KR20230085170A - 동시 유전자 활성화를 위한 핵산 구조체 - Google Patents

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지몬 아우슬렌더
울리히 괴퍼트
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원에서는 신규 DNA 구조체 및 이의 사용방법이 보고된다. 본 발명은 부위-특이적 재조합효소와의 상호작용에 의해 이의 활성 형태로 전환되는 DNA 분자의 코딩 및 주형 가닥 상의 비-생산적/비활성 프로모터 및 유전자의 의도적인 배열을 사용한다. 더 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 요소는 함유된 제1 및 제2 유전자의 발현에 대하여 작용하지 않는다. 본 발명에 따른 DNA 요소는 제1 및 제2 유전자의 발현에 대하여 작용하지 않기 때문에, 포함된 구조적 유전자가 통합 직후에 기발현될 위험 없이 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 상기 유전자들은 DNA 요소의 재조합 인식 서열을 인식하고 이에 대하여 작용하는 재조합효소가 활성화되거나 세포 내로 도입되면 발현될 뿐이다. 이에 의해, 본 발명의 유전적으로 통합된 DNA 요소에서 제1 및 제2 돌연변이된 재조합효소 인식 서열 사이의 재조합효소 매개 카세트 역위(recombinase mediated cassette inversion; RMCI)가 개시된다. 상기 RMCI는 2개의 돌연변이체 재조합효소 인식 서열 사이에 위치하는 본 발명에 따른 DNA 요소의 해당 부분의 역위(inversion)를 발생시킨다. 이에 의해, 제1 프로모터는 제1 유전자에 작동가능하게 연결되고, 제2 프로모터는 제2 유전자에 작동가능하게 연결된다. 이 후에야, 제1 및 제2 유전자가 전사되고, 각각의 인코딩된 단백질이 발현된다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 요소는 세포 내에서 두 유전자의 동시 활성화에 특히 유용하다.

Description

동시 유전자 활성화를 위한 핵산 구조체
본원에서는 신규 DNA 구조체 및 이의 사용방법이 보고된다. 본 발명에 따른 신규 DNA 구조체로 인하여, 적어도 2개의 유전자의 전사가 부위-특이적 재조합효소 기술을 사용하여 동시에 활성화될 수 있다. 본 발명은 부위-특이적 재조합효소와의 상호작용에 의해 이의 활성 형태로 전환되는 DNA 분자의 코딩 및 주형 가닥 상의 프로모터 및 유전자 요소의 의도적인 비활성 배열을 사용한다. 또한, 본원에서는 교환된 프로모터 및 혼입된 LoxP 부위를 갖는 신규한 VA RNA 요소를 보고한다.
유전자 치료는 살아있는 세포의 유전자 발현을 변형시켜 이의 생물학적 특성을 변화시키는 유전 물질의 치료적 투여를 광범위하게 지칭한다. 수십 년의 연구 끝에, 유전자 치료가 시장에 진입하게 되었고 점점 더 중요해질 것으로 예상된다. 일반적으로, 유전자 치료는 생체내 또는 생체외 접근법으로 구분될 수 있다.
오늘날, 대부분의 생체내 요법은 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 이용한 DNA 전달에 의존한다. AAV는 작은 자연 발생의 비-병원성 파르보바이러스이며, 이는 비-외피성 정이십면체 캡시드로 구성된다. 이는 대략 4.7 kb의 선형 단일 가닥 DNA 게놈을 함유한다. 야생형 AAV 벡터의 게놈은 2개의 유전자, rep 및 cap를 보유하며, 이는 역위 말단 반복부(ITR)에 의해 측접(flanked)된다. ITR은 바이러스 복제 및 패키징을 위해 cis에서 필요하다. rep 유전자는 4개의 상이한 단백질에 대해 인코딩하며, 이의 발현은 2개의 대안적인 프로모터, P5 및 P19에 의해 구동된다. 부가적으로, 상이한 형태들이 대안적인 스플라이싱에 의해 생성된다. Rep 단백질은 다중 기능, 예컨대, 예를 들어, DNA 결합, 엔도뉴클레아제 및 헬리카아제 활성을 갖는다. 이들은 유전자 조절, 부위-특이적 통합, 절제, 복제 및 패키징에서 역할을 한다. cap 유전자는 3개의 캡시드 단백질 및 하나의 조립-활성화 단백질을 코딩한다. 이들 단백질의 차별적 발현은 대안적 스플라이싱 및 대안적 개시 코돈 사용에 의해 달성되고, rep 유전자의 코딩 영역에 위치하는 단일 프로모터 P40에 의해 구동된다.
조작된 치료 rAAV 벡터에서, 바이러스 유전자는 이식유전자 발현 카세트로 대체되고, 이는 바이러스 ITR에 의해 측접된 상태로 유지되지만, 선택된 프로모터의 제어하에 관심 유전자를 인코딩한다. 야생형 바이러스와 달리, 조작된 rAAV 벡터는 숙주 게놈 내로 부위-특이적 통합을 겪지 않고, 형질도입된 세포의 핵에서 우세하게 에피솜을 유지한다.
AAV는 그 자체로 복제 능력이 없지만 헬퍼(helper) 유전자의 기능을 요구한다. 이들은 아데노바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)와 같은 공동-감염된 헬퍼 바이러스에 의해 자연적으로 제공된다. 예를 들어, 5개의 아데노바이러스 유전자, 즉 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA는 AAV 복제에 필수적인 것으로 공지되어 있다. 단백질에 대해 코딩하는 다른 헬퍼 유전자와는 대조적으로, VA는 작은 RNA 유전자이다.
rAAV 벡터의 생산을 위해, ITR이 측접된 이식유전자를 보유하는 DNA를 패키징 숙주 세포주에 도입하며, 이는 또한 rep 및 cap 유전자뿐만 아니라 필요한 헬퍼 유전자를 포함한다. 이들 3개 군의 DNA 요소를 세포 내로 도입하는 많은 방법 및 이들을 상이한 DNA 플라스미드 상에서 조합하는 방법이 있다(예컨대, Robert, M.A., et al. Biotechnol. J. 12 (2017) 1600193을 참조).
두 가지 일반적인 생산 방식이 널리 사용되고 있다. 삼중 형질감염 방법에서, 아데노바이러스 E1A 및 E1B를 이미 발현하는 HEK293 세포를 E2A, E4 및 VA를 보유하는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHELPER), rep/cap을 포함하는 플라스미드 및 rAAV-이식유전자를 포함하는 플라스미드로 일시적으로 공동-형질감염시킨다. 대안적으로, rep/cap 및 바이러스 헬퍼 유전자를 하나의 더 큰 플라스미드 상에서 조합할 수 있다(이중 형질감염 방법). 두 번째 방법은 하나는 rAAV 게놈을 보유하고 다른 하나는 rep 및 cap을 보유하는 2개의 베큘로바이러스로 곤충 세포(Sf9)를 감염시키는 것을 포함한다. 상기 시스템에서 헬퍼 기능은 베큘로바이러스 벡터 자체에 의해 제공된다. 동일한 방식으로, 단순 헤르페스 바이러스는 HEK293 세포 또는 BHK 세포와 조합하여 사용된다. 좀 더 최근에는, Mietzsch et al. (Hum. Gene Ther. 25 (2014) 212-222; Hum. Gene Ther. Methods 28 (2017) 15-22)이 rep 및 cap를 갖는 Sf9 세포를 게놈 내로 안정하게 통합되도록 조작하였다. 이들 세포와 함께 rAAV 전이유전자를 보유하는 단일 배큘로바이러스는 rAAV 벡터를 생산하기에 충분하다. Clark et al. (Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341)은 이의 게놈에 통합된 rAAV 이식유전자 및 rep/cap 유전자를 갖는 HeLa 세포주를 생성시켰다. 세포를 야생형 아데노바이러스로 형질감염시킴으로써, rAAV 벡터 생성이 유도되고, rAAV 벡터 및 아데노바이러스의 혼합 스톡(stock)이 생성된다.
지금까지, 헬퍼 유전자가 이의 게놈에 안정하게 통합된 포유류 세포주는 기재되어 있지 않다. 바이러스 헬퍼 유전자뿐만 아니라 rep의 발현은 세포에 독성이 있으며 엄격하게 제어될 필요가 있다(예컨대, Qiao, C., et al., J. Virol. 76 (2002) 1904-1913을 참조).
rep 유전자의 경우, 이러한 대조군은 LoxP 부위에 의해 측접된(flanked) 폴리아데닐화 부위를 함유하는 rep 유전자에 인트론을 도입함으로써 달성되었다. 재조합 아데노바이러스의 도움으로 Cre-재조합효소를 도입한 후, 폴리아데닐화 부위를 제거하고 인트론을 스플라이싱한다(예컨대, Yuan, Z., et al., Hum. Gene Ther. 22 (2011) 613-624; 상기 Qiao, C., et al.를 참조).
Podhajska, A.J., et al. (Gene 40 (1985) 163-168)은 다음과 같이 세 가지 신규한 특성을 가진 유전자-발현 플라스미드의 프로토타입을 보고하였다: (i) 이의 "OFF 단계"는 모든 일반적인 숙주에서 절대적인데, 이는 발현 프로모터가 연구된 유전자로부터 멀리 향하고 있고 강력한 종결인자에 의해 차단되기 때문이다; (ii) "ON 단계"는 프로모터의 빠르고 효율적인 역위에 의해 달성된다; (iii) 이러한 2 단계 공정을 개시하기 위해 단지 짧은 열 펄스 또는 다른 유도제에 대한 노출이 요구된다.
WO 97/9441 (EP 0 850 313 B1)은 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)의 생성 방법을 보고하였고, 상기 방법은 다음과 같이: (1) 하기의: (a) AAV rep 및 cap 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드; (b) 필수 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로서, 상기 플라스미드에 존재하는 상기 필수 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 E1A, E1B, E2A, E4, E4ORF6, E4ORF6/7, VA RNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드; 및 (c) 제1 및 제2 AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR)를 포함하는 AAV 플라스미드로서, 상기 제1 및 제2 AAV ITR은 관심의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 측접하고, 상기 DNA는 프로모터 DNA에 작동가능하게 연결되는, AAV 플라스미드로 아데노바이러스 입자의 부재 하에 일시적으로 형질감염된 세포를 포함하는 조성물을 배양하는 단계; 및 (2) 이로부터 생산된 재조합 AAV를 정제하는 단계를 포함한다.
JP　10-33175　A는 아데노-연관 바이러스 게놈 서열 내에 두 개의 재조합효소 인식 서열이 측접하는 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 삽입한 유전자 서열을 보고하였고, 여기서 상기 유전자 서열은 재조합효소 인식 서열의 삽입 부위가 프로모터 P5와 rep78/68 유전자의 번역 개시 코돈 사이에 있는 것을 특징으로 하며, 상기 스터퍼 서열은 프로모터 P5 및 rep78/68 유전자와 동일한 방향으로 적어도 하나의 검출가능한 유전자 마커 및 폴리A 신호를 함유한다.
WO 98/24918 (EP 0 942 999 B1; US 6,303,302 B1)은 활성화 후에 제2 리포터 유전자를 활성화시킬 수 있는 제1 리포터 유전자를 함유하는 유전자-포획 구축물을 보고하였고, 여기서 제1 리포터 유전자는 재조합효소를 코딩하고, 제2 리포터 유전자는 단백질 인자를 코딩하고, 제2 리포터 유전자는 활성화되며, 이에 의해 재조합효소는 제2 리포터 유전자 앞에 위치된 DNA 단편을 결실하고, 이로써 제2 리포터 유전자는 이의 제어 하에 프로모터로부터 하류에 배치된다.
WO 98/27207은 상류에서 하류로 열거된 상대적인 순서에 따라 하기의 성분을 포함하는, 재조합효소-활성화가능한 아데노-연관 바이러스(AAV) 패키징 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 보고하였다: (i) 제1 부위-특이적 재조합(ssr) 부위; (ii) ssr-개재 서열; 및 (iii) 제2 부위-특이적 재조합(ssr) 부위; 여기서 카세트는 프로모터 및 AAV rep 유전자 및 AAV cap 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 패키징 유전자를 포함하고, 여기서 상기 프로모터는 ssr-개재 서열 또는 제1 ssr 부위의 상류에 위치하고, 상기 AAV 패키징 유전자는 제2 ssr 부위의 하류 또는 ssr-개재 서열 내에 위치하고, 상기 프로모터는 상기 AAV 패키징 유전자에 활성화가능하게 연결된다.
WO 98/10086 (US 6,274,354 B1)은 재조합 AAV의 효율적인 생산을 위한 방법을 보고하였다. 일 양태에서, 3개의 플라스미드가 숙주 세포 내로 도입된다. 제1 플라스미드는 Cre-재조합효소의 발현을 지시하고, 제2 플라스미드는 프로모터, LoxP 부위 및 rep/cap에 의해 측접된 스페이서 서열을 함유하고, 제3 플라스미드는 AAV ITR에 의해 측접된 이식유전자 및 조절 서열을 함유하는 미니유전자를 함유한다. 다른 양태에서, 숙주 세포는 Cre-재조합효소를 안정하게 또는 유도성으로 발현하고, 시스템의 다른 요소를 보유하는 2개의 플라스미드가 숙주 세포 내로 도입된다.
WO 98/27217 (EP 0 953 647 B1)은 재조합 효소 및 이의 인식 서열을 이용하여 바이러스 구조 단백질 유전자의 발현을 조절하기 위한 DNA 구축을 보고하였고, 여기서 프로모터, 재조합효소 인식 서열, 약물 내성 유전자, polyA 부가 신호, 재조합효소 인식 서열, 바이러스 구조 단백질 유전자 및 polyA 부가 신호가 순서대로 배열되어 있다.
WO 2001/36615 (EP 1 230 354 B1)는 아데노바이러스 E1A 및 E1B 영역의 유전자 산물의 발현을 발생시키는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 영구 양수 세포주를 보고하였다.
WO 2001/66774는 프로모터와 기능적 관계로 연결된 관심 유전자를 포함하는 제1 DNA 서열, 및 표적 DNA 서열에 특이적인 재조합 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 유전자를 포함하는 제2 DNA 서열을 포함하는 관심 유전자의 발현을 제어하는 시스템을 보고하였고, 여기서 상기 표적 DNA 서열 중 2개는 상기 2개의 DNA 서열 중 하나에 측접하고, 상기 제2 DNA 서열은 상기 프로모터와 상기 관심 유전자 사이에 위치하는 것을 특징으로 한다.
Silver, D.P. 및 Livingstone, D.M.은 외인성 LoxP 부위가 결여된 배양된 세포에서 Cre-재조합효소의 지속적인 발현이 감소된 성장, 세포변성 효과, 및 염색체 이상을 발생시킨다고 보고하였다. Cre-재조합효소 발현의 지속시간 및 강도를 제한하기 위해 음성 피드백 루프를 통합하는 자가-절제된 레트로바이러스 벡터는 측정가능한 독성을 피하고 LoxP 부위에 의해 측접된 표적 서열을 절제하는 능력을 보유하였다(Mol. Cell 8 (2001) 233-243).
Siegel, R.W., et al.은 유전자 기능의 설명을 위한 Cre/LoxP 시스템의 증가하는 중요성을 감안할 때, 유전자를 활성화 또는 비활성화시키는 좀 더 정교한 계획뿐만 아니라 선택가능한 마커가 후속 재사용을 위해 재순환되는 것을 허용하는 것은 비-호환성 LoxP 부위의 세트의 이용가능성을 요구한다고 약술하였다. 정의된 위치에서 게놈에 다수의 비-호환성 LoxP 부위를 통합하면, 표적화 벡터 상의 상응하는 LoxP 부위를 간단히 특정함으로써 상이한 염색체 위치에 이삭유전자 구조체의 후속 Cre-재조합효소-매개 도입을 가능하게 한다(FEBS Lett. 499 (2001) 147-153).
WO 2002/8409 (EP 1 309 709 A2, US 7,972,857)는 포유류 세포에서 관심 DNA의 부위-특이적 교체를 수득하는 방법을 보고하였고, 상기 방법은 a) 수용체 구조체를 포함하는 포유류 세포를 제공하는 단계로서, 상기 수용체 작제물은 교체될 수용체 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 수용체 폴리뉴클레오티드는 비가역적 재조합 부위(IRS)의 2개 이상의 복제에 의해 측접되는, 단계; b) 수용체 폴리뉴클레오티드를 교체하기 위해 공여체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 공여체 구조체를 세포 내로 도입하는 단계로서, 상기 공여체 폴리뉴클레오티드는 상보적 비가역적 재조합 부위(CIRS)의 2개 이상에 의해 측접되는, 단계; 및 c) 수용체 구조체 및 공여체 구조체를 비가역적 재조합효소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 비가역적 재조합효소는 IRS와 CIRS 사이의 재조합 및 수용체 폴리뉴클레오티드의 공여체 폴리뉴클레오티드로의 교체를 촉매하여, 대체 구조체를 형성한다.
WO 2002/40685 (US 7,449,179 B2)는 유전자를 조건부 비활성화하기 위한 유전자 포획 라이브러리 및 유전자 표적화 세포의 생산 방법을 보고하였다. 돌연변이 요소 카세트 및 유전자 포획 카세트를 갖고, 각각의 카세트는 부위-특이적 재조합 서열을 갖는 플라스미드를 제공하였다. 돌연변이 요소 카세트는 제1 부위-특이적 재조합 서열, 및 제2 부위-특이적 재조합 서열 및 폴리아데닐화 서열에 연결된 제1 마커 유전자에 연결된 스플라이스 수용체 서열을 포함하는 돌연변이 서열을 포함하는 DNA를 포함하였다. 유전자 포획 카세트는 제1 부위 특이적 재조합 서열, 및 스플라이스 공여체 서열에 작동가능하게 연결된 제2 마커 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 유전자 포획 요소 및 선택된 숙주 세포의 게놈에 존재하지 않는 독특한 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 제2 유전자 포획 카세트를 포함하는 DNA를 포함하였다.
WO 2002/88353 (EP 1 383 891 B1)은 적어도 부위 특이적 재조합효소 표적화 서열(SSRTS) L1에 의해 측접된 적어도 서열 A 및 적어도 부위 특이적 재조합효소 표적화 서열(SSRTS) L2에 의해 측접된 적어도 서열 B를 포함하는 단리된 DNA 분자를 보고하였고, 상기 서열 A 및 B는 반대 배향으로 전사되고 번역되며, 상기 SSRTS L1 및 SSRTS L2는 서로 재조합할 수 없고, 여기서 서열 L1은 반대 배향이고, 서열 L2는 반대 배향이고, 상기 DNA 분자 내의 SSRTS 서열의 순서는 5'-L1-L2-L1-L2-3'이고, 상기 SSRTS L1의 재조합효소 특이성 및 상기 SSRTS L2의 재조합효소 특이성은 동일하다.
Mlynarova, L., et al.은 Cre-재조합효소의 존재하에 재조합 파트너 중 하나가 비-lox DNA의 역위 반복부의 더 큰 스트레치 내에 존재할 때 Escherichia coli에서 Lox511 및 Lox2272 부위 둘 모두가 LoxP에 대해 매우 무차별해진다고 보고하였다(Gene 296 (2002) 129-137).
Langer, S.J., et al.은 상보적인 돌연변이 암(arm)(Lox66 및 Lox71)을 갖는 LoxP 부위의 사용이 야생형 LoxP 부위 및 이중 돌연변이 암을 갖는 결함 부위를 생성하는 트랜스에서 효율적인 재조합을 허용한다고 보고하였다(Nucl. Acids Res. 30 (2002) 3067-3077). 이중 돌연변이 LoxP 부위는 더 이상 재조합효소에 대한 효율적인 기질이 아니기 때문에, 삽입이 선호되고 반응은 한 방향으로 진행된다.
Tronche, F., et al.은 마우스에서 부위-특이적 재조합효소의 사용을 보고하였다(FEBS Lett 529 (2002) 116-121). 마우스에서, Cre-LoxP 시스템은 주어진 세포 집단에서 유전자 발현을 스위치 온(switch on)하기 위해 초기에 사용된다는 것이 설명되었다. 2개의 별개의 형질전환 마우스 라인(line)을 생성하였다. 첫 번째는 '중단 카세트(stop cassette)'에 의해 프로모터로부터 이격된 침묵 이식유전자를 보유한다. 상기 중단 카세트는 강한 폴리아데닐화 신호 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 함유하거나 침묵 유전자의 ORF를 방해하기 때문에 이식유전자의 전사를 방지한다. 두 번째는 세포 유형-특이적, 즉 조직-특이적 방식으로 Cre-재조합효소의 발현을 유도하는 이삭유전자를 보유한다. 모든 Cre-재조합효소 발현 세포에서, 중단 카세트는 이들 세포에서만 원하는 이식유전자의 발현을 가능하게 하도록 절단될 것이다. Tronche et al.에 따르면, LoxP 부위의 삽입은 유전자의 정상 발현을 방해하지 않는 것이 필수적이다. 이상적으로는, 조절 영역의 방해를 피하면서 인트론이나 비전사 영역에 배치해야 한다. 하지만, 몇몇 경우에, LoxP 부위가 부정적인 효과 없이 전사되지만 번역되지 않은 영역에 삽입되었다. Tronche et al.은 세포 증식의 감소뿐만 아니라 높은 수준의 Cre-재조합효소를 발현하는 세포에서 세포자멸의 증가가 관찰되었음을 추가로 설명한다. 이는 세포주기의 G2/M 단계에서 Cre-재조합효소 발현 세포의 축적, 염색체 재배열 및 미세핵의 출현과 관련이 있다. 이러한 이상은 게놈 내에 존재하는 숨은 표적 부위에 대한 Cre-재조합효소의 작용에 기인할 수 있다.
WO 2003/84977은 인트론 내에 위치한 전사 종결 서열을 이용하는 유전자 발현 조절 방법을 보고하였다. 전사 종결 서열은 트랜스-작용 인자의 첨가에 의해 붕괴될 수 있다. 예를 들어, "이중 스플라이싱 스위치"에서 전사 종결 서열은 재조합 부위에 의해 측접되고 재조합효소에 의해 절단될 수 있다. Cre/LoxP 재조합 시스템은 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
Thomson, J.G., et al.은 Cre/LoxP 시스템에서의 삽입 반응이 운동학적으로 유리하기 때문에 제어하기가 더 어렵다고 보고하였다. 50개의 돌연변이체 LoxP 부위 조합을 천연 LoxP 부위와 비교한 결과, Cre-재조합효소 결합 도메인의 내부 6 bp에 대한 돌연변이가 재조합을 심각하게 억제한 반면, 외부 8 bp에 있는 것들은 내성을 더 많이 보였다(Genesis 36 (2003) 162-167).
WO 2004/29219는 세포 및 유기체에서 shRNA 구조체의 시간적 및 공간적 발현을 조절하기 위한 벡터 및 방법을 보고하였다. 이러한 벡터는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)와 같은 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 바람직한 구현예들에서, shRNA의 발현은 RNA 중합효소 III 프로모터에 의해 조절되고; 이러한 프로모터는 효율적인 침묵화를 생성하는 것으로 공지되어 있다. 본질적으로 임의의 polIII 프로모터가 사용될 수 있지만, 바람직한 예는 인간 U6 snRNA 프로모터, 마우스 U6 snRNA 프로모터, 인간 및 마우스 Hl RNA 프로모터 및 인간 tRNA-val 프로모터를 포함한다.
Mizukami, H., et al.은 돌연변이체 및 야생형 LoxP 서열 및 아데노-관련 바이러스 벡터 생산을 위한 개선된 패키징 시스템을 사용하여 rep 및 cap 발현의 개별 제어를 보고하였다. 이들은 2개의 별개의 플라스미드를 사용함으로써 Rep 및 Cap 단백질 둘 모두에 대한 유도성 발현 시스템을 개발하였고, 여기서 하나는 돌연변이체를 갖고 다른 하나는 야생형 LoxP 서열을 갖지며, 2개의 상이한 단백질의 발현은 Cre-재조합효소에 의해 동시에 유도될 수 있다(Mol. Biotechnol. 27 (2004) 1-14). 재조합을 달성하기 위해, Cre-재조합효소-발현 아데노바이러스 플라스미드를 배양물에 적용하였다. rep 및 cap 발현을 조절하기 위해, 스터퍼 서열은 2개의 LoxP(야생형 또는 돌연변이체) 서열에 의해 측접된다. Cre-재조합효소의 존재하에, 상기 스터퍼 서열을 제거하고 cap 및 rep 유전자를 발현시킨다.
Chatterjee, P.K., et al.은 생체내에서 수득된 결과와 앞서 보고된 결과간의 차이가 재조합에 이용가능한 일시적 대 구성적으로 발현된 Cre-재조합효소 단백질과 관련될 수 있다고 보고하였다. LoxP 부위 불규칙성은 Cre-재조합효소 단백질의 수준 및 지속성에 따라 증가하는 것으로 보인다(Nucl. Acids Res. 32 (2004) 5668-5676).
Ventura, A., et al.은 이식유전자로부터의 Cre-lox-조절된 조건부 RNA 간섭을 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 10380-10385을 참조). 본 발명가들은 조건부 Cre-lox-조절된 RNA 간섭에 대해 2개의 렌티바이러스 벡터를 생성하였다. 하나의 벡터는 조건부 활성화를 허용하는 반면, 다른 하나는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 발현의 조건부 비활성화를 허용한다. 전자는 마우스 U6 프로모터가 LoxP 부위와 TATA 박스 사이에 하이브리드(hybrid)를 포함함으로써 변형되는 전략에 기반한다.
US 2006/110390은 아데노바이러스 발현 벡터 AdCMV-Ku70 및 AdCMV-Ku80을 보고하였는데, 이들은 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터(CMV)의 하류에서 안티-센스 반딧불이 발광효소(firefly luciferase) 리포터 유전자를 측접하는, 반대 배향된 돌연변이체 LoxP 부위, Lox71 및 Lox66으로 이루어진 AdCUL인 재조합효소-의존성 발광효소 발현 플라스미드에 기초한다. Lox71과 Lox66 사이의 Cre-재조합효소-매개된 재조합은 플록스드 카세트를 센스 배향으로 전환시켜, 발광효소 유전자 발현을 발생시킨다.
US 2006/143737 (US 7,267,979 B2)은 이중 가닥 표적 서열 RNA를 생성함으로써, 내인성 유전자 침묵 메커니즘을 촉발하는 기능을 하는 재조합효소 역위 또는 절단을 위한 구조체를 보고하였다.
WO 2006/99615는 변형된 표적화 유전자를 아데노바이러스 벡터의 섬유 영역 내로 단방향으로 교환하기 위해 비호환성 스페이서를 갖는 Cre-재조합효소 및 반-돌연변이체 LoxP 부위의 적용을 보고하였다.
Missirlis, P.I., et al. (BMC Genomics 7 (2006) A13)은 Cre-재조합효소-매개된 재조합에서 LoxP 스페이서 영역의 서열 및 무차별성(promiscuity) 특성을 확인하는 높은 처리량의 스크린을 보고하였다. 그들은 스페이서 및 역위 반복부의 돌연변이체가 성공적으로 함께 사용된 경우, 충분한 수의 비-무차별 LE/RE-스페이서 돌연변이체가 확인될 수 있다면, 수많은 DNA 절편을 주어진 표적 분자, 염색체 또는 게놈으로 도입하는 것이 가능할 수 있다고 개략적으로 설명하였다. 하지만, RMCE의 직렬화 또는 역위 반복부를 통한 삽입 재조합은 현재까지 확인된 적은 수의 안정적이고 비-무차별적인 LoxP 부위에 의해 제한되어 왔다.
WO 2015/068411은 대개 관심 단백질을 발현하지 않는 프로모터의 배향과 반대 방향으로 Lox71과 LoxJTZ17 사이에 위치하는 표적 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV-LoxP-플라스미드를 보고하였다.
WO 2011/100250은 진핵 세포에서 생체내 유전자 조절을 위한 표적화 플라스미드를 보고하였고, 여기서 상기 표적화 플라스미드는 게놈 내의 특정 유전자좌에 LoxP-FRT-Neo STOP-FRT-tetO-LoxP 카세트를 도입하였다.
Kawabe, Y., et al.은 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 이용한 항체 생산을 위한 유전자 통합 시스템을 보고하였다(Cytotechnol. 64 (2012) 267-279). 야생형 및 돌연변이된 LoxP 부위에 의해 측접된 교환 카세트를 수용체 원조 세포(founder cell)의 확립을 위해 CHO 세포의 염색체 내로 통합하였다. 그런 다음, LoxP 부위의 호환성 쌍에 의해 측접된 마커-항체-발현 카세트를 포함하고, 또한 선택 마커용 발현 카세트와 항체의 발현 카세트 사이에 내부의 쌍을 이루지 못한 LoxP 부위를 포함하는 공여체 플라스미드를 제조하였다. 공여체 플라스미드 및 Cre-재조합효소 발현 플라스미드를 시조 CHO 세포 내로 공동-형질감염시켜 CHO 게놈 내에 RMCE를 생성함으로써, 항체 유전자의 부위-특이적 통합을 발생시켜 원래의 야생형 LoxP 부위를 복원시키고, RMCE에 더 이상 참여하지 않는 비활성 이중-돌연변이된 LoxP 부위를 생성하였다. RMCE 절차를 반복하여 통합된 유전자의 복제수를 증가시킴으로써 각 단계에서 세포에 존재하는 선택 마커에 대한 발현 카세트를 절단하고 제거하였다.
Niesner, B. 및 Maheshri, N.는 관심 유전자 앞에 역위 LoxP 부위에 의해 측접된 프로모터를 삽입함으로써, 발현이 프로모터의 Cre-재조합효소 매개 플립핑(flipping)에 의해 임의로 변경될 수 있다고 보고하였다. 이는 끊임없이 프로모터의 배향을 뒤집는 회전목마 과정과 같다. 공정의 종결은 Cre-재조합효소 발현의 종결에 의해 영향을 받는다. 하지만, Cre-재조합효소는 매우 효율적이지만, 다중 역위 현상은 플록스드 프로모터의 비가역적 손실 또는 다른 게놈 영역과의 재조합을 발생시켜 대규모 재배열을 발생시킬 수 있다(Biotechnol. Bioeng. 110 (2013) 2677-2686).
WO 2013/014294는 상동 재조합에 의해 제1 유전자를 선택 마커, 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 항생제 마커로 대체함으로써 마커의 양 말단에 LoxP 부위가 존재하여 제거할 수 있음을 보고하였다. 사용된 설정에서, 각각 상이한 돌연변이를 갖는 2개의 변형된 LoxP 부위(Lox66 및 Lox71)가 사용된다. Cre-재조합효소에 의한 재조합 후, Lox72 부위가 남게 되고(Lambert, J.M., et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007) 1126-1135), 이는 하나 대신 두 개의 돌연변이를 갖고, Cre-재조합효소에 의해 더 이상 인식될 수 없다.
US 2013/58871은 머리-대-머리 위치로 배향된 2개의 돌연변이체 LoxP 부위(Lox66 및 Lox71)를 사용하여 Cre-재조합효소-매개 스위칭가능한 역위 플라스미드의 생성을 보고하였다. Cre-재조합효소가 존재하는 경우, 2개의 돌연변이체 LoxP 부위에 의해 측접된 유전자는 역위되어, 하나의 LoxP 및 하나의 이중-돌연변이된 LoxP 부위를 형성한다. 이중-돌연변이된 LoxP 부위는 Cre-재조합효소에 대해 매우 낮은 친화도를 나타내기 때문에, 유리한 한 단계 역위는 거의 비가역적이어서, 유전자가 원하는 대로 '온' 및 '오프'로 안정하게 스위칭될 수 있게 한다. Cre-재조합효소의 부재 하에서의 발현의 누출성은 플록스트 유전자의 측면에서 잘못된 TATA 박스 및 개시 코돈을 함유하는 서열을 제거함으로써 최소화되었다.
WO 2015/38958은 cap-in-cis rAAV 게놈을 보고하였고, 여기서 유비퀴틴 C 프로모터 단편은 mCherry 리포터의 발현에 이어서 합성 polyA 서열의 발현을 유도하기 위해 사용되고; rep 조절 서열에 의해 제어되는 AAV 캡시드 유전자는 Lox71- 및 Lox66-측접 SV40 후기 polyA 신호가 뒤따르고; Lox66 부위는 Lox71 부위에 대해 역위되고; 이 구성에서, Cre-재조합효소는 돌연변이체 LoxP 부위에 의해 측접된 서열의 역위를 매개하고; 역위, 비호환성인 이중 돌연변이체 Lox72 및 LoxP 부위가 생성된 후, 원래의 상태로의 역위의 효율을 감소시킨다.
WO 2015/68411은 프로모터의 배향과 반대 방향에 있는, 표적 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열인 바이러스 AAV-LoxP-WGA를 보고하였다. 이러한 구조체는 보통 관심 단백질을 발현하지 않는다. 상기 부위-특이적 재조합효소 인식 서열들 사이의 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 이러한 방향으로 역위될 때, 표적 단백질이 발현된다.
Arguello, T. 및 Moraes, C.T.는 Cre-재조합효소 활성이 원위 LoxP 부위의 비대칭 스페이서 영역에서의 돌연변이에 의해 생체내에서는 억제되지만 생체외에서는 억제되지 않는다고 보고하였다.
WO 2016/57800은 Cre-재조합효소에 작동가능하게 연결된 TGG 또는 DRG 프로모터 및 억제 RNA에 작동가능하게 연결된 LOX-stop-LOX 유도성 RNA 중합효소 III 프로모터를 보고하였다. 생체내에서, 본 발명가들은 원위 (3') LoxP 부위에서의 중심 스페이서 영역의 위치 4에서의 단일 T에서 C로의 돌연변이가 2개의 조건부 마우스 모델에서 재조합 반응을 완전히 억제함을 발견하였다.
WO 2017/100671은 형질도입된 표적 세포로부터의 AAV 캡시드 서열의 Cre-재조합효소-의존성 회복을 보고하였다. rAAV-Cap-in-cis-lox rAAV 게놈에서, Lox71 및 Lox66 부위에 의해 측접된 폴리아데닐화(pA) 서열은 Cre-재조합효소에 의해 역위된다.
WO 2017/189683은 유전적 섭동 카세트를 포함하는 유전적 구조체 및 유전자 발현의 시기 및 순서를 평가하기 위해 이를 사용하는 방법을 보고하였다.
WO 2018/96356은 표적 유전자를 포함하는 세포에서 조건부 유전자 녹아웃에 대한 대립유전자를 생성하는 방법을 보고하였고, 상기 방법은 인공 인트론 서열을 표적 유전자의 엑손 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 인공 인트론 서열은 스플라이스 공여체 서열; 제1 뉴클레아제 또는 재조합효소 부위; 분지점 서열; 제2 뉴클레아제 또는 재조합효소 부위; 스플라이스 수용체 서열; 및 제1 뉴클레아제 또는 재조합효소 부위에 또는 그 내에 5' 위치된 종결 코돈을 포함하고, 여기서 도입된 인트론의 비활성화를 위해, 상기 방법은 세포에서 재조합효소 또는 뉴클레아제를 도입하거나 활성화함으로써 분지점을 절제하거나 파괴하고 인공 인트론 서열의 스플라이싱을 붕괴시키는 단계를 포함한다.
WO 2018/229276은 서열 A, 서열 B, 재조합효소 표적 부위(RTS)의 제1 쌍 RTS1 및 RTS1' 및 제2 쌍 RTS2 및 RTS2'를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자인 조건부 녹인(knock-in) 카세트를 보고하였으며, 여기서 (i) 제1 쌍의 RTS 및 제2 쌍의 RTS는 함께 재조합할 수 없고, (ii) RTS1 및 RTS1'는 반대 배향이고, (iii) RTS2 및 RTS2'는 반대 배향이며, (iv) 서열 A 및 B 및 RTS는 5'에서 3'으로 하기와 같이: RTS1, 서열 A, RTS2, 서열 B, RTS1' 및 RTS2'의 순서로 존재하고, (v) 서열 A 및 B는 각각 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열은 상이한 DNA 가닥 상에 있고, (vi) 서열 A에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 서열 B에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, (vii) 서열 A의 코딩 가닥 및 서열 B의 비-코딩 가닥은 혼성화할 수 없다.
WO 2019/46069는 한 쌍의 LoxP 부위로 cap 유전자를 측접함으로써 AAV cap 유전자의 선택적 복원 및 Cre-재조합효소 발현의 세포 유형 특이성의 개발을 보고하였다. Cre-재조합효소 발현 세포의 AAV 감염에 이은 제2 가닥 AAV 게놈 합성은 플록스트 cap의 역위를 유도하였다. 돌연변이체 LoxP 부위 Lox66 및 Lox71을 이용하여 Cre-재조합효소-매개 재조합의 평형을 단방향 역위를 향해 유도하였다. LoxP 부위는 초기에 cap의 3' UTR에 삽입되었고, 여기서 상기 부위는 Cre-재조합효소-의존성 복원을 위한 표적 서열을 함유하는 짧은 스터퍼 서열을 측접하였다.
Fischer, K.B., et al.은 재조합효소-의존성 AAV 벡터로부터의 오프-표적 발현 및 교차-비민감성 ATG-아웃 벡터를 이용한 완화의 공급원을 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116 (2019) 27001-27010). 재조합효소-의존성 아데노-연관 바이러스(AAV)는 형질전환 마우스 라인 생산의 비교적 번거로운 과정 없이 특정 영역의 표적화 및 상이한 이식유전자의 발현을 가능하게 한다. lox-STOP-lox 및 FRT-STOP-FRT 시스템을 사용하는 재조합효소-의존성 AAV 설계가 사용되었지만, 이들의 설계에서 효과적으로 동일한 이중-역위 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)(DIO) 및 플립/절제(flip/excision, FLEX) 구조체는 강력한 프로모터를 사용할 때 이들의 제한된 크기 및 덜 누출되는 특성으로 인해 가장 광범위하게 사용되었다. 간략하게, DIO 및 FLEX 설계는 원하는 이식유전자 주위에서 중첩되는 역평행 배향으로, 즉 발현 카세트의 나머지에 대해 역위되어 전사적으로 억제되는 2쌍의 직교 인식 부위를 사용한다. 적절한 재조합효소에 노출될 때, 이식유전자 ORF는 역위되고 프로모터 및 3'-비번역 영역(UTR)과 함께 센스로 잠겨, 발현을 유도한다. 때때로 "ATG-out" 또는 "스플릿(split)-이식유전자"로 지칭되는 역위된 ORF에서, 코작(Kozak) 서열 및 이식유전자의 개시 코돈은 재조합효소 인식 부위의 제1 세트 외부에 위치하여, 이식유전자 ORF를 재조합 후에야 재구성되도록 한다. 자발적 역위 및 이식유전자 ORF를 독립적으로 파괴함으로써, 본 발명가들은 둘 모두 누출을 완전히 폐기하기 위해 파괴되어야 한다는 것을 보여준다. 추가로, 원형 ORF로부터의 누출 발현은 고도로 민감한 시스템에서만 검출가능한 반면, 자발적 역위는 형광 단백질의 발현의 낮지만 검출가능한 수준을 유도할 수 있다. 마지막으로, 본 발명가들은 CIAO(교차 비민감성 ATG-out)라고도 하는 ATG-out 이식유전자 설계를 활용하는 AAV에서 상동성이 감소된 돌연변이체 재조합효소 인식 부위의 사용이 재조합효소 리포터 마우스의 마우스 뇌에서 누출 발현을 크게 감소시킨다는 것을 보여준다.
일시적인 형질감염 방법은 대규모 발효 및 DNA 정제에 의해 생산될 필요가 있는 대량의 플라스미드 DNA를 필요로 한다. 보다 중요하게는, 형질감염 시약을 이용한 DNA 복합체 형성의 확장성이 제한된다. 전기천공의 확장성도 역시 제한적이다. 또한, 세포의 일시적 형질감염은 불량하게 재현가능하다.
단순포진 또는 아데노바이러스 형질도입에 의존하는 시스템은 rAAV 제제가 복제 적격의 헬퍼 바이러스로 오염되는 본질적인 위험을 갖는다.
배큘로바이러스 기반 시스템은 3가지 주요 단점을 갖는다: 첫째, 100 kb 범위의 배큘로바이러스 게놈의 큰 크기로 인해, 재조합 바이러스 DNA를 생성 및 제조하기 위해 지루한 기술이 적용되어야 한다. 두 번째로, 고농축 재조합 바이러스 스톡은 실제 생산 공정에 앞서 준비될 필요가 있다. 마지막으로, 배큘로바이러스-기반 시스템으로부터 유래된 rAAV는 변경된 캡시드 조성물 및 더 낮은 효능의 문제를 쉽게 겪을 수 있다. 따라서, 서로 상이한 캡시드 단백질의 발현 비율을 조절하기 위한 추가적인 노력이 필요하다(Kondratov, O., et al., Mol. Ther. 25 (2017) 2661-2675).
Ojala, D.S., et al.은 컴퓨터 상으로 설계된 SCHEMA AAV 라이브러리의 생체 내 선택이 SVZ에서 성체 신경 줄기 세포의 감염에 대한 신규한 변이체를 수득한다고 보고하였다(Mol. Thera. 26 (2018) 304-319.
WO 2020/78953은 AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 바이러스 유전자 및 AAV 벡터의 DNA 게놈을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 생산자 세포를 보고하였고; AAV rep 유전자는 인트론을 포함하고, 인트론은 전사 종결 서열의 상류에 위치한 제1 재조합 부위 및 전사 종결 서열의 하류에 위치한 제2 재조합 부위를 갖는 전사 종결 서열을 포함하고; 핵산 서열은 모두 AAV 벡터 생산자 세포 게놈 내의 단일 유전자좌에 함께 통합되었다. 상기 발명은 또한 AAV 벡터 생산자 세포주를 생산하는 방법에 관한 것이다.
WO 2018/150271은 적어도 4개의 별개의 재조합 표적 부위(RTS), E1A, E1B 또는 이들의 조합을 포함하는 아데노바이러스(Ad) 유전자, 및 Ad 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 세포로서, RTS, Ad 유전자 및 프로모터는 염색체된, 포유류 세포를 보고하였고; 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 생산자 숙주 세포를 생성하기 위해 세포를 사용하는 방법; 및 rAAV를 생성, 패키징 및 정제하기 위해 AAV 생산자 숙주 세포를 사용하는 방법을 보고하였다.
Mingqi, X., et al.은 포유류 디자이너(designer) 세포 - 공학 원리 및 생의학 응용에 대해 보고하였다(Biotechnol. J. 10 (2015) 1005-1018.
따라서, 게놈 서열에서 선택적으로 처리할 수 있는 형질전환 DNA 절편의 수를 증가시키는 기능적 유전체학 도구가 필요하다.
