CN105340834B - 动物模型及治疗分子 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了产生嵌合人‑非人抗体及嵌合抗体链的方法，以及如此产生的抗体和抗体链，及其衍生物，包括完全人源化抗体；本发明还揭示了包含所述抗体、抗体链及衍生物的组合物，以及适用于所述方法中的细胞、非人哺乳动物和载体。

Description

动物模型及治疗分子
本申请是2010年7月7日提交的题为“动物模型及治疗分子”的中国专利申请201080040055.5的分案申请。
发明背景
本发明涉及被工程化为含有外源DNA如人免疫球蛋白基因DNA的非人动物和细胞，其在医药学和疾病研究中的应用，产生非人动物和细胞的方法，以及由这种动物产生的抗体和抗体链及其衍生物。
为了解决人源化抗体的问题，许多公司着手产生具有人免疫系统的小鼠。使用的策略是敲除ES细胞中的重链和轻链基因座，并用转基因互补这种遗传损伤，所述转基因被设计为表达人重链和轻链基因。尽管可以产生完全人抗体，但是这些模型具有一些主要限制：
(i)重链和轻链基因座的大小(每个均几个Mb)使得不能将全部基因座导入这些模型中。结果获得的转基因品系具有非常有限的V区库(repertoire)，大多数恒定区缺失并且重要的远距离(distant)增强子区未包含在该转基因中。
(ii)产生大插入体转基因品系的极低效率以及使其与重链和轻链敲除品系杂交及使其再次纯合的复杂性和所需时间，限制了可以进行分析最优化表达的转基因品系的数目。
(iii)个体抗体亲和性很少达到可以得自完整(非转基因)动物的那些亲和性。
WO2007117410揭示了表达嵌合抗体的嵌合构建体。
WO2010039900揭示了具有编码嵌合抗体的基因组的敲入(knock in)细胞和哺乳动物。
本发明提供了在非人哺乳动物中产生包含人Ig可变区的抗体的方法，及进一步提供了产生这种抗体的非人动物模型。
发明概述
一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，
其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库或者嵌合轻链或重链库，所述嵌合抗体或嵌合轻链或重链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，
其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库或者嵌合轻链或重链库，所述嵌合抗体或嵌合轻链或重链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
一方面，本发明涉及非人哺乳动物细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区。
一方面，本发明涉及非人哺乳动物细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区。
另一方面，本发明涉及产生非人细胞或哺乳动物的方法，包括将如下结构插入非人哺乳动物细胞基因组如ES细胞基因组中：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，
所述插入使得非人细胞或哺乳动物能产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体库，其中步骤(a)和(b)可以依次进行，步骤(a)和(b)每个步骤可以逐步进行或者单步进行。
插入可以通过同源重组进行。
另一方面，本发明涉及产生特异于希望的抗原的抗体或抗体链的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文揭示的转基因非人哺乳动物及回收所述抗体或抗体链。
另一方面，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文所述转基因非人哺乳动物，回收所述抗体或产生所述抗体的细胞，然后例如通过蛋白质或DNA工程将所述非人哺乳动物恒定区用人恒定区置换。
另一方面，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，其是嵌合的(如小鼠-人)和完全人源化形式的，本发明还涉及所述抗体和抗体链的片段和衍生物，以及所述抗体、抗体链及片段在医药学包括诊断中的应用。
另一方面，本发明涉及本文所述非人哺乳动物作为模型在检测药物和疫苗中的应用。
附图简述
图1-8示出将一系列人BAC插入小鼠Ig基因座中的重复过程(iterativeprocess)。
图9-18示出针对IgH和κ基因座的图1-8的更详细过程。
图19和20示出在嵌合小鼠中抗体产生的原理。
图21示出人DNA在小鼠染色体中的可能的插入位点。
图22-26揭示了将一系列人BAC插入小鼠Ig基因座的另一种重复过程。
图27-29例证了宿主VDJ区倒位的机制。
图30例证了使用RMCE方法插入质粒的原理证明。
图31例证了连续RMCE–整合进着陆垫(landing pad)中。
图32例证了成功插入着陆垫的证实。
图33例证了3’末端消除(Curing)的PCR证实。
图34例证了BAC#1和PCR Diagnostics的插入。
一般描述
小鼠的所有核苷酸坐标均来自NCBI m37,April 2007 ENSEMBL Release 55.37h，小鼠C57BL/6J品系。人核苷酸来自GRCh37,Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37，大鼠核苷酸来自RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w。
在本发明中，我们揭示了在非人哺乳动物如小鼠中构建嵌合人重链和轻链基因座的方法。本文中，在小鼠中进行的研究工作只是举例说明，除非特别说明，关于小鼠提及的也包括所有非人哺乳动物，小鼠是优选的非人哺乳动物。
一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体或者抗体链库，所述嵌合抗体或抗体链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
另一方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；
其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库，所述嵌合抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
任选地，所述非人哺乳动物基因组被修饰为防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
一方面，插入的人DNA包含至少50％人重链可变(V)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人V基因。
一方面，插入的人DNA包含至少50％人重链多样性(D)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人D基因。
一方面，插入的人DNA包含至少50％人重链结合(J)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人J基因。
一方面，插入的人DNA包含至少50％人轻链可变(V)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人V基因。
一方面，插入的人DNA包含至少50％人轻链结合(J)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人轻链J基因。
插入的人基因可以衍生自相同或不同个体，或者是合成的或代表人共有序列。
一方面，尽管V、D和J区的数目在人个体中是可变的，但是据认为在重链上是51个人V基因，27个D基因和6个J基因，在κ轻链上是40个人V基因和5个J基因，在λ轻链上是29个人V基因和4个J基因(Janeway and Travers,Immunobiology,Third edition)。
一方面，插入非人哺乳动物中的人重链基因座含有人V、D和J区库，其在基因组中与非人哺乳动物恒定区功能性排列，由此在人可变区与非人哺乳动物恒定区之间可以产生功能性嵌合抗体。这个全部的插入的人重链遗传材料在本文被称作人IgH VDJ区，包含来自编码人V、D和J部分的所有外显子及合适地相关内含子的人基因组的DNA。相似地，人Ig轻链κV和J区在本文是指人DNA，其包含编码V和J区的所有外显子及适当地人基因组的相关内含子。人Ig轻链λV和J区在本文是指人DNA，其包含编码V和J区的所有外显子及适当地人基因组的相关内含子。
人可变区被合适地插入在非人哺乳动物恒定区上游，后者包含编码全部恒定区或者足够部分的恒定区所需的所有DNA，使得能形成能够特异性识别抗原的有效嵌合抗体。
一方面，所述嵌合抗体或者抗体链具有一部分宿主恒定区，足以提供抗体在宿主哺乳动物中天然发生的一或多种效应物功能，例如其能与Fc受体相互作用，和/或结合补体。
具有宿主非人哺乳动物恒定区的嵌合抗体或抗体链因此在本文不限于完整的恒定区，也包括嵌合抗体或抗体链，其具有全部宿主恒定区或者其足以提供一或多种效应物功能的部分。这也适用于本发明的非人哺乳动物和细胞及方法，其中人可变区DNA可以插入宿主基因组中，由此其形成具有全部或者部分宿主恒定区的嵌合抗体链。一方面，全部的宿主恒定区与人可变区DNA可操纵地连接。
本文中宿主非人哺乳动物恒定区优选是内源宿主野生型恒定区，位于野生型基因座，与重链或轻链相适合。例如，人重链DNA合适地插入在小鼠第12号染色体上，合适地邻近小鼠重链恒定区。
一方面，人DNA如人VDJ区的插入被靶向在小鼠基因组IgH基因座中J4外显子与Cμ基因座之间；在一个方面，插入在坐标114,667,090与114,665,190之间，合适地在坐标114,667,091。一方面，人DNA如人轻链κVJ的插入被靶向在小鼠第6号染色体的坐标70,673,899与70,675,515之间，合适地在第70,674,734位置，或者在λ小鼠基因座第16号染色体上的等价位置上。
一方面，形成嵌合抗体的宿主非人哺乳动物恒定区可以在不同的(非内源)染色体基因座。在这种情况中，插入的人DNA如人可变VDJ或VJ区随后可以插入非人基因组中与天然发生的重链或轻链恒定区的位点不同的位点。天然恒定区可以在位于与天然位置不同的染色体基因座插入该基因组中或者在该基因组中复制，由此其与人可变区功能性排列，由此仍可以产生本发明的嵌合抗体。
一方面，人DNA插入在内源宿主野生型恒定区，位于宿主恒定区与宿主VDJ区之间的野生型基因座。
位于非人哺乳动物恒定区上游的可变区的位置是指两个抗体部分-可变区与恒定区-的适当相对位置，使得所述可变区与恒定区在哺乳动物体内形成嵌合抗体或抗体链。因此，插入的人DNA与宿主恒定区是彼此功能性排列的，用以产生抗体或抗体链。
一方面，插入的人DNA通过同种型转换能与不同的宿主恒定区表达。一方面，同种型转换不需要或涉及反式转换(trans switching)。人可变区DNA插入在与相关宿主恒定区相同染色体上意味着不需要反式转换以产生同种型转换。
如上所述，用于现有技术模型中的转基因基因座是人源的，因此即使在所述转基因能与小鼠基因座互补由此小鼠产生可产生完全人抗体的B细胞的情况中，各个抗体亲和性也很少能达到可得自完整(非转基因)小鼠的那些水平。这个原因是(除了上述库和表达水平之外)所述基因座的控制元件是人的。因此，损害了信号传导成分如激活高亲和性抗体的超变和选择的成分。
