsin/EDTA,总消化时间不超过25min;
⑤用30ml MEF培养基终止消化,1500rpm×10min,小心吸弃上清(不能丢弃中间悬浮的组织团),再加30ml MEF培养基重悬细胞和组织块,1500rpm×10min。按照分离时计数的子宫数接种,大概每6个胚胎的细胞接种至一个T225的培养瓶中;
⑥待细胞长至接近汇合时冻存细胞或传代,一般在第2天或第3天会汇合。此时记为P0,每瓶可冻存3-4管(以后复苏时每管接种至一个T225的培养瓶中)。如传代可1:3或1:4传代,如此传代至P3时用10μg/ml丝裂霉素C处理细胞2.5h后消化细胞,计数并分装冻存;
⑦丝裂霉素C处理过的MEF需检测无支原体污染且确定细胞密度后才能用于iPS细胞的培养。
(7)iPS细胞的培养及鉴定
iPS细胞复苏培养
①以0.1%gelatin包被培养皿45min以上,复苏丝裂霉素C处理过的MEF。用于培养干细胞的饲养层最佳密度为20000细胞/cm2。考虑到冻存复苏的细胞损失,一般接种1.5×106/10cm dish。贴壁过夜后可用于培养iPS细胞;
②复苏冻存的iPS细胞,加5ml ES培养基,稍混匀后自然沉降5min,吸弃上清后用适量ES培养基重悬细胞后接种于饲养层上,并加入终浓度为10μM的Y27632以利于细胞存活;
③过夜后换液以去除未贴壁细胞,每天观察细胞。iPS细胞的复苏效率较低,往往需连续培养5-10天才能视情况通过手工挑取细胞团或消化法传代;
④正常培养的iPS细胞一般按1:4-1:6的比例5天传一次代,1mg/ml dispase消化传代即可,如存在分化现象可用巴斯德管手工挑取未分化细胞团传代或者将分化细胞挑掉后剩余细胞以dispase消化传代;
⑤细胞量比较可观时可冻存备用,冻存前2小时换新鲜ES培养基一次并加入终浓度为10μM的Y27632,冻存时消化细胞,以70%ES培养基+20%FBS+10%DMSO作为冻存液,一般六孔板的一个孔的细胞可冻存1-2管。
⑥
免疫荧光检测干细胞标志物
①将iPS细胞传至24孔的爬片上,爬片预铺MEF或用matrigel包被均可,培养至第3天可进行免疫荧光检测;
②将爬片夹出后细胞朝上放置于parafilm上,3.7%paraformaldehyde/10%sccrose/PBS固定15min后用0.1%PBST透化细胞15min;
③PBS漂洗3次后用5%BSA/PBS封闭30min,中途用封闭液稀释抗体,抗体使用Oct4、SSEA-1、SSEA-4、Tra-1-60以及Tra-1-81;
④将爬片上的封闭液吸掉,每片爬片加抗体50μl,室温孵育1h;
⑤PBS漂洗2次后再以PBS洗3×10min,接着5%BSA/PBS封闭30分钟;
⑥二抗(1:400)避光孵育1小时后吸弃二抗,先用PBS漂洗2次,再以PBS洗5×5min;
⑦ddH2O漂洗一次后在载破片上滴加4μl 60%甘油,倒置盖片,然后以指甲油封边,避光保存,指甲油干燥固定过夜后第二天荧光显微镜下观察或共聚焦显微镜下拍照。体内成畸胎瘤实验
①应使用裸鼠或NOD/SCID鼠进行实验。准备iPS细胞,注射一次至少需一个10cmdish的细胞,可将细胞培养在matrigel上,用mTesR培养基进行培养,成畸胎瘤效果较好;
②收获细胞数小时前应换一次新鲜培养基以补充营养。使用胰酶收获细胞,用140μl ES培养基重悬细胞,再加入70μl matrigel混匀,置冰上带至动物学部;
③取出免疫缺陷小鼠,固定小鼠后用碘伏将小鼠后腿腹股沟位置局部消毒,然后使用1ml注射器将上述细胞悬液缓慢注射入皮下,注射完成后停针片刻,以减少溢出量;
④将小鼠耳朵打孔标记,并记录,寄养于动物学部;
⑤大概一周后可见注射部位存在小突起,之后该突起会消失。大概一个月以后可见到明显的瘤体。约8-12周畸胎瘤可长至直径1cm以上,可手术收获畸胎瘤;
⑥畸胎瘤应为水泡样瘤体,包膜光滑。测量瘤体直径并拍照,之后用3.7%多聚甲醛固定过夜后送至湘雅医学院组织胚胎学教研室做石蜡组织切片并行HE染色。切片可在光学显微镜下观察并拍照。
(8)F8-22-PGK-Neo打靶F8基因22号内含子倒位型iPSCs
①备基因打靶的iPS细胞一定要保证细胞状态良好。待10cm dish里培养在MEF饲养层上的iPS细胞长至需传代时传至matrigel上。一个10cm dish密度较密的细胞可传至两个6cm dish的matrigel上,用MEF条件培养基进行培养;
