CN101679974B - 包含抗体替代轻链序列的构建体和文库 - Google Patents

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本发明涉及包含抗体替代轻链序列的构建体和文库。具体地，本发明涉及包含VpreB序列(任选地，与另一多肽诸如例如抗体重链可变域序列配偶的)的构建体及含有其的文库。

Description

包含抗体替代轻链序列的构建体和文库
发明领域
本发明涉及包含抗体替代轻链序列的构建体和文库。具体地，本发明涉及包含VpreB序列(任选地，与另一多肽诸如例如抗体重链可变域序列配偶的)的构建体及含有其的文库。
发明背景
由B淋巴细胞所生成的抗体(Ig)分子是由重(H)链和轻(L)链构成的。H和L链的氨基端域的氨基酸序列是可变的(VH和VL)，尤其在形成抗原结合位点的三个高变区(CDR1、CDR2、CDR3)处。H和L链的装配物通过L链的恒定区(CL)和重链的第一恒定区(CH1)之间的二硫键及通过VH和VL域之间的非共价相互作用而稳定化。
在人和许多动物(诸如小鼠)中，编码抗体H和L链的基因是通过编码V区各部分的基因片段的逐步体细胞重排而装配的。B淋巴细胞发育的各个阶段以Ig基因基因座的重排状态表征(参见例如Melchers，F.和Rolink，A.，《B-Lymphocyte Development and Biology》，Paul，W.E.编，1999，Lippincott，Philadephia)。
B细胞的前体(前B细胞)已经在骨髓中被鉴定为这样的淋巴细胞，它们生成μ重链，但是不是完全形成的轻链，而是表达一组分别称为VpreB(1-3)和λ5的B谱系特异性基因。
人VpreB1的主要同等型(CAG30495)是一种长145个氨基酸的多肽(SEQID NO：1)。它具有Ig V域样的结构，但是缺乏典型V域的最后的β链(β7)，并且具有与任何其它蛋白质没有显示序列同源性的羧基端末端。VpreB2具有数种同等型，包括142个氨基酸的小鼠VpreB2多肽(P13373；SEQ ID NO：2)、和长171个氨基酸的小鼠VpreB2序列剪接变体(CAA019641 SEQ ID NO：3)。VpreB1和VpreB2序列已经披露于EP 0 269 127和美国专利No.5,182,205；Collins等，Genome Biol.5(10)：R84(2004)；及Hollins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(14)：5552-5556(1989)。人VpreB3的主要同等型(SEQ ID NO：4)是一种 长123个氨基酸的蛋白质(CAG30496)，其披露于Collins等，Genome Biol.5(10)：R84(2004)。
VpreB(1-3)与另一种蛋白质λ5非共价结合。人λ5是一种209个氨基酸的多肽(CAA01962；SEQ ID NO：5)，它携带与抗体轻链具有强烈同源性的Ig C域样结构和朝向其氨基端末端的两个功能上独特的区域，其中之一与Vλ域的β7链显示了强烈的同源性。人λ5样蛋白具有213个氨基酸(NP 064455；SEQ IDNO：6)，而且与抗体λ轻链恒定区显示约84％的序列同一性。
关于进一步的详情，参见下列综述文章：Karasuyama等，Adv.Immunol.63：1-41(1996)；Melchers等，Immunology Today 14：60-68(1993)；及Melchers， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2571-2573(1999)。
VpreB和λ5多肽一起形成非共价结合的Ig轻链样结构，其称为替代轻链(surrogate light chain)或假轻链(pseudo light chain)。在早期前B细胞表面上，替代轻链与膜结合Igμ重链以二硫键连接，并与信号转导物CD79a/CD79b异二聚物结合以形成B细胞受体样结构，所谓的前B细胞受体(preBCR)。
发明概述
一方面，本发明涉及包含与异质氨基酸序列偶联的VpreB序列或λ5序列的多肽，其中所述多肽能够结合靶物。
在一个优选的实施方案中，所述多肽包含VpreB序列，其中VpreB可以是任何天然VpreB，包括人VpreB1(SEQ ID NO：1)、小鼠VpreB2(SEQ ID NO：2和3)和人VpreB3(SEQ ID NO：4)，或其在另一种哺乳动物物种中的同源物，或其片段或变体，只要所述多肽保留结合靶物的能力。
在一个优选的实施方案中，所述异质氨基酸序列是λ5序列，其可以是任何天然λ5序列，或其任何片段或变体，包括SEQ ID NO：5的天然人λ5序列、SEQ ID NO：6的人λ5样序列、及其片段和变体。
所述VpreB序列和所述异质氨基酸序列(例如λ5序列)可以是彼此直接融合的，或者可以是非共价结合的。在前一种情况中，优选地，所述融合分别在VpreB和λ5的CDR3类似区处或周围发生。
在另一个实施方案中，所述异质氨基酸序列是或包含抗体轻链可变区序列。在一个具体的实施方案中，所述抗体轻链可变区序列是在与抗体轻链CDR3区类似的位点处与所述VpreB序列融合的。在另一个实施方案中，所述 融合在抗体轻链的CDR3区和VpreB的CDR3类似区之间。在所有的实施方案中，所述抗体轻链可以是λ链或κ链。
在具体的实施方案中，本文中的多肽[包括但不限于VpreB-λ5偶联物(包括融合物、其它共价连接、和非共价结合)和VpreB-抗体轻链偶联物]可以进一步与包含抗体重链可变区序列(诸如抗体重链可变区)或完整抗体重链(包括可变区)的序列结合。
在所述多肽包含λ5序列时，λ5可以是任何天然λ5，包括SEQ ID NO：5的人λ5和SEQ ID NO：6的人λ5样蛋白，或另一种哺乳动物物种中的同源物，或其任何片段或变体，只要所述多肽保留结合靶物的能力。在一个具体的实施方案中，与所述λ5序列偶联的所述异质氨基酸序列是VpreB序列。
在本发明的多肽构建体中，VpreB和λ5序列(若都存在的话)可以是通过任何手段得到的偶联物，包括直接融合、通过接头序列(例如肽接头)实现的共价连接、和非共价结合。
在一个具体的实施方案中，VpreB序列和λ5序列的融合物通过非共价结合而与抗体重链序列偶联，以形成二聚体复合物。
在另一个实施方案中，通过VpreB序列、λ5序列和抗体重链序列的非共价结合而形成三聚体复合物。在某些实施方案中，在这些结构(它们也被称为“SURROBODYTM变体”的变异型替代轻链结构)中，VpreB和λ5部分之一或两者的特征性尾部(附属物)可以(但非必须)保留。有可能将别的功能性(functionality)附着于此类附属物。另外，在多个实施方案中，可以设计并制备有益的附属融合物，以便改善构建体的各种特性，诸如PK和/或效力。
在所有的实施方案中，在存在包含可变区序列的抗体重链时，本发明的多肽和抗体重链可变区序列可结合相同的或不同的靶物。
另一方面，本发明涉及此类多肽的文库。
又一方面，本发明涉及与包含可变区序列的抗体重链或其片段结合的此类多肽的文库。
在一个进一步的方面，本发明涉及包含任选地与抗体重链可变区序列结合的替代轻链序列的集合的文库。
在所有的方面，所述文库可以处于展示形式，诸如例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示、DNA展示、哺乳动物细胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白质-DNA连接的展示、和微珠展示。
本发明进一步涉及此类多肽和含有此类多肽的文库的各种用途，例如用于设计或选择具有想要的结合特异性和/或结合亲和力的抗体样分子，它们具有重要的治疗应用。
附图简述
图1显示了人VpreB1(SEQ ID NO：1)和人λ5(SEQ ID NO：5)与抗体λ链可变区(SEQ ID NO：27)和恒定区(SEQ ID NO：28)的比对。VpreB1与抗体λ链可变区共享一些序列相似性，而λ5与抗体λ链恒定区和框架区4共享一些相似性。框示的区域鉴定出分别与抗体λ链CDR1、CDR2和CDR3区相似的VpreB1和λ5序列。
图2是由VpreB和λ5序列所形成的替代轻链、包含替代轻链序列的例示性融合多肽、和自V-J连接衍生的抗体轻链结构的示意图。
图3是多种替代轻链删除和单链构建体的示意图。
图4示意性地显示了将组合功能多样性掺入替代轻链构建体中。
图5显示了多种例示性替代轻链构建体的基因和蛋白质结构。(Gly4Ser)3接头以SEQ ID NO：35公开。
图6是VpreB1序列(SEQ ID NO：1)与抗体λ5轻链可变区序列(分别为SEQID NO 29-31，按出现的次序)的比对。框示了具有最高程度序列相似性的区域。如该图中所示，VpreB1与λ5轻链可变区种系序列仅显示56％-62％(氨基酸2至97)的序列同一性。
图7是VpreB1序列与抗体λ5轻链恒定区序列的比对。如该图中所示，所比对的VpreB1序列与相应的抗体λ5轻链恒定区序列仅显示62％(氨基酸97至209)的序列同一性。图7按出现次序分别公开了SEQ ID NO 5和32。
图8是VpreB1序列与抗体κ轻链恒定区序列的比对。如该图中所示，所比对的VpreB1序列与相应的抗体κ轻链恒定区序列仅显示35％(氨基酸105至209)的序列同一性。图8公开了SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：5的残基1-208。
图9显示了将功能性添加至替代轻链(SLC)构件的多种例示性方式。
图10显示了SEQ ID NO：1的人VpreB1序列、SEQ ID NO：2和3的小鼠VpreB2序列、SEQ ID NO：4的人VpreB3序列、SEQ D NO：5的人λ5序列和SEQID NO：6的人λ5样蛋白质序列、和实施例中所使用的多种构建体的序列。
图11显示了本发明的多种三聚体和二聚体替代轻链构建体。
图12：替代轻链和所偶联的重链的检测。第1道：全长；第2道：λ5dT；第3道：VpreB dt；第4道：短的；第5道：SCL融合物1；第6道：SLC融合物2；第7道：抗体。
