ES2557737T3

ES2557737T3 - Método de recombinación especifica de sitio, roedores y células de roedores capaces de expresar anticuerpos o cadenas quiméricos

Info

Publication number: ES2557737T3
Application number: ES12171791.2T
Authority: ES
Inventors: Allan Bradley; E-Chiang Lee; Qi LIANG; Wei Wang
Original assignee: Kymab Ltd
Current assignee: Kymab Ltd
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2016-01-28
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: EP2517557A3; EP2421357B1; AU2016244326A1; EP2604110B1; CN105340834B; EP2421357A1; DK3028564T5; EP2798950A1; EP2604111A2; LT3241435T; EP2798950B1; JP5944312B2; AU2018206729A1; PT2564695E; EP3622813A1; AU2016244326B2; DK2517556T4; EP3028564B1; EP2517557B2; DK2517556T3

Abstract

Un procedimiento para producir un roedor capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas pesadas de anticuerpos quiméricos, comprendiendo el procedimiento: insertar en un genoma de una célula de roedor; (a) una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del roedor hospedador; y (b) opcionalmente una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig de humano por delante de la región constante de kappa de mamífero roedor hospedador y/o una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig de humano por delante de la región constante de lambda de mamífero roedor hospedador; respectivamente. siendo la inserción de tal manera que el roedor es capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas pesadas de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de roedor y una región variable de humano, en donde las etapas (a) y (b), cuando están presentes ambas, se pueden llevar a cabo en cualquier orden, en donde, uno o varios eventos de inserción utilizan la recombinación específica del sitio, en donde el procedimiento de inserción comienza en un sitio en el que se ha insertado una casete de iniciación en el genoma de la célula de roedor, tal como una célula ES, y en donde la inserción de un primer fragmento de ADN en la casete de iniciación está seguida de la inserción de un segundo fragmento de ADN en una porción del primer fragmento de ADN, y en donde la inserción del ADN humano se realiza entre la región constante de roedor y la última región J de roedor, 3'.

Description

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secuencia o secuencias de la región constante del hospedador.

En un aspecto, una secuencia de cambio no es ni humana ni nativa en el mamífero no humano, por ejemplo en un aspecto una secuencia de cambio de un mamífero no humano, no es una secuencia de cambio de ratón ni humana. La secuencia de cambio puede ser, por ejemplo, una secuencia de roedor o de primate, o una secuencia sintética. En particular, la secuencia de cambio puede ser una secuencia de rata, donde el mamífero no humano es un ratón. A modo de ejemplo, una secuencia de la parte constante de la cadena µ de humano o de ratón puede colocarse bajo el control de una secuencia de cambio de una rata o de un chimpancé u otra secuencia de cambio, convenientemente capaz de permitir que se produzca in vivo el cambio de isotipo.

La célula o mamífero de la invención puede, por lo tanto, comprender una secuencia de cambio de mamífero humano o no humano y una región o regiones potenciadoras de mamífero humano o no humano. Pueden estar por delante de una región constante de mamífero humano o no humano. Preferiblemente, las secuencias de control son capaces de dirigir la expresión, o cuanto menos controlar, la producción de los anticuerpos que comprenden una región constante con la que se asocian. Una combinación contemplada es un cambio de rata con secuencias potenciadoras de ratón y regiones constantes de ratón en una célula de ratón.

En la presente memoria se describe una célula, preferiblemente una célula no humana, o mamífero no humano, que comprende un locus de cadena ligera o de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene ADN de 3 o más especies. Por ejemplo, la célula o animal puede comprender ADN de la región constante de la célula hospedadora, una o varias secuencias codificantes de V, D o J de humano y una o varias regiones de ADN que no son ni humanas ni del hospedador que son capaces de controlar una región del locus de la inmunoglobulina, tal como una secuencia de cambio, promotor o potenciador que es capaz de controlar la expresión o el cambio del isotipo in vivo del ADN de la Ig. En un aspecto, la célula o animal es un ratón y comprende adicionalmente ADN humano del locus de Ig de humano y adicionalmente una secuencia de ADN que no es de ratón, tal como una secuencia de ADN de rata, capaz de regular el ADN humano o de ratón.

En la presente memoria se describe una célula, preferiblemente una célula no humana, o mamífero no humano, que comprende un locus de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina que tiene ADN de 2 o más genomas humanos diferentes. Por ejemplo, podría comprender secuencias V(D)J de la cadena pesada de más de un genoma humano dentro de una cadena ligera o pesada, o ADN de VDJ de la cadena pesada de un genoma y secuencias VJ de la cadena ligera de un genoma diferente.

En la presente memoria se describe un fragmento de ADN o célula o mamífero no humano que comprende un locus de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina, o parte de la misma, que tiene ADN de 2 o más especies, donde una especie contribuye con una región no codificante tal como una región reguladora, y la otra especie codifica regiones tales como las regiones V, D, J o constantes.

En un aspecto, el promotor humano y/o los otros elementos de control que están asociados a las diferentes regiones V, D o J de humano se mantienen en el genoma de ratón.

En otro aspecto, uno o varios de los elementos promotores, u otros elementos de control, de las regiones de humano, tal como las regiones V de humano, están optimizados para interaccionar con la maquinaria transcripcional de un mamífero no humano.

Convenientemente, una secuencia codificante de humano puede estar colocada bajo el control de un promotor adecuado de mamífero no humano, lo que permite que el ADN humano se transcriba con eficacia en la célula animal no humana adecuada. En un aspecto, la región de humano es una secuencia que codifica la región V de humano, y la región V de humano se coloca bajo el control de un promotor del mamífero no humano.

El reemplazo funcional del promotor o de otras regiones de control de humano por el promotor o por las regiones de control del mamífero no humano puede llevarse a cabo mediante el uso de ingeniería de recombinación, u otras tecnologías de ADN recombinante, para insertar una parte de la región de Ig de humano (tal como una región V de humano) en un vector (tal como BAC) que contiene una región de Ig no humana. La técnica recombinante/ingeniería de recombinación reemplaza convenientemente una porción del ADN no humano (p. ej. ratón) con la región de Ig de humano y, por lo tanto, coloca la región de Ig de humano bajo el control del promotor o de otra región de control del mamífero no humano. Convenientemente, la región codificante de humano de una región V de humano reemplaza una secuencia codificante de la región V de ratón. Convenientemente, la región codificante de humano de una región D de humano reemplaza una secuencia codificante de la región D de ratón. Convenientemente, la región codificante de humano de una región J de humano reemplaza una secuencia codificante de la región J de ratón. De este modo, las regiones V, D o J de humano pueden colocarse bajo el control de un promotor de mamífero no humano, tal como un promotor de ratón.

En un aspecto, el único inserto de ADN de humano en el animal o la célula de mamífero no humano son las regiones codificantes de V, D o J, y éstas se colocan bajo el control de las secuencias reguladoras del hospedador u otras secuencias (que no son humanas ni son del hospedador). En un aspecto, la referencia a regiones codificantes de humano incluye tanto intrones como exones de humano o, en otro aspecto, simplemente exones sin intrones, que puede ser en forma de ADNc.

Alternativamente, es posible utilizar la ingeniería de recombinación, u otras tecnologías de ADN recombinante, para insertar un promotor u otra región de control de mamífero no humano (p. ej., ratón), tal como un promotor para una región V, en un BAC que contiene una región de Ig de humano. A continuación, la etapa de ingeniería de recombinación coloca una porción del ADN de humano bajo el control del promotor u otra región de control de ratón.

