CN108118057B - 一种基因编辑系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因编辑系统及其制备方法和应用，所述gRNA包括靶向凝血因子VIII基因22号内含子的核酸序列。本发明的基因编辑系统利用gRNA和Cas9蛋白靶向切割凝血因子VIII基因22号内含子，并定点定向地插入一段含有凝血因子VIII基因23‑26号外显子的人工合成序列，达到了修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位的目的。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种基因编辑系统及其制备方法和应用，尤其涉及一种修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位的基因编辑系统及其制备方法和应用。
背景技术
A型血友病亦称作甲型血友病，是临床上最常见的血友病类型，约占血友病总数的80％-85％，在某些高发地区其比例甚至更高。A型血友病主要是由凝血因子VIII(humanfactor VIII)的缺失引起的，而凝血因子VIII基因的点突变或22号内含子倒位(Intron-22-inversion)造成了凝血因子VIII的缺失。
根据凝血因子VIII的缼失程度，A型血友病可以分为轻度血友病(5-30％凝血因子VIII)、中度血友病(2-5％凝血因子VIII)和重度血友病(<1％凝血因子VIII)，发病率分别为50％、10％和40％。其中，至少50％的重度A型血友病是由22号内含子倒位造成的凝血因子VIII缺失而引起的，因此，凝血因子VIII基因的22号内含子倒位是造成血友病的最常见的突变。
目前，临床上主要通过注射重组的凝血因子VIII治疗A型血友病，然而该治疗方案费用昂贵，仅能减缓症状，对A型血友病不具有治愈作用，而且患者容易产生抗重组的凝血因子VIII的抗体，显著影响重组的凝血因子VIII的治疗效果。
基因治疗方法尚未应用于临床，但于2016年提出的利用腺相关病毒载体(AAV)在体内表达缩小的凝血因子VIII的方法(McIntosh J,Lenting PJ,Rosales C,etal.Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral veinadministration of rAAV vector encoding a novel human factor VIIIvariant.Blood,2013,121:3335-3344.)已开展临床试验，该方法是将凝血因子VIII基因由7kb减小至5.2kb，装入腺相关病毒载体(AAV)，通过静脉血管注射到患者体内。该方法可长久性地在患者体内表达缩小的凝血因子VIII，但不具有永久性，并且不能表达全长的凝血因子VIII，患者容易产生抗缩小的凝血因子VIII的抗体，影响凝血功能。
因此，提供一种修复凝血因子VIII基因的22号内含子倒位的产品和方法，从根本上修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位，具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基因编辑系统及其制备方法和应用，所述基因编辑系统利用gRNA和Cas9蛋白靶向切割凝血因子VIII基因22号内含子，并定点定向地插入一段含有凝血因子VIII基因23-26号外显子的人工合成序列，达到修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位的目的。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种gRNA，所述gRNA包括靶向凝血因子VIII基因22号内含子的核酸序列。
本发明中，所述gRNA具有特异性靶向凝血因子VIII基因22号内含子的作用，可以介导Cas9蛋白对凝血因子VIII基因22号内含子进行切割。
优选地，所述gRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述SEQ ID NO.1-2所示的核酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGTGGCAACAGCGGTATAAATGG-3’；
SEQ ID NO.2：5’-GGTGAGCTCAAGACCCTTAAAGG-3’.