图13：SLC融合蛋白良好地表达并分泌入大肠杆菌(E.coli)的周质中，而且它们与来自IgG1而不是来自IgM的重链CH1最好地配偶。小图A：大肠杆菌中的SCL融合蛋白表达。小图B：IgG1γ链比IgMμ链更好地与SLC融合物配偶并纯化。
图14：经由抗噬菌体检测进行的噬菌体替代轻链构建体捕捉ELISA。
图15：哺乳动物细胞中所表达的纯化的替代轻链构建体结合病毒靶物。
图16：哺乳动物细胞中所表达的纯化的替代轻链构建体含有结合病毒抗原的稳定复合物。
图17：用大肠杆菌周质溶胞物进行的抗原结合。
图18：与中和性重链配对的替代轻链融合物构建体噬菌体容易结合H5HA抗原。
图19：与中和性重链配对的替代轻链构建体噬菌体结合抗原。
图20：汇总噬菌体展示实验结果的表。
图21和图22：第1轮和第2轮替代轻链融合物1和2的克隆分析结果。
发明详述
A.定义
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的一般理解相同的意义。Singleton等，《Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology》，第2版，J.Wiley & Sons(New York，NY1994)为本领域技术人员提供本申请中所使用的许多术语的一般指导。
本领域技术人员会认识到与那些本文中所描述的类似或等同的许多方法和材料，这些方法和材料可以用于实施本发明。实际上，本发明绝不限于所述方法和材料。出于本发明的目的，下列术语定义如下。
如本文中所使用的，术语“替代轻链”指通过VpreB和λ5蛋白的非共价结合所形成的二聚物。
术语“VpreB”在本文中以最广义使用，指任何天然序列或变异型VpreB多肽，明确包括但不限于SEQ ID NO：1的人VpreB1、SEQ ID NO：2和3的小鼠VpreB2、SEQ ID NO：4的人VpreB3和同等型，包括剪接变体和通过翻译后修饰所形成的变体，它们的其它哺乳动物同源物，以及这些天然序列多肽的变体。
术语“λ5”在本文中以最广义使用，指任何天然序列或变异型λ5多肽，明确包括但不限于SEQ ID NO：5的人λ5、SEQ ID NO：6的人λ5样蛋白、及其同等型，包括剪接变体和通过翻译后修饰所形成的变体，它们的其它哺乳动物同源物，以及这些天然序列多肽的变体。
术语“变异型VpreB多肽”和“VpreB多肽变体”可互换使用，在本文中定义为由于氨基酸修饰而与天然序列VpreB多肽在一个或多个氨基酸位置处不同的多肽。如本文中所定义的，“变异型VpreB多肽”会不同于天然抗体λ或κ轻链序列，或其片段。优选地，“变异型VpreB多肽”会保留至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％的与天然序列VpreB多肽的序列同一性。在另一个优选的实施方案中，“变异型VpreB多肽”在其氨基酸序列方面与天然抗体λ或κ轻链序列会是小于95％、或小于90％、或小于85％、或小于80％、或小于75％、或小于70％、或小于65％、或小于60％相同的。变异型VpreB多肽明确包括但不限于这样的VpreB多肽，其中VpreB序列C端的非Ig样独特尾部是部分或完全除去的。
术语“变异型λ5多肽”和“λ5多肽变体”可互换使用，在本文中定义为由于氨基酸修饰而与天然序列λ5多肽在一个或多个氨基酸位置处不同的多肽。如本文中所定义的，“变异型λ5多肽”会不同于天然抗体λ或κ轻链序列，或其片段。优选地，“变异型λ5多肽”会保留至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％的与天然序列λ5多肽的序列同一性。在另一个优选的实施方案中，“变异型λ5多肽”在其氨基酸序列方面与天然抗体λ或κ轻链序列会是小于95％、或小于90％、或小于85％、或小于80％、或小于75％、或小于70％、或小于65％、或小于60％相同的。变异型λ5多肽明确包括但不限于这样的λ5多肽，其中λ5序列N端的独特尾部是部分或完全除去的。
百分比氨基酸序列同一性可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))来确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可以自http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或以其它方式从国立卫生研究院(National Institute of Health，Bethesda，MD)获得。NCBI-BLAST2使用数项检索参数，其中所有那些搜索参数设置成缺省值，包括例如未遮掩＝是，链＝全部，期望发生＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多通过e值＝0.01， 多通过常数＝25，最终带缺口对比的降低(dropoff)＝25和评分矩阵＝BLOSUM62。
术语“VpreB序列”在本文中用于指如上文中所定义的“VpreB”的序列，或其片段。
术语“λ5序列”在本文中用于指如上文中所定义的“λ5”的序列，或其片段。
如本文中所定义的，术语“替代轻链序列”指包含如上文中所定义的“VpreB序列”和/或“λ5序列”的任何多肽序列。如本文中所定义的，“替代轻链序列”明确包括但不限于SEQ ID NO 1的人VpreB1序列、SEQ ID NO：2和3的小鼠VpreB2序列、和SEQ ID NO：4的人VpreB3序列，及其多种同等型，包括剪接变体和通过翻译后修饰所形成的变体，其在其它哺乳动物物种中的同源物，以及其片段和变体。另外，术语“替代轻链序列”包括但不限于SEQID NO：5的人λ5序列、SEQ ID NO：6的人λ5样序列、及其同等型，包括剪接变体和通过翻译后修饰所形成的变体，其在其它哺乳动物物种中的同源物，以及其片段和变体。另外，术语“替代轻链序列”包括包含如上文中所定义的VpreB和λ5序列两者的序列。
关于前B细胞受体(前BCR)的三维结构，包括替代轻链(SCL)及其构件的结构，参见例如Lanig等，Mol.Immunol.40(17)：1263-72(2004)。
任选地，“替代轻链序列”可以与异质氨基酸序列，或任何其它异质构件偶联以形成本文中的“替代轻链构建体”。如此，术语“替代轻链构建体”以最广义使用，包括任何和所有别的异质构件，包括与替代轻链序列偶联的异质氨基酸序列、核酸、和其它分子，其中“偶联”在下文定义。“替代轻链构建体”在本文中也称为“SURROBODYTM”，并且这两个术语可互换使用。
在本发明多肽的语境中，相对于第一氨基酸序列的术语“异质氨基酸序列”用于指与第一氨基酸序列非天然相关的、至少不处于其在本文中替代轻链构建体中的存在形式的氨基酸序列。如此，相对于VpreB的“异质氨基酸序列”是任何在其天然环境中与天然VpreB无关的氨基酸序列，包括但不限于这样的λ5序列，其不同于那些与VpreB一起形成发育中的B细胞上的替代轻链的λ5序列，诸如氨基酸序列变体，例如截短的和/或衍生化的λ5序列。相对于VpreB的“异质氨基酸序列”还包括与VpreB共价结合(例如融合)的λ5 序列，包括天然序列λ5，因为在它们的天然环境中，VpreB和λ5序列彼此不是共价结合(例如融合)的。异质氨基酸序列还包括但不限于抗体序列，包括抗体和重链序列及其片段，诸如例如抗体轻链和重链可变区序列，及抗体轻链和重链恒定区序列。
术语“偶联”指任何和所有形式的共价或非共价连接，包括但不限于直接的遗传或化学融合、经由接头或交联剂进行的偶联、和非共价结合，例如经由范德华力或通过使用亮氨酸拉链来实现。
术语“融合/融合物”在本文中用于指不同起源的氨基酸序列在一条多肽链中的组合，其通过以符合读码框的方式组合它们的编码核苷酸序列来实现。在与其末端之一的融合之外，术语“融合/融合物”明确涵盖内部融合/融合物，即在多肽链内插入不同起源的序列。
如本文中所使用的，术语“靶/靶物”指与本文中的多肽相互作用的物质。本文中所定义的靶物明确包括与本发明的含有VpreB的构建体相互作用的抗原。优选地，相互作用通过直接结合发生。
如本文中所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”均指通过共价“肽连接”接合的氨基酸一级序列。一般而言，肽由少数氨基酸组成，通常约2个至约50个氨基酸，并且比蛋白质短。本文中所定义的术语“多肽”涵盖肽和蛋白质。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指具有其领域公认的定义的氨基酸，诸如选自下组的氨基酸：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)，虽然经修饰的、合成的、或罕见的氨基酸也可以根据需要使用。如此，37CFR 1.822(b)(4)中所列出的经修饰的和不常见的氨基酸明确包括在该定义之内，并且通过提及而明确收入本文。氨基酸可以细分成多个亚组。如此，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷的侧链(例如Asp、Glu)；带正电荷的侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、和Tyr)。氨基酸还可以分组为小氨基酸(Gly、Ala)、亲核性氨基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水性氨基酸(Val、 Leu、Ile、Met、Pro)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)、和碱性氨基酸(Lys、Arg)。
术语“多核苷酸”指核酸诸如DNA分子和RNA分子及其类似物(例如使用核苷酸类似物或使用核酸化学所生成的DNA或RNA)。根据需要，多核苷酸可以以合成方式制备，例如使用本领域公认的核酸化学来实现或者使用例如聚合酶以酶法来实现，而且若想要的话，可以进行修饰。典型的修饰包括甲基化、生物素化、和其它本领域已知的修饰。另外，核酸分子可以是单链的或双链的，而且若想要的话，可以连接至可检测的模块。