Las estrategias descritas en la presente memoria también pueden utilizarse para insertar parte de las regiones V, D y J, o todas ellas, de la cadena pesada de humano por delante de una región constante de la cadena ligera, en vez de por delante de la región constante de la cadena pesada. Asimismo, parte o todas las regiones V y J de la cadena ligera de humano se pueden insertar por delante de la región constante de la cadena pesada. La inserción puede estar en el locus de la región constante endógena, por ejemplo, entre las regiones J y constante endógena, y puede ser soslamente de parte, o de todos, los genes de V, D o J, descartando el promotor o las secuencias potenciadoras,

o puede ser de parte, o de todos, los genes de V, D o J con uno o varios de todos los promotores o secuencias potenciadoras correspondientes. En un aspecto, el repertorio completo de fragmentos de V, D o J en la orientación en que están en las células reproductoras puede insertarse por delante de una región constante del hospedador y en disposición funcional con ella.

Así pues, la presente invención permite la inserción de regiones V y/o D y/o J de un humano, o de cualquier especie, en un cromosoma de una célula de diferentes especies que comprende una región constante, lo que permite expresar una cadena quimérica de anticuerpo.

En esta memoria se describe la inserción de parte del ADN de la región variable de humano en el genoma de un mamífero no humano en disposición operativa con parte, o toda, la región constante de la cadena pesada de humano en la región del locus de la región constante de la cadena pesada endógena, de tal forma que pueda producirse una cadena de anticuerpo. En este aspecto de la invención y cuando está además insertado el ADN de la cadena ligera de humano, la inserción del ADN de la cadena ligera puede ser en forma de una construcción completamente humana, que tiene ADN de la región variable de humano y ADN de la región constante de humano,

: o tiene ADN de la región variable de humano y ADN de la región constante de una especie no humana que no es la hospedadora. También se pueden llevar a cabo otras variaciones, tales como la inserción tanto de la región variable de la cadena ligera de humano como de la región constante del genoma del hospedador. Además, la inserción de dichos transgenes de la cadena ligera necesitan no estar en el locus endógeno equivalente, sino que podría estar en cualquier otro lugar del genoma. En tal escenario, la célula o mamífero podría producir cadenas pesadas quiméricas (que comprenden ADN de la región variable de humano y ADN de la región constante de ratón) y cadenas ligeras que comprenden ADN de la región constante de humano y de la variable de humano. Así pues, en un aspecto de la invención, el ADN de la región variable de λ y/o κ de humano puede estar insertado por delante del locus endógeno,

: o por detrás, o realmente en un cromosoma diferente al del locus endógeno, y estar insertado con o sin el ADN de la región constante.

Al igual que la inserción del ADN de la cadena ligera de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador, otro aspecto de la invención se refiere a la inserción de una o ambas regiones variables de las cadenas ligeras de humano por detrás de la región constante del locus endógeno, o en cualquier otro lugar del genoma.

Por lo general, se prefiere la inserción del ADN de la región variable de humano en, o cerca de él, el locus endógeno equivalente en el genoma receptor, por ejemplo, a menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 kb del borde (delantero o trasero) de un locus de inmunoglobulina del hospedador.

En la presente memoria se describe una célula o mamífero no humano, cuyo genoma comprende:

(a): una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; y

(b): una o varias regiones V de la cadena ligera κ de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera κ de Ig de humano; y/o una o varias regiones V de la cadena ligera λ de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera λ de Ig de humano;

en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas ligeras o pesadas quiméricas, que tienen una región constante del mamífero no humano y una región variable de humano.

En un aspecto particular, el genoma de la célula o mamífero no humano comprende:

una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador;

una o varias regiones V de la cadena ligera κ de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera κ de Ig de humano por delante de la región constante de la κ del mamífero no humano hospedador; y

una o varias regiones V de la cadena ligera λ de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera λ de Ig de humano por detrás de la región constante de la λ del mamífero no humano hospedador,

opcionalmente en las que la región variable de la λ de humano puede estar insertada por detrás del locus endógeno de la λ del hospedador en unión operativa con una región constante de la λ de humano, de tal forma que la célula o el mamífero no humano pueden producir cadenas ligeras de anticuerpo completamente humanas y cadenas pesadas quiméricas.

En otro aspecto diferente de la invención, el uso de los procedimientos de la invención permite construir un locus por etapas mediante inserciones secuenciales y por lo tanto garantiza la inserción del ADN de la región variable de humano junto con el ADN de la región constante de humano o de no humano en cualquier posición adecuada del genoma de una célula hospedadora no humana. Por ejemplo, los procedimientos de la invención se pueden utilizar para insertar ADN de la región variable de inmunoglobulina de humano junto con ADN de la región constante del genoma del hospedador en cualquier lugar del genoma de una célula hospedadora no humana, lo que permite producir una cadena de anticuerpo quimérica desde un sitio diferente al de la región pesada endógena. Cualquier construcción de ADN de la cadenas ligera o de la cadena pesada de humano contemplada más arriba se puede insertar en cualquier posición deseada del genoma de una célula hospedadora no humana mediante las técnicas descritas en la presente memoria. Así, la presente invención también se refiere a células y mamíferos que tienen genomas que comprenden tales inserciones.

En la presente memoria se describe un vector, tal como un vector BAC, que comprende una región V, D o J de humano en una disposición funcional con un promotor, u otra secuencia de control, de mamífero no humano de tal forma que la expresión de la región V, D o J de humano se encuentra controlada por el promotor de mamífero no humano en una célula del mamífero no humano, tal como una célula ES, en particular una vez insertado en el genoma de dicha célula.

En la presente memoria se describen células y mamíferos no humanos que contienen dichas células, en donde dichas células o mamíferos tienen una región V, D o J de humano en una disposición funcional con un promotor de mamífero no humano, u otra secuencia de control, de tal forma que la expresión de la región V, D o J de humano está controlada por el promotor del mamífero no humano en las células o en el mamífero.

Así, generalmente, un aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora de mamífero no humano capaz de expresar la secuencia codificante de V, D o J de humano bajo el control de un promotor o región de control del hospedador, en donde la expresión es capaz de producir un anticuerpo humanizado que tiene un dominio variable humano y una región constante del mamífero no humano.

En la presente memoria se describe una célula, tal como una célula de no mamífero, tal como una célula ES, cuyo genoma comprende:

(b): opcionalmente, una o varias regiones V de cadena ligera κ de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera κ de Ig de humano por delante de la región constante κappa del mamífero no humano hospedador y/o una o varias regiones V de cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera lambda de Ig de humano por delante de la región constante lambda del mamífero no humano hospedador;

En la presente memoria se describe una célula, tal como una célula de mamífero no humano, tal como una célula ES, cuyo genoma comprende:

(a): una serie de regiones V de cadena ligera κappa de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera κappa de Ig de humano por delante de la región constante κappa del mamífero no humano hospedador y/o una serie de regiones V de cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera lambda de Ig de humano por delante de la región constante lambda del mamífero no humano hospedador; y

(b): opcionalmente una o varias regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la constante del mamífero no humano hospedador.

En un aspecto, la célula es una célula ES capaz de desarrollarse en un mamífero no humano capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, en donde dichos anticuerpos quiméricos tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano. Opcionalmente, el genoma de la célula está modificado para impedir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie hospedadora.

