BR112012000536A2 - métodos para produção de anticorpo ou cadeia leve ou pesada de anticorpo específico para um antígeno desejado, para produção de anticorpo ou cadeia de anticorpo e seu uso, composição farmacêutica e derivado de anticorpo quimérico - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO OU CADEIA LEVE OU PESADA DE ANTICORPO ESPECÍFICO PARA UM ANTÍGENO DESEJADO, PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO OU CADEIA DE ANTICORPO TOTALMENTE HUMANIZADO ANTICORPO OU CADEIA DE ANTICORPO E SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E DERIVADO DE ANTICORPO QUIMÉRICO. A presente invenção refere-se a métodos para a geração de anticorpos quiméricos humanos não - humanos e de cadeias quiméricas de anticorpos, anticorpos e cadeias de anticorpos assim produzidos, e seus derivados, incluindo anticorpos totalmente humanizados, composições compreendendo os referidos anticorpos, cadeias e derivados dos anticorpos bem como células, mamíferos não humanos e vetores, adequados para uso nos referidos métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS í PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO OU CADEIA LEVE OU PESADA DE . ANTICORPO ESPECÍFICO PARA UM ANTÍGENO DESEJADO, PARA PRO- DUÇÃO DE ANTICORPO OU CADEIA DE ANTICORPO TOTALMENTE HU- —MANIZADO, ANTICORPO OU CADEIA DE ANTIRCOPO E SEU USO, COM- POSIÇÃO FARMACÊUTICA E DERIVADO DE ANTICORPO QUIMÉRICO", Antecedentes A presente invenção refere-se, inter alia, a animais e células não hu- manos que são construídos para conter DNA exógeno, tal como o DNA do gene deimunoglobulinas humanas, ao seu uso na medicina e no estudo de doenças, a métodos para a produção de animais e células não humanos e a anticorpos e ca- deias de anticorpos produzidos por estes animais e aos derivados destes.

No intuito de contornar os problemas encontrados ao humaniza- rem anticorpos, algumas empresas começaram a gerar camundongos com sistemas imunes humanos.

A estratégia usada foi silenciar (knockouf) a ex- pressão dos /oci de cadeia pesada e de leve em células ES (células-tronco embrionárias) e complementar essas lesões genéticas com transgenes de- senhados para expressarem os genes de cadeias pesada e leve humanas.

Embora anticorpos totalmente humanos pudessem ser gerados, esses mo- delos sofrem de várias limitações importantes: (i) O tamanho dos loci de cadeia pesada e de leve (cada um de vários Mb) im- possibilitava que fossem introduzidos inteiramente nestes modelos.

Como re- sultado, o repertório de regiões V das linhagens transgênicas recuperadas era muito limitado, a maior parte das regiões constantes estava faltando e importan- tesregiões intensificadoras distantes não estavam incluídas nos transgenes. (ii) A eficiência muito baixa de se gerar as grandes linhagens transgênicas inse- ridas e a complexidade e o tempo necessário para o cruzamento de cada uma destas nas linhagens silenciadas (Knockout) de cadeia pesada e de leve e para torná-las novamente homozigotas restringiam o número de linhagens transgê- —nicasque poderiam ser analisadas quanto à expressão ideal. (iii) As afinidades individuais dos anticorpos raramente atingiam as que po- deriam ser obtidas a partir de animais intactos (não transgênicos). O documento WOZ2007117410 descreve construtos quiméricos

% para expressão de anticorpos quiméricos.

O documento WOZ2010039900 descreve o processo de knock in Í (eliminação ou substituição de uma ou mais bases) em células e mamíferos com genoma codificador de anticorpos quiméricos.

A presente invenção provê, inter alia, um processo para a gera- ' ção, em mamíferos não humanos, de anticorpos que compreendem uma região variável humana de lg e provê ainda modelos de animais não huma- nos para a geração de tais anticorpos.

Sumário da invenção Em um aspecto, a invenção refere-se a um mamífero não huma- no cujo genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais o regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano hospedeiro, e ] 15 (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas da cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente à região constante kappa do mamífero não huma- no hospedeiro e/ou uma ou mais regiões V humanas da cadeia leve lambda de lg em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos quiméricos, ou cadeias pesadas e leves quiméricas, tendo uma regi- ão constante de mamífero não humano e uma região variável humana.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um mamífero não huma- —nocujogenoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascen- dente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro e/ou uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve lambda de lg e uma oumaisregiõesJ humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido ascen- dente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de IgH, uma ou mais |

7 regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; Í em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos quiméricos, ou cadeias leves ou pesadas quiméricas, tendo uma re- giãoconstantede mamífero não humano e uma região variável humana. ' Em um aspecto, a invenção refere-se a uma célula mamífera não humana cujo genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constante do mamífero não hu- mano hospedeiro e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido SO ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro elou uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou ' 15 maisregiõesJ humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro.

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma célula mamífera não humana cujo genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve kappa de Ig e uma ou maisregiõesJ humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascen- dente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro e/ou uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve lambda de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascen- dente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano hospedeiro.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para pro- duzir uma célula ou mamífero não humano compreendendo inserir no geno- made uma célulamamiífera não humana, tal como genoma de célula ES: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região |

- constante do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve Kappa de ' lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro elouuma oumaisregiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou ' mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; respecti- vamente, a inserção sendo de tal modo que a célula ou o mamífero não humano seja capaz de produzir um repertório de anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, em que as etapas (a) e (b) podem ser realizadas em qualquer ordem e cada uma " das etapas (a) e (b) pode ser realizada em etapas ou em uma única etapa.

A inserção pode ser por recombinação homóloga.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para pro- duzir um anticorpo ou cadeia de anticorpo específica para um antígeno de- sejado, o método compreendendo imunizar um mamífero não humano transgênico, como descrito neste pedido de patente, com o antígeno deseja- do e recuperar o anticorpo ou a cadeia de anticorpo.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método pa- ra produzir um anticorpo totalmente humanizado, compreendendo imunizar um mamífero não humano transgênico, como descrito neste pedido de pa- tente, com o antígeno desejado, recuperar o anticorpo ou células produtoras do anticorpo e, em seguida, substituir a região constante do mamífero não humano por uma região constante humana, por exemplo, por engenharia de proteínas ou de DNA.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a anticorpos humaniza- dos e a cadeias de anticorpos produzidas de acordo com a presente inven- ção, ambos em forma quimérica (por exemplo, camundongo-humano) e to- talmente humanizada, bem como fragmentos e derivados dos referidos anti- corpos e cadeias, e ao uso dos referidos anticorpos, cadeias e fragmentos em medicina, incluindo em diagnóstico.

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: Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um mamífero não humano, como descrito neste pedido de patente, como modelo para os Í testes de fármacos e vacinas. Figuras As figuras 1 - 8 mostram um processo iterativo para in- i 5 serçãode uma série de BACs humanos em um lócus de Ig de camundongo. ' As figuras 9 - 18 mostram mais detalhadamente o processo das figuras 1 - 8 para a IgH e lócus kappa. As figuras 19 e 20 mostram os princípios subjacentes à geração de anticorpos em camundongos quiméricos. A figura 21 mostra um possível sítio de inserção para o DNA : humano em um cromossomo de camundongo. As figuras 22 - 26 descrevem um processo iterativo alternativo CU para inserção de BACs humanos em um lócus de Ig de camundongo. As figuras 27 - 29 ilustram um mecanismo para inversão da regi- : 15 ãoVDJdo hospedeiro. A figura 30 ilustra a prova de princípio para inserção de um plasmídeo com abordagem RMCE. A figura 31 ilustra o processo de RMCE - Integração sequencia- da em Landing Pad (plataforma de pouso). A figura 32 ilustra a confirmação de inserção bem sucedida no Landing Pad. A figura 33 ilustra a confirmação por PCR de cura da extremida- de3'. A figura 34 ilustra a inserção de BAC nº 1 e diagnóstico por P-

CR Descrição geral Todas as coordenadas de nucleotídeos para o camundongo pro- vêm de NCBI m37, April 2007 ENSEMBL Release 55.37h para a linhagem C57BL/6J de camundongos. Os nucleotídeos humanos provêm de GRCh37, Feb2009ENSEMBL Release 55.37 e de ratos de RGSC 3.4 Dec 2004 EN- SEMBL release 55.34w. Na presente invenção, são descritos métodos para a construção |

. de loci quiméricos de cadeias pesada e leve humanas em um mamífero não humano, por exemplo, um camundongo.

Neste relatório descritivo, referência , a trabalho em camundongos consta para fins de exemplo somente, e refe- rência a camundongos deve ser entendida como incluindo referência a todos osmamiíferosnão humanos a menos que de outra forma evidente a partir do ' relatório descritivo, sendo preferidos camundongos como o mamífero não humano.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um mamífero não huma- no cujo genoma compreende: (a)uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constan- te do mamífero não humano hospedeiro; e CS (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de . lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido i 15 ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro e/ou uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; Em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos quiméricos ou de cadeias de anticorpos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um mamífero não hu- mano cujo genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve kappa de Ig e uma oumaisregiõesJ humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascen- dente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro e/ou uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascen- dente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; |

7I58 . em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos quiméricos tendo uma região constante do mamífero não humano e ' uma região variável humana. Opcionalmente, o genoma do mamífero não humano é modifica- | 5 doparaimpedira expressão de anticorpos completos específicos da espécie : do hospedeiro.

Em um aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo me- nos 50% dos genes de região variável (V) da cadeia pesada humana, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% * e, em um aspecto, todos os genes V humanos. : Em um aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo me- nos 50% dos genes de região de diversidade (D) da cadeia pesada humana, Fa tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e, em um aspecto, todos os genes D humanos. ] 15 Em um aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo me- nos 50% dos genes de região de união (J) da cadeia pesada humana, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e, em um aspecto, todos os genes J humanos. Em um aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo me- nos50% dos genes de região Variável (V) da cadeia leve humana, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e, em um aspecto, todos os genes V de cadeia leve humana.

Em um aspecto, o DNA humano inserido compreende pelo me- nos 50% dos genes de região de união (J) da cadeia leve humana, tal como pelomenos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e, em um aspecto, todos os genes J de cadeia leve humana.

Os genes humanos inseridos podem ser derivados do mesmo indivíduo ou de indivíduos diferentes, ou serem sintéticos ou representarem sequências humanas de consenso.

Embora o número de regiões V, D e J seja variável entre indiví- duos humanos, em um aspecto, são considerados serem 51 genes V huma- nos, 27 genes D e 6 genes J na cadeia pesada, e 40 genes V humanos e 5 |

. genes J na cadeia leve kappa e 29 genes V humanos e 4 genes J na cadeia leve lambda (Janeway e Travers, Immunobiology, Terceira edição). ' Em um aspecto, o /ocus de cadeia pesada humana inserido no mamífero não humano contém o repertório completo de regiões V, De J humanas, presentes no genoma em arranjo funcional com as regiões cons- ' tantes do mamífero não humano de modo que anticorpos quiméricos funcio- nais possam ser produzidos entre as regiões variáveis humanas e as cons- tantes do mamífero não humano. Esse material genético total inserido de cadeia pesada humana é designado neste relatório descritivo como a região VDJ humana de IlgH e compreende o DNA de um genoma humano que codi- fica todos os exons codificadores de porções V, D e J humanas, além de adequadamente os introns associados. Do mesmo modo, referência às regi- O ões V e J de cadeia leve kappa humana, neste relatório descritivo, refere-se ao DNA humano compreendendo todos os exons codificadores de regiões V ey, além de adequadamente os introns associados do genoma humano. Referência às regiões V e J humanas de cadeia leve lambda de lg, neste relatório descritivo, refere-se ao DNA humano compreendendo todos os e- xons codificadores de regiões V e J, além de adequadamente os introns as- sociados do genoma humano.

Regiões variáveis humanas são adequadamente inseridas em sentido ascendente à região constante de mamífero não humano, a última compreendendo a região constante completa ou uma parte da região cons- tante que permita a formação de um anticorpo quimérico eficaz, capaz de reconhecer especificamente um antígeno.

Em um aspecto, os anticorpos quiméricos ou cadeias de anticor- pos possuem parte de uma região constante do hospedeiro suficiente para possibilitar uma ou mais funções efetoras vistas em anticorpos naturais em um mamífero hospedeiro, por exemplo, que lhes permita interagir com re- ceptores de Fc e/ou de se ligarem ao complemento.

Neste relatório descritivo, portanto, referência a um anticorpo quimérico ou cadeia de anticorpo tendo uma região constante de mamífero não humano hospedeiro não se limita à região constante completa, mas in- |

. clui também anticorpos ou cadeias quiméricas que contêm toda a região constante do hospedeiro, ou uma parte desta suficiente para possibilitar uma . ou mais funções efetoras. O mesmo se aplica a mamíferos e células não humanas e a métodos da invenção nos quais o DNA de uma região variável | 5 humana pode ser inserido no genoma hospedeiro de tal modo que forme : uma cadeia quimérica de anticorpo com toda ou com parte de uma região constante do hospedeiro. Em um aspecto, toda a região constante do hos- pedeiro está operacionalmente ligada ao DNA de uma região variável huma- na.

Neste relatório descritivo, a região constante do mamífero não : humano hospedeiro é de preferência a região constante endógena do tipo selvagem do hospedeiro, situado no locus do tipo selvagem, conforme apro- - priado para a cadeia pesada ou a leve. Por exemplo, o DNA da cadeia pe- sada humana é adequadamente inserido no cromossomo 12 de camundon- gos, adequadamente adjacente à região constante da cadeia pesada de ca- mundongo.

Em um aspecto, a inserção do DNA humano, tal como a região : VDJ humana é direcionada para a região entre o exon J4 e o locus Cu no locus de IgH no genoma de camundongo e, em um aspecto, é inserido entre as coordenadas 114.667.090 e 114.665.190, adequadamente na coordena- da 114.667.091. Em um aspecto, a inserção do DNA humano, tal como VJ de cadeia leve kappa humana é direcionada para o cromossomo 6 de ca- mundongos, entre as coordenadas 70.673.899 e 70.675.515, adequadamen- te na posição 70.674.734, ou em posição equivalente no /ocus lambda de camundongo no cromossomo 16.

Em um aspecto, a região constante do mamífero não humano hospedeiro para formar o anticorpo quimérico pode estar em locus cromos- sômico diferente (não endógeno). Nesse caso, o DNA humano inserido, tal como a(s) região(ões) VDJ ou VJ variável(is) humana(s), pode ser inserido depoisnogenoma não humano em um sítio distinto daquele da região cons- tante pesada ou leve natural. A região constante nativa pode ser inserida no genoma, ou duplicada dentro do genoma, em um locus cromossômico dife- |

: rente da posição nativa, de tal modo que esteja em arranjo funcional com a região variável humana e que anticorpos quiméricos da invenção ainda pos- ' sam ser produzidos. Em um aspecto, o DNA humano é inserido na região constante endógena do tipo selvagem do hospedeiro, situada no locus do tipo selva- ' gem entre a região constante do hospedeiro e a região VDJ do hospedeiro.

Referência à localização da região variável em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano significa que existe uma localização relativa adequada das duas porções do anticorpo, variável e constante, para permitir que a região variável e a constante formem um anti- : corpo quimérico ou cadeia do anticorpo in vivo no mamífero. Por conseguin- te, o DNA humano inserido e a região constante do hospedeiro estão em ao arranjo funcional entre si para produção de anticorpos ou cadeias de anti- corpo.

] 15 Em um aspecto, o DNA humano inserido é capaz de ser expres- so com diferentes regiões constantes do hospedeiro mediante switching (mudança isotípica) de isotipos. Em um aspecto, o switching de isotipos não : requer ou envolve trans switching. A inserção do DNA da região variável humana no mesmo cromossoma como à região constante relevante do hos- pedeiro significa que não há necessidade de trans switching para produzir variação isotípica.

Como explicado acima, os loci transgênicos usados para os mo- delos do estado da técnica anterior eram de origem humana, dessa forma, mesmo naqueles casos em que os transgenes eram capazes de comple- mentaro/locusde camundongo de modo que os camundongos produziam células B produtoras de anticorpos totalmente humanos, as afinidades indi- viduais dos anticorpos raramente atingiam as que poderiam ser obtidas de animais intactos (não transgênicos). O motivo principal para tanto (além de repertório e níveis de expressão descritos acima) é o fato de que os elemen- tosde controle do locus são humanos. Por conseguinte, os componentes de sinalização, por exemplo, para ativar a hipermutação e a seleção de anticor- pos de alta afinidade estão comprometidos.