关于参照多肽的术语“变体”指与天然多肽相比拥有至少一处氨基酸突变或修饰(即改变)的多肽。通过“氨基酸修饰”所生成的变体可以例如通过替代、删除、插入和/或化学修饰天然氨基酸序列中的至少一个氨基酸来产生。
“氨基酸修饰”指预定氨基酸序列的氨基酸序列变化。例示性修饰包括氨基酸替代、插入和/或删除。
在指定位置处的“氨基酸修饰”指指定残基的替代或删除，或邻近指定残基的至少一个氨基酸残基的插入。通过“邻近”指定残基的插入意指其1至2个残基之内的插入。插入可以在指定残基的N端或C端。
“氨基酸替代”指用另一种不同的“替换”氨基酸残基替换预定氨基酸序列中的至少一个现有氨基酸残基。替换残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码所编码的)，且选自下组：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。用一种或多种非天然存在的氨基酸残基进行的替代也为本文中的氨基酸替代的定义所涵盖。
“非天然存在的氨基酸残基”指除上文所列出的那些天然存在的氨基酸残基以外的残基，其能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如那些记载于Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)的。为了生成此类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等，Science244：182(1989)和Ellman等，见上文的规程。简言之，这些规程牵涉用非天然 存在的氨基酸残基化学活化抑制型tRNA，接着是RNA的体外转录和翻译。
“氨基酸插入”指至少一个氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。虽然插入通常会由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但是本申请涵盖更大的“肽插入”，例如约3个至约5个或者甚至多至约10个氨基酸残基的插入。所插入的残基可以是如上文所公开的天然存在的或非天然存在的。
“氨基酸删除”指从预定的氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。
除非另有说明，术语“诱变”指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域公认的技术。优选的诱变类型包括易错PCR诱变、饱和诱变、或其它定点诱变。
“定点诱变”是本领域中的标准技术，并使用如下的合成寡核苷酸引物进行，所述合成寡核苷酸引物与要诱变的单链噬菌体DNA互补，只是有有限的错配，其代表想要的突变。简言之，使用合成的寡核苷酸作为引物来指导与单链噬菌体DNA互补的链的合成，并将所得的双链DNA转化入支持噬菌体的宿主细菌中。将经转化细菌的培养物铺板于上层琼脂中，容许自含有噬菌体的单细胞形成噬斑。理论上，50％的新噬斑会含有具有作为单链的突变形式的噬菌体；50％会具有最初的序列。通过在一定温度与经激酶处理的合成引物杂交来选择感兴趣的噬斑，所述温度容许精确匹配发生杂交，但是在此温度与最初链的错配足以阻止杂交。然后选择与探针杂交的噬斑，测序并培养，并回收DNA。
在本发明的语境中，术语“抗体”(Ab)用于指来自自V(D)J基因重组衍生的经典重组重链和也自VJ基因重组衍生的经典重组轻链的天然抗体，或其片段。
“天然抗体”是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过共价二硫键与重链连接，但不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目有所不同。每条重链和轻链还具有间隔规则的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，随后是许多恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，在其另一端具有一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的界面，Chothia等，J.Mol.Biol.186：651(1985)；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：4592(1985)。
关于抗体链的术语“可变的”用于指抗体链中在抗体间序列差异广泛并参与每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的部分。此类变异型集中于轻链和重链可变域中称为高变区的3个区段中。可变域中更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含4个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，框架区主要采取β-片层构型，由3个高变区连接，高变区形成连接β-片层结构的环，并在某些情况中形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密相邻地保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)，第647页-第669页)。恒定域不直接牵涉抗体与抗原的结合，但是展现出多种效应器功能，诸如在抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变域中的残基30-36(L1)、46-55(L2)和86-96(L3)和重链可变域中的30-35(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)；MacCallum等，J.Mol.Biol.262(5)：732-45(1996)。
术语“框架区”指抗体可变区中更趋异的CDR区之间所存在的本领域公认的部分。这些框架区通常称为框架1至4(FR1、FR2、FR3、和FR4)，并为在三维空间中保持重链或轻链抗体可变区中找到的3处CDR提供支架，使得CDR能形成抗原结合表面。
根据其重链恒定域氨基酸序列，抗体可归入不同的类。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的数种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
与不同类的免疫球蛋白相对应的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、和μ。
基于其恒定域的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”归入两种截然不同的型之一，称为卡帕(kappa，κ)和拉姆达(lambda，λ)。本文中对抗体轻链的任何提及包括κ和λ轻链两者。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变域。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、和(scFv)2片段。
如本文中所使用的，术语“抗体结合区”指免疫球蛋白或抗体可变区中能够结合抗原的一个或多个部分。通常，抗体结合区是例如抗体轻链(VL) (或其可变区)、抗体重链(VH)(或其可变区)、重链Fd区、组合的抗体轻链和重链(或其可变区)诸如Fab、F(ab’)2、单域、或单链抗体(scFv)、或全长抗体，例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“表位”指至少约3至5个，优选至少约5至10个，或至少约5至15个氨基酸，且通常不大于约500个，或约1,000个氨基酸的序列，这些氨基酸定义通过自身或作为更大序列的一部分而与应答此序列所生成的抗体结合的序列。表位不限于具有与衍生其的亲本蛋白质的一部分相同的序列的多肽。实际上，病毒基因组处于不断变化的状态，并且在分离群之间展现出相对高度的变异性。如此，术语“表位”涵盖与天然序列相同的序列，以及对天然序列的修饰，诸如删除、替代和/或插入。一般而言，此类修饰本质上是保守的，但是也涵盖非保守修饰。该术语明确包括“模拟表位”，即这样的序列，其没有鉴定出连续的线性天然序列或者不必在天然蛋白质中存在，但是在功能上模拟天然蛋白质上的表位。术语“表位”明确包括线性或构象性表位。
术语“载体”用于指能够在细胞中自主复制，并且DNA区段(例如基因或多核苷酸)能与其可操作连接以便引起附着区段复制的rDNA分子。能够指导编码一种或多种多肽的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列包括例如启动子、任选的操纵基因序列、及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、及增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的定位促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
“噬菌体展示文库”是蛋白质表达文库，其将所克隆的蛋白质序列的集合表达为与噬菌体外壳蛋白的融合物。如此，短语“噬菌体展示文库”在本文中指噬菌体(例如丝状噬菌体)的集合，其中所述噬菌体表达外部(通常为异源)蛋白质。外部蛋白质自由地与和噬菌体接触的其它模块相互作用(结合)。每个展示外部蛋白质的噬菌体都是该噬菌体展示文库的“成员”。
术语“丝状噬菌体”指能够在其表面上展示异质多肽的病毒颗粒，包括但不限于f1、fd、Pf1和M13。丝状噬菌体可以包含选择标志，诸如四环素(例如“fd-tet”)。各种丝状噬菌体展示系统是本领域技术人员公知的(参见例如Zacher等，Gene 9：127-140(1980)；Smith等，Science 228：1315-1317(1985)；及Parmley和Smith，Gene 73：305-318(1988))。