②约3-4天后可长至汇合,此时可进行基因打靶。前一天准备具有抗性的MEF,使用millipore公司的pMEF-NL饲养层细胞。基因打靶当天上午换一次新鲜培养基并加终浓度为10μM的Y27632至培养基中继续培养;
③下午观察可见Y27632可使细胞形态趋于扁平。通过核转的方式进行基因打靶,使用Lonza公司的核转染试剂Human Stem CellKit 2进行转染。先取试剂盒中的82μl Solution II以及18μl的supplement I混合后置于室温平衡温度;
④用TrypLE SELECT消化干细胞,大概需37℃消化3-5min,置培养箱中消化,不时拿出来观察,待摇晃时细胞团有一半会剥落时取出,用ES培养基终止消化后立即将细胞吹打下来。这一步动作一定要快,因为一旦终止消化,细胞会以极快的速度重新贴壁至无法吹打下来。吹打力度不能太大,一般由于细胞重贴壁速度太快以及细胞团中间往往消化不彻底,从而不可能把细胞完全吹打下来,剩余的少量细胞舍弃,不要反复吹打以免对细胞造成比较严重的损伤;
⑤细胞计数,取样在血细胞计数板上计数。这一步可以检查细胞状态,正常情况下细胞应为圆形且光滑的,如果细胞边缘发毛则可能是由于消化过度或吹打过猛所致。根据计数的浓度取适量细胞悬液1000rpm室温离心5min,一般取300-500万细胞进行一次核转;
⑥离心完成后弃上清,洗净残液。用上述100μl核转液重悬细胞并移入电击杯中,再加入AhdI线性化的打靶载体以及两侧的TALENs,三个质粒用量均为5μg。置核转仪上使用程序B016核转,之后立即加400μl ES培养基或1640,室温静置10min;
⑦将准备的pMEF-NL培养基换成ES培养基,将核转产物用专用吸管吸至pMEF-NL上并加终浓度为10μM的Y27632至培养基中,十字摇匀后于培养箱中培养;
⑧从第二天开始每天换液,待细胞密度近50%时加G418至终浓度50μg/ml进行筛选。一般加药后第二天无变化,最早从隔天开始死亡,逐渐大量死亡。约打靶后10天左右可见确定的抗性克隆,14天左右抗性克隆可达一个10倍物镜的视野,即可挑取克隆。克隆最好接种至matrigel上用mTesR在24孔板上进行培养,这样有助于贴壁。剩余的克隆用Giemsa染液染色用于计数,染色的时候注意不需要进行固定,否则会导致染色过浅,只需将培养基吸尽后直接将Giemsa原液倒入培养皿内,能够覆盖细胞就可以,室温染色几小时至过夜,自来水洗掉染液后干燥即可;
⑨贴壁克隆细胞量增殖较多时可用dispase消化传代至24孔板的两个孔里,两孔细胞量比值为2:8。多的那一份大概传代后2-3天后可提gDNA用于PCR鉴定。PCR阳性的克隆对应的保种细胞扩大培养用于提gDNA用于Southern blot检测并冻存,阴性细胞可丢弃以减少工作量。
(9)切除PGK-Neo表达框
①取PCR、Southern blot鉴定同源重组的克隆,并选取其中核型鉴定无异常且细胞形态较好,增殖快速的克隆用于本部分实验;
②类似上一步基因打靶,只是细胞量需要的较少,只要保证最终matrigel上有一个6cmdish的细胞就足够。转染前数小时同样加终浓度为10μM的Y27632。TrypLE SELECT消化干细胞后进行核转,只转染5μg pCAG-Cre。转染完成后接种至6cm dish的matrigel上,并加终浓度为10μM的Y27632;
③转染细胞的当天准备MEF,使用普通MEF在6cm dish即可;
④细胞贴壁过夜后用TrypLE SELECT消化matrigel上瞬时表达了Cre的干细胞,轻轻摇下部分消化完全的细胞,不用吹打其余大部分任然贴壁的细胞;
⑤终止消化后收集上清里的细胞继续轻轻吹打,尽量将其吹打成单个细胞,计数后接种到6cm dish上,一个dish接种1万个细胞,并加终浓度为10μM的Y27632,不加筛选药物,连续培养;
⑥大概培养2周左右可见单一的克隆形成,挑取较大的克隆至24孔板中培养;
⑦少量提取gDNA,PCR初步鉴定,PCR阳性克隆扩增后提取gDNA进一步进行Southern blot鉴定。
(10)F8-22-PGK-Neo打靶的鉴定
初步PCR鉴定
①配制PCR体系:
5′同源重组使用引物F8-HR-5F3+F8-HR-5R3
3′同源重组使用引物F8-HR-3F2+F8-HR-3R1
热循环条件如图29所示。
产物行琼脂糖凝胶电泳分析,阳性克隆的5′同源重组PCR产物大小为1330bp,3′同源重组PCR产物大小为1372bp,未打靶的阴性细胞均无条带;
②PCR阳性的克隆提取足够gDNA后以AflII酶切过夜,配制体系:
产物确定酶切完全后以两倍体积酒精纯化后备用;
③标记探针,配制体系:
在ABI热循环仪上按图30所示条件扩增:
琼脂糖凝胶电泳分析,确定标记的特异性以及探针产量;
④Southern blot分析,阳性克隆可进一步进行核型鉴定,核型无突变的克隆可用于后续试验。
(11)切除PGK-Neo鉴定
①挑取单个克隆于24孔板中培养,少量提取gDNA用于PCR鉴定,PCR体系:
使用引物F8-lox-ex-F1+F8-lox-ex-R2
热循环条件如图31所示。
产物行琼脂糖凝胶电泳分析,如筛选基因未切除则PCR产物大小为2480bp,如筛选基因已成功切除则PCR产物大小为524bp;
②PCR阳性克隆进一步通过Southern blot验证。确定切除Neo且无随机整合的克隆进一步扩增后送湖南家辉遗传专科医院做核型鉴定,并冻存细胞备用。
(12)iPS细胞向ECs(endothelial cells,ECs)的定向分化
①OP9细胞的培养及传代。OP9细胞需培养在预铺0.1%gelatin的培养皿上,每2-3天用胰酶以1:5左右的比例传代,一定要在细胞汇合前进行传代,因为密度过高的情况下细胞会自发分化成脂肪细胞;
②准备用于内皮分化的OP9细胞。将OP9以正常传代的方式接种到预铺gelatin的10cm dish中以10ml OP9培养基进行常规培养。在第4天进行半量换液,之后一直不换液直到第8天备用;
③准备好的OP9细胞会形成致密生长的单层,不会形成多层细胞。细胞表面可以看到一层光滑致密的胶状基质层,并且不会有过分的脂肪细胞分化。准备好的细胞在第8-12天(中途无需换液)均可用于干细胞向ECs的分化;
④消化iPS细胞前从培养箱中取出准备用于分化的OP9细胞,换10ml新鲜的OP9分化培养基,继续置培养箱中。用1mg/ml dispase消化iPS细胞10min左右,吸弃dispase并洗掉残留的酶。用tip吹打下细胞团,在离心管中自然沉降后吸弃上清。一般用六孔板的半个孔的细胞接种一个10cm dish用于分化,用1ml OP9分化培养基重悬细胞团并轻轻吹打成小细胞团后接种于准备好的10cm dish中,十字摇匀置于培养箱中培养,这一天记为第0天;
⑤第1天取出培养皿,吸弃培养基后加20ml预温的新鲜OP9分化培养基继续培养,此时细胞已经贴壁,iPS细胞在OP9细胞上贴壁很好,基本上看不到未贴壁的细胞。随着培养的继续贴壁细胞开始展开并迅速增殖;
⑥在第4天和第6天时半量换液,培养过程中可看到干细胞团快速增大并多数变为上皮样细胞形态,但是细胞团与OP9细胞之间的边界一直保持清晰;
⑦在第7-9天可收获细胞用于进一步的磁珠分选。
注意:用于ECs定向分化的OP9细胞与iPS细胞均不能有支原体污染,需事先检测,否则分化不会成功。
(13)CD31磁珠分选分化的ECs
使用德国Miltenyi Biotec的Human CD31磁珠分选试剂盒进行操作。分选后使用Invitrogen公司的Human Endothelial-SFM培养基进行培养,培养皿应先用Fibronectin预先包被。人血浆Fibronectin为Invitrogen公司的粉末,应先用无菌ddH2O溶解成1mg/ml的储存液,然后将储存液以1:200稀释到PBS中用于包被培养板,六孔板的一个孔使用1ml上述工作液于4℃包被过夜备用。
①将分化的细胞取出,洗尽培养基后加入5ml预温的1mg/ml dispase于37℃培养箱中消化20min,然后将消化液吸至50ml无菌离心管内备用。用PBS仔细漂洗培养物,因细胞密度较高且部分分化的细胞会呈多层形态,所以至少需用PBS洗两次,动作要很轻柔以防细胞掉下来;
②加5ml 0.05%trypsin/EDTA于37℃培养箱中消化15min左右(至轻轻摇晃时大部分细胞会剥落即可)加5%FBS/PBS终止消化,立即将细胞团尽量吹打成单个细胞,吹打不可太剧烈以防损伤细胞。吹打完成后将该部分消化产物与前一步收集的dispase消化液混合;