본원에서는 신규 디옥시리보 핵산 및 이의 사용방법이 보고된다. 본 발명에 따른 신규 디옥시리보 핵산은 부위 특이적 재조합효소 기술에 의해 적어도 2개의 오픈 리딩 프레임/유전자의 발현을 동시에 활성화시키는데 유용하다. 본 발명은 전사적 활성화, 즉 코딩 서열의 전사적 활성화를 가능하게 하는 프로모터 및 상기 코딩 서열의 작동가능한 연결, 부위-특이적 재조합효소와의 상호작용에 의한 역위를 필요로 하는 디옥시리보 핵산(DNA) 분자의 코딩 가닥((+) 가닥, 양으로 배향된 가닥) 및 주형 가닥((-) 가닥, 음으로 배향된 가닥) 상의 프로모터 및 오픈 리딩 프레임/유전자 요소의 의도적인 비활성 배열을 사용한다.
또한, 본 발명의 한 양태는 rAAV 입자 생산을 위한 재조합효소-활성화가능한 패키징 세포주이며, 여기서 rep/cap 유전자뿐만 아니라 아데노바이러스 헬퍼 유전자가 게놈 내로 (안정적으로)통합되고, 이들 중 적어도 하나, 바람직한 일 구현예에서, 이들 중 적어도 2개가 본 발명에 따른 디옥시리보 핵산에 포함되고, 이에 의해 부위-특이적 재조합효소와의 상호작용에 의해 전사적으로 활성화될 수 있다. 특정 구현예들에서, 하나 이상의 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 전사 활성화는 재조합효소-매개 오픈 리딩 프레임/유전자 역위(RMCI)에 의해 달성된다. 예를 들어, 이러한 활성화 후에 아데노바이러스 헬퍼 단백질 E1A는 자가 P5 프로모터로부터 rep 유전자의 전사를 활성화시키고, 이어서 cap 유전자의 전사를 활성화시킨다. 특정 구현예들에서, rep/cap 유전자 전사는 아데노바이러스 E1A 단백질이 구성적으로 발현되는 세포, 예를 들어, HEK 세포에서 본 발명에 따른 디옥시리보 핵산에서 재조합효소-매개 오픈 리딩 프레임/유전자 역위를 사용하여 활성화되거나, 또는 이종 프로모터가 rep 및/또는 cap 유전자 전사를 유도하기 위해 사용된다. 특정 구현예들에서, 상기 재조합효소는 박테리오파지 P1의 Cre-재조합효소이다.
특정 구현예들에서, Cre-재조합효소 발현은 소량의 핵산을 인코딩하는 Cre-재조합효소의 일시적 형질감염에 의해 유도된다. 효율적인 재조합은 일시적인 바이러스 생산을 위해 일반적으로 사용되는 플라스미드 DNA의 양의 10%만큼 적은 양으로 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소가 사용되는 경우 심지어 더 적은 양의 핵산으로도 충분하다. 특정 구현예들에서, 핵산을 인코딩하는 Cre-재조합효소는 패키징 세포주의 게놈 내로 통합되고, 유도성 프로모터, 예컨대, 예를 들어, Tet-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 바람직한 일 구현예에서, ITR 및 이식유전자를 포함하는 rAAV 게놈이 또한 패키징 세포주의 게놈에 통합된다. 이에 의해, 패키징 세포주는 rAAV 벡터 및 입자 생성 세포주로 전환된다. 마찬가지로, 특정 구현예들에서, rAAV 게놈은 일시적으로 도입된다.
재조합 후, 생산 세포주의 세포는 유전적으로 균일하고, 정확한 화학량론에서 rAAV 복제 및 패키징에 필요한 모든 유전자를 발현한다(이와 대조적으로, 삼중 또는 이중 형질감염 방법에서, 일부 세포는 준최적 용량의 하나 또는 다른 플라스미드/유전자를 수용할 수 있다). 따라서, 이러한 이론에 구속되지 않고, 안정한 rAAV 벡터/입자 패키징 또는 생산 세포주는 일시적 패키징 또는 생산 세포에 비해 더 높은 생성물 품질을 발생시킬 수 있다. 또한, 헬퍼 바이러스 대신 핵산을 인코딩하는 Cre-재조합효소로 형질감염시켜 rAAV 벡터 또는 입자 생성을 유도하면 생성된 rAAV 벡터/입자의 개선된 안전성을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 신규한 아데노바이러스 VA RNA 유전자이다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 역위에 의해 Cre-재조합효소 매개 유전자 활성화를 가능하게 한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA에서, 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 아데노바이러스 VA RNA의 비-코딩, 즉 조절 요소에 도입된 LoxP 부위와 함께 정확한 전사 개시 부위를 갖는 임의의 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 신규한 LoxP 부위(스페이서 서열) AGTTATA(서열번호　01(정방향); 서열번호 02(역방향)이다. 상기 스페이서 서열은 본원에서 Lx로 지칭된다. 이는 임의의 공지된 좌측 및 우측 반복부 서열과 조합될 수 있다.
특정 구현예들에서, Lx 스페이서 서열은 돌연변이된 좌측 역위 반복부 및 야생형 우측 역위 반복부와 조합된다. 이러한 Cre-재조합효소 인식 서열은 Lx-LE로 표시되고, 정방향으로 서열번호 03의 서열 및 역방향으로 서열번호 04의 서열을 가진다.
특정 구현예들에서, Lx 스페이서 서열은 돌연변이된 우측 역위 반복부 및 야생형 좌측 역위 반복부와 조합된다. 이러한 Cre-재조합효소 인식 서열은 Lx-RE로 표시되고, 정방향으로 서열번호 05의 서열 및 역방향으로 서열번호　06의 서열을 가진다.
본 발명의 기초가 되는 기술적 원리는 DNA-역위를 조절 요소, 예컨대, 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결하는 것과 병용함으로써 오픈 리딩 프레임 또는 유전자의 전사 활성화이다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소이고,
여기서
상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 제1 프로모터,
- 역위 반복부들 중 하나, 즉, 좌측 역위 반복부 또는 우측 역위 반복부에서 돌연변이를 포함하고, 다른 역위 반복부는 돌연변이되지 않은/야생형 역위 반복부인 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥(방향)에 대해 역위된(서열) 제2 프로모터,
- 상기 코딩 가닥(방향)에 대해 역위된(서열) 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 상기 코딩 가닥(방향)에 대해 역위되고 상기 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 제1 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열로서 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 역위/상호 배향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 제2 오픈 리딩 프레임, 및
- 상기 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 5'에서 3’ 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 5'에서 3' 방향/양의 배향의 제1 프로모터,
- 역위 반복부들 중 하나, 즉, 좌측 역위 반복부 또는 우측 역위 반복부에서 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 3'에서 5' 배향/음의 배향의 제2 프로모터,
- 3'에서 5’ 배향/음의 배향의 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 3'에서 5’ 배향/음의 배향으로 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 제1 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열로서 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 5'에서 3' 배향/양의 배향의 제2 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는 이중가닥 DNA 요소이다.
특정한 종속적 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소로 이중 가닥 DNA 요소를 인큐베이션하는 것은
- 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이에 위치한 서열을 역위시킨 후, 상기 제1 프로모터가 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하고 상기 제2 프로모터가 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하며, 그리고
- 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 DNA 서열에 대한 재조합 효소 매개 역위 이후에 제1 프로모터와 제1 오픈 리딩 프레임 사이 또는 제2 프로모터와 제2 오픈 리딩 프레임 사이에 ((제3)재조합효소 인식 서열이)상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 (제3)재조합효소 인식 서열을 생성시킨다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 5'에서 3’ 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 5'에서 3' 배향/양의 배향의 프로모터,
- 역위 반복부들 중 하나, 즉, 좌측 역위 반복부 또는 우측 역위 반복부에서 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 3'에서 5’ 배향/음의 배향으로 아데노바이러스 VA RNA,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열로서 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열을 포함하는 이중가닥 아데노바이러스 VA RNA 요소이다.
특정한 종속적 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소로 이중 가닥 VA RNA 요소를 인큐베이션하는 것은
- 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 프로모터가 VA RNA 유전자에 작동가능하게 연결되도록 하며, 그리고
- 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 DNA 서열에 대한 재조합 효소 매개 역위 이후에 프로모터와 VA RNA 유전자 사이 또는 VA RNA의 하류에 ((제3)재조합효소 인식 서열이) 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 (제3)재조합효소 인식 서열을 생성시킨다.
본 발명의 독립적인 일 양태는
- 본 발명에 따른 제1 이중 가닥 DNA 요소,
- 본 발명에 따른 제2 이중 가닥 DNA 요소,
- 임의적으로 본 발명에 따른 제3 이중 가닥 DNA 요소 또는 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 요소, 및
- rep 또는/및 cap 오픈 리딩 프레임(요소)을 포함하는 (이중 가닥)DNA(분자)이다.
특정한 종속적 구현예들에서,
1)
- 제1 이중 가닥 DNA 요소에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 E1A 오픈 리딩 프레임이고, 제2 오픈 리딩 프레임은 E1B 오픈 리딩 프레임이거나, 또는 그 반대이고; 그리고
- 제2 이중 가닥 DNA 요소에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 E2A 오픈 리딩 프레임이고, 제2 오픈 리딩 프레임은 E4 오픈 리딩 프레임 또는 E4orf6(오픈 리딩 프레임)이거나, 또는 그 반대이거나;
또는
2)
- 제1 이중 가닥 DNA 요소에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 E2A 오픈 리딩 프레임이고, 제2 오픈 리딩 프레임은 E4 오픈 리딩 프레임 또는 E4orf6(오픈 리딩 프레임)이거나, 또는 그 반대이고; 그리고
- 제2 이중 가닥 DNA 요소에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 E1A 오픈 리딩 프레임이고, 제2 오픈 리딩 프레임은 E1B 오픈 리딩 프레임이거나, 또는 그 반대이다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 본 발명에 따른 적어도 하나의 이중 가닥 DNA 요소 또는 분자 또는 이의 (서열) 역위 형태를 포함하는 포유류 또는 곤충 세포이다.
본 발명에 따른 독립적인 일 양태는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 입자의 생성 방법이고, 상기 방법은 다음과 같이:
- 본 발명에 따른 세포를 배양/증식(세포 분열에 적합한 조건하에서)하는 단계,
- 본 발명에 따른 재조합효소 매개 오픈 리딩 프레임 역위에 의해 rAAV 벡터 또는 입자 생성을 활성화하는 단계(본 발명에 따른 세포에서 재조합효소를 단백질로서 또는 mRNA로서 또는 DNA로서 도입함으로써, 상기 재조합효소는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자에서 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용함),
- 선택적으로 이전 단계에서 수득된 rAAV 벡터 또는 입자 생산 활성화 세포를 배양하는 단계(rAAV 벡터 또는 입자 생산에 적합한 조건하에서),
- 세포 또는/및 배양 배지로부터 rAAV 벡터 또는 입자를 회수하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 독립적인 일 양태는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
a) E1A 오픈 리딩 프레임 및 E1B 오픈 리딩 프레임; 및
b) E2A 오픈 리딩 프레임 및 E4 또는 E4orf6 오픈 리딩 프레임을 포함하고,
a) 또는 b)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임은 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소에 포함/함유되는 것을 특징으로 하고,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 제1 프로모터(양의 배향의),
- 역위 반복부들 중 하나에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위된(서열) 제2 프로모터,
- 임의적으로, 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위되고(서열) 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 상기 코딩 가닥 방향에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위된(서열) (a) 또는 b)의) 제1 오픈 리딩 프레임,
- 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 제 1 오픈 리딩 프레임이 a)인 경우 a)의 제 2 오픈 리딩 프레임 또는 제 1 오픈 리딩 프레임이 b)인 경우 b)의 제 2 오픈 리딩 프레임(양의 배향의)
- 임의적으로, (양의 배향의 및 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된)제2 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는 (이중 가닥)DNA(분자)이다.
따라서, 본 발명의 독립적인 일 양태는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
a) E1A 오픈 리딩 프레임 및 E1B 오픈 리딩 프레임; 및
b) E2A 오픈 리딩 프레임 및 E4 또는 E4orf6 오픈 리딩 프레임을 포함하고,
a)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임 및 b)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임이 각각 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 각각 포함하는 이중 가닥 DNA 요소(즉, DNA 분자가 상기 DNA 요소 중 2개를 포함함)에 함유되는 것을 특징으로 하며,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 제1 프로모터(양의 배향의),
- 역위 반복부들 중 하나에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위된(서열) 제2 프로모터,
- 임의적으로, 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위되고(서열) 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 상기 코딩 가닥 방향에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위된(서열) (a) 또는 b)의) 제1 오픈 리딩 프레임,
- 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 제 1 오픈 리딩 프레임이 a)인 경우 a)의 제 2 오픈 리딩 프레임 또는 제 1 오픈 리딩 프레임이 b)인 경우 b)의 제 2 오픈 리딩 프레임(양의 배향의)
- 임의적으로, (양의 배향의 및 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된)제2 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는 (이중 가닥)DNA(분자)이다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 (적어도 하나의)이중 가닥 DNA 요소를 포함하는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 제1 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P5 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 역위 반복부들 중 하나에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥(방향)에 대하여(즉, 역위/음의 배향의) 역위된 Rep 및 Cap 단백질의 발현을 위한 추가의 프로모터를 포함하는 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임,
- 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 폴리아데닐화 신호로서, 바람직한 일 구현예에서는 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임의 자가 폴리아데닐화 신호를 포함하는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
특정한 종속적 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소로 (이중 가닥)DNA(분자)를 인큐베이션하는 것은
- 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 제1 프로모터가 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하며, 그리고
- 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 DNA 서열에 대한 재조합 효소 매개 역위 이후에 제1 프로모터와 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임 사이 또는 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임과 폴리아데닐화 신호 사이에 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임이 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 (제3)재조합효소 인식 서열을 생성시킨다.
본 발명의 독립적인 다른 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소를 포함하는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 제1 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P5 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 역위 반복부들 중 하나에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위된 제2 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P19 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 임의적으로, 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위되고(서열) Rep78 또는 Rep68 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 코딩 서열로서, 배타적으로 Rep78 단백질 또는 배타적으로 Rep68 단백질을 인코딩하지만, 둘 모두를 인코딩하지는 않고, 여기서
(i) 임의적으로 내부 P40 프로모터가 비활성화되며, 그리고/또는,
(ii) Rep52/40의 개시 코돈이 비-개시 코돈으로 변이되며, 그리고/또는
(iii) 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거되고,
상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위되는, 코딩 서열,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열로서 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 공통 폴리아데닐화 신호 서열, 즉 상기 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Rep52/Rep40 및 Cap 오픈 라딩 프레임을 포함하는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
본 발명의 독립적인 다른 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소를 포함하는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 즉 하기의 순서로
- 제1 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P5 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 역위 반복부들 중 하나에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위된 제2 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P19 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 임의적으로, 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위되고(서열) Rep78 또는 Rep68 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 코딩 서열로서, 배타적으로 Rep78 단백질 또는 배타적으로 Rep68 단백질을 인코딩하지만, 둘 모두를 인코딩하지는 않고, 여기서
(i) 임의적으로 내부 P40 프로모터가 비활성화되며, 그리고/또는,
(ii) Rep52/40 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈이 비-개시 코돈으로 변이되며, 그리고
(iii) 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거되고,
상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위되는, 코딩 서열,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열로서 각각의 다른 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 상호/역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 임의적으로 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거된 Rep52 오픈 리딩 프레임, 또는 폴리아데닐화 신호 서열, 즉 상기 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Rep40 오픈 리딩 프레임,
- 임의적으로 제3 프로모터, cap 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 및/또는 종결인자 서열을 포함하고, 여기서 모두는 작동가능하게 연결되는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 기능적 프로모터에 작동가능하게 연결된 아데노바이러스 VA RNA 유전자이고, 여기서 정확한 전사 개시 부위가 첨가되고, Cre-재조합효소 인식 서열이 아데노바이러스 VA RNA 유전자 내로/내에 조작되었다.
본 발명의 일 양태는 본 발명의 DNA 요소 또는 DNA(분자) 또는 아데노바이러스 VA RNA 중 적어도 하나를 원래의 형태 또는 (재조합효소)역위 형태로 포함하는 단리된 (포유류 또는 곤충)세포이다.
본 발명의 일 양태는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 입자의 생성/생산 방법이고, 상기 방법은 다음과 같이:
- 부유 상태로 성장하는 포유류 세포로서
- 2개의 AAV ITR 사이에 이격된 이식유전자 발현 카세트;
- 아데노바이러스 E1A, E1B, E2A, E4 또는 E4orf6 단백질 및 아데노바이러스 VA RNA를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임;
- 아데노 연관 Rep/Cap 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임;
- 비-호환성 재조합효소 인식 서열의 하나 이상의 상이한 쌍을 포함하는, 포유류를 제공하는 단계로서,
여기서, E1A 오픈 리딩 프레임, E1B 오픈 리딩 프레임, E2A 오픈 리딩 프레임, E4 오픈 리딩 프레임, E4 오픈 리딩 프레임 6, Rep78 오픈 리딩 프레임, Rep68 오픈 리딩 프레임, Rep52 오픈 리딩 프레임, Rep40 오픈 리딩 프레임, Rep/Cap 오픈 리딩 프레임 및 아데노바이러스 VA RNA 유전자로 이루어진 군으로부터 하나 이상은 개별적으로 또는 조합하여 작동가능하게 연결된 프로모터없이, 하지만 한 쌍의 상기 비-호환성 재조합효소 인식 서열들 사이에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 및/또는 전사 종결 신호를 포함하여 각각 배치되고, 여기서 하나의 재조합효소 인식 서열은 좌측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고, 하나의 재조합효소 인식 서열은 우측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하고, 프로모터는 제1 재조합효소 인식 서열의 상류에 위치되며, 오픈 리딩 프레임은 이로부터 상류에 위치된 프로모터에 대해 역 배향이고;
재조합효소 인식 서열은 (예컨대, rAAV 벡터 또는 입자 생성에 의해) 검출가능한 재조합효소-의존적 변화의 생성을 허용하도록 조직화되고, 특정 구현예들에서 하나 이상의 재조합효소 인식 서열은 Cre-재조합효소 인식 부위이고(즉, 재조합효소 인식 서열은 서로에 대해 상호/역위 배향이고, 재조합효소의 작용은 재조합효소 인식 서열과 상류 위치된 프로모터에 작동가능하게 연결된 수반물 사이의 서열(들)을 역위 서열에 역위시킴), 특정 구현예들에서 하나 이상의 재조합효소 인식 서열은 Flp-인식 부위인(즉, 재조합효소 인식 서열은 서로에 대해 상호/역 배향이고, 재조합효소의 작용은 재조합효소 인식 서열과 상류 위치된 프로모터에 작동가능하게 연결된 수반물 사이의 서열(들)을 역위 서열에 역위시킴), 단계;
- 상기 세포를 재조합효소 발현 플라스미드 또는 재조합효소 mRNA로 형질감염시키거나 또는 상기 포유류 세포 내에서 조건부 재조합효소 발현을 활성화시킴으로써 상기 포유류 세포에서 재조합효소의 발현을 유도하는 단계로서, 이에 따라 재조합효소의 발현이 재조합효소-매개 카세트 역위를 발생시켜 rAAV 벡터 또는 입자 생성을 발생시키고, 재조합효소-매개 카세트 역위는 재조합효소 인식 서열에 의해 측접된 서열의 역위인, 단계;
- rAAV 벡터 또는 입자를 세포 또는 배양 배지로부터 단리하여 rAAV 벡터 또는 입자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법이다.
본 발명의 일 양태는 포유류 세포에서 관심 DNA의 부위-특이적 치환을 수득하는 방법으로서:
a) 본 발명에 따른 DNA 요소를 포함하는 포유류 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 a)의 DNA 요소의 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소를 세포 내로 도입하거나 세포 내에서 활성화시키는 단계를 포함하고,
여기서 상기 재조합효소는 재조합효소 인식 서열들 사이의 서열의 역위를 촉매하여, 포유류 세포에서 관심 DNA의 부위-특이적 치환이 수득되는, 방법이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 재조합효소 인식 서열은 좌측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함하고, 제2 재조합효소 인식 서열은 우측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함한다. 이러한 배열로 인해, 재조합효소-매개 역위 후에, 상류의, 즉 5'-위치된 재조합효소 인식 서열이 역위 반복부들 둘 모두에서 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 비-작용성이며, 즉 각각의 재조합효소에 의해 인식될 수 없다. 하류의, 즉 3'-위치된 재조합효소 인식 서열은 역위 반복부 둘 모두에 대해 야생형이고, 이에 의해 작용성이며, 즉 각각의 재조합효소에 의해 인식될 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 재조합효소 인식 서열은 우측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함하고, 제2 재조합효소 인식 서열은 좌측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함한다. 이러한 배열로 인해, 재조합효소-매개 역위 후에, 하류의, 즉 3'-위치된 재조합효소 인식 서열이 역위 반복부들 둘 모두에서 돌연변이를 포함하고, 이에 의해 비-작용성이며, 즉 각각의 재조합효소에 의해 인식될 수 없다. 상류의, 즉 5'-위치된 재조합효소 인식 서열은 역위 반복부 둘 모두에 대해 야생형이고, 이에 의해 작용성이며, 즉 각각의 재조합효소에 의해 인식될 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 프로모터는 양의 배향에 있고, 그리고/또는 제2 오픈 리딩 프레임은 양의 배향에 있다.
도 1 RMCI 이전(좌측 도면) 및 이후(우측 도면)에 본 발명에 따른 DNA 요소의 도식.
도 2 본 발명에 따른 2개의 DNA 요소를 포함하는 본 발명에 따른 DNA의 도식
도 3 RMCI 이전(상측 도면) 및 이후(하측 도면)에 본 발명에 따른 DNA의 도식.
도 4 본 발명에 따른 DNA에서의 순차적 전사 활성화의 도식.
도 5 E1A, E1B, E2A 및 E4(ORF6)에 대한 4개의 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성화를 위한 본 발명에 따른 DNA의 예시적인 사용.
도 6 E2A 및 E4(ORF6)에 대한 2개의 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성화를 위한 본 발명에 따른 DNA 요소의 예시적인 사용.
도 7 rep 및 cap(좌측), rep78 및 rep52/40(중간) 및 rep78 및 rep52(우측)에 대한 2개의 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성화를 위한 본 발명에 따른 DNA 요소의 예시적인 사용.
도 8 VA RNA 유전자에 대한 1개의 오픈 리딩 프레임의 전사 활성화를 위한 본 발명에 따른 DNA 요소의 예시적인 사용.
도 9 RMCI 전에 E1A 및 E1B에 대한 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성을 위한 본 발명에 따른 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 10 RMCI 후에 E1A 및 E1B에 대한 전사적으로 활성인 오픈 리딩 프레임을 갖는 본 발명에 따른 역위 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 11 RMCI 전에 E2A 및 E4orf6에 대한 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성을 위한 본 발명에 따른 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 12 RMCI 후에 E2A 및 E4orf6에 대한 전사적으로 활성인 오픈 리딩 프레임을 갖는 본 발명에 따른 역위 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 13 RMCI 전에 Rep78 및 Rep52/40에 대한 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성을 위한 본 발명에 따른 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 14 RMCI 후에 Rep78 및 Rep52/40에 대한 전사적으로 활성인 오픈 리딩 프레임을 갖는 본 발명에 따른 역위 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 15 VA RNA 및 VA RNA G58T/G59T/C68A 변이체의 정렬.
도 16 RMCI 이전에 본 발명에 따른 VA RNA.
도 17 RMCI 이후에 본 발명에 따른 VA RNA.
도 18 RMCI 전에 mCherry 및 EGFP에 대한 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성화를 위한 본 발명에 따른 예시적인, 전사 비활성 DNA 요소의 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 19 RMCI 후에 EmCherry 및 EGFP에 대한 전사적으로 활성인 오픈 리딩 프레임을 갖는 도 18의 본 발명에 따른 역위 DNA 요소의 예시적인 도면. 클로닝을 위한 제한 부위를 나타내었다.
도 20 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에서 RMCI의 세포측정 분석. GFP 및 mCherry 발현 세포의 평균 백분율을 표준 편차(오차 막대)와 함께 나타낸다. 각 조건은 생물학적 삼중 시험법으로 시험하였다. 표 5에 따라 번호를 매겼다.
본원에서는 신규 DNA 구조체 및 이의 사용방법이 보고된다. 본 발명에 따른 신규한 DNA 구조체는 부위-특이적, 재조합효소-매개 카세트 역위(RMCI)를 사용한 적어도 2개의 오픈 리딩 프레임 또는 유전자의 동시 전사 활성화에 유용하다. 본 발명은 부위-특이적 재조합효소와의 상호작용(즉, 역위)에 의해 이의 생산적, 즉 작동가능하게 연결된 형태로 전환되는 이중 가닥 DNA 분자의 코딩 및 주형 가닥 상의 프로모터 및 오픈 리딩 프레임의 의도적인 비-생산적 배열을 사용한다.
정의
본 발명을 실시하기 위한 유용한 방법 및 기술은, 예컨대 Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)에 기재되어 있다.
재조합 DNA 기술을 사용하면 핵산 유도체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해, 개별 뉴클레오티드 위치 또는 다수의 뉴클레오티드 위치에서 이러한 유도체들은 변형될 수 있다. 변형 또는 유도체화는 예를 들어, 부위 지향된 돌연변이생성에 의해 실시될 수 있다. 상기 변형은 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 실시될 수 있다(예컨대, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England를 참조).
디옥시리보 핵산은 코딩 및 비-코딩 가닥을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "5'" 및 "3'"은 코딩 가닥 상의 위치를 지칭한다.
용어 "3' 측접(flanking) 서열"은 뉴클레오티드 서열의 3'-말단(하류; 아래)에 위치하는 서열을 의미한다.
용어 "5' 측접 서열"은 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(상류; 위)에 위치하는 서열을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 “한(a)”, "하나(an)" 및 "그것(the)"은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 세포"에 대한 언급에는 복수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지된 이의 등가물 및 기타 등등을 포함한다. 마찬가지로, 용어 단수 부정관사(“a”, “an”), “하나 또는 그 이상의” 및 ”적어도 하나”는 함께 사용된다. 또한, "포함한", "포함하는" 및 "갖는"이라는 용어는 함께 사용될 수 있음에 유의해야 한다.
용어 "AAV 헬퍼 기능"은 생산적 AAV 복제 및 패키징에 대해 트랜스로 기능하는 AAV 유전자 생성물 및 AAV 입자를 제공하도록 발현될 수 있는 AAV-유래 코딩 서열(단백질)을 나타낸다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 rep 및 cap 및 특정 AAV 혈청형에 대한 AAP와 같은 다른 것들을 포함하는 AAV 오픈 리딩 프레임을 포함한다. rep 유전자 발현 생성물은 그 중에서도 특히 DNA 복제의 AAV 원점의 인식, 결합 및 닉킹(nicking); DNA 헬리카제 활성; 및 AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사의 조절을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 나타났다. 캡 유전자 발현 생성물(캡시드)은 필요한 패키징 기능을 공급한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터 게놈으로부터 누락된 트랜스로 AAV 기능을 보완하기 위해 사용된다.
용어 "약(about)"은 이 용어 다음의 수치의 +/- 20% 범위를 나타낸다. 특정 구현예들에서, 용어 "약(about)"은 이 용어 다음의 수치의 +/- 10% 범위를 나타낸다. 특정 구현예들에서, 용어 "약(about)"은 이 용어 다음의 수치의 +/- 5 % 범위를 나타낸다.
"~를 포함하는"이라는 용어는 "~로 구성되는"이라는 용어를 또한 포괄한다.
용어 "CAS 단백질"은 리보뉴클레아제 활성을 가지고 특이적 RNA 서열에 결합할 수 있는 CRISPR-관련 단백질을 나타낸다.
용어 "CAS9"는 엔도뉴클레아제 Cas9를 의미한다. 이 효소는 RNA 서열 GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG (crRNA 반복부) (서열번호 26)에 결합하고, 거기서 연관된 DNA를 절단한다.
"Cre-재조합효소"라는 용어는 LoxP 부위들 사이의 토포이소머라제 I 유사 기전을 사용하여 부위 특이적 재조합효소를 촉매하는 티로신 재조합효소를 나타낸다. 효소의 분자량은 약 38 kDa이며 343개의 아미노산 잔기로 구성된다. 이는 인테그라제 계열의 한 구성원이다. 예시적인 Cre-재조합효소는 하기의:
MSNLLTVHQN LPALPVDATS DEVRKNLMDM FRDRQAFSEH TWKMLLSVCR
SWAAWCKLNN RKWFPAEPED VRDYLLYLQA RGLAVKTIQQ HLGQLNMLHR
RSGLPRPSDS NAVSLVMRRI RKENVDAGER AKQALAFERT DFDQVRSLME
NSDRCQDIRN LAFLGIAYNT LLRIAEIARI RVKDISRTDG GRMLIHIGRT
KTLVSTAGVE KALSLGVTKL VERWISVSGV ADDPNNYLFC RVRKNGVAAP
SATSQLSTRA LEGIFEATHR LIYGAKDDSG QRYLAWSGHS ARVGAARDMA
RAGVSIPEIM QAGGWTNVNI VMNYIRNLDS ETGAMVRLLE DGD
(서열번호 07);의 아미노산 서열
및 이에 대응하는 하나의 Cre mRNA는 하기의:
AUGAGCAACC UGCUGACCGU GCACCAGAAC CUGCCCGCCC UGCCCGUGGA
CGCCACCAGC GACGAGGUGA GGAAGAACCU GAUGGACAUG UUCAGGGACA
GGCAGGCCUU CAGCGAGCAC ACCUGGAAGA UGCUGCUGAG CGUGUGCAGG
AGCUGGGCCG CCUGGUGCAA GCUGAACAAC AGGAAGUGGU UCCCCGCCGA
GCCCGAGGAC GUGAGGGACU ACCUGCUGUA CCUGCAGGCC AGGGGCCUGG
CCGUGAAGAC CAUCCAGCAG CACCUGGGCC AGCUGAACAU GCUGCACAGG
AGGAGCGGCC UGCCCAGGCC CAGCGACAGC AACGCCGUGA GCCUGGUGAU
GAGGAGGAUC AGGAAGGAGA ACGUGGACGC CGGCGAGAGG GCCAAGCAGG
CCCUGGCCUU CGAGAGGACC GACUUCGACC AGGUGAGGAG CCUGAUGGAG
AACAGCGACA GGUGCCAGGA CAUCAGGAAC CUGGCCUUCC UGGGCAUCGC
CUACAACACC CUGCUGAGGA UCGCCGAGAU CGCCAGGAUC AGGGUGAAGG
ACAUCAGCAG GACCGACGGC GGCAGGAUGC UGAUCCACAU CGGCAGGACC
AAGACCCUGG UGAGCACCGC CGGCGUGGAG AAGGCCCUGA GCCUGGGCGU
GACCAAGCUG GUGGAGAGGU GGAUCAGCGU GAGCGGCGUG GCCGACGACC
CCAACAACUA CCUGUUCUGC AGGGUGAGGA AGAACGGCGU GGCCGCCCCC
AGCGCCACCA GCCAGCUGAG CACCAGGGCC CUGGAGGGCA UCUUCGAGGC
CACCCACAGG CUGAUCUACG GCGCCAAGGA CGACAGCGGC CAGAGGUACC
UGGCCUGGAG CGGCCACAGC GCCAGGGUGG GCGCCGCCAG GGACAUGGCC
AGGGCCGGCG UGAGCAUCCC CGAGAUCAUG CAGGCCGGCG GCUGGACCAA
CGUGAACAUC GUGAUGAACU ACAUCAGGAA CCUGGACAGC GAGACCGGCG
CCAUGGUGAG GCUGCUGGAG GACGGCGAC
(서열번호 08)의 서열 또는 이처럼 상이한 코돈 사용을 갖는 이의 변이체를 가진다.
용어 "CRISPR"은 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)의 약어이고; 규칙적인 간격으로 그룹화된 짧은 회문 반복부이다.
용어 "CRISPR/CAS"는 CRISPR 관련 시스템을 나타낸다. 클러스터링된 일정한 간격을 둔 짧은 회문 반복부는 다수의 짧은 직접 반복부를 함유하는 유전자좌이고, 세균 및 고세균에 대한 획득된 면역성을 제공한다. CRISPR 시스템은 외래 DNA를 침입하는 서열-특이적 침묵을 위해 crRNA 및 tracrRNA에 의존한다. 3가지 유형의 CRISPR/CAS 시스템이 존재하며: II형 시스템에서, Cas9는 crRNA-tracrRNA 표적 인식시 DNA를 절단하는 RNA-유도의 DNA 엔도뉴클레아제로서 작용한다.
용어 "crRNA"는 crRNA 반복부 서열 및 crRNA 스페이서 서열로 구성된 RNA를 나타내고; 특이적 2차 구조를 가지며; crRNA는 Cas9에 결합함으로써, Cas9의 형태 변화를 유도하여, 표적 DNA가 crRNA 스페이서에 의해 결합될 수 있고(표적 DNA에 상보적임); crRNA 스페이서 서열을 교환함으로써, 표적 DNA가 (표적 DNA 상보적 RNA 서열에 대해)변경될 수 있고; crRNA 반복부는 20개의 뉴클레오티드로 구성되며; PAM 모티프에 인접한 12개의 뉴클레오티드는 결합 특이성에 중요하다.
용어 "공여체 플라스미드"는 공여체 서열을 함유하는 플라스미드를 의미한다.
용어 "공여체 서열"은 5' 측접 서열 - 표적 서열 - 3' 측접 서열을 포함하는 서열을 의미한다.
용어 "DSB"는 이중 가닥 파괴를 나타내며: ZFN, TALEN, 및 CRISPR/Cas9 작용의 생성물, 이중 가닥 파괴는 DNA 가닥 둘 모두가 절단될 때 발생하는 DNA 손상의 한 형태이다.
용어 "빈 캡시드" 및 "빈 입자"는 AAV 단백질 쉘을 갖지만 단백질을 인코딩하거나 AAV ITR에 의해 측접된 관심의 전사체, 즉 벡터로 전사되는 핵산이 전부 또는 부분적으로 결여된 AAV 입자를 지칭한다. 이에 따라, 빈 캡시드는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체 내로 전사되는 핵산을 숙주 세포 내로 전달하는 기능을 하지 않는다.
용어 "내인성"은 어떤 것이 세포 내에서 자연적으로 발생하고; 세포에 의해 자연적으로 생성되는 것을 나타내고; 마찬가지로 "내인성 유전자 자리/세포-내인성 유전자 자리"는 세포에서 자연적으로 발생하는 자리이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 “외인성”이란 뉴클레오티드 서열이 특정 세포로부터 기원되지 않고, DNA 전달 방법, 예컨대, 형질감염, 전기천공, 또는 바이러스 벡터에 의한 형질도입에 의해 상기 세포로 도입될 수 있음을 의미한다. 따라서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인위적인 서열이며, 여기서 이러한 인위성은, 예컨대, 상이한 기원의 하위서열의 조합(예컨대, SV40 프로모터가 있는 재조합효소 인식 서열 및 녹색 형광 단백질의 코딩 서열의 조합은 인위적인 핵산임)으로부터 기인될 수 있거나 또는 서열의 일부분의 결실(예컨대, 막-결합된 수용체의 세포외 도메인을 배타적으로 코딩하는 서열, 또는 cDNA)로부터 기인될 수 있거나, 또는 핵염기의 돌연변이로 기인될 수 있다. 용어 “내인성”이란 세포로부터 기인된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. “외인성” 뉴클레오티드 서열은 염기 조성에서는 동일한 "내인성" 대응부(counterpart)를 가질 수 있지만, 여기에서 상기 서열은 세포 내로의 이의 도입에 의해, 예컨대, 재조합 DNA 기술을 통하여 “외인성” 서열이 되고 있다.
본원에 사용된 용어 "측접"은 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열의 5'- 또는 3'- 말단, 또는 양쪽 말단에 위치함을 지칭한다. 측접 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열에 인접하거나 이로부터 정해진 거리에 존재할 수 있다. 실용적인 요건 외에 측접 뉴클레오티드 서열의 길이에는 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 측접 서열은 몇 개의 염기 쌍 또는 수천 개의 염기 쌍이 될 수 있다. 용어 "측접 뉴클레오티드 서열"은 삽입되는 서열(= 표적 서열)에 앞서거나 뒤따르는 핵산의 서열 단편을 의미한다.
용어 "유전자좌"는 염색체상의 유전자의 위치, 즉 게놈내 유전자의 위치, 즉 유전자 위치를 의미한다.
용어 "HR"은 상동성 재조합을 나타내고: 상동성-지향의 복원은 DSB 복원을 위한 주형-의존적 경로이다. 부위-특이적 뉴클레아제와 함께 상동성-함유 공여체 주형을 공급함으로써, HDR은 표적 유전자좌에 공여체 분자를 충실하게 삽입한다. 이러한 접근법은 단일 또는 다수의 이식유전자의 삽입뿐만 아니라 단일 뉴클레오티드 치환을 가능하게 한다.
“단리된" 조성물은 이의 자연 환경의 하나 이상의 성분(들)으로부터 분리되어 있는 조성물이다. 일부 구현예들에 있어서, 조성물은, 예를 들어, 전기영동의(예컨대, SDS-PAGE, 등전초점조절(IEF), 모세관전기이동, CE-SDS) 또는 크로마토그래피(예컨대, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다. 예컨대, 항체 순도를 평가하는 방법들을 검토하려면, 예컨대, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87을 참조한다.
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 하나 이상의 성분(들)으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 함유하는 세포 안에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 이의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체 외부에 존재한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 항체는 이의 자연 환경의 하나 이상 성분(들)으로부터 분리되어 있는 폴리펩티드 분자 또는 항체 분자를 지칭한다.
용어 “통합 부위”는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된/삽입되었던 세포의 게놈 내 핵산 서열을 뜻한다. 특정 구현예들에서, 통합 부위는 세포 게놈 내 2개 인접 뉴클레오티드 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 통합 부위는 뉴클레오티드의 스트레치(stretch)를 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 통합 부위는 포유류 세포의 게놈의 특정 유전자좌 내에 위치한다. 특정 구현예들에서, 상기 통합 부위는 포유류 세포의 내인성 유전자 내에 있다.
용어 "LoxP 부위"는 말단(ATAACTTCGTATA(서열번호 14) 및 TATACGAAGTTAT(서열번호 15), 각각)에서 2개의 회문 13 bp 서열(역위 반복부) 및 중심 8 bp 코어(대칭이 아님)로 이루어진 길이 34 bp의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 스페이서 서열들은 LoxP 부위의 배향을 결정한다. 서로에 대한 2개의 LoxP 부위들의 상대적 배향 및 위치에 따라, 개제(intervening) DNA가 절제되거나(LoxP 부위들이 같은 방향으로 배향됨) 역위된다(LoxP 부위들이 반대 방향으로 배향됨). "플록스트(floxed)"라는 용어는 DNA 서열이 2개의 LoxP 부위들 사이에 위치함을 나타낸다. 2개의 플록스트 서열, 즉, 게놈의 표적 플록스트 서열과 공여체 핵산의 플록스트 서열이 있는 경우, 두 서열은 서로 교환될 수 있다. 이는 "재조합효소-매개 카세트 교환"이라고 한다.
예시적인 LoxP 부위들을 다음 표에 나타낸다:
Figure pct00001
용어 “외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한 포유류 세포”는 이러한 세포들의 자손을 포함한 하나 이상의 외인성 핵산(들)이 도입된 세포를 포함한다. 이들은 추가적인 유전자 변형의 시작점이 될 수 있다. 따라서, "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한 포유류 세포"라는 용어는 상기 포유류 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 포함하며, 여기서 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 부위(이들 재조합 인식 부위들은 상이함)를 포함한다. 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포는 상기 세포의 게놈의 유전자좌 내 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포이며, 여기서 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 서열 사이에 위치한 제3 재조합 인식 서열을 포함하며, 이들 모든 재조합 인식 서열은 상이하다.
“외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포” 및 “재조합 세포”는 모두 "형질감염된 세포"이다. 이 용어는 일차 형질감염된 세포뿐만 아니라 계대의 수에 관계없이 이로부터 파생된 자손을 포함한다. 자손은, 예컨대, 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질감염된 세포에서 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
용어 "NHEJ"는 비-상동성 말단 접합(non-homologous end joining)을 의미한다. 이는 두 개의 끊어진 말단을 서로 결찰하거나 접합하는 DSB 복구 경로이다. NHEJ는 복구를 위해 상동성 주형을 사용하지 않으므로, 전형적으로 절단 부위에서 작은 삽입 및 결실의 도입을 유도하여, 종종 유전자 기능을 녹아웃하는 프레임-이동을 유도한다.
본원에서 사용된 용어 "비-호환성"은 다른 재조합효소 인식 부위, 예컨대, 예를 들어, 스페이서 영역 상동성을 공유하지 않는 제2 LoxP 부위와 재조합하지 않는 재조합효소 인식 부위, 예컨대, 예를 들어, 제1 LoxP 부위를 나타낸다. 특정 구현예들에서, 비-호환성 LoxP 부위는 스페이서 영역 상동성을 1% 미만, 바람직한 일 구현예에서 0.5% 이하로 공유하지 않는 다른 LoxP 부위와 재조합된다. 이는 cis에 연결된 2개의 비-호환성 LoxP 부위가 Cre-재조합효소의 존재하에 안정하며, 즉 최대 1%의 부위 교환, 바람직한 구현예에서 0.5% 이하의 부위 교환을 의미한다.
본원에 사용된 용어 “핵 위치화 서열”은 양으로 하전된 아미노산 잔기 아르기닌 또는/및 리신의 복제를 다수 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 서열을 포함하는 폴리펩티드는 세포 핵으로의 도입을 위한 세포에 의해 확인된다. 예시적인 핵 위치화 서열은 PKKKRKV(서열번호 09; SV40 거대 T-항원), KR[PAATKKAGQA]KKKK(서열번호 10, SV40 뉴클레오플라스민), MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN(서열번호 11; 꼬마 선충 EGL-13), PAAKRVKLD(서열번호 12, 인간 c-myc), KLKIKRPVK(서열번호 13, 대장균 말단 이용 기질 단백질)이다. 다른 핵 위치화 서열들은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
"AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산"은 일반적으로 형질도입 적격 재조합 AAV 입자를 생산하는데 사용되는 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 지칭한다. AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산은 통상적으로 AAV 복제에 필요한 결여된 AAV 기능을 보완하기 위한 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 발현을 제공하는데 사용된다; 하지만, 핵산 구조체는 AAV ITR을 결여하고 자체를 복제하거나 패키징할 수 없다. AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산은 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스 또는 입자의 형태일 수 있다. rep 및 cap 유전자 발현 생성물 둘 모두를 인코딩하는 통상적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 다수의 핵산 구조체가 기재되었다. 예컨대, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; 및 McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945를 참조한다. rep 및/또는 cap 유전자 발현 생성물을 인코딩하는 다수의 플라스미드가 기재되었다(예컨대, US 5,139,941 및 US 6,376,237). AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 이들 핵산 중 어느 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산을 포함할 수 있다.