术语“淘选(panning)”用于指在对携带对靶物具有高亲和力和特异性的化合物(诸如抗体)的噬菌体的鉴定和分离中的多轮筛选过程。
B.详细描述
用于实施本发明方法的技术是本领域公知的，并记载于标准实验室教科书中，包括例如Ausubel等，《Current Protocols of Molecular Biology》，JohnWiley and Sons(1997)；《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第三版，J.Sambrook和D.W.Russell编，Cold Spring Harbor，New York，USA，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001；O’Brian等，《Analytical Chemistry of BacillusThuringiensis》，Hickle和Fitch编，Am.Chem.Soc.，1990；《Bacillus thuringiensis：biology，ecology and safety》，T.R.Glare和M.O’Callaghan编，John Wiley，2000；《Antibody Phage Display，Methods and Protocols》，Humana Press，2001；及《Antibodies》，G Subramanian编，Kluwer Academic，2004。例如，诱变可以使用定点诱变来进行(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985))。PCR扩增方法记载于美国专利号4,683,192；4,683,202；4,800,159；和4,965,188，及数本教科书，包括《PCRTechnology：Principles and Applicationsfor DNA Amplification》，H.Erlich编，Stockton Press，New York(1989)；及《PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications》，Innis等编，AcademicPress，San Diego，Calif.(1990)。
本发明涉及包含抗体替代轻链序列的构建体和文库。
替代轻链构建体
如上文所讨论的，前B细胞已经在骨髓中被鉴定为这样的淋巴细胞，它们生成u重链，但是不是完全形成的轻链，而是表达一组分别称为VpreB(1-3)和λ5的B谱系特异性基因。VpreB和λ5多肽一起形成非共价结合的Ig轻链样结构，其称为替代轻链。替代轻链虽然不是抗体链，但是与所有抗体重链天然结合，而且已经显示了替代轻链-抗体重链复合物结合自身抗原。
一方面，本发明提供了包含VpreB和/或λ5序列且具有结合靶物能力的多肽。所述靶物可以是任何如下的肽或多肽，其是本发明的含有VpreB和/或λ5序列的多肽的结合配偶体。靶物明确包括在抗体结合的语境中通常称为“抗原”的所有类型的靶物。
如此，本发明的多肽包括但不限于VpreB序列与异质氨基酸序列的偶联物，只要它们保留结合想要的靶物的能力。VpreB序列与异质氨基酸序列的结合可以是共价的或非共价的，并且可以直接发生，或者经由接头(包括肽接头)发生。
本文中多肽构建体的具体例子包括这样的多肽，其中VpreB序列(诸如VpreB1、VpreB2、或VpreB3序列，包括天然序列的片段和变体)是与λ5序列(包括天然序列的片段和变体)偶联的。图2和11中显示了这种类型的代表性融合物，并在实施例中进行描述。
在直接的融合物中，VpreB序列(例如VpreB1、VpreB2或VpreB3序列)的C端通常与λ5序列的N端相融合。虽然有可能融合全长的天然VpreB序列与全长λ5序列(参见例如图3中的第一示图)，但是融合通常在两种多肽之每一个中的CDR3类似位点处或周围发生。图1中显示了VpreB1和λ5的此类CDR3类似位点，并在图2中显示了代表性融合构建体。在这种实施方案中，融合可以在CDR3类似区内或在CDR3类似区的任一侧的约10个氨基酸残基内的位置处发生。在一个优选的实施方案中，融合在天然人VpreB1序列(SEQ IDNO：1)的约氨基酸残基116-126之间和天然人λ5序列(SEQ ID NO：5)的约氨基酸残基82和93之间发生。
还有可能融合VpreB序列至抗体λ轻链的CDR3区，如图2中所示。图3中显示了别的构建体，其中VpreB和λ5中仅一个是截短的。可以使用抗体κ轻链序列来制备类似的构建体。
在图11的右侧显示了别的直接融合构建体。称为“SLC融合物1”的结构是四聚物，由两个二聚物构成，其中截短的V-preB1序列(缺乏天然VpreB1 C 端的特征性“尾部”)与类似截短的λ5序列的融合物与抗体重链非共价结合。称为“SLC融合物2”的结构是四聚物，由两个二聚物构成，其中截短的VpreB1序列(缺乏天然VpreB1C端的特征性“尾部”)与抗体轻链恒定区的融合物与抗体重链非共价结合。称为“SLC融合物3”的结构是四聚物，由两个二聚物构成，其中抗体轻链可变区与截短的λ5序列(缺乏天然λ5N端的特征性“尾部”)的融合物与抗体重链非共价结合。
如上文所记录，在直接的融合物之外，本发明的多肽构建体包括VpreB序列(包括天然序列的片段和变体)与异质序列诸如λ5序列(包括天然序列的片段和变体，和/或抗体序列的非共价结合。如此，例如全长VpreB序列可以与截短的λ5序列非共价结合。或者，截短的VpreB序列可以与全长λ5序列非共价结合。
在图11的左侧显示了与抗体重链非共价结合的，包含非共价结合的VpreB1和λ5序列的替代轻链构建体。如多个图示显示，所述结构可以包括例如全长VpreB1和λ5序列、与截短的λ5序列结合的全长VpreB1序列(“λ5dT”)、与全长λ5序列结合的截短的V-preB1序列(“VpreB dT”)和与截短的λ5序列结合的截短的VpreB1序列(“短的”)。
虽然图11显示了某些特定的构建体，但是普通技术人员会领会，可以以类似的方式制备和使用多种其它构建体。例如，与图11中所显示的结构相反，所述结构可以是不对称的，在每个臂中包含不同替代轻链序列，和/或具有三聚体或五聚体结构。还有可能在本发明的替代轻链构建体的各个部分中包括不同功能性，由此产生多特异性和/或多价构建体。
若想要的话，本发明的构建体可以进行工程化改造，例如通过将来自抗体(包括已知的治疗性抗体)CDR1、CDR2和/或CDR3区的已知序列或序列基序掺入或附加入替代轻链序列的CDR1、CDR2和/或CDR3类似区中来实现。这容许创建如下分子，所述分子不是抗体，但是会展现出与已知的治疗性抗体的结合特异性和亲和力非常类似的结合特异性和亲和力。
本文中的所有替代轻链构建体可以与抗体序列相结合。例如，如图5中所示，VpreB-λ5融合物可以通过肽接头而与抗体重链可变区序列相连接。在另一个实施方案中，VpreB-λ5融合物与抗体重链或其包括可变区序列的片段非共价结合，以形成二聚体复合物。在又一个实施方案中，VpreB和λ5序列彼此及与抗体重链或其包括可变区序列的片段非共价结合，由此形成三聚体 复合物。图11中显示了包含抗体重链的例示性构建体。
虽然通过提及某些实施方案来例示本发明的构建体，但是普通技术人员会理解，通过对替代轻链和抗体序列的各种变换所获得的许多别的实施方案也是有可能的，并且在本发明的范围之内。本发明包括所有如下构建体，所述构建体包含替代轻链序列，并具有结合想要的靶物的能力。在某些实施方案中，所述构建体还具有与抗体重链可变区序列结合的能力。
可以使用本发明的构建体来建造替代轻链序列的文库，与抗体文库类似地，其可以用于多种目的，包括选择具有想要的结合特异性和亲和力的构建体。
在VpreB和λ5替代轻链序列彼此非共价结合时，这两种构件之一或二者的游离末端(即VpreB序列的C端末端和/或λ5序列的N端末端)可用于将别的多样性掺入此类序列的文库中。例如，可以将随机肽文库附加或替代至这些游离末端之一，并淘选对特定靶物的特异性结合。通过组合鉴定成具有想要的结合特异性的替代轻链与来自针对同一靶物的抗体的重链或重链片段，可以创建如下分子，所述分子具有在两个不同位置上结合关联靶物的能力。与在二聚体免疫球蛋白中所看到的亲合力效应类似地，这种串联结合或“螯合”效应强烈地加强对单一靶物的结合。还有可能使用结合不同靶物的构件。如此，例如，可以将具有想要的结合特异性的替代轻链构件与结合不同靶物的抗体重链或重链片段组合。例如，替代轻链构件可以结合肿瘤抗原，而抗体重链或重链片段可以结合效应细胞。这样，可以创建具有靶向和抗肿瘤活性的单一实体(entity)。在一个具体的实施方案中，连接VpreB和λ5序列的附加物或多肽可以是抗体或抗体片段，诸如Fab或scFv片段。抗体序列的掺入不仅会创建“鳌合”效应，而且还可以在不需要第二独立臂(诸如双特异性抗体中找到的)的情况中在单个分子中产生双特异性。两种特异性可以是针对同一靶物的不同部分，或者针对不同靶物，或者针对靶物抗体复合物。类似地，可以用不同于抗体或抗体片段的任何类型的分子(包括肽、蛋白质、酶等)来制备多特异性构建体。例如，可以将具有想要的特异性的替代轻链构件与任何治疗性肽或蛋白质组合。
替代轻链构建体的制备
可以通过本领域中已知的方法来制备本发明的替代轻链构建体，包括重组DNA技术的公知技术。
可以自天然来源(例如发育中的B细胞)分离和/或通过合成或半合成方法获得编码替代轻链(例如VpreB和λ5多肽)的核酸。一旦鉴定并分离或以其它方式生成这种DNA，则可以将它连接入可复制的载体中以进行进一步克隆或表达。
可用于表达本文中多肽编码序列的克隆和表达载体是本领域公知的，并且是商品化的。载体构件通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。适用于克隆或表达本文载体中编码替代轻链构建体的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母、或高等真核生物(哺乳动物)细胞，优选哺乳动物细胞。