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. Em contraste, na presente invenção, as regiões constantes do mamífero não humano hospedeiro são mantidas, sendo preferido que pelo ' menos uma sequência intensificadora ou outra de controle do mamífero não humano, como região de troca (switch), seja mantida em arranjo funcional i 5 comaregião constante do mamífero não humano, de modo que o efeito da ' sequência intensificadora ou outra de controle conforme visto no mamífero hospedeiro seja exercido no todo ou em parte no animal transgênico.

Essa abordagem acima é criada para que toda a diversidade do locus humano possa ser amostrada, para permitir os mesmos altos níveis de expressão que seriam alcançados por sequências de controle do mamífero : não humano, tais como intensificadoras, e é tal que a sinalização na célula B, por exemplo, switching de isotipos empregando sítios recombinados para .” variação isotípica, usaria ainda sequências do mamífero não humano. Um mamífero com tal genoma produziria anticorpos quiméricos com regiões variáveis humanas e constantes do mamífero não humano, mas estes poderiam ser rapidamente humanizadas, por exemplo, em uma etapa de clonagem. Além disso, a eficácia in vivo destes anticorpos quiméricos : poderia ser avaliada nestes mesmos animais. Em um aspecto, a região VDJ humana inserida de IgH compre- ende,em configuração de linhagem germinativa, todas as regiões V, De Je as sequências intervenientes derivadas de um humano.

Em um aspecto, 800 — 1000 kb da região VDJ humana de IgH são inseridos no locus de IgH do mamífero não humano e, em um aspecto, um fragmento de 940, 950 ou 960 kb é inserido. Adequadamente, este inclui asbases 105.400.051 a 106,368.585 do cromossomo 14 humano (todas as coordenadas referem-se a NCBI36 para o genoma humano, ENSEMBL Re- lease 54 e NCBIM37 para o genoma de camundongo, relativo à linhagem C57BL/6J de camundongo).

Em um aspecto, o fragmento inserido de IgH humana consiste nasbases 105.400.051 a 106.368.585 do cromossoma 14. Em um aspecto, o DNA inserido de cadeia pesada humana, como o DNA formado pelas ba- ses 105.400.051 a 106.368.585 do cromossoma 14, é inserido no cromos- |

' somo 12 de camundongo, entre o final da região J4 e a região Eu de ca- mundongo, adequadamente entre as coordenadas 114.667.091 e ' 114.665.190, adequadamente na coordenada 114.667.091. Em um aspecto, a região VJ kappa humana inserida compreen- de,em configuração de linhagem germinativa, todas as regiões V e J e se- ' quências intervenientes derivadas de um humano.

Adequadamente, esta inclui as bases 88.940.356 a 89.857.000 do cromossomo 2 humano, com adequadamente em torno de 917kb. Em outro aspecto, o inserto VJ de cadeia leve pode compreender somente os agrupamentos terminais de segmentos V e segmentos J. Tal inserto teria BR aproximadamente 473 kb. ' Em um aspecto, o DNA de cadeia leve kappa humana, tal como é o fragmento de IgK humana de bases 88.940.356 a 89.857.000 do cromos- somo 2 humano, é adequadamente inserido no cromossomo 6 de camun- i 15 dongo, entre as coordenadas 70.673.899 e 70.675.515, adequadamente na posição 70.674.734. Ú Em um aspecto, a região VJ lambda humana compreende, em : configuração de linhagem germinativa, todas as regiões V e J e sequências intervenientes derivadas de um humano. Adequadamente, esta inclui bases análogas às selecionadas pa- ra o fragmento kappa, a partir do cromossomo 2 humano, Todos os fragmentos humanos específicos descritos acima po- dem variar em extensão e podem, por exemplo, ser mais longos ou mais curtos do que os definidos acima, tal como 500 bases, 1 KB, 2K, 3K,4K,5 KB,10KB,20 kKB,30KB,40 KB ou 50 KB ou mais, compreendendo ade- quadamente toda ou parte da região V(D)J humana, ao mesmo tempo em que retendo, de preferência, o requisito para o inserto final de compreender material genético humano codificador da região completa da cadeia pesada e da leve, conforme apropriado, como descrito acima.

Em um aspecto, a extremidade 5' do inserto humano descrito a- cima é aumentada em extensão. Quando o inserto é gerado em etapas, o aumento em extensão, nesse caso, é geralmente em relação ao clone (5º) |

. em sentido ascendente.

Em um aspecto, a extremidade 3' do último gene humano inseri- ' do, geralmente o último gene J humano a ser inserido, possui menos de 2 . kb, de preferência menos de 1 KB da região de união humano-camundongo. Em um aspecto, o mamífero não humano compreende parte ou ' toda a região VJ da cadeia leve humana, conforme descrita neste relatório, mas não a região VJ da cadeia leve lambda humana. Em outro aspecto, o genoma compreende uma inserção dos ge- nes V, D (somente cadeia pesada) e J, como descritos neste relatório, no locus de cadeia pesada e um locus de cadeia leve, ou no locus de cadeia : pesada e os dois loci de cadeia leve. De preferência, o genoma é homozigo- to em um, ou ambos, ou em todos os três foci.

CC Em outro aspecto, o genoma pode ser heterozigoto em um ou mais dos /oci, tal como heterozigoto para DNA codificador de uma cadeia de ] 15 anticorpo quimérico e cadeia de anticorpo nativo (célula hospedeira). Em um aspecto, o genoma pode ser heterozigoto para DNA capaz de codificar 2 i diferentes cadeias de anticorpo da invenção, por exemplo, compreendendo 2 : diferentes cadeias pesadas quiméricas ou 2 diferentes cadeias leves quimé- ricas.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um mamífero ou célula não humana e a métodos para produzir o referido mamífero ou célula, como descrito neste relatório, em que o DNA humano inserido, tal como a região VDJ humana de IgH e/ou regiões V, J de cadeia leve, é encontrado somente em um único alelo e não nos dois alelos no mamífero ou na célula. Neste aspecto, um mamífero ou células possui o potencial para expressar a cadeia pesada ou leve endógena de anticorpo do hospedeiro e uma cadeia pesada ou leve quimérica.

Em um aspecto adicional da invenção, a região VDJ humana ou região VJ de cadeia leve não é usada em sua totalidade, mas partes da re- giãoVDJ ou VJ humana equivalente, tais como os exons, de outras espécies podem ser usados, tais como, um ou mais exons V, D ou J de outras espé- cies, ou sequências reguladoras de outras espécies. Em um aspecto, as se- |

. quências usadas no lugar das sequências humanas não são humanas ou de camundongo. Em um aspecto, as sequências usadas podem ser de roedor Í ou primata, como chimpanzé. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais ou todas as regiões J de um primata diferente de humano podem ser usadas para substi- tuirum,2,3,4oumais ou todos os exons na região VDJ/VJ das células e de ' animais da invenção.

Em um aspecto adicional, o DNA humano inserido, como a regi- ão VDJ humana de IgH e/ou regiões VJ de cadeia leve, pode ser inserido de modo que estas sejam operacionalmente ligadas no genoma com uma regi- ão constante mu de uma espécie não humana, não de camundongo, tal co- : mo uma sequência de roedor ou de primata, tal como uma sequência de ra- to. : Outras espécies diferentes de humana e de camundongo, das quais elementos de DNA podem ser usados na presente invenção, incluem Ú 15 coelhos, dromedários, alpacas, camelos e tubarões. Em um aspecto, o DNA humano inserido, tal como a região VDJ ou VJ humana, não é ligado operacionalmente à sequência mu endógena do : hospedeiro, mas sim a uma sequência um que não pertence ao hospedeiro. A ligação operacional permite adequadamente a produção de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo compreendendo a região variável humana.

Em um aspecto, o DNA humano inserido, tal como a região VDJ humana de IgH (e/ou regiões VJ de cadeia leve), pode ser inserido no cro- mossoma do hospedeiro junto com o ácido nucleico da região constante um, oqualnão é o ácido nucleico da região constante um do hospedeiro e é, de preferência, uma região constante um de uma espécie não de camun- dongo, nem humana. Adequadamente, o DNA humano inserido, tal como a região VDJ humana (e/ou regiões VJ de cadeia leve), está ligado operacio- nalmente a mu não humano, nem de camundongo e é capaz de formar uma cadeia pesada ou leve quimérica de anticorpo. Em outro aspecto, mu não de camundongo, nem humano pode ser inserido no cromossomo do hospedeiro em um elemento genético separado daquele da região humana variável, ou |

. em uma localização diferente no genoma, adequadamente ligado operacio- nalmente à região variável de modo que uma cadeia pesada ou leve quimé- ' rica de anticorpo possa ser formada.

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma célula, ou a um mamífero não humano, cujo genoma compreende uma ou mais regiões V " humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente a toda ou parte da região constante kappa humana.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula, ou a um mamífero não humano, cujo genoma compreende: uma ou mais regiões V . humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido ascendente a toda ou parte da região CJ constante lambda humana.

Adequadamente, as regiões VJ e C de cadeia leve conseguem formar cadeias de anticorpo in vivo capazes de reagir especificamente com um antígeno. ' Em um aspecto da invenção, não há sequência codificadora não ' humana na região inserida de cadeia leve.

Em tais aspectos, uma região kappa e/ou lambda humana é in- seridano genoma, em combinação com a inserção da região VDJ de cadeia pesada, ou parte desta, em sentido ascendente à região constante de cadeia pesada do hospedeiro como descrito neste relatório.

Por conseguinte, a célula ou o mamífero não humano da inven- ção pode compreender: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; e (b) uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente atodaou parte da região constante kappa não humana, em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos tendo uma cadeia de anticorpo compreendendo uma região constan- |

. te de mamífero não humano e uma região humana.

A célula ou o mamífero não humano da invenção pode compre- ' ender: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanase uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região Ú constante do mamífero não humano hospedeiro; e uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; emque o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- : corpos tendo uma cadeia de anticorpo compreendendo uma região constan- te de mamífero não humano e uma região variável humana.

C Adequadamente, a inserção do DNA humano de VJC de cadeia leve, ou parte deste, como descrito acima, é efetuada no locus equivalente | 15 de camundongo.

Em um aspecto, é inserido o DNA de VJC humana de ca- deia leve kappa ou parte deste em sentido imediatamente ascendente ou : descendente à região VJC kappa de camundongo.

Em um aspecto, é inseri- ' da a região VJC humana de cadeia leve lambda ou parte desta em sentido imediatamente ascendente ou descendente à região VJC lambda de camun- dongo.

Em um aspecto, somente o locus de VJC kappa humana é inserido.

As inserções podem ser efetuadas usando as técnicas aqui descritas e, a- dequadamente, não removem as sequências do hospedeiro do genoma.

Em um aspecto, as sequências VJC do mamífero não humano hospedeiro po- dem ser inativadas em alguma maneira, por mutação, ou inversão, ou por inserção do DNA da região variável humana ou por quaisquer outros meios.

Em um aspecto, a célula ou o mamífero não humano da invenção pode compreender uma inserção da região VJC humana completa.

O DNA da região variável kappa humana poderia seria inserido no genoma em arranjo funcional com uma região constante lambda, por e- xemplo, inserido em sentido ascendente a uma região constante lambda.

Alternativamente, o DNA da região variável lambda humana poderia ser in- serido em arranjo funcional com uma região constante kappa, por exemplo, |

. inserido em sentido ascendente a uma região constante kappa. Em um aspecto, uma ou mais sequências de controle do mamí- ' fero não humano, tais como a(s) sequência(s) intensificadora(s), são manti- : das em sentido ascendente à região constante Mu do mamífero não huma- no, adequadamente em sua posição nativa no que diz respeito à distância até a região constante.

Em um aspecto, uma ou mais sequências de controle do mamí- fero não humano, tais como sequência(s) intensificadora(s), são mantidas em sentido descendente à região constante Mu do mamífero não humano, adequadamente em sua posição nativa no que diz respeito à distância até a .: região constante. Em um aspecto, uma sequência de switch (mudança isotípica) SÊ de mamífero não humano, adequadamente uma sequência endógena de switch, é mantida em sentido ascendente à região constante Mu do mamífe- ronão humano, adequadamente no que diz respeito à distância até a região constante. Ú Em tal localização, as sequências intensificadoras ou de switch : do hospedeiro são operacionais in vivo com a(s) sequência(s) da região constante do hospedeiro.

Em um aspecto, uma sequência switch não é humana, nem nati- va no mamífero não humano, por exemplo, em um aspecto, uma sequência de switch de mamífero não humano não é uma sequência de switch de ca- mundongo, nem humana. A sequência de switch pode ser, por exemplo, uma sequência de roedor ou primata, ou uma sequência sintética, Especifi- camente,a sequência de swifch pode ser uma sequência de rato, quando o mamífero não humano for um camundongo. A título de exemplo, uma se- quência mu constante de camundongo ou humano pode ser colocada sob o controle de uma sequência de switch de rato ou de chimpanzé, ou de outra sequência de switch, adequadamente capaz de permitir que switching de isotipos ocorram in vivo.

A célula ou o mamífero da invenção podem, portanto, compre- ender uma sequência de switch humana ou de mamífero não humano e uma |

. região ou regiões intensificadoras humanas ou de mamífero não humano.

Estas podem estar em sentido ascendente a uma região constante humana : ou de mamífero não humano.

De preferência, as sequências de controle R conseguem direcionar a expressão ou, de outra forma, controlar a produção de anticorpos compreendendo uma região constante com a qual estão asso- ' ciadas.

Uma combinação cogitada é uma sequência de switch de rato com sequências intensificadoras de camundongo e regiões constantes de ca- mundongo em uma célula de camundongo.

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma célula, de preferên- ciauma célulanão humana, ou a um mamífero não humano compreendendo . um locus de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina, contendo DNA de 3 ou mais espécies.

Por exemplo, a célula ou o animal pode com- CU preender o DNA da região constante da célula hospedeira, uma ou mais se- quências humanas de codificação de V, D ou J e uma ou mais regiões de | 15 DNA não humano, nem do hospedeiro que sejam capazes de controlar uma região do locus da imunoglobulina, tal como uma sequência de switch, pro- motora ou intensificadora, as quais sejam capazes de controlar a expressão . ou a mudança isotípica in vivo do DNA da lg.

Em um aspecto, a célula per- tence ou o animal é camundongo e compreende adicionalmente DNA huma- no dolocusde lg humana e, adicionalmente, uma sequência de DNA que não é de camundongo, tal como sequência de DNA de rato, capaz de regu- lar o DNA de camundongo ou o humano.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula, de prefe- rencia uma célula não humana, ou a um mamífero não humano compreen- —dendo um /ocusde cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobulina, con- tendo DNA de 2 ou mais diferentes genomas humanos.

Por exemplo, pode- ria compreender sequências de V(D)J de cadeia pesada, provenientes de mais de um genoma humano, em uma cadeia pesada ou leve, ou DNA de VDJ de cadeia pesada proveniente de um genoma e sequências de VJ de cadeialevede um genoma diferente.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um fragmento de DNA ou célula ou mamífero não humano compreendendo um locus de cadeia pe- |

. sada ou leve de imunoglobulina, ou parte deste, contendo DNA de 2 ou mais espécies, em que uma espécie contribui com uma região não codificadora, , tal como região reguladora, e a outra espécie com regiões codificadoras, . como regiões V, D, J ou constantes.

Em um aspecto, os elementos humanos promotores e/ou de ' controle que estão associados com as diferentes regiões V, D ou J humanas são mantidos no genoma do camundongo.

Em um aspecto adicional, um ou mais dos elementos promoto- res, ou outros elementos de controle, das regiões humanas, tais como regi- ões WV humanas, são otimizados para interagirem com o mecanismo de . transcrição de um mamífero não humano.

Adequadamente, uma sequência humana de codificação pode o ser posta sob o controle de um promotor apropriado de um mamífero não humano, que permita o DNA humano ser transcrito eficientemente na célula i 15 de animal não humano.

Em um aspecto, a região humana é uma sequência de codificação de região V humana, e uma região V humana é posta sob o controle de um promotor de mamífero não humano. . A substituição funcional de um promotor ou de outras regiões humanas de controle por um promotor ou regiões de controle de mamífero não humano pode ser realizada pelo uso de recombineering (engenharia genética) ou por outras tecnologias de DNA recombinante, para inserir uma parte da região humana de lg (como região V humana) em um vetor (como um BAC) contendo uma região não humana de Ig.

