JP7157052B2 - 筋緊張性ジストロフィーの治療のための組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、筋緊張性ジストロフィーの治療のための組成物および方法に関する。

ヌクレオチドリピート伸長、特にトリヌクレオチドリピート伸長は、２０を超える神経障害または発達障害に関与している。これらの疾病を治療するために提案されてきた１つのアプローチは、非常に特異的なヌクレアーゼを使用して、リピートを非病的長さまで短くすることである（総説については、Richard GF, Trends Genet. 2015 Apr; 31(4):177-186を参照）。

メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどの、非常に特異的なヌクレアーゼが、これらの戦略において使用されてきた。しかしながら、後者はトリヌクレオチドリピート伸長の切除には不適当であると当業者によって考えられていた（上記のRichardを参照）。全体的に見て、ＴＡＬＥＮがトリヌクレオチドリピートを短縮するためのより有望なツールと考えられていた。

この強い偏見に反して、本発明者らは、本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムが、ＤＭＰＫ遺伝子内のゲノムＤＮＡからヌクレオチドリピート伸長を切除するために実行され、それによって筋緊張性ジストロフィーを治療するための強力かつ予想外のツールを提供し得ることを示す。より具体的には、本発明者らは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９を用いて、ＤＭＰＫ遺伝子内のヌクレオチドリピート伸長の切除効率を改善する方法を発見した。

本発明者らは、上記で生じた強い偏見に反して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムがヌクレオチドリピート伸長の切除に有効であり得ることを示した。本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを、適切なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共に用いて、ＤＭＰＫ遺伝子内のヌクレオチドリピート伸長を切除するための改善されたツールに関する。

ある局面では、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲから、ヌクレオチドリピート伸長、特にトリヌクレオチドリピート伸長を特異的に切除するのに有用な、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子が、本明細書で開示される。本明細書で開示されるｓｇＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド伸長の５’側または３’側にあるゲノムＤＮＡ標的（プロトスペーサー）配列に相補的な配列に、塩基対形成により結合することができ、かつ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、ｓｇＲＮＡとゲノムＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション部位またはその近傍に、動員することができる。より正確には、トリヌクレオチドリピート伸長を切除するために本明細書で用いられるＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌に由来する（ＳａＣａｓ９）。本発明のｓｇＲＮＡ分子は、相補性部位の近傍でＳａＣａｓ９媒介二本鎖切断を誘導するのに適切な全ての配列要素を含む。特に、本出願は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に存在するヌクレオチドリピート伸長の切除をもたらすのに適切なｓｇＲＮＡ対を開示しており、該ｓｇＲＮＡ対は、ヌクレオチドリピート伸長の５’側に位置する標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的である第１のｓｇＲＮＡと、ヌクレオチドリピート伸長の３’側に位置する標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的である第２のｓｇＲＮＡとを含む。第１のｓｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの存在下、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内で、ヌクレオチドリピート伸長の５’側において、２本鎖切断を誘導することができる。第２のｓｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの存在下、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内で、ヌクレオチドリピート伸長の３’側において、２本鎖切断を誘導することができる。本発明の文脈において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは黄色ブドウ球菌に由来する（ＳａＣａｓ９）か、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼはＳａＣａｓ９の機能的変異体である。

第２のｓｇＲＮＡ分子は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む、１５～４０ヌクレオチドのガイド配列を含む。特定の実施形態では、第２のｓｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなる。

特定の実施形態では、第１のｓｇＲＮＡ分子は、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む、１５～４０ヌクレオチド長のガイド配列を含む。

本発明の別の局面は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内のヌクレオチドリピート伸長の５’側または３’側に位置する標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な配列に、塩基対形成により結合することができる配列を含むｓｇＲＮＡに関し；
ｓｇＲＮＡ分子は、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＳａＣａｓ９）、またはＳａＣａｓ９の機能的変異体であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼの存在下、前記３’－ＵＴＲ内で、前記ヌクレオチドリピート伸長の５’側または３’側のいずれかにおいて、２本鎖切断を誘導することができ；
ｓｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１１からなる群から選択される配列を含む、１５～４０ヌクレオチドのガイド配列を含む。

本明細書で開示される別の局面は、標的細胞のゲノムＤＮＡ内にあり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ内にある、ヌクレオチドリピート伸長を切除するための、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの使用である。

さらなる局面によると、細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲからヌクレオチドリピート伸長を切除するための方法であって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを実行する方法が、本明細書で開示される。本方法は、細胞に、上述のｓｇＲＮＡ分子の対、および黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼの機能的変異体をコードする遺伝子を、導入することを含む。

別の局面では、１型筋緊張性ジストロフィーを治療するための方法が、本明細書で開示され、ここでは、ヌクレオチドリピート伸長が、少なくとも１つの上述のｓｇＲＮＡ分子の対、および黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼの機能的変異体を用いて、ＤＭＰＫ遺伝子から切除される。
特定の実施形態では、切除されるヌクレオチドリピート伸長は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内に位置する、ビ、トリ、テトラ、ペンタまたはヘキサヌクレオチドリピート伸長であり、好ましくはトリヌクレオチドリピート伸長である。
特定の実施形態では、ヌクレオチドリピート伸長は、２０～１００００リピートなど、特に５０～５０００リピートなどの、２０以上のリピートを含み得る。

より具体的に言えば、本発明の使用および方法は、細胞、例えば、それを必要する対象の細胞に、以下を導入することを含む：
（ｉ）第１のｓｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号１１に示される配列を含む、１５～４０ヌクレオチド長の第２のｓｇＲＮＡ分子；および
（ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、または黄色ブドウ球菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの機能的変異体；
ここで、第１および第２のｓｇＲＮＡは、それぞれ、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内のヌクレオチドリピート伸長の５’側および３’側に位置する配列に相補的であり、それにより、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内の、ヌクレオチドリピート伸長の５’側に、２本鎖切断を誘導することによって、および、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内の、ヌクレオチドリピート伸長の３’側に、２本鎖切断を誘導することによって、ヌクレオチドリピート伸長を切除するのに適切である。

本発明は、１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）の治療のための治療戦略を提供する。

ｓｇＲＮＡ分子は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内のゲノムＤＮＡ標的配列（単に、標的配列とも称する）の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に、塩基対形成により結合するように設計される。本標的配列は、プロトスペーサーと呼ばれ、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれるヌクレオチドモチーフに隣接し、ＰＡＭは、実行された黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＳａＣａｓ９）によって特異的に認識される。言い換えれば、ｓｇＲＮＡ分子は、相補物をプロトスペーサーに結合させるために、プロトスペーサー配列に対応するガイドＲＮＡ配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ配列および足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）配列を含み、ガイドＲＮＡ配列は、１５～４０ヌクレオチド、特に１７～３０ヌクレオチド、特に２０～２５ヌクレオチド、例えば２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は、２１～２４ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は、２１または２４ヌクレオチドからなるガイドＲＮＡ配列を含む。

別の局面は、本明細書で提供されるｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ分子の対をコードするベクターに関し、ベクターは、好ましくはプラスミドまたはウイルスベクターであり、例えばｒＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター、特にｒＡＡＶベクターである。

いくつかの実施形態では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび／またはｓｇＲＮＡ分子は、１つまたは複数のベクター、例えば１つまたは複数のプラスミドまたはウイルスベクターから発現される。例えば、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、第１のベクターから発現され得、かつ第１および第２のｓｇＲＮＡ分子は、いずれも単一の第２のベクターから発現され得るか、または一方は第２のベクターから、他方は第３のベクターから発現され得る。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを実行するのに必要な全ての要素が、単一のベクターに含まれている。別の実施形態では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ分子は、インビトロでリボ核たんぱく質複合体（ＲＮＰ）として組み立てられた後、トランスフェクション法によって細胞に送達される。さらなる実施形態では、精製された組換え型ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質およびｓｇＲＮＡ分子がインビトロで合成され、別々に細胞に送達される。

別の実施形態では、上述のｓｇＲＮＡ分子の対は、別のｓｇＲＮＡ分子の対と組み合わせて用いられる。本実施形態では、組み合わせて用いられるｓｇＲＮＡ分子の対は、１つまたは複数のベクター、例えば１つまたは複数のプラスミドまたはウイルスベクターから発現され得る。

別の局面は、本明細書に記載されるベクターを、トランスフェクトまたは形質導入した標的細胞に関する。

さらなる局面では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼの機能的変異体、および上述の第１および第２のｓｇＲＮＡ分子を含むキットが、本明細書で開示される。別の局面では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするベクターおよび上述の第１および／または第２のｓｇＲＮＡ分子をコードするベクターを含むか、または、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび一方または両方のｓｇＲＮＡ分子を発現する単一のベクターを含むキットが、本明細書で開示される。上述のように、キット内のベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターであり得る。さらなる局面では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＲＮＡ分子のリボ核たんぱく質複合体を含むキットが、本明細書で開示される。別の局面では、インビトロで別々に合成された、組換え型ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼたんぱく質およびｓｇＲＮＡ分子を含むキットが、本明細書で開示される。さらに、本発明に記載されるキットは、本明細書に開示される方法および使用の実行において有用な、さらなる試薬（バッファー、および／または１つ以上のトランスフェクション試薬など）または装置を含んでよい。

本発明の他の局面および実施形態は、以下の詳細な説明において、明らかになるであろう。

ＳａＣａｓ９およびＳａｓｇＲＮＡ発現カセット。Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６１５９１およびその派生的プラスミドＭＬＳ４３（元のＣＭＶの代わりにより小さいプロモーターＥＦＳを含む）およびＭＬＳ４７（第２のｓｇＲＮＡの発現のために、第２のカセットを含む）に由来する、黄色ブドウ球菌由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）の発現カセット。黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＣＣＫ７４１７３．１の配列である（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６１５９１）。

選択したｓｇＲＮＡプロトスペーサー、それぞれのゲノム標的およびＰＡＭ、並びに切断効率。ｓｇＲＮＡのガイド配列に対応するｓｇＲＮＡプロトスペーサーは、遺伝子ＤＭＰＫのストップコドンからポリＡシグナルに至る、ＣＴＧリピートの上流または下流のゲノム領域を標的とする。対応するゲノム標的配列およびＳａＣａｓ９に特異的なＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）を提示している。全てのｓｇＲＮＡを、そのゲノム標的でＤＮＡを切断する能力について、試験した。オンラインプログラムＴＩＤＥにより解析した切断効率の結果を、表の最終列に示す。

ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲのＣＴＧリピートを取り囲む、該遺伝子のストップコドン（ここでは、任意にヌクレオチド１と示す）から、ポリＡまでの、ゲノム領域。ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲ内の、全ての試験したｓｇＲＮＡの位置を示す。ＳａＣａｓ９に特異的なそれぞれのＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）を、四角で囲んでいる。ＣＴＧリピート、並びにＤＭＰＫストップコドンおよびポリＡシグナルに、下線を引いている。

ＨｅＬａ細胞（Ａ）およびＤＭ１ヒト細胞（ｉＰＳ由来ＭＰＣ）（Ｂ）における、ＤＭＰＫのＣＴＧリピートの欠失。示した細胞株から抽出したｇＤＮＡから、ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲ領域をＰＣＲ増幅して、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離した。細胞を、示したｓｇＲＮＡ対を含むプラスミドＭＬＳ４３の派生体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）でトランスフェクトした。下流のｓｇＲＮＡ２３を、上流のｓｇＲＮＡ１、４、７および８Ｂのそれぞれと共に、試験した。ＳａＣａｓ９発現プラスミドのみでトランスフェクトした細胞、または、ＧＦＰ発現プラスミドのみでトランスフェクトした細胞由来のｇＤＮＡを、コントロールとして用いた（ｃｔｒｌ）。欠失したＰＣＲフラグメントの予想サイズを、アガロースゲルの写真の下部のパネルに示している。

ＤＭＰＫのＣＴＧリピート欠失を有するゲノム領域の配列決定による調査。ＣＴＧリピート欠失を含むものに対応するＰＣＲ産物（図４において矢印で示される）を、アガロースゲルから抽出し、精製し、標準的な配列決定により、配列決定した。非欠失ゲノム領域（ＷＴ）と欠失領域（Δの後に、ｓｇＲＮＡ対のそれぞれの番号が続く）とのアラインメントは、ＳａＣａｓ９の正確な位置（すなわち、プロトスペーサーのヌクレオチドＮ_３とＮ_４との間）を示す。

レンチウイルスベクターＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で処理したＤＭ１細胞における、ＤＭＰＫのＣＴＧリピートの欠失とフォーカスの消失。Ａ）それぞれ、ＣＭＶおよびＵ６プロモーターの発現下の、黄色ブドウ球菌（Ｓａ）由来Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡレンチウイルスベクターの、二重システムの概略図。ｓｇＲＮＡのＵＰおよびＤＷ：ＣＴＧリピートの上流および下流のゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡ。ＬＴＲ：末端反復配列；ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター；ＮＬＳ：核移行シグナル；ＨＡ：ヒトインフルエンザ血球凝集素エピトープ；ｐＡ：ポリアデニル化シグナル；Ｕ６：核内低分子ＲＮＡのヒトプロモーター；ｈＰＧＫ：ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター；ＧＦＰ：増強緑色蛍光タンパク質。Ｂ）ゲノムＰＣＲによる、ＤＭ１不死化筋芽細胞における、ＣＴＧリピート切除の検出。２６００ＣＴＧリピートを有する患者由来の細胞を、ＭＯＩの増加したＣａｓ９およびｓｇＲＮＡレンチウイルスベクター（４－２３および８Ｂ－２３の対、各アガロースゲル画像の左側に示す）で、形質導入した。編集された、および未編集のＰＣＲアンプリコンを、それぞれ、黒および白の矢印で示している。ＣＴＧリピート欠失の割合の推定を、対応するＰＣＲバンドの下部に示している（♯％ＤＥＬ）。Ｃ）レンチウイルスベクターＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による処置後の、核内フォーカスを失ったＤＭ１細胞の定量。

ＤＭ１筋芽細胞におけるＣＴＧリピート伸長のゲノム切除の検出。Ａ）ＥｃｏＲＩ制限酵素部位、Ａｌｕ多型、ＣＴＧリピート［（ＣＴＧ）ｎ］、本遺伝子のストップコドン（ｓｔｏｐ）、並びに、ＣＴＧリピートの上流および下流にあるｓｇＲＮＡ標的４および２３に対するＣａｓ９切断位置（Ｃｕｔ ＵＰおよびＣｕｔ ＤＷ）の相対位置を示す、ＤＭＰＫ遺伝子地図。サザンブロットに用いたプローブは、エクソン１３から１５の領域に渡る。Ｂ）示した筋芽細胞から抽出し、ＥｃｏＲＩで切断し、上図に示した放射性プローブとハイブリダイズさせたＤＮＡについての、サザンブロット画像。ＷＴおよびＤＭ１：レンチウイルスベクターＣａｓ９およびレンチウイルスベクターｓｇＲＮＡを有する（＋）、または有さない（－）、不死化した野生型およびＤＭ１筋芽細胞。Ｃｔｒｌ１および２：２６００ＣＴＧリピート伸長を有するＤＭ１コントロールクローン；デルタ：ＣＴＧ伸長の有無にかかわらず、両方の対立遺伝子にＣＴＧリピートの欠失を有するＤＭ１クローン。アスタリスク：２６００ＣＴＧリピートを有するＥｃｏＲＩフラグメント。Ｃ）各細胞型（ＷＴ、ＤＭ１、およびＤＭ１デルタ）、２つの対立遺伝子（１および２）のそれぞれについてのＣＴＧリピート［（ＣＴＧ）ｎ］の数、および、ＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡバンドについてのそれぞれの予想サイズを示す表。筋芽細胞ＷＴおよびＤＭ１の両方において、２つの対立遺伝子の１つ（ここでは１として示される）は約１ｋｂの長さのＡｌｕ多型を有する。

ＣＴＧリピート伸長の欠失は、ＤＭ１スプライシング異常を復帰させる。分化した筋芽細胞野生型（ＷＴ）およびＤＭ１（ＣＴＧリピート伸長あり（ｃｔｒｌ１および２）とＣＴＧリピート伸長なし（デルタ））における、示した転写産物のスプライシングプロファイル。（Ａ）ＲＴ－ＰＣＲについてのアガロースゲル画像および（Ｂ）それらのそれぞれの定量化。ヒストグラムは、３回の独立した生物学的反復試験の平均値±標準偏差である。スチューデントｔ検定による統計解析：二峰性および不等分散。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；ｎｓ：有意差なし；ＤＬ：検出限界未満。

ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲによる、ヘテロ欠損ＤＭＳＸＬマウスにおける、ＤＭＰＫのＣＴＧリピート伸長のインビボでの欠失。Ａ）それぞれ、ＳＰｃ５－１２およびＵ６プロモーターの発現下の、ＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡについてのＡＡＶ。ＩＴＲ：末端逆位配列；ＳＰｃ５－１２：合成筋肉特異的プロモーター；Ｉｎｔ：イントロン；ＮＬＳ：核移行シグナル；ＨＡ：ヒトインフルエンザ血球凝集素エピトープ；ｐＡ：ポリアデニル化シグナル；Ｄｅｓｍ：デスミンプロモーター；ｅＧＦＰ－Ｋ＝Ｋａｓｈペプチドに連結した、増強緑色蛍光タンパク質；Ｕ６：核内低分子ＲＮＡのヒトプロモーター；ｓｇＲＮＡのＵＰおよびＤＷ：ＣＴＧリピートの上流および下流のゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡ。Ｂ）Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡについてのＡＡＶベクターの筋肉内注射を受けたヘテロ欠損ＤＭＳＸＬマウスにおける、ＣＴＧリピート切除を示す、ゲノムＰＣＲ。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡについてのＡＡＶの、等量のウイルス粒子を、左ＴＡに同時注射した（＋）：それぞれ、約０.６×１０^１１および１×１０^１１総Ｖｇ、３および６週齢（３－６ｗ）。ネガティブコントロールとして、ＰＢＳを右ＴＡに注射した（－）。Ｃ）非欠失ＰＣＲ産物を示すゲノムＰＣＲ。黒矢印：欠失ＰＣＲ産物（３９９ｂｐ）。白矢印：約１２００のＣＴＧリピートを有する非欠失ＰＣＲ産物（約４５２７ｂｐ）。

発明の詳細な説明
本発明者らは、本明細書において、黄色ブドウ球菌由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが、ＤＭＰＫ遺伝子からヌクレオチドリピートを切り出すために効率的に用いられ、それによって１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）の治療のための強力なツールを提供し得ることを、示す。

従って、第１の局面において、以下が本明細書で開示される。
（ｉ）ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ内に位置するヌクレオチドリピートの５’側に位置するゲノムＤＮＡにおける標的配列（プロトスペーサー）に相補的な配列に、塩基対形成により結合することができる、第１のｓｇＲＮＡ分子。
（ｉｉ）ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ内に位置するヌクレオチドリピートの３’側に位置するゲノムＤＮＡにおける標的配列（プロトスペーサー）に相補的な配列に、塩基対形成により結合することができる、第２のｓｇＲＮＡ分子。
（ｉｉｉ）ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ内に位置するヌクレオチドリピートの、それぞれ５’側および３’側に位置するゲノムＤＮＡにおける標的配列に相補的な配列に、塩基対形成によりそれぞれ結合することができる、ｓｇＲＮＡ分子の対。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム
クリスパー（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）タイプＩＩシステムは、近年有望なゲノム編集ツールとして浮上しているＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ技術である。本システムには、２つの異なる構成要素がある：（１）ガイドＲＮＡ、および（２）エンドヌクレアーゼ、この場合ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９である。ガイドＲＮＡは、細菌性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の組み合わせであり、シングルキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）転写物として設計されている（Ｊinek et al., Science 2012 Aug 7; 337(6096):816-21）。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的特異性とｔｒａｃｒＲＮＡの足場特性とを組み合わせて単一の転写物とされる。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９が細胞内で発現されると、ゲノム標的配列は修飾され得るかまたは永久に破壊され得る。

ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｓｇＲＮＡガイド配列と、ゲノムＤＮＡの標的配列（プロトスペーサー）に対する相補物との間に、塩基対形成することにより、標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合を成功させるために、ゲノム標的配列は標的配列の直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含まなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが両方のＤＮＡ鎖を切断して２本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことができるように、Ｃａｓ９をゲノム標的配列に局在化させる。Ｃａｓ９はＰＡＭ配列の上流の３番目と４番目のヌクレオチドの間を切断し得る。本発明で実行されるシステムによると、ＤＳＢはその後、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を介して修復され得る。

本発明は、１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）に関連することが報告されているリピート配列を効率的に切除するための、本明細書において革新的な方法で改良されているこの強力なシステムの実行に関する。

Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ
タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＤＮＡターゲティングメカニズムは、標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在に応じて、配列特異的な方法で、ＣＡＳ９エンドヌクレアーゼが標的ＤＮＡを切断するように誘導する、ガイドＲＮＡを包含する。

ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが由来する細菌の種によって異なる。

本発明の文脈において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌に由来する（ＳａＣａｓ９）。それゆえ、ＤＮＡの切断はＳａＣａｓ９に特異的なＰＡＭの存在に依存している。ＳａＣａｓ９のコンセンサスＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴであり、ＲはＡまたはＧである（相補鎖ではＡＹＹＣＮＮであり、ＹはＴまたはＣである）（Ran FA et al, Nature 2015; Kleinstiver BP et al, Nat Biotech 2015）。

本発明で用いられるＣａｓ９エンドヌクレアーゼはまた、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼの機能的変異体であってよい。

「機能的変異体」とは、親のＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼとは異なる配列を有し、親のＳａＣａｓ９と同じプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、同じｓｇＲＮＡの定常部分に適合することにより、ＤＮＡにおいて部位特異的２本鎖切断を誘導することができる、変異体Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを意味する。前記変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＣＣＫ７４１７３．１を有するＳａＣａｓ９か、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６１５９１によりコードされるＳａＣａｓ９（配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する）などの、親のＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼに由来し得る。例えば、機能的変異体ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、既知のＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み得、既知のＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。

ガイドＲＮＡ
黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、または黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼの変異体を用いて、ＤＭＰＫからトリヌクレオチドリピート伸長を切除するために、特異的に設計されたシングルガイドＲＮＡ（すなわちｓｇＲＮＡ）が、本明細書で開示される。

上述のように、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの一部であり、該システムにゲノムＤＮＡ標的特異性を提供する。標的ゲノムＤＮＡ配列は、１５～４０ヌクレオチド、特に２０～３０ヌクレオチド、特に２０～２５ヌクレオチド、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチドを含み、上述のように、その後に適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が続く。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内のＰＡＭの前の、１５～４０ヌクレオチド，特に２０～３０ヌクレオチド、特に２０～２５ヌクレオチド、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、より詳細には２１または２４ヌクレオチドの、ゲノム配列の相補配列に相補的な、ガイドＲＮＡ配列を含む。

特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、ＤＭＰＫの前記ゲノム配列に、同一であるか、または少なくとも８０％同一であるか、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一のいずれかであり、ＳａＣａｓ９に特異的なＰＡＭの前の、１５～４０ヌクレオチド、特に２０～３０ヌクレオチド、特に２０～２５ヌクレオチド、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、より詳細には２１または２４ヌクレオチドの前記ゲノム配列の相補配列にハイブリダイズすることができる。当業者には周知であるが、ｓｇＲＮＡはＰＡＭモチーフを含まず、結果としてＰＡＭに相補的な配列に結合しない。標的配列は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内で、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖上に存在してもよい。従って、本発明によると、標的配列全体およびＰＡＭが、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内に存在する。

本発明の文脈において、「３’－ＵＴＲ」は、ＤＭＰＫ遺伝子のストップコドンからＤＭＰＫ遺伝子のポリアデニル化までのゲノム領域として定義される。

以下のウェブツールによって提供されるツールなどの、適切なＰＡＭを含む標的ゲノムＤＮＡ配列を同定するためのバイオインフォマティクスツールが、利用可能である：ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／ｄｅｓｉｇｎｃｒｉｓｐｒ．ｈｔｍｌ）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｒｅｐ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＣａｓＦｉｎｄｅｒ／）、およびＣＲＩＳＰＯＲ（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／ｃｒｉｓｐｏｒ／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｃｇｉ）。当業者はまた、Doench et al., Nat Biotechnol. 2014 Dec;32(12):1262-7 またはPrykhozhij et al., PLoS One. 2015 Mar 5;10(3):e0119372を参照することができ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムに関する、および、適切なＰＡＭを含む標的ゲノムＤＮＡの同定に関する情報およびリソースを、さらに以下のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／～ｍｏｎｔｏｌｉｕ／ＣＲＩＳＰＲ／で見つけてもよい。あるいは、目的の遺伝子内で、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムなどの配列アラインメントツールにおいて、クエリーとして、これらの配列を使用することによって、ＰＡＭ配列を同定することができる。

しかし、本出願において、本発明者らは、ＤＭＰＫ遺伝子中のヌクレオチドリピートの下流の領域を標的とするｓｇＲＮＡのうち、限られた数だけがこれらのリピートの効率的な切除を提供できることを示す。

周知されているように、ｓｇＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物であり、標的特異性（標的ゲノムＤＮＡ配列の相補配列に対する、ガイド配列塩基対形成により与えられる）およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対する足場／結合能力の両方を提供する。言い換えれば、ｓｇＲＮＡ分子は、ガイド配列（プロトスペーサーの相補物に結合するｃｒＲＮＡの特異的部分に対応する）およびｓｇＲＮＡ定常部分（ｃｒＲＮＡの非特異的部分、リンカーループ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む）を含む。両方とも黄色ブドウ球菌に由来するという意味で、ｓｇＲＮＡ定常部分と選択されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼは適合する。

特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡの定常配列（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号６に示されるＳａｓｇＲＮＡ定常部分（８１ヌクレオチドの配列、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６１５９１由来）である。

配列番号６：
ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵＵ

別の実施形態では、ｓｇＲＮＡの定常配列は、配列番号６に示されるＳａｓｇＲＮＡ定常部分の機能的変異体であり、配列番号６に示される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有し、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼの機能的変異体に対する足場／結合能力を提供することができる。

適切なプラスミドなどの、分子生物学キットおよびツールは、ＤＭＰＫの標的ゲノムＤＮＡ配列およびＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼの両方の観点から、所望の特異性を有するｓｇＲＮＡを容易に生成するために、利用可能である。例えば、多くのプラスミドおよびツールが、Ａｄｄｇｅｎｅから利用可能である。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ対は、Ｕ６プロモーターの制御下で、プラスミドから発現される。特定の実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡ対の両方のｓｇＲＮＡは、２つのＲＮＡ足場を含有する単一の発現カセットから発現され、それぞれが、同じベクターのプロモーター、特にＵ６プロモーターの制御下にある（例えば、同じプラスミド内の、または、ＡＡＶゲノムまたはレンチウイルスなどの同じ組換え型ウイルスゲノム内の）。特定の実施形態では、２つのｓｇＲＮＡ足場は、逆位（すなわち、ｔａｉｌ ｔｏ ｔａｉｌの方向）またはタンデムで、特にタンデム（例えば、ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌの方向）で提供される。別の実施形態では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする遺伝子は、誘導性または構成的プロモーターなどのプロモーター、特にユビキタスまたは組織特異的プロモーター、特に筋特異的プロモーターに、作動可能に連結している。ユビキタスプロモーターには、例えば、ＥＦＳ、ＣＭＶ、ＳＦＦＶまたはＣＡＧプロモーターが含まれる。筋特異的プロモーターには、当業界で周知であるように、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、デスミンプロモーター、または合成Ｃ５．１２プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼの発現に用いられるプロモーターは、テトラサイクリン、タモキシフェン、エクジソン誘導性プロモーターなどの、誘導性プロモーターであり得る。

第１および第２のｓｇＲＮＡ分子は、切除するべきＤＭＰＫのヌクレオチドリピート伸長のそれぞれ５’側および３’側にある領域に、それぞれ相補的である。したがって、ｓｇＮＡ分子は、ＰＡＭを伴うヌクレオチドリピート伸長の上流および下流の領域と特異的に結合するように設計されており、ここで標的配列全体およびＰＡＭはＤＭＰＫ遺伝子の３'ＵＴＲ内にある。

切除領域から標的配列（相同領域＋ＰＡＭ）までの距離は、重要でないかもしれないが、遺伝子構造の不安定化を最小限にするために、標的配列は、ヌクレオチドリピート伸長の最も近い末端から、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０未満または１０未満のヌクレオチド内にあるように選択され得る。例えば、ヌクレオチドリピート伸長の５’側でＤＳＢの誘導を指示するように設計されたｓｇＲＮＡを考慮すると、標的配列のＰＡＭの最も３’側にあるヌクレオチドは、切除するべきヌクレオチドリピート伸長の第１の（５’から３’方向を考慮）ヌクレオチドである最も５’側のヌクレオチドから、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０未満、または１０未満のヌクレオチドの範囲内にある。

ｓｇＲＮＡ分子は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域内に位置するトリヌクレオチドリピート伸長を、ＳａＣａｓ９を用いて切除するために、設計される。本実施形態の特定の変異体において、本発明は、以下からなる群から選択される配列を含む、１５～４０ヌクレオチドのガイド配列を含むｓｇＲＮＡ分子に関する：
ＡＧＵＣＧＡＡＧＡＣＡＧＵＵＣ（配列番号７）
ＡＣＡＡＣＣＧＣＵＣＣＧＡＧＣ（配列番号８）
ＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＧＣＵＣＧ（配列番号９）
ＡＧＧＧＵＣＣＵＵＧＵＡＧＣＣ（配列番号１０）
ＡＡＵＡＣＣＧＡＧＧＡＡＵＧＵ（配列番号１１）