合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括但不限于经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；为了在悬浮培养中生长而亚克隆的人胚肾系293(293细胞)(Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。
为了在哺乳动物细胞中使用，常常由病毒材料提供对表达载体的控制功能。如此，通常使用的启动子可以衍生自多瘤病毒、腺病毒2、逆转录病毒、巨细胞病毒、和猿病毒40(SV40)的基因组。其它启动子(诸如β-肌动蛋白启动子)源自异源来源。合适启动子的例子包括但不限于SV40病毒的早期和晚期启动子(Fiers等，Nature，273：113(1978))、人巨细胞病毒的立即早期启动子(Greenaway等，Gene，18：355-360(1982))、和通常与想要的基因序列有关的启动子和/或控制序列，只要此类控制序列与宿主细胞系统相容。
高等真核生物转录编码想要的异源多肽的DNA可以通过将增强子序列插入载体中而得到增加。增强子是对启动子起作用而增加其转录启动活性的顺式作用DNA元件，通常为约10-300bp。增强子相对与取向和位置无关，但 是优选定位于表达载体中所存在的启动子序列的上游。增强子可以与启动子源自相同的来源，诸如例如来自真核细胞病毒，例如复制起点的晚期侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的晚期侧上的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。
哺乳动物宿主细胞中所使用的表达载体还含有多腺苷酸化位点，诸如那些衍生自病毒诸如例如SV40(早期和晚期)或HBV的。
复制起点可以通过载体的构建来提供以包括外源起点，诸如可以是衍生自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)来源的，或者可以由宿主细胞提供。
表达载体通常含有选择标志，其编码用该载体转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。适用于哺乳动物细胞的选择标志的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、和新霉素。
合适的哺乳动物表达载体是本领域公知的，而且是商品化的。如此，例如，可使用pCI表达载体(Promega)在哺乳动物宿主细胞中生成本发明的替代轻链构建体，pCI载体携带人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子区，以促进DNA插入物的组成型表达。载体可以含有作为选择标志的新霉素磷酸转移酶基因。
还可以在细菌宿主细胞中生成本发明的替代轻链构建体。在细菌系统中使用的控制元件包括启动子(任选地含有操纵基因序列)和核糖体结合位点。合适的启动子包括但不限于半乳糖(gal)、乳糖(lac)、麦芽糖、色氨酸(trp)、β-内酰胺酶启动子、噬菌体λ和T7启动子。另外，可以使用合成的启动子，诸如tac启动子。细菌系统中使用的启动子通常还含有与编码Fab分子可操作连接的Shine-Dalgarno(SD)序列。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌。
包含抗体替代轻链序列的多链构建体内的各条链的编码序列可以存在于同一表达载体中，在分开的调控序列控制之下，或在分开的表达载体中，用于共转染想要的宿主细胞，包括真核的和原核的宿主。如此，可使用购自Novagen的DuetTM载体来共表达多种基因。
可以在多种培养基中培养经转化的宿主细胞。用于培养哺乳动物宿主细胞的商品化培养基包括Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)(Sigma)。此 外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)和Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。培养条件(诸如温度、pH等)就是那些先前与为表达所选择的宿主细胞一起使用的，并且包括在制造商的说明书中或者以其它方式对于普通技术人员会是显而易见的。
适用于培养哺乳动物、细菌(例如大肠杆菌)或其它宿主细胞的别的培养基还记载于标准教科书中，诸如例如Sambrook等，见上文或Ausubel等， 见上文。
可以通过本领域中已知的方法来实施纯化。在一个优选的实施方案中，使用Ni-NTA纯化系统(Invitrogen)，以带6xHis标签的形式纯化替代抗体分子。
包含替代轻链序列的文库
本发明进一步涉及替代轻链序列的各种文库和包含此类序列的构建体。如此，此类文库可包含替代轻链序列(诸如本发明的含有VpreB和/或λ5的构建体，包括但不限于那些上文明确描述的，图中所显示的和/或实施例中所描述的)的展示，基本上由其组成，或由其组成。
本发明的文库优选处于展示形式。用于展示异源蛋白质(包括抗体和其它多肽)的系统是本领域公知的。已经在编码抗体基因的丝状噬菌体表面上展示了抗体片段(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，222：381-388(1992)；McCafferty等，Nature 348(6301)：552-554(1990)；Griffiths等，EMBO J.，13(14)：3245-3260(1994))。关于用于选择和筛选抗体文库的技术的综述，参见例如Hoogenboom，Nature Biotechnol.23(9)：1105-1116(2005)。另外，有本领域中已知的用于在大肠杆菌(Agterberg等，Gene 88：37-45(1990)；Charbit等， Gene 70：181-189(1988)；Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2713-2717(1992))和酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))(Boder和Wittrup， Nat.Biotechnol.15：553-557(1997)；Kieke等，Protein Eng.10：1303-1310(1997))表面上展示异源蛋白质及其片段的系统。其它已知的展示技术包括核糖体或mRNA展示(Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022-9026(1994)；Hanes和Pluckthun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4937-4942(1997))、DNA展示(Yonezawa等，Nucl.Acid Res.31(19)：e118(2003))；微生物细胞展示诸如细菌展示(Georgiou等，Nature Biotech.15：29-34(1997))、哺乳动物细胞上的展示、孢子展示(Isticato等，J.Bacteriol.183：6294-6301(2001)；Cheng等，Appl.Environ.Microbiol.71：3337-3341(2005)和2006年11月13日提交的共同悬而未 决的临时申请流水号60/865,574)、病毒展示诸如逆转录病毒展示(Urban等， Nucleic Acids Res.33：e35(2005)、基于蛋白质-DNA连接的展示(Odegrip等， Proc.Acad.Natl.Sci.USA 101：2806-2810(2004)；Reiersen等，Nucleic AcidsRes.33：e10(2005))和微珠(microbead)展示(Sepp等，FEBS Lett.532：455-458(2002))。
出于本发明的目的，可使用任何展示技术(包括噬菌体展示和孢子展示)来有利地展示含有替代轻链的文库。
在噬菌体展示中，将异源蛋白质(诸如替代轻链多肽)连接至噬菌体颗粒的外壳蛋白，而表达它的DNA序列包装在噬菌体外壳之内。噬菌体展示方法的详情可见于例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)，该文献记载了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集在体外生成人抗体和抗体片段。依照此技术，以符合读码框的方式将抗体V域基因克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性特性的选择也导致对编码展现出那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。
噬菌体展示可以多种形式实施；关于它们的综述，参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。可经由噬菌体展示来发现重链V基因区段的数种来源。Clackson等， Nature 352：624-628(1991)从自经免疫小鼠的脾衍生的V基因小型随机组合文库分离了一批不同的抗噁唑酮重链和轻链。可构建来自未免疫人供体的重链和轻链V基因全集，并回收对一批不同抗原(包括自身抗原)特异性的，基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所记载的技术进行。可以修改这些技术及本领域中已知的其它技术来展示任何多肽，包括包含替代轻链序列的多肽及其它构建体。如此，例如，可以用来自天然多样来源(诸如淋巴细胞)的重链集合，或者来自完全经由分子生物学技术创建的以合成方式生成的集合的重链集合来补足替代轻链。可以通过本领域中已知的方法来克隆、表达和选择这些集合。选定的所得SURROBODyTM可以直接使用，作为多聚体分子表达，或者经由重链优化或替代轻链优化而进一步优化，例如使用随机或非随机位点特异性或区域性诱变。