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En un aspecto, el primer fragmento de la región variable de humano se inserta mediante recombinación homóloga en la secuencia del esqueleto del casete de iniciación y, luego, el ADN de todo marcador de selección negativo y casete de iniciación se retiran posteriormente por recombinación entre las secuencias diana de la recombinasa, tal como la FRT que se utiliza en este ejemplo, la expresión de FLPasa. Por lo general, la repetición de las inserciones en la diana de la secuencia de inicio del esqueleto (p. ej. BAC) y la posterior retirada mediante reorganización entre las secuencias diana de la recombinasa se repiten para reconstruir toda la región VDJ de humano por delante de la región constante del no mamífero hospedador.

En un aspecto, en el procedimiento puede utilizarse un marcador o sistema de selección. El marcador puede generarse durante la inserción de un fragmento de ADN en un genoma, por ejemplo, al formar un marcador de selección junto con un elemento de ADN ya presente en el genoma.

En un aspecto, el genoma de la célula (p. ej., célula ES) no contiene 2 marcadores de selección idénticos al mismo tiempo durante el proceso. Se puede observar que el proceso repetitivo de inserción y selección puede llevarse a cabo con 2 marcadores de selección diferentes, como se describe en los ejemplos de la presente memoria y, por ejemplo, el tercer marcador de selección puede ser idéntico al primer marcador, ya que en el momento de insertar el tercer fragmento de vector ya se han eliminado el primer fragmento de vector y el primer marcador.

En un aspecto, hay que confirmar que la inserción es correcta antes de proseguir a la siguiente etapa de todo proceso de clonación por etapas, por ejemplo, mediante la confirmación de la estructura del BAC con matrices genómicas de alta densidad para escrutar las células ES para identificar las que tienen inserciones de BAC intactos, secuenciación y verificación por PCR.

En un aspecto, el procedimiento utiliza la recombinación específica de sitio para la inserción de uno o varios vectores en el genoma de una célula, tal como una célula ES. Los sistemas de recombinasa específica de sitio se conocen bien en la técnica y pueden incluir Cre-lox, y FLP/FRT o combinaciones de los mismos, en los cuales la recombinación se produce entre 2 sitios que tienen homología de secuencia.

Los BAC adecuados se pueden adquirir al Centro Sanger, véase «A genome-wide, end-sequenced 129Sv BAC library resource for targeting vector construction». Adams D. J., Quail M. A., Cox T., van der Weyden L., Gorick B. D., Su Q., Chan W. I., Davies R., Bonfield J. K., Law F., Humphray S., Plumb B., Liu P., Rogers J., Bradley A. Genomics. Dic 2005, 86 (6): 753-8. Epub 27 de octubre de 2005. The Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire CB10 1SA, Reino Unido. Los BAC que contienen ADN de humano también se pueden comprar a, por ejemplo, Invitrogen. En Osoegawa K et al., Genome Research, 2001, 11: 483-496 se describe una genoteca adecuada.

En un aspecto un procedimiento de la invención comprende específicamente:

(1): inserción de un primer fragmento de ADN en una célula ES no humana, en donde el fragmento contiene una primera porción del ADN de la región VDJ o VJ de humano y una primera porción de vector que contiene un primer marcador de selección;

(2): opcionalmente, deleción de una parte de la primera porción de vector,

(3): inserción de un segundo fragmento de ADN en una célula ES no humana que contiene el primer fragmento de ADN, en donde la inserción se produce dentro de la primera porción de vector, en donde el segundo fragmento de ADN contiene una segunda porción de la región VDJ o VJ de humano y una segunda porción de vector que contiene un segundo marcador de selección,

(4): deleción del primer marcador de selección y de la primera porción de vector, preferiblemente mediante la acción de una enzima recombinasa;

(5): inserción de un tercer fragmento de ADN en una célula ES no humana que contiene el segundo fragmento de ADN, en donde la inserción se produce dentro de la segunda porción de vector, en donde el tercer fragmento de ADN contiene una tercera porción de la región VDJ o VJ de humano y una tercera porción de vector que contiene un tercer marcador de selección,

(6): deleción del segundo marcador de selección y una segunda porción de vector; y

(7): repetición de las etapas de inserción y deleción, cuando sea necesario, para el cuarto y posteriores fragmentos de las regiones VDJ o VJ de humano, cuando sea necesario, para producir una célula ES con una parte o toda la región VDJ o VJ de humano insertada tal y como se describe en la presente memoria y, convenientemente, retirar todas las porciones de vector dentro del genoma de la célula ES.

En otro aspecto la invención comprende:

Inserción de ADN que forma un casete de iniciación en el genoma de una célula; 2 Inserción de un primer fragmento de ADN en el casete de iniciación, en donde el primer fragmento de ADN comprende una primera porción de un ADN de humano y una primera porción de vector que contiene un primer marcador de selección o que genera un marcador de selección tras la inserción;

3 Opcionalmente, retirada de parte del ADN del vector;

4 Inserción de un segundo fragmento de ADN dentro de la porción del vector del primer fragmento de ADN, en donde el segundo fragmento de ADN contiene una segunda porción del ADN de humano y una segunda porción de vector, en donde la segunda porción de vector contiene un segundo marcador de selección, o genera un segundo marcador de selección tras la inserción;

5 Opcionalmente, retirada de todo ADN de vector para permitir que el primer y el segundo fragmento de ADN humano formen una secuencia contigua; y

6 Repetición de las etapas de inserción del ADN de VDJ de humano y retirada del ADN de vector, cuando sea necesario, para producir una célula con toda o parte de la región VDJ o VJ de humano suficiente para ser capaz de generar, junto a una región constante del hospedador, un anticuerpo quimérico,

en donde la inserción de uno, o más, o todos los fragmentos de ADN utiliza la recombinación específica de sitio.

En un aspecto, el mamífero no humano es capaz de generar una diversidad de al menos 1 x 106 combinaciones diferentes de secuencias de inmunoglobulinas quiméricas funcionales.

En un aspecto, la integración se realiza en las células ES procedentes de la cepa de ratón 129S5 o 129Sv, C57BL/6N, C57BL/6J.

En un aspecto los animales no humanos, tales como ratones se generan en un fondo genético carente de RAG-1, u otro fondo genético adecuado que impide la formación de linfocitos T y B maduros en el hospedador.

El mamífero no humano reivindicado en esta memoria es un roedor, convenientemente un ratón, y las células de la invención son células de roedor o células ES, convenientemente células ES de ratón.

Las células ES de la presente invención pueden utilizarse para generar animales mediante la tecnología bien conocida en la técnica, que comprende la inyección de la célula ES en un blastocisto seguido de la implantación de los blastocistos quiméricos en las hembras para producir una camada que se pueda criar y se pueda seleccionar de ellos los recombinantes homocigotos que tienen la inserción requerida. En un aspecto, la invención se refiere a un animal quimérico que comprende un tejido procedente de las células ES y un tejido procedente del embrión hospedador. En un aspecto la invención se refiere a animales generados después de la alteración genética, que incluye animales que tienen recombinantes homocigotos para las regiones VDJ y/o VJ.

En un aspecto adicional la invención se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo específico contra un antígeno deseado, en donde el procedimiento comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico como anteriormente con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo (véase, p. ej., Harlow, E. y Lane, D., 1998, 5.ª edición, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY; y Pasqualini y Arap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101: 257-259). Convenientemente, se introduce una cantidad inmunógena del antígeno. La invención también se refiere a un procedimiento para detectar un antígeno deseado que comprende la detección de un anticuerpo producido como más arriba con un agente de detección secundario que reconoce una porción de dicho anticuerpo.