相反，在本发明中，宿主非人哺乳动物恒定区被保留，并且优选至少一个非人哺乳动物增强子或者其它控制序列如转换区被保留与非人哺乳动物恒定区功能性排列，由此如在宿主哺乳动物中可见的增强子或其它控制序列的作用在所述转基因动物中完全或者部分发挥。
上述方法被设计为使得人基因座的全部多样性均被取样，使得通过非人哺乳动物控制序列如增强子达到同样高水平表达，由此在B细胞中的信号传导例如使用转换重组位点的同种型转换将仍使用非人哺乳动物序列。
具有这种基因组的哺乳动物将产生嵌合抗体，其具有人可变区和非人哺乳动物恒定区，但是这些抗体在例如一个克隆步骤中即可易于人源化。此外，这些嵌合抗体的体内效力可以在这些相同动物中评估。
一方面，插入的人IgH VDJ区包含以种系方式排列的(germline configuration)来自人的所有V、D和J区及间插序列。
一方面，将800-1000kb的人IgH VDJ区插入非人哺乳动物IgH基因座，一方面，插入940、950或者960kb片段。合适地，这包括来自人第14号染色体105,400,051-106,368,585的碱基(对于人基因组，所有坐标均参照NCBI36，对于小鼠基因组，坐标参照ENSEMBL Release54和NCBIM37，涉及小鼠株系C57BL/6J)。
一方面，插入的IgH人片段由来自第14号染色体105,400,051-106,368,585的碱基组成。一方面，插入的人重链DNA如由来自第14号染色体105,400,051-106,368,585的碱基组成的DNA插入在小鼠第12号染色体的小鼠J4区末端与Eμ区之间，合适地在坐标114,667,091与114,665,190之间，优选在坐标114,667,091。
一方面，插入的人κVJ区包含以种系方式排列的来自人的所有V和J区及间插序列。
合适地，这包括来自人第2号染色体88,940,356-89,857,000碱基，合适地大约为917kb。另一方面，轻链VJ插入物可包含仅V节段和J节段的近端簇(proximal clusters)。这种插入物是大约473kb。
一方面，人轻链κDNA如由来自人第2号染色体88,940,356-89,857,000的碱基组成的人IgK片段合适地插入小鼠第6号染色体的坐标70,673,899与70,675,515之间，合适地在70,674,734位置。
一方面，人λVJ区包含以种系方式排列的来自人的所有V和J区及间插序列。
合适地，这包括与针对κ片段选择的来自人第2号染色体的那些碱基类似的碱基。
上述所有特异性人片段的长度可以变化，例如与上述长度相比可更长或更短，如500个碱基、1KB、2K、3K、4K、5KB、10KB、20KB、30KB、40KB或50KB或更多，其合适地包含所有或部分人V(D)J区，同时优选保留最终插入物以包含编码全部重链区和轻链区(合适时，如上所述)的人遗传材料的必要条件。
一方面，上述人插入物的5’末端长度增加。其中插入物是以逐步方式产生的，然后长度的增加通常是相关于上游(5’)克隆。
一方面，最后插入的人基因、通常为插入的最后的人J基因的3’末端距离人-小鼠结合区少于2kb，优选少于1kb。
一方面，所述非人哺乳动物包含如本文揭示的一些或全部人轻链κVJ区，但是不包含人轻链λVJ区。
另一方面，所述基因组包含如本文所述V、D(仅重链)和J基因的插入，位于重链基因座和一个轻链基因座，或者位于重链基因座和两个轻链基因座。优选所述基因组在一个或者两个或者所有三个基因座是纯合的。
另一方面，所述基因组在一或多个基因座可以是杂合的，如对于编码嵌合抗体链和天然(宿主细胞)抗体链的DNA是杂合的。一方面，所述基因组对于能编码本发明2个不同抗体链的DNA可以是杂合的，例如包含2个不同的嵌合重链或者2个不同的嵌合轻链。
一方面，本发明涉及非人哺乳动物或细胞，及产生所述哺乳动物或细胞的方法，如本文所述，其中发现插入的人DNA如人IgH VDJ区和/或轻链V、J区在所述哺乳动物或细胞中只在一个等位基因上，而不是在两个等位基因上。在这方面，哺乳动物或细胞具有表达内源宿主抗体重链或轻链及嵌合重链或轻链这两者的潜力。
本发明的另一方面，所述人VDJ区或者轻链VJ区不是以其全部而使用，而是可以使用来自其它物种的部分等价的人VDJ或VJ区，如外显子，如来自其它物种的一或多个V、D或J外显子，或者来自其它物种的调节序列。一方面，用于置换人序列的序列不是人序列或小鼠序列。一方面，使用的序列可以来自啮齿动物或者灵长类动物，如黑猩猩。例如，来自除人之外的灵长类动物的1、2、3、4或更多个或者全部J区可用于置换本发明的细胞和动物的VDJ/VJ区中1、2、3、4或更多个或者全部人J外显子。
另一方面，插入的人DNA如人IgH VDJ区和/或轻链VJ区可以这样地插入，由此其在基因组中与来自非人、非小鼠物种如啮齿动物或灵长类动物序列如大鼠序列的mu恒定区可操纵地连接。
其DNA元件可用于本发明中的其它非人、非小鼠物种包括兔、lamas、单峰骆驼、羊驼、骆驼和鲨鱼。
一方面，插入的人DNA如人VDJ或VJ区与内源宿主mu序列不是可操纵地连接的，而是与非宿主mu序列可操纵地连接。
可操纵连接合适地使得可产生包含所述人可变区的抗体重链或轻链。
一方面，插入的人DNA如人IgH VDJ区(和/或单链VJ区)可以与mu恒定区核酸一起插入宿主染色体中，所述mu恒定区核酸不是宿主mu恒定区核酸，优选是来自非小鼠、非人物种的mu恒定区。合适地，插入的人DNA如人VDJ区(和/或轻链VJ区)与非人、非小鼠mu序列可操纵地连接，且能形成嵌合抗体重链或轻链。另一方面，非小鼠、非人mu序列可以插入宿主染色体上与人可变区分开的遗传元件上，或者在基因组中的不同位置，合适地与可变区可操纵地连接，由此可以形成嵌合抗体重链或轻链。
一方面，本发明涉及细胞或非人哺乳动物，其基因组包含：一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，位于全部或部分人κ恒定区上游。
另一方面，本发明涉及细胞或非人哺乳动物，其基因组包含：一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，位于全部或部分人λ恒定区上游。
合适地，所述轻链VJ和C区在能形成在体内能与抗原特异性反应的抗体链。
一方面，在插入的轻链区中不含非人编码序列。
在此方面，如本文所示，人κ和/或λ区插入基因组，组合插入重链VDJ区或其一部分，位于宿主重链恒定区上游。
因此，本发明的细胞或非人哺乳动物可包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)位于全部或部分非人κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，
其中所述非人哺乳动物能产生抗体库，所述抗体具有包含非人哺乳动物恒定区和人可变区的抗体链。
本发明的细胞或非人哺乳动物可包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中所述非人哺乳动物能产生抗体库，所述抗体具有包含非人哺乳动物恒定区和人可变区的抗体链。
合适地，人VJC轻链DNA或者其一部分的插入是在等价小鼠基因座进行。一方面，人轻链κVJC DNA或者其一部分插入在小鼠κVJC区的紧邻上游或下游。一方面，人轻链λVJC区或者其一部分插入在小鼠λVJC区的紧邻上游或下游。一方面，仅插入人κVJC基因座。插入可以使用本文揭示的技术进行，且合适地不从基因组中除去宿主序列。一方面，非人哺乳动物宿主VJC序列可以通过一些方式失活，例如通过突变或者倒位，或者通过插入人可变区DNA或者通过任何其它方式进行。一方面，本发明的细胞或非人哺乳动物可包含完整人VJC区的插入。
所述人κ可变区DNA可以插入基因组中，与λ恒定区功能性排列，例如插入λ恒定区上游。或者，人λ区可变DNA可以与κ恒定区功能性排列而插入，例如插入κ恒定区上游。
一方面，一或多个非人哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人哺乳动物Mu恒定区上游，合适地在其相对于所述恒定区的距离而言的天然位置。
一方面，一或多个非人哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人哺乳动物Mu恒定区下游，合适地在其相对于所述恒定区的距离而言的天然位置。
一方面，非人哺乳动物转换序列-合适地为内源转换序列-保持在非人哺乳动物Mu恒定区上游，合适地在其相对于所述恒定区的距离而言的天然位置。
在这个位置，所述宿主增强子或者转换序列在体内与宿主恒定区序列起作用。
一方面，转换序列既不是人序列也不是非人哺乳动物天然序列，例如一方面非人哺乳动物转换序列不是小鼠或人转换序列。所述转换序列可以是例如啮齿动物或灵长类动物序列，或者是合成序列。特别地，在所述非人哺乳动物是小鼠的情况中，所述转换序列可以是大鼠序列。例如，小鼠或人恒定区mu序列可以置于来自大鼠或黑猩猩的转换序列或者其它转换序列的控制下，合适地能使得可以在体内发生同种型转换。
本发明的细胞或哺乳动物因此可包含人或非人哺乳动物转换序列及一或多个人或非人哺乳动物增强子区。它们可位于人或非人哺乳动物恒定区上游。优选地，所述控制序列能指导表达或者另外控制抗体的产生，所述抗体包含与其相关联的恒定区。一种可能的组合是用小鼠细胞中的小鼠增强子序列和小鼠恒定区转换的大鼠。
一方面，本发明涉及细胞，优选非人细胞，或者非人哺乳动物，其包含具有来自3或多个物种的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，所述细胞或动物可包含宿主细胞恒定区DNA，一或多个人V、D或J编码序列及一或多个非人、非宿主DNA区，其能控制免疫球蛋白基因座的区域，如转换序列、启动子或增强子，其能控制Ig DNA在体内的表达或同种型转换。一方面，所述细胞或动物是小鼠，包含另外的来自人Ig基因座的人DNA及另外的非小鼠DNA序列，如大鼠DNA序列，其能调节小鼠或人DNA。
另一方面，本发明涉及细胞、优选非人细胞或非人如动物，其包含具有来自2或多个不同人基因组的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，其在一个重链或轻链内可包含来自一个以上人基因组重链V(D)J序列，或者来自一个基因组的重链VDJ DNA和来自不同基因组的轻链VJ序列。
一方面，本发明涉及DNA片段或者细胞或非人哺乳动物，其包含免疫球蛋白重链或轻链基因座或者其一部分，具有来自2或多个物种的DNA，其中一个物种提供非编码区如调节区，另一物种提供编码区如V、D、J或者恒定区。
一方面，与不同的人V、D或J区相关联的人启动子和/或其它控制元件保持在小鼠基因组中。
另一方面，人源的一或多个启动子元件或者其它控制元件如人V区被优化为与非人哺乳动物的转录机构相互作用。
合适地，人编码序列可以置于合适的非人哺乳动物启动子控制下，其使得所述人DNA在合适的非人动物细胞中被有效转录。一方面，所述人区是人V区编码序列，人V区置于在非人哺乳动物启动子控制下。
人启动子或其它控制区由非人哺乳动物启动子或控制区的功能性置换可以通过使用重组工程(recombineering)或者其它重组DNA技术进行，以将一部分人Ig区(如人V区)插入含有非人Ig区的载体(如BAC)。所述重组工程/重组技术合适地用人Ig区置换了一部分非人(例如小鼠)DNA，因此将所述人Ig区置于非人哺乳动物启动子或其它控制区的控制下。合适地，所述人V区的人编码区置换小鼠V区编码序列。合适地，人D区的人编码区置换小鼠D区编码序列。合适地，人J区的人编码区置换小鼠J区编码序列。在这种方式中，人V、D或J区可以置于非人哺乳动物启动子如小鼠启动子的控制下。