孢子展示系统是基于将要展示的序列附着于外壳蛋白，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子外壳蛋白。孢子原生质体(核心)环绕有细胞壁、皮层、和孢子外壳。根据物种，也可存在孢子外壁。核心壁由与营养细胞壁相同类型的肽聚糖构成。孢子展示(包括使用枯草芽孢杆菌孢子外壳成分(CorB)的表面展示系统和苏云金芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Bt)孢子展示)记载于Isticato等，J.Bacteriol.183：6294-6301(2001)；Cheng等，Appl.Environ.Microbiol.71：3337-3341(2005)，在此通过提及明确收录它们的完整公开文本。多种孢子展示技术还记载于美国专利申请公开文本号20020150594；20030165538；20040180348；20040171065；及20040254364，在此本文通过提及明确收录它们的完整公开文本。
孢子展示系统的优点在于非真核性质的同质颗粒表面和颗粒大小，预期提供理想的非反应性背景。另外，孢子的颗粒大小足以能够通过流式细胞术进行选择，所述流式细胞术基于相互作用而容许可选择克隆分离。
通过影响(leveraging)孢子稳定性，有可能实施多种孢子形成后的化学的、酶的和/或环境的处理和修饰。如此，有可能使用三氟乙醇(TFE)用化学处理来稳定化结构性螺旋结构，在展示此类结构时。另外，氧化压力处理(诸如用反应性氧种类(例如过氧化物)或反应性氮种类(例如亚硝酸)进行的处理)是可能的。还有可能将孢子展示多肽的限定的或初级(crude)的群体暴露于酶促处理，诸如蛋白水解暴露、其它酶促过程、磷酸化等。其它可能的处理包括但不限于通过过氧亚硝酸盐处理进行的亚硝基化，通过重组的、纯化的或血清的蛋白酶处理进行的蛋白水解，照射，与已知的伴侣蛋白诸如热休克蛋白(细菌的和哺乳动物的两者)一起共温育，用折叠蛋白质(诸如蛋白质二硫键异构酶、脯氨酰异构酶等)进行的处理，冻干，和防腐剂样处理(诸如用硫柳汞进行的处理)。这些处理可通过本领域中公知的方法进行。
可以在所有的孢子展示系统中使用类似的技术，包括附着于孢子外壳蛋白的展示，包括例如所披露的孢子展示系统。
替代轻链序列、含有其的构建体和文库的用途
本发明的文库可用于鉴定具有想要的特性的替代轻链序列和替代轻链构建体，诸如包含替代轻链序列的融合物。例如，对本文中文库的体外或体内筛选可产生包含以高结合特异性和亲和力结合想要的靶物的替代轻链序列的多肽。如此，本文中的文库可用于鉴定用于治疗和诊断目的的分子，诸 如包含结合肿瘤标志物或治疗性干预的其它分子靶物的替代轻链序列的多肽。另外，通过上文所描述的技术，可以对替代轻链多肽的高度多样文库进行工程化改造，包括包含结合相同靶物的多肽的集合的文库，结合不同靶物的多肽的文库，具有多特异性的多肽的文库等。
由于它们结合任何想要的靶物的能力，本发明的抗体替代轻链构建体可以在分析和诊断测定法中使用，用以检测想要的靶分子(诸如肿瘤抗原或与疾病状态或疾患有关的任何多肽)的存在。另外，本发明的替代轻链构建体可以在诸如例如癌症疗法中作为治疗剂使用，以靶向已经确定与癌症的形成和/或扩散有关的肿瘤抗原。
在下列非限制性实施例中提供了本发明的进一步详情。
实施例
实施例1：作为结合域蛋白质的VpreB和含有它的融合物
为了制备VpreB结合域，以重组方式创建了图5中所示的单一蛋白质。SLC结合域蛋白质构建体由来自VpreB1的氨基酸20至121和来自λ5的氨基酸87至105构成。若想要的话，为了创建新的且特异性的结合能力，依照结构或序列证据来对分子再次进行工程化改造。另外/或者，或是随机地(通过例如易错PCR)或是直接地(通过用氨基酸集合进行的单位点或多位点特异性的诱变)来创建变体集合。然后将所得的克隆或集合与pIII以符合读码框的方式克隆，供噬菌体或噬菌粒展示中使用。将这种噬菌粒构建体转化入TG1细胞中。接着，将单集落在补充有50μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LuriaBroth(LB)中增殖，直至其达到OD600约0.3，并在不进行摇动的情况中于37℃用MK307辅助噬菌体感染30分钟。然后将细胞沉淀，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素的LB中重悬，并容许在剧烈通气的情况中于30℃生长过夜。次日，在噬菌体ELISA中使用含有噬菌粒表达的SLC-HC融合蛋白的上清液以确定靶向结合。简言之，ELISA需要用人TNF-α包被和封闭ELISA板，接着将SLC-HC噬菌体于4℃温育2小时，用PBS-Tween-20(0.05％)清洗和用抗m13-HRP抗体直接检测。或者，如下评估结合，即直接扩增或洗脱所结合的噬菌体，并使用XL-1Blue细胞来测定噬菌体滴度。本实施例描述了作为单克隆的SLC结合域融合物，但是这种SLC可以与识别共同靶物的其它异源序列以重组方式重组，并作为文库筛选。此外，这种SLC结合蛋白可 以与先前选定的重链集合组合，并直接针对感兴趣的相同靶物或感兴趣的第二靶物进行筛选以创建双特异性分子。或者，可以通过与未选择的重链集合联合进行的筛选来发现这种加强的结合或双特异性结合。另外，虽然本实施例提及抗体重链，但是应当理解不需要整个重链。包含重链可变区序列(在没有重链恒定区的情况中)或整个重链恒定区的单链融合物可以以类似的方式制备，并且在本实施例的范围之内。
实施例2：作为可变重链(VH)配偶体的VpreB融合物
以重组方式创建图5的第二幅图中所显示的功能性VpreB-λ5融合蛋白(称为“VpreB蛋白融合物——二聚体复合物”)。VpreB-λ5融合蛋白由m13基因III信号序列、来自VpreB1的氨基酸20至115和来自λ5的氨基酸83至209构成。将此构建体与以符合读码框的方式与pIII在一起的可变重链-CH1融合物共表达，供噬菌体或噬菌粒展示中使用。使用来自抗TNF-α抗体D2E7的VH编码序列作为VH编码序列，而CH1是人IgG1的CH1区。将这种噬菌粒构建体转化入TG1细胞中。接着，将单集落在补充有50μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的Luria Broth(LB)中增殖，直至其达到OD600约0.3，并在不进行摇动的情况中于37℃用MK307辅助噬菌体感染30分钟。然后将细胞沉淀，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素的LB中重悬，并容许在剧烈通气的情况中于30℃生长过夜。次日，在噬菌体ELISA中使用含有噬菌粒表达的SLC-HC融合蛋白的上清液以确定靶向结合。简言之，ELISA需要用人TNF-α包被和封闭ELISA板，接着将SLC-HC噬菌体于4℃温育2小时，用PBS-Tween-20(0.05％)清洗和用抗m13-HRP抗体直接检测。或者，可以如下评估结合，即直接扩增或洗脱所结合的噬菌体，并使用XL-1Blue细胞来测定噬菌体滴度。本实施例描述了作为单克隆的与重链可变-CH1融合物配偶的SLC融合物，但是这种SLC还可以与识别共同靶物的重链可变区的聚焦集合组合，并作为文库筛选。此外，这种SLC融合物可以与未选择的重链集合组合，并直接针对感兴趣的靶物进行筛选。作为合理的SLC融合物备选方案，可以通过融合来自传统抗体轻链的λ恒定区替代λ5蛋白质片段来加强VH结合。
实施例3：作为所结合的可变重链(VH)配偶体的VpreB和λ5
图5的第三幅图中所显示的VpreB-λ5共表达蛋白质(称为“VpreB和λ5——三聚体复合物”)由m13基因III信号序列和预测的成熟的、经加工的VpreB1(氨基酸20至146)和λ5(氨基酸31至209)的相应氨基酸构成。将这些与以符合读码框的方式与pIII在一起的可变重链-CH1融合物共表达，供噬菌体或噬菌粒展示中使用。使用来自抗TNF-α抗体D2E7的VH编码序列作为VH编码序列，而CH1是人IgG1的CH1区。将这种噬菌粒构建体转化入TG1细胞中。接着，将单集落在补充有50μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LuriaBroth (LB)中增殖，直至其达到OD600约0.3，然后在不进行摇动的情况中于37℃用MK307辅助噬菌体感染30分钟。然后将细胞沉淀，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素的LB中重悬，并容许在剧烈通气的情况中于30℃生长过夜。次日，在噬菌体ELISA中使用含有噬菌粒表达的SLC-HC三聚体蛋白质复合物的上清液以确定靶向结合。简言之，ELISA需要用人TNF-α包被和封闭ELISA板，接着将SLC-HC噬菌体于4℃温育2小时，用PBS-Tween-20(0.05％)清洗和用抗m13-HRP抗体直接检测。或者，可以如下评估结合，即直接扩增或洗脱所结合的噬菌体，并使用XL-1Blue细胞来测定噬菌体滴度。本实施例描述了作为单克隆的与重链可变-CH1融合物配偶的SLC，但是这种SLC可以与识别共同靶物的重链可变区的聚焦集合组合，并作为文库筛选。此外，这种SLC融合物可以与未选择的重链集合组合，并直接针对感兴趣的靶物进行筛选。
实施例4：将多样性工程化改造入VpreB1 CDR3类似区中
因为替代轻链(SLC)的CDR类似区会具有与抗体轻链的CDR类似的功能，所以确定VpreB和λ5之间的融合点是重要的。依照一种方法，如下确定最适合于特定目的的融合点，即以含有全部VpreB氨基酸的CDR3类似位点开始，并在可克隆寡核苷酸中用来自所编码的λ5的氨基酸逐个位置地递增地替代VpreB的氨基酸。继续这种递增替代，直至CDR类似位点完全由λ5来源序列构成。在此过程中的一些点，可能希望添加互补重链，并容许/促进其抗原结合和识别。为了进一步增强或实现这种互补，可以在任何CDR类似位点中使用随机多样性，以及基于匹配CDR长度分析的多样性。或者/另外，可使用抗体Vλ5序列来添加多样性，因为它们的CDR长度与VpreB CDR类似位点长度良好地匹配。