En un aspecto adicional la invención se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo completamente humanizado que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico como más arriba con el antígeno deseado, la recuperación del anticuerpo o de las células que expresan el anticuerpo y, luego, reemplazar la región constante del mamífero no humano con una región constante de humano. Esto puede realizarse mediante técnicas de clonación estándar a nivel del ADN para reemplazar la región constante del mamífero no humano con una secuencia de ADN de la región constante de humano adecuada, véase, p. ej., Sambrook, J. y Russell, D. (2001, 3.ª edición) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).

En un aspecto adicional la invención se refiere a anticuerpos y cadenas de anticuerpo humanizados producidos de acuerdo con la presente invención, tanto en forma quimérica como en forma completamente humanizada, y el uso de dichos anticuerpos en la medicina. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende tales anticuerpos y un vehículo u otro excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las cadenas de anticuerpo que contienen secuencias humanas, tales como las cadenas de anticuerpo quimérico humano-no humano se consideran humanizadas en la presente memoria en virtud de la presencia de la región de las regiones que codifican la proteína humana. Se pueden producir anticuerpos completamente humanizados partiendo del ADN que codifica una cadena de anticuerpo quimérica descrita en la presente memoria por medio de técnicas estándares.

Los procedimientos para generar anticuerpos monoclonales y policlonales se conocen bien en la técnica y la presente invención se refiere tanto a anticuerpos monoclonales como a policlonales de anticuerpos quiméricos o completamente humanizados que se sintetizan en respuesta a una prueba de provocación al antígeno en mamíferos no humanos de la presente invención.

Aún en otro aspecto, los anticuerpos o cadenas de anticuerpo quiméricos generados en la presente invención pueden manipularse, convenientemente a nivel de ADN, para generar moléculas con propiedades o estructura similares a las de los anticuerpos, tal como una región variable de humano de una cadena ligera o pesada que carece de una región constante, por ejemplo, un dominio de anticuerpo; o una región variable de humano con alguna región constante de cadena ligera o pesada de la misma especie o de diferente especie; o una región variable de humano con una región constante que no se produce en la naturaleza; o una región variable de humano junto con cualquier otra proteína acompañante para fusión. La invención se refiere a tales derivados de anticuerpos quiméricos procedentes de anticuerpos quiméricos identificados de acuerdo con la presente invención.

En esta memoria se describe el uso de animales de la presente invención en el análisis de los probables efectos de los fármacos y vacunas en el contexto de un repertorio de anticuerpos casi humanos.

En la presente memoria se describe un procedimiento para identificar o validar un fármaco o vacuna, en donde el procedimiento comprende la administración de la vacuna o el fármaco a un mamífero de la presente invención y monitorizar uno o varios de: la respuesta inmunitaria, el perfil de seguridad, el efecto sobre la enfermedad.

En la presente memoria se describe un kit que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo como el descrito en la presente memoria y o bien instrucciones para el uso de tal anticuerpo, o bien un reactivo de laboratorio adecuado, tal como un tampón, reactivo de detección de anticuerpo.

En la presente memoria se describen:

Un mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a): la región VDJ de IgH de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; y

(b): las regiones V y J de la cadena ligera κ de Ig de humano por delante de la región constante de la κ del mamífero no humano hospedador y/o las regiones V y J de la cadena ligera λ de Ig de humano por delante de la región constante de la λ del mamífero no humano hospedador;

en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante del mamífero no humano y una región variable de humano,

y opcionalmente en donde el genoma del mamífero no humano está modificado para impedir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie hospedadora.

Una célula ES de mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a): la región V, D y J de IgH de humano por delante de una región constante del mamífero no humano; y

(b): las regiones V y J de la cadena ligera κ del locus de Ig de humano por delante de la región constante de la κ del mamífero no humano hospedador, y/o las regiones V y J de la cadena ligera λ del locus de Ig de humano por delante de la región constante de la λ del mamífero no humano hospedador

en donde la célula ES es capaz de desarrollarse en un mamífero no humano, y que es capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

Un procedimiento para producir un mamífero no humano transgénico capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, en donde los anticuerpos tienen una región constante del mamífero no humano y una región variable de humano, en donde el procedimiento comprende insertar en un genoma de célula ES de mamífero no humano, mediante recombinación homóloga,

(a): la región VDJ de IgH de humano por delante de la región constante de la cadena pesada del mamífero no humano hospedador, y

(b): la región VJ de la cadena λ y κ de IgL de humano por delante de la región constante de la cadena λ o κ del mamífero no humano hospedador, respectivamente

de tal forma que el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen

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La terminología «o combinaciones de los mismos» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, «A, B, C o combinaciones de las mismas» pretende incluir al menos una de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o varios elementos o términos, tal como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB y etcétera. El experto en la técnica comprenderá que típicamente no hay límite al número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que resulte evidente a partir del contexto.

Cualquier parte de esta descripción puede ser leída en combinación con cualquier otra parte de la descripción, a menos que resulte evidente a partir del contexto.

Todas las composiciones y/o procedimientos descritos y reivindicados en la presente memoria pueden realizarse y ejecutarse sin demasiada experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y procedimientos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o procedimientos y en las etapas o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en la presente memoria sin alejarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Todos estos sustitutos y modificaciones similares que resultan evidentes para los expertos en la técnica se considera que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención tal y como está definido en las reivindicaciones anexas.

La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes. El ejemplo 3 describe datos experimentales que se han obtenido y que apoyan la demostración preliminar de algunos aspectos de la invención, mientras que los ejemplos 1 y 2 proporcionan una guía detallada para la persona experta en la técnica a la hora de llevar a cabo la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Estrategia global.

Se puede conseguir un modelo de ratón de la invención mediante la inserción de aproximadamente 960 kb del locus de la cadena pesada de humano que contiene todas las regiones V, D y J por delante de la región constante de ratón y 473 kb de la región de la cadena κ de humano por delante de la región constante de ratón. Alternativamente,

o en tándem, la región de la cadena λ de humano se inserta por delante de la región constante de ratón. Esta inserción se consigue mediante integración génica en las células ES gracias a la tecnología bien conocida en la técnica.

La inserción con gran fidelidad de las regiones V-D-J intactas en cada locus en su configuración nativa (tipo silvestre) se consigue convenientemente mediante la inserción de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de humano en el locus. Convenientemente, los BAC están recorortados de tal forma que en el locus final no se duplica ni se pierde ninguna secuencia en comparación con el original. Tal recorte se puede llevar a cabo mediante ingeniería por recombinación.

Los BAC de humano relevantes y convenientemente recortados que cubren estos locus tienen un tamaño medio de 90 kb.

En una estrategia, todo el complemento de los elementos D y J humanos así como siete u ocho regiones V de humano están cubiertos por el primer BAC a insertar en el esquema de inserción experimental descrito más adelante. Los primeros BAC que se insertarán en los locus de IgH e IgK pueden contener las siguientes regiones V: IgH: V6-1, VII-1-1, V1-2, VIII-2-1, V1-3, V4-4, V2-5 e IgK: V4-1, V5-2, V7-3, V2-4, V1-5, V1-6, V3-7, V1-8.

Convenientemente la funcionalidad de cada locus se evalúa tras la inserción del primer BAC mediante ratones quiméricos y también tras cada adición posterior de BAC. Véase más adelante una descripción detallada de esta prueba de funcionalidad.