용어 "헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산"은 일반적으로 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(들) 및/또는 아데노바이러스 헬퍼 기능(들)을 제공하는 RNA 분자를 지칭한다. 헬퍼 단백질(들)을 인코딩하는 핵산(들)을 갖는 플라스미드를 적합한 세포 내로 형질감염시킬 수 있고, 여기서 플라스미드는 상기 세포에서 AAV 입자 생성을 지지할 수 있다. 헬퍼 단백질을 인코딩하는 이들 핵산 중 어느 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산을 포함할 수 있다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두 바이러스 입자와 같이 자연에 존재함에 따라, 감염성 바이러스 입자는 상기 용어로부터 명백하게 배제된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 두 개 이상의 구성요소들의 병치를 의미하고, 여기서 상기 구성요소들은 의도된 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인헨서는 해당 프로모터 및/또는 인헨서가 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 전사를 조절하는 작용을 한다면, 해당 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예들에서, "작동가능하게 연결된" DNA 서열들은 근접해 있다. 특정 구현예들에서, 예컨대, 2개의 단백질 인코딩 영역, 예컨대, 분비 리더와 폴리펩티드를 연결시킬 필요가 있을 때, 이들 서열은 근접해 있으며, 동일한 리딩 프레임 안에 있다. 특정 구현예들에서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 상기 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 상류에 위치하며, 이에 인접해 있을 수 있다. 특정 구현예들에서, 예컨대, 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 발현을 조절하는 인헨서 서열에 대하여, 2개 구성요소는 인접하지는 않지만, 작동가능하게 연결될 수 있다. 인헨서는 해당 인헨서가 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 전사를 증가시킨다면, 해당 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인헨서는 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 상류, 내부 또는 하류에 위치할 수 있고, 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다.
용어 "패키징 단백질"은 AAV가 이의 복제에 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 AAV 유전자 전사, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립의 활성화에 관여하는 모이어티를 포함하는 AAV 복제에 필요한 단백질 및 RNA를 포획한다. 바이러스-기반 부속 기능은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(헤르페스 단순 바이러스 I형을 제외한) 및 우두 바이러스와 같은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "AAV 패키징 단백질"은 생산적 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능하는 AAV-유래 서열을 지칭한다. 따라서, AAV 패키징 단백질은 주요 AAV 오픈 리딩 프레임(ORF), rep 및 cap에 의해 인코딩된다. rep 단백질은 그 중에서도 특히 DNA 복제의 AAV 원점의 인식, 결합 및 닉킹(nicking); DNA 헬리카제 활성; 및 AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사의 조절을 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 나타났다. 캡(캡시드) 단백질은 필요한 패키징 기능을 공급한다. AAV 패키징 단백질은 AAV 벡터로부터 누락된 트랜스로 AAV 기능을 보완하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "PAM 모티프"는 프로토스페이서 인접 모티프; 프로토스페이서 인접한 모티프; 서열 NGG를 나타내며; 표적 DNA에서 표적 DNA의 절단은 PAM 전에 3개의 뉴클레오티드에서 일어난다.
"플라스미드"는 플라스미드의 발현(예컨대, 전사, 복제 등) 또는 증식(복제)을 위한 추가 요소를 전형적으로 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 한 형태이다. 본원에 사용된 바와 같은 플라스미드는 또한 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 참조하는데 사용될 수 있다. 이에 따라, 모든 양태에서 본 발명의 조성물 및 방법은 핵산, 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 플라스미드, 예컨대, 바이러스(예컨대, AAV) 벡터를 생성하는 세포를 생성하기 위한, 바이러스(예컨대, AAV) 입자를 생성하기 위한, 바이러스(예컨대, AAV) 입자를 포함하는 세포 배양 배지를 생성하기 위한 목적 등에 적용가능하다.
용어 "단백질성 화합물(proteinaceous compound)"은 포유류 세포에서 기능적 형태로 생산된 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 헤테로다량체 분자를 의미한다. 예시적인 단백질성 화합물은 캡시드 폴리펩티드로 형성된 캡시드 및 비-폴리펩티드 성분인 단일 가닥 DNA 분자를 포함하는 아데노-연관 바이러스 입자(AAV 입자)이다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 세포"는 최종 유전적 변형 후의 세포, 예컨대, 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 발현시키거나 관심 rAAV 입자 생성하는 세포를 의미하고, 임의의 규모에서 상기 관심 폴리펩티드 또는 관심 rAAV 입자의 생산에 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 재조합효소 매개된 카세트 교환(RMCE)을 겪었고, 이로 인하여 관심 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 숙주 세포의 게놈 내로 도입된 “외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포”가 “재조합 세포”이다. 비록 상기 세포는 여전히 추가 RMCE 반응을 실시할 수 있지만, 그렇게 하도록 의도된 것은 아니다.
"재조합 AAV 벡터"는 바이러스(예컨대, AAV)로부터 야생형 게놈을 제거하기 위해 분자 생물학적 방법을 사용하고, 이를 전사체로 전사되거나 단백질을 인코딩하는 핵산과 같은 비천연 핵산으로 대체함으로써 AAV와 같은 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유도된다. 전형적으로, AAV에 대해 야생형 AAV 게놈의 하나 또는 둘 모두의 역위 말단 반복부(ITR) 서열이 재조합 AAV 벡터 내에 보유된다. "재조합" AAV 벡터는 야생형 바이러스 AAV 게놈과 구별되는데, 이는 바이러스 게놈의 전부 또는 일부가 바이러스 게놈 핵산에 대해 비-천연(즉, 이종) 서열로 대체되었기 때문이다. 따라서, 비-천연 서열의 혼입은 바이러스 벡터(예컨대, AAV)를 "재조합" 벡터로서 정의하며, AAV의 경우 "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있다.
재조합 벡터(예컨대, AAV) 서열은 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위해 패키징될 수 있고, 본원에서는 "입자"로 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자 내로 캡슐화되거나 패키징되는 경우, 입자는 또한 "rAAV"로 지칭될 수 있다. 이러한 입자는 벡터 게놈을 캡슐화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는 바이러스 외피 단백질, 및 AAV의 경우, 캡시드 단백질, 예컨대 AAV VP1, VP2 및 VP3을 포함한다.
“재조합 인식 부위”(RRS)는 재조합효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열이며, 재조합효소-매개된 재조합 사례에 필요조건 및 충분조건이다. RRS는 뉴클레오티드 서열에서 재조합 이벤트가 발생할 위치를 특정하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 “선택 마커”는 해당 유전자를 휴대하는 세포가 상응하는 선별 제제의 존재하에 이 유전자를 특이적으로 선택하도록 만들거나, 또는 이 유전자에 반하게 선택되도록 유전자를 뜻한다. 예를 들어, 이에 국한되지는 않지만, 선택 마커는 각 선별 제제의 존재하에서(선택적 배양 조건) 이 선택 마커 유전자로 형질전환된 숙주 세포를 양성적으로 선택되게 할 수 있고; 비-형질전환된 숙주 세포는 이러한 선택적 배양 조건하에서 성장할 수 없거나, 또는 생존할 수 없다. 선택 마커는 양성적, 음성적, 또는 이중-기능적일 수 있다. 양의 선택 마커는 해당 마커를 유대하고 있는 세포가 선택될 수 있도록 하며, 반면 음성적 선택 마커는 해당 마커를 휴대하고 있는 세포들을 선택적으로 제거되도록 할 수 있다. 선택 마커는 약물에 대한 내성을 부여하거나, 또는 숙주 세포의 대사적 결함 또는 이화작용적 결함을 보상할 수 있다. 그 중에서도, 원핵 세포에서 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자가 사용될 수 있다. 진핵 세포에서 선택 마커로 유용한 저항성 유전자는: 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제(APH) (예를 들면, 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나아제 (TK), 글루타민 합성효소 (GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소 (히스티디놀 D)에 대한 유전자, 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신(Zeocin), 및 미코페놀산에 대한 저항성을 인코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가 마커 유전자들은 WO 92/08796 및 WO 94/28143에서 기술된다.
상응하는 선별 제제의 존재하에서 선별의 용이성을 넘어, 선택 마커는 대안적으로 해당 세포에 정상적으로 존재하지 않은 분자일 수도 있는데, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP(eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 YFP(eYFP), 청록 형광 단백질(CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean, 그리고 T-Sapphire일 수 있다. 이러한 분자를 발현시키는 세포들은, 예컨대, 인코딩된 폴리펩티드에 의해 방출된 각각 형광의 검출 또는 부재에 의해, 상기 유전자를 보유하지 세포들과 구별될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈청형"은 AAV 캡시드가 혈청학적으로 구별된다는 것에 기초한 구별이다. 혈청학적 구별성은 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체 사이의 교차-반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 이러한 교차-반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정기의 차이(예컨대, AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열 차이로 인한)에 기인한다. 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체가 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 수 있는 가능성에도 불구하고, 이들은 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 상이하다.
전통적인 정의에서, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성에 대한 모든 기존의 그리고 특징적인 혈청형들에 대해 특이적인 혈청에 대해 검사되었으며, 관심의 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않았다는 것을 의미한다. 보다 자연적으로 발생하는 바이러스 분리체(virus isolate)가 발견되고 및/또는 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 혈청형들 중 임의의 혈청형과 혈청학적 차이가 있을 수 있거나 없을 수 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예컨대, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 상기 새로운 바이러스(예컨대, AAV)는 대응하는 혈청형의 하위군 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학 시험은 아직은 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이체 바이러스에 대해 실시되어 이들이 혈청형의 전통적인 정의에 따른 다른 혈청형인지를 결정하여야 한다. 이에 따라, 편의를 위해 및 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 광범위하게 혈청학적으로 구별되는 바이러스(예컨대, AAV) 뿐만 아니라 주어진 혈청형의 하위군 또는 변이체 내에 있을 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스(예컨대, AAV) 둘 모두를 지칭한다.
용어 "sgRNA"는 단일 가이드 RNA; crRNA 및 tracerRNA를 함유하는 단일 RNA 가닥을 나타낸다.
용어 "TALENs"는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제를 나타낸다. 이들은 FokI 절단 도메인과 TALE 단백질로부터 유래된 DNA-결합 도메인의 융합체이다. TALE는 각각 단일 염기 쌍을 인식하는 다수의 33-35-아미노산 반복부 도메인을 함유한다. ZFN과 마찬가지로, TALEN은 DNA 손상 반응 경로를 활성화하고 맞춤형 변경을 가능하게 하는 표적화된 DSB를 유도한다.
용어 "tracrRNA"는 트랜스-작용성 CRISPR RNA를 나타내고; 비-코딩 RNA이고; crRNA에 부분적으로 상보적이고; RNA 이중 나선을 형성하고; crRNA 처리를 촉진하고; RNase III에 의한 활성화를 촉진하고; 표적 DNA에 결합하고; 결합 부위 근처에서 엔도뉴클레아제 기능을 절단하고; CAS9에 의한 RNA-유도 절단을 활성화시키는데 필요하다.
용어 "형질도입" 및 "형질감염"은 핵산(바이러스 벡터, 플라스미드)과 같은 분자를 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 세포는 외인성 핵산이 세포막 내부로 도입되었을 때 "형질도입" 또는 "형질감염"되었다. 이에 따라, “형질도입된 세포”는 “핵산” 또는 “폴리뉴클레오티드”가 도입된 세포 또는 외인성 핵산이 도입된 이의 자손이다. 특정 구현예들에서, "형질도입된" 세포(예컨대, 포유류에서의 세포, 예컨대, 세포 또는 조직 또는 기관 세포)는 외인성 분자, 예를 들어, 핵산(예컨대, 이식유전자)의 혼입 후에 유전적 변화를 갖는다. "형질도입된" 세포(들)가 증식될 수 있고, 도입된 핵산이 전사되고 그리고/또는 단백질이 발현될 수 있다.
"형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포에서, 핵산(바이러스 벡터, 플라스미드)은 게놈 핵산에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 핵산이 수용체 세포 또는 유기체의 핵산(게놈 DNA)으로 통합되는 경우, 이는 상기 세포 또는 유기체 내에서 안정하게 유지될 수 있고, 추가로 수용체 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체로 전달되거나 이에 의해 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 핵산은 염색체외로 또는 일시적으로만 수용체 세포 또는 숙주 유기체에 존재할 수 있다. 많은 기술들이 공지되어 있고, 예컨대, (1973) Virology, 52:456; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York; Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; and Chu et al. (1981) Gene 13:197을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다.
용어 "이식유전자"는 세포 또는 유기체 내로 도입되거나 의도된 핵산을 편리하게 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 이식유전자는 전사체로 전사되거나 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자와 같은 임의의 핵산을 포함한다.
"벡터"는 바이러스(예컨대, AAV) 입자를 형성하기 위해, 직접적으로 또는 단일 가닥 또는 RNA의 형태로 최종적으로 패키징되거나 캡슐화된 재조합 플라스미드 서열의 부분을 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 바이러스 입자를 구성하거나 제조하기 위해 사용되는 경우, 바이러스 입자는 재조합 플라스미드의 벡터 서열에 대응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이 비-벡터 부분은 "플라스미드 골격"이라고 하며, 이는 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요하며, 이 과정은 증식 및 재조합 바이러스 생산에 필요하지만, 그 자체가 바이러스(예컨대, AAV) 입자로 패키징되거나 캡슐화되지 않는다. 따라서, "벡터"는 바이러스 입자(예컨대, AAV)에 의해 패키징되거나 캡슐화되는 핵산을 지칭한다.
용어 "ZFN"은 아연-집게 뉴클레아제를 나타낸다. 이들은 FokI 제한 엔도뉴클레아제로부터의 비특이적 DNA 절단 도메인과 아연-집게 단백질의 융합체이다. ZFN 이량체는 DNA 손상 반응 경로를 자극하는 표적화된 DNA DSB를 유도한다. 설계된 아연-집게 도메인의 결합 특이성은 ZFN을 특이적 게놈 부위로 지향시킨다.
용어 "ZFN 틈내기효소"는 아연-집게 틈내기효소를 나타낸다. 이들 ZFN은 2개의 FokI 절단 도메인 중 하나에 불활성화 돌연변이를 함유한다. ZFN 틈내기효소는 단일 가닥 DNA 파괴만을 만들고 돌연변이 NHEJ 경로를 활성화하지 않고 HDR을 유도한다.
유전자 편집 방법
다양한 범위의 세포 유형 및 유기체 내의 사실상 임의의 유전자의 조작을 가능하게 하는 접근법은 지난 수십 년 동안 발전하였다. 이러한 기술을 흔히 "유전체 편집"이라고 한다.
뉴클레아제
게놈 편집을 실시하는 한 가지 방법은 조작된 뉴클레아제의 사용에 기초한다. 이들은 비-특이적 DNA 절단 모듈에 융합된 서열-특이적 DNA-결합 도메인으로 구성된다. 이러한 키메라 뉴클레아제는 오류-유발 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 및 상동성-지향의 복구(HR)를 포함하는 세포 DNA 복구 메커니즘을 자극하는 표적화된 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 유도함으로써 효율적이고 정밀한 유전자 변형을 가능하게 한다. 이들 방법의 다양성은 사실상 임의의 서열을 인식하기 위해 DNA-결합 도메인을 맞춤화하는 능력으로부터 발생한다.
따라서, 유전자 변경을 실행하는 능력은 설계된 단백질의 DNA-결합 특이성 및 친화성에 크게 의존한다(Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405).
표적화된 핵산 치환은 염색체 핵산 서열과 외인성 공여체 핵산 서열 부위-특이적 핵산 교환 사이의 상동성 재조합에 의해 도입된다. 지시된 유전적 변화를 만드는 것은 종종 "유전자 표적화"로 지칭된다(예컨대, Carroll, D., Genetics, 188 (2011) 773-782를 참조).
CRISPR/CAS 뿐만 아니라 아연-집게 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 표적화된 핵산 치환을 위한 도구를 나타낸다. 클러스터링된 일정한 간격을 둔 짧은 회문 반복부(CRISPR)/CAS-기반 RNA-유도 DNA 엔도뉴클레아제는 DNA의 서열-특이적 변형을 위해 crRNA 및 tracrRNA에 의존한다. 세 가지 유형의 CRISPR/CAS 시스템이 존재한다. II형 시스템에서, 예를 들어, CAS9는 crRNA-tracrRNA 표적 인식시 DNA를 절단하는 RNA-유도의 DNA 엔도뉴클레아제로서 작용한다.
부위-특이적 뉴클레아제를 유전자좌-특이적 상동성 아암을 갖는 공여체 플라스미드와 함께 동시전달함으로써, 단일 또는 다중 이식유전자, 즉 발현 카세트를 포함하는 외인성 핵산이 염색체 표적 유전자좌 내로 효율적으로 통합될 수 있다. 공여체 DNA의 뉴클레아제-매개 절단을 염색체 표적과 동기화시킴으로써 NHEJ-매개 결찰을 통해 거대 이식유전자(최대 14 kbps)가 다양한 내인성 유전자좌 내로 도입되었다(Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405).
이중 가닥 DNA "공여체 주형"이 공급되는 경우, 뉴클레아제-유도된 DSB의 HR을 사용하여 파괴 부위에서 또는 그 근처에서 7.6 kbps까지의 정확한 핵산 치환 또는 삽입을 도입할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 정확한 변경, 작은 삽입, 및 큰 결실을 도입하기 위해 ZFN과 함께 사용될 수 있다. ZFN은 NHEJ- 또는 HR-매개 유전자 변경을 도입하기 위해 사용되어 왔다(Joung, J.K. and Sander, J.D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (2013) 49-55).
전형적으로, 뉴클레아제-인코딩된 유전자는 플라스미드 DNA, 바이러스 벡터, 또는 시험관내 전사된 mRNA에 의해 세포 내로 전달된다. 플라스미드 DNA 또는 mRNA의 형질감염은 전기천공 또는 양이온성 지질-기반 시약에 의해 실시될 수 있다. 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터(IDLV)는 형질감염-내성의 세포 유형에 뉴클레아제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. AAV는 또한 뉴클레아제 전달을 위해 사용될 수 있다.
아연-집게 뉴클레아제(ZFN)
FokI 엔도-뉴클레아제의 비-특이적 절단 도메인(N)을 아연 집게 단백질(ZFP)과 조합하는 아연-집게-뉴클레아제는 게놈 내에 부위-특이적 이중 가닥 파괴(DSB)를 도입하는 일반적인 방법을 제공한다.
아연 집게(ZF) 모티프의 모듈형 구조 및 ZF 도메인에 의한 모듈형 인식은 이들을 인공 DNA-결합 단백질을 설계하기 위한 다용도의 DNA 인식 모티프로 만든다. 각각의 ZF 모티프는 대략 30개의 아미노산으로 구성되고, 보존된 Cys2His2 잔기에 의한 아연 이온의 킬레이션에 의해 안정화된, ßßa 구조 내로 접힌다. ZF 모티프는 a-나선을 DNA 이중 나선의 주요 홈에 삽입함으로써 DNA에 결합한다. 각각의 집게는 DNA 기질 내의 트리플렛(triplet)에 1차적으로 결합한다. 각각의 ZF 모티프의 a-나선의 시작에 대해 -1, +1, +2, +3, +4, +5 및 +6 위치에서의 주요 아미노산 잔기는 DNA 부위와의 대부분의 서열-특이적 상호작용에 기여한다. 이들 아미노산은 나머지 아미노산을 공통 백본(consensus backbone)으로서 유지하면서 변화되어 상이한 트리플렛 서열 특이성을 갖는 ZF 모티프를 생성할 수 있다. 더 긴 DNA 서열에 대한 결합은 ZFP를 형성하기 위해 이들 ZF 모티프 중 일부를 직렬로 연결함으로써 달성된다. 설계된 ZFP는 강력한 기술을 제공하는데, 그 이유는 비-특이적 FokI 절단 도메인(N), 전사 활성인자 도메인(A), 전사 억제 도메인(R) 및 메틸라아제(M)와 같은 다른 기능성이 ZFP에 융합되어 각각 ZFN, 아연 집게 전사 활성인자(ZFA), 아연 집게 전사 억제인자(ZFR) 및 아연 집게 메틸라아제(ZFM)를 형성할 수 있기 때문이다.
박테리아 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제인 FokI 제한 효소는 비-회문 펜타 디옥시-리보뉴클레오티드, 5'-GGATG-3':5'-CATCC-3'(서열번호 27)을 이중체 DNA에서 인식하고, 인식 부위의 9/13 nt 하류를 절단한다. Durai et al.은 키메라 뉴클레아제를 생성하기 위해 FokI 인식 도메인을 더 긴 DNA 서열 또는 다른 설계된 DNA-결합 모티프를 인식하는 다른 천연 발생 DNA-결합 단백질과 교환할 수 있다고 제안하였다(Durai, S., et al., Nucl. Acids Res. 33 (2005) 5978-5990).
FokI 뉴클레아제는 이량체로서 작용하고, 따라서 2개의 아연 집게 어레이는 각각의 표적 부위에 대해 설계되어야 한다. 절대적인 이종이량체 FokI 도메인의 사용은 원치않는 동종이량체 종의 형성을 감소시키고, 따라서 개선된 특이성을 갖는다(Joung, J.K. and Sander, J.D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (2013) 49-55). 따라서, ZFN 표적 부위는 FokI 절단 도메인에 의해 인식되는 5 내지 7 bp 스페이서 서열에 의해 분리된 2개의 아연-집게 결합 부위로 이루어진다(Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405).
전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)
식물 병원성 크산토모나스(Xanthomonas) 종의 전사 활성인자-유사(TAL) 이펙터와 FokI 뉴클레아제의 융합은 TALEN을 생성하였다. 이들은 결합하여 DNA를 쌍으로 절단한다. 결합 특이성은 TAL 이펙터에서 다형성 아미노산 반복부의 맞춤형 어레이(customizable array)에 의해 결정된다.
TAL 이펙터(TALE)는 핵으로 진입하고, 숙주 유전자 프로모터 내의 이펙터-특이적 서열에 결합하고 전사를 활성화한다. 이들의 표적화 특이성은 33~35개의 아미노산 반복부에 이어서 20개 아미노산의 단일 절두된 반복부의 탠덤(tandem)의 중심 도메인에 의해 결정된다. 자연 발생 인식 부위는 TAL 이펙터 활성에 요구되는 T에 의해 균일하게 선행된다(Cermak, T., et al., Nucl. Acids Res. 39 (2011) e82).
TALE 특이성은 반복부-가변 di-잔기(RVD)로 공지진 2개의 초가변 아미노산에 의해 결정된다. 아연 집게와 같이, 모듈 방식의 TALE 반복부는 인접한 DNA 서열을 인식하기 위해 함께 연결된다(Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405).
TAL 이펙터는 FokI 뉴클레아제의 촉매 도메인에 융합되어 게놈 편집을 위한 생체내 표적화된 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있다. FokI가 이량체로서 절단하기 때문에, 이들 TAL 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 쌍으로 작용하여, FokI 도메인이 함께 파괴를 생성하는 스페이서를 가로질러 대향하는 표적에 결합한다. DSB는 유전자 삽입 또는 치환에 사용될 수 있는 비-상동 말단 결합(NHEJ) 및 상동 재조합(HR)의 두 가지 고도로 보존된 과정 중 하나에 의해 거의 모든 세포에서 복구된다.
TALEN 또는 TAL 이펙터 구조체의 조립은 2개의 단계를 포함한다: (i) 반복부 모듈들을 1~10개의 반복부들의 중간 어레이들로 조립하는 단계 및 (ii) 최종 구조체를 만들기 위해 중간 어레이들을 백본으로 결합하는 단계(Cermak, T., et al., Nucl. Acids Res. 39 (2011) e82).
TALEN 표적 부위는 가변 길이(12-20 bp)의 스페이서 서열에 의해 분리된 2개의 TALE 결합 부위로 이루어진다(Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405).
전형적인 이종이량체성 표적 부위(즉, 전형적으로 천연 DNA 서열에서 발생하는 것과 같은)에 대해, 쌍을 이룬 TALEN 구조체를 함께 표적 세포로 형질전환시킨다.
표적 핵산으로 지향된 TALEN 쌍 중 하나는 적합한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 포유류 발현 플라스미드로 서브클로닝된다. 생성된 플라스미드를 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙트아민(LipofectAmine) 2000(인비트로겐)을 사용하여 형질감염시킴으로써 표적 세포 내로 도입하였다. 형질감염 후 72시간에 세포를 수집하였다(Cermak, T., et al., Nucl. Acids Res. 39 (2011) e82).
일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR-연관 단백질 9(CRISPR/CAS9)
자연 발생 CRISPR/CAS II형 시스템은 진핵 세포를 위한 강력한 유전자 편집 도구로 개발되었다. 특히, crRNA와 tracrRNA가 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 결합될 수 있다고 입증한 것은 상기 개발을 위한 발판이 되었다. Cas9는 DNA에서 단일 이중 가닥 파괴를 생성한다. 이 방법은 유전자 변경을 만드는 두 가지 방식을 제공하기 위해 진핵 세포에서 DNA 복구 경로를 이용한다. 첫 번째 방식은 절단된 말단을 결합하는 비-상동성 말단 결합(NHEJ)에 의존한다. 두 번째 방식에서는, 상동성 지향의 복구(homology directed repair, HDR)를 사용하여, 표적에 대한 상동성을 갖는 다른 DNA 조각을 사용하여 손상된 대립유전자를 복구한다. 재조합에 의해 삽입될 수 있는 DNA 요소를 제공함으로써, 임의의 유형의 삽입, 결실 또는 서열 변화가 달성될 수 있다(Rath, D., et al., Biochim. 117 (2015) 119-128).
II형 CRISPR/CAS 시스템에서, “스페이서”로 지칭되는 외래 DNA의 짧은 절편이 CRISPR 게놈 유전자좌 내에 통합되고, 전사되고 짧은 CRISPR RNA(crRNA)로 가공된다. 이들 crRNA는 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)에 어닐링되고, CAS 단백질에 의한 병원성 DNA의 직접적인 서열-특이적 절단 및 침묵을 유도한다. Cas9 단백질에 의한 표적 인식은 crRNA 내의 “종자” 서열 및 crRNA-결합 영역의 상류에서 보존된 디뉴클레오티드-함유 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM) 서열을 필요로 하는 것으로 나타났다. CRISPR/CAS 시스템은 Cas9 엔도-뉴클레아제 및 필요한 crRNA 성분을 발현하는 플라스미드의 공동-전달에 의해 인간 세포에 직접 이동 가능한 것으로 밝혀졌다(Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405).
재조합 세포주 생성
일반적으로, 관심의 단백질성 화합물, 예컨대, 예를 들어, rAAV 입자 또는 치료용 폴리펩티드의 효율적인 대규모 생산을 위해, 상기 단백질성 화합물을 안정하게 발현하고, 가능하다면 또한 분비하는 세포가 필요하다. 이러한 세포를 "재조합 세포" 또는 "재조합 생산 세포"로 지칭한다. 이러한 재조합 세포를 생성하는 과정을 세포주 개발(CLD)이라고 한다.
제1 단계에서, 적합한 숙주 세포는 상기 관심의 단백질성 화합물을 인코딩하는 필요한 핵산 서열로 형질감염된다. 추가적인 헬퍼 폴리펩티드의 형질감염이 필요할 수 있다. 제2 단계에서, 관심의 단백질성 화합물을 안정하게 발현하는 세포를 선별한다. 이는, 예컨대, 관심의 단백질성 화합물을 인코딩하는 핵산 서열로 공동-형질감염된 선택 마커의 공동-발현, 또는 단백질성 화합물 자체의 발현에 기초하여 실시될 수 있다.
코딩 서열, 즉 오픈 리딩 프레임의 발현을 위해서는, 프로모터 및 폴리아데닐화 신호(서열)와 같은 추가적인 조절 요소가 필요하다. 따라서, 오픈 리딩 프레임은 전사를 위한 상기 추가적인 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 이는 소위 발현 카세트에 통합시킴으로써 달성될 수 있다. 발현 카세트가 포유류 세포에서 기능하기 위해 필요한 최소한의 조절 요소들은 오픈 리딩 프레임의 상류, 즉 5'에 위치하는 상기 포유류 세포에서 작용하는 프로모터, 그리고 오픈 리딩 프레임의 하류, 즉 3’에 위치하는 상기 포유류 세포에서 작용하는 폴리아데닐화 신호 서열이다. 추가적으로, 종결인자 서열은 폴리아데닐화 신호(서열)의 3'에 존재할 수 있다. 발현을 위해, 프로모터, 오픈 리딩 프레임/코딩 영역 및 폴리아데닐화 신호 서열은 작동가능하게 연결된 형태로 배열되어야 한다.
마찬가지로, 비-단백질 코딩 RNA로 전사되는 핵산을 "RNA 유전자"라고 한다. 또한, RNA 유전자의 발현을 위해서는, 프로모터 및 전사 종결 신호 또는 폴리아데닐화 신호(서열)와 같은 추가적인 조절 요소가 필요하다. 이러한 요소의 성질 및 위치화는 RNA 유전자의 발현을 유도하도록 의도된 RNA 폴리머라제에 의존한다. 따라서, RNA 유전자는 또한 정상적으로 발현 카세트로 통합된다.
관심의 단백질성 화합물이 상이한(단량체성) 폴리펩티드로 구성된 이종다량체 폴리펩티드인 경우, 단일 발현 카세트가 필요할 뿐만 아니라 상이한 폴리펩티드 각각에 대해 하나씩만, 즉 오픈 리딩 프레임/코딩 서열뿐만 아니라, 존재하는 경우 RNA 유전자도 요구된다. 이들 발현 카세트는 적어도 함유된 오픈 리딩 프레임/코딩 서열에서 상이하지만, 프로모터 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열에서도 상이할 수 있다.
예를 들어, 관심의 단백질성 화합물이 전장 항체인 경우, 이는 경쇄의 2개의 복제뿐만 아니라 중쇄의 2개의 복제를 포함하는 이종다량체 폴리펩티드이고, 2개의 상이한 발현 카세트가 필요한데, 하나는 경쇄에 대한 것이고 하나는 중쇄에 대한 것이다. 만약, 예를 들어, 전장 항체가 이중특이적 항체인 경우, 즉 항체가 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 결합 부위를 포함하는 경우, 각 경쇄 및 각 중쇄는 또한 서로 상이하다. 따라서, 이중특이적 전장 항체는 4개의 상이한 폴리펩티드로 구성되며, 따라서 4개의 상이한 폴리펩티드를 인코딩하는 4개의 상이한 오픈 리딩 프레임을 함유하는 4개의 발현 카세트가 필요하다.
관심의 단백질성 화합물이 상이한 (단량체)폴리펩티드 및 단일 가닥 DNA 분자로 구성되고, 또한 생산 및 캡슐화를 위한 다른 보조인자를 필요로 하는 AAV 입자인 경우, 함유된 오픈 리딩 프레임/코딩 서열에서 상이한 다수의 발현 카세트가 필요하다. 이 경우, VA RNA 뿐만 아니라 필요한 헬퍼 기능을 위해, 이식유전자 각각에 대한 적어도 발현 카세트, AAV 벡터의 캡시드를 형성하는 상이한 폴리펩티드가 필요하다. 따라서, 헬퍼 E1A, E1B, E2A, E4orf6, VA RNA, rep 및 cap 유전자 각각에 대한 개별 발현 카세트가 필요하다.
이전 단락에 개략된 바와 같이, 관심의 단백질성 화합물이 더 복잡할수록 또는 추가의 요구되는 헬퍼 폴리펩티드 및/또는 RNA의 수가 각각 더 많을수록, 요구되는 상이한 발현 카세트의 수가 더 많다. 본질적으로 발현 카세트의 수와 함께, 숙주 세포의 게놈에 통합될 핵산의 크기도 증가한다. 하지만, 전달될 수 있는 핵산의 크기에 대한 실제적인 상한선은 약 15 kbps(킬로-염기쌍)의 범위이다. 상기 한도를 초과하면 처리 및 처리 효율성이 크게 떨어진다. 이 문제는 2개 이상의 발현 벡터를 사용하여 해결할 수 있다. 이에 의해, 상이한 발현 카세트가 상이한 핵산에 할당되고, 따라서 각각의 핵산은 단지 일부의 발현 카세트를 배타적으로 포함한다.
세포주 개발을 위해, 관심의 단백질성 화합물에 대한 발현 카세트를 보유하는 핵산(들)의 무작위 통합(RI)이 사용될 수 있다. 일반적으로, RI를 사용함으로써 핵산 또는 이의 단편은 숙주 세포의 게놈에 무작위로 통합된다.
대안적으로, RI에 대해, 표적화된 통합(TI)이 CLD를 위해 사용될 수 있다. TI CLD에서, 상이한 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 핵산(들)은 숙주 세포의 게놈 내 소정의 유전자좌에 도입된다.
TI에서, 상동성 재조합 또는 재조합 매개된 카세트 교환 반응(RMCE)은 각각의 발현 카세트를 포함하는 핵산(a)을 TI 숙주 세포의 게놈 내 특정 유전자좌 내로 통합시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예들에서, 이후 단백질성 화합물을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 이후 상기 단백질성 화합물을 생산하는, (숙주)포유류 세포의 게놈 내로 단일 디옥시리보 핵산을 표적화 통합하는 방법(즉, 재조합 포유류 세포를 생산하는 방법)으로서, 하기의:
a) 포유류 세포의 게놈의 유전자좌 내의 정의된(임의적으로 단일) 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 제1 및 제2 재조합 서열을 포함하며, 이에 의해 모든 재조합 서열은 상이하거나 그리고/또는 비-호환성인(즉, 이들은 교차-교환 반응을 일으키지 않음), 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 포유류 세포 내로, 2개의 상이한 재조합 서열 및 1 내지 8개의 발현 카세트를 포함하는 디옥시리보 핵산을 도입하는 단계로서,
상기 디옥시리보 핵산은 5'에서 3' 방향으로(하기의 순서로),
- 제1 재조합 서열,
- 이 중 하나의 발현 카세트는 하나의 제2 선택 마커를 인코딩하는, 1 내지 8개의 발현 카세트(들), 및
- 제2 재조합 서열을 포함하고,
여기서 디옥시리보 핵산의 제1 및 제2 재조합 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 및 제2 재조합 서열과 매칭되는, 단계;
c) 임의적으로, 단계 b)에서 수득된 상기 포유류 세포내로 상기 제1 및 제2 재조합 서열에 대하여 작용하는 재조합효소(제1 및 제2 재조합 서열 사이의 상기 외인성 뉴클레오티드 서열의 일부를 제1 및 제2 재조합 서열 사이의 상기 디옥시리보 핵산의 일부와 교환시켜 후자를 상기 포유류 세포의 게놈 내로 통합시킴)를 도입하거나 상기 포유류 세포에서 활성화시키는, 단계;
d) 임의적으로, 상기 제2 선택 마커를 발현하는 세포를 선택하고, 도입된 디옥시리보 핵산에 의해 인코딩되는 단백질성 화합물을 생산하는 단계을 포함하고,
이로써 단백질성 화합물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 제조하고, 상기 단백질성 화합물을 생산하는, 방법이 제공된다.
특정 구현예들에서, 단백질성 화합물을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 임의적으로 상기 단백질성 화합물을 발현하는, (숙주)포유류 세포의 게놈 내로 2개의 디옥시리보 핵산을 동시 표적화 통합하는 방법(즉, 재조합 포유류 세포를 생산하는 방법)으로서, 하기의:
a) 포유류 세포의 게놈의 유전자좌 내의 정의된(임의적으로 단일) 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포를 제공하는 단계로서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 제1 및 제2 재조합 서열, 및 제1 및 제2 재조합 서열 사이에 위치된 제3 재조합 서열을 포함하며, 모든 재조합 서열은 상이하거나 그리고/또는 비-호환성인(즉, 이들은 교차-교환 반응을 일으키지 않음), 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 세포 내로, 3개의 상이한 재조합 서열 및 1 내지 8개의 발현 카세트를 포함하는 2개의 디옥시리보 핵산의 조성물을 도입하는 단계로서,
제1 디옥시리보 핵산은 5'에서 3' 방향으로(하기의 순서로),
- 제1 재조합 서열,
- 하나 이상(바람직한 일 구현예서는 최대 4개)의 발현 카세트(들),
- 하나의 제2 선택 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분, 및
- 제3 재조합 서열의 제1 복제를 포함하며,
그리고
제2 디옥시리보 핵산은 5'에서 3' 방향으로(하기의 순서로),
- 제3 재조합 서열의 제2 복제,
- 하나의 제2 선택 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-말단 부분,
- 하나 이상(바람직한 일 구현예서는 최대 4개)의 발현 카세트(들), 및
- 제2 재조합 서열을 포함하고,
여기서 제1 및 제2 디옥시리보 핵산의 제1 내지 제3 재조합 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 내지 제3 재조합 서열과 일치하고,
여기서 하나의 제2 선택 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5'-말단 부분 및 3'-말단 부분은 함께 하나의 제2 선택 마커의 기능적 발현 카세트를 형성하는, 단계;
c) 임의적으로, 단계 b)에서 수득된 상기 포유류 세포내로 상기 제1, 제2 및 제2 재조합 서열에 대하여 작용하는 재조합효소(제1 및 제3 재조합 서열 사이의 상기 외인성 뉴클레오티드 서열의 일부뿐만 아니라 제3 및 제2 재조합 서열 사이의 일부를 제1 및 제3 재조합 서열 사이뿐만 아니라 제3 및 제2 재조합 서열의 상기 디옥시리보 핵산의 일부와 교환시켜 후자를 상기 포유류 세포의 게놈 내로 통합시킴)를 도입하거나 상기 포유류 세포에서 활성화시키는, 단계;
d) 임의적으로, 제2 선택 마커를 발현하는 세포를 선택하고, 임의적으로, 도입된 디옥시리보 핵산에 의해 인코딩되는 단백질성 화합물을 생산하는 단계을 포함하고,
이로써 단백질성 화합물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 생산하는, 방법이 제공된다.
선택 압력을 증가시키기 위해, 제1 선택 마커는 음성 선택 마커, 예컨대, 예를 들어, 특정 구현예들에서, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제(5-요오도-2'-플루오로-2'-디옥시-1-β-D-아라비노-푸로노실 우라실(FIAU) 또는 간시클로비르와 같은 티미딘 유사체에 민감한 세포를 생성시킴) 또는 코리네박테리움 디프테리아로부터의 디프테리아 독소 단편 A(단백질 합성을 억제함으로써 독성을 야기함; 예를 들어, 포스포글리세레이트 키나아제 프로모터(PGK)-유도된 디프테리아 독소 A 단편 유전자의 발현에 의해 독성을 야기함)이다. 도입된 디옥시리보 핵산과의 교환 동안, 음성 선택 마커가 제거된다. 이는 정확한 표적화된 통합과 정확하지 않은 무작위 통합 사이의 구별을 가능하게 한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 발현 카세트의 각각은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 오픈 리딩 프레임/코딩 서열 또는 RNA 유전자 및 폴리아데닐화 신호 서열, 및/또는 종결인자 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 인코딩하고, 발현 카세트는 추가의 종결인자 서열을 갖거나 갖지 않는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 발현 카세트는 RNA 유전자를 포함하고, 프로모터는 2형 Pol III 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열 또는 폴리U 종결인자가 존재한다. 예컨대, Song et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 323 (2004) 573-578을 참조한다. 특정 구현예들에서, 발현 카세트는 RNA 유전자를 포함하고, 프로모터는 2형 Pol III 프로모터 및 폴리U 종결인자 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 인코딩하고, 프로모터는 인트론 A를 갖거나 갖지 않는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH(소 성장 호르몬) 폴리A 신호 서열이고, 종결인자는 hGT(인간 가스트린 종결인자)이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 프로모터는 인트론 A를 갖는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 종결인자는 RNA 유전자의 발현 카세트 및 선택 마커의 발현 카세트를 제외하고는 hGT이고, 여기서 선택 마커에 대해 프로모터는 SV40 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이고, 종결인자는 부재하고, RNA 유전자에 대해 프로모터는 야생형 2형 중합효소 III 프로모터이고, 종결인자는 중합효소 II 또는 III 종결인자이다.
모든 이전의 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 인간 CMV 프로모터는 서열번호 28의 서열을 갖는다. 특정 구현예들에서, 상기 인간 CMV 프로모터는 서열번호 29의 서열을 갖는다. 특정 구현예들에서, 상기 인간 CMV 프로모터는 서열번호 30의 서열을 갖는다.
모든 이전의 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, bGH 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 31이다.
모든 이전의 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, hGT는 서열번호 32의 서열을 갖는다.
모든 이전의 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, SV40 프로모터는 서열번호 33의 서열을 갖는다.
모든 이전의 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, SV40 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호 34이다.
본 발명은 아데노바이러스 유전자 기능 E1A 및 E1B에 대한 핵산 서열 및 동시에 SV40 거대 T-항원 또는 엡스타인바 바이러스(EBV) 핵 항원 1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열을 포함하는 영구 인간 세포주를 포함하지 않는다는 것을 주목해야 한다.
상동성 재조합
특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 상동 재조합에 의해 매개된다.
상동 재조합에 의한 표적화된 통합은 당업계에서 확립된 기술이다. 예를 들어, 30년 이상 동안 상동 재조합은 쥐과 배아 줄기 세포에서 부위-특이적 방식으로 특이적 유전자 변형을 도입하는데 사용되어 왔다(Doetschman, T., et al., Nature 330 (1987) 576-578; Thomas, K.R. and Capecchi, M.R., Cell 51 (1987) 503-512; Thompson, S., et al., Cell 56 (1989) 313-321; Zijlstra, M., et al., Nature 342 (1989) 435-438; Bouabe, H. and Okkenhaug, K., Meth. Mol. Biol. 1064 (2013) 315-336).
표적화된 통합을 위한 상동 재조합의 사용의 경우, 재조합 서열은 외인성 핵산 서열에 상동인 서열이며 "상동성 아암(homology arms)"으로 지칭된다. 이 경우, 숙주 세포 내로 도입된 디옥시리보 핵산은 제1 재조합 서열로서 외인성 핵산 서열(즉, 랜딩 부위)에 대해 서열 5'(상류)에 상동인 서열을 포함하고, 제2 재조합 서열로서 외인성 핵산 서열에 대해 서열 3'(하류)에 상동인 서열을 포함한다. 일반적으로, 표적화된 통합 빈도는 상동성 아암의 동질 유전자성뿐만 아니라 길이에 따라 증가한다. 이상적으로, 상동성 아암은 각각의 숙주 세포로부터 생산된 게놈 DNA로부터 유래된다.