③将上述细胞悬液用40μm细胞筛过滤一遍,收集滤过液,1000rpm室温离心5min,弃上清后用10ml 4℃预冷的MACS缓冲液(0.5%BSA/2mM EDTA/PBS)重悬细胞,1000rpm室温离心5min;
④弃上清,尽量将残液吸尽后加60μl MACS缓冲液,再加入20μl FcR BlockingReagent混匀后加入20μl CD31MicroBeads,4℃精确孵育15min。说明书中要求置冰箱,如放冰上需要延长孵育时间。但是我们的经验是冰上孵育的产量以及纯度都比较理想;
⑤孵育完成后加1ml MACS缓冲液,1000rpm室温离心5min。弃上清后用1ml MACS缓冲液重悬细胞。
⑥将LS分选柱固定到MACS分选适配架上,下面放一个废液收集离心管。先用3mlMACS缓冲液平衡分选柱,即将MACS缓冲液加入到LS分选柱的储液槽中让其自然流过;
⑦平衡后的LS分选柱即可用于分选细胞。将细胞悬液加入到LS分选柱的储液槽中,待其自由通过后加MACS缓冲液洗柱3ml×3次。待液体完全流过后将下面的废液收集管换成一个无菌的15ml离心管,再在LS分选柱内加5ml MACS缓冲液,使用试剂盒里的无菌活塞一次性快速将缓冲液推过分选柱并收集到15ml离心管中;
⑧取样计数细胞后1000rpm室温离心5min,培养于包被好Fibronectin的孔板中。
注意:在使用LS分选柱分选的过程中,所有加样操作必须小心操作,完全避免气泡的产生,否则会导致LS分选柱堵塞。
(14)iPS细胞向MSCs(mesenchymal stem cells,MSCs)的定向分化
使用Trypsin连续传代法分化间MSCs,MSCs培养基为Knock DMEM+10%KSR再添加2mM L-Glu、1%非必须氨基酸、1%penicillin-streptomycin、0.1mMβ巯基乙醇、20ng/mlbFGF以及20ng/ml EGF。
①用0.05%Trypsin/EDTA消化MEF上的iPSCs,吹打成单个细胞后以1:1的面积接种于预铺gelatin的培养皿中,使用MSC分化培基培养;
②第二天可见少量贴壁细胞,每天换液。待细胞增殖到50%以上密度时,用0.05%Trypsin/EDTA进行传代,比例为1:3-1:4,如此连续传代;
③P3-P5的细胞进行流式检测,检测CD44,CD73,CD90,CD105这4个MSC特异表面标志物。其表达率均在90%以上时用以进行下步实验。
(15)RT-PCR检测F8的表达
①将病人iPSCs以及修复后的iPSCs分化而来的ECs于六孔板中培养,待汇合度达到50%以上时以Trizol法提取总RNA;
②取1μg总RNA到PCR管,在PCR仪上70℃处理10min,置于冰上5min后短暂离心,使用Promega公司的Reverse Transcription System配制逆转录体系:
在PCR仪上进行逆转录,反应程序:
42℃,30min→95℃,5min→冰上5min
③以上一步逆转录的cDNA为模板,配制PCR体系如下:
内参基因GAPDH使用引物为GAPDH-F+GAPDH-R(理论大小为453bp)。F8跨22号内含子的RT引物使用F8-RT-ov22-F2+F8-RT-ov22-R1(理论大小为478bp)。热循环条件如图32所示:
取5μl产物琼脂糖凝胶电泳分析。
现有的针对其他基因的原位修复一般是针对个发的突变类型,比如单碱基的突变或者小片段的突变等,一般就是通过同源重组替换突变的少许遗传信息。而本文针对的突变类型,倒位的片段长达600kb,将186kb的F8分成了141kb和45kb两个部分,并且这两部分的方向是相反的,从而导致重度HA表型。本发明是将45kb中的627bp编码序列通过同源重组添加到141kb那部分后面,将这一部分的遗传信息补齐。
总之,本发明提出一种针对该倒位型的基因原位修复策略,即通过基因打靶的方式将23-26号外显子的编码序列及polyA信号直接无缝添加到22号外显子和22号内含子的交界处,这样后面4个外显子可以接着前面22个外显子被连续转录出来,实现比较完美的基因修复,修复后基因不仅包含了完整的编码序列,更重要的是完全保留了基因5’端包括启动子在内的调控序列。该策略不仅具有原位修复的优点,而且由于对序列的改动较小,其实施难度可能比传统的定点基因替代还要低。