一方面，插入非人哺乳动物细胞或动物中的人DNA是V、D或J编码区，这些区置于宿主调节序列或者其它(非人、非宿主)序列的控制下；一方面，人编码区既包括人内含子也包括外显子，或者另一方面，仅包括外显子而无内含子，其可以是cDNA形式。
或者，可以使用重组过程或者其它重组DNA技术将非人哺乳动物(例如小鼠)启动子或其它控制区如V区的启动子插入含有人Ig区的BAC中。然后所述重组工程步骤使一部分人DNA置于小鼠启动子或其它控制区的控制下。
本文所述方法也可用于将来自人重链的一些或者所有V、D和J区插入轻链恒定区上游而不是重链恒定区上游。同样，一些或所有人轻链V和J区可以插入重链恒定区上游。插入可以是在内源恒定区基因座，例如在内源恒定区与J区之间，可以单独是一些或者所有V、D或J基因，除外启动子或增强子序列，或者可以是一些或所有V、D或J基因以及一或多个或者所有的各个启动子或增强子序列。一方面，种系定向中V、D或J片段的全部库可以插入在宿主恒定区上游并与之功能性排列。
因此，本发明使得来自人或任何物种的V和/或D和/或J区可以插入在来自不同物种的包含恒定区的细胞染色体中，使得嵌合抗体链可以表达。
一方面，本发明仅需要一些人可变区DNA插入非人哺乳动物基因组中，在内源重链恒定区基因座的区域与一些或所有人重链恒定区可操纵地排列，由可以产生抗体链。在本发明的这个方面及另外插入人轻链DNA的情况中，所述轻链DNA插入可以是完全人构建体形式，具有人可变区DNA和人恒定区DNA二者，或者具有人可变区DNA及来自非人非宿主物种的恒定区DNA。其它变化也是可能的，如插入轻链人可变区和宿主基因组恒定区二者。此外，所述轻链转基因的插入不需要在等价的内源基因座，而是可以在基因组的任何位置。在这种方案中，所述细胞或哺乳动物可以产生嵌合重链(包含人可变区DNA和小鼠恒定区DNA)及包含人可变区和人恒定区DNA的轻链。因此，本发明的一方面是所述λ和或κ人可变区DNA可以插入在内源基因座上游，或者下游，或者实际上在与所述内源基因座不同的染色体上，与或不与恒定区DNA一起插入。
一方面将人轻链DNA插入在宿主非人哺乳动物恒定区上游，本发明另一方面涉及将一或两条轻链人可变区插入在内源基因座恒定区下游，或者在基因组的其他位置。
通常，优选将人可变区DNA插入在受体基因组中等价内源基因座或者其附近，例如在宿主免疫球蛋白基因座的边界(上游或下游)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb之内。
因此，本发明一方面可涉及细胞或非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，和/或，一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库或者嵌合轻链或重链库，所述嵌合抗体或嵌合轻链或重链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
在一特定方面，所述细胞或非人哺乳动物的基因组包含：
位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，
位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，及
位于宿主非人哺乳动物λ恒定区下游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，
任选其中人λ可变区可以插入在内源宿主λ基因座下游，与人λ恒定区可操纵地连接，由此所述非人哺乳动物或细胞可以产生完全的人抗体轻链和嵌合重链。
在本发明的进一步的一个不同方面，本发明方法的使用使得可以通过逐步顺序插入方式建立基因座，因此使得人可变区DNA与人或非人恒定区DNA可以一起插入在非人宿主细胞基因组的任何合适位置。例如，本发明的方法可用于将人免疫球蛋白可变区DNA与来自宿主基因组的恒定区DNA一起插入非人宿主细胞基因组的任何位置，使得可以从内源重链区之外的位点产生嵌合抗体链。通过使用本文所述技术，上述任何人重链或轻链DNA构建体可以插入非人宿主细胞基因组中任何希望的位置。本发明因此还涉及具有包含这种插入的基因组的细胞和哺乳动物。
本发明还涉及载体如BAC，其包含与非人哺乳动物启动子或其它控制序列功能性排列的人V、D或J区，由此所述人V、D或J区在所述非人哺乳动物细胞如ES细胞中的表达在所述非人哺乳动物启动子的控制下，特别是一旦插入在该细胞基因组中的情况下。
本发明还涉及细胞和含有所述细胞的非人哺乳动物，所述细胞或哺乳动物具有人V、D或J区，与非人哺乳动物启动子或其它控制序列功能性排列，由此所述人V、D或J区在所述细胞或哺乳动物中的表达在所述非人哺乳动物启动子的控制下。
通常，本发明一方面涉及非人哺乳动物宿主细胞，其能在宿主启动子或控制区的控制下表达人V、D或J编码序列，所述表达能产生具有人可变结构域和非人哺乳动物恒定区的人源化抗体。
一方面，方面涉及细胞如非哺乳动物细胞，如ES细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、，一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区。
另一方面，本发明涉及细胞，如非人哺乳动物细胞，如ES细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区，一或多个人D区及一或多个人J区。
一方面，所述细胞是ES细胞，其能发育成能产生嵌合抗体库的非人哺乳动物，所述嵌合抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。任选地，所述细胞的基因组被修饰为防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
一方面，所述细胞是诱导的多能干细胞(iPS细胞)。
一方面，所述细胞是分离的非人哺乳动物细胞。
一方面，本文揭示的细胞优选是非人哺乳动物细胞。
本发明还涉及从本文所述细胞中生长或者另外衍生自其中的细胞系，包括永生细胞系。所述细胞系可包含以种系方式排列的或者在体内突变后的重排之后的如本文所述的插入的人V、D或J基因。所述细胞可以通过与肿瘤细胞融合而永生化以提供抗体产生细胞和细胞系，或者通过直接细胞永生化制成。
本发明还涉及用于本发明的载体。一方面，这种载体是BAC(细菌人工染色体)。应意识到其它克隆载体也可用于本发明中，因此本文提及的BAC可以通常是指任何合适载体。
一方面，用于产生待插入的人DNA如VDJ或VJ区的BAC被修剪，由此当与原始人基因组序列相比时，在非人哺乳动物中最后的人VDJ或VJ区或者其一部分中没有序列被复制或丧失。
一方面，本发明涉及载体，其包含插入物，优选包含来自一些人VDJ或VJ基因座的人DNA区，其侧翼不是来自该基因座的DNA。侧翼DNA可包含一或多个选择标记或者一或多个位点特异性重组位点。一方面，所述载体包含2或多个如3个异种特异性及不相容位点特异性重组位点。一方面，所述位点特异性重组位点可以是loxP位点或者其变体，或者是FRT位点或者其变体。一方面，所述载体包含一或多个转座子ITR(反向末端重复)序列。
一方面，本发明的非人动物合适地不产生任何完全人源化抗体。一方面，这是因为没有来自人恒定区的插入的DNA。或者，在基因组中没有人恒定区DNA能结合插入的人可变区DNA成分形成抗体，例如由于任何人恒定区DNA中的突变或者远离任何恒定区人DNA和人可变区DNA所致。
一方面，人轻链恒定区DNA可包含在细胞基因组中，由此可以产生完全人λ或κ人抗体链，但是这仅能形成具有嵌合重链的抗体，不产生具有人可变区和恒定区的完全人抗体。
一方面，所述非人哺乳动物基因组被修饰为防止完全宿主物种特异性抗体表达。完全宿主物种特异性抗体是既具有来自宿主生物体的可变区又具有其恒定区的抗体。在文中术语“特异性”不涉及由本发明的细胞或动物产生的抗体的结合，而是涉及编码这些抗体的DNA的来源。
一方面，所述非人哺乳动物基因组被修饰为防止天然(完全宿主物种特异性)抗体在该哺乳动物中表达，通过失活所有或部分宿主非人哺乳动物Ig基因座实现。一方面，这通过对所有或部分非人哺乳动物VDJ区或VJ区进行倒位实现，任选通过在该基因组中插入一或多个位点特异性重组位点，然后使用这些位点进行重组酶介导的切割或者倒位所有或部分非人哺乳动物Ig基因座。一方面，可以应用双倒位，第一次从内源基因座除去V(D)J，然后进行使其位于正确方向的更局部的倒位。一方面，单一loxP位点用于将非人哺乳动物VDJ区倒位至着丝粒基因座或者端粒基因座。
一方面，其中插入人DNA的非人哺乳动物基因组包含内源V、(D)和J区，内源序列未缺失。
本发明包含将多个DNA片段插入DNA靶中的方法，合适地形成连续插入，其中插入的片段直接连接在一起，不含间插序列。所述方法特别适用于将大DNA片段插入宿主染色体中，可以通过逐步方式进行。
一方面，所述方法包括将第一DNA序列插入靶中，该序列具有DNA载体部分和第一感兴趣序列(X1)；将第二DNA序列插入第一序列的载体部分中，所述第二DNA序列具有第二感兴趣序列(X2)和第二载体部分；然后切除分隔X1与X2的任何载体序列DNA，提供在所述靶内连续的X1X2或X2X1序列。任选将进一步的一或多个DNA序列(每个DNA序列均具有进一步的感兴趣序列(X3,...)及进一步的载体部分)插入前述DNA序列的载体部分中，以构建在所述靶内的连续DNA片段。
插入第一DNA序列的DNA靶可以是特定细胞基因组中特异性位点或者任何位点。
本发明描述了关于插入人VDJ区元件的一般方法，但是其可用于插入来自任何生物体的任何DNA区，特别是插入>100kB的大DNA片段，如100-250kb或者甚至更大的片段，如TCR或HLA。本文描述的关于VDJ插入的特征和方法可等同用于本文揭示的任何方法。
一方面，插入的DNA是人DNA，如人VDJ或VJ区，是在细胞如ES细胞的基因组中以逐步方式构建的，对于每个重链或轻链区使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多个独立插入。片段被合适地插入在相同或基本相同的细胞基因座，例如ES细胞基因座，一个接一个地形成完整VDJ或VJ区或者其一部分。本发明还涉及包含过程中间体的细胞和非人动物，其基因组可包含仅部分VDJ区，如仅人可变区DNA。
另一方面，产生转基因非人哺乳动物的方法包括通过同源重组逐步插入多个片段的方式将人VDJ或VJ区插入宿主非人哺乳动物恒定区上游，优选使用重复过程。插入来自人VDJ和VJ基因座的大约100kb的合适片段，在如本文所述最终的反复插入过程之后合适地形成部分或完整的VDJ或VJ区。
一方面，所述插入过程在提供独特的靶向区的起始盒已经插入细胞如ES细胞的基因组中的位点开始。一方面，所述起始盒插入在非人哺乳动物重链基因座，用于插入人重链DNA。相似地，起始盒插入在非人哺乳动物轻链基因座，用于插入人轻链VJ DNA。所述起始盒合适地包含载体主链序列，在同一主链序列中具有人DNA片段的载体与其可以重组以将人DNA插入细胞(如ES细胞)基因组中，所述起始盒还合适地包含选择标记，如阴性选择标记。合适地，所述载体主链序列是BAC文库的序列，使得BAC可用于构建所述ES细胞和哺乳动物。然而，所述载体主链序列可以是任何序列，其例如通过同源重组和RMCE作为同源序列可以插入其中的靶位点，优选不是编码任何VDJ或恒定区的DNA。