Se requerirán nueve inserciones adicionales de BAC en el locus IgH y cinco en el IgK para proporcionar todo el complemento de las regiones V de humano que cubren las 0,96 Mb y 0,473 Mb de los locus IgH e IgK, respectivamente.

No todos los BAC conservan su configuración de tipo silvestre cuando están insertados en el genoma de las células ES. Así pues, hemos desplegado matrices genómicas de alta densidad para escrutar las células ES e identificar las que presentan inserciones intactas de BAC (Barrett, M. T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P. S., et al. (2004). «Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 17765-17770). Este escrutinio también permite que se puedan identificar y seleccionar clones de ES en los que el genoma de la célula ES está comprometido y, por consiguiente, que no serían capaces de poblar la línea de células reproductoras de los animales quiméricos. Otras herramientas genómicas adecuadas para facilitar esta valoración incluyen la secuenciación y verificación por PCR.

Así pues, en un aspecto, la estructura correcta del BAC se confirma antes de proseguir con la siguiente etapa.

Está implícito a partir de la descripción anterior que para reconstruir completamente los locus con los BAC de 90 kb es necesario realizar un mínimo de 10 etapas de inserción para IgH y 5 etapas para IgK. Los ratones con un locus IgL se pueden generar de una manera similar al locus IgK. Se requieren etapas adicionales para retirar los marcadores de selección necesarios para apoyar la integración génica. Ya que estas manipulaciones se realizan por etapas en las células ES, en un aspecto se conserva la capacidad de transmisión de las células reproductoras a lo largo de este proceso.

Mantener la funcionalidad de los clones de células ES a lo largo de varias rondas de manipulación sin necesidad de comprobar la potencialidad de las células reproductoras de la línea de células ES en cada etapa puede ser importante en la presente invención. Las líneas celulares actualmente en uso para los proyectos de genosupresión globales KOMP y EUCOMM se han modificado dos veces antes de su uso para este proyecto y la velocidad de transmisión de sus células reproductoras sigue siendo la misma que la de las células parentales (dichas líneas están disponibles al público, véase www.komp.org y www.eucomm.org). Esta línea celular, denominada JM8, puede generar ratones que proceden al 100% de las células ES en las condiciones de cultivo publicadas (Pettitt, S. J., Liang, Q., Rairdan, X. Y., Moran, J. J., Prosser, H. M., Beier, D. R., Lloyd, K. C., Bradley, A. y Skarnes, W. C. (2009). «Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources». Nature Methods). Se ha demostrado que estas células son capaces de contribuir reproduciblemente a formar el tejido somático y germinal de los animales quiméricos utilizando las condiciones de cultivo estándares para las células ES de ratón. Esta capacidad se puede encontrar en las células cultivadas con una línea de células alimentadoras estándares (SNL, por su nombre en inglés) e incluso libres de alimentadoras, crecidas sólo en placas de cultivo de tejidos recubiertas con gelatina. Una sublínea particular, JM8A3, mantuvo la capacidad de poblar las células reproductoras de quimeras tras varias rondas en serie de subclonación. La manipulación genética extensa vía, por ejemplo, la recombinación homóloga — como sería el caso en la presente invención— no puede comprometer la pluripotencia de las células. La capacidad para generar quimeras con tan alto porcentaje de tejido procedente de células ES tiene otras ventajas. Primero, unos niveles altos de quimerismo se correlacionan con el potencial de transmisión de las células reproductoras y proporciona un ensayo sustitutivo para la transmisión de las células reproductoras, que sólo necesita 5 a 6 semanas. Segundo, ya que estos ratones proceden de las células ES al 100%, se puede analizar directamente el locus manipulado genéticamente, con lo que se quita el retraso ocasionado por la crianza. El análisis de la integridad de los nuevos locus de Ig se puede hacer en la quimera, ya que el embrión hospedador procederá de animales que son mutantes para el gen de RAG-1 tal y como se describe en el apartado siguiente.

Otra línea celular que puede utilizarse es una línea celular HPRT-ve, tal como AB2.1, tal y como se describe en «Chromosome engineering in mice», Ramírez-Solis R, Liu P y Bradley A, Nature 1995; 378; 6558; 720-4.

Complementación de RAG-1.

Mientras que muchos clones generarán ratones procedentes de ES al 100%, algunos no lo harán. Así pues, en cada etapa, los ratones se generan en un fondo genético que carece de RAG-1. Esto proporciona ratones con linfocitos B y T que proceden de ES al 100% y que pueden utilizarse directamente para la inmunización y la producción de anticuerpos. Se pueden utilizar las células que tienen un fondo fondo genético que carece de RAG-2, o un fondo genético combinado que carece de RAG-1/RAG-2, o mutaciones equivalentes en las cuales los ratones producen sólo linfocitos B y/o linfocitos T procedentes de las células ES.

Para que sólo estén activos los locus IgH o IgK de ratón-humano en estos ratones, los locus IgH e IgK de ratónhumano pueden modificarse genéticamente en una línea celular en la cual un alelo del locus de IgH o de IgK ya está inactivado. Alternativamente, tras la inserción se puede llevar a cabo la inactivación de locus de la Ig del hospedador, tal como los locus IgH o IgK.

Las cepas de ratón que tienen el gen de RAG-1 mutado son inmunodeficientes porque no tienen linfocitos B o T maduros (patente de los EE.UU. US 5.859.307). Los linfocitos T y B sólo se diferencian si se produce una recombinación de V(D)J correcta. Dado que RAG-1 es una enzima crucial para esta recombinación, los ratones que carecen de RAG-1 son inmunodeficientes. Si los embriones hospedadores son mutantes genéticamente homocigotos de RAG-1, una quimera producida por la inyección de tal embrión no podrá producir anticuerpos si los tejidos linfáticos del animal proceden del embrión hospedador. Sin embargo, las células JM8 y AB2.1, por ejemplo, contribuyen por lo general en exceso al 80% de los tejidos somáticos del animal quimérico y, por consiguiente, suelen poblar el tejido linfático. Las células JM8 tienen actividad RAG-1 de tipo silvestre y, por lo tanto, los anticuerpos producidos en el animal quimérico estarían codificados sólo por el genoma de las células ES JM8. Por lo tanto, el animal quimérico puede exponerse a un antígeno mediante inmunización y, posteriormente, producir anticuerpos contra ese antígeno. Esto permite que el experto en la técnica compruebe la funcionalidad de los locus de IgH e IgK de humano/ratón modificados genéticamente como se describe en la presente memoria. Véanse las

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Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 17453-17456). Las células ES que tienen genomas anómalos no contribuyen de manera eficaz a los tejidos reproductores de los ratones quiméricos. Se examinará la integridad del BAC mediante amplificación por PCR de cada gen V funcional conocido en el BAC. Por ejemplo, en una estrategia, el primer BAC de humano elegido para el locus IgH tiene 6 genes V funcionales. Para confirmar la integridad de este BAC por la presencia de estos 6 genes V de IgH, se diseñarán al menos 14 pares de cebadores para PCR y se utilizarán para amplificar por PCR el ADN genómico de las células ES que llevan la integración. Se considera que el BAC insertado no se ha reorganizado cuando el tamaño y la secuencia de estos fragmentos son como los del tipo silvestre humano.