本发明构建了针对性的原位修复策略,针对性地修复这种类型的F8突变,并且联合应用TALEN技术在血友病病人特异的iPSCs中验证了这种原位修复策略。这是国际上第一个针对内含子22倒位这种常见HA突变的原位修复策略。原位修复策略导入的序列是精确的定点导入,相对安全,不存在现有技术中的不确定性。
附图说明
图1为F8内含子22倒位示意图;
图2为二联体、六联体、七联体连接的PCR鉴定胶图;TALE单体对应的条带大小是0.3k左右,成功连接的二联体为0.4k,六联体、七联体的PCR产物大小分别为0.8k和0.9k;
图3为八联体和十六联体的连接图;A,将准备连接的两个质粒使用相同的内切酶体系进行酶切并琼脂糖凝胶电泳分析,图中每相邻的两个泳道为准备连接的两个酶切产物,一个酶切出TALE模块片段(约0.8k,骨架为2.7k),另一个仅仅线性化(八联体为3.5k);B,连接后转化挑取单菌落进行初步的PCR鉴定,成功连接的八联体PCR产物为1k,十六联体为1.8k(此PCR并不特异,但按照图中每个泳道较大的PCR产物片段大小进行判断跟Sanger测序结果非常吻合。B下图中的不全是十六联体,也有部分十五联体,PCR产物为1.7k);图中Marker均为DL2000;
图4为将串联的TALE模块连接到TALEN表达质粒上的图;A,使用BsmBI线性化TALENs表达质粒,四种表达载体均为6.4k;B,使用BsaI和BbsI将TALE模块从中间质粒上酶切下来并切胶纯化;不同的中间载体大小不一样,但是上面一条为骨架,均为2.7kb,下面的TALE条带大小根据模块数有所不同,约为0.1k×TALE模块数;
图5为TALEN成品的鉴定图;A,菌液PCR初步检测是否连接成功,Marker为DL2000,不同TALEN由于含有的TALE模块数不同所以产物大小不同,约为2k左右;B,测序验证TALENs序列是否正确,上一排为拼接的理论序列,下一排为Sanger测序结果;
图6为PCR扩增质粒构建所需的各个片段图;M,DL2000Marker;1,5′同源臂(786bp);2,F823-26号外显子的编码序列以及SV40polyA(899bp);3,3′同源臂(909bp);4,PGK启动子(692bp);5,Neo-pA(1206bp);
图7为Overlap连接原位修复质粒前三段以及测序结果图;A,Overlap PCR后将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,切胶纯化箭头所示的接近2.6kb的片段进行T连;B,T联合挑取菌落测序结果;
图8为连接PGK-Neo以及测序结果图;A,将PGK、Neo的PCR产物的T连质粒酶切后切取图中箭头所示片段,胶纯化后进行连接,M为DL2000Marker,泳道1为Neo的T连质粒,泳道2为PGK的T连质粒;B为这两段连接后的测序结果,证实PCR扩增、T连以及酶切连接成功且得到了无突变的菌落;
图9为F8-22-PGK-Neo的最终连接及鉴定图;M1、M2、M5和M6均为λDNA HindIIIMarker,M3和M4为DL2000Marker,泳道1为NheI线性化的F8-22,条带大小为5.6kb。泳道2、3为NheI酶切后的PGK-Neo中间质粒,上面的条带为3kb的T载体骨架,下面的条带为2.0kb的PGK-Neo片段;泳道4、5、6、7、8均为连接成功的F8-22-PGK-Neo,电泳结果为使用XhoI+XbaI双酶切以确定PGK-Neo连接的正反向,条带大小为4.8k+1.7k的为正向连接,条带大小为4.8k+1.5k的为反向连接;泳道9为环状F8-22-PGK-Neo(7.5k),泳道10、11分别为AhdI(7.5k)和NotI(4.5k+3k)线性化的F8-22-PGK-Neo;
图10为通过测序的方式检测TALENs活性图;WT示未修改的原始序列,下划线部分示TALENs识别序列,中间为间隔序列,虚线示缺失的部分;
图11为iPSCs的诱导图;A,IS-PCR检测F822号外显子倒位;B,尿液细胞培养形态;C,GFP指示病毒包装及感染效率;D,四因子诱导产生的iPSC克隆形态,标尺为200μm;