さらに特定の実施形態では、本発明は、以下からなる群から選択されるガイド配列を含む、ｓｇＲＮＡ分子に関する：
ＧＣＣＣＣＧＧＡＧＵＣＧＡＡＧＡＣＡＧＵＵＣ（配列番号１）
ＣＡＧＵＵＣＡＣＡＡＣＣＧＣＵＣＣＧＡＧＣ（配列番号２）
ＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＧＣＵＣＧ（配列番号３）
ＧＧＣＵＣＧＡＡＧＧＧＵＣＣＵＵＧＵＡＧＣＣ（配列番号４）
ＧＡＣＡＡＵＡＡＡＵＡＣＣＧＡＧＧＡＡＵＧＵ（配列番号５）

さらに特定の実施形態では、本発明は、以下からなる群から選択されるガイド配列を含む、ｓｇＲＮＡ分子に関する：

上記のように配列番号１８では、ＧがＵ６プロモーターからの転写を開始するのに必要であるので、下線を引いたＧ塩基を、配列番号２と比較して導入した。しかしながら、当業者であれば、他のプロモーターがガイドコード配列（ｇｕｉｄｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の直前のこの位置にＧを必要としないこと、または当業界で周知であるように、１つ以上の他のヌクレオチド塩基を必要とし得ることを理解するであろう。

本発明はさらに、配列番号１～５、および配列番号１８からなる群から選択されるガイド配列を含むｓｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む、上記に規定したベクターに関する。より特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子をコードする配列はさらに、配列番号６に示されるｓｇＲＮＡ定常部分配列、または上記に規定したそれらの変異体をコードする配列を含む。より具体的には、ｓｇＲＮＡ分子全体をコードする配列は、配列番号１２～１６からなる群から選択される。

特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子の対は、以下を含む一対のｓｇＲＮＡである：
―ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ内に位置するトリヌクレオチドリピート伸長領域の上流（すなわち５’側）に、２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するために用いられる第１のｓｇＲＮＡ分子であって、ここで、上流のＤＳＢは３’－ＵＴＲ内に誘導される；
―ＤＭＰＫのトリヌクレオチドリピート伸長領域の下流（すなわち３’側）にＤＳＢを誘導するために用いられる第２のｓｇＲＮＡ分子であって、ここで、下流のＤＳＢは３’－ＵＴＲ内に誘導され、ここで、第２のｓｇＲＮＡ分子は、１５～４０ヌクレオチド長の、特に２０～３０ヌクレオチド、特に２０～２５ヌクレオチドの範囲であり、例えば２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドであり、特に２１または２４ヌクレオチドからなるガイド配列であって、かつ、配列番号１１に示される配列を含むガイド配列を含む。

さらに特定の実施形態では、第１のｓｇＲＮＡ分子は、１５～４０ヌクレオチド長，特に２０～３０ヌクレオチド、特に２０～２５ヌクレオチドの範囲の、例えば２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドからなる、特に２１または２４ヌクレオチドからなる、かつ、配列番号７～配列番号１０から選択される配列を含む、ガイド配列を含む。好ましい実施形態では、第１のｓｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号１～４および配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列からなる。

別の好ましい実施形態では、第２のｓｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなる。

別の実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡ分子の対は、以下からなる群から選択される一対のガイド配列を含む：
－配列番号１および配列番号５；
－配列番号２（または配列番号１８）および配列番号５；
－配列番号３および配列番号５；
－配列番号４および配列番号５；

上述のように、本発明のｓｇＲＮＡは、発現カセットから発現され得る。ｓｇＲＮＡの発現は、特に、Ｕ６プロモーターなどのプロモーターにより調節され得る。従って、本発明はまた、配列番号１７に示されるＵ６プロモーターなどのプロモーターの制御下に置かれたｓｇＲＮＡコード配列を含む、ｓｇＲＮＡの発現のためのカセットを含む。

特定の実施形態では、発現カセットは、Ｕ６プロモーターからのｓｇＲＮＡの発現のために、以下の配列を含む：
―５’から３’方向に、配列番号１７、配列番号４３および配列番号４８の組み合わせ；
―５’から３’方向に、配列番号１７、配列番号４４および配列番号４８の組み合わせ；
―５’から３’方向に、配列番号１７、配列番号４５および配列番号４８の組み合わせ；
―５’から３’方向に、配列番号１７、配列番号４６および配列番号４８の組み合わせ；または
―５’から３’方向に、配列番号１７、配列番号４７および配列番号４８の組み合わせ。

本発明の方法および使用
本発明は、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ分子を用いて、ＤＭＰＫの標的ゲノムＤＮＡ配列に到達する様々な方法を企図している。いくつかの実施形態では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ポリペプチド形態で、細胞内に導入される。一変異体では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、細胞透過性ペプチド（細胞への分子の取り込みを促進するペプチドである）にコンジュゲートまたは融合する。ｓｇＲＮＡ分子はまた、直接的に、または、脂質誘導体、リポソーム、リン酸カルシウム、ナノ粒子などのトランスフェクション試薬、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションを用いて、単離オリゴヌクレオチドとして、細胞に投与され得る。ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ分子はまた、インビトロでリボ核たんぱく質複合体として予め組み立てられて、その後、直接的に、またはトランスフェクション試薬を用いて、細胞に送達されてもよい。

別の実施形態では、本発明は、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび／またはｓｇＲＮＡ分子を、標的細胞に、前記エンドヌクレアーゼおよび／またはｓｇＲＮＡ分子を発現するベクターの形態で、導入することを企図している。したがって、本発明はまた、本発明に記載のｓｇＲＮＡ分子またはｓｇＲＮＡ分子の対をコードするベクターに関する。細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は、当業界で知られている。発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移すことができる。発現ベクターは、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの、既知の物理的方法を用いて、細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、および脂質誘導体およびリポソームのようなコロイド分散系が含まれる。他の実施形態では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび／またはｓｇＲＮＡ分子は、生物学的手段、特にウイルスベクターにより、導入される。本発明の実施において有用な代表的なウイルスベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、特にレンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス１型およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。適切なウイルスベクターの選択は、当然、標的細胞およびウイルス親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）によるであろう。

ある実施形態では、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ分子は、異なるベクター内で提供される（例えば２つのベクターであって、１つ目がＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含有し、２つ目が両方のｓｇＲＮＡ分子をコードしている；あるいは、３つのベクターであって、１つ目がＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードしており、かつ、それぞれのｓｇＲＮＡ分子について１つのベクターである）。別の実施形態では、ＤＭＰＫからのトリヌクレオチドリピート伸長の切除に必要なＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよび両方のｓｇＲＮＡ分子を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの全ての要素が、単一の発現ベクターから発現される。

特定の実施形態では本発明のＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ分子は、他のＤＭ１治療薬と、同時にまたは連続的に組み合わせて使用される。特に、本発明のＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ分子は、リピート伸長を切除するために、ｓｇＲＮＡ分子の別の対、および別のまたは同じＣａｓ９エンドヌクレアーゼと、同時にまたは連続的に組み合わせて使用されてよい。

特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子の他の対は、ＥＰ１６３０６４２６（参照によりその全体が組み込まれる）に開示された対から選択される。

特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子の他の対は、ＥＰ１６３０６４２６の配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む、１５～４０ヌクレオチドのガイド配列を含むｓｇＲＮＡ分子を含む。

特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子の他の対は、第１のｓｇＲＮＡ分子を含み、第１のｓｇＲＮＡ分子はＥＰ１６３０６４２６の配列番号８、ＥＰ１６３０６４２６の配列番号９、ＥＰ１６３０６４２６の配列番号１０、またはＥＰ１６３０６４２６の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む、１５～４０ヌクレオチド長のガイド配列を含む。別の特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子の他の対は、第１のｓｇＲＮＡ分子を含み、ここで第１のｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＥＰ１６３０６４２６の配列番号１～４、およびＥＰ１６３０６４２６の配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列からなる。

別の特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子の他の対は、第２のｓｇＲＮＡ分子を含み、第２のｓｇＲＮＡ分子のガイド配列は、ＥＰ１６３０６４２６の配列番号５、ＥＰ１６３０６４２６の配列番号６、およびＥＰ１６３０６４２６の配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列からなる。

ある局面では、本発明はまた、本発明のｓｇＲＮＡ分子または本発明のｓｇＲＮＡ対を含むか、あるいは、本発明のベクターでトランスフェクトまたは形質導入されている標的細胞に関する。場合により、標的細胞はさらに、例えば、本発明のｓｇＲＮＡ分子またはｓｇＲＮＡ対を発現するベクターと同じベクターから、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼを発現する。例えば、組換え型細胞は、ｉＰＳ由来間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ＭＰＣから選択され得る。

本発明のシステムは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域内で、ヌクレオチドリピート伸長、特にトリヌクレオチドリピートを切除するために、用いられる。特定の実施形態では、ヌクレオチドリピート伸長（例えば、トリヌクレオチドリピート伸長）は、ヌクレオチドモチーフの２０～１００００リピート、より具体的には５０～５０００リピートを含む。例えば、切除するべきヌクレオチドリピート伸長（例えば、トリヌクレオチドリピート伸長）は、任意の数のリピートを含んでよく、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００リピート、または少なくとも２０００リピートを上回るヌクレオチドモチーフを含んでよい。より具体的に言えば、リピートの数は、病的なリピートの数であり、これは、ヌクレオチドリピート（例えば、トリヌクレオチドリピート）が、病状に関連しているか、関連し得ることを意味する。特定の実施形態では、リピートは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域内のＣＴＧリピートであり、２０以上のリピートから、または５０以上のリピートから、病的である。特定の実施形態では、ヌクレオチドリピート伸長は、２０～１００００リピート、より具体的には５０～５０００リピートを含む。特に、ヌクレオチドリピート伸長は、１０００～３０００リピート、より具体的には１２００～２６００リピートを含む。

本明細書で用いられる場合、「治療すること」および「治療」という用語は、対象が、疾病の少なくとも１つの症状の軽減または疾病の改善を得るように、例えば有益な、または望ましい臨床結果を得るように、対象に組成物の有効量を投与することを指す。本発明の目的のために、有益な、または望ましい臨床結果には、検出可能か検出不能かにかかわらず、１つ以上の症状の軽減、疾病の程度の減少、疾病の安定（すなわち悪化しない）状態、疾病進行の遅延または緩徐、病状の回復または緩和、および寛解（部分的または完全かどうかにかかわらず）が含まれるが、これらに限定されない。治療することは、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを指すことができる。あるいは、疾病の進行が低減または停止している場合に、治療は「有効」である。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを意味することができる。治療を必要とするものには、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害とすでに診断されているもの、並びに遺伝子感受性または他の要因によりそのような障害を発症する可能性があるものが含まれる。本明細書で用いられる場合、「治療すること」および「治療」はまた、疾病または障害の予防を指し、これらの疾病または障害の発症を遅延させるか、または予防することを意味する。