A técnica de recombinee- ringlrecombinante substitui adequadamente uma parte do DNA não humano (por exemplo, de camundongo) pela região humana de lg e, dessa forma, coloca a região humana de Ig sob o controle do promotor ou de outra região de controle do mamífero não humano.

Adequadamente, a região codificado- ra humana de uma região V humana substitui uma sequência de codificação da região V de camundongo.

Adequadamente, a região codificadora humana de uma região D humana substitui uma sequência de codificação da região D de camundongo.

Adequadamente, a região codificadora humana de uma região J humana substitui uma sequência de codificação da região J de ca- |

' mundongo.

Nessa maneira, regiões V, D ou J podem ser colocadas sob o controle de um promotor de mamífero não humano, tal como um promotor " de camundongo. : Em um aspecto, o único DNA humano inserido na célula mamí- fera ou no animal não humano são as regiões que codificam V, D ou J, e ' estas são postas sob o controle das sequências reguladoras do hospedeiro ou de outras sequências (não humanas, nem do hospedeiro), Em um aspec- to, a referência a regiões codificadoras humanas inclui introns e exons hu- manos ou, em outro aspecto, simplesmente exons e não introns, os quais podem estar na forma de cDNA. : Alternativamente, é possível usar recombineering ou outras tec- nologias de DNA recombinante para inserir um promotor ou outra região de Co controle de mamífero não humano (por exemplo, camundongo), como um promotor para região V, em um BAC contendo uma região humana de Ig.

À etapa de recombineering coloca, então, uma parte do DNA humano sob o controle do promotor ou de outra região de controle de camundongo. : As abordagens aqui descritas podem ser empregadas também : para inserir algumas ou todas as regiões V, D e J da cadeia pesada humana em sentido ascendente a uma região constante de cadeia leve, em vez de em sentido ascendente à região constante da cadeia pesada.

Do mesmo modo, algumas ou todas as regiões V e J humanas de cadeia leve podem ser inseridas em sentido ascendente à região constante da cadeia pesada.

À inserção pode ser no focus endógeno da região constante, por exemplo, en- tre a região constante endógena e a J, e pode ser de alguns ou de todos os genes V,D ouy apenas, excluindo sequências promotoras ou intensificado- ras, ou pode ser de alguns ou de todos os genes V, D ou J com uma ou mais ou todas as respectivas sequências promotoras ou intensificadoras.

Em um aspecto, o repertório completo de fragmentos V, D ou J em orientação de linhagem germinativa pode ser inserido em sentido ascendente e em arranjo funcional com uma região constante do hospedeiro.

Por conseguinte, a presente invenção permite que regiões V e/ou D e/ou J de um humano ou de qualquer espécie sejam inseridas em um |

. cromossoma de uma célula de uma espécie diferente que compreenda uma região constante, possibilitando a expressão de uma cadeia quimérica de Ú anticorpo. . Em um aspecto, a invenção requer somente que algum DNA de região variável humana seja inserido no genoma de um mamífero não hu- ' mano em arranjo operacional com alguma ou toda a região constante da cadeia pesada humana na região do /ocus endógeno da região constante de cadeia pesada de tal modo que uma cadeia de anticorpo possa ser produzi- da. Neste aspecto da invenção e quando DNA de cadeia leve humana for adicionalmente inserido, a inserção do DNA de cadeia leve pode ser na for- . ma de um construto totalmente humano, tendo DNA de região variável hu- mana e DNA de região constante humana, ou tendo DNA de região variável Ss humana e DNA de região constante de uma espécie não humana, nem do hospedeiro. Outras variações são também possíveis, tal como inserção da região variável humana de cadeia leve e da região constante do genoma do hospedeiro. Além de serem inseridos, os referidos transgenes de cadeia leve não precisam estar no locus endógeno equivalente, mas podem estar em : qualquer outro lugar no genoma. Nessa hipótese, a célula ou o mamífero podem produzir cadeias pesadas quiméricas (compreendendo DNA de regi- ão variável humana e DNA de região constante de camundongo) e cadeias leves compreendendo DNA de região variável humana e de constante hu- mana. Portanto, em um aspecto da invenção, o DNA da região variável hu- mana lambda e/ou kappa pode ser inserido em sentido ascendente ao locus endógeno, ou em sentido descendente, ou, de fato, em um cromossomo di- ferente ao do locus endógeno, e inserido com ou sem DNA de região cons- tante.

Assim como inserção de DNA de cadeia leve humana DNA em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedei- ro, um aspecto adicional da invenção refere-se à inserção de uma ou de ambas as regiões variáveis humanas de cadeia leve em sentido descenden- te à região constante do focus endógeno ou em outro lugar no genoma.

Em geral, a inserção de DNA da região variável humana em ou |

. próximo ao locus endógeno equivalente no genoma receptor é preferida, por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 kb dos limites (em sentido " ascendente ou descendente) de um /ocus de imunoglobulina do hospedeiro. . Por conseguinte, em um aspecto, a invenção pode referir-se a uma célulaoumanmiífero não humano cujo genoma compreende: ' (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; e (b) uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de Ig e uma ou maisregiõesJ humanas de cadeia leve kappa de Ig e/ou, uma ou mais regi- . ões V humanas de cadeia leve lambda de lg e uma ou mais regiões J huma- nas de cadeia leve lambda de lg; CU em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos quiméricos, ou de cadeias leves ou pesadas quiméricas, tendo uma região constante do mamífero não humano e uma região variável humana.

Em um aspecto específico, o genoma da célula ou do mamífero não humano compreende: BR uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D hu- manas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constantedo mamífero não humano hospedeiro; uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente à re- gião constante kappa do mamífero não humano hospedeiro, e uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido descendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro, opcionalmente na qual a região variável lambda humana pode ser inserida em sentido descendente ao locus endógeno lambda do hospedeiro em liga- ção operacional com uma região constante lambda humana de tal modo que omarmífero ou a célula não humana possa produzir cadeias leves totalmente humanas e pesadas quiméricas de anticorpos.

Em outro aspecto diferente da invenção, o uso dos métodos da |

- invenção permite ser construído um locus em etapas por inserções sequen- ciais e, dessa forma, possibilita a inserção de DNA de região variável huma- ' na ou DNA de região constante não humana em qualquer localização ade- ' quada no genoma de uma célula de hospedeiro não humano.

Por exemplo, métodos da invenção podem ser empregados para inserir o DNA de região ' variável de imunoglobulina humana junto com o DNA de região constante do genoma do hospedeiro em qualquer lugar no genoma de uma célula do hos- pedeiro não humano, possibilitando que uma cadeia quimérica de anticorpo seja produzida de um sítio diferente da região endógena pesada.

Qualquer construto cogitado acima de DNA de cadeia pesada ou cadeia leve humana BR pode ser inserido em qualquer posição desejada no genoma de uma célula de hospedeiro não humano usando as técnicas aqui descritas.

A presente invenção refere-se também, portanto, a células e mamíferos com genomas compreendendo tais inserções.

A invenção refere-se também a um vetor, tal como BAC, com- preendendo uma região V, D ou J humana em arranjo funcional com um promotor de mamífero não humano, ou outra sequência de controle, de mo- - do que a expressão da região V, D ou J humana esteja sob o controle do promotor do mamífero não humano em uma célula do mamífero não huma- no, tal como célula ES, especialmente uma vez inserido no genoma desta célula.

A invenção refere-se também a células e mamíferos contendo as referidas células, tendo estas células ou mamíferos uma região V, D ou J humana em arranjo funcional com um promotor de mamífero não humano, ououtra sequência de controle, de modo que a expressão da região V, D ou J humana esteja sob o controle do promotor do mamífero não humano nas células ou no mamífero.

Em geral, um aspecto da invenção refere-se, por conseguinte, a uma célula de hospedeiro mamífero não humano capaz de expressar uma sequência codificadora de V, D ou J humana sob o controle de um promotor ou região de controle do hospedeiro, a expressão capaz de produzir um an- ticorpo humanizado tendo um domínio variável humano e uma região cons- |

- tante de mamífero não humano. Em um aspecto, a invenção refere-se a uma célula, tal como cé- ' lula não mamífera, como célula ES, cujo genoma compreende: : (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanase uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região Í constante do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro elouuma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda de lg e uma ou BR mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; - Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula, tal como células de mamíferos não humanos, como células ES, cujo genoma com- preende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve Kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascen- - dente à região constante kappa do mamífero não humano hospedeiro e/ou uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve lambda de lg e uma oumaisregiõesJ humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascen- dente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano hospedeiro.

Em um aspecto, a célula é uma célula ES capaz de desenvolver- se em um mamífero não humano e produzir um repertório de anticorpos, os quais são quiméricos, os referidos anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana. Opcio- nalmente, o genoma da célula é modificado para impedir a expressão de anticorpos totalmente específicos para a espécie do hospedeiro.

Em um aspecto, a célula é uma célula-tronco pluripotente indu- zida (célula iPS). |

. Em um aspecto, as células são células mamíferas não humanas isoladas. ' Em um aspecto, uma célula descrita neste relatório é de prefe- . rência uma célula de mamífero não humano.

A invenção refere-se também a uma linhagem celular que é cul- ' tivada ou de outra forma derivada de células como descritas neste relatório, incluindo linhagem celular imortalizada.

A linhagem celular pode compreen- der genes V, D ou J humanos inseridos, como aqui descritos, seja em confi- guração de linhagem germinativa ou depois de rearranjo seguinte à matura- ção in vivo, A célula pode ser imortalizada por fusão a uma célula tumoral . para fornecer célula ou linhagem celular produtora de anticorpos, ou pode ser produzida por imortalização celular direta. é A presente invenção refere-se também a vetores para uso na in- venção.

Em um aspecto, tais vetores são BACs (cromossomos artificiais bacterianos). Será apreciado que outros vetores de clonagem podem ser usados na invenção e, portanto, referência a BACs neste pedido de patente pode ser entendida como se referindo em geral a qualquer vetor adequado. - Em um aspecto, BACs usados para geração de DNA humano a serem inseridos, tal como as VDJ ou VJ, são aparados de modo que, na re- giãoVDJ ou WVJ humana final, ou parte desta, no mamífero não humano, ne- nhuma sequência seja duplicada ou perdida quando comparada à sequência genômica humana original.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um vetor compreenden- do um inserto, incluindo, de preferência, uma região de DNA humano deri- —vado de alguns dos loci humanos de VDJ ou VJ, flanqueada por DNA não pertencente àquele Jocus.

O DNA flanqueador pode compreender um ou mais marcadores selecionáveis ou um ou mais sítios de recombinação sítio- específica.

Em um aspecto, o vetor compreende 2 ou mais, tal como 3, sítios heteroespecíficos e incompatíveis de recombinação síitio-específica.

Em um — aspecto, os sítios de recombinação específica podem ser sítios loxP, ou va- riantes deste, ou sítios FRT ou variantes deste.

Em um aspecto, o vetor compreende uma ou mais sequências transposon ITR (repetição terminal |

. invertida). Em um aspecto, os animais não humanos da invenção adequa- : damente não produzem anticorpos totalmente humanizados.

Em um aspec- . to, isso se deve ao fato de não ter sido inserido DNA da região constante humano.

Alternativamente, não há DNA da região constante humana no ge- , noma capaz de formar um anticorpo em conjunto com o componente inseri- do de DNA de região variável humana, por exemplo, devido à mutação den- tro de qualquer DNA de região constante humana ou a distância de qualquer DNA de região constante humana e DNA de região variável humana.

Em um aspecto, o DNA humano de região constante de cadeia BR leve pode ser incluído no genoma celular, de tal modo que uma cadeia lambda ou kappa totalmente humana de anticorpo pudesse gerar, mas que CC fosse somente capaz de formar um anticorpo com uma cadeia pesada qui- mérica e não produzir um anticorpo totalmente humano tendo regiões variá- veise constantes humanas.

Em um aspecto, o genoma do mamífero não humano é modifi- cado para impedir a expressão de anticorpos totalmente específicos para a . espécie do hospedeiro.

Anticorpos totalmente específicos para a espécie do hospedeiro são anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes deri- vadas do organismo hospedeiro.

Nesse contexto, o termo "específico" não se destina a se referir à ligação dos anticorpos produzidos pelas células ou os animais da invenção, mas sim à origem do DNA que codifica estes anti- corpos.

Em um aspecto, o genoma do mamífero não humano é modifi- cado para prevenir a expressão dos anticorpos nativos (totalmente específi- cos para a espécie do hospedeiro) no mamífero por inativação de todos ou de parte dos loci de lg do mamífero não humano hospedeiro.

Em um aspec- to, isso é conseguido pela inversão de toda ou de parte da região VDJ ou região VJ do mamífero não humano, opcionalmente pela inserção de um ou mais sítios específicos para recombinase no genoma e, em seguida, usando estes sítios para excisão ou inversão, mediada pela recombinase, de todo ou de parte do locus de lg do mamífero não humano.

Em um aspecto, uma in- |

. versão dupla pode ser empregada, a primeira para deslocar e afastar as V(D)Js do locus endógeno e depois uma inversão mais local que as posicio- ' na na orientação correta. Em um aspecto, um único sítio loxP é utilizado pa- . ra inverter a região VDJ do mamífero não humano para um locus centromé- rico oulocustelomérico.

' Em um aspecto, o genoma do mamífero não humano no qual DNA humano é inserido compreende regiões V, (D) e J endógenas, e as se- quências endógenas não foram deletadas.

A invenção compreende um método para inserção de múltiplos fragmentos de DNA em um DNA alvo, adequadamente para formar uma in- r serção contígua na qual os fragmentos inseridos são unidos diretamente sem sequências intervenientes. O método aplica-se especialmente à inser- VU ção de um grande fragmento de DNA em um cromossoma hospedeiro que pode ser realizada em etapas.

Em um aspecto, o método compreende a inserção de uma pri- meira sequencia de DNA em um alvo, a sequência tendo uma porção de | DNA de vetor e uma primeira sequência de interesse (X1); a inserção de - uma segunda sequência de DNA na porção de vetor da primeira sequência, a segunda sequência de DNA tendo uma segunda sequência de interesse (X2) e uma segunda porção de vetor; e, depois, a excisão de qualquer se- quência de DNA de vetor, separando X1 e X2, para fornecer uma sequência contígua X1X2 ou X2X1 dentro do alvo. Existe opcionalmente a inserção de uma ou mais sequências adicionais de DNA, cada sequência de DNA tendo uma sequência adicional de interesse (X3,...) e uma porção adicional de ve- torna porção de vetor da sequência precedente de DNA para construir um fragmento contíguo de DNA no alvo.

O alvo de DNA para inserção da primeira sequência de DNA po- de ser um sítio específico ou qualquer ponto no genoma de uma determina- da célula.

O método geral é descrito neste relatório em relação à inserção de elementos da região VDJ humana, mas pode se aplicar à inserção de qualquer região do DNA, derivado qualquer organismo e, especificamente, a |

. inserção de grandes fragmentos de DNA de > 100 kB, como 100 — 250 kb, ou mesmo maiores, como aquele do TCR ou HLA. Características e aborda- : gens descritas neste pedido de patente a respeito da inserção de VDJ po- . dem ser igualmente aplicadas a qualquer um dos métodos descritos. Em um aspecto, o DNA inserido é DNA humano, tal como a re- ' gião VDJ ou VJ humana, é construído no genoma de uma célula, tal como célula ES, em etapas, usando 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ou mais inserções separadas para cada região de cadeia pesada ou de ca- deia leve. Os fragmentos são adequadamente inseridos no mesmo ou subs- tancialmente no mesmo locus celular, por exemplo, locus da célula ES, um . depois da outro, para formar a região VDJ ou VJ completa, ou parte desta. A presente invenção refere-se também a células e animais não humanos, - compreendendo intermediários no processo, cujos genomas possam com- preender somente uma região VDJ parcial, tal como somente DNA da região variável humana.

Em um aspecto adicional, o método para produzir um mamífero não humano transgênico compreende a inserção de regiões VDJ ou VJ hu- . manas em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedeiro em inserção por etapas de múltiplos fragmentos por recombina- çãohomóloga, de preferência usando um processo iterativo. Adequadamen- te, fragmentos de aproximadamente 100 KB do locus humano de VDJ e VJ são inseridos, adequadamente para integrar ou completar uma região VDJ ou VJ depois da iteração final do processo de inserção, como descrito neste pedido de patente.