本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的序列靶向凝血因子VIII基因22号内含子的反义链，所述SEQ ID NO.2所示的序列靶向凝血因子VIII基因22号内含子的正义链，下划线标注的TGG和AGG为原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，用于协助gRNA/Cas9复合物定位于切割位点。
第二方面，本发明提供一种基因供体，所述基因供体按照5’-3’方向顺次包括：gRNA识别序列、剪接受体序列、凝血因子VIII基因23-26号外显子序列、转录终止信号序列和gRNA识别序列。
优选地，所述gRNA识别序列为第一方面所述的gRNA。
本发明中，基因供体按照5’-3’为23号外显子-26号外显子的方向插入到凝血因子VIII基因被切割的22号内含子中，连接于22号外显子后；如果基因供体按照5’-3’为26号外显子-23号外显子的方向插入到凝血因子VIII基因被切割的22号内含子中，则接入的基因供体将会与凝血因子VIII基因形成gRNA序列，介导Cas9蛋白进行二次切割。本发明的gRNA识别序列准确限定了基因供体的插入位置和插入方向，避免了基因供体以相反的方向插入凝血因子VIII基因，实现了对凝血因子VIII基因22号内含子倒位的修复。
优选地，所述gRNA识别序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述SEQ ID NO.3-4所示的核酸序列如下：
SEQ ID NO.3：5’-TGTGGCAACAGCGGTATAAATGG-3’；
SEQ ID NO.4：5’-GGTGAGCTCAAGACCCTTAAAGG-3’.
第三方面，本发明提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包括如第一方面所述的gRNA和Cas9蛋白表达载体。
优选地，所述基因编辑系统还包括如第二方面所述的基因供体。
本发明中，gRNA靶向介导Cas9蛋白切割凝血因子VIII基因22号内含子，基因供体由于具有与gRNA相同的序列，介导Cas9蛋白切割基因供体的gRNA识别序列；随后，切割后的基因供体按照5’-3’为23号外显子-26号外显子的方向插入到凝血因子VIII基因被切割的22号内含子中，将23-26号外显子连接于22号外显子后，实现了凝血因子VIII基因22号内含子倒位的修复；如果基因供体按照5’-3’为26号外显子-23号外显子的方向，插入到凝血因子VIII基因22号内含子中，则接入的基因供体将会与凝血因子VIII基因形成gRNA序列，介导Cas9蛋白进行二次切割。
第四方面，本发明提供了一种制备如第三方面所述的基因编辑系统的方法，包括以下步骤：
(1)设计gRNA的引物，变性后冷却至室温，得到所述gRNA；
(2)将gRNA克隆到表达载体上，得到表达gRNA的载体；
(3)将基因供体克隆到表达载体上，得到所述基因编辑系统。
本发明中，所述基因供体可以克隆到表达有gRNA和Cas9蛋白的载体上，也可以克隆到其他载体上，优选为克隆到表达有gRNA和Cas9蛋白的载体上。
优选地，步骤(1)所述gRNA的引物如SEQ ID NO.5-8所示，所述SEQ ID NO.5-8所示的核酸序列如下：；
SEQ ID NO.5：5’-caccTGTGGCAACAGCGGTATAAA-3’；
SEQ ID NO.6：5’-aaacTTTATACCGCTGTTGCCACA-3’；
SEQ ID NO.7：5’-caccGGTGAGCTCAAGACCCTTAA-3’；
SEQ ID NO.8：5’-aaacTTAAGGGTCTTGAGCTCACC-3’.