本発明は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域内の、トリヌクレオチド(例えばＣＴＧ)リピート伸長に関連する、ＤＭ１であるヌクレオチドリピート伸長障害の治療を提供する。

本発明はまた、医薬として用いるための、上述のｓｇＲＮＡ分子の対に関する。

本発明はさらに、ＤＭ１を治療するための方法において用いるための、上述のｓｇＲＮＡ分子の対に関する。

本発明はさらに、ＤＭ１の治療のための医薬の製造のための、上述のｓｇＲＮＡ分子の対の使用に関する。

本発明はさらに、ＤＭ１を治療するための方法であって、上述のｓｇＲＮＡ分子の対
の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。

本発明に記載されるｓｇＲＮＡ分子、ｇＲＮＡ分子の対、組換え型ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼたんぱく質、ベクター（１つ以上のｓｇＲＮＡ分子および／またはＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするもの）および細胞は、それを必要とする対象において、ｓｇＲＮＡ分子、ｓｇＲＮＡ分子の対、ベクターおよび細胞と、その作用部位との接触を生じさせる任意の手段によって筋緊張性ジストロフィーを治療するために、製剤化され、投与され得る。

本発明はまた、本発明のｓｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ対、または、本発明の組換え型ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼたんぱく質もしくはベクター（本発明のｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ対を、単独で、またはＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼコード配列と共にコードするもの）、または、本発明の細胞を含む、医薬組成物を提供する。これらの組成物は、治療薬（本発明のｓｇＲＮＡ、ベクター、または細胞）の治療有効量および医薬的に許容できる担体を含む。具体的な実施形態では、「医薬的に許容できる」という用語は、動物およびヒトへの使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認された、または米国または欧州薬局方または他の一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。これらの医薬担体は、水および油などの滅菌した液体であり得、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む。水は、医薬組成物を静脈内に投与する場合に、好ましい担体である。食塩水並びに水溶性デキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として使用することができる。好適な医薬品賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。

組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態をとることができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。好適な医薬担体の例は、E. W. Martinにより、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。これらの組成物は、対象に適切に投与するための形態を提供するように、好適な量の担体と共に、好ましくは精製された形態の、治療有効量の治療薬を含有するであろう。

医薬組成物は、哺乳動物、特にヒトへのあらゆる種類の投与に適しており、通例の手順に従って製剤化される。該組成物は、好適な従来の医薬担体、希釈剤および／または賦形剤を用いて、製剤化される。該組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、いずれの一般的な経路を介してもよい。これには、例えば経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与または静脈内投与が含まれる。好ましくは、該組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、製剤化される。一般的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌した、等張の、水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、該組成物は可溶化剤、および注射部位の痛みを軽減するためにリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。

ヌクレオチドリピート伸長の治療において有効であろう、本発明の治療薬の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。さらに、最適な投与量範囲を予測するのを助けるために、インビボおよび／またはインビトロアッセイを場合により使用してもよい。製剤化に使用される正確な投与量はまた、投与経路、および疾病の重篤度にも左右されるであろうし、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。必要とする対象に投与されるｓｇＲＮＡ、ベクターまたは細胞の投与量は、投与経路、対象の年齢または必要な治療効果を得るのに必要な発現レベルを含むが、これらに限定されない、いくつかの要因に基づいて、変化するだろう。当業者であれば、これらの要因やその他の要因に基づき必要とされる投与量範囲を、当業界の知識に基づいて、容易に決定することができる。

下記に、以下の実験部分および図において使用されるｓｇＲＮＡ番号と配列番号を対応させた表を提供する。

材料および方法
プラスミド構築
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９をコードするプラスミドは、プラスミドｐＸ６０１－ＡＡＶ－ＣＭＶ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ（ＭＬＳ４２）［Ran et al, 2015］に由来する。ＥＦＳプロモーターを、プライマーＦ－ＸｈｏＩ－ＭｒｅＩ－ＥＦＳ（ＭＬＳ６３）およびＲ－ＸｍａＩ－ＮｒｕＩ－ＥＦＳ（ＭＬＳ６４）でＰＣＲ増幅し、プロモーターを欠いたｐＸ６０１－ＡＡＶ－：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡのＸｈｏＩ／ＡｇｅＩ部位にクローニングして、ｐＡＡＶ－ＥＦＳ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ（ＭＬＳ４３）を得た。

ｓｇＲＮＡの第２のカセット（Ｕ６：：ＢｂｓＩ－ｓｇＲＮＡ）を、プラスミドＭＬＳ４３のＡｃｃ６５Ｉ部位、第１のｓｇＲＮＡカセットの上流に、タンデムにクローニングし、コンストラクトｐＡＡＶ－ＥＦＳ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｂｓＩ－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ（ＭＬＳ４７）を得た。既存のカセットＵ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡの同じ配列を用いたが、ｓｇＲＮＡプロトスペーサークローニング部位をＢｂｓＩに交換して、インサートＵ６：：ＢｂｓＩ－ｓｇＲＮＡを、合成的に合成した（ＧｅｎｅＣｕｓｔ）。

ＩＤ番号ｎのＳａｓｇＲＮＡプロトスペーサーを、順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドの対として合成し（表２）、制限酵素部位ＢｂｓＩ（ＭＬＳ４７派生的プラスミドｐＡＡＶ－ＥＦＳ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ｎ－ＤＭＰＫ－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ）およびＢｓａＩ（プラスミドｐＡＡＶ－ＥＦＳ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ｎ－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：ｎ－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫ）へのクローニングに先立ち、インビトロでアニーリングした。

レンチウイルスベクターは、ｐＣＣＬプラスミド［ｐＣＣ－ｈＰＧＫ．ＧＦＰ（ＭＬＳ８７）；Dr. Mario Amendolaから寛大にも譲渡］の主鎖を用いて構築した。インサートＵ６：：４－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：２３－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫおよびＵ６：：８Ｂ－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：２３－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫ（酵素的に分解したプラスミドＭＬＳ９３およびＭＬＳ９５に由来）を、プラスミドＭＬＳ８７のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ部位にクローニングして、ｐＣＣＬ－Ｕ６：：４－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：２３－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫ－ｈＰＧＫ．ＧＦＰおよびｐＣＣＬ－Ｕ６：：８Ｂ－ｓｇＲＮＡ；Ｕ６：：２３－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫ－ｈＰＧＫ．ＧＦＰ（ＭＬＳ１００およびＭＬＳ１０２）を得た。プラスミドＭＬＳ４２由来のＣＭＶプロモーターを、プロモーターを欠いたｐＣＣＬ－ＧＦＰ（ｈＰＧＫプロモーターを有さないＭＬＳ８７）のＸｈｏＩ／ＡｇｅＩ部位にクローニングし、ｐＣＣＬ－ＣＭＶ－ＧＦＰ（ＭＬＳ１０７）を得た。

ＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ対４－２３に対するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、配列決定ＩＴＲを有するｐＡＡＶプラスミド［Ｇｅｎｅｔｈｏｎプラスミドバンク］を用いて構築した。ＳａＣａｓ９を、鋳型としてプラスミドＭＬＳ４２を用いて、プライマーＦ－ＰｍｅＩ－ＳａＣａｓ９（ＭＬＳ１４６）およびＲ－ＮｏｔＩ－ＳａＣａｓ９＿３ｘＨＥ（ＭＬＳ１４７）によりＰＣＲ増幅した。ｐＡＡＶ－ＳＰｃ５－１２－ＳａＣａｓ９（ＭＬＳ１１８）を得るために、ゲル精製したインサートＳａＣａｓ９を、ＡＡＶプラスミドｐＣ５１２－Ｉｎｔ－ｓｍＳＶｐｏｌｙＡ（ＭＬＳ１）のＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。ＰＣＲインサートＵ６：：４－２３－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫ［プライマーＦ－ＭＣＳ－ｂｅｆｏｒｅ－Ｕ６ＳａｓｇＲＮＡ（ＭＬＳ１６３）およびＲ－ＰｍｌＩ－ＥｎｄＳａｓｇＲＮＡ－ｕｐ（ＭＬＳ１６６）；鋳型としてＭＬＳ９３］を、ｐＡＡＶ－Ｄｅｓ－ＥＧＦＰ－ＫＡＳＨ（ＭＬＳ２３／ＭＬＳ２７）の、ＡｆｌＩＩ／ＭｓｓＩ部位にクローニングすることにより、ｐＡＡＶ－Ｄｅｓ－ｅＧＦＰ－ＫＡＳＨ－Ｕ６：：４－２３－ｓｇＲＮＡ＿ＤＭＰＫ（ＭＬＳ１２３）を得た。

ｓｇＲＮＡの設計
ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲ内の全ての可能性のあるＳａＣａｓ９標的を、手動で、およびプログラムＣａｓＢＬＡＳＴＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂｌａｓｔｒ．ｏｒｇ／）およびＣＲＩＳＰＯＲ（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／ｃｒｉｓｐｏｒ）によって、スクリーニングした。ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを、Ｒ＝ＡまたはＧで、スクリーニングに用いた（非コード鎖ではＡＹＹＣＮＮ、Ｙ＝ＴまたはＣ［Ran et al, Nature 2015; Kleinstiver et al, Nat Biotech 2015］．）。各ｓｇＲＮＡプロトスペーサーについて、潜在的オフターゲットの数を、ヒトゲノム「ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）－ヒト（２０１４年４月２日更新）」に基づき、ミスマッチのカットオフの数≦４に設定して、プログラムＣａｓＯＦＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ／）により計算した。潜在的オフターゲットはまた、ヒトゲノム「ホモサピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）－ヒト－ＵＣＳＣ２０１３年１２月（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）」に基づき、ＣＲＩＳＰＯＲ（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／ｃｒｉｓｐｏｒ）によってもチェックした。