Una CGH más detallada también confirmará la integridad de los BAC insertados. Por ejemplo, el experto en la técnica podría utilizar una plataforma de aCGH de oligonucleótidos, que está desarrollada por Agilent Technologies, Inc. Esta plataforma no sólo permite estudiar la variación del número de copias del ADN por todo el genoma a gran resolución (Barrett, M. T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P. S., et al. (2004). «Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 1776517770), sino que permite examinar una región concreta del genoma mediante matrices diseñadas a medida. Al comparar las técnicas de aCGH tradicionales que se basan en sondas de ADNc o sondas de todo el BAC, las sondas oligonucleotídicas de 60 nucleótidos pueden asegurar la hibridación específica y la alta sensibilidad y precisión que se necesitan para detectar las alteraciones cromosómicas por modificación genética que se han realizado. Por ejemplo, los oligonucleótidos diseñados para que se hibriden a intervalos regulares a lo largo de toda la longitud del BAC insertado detectarían incluso deleciones, inserciones u otras reorganizaciones muy cortas. Asimismo, esta plataforma proporciona la mayor flexibilidad para los diseños de micromatrices a medida. El ADN genómico de las células ES con integración y el ADN genómico individual humano normal se marcarán por separado con fluoróforos y se hibridarán a la matriz. Los soportes de las matrices se escanearán con un escáner de micromatrices de ADN de Agilent Technologies. La intensidad de fluorescencia recíproca de los fluoróforos Cy5 y Cy3 en cada imagen de la matriz y el logaritmo en base 2 de los valores de la proporción se extraerán con el programa informático Bluefuse (Bluegnome). Los puntos con patrones de fluorescencia incoherentes («confianza» < 0,29 o «calidad» = 0) se descartarán antes de normalizar todos los valores de los log2 de las proporciones. Dentro de un experimento, el log2 de la proporción entre –0,29 y +0,29 para la señal de cualquier sonda de oligonucleótidos se considera que no implica ningún cambio en el número de copias. El umbral del log2 de la proporción para la «duplicación» es normalmente > 0,29999, y para la deleción es <0,29999.

Una vez que el primer BAC humano está insertado en el locus IgH de ratón y se confirma que está en su configuración nativa intacta, el esqueleto de BAC flanqueado por FRT se escindirá mediante la recombinasa Flp específica de sitio. Si la recombinación normal de FRT catalizada por Flp no es suficientemente alta, se puede utilizar Flo, una versión mejorada de la recombinasa Flp que en algunos análisis es de 3 a 4 veces más eficaz en las células ES que la Flp original. Después de haber escindido el esqueleto del BAC, las células ES se harán sensibles a la puromicina (o al G418) y resistentes a FIAU (por la pérdida del casete TK). Cada escisión se caracterizará adicionalmente mediante amplificación por PCR del fragmento de unión con el uso de cebadores del ADN genómico humano. Estas células ES sin el esqueleto del BAC flanqueado por FRT se utilizarán en la siguiente ronda de inserción de BAC de humano y para la inyección de blastocistos.

La integración en el genoma de una célula ES para producir un ratón transgénico puede llevarse a cabo con un protocolo como el explicado con referencia a las figuras 1 a 18 adjuntas.

La figura 1 ilustra el esqueleto básico de tres vectores; un casete de iniciación y 2 vectores con insertos grandes, 1 y 2, respectivamente. El casete de iniciación comprende secuencias homólogas al sitio de inserción deseado en el genoma de ratón, esos sitios que flanquean un marcador de selección y secuencia de relleno con el cebador para el genotipado por PCR para confirmar que inserción de los BAC ha sido correcta. La secuencia del cebador en el relleno proporciona la base para el genotipado de cada etapa de adición de BAC. Se considera que esta secuencia proporciona una plantilla de secuencia bien validada y robusta para el cebador de la PCR y puede localizarse en el sitio de I-Scel, idealmente a aproximadamente 1 kb del inserto del BAC.

Los vectores con insertos grandes comprenden ADN de humano en plásmidos con marcadores de selección y un único sitio de restricción para la linealización del plásmido para ayudar en la recombinación homóloga en el genoma de la célula ES.

La figura 2 ilustra la inserción de un casete de iniciación en el genoma de ratón mediante recombinación homóloga entre los exones J4 y Cα de ratón. La selección con puromicina permite identificar las células ES con la inserción del casete. Pu(∆)tk es una proteína de fusión bifuncional entre la puromicina N-acetiltransferasa (Puro) y una versión truncada de la timidina cinasa de tipo 1 del virus del herpes simple (∆Tk). Las células ES (troncales embrionarias) murinas que están transfectadas con pu(∆)tk se vuelven resistentes a la puromicina y sensibles al 1-(2-desoxi-2fluoro-1-β-D-arabino-furanosil)-5-yodouracilo (FIAU). A diferencia de otros transgenes de la tk del HSV1, pu(∆)tk se transmite con facilidad a través de las células reproductoras macho. Esta pu(∆)tk es un marcador de selección

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El tamaño de inserto más grande que admite un BAC es de aproximadamente 300 kb y, por lo tanto, esto coloca un límite superior al tamaño del casete para RMCE.

En la presente invención utilizamos una nueva técnica basada en la SSR llamada RMCE secuencial (SRMCE, por su nombre en inglés), que permite la inserción continua de insertos de BAC en el mismo locus.

El procedimiento comprende las etapas de

1 Inserción del ADN que forma parte de un casete de iniciación (también llamado una zona de integración en la presente memoria) en el genoma de una célula;

2 Inserción de un primer fragmento de ADN en el sitio de inserción, en donde el primer fragmento de ADN comprende una primera porción de un ADN de humano y una primera porción de vector que contiene un primer marcador de selección o que genera un marcador de selección tras la inserción;

3 Retirada de parte del ADN del vector;

4 Inserción de un segundo fragmento de ADN en la porción del vector del primer fragmento de ADN, en donde el segundo fragmento de ADN contiene una segunda porción del ADN de humano y una segunda porción de vector, en donde la segunda porción de vector contiene un segundo marcador de selección, o que genera un segundo marcador de selección tras la inserción;

5 Retirada de todo ADN de vector para permitir que el primero y el segundo fragmentos de ADN humanos formen una secuencia contigua; y

6 Repetición de las etapas de inserción de una parte del ADN de V(D)J de humano y retirada del ADN del vector, cuando sea necesario, para producir una célula con toda o parte de la región VDJ o VJ de humano suficiente para ser capaz de generar un anticuerpo quimérico junto con una región constante del hospedador,

en donde la inserción de al menos un fragmento de ADN utiliza la recombinación específica de sitio.

En un aspecto específico, la estrategia utiliza tres sitios loxP incompatibles y heteroespecíficos. El procedimiento comprende las etapas que siguen, y que se ilustran en las figuras 22 a 26:

1.: Reconocimiento de una zona de integración en el locus definido. Un vector de entrada que contiene un minigén de HPRT flanqueado por las ITR de piggyBac (PB) invertidas se integra en la región definida (por ejemplo, una región entre IgHJ y Eµ o IgKJ y Eκ o IgLC1 y Eλ3-1) para servir de zona de integración para la inserción del BAC. El minigén de HPRT está comprendido por dos exones sintéticos y el intrón asociado. El exón de HPRT en 5' está flanqueado por dos sitios loxP heteroespecíficos e incompatibles (un sitio es de tipo silvestre y el otro es un sitio mutado, lox5171) en orientación inversa el uno respecto al otro (figura 22). Estos dos sitios loxP proporcionan sitios de recombinación para la inserción del BAC mediante RMCE.