뉴클레아제
특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 매개되는 상동 재조합에 의한 것이다.
특정 구현예들에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR 연관된 단백질-9 뉴클레아제(Cas9) 시스템으로부터 선택된다.
뉴클레아제-인코딩 유전자는 플라스미드 DNA, 바이러스 벡터, 또는 시험관내 전사된 mRNA에 의해 세포 내로 전달된다. 플라스미드 DNA 또는 mRNA의 형질감염은 전기천공 또는 양이온성 지질-기반 시약에 의해 실시될 수 있다. 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터는 형질감염-내성의 세포 유형에 뉴클레아제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터는 또한 뉴클레아제 전달을 위해 사용될 수 있다.
재조합효소
재조합 시스템, 예컨대, Cre/LoxP 또는 Flp/FRT는 상이한 핵산 분자 사이의 부분 핵산 서열의 교환, 핵산 분자로부터의 핵산 단편의 절제, 또는 핵산 분자 내의 부분의 역위를 위해 사용될 수 있다. 재조합효소의 작용의 결과는 단일 온/오프-이벤트를 사용하여 영구적일 수 있고, 이는 정의된, 하지만 제한된 기간 동안일 수 있고, 이는 정의된, 및 그에 의해, 특정 세포 유형 또는 조직으로 조정될 수 있다.
Flp-재조합효소
Flp/FRT 부위-특이적 재조합 시스템은 재조합효소 플리파아제(Flp)에 의해 플리파아제 인식 표적(FRT) 부위 사이의 서열의 재조합을 포함한다. 플립파아제는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 유래한다. Flp의 서열은, 예컨대, 유니프롯(UniProt) P03870으로부터 입수가능하다. 34 bp FRT 부위는 GAAGTTCCTATTCtctagaaaGAATAGGAACTTC(서열번호 36; 소문자 중심 스페이서 서열)의 서열을 가지고, 여기서 Flp-재조합효소는 8 bp 중심 스페이서 서열에 측접하는 GAAGTCCTATTC(정방향 서열번호 37; 역방향 서열번호 38)의 역위 13 bp 반복부에 결합한다.
예시적인 FRT 부위가 하기의 표에 나타나 있다(Branda and Dymecki, Dev. Cell 6 (2004) 7-28을 참조):
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Cre-재조합효소
Cre-LoxP 부위-특이적 재조합 시스템은 많은 생물학적 실험 시스템에서 널리 사용되었다. Cre-재조합효소는 34 bp의 LoxP 서열을 인식하는 38-kDa 부위-특이적 DNA 재조합효소이다. Cre-재조합효소는 박테리오파지 P1에서 파생되며, 티로신 계열 부위-특이적 재조합효소에 속한다. Cre-재조합효소는 LoxP 서열 사이의 분자내 재조합 및 분자간 재조합 모두를 매개할 수 있다. 정준 LoxP 서열은 2개의 13 bp 역위 반복부에 의해 측접된 8 bp의 비-회문 스페이서 서열로 구성된다. Cre-재조합효소는 상기 13 bp의 반복부에 결합하고, 이로 인하여 8 bp의 스페이서 서열 내 재조합을 매개한다. Cre/LoxP-매개된 재조합은 고효율로 발생하며, 다른 숙주 요소가 필요하지 않다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상의 동일한 배향에 위치한다면, Cre-재조합효소-매개된 재조합은 2개의 LoxP 서열 사이에 위치한 DNA 서열을 공유적으로 닫힌 원으로 절단시킨다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상에 역위/상호 배향에 배치된다면, Cre-재조합효소-매개된 재조합은 상기 2개의 LoxP 서열 사이에 위치한 DNA 서열의 배향을 역위시킬 것이다. 만약 2개의 LoxP 서열이 상이한 2개의 DNA 분자 상에 있고, 한 개 DNA 분자가 원형이라면, Cre-재조합효소-매개된 재조합으로 원형 DNA 서열을 통합시킬 것이다.
Cre-재조합효소는 임의의 공지된 방법으로 세포 내로 도입되거나 세포 내에서 활성화될 수 있다. 예를 들어, 리포좀-기반 유전자 전달(WO 93/24640; Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (1988) 682-691; US 5,279,833; WO 91/06309; Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (9871) 7413-7414), 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 유두종 바이러스, 레트로 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터(예컨대, Berns et al., Ann. NY Acad. Sci. 772 (1995) 95-104; Ali et al., Gene Ther. 1 (1994) 367-384; Haddada et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199 (1995) 297-306; Buchscher et al., J. Virol. 66 (1992) 2731-2739; Johann et al., J. Virol. 66 (1992) 1635-1640; Sommerfelt et al., Virol. 176 (1990) 58-59; Wilson et al., J. Virol. 63 (1989) 2374-2378; Miller et al., J. Virol. 65 (1991) 2220-2224; WO 94/26877; Rosenburg and Fauci in Fundamental Immunology, Third Edition Paul (ed.) Raven Press, Ltd., New York (1993) 및 이의 참조; West et al., Virology 160 (1987) 38-47; US 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5 (1994) 793-801; Muzyczka, J. Clin. Invest. 94 (1994) 1351; US 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3251-3260; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4 (1984) 2072-2081; Hermonat and Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6466-6470; Samulski et al., J. Virol. 63 (1989) 3822-3828)을 사용하는 것이다.
예를 들어, Cre-재조합효소를 발현하는 혈청형 2의 재조합 AAV 벡터는 Li, X., et al. (PLOS ONE 7 (2012) e50063) 및 Scammell, E., et al. (J. Neurosci. 23 (2003) 5762 - 5770)에 의해 기재되어 있다. 이 rAAV-Cre를 사용하여 표적 LoxP 부위의 매우 완전한 재조합이 유도될 수 있다. rAAV 벡터-기반 전달의 경우, 또한 Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158 (1992) 97-129; US 4,797,368; WO 91/18088; Samulski, Current Opinion in Genetic and Development 3 (1993) 74-80을 참조한다.
예를 들어, Cre-재조합효소 발현 플라스미드가 사용될 수 있다.
예를 들어, mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소가 사용될 수 있다.
다수의 기능적 LoxP 부위, 예컨대, 예를 들어, Lox511, Lox66, Lox11, Lox76, Lox75, Lox43, Lox44(예컨대, Hoess, R., et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 2287-2300; Albert, H., et al., Plant J. 7 (1995) 649-659를 참조)가 공지되어 있다.
예를 들어, Cre-재조합효소가 사용되는 경우, 교환될 서열은 게놈 내에서 뿐만 아니라 공여체 핵산 내에서 2개의 LoxP 부위의 위치에 의해 정의된다. 이러한 LoxP 부위는 Cre-재조합효소에 의해 인식된다. 더 이상 필요한 것은 없는데, 즉, ATP 등이 없다.
Cre/LoxP 시스템은 포유류, 식물, 박테리아 및 효모와 같은 다양한 세포 유형에서 작동한다.
재조합효소를 이용한 표적화된 통합
특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 재조합효소 매개 카세트 교환 반응(RMCE)에 의한 것이다.
이는 게놈의 통합 부위에 있는 서열이 공여체 핵산으로 교환되는 효소적 과정이다. Cre-재조합효소, Flp-재조합효소, Bxb1-인테그라제, pSR1-재조합효소, 또는 ΦC31-인테그라제와 같은 임의의 재조합효소가 상기 공정에 사용될 수 있다.
하나의 구체적인 TI 방법은 이중 재조합효소 매개 카세트 교환(이중 RMCE)이다.
이중 RMCE는 단일 유전자좌에서 숙주 세포의 게놈 내로 2개의 핵산 서열의 재조합 효소-매개 도입에 의해 관심의 단백질성 화합물을 인코딩하는 디옥시리보 핵산을 포함하는 재조합 포유류 세포를 생산하는 방법이다. 통합 후, 2개의 핵산 서열은 서로 작동가능하게 연결된다.
예를 들어, 비제한적으로, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열, 즉 TI 랜딩 부위는 2개의 재조합 인식 부위(RRS)를 포함할 수 있는 반면, (공여체)핵산 서열은 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 RRS와 매칭되는 2개의 RRS를 포함한다. 이러한 단일-플라스미드 RMCE 전략은 RRS의 쌍 사이의 각각의 서열에 적절한 수의 발현 카세트를 통합함으로써 다중 오픈 리딩 프레임의 도입을 허용한다.
예를 들어, 비제한적으로, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열, 즉 TI 랜딩 부위는 3개의 재조합 인식 부위(RRS)를, 예컨대, 제3 RRS(“RRS3”)가 제1 RRS(“RRS1”) 및 제2 RRS(“RRS2”) 사이에 존재하는 배열로 포함할 수 있는 반면, 제1(공여체) 핵산은 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제1 및 제3 RRS에 매칭되는 2개의 RRS를 포함하고, 제2(공여체) 핵산은 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열 상의 제3 및 제2 RRS에 매칭되는 2개의 RRS를 포함한다. 이러한 이중 RMCE 전략은 RRS의 각 쌍 사이의 각각의 서열에 적절한 수의 발현 카세트를 통합함으로써 다중 오픈 리딩 프레임의 도입을 허용한다.
또한, 2개의 플라스미드 RMCE에는 2개의 선택 마커가 필요하다. 1개의 선택 마커 발현 카세트는 두 부분으로 갈라진다. 제1(전면) 핵산은 프로모터에 이어서 번역 시작 코돈 및 RRS3 서열을 함유할 것이다. 제2(후면) 핵산은 이에 상응하게 번역 시작 코돈(예컨대, ATG)을 제외한, 선택 마커 코딩 서열의 N-말단에 융합된 RRS3 서열을 포함한다. 추가적인 뉴클레오티드는 융합 단백질, 즉 작동가능한 연결로부터 프레임 내 번역을 보장하기 위해 RRS3 부위와 선택 마커 코딩 서열 사이에 삽입될 필요가 있을 수 있다. 두 핵산(전면 및 후면) 모두가 올바르게 삽입된 경우에만, 해당 선택 마커의 전체 발현 카세트가 조립되며, 따라서 세포에게 각각의 선별 제제에 저항성이 부여된다.
단일 및 이중 RMCE 둘 모두를 통해, 공여체 DNA에 존재하는 DNA 서열을 통합 부위가 존재하는 포유류 세포의 게놈 내 DNA 서열과 정확하게 교환하여 포유류 세포 게놈의 소정의 부위에 하나 이상의 공여체 DNA 분자(들)을 통합할 수 있게 된다. 이들 DNA 서열은 i) 적어도 하나의 선택 마커 또는 특정 2-플라스미드 RMCE에서 "분할 선택 마커" 및/또는 ii) 적어도 하나의 외인성 관심 유전자에 측접한 2개의 이종특이적 RRS를 특징으로 한다.
RMCE는 표적 게놈 유전자좌 내부의 2개의 이종특이적 RRS와 공여체 DNA 분자 사이에 재조합효소에 의해 촉매되는 이중 재조합 교차 이벤트를 포함한다. 이중 RMCE는 전방 및 후방 핵산으로부터의 DNA 서열 복제를 포유류 세포 게놈의 소정의 유전자좌로 조합하여 도입하도록 설계된다. 상기 RMCE 절차는 다중 DNA 서열로 반복될 수 있다.
특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 이중 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 2개의 이종특이적 RRS에 의해 측접된 적어도 하나의 선택 마커 또는 이의 일부 및/또는 관심 단백질성 화합물의 일부를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트를 각각 포함하는 2개의 상이한 DNA 서열이 모두 TI에 적합한 포유류 세포 게놈의 소정의 부위에 통합된다. 특정 구현예들에서, 표적화된 통합은 다수의 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 2개의 이종특이적 RRS에 의해 측접된 적어도 하나의 선택 마커 또는 이의 일부 및/또는 관심 단백질성 화합물의 일부를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 카세트를 각각 포함하는 다수의 핵산으로부터의 DNA 서열 모두가 TI에 적합한 포유류 세포 게놈의 소정의 부위에 통합된다. 특정 구현예들에서, 상기 선택 마커는 제1 핵산(전면) 상에 부분적으로 인코딩될 수 있고, 제2 핵산(후면) 상에 부분적으로 인코딩될 수 있고, 따라서 이중 RMCE에 의한 핵산 둘 모두가 올바르게 통합되어야만, 이들 선택 마커의 발현이 허용된다.
단일 RMCE 및 이중 RMCE의 경우, 수용체/표적 세포의 게놈 내로의 공여체 핵산의 표적화된 통합 방법뿐만 아니라 상기 개요된 수용체/표적 세포의 게놈 내로의 2개의 공여체 핵산의 동시 표적화된 통합 방법은 재조합효소를 도입/활성화시키는 추가의 단계를 포함한다.
따라서, 특정 구현예들에서, 재조합 서열은 재조합 인식 서열이며, 상기 방법은 하기의:
c) 재조합 효소를,
i) b)의 디옥시리보 핵산의 도입과 동시에,
또는
ii) 순차적으로 그 이후에
도입 또는 활성화하는 단계로서,상기 재조합 효소는 상기 제1 및 제2 디옥시리보 핵산의 재조합 인식 서열들을 인식하는;(그리고 임의적으로 하나 이상의 재조합 효소는 재조합 효소 매개 카세트 교환을 실시하는) 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, RRS는 LoxP 서열, L3 서열, 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, F3 서열, F5 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 및 φC31 attB 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다수의 RRS가 존재해야 하는 경우, 동일하지 않은 RRS가 선택되는 한, 각 서열의 선택은 서로 연관된다.
특정 구현예들에서, RRS는 Cre-재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 Flp-재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 Bxb1-인테그라제에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 φC31-인테그라제에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, RRS는 pSR1-재조합효소에 의해 인식될 수 있다.
RRS가 LoxP 부위에 있는 특정 구현예들에서, 세포는 재조합을 실시하기 위해 Cre-재조합효소를 필요로 한다.
RRS가 FRT 부위에 있는 특정 구현예들에서, 세포는 재조합을 실시하기 위해 Flp-재조합효소를 필요로 한다.
RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위에 있는 특정 구현예들에서, 세포는 재조합을 실시하기 위해 Bxb1-인테그라제를 필요로 한다.
특정 구현예들에서 RRS가 φC31 attP 또는 φC31 attB 부위인 경우, 세포는 재조합을 실시기 위해 φC31-인테그라제를 필요로 한다.
특정 구현예들에서 RRS가 지고사카로미세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1-재조합효소에 대한 인식 부위인 경우, 세포는 재조합을 실시하기 위해 pSR1-재조합효소를 필요로 한다.
재조합효소-인코딩 유전자는 DNA로서, 바이러스 벡터에 의해, 또는 mRNA로서 세포 내로 전달될 수 있다. DNA 또는 mRNA의 형질감염은 전기천공 또는 양이온성 지질-기반 시약에 의해 실시될 수 있다. 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터는 형질감염-내성의 세포 유형에 재조합효소를 전달하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터는 또한 재조합효소 전달을 위해 사용될 수 있다. 재조합효소 단백질은 또한 노노베시클(nonovesicle)에 의해 도입될 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 재조합효소는 mRNA로서 세포 내로 도입된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 재조합효소는 DNA로서 숙주 세포 내로 도입된다. 특정 구현예들에서, DNA는 발현 카세트에 포함된 재조합효소 인코딩 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 재조합효소는 Cre-재조합효소이고, Cre-재조합효소는 서열번호 07의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소로서 세포 내로 도입된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, Cre-재조합효소 mRNA는 서열번호 07의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 이의 N- 또는 C-말단 또는 둘 모두에 핵 위치화 서열을 추가로 포함한다. 특정 구현예들에서, Cre-재조합효소 mRNA는 서열번호 07의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 이의 N- 또는 C-말단 또는 둘 모두에서 서로 독립적으로 1개 내지 5개의 핵 위치화 서열을 추가로 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소는 서열번호 08의 뉴클레오티드 또는 상이한 코돈 사용을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소는 서열번호 08의 뉴클레오티드 서열 또는 상이한 코돈 사용을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 이의 5'- 또는 3'-말단에 또는 둘 모두에 핵 위치화 서열을 인코딩하는 추가의 핵산을 추가로 포함한다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소는 서열번호 08의 뉴클레오티드 서열 또는 상이한 코돈 사용을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 이의 5'- 또는 3'-말단에 또는 둘 모두에서 서로 독립적으로 핵 위치화 서열을 인코딩하는 1개 내지 5개의 핵산을 추가로 포함한다.
특정 구현예들에서, LoxP 서열은 야생형 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, LoxP 서열은 돌연변이 LoxP 서열이다. Cre-재조합효소-매개 통합 또는 치환의 효율성을 증가시키기 위한 돌연변이 LoxP 서열들이 개발되었다. 특정 구현예들에서, 돌연변이 LoxP 서열은 L3 서열, 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, 및 Lox66 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, Lox71 서열은 왼쪽 13 bp 반복부에서 5 bp 돌연변이된다. Lox66 서열은 오른쪽 13 bp 반복부에서 5 bp 돌연변이된다. 야생형 및 돌연변이 LoxP 서열 둘 모두는 Cre-재조합효소-의존성 재조합을 매개할 수 있다.
"RRS들을 매칭시킨다"라는 용어는 두 개의 매칭 RRS들 사이에 재조합이 일어나는 것을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 상기 2개의 매칭 RRS들은 동일하다. 특정 구현예들에서, 이들 두 RRS들은 모두 야생형 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, 이들 두 RRS들은 돌연변이 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, 이들 두 RRS들은 야생형 FRT 서열이다. 특정 구현예들에서, 이들 두 RRS들은 돌연변이 FRT 서열이다. 특정 구현예들에서, 상기 2개의 매칭 RRS들은 상이한 서열이지만, 동일한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 매칭 RRS는 Lox71 서열이며, 상기 제2 매칭 RRS는 Lox66 서열이다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 매칭 RRS는 Bxb1 attP 서열이며, 상기 제2 매칭 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 매칭 RRS는 φC31 attB 서열이며, 상기 제2 매칭 RRS는 φC31 attB 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 이중 RMCE에서의 재조합 인식 부위는 L3, 2L 및 LoxFas이다.
특정 구현예들에서, L3은 스페이서 서열로서 서열번호 17의 서열을 포함하고, 2L은 스페이서 서열로서 서열번호 18의 서열을 포함하며, LoxFas는 스페이서 서열로서 서열번호 19의 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 제1 재조합 인식 서열은 L3이고, 제2 재조합 인식 서열은 2L이며, 제3 재조합 인식 서열은 LoxFas이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 선택 마커를 인코딩하는 발현 카세트는 제3 재조합 인식 서열에 대해 부분적으로 5' 및 부분적으로 3'에 위치하고, 여기서 상기 발현 카세트의 5'-위치 부분은 프로모터 및 번역 개시-코돈을 포함하고 상기 발현 카세트의 3'-위치 부분은 폴리A 신호 서열 및 번역 개시 코돈이 없는 코딩 서열을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 선택 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 5’-위치 부분은 번역 개시 코돈에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 이에 의해 프로모터 서열은 상류에서 제2, 제3 또는 제4 발현 카세트에 각각 측접되고(즉, 제2, 제3 또는 제4 발현 카세트에 대해 하류에 위치) 개시 코돈은 하류에서 제3 재조합 인식 서열에 측접되며(즉, 제3 재조합 인식 서열의 상류에 위치); 그리고 선택 마커를 인코딩하는 발현 카세트의 3'-위치 부분은 번역 개시 코돈이 없는 선택 마커를 인코딩하는 핵산을 포함하며 상류에서 제3 재조합 인식 서열에 측접되고, 이후 하류에서 제3, 제4 또는 제5 발현 카세트에 각각 측접된다.
본원에 기재된 바와 같은 외인성 핵산("랜딩 부위")을 포함하는 표적화된 통합에 적합한 임의의 공지된 또는 공지될 포유류 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 바람직한 일 구현예에서, 포유류 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포는, 특정 구현예들에서, CHO 세포이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 게놈의 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 포유류 세포는 Cre-재조합효소 매개 카세트 교환을 위한 3개의 이종특이적 LoxP 부위를 포함하는 랜딩 부위(= 포유류 세포의 게놈 유전자좌 내의 단일 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열)를 보유하는 CHO 세포 또는 HEK293 세포 또는 Per.C6 세포이다. 특정 구현예들에서, 상기 이종특이적 LoxP 부위는 L3, LoxFas 및 2L이고(예컨대, Lanza et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 898-908; Wong et al., Nucleic Acids Res. 33 (2005) e147을 참조), 이로써 L3 및 2L은 각각 5’-말단 및 3’-말단에서 랜딩 지점에 측접하거나, 또는 그 반대이며, LoxFas는 L3 및 2L 부위 사이에 위치한다. 모든 양태 및 구현예의 바람직한 일 구현예에서, 상기 랜딩 부위는 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 위해 IRES를 통하여 선택 마커의 발현에 연계된 바이시스트로닉 단위를 더 함유하고, 이로써 양의 선택에 의해 해당 랜딩 부위를 안정하시킬 뿐만 아니라 형질감염 및 Cre-재조합효소-매개 재조합(음의 선택) 후 해당 부위의 부재에 대해 선택이 가능하다. 예시적인 GEP는 서열번호 35의 서열을 갖는다.
이전 단락에서 개괄된 랜딩 부위의 이러한 구성을 통해, L3 및 LoxFas 부위를 갖는 소위 전방 벡터와 LoxFas 및 2L 부위를 포함하는 후방 벡터인 상이한 플라스미드 내에 포함된 두 핵산의 동시 통합이 가능하다. 랜딩 부위에 존재하는 것과 상이한 선택 마커 유전자의 기능적 요소들은 두 핵산 사이에 분포되어 있고: 프로모터와 번역 개시 코돈은 전방 핵산에 위치하는 반면, 코딩 영역과 폴리 A 신호는 후방 핵산에 위치한다. 상기 핵산 둘 모두의 정확한 Cre-재조합효소-매개 통합만이 각각의 선별 제제에 대한 내성을 유도한다.
일반적으로, TI에 적합한 포유류 세포는 이의 게놈 유전자좌 내의 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유류 세포이고, 여기서 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 제1 선택 마커에 측접하는 적어도 제1 및 제2 재조합 인식 서열, 및 상기 제1 및 제2 재조합 인식 부위 사이에 위치하는 제3 재조합 인식 부위를 포함하며, 상기 모든 재조합 인식 부위는 상이하다. 상기 외인성 뉴클레오티드 서열을 "랜딩 부위"라고 한다.
본원에 개시된 발명의 요지는 외인성 뉴클레오티드 서열의 TI에 적합한 포유류 세포를 사용한다. 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유류 세포는 포유류 세포의 게놈의 통합 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. TI에 적합한 이러한 포유류 세포는 “TI 숙주 세포”를 의미할 수도 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유류 세포는 랜딩 부위를 포함하는 햄스터 세포, 인간 세포, 랫트 세포, 또는 마우스 세포이다. 특정 구현들에서, TI에 적합한 포유류 세포는 각각의 랜딩 부위를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO K1 세포, CHO K1SV 세포, CHO DG44 세포, CHO DUKXB-11 세포, CHO K1S 세포, CHO K1M 세포, 인간 세포, HEK293 세포, 또는 Per.C6 세포이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유류 세포는 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 서열(RRS)을 포함한다. 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. RRS는 재조합효소, 예를 들어, Cre-재조합효소, Flp-재조합효소, Bxb1-인테그라제, 또는 φC31-인테그라제에 의해 인식될 수 있다. RRS는 LoxP 부위, L3 부위, 2L 부위, LoxFas 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, FRT 부위, F3 부위, F5 부위, Bxb1 attP 부위, Bxb1 attB 부위, ΦC31 attP 부위, 및 ΦC31 attB 부위로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 선택 마커는 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제(APH)(예컨대, 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 조이신, 및 미코페놀산에 대한 저항성을 인코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 서로 독립적으로 선택될 수 있다. 상기 선택 마커(들)은 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화된 GFP (eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질 (YFP), 강화된 YFP (eYFP), 청록 형광 단백질 (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald6, CyPet, mCFPm, Cerulean, 그리고 T-Sapphire로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질일 수 있다.
외인성 뉴클레오티드 서열은 특정 세포로부터 기원되지 않지만, DNA 전달 방법, 예컨대, 예를 들어, 형질감염, 형질도입, 전기천공, 또는 형질변환 방법들에 의해 상기 세포로 도입될 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, TI에 적합한 포유류 세포는 포유류 세포의 게놈에서 하나 이상의 통합 부위에 통합된 적어도 하나의 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 포유류 세포의 게놈의 특정 유전자좌 내부의 통합 부위에 통합된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 재조합 인식 부위(RRS)를 포함하며, 여기서 RRS는 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 RRS를 포함한다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS를 포함하고, 여기서 제 3 RRS는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 제1 및 제2 RRS는 동일하고 제3 RRS는 제1 또는 제2 RRS와 상이하다. 특정 구현예들에서, 3개 RRS 모두는 상이하다. 특정 구현예들에서, RRS는 LoxP 부위, L3 부위, 2L 부위, LoxFas 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372 부위, Lox5171 부위, Loxm2 부위, Lox71 부위, Lox66 부위, FRT 부위, F3 부위, F5 부위, Bxb1 attP 부위, Bxb1 attB 부위, ΦC31 attP 부위, 및 ΦC31 attB 부위로 이루어진 군으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정 구현예들에서, 통합되는 외인성 뉴클레오티드 서열은 제1, 제2 및 제3 RRS, 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정 구현예들에서, 선택 마커는 상기 제1 및 제2 RRS 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 2개 RRS들은 적어도 하나의 선택 마커에 측접하고, 즉, 제1 RRS는 상기 선택 마커의 5’(상류)에 위치하며, 제2 RRS는 상기 선택 마커의 3’(하류)에 위치한다. 특정 구현예들에서, 제1 RRS는 상기 선택 마커의 5’-말단에 인접하며, 제2 RRS는 상기 선택 마커의 3’-말단에 인접한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 선택 마커는 제1 및 제2 RRS 사이에 위치하고, 2개의 측접 RRS들은 상이하다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 L3 서열이고 제2 측접 RRS는 2L 서열이다. 특정 구현예들에서, L3 서열은 상기 선택 마커의 5'에 위치하고, 2L 서열은 상기 선택 마커의 3'에 위치한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 야생형 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이고, 제2 측접 RRS는 하나의 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 제1 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이고, 제2 측접 RRS는 제1 돌연변이된 역위 반복부와 동일하거나 상이한 제2 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 야생형 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이고, 제3 RRS는 하나의 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, 제2 측접 RRS는 야생형 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이고, 제3 RRS는 하나의 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이다. 특정 구현예들에서, 제1 측접 RRS는 제1 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이고, 제3 RRS는 제2 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제2 측접 RRS는 제1 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이고, 제3 RRS는 제2 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 LoxP 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 제1 측접 RRS는 야생형 FRT 서열이고, 상기 제2 측접 RRS는 돌연변이 FRT 서열이다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 측접 RRS는 제1 돌연변이 FRT 서열이고, 상기 제2 측접 RRS는 제2 돌연변이 FRT 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 제1 측접 RRS는 Bxb1 attP 서열이고, 상기 제2 측접 RRS는 Bxb1 attB 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 제1 측접 RRS는 φC31 attP 서열이고, 상기 제2 측접 RRS는 φC31 attB 서열이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 2개의 RRS에 의해 측접된 제1 및 제2 선택 마커를 포함하고, 여기서 제1 선택 마커는 제2 선택 마커와 상이하다. 특정 구현예들에서, 2개의 선택 마커들은 글루타민 합성효소 선택 마커, 티미딘 키나제 선택 마커, HYG 선택 마커, 및 푸로마이신 저항성 선택 마커로 이루어진 군으로부터 서로 독립적으로 선택된다. 특정 구현예들에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 티미딘 키나아제 선택 마커 및 HYG 선택 마커를 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 선택 마커는 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제(APH)(예컨대, 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제(HYG), 네오마이신 및 G418 APH), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 조이신, 및 미코페놀산에 대한 저항성을 인코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 제2 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean, 및 T-Sapphire 형광 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예들에서, 상기 제1 선택 마커는 글루타민 합성효소 선택 마커이며, 상기 제2 선택 마커는 GFP 형광 단백질이다. 특정 구현예들에서, 선택 마커들에 측접하는 2개의 RRS들은 상이하다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 선택 마커는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예들에서, 상기 선택 마커는 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 구현예들에서, 상기 선택 마커는 인간 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
공여체 디옥시리보 핵산의 도입에 사용되는 방법과 무관하게, 성공적으로 형질감염된 세포는 도입된 제2 선택 마커에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 요소, DNA 분자, 또는 VA RNA 유전자를 재조합효소-매개 카세트 교환 반응과 조합하여 사용할 때, 상이한 재조합효소가 RMCE 및 RMCI에 사용된다는 것을 주목해야 한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 DNA 요소, DNA 분자 또는 VA RNA에서 Cre/LoxP-시스템은 재조합효소-매개 카세트 교환 반응(RMCE)에 사용되고, Flp/FRT-시스템은 재조합효소-매개 카세트 역위(RMCI)에 사용된다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 DNA 요소, DNA 분자 또는 VA RNA에서 Flp/FRT-시스템은 재조합효소-매개 카세트 교환 반응(RMCE)에 사용되고, Cre/LoxP-시스템은 재조합효소-매개 카세트 역위(RMCI)에 사용된다.
아데노-관련 바이러스 벡터
AAV 및 아데노바이러스 또는 헤르페스 헬퍼 기능의 일반적인 검토를 위해, Berns and Bohensky, Advances in Virus Research, Academic Press., 32 (1987) 243-306을 참조한다. AAV의 게놈은 Srivastava et al., J. Virol., 45 (1983) 555-564에 기재되어 있다. US 4,797,368에서는, 재조합 AAV 벡터를 구축하기 위한 설계 고려사항이 기재되어 있다(또한 WO　93/24641을 참조). AAV 벡터를 기재하는 추가 참고문헌은 West et al., Virol. 160 (1987) 38-47; Kotin, Hum. Gene Ther. 5 (1994) 793-801; and Muzyczka J. Clin. Invest. 94 (1994) 1351이다. 재조합 AAV 벡터의 구축은 US　5,173,414; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3988-3996; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 3251-3260; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 4 (1994) 2072-2081; Hermonat and Muzyczka Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6466-6470; Samulski et al. J. Virol. 63 (1989) 3822-3828에 기재되어 있다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 복제-결핍 파르보바이러스이다. 이는 세포에서만 복제할 수 있으며, 여기서 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 일부 경우에 우두 바이러스와 같은 폭스바이러스와 같은 공동 감염 헬퍼 바이러스에 의해 특정 바이러스 기능이 제공된다. 그럼에도 불구하고, AAV는 적절한 헬퍼 바이러스 기능이 존재한다면, 인간, 유인원 또는 설치류 기원의 사실상 임의의 세포주에서 복제할 수 있다.
헬퍼 바이러스 유전자가 존재하지 않으면, AAV는 이의 숙주 세포에서 잠복기를 확립한다. 이의 게놈은 19번 염색체의 특정 부위[(Chr) 19 (q13.4)]에 통합되는데, 이를 아데노-관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1)이라고 한다. 특이적 혈청형, 예컨대 AAV-2의 경우, 예컨대, 예를 들어, 염색체 5[(Chr) 5 (p13.3)] 상에서, AAVS2로 명명되고, 염색체 3[(Chr) 3 (p24.3)] 상에서, AAVS3으로 명명되는 다른 통합 부위가 발견되었다.
AAV는 상이한 혈청형으로 분류된다. 이들은 혈구응집, 종양원성 및 DNA 서열 상동성과 같은 매개변수에 기초하여 할당되어 왔다. 지금까지, AAV의 상이한 군에 상응하는 10개 초과의 상이한 혈청형 및 100개 초과의 서열이 확인되었다.
캡시드 단백질 유형 및 대칭성은 각각의 AAV의 조직 친화성을 결정한다. 예를 들어, AAV-2, AAV-4 및 AAV-5는 망막에 특이적이고, AAV-2, AAV-5, AAV-8, AAV-9 및 AAVrh-10은 뇌에 특이적이며, AAV-1, AAV-2, AAV-6, AAV-8 및 AAV-9는 심장 조직에 특이적이고, AAV-1, AAV-2, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 및 AAV-10은 간에 특이적이고, AAV-1, AAV-2, AAV-5 및 AAV-9는 폐에 특이적이다.
위형 형성(pseudotyping)은 다양한 혈청형 사이의 AAV 게놈의 교차 패키징을 포함하는 과정을 의미한다, 즉 게놈은 상이하게 기원하는 캡시드 단백질과 함께 패키징된다.
야생형 AAV 게놈은 약 4.7 kb의 크기를 갖는다. AAV 게놈은 rep 및 cap으로 명명된 2개의 중첩 유전자를 추가로 포함하며, 이는 다수의 오픈 리딩 프레임을 포함한다(예컨대, Srivastava et al., J. Viral., 45 (1983) 555-564; Hermonat et al., J. Viral. 51 (1984) 329-339; Tratschin et al., J. Virol., 51 (1984) 611-619를 참조). 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40으로 지칭되는 상이한 크기의 4개의 단백질을 제공한다. 이들은 AAV의 복제, 구조 및 통합에 관여한다. 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 Cap 단백질은 VP1, VP2, VP3 및 Rep40으로 지칭되는 4개의 단백질을 제공한다. VP1, VP2 및 VP3은 AAV 입자의 단백질성 캡시드의 일부이다. 조합된 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임은 소위 역위 말단 반복부(ITR)에 의해 이들의 5'- 및 3'-말단에 측접된다. 복제를 위해, AAV는 Rep 및 Cap 단백질 이외에 아데노바이러스의 유전자 E1A, E1B, E4orf6, E2A 및 VA 또는 다른 헬퍼 바이러스의 상응하는 인자의 생성물을 요구한다.
혈청형 2의 AAV(AAV-2)의 경우, 예를 들어, ITR은 각각 145개의 뉴클레오티드의 길이를 갖고 약 4470개의 뉴클레오티드의 코딩 서열 영역을 측접한다. ITR의 145개의 뉴클레오티드 중, 125개의 뉴클레오티드는 앞뒤역순상동(palindromic) 서열을 가지며, T-형 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 이 구조는 바이러스 복제 동안 프라이머(primer)의 기능을 갖는다. 쌍을 이루지 않은 나머지 20개의 뉴클레오티드는 D-서열로 표시된다.
AAV 게놈은 rep 및 cap 유전자의 발현을 위해 3개의 전사 프로모터 P5, P19 및 P40을 보유한다(Laughlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5567-5571).
ITR 서열은 코딩 영역에서 시스(cis)로 존재해야 한다. ITR은 기능적 복제 기점(ori), 표적 세포의 게놈 내로의 통합에 필요한 신호, 및 숙주 세포 염색체 또는 재조합 플라스미드로부터의 효율적인 절제 및 구제를 제공한다. ITR은 Rep-단백질 결합 부위(RBS) 및 말단 분해 부위(TRS)와 같은 복제원점 유사-요소를 추가로 포함한다. ITR 자체가 AAV 벡터에서 전사 프로모터의 기능을 가질 수 있는 것으로 밝혀졌다(Flotte et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 3781-3790; Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1993) 10163-10167).
바이러스 단일-가닥 DNA 게놈의 복제 및 캡시드화를 위해, 각각 rep 및 cap 유전자 산물의 트랜스(in trans) 조직이 요구된다.
rep 유전자좌는 P5 및 P19로 명명되는 2개의 내부 프로모터를 포함한다. 이는 4가지 단백질을 위한 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 프로모터 P5는 Rep 단백질 Rep78을 인코딩하는 스플라이싱되지 않은 4.2 kb mRNA(세포 주기를 정지시키기 위한 염색질 틈내기효소), 및 Rep 단백질 Rep68을 인코딩하는 스플라이싱된 3.9 kb mRNA(부위-특이적 엔도뉴클레아제)를 제공하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터 P19는 Rep 단백질 Rep52를 인코딩하는 스플라이싱되지 않은 mRNA 및 Rep 단백질 Rep40을 인코딩하는 스플라이싱된 3.3 kb mRNA(축적 및 패키징을 위한 DNA 헬리카제)를 제공하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
2개의 더 큰 Rep 단백질인 Rep78 및 Rep68은 AAV 이중 DNA 복제에 필수적인 반면, 더 작은 Rep 단백질인 Rep52 및 Rep40은 자손, 단일 가닥 DNA 축적에 필수적인 것으로 보인다(Chejanovsky & Carter, Virology 173 (1989) 120-128).
더 큰 Rep 단백질인 Rep68 및 Rep78은 AAV ITR의 헤어핀 형태에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 정의된 효소 활성을 나타내며, 이는 AAV 말단에서 복제를 분해하는데 필요하다. Rep78 또는 Rep68의 발현은 감염성 입자 형성에 충분할 수 있다(Holscher, C., et al. J. Virol. 68 (1994) 7169-7177 and 69 (1995) 6880-6885).
모든 Rep 단백질, 주로 Rep78 및 Rep68은 AAV 유전자의 유도 및 억제와 같은 조절 활성뿐만 아니라 세포 성장에 대한 억제 효과를 나타내는 것으로 간주된다(Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894; Labow et al., Mol. Cell. Biol., 7 (1987) 1320-1325; Khleif et al., Virology, 181 (1991) 738-741).
Rep78의 재조합 과발현은 DNA 손상의 유도에 기인하여 감소된 세포 성장을 갖는 표현형을 발생시킨다. 이에 의해, 숙주 세포가 S기에 구속되어, 바이러스에 의한 잠복 감염이 촉진된다(Berthet, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 13634-13639).
Tratschin et al.은 P5 프로모터가 Rep78 또는 Rep68에 의해 음성적으로 자동 조절된다고 보고하였다(Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894). Rep 단백질의 발현의 독성 효과로 인해, AAV의 안정한 통합 후 특정 세포주에 대해 매우 낮은 발현만이 보고되었다(예컨대, Mendelson et al., Virol. 166 (1988) 154-165를 참조).
cap 유전자좌는 P40으로 명명되는 하나의 프로모터를 포함한다. 프로모터 P40은 2.6 kb mRNA를 제공하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 이는 선택적 스플라이싱 및 선택적 개시 코돈의 사용에 의해 Cap 단백질 VP1(87 kDa, 비-스플라이싱된 mRNA 전사체), VP2(72 kDa, 스플라이싱된 mRNA 전사체로부터) 및 VP3(61 kDa, 선택적 개시 코돈으로부터)을 인코딩한다. VP1 내지 VP3은 바이러스 캡시드의 구성 요소를 구성한다. 캡시드는 세포 표면 수용체에 결합하여 바이러스의 세포 내 트래피킹(trafficking)을 허용하는 기능을 갖는다. VP3은 전체 바이러스 입자 단백질의 약 90%를 차지한다. 그럼에도 불구하고, 상기 세 가지 단백질 모두는 효과적인 캡시드 생산을 위해 필수적이다.
3개의 캡시드 단백질인 VP1 내지 VP3 모두의 비활성화가 단일 가닥 자손 AAV DNA의 축적을 방지하는 것으로 보고되었다. VP1 아미노-말단에서의 돌연변이("Lip-음성" 또는 "Inf-음성")는 여전히 단일-가닥 DNA를 바이러스 입자로 조립할 수 있게 하며, 이에 의해 감염성 역가가 크게 감소된다.
AAP 오픈 리딩 프레임은 어셈블리 활성화 단백질(AAP)을 인코딩하고 있다. 이는 약 22 kDa의 크기를 가지며, 캡시드 조립을 위해 고유 VP 단백질을 핵 영역으로 수송한다. 이 오픈 리딩 프레임은 VP3 단백질 인코딩 서열의 상류에 위치한다.
개별 AAV 입자에는, 단 하나의 단일 가닥 DNA 분자만이 함유된다. 이는 "플러스" 또는 "마이너스" 가닥일 수 있다. DNA 분자를 함유하는 AAV 바이러스 입자는 감염성이다. 감염된 세포 내부에서는, 부모 감염성 단일가닥이 이중 가닥으로 전환되고, 순차적으로 증폭된다. 상기 증폭은 단일 가닥이 치환되고 캡시드로 패키징된 이중 가닥 DNA 분자의 큰 풀을 발생시킨다.
아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 휴지 세포뿐만 아니라 분할 세포를 형질도입시킬 수 있다. AAV 벡터를 이용하여 표적 세포에 도입된 이식유전자는 장기간 발현될 것이라고 가정할 수 있다. AAV 벡터를 사용하는 것의 하나의 단점은 세포 내로 도입될 수 있는 이식유전자의 크기의 제한이다.
Carter et al.은 전체 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임이 결실되고 이식유전자로 대체될 수 있음을 보여주었다(Carter, B. J., in "Handbook of Parvoviruses", ed. by P. Tijssen, CRC Press, pp. 155-168 (1990)). 추가로, ITR은 표적 세포의 게놈 내로 이식유전자의 복제, 구조, 패키징 및 통합의 기능을 유지하기 위해 유지되어야 한다고 보고되었다.
각각의 바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 세포가 AAV 벡터에 의해 형질도입되거나, 또는 그 반대일 때, 통합된 AAV 프로바이러스를 포함하는 세포가 적합한 헬퍼 바이러스에 의해 형질도입되면, AAV 프로바이러스가 활성화되고 용해 감염 주기에 다시 진입한다(Clark, K.R., et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341; Samulski, R.J., Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (1993) 74-80).
E1A는 아데노바이러스 DNA가 세포 핵으로 들어간 후 발현되는 제1 바이러스 헬퍼 유전자이다. E1A 유전자는 대체 스플라이싱에 의해 동일한 E1A mRNA에 기초한 12S 및 13S 단백질을 인코딩한다. 12S 및 13S 단백질의 발현은 다른 바이러스 기능 E1B, E2, E3 및 E4의 활성화를 발생시킨다. 추가적으로, 12S 및 13S 단백질의 발현은 세포를 세포 주기의 S기로 강제한다. E1A-유래 단백질만 발현된다면, 세포는 염색될 것이다(세포자멸사).
E1B는 발현되는 제2 바이러스 헬퍼 유전자이다. 이는 E1A-유래 단백질인 12S 및 13S에 의해 활성화된다. E1B 유전자 유래 mRNA는 두 가지 상이한 방식으로 스플라이싱되어, 제1 55 kDa 전사체 및 제2 19 kDa 전사체를 생성할 수 있다. E1B 55 kDa 단백질은 세포 주기의 조절, 감염의 후기 단계에서 세포 mRNA의 수송의 방지, 및 E1A-유도된 세포자멸사의 방지에 관여한다. E1B 19 kDa 단백질은 세포의 E1A-유도된 세포자멸사의 방지에 관여한다.