ｓｇＲＮＡプロトスペーサーの選択は、それぞれの潜在的オフターゲット数とＤＭＰＫの３’－ＵＴＲ領域内のそれらの標的位置を考慮して行った。各ＳａｓｇＲＮＡの長さは、２１～２４までで可変である。プロトスペーサーがＧで始まっていない場合は常に、このヌクレオチドを配列の５’側に付加して、Ｕ６により駆動される転写を最適化した。

細胞培養
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した、高グルコールおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＤＭ１細胞（ｉＰＳ由来ＭＰＣ）を、２０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させた。

不死化したＷＴおよびＤＭ１筋芽細胞を、１５％ＦＢＳを添加した骨格筋細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、または１９９培地と混合し（１：４の比率；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、かつ２０％ＦＢＳ、２５μｇ／ｍｌフェツイン、０．５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌＥＧＦおよび０．２μｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＤＭＥＭのいずれかで、培養した。

筋芽細胞の分化は、コンフルエントな細胞において、増殖培地を分化培地（５μｇ／ｍｌのインスリンを添加したＤＭＥＭ）に置き換えることによって、誘導した。
３７℃の標準温度および５％ＣＯ_２を用いて細胞を増殖させ、培養細胞を維持した。

トランスフェクション実験
細胞を、トランスフェクションの前日に、６または１２ウェルプレートに播種し、７０～９０％の培養密度でトランスフェクトした。トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（ＦｕＧＥＮＥ－ＤＮＡ比率３：１；Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびリポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、それぞれＨｅＬａ細胞およびＤＭ１ ｉＰＳ由来ＭＰＣ細胞を、トランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの２～３日後に遠心分離で回収し、細胞ペレットをゲノムＤＮＡ抽出まで－８０℃で保管した。

レンチウイルスベクターおよび形質導入実験
レンチウイルスベクターを、以前に記載されているように（Cantore et al，2015）、リン酸カルシウム沈殿による２９３Ｔ細胞の一過性の４－プラスミドトランスフェクションによって生成した。ベクター力価［１ｍｌ当たりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍｌ）］を、感染したＨＣＴ１１６細胞のゲノムＤＮＡに対する定量的ＰＣＲにより、決定した（ウイルス生成および力価測定は、それぞれＧｅｎｅｔｈｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ＣｏｒｅおよびＱｕａｌｉｔｙコントロール Ｓｅｒｖｉｃｅｓによる）。

ＤＭ１筋芽細胞を、形質導入の前日に、１２ウェルプレートに播種し、培養密度７０％で感染させた。形質導入前に増殖培地を除去し、最小容量（４００μｌ／ディッシュ）の形質導入培地［１０％ＦＢＳおよび４μｇ／ｍｌポリブレンを添加した骨格筋基本培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）またはＤＭＥＭ］と交換した。ウイルスを、直接形質導入培地へ添加し、細胞を、５～６時間インキュベートした後に、完全増殖培地を添加した。形質導入後１日目に、細胞を６ウェルプレートに移し、２回継代培養してから、１）ｇＤＮＡ抽出のためにそれらを回収して凍結し、２）ＦＩＳＨ／免疫蛍光分析のためにそれらを固定した。

ゲノムＤＮＡ抽出およびゲノムＰＣＲ
ゲノムＤＮＡを、ＨｅＬａ細胞およびＤＭ１ ｉＰＳ由来ＭＰＣ細胞から、ＧｅｎｅＪｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ａｎｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ＱＩＡＧＥＮ）のいずれかを用いて、製造元の指示に従い抽出した。マウス筋肉由来の不死化ＤＭ１筋芽細胞からのｇＤＮＡ抽出は同様に、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６システムによって行った。

Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲを増幅した。ＰＣＲマスターミックスは、１０％ＤＭＳＯを添加して、製造元のプロトコール通りに調製した。鋳型としての１５０ｎｇのｇＤＮＡ、およびＣａｓ９予想切断部位の上流および下流にアニーリングするプライマー（表２）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃２分、［９５℃３０秒、５２℃３０秒、７２℃３０秒］×３５、７２℃１０分。ＤＭＳＸＬマウス筋肉における長いＣＴＧリピート伸長を増幅するには、より多くのサイクル（３８）および、より長い伸長時間（５分）を用いた。ＧｅｌＲｅｄ ＤＮＡ染色剤を含有する１．５～２％アガロースゲル中での電気泳動により、ＰＣＲ産物を分離した。ゲル画像をＵＶ露光時に撮影し、明るさおよびコントラストについて調整した。

ＰＣＲ産物をゲル抽出（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ，Ｍａｃｈｅｒａｙ Ｎａｇｅｌａｎｄ）により精製し、サンガーＤＮＡ配列決定（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により配列決定した。

ＤＭ１筋芽細胞における、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および免疫蛍光
ＦＩＳＨ実験は、いくつかの修正を加えて、Taneja KL［Taneja KL, 1998］により記載されているように行った［Denis Furling laboratory,Institut de Miologie,Paris］。簡単に説明すると、チャンバースライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。固定後、細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％エタノール中、４℃で保管した。細胞をＰＢＳ中で水和させ、ハイブリダイゼーションバッファー（４０％ホルムアミド、２×食塩水－クエン酸ナトリウム（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ）、０．２％ＢＳＡ）中で、プローブＣｙ３標識２’ＯＭｅ（ＣＡＧ）７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、顕微鏡スライドガラスを数回洗浄した後、細胞膜をＰＢＳ／０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中で透過処理した。ＳａＣａｓ９を、たんぱく質のＣ末端に位置するＨＡタグエピトープに対する抗体によって検出した。精製マウスモノクローナル抗ＨＡタグ（Ｃｏｖａｎｃｅ）を、５％ＢＳＡ中で１／４００の希釈度で一次抗体として使用し、室温で１時間３０分間インキュベートした。ヤギ抗マウス６３３二次抗体（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５％ＢＳＡ中で１／１０００の希釈度で使用し、室温で１時間インキュベートした。ＤＡＰＩを含むマウント液（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、カバーガラス付き顕微鏡スライドガラスを組み立てた。顕微鏡画像を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ １８）で取得し、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｘソフトウェアで分析し、Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐまたはＩｍａｇｅＪソフトウェアで処理した。

サザンブロット解析
ゲノムＤＮＡを、上述のＷＴおよびＤＭ１不死化細胞株から抽出した。およそ５μｇのｇＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素により、３７℃で一晩切断した。切断したＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で、約１６時間、５０Ｖで分離した。移動後、アガロースゲルを１Ｍ ＮａＯＨ溶液中で１時間インキュベートしてＤＮＡを変性させ、次いで中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ、３Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５）中で２時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡフラグメントを、６×ＳＳＣバッファー中で、毛細管現象を介して、ゲルからＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に移し、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ＵＶ架橋剤を用いてメンブレンを架橋した。ＤＮＡを、ＤＭＰＫ ＣＴＧリピートの領域をカバーする２×１０^６ ｃｐｍ／ｍＬの１．４ｋｂ ＢａｍＨＩプローブ（Ｂ１．４）（Gourdon et al, 1997）と、ハイブリダイズさせた。プローブをＨｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で予め標識し、５０μｇ／ ｍＬのＨｕｍａｎ Ｃｏｔ－１ ＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。シグナルは、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて出現させた。

選択的スプライシングについてのＲＴ－ＰＣＲ
製造元のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを単離した。ＲＴ－ＰＣＲは、Arandelおよび同僚によって記載されたように（Arandel et al, 2017）、行った。簡単に説明すると、１μｇのＲＮＡをＭ － ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって逆転写し、１μｌのｃＤＮＡ調製物を、表２に列挙したプライマーと共にＰＣＲ（ＲｅｄｄｙＭｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に使用した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＵＶ曝露時にＧｅｌＲｅｄＤＮＡ染色で可視化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して各ＰＣＲバンドの光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を定量化し、エクソンインクルージョン（ｅｘｏｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）の割合を［エクソンインクルージョンバンド／（エクソンインクルージョンバンド＋エクソンエクスクルージョン（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）バンドの合計）］×１００として計算した。

動物およびＡＡＶベクターの注射
ＤＭ１患者からクローニングした４５ｋｂのヒトゲノムＤＮＡを有するＤＭＳＸＬマウス（９０％ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を、インビボ研究に使用した［Huguet et al, 2012］。トランスジェニック状態は、Gomes-Pereiraおよび共同研究者によって記載されているように［Gomes-Pereira et al，2007］、ＰＣＲによってアッセイした。マウスの飼育および取り扱いは、フランスの動物保護委員会によって定められたガイドライン「実験動物の管理および使用の手引き」に従って行われた：ＥＥＣ８６／６０９ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ－Ｄｅｃｒｅｅ ２００１－１３。

ｒＡＡＶベクターを、以前に記載されているように（Ronzitti et al, 2016）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって、生成および力価測定した。

ケタミン／キシラジン混合物で麻酔した、３および６週齢のＤＭＳＸＬマウスに、筋肉内注射を行った。ＡＡＶウイルスを左ＴＡに注射した（それぞれ、０.６×１０^１１および１×１０^１１総Ｖｇ／ＴＡ、３および６週）；コントロールとして、ＰＢＳを右ＴＡに注射した。注射の４週間後に、ＴＡ筋を回収し、液体窒素中で凍結した。

結果
ＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現カセット
本研究で調べたＣａｓ９は、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）である。ＳａＣａｓ９はサイズが小さく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに適合することができるので、本エンドヌクレアーゼは特に興味深い。ＳａＣａｓ９およびＳａｓｇＲＮＡ足場を含有する全てのプラスミドは、プラスミドｐＸ６０１－ＡＡＶ－ＣＭＶ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ－ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ－ｓｇＲＮＡ（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ，Ａｄｄｅｇｅｎｅ番号６１５９１、図１）に由来する。同じベクター内に、ＳａＣａｓ９と２つのｓｇＲＮＡカセットを含めるために、当初のＣＭＶプロモーターを、最初に、より小さいＥＦＳに置き換えた（図１、ＭＬＳ４３）。ＳａＣａｓ９の発現およびその核局在化を、ＨＡエピトープに対する抗体（Ａｂ）を用いたウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光によって検証した（データ不掲載）。次に、ｓｇＲＮＡについての第２のカセットを追加した。これは、既存のものと同じであるが、ｓｇＲＮＡプロトスペーサーのための異なるクローニング部位を伴う（図１、ＭＬＳ４７）。