Em um aspecto, o processo de inserção inicia em um sítio onde um cassete de iniciação foi inserido no genoma de uma célula, tal como cé- lula ES, criando uma região única para o direcionamento. Em um aspecto, o cassete de iniciação é inserido no locus de cadeia pesada do mamífero não humano, para uso na inserção de DNA humano de cadeia pesada. Igual- mente, um cassete de iniciação é inserido no locus de cadeia leve do mamí- fero não humano, para uso na inserção de DNA de região VJ humana. O cassete de iniciação compreende adequadamente a sequência de cadeia |

. principal de um vetor com a qual um vetor tendo um fragmento de DNA hu- mano na mesma sequência de cadeia principal pode recombinar-se para Ú inserir o DNA humano no genoma celular da célula (por exemplo, ES) e, a- c dequadamente, um marcador de seleção, tal como marcador de seleção ne- gativa. Adequadamente, a sequência de cadeia principal de vetor é a de ' uma biblioteca de BAC para permitir que BACs sejam utilizados na constru- ção das células ES e de mamíferos. A sequência de cadeia principal de ve- tores pode, no entanto, ser qualquer sequência que sirva como sítio-alvo no qual uma sequência homóloga possa inserir-se, por exemplo, por recombi- nação homóloga e RMCE, e, de preferência, não é de DNA codificador de . qualquer região VDJ ou de constante. Em um aspecto, a inserção do primeiro fragmento de DNA no * cassete de iniciação é seguida pela inserção de um segundo fragmento de DNA em uma porção do primeiro fragmento de DNA, adequadamente uma parte da cadeia principal do vetor do segundo fragmento de DNA. Em um aspecto, um fragmento de DNA inserido compreende uma parte da região VDJ humana flanqueada por sequências 5' e/ou 3' que não pertencem à re- . gião VDJ humana. Em um aspecto, as sequências flanqueadoras 5' e/ou 3' podem conter cada um ou mais marcadores selecionáveis ou serem capa- zesde criar um sistema selecionável quando inseridas no genoma. Em um aspecto, uma ou as duas sequências flanqueadoras podem ser removidas do genoma in vitro ou in vivo, após a inserção. Em um aspecto, o método compreende a inserção de um fragmento de DNA seguida pela seleção das duas extremidades, 5' e 3', do fragmento inserido flanqueando o DNA de VDJ humano. Em um aspecto, a inserção iterativa é efetuada pela inserção de fragmentos de DNA na extremidade 5' do fragmento prévio inserido e, neste aspecto, pode haver deleção in vivo do DNA do vetor que separa as sequências inseridas de DNA humano, para criar uma sequência contínua de DNA humano.

Em um aspecto, o DNA de VDJ humano pode ser inserido em um genoma sem que qualquer DNA flanqueador seja deixado no genoma, por exemplo, por excisão de DNA mediada por transposase. Uma transpo- |

+ sase adequada é a transposase Piggybac.

Em um aspecto, o primeiro fragmento de região variável humana ' é inserido por recombinação homóloga na sequência da cadeia principal do x cassete de iniciação e depois é efetuada a remoção subsequente do DNA de qualquer marcador de seleção negativa e do cassete de iniciação por re- ' combinação entre sequências alvo de recombinase, tal como FRT, usando neste exemplo, a expressão de FLPase. Em geral, inserções direcionadas repetidas na sequência de iniciação da cadeia principal (por exemplo, BAC) e a remoção subsequente por rearranjo entre sequências alvo de recombi- nase são repetidas para construir a região VDJ humana inteira em sentido - ascendente à região constante não mamífera hospedeira. Em um aspecto, um marcador ou sistema selecionável pode ser ” usado no método, O marcador pode ser gerado quando da inserção de um : fragmento de DNA em um genoma, por exemplo, formando um marcador —selecionável em conjunto com um elemento de DNA já presente no genoma. : Em um aspecto, o genoma celular da célula (por exemplo, ES) não contém 2 marcadores selecionáveis idênticos ao mesmo tempo durante , o processo, Pode ser observado que o processo iterativo de inserção e sele- ção pode ser realizado usando somente 2 marcadores diferentes de seleção, conforme descrito nos exemplos deste pedido de patente, e, por exemplo, o terceiro marcador selecionável pode ser idêntico ao primeiro marcador, uma vez que, quando o terceiro fragmento de vetor for inserido, o primeiro frag- mento de vetor e o primeiro marcador já terão sido removidos.

Em um aspecto, um evento correto de inserção é confirmado an- tes que se prossiga para a etapa seguinte de qualquer processo de clona- gem de múltiplas etapas, por exemplo, por confirmação da estrutura de BAC usando arranjos genômicos de alta densidade para rastrear células ES e identificar aquelas com inserções intactas de BAC, por sequenciamento e verificação por PCR.

Em um aspecto, o método emprega recombinação sítio- específica para inserção de um ou mais vetores no genoma de uma célula, como célula ES. Sistemas sítio-específicos para recombinase são bem co- |

. nhecidos no estado da técnica e podem incluir Cre-lox e FLP/FRT ou combi- nações destes, nos quais a recombinação ocorre entre 2 sítios tendo homo- ' logia de sequência.

. BACs adequados são disponibilizados pelo Sanger centre, con- sultar"A genome-wide, end-sequenced 129Sv BAC library resource for tar- : geting vector construction". Adams DJ, Quail MA, Cox T, van der Weyden L, Gorick BD, Su Q, Chan WI, Davies R, Bonfield JK, Law F, Humphray S, Plumb B, Liu P, Rogers J, Bradley A. Genomics. 2005 Dec;86(6):753-8. E- pub 2005 Oct 27. The Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge- shire CB10 1SA, Reino Unido. BACs contendo DNA humano são disponibili- . zados também, por exemplo, pela Invitrogen. Uma biblioteca adequada está descrita em Osoegawa K et al., Genome Research 2001.11: 483-496. ” Em um aspecto, um método da invenção compreende especifi- camente: i 15 (1) ainserção de um primeiro fragmento de DNA em uma célula ES não hu- mana, o fragmento contendo uma primeira porção de DNA humano de regi- i ão VDJ ou VJ e uma primeira porção de vetor contendo um primeiro marca- : dor selecionável; (2) opcionalmente, a delação da parte da primeira porção de vetor; (3) a inserção de um segundo fragmento de DNA em uma célula ES não humana contendo o primeiro fragmento de DNA, a inserção ocorrendo den- tro da primeira porção de vetor, o segundo fragmento de DNA contendo uma segunda porção da região VDJ ou VJ humana e uma segunda porção de vetor contendo um segundo marcador selecionável, (4) a deleção do primeiro marcador selecionável e da primeira porção de vetor, de preferência pela ação de uma enzima recombinase; (5) a inserção de um terceiro fragmento de DNA em uma célula ES não hu- mana contendo o segundo fragmento de DNA, a inserção ocorrendo dentro da segunda porção de vetor, o terceiro fragmento de DNA contendo uma terceira porção da região VDJ ou VJ humana e uma terceira porção de vetor contendo um terceiro marcador selecionável, (6) a deleção do segundo marcador selecionável e da segunda porção de |

. vetor; e (7) a iteração das etapas de inserção e deleção, conforme necessário, para ] o quarto fragmentos e adicionais das regiões VDJ ou VJ humanas, conforme | necessário, para produzir uma célula ES com uma parte ou toda a região WVDJ ou WVJ humana inserida conforme aqui descrito e, adequadamente re- ' mover todas as porções de vetor dentro do genoma da célula ES.

Em outro aspecto, a invenção compreende: (1) inserção de DNA, formando de um cassete de iniciação no genoma de uma célula; (2) inserção de um primeiro fragmento de DNA no cassete de iniciação, o . primeiro fragmento de DNA compreendendo uma primeira porção de um DNA humano e uma primeira porção de vetor contendo um primeiro marca- o dor selecionável ou gerando um marcador selecionável quando da inserção; (3) opcionalmente, remoção de parte do DNA de vetor; (4) inserção de um segundo fragmento de DNA na porção de vetor do pri- meiro fragmento de DNA, o segundo fragmento de DNA contendo uma se- ] gunda porção de DNA humano e uma segunda porção de vetor, a segunda porção de vetor contendo um segundo marcador selecionável, ou gerando um segundo marcador selecionável quando da inserção; (5) opcionalmente, remoção de qualquer DNA de vetor para permitir que o primeiro e o segundo fragmento de DNA humano formem uma sequência contígua; e (6) iteração das etapas de inserção de DNA de VDJ humana e remoção de DNA de vetor, conforme necessário, para produzir uma célula com toda ou parteda região VDJ ou VJ humana suficiente para ser capaz de gerar um anticorpo quimérico em conjunto com uma região constante do hospedeiro, em que a inserção de um ou mais ou de todos os fragmentos de DNA usa recombinação sítio-específica.

Em um aspecto, o mamífero não humano consegue gerar uma diversidade de pelo menos 1 X 10º diferentes combinações de sequências funcionais quiméricas de imunoglobulina.

Em um aspecto, o direcionamento é realizado em células ES de- |

. rivadas da linhagem C57BL/6N, C57BL/6J, 12985 ou 129Sv de camundon- go. ' Em um aspecto, animais não humanos, tais como camundon- . gos, são gerados em background deficiente em RAG-1 ou outro background genético adequado que impeça a produção de linfócitos B e T maduros do ' hospedeiro.

Em um aspecto, o mamífero não humano é um roedor, adequa- damente um camundongo, e células da invenção, são células de roedores ou células ES, adequadamente são células ES de camundongo.

As células ES da presente invenção podem ser utilizadas para - gear animais usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, as quais compreendem injeção da célula ES em um blastócito, seguida por im- -C plantação de blastócitos quiméricos em fêmeas para produzir uma ninhada que possa ser aperfeiçoada e selecionada quanto à presença de recombi- | 15 nantes homozigotos tendo a inserção exigida. Em um aspecto, a invenção refere-se a um animal quimérico constituído de tecido derivado de células ES e tecido derivado de embrião hospedeiro. Em um aspecto, a invenção ' refere-se a animais com geração subsequente alterada geneticamente, os quais incluem animais tendo recombinantes homozigotos para as regiões VDJe/ouVJ.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método pa- ra produzir um anticorpo específico contra um antígeno desejado, o método compreendendo imunizar um mamífero não humano transgênico, conforme acima, com o antígeno desejado e recuperar o anticorpo (consultar, por e- xemplo, Harlow, E. & Lane, D. 1998, 5º edição, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY; e Pasqualini and A- rap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257-259). Adequadamente, uma quantidade imunogênica do antígeno é liberada. A invenção refere-se também a um método para detectar um antígeno alvo, compreendendo detectar um anticorpo produzido como acima com um agen- te secundário de detecção que reconhece uma parte deste anticorpo.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método pa- |

. ra produzir um anticorpo totalmente humanizado, compreendendo imunizar um mamífero não humano transgênico como acima com o antígeno deseja- ' do, recuperar o anticorpo ou células que expressam o anticorpo e, em se- . guida, substituir a região constante do mamífero não humano com uma regi- ão constante humana.

Técnicas padrão de clonagem em nível de DNA po- ' dem ser empregadas para substituir a região constante do mamífero não humano com uma sequência apropriada de DNA de região constante huma- na — consultar, por exemplo, Sambrook, J and Russell, D. (2001, 3º edição) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab.

Press, Plainview, NY). . Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a anticorpos hu- manizados e cadeias de anticorpos produzidos de acordo com a presente . invenção, tanto em forma quimérica como em totalmente humanizada, e uso dos referidos anticorpos em medicina.

A invenção refere-se também a uma | 15 composição farmacêutica compreendendo estes anticorpos e um veículo ou outro excipiente farmaceuticamente aceitável.

Neste relatório descritivo, cadeias de anticorpos contendo se- . quências humanas, tais como cadeias quiméricas humanas-não humanas de anticorpos, são consideradas humanizadas devido à presença da regi- âáo/regiões de codificação de proteínas humanas.

Anticorpos totalmente hu- manizados podem ser produzidos a partir de DNA codificador de uma cadeia quimérica de anticorpos da invenção empregando técnicas padrão.

Métodos para a geração de anticorpos monoclonais e policlonais são bem conhecidos no estado da técnica, e a presente invenção refere-se a anticorpos policlonais e monoclonais de anticorpos quiméricos ou totalmente humanizados produzidos em resposta à exposição antigênica em mamíferos não humanos da presente invenção.

Em ainda outro aspecto, anticorpos quiméricos ou cadeias de anticorpos gerados na presente invenção podem ser manipulados, adequa- damente em nível do DNA, para gerar moléculas com propriedades ou estru- tura do tipo anticorpo, tais como região variável humana a partir de uma ca- deia pesada ou leve sem região constante, por exemplo, um anticorpo de |

- domínio; ou uma região variável humana com qualquer região constante a partir da cadeia pesada ou da leve da mesma espécie ou de diferente; ou ' região variável humana com uma região constante que não ocorra natural- . mente; ou região variável humana junto com qualquer outro parceiro de fu- são. A invenção refere-se a todos tais produtos quiméricos de anticorpos, ' derivados de anticorpos quiméricos identificados de acordo com a presente invenção. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de ani- mais da presente invenção na análise dos efeitos prováveis de fármacos e vacinas no contexto de um repertório de anticorpos quase humanos.

- A invenção refere-se também a um método para identificação ou validação de um fármaco ou vacina, o método compreendendo liberar a va- o cina ou fármaco a um mamífero da invenção e monitorar um ou mais de: a : resposta imune, o perfil de segurança, o efeito sobre doença.

A invenção refere-se também a um kit compreendendo um anti- : corpo ou derivado de anticorpo, conforme descrito neste pedido de patente, e instruções para uso deste anticorpo ou um reagente laboratorial adequado, - tal como tampão, reagente de detecção de anticorpos.

Em certos aspectos, a invenção refere-se a: Um mamífero não humano cujo genoma compreende: (a) a região VDJ humana de lgH em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; e (b) as regiões V e J humanas de cadeia leve kappa de Ig em sentido ascen- dente à região constante Kappa do mamífero não humano hospedeiro e/ou asregiões Ve J humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascen- dente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; em que o mamífero não humano é capaz de produzir um repertório de anti- corpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, e opcionalmente em que o genoma do mamífero não humano é modificado para prevenir a expressão de anticorpos totalmente específicos para a espé- cie do hospedeiro.

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. Uma célula ES de mamífero não humano cujo genoma compre- ende: : (a) a região V, D e J humanas de IgH em sentido ascendente a uma região “ constante de mamífero não humano; e (b)asregiõesVeJ humanas do /ocus de cadeia leve kappa de lg em senti- do ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospe- deiro, e/ou as regiões V e J humanas do locus de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; emquea célula ES é capaz de desenvolver-se em um mamífero não huma- - no, conseguindo produzir um repertório de anticorpos que são quiméricos, tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável - humana. : Um método para produzir um mamífero não humano transgênico capaz de produzir um repertório de anticorpos quiméricos, os anticorpos tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, o método compreendendo inserir no genoma de uma célula ES de - mamífero não humano, por recombinação homóloga, (a) a região VDJ humana de IgH em sentido ascendente à região constante da — cadeiapesada do mamífero não humano hospedeiro e (b) a região VJ humana de IlgL para cadeias lambda ou kappa em sentido ascendente à região constante da cadeia lambda ou kappa do mamífero não humano hospedeiro, respectivamente, de modo que o mamífero não humano seja capaz de produzir um repertório de anticorpos quiméricos tendo uma região constante de mamífero não hu- mano e uma região variável humana, em que as etapas (a) e (b) podem ser realizadas em qualquer ordem e cada uma das etapas (a) e (b) pode ser rea- lizada em etapas ou em uma única etapa.

Em um aspecto, a inserção de regiões VDJ ou VJ humanas em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano é realizada por inserção em etapas de múltiplos fragmentos por recombinação homólo- ga. |

. Em um aspecto, as inserções em etapas iniciam em um sítio on- de um cassete de iniciação foi inserido no genoma de uma célula ES forne- ' cendo uma região única como alvo, constituída por uma sequência de ca- . deia principal de BAC e um marcador de seleção negativa. Em um aspecto, o primeiro fragmento de região variável humana Ú é inserido por recombinação homóloga na sequência de cadeia principal de BAC do cassete de iniciação e o referido marcador de seleção negativa e o cassete de iniciação são subsequentemente removidos por recombinação entre sequências alvo de recombinase.