2.: Inserción del primer BAC modificado en la zona de integración reconocida. El primer BAC tiene un tramo del ADN a insertar en el genoma flanqueado por las modificaciones introducidas mediante ingeniería genética. La modificación en 5' (loxP — gen neo — lox2272 — promotor de PGK — 5'-LTR de PB) y la modificación en 3' (3'-LTR de PB — gen puroΔTK — lox5171) se describen en la figura 23 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y las LTR de PB. Con la expresión transitoria de CRE desde un vector coelectroporado, la secuencia de ADN se insertaría en el locus definido mediante la RMCE. Las células en las cuales se ha producido una inserción correcta pueden seleccionarse como se describe a continuación: (i) resistencia a la puromicina (el gen puroΔTK ha adquirido un promotor [«PGK»] que estaba en la zona de integración), (ii) resistencia a 6TG (el minigén de HPRT está interrumpido) y (iii) resistencia a G418 (selecciona cualquier inserción gracias a la disposición de la región 5' de PGK-neo). Puede utilizarse cualquier combinación de estas formas de selección. La resistencia a G418 y 6TG selecciona las integraciones correctas en el extremo 5' mientras que la resistencia a la puromicina selecciona las integraciones correctas en el extremo 3'.

3.: Curación (retirada) de la modificación en 3' de la primera inserción. Un primer BAC insertado correctamente da lugar a que el extremo 3' tenga un gen puroΔTK flanqueado por las LTR de PB invertidas (figura 24), esencialmente una estructura de transposón correcta. A continuación, este transposón puede retirarse mediante la expresión transitoria de la transposasa de piggyBac (desde un vector electroporado). Las células con el acontecimiento de escisión correcto pueden seleccionarse mediante resistencia al FIAU: esto es, no hay actividad timidina cinasa del gen puroΔTK. Esto retira completamente la modificación en 3' sin dejar nucleótidos de más.

4.: Inserción de un segundo BAC modificado en el extremo 5' de la primera inserción. El segundo BAC tiene un tramo de ADN a insertar en el genoma (normalmente se pretende que sea contiguo con el ADN insertado

con el primer BAC) flanqueado por modificaciones introducidas por ingeniería genética. La modificación en 5' (loxP — porción 5' del minigén de HPRT — lox5171 — promotor de PGK — 3'-LTR de PB) y la modificación en 3' (3'-LTR de PB — puroΔTK — lox2272) se describe en la figura 25 junto con las orientaciones relativas de los sitios de lox y las LTR de PB. Con la expresión transitoria de CRE desde un vector coelectroporado, la secuencia de ADN se insertaría en el locus mediante RMCE. Las células en las cuales se ha producido una inserción correcta pueden seleccionarse del siguiente modo: (i) resistencia a HAT (el minigén de HPRT se reconstruye mediante un acontecimiento de inserción correcto, a saber: las estructuras exónicas en 3' y 5' se ponen juntas) y (ii) resistencia a la puromicina (el gen puroΔTK ha adquirido un promotor -«PGK»-que estaba en la zona de integración).

5.: Curación (retirada) de la modificación en 3' de la segunda inserción. Un segundo BAC insertado correctamente da lugar al extremo 3' que tiene un gen puroΔTK flanqueado por las LTR de PB invertidas (figura 26) —esencialmente una estructura de transposón correcta, exactamente análoga a la consecuencia de una primera inserción satisfactoria de BAC—. Y por lo tanto, este transposón puede retirarse igualmente mediante la expresión transitoria de la transposasa de piggyBac (desde un vector electroporado). Las células con la escisión correcta pueden seleccionarse mediante resistencia a FIAU: esto es, no hay actividad timidina cinasa a partir del gen puroΔTK. Esto retira completamente la modificación en 3' sin dejar nucleótidos de más.

6.: Después de curar la modificación en 3' de la inserción del segundo BAC, la zona de integración se convierte en una idéntica a la original. Este proceso completo, las etapas 2 hasta la 5, pueden repetirse varias veces para construir una inserción grande en el genoma. Cuando esté completa, no quedará ningún nucleótido residual que no pertenezca a la inserción deseada.

Con la inserción de un número impar de BAC en los locus de Ig, las secuencias endógenas de VDJ o VJ pueden inactivarse a través de una inversión gracias a una modificación genética del cromosoma como la descrita a continuación (véanse las figuras 27 a 29):

1.: Inserción de un casete «volteador» en una región en 5' que está a entre 10 y 40 megabases de la VDJ o VJ endógena. El vector volteador (3'-LTR de PB — promotor de PGK — porción en 5' del minigén de HPRT — loxP — puroΔTK — promotor de CAGGS — 3'-LTR de PB) se describe en la figura 27 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y de las LTR de PB.

2.: La expresión transitoria de CRE dará lugar a la recombinación entre el sitio loxP en el casete «volteador» y el sitio loxP de la modificación en 5'. Esta modificación en 5' es como está descrito en las etapas 2 y 3 de más arriba: esencialmente, la modificación que es resultado de insertar un número impar de BAC, después de que se haya curado la modificación en 3'. Los sitios loxP están invertidos entre sí y, por lo tanto, el acontecimiento de recombinación descrito da lugar a una inversión como la descrita en la figura 28. Las células con la inversión correcta tendrán resistencia a HAT, ya que el minigén de HPRT se ha reconstruido mediante una inversión correcta.

3.: Una inversión correcta también deja dos estructuras de transposón flanqueando el casete «volteador» y la modificación en 5'. Ambos pueden escindirse con la expresión transitoria de la transposasa de piggyBAC, lo que no deja ningún resto de ninguna de las modificaciones (figura 29). Las células con las escisiones correctas pueden seleccionarse como se explica a continuación: (i) resistencia a 6TG (se ha eliminado el minigén de HPRT) y (ii) resistencia a FIAU (se ha eliminado el gen puroΔTK). Una inversión como la descrita en los locus de Ig alejarían la región endógena IgH-VDJ o IgK-VJ de la región potenciadora de Eµ

o Eκ, respectivamente, y conducirían a la inactivación de las regiones endógenas IgH-VDJ o IgK-VJ.

Los procedimientos de inserción de la invención dan a conocer convenientemente uno o varios de:

Selección de ambos extremos 5' y 3' del fragmento de ADN insertado;

Curación eficaz de la modificación en 3', preferiblemente mediante la escisión de ADN mediada por transposasa;

Inactivación de la actividad endógena de IgH o IgK mediante una inversión; y

Escisión de las modificaciones, lo que no deja ningún nucleótido de más en el cromosoma.

Ejemplo 3

La demostración preliminar de la técnica se describe en la figura 30. En la figura 30, una zona de integración como la mostrada en la figura 22 se insertó en el genoma de un ratón mediante recombinación homóloga, y luego se insertó el plásmido R21 en esa zona de integración gracias a la recombinación específica de sitio mediada por CRE. El acontecimiento de inserción generó numerosas inserciones generales, 360 colonias resistentes a G418, de las cuales aproximadamente 220 tenían el inserto en el locus deseado, como se demostró por la interrupción del minilocus de HRPT.

