BRPI0809435A2 - Constructos e bibliotecas que compreendem sequências de cadeia leve substituida de anticorpos - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRUCTOS E BIBLIOTECAS QUE COMPREENDEM SEQÜÊNCIAS DE CADEIA LEVE SUBSTITUTA DE ANTICORPOS".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se o constructos e bibliotecas que
compreendem seqüências de cadeia leve substituta de anticorpos. Em particular, a invenção está relacionada o constructos que compreendem seqüências VpreB1 opcionalmente utilizadas como parceiras com outro polipeptídeo, tal como, por exemplo, seqüências de domínios variáveis de cadeias pesadas de anticorpos e bibliotecas que contêm as mesmas.
Antecedentes da Invenção
Moléculas de anticorpo (Ig) produzidas por linfócitos B são constituídas de cadeias pesadas (H) e leves (L). As seqüências de aminoácidos dos domínios amino terminais das cadeias HeL são variáveis (VH e VL), es15 pecialmente nas três regiões hipervariáveis (CDR1, CDR2, CDR3) que formam o sítio de combinação de antígenos. A montagem das cadeias H e L é estabilizada por uma ligação bissulfeto entre a região constante da cadeia L (Cl) e a primeira região constante da cadeia pesada (Cm) e através de interações não-covalentes entre os domínios Vh e VL.
Em seres humanos e muitos animais, tais como camundongos,
os genes que codificam as cadeias H e L do anticorpo são montados em rearranjos somáticos em etapas de fragmentos gênicos que codificam ptécnicas das regiões V. Vários estágios do desenvolvimento de linfócitos B são caracterizados pelo status de rearranjo dos Ioci gênicos de Ig (vide, por e25 xemplo, Melchers, F. & Rolink, A., B-Lvmphocvte Development and Bioloqy, Paul, W.E., ed., 1999, Lippincott, Filadélfia).
Os precursores de células B (pré-células B) foram identificados na medula óssea como linfócitos que produzem cadeias pesadas μ, mas ao invés das cadeias leves completamente desenvolvidas expressam um conjunto de genes específicos à linhagem B chamado VpreB(1-3) e Λ5, respectivamente.
A isoforma principal da VpreBI humana (CAG30495) é um poli peptídeo de 145 aa de comprimento (SEQ ID NO: 1). Esta possui uma estrutura similar ao domínio V de Ig1 mas não possui o última fita β (β7) de um domínio V típico e possui uma extremidade terminal carboxila que não exibe homologias de seqüência com quaisquer outras proteínas. A VpreB2 possui 5 várias isoformas, incluindo um polipeptídeo VpreB2 de camundongo de 142 aminoácidos (P13373; SEQ ID NO: 2) e uma variação de processamento de 171 aminoácidos de comprimento da seqüência VpreB2 de camundongo (CAA01964I SEQ ID NO: 3). As seqüências de VpreBI e VpreB2 foram descritas na EP 0 269 127 e na Patente U.S. N2 5.182.205; Collins e outros, 10 Genome Biol. 5(10):R84 (2004); e Hollins e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86(14):5552-5556 (1989). A isoforma principal da VpreB3 humana (SEQ ID NO: 4) é uma proteína de 123 aminoácidos de comprimento (CAG30496), descrita em Collins e outros, Genome Biol. 5(10):R84 (2004).
As VpreB(1-3) estão associadas de forma não-covalente com 15 outra proteína, A5. A A5 humana é um polipeptídeo de 209 aminoácidos (CAA01962; SEQ ID NO: 5), que carrega uma estrutura similar ao domínio C de Ig com grandes homologias com as cadeias leves do anticorpo e, em direção a sua extremidade amino terminal, duas regiões funcionalmente distintas, das quais uma exibe grande homologia com a fita β7 dos domínios VA. 20 Uma proteína similar à A5 humana possui 213 aminoácidos (NP_064455; SEQ ID NO: 6) e exibe aproximadamente 84% de identidade de seqüência com a região constante da cadeia leve de A do anticorpo.