Em um aspecto, inserções direcionadas repetidas na sequência . de iniciação da cadeia principal de BAC e a remoção subsequente da cadeia principal por rearranjo entre sequências alvo de recombinase são repetidas o para construir toda a região VDJ humana em sentido ascendente à região constante não mamífera hospedeira.

Outros aspectos incluem: . Um método para produzir um anticorpo específico contra um an- tígeno desejado, o método compreendendo imunizar um mamífero não hu- - mano, como aqui descrito, com o antígeno desejado e recuperar o anticorpo ou uma célula produtora do anticorpo.

Um método para produzir um anticorpo totalmente humanizado, compreendendo imunizar um mamífero não humano, como aqui descrito, e, em seguida, substituir a região constante do mamífero não humano de um anticorpo especificamente reativo com o antígeno por uma região constante humana, adequadamente por engenharia do ácido nucleico codificador do anticorpo.

Um método, célula ou um mamífero como descritos neste relató- rio, em que uma sequência de DNA humano de região codificadora está em arranjo funcional com uma sequência de controle de mamífero não humano, de tal modo que a transcrição do DNA seja controlada pela sequência de controle do mamífero não humano. Em um aspecto, a região codificadora humana das regiões V, D ou J está em arranjo funcional com uma sequência promotora de camundongo.

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. A invenção refere-se também a um anticorpo humanizado pro- duzido de acordo com quaisquer métodos descritos neste relatório e ao uso

' de um anticorpo humanizado assim produzido em medicina. . Será entendido que concretizações específicas descritas neste pedido de patente são mostradas a título de ilustração e não como limita- ' ções da invenção.

As principais características desta invenção podem ser empregadas em várias concretizações sem se afastarem do âmbito da in- venção.

Aqueles versados no estado da técnica reconhecerão, ou serão ca- pazes de verificar, usando não mais do que o estudo de rotina, inúmeros equivalentes aos procedimentos específicos descritos neste relatório.

Tais - equivalentes são considerados abrangidos pelo âmbito desta invenção e estão cobertos pelas reivindicações.

Todas as publicações e os pedidos de ” patente mencionados neste pedido de patente são indicativos do nível de capacidade daqueles versados no estado da técnica à qual esta invenção pertence.

Todas as publicações e os pedidos de patente são aqui incorpora- : dos por referência neste pedido de patente na mesma medida conforme se- ria se cada publicação ou pedido de patente tivesse sido específica e indivi- dualmente indicado para ser incorporado por referência.

O uso da palavra "um" ou "uma" quando utilizada em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar "um,", porém é compatível também com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um". O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou" a menos que explicitamente indicado para referir-se a alter- nativamente somente ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora orelatório descritivo sustente uma definição que se refira somente a alterna- tivas e "e/ou." Por todo este pedido de patente, o termo "em torno de" é utili zado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dis- positivo, o método sendo empregado para determinar o valor ou a variação existente entre os sujeitos em estudo.

Neste relatório descritivo e nas reivindicações, as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de compreendendo, como "compreen- dem" e "compreende"), "tendo" (e qualquer forma de tendo, como "têm" e |

. "tem"), "incluindo" (e qualquer forma de incluindo, como "inclui" e "incluem") ou "contendo" (e qualquer forma de contendo, como "contém" e "contêm") Ú são inclusivos ou abertos e não excluem elementos ou etapas de métodos . adicionais, não enunciados.

O termo "ou combinações destes", neste relatório descritivo, re- ] fere-se a todas as permutações e as combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C ou combinações destes" destina- se a incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC, e se a ordem for importante em determinado contexto, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB,BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, expressamente incluí- . das são combinações que contêm repetições de um ou mais item ou termo, tais como BB, AAA, MB, BBC, ASABCCCC, CBBAAA, CABABB e assim por - diante. Aquele versado na técnica entenderá que tipicamente não há limite sobre o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outraforma evidente a partir do contexto.

Qualquer parte deste relatório descritivo poderá ser lida em combinação com qualquer outra parte do relatório descritivo, a menos que - de outra forma evidente a partir do contexto.

Todas as composições e/ou os métodos que foram descritos e são reivindicados neste pedido de patente podem ser produzidos e executa- dos sem indevida experimentação, à luz do presente relatório descritivo. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de concretizações preferidas, será evidente para aqueles versa- dos no estado da técnica que variações poderão ser aplicadas às composi- çõese/ouaos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método aqui descrito sem se afastarem do conceito, do espírito e do âmbito da in- venção. Todos tais substitutos e modificações evidentes para aqueles ver- sados no estado da técnica são considerados abrangidos pelo espírito, pelo âmbito e pelo conceito da invenção conforme definida pelas reivindicações anexadas.

A presente invenção está descrita mais detalhadamente nos E- xemplos seguintes não limitantes. O Exemplo 3 descreve dados experimen- |

. tais que foram obtidos e reforçam a prova de conceito de certos aspectos da invenção, enquanto o Exemplo 1 e o 2 fornecem orientação detalhada para Ú aquele versado na técnica para pôr em prática a invenção reivindicada. R Exemplo 1 Estratégia global ' Um modelo de camundongo da invenção pode ser conseguido inserindo -960 kb do locus de cadeia pesada humana, contendo todas as regiões V, D e J em sentido ascendente à região constante de camundongo e 473 kb da região kappa humana em sentido ascendente à região constan- tede camundongo. Alternativamente, ou in tandem, a região lambda huma- - na é inserida em sentido ascendente à região constante de camundongo. Esta inserção é conseguida por direcionamento genético em células ES, u- V sando técnicas bem conhecidas no estado da técnica. A inserção de alta fidelidade de regiões V-D-J intactas em cada locusem sua configuração nativa (tipo selvagem) é adequadamente conse- : guida por inserção de cromossomos artificiais bacterianos (BACs) humanos no locus. Adequadamente, os BACs são cortados e aparados de modo que, - no locus final, não exista sequência duplicada ou perdida quando comparada à original. Esse ajuste pode ser realizado por recombineering. Os BACs humanos relevantes, adequadamente aparados, co- brindo estes /oci possuem em média tamanho de 90 kb.

Em uma abordagem o complemento total de elementos D e J humanos, bem como sete ou oito regiões V humanas são cobertos pelos primeiros BACs a serem inseridos no esquema de inserção experimental descrito abaixo. Os primeiros BACs a serem inseridos nos loci de IgH e IgK podem conter as seguintes regiões V. IgH :V6-1, VII-1-1, V1-2, VIII-2-1, V1- 3, V4-4, V2-5 e IgK: V4-1, V5-2, V7-3, V2-4, V1-5, V1-6, V3-7, V1-8.

Adequadamente, o desempenho de cada locus é avaliado de- pois da inserção dos primeiros BACs, usando camundongos quiméricos, a- lém de depois de cada adição subsequente de BAC. Vide abaixo para des- crição detalhada deste teste de desempenho.

Nove inserções adicionais de BAC serão necessárias para o lo- |

. cus de IgH e cinco para o de IgK para obter o complemento total de regiões V humanas, cobrindo todos os 0,96 Mb e 0,473 Mb dos /oci de IgH e IgK,

Ú respectivamente. . Nem todos os BACs reterão sua configuração do tipo selvagem quando inseridos no genoma da célula ES.

Portanto, são empregados arran- i jos genômicos de alta densidade para rastrear células ES e identificar aque- las com inserções intactas de BAC (Barrett, M.T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., et al. (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA.

Proceedings of the National Academy of . Sciences of the United States of America 101, 17765-17770.). Este rastrea- mento possibilita também identificar e selecionar contra clones de ES nos -” quais o genoma da célula ES está comprometido e, dessa forma, incapaz de povoar a linhagem germinativa de animais quiméricos.

Outras ferramentas i 15 —genômicas adequadas para facilitar esta avaliação incluem sequenciamento

: e verificação por PCR.

Por conseguinte, em um aspecto, a estrutura correta do BAC é - confirmada antes de se prosseguir para a etapa seguinte.

Está implícito, a partir da descrição acima, que a fim de construir completamente os /ocicom BACs de 90 kb, é necessário realizar no mínimo 10 etapas de direcionamento para lIgH e 5 etapas para o IgK.

Camundongos com locus de lgl. podem ser gerados em maneira semelhante ao locus de IgK.

Etapas adicionais são necessárias para remover os marcadores de se- leção exigidos para apoiar o direcionamento do gene.

Dado que essas ma- —nipulações são realizadas em células ES em etapas, em um aspecto, a ca- pacidade de transmissão da linhagem germinativa é retida por todo este pro- cesso.

Manter o desempenho dos clones de células Es através de múltiplas roda- das de manipulação sem a necessidade de testar o potencial de linhagem germinativa da linhagem de células ES em cada etapa pode ser importante na presente invenção.

As linhagens celulares atualmente em uso para os projetos globais de knockout (silenciamento) KOMP e EUCOMM foram modi- |

: ficadas duas vezes antes que fossem usadas neste projeto, e suas taxas de transmissão de linhagem germinativa não se alteraram das células progeni- : toras (estas linhagens encontram-se publicamente disponíveis, consultar . www.Komp.org e www.eucomm.ord). Esta linhagem celular, denominada —JMB, pode gerar camundongos 100% derivados de célula Es sob as condi- ' ções publicadas de cultura (Peítitt, S.J., Liang, Q., Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, H.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, W.C. (2009). Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods). Estas células demonstraram capacidade para contribuir de modo reprodutível para tecido somático e de linhagem germinativa de ani- . mais quiméricos, usando condições padrão de cultura de células ES de ca- mundongos. Esta capacidade pode ser encontrada com células cultivadas C em linhagem celular alimentadora padrão (SNL) e mesmo sem alimentadora, cultivadas somente em placas de cultura de tecido revestidas com gelatina.

Uma sublinhagem específica, JMBA3, manteve a capacidade de povoar a : linhagem germinativa de quimeras depois de várias rodadas de subclona- gem. A manipulação genética intense por meio de, por exemplo, recombina- « ção homóloga — como seria o caso na presente invenção — não pode com- prometer a pluripotência das células. A capacidade para gerar quimeras com talalto percentual de tecido derivado de células ES possui outras vantagens. Primeiramente, altos níveis de quimerismo correlacionam-se com potencial de transmissão da linhagem germinativa e servem como ensaio substituto para transmissão de linhagem celular, enquanto necessitando somente 5 a 6 semanas. Em segundo lugar, como estes camundongos são 100% deriva- dosde células ES, os /oci construídos podem ser diretamente testados, eli- minando o atraso causado pelo melhoramento genético. É possível testar a integridade dos novos loci de lg nos quimeras já que o embrião hospedeiro será derivado de animais que são mutantes para o gene RAG-1 como des- crito na seção seguinte.

— Outra linhagem celular que pode ser utilizada é uma linhagem de célula H- PRT-ve, como AB2.1, descrita em "Chromosome engineering in mice", Ram- frez-Solis R, Liu P and Bradley A, Nature 1995;378;6558;720-4.

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. Complementação de RAG-1 Enquanto muitos clones gerarão camundongos 100% derivados Ú de ES, alguns não o irão.

Portanto, em toda etapa são gerados camundon- - gos com background de deficiência de RAG-1. Dessa forma, são fornecidos camundongos com células Be T 100% derivadas de ES que podem ser u- ' sadas diretamente para imunização e produção de anticorpos.

Células com background deficiente em RAG-2, ou background de deficiência combinada de RAG-1/RAG-2 podem ser utilizadas, ou mutações equivalentes nas quais os camundongos produzem somente células B e/ou células T derivadas de célulaES. - Para que somente os loci humano-camundongo de IgH ou IgK estejam ativos nestes camundongos, os loci humano-camundongo de IgH e CG IgK podem ser construídos em uma linhagem celular na qual um alelo do : locus de IgH ou de IgK já foi inativado.

Alternativamente, a inativação do lo- cusde lg do hospedeiro, tal como o focus de IgH ou IgK, pode ser realizada . depois da inserção.

Linhagens de camundongo com mutação no gene RAG-1 são - imunodeficientes uma vez que não possuem linfócitos B ou T maduros (US 5 859 307). Os linfócitos T e B somente se diferenciam se a recombinação ocorrida de V(D)J for apropriada.

Como RAG-1 é uma enzima fundamental para esta recombinação, camundongos desprovidos de RAG-1 são imuno- deficientes.

Se embriões hospedeiros forem geneticamente mutantes homo- zigotos para RAG-1, uma quimera produzida por injeção de tal embrião não será capaz de produzir anticorpos se os tecidos linfoides do animal forem derivados do embrião hospedeiro.

No entanto, células JM8 e células AB2.1, por exemplo, contribuem em geral para mais de 80% dos tecidos somáticos do animal quimérico e povoariam, portanto, normalmente o tecido linfoide.

As células JM8 possuem atividade de RAG-1 do tipo selvagem e, por conse- guinte, anticorpos produzidos no animal quimérico seriam codificados pelo genoma construído somente com células ES JM8. Portanto, o animal quimé- rico pode ser exposto a um antígeno por imunização e subsequentemente produzir anticorpos contra este antígeno.

Isso permite àquele versado na |

. técnica testar o desempenho dos loci humanos/camundongos de IgH e IgK, construídos conforme descrito na presente invenção. Consultar as figuras 19 ] e 20.

. Qualquer técnico versado na técnica usaria o animal quimérico descritopara determinar a extensão da diversidade de anticorpos (consultar, : por exemplo, Harlow, E. & Lane, D. 1998, 5º edição, Antibodies: A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por exemplo, a existência no soro do animal quimérico de certos epítopos de anticorpos po- deria ser verificada por ligação ao antissoro específico anti-idiotipo, por e- xemplo, em um ensaio ELISA. Um técnico versado no assunto poderia tam- - bém sequenciar os genomas de clones de células B derivados do animal quimérico e comparar a referida sequência com a sequência do tipo selva- "” gem para verificar o nível de hipermutação, tal como hipermutação indicativa de maturação normal de anticorpos.

Um técnico versado na técnica utilizaria também o referido ani- mal quimérico para examinar a função de anticorpo, em que os referidos an- ticorpos são codificados a partir dos loci construídos de Ig (consultar, por ' exemplo, Harlow, E. & Lane, D. 1998, 5º edição, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por exemplo, o an- tissoro poderia ser testado quanto à ligação a um antígeno, o referido antí- geno usado para imunizar o animal quimérico. Tal avaliação poderia ser efe- tuada por um ensaio ELISA. Alternativamente, qualquer técnico no assunto poderia testar a neutralização do antígeno por adição dos antissoros coleta- dos do animal quimérico apropriadamente imunizado.

Conforme bem conhecido por aqueles versados no estado da técnica, resultados positivos para qualquer um destes testes demonstram a capacidade dos loci construídos de Ig, o objeto da presente invenção, para codificar anticorpos com regiões variáveis humanas e regiões constantes de camundongo, os referidos anticorpos capazes de operar na maneira de anti- corpos do tipo selvagem.

Técnicas experimentais Recombineering para produção de vetores a serem usados em |

. recombinação homóloga em células ES está descrito em, por exemplo, os documentos WO09929837 e WO0104288, e as técnicas são bem conhecidas ' no estado da técnica.

Em um aspecto, o recombineering do DNA humano . ocorre usando BACs como fonte do referido DNA humano.

O isolamento de —DNA de BAC humano é efetuado com kit de purificação de BAC da Qiagen. ' A cadeia principal de cada BAC humano será modificada pela técnica de recombineering exatamente na mesma ou em configuração semelhante à do BAC já inserido na região IgH de camundongo.

O inserto genômico de cada BAC humano será cortado e aparado pela técnica de recombineering de modo que uma vez os BACs sejam inseridos, uma parte contígua contínua . da região genômica V(D)J humana se formará no locus de IgH ou IgK de camundongo.

O DNA do BAC será transfectado por eletroporação, e a geno- À tipagem será realizada de acordo com protocolos padrão (Prosser, H.M,, Rzadzinska, A.K., Steel, K.P., and Bradley, A. (2008). Mosaic complementa- tion demonstrates a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics of ste- reocilia.

Molecular and Cellular Biology 28, 1702-1712; Ramirez-Solis, R., Davis, A.C., and Bradley, A. (1993). Gene targeting in embryonic stem cells. - Methods in Enzymology 225, 855-878.). O método de recombineering será realizado usando os procedimentos e os reagentes desenvolvidos pelo labo- ratório de Pentao Liu e Don Court (Chan, W.,, Costantino, N,, Li, R., Lee, S.C., Su, Q., Melvin, D., Court, D.L., and Liu, P. (2007). A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.