ｓｇＲＮＡプロトスペーサー（ｓｇＲＮＡのガイド配列に対応）は図２に挙げられており、それらは遺伝子ＤＭＰＫのストップコドンからポリＡシグナルに至る、ＣＴＧリピートの上流または下流のゲノム領域を標的としている。ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲ内の試験した全てのｓｇＲＮＡの位置を、図３に示す。

ｓｇＲＮＡを、そのゲノム標的でＤＮＡを切断する能力について、試験した。簡単に説明すると、ＨｅＬａ細胞を、ＳａＣａｓ９およびたった１つのｓｇＲＮＡ（ＢｂｓＩ部位にクローニングしたプロトスペーサー）を有するプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクトの２～３日後に回収した。これらのトランスフェクトされた細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、各ｓｇＲＮＡのゲノム標的を囲むＤＭＰＫの３’－ＵＴＲ領域を、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、配列決定のために送り、トランスフェクトした細胞、およびトランスフェクトしていない細胞のクロマトグラムファイルを用いて、オンラインプログラムＴＩＤＥ（ｈｔｔｐ：／／ｔｉｄｅ－ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｎｋｉ．ｎｌ／）により、切断効率を解析した。

ＴＩＤＥ解析の結果は、図２の表の最終列に示している。

この表の最終列は、試験したｓｇＲＮＡプロトスペーサー間で、切断効率が異なることを示す。特に、試験した全ての上流プロトスペーサー（１、４、７、８Ｂ）は非常に効率的であり、４２～４７．４％の間に含まれる、ＴＩＤＥによる切断率を有した。

下流プロトスペーサーに関して、本発明者らは、驚くべきことにそれらのいくつかがＣＴＧリピートの下流の領域を切断するのに、より効率的であることを見出した。特に、６個の下流プロトスペーサー（１０、１５Ｂ、２２、１７Ａ、１７Ｂおよび１９）は１．１～７．９％の弱い切断率を有し、一方下流プロトスペーサー２３は、ＤＮＡを切断するのに特に効率的であり、切断率は４８．３％であった。

これらの結果は、全てのｓｇＲＮＡが、ＤＮＡ切断に関して、全く同じ効率では挙動しないこと、そして予想外に、下流のｓｇＲＮＡ２３が、ＣＴＧリピート伸長の下流でＤＮＡを切断するのに特に有効であることを示す。

ヒトＤＭＰＫ遺伝子における、ＣＴＧリピートの、ＳａＣａｓ９媒介欠失
次に、病的ＣＴＧ伸長の存在下で、ヒトＤＭＰＫ遺伝子座において適切なｓｇＲＮＡと組み合わせてＳａＣａｓ９を用いた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの有効性を試験した。ＣＴＧリピート伸長を欠失させるために、同一のプラスミド内に、ＳａＣａｓ９および２つのｓｇＲＮＡを有するコンストラクトを構築し、ｓｇＲＮＡの一つはＣＴＧリピートより上流の領域を標的とし、もう一つはＣＴＧリピートより下流の領域を標的とした（それぞれ、プラスミドＭＬＳ４７のＢｂｓＩおよびＢｓａＩ部位にクローニングされている、図１参照）。

単独での切断効率（ＴＩＤＥ解析、図２）に基づいて、ｓｇＲＮＡ対を選択した。より詳細には、上流のｓｇＲＮＡ１、４、７および８Ｂを、それぞれ、下流のｓｇＲＮＡ１０、１５Ｂ、１７Ａ、１７Ｂ、１９および２２と比較して最も高い切断率を示す、下流のｓｇＲＮＡ２３と、試験した。

ＳａＣａｓ９および示されたｓｇＲＮＡ対を有するプラスミドを用いて、ＨｅＬａ細胞またはＤＭ１細胞（ｉ－Ｓｔｅｍ、Ｅｖｒｙの、ｉＰＳ由来ＭＰＣ）をトランスフェクトした。ＤＭＰＫの３’－ＵＴＲを、材料および方法に記載したようにＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルで分離した（図４）。完全長の産物およびＣＴＧリピート欠失を含む産物に対するバンドを、アガロースゲルから抽出し、配列決定により確認した。非欠失野生型ＤＭＰＫ３’－ＵＴＲ領域と欠失した領域との間のアニーリングを図５に示し、試験したｓｇＲＮＡ対について切断部位を強調している（すなわち、プロトスペーサーのヌクレオチドＮ_３とＮ_４との間）。

まとめると、これらの結果は、記載されたＳａＣａｓ９－ｓｇＲＮＡシステムが、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ領域からＣＴＧリピートを効率的に切除するのに好適なことを示している。

それはまた、下流のｓｇＲＮＡの選択が、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ領域からのＣＴＧリピートの効率的な切除を得るための、重要なパラメータであることも示している。

要するに、本発明者らは、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼと共に用いた場合に、効率的な単独の切断効率につながる、特異的なｓｇＲＮＡプロトスペーサーを、特定した。さらに本発明者らは、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼを適切なｓｇＲＮＡと組み合わせて用いるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが、ＤＭＰＫの３’ＵＴＲからのＣＴＧリピートの切除に、好適かつ効率的であることを証明した。

ＤＭ１患者細胞株における、長いＣＴＧリピート伸長の、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介欠失。
長いＣＴＧリピート伸長の欠失におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の能力を試験するために、２６００ＣＴＧリピートを有する患者由来の、不死化ＤＭ１細胞を使用した（Arandel et al, 2017）。ＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡについてのレンチウイルスベクターを構築した。これらのウイルスは、筋芽細胞を、高効率で形質導入することが知られている。レンチウイルスコンストラクトの図を、図６Ａに図示する：ＳａＣａｓ９は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、２つのｓｇＲＮＡの対（ＣＴＧリピートの上流および下流の領域を標的とする。ＵＰおよびＤＷ）は、タンデムであり、共にＵ６プロモーターの制御下にある。細胞内のｓｇＲＮＡ発現を追跡するために、ＧＦＰ発現カセットもｓｇＲＮＡレンチウイルスベクターに含めた。

ＤＭ１細胞は、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡレンチウイルスベクターの感染効率（ＭＯＩ、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の上昇に伴い形質導入され、ゲノムＰＣＲによりＣＴＧ欠失について試験した（図６Ｂ）。ＰＣＲは、材料および方法のセクションに記載したように、また、Ｆ１－ＤＭＰＫ－３ＵＴＲおよびＲ１－ＤＭＰＫ－３ＵＴＲのプライマー対を用いて行った。未処理細胞由来のｇＤＮＡ（－／－）、または５０ＭＯＩのｓｇＲＮＡレンチウイルスベクターのみを形質導入した細胞由来のｇＤＮＡ（－／５０）を、ネガティブコントロールとして使用した。より低分子量のバンド（４－２３対では３０３ｂｐ、８Ｂ―２３対では４１４ｂｐ）は、伸長対立遺伝子と非伸長対立遺伝子とを区別することなく、ＣＴＧリピートのゲノム欠失を有するＤＮＡ産物を表す。より高分子量のバンドは、非伸長ＣＴＧリピートを有する、非欠失ゲノム領域のＰＣＲ産物を表す（８７０ｂｐ）。長さの程度のために、伸長非欠失ＣＴＧリピートをＰＣＲ増幅することはできなかった（２６００リピートは、８６００ｂｐよりも長いＰＣＲ産物に相当する）。我々の結果は、接種したウイルス粒子の量とＰＣＲバンドの強度との間に相関があることを示した：ベクターのＭＯＩの上昇に伴い、ＣＴＧ欠失に関するバンドの強度の増加と、非欠失ＰＣＲ産物に関するバンドの強度の減少を、観察し得た。これらのデータは、Ｃａｓ９と、選択されたｓｇＲＮＡ対４－２３、および８Ｂ－２３が、インビトロで、ＣＴＧリピートの効率的な欠失を導き得ることを示した。

次に、ＣＴＧ欠失が、核内フォーカスの存在に影響を与えるかどうかを理解することに興味を持った。したがって、我々は高いＭＯＩ（２５および５０）の両方のベクターで形質導入したＤＭ１細胞を選択し、ＦＩＳＨ分析を行った。未処理または２つのベクターのうち１つのみで処理したＤＭ１細胞を、コントロールとして用いた。共焦点顕微鏡による画像取得の後、手動でフォーカスが消えた細胞の数を数え、この数を集団全体に対する割合として報告した（図６Ｃ）。注目すべきことに、すべての細胞が両方のレンチウイルスベクターに感染しているわけではないので、二重陽性細胞Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡについて正規化した場合、図６Ｃに報告されている割合はより高くなるであろう。ＰＣＲの欠失について観察されたように、フォーカスの消失もまた、接種したウイルス粒子の量と相関し、本研究で用いられた最大のＭＯＩ（ＭＯＩ５０）において、フォーカスのない細胞の数が、より多かった。

我々のデータは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介ＣＴＧリピート切除が、核へ移るフォーカスの消失を決定することを示した。