一方面，在将第一DNA片段插入起始盒之后将第二DNA片段插入一部分第一DNA片段中，合适地第二DNA片段的部分载体主链。一方面，插入的DNA片段包含一部分人VDJ区，其侧翼是非来自人VDJ区的5’和/或3’序列。一方面，所述5’和/或3’侧翼序列可均含有一或多个选择标记，或者在插入基因组中之后能产生选择系统。一方面，在插入后可以在体外或体内从是基因组中除去一或全部两个侧翼序列。一方面，所述方法包括插入DNA片段，随后选择在人VDJ DNA侧翼的插入片段的5’和3’末端。一方面，重复插入通过将DNA片段插入在前一插入片段的5’末端进行，在此方面可以在体内缺失分隔插入的人DNA序列的载体DNA，以提供连续的人DNA序列。
一方面，将人VDJ DNA插入基因组中可以不用去除该基因组中任何侧翼DNA而实现，例如过转座酶介导的DNA切除进行。一种合适的转座酶是Piggybac转座酶。
一方面，通过同源重组将第一人可变区片段插入在起始盒主链序列，然后通过重组酶靶序列之间的重组除去任何阴性选择标记和起始盒的DNA，如在这个实例中使用FRT，FLPase表达。通常重复进行在(如BAC)主链起始序列的重复靶向插入及随后通过重组酶靶序列之间的重排而除去的步骤构建位于宿主非哺乳动物恒定区上游的完整的人VDJ区。
一方面，在本发明方法中可以使用选择标记或系统。所述标记可以在将DNA片段插入基因组中时产生，例如形成与已经存在于该基因组中DNA元件结合的选择标记。
一方面，所述细胞(如ES细胞)基因组在过程期间不同时含有2个相同的选择标记。可以看出重复插入和选择过程可以使用仅2个不同选择标记进行，如在本文实施例中揭示，例如第三选择标记可以与第一选择标记相同，因为在插入第三载体片段时第一载体片段和第一标记已经除去。
一方面，正确的插入事件是在开始进行任何多步骤克隆方法的下一步骤之前证实，例如通过使用高密度基因组阵列筛选ES细胞以鉴别具有完整BAC插入、测序及PCR核实等方式证实BAC结构。
一方面，所述方法使用位点特异性重组以将一或多个载体插入细胞如ES细胞的基因组中。位点特异性重组酶系统为本领域熟知，可包括Cre-lox和FLP/FRT或其组合，其中重组发生在具有序列同源性的两个位点之间。
合适的BAC可得自Sanger中心，见"A genome-wide,end-sequenced 129Sv BAClibrary resource for targeting vector construction".Adams DJ,Quail MA,Cox T,van der Weyden L,Gorick BD,Su Q,Chan Wl,Davies R,Bonfield JK,Law F,HumphrayS,Plumb B,Liu P,Rogers J,Bradley A.Genomics.2005 Dec；86(6):753-8.Epub 2005Oct 27.The Wellcome Trust Sanger Institute,Hinxton,Cambridgeshire CB10 1 SA,UK。含有人DNA的BAC也可得自如Invitrogen。一种合适的文库在Osoegawa K et a/,GenomeResearch 2001.11:483-496中描述。
一方面，本发明的方法特别包括：
(1)将第一DNA片段插入非人ES细胞中，所述片段含有人VDJ或VJ区DNA的第一部分及含有第一选择标记的第一载体部分，
(2)任选地，缺失一部分第一载体部分，
(3)将第二DNA片段插入含有第一DNA片段的非人ES细胞中，所述插入发生在第一载体部分之内，第二DNA片段含有人VDJ或VJ区的第二部分及含有第二选择标记的第二载体部分，
(4)缺失第一选择标记和第一载体部分，优选通过重组酶作用进行，
(5)将第三DNA片段插入含有第二DNA片段的非人ES细胞中，所述插入发生在第二载体部分之内，第三DNA片段含有人VDJ或VJ区的第三部分及含有第三选择标记的第三载体部分，
(6)缺失第二选择标记和第二载体部分，及
(7)如果需要，重复进行本发明的人VDJ或VJ区的第四片段及进一步的片段的插入步骤和缺失，以产生具有如本文揭示插入的部分或者全部人VDJ或VJ区的ES细胞，并合适地除去所述ES细胞基因组内所有载体部分。
另一方面，本发明包括：
1.将形成起始盒的DNA插入细胞基因组中，
2.将第一DNA片段插入所述起始盒中，第一DNA片段包含人DNA的第一部分及含有第一选择标记或者在插入时产生选择标记的第一载体部分，
3.任选地除去部分载体DNA，
4.将第二DNA片段插入第一DNA片段的载体部分中，第二DNA片段含有人DNA的第二部分及第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记，
5.任选地，除去任何载体DNA以使得第一和第二人DNA片段形成连续序列，及
6.如果需要，重复进行插入人VDJ DNA及除去载体DNA的步骤，以产生具有全部或部分人VDJ或VJ区的细胞，其足以能产生结合宿主恒定区的嵌合抗体，
其中使用位点特异性重组插入一或多个或者所有DNA片段。
一方面，所述非人哺乳动物能产生至少1×106个不同功能性嵌合免疫球蛋白序列组合的多样性。
一方面，所述靶向是在衍生自小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或者129Sv品系的ES细胞中进行的。
一方面，非人哺乳动物如小鼠是在RAG-1-缺陷背景或者其它合适遗传背景中产生的，其防止成熟宿主B和T淋巴细胞的产生。
一方面，所述非人哺乳动物是啮齿动物，合适地是小鼠，本发明的细胞是啮齿动物细胞或ES细胞，合适地是小鼠ES细胞。
本发明的ES细胞可用于通过使用本领域熟知的技术产生动物，包括将ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡植入雌性动物中，产生可以繁殖的后代，并选择具有所需插入的纯合重组体。一方面，本发明涉及包含ES细胞衍生的组织和宿主胚胎衍生的组织的嵌合动物。一方面，本发明涉及遗传改变的随后后代动物，包括具有VDJ和/或VJ区纯合重组体的动物。
另一方面，本发明涉及产生特异于希望的抗原的抗体的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如上述转基因非人哺乳动物并回收抗体(见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY；和Pasqualini and Arap,Proceedings of the National Academy ofSciences(2004)101:257-259)。合适地，给予免疫原性量的抗原。本发明还涉及检测靶抗原的方法，包括用识别一部分所述抗体的二级检测剂检测如上述产生的抗体。
另一方面，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，包括用希望的抗原免疫如上述转基因非人哺乳动物，回收所述抗体或者表达所述抗体的细胞，然后用人恒定区置换所述非人哺乳动物恒定区。这可以通过标准克隆技术在DNA水平进行，用合适的人恒定区DNA序列置换非人哺乳动物恒定区。见例如Sambrook,J and Russell,D.(2001,3'd edition)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)所述。
另一方面，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，其均是嵌合及完全人源化形式，本发明还涉及所述抗体在医药学中的应用。本发明还涉及包含这种抗体及药物可接受载体或其它赋形剂的药物组合物。
含有人序列的抗体链，如嵌合人-非人抗体链，由于存在人蛋白质编码区而在本文被认为是人源化的。完全人源化抗体可以通过使用标准技术从编码本发明嵌合抗体链的DNA开始产生。
产生单克隆抗体和多克隆抗体的方法为本领域熟知，本发明涉及在本发明的非人哺乳动物中应答抗原攻击中产生的嵌合或者完全人源化抗体的多克隆和单克隆抗体。
再一方面，根据本发明产生的嵌合抗体或抗体链可以合适地在DNA水平操纵，以产生具有抗体样性质或结构的分子，如人可变区来自缺乏恒定区的重链或轻链，例如结构域抗体；或者人可变区具有来自相同或不同物种的重链或轻链的任何恒定区；或者人可变区具有非天然发生的恒定区；或者人可变区与任何其它融合配偶体一起。本发明涉及衍生自本发明鉴别的嵌合抗体的所有这种嵌合抗体衍生物。
另一方面，本发明涉及本发明的动物在分析药物和疫苗的准人(quasi-human)抗体库中的可能作用中的应用。
本发明还涉及鉴别或确认药物或疫苗的方法，所述方法包括给予本发明的哺乳动物所述疫苗或药物，监测如下一或多项：免疫应答，安全性谱，对疾病的作用。
本发明还涉及试剂盒，其包含如本文揭示的抗体或抗体衍生物及使用这种抗体的说明书或者合适的实验室试剂如缓冲液、抗体检测试剂。
在某些方面，本发明涉及：
非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的人IgH VDJ区，及
(b)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的人Ig轻链κV和J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的人Ig轻链λV和J区，
其中所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库，所述嵌合抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区，
以及任选地，其中非人哺乳动物基因组被修饰为防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
一种非人哺乳动物ES细胞，其基因组包含：
(a)位于非人哺乳动物恒定区上游的人IgH V、D和J区，及
(b)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的人Ig基因座轻链κV和J区，和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的人Ig基因座轻链λV和J区，
其中所述ES细胞能发育成非人哺乳动物，能产生嵌合抗体库，所述抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
一种产生能产生嵌合抗体库的转基因非人哺乳动物的方法，所述抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区，所述方法包括通过同源重组将如下结构插入非人哺乳动物ES细胞基因组中：
(a)人IgH VDJ区，位于宿主非人哺乳动物重链恒定区上游，及
(b)λ或κ链的人IgL VJ区，分别位于宿主非人哺乳动物λ或κ链恒定区上游，
由此所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体库，所述抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区，其中步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行或者步骤(a)和(b)的每一步可以逐步进行或者作为一个步骤进行。
一方面，人VDJ或VJ区插入在宿主非人哺乳动物恒定区上游是通过同源重组逐步插入多个片段而实现的。
一方面，所述逐步插入从提供独特的靶向区的起始盒已经插入ES细胞基因组中的位点开始，所述独特的靶向区由BAC主链序列和阴性选择标记组成。
一方面，第一人可变区片段是通过同源重组插入在起始盒BAC主链序列，所述阴性选择标记和起始盒随后通过重组酶靶序列之间的重组除去。