Nucleic Acids Research 35, e64). Estas e outras técnicas para direcionamento genético e recombinação de fragmentos cromossômicos derivados de BAC no genoma de um mamífero não humano, tal como camundongo, estão descritas em, por exemplo,

http:/Avww.eucomm.org/information/targeting/e http:/NWwww.eucomm.org/information/publications.

A cultura celular de linhagens de células derivadas de C57BL/6N, como as células ES de JM8 de machos seguirá técnicas padrão.

As células ES de JM8 demonstraram ser competentes em contribuir inten- samente para tecidos somáticos e para a linhagem germinativa e estão sen- |

. do usadas em programas de grande mutagênese em camundongos no San- ger, tais como EUCOMM e KOMP (Pettitt, S.J., Liang, Q., Rairdan, X.Y., Mo- : ran, J.L., Prosser, H.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., and Skarnes, : W.C. (2009). Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic re- sources.

Nature Methods). Células ES de JM8 ES (1,0 X 107) sofrerão ele- ' troporação (500 UF, 230 V; BioRad) com 10 pg de DNA de BAC humano linearizado de |-Scel, Os transfectantes serão selecionados com Puromicina (3 pug/ml) ou com G418 (150 pg/ml). A seleção iniciará depois de 24 horas (com G418) ou 48 horas (com Puromicina) da eletroporação e prosseguirá por5dias.10 ug de DNA de BAC humano linearizado podem render até 500 . colônias de células ES resistentes à Puromicina ou a G418. As colônias de células ES resistentes ao antibiótico serão coletadas em placas de cultura e celular de 96 cavidades para genotipagem e identificação dos clones alvo.

Uma vez identificados, os clones alvo de células ES de camundongo serão analisados por Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em arranjos : quanto à integridade total do genoma (Chung, Y.J., Jonkers, J., Kitson, H., Fiegler, H., Humphray, S., Scott, C, Hunt, S., Yu, Y., Nishijima, |., Velds, A., N et al. (2004). A whole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes by array comparative genomic hybridization Genome research 14, 188-196 e Liang, Q., Conte, N., Skarnes, W.C, and Bradley, A. (2008). Extensive genomic copy number variation in embryonic stem cells.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 17453-17456.). Células ES contendo ge- nomas anormais não contribuem eficientemente para a linhagem germinativa dos camundongos quiméricos.

A integridade de BACs será examinada por amplificação por PCR de cada gene V funcional conhecido no BAC.

Por e- xemplo, em uma abordagem, o primeiro BAC escolhido para o locus de IgH possui 6 genes V funcionais.

A fim de confirmar a integridade deste BAC quanto à presença destes 6 genes V de IGH, pelo menos 14 pares de inicia- dores (primers) de PCR serão desenhados e usados para amplificar por PCR o DNA genômico das células ES alvo.

O tamanho e a sequência do tipo selvagem desses fragmentos assegurarão que o BAC inserido não foi rear-

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. ranjado. . CGH mais detalhada confirmará também a integridade dos ' BACs inseridos, Por exemplo, qualquer técnico versado no assunto poderia . utilizar uma plataforma de oligo aCGH, a qual é desenvolvida pela Agilent Technologies, Inc.

Esta plataforma não só possibilita o estudo genômico : amplo da variação do número de cópias de DNA em alta resolução (Barrett, M.T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., et al. (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA.

Pro- ceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ameri- . ca 101, 17765-17770.), mas também o exame de uma região específica do genoma usando arranjos especificamente desenhados.

Em comparação às C técnicas tradicionais de aCGH que se baseiam em sondas de cDNA ou son- das de BACs inteiros, as sondas de oligonucleotídeos de 60 mer podem as- i 15 segurar a hibridização específica e alta sensibilidade e precisão que são ne- : cessárias para se detectar as alterações cromossômicas construídas que foram efetuadas.

Por exemplo, oligos desenhados para hibridizarem-se em - intervalos regulares ao longo da extensão inteira do BAC inseria detectariam mesmo deleções, inserções ou outros rearranjos bem curtos.

Adicionalmen- te, esta plataforma oferece a maior flexibilidade para desenhos personaliza- dos de microarranjos.

O DNA genômico de células ES alvo e o DNA genô- mico individual humano normal serão marcados separadamente com coran- tes e hibridizados ao arranjo.

Lâminas com arranjos serão rastreadas usan- do o rastreador (scanner) de microarranjos de DNA da Aglient Technologies.

Intensidades recíprocas de fluorescência do corante Cy5 e do corante Cy3, em toda imagem de arranjo, e os valores da razão em log? serão extraídos usando o soffware Bluefuse (Bluegnome). Manchas com padrões inconsis- tentes de fluorescência ("confiança" < 0,29 ou "qualidade" = 0) serão excluí- das antes de serem normalizados todos os valores da razão em log2. Em um experimento, razão em log2 entre -0,29 e +0,29 para o sinal emitido por qualquer sonda de oligos é considerada como sem alteração no número de cópias.

O limiar da razão em log2 para "Duplicação" é geralmente >0,29999,

| e para deleção é <0,29999. Uma vez o primeiro BAC humano seja inserido no locus de Ig i de camundongo e confirmado como estando em sua configuração intacta, Y nativa, a cadeia principal do BAC flanqueada por FRT será removida por excisãocom recombinase sítio-específica para Flp.

Se a recombinação regu- Ú lar de FRT catalizada por Flp não for suficientemente alta, é possível usar Flo, uma versão melhorada de Flpo recombinase, a qual em certos testes é 3 a 4 vezes mais eficiente do que a Flp original em células ES.

Depois da excisão da cadeia principal do BAC, as células ES tornam-se sensíveis à Puromicina (ou G418) e resistentes a FIAU (pela perda do cassete TK). Os - eventos de excisão serão caracterizados mais detalhadamente por amplifi- cação por PCR do fragmento de junção, usando iniciadores de DNA genô- C mico humano.

Estas células ES livres da cadeia principal do BAC flanqueada . por FRT serão utilizadas para a rodada seguinte de inserção de BAC huma- noe para injeção de blastócitos. : O direcionamento para o genoma de uma célula ES para produ- zir um camundongo transgênico pode ser realizado utilizando um protocolo - conforme explicado por referência às figuras 1— 18 anexadas.

A figura 1 ilustra três vetores básicos de cadeia principal; um cassete de iniciação e 2 grandes vetores inseridos, 1 e 2 respectivamente.

O cassete de iniciação compreende sequências homólogas ao sítio desejado de inserção no genoma de camundongo, estes sítios flanqueando um mar- cador selecionável e uma sequência stuffer (de preenchimento) iniciadora para genotipagem com base em PCR e confirmação da inserção correta de BACs.A sequência Stuffer-iniciadora fornece a base para genotipagem em cada etapa de adição de BAC.

Esta sequência é considerada um modelo robusto bem validado de sequência para iniciador de PCR e pode estar situ- ada no sítio IScel, idealmente a uma distância de -1 kb do BAC inserido.

Os grandes vetores inseridos compreendem DNA humano em — plasmídeoscom marcadores selecionáveis e um sítio de restrição único para linearização do plasmídeo de modo a auxiliar a recombinação homóloga no genoma da célula ES. |

A figura 2 ilustra a inserção de um cassete de iniciação no ge- noma de camundongo por recombinação homóloga entre os exons J4 e C alpha de camundongo. A seleção pela Puromicina permitir identificar células . ES com inserção do cassete. pu(Delta)tk é uma proteína de fusão bifuncio- nal entre puromicina N-acetiltransferase (Puro) e uma versão truncada de ' timídina quinase (DeltaTk) do vírus herpes simples tipo 1. Células-tronco embrionárias (ES) murinas transfectadas com pu(Delta)tk tornam-se resis- tentes à puromicina e sensíveis ao 1-(-2-desoxi-2-flúor-1-beta-D-arabino- furanosil)-5-iodouracil (FIAU). Diferentemente de outros transgenes HSV1 tk, puDeltatk&é rapidamente transmitida através da linhagem germinativa mas- . culina. Dessa forma, pu(Deltatk é um marcador selecionável positi- vol/negativo conveniente que pode ser amplamente utilizado em muitas apli- CÚ cações de células ES.

. A figura 3 ilustra o direcionamento do grande vetor 1 inserido pa- rao genoma de células ES de camundongos. O vetor é linearizado na mes- : ma posição que a sequência stuffer iniciadora que permite uma estratégia de genotipagem para reparo de gap (lacuna), bem conhecida no estado da téc- nica. Consultar Zheng et al NAR 1999, Vol 27, 11, 2354 - 2360. Em essên- cia, a inserção aleatória do vetor alvo no genoma não "reparará" o gap, en- quanto um evento de recombinação homóloga reparará o gap. A justaposi- ção de sequências apropriadas de iniciadores de PCR permitirá que colônias sejam rastreadas individualmente quanto a um fragmento positivo por PCR, indicando a inserção apropriada. A seleção positive usando G418 permite identificar células ES de camundongo contendo o novo marcador de sele- ção. Todas as regiões V, D e J críticas podem ser verificadas por PCR. A hibridização genômica comparativa de arranjos pode ser utilizada para vali- dar a estrutura do BAC. A figura 4 ilustra que o cassete de puro-delta-tk e a cadeia prin- cipal de BAC do plasmídeo são deletados usando Flpe e selecionados em —FIAU. Dado que Flpe opera de modo ineficiente em células ES de camun- dongo (5% de deleção com expressão transitória de Flpe), prevê-se que, na maioria dos casos, a recombinação ocorra entre os sítios de FRT que flan- | queiam a cadeia principal do BAC.

Flpo pode ser testada também para des- cobrir a eficiência da recombinação entre os dois sítios de FRT que estão a : uma distância de 10 kb. : Dado que a etapa de deleção de FRT é selecionável, é possível agrupar clones resistentes ao FIAU e prosseguir imediatamente para a etapa Ú seguinte, paralelamente à análise clonal.

Alternativamente, pode ser desejá- vel demonstrar, por PCR de curto alcance, que as sequências humanas es- tão agora adjacentes às do camundongo como demonstrado (iniciador 1 Hu e iniciador Mo). Neste estágio, um locus humano de 200 kb terá sido inserido. . A figura 5 ilustra que um segundo grande vetor inserido é dire- cionado para o cromossoma da célula ES.

O BAC humano é direcionado ” para o locus de IgH de camundongo, usando a inserção do mesmo cassete de iniciação, seguido por linearização de IScel BAC, direcionamento do BAC parao cassete de iniciação e estratégia de genotipagem de reparo de gap.

À ' verificação da inserção do BAC é realizada como antes.

A figura 6 ilustra que a cadeia principal do BAC flanqueada por - FRTY do grande vetor 2 inserido e o novo marcador são deletados via Flpo.

Observar que isso não é selecionável, portanto, será necessária a análise clonal nesse ponto.

Isso possibilitará confirmar a justaposição do inserto 2 humano com o 1 humano e outras tentativas de validação.

Neste estágio, um locus humano de — 200Kkb terá sido inserido.

A figura 7 ilustra o próximo grande vetor inserido direcionado pa- ra o focus de lgH de camundongo.

O cassete pu-delta TK é removido a se- —guir, conforme para a figura 4. O processo pode ser repetido para incorporar outros BAC's.

A figura 8 ilustra o construto final predito de célula ES.

As figuras 9 - 18 fornecem um nível mais detalhado deste pro- cesso.

Exemplo 2 Em um método adicional da invenção, recombinação sítio- específica pode ser empregada também.

A recombinação sítio-específica |

(SSR) tem sido amplamente utilizada nos últimos 20 anos para a integração de transgenes em loci cromossômicos definidos.

A SSR envolve a recombi- nação entre sequências homólogas de DNA. . A primeira geração de direcionamento cromossômico com base emSSR envolveua recombinação entre (i) um único sítio alvo (RT) de como ' loxP ou FRT em um plasmídeo transfectado com (il) um sítio cromossômico RT fornecido por uma integração prévia.

Um grande problema com esta a- bordagem é que eventos de inserção são raros, uma vez que excisão é sempre mais eficiente do que inserção.

Uma segunda geração de SSR de- nominadaRMCE (troca de cassete mediada por recombinase) foi introduzida - por Schlake e Bode em 1994 (Schlake, T.; J.

Bode (1994). "Use of mutafed FLP-recognition-target-(FRT-)sites for the exchange of expression cassettes ” at defined chromosomal loci". Biochemistry 33: 12746-12751). O método que : empregavam é fundamentado no uso de dois RTs heteroespecíficos e in- compatíveis no plasmídeo transfectado que podem se combinar com sítios : RT compatíveis no cromossoma, resultando na permute (swap) de um peda- ço de DNA por outro — ou uma troca de cassete.

Essa abordagem tem sido explorada com êxito em uma variedade de direcionamento cromossômico eficiente, incluindo integração de insertos de BAC de mais de 50 kb (Walla- ce, HAC, ef al. (2007). "Manipulating the mouse genome to engineering precise functional syntenic replacements with human sequence". Cell 128: 197-209; Prosser, H.M. et al. (2008). "Mosaic complementation demonstra- tes a regulatory role for myosin Vila in actin dynamics of Stereocilia". Mol.

Cell.

Biol. 28: 1702-12). O maior tamanho de inserto de um BAC é em torno de 300 kb e, por conseguinte, coloca-se no limite superior de tamanho de cassete para RMCE.

Na presente invenção, é utilizada uma nova técnica com base em SSR denominada RMCE sequencial (SRMCE), que permite a inserção contínua de insertos de BACs no mesmo locus.

O método compreende as etapas de: (1) inserção de DNA formador de um cassete de iniciação (também denomi- | nado neste relatório descritivo landing pad) no genoma de uma célula; (2) inserção de um primeiro fragmento de DNA no sítio de inserção, o primei- Ú ro fragmento de DNA compreendendo uma primeira porção de um DNA hu- . mano e uma primeira porção de vetor contendo um primeiro marcador sele- cionávelou gerando um marcador selecionável quando da inserção; ' (3) remoção de parte do DNA de vetor; (4) inserção de um segundo fragmento de DNA na porção de vetor do pri- meiro fragmento de DNA, o segundo fragmento de DNA contendo uma se- gunda porção de DNA humano e uma segunda porção de vetor, a segunda porção de vetor contendo um segundo marcador selecionável ou gerando um segundo marcador selecionável quando da inserção; (5) remoção de qualquer DNA de vetor para permitir que o primeiro e o se- VU gundo fragmento de DNA humano formem uma sequência contígua; e (6) iteração das etapas de inserção de uma parte do DNA de V(D)J humano eremoção de DNA de vetor, conforme necessário, para produzir uma célula : com toda ou parte da região VDJ ou VJ humana suficiente para ser capaz de gerar um anticorpo quimérico em conjunto com uma região constante do - hospedeiro, em que a inserção de pelo menos um fragmento de DNA utiliza recombina- çãosíiti-específica.

Em um aspecto específico, a abordagem utiliza três sítios loxP heteroespecíficos e incompatíveis.

O método é constituído das etapas se- guintes e está ilustrado nas figuras 22 - 26: (1) Direcionamento de um landing pad no locus definido.

Um vetor de entra- da contendo um minigene HPRT flanqueado por ITRs invertidas piggyBac (PB) é direcionado para a região definida (por exemplo: uma região entre IGHJ e Eu ou IGKJ e Ek ou IGLC1 e EA3-1) para servir como landing pad para o direcionamento de BAC.

O minigene HPRT é composto por dois e- xons sintéticos e intron associado.

O exon 5' HPRT é flanqueado por dois sítiosloxP heteroespecíficos e incompatíveis (um sítio do tipo selvagem e o outro um mutante, lox5171) em orientação invertida entre si (figura 22). Es- tes dois sítios loxP fornecem sítios de recombinação para a inserção de BAC | através de RMCE. (2) Inserção do 1º BAC modificado no fanding pad alvo.

O 1º BAC possui ] uma extensão de DNA a ser inserido no genoma flanqueado por modifica- . ções construídas por engenharia.

A modificação em 5' (loxP - neo gene - lox2272- promotor PGK - PB 5'LTR) e modificação em 3' (PB3'LTR — gene puroATK - lox5171) está retratada na figura 23, acompanhada pelas orienta- ções relativas dos sítios lox e PB LTRs.

Com a expressão transitória de CRE a partir de um vetor eletroporado concomitantemente, a sequência de DNA seria inserida no locus definido através de RMCE.