E2 유전자는 상이한 단백질을 인코딩한다. E2A 전사체는 AAV 복제에 필수적인 단일 가닥-결합 단백질(SSBP)을 코딩한다.
또한 E4 유전자는 여러 단백질을 인코딩한다. E4 유전자 유래 34 kDa 단백질(E4orf6)은 E1B 55 kDa 단백질과 함께 세포질에서의 세포 mRNA의 축적을 방지하지만, 또한 세포 핵으로부터 세포질로의 바이러스 RNA의 수송을 촉진한다.
일반적으로, 재조합 AAV 입자를 생산하기 위해, 상이한 상보성 플라스미드가 숙주 세포 내로 공동-형질감염된다. 플라스미드 중 하나는 2개의 cis 작용 AAV ITR 사이에 개재된 이식유전자를 포함한다. 자손 재조합 게놈의 복제 및 후속 패키징에 필요한 누락된 AAV 요소, 즉 Rep 및 Cap 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임이 제2 플라스미드 상의 트랜스에 함유된다. Rep 단백질의 과발현은 세포 성장에 대한 억제 효과를 발생시킨다(Li, J., et al., J. Virol. 71 (1997) 5236-5243). 추가적으로, 헬퍼 바이러스, 즉 아데노바이러스로부터의 E1, E4orf6, E2A 및 VA의 유전자를 포함하는 제3 플라스미드는 AAV 복제에 필요하다.
필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위해, Rep, Cap 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 단일 플라스미드 상에 조합할 수 있다.
대안적으로, 숙주 세포는 이미 안정적으로 E1 유전자 산물을 발현할 수 있다. 이러한 세포는 HEK293 세포이다. 293으로 표시되는 인간 배아 신장 클론은 아데노바이러스 DNA를 인간 배아 신장 세포(HEK 세포)에 통합시킴으로써 1977년에 생성되었다(Graham, F.L., et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74). HEK293 세포주는 아데노바이러스 혈청형 5 게놈의 염기쌍 1 내지 4344를 포함한다. 이는 E1A 및 E1B 유전자뿐만 아니라 아데노바이러스 패키징 신호를 포함한다(Louis, N., et al., Virology 233 (1997) 423-429).
HEK293 세포를 사용할 때, 누락된 E2A, E4orf6 및 VA 유전자는 아데노바이러스를 이용한 공동-감염에 의해 또는 E2A-, E4orf6- 및 VA-발현 플라스미드를 이용한 공동-형질감염에 의해 도입될 수 있다(예컨대, Samulski, R.J., et al., J. Virol. 63 (1989) 3822-3828; Allen, J.M., et al., J. Virol. 71 (1997) 6816-6822; Tamayose, K., et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996) 507-513; Flotte, T.R., et al., Gene Ther. 2 (1995) 29-37; Conway, J.E., et al., J. Virol. 71 (1997) 8780-8789; Chiorini, J.A., et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1531-1541; Ferrari, F.K., et al., J. Virol. 70 (1996) 3227-3234; Salvetti, A., et al., Hum. Gene Ther. 9 (1998) 695-706; Xiao, X., et al., J. Virol. 72 (1998) 2224-2232; Grimm, D., et al., Hum. Gene Ther. 9 (1998) 2745-2760; Zhang, X., et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999) 2527-2537을 참조). 대안적으로, 아데노바이러스/AAV 또는 단순 헤르페스 바이러스/AAV 하이브리드 벡터가 사용될 수 있다(예컨대, Conway, J.E., et al., J. Virol. 71 (1997) 8780-8789; Johnston, K.M., et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370; Thrasher, A.J., et al., Gene Ther. 2 (1995) 481-485; Fisher, J.K., et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996) 2079-2087; Johnston, K.M., et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370을 참조).
따라서, rep 유전자가 통합되고 발현되는 세포주는 느리게 성장하거나 매우 낮은 수준으로 Rep 단백질을 발현하는 경향이 있다.
큰 안전성 문제는 복제-적격 아데노바이러스(RCA)에 의한 rAAV 입자 제제의 오염이다. RCA는 숙주 세포 내로 통합된 아데노바이러스 DNA 및 벡터 게놈이 상동 재조합에 의해 바이러스 복제 동안 재조합될 때 생성된다(Lochmueller, H., et al., Hum. Gene Ther. 5 (1994) 1485-1491; Hehir K.M., et al., J. Virol. 70 (1996) 8459-8467). 따라서, HEK 293 세포는 약학적 적용을 위한 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 적합하지 않다.
이식유전자 활성을 특정 조직으로 제한하기 위해, 즉 통합 부위를 제한하기 위해, 이식유전자는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다(예컨대, Yang, Y., et al. Hum. Gene. Ther. 6 (1995) 1203-1213을 참조).
오늘날까지, rAAV 입자의 생산에 있어서의 주된 어려움은 낮은 역가를 발생시키는 rAAV 벡터의 비효율적인 패키징이다. 패키징은 하기의:
- 존재하는 경우, 야생형 AAV 게놈의 바람직한 캡시드화;
- rep 유전자 산물과 관련된 억제 효과로 인해 야생형 rep 및 cap 유전자에 의해 제공되는 것과 같은 충분한 보완 기능을 생성하는데 있어서의 어려움;
- 플라스미드 구조체의 공동-형질감염의 제한된 효율을 포함하는 여러 가지 이유로 어려웠다.
이러한 모든 문제점들은 Rep 단백질의 생물학적 특성에 기초하고 있다. 특히 Rep 단백질의 억제적(세포증식 억제 및 세포독성) 특성뿐만 아니라 배양된 세포의 불멸성 표현형을 역위시키는 능력이 문제가 된다. 추가적으로, Rep 단백질은 널리 사용되는 AAV P5 프로모터가 사용될 때 자체의 발현을 하향 조절한다(예컨대, Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894를 참조).
본 발명에 따른 예시적인 화합물 및 조성물
본원에서는 신규 DNA 구조체 및 이의 사용방법이 보고된다. 본 발명에 따른 신규한 DNA 구조체는 부위-특이적 재조합효소 기술을 사용한 적어도 2개의 오픈 리딩 프레임의 동시 전사 활성화에 유용하다. 본 발명은 부위-특이적 재조합효소와의 역위에 의해 이의 생산적 형태로 전환되는 이중 가닥 DNA 분자의 코딩 및 주형 가닥 상의 프로모터 및 오픈 리딩 프레임의 의도적인 비-생산적 배열을 사용한다.
본 발명의 기술적 개념의 기초가 되는 원리는 조합된 DNA-역위 및 프로모터에 작동가능한-연결에 의한 유전자 발현 활성화이다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소로서,
여기서
상기 코딩 가닥은 양의 배향으로(즉, 5'에서 3’ 방향으로) 하기의 순서로
- 양의 배향의 제1 프로모터,
- 역위 반복부들 중 하나에 양의 배향으로 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 음의 배향(즉, 코딩 가닥에 대해 음의 배향)의 제2 프로모터,
- 음의 배향(즉, 코딩 가닥의 5'에서 3' 방향에 대해 역위된)의 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
- 음의 배향이고 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된(즉, 코딩 가닥의 5'에서 3’ 배향에 대해 역위된) 제1 오픈 리딩 프레임,
- 제1 재조합효소 인식 서열과 다른 각각의 역위 반복부 내 돌연변이를 포함하고 음의 배향(즉, 제1 재조합효소 인식 서열에 대한 상호 배향 및 코딩 가닥의 5'에서 3’ 방향에 대해 역위된)에 있는 제2 재조합효소 인식 서열,
- 양의 배향의 제2 오픈 리딩 프레임, 및
- 양의 배향의 및 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중 가닥 DNA 요소이다.
본 발명의 독립적인 일 양태는 5'에서 3’ 방향으로 하기의 순서로
- 5'에서 3’ 방향(즉, 양의 배향)의 제1 프로모터,
- 역위 반복부들 중 하나에 돌연변이를 포함하는 5'에서 3’ 방향의 제1 재조합효소 인식 서열,
- 3'에서 5' 방향(즉, 음의 배향)의 제2 프로모터,
- 3'에서 5' 방향(즉, 코딩 가닥의 5'에서 3' 방향에 대해 역위된)의 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
- 3'에서 5’ 방향의 및 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 제1 오픈 리딩 프레임,
- 제1 재조합효소 인식 서열과 다른 각각의 역위 반복부 내 돌연변이를 포함하고 3'에서 5’ 배향(즉, 제1 재조합효소 인식 서열에 대한 상호 배향)의 제2 재조합효소 인식 서열,
- 5'에서 3' 배향 제2 오픈 리딩 프레임, 및
- 5'에서 3' 배향의 및 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는, 이중 가닥 DNA 요소이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소로 이중 가닥 DNA 요소를 인큐베이션하는 것은
- 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 상기 제1 프로모터는 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되고 상기 제2 프로모터는 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되며, 그리고
- 재조합 이후에 제1 프로모터와 제1 오픈 리딩 프레임 또는 제2 프로모터와 제2 오픈 리딩 프레임 사이에 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 (제3)재조합 효소 인식 서열 생성을 생성시킨다.
따라서, 본 발명에 따른 DNA 요소는 함유된 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임의 전사에 대하여 더 이상 작용하지 않는다. 본 발명에 따른 DNA 요소는 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임의 전사에 대하여 작용하지 않기 때문에, 포함된 오픈 리딩 프레임이 통합 직후에 기발현될 위험 없이 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 세포 내로 도입된 후, 오픈 리딩 프레임은 DNA 요소의 재조합 인식 서열에 대하여 작용하는, 즉 인식 서열을 인식하는 재조합효소가 세포 내에서 활성화되거나 세포 내로 도입되면 전사될 뿐이다. 이에 의해, 본 발명의 유전적으로 통합된 DNA 요소에서 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 재조합효소-매개 카세트 역위(RMCI)이 개시된다. 상기 RMCI는 2개의 역위 재조합효소 인식 서열 사이에 위치하는 본 발명에 따른 DNA 요소의 해당 부분의 역위를 발생시킨다. 이에 의해, 제1 프로모터는 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되고, 제2 프로모터는 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된다. 이 후에야, 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임이 전사되고, 각각의 인코딩된 단백질이 발현된다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 요소는 세포 내에서 두 오픈 리딩 프레임의 동시 활성화에 특히 유용하다.
전사적으로 비활성인 오픈 리딩 프레임을 갖는 본 발명에 따른 DNA 요소는 도 1의 좌측에 개략적으로 도시되어 있다. 작동가능하게 연결된 프로모터 및 오픈 리딩 프레임, 즉 전사적으로 활성인 오픈 리딩 프레임을 갖는 RMCI로부터 생성된 역위 DNA 요소는 도 1의 우측에 도시되어 있다.
따라서, 본 발명의 독립적인 일 양태는 5'에서 3’ 방향으로 하기의 순서로
- 5'에서 3’ 방향(즉, 양의 배향)의 제1 프로모터,
- 역위 반복부 둘 모두에서의 돌연변이를 포함하거나 또는 역위 반복부 중 그 어느 것도 포함하지 않는 5'에서 3’ 방향의 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 5'에서 3’ 방향의 제1 오픈 리딩 프레임,
- 5'에서 3' 방향의 및 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
- 5'에서 3' 방향의 제2 프로모터,
- 제1 재조합효소 인식 서열이 역위 반복부 내에 돌연변이를 갖지 않는 경우 역위 반복부 둘 모두에 돌연변이를 포함하거나, 또는 제1 재조합효소 인식 서열이 역위 반복부 둘 모두에 돌연변이를 갖는 경우 역위 반복부에 돌연변이를 포함하지 않는 제2 재조합효소 인식 서열,
- 상기 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 5'에서 3’ 방향의 제2 오픈 리딩 프레임, 및
- 5'에서 3' 방향의 및 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는, 이중 가닥 DNA 요소이다.
재조합효소 인식 서열은 역위되어 활성화된 구조체에서 유지된다. 교환 반응이 효소 반응이기 때문에, 재조합효소 인식 서열, 예컨대, LoxP 부위가 임의의 교환 후에 이의 작용성을 보유함에 따라, 효소가 여전히 존재/활성 또는 재도입되는 경우에 제2, 즉 반전된 역위 반응이 가능하다. 반전된 역위 반응은 이전에 활성화된 오픈 리딩 프레임의 전사 비활성화를 발생시킬 것이다. 재조합효소-매개 카세트 역위의 가역성은 사용된 재조합효소뿐만 아니라 사용된 재조합효소 인식 서열에 의존한다.
예를 들어, Cre-재조합효소에 의해 촉매되는 RMCI 반응은 가역 반응이다. 따라서, 이들의 게놈 내에 활성 Cre-재조합효소 및 LoxP 부위를 포함하는 세포는 의도하는 경향이 있지만, 또한 재조합효소 인식 서열이 각각의 교환 반응 후에 작용성을 유지함에 따라 의도하지 않은 역위 이벤트가 발생하는 경향이 있다.
따라서, 1차 의도된 역위 반응이 일어난 후 2차 비의도된 역위 반응을 방지하기 위해 재조합효소 시스템의 활성 또는/및 작용 부위 및/또는 가역성을 제어할 필요가 있다.
따라서, 본 발명에 따른 DNA 요소는 일측 변이 재조합효소 인식서열을 포함한다. 따라서, 각각의 재조합효소 인식 서열은 하나의 야생형 및 하나의 돌연변이된 역위 반복부를 갖는다. 예를 들어, 제1 재조합효소 인식 서열은 돌연변이된 좌측 역위 반복부(및 우측 야생형 반복부)를 갖고, 제2 재조합효소 인식 서열은 돌연변이된 우측 역위 반복부(및 좌측 야생형 반복부)를 갖는다. RMCI 후에, 활성화되고 생산적인 DNA는 2개의 야생형 역위 반복부를 갖는 하나의 재조합효소 인식 서열 및 2개의 돌연변이된 역위 반복부를 갖는 하나의 재조합효소 인식 서열을 포함한다. 이중 돌연변이된 재조합효소 인식 서열은 재조합효소에 의해 더 이상 인식되지 않으며, 이에 의해 잠재적인 역반응이 방지된다. 이러한 의도적인 설계에 기초하여, 단지 단일, 즉 하나의 RMCI가 발생할 수 있고, 전사가 안정적으로 활성화된다.
모든 양태 및 구현예의 바람직한 일 구현예에서, 재조합효소는 Cre-재조합효소이고, 재조합효소 인식 서열은 RE- 및 LE-LoxP 부위이다.
모든 양태 및 구현예의 바람직한 일 구현예에서, 재조합효소는 Flp-재조합효소이고, 재조합효소 인식 서열은 RE- 및 LE-FRT 부위이다.
대안적으로, phiC31-매개 RMCI를 사용할 수 있다. 이러한 역위 반응 동안, 재조합 부위들은 보존되지 않는다. 보다 상세하게, Cre- 또는 FLP-시스템과는 대조적으로, attP 및 attB 부위는 재결합하여 비호환성 attL 및 attR 부위를 생성하고, 따라서 연속적인 교환 반응을 방지한다. 따라서, 이들은 각각 역 attP 및 attB 부위와 역위될 서열에 측접함으로써 일회의 단방향 RMCI에 사용될 수 있다(예컨대, Haecker, I., et al., Nat. Sci. Rep. 7 (2017) 43883을 참조).
모든 양태 및 구현예의 바람직한 일 구현예에서, 재조합효소는 phiC31-인테그라제이고, 재조합효소 인식 서열은 attP 및 attB이다. AttP 및 attB는 이들 서열의 사용이 RMCI 후에 더 이상 작용하지 않는 재조합효소 인식 서열을 발생시키기 때문에 본 발명에 따른 반복부들 중 하나에서 돌연변이를 갖는 재조합효소 인식 서열로 간주된다.
본 발명에 따른 DNA 요소의 유리한 효과를 추가로 증가시키기 위해, 사용된 프로모터는 또한 유도/활성화가능하도록 선택될 수 있다. 따라서, 오픈 리딩 프레임의 전사는 재조합효소 매개 역위가 단지 추가의 특이적 프로모터 활성화에 의해 온(on)될 수 있다. 이는 한편으로는 오픈 리딩 프레임의 전사의 개선된 제어를 발생시키고, 다른 한편으로는 전사를 다시 오프(off)할 가능성을 발생시킨다. 본 발명에 따른 DNA 요소와 유도성 프로모터의 조합에 의해, 분리에 사용될 때 유도성 프로모터의 잠재적 누출성이 강화될 수 있다. 유도성 시스템, 예컨대, Tet-온/오프-시스템은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 개시된 주제는 다중 오픈 리딩 프레임의 유도성 전사를 갖는 재조합 포유류 세포를 생산하기에 적합한 유전자 구조체를 위한 방법을 제공할 뿐만 아니라, 각각의 단백질성 화합물의 안정한 대규모 생산도 제공한다. 마찬가지로, 관심의 단백질성 화합물의 높은 생산성을 갖는 재조합 안정한 생성 포유류 세포를 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 각각의 재조합효소-특이적 LoxP 부위, FRT 부위, attB/attP 부위, 및 roxP 부위를 사용하여 각각 임의의 부위-특이적 재조합효소, 예컨대, Cre-재조합효소, Flp-재조합효소와 함께 사용될 수 있다(GAAGTTCCTATTC-TCTAGAAA-GTATAGGAACTTC (서열번호 36)와 같은 FRT-부위를 인식함), phiC31-인테그라제, 및 Dre-재조합효소(TAACTTTAAATA-ATGCCAAT-TATTTAAAGTTA (서열번호 42와 같은 roxP-부위를 인식함); Bessern, J.L., et al., Nat. Commun. 10 (2019) 1937) 또는 Tre, Brec　1 및 VCre로서 조작된 이의 변이체(LoxLTR와 같은 LoxP 변이체를 인식함 (ACAACATCCTATT-ACACCCTA-TATGCCAACATGG (서열번호 43)) 및 LoxBTR (AACCCACTGCTTA-AGCCTCAA-TAAAGCTTGCCTT (서열번호 44)), 또는 LoxV (TCAATTTCTGAGA-ACTGTCAT-TCTCGGAAATTGA (서열번호 45); Sarkar, I., et al., Science 316 (2007) 1912-1915, Karpinski, J., et al., Nat. Biotechnol. 34 (2016) 401-409, Bessern, J.L., et al., Nat. Commun. 10 (2019) 1937). 유일한 전제조건은 사용된 재조합효소 인식 서열들이 비호환성이라는 것이다, 즉 이들은 제2의 동일한 복제와만 상호작용하고 밀접하게 관련된 서열들에 대해 검출가능한 무차별성(promiscuity)을 갖지 않는다.
본 발명에 따른 방법은 Cre/LoxP-시스템을 사용하여 하기에서 예시되며, 여기서 부위-특이적 재조합효소는 Cre-재조합효소이고, 재조합 인식 부위는 각각 LoxP 부위이다. 이는 본 발명 개념을 예시하기 위한 것이다. 당업자라면 Cre/LoxP-시스템으로 나타낸 본 발명의 개념이 Flp/FRT-시스템, phiC31/att-시스템, 또는 Dre/roxP-시스템과 같은 상기 열거된 다른 부위-특이적 재조합효소 시스템에도 유사하게 적용될 수 있음을 바로 알 수 있을 것이다. 따라서, 이하에서 제공되는 본원의 예시 및 정의에서, 용어 "Cre-재조합효소"는 각각 "Flp-재조합효소" 또는 "phiC31-인테그라제" 또는 "Dre-인테그라제"로 치환될 수 있고, 용어 "LoxP 부위"는 각각 "FRT 부위" 또는 "att 부위" 또는 "roxP 부위"로 치환될 수 있다.
LoxP 부위의 배향 및 아이덴티티/비-아이덴티티에 따라, 재조합효소는 개재 DNA 서열을 역위, 절제 또는 치환한다. 따라서, 제1 모드에서, 2개의 LoxP 부위가 동일한 방향으로 배향된다. 이는 Cre-재조합효소와의 상호작용시 개재 DNA 서열을 결실시키고, 단리된 LoxP 부위를 뒤에 남긴다. 제2 모드에서, 2개의 LoxP 부위는 머리-대-머리 방향으로 배향되며, 즉 2개의 LoxP 부위는 서로에 대해 상호/역배향된다. 이러한 배향에서, Cre-재조합효소와의 상호작용은 2개의 LoxP 부위를 남기고 개재 DNA 서열의 역위를 발생시킨다. 제2 모드의 DNA 서열의 역위 동안, LoxP 부위 사이의 코딩-가닥 및 주형-가닥은 서로 교환되며, 즉 Cre-재조합효소와의 상호작용 전에 코딩-가닥이었던 것이 Cre-재조합효소와의 상호작용 후에 주형-가닥이 되고, 그 반대도 마찬가지이다. 이 과정을 재조합효소-매개 카세트 역위(RMCI)라 한다. 제3 방식에서, 각각 동일한 방향으로 배향된 제1 및 제2 LoxP 부위에 의해 측접된 DNA 서열을 포함함에 따라 제1 분자 상의 하나의 LoxP 부위 및 제2 분자 상의 LoxP 부위 중 하나는 동일하고, 제1 분자 상의 제2 LoxP 부위는 제2 분자 상의 각각의 다른 LoxP 부위와 동일한, 2개의 분자가 Cre-재조합효소와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 두 분자 사이의 LoxP 부위 사이의 DNA 서열의 교환을 발생시킨다. 이러한 과정은 재조합효소-매개 카세트-교환, 또는 짧은 RMCE로 명명된다.
야생형 LoxP 부위와 호환 가능하지 않은 변이체 LoxP 부위는 당업계에 공지되어 있다. 하지만, 이러한 비-호환성 LoxP 부위의 수는 제한된다. 이들 부위 중 무차별성없이, 즉 비-특이적 상호작용 없이 LoxP 호환성 부위를 갖지 않는 일부는 하기의 표 1a에 열거되어 있다.
표 1a: 비-호환성 LoxP 부위.
Figure pct00003
야생형 FRT 부위와 호환 가능하지 않은 FRT 부위는 당업계에 공지되어 있다. 하지만, 이러한 비-호환성 FRT 부위의 수는 제한된다. 이렇듯 무차별성없이, 즉 비-특이적 상호작용 없이 FRT 호환성 부위를 갖지 않는 일부는 하기의 표 1b에 열거되어 있다.
표 1b: 비-호환성 FRT 부위.
Figure pct00004
단일 특이적 비-호환tjd LoxP 부위를 쉽게 찾을 수 있다(상기 표 1a를 참조). 하나 초과의 Cre-lox-기반 교환이 단일 핵산에서 실시되어야 하는 경우, 하나 초과의 비-호환성 LoxP 부위, 즉 2개 이상의 비-호환성 LoxP 부위를 포함하는 세트가 필요하다. 이는 상기 세트 내의 각각의 LoxP 부위가 상기 세트에 포함된 모든 다른 LoxP 부위와 호환되지 않아야 한다는 것을 의미한다. 하나 초과의 오픈 리딩 프레임이 선택적으로 활성화되어야 하는 경우, 이러한 세트가 특히 필요하다.
예를 들어, Lee 및 Saito(Gene 216 (1998) 55-65)는 단일-염기 치환을 갖는 24개의 LoxP 스페이서 돌연변이체 및 이중-염기 치환을 갖는 30개의 LoxP 스페이서 돌연변이체의 완전한 세트를 합성하였다. 이들 중에서, 2개의 LoxP 스페이서 돌연변이체, 즉 돌연변이체 Lox5171 및 Lox2272가 확인되었으며, 이는 동일한 돌연변이체와 효율적으로 재조합되지만, 다른 돌연변이체 또는 야생형 LoxP와는 재조합되지 않는다.
마찬가지로, Langer, S.J., et al. (Nucl. Acids Res. 30 (2002) 3067-3077)은 정준 LoxP 부위와의 향상된 비-호환성을 나타내는 신규한 돌연변이체 스페이서-함유 LoxP 부위를 식별하기 위해 설계된 유전자 스크리닝을 실시하였다. Langer et al.의 표 1로부터, 서로 호환되지 않는 LoxP 세트들을 식별할 수 있음을 알 수 있다.
표 2: Langer et al.의 표 1
Figure pct00005
(서열번호 16, 20, 23, 24, 25, 49)
Missirlis, P.I., et al. (BMC Genomics 7 (2006) 73, A13)은 Cre-재조합효소 매개된 재조합에서 LoxP 스페이서 영역의 서열 및 무차별성(promiscuity) 특성을 확인하는 높은 처리량의 스크린을 실시하였다. 그들은 31개의 독특하고 신규한 자가-재조합 서열을 확인하였고, 이 중 2개는 단일 재조합 파트너를 배타적으로 가졌다.
예시적인 비-호환성 LoxP 부위 세트는 표 3에 열거된다.
표 3: 비-호환성 LoxP 부위 세트.
Figure pct00006
굵은 글씨체의 뉴클레오티드는 각 출판물과 Lee 및 Saito 사이의 서열 차이를 나타낸다.
Langer, S.J., et al.은 상보적 돌연변이 역위 반복부(Lox66 및 Lox71)를 갖는 LoxP 부위의 사용이 트랜스에서 효율적인 재조합을 허용하여, 역위 반복부 둘 모두가 돌연변이된 결함 부위 및 야생형 LoxP 부위가 생성되었다고 보고하였다. 역위 반복부 둘 모두가 돌연변이된 LoxP 부위는 더 이상 재조합효소에 대한 효율적인 기질이 아니기 때문에, 반응은 한 방향으로 구동된다.
이들 상보적 돌연변이 역위 반복부는 반복 서열의 말단 중 하나에 변경된 염기-펜테트(pentett)를 함유한다. 좌측 역위 반복부의 말단에 돌연변이를 갖는 돌연변이체를 LE-돌연변이체라고 한다. 마찬가지로, 우측 역위 반복부의 말단에 돌연변이를 갖는 것은 RE-돌연변이체라고 한다. LE-돌연변이체인 Lox71은 좌측 역위 반복부의 5'-말단 상에 5 bp가 야생형 서열로부터 TACCG(서열번호 50)로 변화하고, RE-돌연변이체인 Lox66은 5개의 3'에 가장 가까운 염기가 CGGTA(서열번호 51)로 변화하였다. Lox71과 cis에 위치한 역위 Lox66 부위 사이의 재조합효소 반응 후에, 생성된 LoxP 부위는 여전히 표적 DNA 서열을 둘러싸는 cis에 위치하지만, 생성된 LoxP 부위 중 하나는 이중 돌연변이된 부위, 즉 각각의 말단 서열에 돌연변이를 갖고, 따라서 LE- 및 RE-역위 반복부 돌연변이 둘 모두를 함유하는 부위이다. 각각의 다른 생성된 LoxP 부위는 야생형 서열에 대응한다. 상기 이중 돌연변이된 LoxP 부위는 Cre-재조합효소 매개된 재조합에서 더 이상 작용하지 않는다(예컨대, 상기 Langer et al.; Missirlis et al. 둘 모두를 참조).
상이한 LoxP RE-돌연변이체 및 LE-돌연변이체 서열이 공지되어 있다. 일부는 하기의 표 4a에 나타나 있다.
표 4a: LoxP RE-돌연변이체 및 LE-돌연변이체 서열.
Figure pct00007
*: 교환 반응 후 가장 높은 안정성을 가짐; Hoess et al. (1982)에 의해 정의된 바와 같은 역 배향의 스페이서.
예를 들어, RE-돌연변이체 및 LE-돌연변이체 서열 Lox71 및 Lox66, 또는 LoxJT15 및 LoxJTZ17은 쌍으로 사용될 수 있다.
마찬가지로, 상이한 FRT RE-돌연변이체 및 LE-돌연변이체 서열이 공지되어 있다. 일부는 하기의 표 4b에 나타나 있다.
표 4b: FRT RE-돌연변이체 및 LE-돌연변이체 서열.
Figure pct00008
일반적으로, 어느 한 가닥(예컨대, LoxP, Lox511, Lox5171, Lox66 또는 Lox71) 상의 서열에서 (기능성)개시 코돈을 함유하는 재조합 부위는 재조합 후 상기 개시 코돈이 활성화될 유전자의 5' UTR의 코딩 가닥 상에 위치되는 방식으로 위치되어서는 안된다. 그렇지 않으면, 상기 개시 코돈은 오픈 리딩 프레임의 번역을 억제할 수 있다. 이러한 경우, 재조합 부위는 프로모터의 TATA 요소의 3' 또는 TATA 요소와 전사 개시 부위 사이에 (바로)위치할 수 있어, 상기 개시 코돈이 전사되지 않는다(개시 코돈의 침묵).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 본 발명의 DNA 요소는, 사용된 재조합효소 인식 부위가 비-호환성인 한 이량체, 삼량체 및 어레이로 조합된다. 이는 본 발명에 따른 상이한 DNA 요소가 조합하여 사용될 때 유일한 요건이다. 이에 의해, 동일한 재조합효소를 사용하는 경우, 또는 실질적으로 본 발명에 따른 각 DNA 요소에 상이한 재조합효소의 비-호환성 재조합효소 인식 부위를 사용하는 경우에도, 2개, 4개, 6개 및 심지어 그 이상의 오픈 리딩 프레임/유전자의 전사를 한번에 활성화시킬 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 2개, 4개, 6개 및 심지어 그 이상의 오픈 리딩 프레임/유전자의 순차적 활성화는 본 발명에 따른 2개 이상의 DNA 요소가 조합되고 각각의 DNA 요소가 RMCI에 대해 상이한 재조합효소를 필요로 할 때 달성된다. 이는 앞서 개략적으로 설명한 바와 같은 2개의 상이한 부위-특이적 재조합효소 시스템의 조합에 의해 달성될 수 있다. 예컨대, 예를 들어, Cre/LoxP-시스템과 Flp/FRT-시스템의 조합, 또는 Cre/LoxP-시스템과 Dre/roxP-시스템의 조합(예컨대, Chuang, K., et al., Genes Genom. Genet. 6 (2016) 559-571을 참조), 또는 Cre/LoxP-시스템과 phiC31-인테그라제/att-시스템의 조합, 또는 Flp/FRT-시스템과 phiC31-인테그라제/att-시스템의 조합을 들 수 있다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 및 심지어 그 이상의 오픈 리딩 프레임/유전자의 순차적 활성화가 달성되며, 여기서 본 발명에 따른 하나의 DNA 요소가 사용되거나(1개 또는 2개의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화), 또는 본 발명에 따른 2개 이상의 DNA 요소가 조합되고(2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화), 이에 의해 2개 이상의 DNA 요소의 경우에 각각의 DNA 요소는 RMCI에 대해 상이한 재조합효소를 필요로 하고, 제1 또는 제2 프로모터 중 하나는 유도성 프로모터(2개의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화의 경우)이거나, 또는 각각의 제2 프로모터는 유도성 프로모터(2개 이상의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화의 경우)이다.
따라서, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 프로모터 또는 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 특정 구현예들에서, 유도성 프로모터는 테트라시클린-제어된 프로모터, 큐메이트-제어된 프로모터, FKBP12-mTOR-제어된 프로모터, 라파마이신-제어된 프로모터, FKCsA-제어된 프로모터, 앱시스산-제어된 프로모터, 타목시펜-제어된 프로모터, 및 리보스위치-제어된 프로모터(FKCsA = FK506 및 시클로스포린 A의 이종이량체)를 포함하는 유도성 프로모터의 군으로부터 선택된다.
유도성 프로모터의 검토를 위해, 예컨대, Kallunki, T., et al., Cells 8 (2019) 796을 참조한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 및 심지어 그 이상의 오픈 리딩 프레임/유전자의 순차적 활성화가 달성되며, 여기서 본 발명에 따른 하나의 DNA 요소가 사용되거나(1개 또는 2개의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화), 또는 본 발명에 따른 2개 이상의 DNA 요소가 조합되고(2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화), 이에 의해 2개 이상의 DNA 요소의 경우에 각각의 DNA 요소는 RMCI에 대해 상이한 재조합효소를 필요로 하고, 제1 또는 제2 프로모터 중 하나는 억제성 프로모터(2개의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화의 경우)이거나, 또는 각각의 제2 프로모터는 억제성 프로모터(2개 이상의 오픈 리딩 프레임의 순차적 활성화의 경우)이다.
따라서, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 프로모터 또는 제2 프로모터는 억제성 프로모터이다. 특정 구현예들에서, 상기 억제성 프로모터는 테트라시클린-제어된 프로모터, GAL4/UAS-제어된 프로모터, 및 LexA/lexAop-제어된 프로모터를 포함하는 억제성 프로모터의 군으로부터 선택된다.
훨씬 더 많은 조합을 허용하기 위해, 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터가 조합될 수 있다. 예를 들어 테트라시클린-의존성 유도성 및 억제성 프로모터가 조합되는 경우, 테트라시클린의 첨가에 의해 하나의 프로모터는 침묵되고 다른 프로모터는 활성화되어, 상이한 오픈 리딩 프레임의 전사의 전환을 허용한다.
도 2에는, 본 발명에 따른 두 가지 DNA 요소의 조합이 도시되어 있다. 제1 DNA 요소는 정방향의 좌측 역위 반복부에서 돌연변이를 갖는 제1 재조합효소 인식 서열(RRS1), 역방향의 제1 폴리아데닐화 신호 서열에 작동가능하게 연결된 역방향의 제1 오픈 리딩 프레임(SG1), 역방향의 우측 역위 반복부에서 돌연변이를 갖는 RRS1과 호환성인 제2 재조합효소 인식 서열(RRS2), 및 제2 폴리아데닐화 신호 서열에 작동가능하게 연결된 정방향의 오픈 리딩 프레임(SG2)을 포함한다. 제2 DNA 요소는 RRS1 및 RRS2와 호환되지 않는, 정방향의 좌측 역위 반복부에서의 돌연변이를 갖는 제3 재조합효소 인식 서열(RRS3), 제3 폴리아데닐화 신호 서열에 작동가능하게 연결된 역방향의 제3 오픈 리딩 프레임(SG3), RRS1 및 RRS2와 호환되지 않고 RRS3과 호환되는, 우측 역위 반복부에서의 돌연변이를 갖는 제4 재조합효소 인식 서열(RRS4), 및 제4 폴리아데닐화 신호 서열에 작동가능하게 연결된 제4 오픈 리딩 프레임(SG4)을 포함한다.
모든 RRS가 단일, 즉 동일한 재조합효소에 의해 인식되면, 그 후 이와 함께 인큐베이션시 2개의 역위 반응이 일어나는데, 즉 RRS1과 RRS2 사이의 DNA 단편뿐만 아니라 RRS3과 RRS4 사이의 DNA 단편이 역위된다. 이에 의해 4개의 오픈 리딩 프레임 모두가 이들의 각각의 프로모터에 작동가능하게 연결되고 전사된다. 각각의 교환 반응은 도 3에서 도시된다. 예를 들어, Cre-재조합효소가 사용되는 경우, 비-호환성 RRS 쌍 Lox71/Lox66 및 L3-LE/L3-RE가 각각 사용될 수 있다.
RRS1 및 RRS2가 제1 재조합효소에 의해 인식되고 RRS3 및 RRS4가 제2 재조합효소에 의해 인식되면, 제1 재조합효소와 함께 인큐베이션시 단지 하나의 역위 반응이 일어나는데, 즉, RRS1과 RRS2 사이의 DNA 단편이 역위된 반면, RRS3과 RRS4 사이의 DNA 단편은 유지된다. 이에 의해 2개의 오픈 리딩 프레임만이 이들의 각각의 프로모터에 작동가능하게 연결되고 전사된다. 제1 재조합효소 후에 각각의 제2 재조합효소가 각각의 세포 내로 도입되면, 또한 RRS3과 RRS4 사이의 DNA 단편이 역위되고 각각의 오픈 리딩 프레임이 활성화된다. 각각의 교환 반응은 도 4에서 도시된다. 예를 들어, 제1 재조합효소는 Cre-재조합효소일 수 있고, RRS1/RRS2는 LoxP 부위이고, 제2 재조합효소는 phiC31-인테그라제일 수 있고, RRS3/RRS4는 attP 및 attB이다.
적어도 하나의 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임의 전사는 RMCI 후에 추가로 각각의 유도자의 존재를 필요로 하거나, 적어도 하나의 프로모터가 억제가능한 프로모터인 경우, 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임의 전사는 각각의 억제자의 첨가에 의해 RMCI 후에 억제될 수 있다.
재조합 AAV 입자
재조합 AAV 입자의 생성을 위해, 단일 포유류 세포에서 Rep 및 Cap 단백질, 헬퍼 단백질 E1A, E1B, E2A 및 E4orf6 뿐만 아니라 아데노바이러스 VA RNA의 발현이 요구된다. 특히 Rep 단백질의 발현은 포유류 세포의 성장 및 생존에 부정적인 영향을 미친다. 이러한 단점은 본 발명에 따른 DNA 요소를 사용함으로써 극복될 수 있다. 예시적인 설계는 하기에 개괄되고, 도 5, 도 6 및 도 7에 도시되어 있으며, 여기서 본 발명에 따른 1개 또는 2개의 DNA 요소가 조합되어 사용된다. 헬퍼 단백질 E1A, E1B, E2A 및 E4orf6은 Matsushita et al. (Gene Ther. 5 (1998) 938-945)에 의해 제시된 바와 같은 임의의 프로모터, 특히 CMV IE 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 따라서, 하기에서 임의의 프로모터가 사용될 수 있다.
E1A, E1B, E2A, E4orf6 오픈 리딩 프레임
따라서, 본 발명의 독립적인 일 양태는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
a) E1A 오픈 리딩 프레임 및 E1B 오픈 리딩 프레임; 및
b) E2A 오픈 리딩 프레임 및 E4orf6 오픈 리딩 프레임을 포함하고,
a) 또는 b)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임은 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 (본 발명에 따른)이중 가닥 DNA 요소에 함유되는 것을 특징으로 하고,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
- 제1 프로모터,
- 좌측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위된 제2 프로모터,
- 코딩 가닥에 대해 역위되고 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
- 상기 코딩 가닥 방향에 대해(역 배향의) 역위된 a) 또는 b)의 제1 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 우측 역위 반복부 및 상호 배향의 돌연변이를 포함하는 제2 재조합효소 인식 서열,
- 제 1 오픈 리딩 프레임이 a)인 경우 a)의 제 2 오픈 리딩 프레임 또는 제 1 오픈 리딩 프레임이 b)인 경우 b)의 제 2 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 각각의 다른 오픈 리딩 프레임은 발현 카세트 내에, 즉 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된다.
도 9 및 도 10은 상기 양태 a)의 방식을 RMCI 전(도 9) 및 RMCI 후(도 10)에 도시한다.
도 11 및 도 12은 상기 양태 b)의 방식을 RMCI 전(도 11) 및 RMCI 후(도 12)에 도시한다.
본 발명에 따른 DNA 요소 내의 재조합 인식 부위의 서열은 서로에 대해 특정 배향을 가질 필요가 있다. 제1 재조합 인식 부위는 제1 재조합 인식 부위에 대해 정방향에 있고, 제2 재조합 인식 부위는 역위/역 배향에 있다.
예를 들어, 코딩 가닥/양성 가닥/전방 가닥 상에서와 같이 5'에서 3’ 방향으로 하기의 서열을 갖는 LoxP 부위의 경우:
5’-ataacttcgtata-atgtatgc-tatacgaagttat-3’
코딩 가닥에, 즉 5'에서 3’ 방향으로 위치하는 역위 서열은 각각의 뉴클레오티드를 이의 상보적 염기로 치환하고 원래 서열의 3'-말단으로부터 시작하여 수득되며, 이는 하기의 역위 코딩 가닥 서열을 발생시킨다:
5’-ataacttcgtata-gcatacat-tatacgaagttat-3’.
마찬가지로, 본 발명에 따른 DNA 요소에서 조합되는 다른 역위 서열들이 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 예시적인 DNA 요소는 코딩 가닥 상에 하기의 서열을 갖는다:
정방향의 제1 프로모터 -
5'-ataacttcgtata-atgtatgc-tatacgaagttat-3'(정방향의 제1 재조합효소 인식 서열) -
역방향의 제2 프로모터 -
역방향의 제1 폴리A/종결인자 서열 -
역방향의 제1 오픈 리딩 프레임 -
5'-ataacttcgtata-gcatacat-tatacgaagttat-3'(역방향의 제2 재조합효소 인식 서열) -
제2 오픈 리딩 프레임(정방향) -
정방향의 제2 폴리A/종결인자 서열.
추가로, 본 발명의 독립적인 일 양태는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
a) E1A 오픈 리딩 프레임 및 E1B 오픈 리딩 프레임; 및
b) E2A 오픈 리딩 프레임 및 E4orf6 오픈 리딩 프레임을 포함하고,
a)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임은 (본 발명에 따른)이중 가닥 DNA 요소에 함유되고, b)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임은 (본 발명에 따른)이중 가닥 DNA 요소에 함유되며(즉, DNA가 본 발명에 따른 상기 DNA 요소 중 2개를 포함함), 각각의 이중 가닥 DNA 요소는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하며,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
- 제1 프로모터,
- 좌측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위된 제2 프로모터,
- 코딩 가닥에 대해 역위되고 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- 상기 코딩 가닥 방향에 대해(역 배향의) 역위된 a) 또는 b)의 제1 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 우측 역위 반복부 및 상호 배향의 돌연변이를 포함하는 제2 재조합효소 인식 서열,
- 제 1 오픈 리딩 프레임이 a)인 경우 a)의 제 2 오픈 리딩 프레임 또는 제 1 오픈 리딩 프레임이 b)인 경우 b)의 제 2 오픈 리딩 프레임, 및
- 상기 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소를 포함하는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
각 경우에, 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소로 이중 가닥 DNA 분자를 인큐베이션하는 것은
- 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 상기 제1 프로모터는 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되고 상기 제2 프로모터는 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되며, 그리고
- 재조합 이후에 제1 프로모터와 제1 오픈 리딩 프레임 사이에 위치하고 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 (제3)재조합효소 인식 서열을 생성시킨다.
마찬가지로 상기 두 양태에서, 제1 재조합효소 인식 서열은 우측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함하고, 제2 재조합효소 인식 서열은 좌측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이는 재조합 이후에 제2 프로모터와 제2 오픈 리딩 프레임 사이에 위치하고 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 재조합효소 인식 서열을 생성시킬 것이다.
재조합효소, 예컨대, Cre-재조합효소의 일시적 발현은 재조합효소 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터를 사용하거나, 또는 mRNA 등을 인코딩하는 재조합효소의 도입에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 유도성 Cre-재조합효소 발현 시스템은 Carter, Z. 및 Delneri, D. (Yeast 27 (2010) 765-775)에 의해 보고되었다. 여기에서, Cre-재조합효소의 발현은 갈락토오스(YPGal)에 일정 시간 노출시켜 형질전환체에서 유도하였다.