图12为iPSC克隆干细胞特性检测图;左侧为免疫荧光检测干细胞特异性表达蛋白,右侧为小鼠体内形成的畸胎瘤以及组织切片及HE染色结果,从上到下依次为畸胎瘤照片、外胚层的复层立方上皮组织、中胚层的软骨组织以及内胚层的消化道上皮组织,右图标尺为100μm;
图13为F8-22-PGK-Neo打靶iPSCs以及切除Neo表达框示意图;Inverted F8为未打靶的F8 22号外显子与内含子附近示意图;Targeting vector为基因打靶载体F8-22-PGK-Neo的结构示意图;Repaired F8为原位修复后的F8情况;Excision of Neo为通过瞬时表达Cre切除筛选基因后的F8基因结构示意图;
图14为F8-22-PGK-Neo打靶iPSCs后进行同源重组的鉴定图;A,跨同源臂PCR鉴定克隆是否发生同源重组,共设计了两组PCR条件,分别通过扩增跨5′和3′同源臂的片段的方式进行检测,两个PCR产物胶图的最后一个泳道均为阴性对照的PCR产物,即为使用未打靶的病人样本作为模板;B,Southern blot检测同源重组,1为阴性对照,2-7为PCR阳性克隆;
图15为抗性克隆染色及两次打靶统计图;A,两次使用TALENs成功基因打靶后对抗性克隆进行了染色用于计数,使用的TALENs组合如表中所示;B,三次基因打靶的数据统计,打靶效率为同源重组克隆数占抗性克隆数的比例,同源重组率为理论同源重组克隆除以转染细胞数所得的数值;
图16为Cre-LoxP系统切除检测图;A,PCR检测PGK-Neo表达框的切除,M为DL2000Marker,泳道1-11为待检测样本的PCR产物;B,Southern blot检测PGK-Neo表达框的切除,样本1为原始的iPSCs的gDNA,样本12为F8-22-PGK-Neo打靶成功的克隆,样本2-11为上一步PCR阳性的克隆;
图17为细胞核型分析图;A,从病人尿液细胞诱导出的原始iPSCs核型;B,第一次基因修复后的iPSCs核型;C-D,经历了基因打靶以及切除PGK-Neo表达框后的克隆的核型,如图所示均未见明显的突变发生;
图18为iPSCs向ECs的分化及分选图;上图左图显示分化完成即将进行磁珠分选的细胞形态,右图为CD144磁珠分选并贴壁过夜后的细胞形态。下图分别为免疫荧光检测CD31和CD144的结果;
图19为原位修复前后F8在ECs中的表达图;左图为RT-PCR检测F8表达,使用的引物用于检测跨22-23外显子的转录子,并使用非血友病的ECs作为对照;右图为ELISA结果,17-9和11-10均为原位修复后并且切除了PGK-Neo的克隆;
图20为iPSCs向MSCs的分化图;A图为分化的MSCs形态;B图为流式检测MSCs表面标志蛋白;
图21为原位修复前后F8在MSCs中的表达图;A图为RT-PCR结果;B图为ELISA结果;
图22至图32为循环条件图。
具体实施方式
实施例1
(1)TALENs表达质粒的构建
①每次连接转化后挑取菌落,使用引物TAL-J-F和TAL-J-R通过菌液PCR初步筛选,PCR产物的大小约为100×(TALE模块数)+200bp。如图2,二联体阳性菌落的PCR产物大小应接近400bp,六联体、七联体的产物大小分别为800bp和900bp左右,PCR阳性的样本进一步送测序验证;
②八联体以及十六联体的连接需要将前一步质粒酶切并切胶纯化后进行连接,否则阳性率会比较低。如图3A,将准备连接的两个质粒使用相同的酶切体系完全酶切,相邻两个泳道的其中一个是将TALE模块完全切除,另一个仅仅切除十几个碱基将质粒线性化。切胶纯化图中前一个泳道的TALE模块片段以及后面一个泳道的线性化骨架,并进行连接。八联体以及十六联体连接成功后的PCR产物大小分别为1kb及1.8kb左右,使用切胶纯化的片段进行连接,如图3B所示绝大部分为阳性菌落,PCR阳性的样本进一步送测序验证;
③将按顺序串联好的TALE模块连接到TALENs表达质粒上面。先使用BsmBI线性化TALENs表达质粒,4种TALENs表达质粒的大小一致,载体上有两个间隔十几个碱基的BsmBI酶切位点,使用该内切酶可将4种TALENs表达质粒线性化。如图4A,连续的三个泳道为同一质粒,第一个为未酶切的环状质粒,后面两个为线性化质粒。另外同时使用BsaI和BbsI可从中间载体上将串联的TALE模块完全酶切下来,该片段与上一步线性化的TALENs表达质粒两端具有分别匹配的粘性末端,切胶纯化图4B中的较小片段,与线性化的TALENs表达质粒进行连接。