El vector de R21 imita los extremos en 5' y 3' del vector de inserción del primer BAC, incluidos todos los elementos de selección y sitios diana de la recombinasa. En lugar de la secuencia de los BAC, hay una pequeña secuencia de «relleno». Este vector servirá para analizar todos los principales diseños de la invención y permitirá que se analicen son facilidad los resultados, ya que se puede realizar una PCR que abarque el relleno y, por lo tanto, permite el análisis fácil de ambos extremos de la inserción. El R21 se coelectroporó con un vector de expresión de CRE en las células ES que albergan la zona de integración en el locus IgH. Se transfectaron en paralelo cuatro conjuntos de células transformadas y luego se colocaron en regímenes de selección diferentes tal y como se indica en la figura

30. La selección por G418 (expresión del gen neo) dio lugar al mayor número de colonias debido a que no hay ningún requisito para la inserción por la zona de integración específica. Toda integración de R21 en el genoma proporcionará la expresión de neo, lo que conduce a la resistencia a G418. La selección con puromicina dio lugar a un número de colonias similar a puromicina + 6TG o G418 + 6TG, lo que sugiere que el rigor de la selección con puromicina se debe a que el gen puroΔTK carece de promotor en el vector. La expresión de resistencia a la puromicina sólo se adquiere cuando se produce una integración cerca de un elemento promotor —en este diseño, lo más probable es la inserción específica en la zona de integración—. Estas conclusiones están apoyadas por los resultados de la PCR sobre la unión que se muestra en la figura 31.

La siguiente etapa en la invención es «curar» el extremo 3' del vector BAC integrado, lo que deja una transición ininterrumpida entre la inserción y el genoma flanqueante. Demostramos que se produjo esta curación mediante la expansión de uno de los clones anteriores (R21 insertado en la zona de integración) y la expresión de la recombinasa de piggyBAC en este clon mediante la transfección de un plásmido que la expresa. Se utilizó el FIAU para seleccionar colonias en las cuales se escindió la modificación en 3': esto es, a través de la pérdida del elemento «PGK — puroΔTK» entre las repeticiones terminales de piggyBAC. En una transfección de 106 células se obtuvieron 50 de tales clones; se analizó la estructura genómica esperada en 6 de ellos. La curación satisfactoria permitía obtener una PCR positiva entre el conjunto de cebadores marcado con «3» en la figura 32. De los 6 clones, 4 tuvieron escisiones correctas, 1 clon se quedó con la configuración original y otro más tenía una deleción.

Estos datos demuestran que se insertó repetidamente ADN en una zona de integración en un locus genómico definido mediante las estrategias descritas más arriba.

Ejemplo 4

El ejemplo 3 demostró que el diseño de la invención reivindicada era capaz de proporcionar la inserción de un vector problema en el genoma en una posición definida, en este caso el vector de R21 en el locus de IgH de ratón. El uso del medio de selección adecuado y la expresión de la recombinasa cre dieron lugar a una alteración genómica con la estructura predicha.

Los mismos elementos diseñados que se describen en esta invención se colocaron en los extremos en 5' y 3' de un inserto de BAC. Dicho inserto comprendía secuencias humanas del locus IgH y tenía aproximadamente 166 kb. Este BAC modificado genéticamente se introdujo por electroporación, junto con un ADN plasmídico que expresaba cre, en las células ES de ratón que albergan la zona de integración en el locus IgH de ratón. La población de células transfectadas se hizo crecer en el medio con puromicina para seleccionar las inserciones correctas.

Se aislaron los siete clones resultantes y se analizaron con más detalle. El acontecimiento de recombinación esperado y la estructura resultante se describen en la figura 33. Basándose en los datos del experimento de R21 descrito en el ejemplo 3, se esperaba una selección rigurosa de los clones correctos cuando se seleccionó la población transfectada en el medio con puromicina. Esto es porque la región que codifica la resistencia a la puromicina requiere un elemento promotor, y éste lo suministra preferiblemente la zona de integración después de la recombinación. Por consiguiente, la mayoría de los 7 clones aislados tenían la inserción correcta en el genoma en la zona de integración, tal y como se determinó mediante PCR diagnóstica. Los cebadores para diagnosticar una inserción correcta se describen en la figura 33. Las uniones correctas están presentes en el genoma si se amplifica un fragmento de 610 pb entre los cebadores «A» y «X» y se amplifica un fragmento de 478 pb entre los cebadores

«Y» y «B» (figuras 33 y 34). Obsérvese que hay fragmentos amplificados entre los cebadores «A» y «1» y entre los cebadores «2» y «B», lo que indica la presencia de un genoma parental (es decir, únicamente la zona de integración). Estos se deben a que las células parentales presentes en el interior en las colonias de células en selección con puromicina se escapan a dicha selección debido a la geometría de una colonia. Después de hacer pases de la colonia por medios que contienen puromicina, estos fragmentos de unión originales desaparecen, lo que indica que las células parentales han sido retiradas de la población. Además, todos los clones resultaron ser resistentes a 6TG como se esperaba si el gen HPRT está inactivado por el acontecimiento de inserción correcto.

Estos datos indican que la estrategia descrita para insertar grandes partes de los locus humanos de Ig en las posiciones definidas en el genoma de ratón permitirán la construcción de un ratón con numerosas regiones variables de las regiones de Ig de humano por delante de las regiones constantes de ratón tal y como está descrito.

En la presente memoria se describen:

A Un mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a): una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante de mamífero no humano hospedador; y

(b): opcionalmente una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de humano por delante de la región constante kappa de mamífero no humano hospedador y/o una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig de humano por delante de la región constante de lambda de mamífero no humano hospedador;

en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas pesadas y ligeras quiméricas, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

B Un mamífero no humano cuyo genoma comprende

(a): una serie de regiones V de la cadena ligera kappa de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig de humano por delante de la región constante de kappa de mamífero no humano hospedador; y/o una serie de regiones V de la cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante de lambda de mamífero no humano hospedador; y

(b) opcionalmente una o varias regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una

: o varias regiones J de humano por delante de la constante de mamífero no humano hospedador;

en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas pesadas

: o ligeras quiméricas, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

C Una célula de mamífero no humano cuyo genoma comprende

(a): una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante de mamífero no humano hospedador y

(b): opcionalmente una o varias regiones V de la cadena ligera kappa de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig de humano por delante de la región constante kappa de mamífero no humano hospedador, y/o una o varias regiones V de la cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig de humano por delante de la región constante de lambda de mamífero no humano hospedador.

D Una célula de mamífero no humano cuyo genoma comprende

(a): una serie de regiones V de la cadena ligera kappa de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera kappa de Ig de humano por delante de la región constante kappa de mamífero no humano hospedador y/o una serie de regiones V de la cadena ligera lambda de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera lambda de Ig de humano por delante de la región constante de lambda de mamífero no humano hospedador; y

: o varias regiones J de humano por delante de la región constante de mamífero no humano hospedador.

E Una célula de acuerdo con el enunciado C o D que es una célula ES, una célula madre hematopoyética u otra célula capaz de desarrollarse en un mamífero no humano capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas de anticuerpos que son quiméricos, teniendo dichos anticuerpos o cadenas quiméricos una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

F Una célula de acuerdo con el enunciado C o D que es una célula ES, una célula madre hematopoyética u otra célula capaz de contribuir a tejidos y órganos de un mamífero no humano que es capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas de anticuerpos que son quiméricos, teniendo dichos anticuerpos o cadenas quiméricos una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

G Una célula o mamífero de acuerdo con el enunciado A-F en donde el genoma de la célula o mamífero se modifica para evitar o reducir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie de hospedador.

H Una célula o mamífero de acuerdo con los enunciados A-G que comprende un ADN de la región variable de humano insertado de al menos una cadena pesada de humano y ligera de humano.

I Una célula o mamífero de acuerdo con el enunciado H en donde la célula o mamífero son homocigotos en

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Claims

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