E1A 및 E1B(오픈 리딩 프레임)의 코딩 서열은 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서 인간 아데노바이러스, 예컨대, 특히 인간 아데노바이러스 혈청형 2 또는 혈청형 5로부터 유래된다. 인간 Ad5(아데노바이러스 혈청형 5)의 예시적인 서열은 GenBank 등록 X02996, AC_000008 및 GenBank 등록 AC_000007 내의 예시적인 인간 Ad2에서 발견될 수 있다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 뉴클레오티드 505 내지 3522는 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 E1A 및 E1B를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. EP 1 230 354 B1에 보고된 플라스미드 pSTK146, 및 WO 2007/056994에 보고된 플라스미드 pGS119 및 pGS122는 또한 E1A 및 E1B 오픈 리딩 프레임을 위한 공급원으로서 사용될 수 있다.
Rep/Cap 오픈 리딩 프레임
조합된 DNA-역위 및 프로모터에 대한 작동가능한 연결에 의해 유전자 활성화의 원리는 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임을 조건부로 활성화시키기 위해 사용될 수도 있다.
P5 프로모터를 제외하고, rep 및 cap 오픈 리딩 프레임 발현을 구동하는 프로모터는 Rep-폴리펩티드 코딩 서열 내에 위치한다. 따라서, 재조합효소-매개된 서열 역위 및 수반되는 프로모터에 대한 작동가능한 연결에 의한 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임의 조건부 활성화를 위해, 비-호환성 재조합효소 인식 서열 중 하나는 P5 프로모터와 rep 오픈 리딩 프레임 사이에 위치되어야 하고, 다른 비-호환성 재조합효소 인식 서열은 cap 오픈 리딩 프레임과 폴리아데닐화 신호 사이에 위치되어야 한다. 이는 도 7의 왼쪽 도면에 개략적으로 도시되어 있다.
따라서, 본 발명의 독립적인 일 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 (본 발명에 따른)이중 가닥 DNA 요소를 포함하는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
- 제1 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P5 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 좌측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대하여(역 배향의) 역위된 Rep 및 Cap 단백질의 발현을 위한 추가의 프로모터를 포함하는 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 우측 역위 반복부 및 역위/상호 배향의 돌연변이를 포함하는 제2 재조합효소 인식 서열, 및
- 폴리아데닐화 신호를 포함하는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
본 발명의 독립적인 다른 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 (본 발명에 따른)이중 가닥 DNA 요소를 포함하는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
- 제1 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P5 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 좌측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위된 제2 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P19 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 상기 코딩 가닥에 대해 역위된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- Rep78 단백질을 배타적으로 인코딩하거나 Rep68 단백질을 배타적으로 인코딩하는 코딩 서열로서, 내부 P40 프로모터가 비활성화되고 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거되며 코딩 가닥에 대해 역위된(역 배향의), 코딩 서열,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 우측 역위 반복부 및 역위/상호 배향의 돌연변이를 포함하는 제2 재조합효소 인식 서열, 및
- 공통 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Rep52/Rep40 및 Cap 유전자를 포함하는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
도 13 및 도 14은 상기 양태의 방식을 RMCI 전(도 13) 및 RMCI 후(도 14)에 도시한다. 도 7, 중간 도면을 참조한다.
본 발명의 독립적인 다른 양태는 (양으로 배향된)코딩 가닥 및 (음으로 배향된)주형 가닥을 포함하는 (본 발명에 따른)이중 가닥 DNA 요소를 포함하는 (재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 및 입자를 생산하기 위한)(이중 가닥)DNA(분자)로서,
여기서 상기 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
- 제1 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P5 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 좌측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
- 상기 코딩 가닥에 대해(역 배향의) 역위된 제2 프로모터, 바람직한 일 구현예에서 아데노-연관 바이러스 프로모터 P19 또는 이의 기능적 단편 또는 이의 변이체,
- 코딩 가닥(방향)에 대해(즉, 역위/음의 배향의) 역위되고(서열) Rep78 또는 Rep68 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제1 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 종결 요소,
- Rep78 단백질을 배타적으로 인코딩하거나 Rep68 단백질을 배타적으로 인코딩하는 코딩 서열로서, 내부 P40 프로모터가 비활성화되고 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거되며 코딩 가닥에 대해 역위된(역 배향의), 코딩 서열,
- 상기 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 우측 역위 반복부의 돌연변이를 포함하고 상호/역 배향인 제2 재조합효소 인식 서열,
- 폴리아데닐화 신호 서열, 즉 상기 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Rep52 오픈 라딩 프레임, 및
- 임의적으로 제3 프로모터, cap 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 및/또는 종결인자 서열을 포함하고, 여기서 모두는 작동가능하게 연결되는, (이중 가닥)DNA(분자)이다.
도 7, 우측 도면을 참조한다.
상기 각각의 양태에서, 상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 및/또는 상기 제3 및 제4 재조합효소 인식 서열에 대하여 각각 작용하는 재조합효소와 함께 이중 가닥 DNA 분자를 인큐베이션하는 것은
- 상기 제1/제3 및 제2/제4 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 상기 제1/제3 프로모터가 제1/제3 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하고 상기 제2/제4 프로모터가 제2/제4 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하며, 그리고
- 재조합 이후에 제1/제3 프로모터와 제1/제3 오픈 리딩 프레임 사이에 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 재조합효소 인식 서열을 생성시킨다.
마찬가지로 상기 3가지 양태에서, 제1 재조합효소 인식 서열은 우측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함하고, 제2 재조합효소 인식 서열은 좌측 역위 반복부 내의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이는 재조합 이후에 제2 프로모터와 제2 오픈 리딩 프레임 사이에 위치하고 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 재조합효소 인식 서열을 생성시킬 것이다.
재조합효소, 예컨대, Cre-재조합효소의 일시적 발현은 재조합효소 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터를 사용하거나, 또는 mRNA 등을 인코딩하는 재조합효소의 도입에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 유도성 Cre-재조합효소 발현 시스템은 Carter, Z. 및 Delneri, D. (Yeast 27 (2010) 765-775)에 의해 보고되었다. 여기에서, Cre-재조합효소의 발현은 갈락토오스(YPGal)에 일정 시간 노출시켜 형질전환체에서 유도하였다.
아데노바이러스 VA RNA 유전자
조합된 DNA-역위 및 프로모터에 대한 작동가능한 연결에 의해 유전자 활성화의 원리는 아데노바이러스 VA RNA 유전자 전사를 조건부로 활성화시키기 위해 사용될 수도 있다.
아데노바이러스 VA RNA 유전자는 2가지 유전자내 요소인 A-박스 및 B-박스를 포함하는 2형 중합효소 III 프로모터에 의해 유도된다. Snouwaert et al. (Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8293-8303)은 프로모터 활성을 완전히 폐기하는 VA RNAI B-박스의 돌연변이체를 식별하였다. 이들 돌연변이는 PKR에 대한 VA RNAI의 결합 및 관련 기능에 영향을 미치지 않을 것이다(Clark, K.R., et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341).
본 발명의 추가의 양태는 신규한 아데노바이러스 VA RNA 유전자이다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 역위에 의해 Cre-재조합효소 매개 유전자 활성화를 가능하게 한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA에서, 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 아데노바이러스 VA RNA의 비-코딩, 즉 조절 요소에 도입된 LoxP 부위와 함께 정확한 전사 개시 부위를 갖는 임의의 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
본 발명가들은 TATA 박스가 LoxP 부위의 8 bp 스페이서 내로 통합되어 특이적으로 조작된 신규한 LoxP 부위를 생성할 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 신규한 LoxP 스페이서 서열 AGTTTATA (서열번호 01)는 Lx로 표시된다. 이러한 신규한 스페이서 서열은 임의의 공지된 역위 반복 서열, 예컨대, 서열번호 14 및 서열번호 15(서열번호 14+서열번호 01+서열번호 15)의 야생형 LoxP 역위 반복 서열뿐만 아니라, 서열번호 50 및 서열번호 51(=서열번호 03 및 서열번호05)의 LE- 및 Re-돌연변이 서열을 포함하는 역위 반복 서열과 정면 및 역위(inv) 형태(=서열번호 14+서열번호 02+서열번호 15)로 조합될 수 있다:
Lx ataacttcgtata - agtttata - tatacgaagttat
Lx (inv) ataacttcgtata - tataaact - tatacgaagttat
Lx-LEtaccgttcgtata - agtttata - tatacgaagttat
Lx-REataacttcgtata - agtttata - tatacgaacggta
LoxP 부위(1), 본 발명에 따른 Lx-LE 부위(돌연변이된 좌측 역위 반복부를 포함)(2), 및 예시적인 TATA 박스(3)의 서열 정렬 아래에 나타내었다(밑줄 친 TATA 박스, 굵은 글씨체로 표시한 스페이서 서열):
(1) ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
(2) TACCGTTCGTATAAG TTTATA TATACGAAGTTAT
(3) TTTATATAT
본 발명에 따른 Lx-LE 부위는 TATA 박스를 변화시키지 않고 남겨두며, 돌연변이 좌측 반복부(LE), 야생형 우측 반복부 및 신규 Lx 스페이서 서열을 포함한다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 서열번호 30 (TACCGTTCGTATAAGTTTATATATACGAAGTTA T)의 Cre-재조합효소 인식 서열 Lx-LE 이다.
따라서, 본 발명의 독립적인 양태는 LoxP 부위 AGTTATA(서열번호 01 정방향; 서열번호 02 역방향)이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 서열번호 01 또는 서열번호 02의 스페이서 서열은 야생형 좌측 역위 반복부 및 야생형 우측 역위 반복부와 조합된다. 이 Cre-재조합효소 인식 서열은 정방향으로 서열번호 14+서열번호 01+서열번호 15의 서열의 직접적인 조합 및 역방향으로 서열번호 14+서열번호 02+서열번호 15의 직접적인 조합을 갖는다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 서열번호 01 또는 서열번호 02의 스페이서 서열은 돌연변이된 좌측 역위 반복부 및 야생형 우측 역위 반복부와 조합된다. 이러한 Cre-재조합효소 인식 서열은 Lx-LE로 표시되고, 정방향으로 서열번호 03의 서열 및 역방향으로 서열번호 04의 서열을 가진다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 서열번호 01 또는 서열번호 02의 스페이서 서열은 돌연변이된 우측 역위 반복부 및 야생형 좌측 역위 반복부와 조합된다. 이러한 Cre-재조합효소 인식 서열은 Lx-RE로 표시되고, 정방향으로 서열번호 05의 서열 및 역방향으로 서열번호 06의 서열을 가진다.
본 발명의 독립적인 추가의 양태는 아데노바이러스 VA RNA 유전자의 전사에서 서열번호 03의 Cre-재조합효소 인식 서열의 사용이다.
본 발명의 독립적인 추가의 양태는 신규한 아데노바이러스 VA RNA 유전자이다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 역위에 의해 Cre-재조합효소 매개 유전자 활성화를 가능하게 한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA에서, 아데노바이러스 VA RNA 유전자 전사는 아데노바이러스 VA RNA의 비-코딩, 즉 조절 요소에 도입된 LoxP 부위와 함께 정확한 전사 개시 부위를 갖는 임의의 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
본 발명의 상기 양태는 도 16에서 도시된다.
바이러스 관련 RNA(VA RNA)는 아데노바이러스(Ad)의 비-코딩 RNA로서, 번역을 조절한다. 아데노바이러스 게놈은 2개의 독립적인 복제인: VAI(VA RNAI) 및 VAII(VA RNAII)를 포함한다. 둘 모두 RNA 중합효소 III에 의해 전사된다(예컨대, Machitani, M., et al., J. Contr. Rel. 154 (2011) 285-289를 참조).
계통발생학적 접근법을 이용한 아데노바이러스-관련 RNA의 구조, 기능 및 진화는 Ma, Y. 및 Mathews, M.B (J. Virol. 70 (1996) 5083-5099)에 의해 조사되었다. 이들은 47개의 공지된 인간 아데노바이러스 혈청형에 기초한 공통 VA RNA 서열뿐만 아니라 정렬을 제공하였다. 상기 개시는 본원에 그 전체가 본원에 원용된다.
VA RNA, VAI 및 VAII는 157-160개의 뉴클레오티드(nt)로 이루어진다.
혈청형에 따라, 아데노바이러스는 1개 또는 2개의 VA RNA 유전자를 포함한다. VA RNAI는 우세한 프로-바이러스 역할을 하는 것으로 여겨지는 반면, VA RNAII는 VA RNAI의 부재를 부분적으로 보상할 수 있다(Vachon, V.K. and Conn, G.L., Virus Res. 212 (2016) 39-52).
VA RNA는 필수적인 것은 아니지만, 세포 항바이러스 기구를 극복함으로써 효율적인 바이러스 성장에 중요한 역할을 한다. 즉, VA RNA가 바이러스 성장에 필수적인 것은 아니지만, VA RNA-결실 아데노바이러스는 벡터 생성의 초기 단계 동안 성장할 수 없고, 여기서 바이러스 게놈의 단지 몇 개의 복제가 세포당 존재하는데, 이는 아마도 세포 항바이러스 기구를 차단하는 VA RNA 이외의 바이러스 유전자가 충분히 발현되지 않을 수 있기 때문이다(예컨대, Maekawa, A., et al. Nature Sci. Rep. 3 (2013) 1136을 참조).
RNA 중합효소 III에 대한 내부 대조군 영역(또는 프로모터)을 구성하는 A- 및 B-박스는 아데노바이러스 혈청형 2(Ad 2) VA RNAI에 대해 실험적으로 정의되었다. 이들은 잘 보존되어 있다. 모든 VA RNA는 유사한 위치에 두 박스를 갖는다. B-박스 상동성은 매우 높다. B-박스의 34 내지 40 nt 상류에 위치하는 A-박스는 VA RNA의 일부에서 약간 덜 상동성이다. VA RNA의 정점 줄기의 일부를 형성하는 한 쌍의 상호 보완적인 테트라뉴클레오티드, CCGG(서열번호 77) 및 TATACGAAGTTAT(서열번호 78)는 VA RNA 서열에서 합리적으로 잘 보존된다. B-박스의 첫 번째 2개의 베이스를 포함하는 제1 CCGG는 불변이다. 하나를 제외한 모든 VA RNA 유전자는 tRNA 전사 개시 요소에 대해 5' 절반 상동성인 서열을 가지며, A- 및 B-박스 공통 서열 RRYNNARYGG(서열번호 79) 및 GWTCRANNC(서열번호 80)을 각각 갖는다. A-박스가 B-박스보다 VA RNA 전사에 덜 중요하다는 발견에 따라, VA RNAII 유전자에서의 A-박스 상동성은 일반적으로 VA RNAI 유전자에서의 상동성보다 약하다. VA RNA 코딩 서열의 말단에는 중합효소 III 종결 부위에 전형적인 뉴클레오티드 C 및 G에 의해 측접하는 일련의 T 잔기가 있다. 티미딘의 수는 최소 4 내지 10 초과로 가변되며, A 잔기는 T가 풍부한 일련의 잔기의 어느 한 측면에서 적어도 3 nt에 대해 부재한다(단, 매우 긴 일련의 T 잔기의 중간에 A 잔기를 갖는 Ad 12 및 Ad 18에서는 제외함)(Ma, Y. and Mathews, M.B., J. Virol. 70 (1996) 5083-5099).
VA RNAI 및 VA RNAII의 B-박스 서열은 내부 중합효소-III 프로모터의 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다.
Maekawa, A., et al. (Nature Sci. Rep. 3 (2013) 1136)은 세포 RNAi 기구를 방해하는 바이러스-관련 RNA의 유전자가 결여된 아데노바이러스 벡터의 효율적인 생산이 보고되었으며, 여기서 구성적으로 및 고도로 플립파제 재조합효소를 발현하는 HEK293 세포를 감염시켜 VA RNA 유전자좌의 FLP 재조합효소-매개된 절단에 의해 VA RNA-결실된 아데노바이러스를 수득하였다.
인간 아데노바이러스 2 VA RNAI(GenBank 등록 AC_000007의 뉴클레오티드 10586-10810) 서열은 서열번호 81; G58T/G59T/C68A(연속적인 잔기 넘버링)는 서열번호 82에 제시된다. 인간 아데노바이러스 5 VA RNAI(GenBank 등록 AC_000008의 뉴클레오티드 10579-10820) 서열은 서열번호 83; 인간 아데노바이러스 5 VA RNAI 및 VA RNAII는 서열번호 84에 제시된다.
Hahn, S. (Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (2004) 394-403) 및 Revyakin, A., et al. (Gen. Devel. 26 (2012) 1691-1702)은 RNA 중합효소 II 전사 기구 및 Nikitina, T.V. 및 Tishchenko, L.I (Mol. Biol. 39 (2005) 161-172)의 구조 및 기전에 대해 보고하였고, RNA 중합효소 III 전사 기구를 검토하였다. 이를 정리하면 하기와 같다.
전사, 즉 DNA 주형에서의 RNA 합성은 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 실시된다(Pols, [EC 2.7.7.6]). RNA 중합효소 이외에, 일반적인 전사 인자(GTF)라고 불리는 추가의 인자가 관여한다. 이들은 프로모터 서열의 인식, 조절 인자에 대한 반응, 및 전사 중 중합효소의 활성에 필요한 구조 변화를 위해 필요하다.
코어 프로모터(비조절 또는 기저 전사를 특정하는데 필요한 최소 DNA 서열)는 개시-전 복합체(PIC)로 지칭되는 상태로 Pol을 위치시키는 역할을 한다. 이 상태에서, Pol 및 GTF는 모두 프로모터에 결합하지만, 전사를 시작하기 위한 활성 입체구조에 있지 않다.
진핵 세포는 I, II 및 III으로 표시되는 3개의 Pol을 함유하며, 이는 하위단위 조성이 상이하다.
특정 Pol에 의해 전사된 유전자는 클래스 I, II, 또는 III에 대응하여 할당된다.
Pol I은 pre-rRNA에 대한 유전자를 전사한다. Pol II는 모든 단백질-코딩 유전자 및 U6 snRNA 이외의 snRNA에 대한 유전자를 전사한다. Pol III은 5S rRNA, tRNA, U6 snRNA, 7SK RNA, 7SL RNA에 대한 유전자; Alu 반복부; 일부 바이러스 유전자; 및 작은 안정한 비번역 RNA에 대한 유전자를 전사한다.
상이한 부류의 유전자들은 프로모터 구조에서 상이하며, 이는 PIC의 형성에 관여하는 기본(일반) 전사 인자 및 Pol을 결정한다.
RNA 중합효소 II(Pol II)는 진핵 세포에서 DNA로부터 메신저 RNA(mRNA)로의 유전 정보의 흐름을 담당한다. 연구에서는 GTF - TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, 및 TFIIH - 를 Pol II와 함께, 프로모터 부위에서 PIC로 조립하고 기초 활성 수준에서 전사 개시를 지시하는 것으로 확인되었다. 전사 활성의 추가 조절은 공동-활성인자에 의해 보조되는 서열-특이적 활성인자/억제인자에 의해 인식되는 DNA 주형에서의 cis 제어 요소에 의존한다.
Pol II 코어 프로모터에서 발견되는 서열 요소는 TATA 요소(TATA-결합 단백질(TBP) 결합 부위), BRE(TFIIB 인식 요소), Inr(개시자 요소) 및 DPE(하류 프로모터 요소)를 포함한다. 대부분의 프로모터는 이들 요소 중 하나 이상을 포함하지만, 프로모터 기능에 절대적으로 필수적인 요소는 없다. 프로모터 요소는 전사 기구의 하위단위에 대한 결합 부위이며, 프로모터에 전사 기구를 비대칭적으로 배향시켜 단방향 전사를 유도하는 역할을 한다.
TBP의 코어 도메인은 8-bp TATA 요소에서 DNA에 결합하는 분자를 형성하는 2개의 불완전한 반복부로 구성된다. TATA-함유 프로모터에서, 이 단백질-DNA 복합체의 형성은 전사 기구의 조립에서의 초기 단계이다. TATA-유사 서열은 전사 개시 부위의 약 30 bp 상류에 위치한다.
RNA 중합효소 III(Pol III)은 모든 진핵 Pol 중에서 가장 복잡한 구조를 갖고: 효소는 ~10 kDa 내지 ~160 kDa의 17개의 하위단위로 이루어지고, 600-680 kDa의 총 분자량을 갖는다.
Pol III에 의해 전사되는 부류 III 유전자는 3개의 구조적으로 다양한 프로모터를 포함하며, 이들은 대부분 세포내 위치를 갖는다. Pol III 기구의 일반적인 전사 인자는 TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC, 및 소형 핵 RNA-활성화 단백질 복합체(SNAPc)이다.
부류 III 유전자(유형 1, 2, 3)의 상이한 프로모터 상의 PIC의 조립은 A-, B- 및 C-박스; 내부 제어 영역(ICR); TATA 박스; 원위(DSE) 및 근위(PSE) 서열 요소 중 하나 이상을 필요로 한다. 1형 유전자는 +1의 전사 개시에 대하여 위치 +57에 A-박스 및 위치 +90에 C-박스를 포함한다. 2형 유전자는 A-박스 및 B-박스를 포함한다. 3형 유전자는 +1의 전사 개시에 대하여 위치 -250에 DSE, 위치 -60에 PSE, 및 위치 -27에 TATA-박스를 포함한다. A-박스가 존재할 수 있지만, 필수적인 것은 아니다.
모든 3가지 유형의 프로모터에 대한 Pol III의 모집 및 전사 개시는 전사 인자 IIIB(TFIIIB)의 작용을 필요로 하며, 고도로 조절된다. TFIIIB 결합 부위는 TATA 박스 주위의 +/-8 nt이다. 또한, TBP는 3개의 모든 중합효소에 의한 전사를 위해 필요하다(Han, Y., et al., Cell. Discover. 4 (2018) 40).
Pol III 유전자의 세 가지 유형에 관하여, Oler, A.J., et al. (Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (2010) 620-628)은 1) cis 조절 요소의 존재 및 위치, 및 2) 특정 기저 또는 부속 전사 인자에 대한 요건에 기초하여 인간에서 Pol III을 표적 유전자 및 Pol III의 3가지 '유형'으로 지시하기 위해 필요한 인자를 개략적으로 설명하였다. 간략하게, 5S rRNA는 유일하게 TFIIIA를 필요로 하는 1형 유전자이다. 1형 및 2형 유전자 둘 모두는 기본 인자 및 표적화 복합체인 TFIIIC를 필요로 하며, 이는 2형에서 유전자-내부 A-박스 및 B-박스 인자를 인식하지만, 1형 유전자는 인식하지 않는다. TFIIIB 복합체는 TATA/프로모터 인식 및 Pol III 개시를 위해 필요한 TBP를 포함한다. 2형 및 3형 유전자는 TFIIIB의 대안적인 조립을 활용한다: 2형에 대한 BRF1(TFIIIB-관련 인자 1) 및 3형 유전자에 대한 BRF2(TFIIIB-관련 인자 2). 3형 유전자는 내부 A- 또는 B-박스가 없고, TFIIIC에 대한 의존성이 없으며 - 대신 상류 PSE 및 DSE 및 표적화를 위한 특정 인자(OCT1, SNAPc, 기타)에 의존한다. 특히, 3형 Pol III 프로모터는 유전자-내부 요소보다는 상류 조절 요소를 활용하는 이의 아키텍처에서 Pol II 유전자와 유사하다.
본 발명에 따른 신규한 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 특정 구현예들에서 하기의 순서로 5'에서 3'의 방향으로
- 전사 개시 부위(TSS)를 포함하는 아데노바이러스 VA RNAI의 적어도 6개의 5'-말단 뉴클레오티드(후속 중합효소 III(폴리 III) 종결 인자의 우회를 방지하기 위함);
- (임의로 존재하는 구성적으로 활성인 상류 프로모터로부터 역 상보성 VA RNA의 전사를 방지하기 위한) 기능성 중합효소 III 종결 인자,
- 아데노바이러스 VA RNAI 서열을 역위 형태(3'에서 5’ 방향)로 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, VA RNA 유전자는 이의 5'-말단에 융합된 중합효소 프로모터를 추가로 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 직접적으로 또는 이의 5'-말단에 융합된 뉴클레오티드 링커를 통해 서열번호03의 Cre-재조합 부위를 추가로 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 직접 또는 뉴클레오티드 링커를 통하여 이의 5'-말단에 융합되는 서열번호 03의 Cre-재조합효소 부위 그리고 직접 또는 뉴클레오티드 링커를 통하여 이의 3'-말단에 융합되는 서열번호 06의 Cre-재조합효소 부위를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 서열은 서열번호 62 또는 서열번호 81 또는 서열번호 83의 야생형 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg ttcgaacccc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc ggctgctgcg ctagcttttt t.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 서열은 돌연변이 G58T, G59T 및 C68A(순차적 넘버링) (서열번호 62)를 갖는 야생형 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgttg ttcgaacacc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc ggctgctgcg ctagcttttt t.
도 15는 서열번호 62 및 서열번호 63의 상기 서열을 포함하는 배열을 도시한다.
5'-말단에서 서열번호 03 및 3'-말단에서 서열번호 06에 융합된 본 발명에 따른 상기 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 RMCI 이전에 도 16 및 RMCI 이후에 도 17에 도시된다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA는 하기의 서열을 하기의 순서로 5'에서 3'의 방향으로 포함한다:
(1) taccgttcgt ataagtttat atatacgaag ttat (서열번호 03)
(1a) 임의적으로 스터퍼 서열 ggacgaaaca cc (서열번호 68)
(2) gggcac (서열번호 64)
(3) tttttt (서열번호 65)
(4) aggagcgctc ccccgttgtc tgacgtcgca cacctgggtt cgacacgcgg gcggtaaccg catggatcac ggcggacggc cggatccggt gttcgaacaa cggtcgtccg ccatgatacc cttgcgaatt tatccaccag accacggaag agtgccc
(서열번호 66)
(5) taccgttcgt atatataaac ttatacgaag ttat (서열번호 06)
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 하기의: taccgttcgt ataagtttat atatacgaag ttatggacga aacaccgggc acttttttca gtggccaaaa aagctagcgc agcagccgcc gcgcctggaa ggaagccaaa aggagcgctc ccccgttgtc tgacgtcgca cacctgggtt cgacacgcgg gcggtaaccg catggatcac ggcggacggc cggatccggt gttcgaacaa cggtcgtccg ccatgatacc cttgcgaatt tatccaccag accacggaag agtgcccggt gtttcgtcct accgttcgta tatataaact tatacgaagt tat
(서열번호 67)의 서열을 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 Lx-LE 부위는 적절한 간격을 위한 스터퍼(stuffer) 서열을 포함하는 하기의 서열을 포함한다:
taccgttcgt ataagtttat atatacgaag ttatggacga aacacc
(서열번호 69).
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 아데노바이러스 VA RNA를 원래의 형태 또는 역위 형태로 포함하는 세포이다.
본 발명에 따른 DNA 요소 및 DNA 분자를 포함하는 예시적인 사용 및 방법
본 발명에 따른 임의의 핵산뿐만 아니라 이중 가닥 DNA 요소 또는 분자는 재조합 AAV 벡터 및 이를 포함하는 재조합 AAV 입자의 생산에 사용될 수 있다.
rAAV 입자를 생성하기 위해 상이한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 플라스미드 및 AAV 헬퍼 서열을 하나의 AAV 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두 바이러스)와의 공동-감염과 함께 사용하는 형질감염 또는 재조합 AAV 플라스미드, AAV 헬퍼 플라스미드 및 헬퍼 기능 플라스미드를 사용한 형질감염이 있다. rAAV 입자를 생성하기 위한 비제한적인 방법은, 예를 들어, US 6,001,650, US 6,004,797, WO 2017/096039, 및 WO 2018/226887에 기재되어 있다. 재조합 rAAV 입자 생성(즉, 세포 배양 시스템에서 입자 생성) 후, rAAV 입자는 숙주 세포 및 세포 배양 상청액으로부터 수득되고 정제될 수 있다.
본 발명의 양태는 본 발명에 따른 핵산(예컨대, 플라스미드)과 같은 분자로 세포를 형질도입하고 각각의 유전자 산물을 생산하는 방법이다. 추가적으로, 바이러스 패키징 단백질 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 같은 서열로 형질도입되는 경우, 이러한 세포는 관심의 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 관심의 전사체로 전사되는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있으며, 여기에서 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산을 포함하고, 이는 결과적으로 재조합 바이러스 입자를 높은 수율로 생산한다.
본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 DNA(요소)를 사용함으로써 현재의 '산업-표준' 바이러스(예컨대, AAV) 입자 생산 공정과 구별하는 특징을 포함하는 바이러스(예컨대, AAV) 입자 생산 플랫폼을 제공한다.
핵산(플라스미드)의 논의에 있어서, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향의 서열을 제공하는 협약에 따라 본원에 기재될 수 있다.
더 일반적으로, 이러한 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산이 형질감염 또는 형질도입된 세포는 "재조합 세포"로 지칭될 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들어, 패키징 단백질, 예컨대 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산(플라스미드), 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산(플라스미드), 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체, 즉 2개의 AAV ITR 사이에 위치한 이식유전자 내로 전사되는 핵산(플라스미드), 또는 다른 전달 핵산(플라스미드)의 수용체로서 사용된 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포일 수 있으며, 여기서 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함한다. 상기 용어는 형질도입 또는 형질감염된 원래의 세포의 자손을 포함한다. 단일 부모 세포의 자손(progeny)은 자연적, 우발적, 또는 의도적 돌연변이로 인해, 원래의 부모와 형태학 또는 게놈 또는 총 핵산 상보체(complement)에서 반드시 완전히 동일할 필요는 없는 것으로 이해된다.
세포 생존력을 유지하거나 세포 성장 및/또는 증식을 제공하기에 적합한 수많은 세포 성장 배지가 상업적으로 이용가능하거나 용이하게 생산될 수 있다. 이러한 배지의 예는 생존력을 유지하거나 포유류(예컨대, 인간) 세포의 성장을 제공하기 위한 배지와 같은 무혈청 진핵 성장 배지를 포함한다. 비제한적인 예는 Ham's F12 또는 F12K 배지(Sigma-Aldrich), FreeStyle(FS) F17 배지(Thermo-Fisher Scientific), MEM, DMEM, RPMI-1640(Thermo-Fisher Scientific) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 이러한 배지는 비타민 및/또는 미량 미네랄 및/또는 염 및/또는 아미노산, 예컨대 포유류(예컨대, 인간) 세포에 대한 필수 아미노산으로 보충될 수 있다.
헬퍼 단백질 플라스미드는 플라스미드, 파지, 트랜스포존(transposon) 또는 코스미드(cosmid) 형태일 수 있다. 특히, 헬퍼 기능을 위해 아데노바이러스 유전자의 완전-보체가 필요하지 않다는 것이 입증되었다. 예를 들어, DNA 복제 및 후기 유전자 합성이 불가능한 아데노바이러스 돌연변이체는 AAV 복제를 허용하는 것으로 나타났다. Ito et al., J. Gen. Virol. 9 (1970) 243; Ishibashi et al, Virology 45 (1971) 317.
E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이체는 AAV 복제를 지지하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 E2B 및 E3 영역이 아마도 헬퍼 기능을 제공하는데 관여하지 않음을 나타낸다. Carter et al., Virology 126 (1983) 505. 하지만, E1 영역에서 결함이 있거나 결실된 E4 영역을 갖는 아데노바이러스는 AAV 복제를 지원할 수 없다. 따라서, 아데노바이러스 헬퍼 단백질의 경우, E1A 및 E4 영역은 직접적으로 또는 간접적으로 AAV 복제에 필요할 수 있다(예컨대, Laughlin et al., J. Virol. 41 (1982) 868; Janik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 1925; Carter et al., Virology 126 (1983) 505를 참조). 다른 특징적인 아데노바이러스 돌연변이체는 하기의: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981 ), supra; Ostrove et al., Virology 104 (1980) 502); E2A (Handa et al., J. Gen. Virol. 29 (1975) 239; Strauss et al., J. Virol. 17 (1976) 140; Myers et al., J. Virol. 35 (1980) 665; Jay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 2927; Myers et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), supra); and E4 (Carter et al.(1983), supra; Carter (1995))를 포함한다.
E1B에서 돌연변이를 갖는 아데노바이러스에 의해 제공되는 헬퍼 단백질의 연구는 E1B 55 kDa 단백질이 AAV 입자 생산에 필요한 반면, E1B 19 kDa은 그렇지 않다는 것을 보고하였다. 또한, WO 97/17458 및 Matshushita et al. (Gene Therapy 5 (1998) 938-945)는 다양한 아데노바이러스 유전자를 인코딩하는 헬퍼 기능 플라스미드를 기재하였다. 헬퍼 플라스미드의 예는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kDa 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 원형 E1B 55 kDa 코딩 영역이 결여된 아데노바이러스 E1B 영역을 포함한다(예컨대, WO 01/83797을 참조).
따라서, 본원에서는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산 또는 DNA를 사용하여 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법으로서,
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나가 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 단계;
(ii) 관심의 단백질을 인코딩하거나 관심의 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii) 하나 이상의 포유류 또는 곤충 세포를 제공된 플라스미드와 접촉시키는 단계;
(iv) 형질감염 시약을 추가로 첨가하고, 임의적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나; 또는 핵산을 세포 내로 도입하기 위해, 물리적 수단, 예컨대 전류를 제공하는 단계;
(v) 상기 형질감염된 세포를 배양하고, 상기 배양하는 동안 특정 시점/배양 시간에 RMCI를 유도하는 단계;
(vi) 배양된 세포로부터 배양된 세포 및/또는 배양 배지를 회수하여 세포 및/또는 배양 배지 회수물 생성하는 단계; 및
(vii) 세포 및/또는 배양 배지 회수물로부터 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 분리 및/또는 정제하여 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법이다.
본 발명의 일 양태는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법으로서,
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계로서, 적어도 하나가 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 단계;
(ii) 관심의 단백질을 인코딩하거나 관심의 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii) 하나 이상의 포유류 또는 곤충 세포를 단계 (i)의 제공된 플라스미드와 접촉시키는 단계;
(iv) 형질감염 시약을 추가로 첨가하고, 임의적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나; 또는 핵산을 세포 내로 도입하기 위해, 물리적 수단, 예컨대 전류를 제공하는 단계;
(v) 안정하게 형질감염된 세포를 선택하는 단계;
(vi) 단계 (v)의 선택된 세포를 단계 (ii)의 제공된 플라스미드와 접촉시키는 단계;
(vii) 형질감염 시약을 추가로 첨가하고, 임의적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나; 또는 핵산을 세포 내로 도입하기 위해, 물리적 수단, 예컨대 전류를 제공하는 단계;
(viii) 단계 (viii)의 상기 형질감염된 세포를 배양하고, 상기 배양하는 동안 특정 시점/배양 시간에 RMCI를 유도하는 단계;
(ix) 배양된 세포로부터 배양된 세포 및/또는 배양 배지를 회수하여 세포 및/또는 배양 배지 회수물 생성하는 단계; 및
(x) 세포 및/또는 배양 배지 회수물로부터 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 분리 및/또는 정제하여 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법이다.
본 발명의 일 양태는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법으로서,
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 또는 곤충 세포를 제공하는 단계로서, 적어도 하나가 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 단계;
(ii) 관심의 단백질을 인코딩하거나 관심의 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii) 단계 (i)의 세포를 단계 (ii)의 제공된 플라스미드와 접촉시키는 단계;
(iv) 형질감염 시약을 추가로 첨가하고, 임의적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나; 또는 핵산을 세포 내로 도입하기 위해, 물리적 수단, 예컨대 전류를 제공하는 단계;
(v) 안정하게 형질감염된 세포를 선택하는 단계;
(vi) 단계 (v)의 안정하게 형질감염된 세포를 배양하고, 상기 배양하는 동안 특정 시점/배양 시간에 RMCI를 유도하는 단계;
(vii) 배양된 세포로부터 배양된 세포 및/또는 배양 배지를 회수하여 세포 및/또는 배양 배지 회수물 생성하는 단계; 및
(viii) 세포 및/또는 배양 배지 회수물로부터 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 분리 및/또는 정제하여 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법이다.
본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는 핵산의 세포 내로의 도입은 다수의 방식으로 실시될 수 있다.
포유류 세포로의 DNA 전달을 위한 다양한 방법이 당업계에 보고되어 있다. 이들은 모두 본 발명에 따른 방법에서 유용하다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 핵산 전달/형질감염을 위한 전기천공, 뉴클레오펙션(nucleofection) 또는 미세주입(microinjection)이 사용된다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 핵산 전달/형질감염을 위해 무기 물질(예컨대, 예를 들어, 인산칼슘/DNA 공침전), 양이온성 중합체(예컨대, 예를 들어, 폴리에틸렌이민, DEAE-덱스트란), 또는 양이온성 지질(리포펙션)이 사용된다. 인산칼슘 및 폴리에틸렌이민은 보다 큰 규모에서 핵산 전달을 위한 형질감염을 위해 가장 일반적으로 사용되는 시약이고(예컨대, Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29 (2007) 677-684), 여기서 폴리에틸렌이민이 바람직하다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는 핵산은 폴리에틸렌이민(PEI)과 조합한 조성물, 임의적으로 세포와 조합한 조성물로 제공된다. 특정 구현예들에서, 조성물은 하기의 복수의 성분을 갖는 플라스미드/PEI 혼합물을 포함한다: (a) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드로서, 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 플라스미드; (b) 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드; 및 (c) 폴리에틸렌이민(PEI) 용액. 특정 구현예들에서, 플라스미드는 약 1:0.01 내지 약 1:100의 몰비 범위이거나, 또는 약 100: 1 내지 약 1:0.01의 몰비 범위이고, 성분 (a), (b) 및 (c)의 혼합물은 임의적으로 약 10초 내지 약 4시간의 기간 동안 인큐베이션되었다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 조성물은 세포를 추가로 포함한다. 특정 구현예들에서, 세포는 성분 (a), (b) 및/또는 (c)의 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 조성물은 임의적으로 세포와 조합하여 유리 PEI를 추가로 포함한다. 특정 구현예들에서, 세포는 유리 PEI와 접촉한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 세포는 성분 (a), (b) 및/또는 (c)의 혼합물과 적어도 약 4시간, 또는 약 4시간 내지 약 140시간, 또는 약 4시간 내지 약 96시간 동안 접촉하였다. 바람직한 일 구현예에서, 세포는 성분 (a), (b) 및/또는 (c) 및 임의적으로 유리 PEI의 혼합물과 적어도 약 4시간 동안 접촉하였다.
본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는 핵산 이외에, 조성물은 추가적인 플라스미드를 포함할 수 있다. 이러한 플라스미드 및 세포는 유리 PEI와 접촉할 수 있다. 특정 구현예들에서, 플라스미드 및/또는 세포는 유리 PEI와 적어도 약 4시간, 또는 약 4시간 내지 약 140시간, 또는 약 4시간 내지 약 96시간 동안 접촉하였다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는 핵산을 사용하여 형질감염된 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자 및 임의적으로 하나 이상의 추가의 플라스미드를 포함하는 핵산을 제공하는 단계; 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 및 핵산 및 임의적으로 플라스미드(들)를 PEI 용액과 혼합하여 핵산/플라스미드/PEI 혼합물을 생성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예들에서, 이러한 혼합물은 약 10초 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 인큐베이션된다. 상기 방법에서, 그런 다음, 세포를 핵산/플라스미드/PEI 혼합물과 접촉시켜 핵산/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산한 다음; 유리 PEI를 생산된 핵산/플라스미드/PEI 세포 배양물에 첨가하여 유리 PEI/핵산/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산한 다음; 생산된 유리 PEI/핵산/플라스미드/PEI 세포 배양물을 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션시켜 형질감염된 세포를 생산한다. 특정 구현예들에서, 플라스미드는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함한다.
추가로, 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생산하는 형질감염된 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계로서, 여기서 이의 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 단계; 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계; 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 전술한 플라스미드를 PEI 용액과 혼합하는 단계로서, 플라스미드는 약 1:0.01 내지 약 1: 100의 몰비이거나, 또는 약 100: 1 내지 약 1:0.01의 몰비이며, 플라스미드/PEI 혼합물을 생성하는(및 임의적으로 약 10초 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 플라스미드/PEI 혼합물을 인큐베이션하는) 단계; 세포를 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉시켜 플라스미드/PEI 세포 배양물을 생성하는 단계; 유리 PEI를 생성된 플라스미드/PEI 세포 배양물에 첨가하여 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생성하는 단계; 및 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션시켜, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 입자를 생성하는 형질감염된 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
추가로, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계로서, 여기서 이의 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 단계; 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계; 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 전술한 플라스미드를 PEI 용액과 혼합하는 단계로서, 플라스미드는 약 1:0.01 내지 약 1: 100의 몰비이거나, 또는 약 100: 1 내지 약 1:0.01의 몰비이며, 플라스미드/PEI 혼합물을 생성하는(및 임의적으로 약 10초 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 플라스미드/PEI 혼합물을 인큐베이션하는) 단계; 세포를 기재된 바와 같이 생성된 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉시켜 플라스미드/PEI 세포 배양물을 생성하는 단계; 유리 PEI를 기재된 바와 같이 생성된 플라스미드/PEI 세포 배양물에 첨가하여 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생성하는 단계; 플라스미드/PEI 세포 배양물 또는 생성된 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션시켜 형질감염된 세포를 생성하는 단계; 생성된 형질감염된 세포로부터 생성된 형질감염된 세포 및/또는 배양 배지를 회수하여 세포 및/또는 배양 배지 회수물을 생성하는 단계; 및 생성된 세포 및/또는 배양 배지 회수물로부터 재조합 AAV 벡터 또는 입자를 단리 및/또는 정제함으로써 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 입자를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 DNA 요소를 사용하여 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생산하는 방법은 하나 이상의 추가 단계 또는 특징을 포함할 수 있다. 예시적인 단계 또는 특징은 생산된 배양된 세포를 회수하는 단계 및/또는 세포 및/또는 배양 배지 회수물을 생산하기 위해 생산된 배양된 세포로부터 배양 배지를 회수하는 단계를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 예시적인 단계 또는 특징은 세포 및/또는 배양 배지 회수물로부터 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 분리 및/또는 정제하여 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생성하는 단계를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, PEI는 다양한 시점에서 플라스미드 및/또는 세포에 첨가된다. 특정 구현예들에서, 플라스미드/PEI 혼합물이 세포와 접촉하기 전, 그와 동시에 또는 그 후에 유리 PEI가 세포에 첨가된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 세포는 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉될 때 및/또는 유리 PEI와 접촉될 때 특정 밀도 및/또는 세포 생장상 및/또는 생존능에 있다. 바람직한 일 구현예에서, 세포는 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉될 때 및/또는 유리 PEI와 접촉될 때 약 1x10E5 세포/mL 내지 약 1x10E8 세포/mL 범위의 밀도에 있다. 특정 구현예들에서, 플라스미드/PEI 혼합물 또는 유리 PEI와 접촉될 때 세포의 생존력은 약 60% 또는 60% 초과이거나, 또는 여기서 세포는 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉될 때 로그상 성장 상태이거나, 또는 플라스미드/PEI 혼합물 또는 유리 PEI와 접촉될 때 세포의 생존력은 약 90% 또는 90% 초과이거나, 또는 여기서 세포는 플라스미드/PEI 혼합물 또는 유리 PEI와 접촉될 때 로그상 성장 상태이다.