④连接后挑取的菌落使用引物TALEN-F和TALEN-R,阳性菌落能够扩增出约2kb的片段,如图5所示,这一步酶切连接几乎全部为阳性菌落。每种TALEN取个别菌落进行Sanger测序验证,序列正确的菌液扩增后大量提取质粒备用。
(2)原位修复质粒F8-22-PGK-Neo的构建
①分段PCR扩增准备Overlap以及酶切连接的小片段(图6)。按方法中的模板、引物及条件扩增下述5个片段以备Overlap连接或者酶切连接;
②Overlap连接前一步中的1、2、3片段,并在SV40pA的末端加NheI酶切位点。琼脂糖凝胶电泳并切取图7A中的接近2.6kb的片段纯化后进行T连。转化并蓝白筛选后挑取白色的单菌落进行测序,如图7B所示测序结果证明成功将这3段按顺序Overlap成功,并且得到了没有突变的菌落,小量提取质粒用于后续的连接使用;
③连接LoxP-PGK-Neo-LoxP。将第一步中的4、5片段分别T连后挑取菌落进行测序(图8)。测序正确的菌落扩增并小量提取质粒后均以NheI+XbaI进行双酶切,切胶纯化后进行连接,构建带有LoxP-PGK-Neo-LoxP片段的中间质粒。
④F8-22用NheI线性化,PGK-Neo中间质粒也用NheI线性化,两部分琼脂糖凝胶电泳切胶纯化后进行连接。挑取菌落后进一步鉴定,4、5、6、7、8为通过酶切确定Neo表达框连入的正反向,4、5、8为反向连入,6、7为正向连入,正反向连入均送一个菌落进行测序,证实连接均成功且无突变。另外在核转染细胞前使用AhdI或者NotI进行线性化。(图9)
(3)TALENs切割活性检测
使用HEK293T细胞通过Lipofectamine 2000瞬时转染各TALENs组合,24h后提取gDNA,使用引物Dig-F+Dig-R扩增切割位点片段。将PCR产物纯化后连接到T载体,转化后蓝白筛选挑取白色菌落30个送测序(图10)。结果显示L2R2转染组中,22个连接成功的菌落,其中3个产生了indels,突变率(切割活性)为13.6%。而L3R3的活性达到了27.3%。并且indels以小片段缺失为主。
(4)尿液细胞的培养及iPSCs的诱导
在签署知情同意书的前提下无菌采集一例51岁重型HA男性患者的尿液,同时抽取5ml肝素钠抗凝外周血送湖南家辉遗传专科医院进行F822号内含子倒位检测。运用反向移位PCR(inverse shifting-PCR,IS-PCR)可以扩增出333bp的片段,结果提示该患者为22号内含子倒位型突变。培养的尿液细胞呈典型的铺路石样形态,分裂迅速,立体感强。待细胞较密时用胰酶传代一次,取P1细胞进行逆转录病毒4因子感染,GFP提示病毒感染效率接近100%,并且经过约3周的诱导,获得了典型的iPSCs样克隆,挑取克隆扩大培养后进行进一步的鉴定。(图11)
(5)iPSC克隆干细胞特性检测
通过免疫荧光检测,提示诱导获得的克隆能够表达干细胞标志性蛋白Oct4、SSEA-4、Tra-1-60以及Tra-1-81,不能表达SSEA-1,符合干细胞的基因表达特征。同时通过免疫缺陷鼠体内注射形成畸胎瘤,并分离畸胎瘤进行组织切片,HE染色,结果证实诱导获得的克隆能够在小鼠体内分化成三个胚层的组织。(见图12)
(6)F8-22-PGK-Neo打靶F8基因22号内含子倒位型iPSCs
使用F8-22-PGK-Neo并联合TALENs表达质粒核转染iPSCs后通过G418筛选后挑取抗性克隆进行扩增培养。首先用PCR的方式进行初步筛查,使用图13中的F1+R1以及F2+R2引物组合进行PCR,分别跨5′以及3′同源臂进行扩增,如图14A所示,阳性克隆的5′PCR产物大小应为1330bp,3′PCR产物大小应为1372bp。PCR阳性的样本再通过Southern blot进行最终确定,使用图13中的probe,阳性克隆应可以检测到一条4.6kb的片段,而未转染的细胞检测到的条带大小理论上为1.8kb。如图14B,泳道1为未转染细胞的对照,泳道2为随机整合的阴性克隆,而泳道3、4、5、6、7均为成功打靶的阳性克隆。总共使用了两组TALENs进行了打靶实验(图15A),结果2.3.2中切割活性较高的L1R1促进的基因打靶效率比L2R2的效率更高(图15B)。