Para mais detalhes, vide os artigos de revisão a seguir: Karasuyama e outros, Adv. Immunol. 63:1-41 (1996); Melchers e outros, Immunology Today 14:60-68 (1993); e Melchers, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:2571- 2573(1999).
Os polipeptídeos VpreB e A5 formam juntos uma estrutura similar à cadeia leve de Ig associada de forma não-covalente, que é chamada de cadeia leve substituta ou pseudocadeia leve. Na superfície de pré-células B 30 iniciais, a cadeia leve substituta está ligada por dissulfeto à cadeia pesada μ de Ig ligada à membrana em associação com um heterodímero CD79a/CD79b transdutor de sinal para formar uma estrutura similar ao receptor de células B, o assim chamado receptor pré-células B (preBCR).
Sumário da Invenção
Em um aspecto, a invenção está relacionada a polipeptídeos que compreendem uma seqüência de VpreB ou uma seqüência de A5 conju5 gada a uma seqüência de aminoácidos heterogênea, em que os polipeptídeos são capazes de se ligar a um alvo.
Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo compreende uma seqüência de VpreB, em que a VpreB pode ser qualquer VpreB nativa, inclundo a VpreBI humana (SEQ ID NO: 1), a VpreB2 de camundongo (SEQ 10 ID NO: 2 e 3) e a VpreB3 humana (SEQ ID NO: 4) ou um análogo das mesmas em outra espécie de mamífero ou um fragmento ou uma variação das mesmas, contanto que o polipeptídeo mantenha a capacidade de se ligar a um alvo.
Em uma modalidade preferida, a seqüência de aminoácidos heterogênea é uma seqüência de A5, que pode ser qualquer seqüência de A5 nativa ou qualquer fragmento ou variação da mesma, incluindo a seqüência de A5 humana nativa da SEQ ID NO: 5, a seqüência similar à A5 humana da SEQ ID NO: 6 e fragmentos e variações das mesmas.
A seqüência de VpreB e a seqüência de aminoácidos heterogênea, por exemplo, a seqüência de A5, podem ser fundidas diretamente uma com a outra ou podem ser associadas de forma não-covalente. No primeiro caso, a fusão ocorre preferencialmente nas ou ao redor das regiões análogas de CDR3 de VpreB e A5, respectivamente.
Em uma outra modalidade, a seqüência de aminoácidos hetero25 gênea é ou compreende uma seqüência de região variável de cadeia leve de anticorpo. Em uma modalidade particular, a seqüência de região variável de cadeia leve de anticorpo é fundida com a seqüência de VpreB em um sítio análogo a uma região de CDR3 de cadeia leve de anticorpo. Em uma outra modalidade, a fusão ocorre entre a região de CDR3 de uma cadeia leve de 30 anticorpo e a região análoga à CDR3 de uma VpreB. Em todas as modalidades, a cadeia leve de anticorpo pode ser uma cadeia A ou uma cadeia κ.
Em modalidades particulares, os polipeptídeos apresentados aqui, que incluem, sem limitação, conjugados de VpreB-A5 (incluindo fusões, outra ligação covalente e associações não-covalentes) e conjugados de VpreB-cadeia leve de anticorpo, podem estar adicionalmente associados com uma seqüência que compreende uma seqüência de região variável de ca5 deia pesada de anticorpo, tal como uma região variável de cadeia pesada de anticorpo ou uma cadeia pesada completa de anticorpo, incluindo uma região variável.
Quando o polipeptídeo compreende uma seqüência de A5, a A5 pode ser qualquer A5 nativa, incluindo a A5 humana da SEQ ID NO: 5 e a 10 proteína similar a A5 humana da SEQ ID NO: 6 ou um homólogo em outra espécie de mamífero ou qualquer fragmento ou variação dos mesmos, contanto que o polipeptídeo mantenha a capacidade de se ligar a um alvo. Em uma modalidade particular, a seqüência de aminoácidos heterogênea conjugada com a seqüência de A5 é uma seqüência de VpreB.