一方面，重复进行在BAC主链起始序列的重复靶向插入及随后通过重组酶靶序列之间重排而除去该主链以构建位于宿主非哺乳动物恒定区上游的完整人VDJ区。
其它方面包括：
一种产生特异于希望的抗原的抗体的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫如本文所述的非人哺乳动物及回收所述抗体或者产生所述抗体的细胞。
产生完全人源化抗体的方法，包括如本文所述免疫非人哺乳动物，然后合适地通过对编码所述抗体的核酸进行工程化，用人恒定区置换与所述抗原特异性反应的抗体的非人哺乳动物恒定区。
本文揭示的方法、细胞或哺乳动物，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制序列功能性排列，由此所述DNA的转录在所述非人哺乳动物控制序列的控制下。一方面，所述人编码区V、D或J区与小鼠启动子序列功能性排列。
本发明还涉及根据本文揭示的任何方法产生的人源化抗体及如此产生的人源化抗体在医药学中的应用。
应理解本文所述的特定实施方案只是例证本发明而无限制之意。本发明的主要特征可用于不偏离本发明范围的各个实施方案中。本领域技术人员将意识到或者使用不超常规的研究而能确定本文所述特定方法的众多等价物。这种等价物被认为在本发明范围内且涵盖在权利要求书内。本说明书中提及的所有出版物和专利申请均在本发明所属领域技术人员技能水平内。本文提及的所有出版物和专利申请均以每个单独的出版物或专利申请特别及单独指出援引加入的相同程度援引加入。在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用的单词“一个”可意味着“一个”，但是也意味着“一或多个”、“至少一个”及“一个或一个以上”。但是本文支持权利要求书中使用的术语“或者”是指“仅是”及“和/或”的定义，但是除非特别指出是仅唯一或互相除外，其是指“和/或”。在本申请中，术语“大约”用于表示包括对于设备、确定该数值的使用方法或者研究对象存在的变化而言的固有误差的数值。
如在本说明书和权利要求书中所用，单词“包含”(及其任何形式)、“具有”(及其任何形式)、“包括”(及其任何形式)或者“含有”(及其任何形式)均是指包含性的或者开放式的，不排除另外的未列举的元件或方法步骤。
如本文所用，术语“或其组合”是指在该术语前列出的项目的所有排序组合。例如，“A、B、C或者其组合”是指包括至少A、B、C、AB、AC、BC或者ABC之一，且如果特别要求顺序，也可以是BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或者CAB。继续这个实例，显然包括含有一或多个项目重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员理解除非特别指出，则对任何组合的项目或术语的数目无限制。
除非特别指出，则本发明揭示的任何部分可以组合任何其它部分阅读。
本文揭示的及权利要求的所有组合物和/或方法根据本发明揭示可以不用过多实验而进行和实施。虽然本发明的组合物和方法已经在优选的实施方案中描述，但是本领域技术人员了解在不偏离本发明的观点、精神和范围的前提下，可以对本文描述的组合物和/或方法及方法中的步骤或步骤顺序进行改变。本领域技术人员熟知的所有这种相似的取代和修饰均认为在所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和观点之内。
本发明在如下非限制性实施例中得以更详细地描述。实施例3揭示了获得的实验数据，其支持本发明某些方面的观点，而实施例1和2为本领域技术人员实施本发明提供了详细的指导。
实施例1
总体策略
本发明的小鼠模型可以通过将大约960kb的含有全部V、D和J区的人重链基因座插入小鼠恒定区上游以及将473kb的人κ区插入小鼠恒定区上游而建立。或者或串联地将人λ区插入小鼠恒定区上游。这种插入通过使用本领域熟知的技术在ES细胞中通过基因靶向实现。
将完整V-D-J区以其天然(野生型)构型高保真地插入每个基因座合适地是通过将人细菌人工染色体(BAC)插入所述基因座而实现的。合适地，所述BAC被修剪，由此与原始基因座相比在最终的基因座中没有序列复制或者丧失。这种修剪可以通过重组工程进行。
覆盖这些基因座的合适地修剪的相关人BAC的大小为平均90kb。
在下文描述的实验插入方案中，在一种方法中，人D和J元件的完全互补序列以及7或8个人V区由待插入的第一BAC覆盖。待插入在IgH和IgK基因座中的第一BAC可含有如下V区：IgH：V6-1、VII-1-1、V1-2、VIII-2-1、V1-3、V4-4、V2-5；及IgK：V4-1、V5-2、V7-3、V2-4、V1-5、V1-6、V3-7、V1-8。
合适地，每个基因座的性能在插入第一BAC之后使用嵌合小鼠评估，在每次随后的BAC添加之后也评估。见下文关于这个性能检测的详细描述。
对于IgH基因座需要9个额外的BAC插入，对于IgK需要5个，以提供分别覆盖所有0.96Mb和0.473Mb的IgH和IgK基因座的人V区的完全互补序列。
当插入ES细胞基因组中时，不是所有的BAC均保留其野生型构型。因此我们采用高密度基因组阵列筛选ES细胞以鉴别具有完整BAC插入的那些细胞(Barrett,MT.,Scheffer,A.,Ben-Dor,A.,Sampas,N.,Lipson,D.,Kincaid,R.,Tsang,P.,Curry,B.,Baird,K.,Meltzer,P.S.,et al.(2004).Comparative genomic hybridization usingoligonucleotide microarrays and total genomic DNA.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 101,17765-17770)。这种筛选也使得可以鉴别及选择ES克隆，其中ES细胞基因组受损且因此不能发育成嵌合动物种系。便于进行这种评估的其它合适基因组工具包括测序和PCR确认。
因此，一方面，在进行下一步骤之前证实正确的BAC结构。
从上文描述可以看出为了用90kb BAC对基因座进行完全工程化，对于IgH需要进行最少10个靶向步骤，对于IgK需要5个步骤。可以用类似于针对IgK基因座的方式产生具有IgL基因座的小鼠。需要另外的步骤以除去支持基因靶向所需的选择标记。由于这些操作是在ES细胞中逐步进行的，因此一方面在这个过程中种系传递能力(germ linetransmission capacity)得以保留。
在本发明中重要的是维持ES细胞克隆在多轮操作中的性能，而不需要在每个步骤均检测ES细胞系的种系潜力。目前用于KOMP和EUCOMM整体敲除方案的细胞系在用于这个方案之前已经被修饰两次，其种系传递率(germ line transmission rate)与亲代细胞相比未改变(这些细胞系可公开获得，见www.komp.org和www.eucomm.org)。称作JM8的这个细胞系在公开的培养条件下可以产生100％ES细胞衍生的小鼠(Pettitt,S.J.,Liang,Q.,Rairdan,X.Y.,Moran,J.L.,Prosser,H.M.,Beier,D.R.,Lloyd,K.C.,Bradley,A.,andSkarnes,W.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse geneticresources.Nature Methods)。这些细胞具有经证实的可繁殖能力，使用标准小鼠ES细胞培养条件下提供嵌合动物的体细胞和种系组织。使用在标准饲养细胞系(SNL)上培养的以及甚至无饲养细胞系仅在凝胶包被的组织培养板上生长的细胞可以发现这种能力。一个特定的亚系JM8A3在几次连续亚克隆循环之后保持发育成嵌合种系的能力。通过例如同源重组等的大量遗传操作-如在本发明的情况中-不会损害细胞的多能性。产生具有这种高百分比ES细胞衍生的组织的嵌合体的能力具有其它优势。首先，高水平嵌合现象与种系传递潜力相关，且提供了仅需要5-6周的种系传递的替代测定。其次，由于这些小鼠是100％ES细胞衍生的，因此可以直接检测工程化的基因座，排除由于育种导致的延迟。在嵌合体中检测新Ig基因座的完整性是可能的，因为宿主胚胎衍生自RAG-1基因突变体的动物，如在下面章节所述。
可以使用的另一细胞系是HPRT-ve细胞系如AB2.1，如在"Chromosomeengineering in mice,Ramfrez-Solis R,Liu P and Bradley A,Nature 1995；378；6558；720-4中揭示的。
RAG-1互补
虽然许多克隆产生100％ES衍生的小鼠，但是一些不能。因此，在每一步骤，小鼠是在RAG-1缺陷背景中产生的。这提供了具有100％ES衍生的B和T细胞的小鼠，其可直接用于免疫和抗体产生。可以使用具有RAG-2缺陷背景或者组合的RAG-1/RAG-2缺陷背景的细胞，或者其中小鼠仅产生ES细胞衍生的B细胞和/或T细胞的等价突变。
为了在这些小鼠中仅人-小鼠IgH或IgK基因座是活性的，可以在细胞系中将人-小鼠IgH和IgK基因座工程化，所述细胞系中IgH或IgK基因座的一个等位基因已经被失活。或者，可以在插入后进行宿主Ig基因座如IgH或IgK基因座的失活。
具有RAG-1基因突变的小鼠品系是免疫缺陷的，因为其不具有成熟的B或T淋巴细胞(US 5,859,307)。T和B淋巴细胞仅在正确的V(D)J重组发生时分化。由于RAG-1是这种重组的关键酶，因此缺失RAG-1的小鼠是免疫缺陷的。如果宿主胚胎遗传上是RAG-1纯合突变体，如果动物的淋巴组织衍生自该宿主胚胎，则通过注射这种胚胎产生的嵌合体将不能产生抗体。然而，JM8细胞和AB2.1细胞例如通常提供80％以上的嵌合动物的体细胞组织，因此通常会发育成淋巴组织。JM8细胞具有野生型RAG-1活性，因此在嵌合动物中产生的抗体仅由工程化的JM8ES细胞基因组编码。因此，嵌合动物可以通过抗原免疫攻击，随后产生该抗原的抗体。这样使得本领域技术人员可以如本发明所述检测工程化的人/小鼠IgH和IgK基因座的性能。见图19和20。
本领域技术人员可以使用如本文所述嵌合动物确定抗体多样性程度(见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Lab.Press,Plainview,NY)。例如，嵌合动物血清中某些抗体表位的存在可以通过例如在ELISA测定中与特异性抗-独特型抗血清的结合而确定。本领域技术人员也可以对衍生自嵌合动物的B细胞克隆基因组测序并将所述序列与野生型序列对比以确定超变水平，这种超变是正常抗体成熟的指征。
本领域技术人员也可以使用所述嵌合动物检查抗体功能，其中所述抗体从工程化的Ig基因座中编码(见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)。例如，可以检测结合抗原的抗血清，所述抗原用于免疫所述嵌合动物。这种测量可以通过ELISA测定进行。或者，通过加入从适当免疫的嵌合动物中收集的抗血清，本领域技术人员可以检测抗原的中和作用。
本领域技术人员熟知任何这些检测的阳性结果均证实本发明主题即所述工程化的Ig基因座编码具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的能力，所述抗体能以野生型抗体形式发挥功能。
实验技术