本发明中，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6用于合成SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.7和SEQID NO.8用于合成SEQ ID NO.2。
优选地，步骤(1)所述变性的温度为95-98℃，例如可以是95℃、96℃、97℃或98℃，优选为98℃。
优选地，步骤(2)所述表达载体为pSpCas9BB-2A-GFP质粒。
作为优选技术方案，本发明提供了一种制备如第三方面所述的基因编辑系统的方法，包括以下步骤：
(1)设计gRNA的引物，在95-98℃变性后冷却至室温，得到所述gRNA；
(2)将gRNA克隆到pSpCas9BB-2A-GFP质粒上，得到表达gRNA的载体；
(3)将基因供体克隆到表达载体上，得到所述基因编辑系统。
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第三方面所述的基因编辑系统。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供了一种如第三方面所述的基因编辑系统和/或如第五方面所述的药物组合物用于制备修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位和/或血友病的药物或试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的基因编辑系统利用gRNA和Cas9蛋白实现了对凝血因子VIII基因22号内含子的有效切割；
(2)本发明的基因供体中gRNA识别序列准确限定了基因供体的插入位置和插入方向，基因供体需要按照5’-3’为23号外显子-26号外显子的方向插入到凝血因子VIII基因被切割的22号内含子中，连接于22号外显子后，才能形成稳定的结构，如果基因供体以相反的方向插入，则会与凝血因子VIII基因形成gRNA序列，介导Cas9蛋白进行二次切割；
(3)本发明的基因编辑系统和/或包含基因编辑系统的药物组合物可以用于制备修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位和/或的药物和/或试剂。
附图说明
图1为表达gRNA的Cas9载体pSpCas9-gRNA示意图，其中，gRNA ExpressionVectors-gRNA表达载体。
图2为验证gRNA1和gRNA2具有介导Cas9切割靶标DNA性能的电泳图，其中，DNAMarker-DNA标准分子量。
图3为表达gRNA1和Cas9、携带基因供体的载体pSpCas9-edit示意图。
图4为验证pSpCas9-edit具有修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位作用的电泳图，其中，DNA Marker-DNA标准分子量。
图5为正常凝血因子VIII基因的转录和翻译示意图。
图6为22号内含子倒位的凝血因子VIII基因的转录和翻译示意图。
图7为pSpCas9-edit修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位的原理图。
图8为修复后的凝血因子VIII基因的转录和翻译示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1gRNA的设计
根据凝血因子VIII基因22号内含子前800bp的DNA序列，采用gRNA设计软件(CCTop：https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)设计出一系列gRNA，考虑gRNA的特异性及可能脱靶的位置，选择gRNA1和gRNA2进行实验，其中，gRNA1靶向凝血因子VIII基因22号内含子的反义链，gRNA2靶向凝血因子VIII基因22号内含子的正义链。
gRNA1(SEQ ID NO.1)：5’-TGTGGCAACAGCGGTATAAATGG-3’；
gRNA2(SEQ ID NO.2)：5’-GGTGAGCTCAAGACCCTTAAAGG-3’.
实施例2gRNA的合成
分别合成gRNA1和gRNA2的引物对，配置为10pM的溶液，在95-98℃变性后自然冷却至室温，得到gRNA的DNA序列，其中，gRNA1-F和gRNA1-R用于合成gRNA1，gRNA2-F和gRNA2-R用于合成gRNA2。
gRNA1-F(SEQ ID NO.5)：caccTGTGGCAACAGCGGTATAAA；
gRNA1-R(SEQ ID NO.6)：aaacTTTATACCGCTGTTGCCACA；
gRNA2-F(SEQ ID NO.7)：caccGGTGAGCTCAAGACCCTTAA；
gRNA2-R(SEQ ID NO.8)：aaacTTAAGGGTCTTGAGCTCACC.
反应体系如表1-1和表1-2所示。
表1-1gRNA1的合成体系
表1-2gRNA2的合成体系
| 名称 | 体积 |
| gRNA2-F(SEQ ID NO.7) | 10μL |
| gRNA2-R(SEQ ID NO.8) | 10μL |