ゲノムＰＣＲにより得られた結果は、Ｃａｓ９および選択されたｓｇＲＮＡが、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲでＣＴＧリピートを欠失させることができるが、非病的な数のＣＴＧリピート（ｎ＝１３）を有する対立遺伝子の欠失と、伸長ＣＴＧリピート（ｎ＝２６００）を有する対立遺伝子の欠失とを区別しなかったことを示した。これらを区別するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９レンチウイルスベクターで処理した後にＤＭ１シングルクローンを単離し、ＥｃｏＲＩで切断したゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を行った。ＤＭＰＫ内のＥｃｏＲＩ制限酵素部位、ならびにＣａｓ９の予想切断部位、およびサザンハイブリダイゼーションに使用される放射性プローブによって認識される領域の相対位置を、図７Ａに表す。特に、本発明者らは、１）ＰＣＲによりＣＴＧリピートの１００％欠失を示し、かつ２）核内フォーカスの不在を示す、ＤＭ１デルタクローンを選択した。ＤＭ１クローンＣｔｒｌ１（Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡについてネガティブ）およびＣｔｒｌ２（Ｃａｓ９についてネガティブだが、ｓｇＲＮＡについてポジティブ）を、コントロールとして用いた。非病的コントロールとして、５および１４ＣＴＧリピートを有する不死化した野生型筋芽細胞（ＷＴ）もまた用いた。サザンブロット解析は、ＤＭ１デルタクローンが、伸長の有無にかかわらず、両方の対立遺伝子においてＣＴＧリピート欠失を有することを示した（図７Ｂ）。２つの対立遺伝子の識別は、２つのＥｃｏＲＩ制限酵素部位間にＡｌｕ多型が存在するために可能であった。これは、ＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡ切断により、サイズが約１ｋｂ異なる２つのバンドが得られることを意味し、１つはＡｌｕ多型を有する対立遺伝子（ＤＭ１細胞におけるＣＴＧ伸長を有する対立遺伝子に対応）のバンド、もう１つは、Ａｌｕを有さない対立遺伝子（ＤＭ１細胞におけるＣＴＧ伸長を有さない対立遺伝子、すなわち、非病的な数のＣＴＧを有する対立遺伝子に対応）のバンドである。同じＡｌｕ多型はまた、野生型筋芽細胞に存在する。対立遺伝子当たりのＣＴＧリピートの数［（ＣＴＧ）ｎ］、およびＥｃｏＲＩバンドの予想サイズのリストを、図７Ｃに報告している。

これらの結果は、Ｃａｓ９および選択されたｓｇＲＮＡが、ＤＭＰＫ遺伝子の両方の対立遺伝子、すなわち、非病的な数のＣＴＧリピートを有する対立遺伝子および伸長ＣＴＧリピート（２６００に等しい）を有する対立遺伝子の、３’－ＵＴＲにおいて、ＣＴＧリピートを欠失させることができることを、実証している。

ＣＴＧリピート伸長のゲノム切除後の、ＤＭ１細胞におけるスプライシングプロファイル解析
サザンブロットによりＣＴＧ切除について解析したのと同じ細胞およびＤＭ１クローン（図７）を、ＤＭ１患者の骨格筋、並びに患者の不死化ＤＭ１筋芽細胞において、調節解除されていることが知られているいくつかの転写産物（Arandel et al, 2017）の、選択的スプライシングプロファイルを解析するために使用した。細胞を筋管で分化させ（材料と方法を参照）、その後ＲＮＡ抽出のために回収した。解析した転写産物に特異的なプライマーを、表２に挙げる。ＲＴ－ＰＣＲの結果を、図８に示している：各転写産物について、ＲＴ－ＰＣＲゲルの代表的画像を左側に報告し（図８Ａ）、エクソンインクルージョンの定量化を右側に表している（図８Ｂ）。解析した６つの転写産物全てが、ＤＭ１デルタクローンにおいて、スプライシング異常の修正を示した。特に、転写産物ＬＤＢ３、ＳＥＲＣＡ１、ＭＢＮＬ１およびＤＭＤは、野生型（ＷＴ）と同じレベルに達する復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を示した。ＩＲとＢＩＮ１の復帰はそれほど顕著ではなかったが、それでもＤＭ１コントロールクローンＣｔｒｌ１および２とは統計的に差があった。全体的に見て、これらの結果は、ＤＭ１細胞におけるＣＴＧ伸長の切除が、ＤＭ１スプライシング異常症（ｓｐｌｉｃｏｐａｔｈｙ）を復帰させることを示している。

Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡについてのＡＡＶは、ＤＭＳＸＬマウスにおいて、インビボで、ＣＴＧリピート伸長の欠失を誘導する。
我々のｓｇＲＮＡ対が、インビボで、ＣＴＧリピート欠失を誘導する能力を確認するために、ＤＭ１疾病の動物モデルとして、ＤＭＳＸＬマウスを選択する（Huguet et al, 2012）。ＤＭＳＸＬマウスは、約１２００ＣＴＧリピートを有するヒトＤＭＰＫ遺伝子の１コピーを有し、核内フォーカスの存在、スプライシングの欠陥、および筋力低下などの、ヒトの病態の多くの特徴を再現している。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを、ＤＭＳＸＬマウスの筋肉組織に送達するために、ＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡについてのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、構築した。ＡＡＶは効率的に筋肉に感染することが知られているが、約４．７ｋｂの限られたパッケージング能力を有する（Warrington et al, 2006; Buj-Bello et al, 2008）。この理由により、２つのＡＡＶを設計した。１つは、Ｃａｓ９用であり、もう１つは、２つのタンデムなｓｇＲＮＡ用である。ＳａＣａｓ９は、筋肉内の導入遺伝子の良好な発現を推進する合成小型プロモーターである、ＳＰｃ５－１２の制御下にある（Li et al, 1999）。ｓｇＲＮＡ対４－２３およびそれらのＵ６プロモーターに関する配列を、図６に示す対応するレンチウイルスコンストラクトからＰＣＲ増幅し、ＡＡＶプラスミドの、デスミンプロモーター駆動ｅＧＦＰ－Ｋ発現カセット（Ｋは、核膜局在のためのＫａｓｈペプチドである）のポリアデニル化配列の下流に、クローニングした（図９Ａ）。

Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ４－２３の両方についてのＡＡＶを、３および６週齢のヘテロ欠損ＤＭＳＸＬマウスの左前脛骨（ＴＡ）に同時注射した（０.６×１０^１１および１×１０^１１総Ｖｇ）。４週間後に、マウスを安楽死させ、筋肉を回収した。ＣＴＧリピートの欠失を検出するために、ＴＡから抽出したゲノムＤＮＡと、プライマーＦ１－ＤＭＰＫ－３ＵＴＲおよびＲ２－ＤＭＰＫ－３ＵＴＲを用いて、ＰＣＲを行った（材料および方法参照）。ＰＢＳのみを注射した、左ＴＡ由来のｇＤＮＡを、ネガティブコントロール（－）として用いた。ゲノムＰＣＲの結果を図９Ｂに示す。ＡＡＶＣａｓ９－ｓｇＲＮＡを注射した全てのＴＡ（＋）が、ＣＴＧリピート欠失を有するアンプリコンの予想サイズ（３９９ｂｐ）に相当するＰＣＲバンドを示した。非欠失ＣＴＧリピート伸長に関するＰＣＲ産物は、リピートの長さのためにほとんど増幅されず、図９Ｃに示している（予想サイズ４５２７ｂｐ）。

我々の結果は、Ｃａｓ９が、ｓｇＲＮＡ対４－２３と共同して、インビボで、ＤＭＳＸＬマウスモデルにおいて、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲにおける長いＣＴＧリピート伸長を欠失できることを証明した。

Claims (13)

1. 標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な配列に、塩基対形成により結合することができる第１および第２のｓｇＲＮＡ分子を含む、ｓｇＲＮＡ分子の対であって、第１および第２のｓｇＲＮＡ分子は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）内に位置するヌクレオチドリピート伸長の、それぞれ５’側および３’側に位置し、
   第１のｓｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの存在下、３’－ＵＴＲ内で、ヌクレオチドリピート伸長の５’側において、２本鎖切断を誘導することができ；
   第２のｓｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの存在下、３’－ＵＴＲ内で、ヌクレオチドリピート伸長の３’側において、２本鎖切断を誘導することができ；
   Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌に由来するか（ＳａＣａｓ９）、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼはＳａＣａｓ９の機能的変異体であり；
   第２のｓｇＲＮＡ分子は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列からなるガイド配列を含む、ｓｇＲＮＡ分子の対。
2. 第１のｓｇＲＮＡが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む、２０～２５ヌクレオチド長のガイド配列を含む、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ分子の対。
3. 第１のｓｇＲＮＡのガイド配列が、配列番号１～４および配列番号１８から選択されるヌクレオチドからなる、請求項１または２に記載のｓｇＲＮＡ分子の対。
4. ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内の、ヌクレオチドリピート伸長の５’側または３’側に位置する標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な配列に、塩基対形成により結合することができる配列を含む、ｓｇＲＮＡであって；
   ｓｇＲＮＡ分子が、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＳａＣａｓ９）、またはＳａＣａｓ９の機能的変異体であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼの存在下、前記３’－ＵＴＲ内で、前記ヌクレオチドリピート伸長の５’側または３’側のいずれかにおいて、２本鎖切断を誘導することができ；
   ｓｇＲＮＡ分子が、配列番号１～５および配列番号１８からなる群から選択されるガイド配列を含む、ｓｇＲＮＡ。
5. 請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ分子の対をコードするまたは請求項４に記載のｓｇＲＮＡをコードするベクターであって、好ましくは、プラスミドまたは、ｒＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである、ベクター。
6. 請求項５に記載のベクターをトランスフェクトまたは形質導入した標的細胞。
7. 請求項６に記載の標的細胞を、前記ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ分子の対の生成を可能にする条件下で培養すること、および前記培養ステップからｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ分子の対を回収することを含む、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ分子の対の生成方法。
8. 細胞内で、ＤＭＰＫ遺伝子の非翻訳領域内に位置するヌクレオチドリピートを切除するためのインビトロ法であって、細胞内に、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ分子の対、または請求項５に記載のベクター、および黄色ブドウ球菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することを含む、方法。
9. 医薬として、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせて用いるための、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ分子の対、または請求項５に記載のベクター。
10. １型筋緊張性ジストロフィーを治療するための方法において、黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせて使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ分子の対、または請求項５に記載のベクター。
11. ヌクレオチドリピート伸長が、ＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ内に位置する、トリヌクレオチドリピート伸長である、請求項１０に記載のｓｇＲＮＡ分子の対。
12. ヌクレオチドリピート伸長が、２０～１００００リピートなど、より具体的には５０～５０００リピートなどの、２０以上のリピートを含む、請求項１１に記載のｓｇＲＮＡ分子の対。
13. 請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ分子の対もしくは請求項４に記載のｓｇＲＮＡ、または請求項５に記載のベクター、または請求項６に記載の細胞を含む、医薬組成物。

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