产生用于在ES细胞中同源重组的载体的重组工程方法在例如WO9929837和WO0104288中描述，该技术为本领域熟知。一方面，使用BAC作为人DNA的来源进行人DNA的重组工程。使用Qiagen BAC纯化试剂盒分离人BAC DNA。每个人BAC的主链均使用重组工程修饰为与已经插入小鼠IgH区中的BAC相同或相似的构型。每个人BAC的基因组插入序列均使用重组工程修剪，由此一旦BAC插入，则在小鼠IgH或IgK基因座形成人V(D)J基因组区的无缝连续部分。BAC DNA的电穿孔转染和基因分型根据标准方案进行(Prosser,H.M.,Rzadzinska,A.K.,Steel,K.P.,and Bradley,A.(2008).Mosaic complementationdemonstrates a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics ofstereocilia.Molecular and Cellular Biology 28,1702-1712；Ramirez-Solis,R.,Davis,A.C.,and Bradley,A.(1993).Gene targeting in embryonic stemcells.Methods in Enzymology 225,855-878.)。使用由Pentao Liu and Don Court's实验室揭示的程序和试剂进行重组工程(Chan,W.,Costantino,N.,Li,R.,Lee,S.C,Su,Q.,Melvin,D.,Court,D.L.,and Liu,P.(2007).A recombineering based approach forhigh-throughput conditional knockout targeting vector construction.NucleicAcids Research 35,e64)。
关于BAC衍生的染色体片段在非人哺乳动物基因组如小鼠中的基因靶向和重组的这些及其它技术在例如http://www.eucomm.org/information/targeting/和http://www.eucomm.org/information/publications中揭示。
根据标准技术对C57BL/6N-衍生的细胞系如JM8雄性ES细胞进行细胞培养。所述JM8ES细胞已经示出有能力大量提供体细胞组织和种系，并用于Sanger Institute的大量小鼠诱变程序如EUCOMM和KOMP(Pettitt,S.J.,Liang,Q.,Rairdan,X.Y.,Moran,J.L.,Prosser,H.M.,Beier,D.R.,Lloyd,K.C.,Bradley,A.,and Skarnes,W.C.(2009).AgoutiC57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.Nature Methods.)。将JM8ES细胞(1.0×107)用10μg I-Scel线性化人BAC DNA电穿孔(500μF，230V；BioRad)。用嘌呤霉素(3μg/ml)或者G418(150μg/ml)选择转染子。在电穿孔后24小时(用G418)或48小时(用嘌呤霉素)开始选择，进行5天。10μg线性化人BAC DNA可产生直至500个嘌呤霉素抗性或G418抗性ES细胞集落。挑取抗生素抗性ES细胞集落置于96孔细胞培养板中进行基因分型以鉴别被靶向的克隆。
一旦被靶向的小鼠ES细胞克隆被鉴别，通过阵列比较基因组杂交(CGH)分析其总体基因组完整性(Chung,Y.J.,Jonkers,J.,Kitson,H.,Fiegler,H.,Humphray,S.,Scott,C,Hunt,S.,Yu,Y.,Nishijima,I.,Velds,A.,et al.(2004).A whole-genome mouse BACmicroarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes byarray comparative genomic hybridization.Genome research 14,188-196.及Liang,Q.,Conte,N.,Skarnes,W.C,and Bradley,A.(2008).Extensive genomic copy numbervariation in embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 105,17453-17456)。具有异常基因组的ES细胞不能有效提供嵌合小鼠种系。BAC完整性通过PCR扩增BAC中每个已知功能性V基因检查。例如，在一种方法中，针对IgH基因座选择的第一人BAC具有6个功能性V基因。为了证实这个BAC存在这6个IGH V基因的完整性，设计至少14对PCR引物并用于PCR扩增来自被靶向的ES细胞的基因组DNA。这些片段的人野生型大小和序列保证插入的BAC不重排。
更详细的CGH将也证实插入的BAC的完整性。例如，本领域技术人员可以使用由Agilent Technologies,Inc.开发的oligo aCGH平台。这个平台不仅能高分辨度地研究基因组规模DNA拷贝数变化(Barrett,MT.,Scheffer,A.,Ben-Dor,A.,Sampas,N.,Lipson,D.,Kincaid,R.,Tsang,P.,Curry,B.,Baird,K.,Meltzer,P.S.,et al.(2004).Comparativegenomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomicDNA.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 101,17765-17770.)，而且可以使用常规设计的阵列检查特定基因组区域。对比依赖于cDNA探针或者完整BAC特征的传统aCGH技术，60聚体寡核苷酸探针可保证特异性杂交和高敏感性及精确性以用于检测我们制备的工程化的染色体改变。例如，设计为沿着插入的BAC全长每隔一定间隔杂交的寡聚物将能检测甚至非常短的缺失、插入或者其它重排。这个平台也提供了定制微阵列设计的最大灵活性。被靶向的ES细胞基因组DNA和正常的人个体基因组DNA将用染料各自独立地标记并与该阵列杂交。使用Aglient Technologies DNA微阵列扫描仪扫描阵列玻片。每个阵列图像上染料Cy5和染料Cy3的荧光强度的倒数及log2比值将通过使用Bluefuse软件(Bluegnome)提取。具有不一致荧光模式的斑点(“置信度”<0.29或者“质量(quality)”＝0)在校正所有log2比值之前被排除。在一个实验中，对于来自任何寡聚物探针的信号的log2比率在-0.29和+0.29之间被认为无拷贝数变化。对于“复制”的log2比率阈值通常>0.29999，对于确实其为<0.29999。
一旦将第一人BAC插入小鼠IgH基因座中并证实是完整的天然构型，则将可以通过使用Flp位点特异性重组酶切除侧翼为FRT的BAC主链。如果常规的Flp-催化的FRT重组不够高，可以使用Flo，这是改良形式的Flpo重组酶，其在一些检测中比原始Flp在ES细胞中的效力高3-4倍。在切除BAC主链之后，ES细胞将变成对嘌呤霉素(或G418)敏感及对FIAU是抗性的(丧失TK盒)。所述切除事件将通过使用人基因组DNA引物对连接片段进行PCR扩增进一步鉴定。这些不含侧翼为FRT侧翼的BAC主链的ES细胞将用于下一轮人BAC插入及用于胚泡注射。
靶向ES细胞基因组以产生转基因小鼠可以通过使用参考附图1-18所述方案进行。
图1例证了三种基本主链载体，分别为起始盒和2个大插入载体1和2。所述起始盒包含与希望的插入小鼠基因组中的位点同源的序列，这些位点在选择标记和用于基于PCR的基因分型的填充引物序列侧翼以证实BAC的正确插入。所述填充-引物序列提供了基因分型每个BAC添加步骤的基础。这个序列被认为提供了PCR引物的充分确认的(robust wellvalidated)序列模板，其可以位于IScel位点，理想地与BAC插入序列相距～1kb。
所述大插入载体包含在具有选择标记的质粒上的人DNA及独特的限制位点以线性化所述质粒以助于同源重组进ES细胞基因组中。
图2例证了通过在小鼠J4与C alpha外显子之间同源重组而将起始盒插入小鼠基因组中。嘌呤霉素选择可以鉴别具有插入该盒的ES细胞。pu(Delta)tk是一种在嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puro)与截短形式的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(DeltaTk)之间的双功能融合蛋白。用pu(Delta)tk转染的鼠胚胎干(ES)细胞变得对嘌呤霉素有抗性并且对1-(-2-脱氧-2-氟-1-β-D-阿糖-呋喃基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)具有敏感性。与其它HSV1tk转基因不同，puDeltatk易于通过雄性种系传递。因此，pu(Delta)tk是方便的阳性/阴性选择标记，其可以广泛用于许多ES细胞应用中。
图3例证了大插入载体1靶向小鼠ES细胞基因组。载体的线性化是在与填充引物序列相同位置进行，其允许缺口修复基因分型策略，如本领域公知那样–见Zheng et al NAR1999,Vol 27,11,2354–2360。本质上，将靶向载体随机插入基因组中将不“修复”缺口，而同源重组事件将修复该缺口。合适PCR引物序列的并列使得可以逐个筛选集落的阳性PCR片段，表明正确插入。使用G418的阳性选择使得可以鉴别含有neo选择标记的小鼠ES细胞。可以对所有关键的V、D和J区进行PCR确认。阵列比较基因组杂交可用于证实所述BAC结构。
图4例证了使用Flpe缺失puro-delta-tk盒及BAC质粒主链并且在FIAU中选择。由于Flpe在小鼠ES细胞中无效(瞬时Flpe表达5％缺失)，预期在大多数情况中所述重组发生在BAC主链侧翼的两个FRT位点之间。也可以检测Flpo以发现相距10kb的两个FRT位点之间的重组效率。
鉴于FRT缺失步骤是可选择的，因此可以集合FIAU抗性克隆并立即进行与克隆分析平行的下一步骤。或者，可能希望通过短范围PCR示出所述人序列目前与小鼠的那些序列相邻(Hu-引物1和Mo-引物)。
在此阶段将已经插入200kb人基因座。
图5例证了第二大插入载体靶向ES细胞基因组。使用相同起始盒将所述人BAC靶向小鼠IgH基因座，随后进行ISce1BAC线性化，BAC靶向起始盒以及缺口修复基因分型策略。如前进行BAC插入证实。
图6例证了大插入载体2的侧翼为FRTY的BAC主链以及neo标记通过Flpo缺失。注意这不是可选择的，因此将需要在这点进行克隆分析。这将可以证实人2插入物与人1插入物的并列及其它确认结果。
在此阶段，将已经插入大约200kb人基因座。
图7例证了接下来大插入载体靶向小鼠IgH基因座。然后除去pu-delta TK盒，如图4所示。可以重复进行该程序以掺入其它BAC。
图8例证了最终预测的ES细胞构建体。
图9–18提供了关于这种方法的进一步详细描述。
实施例2
在本发明进一步的方法中，也可以采用位点特异性重组。位点特异性重组(SSR)在近20年已经广泛用于将转基因整合进指定染色体基因座中。SSR包括在同源DNA序列之间的重组。