| 10×SmartCut缓冲液 | 5μL |
| 双蒸水 | 25μL |
实施例3构建表达gRNA的载体
将gRNA克隆至Cas9蛋白表达载体pSpCas9BB-2A-GFP中，所述载体如图1所示，具体步骤为：
(1)将pSpCas9BB-2A-GFP在37℃下酶切过夜，用琼脂糖电泳分离酶切后的载体片段，pSpCas9BB-2A-GFP的酶切体系如表2所示；
(2)将酶切后的pSpCas9BB-2A-GFP与gRNA在16℃连接过夜，连接反应体系分别如表3-1和表3-2所示；
(3)连接产物转化到细菌中，采用PCR和测序技术筛选出阳性克隆，将表达gRNA1和gRNA2的载体分别命各为pSpCas9-gRNA1和pSpCas9-gRNA2，PCR技术筛选出阳性克隆的引物序列如表4所示。
表2pSpCas9BB-2A-GFP的酶切反应体系
表3-1gRNA1的连接反应体系
| 名称 | 体积 |
| gRNA1的DNA序列 | 5μL |
| 10×T4DNA连接酶缓冲液 | 1μL |
| 10×T4DNA连接酶 | 1μL |
| 双蒸水 | 3μL |
表3-2gRNA2的连接反应体系
| 名称 | 体积 |
| gRNA2的DNA序列 | 5μL |
| 10×T4DNA连接酶缓冲液 | 1μL |
| 10×T4DNA连接酶 | 1μL |
| 双蒸水 | 3μL |
表4PCR引物
| 名称 | 序列 |
| 正向引物(SEQ ID NO.9) | 5’-gcatatacgatacaaggctgttagag-3’ |
| 反向引物 | gRNA1-R或gRNA2-R |
实施例4gRNA1和gRNA2介导Cas9切割靶标DNA
采用Lipofectamine 3000转染试剂将pSpCas9-gRNA1和pSpCas9-gRNA2共转染到293细胞中，对照组的293细胞转染pSpCas9BB-2A-GFP。72小时后提取细胞的染色体DNA作为模板，PCR分析染色体DNA是否被切割。
PCR引物：正向引物(SEQ ID NO.10)5’-GGGCAAAACCATGGATGGAG-3’，反向引物(SEQID NO.11)5’-TCGGAGAACAGATTAGAAAC-3’。
PCR扩增反应条件：95℃预变性2min，(95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min)，共35循环，72℃延伸7min。
结果如图2所示，对照组仅扩增出长度为330bp的凝血因子VIII基因的DNA片段，实验组扩增出长度分别为330bp和210bp的DNA片段，其中，210bp的片段是被切割后的凝血因子VIII基因片段。由此说明，gRNA1和gRNA2具有介导Cas9切割凝血因子VIII基因的作用。
实施例5构建表达gRNA1和Cas9、携带基因供体的载体
化学合成包括凝血因子VIII基因23-26号外显子序列的基因供体，克隆至pSpCas9-gRNA1的Sbf1位点，新载体命名为pSpCas9-edit，所述载体如图3所示。具体步骤为：
(1)将pSpCas9-gRNA1在37℃下采用Sbf1内切酶酶切过夜，用琼脂糖电泳分离酶切后的载体片段，pSpCas9-gRNA1的酶切体系如表5-1所示；
(2)将基因供体在37℃下采用Sbf1内切酶酶切过夜，用琼脂糖电泳分离酶切后的载体片段，基因供体的酶切体系如表5-2所示；
(3)将酶切后的pSpCas9-gRNA1和基因供体在16℃下酶切过夜，连接产物转化到细菌中，采用PCR和测序技术筛选出阳性克隆，得到pSpCas9-edit，连接反应体系如表5-3所示。
表5-1pSpCas9-gRNA1的酶切体系
表5-2基因供体的酶切体系
| 名称 | 体积 |
| 10×CutSmart缓冲液 | 5μL |
| 基因供体(0.5μg/μL) | 5μL |
| SBf1限制性内切酶(10U/μL) | 2μL |
| 双蒸水 | 38μL |
表5-3pSpCas9-gRNA1和基因供体的连接反应体系
| 名称 | 体积 |
| 酶切纯化后的pSpCas9-gRNA1(0.1μg/μL) | 2μL |
| 酶切纯化后的基因供体(0.5μg/μL) | 2μL |
| 10×T4DNA连接酶缓冲液 | 1μL |
| 10×T4DNA连接酶 | 1μL |
| 双蒸水 | 4μL |
实施例6pSpCas9-edit修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位
采用Lipofectamine 3000转染试剂将pSpCas9-edit转染到293细胞中，对照组的293细胞转染pSpCas9-gRNA1。72小时后采用流式细胞分选仪(FACS)分选表达GFP的细胞，提取细胞的染色体DNA作为模板，PCR分析基因供体是否定点、定向地插入凝血因子VIII基因22号内含子中。
PCR引物：正向引物(SEQ ID NO.12)5’-GGGCAAAACCATGGATGGAG-3’，反向引物(SEQID NO.13)5’-CGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAG-3’，其中，正向引物位于gRNA1结合位点的上游，反向引物位于基因供体的剪接受体序列中。