Nos constructos de polipeptídeos da presente invenção, as se
qüências de VpreB e de A5, se estiverem ambas presentes, podem ser conjugadas através de quaisquer meios, incluindo a fusão direta, a ligação covalente por uma seqüência Iigante (por exemplo, um Iigante peptídico) e a associação não-covalente.
Em uma modalidade particular, uma fusão de uma seqüência de
VpreB e uma seqüência de A5 é conjugada a uma seqüência de cadeia pesada de anticorpo através da associação não-covalente, para formar um complexo dimérico.
Em uma outra modalidade, um complexo trimérico é formado a25 través da associação não-covalente de uma seqüência de VpreB, uma seqüência de A5 e uma seqüência de cadeia pesada de anticorpo. Em certas modalidades, nestas estruturas, que também são referidas com estruturas de cadeia leve substitutas variantes de "variações de SURROBODY®", as caudas características (apêndices) de uma ou de ambas as ptécnicas de V30 preB e A5 podem ser (mas não precisam ser) mantidas. É possível ligar funcionalidades adicionais a tais apêndices. Em adição, em várias modalidades, as fusões benéficas com apêndices podem ser planejadas e produzidas com a finalidade de melhorar várias propriedades dos constructos, tais como PK e/ou potência.
Em todas as modalidades, quando uma cadeia pesada de anticorpo que compreende seqüências da região variável estiver presente, o poIipeptideo da presente invenção e as seqüências de região variável de cadeia pesada de anticorpo podem ser ligar ao mesmo alvo ou a diferentes.
Em um outro aspecto, a invenção está relacionada a uma biblioteca de tais polipeptídeos.
Ainda em um outro aspecto, a invenção está relacionada a uma biblioteca de tais polipeptídeos associados com cadeias pesadas de anticorpo ou fragmentos dos mesmos que compreendem seqüências da região variável.
Em um aspecto adicional, a invenção está relacionada a uma biblioteca que compreende uma coleção de seqüências de cadeia leve substituta opcionalmente associada com seqüências de região variável de cadeia pesada de anticorpo.
Em todos os aspectos, a biblioteca pode estar na forma de uma exibição, tal como, por exemplo, uma exibição em fagos, uma exibição bacteriana, uma exibição em leveduras, uma exibição de ribossomos, uma exi20 bição de mRNA, uma exibição de DNA, uma exibição em células de mamífero, uma exibição em esporos, uma exibição viral, uma exibição baseada na ligação de proteína-DNA ou uma exibição em microesferas.
A invenção está relacionada ainda a vários usos de tais polipeptídeos e bibliotecas que contêm tais polipeptídeos, por exemplo, para planejar ou selecionar moléculas similares a anticorpos com especificidades de ligação e/ou afinidades de ligação desejadas, que possuem aplicações terapêuticas importantes.
Breve Descrição das figuras
A figura 1 mostra o alinhamento de VpreBI humana (SEQ ID NO: 1) e A5 humana com regiões variáveis e constantes da cadeia λ do anticorpo. A VpreBI compartilha alguma similaridade de seqüência com as regiões variáveis da cadeia λ do anticorpo, enquanto que A5 compartilha alguma similaridade com as regiões constantes da cadeia A do anticorpo e a região estrutural 4. As regiões dentro de caixas identificam seqüências de VpreBI e A5 que são similares às regiões estruturais de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia A do anticorpo, respectivamente.
A figura 2 é uma ilustração esquemática de uma cadeia leve
substituta formada pelas seqüências de VpreB e A5, polipeptídeos de fusão ilustrativos que compreendem seqüências de cadeia leve substituta e uma estrutura de cadeia leve de anticorpo derivadas da união V-J.
A figura 3 é uma ilustração esquemática de vários constructos de deleção e de cadeia isolada da cadeia leve substituta.