As células nas quais ocor- reuuma inserção correta podem ser selecionadas como segue: (i) Resistên- . cia à Puromicina (o gene puroATK adquiriu um promotor - "PGK" - do lan- ding pad), (ii) resistência a 6TG (o minigene HPRT foi alterado) e (iii) resis- tência a G418 (seleciona qualquer inserção mediante o novo arranjo-PGK da região 5'). Qualquer combinação destes esquemas de seleção pode ser utili zada A resistência a G418 e a 6TG seleciona eventos corretos na extremi- ' dade 5', enquanto à resistência à puromicina seleciona eventos corretos na extremidade 3'. - (3) Cura (remoção) da modificação em 3' da 1º inserção.

Um 1º BAC devi- damente inserido resulta na extremidade 3' com um gene puroATK flanque- adoporPBLTRs invertidas (figura 24) — essencialmente uma estrutura a- propriada de transposon.

Este transposon pode ser removido em seguida pela expressão transitória da piggyBac transposase (de um vetor eletropora- do). Células com o evento correto de excisão podem ser selecionadas por resistência a FIAU — ou seja, sem atividade de timidina quinase conferida pelo gene puroATK.

Isso remove completamente a modificação em 3' não deixando vestígios de nucleotídeos. (4) Inserção de um 2º BAC modificado na extremidade 5' da 1º inserção.

O 2º BAC possui uma extensão de DNA a ser inserido no genoma (geralmente pretendido para ser contíguo com o DNA inserido com o 1º BAC) flanqueado por modificações construídas por engenharia.

A modificação em 5' (loxP — porção do minigene HPRT em 5' - lox5171 — promotor PGK - PBS'LTR) e modificação em 3' (PB3'LTR - puroATK - lox2272) está retratada na figura 25 | acompanhada pelas orientações relativas dos sítios lox e PB LTRs.

Com a expressão transitória de CRE de um vetor eletroporado concomitantemente, a sequência de DNA seria inserida no locus definido através de RMCE.

As - células nas quais ocorreu uma inserção correta podem ser selecionadas como segue: (i) resistência a HAT (o minigene HPRT é reconstituído por um evento correto de inserção, ou seja: as estruturas de exon em 5' e 3' são unidas) e (ii) resistência à puromícina (o gene puroATK adquiriu um promotor - "PGK" - do landing pad). (5) Cura (remoção) da modificação em 3' da 2º inserção.

Um 2º BAC devi- damente inserido resulta na extremidade 3' tendo um gene puroATK flan- - queado por PB LTRs invertidas (figura 26) — essencialmente uma estrutura apropriada de transposon, exatamente análoga à consequência de uma 1º 7 inserção bem sucedida de BAC.

E, portanto, este transposon pode ser i- : gualmente removido pela expressão transitória da piggyBac transposase (de um vetor eletroporado). Células com o evento correto de excisão podem ser BR selecionadas por resistência a FIAU — ou seja, sem atividade de timidina quinase conferida pelo gene puroATK.

Isso remove completamente a modifi- . cação em 3' não deixando vestígios de nucleotídeos. (6) Depois que a modificação em 3' da inserção do 2º BAC é curada, o lan- dingpad torna-se idêntico ao original.

O processo inteiro, etapas 2 a 5, pode ser repetido múltiplas vezes para construir uma grande inserção no genoma.

Quando completo, não há nucleotídeos residuais restantes a não ser a in- serção desejada.

Com a inserção de um número ímpar de BAC's nos /loci de lg, as sequências VDJ ou VJ endógenas podem ser inativadas mediante uma in- versão por intermédio de engenharia cromossômica como segue (consultar as figuras 27 - 29): (1) Direcionamento de um cassete "flip-over" em uma região de 5' a uma distância de 10 a 40 megabases da VDJ ou VJ endógena.

O vetor flip-over (PB3'LTR - promotor PGK — porção em 5' do minigene HPRT - loxP - pu- roATK — promotor CAGGS - PB3'LTR) está retratado na figura 27 junto com as orientações relativas dos sítios lox e PB LTRs. |

(2) A expressão transitória de CRE resultará na recombinação entre o sítio loxP no cassete "flip-over" e o sítio loxP na modificação em 5'. Esta modifi- cação em 5' é conforme descrita nas Etapas 2 e 3 acima — essencialmente a - modificação resultante da inserção de um número ímpar de BACs, depois quea modificação em 3'tiver sido curada.

Os sítios loxP são invertidos em i relação um ao outro e, portanto, o evento descrito de recombinação resulta em uma inversão como retratada na figura 28. Células com a inversão corre- ta serão resistentes a HAT uma vez que o minigene HPRT é reconstituído por uma inversão correta. (3) Uma inversão correta deixa também duas estruturas de transposon flan- : queando o cassete "flip-over" e a modificação em 5'. As duas podem ser reti- radas por excisão com a expressão transitória de piggyBAC transposase, 7” não deixando resíduos de qualquer modificação (figura 29). Células com as excisões corretas podem ser selecionadas como segue: (i) resistência a 6TG (o minigene HPRT é deletado) e (ii) resistência a FIAU (o gene puroATK é ' deletado). Uma inversão como descrita nos loci de lg afastaria a região IGH- VDJ ou IGK-VJ endógena da região intensificadora Eu ou EK, respectiva- mente, e levaria à inativação das regiões IGH-VDJ ou IGK-VJ endógenas.

Os métodos de inserção da invenção provêm adequadamente umoumaisde: Seleção nas extremidades 5' e 3' do fragmento inserido de DNA; Cura eficiente da modificação em 3', de preferência por excisão de DNA me- diado pela transposase; Inativação da atividade de IGH ou IGK endógena através de uma inversão; e Excisãode modificações, não deixando vestígios restantes no cromossoma.

Exemplo 3 A prova de conceito da abordagem está descrita na figura 30. Na figura 30, um Janding pad, como mostrado na figura 22, foi inserido no ge- noma de um camundongo por recombinação homóloga, seguido por inser- ção do plasmídeo R21 neste /anding pad através de recombinação sítio- específica mediada por cre.

O evento de inserção gerou alguns eventos ge- rais de inserção, 360 colônias que eram resistentes a G418, das quais 220 | foram inseridas no locus desejado, como demonstrado pelo rompimento do minilocus de HRPT.

O vetor R21 mimetiza o 1º vetor de inserção de BAC nas extre- . midades 5' e 3', incluindo todos os elementos de seleção e sítios alvo da re- combinase. Em vez de sequências de BAC, há uma pequena sequência "stuffer". Este vetor testará todos os representados desenhados na invenção e permitirá testar os resultados, no sentido de que PCR na sequência stuffer é viável e, portanto, permite que ambas as extremidades da inserção sejam facilmente testadas. R21 foi eletroporado concomitantemente com um vetor que expressava cre nas células ES abrigando o landing pad no locus de |- - GH. Quatro conjuntos de células transformadas foram transfectados em pa- ralelo e, em seguida, postos em esquemas diferentes de seleção como indi- CÚ cado na figura 30. A seleção por G418 (nova expressão gênica) resultou no : maior número de colônias em virtude de não haver exigência quanto à inte- gração específica no l/anding pad. Qualquer integração de R21 no genoma ' conferirá nova expressão levando à resistência a G418. A seleção com pu- romicina resultou em número semelhante de colônias para Puro + 6TG ou - G418 + 6TG, sugerindo que o rigor da seleção por puromicina decorre do puroATK desprovido de um promotor no vetor. A expressão de Puro é adqui- rida somente quando uma integração ocorre próxima de um elemento pro- motor — neste desenho, o mais provável é especificamente no landing pad. Essas conclusões são reforçadas pelos resultados da PCR da junção que é mostrada na figura 31. A etapa seguinte na invenção é "curar" a extremidade 3' do vetor —BAC integrado, deixando uma transição contínua entre a inserção e o geno- ma flanqueado. Esta cura foi demonstrada expandindo um clone individual do acima (R21 inserido no landing pad) e expressando piggyBac recombina- se neste clone mediante a transfecção de um plasmídeo com expressão. FIAU foi utilizado para selecionar colônias nas quais a modificação em 3' foi removida por excisão — ou seja, através da perda do elemento "PGK- pu- roATK" entre as repetições terminais de piggyBac. Cinquenta de tais clones resultaram de uma transfecção de 10º células; destas, 6 foram testadas | quanto à estrutura genômica prevista. A cura bem sucedida resultou em PCR positiva entre o conjunto de iniciadores marcado com "3" na figura 32. Dos 6 clones, 4 apresentavam excisões corretas, | clone permaneceu na * configuração original e 1 outro apresentou uma deleção. Esses dados demonstram inserção iterativa de DNA em um lan- ding pad em um locus genômico definido usando as abordagens descritas acima. Exemplo 4 O Exemplo 3 demonstrou que o desenho da invenção reivindi- cada foicapaz de prover a inserção de um vetor de teste no genoma em um - local definido, neste caso o vetor R21 no locus de IGH de camundongo. O uso de um meio apropriado de seleção e a expressão de cre-recombinase 7 resultaram em uma alteração genômica com a estrutura predita. : Os mesmos elementos de desenho descritos nesta invenção fo- ram construídos nas extremidades 5' e 3' de um inserto de BAC. O referido inserto compreendia sequências humanas do locus de IGH e era de aproxi- madamente 166 kb. Este BAC construído foi eletroporado junto com DNA de : plasmídeo expressando cre em células ES de camundongo abrigando o lan- ding pad no locus de IGH de camundongo. A população celular transfectada foi cultivadaem meio contendo puromicina para selecionar eventos apropri- ados de inserção.

Sete clones resultantes foram isolados e adicionalmente anali- sados. O evento previsto de recombinação e a estrutura resultante estão retratados na figura 33. Com base em dados obtidos do experimento com —R21 descrito no Exemplo 3, uma seleção rigorosa para clones corretos foi prevista quando a população transfectada foi selecionada em meio contendo puromicina. Isso decorre da região codificadora de puro exigir um elemento promotor e este é de preferência suprido pelo /anding pad após recombina- ção. Dessa forma, a maioria dos 7 clones isolados foi inserida corretamente —nogenoma no landiíng pad conforme determinado pela PCR diagnóstica. Os iniciadores para diagnosticar uma inserção correta estão retratados na figura

33. Junções corretas estão presentes no genoma se um fragmento de 610 | bp for amplificado entre os iniciadores "A" e "X" e um fragmento de 478 bp for amplificado entre os iniciadores "Y" e "B" (figuras 33 e 34). Notar que e- xistem fragmentos amplificados entre os iniciadores "A" e "T" e os iniciado- s res "2" e "B", indicando a presença de genoma progenitor (ou seja, apenas o landingpad). Estes resultam de células progenitoras presentes internamente nas colônias de células sob a seleção por puro que escapam da seleção de- vido à geometria de uma colônia.

Depois da passagem da colônia através do meio contendo puro, estes fragmentos de junção de progenitoras desapare- cem, indicando que as células progenitoras são retiradas da população.

Adi- cionalmente, todos os clones demonstraram ser resistentes a 6-TG, confor-

“ me esperado se o gene HPRT for inativado pelo evento correto de inserção.

Esses dados indicam que a estratégia descrita para inserir gran- CÚ des partes dos loci de IG humana em posições definidas no genoma de ca- . mundongo possibilitará a construção de um camundongo com uma plurali- dadedas regiões variáveis de regiões humanas de IG em sentido ascenden-

' te às regiões constantes de camundongo como descrito. |

Claims (2)

: REIVINDICAÇÕES

1. Método para produção de um anticorpo ou cadeia leve ou pe- t sada de anticopo específico para um antígeno desejado, caracterizado pelo fato de que compreende imunizar um mamífero não humano com o antígeno desejado e recuperar o anticorpo ou cadeia de anticorpo ou recuperar uma célula produzindo o anticorpo ou cadeia leve ou pesada, em que o genoma do animal não humano compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente àregião constante do mamífero não humano hospedeiro; e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de |g e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sentido ascendente à região constante kappa do mamífero não huma- no hospedeiro e/ou uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda delge uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de lg em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; em que o mamífero não humano é capaz de produzir um reper- tório de anticorpos quiméricos, ou cadeias pesadas quiméricas e opcional- mente cadeias leves quiméricas, tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana; e em que a inserção do DNA de cadeia pesada humano é efetu- ada entre a região constante do mamífero não humano e a última, 3', região J do mamífero não humano, ou em que o genoma do animal não humano compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sen- tido ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospe- deiro e/ou uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve lambda de Igeuma ou rmaisregiões Jhumanas de cadeia leve lambda de lg em senti- do ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospe- deiro; e

É 2/5 : (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; em que o mamífero não humano é capaz de produzir um reper- tório de anticorpos quiméricos, ou cadeias leves quiméricas, e opcionalmen- te cadeias quiméricas pesadas, tendo uma região constante de mamífero não humano e uma região variável humana, e em que a inserção do DNA de cadeia kappa ou lambda huma- no é efetuada entre a região constante do mamífero não humano e a última, 72, regiãoJdo mamífero não humano.

2. Célula produtora de anticorpo de mamífero não humano, ca- racterizada pelo fato de que o genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente àregião constante do mamífero não humano hospedeiro e (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve kappa de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de |g em sentido ascendente à região constante kappa do mamífero não huma- no hospedeiro e/ou uma ou mais regiões V humanas de cadeia leve lambda delgeuma ou maisregiões J humanas de cadeia leve lambda de Ig em sentido ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospedeiro; e em que a inserção do DNA de cadeia pesada humano é efetu- ada entre a região constante do mamífero não humano e a última, 3', região Jdomamiífero não humano, ou uma célula produtora de anticorpo de mamífero não humano cujo genoma compreende: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve kappa de lg e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve kappa de lg em sen- tido ascendente à região constante kappa do mamífero não humano hospe- deiro e/ou uma pluralidade de regiões V humanas de cadeia leve lambda de Ig e uma ou mais regiões J humanas de cadeia leve lambda de Ig em senti-

. do ascendente à região constante lambda do mamífero não humano hospe- deiro; e : (b) opcionalmente uma ou mais regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascendente à região constante do mamífero não humano hospedeiro; e em que a inserção do DNA de cadeia kappa ou lambda hu- mano é efetuada entre a região constante do mamífero não humano e a úl- tima, 3', região J do mamífero não humano.

3. Método para produção de um anticorpo ou cadeia leve ou pe- sada de anticopo específico para um antígeno desejado, caracterizado pelo fato de que compreende recuperar um anticorpo ou uma cadeia de anticorpo a partir de uma célula como definida na reivindicação 2.

4. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o genoma de mamífero não humano dentro do qual DNA é inserido compreende regiões V(D)J endóge- nas que não foram deletadas.

5. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mamífero não humano é um roedor ou a célula é uma célula de roedor.

6. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o genoma de mamífero não humano compreende DNA inserido de região variável humana de uma ca- deia pesada humana e cadeia leve humana, em que há: (a) uma pluralidade de regiões V humanas de IgH, uma ou mais regiões D humanas e uma ou mais regiões J humanas em sentido ascen- dente à região constante do mamífero não humano hospedeiro e em que a inserção do DNA de cadeia leve humana é em sentido ascendente à uma região constante da cadeia leve de mamífero não huma- no.

7. Método ou célula, de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zado pelo fato de que o mamífero é um camundongo ou a célula é uma célu- la de camundongo.

' 4/5 : 8. Método ou célula, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zado pelo fato de que a inserção do DNA de cadeia pesada humano é efetu- : ada em um genoma de camundongo entre as coordenadas 114.667.091 e

114.665.190 do cromossomo 12 de camundongo (coordenadas referem-se a NCBI m37, Abril 2007 ENSEMBL Release 55.37 h para a linhagem C57BL/6J de camundongo).

9. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a célula ou genoma de mamiífe- ro é modificado para prevenir ou reduzir expressão de anticorpos totalmente específicos para a espécie do hospedeiro, opcionalmente em que o genoma de mamífero não humano é modificado por inversão de toda ou de parte da região VDJ ou região VJ do mamífero não humano.

10. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o genoma do animal não hu- mano ou célula compreende DNA inserido de região variável humana de pelo menos uma cadeia pesada humana e cadeia leve humana.

11. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o genoma do animal não hu- mano ou célula não compreende DNA de região constante de outra célula ou organismo.

12. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o genoma do animal não hu- mano ou célula compreende uma sequência switch de rato.

13. Método ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações2 a12, caracterizado pelo fato de que a célula produtora de anticor- po é imortalizada.

14. Método ou célula, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizado pelo fato de que a célula é uma célula produtora de anticorpo imor- talizada por fusão a uma célula tumoral para fornecer célula e linhagem celu- lar produtora de anticorpos ou pode ser feita por imortalização celular direta.