实施例5：将功能性添加至SLC构件
因为SLC由两条独立的多肽构成，所以这产生了附加或嵌入第二(secondary)功能性的天然机会。在本实施例中，在第一种情况中，插入抗VEGF scFv以创建连接VpreB和λ5的融合蛋白(图9A)。将这种所得的工程化SLC约束scFv与抗TNF-α抗体的重链配对。将所得的构建体与以符合读码框的方式与pIII一起克隆的重链共表达，供噬菌体或噬菌粒展示中使用。将这种噬菌粒构建体转化入TG1细胞中，并将单集落在补充有50μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的Luria Broth(LB)中增殖，直至其达到OD600约0.3，并在不进行摇动的情况中于37℃用MK307辅助噬菌体感染30分钟。然后将细胞沉淀，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素的LB中重悬，并容许在剧烈通气的情况中于30℃生长过夜。次日，在噬菌体ELISA中使用含有噬菌粒表达的SLC-HC融合蛋白的上清液以确定靶向结合。简言之，ELISA需要用人TNF-α或人VEGF包被和封闭ELISA板，接着将SLC-HC噬菌体于4℃温育2小时，用PBS-Tween-20(0.05％)清洗和用抗m13-HRP抗体直接检测。
接着，创建抗VEGF scFv至VpreB C端的融合物，并与上文所述噬菌粒ELISA类似地评估所得的三元蛋白质复合物构建体。
或者，将抗卵清蛋白scFv融合至λ5的氨基端，并对三元蛋白质复合物测试对TNF-α和卵清蛋白两者的结合。
最后，将这两种融合构建体(VpreB-抗VEGF scFv和λ5-抗卵清蛋白)与抗TNF-α抗体的重链组合以创建三特异性分子，然后如上文所描述的那样在噬菌粒ELISA中进行证实。
在说明书中掺入针对不同靶物的scFv，然而可以组合针对相同靶物的功能性结合物以创建串联的“超级结合物”。这些串联结合物能提供加强的结合，或者甚至在一些情况中提供交联功能。Fab交联在整个抗体提供不想要的和持久的交联的情况中会是有益的。例如，可能不希望充当胰岛素替代物的整个免疫球蛋白胰岛素受体抗体，它们的血清清除需要3-4周。因为胰岛素通常具有几分钟的半衰期，所以Fab与这种规模的半衰期会是更协调的，而且串联功能性能适当地解决这种应用。
上文说明书仅描述了作为第二功能团的抗体，但是还可以类似地将相关肽(例如促红细胞生成素(EPO)模拟物)、受体(例如TNF-RI)、结合蛋白(例如IL-1ra)、和任何治疗性蛋白(诸如干扰素)掺入附加的且约束的构建体以创建类似功能的分子。
还有，可以利用两个位点来掺入异二聚体蛋白质，诸如重链和轻链以创建第二Fab样分子。
最后，我们仅描述了单数情况，但是组合多样性噬菌体抗体文库和肽多样性文库的掺入也包括在本文中，以用针对其针对的且想要的靶物的SLC候选抗体进行筛选。
实施例6：替代轻链构建体(SURROBODYTM)在哺乳动物细胞中的表达
将图11中称为“三聚物”(也称为“SURROBODYTM变体”)的结构的替代轻链构件的编码序列与全长IgG1抗体重链共转染入CHO-K1细胞(ATCCCCL-61)中，以瞬时生成替代轻链构建体，用于生化分析。具体地，将全长人VpreB1和λ5克隆入哺乳动物表达载体pCI(Promega，Madison WI)中。这些构建体含有它们的天然的预测分泌信号。在VpreB1的情况中，预测的信号肽是SEQ ID NO：1的氨基酸1-20，对于λ5，预测的信号序列是SEQ ID NO：5的氨基酸1-30。对于这两种蛋白质，均删除其预测的非结构性尾部的部分。对于VpreB1，这包括SEQ ID NO：1的C端氨基酸122-146，而对于λ5，这包括SEQID NO：5的N端氨基酸30-86。
图11中称为“λ5dT”的“三聚物”中的截短λ5序列的序列以SEQ ID NO：7显示。图11中称为“VpreB dT”的“三聚物”中的截短VpreB1序列的序列以SEQ ID NO：8显示。
将四种组合替代轻链可能性之每一种与已知的人抗流感重链(含有C端六组氨酸(His6)标签)(SEQ ID NO：9)(His6标签以SEQ ID NO：34公开)共转染，并依照制造商的建议(Invitrogen，Carlsbad CA)在低血清培养基中表达。3天后，收集上清液，过滤，并通过镍螯合物层析(Qiagen，Germany)来纯化。然后通过用抗肽家兔血清(VpreB和λ5)或抗组氨酸抗体(Serotec，Raleigh NC)进行的Western印迹分析来检查纯化的蛋白质。抗家兔HRP(VpreB和λ5)或抗小鼠HRP(重链)和用TMB底物进行的比色显色后显现蛋白质的检测。(图12，第1-4道)。
另外，通过工程化改造由VpreB1基因与λ5基因或与轻链λ恒定域构成的嵌合蛋白来创建替代轻链融合物(参见图11)。具体地，生成以重组方式融合的蛋白质，其含有来自VpreB(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-87至λ5蛋白氨基酸121-209(SEQ ID NO：5)(SEQ ID NO：10)。另外，制备第二种融合物，其含有来自VpreB(SEQ ID NO：1)的氨基酸1-87至抗体λ轻链恒定域(SEQ IDNO：11)的C端121个氨基酸。瞬时表达每种替代轻链融合物，收获，纯化，并通过Western印迹分析来检查，基本上如上文所描述的。值得注意的是，因为这两种融合物都含有针对抗VpreB1抗肽血清的表位，所以它被用于Western印迹分析(图12，第5-6道)。
实施例7：替代轻链构建体(SURROBODYTM)在大肠杆菌中的表达
因为重组蛋白通常有利地在细菌中表达，所以对在原核系统中生成可溶性替代轻链构建体的能力进行测试。为了解决这个，将图11中称为“二聚物”的替代轻链融合物克隆入大肠杆菌表达/分泌系统中。使用plac阻遏型表达系统，其中表达成熟的哺乳动物蛋白质，并通过与原核前导序列的重组融合而分泌入周质中。具体地，通过将成熟蛋白质的编码序列融合至m13 gIII前导编码序列(SEQ ID NO：12和13)的C端来将替代轻链融合物指向周质。通过将抗流感抗体的IgG1重链可变区和重链恒定区结构域融合至pelB前导序列(SEQ ID NO：14)的C端来表达重链。将表达这两种蛋白质的质粒转化入HB2151大肠杆菌细胞(Stratagene)中，并在含有100mcg/ml氨苄青霉素和200微摩尔IPTG的LB培养基中于30℃表达过夜。收获细胞，并制备周质溶胞物，其遵循本领域已知的方法进行。直接通过Western印迹分析来测试周质溶胞物，或者如上文所述的那样进行纯化(图13，小图A)。
因为替代轻链传统上是膜结合型前B细胞受体的构件，所以通常发现它与IgM类重链配对。出于我们的功利目的，我们希望比较替代轻链融合物与基于IgM的重域恒定区1配对的能力和与基于IgG的重域恒定区1配对的能力。为了检查这个，我们用μ重链恒定域1(SEQ ID NO：15)替代上文所描述的抗流感抗体的γ重链恒定域区。我们从对周质溶胞物的Western印迹分析发现，基于IgG(γ)的重链恒定域比以基于μ的重链恒定域为基础的系统表达得更好，并纯化至更高的水平(图13，小图B)。
实施例8：替代轻链构建体(SURROBODYTM)m13噬菌粒的表达
因为重组蛋白不仅在细菌中有用地表达而且在细菌病毒颗粒表面上个别地且以多样文库集合表达，我们希望在m13噬菌粒表面上生成可溶性替代轻链构建体。为了解决这个，将替代轻链融合物(图11中的“二聚物”)克隆入大肠杆菌表达/分泌系统中。对于所有的系统都使用上文所述pLac阻遏型表达系统。然而，在这种情况中，我们将E标签表位(GAPVPYPDPLEPR)(SEQID NO：16)附加至替代轻链融合物，以及附加至轻链对照蛋白质。基因IIIVpreB1-λ5-E标签融合物(融合物1)和基因III VpreB1-CI-E标签融合物(融合物2)的序列分别以SEQ ID NO：12和13显示。为了将重链构建体锚定至m13噬菌粒，以重组方式克隆重链构建体，可变重链和γ恒定重域1区与m13基因III产物以符合读码框的方式在一起。具体地，重组蛋白含有间插物、六组氨酸肽(SEQ ID NO：34)、抗c-myc抗体的肽表位(GEQKLISLEEDL)(SEQ ID NO：17)、和琥珀终止密码子。我们分别通过抗组氨酸和抗E捕捉ELISA检查了蛋白质表达和复合物形成的保真性。
通过本领域中公知的标准方法实现了抗体和替代体(surrobody)的噬菌粒表达。基本上，将用表达质粒转化的TG-1细胞在补充有100mcg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖阻遏的2-YT培养基中培养至对数中期(OD 600约0.3)，然后用m13K07辅助噬菌体感染，然后在补充有100mcg氨苄青霉素、70mcg/ml卡那霉素、和200微摩尔IPTG的2-YT培养基中培养过夜。使用含有噬菌体的上清液或经沉淀且经PBS重悬的噬菌体进行噬菌体捕捉ELISA。如下实现噬菌体捕捉ELISA，即用抗组氨酸(Serotec)或抗E抗体(Abcam)包被微量滴定板，然后用抗m13过氧化物酶抗体(Pharmacia)检测结合，接着用TMB底物进行比色显现。在这些情况中，我们通过这两种方法都发现了对噬菌体的特异性捕捉，这支持通过重链和稳定的替代轻链结合获得的对噬菌体的高保真性蛋白质表达融合物。图14中显示了结果。
实施例9：哺乳动物细胞中所表达的替代轻链构建体的抗原结合
因为看来替代轻链变体在镍螯合物层析后形成可容易检测的复合物，所以对它们结合关联重链配偶体的亲本抗原的能力进行测试。如上文所述的那样实施瞬时表达和纯化。通过ELISA来测试抗原结合。简言之，用灭活的H5N1越南12-3/04病毒制备物(USFDA-CBER，抗原标准品)包被微量滴定孔，封闭，然后与量化的连续稀释的纯化蛋白质一起温育。清洗后，用抗人Fc过氧化物酶偶联抗体检测复合物。最后，以比色法显现结合，并用TMB底物显色进行定量(参见图15)。