第一代基于SSR的染色体靶向包括在(i)转染质粒中的单个重组靶位点(RT)如loxP或FRT和(ii)通过预先整合提供的染色体RT位点之间的重组。这种方法的主要问题是插入事件很少见，因为切除总是比插入更有效。称作RMCE(重组酶介导的盒置换)的第二代SSR是由Schlake和Bode在1994年揭示的(Schlake,T.；J.Bode(1994)."Use of mutatedFLP-recognition-target-(FRT-)sites for the exchange of expression cassettesat defined chromosomal loci".Biochemistry 33:12746-12751)。该方法基于在转染的质粒中使用两个异种特异性和不相容RT，其可以与染色体上相容的RT位点重组，导致一段DNA与另一段DNA的交换-或者盒交换。这种方法已经成功用于许多有效的染色体靶向中，包括整合大于50kb的BAC插入物(Wallace,H.A.C.et al.(2007)."Manipulating the mousegenome to engineering precise functional syntenic replacements with humansequence".Cell 128:197-209；Prosser,H.M.et al.(2008)."Mosaic complementationdemonstrates a regulatory role for myosin VIIa in actin dynamics ofStereocilia".MoI.Cell.Biol.28:1702-12)。
BAC的最大插入大小是大约300-kb，因此这给用于RMCE的盒大小设置了上限。
在本发明中，我们利用称作顺序RMCE(sequential RMCE，SRMCE)的新的基于SSR的技术，这种技术可以将BAC插入物连续插入同一基因座中。
所述方法包括如下步骤：
1.将形成起始盒的DNA (本文也称作着陆垫(landing pad))插入到细胞基因组中，
2.将第一DNA片段插入到所述插入位点，所述第一DNA片段包含人DNA的第一部分和含有第一选择标记或者在插入时产生选择标记的第一载体部分，
3.除去部分载体DNA，
4.将第二DNA片段插入到第一DNA片段的载体部分，所述第二DNA片段含有人DNA的第二部分及第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记，
5.除去任何载体DNA，以使得第一和第二人DNA片段形成连续序列，及
6.根据需要重复进行插入部分人V(D)J DNA及除去载体DNA的步骤，以产生具有全部或部分人VDJ或VJ区的细胞，其结合宿主恒定区足以能产生嵌合抗体，
其中至少一个DNA片段的插入使用位点特异性重组。
在一特定方面，所述方法利用三个异种特异性和不相容loxP位点。所述方法包括如下步骤，并如图22-26所例证：
1.将着陆垫靶向指定基因座。将含有侧翼为反向piggyBac(PB)ITR的HPRT小基因的进入载体靶向指定区域(例如IGHJ与Eμ或者IGKJ与EK或者IGLC1与Eλ3-1之间的区域)作为BAC靶向的着陆垫。所述HPRT小基因包含两个合成外显子和相关内含子。所述5’HPRT外显子的侧翼是彼此相反方向的两个异种特异性和不相容loxP位点(一个是野生型的，另一个是突变的位点，lox5171)(图22)。这两个loxP位点提供了通过RMCE插入BAC的重组位点。
2.将第一修饰的BAC插入被靶向的着陆垫。第一BAC具有一段侧翼为工程化修饰的待插入到基因组中的DNA。所述5’修饰(loxP-neo基因-lox2272-PGK启动子-PB 5'LTR)和3’修饰(PB3'LTR-puroΔTK基因-lox5171)在图23中示出，同时示出了lox位点和PB LTR的相对方向。通过从共电穿孔的载体的瞬时CRE表达，所述DNA序列将通过RMCE插入指定基因座。其中已经发生正确插入的细胞可以如下选择：(i)嘌呤霉素抗性(puroΔTK基因从所述着陆垫获得一个启动子-PGK)，(ii)6TG-抗性(HPRT小基因已经被破坏)，及(iii)G418-抗性(选择通过5’区PGK-neo排列的任意插入)。可以使用这些选择方案的任意组合。G418-和6TG-抗性选择5’末端上的正确事件，而嘌呤霉素抗性选择3’末端上的正确事件。
3.消除(除去)第一插入物的3’修饰。适当插入的第一BAC导致3’末端具有puroΔTK基因，侧翼是反向PB LTR(图24)–基本上正确的转座子结构。然后这个转座子可以通过piggyBac转座酶的瞬时表达而被除去(从电穿孔的载体中)。通过FIAU抗性可以选择具有正确切除事件的细胞-即没有来自puroΔTK基因的胸苷激酶活性。这完全除去了3’修饰，未遗留微量核苷酸。
4.在第一插入物的5’末端插入第二修饰的BAC。第二BAC具有一段侧翼是工程化修饰的待插入基因组中的DNA(通常与第一BAC插入的DNA是连续的)。所述5’修饰(loxP–HPRT小基因5’部分-lox5171-PGK启动子-PB5'LTR)和3’修饰(PB3'LTR-puroΔTK-lox2272)如图25所示，同时示出了lox位点和PB LTR的相对方向。通过从共电穿孔载体的瞬时CRE表达，所述DNA序列将通过RMCE插入指定基因座。其中已经发生正确插入的细胞可以如下选择：(i)HAT-抗性(HPRT小基因通过正确插入事件重建，即5’和3’外显子结构被带到一起)，及(ii)嘌呤霉素抗性(puroΔTK基因从着陆垫获得启动子-PGK)。
5.消除(除去)第二插入物的3’修饰。正确插入的第二BAC导致3’末端具有puroΔTK基因，侧翼是反向PB LTR(图26)–基本上正确的转座子结构，与成功的第一BAC插入物的结果完全相似。因此这个转座子可同样通过piggyBac转座酶的瞬时表达而被除去(从电穿孔载体中)。具有正确切除事件的细胞可以通过FIAU抗性选择，即没有来自puroΔTK基因的胸苷激酶活性。这完全除去了3’修饰，未遗留微量核苷酸。
6.在消除了第二BAC插入物的3’修饰之后，所述着陆垫变成与原始状态相同。可以重复进行多次这个完整程序-步骤2至5，以在所述基因组中建立大的插入物。当完成时，除了希望的插入物之外无残余的核苷酸保留。
随着在Ig基因座中插入奇数个BAC，内源VDJ或VJ序列可以通过经如下染色体工程进行的倒位被失活(见图27-29)：
1.将“翻转(flip-over)”盒靶向距离内源VDJ或VJ为10-40兆碱基(megabase)的5’ 区域。所述翻转载体(PB3'LTR-PGK启动子-HPRT小基因5’部分-loxP-puroΔTK-CAGGS启动子-PB3'LTR)如图27所示，同时示出了lox位点和PB LTR的相对方向。
2.瞬时CRE表达将导致在“翻转”盒中的loxP位点与5’修饰中的loxP位点之间的重组。这个5’修饰如上文步骤2和3所述-基本上所述修饰得自插入奇数个BAC，在3’修饰已经被消除之后。所述loxP位点是彼此反向的，因此所述重组事件导致如图28所示的倒位。具有正确倒位的细胞将是HAT-抗性的，因为HPRT小基因通过正确倒位而重建。
3.正确倒位也剩下位于“翻转”盒侧翼的两个转座子结构和5’修饰。这两项均可通过瞬时piggyBAC转座酶表达而切除，不留下任一修饰残余(图29)。具有正确切除的细胞可以如下选择：(i)6TG-抗性(缺失HPRT小基因)及(ii)FIAU-抗性(缺失puroΔTK基因)。在Ig基因座中的倒位将使得内源IGH-VDJ或IGK-VJ区分别远离Eμ或Eκ增强子区域，并且导致内源IGH-VDJ或IGK-VJ区失活。
本发明的方法合适地提供如下一或多项：
在插入的DNA片段的5’和3’末端两端的选择；
有效消除3’修饰，优选通过转座酶介导的DNA切除进行；
通过倒位失活内源JGH或IGK活性；及
切除修饰，在染色体中未留下核苷酸痕迹。
实施例3
所述方法的概念证实如图30所述。在图30中，如图22所示的着陆垫通过同源重组插入小鼠基因组中，随后R21质粒通过cre-介导的位点特异性重组插入该着陆垫。所述插入事件产生许多通常插入事件，360个G418抗性集落，其中大约220个集落插入希望的基因座，这通过HRPT小基因座的破坏而证实。
R21载体在5’和3’末端模拟第一BAC插入载体，其包括所有选择元件和重组酶靶位点。有一个小的“填充”序列代替BAC序列。这个载体既检测本发明中设计的所有原理，也使得能易于检测结果即跨过填充物的PCR是可行的，且因此使得插入物的两端易于被检测。R21与cre-表达载体共电穿孔进具有所述着陆垫的ES细胞中的IGH基因座。将四组转化的细胞平行转染，然后置于如图30所示的不同选择方案中。G418选择(neo基因表达)获得最大数目的集落，这是由于不需要特异性着陆垫整合所致。R21在基因组中的任何整合将均提供导致G418-抗性的neo表达。Puro选择获得与Puro+6TG或者G418+6TG相似的集落数，提示Puro选择的严格性是由于载体中缺少启动子的PuroΔTK所致。Puro表达仅在整合发生在启动子元件附近时获得-在这种设计中最可能特别在着陆垫中发生。这些结论由在图31中示出的连接PCR(junction PCR)结果支持。
本发明接下来的步骤是“消除”整合的BAC载体的3’末端，留下所述插入物与侧翼基因组之间的无缝过渡。我们通过扩增上述各个克隆(R21插入着陆垫中)及在这个克隆中通过转染表达质粒表达piggyBac重组酶而证实这种消除。FIAU用于选择其中3’修饰被切除的集落-即通过piggyBac末端重复之间的PGK-puroΔTK元件的丧失。从106个细胞的转染中获得50个这种克隆，检测其中6个克隆的预期基因组结构。成功的消除导致在图32中标示“3”的引物组之间的阳性PCR。在所述6个克隆中，4个具有正确切除，1个保持原始构型，1个具有缺失。
这些数据证实使用上述方法将DNA反复插入指定基因组基因座的着陆垫。
实施例4
实施例3证实本发明请求保护的设计能使检测载体插入在基因组中指定位置，在这种情况中是R21载体插入小鼠IGH基因座中。合适的选择介质的使用及cre-重组酶的表达导致具有预定结构的基因组改变。
本发明所述的相同设计元件被构建进BAC插入物的5’和3’末端。所述插入物包含来自IGH基因座的人序列，大约166-kb。这个工程化的BAC与cre-表达质粒DNA一起被电穿孔进在小鼠IGH基因座具有着陆垫的小鼠ES细胞中。使转染的细胞群在含有嘌呤霉素的培养基中生长以选择正确的插入事件。
分离7个所得克隆并进一步分析。预期的重组事件和所得结构在图33中示出。基于在实施例3中概述的R21实验的数据，当所述转染的细胞群在含有嘌呤霉素的培养基中选择时，预期对于正确克隆进行严格选择。这是因为在重组后嘌呤霉素编码区需要启动子元件，且其优先由所述着陆垫提供。因此，通过诊断PCR确定，所述7个分离的克隆大部分已经在所述着陆垫正确插入基因组中。诊断正确插入的引物在图33中示出。如果610bp的片段在引物A与X之间被扩增并且478bp的片段在引物Y与B之间被扩增，则所述基因组中存在正确连接(图33和34)。注意在A与1引物及2与B引物之间有扩增的片段则表示存在亲代基因组(即仅着陆垫)。这些得自所述细胞集落中内部存在的亲代细胞在嘌呤霉素选择下由于集落的几何结构而逃脱所述选择所致。在通过含有嘌呤霉素的培养基传代所述集落之后，这些亲代连接片段消失，表明亲代细胞从所述细胞群中除去。此外，如果HPRT基因通过正确的插入事件被失活，则所有克隆均如预期地示出对6-TG的抗性。
这些数据表明本发明揭示的将大部分人IG基因座插入小鼠基因组中指定位置的策略将使得可以构建所述在小鼠恒定区上游具有多个人IG区的可变区的小鼠。

Claims (36)

1.非人哺乳动物细胞，其基因组包含：
位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的人IgH VDJ区，所述人IgH VDJ区包含多个人DNA片段，所述多个人DNA片段包含多个人IgH V区、一或多个人IgH D区和一或多个人IgH J区；和