PCR扩增反应条件：95℃预变性2min，(95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s)，共35循环，72℃延伸7min。
结果如图4所示，对照组未扩增出DNA片段，实验组扩增出长度约为300bp的DNA片段，说明基因供体成功插入凝血因子VIII基因的22号内含子中，该300bp的DNA片段即为基因供体。
如图5所示，正常的凝血因子VIII基因长度为186kb，具有26个外显子，转录的mRNA的长度为9kb，翻译得到包含2332个氨基酸的凝血因子VIII；如图6所示，当凝血因子VIII基因发生22号内含子倒位，转录得到长度小于9kb的缺失的mRNA，翻译得到的凝血因子VIII不具有凝血功能。
pSpCas9-edit修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位的原理如图7所示：gRNA靶向介导Cas9蛋白切割凝血因子VIII基因22号内含子，切割位点如图5箭头所指，基因供体由于具有与gRNA相同的序列，介导Cas9蛋白切割基因供体的gRNA识别序列；随后切割后的基因供体按照5’-3’为23号外显子-26号外显子的方向插入到凝血因子VIII基因被切割的22号内含子中，将23-26号外显子连接于22号外显子后，实现了凝血因子VIII基因22号内含子倒位的修复；如果基因供体按照5’-3’为26号外显子-23号外显子的方向插入到凝血因子VIII基因被切割的22号内含子中，则接入的基因供体将会与凝血因子VIII基因形成gRNA序列，介导Cas9蛋白进行二次切割。
如图8所示，本发明的gRNA识别序列准确限定了基因供体的插入位置和插入方向，将23-26号外显子连接于22号外显子之后，避免了基因供体以相反的方向插入凝血因子VIII基因，实现了对凝血因子VIII基因22号内含子倒位的修复，得到了完整的凝血因子VIII。
综上所述，本发明的基因编辑系统首先利用gRNA和Cas9蛋白实现了对凝血因子VIII基因22号内含子的切割，进而将携带有凝血因子VIII基因23-26号外显子序列的基因供体定点、定向地插入切割位点中，将23-26号外显子连接于22号外显子之后，避免了基因供体以相反的方向插入凝血因子VIII基因，实现了对凝血因子VIII基因22号内含子倒位的修复，得到了完整的凝血因子VIII。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (11)
1.一种基因供体，其特征在于，所述基因供体按照5’-3’方向顺次包括：gRNA识别序列、剪接受体序列、凝血因子VIII基因23-26号外显子序列、转录终止信号序列和gRNA识别序列；
所述gRNA识别序列与靶标DNA序列反向互补。
2.根据权利要求1所述的基因供体，其特征在于，所述gRNA识别序列如SEQ ID NO.3-4所示。
3.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括gRNA和Cas9蛋白表达载体；
所述gRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
所述基因编辑系统还包括如权利要求1或2所述的基因供体。
4.一种制备如权利要求3所述的基因编辑系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计gRNA的引物，变性后冷却至室温，得到所述gRNA；
(2)将gRNA克隆到表达载体上，得到表达gRNA的载体；
(3)将基因供体克隆到表达载体上，得到所述基因编辑系统。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA的引物如SEQ ID NO.5-8所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述变性的温度为95-98℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述表达载体为pSpCas9 BB-2A-GFP质粒。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计gRNA的引物，在95-98℃变性后冷却至室温，得到所述gRNA；
(2)将gRNA克隆到pSpCas9 BB-2A-GFP质粒上，得到表达gRNA的载体；
(3)将基因供体克隆到表达载体上，得到所述基因编辑系统。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求3所述的基因编辑系统。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
11.一种如权利要求3所述的基因编辑系统和/或如权利要求9或10所述的药物组合物在制备修复凝血因子VIII基因22号内含子倒位和/或血友病的药物或试剂中的应用。
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