另外，对未稀释的来自瞬时转染的上清液类似地测试抗原结合，并显示于图16中。清洗后，或是用抗VpreB1抗肽血清和抗家兔过氧化物酶偶联二抗或是用抗人Fc过氧化物酶偶联抗体检测替代轻链复合物，然后以比色法显现，并用TMB底物显色来定量。
实施例10：大肠杆菌中所表达的替代轻链构建体的抗原结合
因为替代轻链融合物展现出形成稳定的复合物，所以我们想要确立与来自抗流感抗体的重链配对的此类融合物是否会结合所述抗体的关联病毒。为了测试结合，如上文所述的那样制备周质溶胞物。然后将溶胞物进行ELISA抗原结合，基本上如上文所述的，只是经由多克隆亲和纯化的抗体用针对重链C端附加的六组氨酸(SEQ ID NO：34)表位的单克隆抗体或针对替代轻链融合物C端附加的E标签的单克隆抗体检测结合。通过抗小鼠或抗家兔过氧化物酶偶联抗体实现表位检测。最后，以比色法显现结合，并用TMB底物显色来定量。图17中显示了结果。
实施例11：噬菌体展示的替代轻链构建体的抗原结合
因为有可能在异源系统中制备替代轻链变体，并且因为噬菌体展示的集合对于未来的蛋白质发现和工程化改造是想要的，所以我们想要确定替代轻链变体和/或融合物作为基因III结合的复合物是否容易展示在m13噬菌体表面上。将变体(SEQ ID NO：18-22)和先前所描述的融合物(SEQ ID NO：12和13)与两种抗流感抗体重链(SEQ ID NO：19和14)之任一种进行共表达，如上文所描述的，并且结合基本上遵循上文也进行描述的条件。简言之，用H5N1越南1203/04病毒包被微量滴定孔，并容许噬菌粒结合，然后清洗，并直接经由抗m13过氧化物酶偶联抗体来检测。用TMB进行的比色底物产物形成后，定量地测定结合。在图18和图19中显示了结果。
实施例12：噬菌体替代轻链构建体文库的构建、选择、克隆ELISA
采用使用组合抗体文库的迭代方法，生成和测试了结合抗原的替代轻链构建体。简言之，创建自H5N1禽流感存活者的骨髓制备的组合抗体文库。针对H5N1病毒血凝素蛋白筛选这些文库达两轮选择。接着，扩增并纯化噬菌粒质粒。通过来自这种质粒制备物的限制性消化来分离重链可变区，并与重链恒定域1以符合读码框的方式克隆，以形成与m13基因III外壳蛋白的重组融合物，供噬菌粒展示使用。重要的是，我们使用两种接受质粒，其中任一种共表达由VpreB1和λ5构成的替代轻链融合物(SLC融合物1)(SEQ ID NO：10)或由VpreB1和来自经典λ轻链的λ恒定域构成的替代轻链融合物(SEQ IDNO：11)(SLC融合物2)。融合物1文库产生3.84×107个独立的转化体，而融合物2文库产生7.8×107个转化体。对这两个文库均独立地经过两轮进行筛选，并且两者都显示超过背景的显著富集(融合物1＝5x，融合物2＝20x)，这在第二轮淘选中得到提高(融合物1＝97x，融合物2＝48x)。
为了通过ELISA来测试克隆抗原结合，将来自这两轮和这两个文库的噬菌体都转移入HB2151大肠杆菌菌株中以生成可溶性替代体融合蛋白。简言之，培养HB2151克隆，并诱导以生成可溶性替代体。具体地，将菌落在补充有100mcg/ml氨苄青霉素和200微摩尔IPTG的2-YT培养基中于30℃培养过夜，制备周质溶胞物，如上文所述的那样。通过ELISA来测试所得的周质溶胞物，基本上如上文所概述的。
图20中显示了第1轮和第2轮淘选时两种融合物的转化体数目和百分比阳性克隆，而图21和图22中显示了融合物1和融合物2文库克隆的第1轮和第2轮的克隆分析数据。
实施例13：为了延长血清半衰期的替代轻链融合物
抗体片段的体内半衰期在它是与完整且整个重链的融合物的一部分时得到相当大地延长，所述完整且整个重链包括所有重链恒定域，不仅仅是那些形成稳定抗原结合片段所必需的。在IgG的情况中，这意味着包括域CH1、CH2、和CH3。特别地，完善建立的是，CH2和CH3赋予大部分的这种体内效应。实际上，与亲本分子相比，这些CH2和CH3域与异源蛋白质的融合物通常足以改善这些嵌合分子的效力和PK/PD。类似地，与VpreB和λ5任一或两者的功能性融合物受益于与重链恒定域的这种结合。
为了治疗II型糖尿病，胰高血糖素样肽1(或GLP-1)的施用通过在胰中诱导葡萄糖依赖性胰岛素分泌，由此改善那些患者中的葡萄糖管理而使个体受益。然而，长寿命的GLP-1肽是所希望的目标。因为替代轻链的尾部是独特且易接近的，所以我们可以通过以重组方式将活性GLP-1模块融合至VpreB1尾部(SEQ ID NO：23和24)的C端或λ5的N端尾部(SEQ ID NO：25和26) 来实现这个目标。在λ5融合物的情况中，我们可以在存在或没有VpreB1的情况中，而且甚至在存在或没有重链可变域的情况中表达这个，如图11中所描绘的。可以在存在或没有λ5的情况中，且可能在有或没有重链CH1域的情况中类似地制备与VpreB1的融合物。类似地，可以创建其它有益的生长因子、细胞因子、受体、和酶融合物。在所有的这些情况中，结合不是替代轻链或SURROBODYTM构件所必需的，而是可以由异源替代轻链融合元件完全或大部分地赋予。
虽然在上述说明书中参照某些实施方案例示了本发明，但是它不限于此。实际上，在那些本文中所显示的和描述的之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员根据上述说明书会变得显而易见，并落入所附权利要求书的范围之内。
实施例14：血凝素结合替代轻链构建体的亲和力测定
为了测定融合替代轻链构建体(SURROBODIESTM，参见图11)的亲和力，我们在大肠杆菌中过表达和纯化多种替代体，并将它们与首先鉴定出重链的亲本Fab进行比较。基本上如下在BioForte Octet上通过生物层干涉测量法(Bio-Layer Interferometry)来测定亲和力。首先，使用Pierce No-Weigh PEO4生物素(产品目录编号21329)依照制造商的说明书以20∶1摩尔过量对100μg纯化的血凝素蛋白进行生物素化，在间歇混合的情况中于室温温育1-3小时，然后于4℃温育过夜。通过大小排阻旋转柱除去过量的生物素，并交换入PBS中。接着，通过使用Ni2+亲和层析的FPLC来纯化HA结合替代轻链构建体和Fab，脱盐以除去过量的咪唑，浓缩，并通过定量轻链ELISA(Bethel Labs，产品目录编号E80-115-κ，和E80-116-λ)来定量，其依照制造商的说明书进行。最后，通过分析一系列样品浓度来测定亲和力，所述样品浓度通常是以连续2倍稀释的15nM-500nM。将所述样品与用HA蛋白包被的生物传感器一起温育达长至15分钟，然后在样品稀释剂中温育达长至1小时。在以1500RPM旋转样品平板的情况中完成所有的这些步骤。在Fab与经HA包被的生物传感器一起温育期间测量结合，并在结合后在样品稀释剂温育中测量解离。下表中显示了亲和力。
  克隆   融合物1   融合物1   Fab
 
    VpreB1-λ5   VpreB1-恒定λ  
  F5   250-400pM   150-270pM   1pM
  B11   31-180pM   未测定   13pM
在此通过提及明确而完整收录贯穿说明书所引用的所有参考文献，及其中所引用的参考文献。

Claims (23)

1.一种多肽，其由SEQ ID NO：10的VpreB1-λ5融合物组成，其中所述多肽在与抗体重链序列偶联时能够结合靶物。
2.一种多肽，其由SEQ ID NO：12的基因III-VpreB1-λ5-E标签融合物组成，其中所述多肽在与抗体重链序列偶联时能够结合靶物。
3.权利要求1或2的多肽，其包含与抗体重链序列偶联的，VpreB1序列与λ5序列的融合物。
4.权利要求3的多肽，其包含与所述抗体重链序列共价结合的，VpreB1序列与λ5序列的融合物。
5.权利要求3的多肽，其中所述抗体重链序列包含可变区。
6.权利要求3的多肽，其中所述抗体重链序列是通过肽接头或通过非共价结合以形成二聚体复合物而与所述VpreB1序列和所述λ5序列的融合物偶联的。
7.权利要求1或2的多肽，其中所述靶物是抗原。
8.权利要求1或2的多肽，其中所述靶物是病毒抗原。
9.权利要求8的多肽，其中所述靶物是流感A病毒。
10.权利要求9的多肽，其中所述多肽中和所述流感A病毒。
11.依照权利要求1-10任一项的多肽的文库。
12.权利要求11的文库，其进一步包含附加至所述文库成员或嵌入所述文库成员中的至少一种别的功能性，其中所述别的功能性是由别的抗体或多肽序列提供的。
13.权利要求12的文库，其中所述别的多肽序列是受体或配体序列。
14.权利要求12的文库，其中所述别的抗体或多肽序列是不同的抗体或多肽序列文库的成员。
15.权利要求14的文库，其中所述不同的多肽序列文库是随机肽序列的文库。
16.权利要求15的文库，其中至少一些所述肽序列具有对靶抗原的结合特异性。
17.处于展示形式的权利要求11或12的文库。
18.权利要求17的文库，其中所述展示选自下组：噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示、DNA展示、哺乳动物细胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白质-DNA连接的展示、和微珠展示。
19.权利要求11的文库，其中所述多肽具有对一种或多种靶物的结合特异性。
20.权利要求19的文库，其中所述多肽具有对同一靶物的结合特异性。
21.权利要求19的文库，其中所述多肽具有对至少两种不同靶物的结合特异性。
22.一种偶联物，其包含与抗体重链序列偶联的多肽，该多肽由SEQ ID NO：10的VpreB1-λ5融合物组成，该抗体重链序列包含可变区。
23.一种偶联物，其包含与抗体重链序列偶联的多肽，该多肽由SEQ ID NO：12的基因III-VpreB1-λ5-E标签融合物组成，该抗体重链序列包含可变区。
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