位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的人κ VJ区，所述人κ VJ区包含多个人DNA片段，所述多个人DNA片段包含一或多个人κ V区及一或多个人κ J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的人λ VJ区，所述人λ VJ区包含多个人DNA片段，所述多个人DNA片段包含一或多个人λ V区及一或多个人λ J区，
其中所述非人哺乳动物是啮齿动物，
其中所述非人哺乳动物细胞可通过插入所述多个人DNA片段形成连续插入获得，其中插入各恒定区上游的DNA片段分别直接连接在一起，不含间插序列，并且
其中所述细胞是永生化的。
2.权利要求1的细胞，其中人IgH VDJ区的插入是在所述非人哺乳动物恒定区与最后的3’非人哺乳动物IgH J区之间。
3.权利要求1的细胞，其中所述细胞是小鼠细胞，且其中所述人IgH VDJ区的插入在小鼠基因组中小鼠第12号染色体的坐标114,667,091与114,665,190之间。
4.权利要求1的细胞，其中所述非人哺乳动物细胞的基因组通过全部或部分非人哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位而被修饰以防止天然的、完全宿主物种特异性的抗体的表达。
5.权利要求1的细胞，其中所述人IgH VDJ区包含来自人第14号染色体的105,400,051至106,368,585位核苷酸，其中坐标参照人基因组NCBI36。
6.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述插入的人κ VJ区包含以种系方式排列的来自人的全部V和J区以及间插序列。
7.权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述插入的人λ VJ区包含以种系方式排列的来自人的全部V和J区以及间插序列。
8.权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述人κ VJ区或其部分插入在非人哺乳动物κ恒定区的立即上游。
9.权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述非人哺乳动物细胞的基因组被修饰以防止或者降低完全宿主物种特异性抗体的表达。
10.权利要求9的细胞，其中所述非人哺乳动物细胞的基因组通过全部或部分非人哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位而被修饰。
11.权利要求1-5中任一项的细胞，其中被插入DNA片段的所述非人哺乳动物细胞的基因组包含未被缺失的内源VDJ区和/或VJ区。
12.权利要求1-5中任一项的细胞，其包含来自至少人重链和人轻链的插入的人可变区DNA。
13.权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述细胞在一个、两个或所有三个免疫球蛋白基因座对于编码嵌合抗体链的DNA是纯合的。
14.权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述细胞在一个、两个或所有三个免疫球蛋白基因座对于编码嵌合重链或轻链的DNA是杂合的。
15.权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述细胞的基因组不包含来自另一细胞或生物体的恒定区DNA。
16.权利要求1-5中任一项的细胞，所述细胞是抗体生产细胞，通过与肿瘤细胞融合而永生化以提供抗体生产细胞和细胞系、或者通过直接细胞永生化制成。
17.权利要求1-5中任一项的细胞，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制序列功能性排列，由此所述人DNA片段的转录被所述非人哺乳动物控制序列控制。
18.产生非人ES细胞的方法，所述方法包括向非人哺乳动物ES细胞基因组中：
(a)在宿主非人哺乳动物恒定区上游插入人IgH VDJ区，所述人IgH VDJ区包含多个人DNA片段，所述多个人DNA片段包含多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，和
(b)在宿主非人哺乳动物κ恒定区上游插入人κ VJ区，所述人κ VJ区包含多个人DNA片段，所述多个人DNA片段包含多个人Ig轻链κ V区及一或多个人Ig轻链κ J区和/或在宿主非人哺乳动物λ恒定区上游插入人λ VJ区，所述人λ VJ区包含多个人DNA片段，所述多个人DNA片段包含多个人Ig轻链λ V区及一或多个人Ig轻链λ J区，
其中步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行而且步骤(a)和(b)每一步都可以逐步方式进行或者作为单一步骤进行，
所述插入使得所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体链的库，所述嵌合抗体链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区，
其中所述非人哺乳动物是啮齿动物，并且
其中所述非人哺乳动物的细胞可通过插入所述多个人DNA片段形成连续插入获得，其中插入各恒定区上游的DNA片段分别直接连接在一起，不含间插序列。
19.权利要求18的方法，其中人IgH VDJ区的插入是在所述非人哺乳动物恒定区与最后的3’非人哺乳动物IgH J区之间。
20.权利要求18的方法，其中所述非人哺乳动物细胞的基因组随后被修饰以防止天然的抗体在哺乳动物中表达，所述修饰通过所有或部分非人哺乳动物VDJ或VJ区的倒位实现。
21.权利要求18的方法，其中所述非人哺乳动物细胞的基因组随后被修饰以防止天然的抗体在哺乳动物中表达，所述修饰通过将一或多个位点特异性重组酶位点插入该基因组、然后在重组酶介导的切割中使用所述一或多个位点、或者倒位所有或部分非人哺乳动物Ig基因座实现。
22.权利要求18的方法，其中人IgH VDJ区或VJ区插入在宿主非人哺乳动物恒定区上游是通过同源重组逐步插入多个片段实现的。
23.权利要求18的方法，其中所述插入的过程在提供独特的靶向区的起始盒已经插入ES细胞基因组中的位点开始。
24.权利要求18的方法，其中一或多个插入事件利用位点特异性重组。
25.权利要求18-24任一项的方法，其中所述方法包括步骤：
1)将形成起始盒的DNA插入细胞基因组中，
2)将第一DNA片段插入所述插入的位点中，所述第一DNA片段包含人DNA的第一部分及第一载体部分，所述第一载体部分含有第一选择标记或者在插入时产生第一选择标记，
3)任选地，除去部分载体DNA，
4)将第二DNA片段插入第一DNA片段的载体部分，第二DNA片段含有人DNA的第二部分及第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记，
5)除去任何载体DNA，以使得第一和第二人DNA片段形成连续序列，及
6)如果需要，重复部分人VDJ和/或VJ DNA的插入及载体DNA除去的步骤，以产生具有全部或部分人VDJ和VJ区的细胞，其与宿主恒定区联合足以产生嵌合抗体，
其中至少一个DNA片段的插入使用位点特异性重组。
26.产生动物的方法，所述方法包括：
1)培育由包括以下步骤的方法产生的非人哺乳动物：将权利要求18-25中任一项的方法产生的ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡植入雌性动物中以产生后代；以及
2)选择具有所需插入的纯合重组体。
27.产生特异于希望的抗原的抗体或抗体重链或轻链的方法，所述方法包括用希望的抗原免疫由权利要求18-25任一项的方法产生的细胞所产生的非人哺乳动物或根据权利要求26的方法产生的动物并且回收所述抗体或抗体链或者回收产生所述抗体或重链或轻链的细胞。
28.产生完全人源化抗体或抗体链的方法，所述方法包括根据权利要求27的方法产生的抗体，且然后合适地通过对编码所述抗体的核酸工程化，将与所述抗原特异性反应的抗体的非人哺乳动物恒定区用人恒定区置换。
29.权利要求18、27或28的方法，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制序列功能性排列，由此所述人DNA片段的转录被所述非人哺乳动物控制序列控制。
30.根据权利要求27或28产生的人源化抗体或抗体链。
31.根据权利要求27或28产生的人源化抗体或抗体链，用于医药学中。
32.药物组合物，其包含根据权利要求27或28的方法产生的抗体及药物可接受的载体。
33.产生包含人IgH VDJ区的小鼠ES细胞的方法，所述方法包括向小鼠ES细胞基因组中插入：
(a)(i)包含BAC DNA主链序列的起始盒，其作为同源序列插入的靶位点，及(ii)与小鼠基因组IgH基因座中的靶位点的希望的插入位点同源的序列，其中所述主链序列通过与希望的插入位点同源的序列与ES细胞基因组中的小鼠同源序列的同源重组而插入，及
(b)在位于小鼠恒定区上游的小鼠IgH基因座插入多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，
其中步骤(b)的IgH区位于载体的载体主链序列中，所述载体主链序列是与起始盒相同的主链序列，并且其中所述IgH区通过所述载体与步骤(a)的靶位点的重组而插入，所述插入使用两个或更多个独立插入以逐步方式进行，并且所述IgH区的插入产生与小鼠恒定区的功能性排列，用于产生抗体或抗体链，并且其中所述插入的过程在提供独特的靶向区的起始盒已经插入ES细胞基因组中的位点开始。
34.产生啮齿动物ES细胞的方法，所述方法包括向啮齿动物ES细胞基因组中：
(a)在啮齿动物恒定区上游插入多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，及
(b)插入一个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或一个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，其中人轻链恒定区DNA包括在基因组中，由此可以产生完全人λ或κ人抗体链，
其中所述啮齿动物不能产生具有人可变区和恒定区的完全人抗体，并且
其中所述啮齿动物能产生包含嵌合重链的嵌合抗体库，所述嵌合重链具有啮齿动物恒定区和人可变区。
35.产生啮齿动物ES细胞的方法，所述方法包括向啮齿动物ES细胞基因组中：
(a)在啮齿动物宿主重链恒定区上游插入多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，
其中来自所述啮齿动物ES细胞的非人哺乳动物能产生嵌合重链的库，所述嵌合重链具有啮齿动物恒定区和人可变区，并且
其中所述来自所述啮齿动物ES细胞的非人哺乳动物包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座具有来自两个或更多个不同的人基因组的DNA。
36.产生动物的方法，所述方法包括将权利要求18-25中任一项的方法产生的非人哺乳动物ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡植入雌性动物中，产生可以繁殖的后代，并选择具有所需插入的纯合重组体。
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