(7)切除PGK-Neo表达框
上一步Southern blot验证打靶成功且无随机整合的克隆,进一步扩增后通过瞬时表达Cre这种重组酶,切除PGK-Neo表达框。在不加筛选药物的情况下低密度接种转染了pCAG-Cre的细胞,待长出单细胞克隆后挑取进行进一步鉴定。首先用PCR的方式进行初步筛查,使用图13中的引物F3+R3,扩增跨整个PGK-Neo表达框的片段,如果没有成功切除则PCR产物大小应为2.5kb,如果切除了PGK-Neo表达框则PCR产物大小应为0.5kb左右(图13)。17A结果提示1、2、4、6、10号克隆为没有切除PGK-Neo表达框的克隆,3、5、7、8、9、11号克隆为成功切除PGK-Neo表达框的克隆。PCR阳性的克隆再用图2-13中标示的探针通过Southernblot进行确认,如图16B所示,样本2—11均为成功切除PGK-Neo表达框的克隆。本部分PCR检测的可信度是很高的,PCR阳性克隆经Southern blot验证几乎全部都是纯的阳性克隆。并且切除Neo的效率非常高,总共进行了两次实验,阳性克隆效率分别达到了50%(6/12)和72%(13/18)。鉴定完成后取部分阳性克隆送湖南家辉遗传专科医院进行核型分析,证实在经历了基因打靶以及瞬时表达Cre后的细胞成克隆过程后,细胞仍然能够保持正常二倍体核型(图17)。
(8)原位修复前后的iPSCs向ECs的分化
将原位修复前后的iPSCs通过与小鼠骨髓基质细胞系OP9共培养的方式分化成ECs,使用CD31(血小板-内皮细胞粘附分子,Platelet endothelial cell adhesionmolecule-1,PECAM-1)磁珠分选出ECs。iPSCs在OP9上贴壁很好,并且从接种两天后开始快速增殖铺展开来,形态逐渐变为以上皮样为主,与OP9细胞的边界一直保持明显。磁珠分选后细胞均一,细胞核立体感强且呈典型的铺路石样,胞体短梭形,细胞有成团聚集生长的趋势。即使是用胰酶消化成单个细胞后重新接种,第二天观察时细胞也主要是以细胞团的形式贴壁。免疫荧光检测结果显示分选的细胞能够表达ECs的标志蛋白CD31以及CD144(Cadherin 5,钙黏蛋白5),纯度较高。(图18)
(9)原位修复后F8在ECs中的表达
我们通过磁珠分选法从分化的细胞里分选ECs后,使用位于19号外显子上的引物F8-RT-ov22-F2以及位于23号外显子上的引物F8-RT-ov22-R1进行RT-PCR。因为22号内含子倒位型HA的特征之一就是无法检测到跨22-23号外显子交界处的转录子。结果如图20,在未修复的病人iPSCs来源的ECs中无法检测到该转录子,而使用修复后的两个克隆以及非血友病ECs进行实验时均能扩增出478bp的目的条带。证明通过本研究所使用的策略可以在转录水平上有效纠正22号内含子倒位型F8的表达。另外我们收集了细胞培养上清以及细胞裂解液进行ELISA检测,我们发现在所有的细胞裂解液内均能检测到信号,而只有修复后的细胞及正常对照的培养上清里能够检测到FVIII蛋白,说明原位修复纠正了FVIII蛋白的分泌。(图19)
(10)原位修复前后的iPSCs向MSCs的分化
通过胰酶连续传代可将iPSCs分化成MSCs,通过流式细胞检测验证MSCs的分化是否成功(图20)。
(11)原位修复后F8在MSCs中的表达
在MSCs中检测F8的转录以及蛋白的表达(图21)。
Claims (4)
1.一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒,其特征在于,所述质粒序列如SEQ ID NO.29所示,命名为质粒F8-22-PGK-Neo。
2.构建权利要求1所述质粒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括序列如SEQ IDNO.7至SEQ ID NO.18所示的引物。
3.一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.28所示的引物。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括权利要求1所述的质粒。
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