인코딩된 AAV 패키징 단백질은, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, AAV rep 및/또는 AAV cap을 포함한다. 이러한 AAV 패키징 단백질은 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서 임의의 AAV 혈청형의 AAV rep 및/또는 AAV cap 단백질을 포함한다.
인코딩된 헬퍼 단백질은, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 아데노바이러스 E2 및/또는 E4, VARNA 단백질, 및/또는 비-AAV 헬퍼 단백질을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 핵산(플라스미드)은 특정한 양 또는 비로 사용된다. 특정 구현예들에서, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드 및 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드의 총량으로서, 여기서 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 플라스미드의 총량은 세포 mL 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 15 ㎍ 범위이다. 특정 구현예들에서, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드 대 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드의 몰비로서, 여기서 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 플라스미드의 몰비는 약 1:5 내지 약 1:1의 범위, 또는 약 1:1 내지 약 5:1의 범위이다.
플라스미드는 상이한 또는 동일한 플라스미드 상의 핵산을 포함할 수 있다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 제1 플라스미드는 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 제2 플라스미드는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 이들 핵산중 적어도 하나는 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 분자를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드 대 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 플라스미드 대 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 플라스미드의 몰비는 공동-형질감염에서 약 1-5: 1: 1, 또는 1: 1-5: 1, 또는 1: 1: 1-5의 범위이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 세포는 진핵 세포이다. 특정 구현예들에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포이다.
배양은 약 37°C, 95% 습도 및 8 vol.-% CO2의 진핵 세포의 배양을 위해 일반적으로 사용되는 조건을 사용하여 실시할 수 있다. 배양은 혈청 함유 또는 무혈청 배지내에서, 부착 배양 또는 현탁 배양으로 실시할 수 있다. 현탁 배양은 임의의 발효 용기, 예컨대, 예를 들어, 교반 탱크 반응기, 웨이브 반응기(wave reactor), 진탕 용기 또는 스피너 용기 또는 소위 롤러 병에서 실시할 수 있다. 형질감염은 각각 높은 처리량 포맷 및 스크리닝으로, 예컨대, 96 또는 384 웰 포맷으로 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 임의의 혈청형의 AAV 입자, 또는 이의 변이체를 포함한다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 재조합 AAV 입자는 AAV 혈청형 1-12, AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질, 또는 변형된 또는 변이체 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질, 또는 야생형 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 중 임의의 것을 포함한다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, AAV 입자는 AAV 혈청형 또는 AAV 위형을 포함하고, 여기서 AAV 위형은 ITR 혈청형과 상이한 AAV 캡시드 혈청형을 포함한다.
AAV 벡터 또는 입자를 제공하거나 포함하는 본 발명에 따른 방법은 또한 다른 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소의 예는 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 역위 말단 반복부(ITR) 및/또는 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 요소는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산 내에 있거나 측접할 수 있거나, 또는 발현 조절 요소는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 AAV ITR(들)은 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산의 5'- 또는 3'-말단에 측접할 수 있거나, 또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질을 인코딩하거나 관심 전사체로 전사되는 핵산의 5'- 또는 3'-말단에 측접할 수 있다.
발현 조절 요소는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터(예컨대, 간에서의 발현을 제공하는)와 같은 구성적 또는 조절가능한 조절 요소를 포함한다.
ITR은 하기의: AAV2 또는 AAV6 또는 AAV8 또는 AAV9 혈청형, 또는 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있다. AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV10, AAV11, AAV-2i8 또는 AAV rh74 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 중 임의의 것에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 임의의 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함할 수 있거나, 또는 하기의: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV10, AAV11, AAV-2i8 및 AAV rh74 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 선택된 변형된 또는 변이체 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합 바이러스(예컨대, AAV) 입자의 생성 후, 원하는 경우, 바이러스(예컨대, rAAV) 입자는 다양한 종래의 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 정제 및/또는 단리될 수 있다. 이러한 방법은 컬럼 크로마토그래피 및 CsCl 구배 등을 포함한다. 예를 들어, 음이온 교환 컬럼, 친화성 컬럼 및/또는 양이온 교환 컬럼을 통한 정제와 같은 복수의 컬럼 정제 단계가 사용될 수 있다. (예컨대, WO 02/12455 and US 2003/0207439를 참조). 대안적으로, 또는 추가적으로, CsCl 구배 단계가 사용될 수 있다(예컨대, US 2012/0135515; 및 US 2013/0072548을 참조). 추가로, 패키징 및/또는 헬퍼 단백질을 발현시키기 위해 감염성 바이러스의 사용을 이용하면, 다양한 방법을 사용하여 잔류 바이러스를 비활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 대략 60°C의 온도로, 예컨대, 20분 이상 가열함으로써 비활성화될 수 있다. 이러한 치료는 헬퍼 아데노바이러스가 열 불안정성인 동안 AAV가 열 안정적이기 때문에 헬퍼 바이러스를 효과적으로 비활성화시킨다.
AAV 혈청형 및 이의 변이체를 포함하는 파르보-바이러스 입자와 같은 바이러스 벡터는 생체 외, 시험관 내 및 생체 내에서 세포 내로 핵산을 전달하기 위한 수단을 제공하며, 이는 세포가 인코딩된 단백질을 발현하도록 단백질을 인코딩한다. AAV는 세포를 침투하여 핵산/유전물질을 도입함으로써 세포 내에서 핵산/유전물질이 안정적으로 유지될 수 있어 유전자 치료 벡터로 유용한 바이러스이다. 또한, 이들 바이러스는, 예를 들어, 특정 부위에 핵산/유전 물질을 도입할 수 있다. AAV가 인간에서 병원성 질환과 연관되지 않기 때문에, AAV 벡터는 실질적인 AAV 발병 또는 질병을 유발하지 않고 인간 환자에게 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 치료 단백질 및 제제)을 전달할 수 있다.
사용될 수 있는 바이러스 벡터는 다중 혈청형의 아데노-관련 바이러스(AAV) 입자(예컨대, AAV-1 내지 AAV-12 등) 및 하이브리드/키메라 AAV 입자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
AAV 입자는 효과적인 유전자 전달을 위한 비히클로서 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 입자는, 세포 분열 및 비-분열에 대한 향성(tropism)을 포함하는, 이러한 응용을 위한 다수의 바람직한 특징을 갖는다. 이러한 벡터들을 사용한 초기 임상 경험은 또한 지속적인 독성을 나타내지 않았고, 면역 반응은 최소이거나 검출할 수 없었다. AAV는 수용체-매개 세포내 섭취(endocytosis) 또는 통과세포외배출(transcytosis)에 의해 생체내 및 시험관내에서 매우 다양한 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지되어 있다. 이들 벡터 시스템은 망막 상피, 간, 골격근, 기도, 뇌, 관절 및 조혈 줄기 세포를 표적으로 하는 인간에서 시험되었다.
재조합 AAV 입자는 전형적으로 발병과 연관된 바이러스 유전자를 포함하지 않는다. 이러한 벡터는 전형적으로 하나 이상의 야생형 AAV 유전자, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자가 전부 또는 부분적으로 결실되어 있지만, 재조합 벡터의 구조, 복제 및 AAV 입자로의 패키징에 필요한 바와 같이 적어도 하나의 기능적 측접 ITR 서열을 보유한다. 예를 들어, 벡터의 필수 부분, 예컨대, 각각 ITR 및 LTR 요소만이 포함된다. 따라서, AAV 벡터 게놈은 복제 및 패키징을 위해 cis에 요구되는 서열(예컨대, 기능성 ITR 서열)을 포함할 것이다.
재조합 AAV 벡터뿐만 아니라 이의 방법 및 사용은 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적인 예로서, 재조합 AAV 벡터는 임의의 AAV 게놈, 예컨대, 예를 들어 AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, 2i8, 또는 AAV rh74에 기초할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 하위군 또는 변이체)에 기초할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 비제한적인 예로서, 하나의 혈청형 게놈에 기초한 재조합 AAV 벡터는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 게놈은 벡터를 패키징하는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질과 구별되는 AAV(예컨대, AAV2) 혈청형 게놈에 기초할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈은 AAV2에 기초할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는, 예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 또는 AAV rh74 또는 이의 변이체일 수 있다. AAV 변이체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8 및 AAV rh74 캡시드의 변이체 및 키메라를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는, 예를 들어, WO 2013/158879, WO 2015/013313 및 US 2013/0059732에 기재된 바와 같이(LK01, LK02, LK03 등을 개시함) AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 및 AAV rh74뿐만 아니라 이의 변이체(예컨대, 캡시드 변이체, 예컨대, 아미노산 삽입, 부가, 치환 및 결실)를 포함한다.
AAV 및 AAV 변이체(예컨대, 캡시드 변이체) 혈청형(예컨대, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)은, 예를 들어, AAV1-AAV12를 포함한 다른 AAV 혈청형과 별개이거나 별개이지 않을 수 있다(예컨대, AAV1-AAV12 혈청형 중 임의의 것의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열과 별개임).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 참조 혈청형과 관련된 AAV 입자는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8 또는 AAV rh74(예컨대, 예를 들어, ITR, 또는 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)와 적어도 80% 이상(예컨대, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등)의 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 하위서열을 갖는다.
본 발명의 조성물, 방법 및 사용은 참조 AAV 혈청형, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 또는 AAV rh74에 대해 100% 미만의 서열 동일성을 나타내지만, 공지된 AAV 유전자 또는 단백질, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 또는 AAV rh74, 유전자 또는 단백질 등과 별개이고 동일하지 않은 AAV 서열(폴리펩티드 및 뉴클레오티드), 및 이의 하위서열은 포함한다. 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, AAV 폴리펩티드 또는 이의 하위서열은 임의의 참조 AAV 서열 또는 이의 하위서열, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 또는 AAV rh74(예컨대, VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 또는 ITR)과 적어도 75% 이상, 예컨대, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 100%까지 동일한 서열을 포함하거나 이로써 구성된다. 특정 구현예들에서, AAV 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 또는 AAV rh74를 포함하는 재조합 AAV 입자, 및 변이체, 관련된, 하이브리드 및 키메라 서열은 하나 이상의 기능성 AAV ITR 서열과 측접된 하나 이상의 핵산 서열(이식유전자)을 포함하도록 당업자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 구성될 수 있다.
재조합 입자(예컨대, rAAV 입자)는 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 특히 생체내 또는 생체외에서 개체에 투여 및 전달에 유용하다. 특정 구현예들에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제는 그 자체로 조성물을 받는 개체에게 유해한 면역 반응을 유도하지 않으며, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다.
아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 프로토콜은 US 5,998,205; US 6,228,646; US 6,093,699; US 6,100,242; WO 94/17810 및 WO 94/23744에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
사람에 대한 병원성에도 불구하고, rAAV 벡터 생산 및 정제 시스템의 목적은 야생형/유사 야생형 AAV 종(wtAAV) 및 AAV-캡슐화된 잔류 DNA 불순물을 포함하는 단백질, 핵산 및 벡터-관련 불순물과 같은 생산 관련 불순물의 생성을 최소화/제어하는 전략을 구현하는 것이다.
rAAV 입자가 단지 미량의 바이오매스를 나타낸다는 것을 고려하면, rAAV 입자는 임상적 인간 유전자 요법 산물로서 사용될 수 있는 순도 수준으로 정제될 필요가 있다(예컨대, Smith P.H., et al., Mo. Therapy 7 (2003) 8348; Chadeuf G., et al, Mo. Therapy 12 (2005) 744; CHMP 유전자 치료 전문가 그룹 미팅, 유럽 의약품 기구 EMEA/CHMP 2005, 183989/2004로부터의 보고서를 참조).
초기 단계로서, 전형적으로 rAAV 입자를 생성하는 배양된 세포는 임의적으로 rAAV 입자를 생성하는 세포(현탁액 또는 부착물)가 배양된 세포 배양 상청액(배지)의 회수와 조합하여 회수된다. 회수된 세포 및 임의적 세포 배양 상청액은 그대로 또는 적절히 이용되거나, 농축될 수 있다. 추가로, 감염이 헬퍼 기능을 발현하기 위해 사용되는 경우, 잔여 헬퍼 바이러스가 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 대략 60°C의 온도로, 예컨대, 20분 이상 가열함으로써 비활성화될 수 있으며, 이는 헬퍼 아데노바이러스가 열 불안정한 동안 AAV가 열 안정성이기 때문에 헬퍼 바이러스을 배타적으로 비활성화한다.
회수물의 세포 및/또는 상청액은 세포를 파괴함으로써, 예를 들어, 세제, 미세유동화 및/또는 균질화와 같은 화학적 또는 물리적 수단에 의해 용해되어 rAAV 입자를 방출한다. 세포 용해 동안 동시에 또는 후속적으로 세포 용해 후에, 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어, 벤조나아제가 첨가되어 오염성 DNA를 분해한다. 전형적으로, 생성된 용해물은, 예컨대, 여과 또는 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하기 위해 정화되어 정화된 세포 용해물을 수득한다. 특정 예에서, 용해물은 마이크론 직경의 기공 크기 필터(예컨대, 0.1 내지 10.0 μm 기공 크기 필터, 예를 들어, 0.45 μm 및/또는 기공 크기 0.2 μm 필터)로 여과되어, 정제된 용해물을 생성한다.
용해물(임의로 정화된)은 AAV 입자(rAAV 벡터뿐만 아니라 빈 캡시드를 포함함) 및 생산/공정 관련 불순물, 예컨대, 특히, 세포 단백질, 지질 및/또는 핵산, 및 세포 배양 배지 성분을 포함할 수 있는 숙주 세포로부터의 가용성 세포 성분을 함유한다. 그런 다음, 임의로 정화된 용해물은 정제 단계에 적용되어 크로마토그래피를 사용하여 불순물로부터 AAV 입자 (rAAV 벡터 포함)를 정제한다. 정화된 용해물은 제1 크로마토그래피 단계 이전에 적절한 완충액으로 희석 또는 농축될 수 있다.
세포 용해, 선택적 정화, 및 선택적 희석 또는 농축 후, 복수의 후속 및 순차적 크로마토그래피 단계가 rAAV 입자를 정제하기 위해 사용될 수 있다.
제1 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 제1 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피인 경우, 제2 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)일 수 있다. 따라서, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자 정제는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제한다.
대안적으로, 제1 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 크로마토그래피이면, 제2 크로마토그래피 단계는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)일 수 있다. 따라서, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자 정제는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제한다.
또한 대안적으로, 제1 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피일 수 있다. 제1 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피인 경우, 제2 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 따라서, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자 정제는 친화성 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제한다.
선택적으로, 제3 크로마토그래피가 전술한 크로마토그래피 단계에 추가될 수 있다. 전형적으로, 선택적인 제3 크로마토그래피 단계는 양이온 교환, 음이온 교환, 크기 배제 또는 친화도 크로마토그래피를 따른다.
따라서, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자 정제는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제한다.
또한, 모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 추가의 rAAV 입자 정제는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제한다.
모든 양태 및 구현예의 다른 추가의 구현예들에서, rAAV 입자 정제는 친화성 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제한다.
모든 양태 및 구현예의 다른 추가의 구현예들에서, rAAV 입자 정제는 친화성 크로마토그래피를 통해 실시한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제한다.
양이온 교환 크로마토그래피는 친화성 또는 크기 배제 크로마토그래피로부터 정화된 용해물 및/또는 컬럼 용출액에 존재하는 세포 및 다른 성분으로부터 AAV 입자를 분리하는 기능을 한다. 넓은 pH 범위에 걸쳐 rAAV 입자에 결합할 수 있는 강한 양이온 교환 수지의 예는 설포프로필 또는 설포에틸 수지와 같은 아릴 및 알킬 치환된 설포네이트를 포함하는 설포네이트 작용기의 존재에 의해 표시되는 임의의 설폰산계 수지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 매트릭스는 POROS HS, POROS HS 50, POROS XS, POROS SP, 및 POROS S(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Fisher Scientific, Inc.로부터 입수가능한 강한 양이온 교환기들)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 예는 Capto S, Capto S ImpAct, Capto S ImpRes(미국 매사추세츠주 말보로 소재의 GE Healthcare로부터 입수가능한 강한 양이온 교환기), 및 Aldrich Chemical Company(미국 위스콘신주 밀리포키 소재)로부터 입수가능한 상업적 DOWEX®, AMBERLITE®, 및 AMBERLYST® 계열의 수지를 포함한다. 약한 양이온 교환 수지는, 제한 없이, 임의의 카르복실산계 수지를 포함한다. 예시적인 양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM), 포스포(포스페이트 작용기를 기준으로 함), 메틸 설포네이트(S) 및 설포프로필(SP) 수지를 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피는 친화성 또는 양이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피로부터 정화된 용해물 및/또는 컬럼 용출액에 존재하는 단백질, 세포 및 다른 성분으로부터 AAV 입자를 분리하는 기능을 한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 또한 용출액 중 빈 캡시드의 양을 감소시키고 이에 의해 제어하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, rAAV 입자가 결합된 음이온 교환 컬럼은 적당한 농도(예컨대, 약 100-125 mM, 예컨대 110-115 mM)의 NaCl을 포함하는 용액으로 세척될 수 있고, 빈 캡시드의 일부는 rAAV 입자의 실질적인 용출 없이 통과액 중에서 용리될 수 있다. 후속적으로, 음이온 교환 칼럼에 결합된 rAAV 입자는 더 높은 농도의 NaCl(예컨대, 약 130-300 mM NaCl)을 포함하는 용액을 사용하여 용리될 수 있고, 이에 의해 rAAV 벡터를 포함하는 감소된 또는 고갈된 양의 빈 캡시드 및 비례적으로 증가된 양의 rAAV 입자를 갖는 칼럼 용출액을 생성한다.
예시적인 음이온 교환 수지는 폴리아민 수지 및 다른 수지를 기재로 하는 것을 제한 없이 포함한다. 강한 음이온 교환 수지의 예는 트리알킬벤질 암모늄 수지와 같은 4급 암모늄 염 수지를 제한 없이 포함하여 일반적으로 4급 질소 원자에 기초한 것을 포함한다. 적합한 교환 크로마토그래피 재료는, 제한 없이, MACRO PREP Q(Hercules, CA, USA에 소재한 BioRad로부터 입수가능한 강한 음이온 교환기); UNOSPHERE Q(Hercules, CA, USA에 소재한 BioRad로부터 입수가능한 강한 음이온 교환기); POROS 50HQ(Foster City, CA, USA에 소재한 Applied Biosystems로부터 입수가능한 강한 음이온 교환기); POROS XQ(Foster City, CA, USA에 소재한 Applied Biosystems로부터 입수가능한 강한 음이온 교환기); POROS SOD(Foster City, CA, USA에 소재한 Applied Biosystems로부터 입수가능한 약한 음이온 교환기); POROS 50PI(Foster City, CA, USA에 소재한 Applied Biosystems로부터 입수가능한 약한 음이온 교환기); Capto Q, Capto XQ, Capto Q ImpRes, 및 SOURCE 30Q(Marlborough, MA, USA에 소재한 GE healthcare로부터 입수가능한 강한 음이온-교환기); DEAE SEPHAROSE(Piscataway, NJ, USA에 소재한 Amersham Biosciences, Piscataway로부터 입수가능한 약한 음이온-교환기); Q SEPHAROSE(Piscataway, NJ, USA로부터 입수가능한 Amersham Biosciences 강한 음이온-교환기)를 포함한다. 추가의 예시적인 음이온 교환 수지는 아미노에틸(AE), 디에틸아미노에틸(DEAE), 디에틸아미노프로필(DEPE) 및 사차 아미노에틸(QAE)을 포함한다.
인간 질병을 치료하기 위한 생성물로서 의도된 재조합 AAV 입자를 정제하기 위한 제조 공정은 다음의 목적을 달성해야 한다: 1) 일관된 입자 순도, 효능 및 안전성; 2) 제조 공정 확장성; 및 3) 허용 가능한 제조 비용.
재조합 AAV 입자 정제를 위한 예시적인 공정은 WO 2019/006390에 보고되어 있다.
하기 개략된 재조합 아데노-연관 바이러스 입자(rAAV 입자) 정제 및 생산 방법은 최대 규모까지 확장가능하다. 예를 들어, 5, 10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-200 또는 그 이상의 리터 부피의 현탁 배양물로 확장가능하다. 재조합 아데노-연관 바이러스 입자 정제 및 생산 방법은 매우 다양한 AAV 혈청형/캡시드 변이체에 적용가능하다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자의 정제는 하기의:
(a) rAAV 입자를 포함하는 세포 및/또는 세포 배양 상청액을 회수하여 회수물을 생성하는 단계;
(b) 임의적으로 단계 (a)에서 생성된 회수물을 농축시켜 농축된 회수물을 생성하는 단계;
(c) 상기 단계 (a)에서 생성된 회수물 또는 상기 단계 (b)에서 생성된 농축 회수물을 용해시켜 용해물을 생성하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 용해물을 처리하여 용해물 중의 오염성 핵산을 감소시켜 핵산 환원된 용해물을 생성하는 단계;
(e) 임의적으로 단계 (d)에서 생성된 핵산 환원된 용해물을 여과하여 정화된 용해물을 생성하고, 임의적으로 정화된 용해물을 희석하여 희석된 정화된 용해물을 생성하는 단계;
(f) 단계 (d)의 핵산 환원된 용해물, 단계 (e)의 정화된 용해물, 또는 단계 (e)에서 생성된 희석된 정화된 용해물을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 컬럼 용출물을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 또는 다른 생성/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 컬럼 용출물을 희석시켜 희석된 컬럼 용출물을 생성하는 단계;
(g) 단계 (f)에서 생성된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생성하고, 이에 의해 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 임의적으로 제2 컬럼 용출액을 농축시켜 농축된 제2 컬럼 용출액을 생성하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 생성된 제2 컬럼 용출액 또는 농축된 제2 컬럼 용출액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(SEC)에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 또는 생산/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 제3 컬럼 용출액을 농축시켜 농축된 제3 컬럼 용출액을 생성하는 단계; 및
(i) 단계 (h)에서 생성된 제3 컬럼 용출액 또는 농축된 제3 컬럼 용출액을 여과하여 정제된 rAAV 입자를 생성하는 단계를 포함한다.
특정 구현예들에서, 단계 (a) 내지 (f)는 유지되고 하기의:
(g) 단계 (f)에서 생성된 컬럼 용출액 또는 농축된 컬럼 용출액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(SEC)에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 또는 다른 생산/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 제2 컬럼 용출액을 희석시켜 농축된 제2 컬럼 용출액을 생성하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 생성된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 음이온 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 생산/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 제3 컬럼 용출액을 희석시켜 희석된 제3 컬럼 용출액을 생성하는 단계; 및
(i) 단계 (h)에서 생성된 제3 컬럼 용출액 또는 농축된 제3 컬럼 용출액을 여과하여 정제된 rAAV 입자를 생성하는 단계와 조합된다.
특정 구현예들에서, 단계 (a) 내지 (g)는 유지되고 하기의:
(i) 단계 (g)에서 생성된 제2 컬럼 용출액 또는 농축된 제2 컬럼 용출액을 여과하여 정제된 rAAV 입자를 생성하는 단계와 조합된다.
구현예들에서, 단계 (a) 내지 (e)는 유지되고 하기의:
(f) 단계 (d)의 핵산 환원된 용해물, 또는 단계 (e)에서 생성된 정화된 용해물 또는 희석된 정화된 용해물을 친화성 교환 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 컬럼 용출물을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 또는 다른 생성/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 컬럼 용출물을 농축시켜 농축된 컬럼 용출물을 생성하는 단계;
(g) 단계 (f)에서 생성된 컬럼 용출액 또는 농축된 컬럼 용출액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(SEC)에 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 또는 다른 생산/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 제2 컬럼 용출액을 희석시켜 희석된 제2 컬럼 용출액을 생성하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 생성된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 음이온 컬럼 크로마토그래피에 임의적으로 적용하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생성하고, 이에 의해 단백질 불순물 또는 다른 생산/공정 관련 불순물로부터 rAAV 입자를 분리하고, 임의적으로 제3 컬럼 용출액을 희석시켜 희석된 제3 컬럼 용출액을 생성하는 단계; 및
(i) 단계 (g)에서 생성된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 여과하거나, 단계 (h)에서 생성된 제3 컬럼 용출액 또는 농축된 제3 컬럼 용출액을 여과하여 정제된 rAAV 입자를 생성하는 단계와 조합된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (b) 및/또는 단계 (f) 및/또는 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 농축은 한외여과/정용여과를 통해, 예컨대, 접선 유동 여과(TFF)에 의해 이루어진다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (b)의 농축은 회수된 세포 및 세포 배양 상청액의 부피를 약 2~20배 감소시킨다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f) 및/또는 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 농축은 컬럼 용출액의 부피를 약 5~20배 감소시킨다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (a)에서 생성된 회수물 또는 단계 (b)에서 생성된 농축된 회수물의 용해는 물리적 또는 화학적 수단에 의한 것이다. 물리적 수단의 비제한적인 예는 미세유동화 및 균질화를 포함한다. 화학적 수단의 비제한적인 예는 용제를 포함한다. 용제는 비이온성 및 이온성 용제를 포함한다. 비이온성 용제의 비제한적인 예는 트리톤(Triton) X-100을 포함한다. 용제 농도의 비제한적인 예는 약 0.1 내지 1.0%(v/v) 또는 (w/v)이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (d)는 뉴클레아제로 처리하여 오염성 핵산을 감소시키는 것을 포함한다. 뉴클레아제의 비제한적인 예는 벤조나아제를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (e)의 정화된 용해물 또는 희석된 정화된 용해물의 여과는 필터를 통해 이루어진다. 필터의 비제한적인 예는 기공 직경이 약 0.1 내지 10.0 미크론(종점 포함)인 것들이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (e)의 정화된 용해물의 희석은 수성 인산염 완충액, 아세테이트 또는 트리스(Tris) 용액으로 이루어진다. 용액 pH의 비제한적인 예는 약 pH 4.0 내지 pH 7.4이다(종점 포함). 트리스 용액 pH의 비제한적인 예는 pH 7.5 초과, 예컨대 약 pH 8.0 내지 pH 9.0이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f)의 컬럼 용출액 또는 단계 (g)의 제2 컬럼 용출액의 희석은 인산염 완충액, 아세테이트 또는 트리스 용액으로 이루어진다. 용액 pH의 비제한적인 예는 약 pH 4.0 내지 pH 7.4이다(종점 포함). 트리스 용액 pH의 비제한적인 예는 pH 7.5 초과, 예컨대 약 pH 8.0 내지 pH 9.0이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (i)로부터 생성된 rAAV 입자는 rAAV 입자 제제를 생성하기 위해 계면활성제와 함께 제제화된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f), 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 조절된 컬럼 크로마토그래피를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 컬럼으로부터 rAAV 입자의 용출 전에 PEG 용액으로 세척한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, PEG는 평균 분자량이 약 1,000 g/mol 내지 80,000 g/mol의 범위이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, PEG는 약 4% 내지 약 10%(w/v)의 농도이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 컬럼은 컬럼으로부터 rAAV 입자의 용출 전에 수성 계면활성제 용액으로 세척한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f)의 양이온 교환 컬럼은 컬럼으로부터 rAAV 입자의 용출 전에 계면활성제 용액으로 세척한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, PEG 용액 및/또는 계면활성제 용액은 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액, 수성 인산염/NaCl 완충액, 또는 수성 아세테이트/NaCl 완충액을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 완충액 또는 용액 중 NaCl 농도는 약 20-300 mM NaCl(종점 포함) 또는 약 50-250 mM NaCl(종점 포함)의 범위이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 계면활성제는 양이온성 또는 음이온성 계면활성제를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 계면활성제는 12개의 탄소 사슬 계면활성제를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 계면활성제는 도데실트리메틸암모늄 클로라이드(DTAC) 또는 사르코실(Sarkosyl)을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자는 단계 (f), 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 컬럼으로부터 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액을 사용하여 용리된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, Tris-HCl/NaCl 완충액은 임의적으로 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0 범위의(종점 포함) pH에서 100-400 mM NaCl을(종점 포함) 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f), 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 컬럼은 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액으로 세척한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액 중 NaCl 농도는 약 75-125 mM의 범위이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액의 pH는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f), 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 칼럼은 제2 또는 제3 칼럼 용출액 중 빈 캡시드의 양을 감소시키기 위해 1회 이상 세척한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 음이온 교환 컬럼 세척은 rAAV 입자 용리 전 및/또는 rAAV 입자 용출 대신에 컬럼으로부터 빈 캡시드를 제거하고, 이에 의해 제2 또는 제3 컬럼 용출액 중 빈 캡시드의 양을 감소시킨다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 음이온 교환 컬럼 세척은 rAAV 입자 용출 전 및/또는 rAAV 입자 용출 대신에 컬럼으로부터 총 빈 캡시드의 적어도 약 50%를 제거하고, 이에 의해 제2 또는 제3 컬럼 용출액 중 빈 캡시드의 양을 약 50%만큼 감소시킨다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액 중 NaCl 농도는 약 110-120 mM의 범위이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 용리되는 rAAV 입자 및 빈 캡시드의 비 및/또는 양은 세척 완충액에 의해 제어된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자는 수성 인산염/NaCl 완충액, 또는 수성 아세테이트/NaCl 완충액에서 단계 (f)의 양이온 교환 컬럼으로부터 용리된다. 완충액 중 비제한적 NaCl 농도는 약 125-500 mM NaCl의 범위이다(종점 포함). 완충액 pH의 비제한적인 예는 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5이다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f), 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 음이온 교환 컬럼은 사차 암모늄 작용기, 예컨대, 사차 폴리에틸렌이민을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 크기 배제 컬럼(SEC)은 약 10,000 g/mol 내지 약 600,000 g/mol의 분리/분별 범위(분자량)를 갖는다(종점 포함).
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (f)의 양이온 교환 칼럼은 설폰산 또는 작용기, 예컨대, 설포프로필을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, AAV 친화성 칼럼은 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 단백질 또는 리간드를 포함한다. 단백질의 비제한적인 예는 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 항체를 포함한다. 더 구체적인 비제한적인 예는 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 단일 사슬 라마 항체(카멜리드)를 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 상기 방법은 염화세슘 구배 초원심분리 단계를 배제한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 방법은 단계 (a)에서 생성된 회수물 또는 단계 (b)에서 생성된 농축된 회수물로부터 총 rAAV 입자의 대략 50-90%를 회수한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 방법은 단일 AAV 친화성 컬럼 정제에 의해 생성되거나 정제된 rAAV 입자보다 더 큰 순도를 갖는 rAAV 입자를 생성한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 단계 (c) 및 단계 (d)는 실질적으로 동시에 실시된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, NaCl 농도는 단계 (c) 후 하지만 단계 (f) 전에 약 100-400 mM NaCl(종점 포함)의 범위, 또는 약 140-300 mM NaCl(종점 포함)의 범위로 조정된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10 및 Rh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV로부터 유래된다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74, 서열번호 75 또는 서열번호 76의 캡시드 서열에 대해 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드 서열을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10 또는 Rh74 ITR 서열에 대해 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 ITR 서열을 포함한다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 세포는 현탁 성장 세포 또는 부착 성장 세포이다.
모든 양태 및 구현예의 특정 구현예들에서, 세포는 포유류 세포이다. 비제한적인 예는 HEK 세포, 예컨대, HEK-293 세포, 및 CHO 세포, 예컨대, CHO-K1 세포를 포함한다.
이식유전자를 함유하는 rAAV 입자의 감염성 역가를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Zhen et al., Hum. Gene Ther. 15 (2004) 709를 참조). 패키징된 이식유전자를 갖는 rAAV 입자 및 빈 캡시드를 분석하는 방법이 공지되어 있다(예컨대, Grimm et al., Gene Therapy 6 (1999) 1322-1330; Sommer et al., Malec. Ther. 7 (2003) 122-128을 참조).
분해된/변성된 캡시드의 존재 또는 양을 결정하기 위해, 정제된 rAAV 입자는 3개의 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들어, 구배 겔로 이루어진 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용될 수 있고, 이어서 샘플이 분리될 때까지 겔을 실행시키고, 겔을 나일론 또는 니트로셀룰로스 막 상에 블롯팅할 수 있다. 그런 다음, 항-AAV 캡시드 항체를 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 1차 항체로서 사용한다(예컨대, Wobus et al., J. Viral. 74 (2000) 9281-9293을 참조). 일차 항체에 결합하는 이차 항체는 일차 항체를 검출하기 위한 수단을 함유한다. 1차 및 2차 항체 사이의 결합은 캡시드의 양을 결정하기 위해 반-정량적으로 검출된다. 다른 방법은 SEC 컬럼 또는 분석적 초원심분리기를 이용한 분석적 HPLC일 것이다.
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설명된 그리고 청구범위에 기재된 다양한 실시형태들 이외에도, 본원 발명은 또한 본원에 개시되고 본원 청구범위에 기재된 특징들의 그 외 조합들을 가지는 다른 실시형태들에도 관련된다. 이와 같이, 여기에 제시된 특정한 특징들은 개시된 주제가 여기에 개시된 특징들의 임의의 적합한 조합을 포함하도록 개시된 주제의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 주제의 특이적 구체예들의 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제공되었다. 개시된 주제를 개시된 구체예들로 제한하거나 또는 배타적이지 않다.
본원에 언급된 모든 참조는 본원에 원용된다.
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하기 실시예, 서열 및 도면은 본 발명에 관한 이해를 보조하기 위해 제공되고, 이의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 진술된다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고 제시된 절차에서 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
일반적인 기술
1) 재조합 DNA 기술
DNA를 조작하기 위해, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용한다.분자 생물학적 시약들은 제조업체의 지침에 따라 사용한다.
2) DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
EMBOSS(유럽 분자생물학 개방 소프트웨어 스위트) 소프트웨어 패키지 및 Invitrogen의 벡터 NTI 및 Geneious Prime을 서열 창출, 매핑, 분석, 주해 및 도해에 사용한다.
3) 유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
원하는 유전자 절편은 Geneart GmbH(Regensburg, Germany)에서 화학적 합성에 의해 준비한다. 합성된 유전자 단편은 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드로 클로닝한다. 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 검증한다. 대안적으로, 짧은 합성 DNA 단편들은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하거나 또는PCR을 통해 조립한다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)에서 제조한다.
4) 시약
모든 상업적 화학 물질, 항체 및 키트는, 달리 명시되지 않는 한, 제조업체의 프로토콜에 따라 제공된 대로 사용한다.
5) TI 숙주 세포주의 배양
TI CHO 숙주 세포는 85% 습도 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 상기 세포는 300 μg/ml 히그로마이신 B 및 4 μg/ml의 제2 선택 마커를 포함하는 등록된 DMEM/F12 기반 배지에서 배양한다. 세포를 30 ml의 총 부피에서 0.3x10E6 세포/ml의 농도로 3일 또는 4일마다 분할한다. 배양을 위해 125 ml 비-배플형 삼각 진탕 플라스크들을 사용한다. 세포를 5 cm의 진탕 진폭으로 150 rpm에서 진탕시킨다. 세포 수는 Cedex HiRes 세포 계수기(Roche)로 측정한다. 세포는 60일령이 될 때까지, 배양물에서 유지한다.
6) 클로닝
일반
R 부위를 사용한 클로닝은 이어지는 단편에 있는 서열과 동일한 관심 유전자(GOI) 옆의 DNA 서열에 따라 달라진다. 이와 같이 단편들의 조립은 동일한 서열들의 중첩 및 DNA 연결효소에 의한 조립된 DNA 내 틈들의 연속 봉쇄에 의해 가능하다. 따라서, 단일 유전자, 특히 올바른 R-부위를 함유하는 예비 플라스미드의 클로닝이 필요하다. 이러한 예비 플라스미드의 성공적인 클로닝 후, R-부위에 의해 측접된 관심 유전자는 R-부위 바로 옆에서 절단되는 효소에 의한 제한 분해를 통해 절단된다. 마지막 단계는 모든 DNA 단편들을 한 단계에서 조립하는 것이다. 보다 상세하게는, 5’-엑소뉴클레아제는 중첩하는 영역들의 5'-단부(R-부위)를 제거한다. 그 후, R-부위의 어닐링이 일어날 수 있고 DNA 중합효소가 3'-말단을 확장시켜 서열의 갭을 채운다. 마지막으로, DNA 연결효소는 뉴클레오티드들 사이의 틈들을 봉쇄한다. 엑소뉴클레아제, DNA 중합효소 및 연결효소와 같은 다양한 효소를 함유하는 어셈블리 마스터 믹스를 첨가한 후, 50°C에서 반응 혼합물을 인큐베이션하면 단일 단편들이 하나의 플라스미드로 조립된다. 그 후, 전능 대장균 세포들은 플라스미드를 이용하여 형질전환된다.
일부 플라스미드의 경우, 제한 효소를 통한 클로닝 전략이 사용되었다. 적절한 제한 효소를 선택하여, 원하는 관심 유전자를 잘라낸 후, 결찰에 의해 상이한 플라스미드에 삽입할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 다수의 클로닝 부위(MCS)에서 절단하는 효소들이 영리한 방식으로 사용 및 선택되므로, 단편들의 결찰은 올바른 배열로 실시될 수 있다. 만약 플라스미드와 단편이 동일한 제한 효소로 미리 절단되어 있다면, 단편과 플라스미드의 점착성 말단들은 완벽하게 맞물려 DNA 연결효소에 의해 결찰될 수 있다. 결찰 후, 전능 대장균 세포들은 새로이 생성된 플라스미드를 이용하여 형질전환된다.
제한 분해를 통한 클로닝
제한 효소로 플라스미드를 분해하기 위해, 다음 성분들을 얼음 위에서 함께 피펫팅한다:
표: 제한 분해 반응 믹스
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한 번의 분해에 더 많은 효소가 사용된 경우, 각 효소 1 μl를 사용하고 더 많거나 적은 PCR 등급의 물을 첨가하여 부피를 조정한다. 모든 효소는 새로운 England Biolabs의 CutSmart 완충액(100% 활성)과 함께 사용하기에 적합하고 동일한 인큐베이션 온도(모두 37°C)를 갖는다는 전제 조건에서 선택한다.
온도 혼합기 또는 열 순환기를 사용하여 인큐베이션을 실시하여 샘플을 일정한 온도(37°C)에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 동안 샘플을 교반하지 않는다. 인큐베이션 시간은 60분으로 설정한다. 그 후 샘플을 로딩 염료와 직접 혼합하고 아가로스 전기영동 겔에 로딩하거나 추가 사용을 위해 4°C/얼음에서 보관한다.
겔 전기영동을 위해 1% 아가로스 겔을 준비한다. 그리하여 다목적 아가로스 1.5 g을 125 삼각 플라스크에 측정하여 넣고 150 ml TAE 완충액으로 채운다. 아가로스가 완전히 용해될 때까지 혼합물을 마이크로파로 가열한다. 0.5 μg/ml 에티듐 브로마이드를 아가로스 용액에 첨가한다. 그 후, 겔을 몰드에서 주형한다. 아가로스를 세팅한 후, 몰드를 전기영동 챔버에 넣고 챔버를 TAE-완충액으로 채운다. 그 후 샘플을 로딩한다. (왼쪽부터)제1 주머니에 적절한 DNA 분자량 마커를 로딩한 다음 샘플을 로딩한다. 겔이 <130V에서 대략 60 분 동안 이동한다. 전기영동 후 겔이 챔버로부터 제거되고 UV-영상장치에서 분석한다.
표적 밴드를 절단하고 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮긴다. 겔 정제를 위해, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen의 QIAquick 겔 추출 키트를 사용한다. DNA 단편은 다음 번 사용을 위해 -20°C에서 보관한다.
결찰을 위한 단편들은 삽입물과 플라스미드-단편의 길이 및 서로의 상관 관계에 따라 1:2, 1:3 또는 1:5의 플라스미드 대 삽입물의 몰비로 함께 피펫팅한다. 플라스미드에 삽입해야 하는 단편이 짧은 경우, 1:5 비율을 사용한다. 삽입물이 길면, 플라스미드에 대한 상관관계에서 더 적은 양의 삽입물이 사용된다. 각 결찰에 50 ng 양의 플라스미드를 사용하며, 삽입물의 특정 양은 NEBioCalculator로 계산한다. 결찰을 위해, NEB의 T4 DNA 결찰 키트를 사용한다. 결찰 혼합물의 예는 하기의 표에 제시되어 있다.
표: 결찰 반응 믹스
Figure pct00010
DNA와 물을 혼합하는 것을 시작으로, 완충액을 첨가하고, 최종적으로 효소를 첨가하여, 모든 성분들을 얼음에서 함께 피펫팅한다. 반응물을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 잠시 마이크로퓨징한 다음 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, T4 연결효소를 65°C에서 10분 동안 열 비활성화시킨다. 샘플을 얼음 위에서 냉각시킨다. 최종 단계에서 10-베타 전능 대장균 세포를 결찰된 플라스미드 2 μl로 형질전환한다(하기를 참조).
형질전환 10-베타 적격 대장균 세포
형질변환을 위해, 10-베타 적격 대장균 세포를 얼음 위에서 해동시킨다. 그 후, 2 μl의 플라스미드 DNA를 세포 현탁액에 바로 피펫하여 옮긴다. 튜브를 가볍게 치고, 30분 동안 얼음 위에 둔다. 그 후, 세포를 42°C 발열-블록에 넣고, 정확히 30초 동안 열-충격을 가한다. 그 직후, 세포를 얼음 위에서 2분 동안 냉각시킨다. 950 μl의 NEB 10-베타 증식물 배지를 세포 현탁액에 첨가한다. 세포를 37°C에서 1시간 동안 진탕 인큐베이션한다. 이어서, 50-100 μl를 예열된(37°C) LB-Amp 한천 플레이트에 피펫하여 옮기고 일회용 주걱으로 펼친다. 상기 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다. 암피실린에 대한 내성 유전자를 보유하고 있는 플라스미드가 성공적으로 통합된 박테리아만이 이 플레이트에서 자랄 수 있다. 다음날, 단일 집락을 골라내고, 후속적으로 플라스미드 제조를 위해, LB-Amp 배지에서 배양시킨다.