15. Método para produção de um anticorpo ou cadeia de anti- corpo totalmente humanizado, caracterizado pelo fato de que compreende

É 5/5 S imunizar um mamífero não humano como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 4 a 11, e, em seguida, substituir a região constante do mamífero não humano de um anticorpo ou cadeia do anticorpo quimérico especificamente reativo com o antígeno com uma região constante humana, opcionalmente por engenharia do ácido nucleico codificador do anticorpo ou cadeia do anticorpo quimérico.

16. Uso de um anticorpo ou cadeia de anticorpo produzido pelo método ou célula, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ser em medicina ou na produção de uma composição farmacêutica.

17. Anticorpo ou cadeia de anticopo produzido pelo método, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 15, caracterizado pelo fato de ser para uso em medicina.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou cadeia de anticopo produzido pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 15, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou outro excipiente.

19. Derivado de anticorpo quimérico, caracterizado pelo fato de ser de um anticorpo quimérico produzido pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações | e3a15.

20. Invenção, em qualquer forma de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.

Figura 1 Três cadeias principais básicas de vetor Stuffer-iniciador 100 bp loxP AP FRT tree, ' ” EpUo TINA : — Iniciando cassete Braço de ditecio- 1 —) BAC-bb à namento == 1kb NR t Braço de direciona- Tracer meme Plasmídeo - cadeia principal | aan coco mento FR lScel FRT S lsiNeo fo BACDD Grande inserto: Vetor 1 kb BAC humano FRT IScei FRT BAC-bb kb Grande inserto: Vetor 2 BAC humano

Figura 2 Vetor de entrada / iniciação: Etapa 1 4 Eu Su Cc Bono" MA ox MM - co0 o maesxn— TETE 8 r BAC-bb & Direcionamento do cassete de iniciação para o intron J-C Puro do locus de Igi de camundongo 4 toxP FRT Cc [Ba FEET A — BAC-bb Validação:

1. LR-PCR/ Southern padrão de direcionamento de gene

2. Produzir quimeras e reproduzir em paralelo com a etapa seguinte.

Figura 3 Vetor de adição: Etapa 2 J4 toxP FRT Cc AI s— ET — OP ——— ES * ESPURO ASI ES BAChbb Huk-primer FRT X Gapped-BAC-bb FRT Grande inserto: Vetor 1 —= CNE 7) Construir o BAC humano e direcioná-lo e o para o focus de IgH o FRT Gap-R-primer S Genotipagem: Human 1 Pela linearização do vetor na mesma posição que a inserção da sequência stuffer é possível usar uma estratégia de genotipagem de reparo de gap, sendo esta PCR de curto alcance OS Seleção com G41 (1 kb) e altamente específica e que poderia ser universal 14 joxP FRT FRT FRT Cc —rAr EE — ms Human 1 EO —

Figura 4 Vetor de adição: Etapa 2 J4 HulA-primer Cc AD EED rimar 1 —"p HE toxP FRT FRT FRT & | ê 4 Y Hutá-primer Cc Human 1 — o—E— loxP FRT FRT Moprimer

Figura 5 Vetor de adição: Etapa 3A 4 C Human 4 —— —— toxP X FRT FRT ram a RATES Grande inserto: Vetor 2 S FRT — Gapped-BACOh FRT Cortar e aparar o BAC humano e direcioná-lo para o focus de IgH de camundongo usando o Human 2 mesmo sítio de linearização /Sce1 e estratégia de genotipagem de reparo dé gap. 4 C Hu2 Hu ———E— toxP FRT FAT FRT

Figura 6 Vetor de adição: Etapa 3B J4 Cc Hu 2 ui —— toxP FRT FRT FRT o À / ! 4 Hu2A-primer Cc e) h ETTA —. Hu2 —o— HW — Aa loxP FRT Hu18-primer

Figura 7 Vetor de adição: Etapa 4 J4 Cc Hu2 —b— HA loxP X FRT FRT 2— ENeg Grande inserto: Vetor 1 Gapped-BACbD BAC-bb Construir o BAC e direcioná-lo para Ss 6 locus de IgH de camundongo Z Human 3 J4 Cc Humans — ——m=— Human 2 —>- Hmant —E— J4 PA Cc Human 3 —— Human 2 — Human 1 —

Figura 8 Locus humanizado de /gH de camundongo o

R J4 Eu S Cc Human 5 dé d- Human 2 > Human 1 so loxP FRT FRT FRT FRT

Figura 9 Landing pad de BAC inserido no locus de IgH 114,667,091 O as XV o o E & DO EE E E S Vo & CS O EL CSS] au SE É SESI vrr1rdicmaeeemmmen CTT 7/7 ã loxP BAC landing pad FRT

CE PS » E RS É E o W Eu S o &o & & foxP BAC-bb FRT Validação:

1. LR-POR/ Southern padrão de direcionamento de gene

2. Produzir quimeras e testar a geração.

Figura 10 1º inserção de BAC — Etapa 1

KA E TS >

CO ZÉ O o” WWW —BAClandingpad Eu S EE É AZ Eee Fra —S o po ioxP FRT 5 Pos SS sa D7-27, 216 AR Gapped-vector FS SL LFLVY SOS +

R IS HHHHHH n EE HIHHE— AH FRT GapR-primer FRT . = do oo DD AIQSSNOSTOS & APS A o

SE FIG FG SEIS S FE SFESSFT FS S BAC 1 humano de IgH =| — seleção com G418 180 kb após corte e ajuste EE / SE

O E 07:27, as > p— Eu S; SS E em Pira —o—o—N--

FRT FRT > > + E CSS S O SE lmss —EHEHHEOA toxP FRT

Figura 11 1º inserção de BAC — Etapa 2

SE

07.27, J16 = EE Eu S .s HFHRNHHO po)

FAT FRT +” P QE PO E Apaes HH HH toxP FRT = 2 Expressão de FIpO Seleção com FIAU S 100% J-segments Z E 100% D-segments 6727 116 FRT cus o ão 6 functional V- segments HH —as—2— o d > o LV TESS 8 Esse NES) AHHH loxP FRT 100% de segmentos J — 100% de segmentos D - 6 segmentos V funcionais

Figura 12 2º inserção de BAC — Etapa 3 e SS D7-27 J16 E) S) EH! | n F > P 2 SY loxP BACIandingpad — FRT E SPSS VT E 3 E — EEE 8 >” Pa Huzprimeç FR XxX Gapped-vector FARTOS TE me eh = = PTE E BAC/2 humano de 'IgH P “*GapR-peimer o <P 136 kb depois de corte e ajuste a : Seleção com Puro

Figura 13 2º inserção de BAC - Etapa 4 Vo

FX D727 J16 Eu S So o HHHHHo sa H

É SC anã r o OP VOS E . = TRE I— A — 655 — AHHH à a RM ES Gap-R-primer nm ww x» E) Ed ” - FIpO expression Z * . F FIAU selection L—— Es E V Landing pad N

À SE 0727 JL6 Eu Su HHHHH— 2-5 o 2

FE É Landing pad ESSES o 7 > - s SS & õ ? Ap) A AAA HAHA

Figura 14 Landing pad de BAC em locus de IgK Ch6 de camundongo: 70.674.735

S SS o ra E O | E : > E Ea AA 11112=111] tutto 207000 cumes rem POSTE 77 R foxP BAClanding pad FRT e: 3 $ E = > : E E3' foxP BAC-bb FRT Validação:

1. LR-PCR/ Southern padrão de direcionamento de gene

2. Produzir quimeras e testar a geração.

Figura 15 1º inserção de BAC — Etapa 1 o SE o O sé E º SD oxP — RT ; Y EX MN sacos J Lfui-pamedRT Gapped-vector FRT vo vas fi : E . S Gap-R-prime; = | U É à. 1 & vao Vv5-2 VI v2-4 VvI-5 Vvr6 v3-7 À BAC 1 humano de IgK 175 kb após corte e ajuste Seleção com G418. u

É vet 1 So vas diria > gToda Ei É | pn ———— É E É) v15 v16 va-7 Eve so

Figura 16 1º inserção de BAC — Etapa 2 e vaca * 52 VA À —FRT med E ET E f—— Il +——n—A5—s—— vs vs vã? E vis É foxP —FgT > Es ss.

E a vs s Expressão de FlpO R Seleção com FIAU 100% J-segments e . S 6 functional V- Fegments . vs2 vas ) " ã N [ El & | (E ————s ves vs v37 Em v1-s S & vs 100% de segmentos J — 6 segmentos V funcionais

Figura 17 2º inserção de BAC — Etapa 3 o 2:4 3 52 Val ao FR E SS : A —li——s— E vs vis va? ES vas É JoxP aC landing pad — FRT à [ass E BAC 2 humano de IgKk ; vo 166 kb depois de corte e ajuste = X à

É Huz-primer FBT Gapped-vector FRT va24 V2-23V1-22 E V3-20 = FERE E E E Er -— EE S > EP vs em & o s E Er dm ESA V218 V210 V341 — Vito VLS VIM V34S VIGO VII | Seleção com Puro

Figura 18 2º inserção de BAC — Etapa 4 va-4 vao Vs2 Vaz AS fRT E SM PHiic—— A vis vt6 va vis VLA3 VL12 — V341 V230 Hoaprimer EM v1.9 A E E.

Re FloO expressio: 1 o.

E Is E) FIAU selection a VLIAV315 VIIJ6 VII7/2-18V2-19V3-20 EMEA vão E S E loxP BAClanding pad Vea VED3 e Va-5 v24 V3 V52 vaz 145 E É P——HAA HAHA É —+ 1 + vis v37 NE VE) V2:10 V311 Vil2 VB Em . ADA É R 8 F sã E ES A— E A HH o | EA loxP BAC landing pad V2-24 V2-23V1-22 V6-21 V3-20V1-19V2-18 VI-17/— VL-16. V3-15V2-14 100% de segmentos J; 14 segmentos V funcionais

Figura 19 Testes rápidos de células ES com /oci humanizados de IgH e IgK RAG -/- TryBrd ENS ANSA ESSA RIAA 7 CREME cs - E gnho/ So sh PER gkhy/ Pa leKkhu/- 200%) 1045% We" ê E sa TE, o AR, STERN ESSE AEE SA, 100% de células B 100% de células B origi- 20 80% derivado de originárias de células nárias de células ES ES ES inietadas injetadas

Figura 20 Geração de anticorpos em camundongos quiméricos com loci humanizados de lgH e Igk RAG -/- Cc TryBrd

SNCT EFE STE ME a lenhur ão 2 ler hu/- Po CAE ok hu/ CAE lgK hu/- E e eo EX se SO e ROAD RES SO SEDIA ANO Nm SE Ear AT ASSADOS SEE TRA ERAS TANDO B

S 10-15% NA 70-80% ? 100% e ; | Exposição a antígeno ER É PA, CE A ES FP : "> MEREÇO É " Es S " ss É 100% de células B originá- 100% de células B originárias 20- 80% rias de células ES injetadas de células ES injetadas derivado de

ES

Figura 21 Sitio de inserção ACI IA BET OS) : Mouse | RR I d s- pa

ESSE MABB6ST1

NM Nx Wa Ss HCHrI4: 106,365,585 HEhri4:105400.081 ausa Human " Mouse Já je VA TA Humas “ É NS t Human VD. l 4

É | F Incluindo seg humana de 400 bp depois de Hu J6 Sítio de inserção Sífio de incarrão MCRIZ 114 867 06) MONI2 17266709: (duplicação de 1 bp'de camundongo

Figura 22 Direcionamento do /andiíng pad Ma «F468?02!EIHOSEEIQATHETVWDTSNNEENEEEZAS e——— p— RA a A LO — FÉ A. [O Í LoxP Lox5171 ASS CDA ESET À cores — NE. o

PP ] HAT toxP Lox5i71

Figura 23 Inserção do 1º BAC tLoxP LtoxS171

NS TETE À cossoaaçe: N e LoxP Loo LoxSi71 mm Sm s BAC1 R l G418, 61G LloxP LoxZ272 Puro toxs171 BAC1

Figura 24 Cura da modificação em 3 LloxP Lox2272 tox5171 2

R ] Expressão de PB

FIAU toxP Lox2272 BAC 1

Figura 25 Inserção do 2º BAC loxP tox2272 BACL o LoxP toxs171 tox2272 Nm a BAC2 gg ]1 HAT, Puro LoxP tox5171 tox2272 Com > BAC1 BAC2

Figura 26 Retirando a modificação em 3' LtoxP Lox5171 Lox2272 pese A roca. ME EE so s ]1 Expressão de PB S

FIAU LoxP Lox5171 os EEE AEE, BAC2 —— BACL ——

Figura 27 Direcionando o vetor “Flip-Over” >10Mb LoxP Lox2272

BAC — ros EEE DEE: > LF At, FÊ To FP toxP Ts,

E NE <a) mem s

W ]1 Puro D LoxP LoxP Lox2272

Figura 28 Inversão LoxP toxP Lox2272 | 1 Expressão de CRE õ 2

R R to HAT?, Puro loxP Lox2272

Figura 29 Retirando todas as modificações LoxP

NM

FE

SR toxP Lox2272 Cos os QUEEN ro > ano — ]1 Expressão de PB 6TG, FIAU

Figura 30 RMCE sequencial — Integração no /landing pad ço, LoxP tons171, OD

DEI LÓ rs Landing pad de RMCE O Ne em cromossoma Pr Stuffer / BAC AS LtoxP Lox2272 tox5171 —. : o EI CNE & O Vetor da fasta R91 > É R21 transfectado com cassete de expressão de Cre M——u——»——Ú Seleção: Puro Puro + 6TG G418 G418 + 6TG Node colônias: — 239 220 360 198

Figura 31 Confirmação de inserção bem sucedida em landing pad Colônias: Resistente a 6-TG e Puro * > s APRENDA e g : Contunto de iniciador — (DI: 2900 24 corretos Conjunto de iniciador 5''"—= (AD) 23de24cometos Sumário: ESSAS AE CR ERDAEAENO EEE AA RREO Ez name DE nd Te scam O ae o | am o

Figura 32 Confirmação por PCR de cura de extremidade 3' Stuffer /BAC toxP Lox2272 LoXx5171 Cos E-ÓEE|os oo AEo>o> —, & o & 102272 Stuffer /BAC PB expression toxP lox / FIAU & 3 * Colônias resistentes a FIAU 1 23456 (Total do 50 de 10º cêldas) = GRRSEATGDDAO

E - CD % GM — Curabem sucedida - o Configuração original

Figura 33 Inserção de BAC nº 1 — Diagnóstico por PCR ua O ras

D N EE ” o BAC1 Ss + " EN . E qe Em EE BAC1 A<>X=610bp | Inserção Y<>B=478bp | correta ASs>1=390bp |: Configuração 2<>B=659bp | oriainal

Figura 34 Inserção de Bac nº 1 — Diagnóstico por POR * Wo 1 2 3 4 5 6 7 1 7 1 bo i 4 t : | : : Í = | UI IADE 3 RR ES | NESSE A<>X=610bp s10= Esto ".. : é ER | v 2-478b0 SA DEN o 1 À ASR cs FS E EDNA UM EN CAN = | : TT Fi É L | rodeios A E - As<>1=390bp | 659 = EUTANE : ESA bos la São - bmiA | Psi AR | 2<>B8=659bp | Jato oa o O *Os clones nº 2, 5 e 6 possuem BAC nº 1 inserido Os clones nº 1, 3, 4 e 7 provavelmente possuem BAC nº 1 inserido, mas as amostras estão misturadas com linhagens de células progenitoras.

Ê RESUMO Patente de Invenção: "MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO OU

É CADEIA LEVE OU PESADA DE ANTICORPO ESPECÍFICO PARA UM ANTÍGENO DESEJADO, PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO OU CA- DEIADE ANTICORPO TOTALMENTE HUMANIZADO, ANTICORPO OU CADEIA DE ANTIRCOPO E SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E DERIVADO DE ANTICORPO QUIMÉRICO". A presente invenção refere-se a métodos para a geração de an- ticorpos quiméricos humanos - não humanos e de cadeias quiméricas de anticorpos, anticorpos e cadeias de anticorpos assim produzidos, e seus de- rivados, incluindo anticorpos totalmente humanizados; composições com- preendendo os referidos anticorpos, cadeias e derivados dos anticorpos, bem como células, mamíferos não humanos e vetores, adequados para uso nos referidos métodos.