박테리아 배양
대장균의 배양은 Luria Bertani의 약자인 LB 배지에서 실시하고, 여기에는 1 ml/L 100 mg/ml 암피실린을 첨가하여, 0.1 mg/ml의 암피실린 농도를 발생시킨다. 상이한 플라스미드 제조물의 양에 대해, 단일 박테리아 집락을 다음의 양으로 접종한다.
표: 대장균 배양 용적
Figure pct00011
미니-프렙의 경우, 96-웰의 2 ml 딥웰 플레이트를 웰당 1.5 ml LB-Amp 배지로 채운다. 집락을 골라 이쑤시개로 찍어내고, 이를 배지에 넣는다. 모든 집락을 골랐을 때, 끈적끈적한 공기 다공성 막으로 플레이트를 닫는다. 상기 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 200 rpm의 진탕 속도로 23시간 동안 인큐베이션한다.
미니-프렙의 경우, 15 ml 튜브(환기 뚜껑을 포함)에 3.6 ml LB-Amp 배지를 채우고 박테리아 집락을 동일하게 접종한다. 상기 이쑤시개는 제거하지 않고, 배양하는 동안 튜브에 그대로 둔다. 96-웰 플레이트와 마찬가지로, 튜브를 37°C, 200 rpm에서 23시간 동안 인큐베이션한다.
맥시-프렙의 경우에, 200 ml의 LB-Amp 배지를 고압멸균된 유리 1 L 삼각 플라스크 내로 채우고, 대략 5시간된 1 ml의 세균 하루-배양액을 접종한다. 상기 삼각 플라스크를 종이 마개로 닫고, 37°C, 200 rpm에서 16시간 동안 인큐베이션한다.
플라시미드 제조
미니-프렙의 경우, 50 μl의 박테리아 현탁액을 1 ml 딥웰 플레이트로 옮긴다. 그 후, 박테리아 세포를 3000 rpm, 4℃의 플레이트에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 박테리아 펠릿이 있는 플레이트를 EpMotion에 넣는다. 대략적으로 90분 후, 실행이 완료되고, 용출된 플라스미드 DNA를 추가 사용을 위해 EpMotion로부터 꺼낼 수 있다.
미니-프렙의 경우, 15 ml 튜브를 인큐베이터에서 꺼내고 3.6 ml 세균 배양물을 2 ml 에펜도르프 튜브 2개에 분할한다. 이들 튜브를 실온에서 3분 동안 탁상용 마이크로원심분리기에서 6,800xg로 원심분리시킨다. 그 후, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit로 미니-프렙을 실시한다. 플라스미드 DNA 농도는 Nanodrop으로 측정한다.
맥시-프렙은 제조업체의 지침에 따라, Macherey-Nagel NucleoBond® Xtra Maxi EF 키트를 사용하여 실시한다. DNA 농도는 Nanodrop으로 측정한다.
에탄올 석출
DNA 용액의 부피를 2.5-배 부피의 에탄올 100%와 혼합한다. 혼합물을 -20℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, DNA를 30분 동안 14,000 rpm, 4°C에서 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 70% 에탄올로 세척한다. 다시, 튜브를 14,000　rpm, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 피펫팅으로 상청액을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 건조시킨다. 에탄올이 증발되면, 적당량의 엔도톡신-없는 물을 첨가한다. 4°C에서 밤새도록 물에 DNA가 다시 용해되도록 시간을 준다. 소량을 취하고, Nanodrop 장치로 DNA 농도를 측정한다.
발현 카세트 조성물
오픈 리딩 프레임의 발현을 위해, 다음의 기능적 요소들을 포함하는 전사 단위를 사용한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포바이러스로부터의 즉각적인 초기 증폭자 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 필요한 경우, 신호 서열을 포함하는 각각의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산,
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA), 및
- 임의적으로 인간 가스트린 종결인자(hGT).
발현시키고자 하는 원하는 유전자가 내포된 발현 유닛/카세트 외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기의:
- 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및
- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자를 함유한다.
세포 배양 기술
표준 세포 배양 기술을 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.에서 기재된 바와 같이 사용한다.
HEK293 시스템에서의 일시적 형질감염
본 발명에 따른 DNA 요소를 포함하는 세포는 제조업체의 지침에 따라 HEK293 시스템(인비트로겐)을 사용하여 각각의 플라스미드(하기의 실시예 1 내지 4를 참조)로 일시적 형질감염에 의해 생성된다. 간략하게, 진탕 플라스크에서 또는 무혈청 FreeStyle™ 293 발현 배지(인비트로겐)에서 교반된 발효기에서 현탁액으로 성장하는 HEK293 세포(인비트로겐)를 각각의 플라스미드 및 293fectin™ 또는 fectin(인비트로겐)의 혼합물로 형질감염시킨다. 1-2 L의 진탕 플라스크(Corning))의 경우, HEK293 세포를 600 mL에서 1*106 세포/mL의 밀도로 분주하고 120 rpm, 8% CO2에서 배양한다. 세포를 약 1.5*106 세포/mL의 세포 밀도에서 A) 600 μg의 총 플라스미드 DNA(1　μg/mL)를 포함한 20 mL의 옵티-MEM(인비트로겐) 및 B) 20 ml의 옵티-MEM + 1.2 mL 293 펙틴 또는 펙틴(2 μL/mL)의 ca. 42 mL 혼합을 이용하여 형질주입한다. 글루코스 소비량에 따라, 글루코스 용액은 발효의 과정 중에 첨가한다.
SDS-PAGE
LDS 샘플 완충액, 4배 농축액(4x): 4 g 글리세롤, 0.682 g TRIS-염기, 0.666 g TRIS-염산염, 0.8 g LDS(리튬 도데실 술페이트), 0.006 g EDTA(에틸렌 디아민 테트라산), 물 중 Serva Blue G250의 1 중량%(w/w) 용액 0.75 ml, 페놀 레드의 1 중량%(w/w) 용액 0.75 ml에 물을 첨가하여 총 부피가 10 ml가 되도록 한다.
배양액의 세포를 용해시킨다. 그 후, 용액을 원심분리하여 세포 잔해를 제거한다. 정화된 상청액의 분취액을 1/4 부피(v/v)의 4xLDS 샘플 완충액 및 1/10 부피(v/v)의 0.5 M 1,4-디티오트리톨(DTT)과 혼합한다. 이어서, 샘플을 70°C에서 10분 동안 인큐베이션하고, 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한다. NuPAGE® Pre-Cast 젤 시스템(Invitrogen Corp.)을 제조업체의 지침에 따라 사용한다. 특히, 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 NuPAGE® MOPS 러닝 버퍼를 사용한다.
웨스턴 블롯
전송 완충액: 39 mM 글리신, 48 mM 트리스-염산염, 0.04 중량%(w/w) SDS, 및 20 부피% 메탄올(v/v)
SDS-PAGE 후, 분리된 폴리펩티드를 Burnette의 “Semidry-Blotting-Method”에 따라 니트로셀룰로오스 필터 막(기공 크기: 0.45 μm)에 전기영동으로 옮겼다(Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).
실시예 1
본 발명에 따른 RMCI에 의한 E2A 및 E4orf6 오픈 리딩 프레임의 동시 Cre-재조합효소 매개 활성화를 위한 DNA 구조체의 생성
608 bp CMV 즉시 초기 프로모터 및 인핸서(서열번호 28)가 인간 면역글로불린 5' UTR과 조합될 때 제1 DNA 단편이 생성된다. 2개의 상기 요소는 돌연변이된 좌측 역위 반복부(L3-LE; taccgttcgt ataaagtctc ctatacgaag ttat; 서열번호 70)를 갖는 간헐적 L3 요소와 정면으로 융합되고 XbaI(5'-말단) 및 KpnI(3'-말단) 제한 부위와 측접한다. 대응하는 DNA 단편은 DNA 합성에 의해 생성되고 적합한 셔틀 플라스미드 내로 클로닝된다.
마찬가지로, 이의 코딩 가닥에 대해 5'에서 3’ 방향으로 하기의: HindIII 제한 부위, 돌연변이된 우측 역위 반복부(L3-RE; ataacttcgt ataagtctc ctatacgaac ggta; 서열번호 71)를 갖는 L3 부위, 코작(Kozak) 서열, 아데노바이러스 E2A 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(GenBank 수탁 번호 AC_000007), 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리 A; 서열번호 31), 인간 가스트린 전사 종결 서열(HGT; 서열번호 32) 및 KpnI 제한 부위를 포함하는 제2 DNA 단편을 생성하고 클로닝한다.
제3 단편이 생성되고, 이의 코딩 가닥에 대해 5'에서 3’ 방향으로 하기의: MfeI 제한 부위, 코작 서열, 아데노바이러스 E4orf6 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(GenBank 수탁 번호 AC_000007), BGH 폴리 A, HGT 서열 및 HindIII 제한 부위를 포함하는 것으로 또한 클로닝된다.
3개의 단편은 각각의 제한 효소를 사용하여 이의 셔틀 플라스미드로부터 절제된다. 절단된 단편은 퓨로마이신 선택 마커와 MfeI- 및 XbaI-호환성 돌출부(overhang)를 보유하는 플라스미드 백본과 4방향 결찰 반응에서 조합하여 포유류 세포의 안정한 형질감염을 위한 플라스미드를 수득한다.
도 11은 이 DNA 단편 내의 요소의 순서 및 배향을 도시하며, 이는 결찰 동안 점착성 말단의 호환성에 의해 결정된다.
실시예 2
본 발명에 따른 RMCI에 의한 E1A 및 E1B 오픈 리딩 프레임의 동시 Cre-재조합효소 매개 활성화를 위한 DNA 구조체의 생성
TATA 박스와 전사 개시 부위 사이의 서열은 제외하고 608 bp CMV 프로모터 및 인핸서 요소의 2개의 복제를 간헐적 Lox71 부위와 정면으로 융합시킨다. 5'-말단에 XbaI 제한 부위 및 3'-말단에 KpnI 제한 부위를 갖는 단편으로 제공된다. 완전한 DNA 단편은 DNA 합성에 의해 생성되고 적합한 셔틀 플라스미드 내로 클로닝된다.
마찬가지로, 이의 코딩 가닥에 대해 5'에서 3’ 방향으로 하기의: SacI 제한 부위, Lox66 부위, TATA 박스와 돌연변이/비활성화된 SacI 부위를 갖는 전사 개시 부위 사이의 CMV 프로모터 단편, 인간 면역글로불린 중쇄 5' UTR, 코작 서열, 아데노바이러스 E1A 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(GenBank 수탁 번호 AC_000008), 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리 A), 인간 가스트린 전사 종결 서열(HGT) 및 KpnI 제한 부위를 포함하는 제2 DNA 단편을 합성하고 클로닝한다.
마찬가지로, 5'에서 3’ 방향으로 하기의: SacI 제한 부위, TATA 박스와 전사 개시 부위 사이의 CMV 프로모터 단편, 인간 면역글로불린 중쇄 5' UTR, 코작 서열, 아데노바이러스 E1B 19　kDa 및 E1B 55　kDa 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(GenBank 수탁 번호 AC_000008), 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리 A), 인간 가스트린 전사 종결 서열(HGT) 및 MfeI 제한 부위를 포함하는 제3 DNA 단편을 합성하고 클로닝한다.
3개의 단편은 각각의 제한 효소를 사용하여 이의 셔틀 플라스미드로부터 절제된다. 단편은 퓨로마이신 선택 마커와 MfeI- 및 XbaI-호환성 돌출부(overhang)를 보유하는 플라스미드 백본과 4방향 결찰 반응에서 조합하여 포유류 세포의 안정한 형질감염을 위한 플라스미드를 수득한다.
도 9는 이 DNA 단편 내의 요소의 순서 및 배향을 도시하며, 이는 결찰 동안 점착성 말단의 호환성에 의해 결정된다.
실시예 3
본 발명에 따른 RMCI에 의한 Rep78 및 Rep52/40 전사의 동시 Cre-재조합효소 매개 활성화를 위한 DNA 구조체의 생성
전사 시작 부위의 하류 21 bp를 포함하는 AAV2 P5 프로모터 및 전사 시작 부위의 하류 103 bp를 포함하는 AAV2 P19 프로모터는 돌연변이된 좌측 역위 반복부(LoxFas-LE; taccgttcgt ataccttt cttactacgaag ttat; 서열번호 72)를 갖는 간헐적 LoxFas 부위와 정면으로 융합시킨다. 5'-말단에 XbaI 제한 부위 및 3'-말단에 KpnI 제한 부위를 갖는 단편으로 제공된다. 완전한 DNA 단편은 DNA 합성에 의해 생성되고 적합한 셔틀 플라스미드 내로 클로닝된다.
마찬가지로, 코딩 가닥에 대해 3'에서 5’ 방향으로, 즉 역위로 하기의: SalI 제한 부위, 돌연변이된 우측 역위 반복부(LoxFas-RE; ataacttcgt atataccttt ctatacgaac ggta; 서열번호 73)를 갖는 LoxFas 부위, Rep78/68 5’UTR로부터의 13 bp 서열, AAV2 Rep78 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리 A), 인간 가스트린 전사 종결 서열(HGT) 및 KpnI 제한 부위를 포함하는 제2 DNA 단편을 생성하고 클로닝한다.
5'에서 3’ 방향으로 하기의: SalI 제한 부위, VP 유전자의 Rep52/40 개시 코돈의 상류 13 bp에서 시작하여 종결 코돈의 하류 124 bp에서 종료하는 AAV2 Rep52/40-Cap 유전자 및 Mfe 제한 부위를 포함하는 제3 단편을 또한 생성한다.
3개의 단편은 각각의 제한 효소를 사용하여 이의 셔틀 플라스미드로부터 절제된다. 단편은 퓨로마이신 선택 마커와 MfeI 및 XbaI 호환성 돌출부(overhang)를 보유하는 플라스미드 백본과 4방향 결찰 반응에서 조합하여 포유류 세포의 안정한 형질감염을 위한 플라스미드를 수득한다.
도 13은 이 DNA 단편 내의 요소의 순서 및 배향을 도시하며, 이는 결찰 동안 점착성 말단의 호환성에 의해 결정된다.
실시예 4
본 발명에 따른 RMCI에 의한 VA RNAI 전사의 Cre-재조합효소 매개 활성화를 위한 DNA 구조체의 생성
5'에서 3’ 방향으로 하기의: 비-무차별성을 보장하는 정준 LoxP 부위로부터의 높은 차이 및 돌연변이된 좌측 역위 반복부를 갖는 Cre-재조합 부위에 통합된 TATA 신호(TTTATATAT; 서열번호 74)를 포함하는 서열번호 69의 Lx-LE 부위(Lx-LE; taccgttcgt ataagtttat atacgaag ttat; 서열번호 03)(TATA와 전사 개시 부위 사이의 거리는 일반적인 거리를 반영하도록 정렬됨), 중합효소 III 종결 인자(헥사-dT)가 바로 뒤따르는 Ad2 VA RNAI 유전자의 바로 5'-말단으로부터 짧은 단편, 역 배향의 Ad2 VA RNAI 유전자(GeneBank AC_000007) 뿐만 아니라 역 배향의 우측 역위 반복부를 갖는 Lx 부위를 포함하는 3' 말단 서열(Lx-RE 역; taccgttcgt atataac tatacgaag tat; 서열번호 06)을 포함하는 DNA 단편을 화학적으로 합성한다.
상기 단편은 퓨로마이신 선택 마커를 보유하는 플라스미드 백본과 결찰되어, 포유류 세포의 안정한 형질감염을 위한 플라스미드를 수득한다.
도 16은 상기 DNA 단편 내의 요소의 순서 및 배향을 도시한다.
실시예 5
RMCI용 카세트의 안정한 통합
현탁액에서 성장하도록 적응된 CHO-K1 세포를 37°C 및 5-7 부피% CO2에서 일회용, 통기성 125 mL 진탕 플라스크 중 50 mL의 화학적으로 규정된 배지에서 증식시킨다. 배양물을 140-180 rpm/분의 일정한 교반 속도로 진탕하고, 신선한 배지로 2-3 x 105/mL의 밀도로 3-4일마다 희석한다. 배양물의 밀도 및 생존율은 Cedex HiRes 세포 계수기(Roche Innovates AG, Bielefeld, Germany)를 사용하여 측정한다.
RMCI 카세트의 안정한 통합을 위해, 현탁액-성장 CHO-K1 세포를 4 x 105 세포/mL의 밀도로 신선한 화학적으로 규정된 배지에 접종한다. 다음 날, 제조업체의 프로토콜에 따라, Nucleofector Kit V(Lonza, Switzerland)를 사용하여 Nucleofector 장치로 형질 감염을 실시한다. 3 x 107 세포를 30 μg의 선형화된 플라스미드 DNA로 형질감염시킨다. 형질감염 후, 세포들을 선별 제제가 없는 30 ml의 신선한 화학적으로 규정된 배지에 접종한다.
형질감염 2일 후, 세포를 선별 제제로서 1 내지 10 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 384-웰 플레이트에 웰당 300 내지 500개의 세포와 함께 접종한다. 3주 후, 세포 집락을 NYONE Plate 영상 장치(SYNENTECH GmbH, Elmshorn, Germany)를 사용하여 영상화함으로써 확인한다. 집락을 96-웰 플레이트로 옮기고, PCR에 의해 RMCI 카세트의 통합에 대해 분석한다. 모든 원하는 RMCI 카세트를 함유하는 세포주는 퓨로마이신을 함유하는 화학적으로 규정된 배지에서 추가로 팽창되고, 팽창 후 냉동-보존한다.
실시예 6
본 발명에 따른 Cre-매개 카세트 역위(RMCI)에 의한 유전자 활성화 및 AAV 생산
Cre-재조합효소-매개 RMCI에 의한 유전자 활성화
카세트 역위(Cre-매개 RMCI)에 의한 Cre-매개 유전자 활성화를 위해, 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 비활성 RMCI 카세트 및/또는 상기 실시예 중 하나에서 수득된 rep-cap 유전자를 보유하는 세포를 mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소로 일시적으로 형질감염시킨다. 형질감염 하루 전에, 세포를 4x105개 세포/mL의 밀도로 신선한 배지에 접종한다. 다음 날, 제조업체의 프로토콜에 따라, Nucleofector Kit V(Lonza, Switzerland)를 사용하여 Nucleofector 장치로 형질 감염을 실시한다. 3 x 107 세포를 mRNA를 인코딩하는 총 30 μg의 Cre-재조합효소로 형질감염시킨다. 성공적인 유전자 활성화는 역위된 게놈 DNA의 PCR, 예상된 mRNA의 RT-PCR 또는 예상된 유전자 산물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명한다.
rAAV 벡터 생산 세포의 생성
재조합 AAV 벡터의 생산을 위해, 상기 실시예 중 하나에서 수득된 아데노바이러스 헬퍼 유전자 및/또는 rep-cap 유전자의 비활성 RMCI 카세트를 보유하는 3 x 107 세포를 mRNA를 인코딩하는 5 μg의 Cre-재조합효소를 포함하는 총 30 μg의 핵산으로 일시적으로 형질감염시킨다. 나머지 25 μg의 핵산은 재조합 AAV 게놈(이식유전자, 예컨대, AAV ITR에 의해 측접된 GFP 유전자)을 제공하는 플라스미드 DNA 및 게놈에 통합되지 않은 헬퍼 유전자 및/또는 rep/cap 유전자에 대한 발현 카세트로 구성된다.
대안적으로, 재조합 AAV 게놈은 실시예 5에 기재된 바와 같이 숙주 세포의 게놈으로의 안정한 통합에 의해 제공된다.
세포의 게놈이 모든 필수 헬퍼 유전자, rep/cap 및 재조합 AAV 게놈을 이미 포함하는 경우, mRNA를 인코딩하는 Cre-재조합효소의 형질감염만으로 충분하다.
AAV 입자는 세포 배양 상청액 또는 총 세포 용해물로부터 회수하고, ELISA, 정량적 PCR 및 표적 세포의 형질도입에 의해 분석한다.
실시예 7
본 발명에 따른 RMCI에 의한 mCherry 및 EGFP 오픈 리딩 프레임의 동시 FRT-재조합효소 매개 활성화를 위한 DNA 구조체의 생성
52 bp 최소 CMV 프로모터(서열번호 85)가 이의 전사 방향으로 하기의 요소와 하기의 순서로 조합되는 제1 DNA 단편을 생성하였다:
- 인간 면역글로불린 5’ UTR;
- 돌연변이된 우측 역위 반복부를 갖는 FRT 요소(FRT-LE; GAAGTTCATATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC; 서열번호 60);
- 역 배향으로 전사 개시(TS) 영역(서열번호 86)을 포함하는 SV40 초기 프로모터의 417 bp 단편;
- 역 배향의 서열번호 32의 인간 가스트린 전사 종결 서열(HGT);
- 역 배향의 서열번호 31의 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리 A);
- 역 배향의 mCherry 형광 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(GenBank 수탁 번호 QUW04963; 서열번호 87);
- 역 배향의 코작 서열;
- 역 배향의 돌연변이된 우측 역위 반복부를 갖는 FRT 부위(FRT-RE; GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATATGAACTTC, 서열번호 61);
- 정 배향의 코작 서열; 및
- 정 배향의 증진된 녹색 형광 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 5’-부분(GenBank 수탁 번호 AAB02572.1; 서열번호 88; 26 bp).
대응하는 DNA 단편을 SalI(5'-말단에서) 및 SgrAI (3'-말단에서) 제한 부위와 측접하고, DNA 합성에 의해 생성하고 적합한 셔틀 플라스미드 내로 클로닝하였다.
또한, 이의 코딩 가닥에 대해 5'에서 3’ 방향으로 하기의 순서로: SalI 제한 부위, EGFP를 코딩하고 내부 SgrAI 제한 부위를 포함하는 오픈 리딩 프레임, BGH 폴리 A 신호 서열, HGT 서열 및 MfeI 제한 부위를 포함하는 제2 단편을 생성하고 클로닝하였다.
제1 단편을 SalI 및 SgrAI 제한 효소를 사용하여 이의 셔틀 플라스미드로부터 절제하고, 제2 단편을 보유하는 플라스미드의 SalI 및 SgrAI 부위 사이에 삽입하여, 포유류 세포의 일시적 형질감염에 적합한 최종 플라스미드를 수득하였다.
도 18은 제1 및 제2 단편의 조합된 DNA 내의 요소들의 순서 및 배향을 도시한다.
실시예 8 - 비교예
본 발명에 따른 RMCI에 의한 mCherry 및 EGFP 오픈 리딩 프레임의 동시 FRT-재조합효소 매개 활성화 후에 수득될 DNA 구성을 나타내는 DNA 구조체의 생성
52 bp 최소 CMV 프로모터(서열번호 85)가 이의 전사 방향으로 하기의 순서로:
- 정 배향의 인간 면역 글로불린 5’ UTR;
- 정 배향의 돌연변이된 좌측 및 우측 역위 반복부를 갖는 FRT 요소(FRT-LE-RE; GAAGTTCATATTCTCTAGAAAGTATATGAACTTC; 서열번호 89);
- 정 배향의 코작 서열;
- 정 배향의 mCherry 형광 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(GenBank 수탁 번호 QUW04963; 서열번호 87);
- 정 배향의 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGH 폴리 A; 서열번호 31);
- 정 배향의 인간 가스트린 전사 종결 서열(HGT; 서열번호 32);
- 정 배향으로 전사 개시(TS) 영역(서열번호 86)을 포함하는 SV40 초기 프로모터의 417 bp 단편;
- 역 배향의 서열번호 36의 FRT 부위;
- 정 배향의 코작 서열; 및
- 정 배향의 증진된 녹색 형광 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 5’-부분(GenBank 수탁 번호 AAB02572.1; 서열번호 88; 26 bp)와 조합되는 제1 DNA 단편을 생성하였다
대응하는 DNA 단편을 SalI(5'-말단에서) 및 SgrAI (3'-말단에서) 제한 부위와 측접하고, DNA 합성에 의해 생성하고 적합한 셔틀 플라스미드 내로 클로닝하였다.
제1 단편을 SalI 및 SgrAI 제한 효소를 사용하여 이의 셔틀 플라스미드로부터 절제하고, 실시예 7에 기재된 바와 같은 제2 단편을 보유하는 플라스미드의 SalI 및 SgrAI 부위 사이에 삽입하여, 포유류 세포의 일시적 형질감염을 위한 플라스미드를 수득하였다.
도 19는 제1 및 제2 단편의 조합된 DNA 내의 요소들의 순서 및 배향을 도시한다.
실시예 9
본 발명에 따른 FLP-매개 카세트 역위(RMCI)에 의한 두 형광 유전자의 동시 활성화
형질감염
HEK293T 부착성 세포를 37°C, 90% 상대 습도 및 5% CO2에서 10% 우태아혈청(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 DMEM, 고글루코스, GlutaMAX™ Supplement, 피루베이트 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전에, 웰 당 10,000개의 세포를 96웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 제조업자의 권고에 따라 PEI max(Polyscience)를 1:2의 DNA 대 PEI max 비로 사용하여 세포를 웰 당 100 ng 플라스미드 DNA의 혼합물로 형질감염시켰다. 하기의 표 5에 나타낸 바와 같은 각 실험 조건을 3회 반복 실험하였다.
표 5: 형질감염을 위한 플라스미드 혼합물의 조성. 웰 당 ng의 DNA 양을 각각의 실험 조건 (1 내지 14)에 대해 나타내었다.
Figure pct00012
본 발명에 따른 FLP-재조합효소-매개 카세트 역위에 의한 mCherry 및 EGFP 유전자의 동시 활성화를 입증하기 위해, 80 ng의 비활성 구조체 mCherry_EGFP_pre rec(실시예 7, 도 18)를 최적화된 버전의 FPL 재조합효소인 FPL 재조합효소 FLPo를 코딩하는 다양한 양의 플라스미드와 혼합하였다(예컨대, Raymond, .CS. and Soriano, P. PLoS ONE 2 (2007) e162를 참조). 비-코딩 플라스미드(모조 DNA)를 필요에 따라 첨가하여 형질감염 혼합물 중의 DNA의 총량을 100 ng으로 유지하였다. mCherry 및 EGFP의 발현이 FLPo의 동시 발현에 의해 영향을 받는지 여부를 시험하기 위해 활성 구조체 mCherry_EGFP_post rec(실시예 8, 도 19)에 대해 대응하는 조건을 적용하였다.
모조 DNA를 단독으로 음성 대조군으로서 형질감염시킨 반면, EGFP 또는 mCherry 발현 단일 유전자 플라스미드(EGFP_단독 및 mCherry_단독)는 양성 대조군으로서 역할을 하였다. 모의 DNA와 조합된 FLPo 플라스미드를 형질감염시켜 FLPo 단독에 의한 형광의 임의의 직접 유도를 배제하였다.
유동 세포측정
일시적 형질감염 2일 후, FLP-매개 카세트 역위의 성공을 세포내 EGFP 및 mCherry의 발현을 측정하는 유세포 분석법에 의해 확인하였다. 이를 위해, HEK293T 세포를 트립신-매개 분리에 의해 96-웰 플레이트로부터 회수하였다. 인산염 완충 식염수에 2% 소 태아 혈청을 첨가하여 반응을 중지시켰다.
유세포 분석은 BD FACSCelesta™ 유세포 분석기(BD, Heidelberg, Germany)로 실시하였다. 살아있는 세포는 측면 산란(SSC)에 대한 전방 산란(FSC)의 플롯에서 게이팅되었다. 단일체 및 세포 응집체를 구별하기 위해, FSC-H 대 FASC-A 플롯을 선택하였다. 샘플당 10,000개의 이벤트가 기록되었다. 게이트 둘 모두는 모의-형질감염된 HEK293T 세포로 정의되었고, FlowJo v10.6.2 소프트웨어(TreeStar, Olten, Switzerland)를 사용하여 모든 샘플에 적용되었다. GFP의 형광은 FITC 채널에서 정량화되었다(488 nm에서 여기, 530 nm에서 검출). mCherry는 PE-CF594 채널에서 측정되었다(561 nm에서 여기, 610 nm에서 검출).
형광 세포 집단을 정확하게 식별하고 레이저를 조정하기 위해, 양성 및 음성 대조군 샘플을 사용하였다. EGFP_단독 플라스미드로 형질감염된 세포를 EGFP 양성 대조군으로서 사용하였고, mCherry_단독 플라스미드로 형질감염된 세포를 mCherry 양성 대조군으로서 사용하였다. 비-코딩 플라스미드(모의 DNA)로 형질감염된 세포는 음성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 20은 상기 표 5에 요약된 바와 같이 각각의 실험 조건 1 내지 14에 대한 GFP 및 mCherry 양성 세포의 평균 백분율을 도시한다. 각각의 표준편차는 오차 막대로 표시된다. 예상된 바와 같이, 세포가 mCherry_EGFP_pre rec 단독으로(조건 7), 즉 재조합효소가 없이 형질감염되었을 때 거의 어떠한 형광 세포(< 2%)도 검출되지 않은 반면, 세포가 mCherry_EGFP_post rec로 형질감염되었을 때(조건 8) 세포의 약 60%는 mCherry 및 EGFP 양성이었다. 이는 mCherry 및 EGFP 유전자가 재조합효소의 부재하에 재조합전 구성에서 비활성이고 재조합후 구성에서 활성임을 나타낸다.
FLPo 발현 플라스미드를 mCherry_EGFP_pre rec 플라스미드와 함께 공동-형질감염시킨 경우, EGFP 및 mCherry 양성 세포의 백분율은 약 30%로 증가하였고(조건 9, 10 및 11), 이는 성공적인 RMCI 및 이중 유전자 활성화를 나타낸다. FLPo 발현 플라스미드와 mCherry_EGFP_post rec의 공동-형질감염은 EGFP 및 mCherry의 발현에 영향을 미치지 않았으며(조건 8 대 조건 12, 13 및 14), 이는 카세트 역위가 재조합 후 구성에서 억제됨을 나타낸다. FLPo 발현 플라스미드를 단독으로 형질감염시켰을 때 형광 세포가 검출되지 않았다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG Hoffmann-La Roche Inc. <120> Nucleic acid constructs for simultaneous gene activation <130> P36312 <150> EP20202009.5 <151> 2020-10-15 <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lx site spacer sequence <400> 1 agtttata 8 <210> 2 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lx site reverse orientation <400> 2 tataaact 8 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lx-LE mutant <400> 3 taccgttcgt ataagtttat atatacgaag ttat 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lx-LE mutant reverse orientation <400> 4 ataacttcgt atatataaac ttatacgaac ggta 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lx-RE mutant <400> 5 ataacttcgt ataagtttat atatacgaac ggta 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lx-RE mutant reverse orientation <400> 6 taccgttcgt atatataaac ttatacgaag ttat 34 <210> 7 <211> 343 <212> PRT <213> Bacteriophage P1 <400> 7 Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val 1 5 10 15 Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg 20 25 30 Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val 35 40 45 Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala 65 70 75 80 Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn 85 90 95 Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala 100 105 110 Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly 115 120 125 Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln 130 135 140 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn 145 150 155 160 Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu 165 170 175 Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg 180 185 190 Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly 195 200 205 Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp 210 215 220 Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys 225 230 235 240 Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu 245 250 255 Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile 260 265 270 Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly 275 280 285 His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val 290 295 300 Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile 305 310 315 320 Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val 325 330 335 Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp 340 <210> 8 <211> 1029 <212> RNA <213> Bacteriophage P1 <400> 8 augagcaacc ugcugaccgu gcaccagaac cugcccgccc ugcccgugga cgccaccagc 60 gacgagguga ggaagaaccu gauggacaug uucagggaca ggcaggccuu cagcgagcac 120 accuggaaga ugcugcugag cgugugcagg agcugggccg ccuggugcaa gcugaacaac 180 aggaaguggu uccccgccga gcccgaggac gugagggacu accugcugua ccugcaggcc 240 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<223> n is a, c, g, or u <400> 26 guuuuagagc unugnuguuu ug 22 <210> 27 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FokI motiv <400> 27 ggatg 5 <210> 28 <211> 608 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 28 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600 gtcagatc 608 <210> 29 <211> 696 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 29 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cgatgcccac 1800 caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1860 ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1920 aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1980 aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 2040 taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 2100 ttgacacggt ttaaacgccg ccacc 2125 <210> 31 <211> 218 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 31 ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 60 tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 120 gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 180 caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatgg 218 <210> 32 <211> 73 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60 ttttattttt gag 73 <210> 33 <211> 288 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 33 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180 aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240 gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288 <210> 34 <211> 129 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 34 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120 tcatgtctg 129 <210> 35 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> green fluorescent protein encoding nucleic acid <400> 35 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780 tccaccggat ctagatga 798 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 36 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 37 <211> 13 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 37 gaagttccta ttc 13 <210> 38 <211> 13 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 38 gaataggaac ttc 13 <210> 39 <211> 8 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 39 tctagaaa 8 <210> 40 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 site spacer sequence <400> 40 ttcaaata 8 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Sequence <220> <223> LoxKR3 site <400> 57 ataacttcgt atagcataca ttataccttg ttat 34 <210> 58 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoxKR4 site <400> 58 ataacttcgt atagcataca ttattgcaag ttat 34 <210> 59 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoxJT15 site <400> 59 aattattcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 60 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRT LE mutant <400> 60 gaagttcata ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 61 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRT RE mutant <400> 61 gaagttccta ttctctagaa agtatatgaa cttc 34 <210> 62 <211> 201 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 62 gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg 60 ttcgaacccc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac 120 ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc 180 ggctgctgcg ctagcttttt t 201 <210> 63 <211> 201 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 63 gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgttg 60 ttcgaacacc ggatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac 120 ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag cgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc 180 ggctgctgcg ctagcttttt t 201 <210> 64 <211> 6 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 64 gggcac 6 <210> 65 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 tttttt 6 <210> 66 <211> 157 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 66 aggagcgctc ccccgttgtc tgacgtcgca cacctgggtt cgacacgcgg gcggtaaccg 60 catggatcac ggcggacggc cggatccggt gttcgaacaa cggtcgtccg ccatgatacc 120 cttgcgaatt tatccaccag accacggaag agtgccc 157 <210> 67 <211> 313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VA RNA inverted sequence with Lx-LE and Lx-RE <400> 67 taccgttcgt ataagtttat atatacgaag ttatggacga aacaccgggc acttttttca 60 gtggccaaaa aagctagcgc agcagccgcc gcgcctggaa ggaagccaaa aggagcgctc 120 ccccgttgtc tgacgtcgca cacctgggtt cgacacgcgg gcggtaaccg catggatcac 180 ggcggacggc cggatccggt gttcgaacaa cggtcgtccg ccatgatacc 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Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 77 <211> 4 <212> RNA <213> Human adenovirus type 2 <400> 77 ccgg 4 <210> 78 <211> 5 <212> RNA <213> Human adenovirus type 2 <400> 78 yccgg 5 <210> 79 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VA RNA A-box consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or u <400> 79 rrynnarygg 10 <210> 80 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VA RNA B-box consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is a, c, g, or u <400> 80 gwucrannc 9 <210> 81 <211> 225 <212> DNA <213> Human adenovirus type 2 <400> 81 cgtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa 60 gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgaa ccccggatcc ggccgtccgc cgtgatccat 120 gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagcgctcc 180 ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct ttttt 225 <210> 82 <211> 225 <212> DNA <213> Human adenovirus type 2 <400> 82 cgtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa 60 gggtatcatg gcggacgacc gttgttcgaa caccggatcc ggccgtccgc cgtgatccat 120 gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagcgctcc 180 ttttggcttc cttccaggcg cggcggctgc tgcgctagct ttttt 225 <210> 83 <211> 242 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 83 tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag cgggcactct tccgtggtct 60 ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg gttcgagccc cgtatccggc 120 cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa cccaggtgtg cgacgtcaga 180 caacggggga gtgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg cggctgctgc gctagctttt 240 tt 242 <210> 84 <211> 466 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 84 tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag cgggcactct tccgtggtct 60 ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg gttcgagccc cgtatccggc 120 cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa cccaggtgtg cgacgtcaga 180 caacggggga gtgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg cggctgctgc gctagctttt 240 ttggccactg gccgcgcgca gcgtaagcgg ttaggctgga aagcgaaagc attaagtggc 300 tcgctccctg tagccggagg gttattttcc aagggttgag tcgcgggacc cccggttcga 360 gtctcggacc ggccggactg cggcgaacgg gggtttgcct ccccgtcatg caagaccccg 420 cttgcaaatt cctccggaaa cagggacgag cccctttttt gctttt 466 <210> 85 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 52bp minimal CMV promoter <400> 85 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcc gtttagtgaa cg 52 <210> 86 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 417 bp fragment of the SV40 early promoter including the transcription start (TS) region <400> 86 atttcaggcc atggtgctgc aacctctgaa agaggaactt ggttaggttc cttctgaggc 60 ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 120 gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 180 ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 240 gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 300 ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 360 ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggactag gcttttgcaa aaagcta 417 <210> 87 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry <400> 87 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe 85 90 95 Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 100 105 110 Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val 180 185 190 Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser 195 200 205 His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 88 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP <400> 88 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 89 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRT-LE-RE <400> 89 gaagttcata ttctctagaa agtatatgaa cttc 34

Claims (11)

  1. 코딩 가닥 및 주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소로서,
    코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
    - 제1 프로모터,
    - 좌측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제2 프로모터,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
    - 코딩 가닥에 대해 역위되고, 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 제1 오픈 리딩 프레임(open reading frame),
    - 우측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 역방향인 제2 재조합효소 인식 서열,
    - 제2 오픈 리딩 프레임, 및
    - 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 제2 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중 가닥 DNA 요소.
  2. 코딩 가닥 및 주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소로서,
    코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
    - 제1 프로모터,
    - 좌측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
    - 코딩 가닥에 대하여 역위되며, Rep 및 Cap 단백질의 발현을 위한 추가의 프로모터를 포함하는 Rep/Cap 오픈 리딩 프레임,
    - 우측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 역방향인 제2 재조합효소 인식 서열, 및
    - 폴리아데닐화 신호 서열
    을 포함하는, 이중 가닥 DNA 요소.
  3. 코딩 가닥 및 주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소로서,
    a) 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
    - 제1 프로모터,
    - 좌측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제2 프로모터,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
    - 코딩 서열로서,
    배타적으로 Rep78 단백질 또는 배타적으로 Rep68 단백질을 인코딩하지만, 둘 모두를 인코딩하지는 않고, 여기서
    (i) 임의적으로 내부 P40 프로모터가 비활성화되며, 그리고/또는,
    (ii) Rep52/40의 개시 코돈이 비-개시 코돈으로 변이되며, 그리고/또는
    (iii) 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거됨,
    코딩 가닥에 대해 역위되며, 그리고
    제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결되는, 코딩 서열,
    - 우측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 역방향인 제2 재조합효소 인식 서열, 및
    - Rep52/Rep40 및 Cap 오픈 리딩 프레임으로서, 상기 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Rep52/Rep40 및 Cap 오픈 리딩 프레임
    을 포함하거나,
    또는
    b) 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
    - 제1 프로모터,
    - 좌측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제2 프로모터,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소,
    - 코딩 서열로서,
    배타적으로 Rep78 단백질 또는 배타적으로 Rep68 단백질을 인코딩하지만, 둘 모두를 인코딩하지는 않고, 여기서
    (i) 임의적으로 내부 프로모터가 비활성화되며, 그리고/또는,
    (ii) Rep52/40 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈이 비-개시 코돈으로 변이되며, 그리고
    (iii) 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거됨,
    코딩 가닥에 대해 역위되며, 그리고
    제1 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결되는, 코딩 서열,
    - 우측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 대해 역방향인 제2 재조합효소 인식 서열, 및
    - 임의적으로 스플라이스 공여체 및 수용체 부위가 제거된 Rep52 오픈 리딩 프레임, 또는 Rep40 오픈 리딩 프레임으로서, 상기 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Rep40 오픈 리딩 프레임
    을 포함하는, 이중 가닥 DNA 요소.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    제1 프로모터는 P5 프로모터인, 이중 가닥 DNA 요소.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    제2 프로모터는 P19 프로모터인, 이중 가닥 DNA 요소.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 코딩 가닥은 이의 3'-말단에
    - 제3 프로모터, cap 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 신호 서열 및/또는 종결 서열을 추가로 포함하고, 여기서 모두는 작동가능하게 연결되는, 이중 가닥 DNA 요소.
  7. 이중 가닥 DNA 분자로서,
    a) E1A 오픈 리딩 프레임 및 E1B 오픈 리딩 프레임; 및/또는
    b) E2A 오픈 리딩 프레임 및 E4orf6 오픈 리딩 프레임
    을 포함하고,
    a) 및/또는 b)의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임은 코딩 가닥 및 주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 요소에 함유되고,
    여기서 코딩 가닥은 5'에서 3' 방향으로 하기의 순서로
    - 제1 프로모터,
    - 우측 역위 반복부에 돌연변이를 포함하는 제1 재조합효소 인식 서열,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 제2 프로모터,
    - 코딩 가닥에 대해 역위된 a) 또는 b)의 제1 오픈 리딩 프레임,
    - 좌측 역위 반복부 내에 돌연변이를 포함하며, 제1 재조합효소 인식 서열에 역방향인 제2 재조합효소 인식 서열, 및
    - a) 또는 b)의 제2 오픈 리딩 프레임
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항으로부터 선택된 2개 이상의 이중 가닥 DNA 요소 또는 분자를 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소와 함께 이중 가닥 DNA 요소를 인큐베이션하는 것은
    - 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 제1 프로모터가 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하며, 그리고
    - 재조합 이후에, 제1 프로모터와 제1 유전자 사이에 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 재조합효소 인식 서열을 생성시키는, 이중 가닥 DNA 요소.
  10. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열에 대하여 작용하는 재조합효소와 함께 이중 가닥 DNA 요소 또는 분자를 인큐베이션하는 것은
    - 제1 및 제2 재조합효소 인식 서열 사이의 서열을 역위시킨 후, 제1 프로모터가 제1 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하고 제2 프로모터가 제2 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되도록 하며, 그리고
    - 재조합 이후에, 제1 프로모터와 제1 유전자 사이에 상기 재조합효소에 대하여 더 이상 작용하지 않는 재조합효소 인식 서열을 생성시키는, 이중 가닥 DNA 요소 또는 이중 가닥 DNA 분자.
  11. 포유류 세포로서,
    - 제1항에 따른 하나 이상의 이중 가닥 DNA 요소, 또는
    - 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 이중 가닥 DNA 요소, 또는
    - 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하나의 이중 가닥 DNA 요소 및 제7항에 따른 하나의 이중 가닥 DNA 분자, 또는
    - 제7항에 따른 적어도 하나의 이중 가닥 DNA 분자, 또는
    - 제8항에 따른 하나 이상의 이중 가닥 DNA 분자
    를 포함하는, 포유류 세포.
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