A figura 4 ilustra esquematicamente a incorporação de diversidade funcional combinatória nos constructos de cadeia leve substituta.
A figura 5 mostra as estruturas de genes e de proteínas de vários constructos de cadeia leve substituta ilustrativas.
A figura 6 é o alinhamento de seqüências de VpreBI com se
qüências da região variável da cadeia leve de A5 do anticorpo. As regiões com o grau mais alto de similaridade de seqüência estão dentro de caixas. Como mostrado na figura, VpreBI exibe apenas 56%-62% (aminoácidos 2 até 97) de identidade de seqüência com as seqüências da linhagem germinativa da região variável da cadeia leve de A5.
A figura 7 é o alinhamento de seqüências de VpreBI com seqüências da região constante da cadeia leve de A5 do anticorpo. Como mostrado na figura, as seqüências de VpreBI alinhadas exibem apenas 62% (aminoácidos 97 até 209) de identidade de seqüência com as sequênicas da região constante da cadeia leve de A5 do anticorpo correspondentes.
A figura 8 é o alinhamento de seqüências de VpreBI com seqüências da região constante da cadeia leve κ do anticorpo. Como mostrado na figura, as seqüências de VpreBI alinhadas exibem apenas 35% (aminoácidos 105 até 209) de identidade de seqüência com as seqüências da região constante da cadeia leve κ do anticorpo correspondentes.
A figura 9 ilustra várias maneiras representativas de adicionar funcionalidade aos componentes de cadeia leve substituta (SLC). A figura 10 mostra a seqüência de VpreBI humana da SEQ ID NO: 1; as seqüências de VpreB2 de camundongo das SEQ ID NOS: 2 e 3; a seqüência de VpreB3 humana da SEQ ID NO: 4, a seqüência de A5 humana da SEQ D NO: 5 e a seqüência da proteína similar à A5 humana da SEQ ID NO: 6 e seqüências de vários constructos utilizados nos Exemplos.
A figura 11 ilustra vários constructos triméricos e diméricas de cadeia leve substituta da invenção.
Figura 12: Detecção de cadeias leves substitutas e cadeias pesadas conjugadas. Faixa 1: Comprimento Completo; Faixa 2: Lambda 5 dT;
Faixa 3: VpreB dt; Faixa 4: Curtas; Faixa 5: fusão de SCL 1; Faixa 6: fusão de SLC 2; Faixa 7: Anticorpo.
Figura 13: as proteínas de fusão de SLC são expressas e bem secretadas dentro do periplasma de E. coli e são utilizadas melhor como parceiras com CH1 de cadeia pesada de IgGI ao invés de IgM. Painel A:
expressão de proteínas de fusão de SCL em E. coli. Painel B: parceiros da cadeia gama de IgGI e é melhor purificada que a cadeia μ de IgM com uma fusão de SLC.
Figura 14: ELISA de captura de constructos de cadeia leve substituta em fagos através da detecção anti fago.
Figura 15: constructos de cadeia leve substituta purificado ex
pressas em células de mamífero que se ligam ao alvo viral.
Figura 16: constructos de cadeia leve substituta purificadas expressas em células de mamífero que contém complexos estáveis que se ligam ao antígeno viral.
Figura 17: Ligação ao antígeno com Iisados periplasmáticos de
E. coli.
Figura 18: Fago com constructo de fusão de cadeia leve substituta pareado com cadeia pesada neutralizadora que se liga facilmente ao antígeno HA de H5.
Figura 19: Fago com constructo de cadeia leve substituta parea
do com cadeia pesada neutralizadora que se liga ao antígeno.
Figura 20: Tabela que resume os resultados de experimentos de exibição em fagos.
Figuras 21 e 22: Resultados da análise clonal dos ciclos 1 e 2 de fusões de cadeia leve substituta 1 e 2.
Descrição Detalhada da Invenção A. Definições
A não ser que seja definido de outra maneira, os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que o comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Singleton e outros, Dictionary of Microbioiogy and Molecular Biology 2- ed., J. Wi10 Iey & Sons (New York, NY 1994), fornecem a um versado na técnica um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido de patente.
Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, que poderiam ser utilizados na prática da presente invenção. Na verdade, a presente invenção não é de forma alguma limitada pelos métodos e materiais descritos. Para as finalidades da presente invenção, os termos a seguir são definidos abaixo.
O termo "cadeia leve substituta", como utilizado aqui, refere-se a um dímero formado pela associação não-covalente de uma proteína VpreB e uma A5.
O termo "VpreB" é utilizado aqui no sentido mais amplo e refere
se a qualquer polipeptídeo de seqüência nativa ou variante de VpreB, incluindo especificamente, sem limitação, a VpreBI humana da SEQ ID NO: 1, a VpreB2 de camundongo das SEQ ID NOS: 2 e 3, a VpreB3 humana da SEQ ID NO: 4 e isoformas, incluindo variações de processamento e variações 25 formadas através de modificações pós-tradução, outros homólogos de mamífero das mesmas, bem como variações de tais polipeptídeos de seqüência nativa.
O termo "A5" é utilizado aqui no sentido mais amplo e refere-se ao polipeptídeo de seqüência nativa ou variante de A5, incluindo especificamente, sem limitação, a A5 humana da SEQ ID NO: 5, a proteína similar à A5 humana da SEQ ID NO: 6 e suas isoformas, incluindo variações de processamento e variações formadas através de modificações pós-tradução, outros homólogos de mamífero das mesmas, bem como variações de tais polipeptídeos de seqüência nativa.
Os termos "polipeptídeo VpreB variante" e "uma variante de um polipeptídeo VpreB" são utilizados de forma intercambiável e são definidos aqui como um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo VpreB de seqüência nativa em uma ou mais posições de aminoácidos como um resultado de uma modificação de aminoácido. O "polipeptídeo VpreB variante", como definido aqui, será diferente de uma seqüência de cadeia leve λ ou κ de anticorpo nativa ou de um fragmento da mesma. O "polipeptídeo VpreB variante" irá preferencialmente manter pelo menos aproximadamente 65% ou pelo menos aproximadamente 70% ou pelo menos aproximadamente 75% ou pelo menos aproximadamente 80% ou pelo menos aproximadamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% ou pelo menos aproximadamente 95% ou pelo menos aproximadamente 98% de identidade de seqüência com um polipeptídeo VpreB de seqüência nativa. Em outra modalidade preferida, o "polipeptídeo VpreB variante" será menos que 95% ou menos que 90% ou menos que 85% ou menos que 80% ou menos que 75% ou menos que 70% ou menos que 65% ou menos que 60% idêntico em sua seqüência de aminoácidos em relação a uma cadeia leve λ ou κ de anticorpo nativa. Os polipeptídeos VpreB variantes incluem especificamente, sem limitação, polipeptídeos VpreB em que a cauda única não similar a Ig no terminal C da seqüência de VpreB é parcialmente ou completamente removida.
Os termos "polipeptídeo A5 variante" e "uma variante de um polipeptídeo A5" são utilizados de forma intercambiável e são definidos aqui co25 mo um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo A5 de seqüência nativa em uma ou mais posições de aminoácidos como um resultado de uma modificação de aminoácido. O "polipeptídeo A5 variante", como definido aqui, será diferente de uma cadeia leve A ou κ de anticorpo nativa ou de um fragmento da mesma. O "polipeptídeo A5 variante" irá preferencialmente manter 30 pelo menos aproximadamente 65% ou pelo menos aproximadamente 70% ou pelo menos aproximadamente 75% ou pelo menos aproximadamente 80% ou pelo menos aproximadamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% ou pelo menos aproximadamente 95% ou pelo menos aproximadamente 98% de identidade de seqüência com um polipeptídeo A5 de seqüência nativa. Em outra modalidade preferida, o "polipeptídeo A5 variante" será menos que 95% ou menos que 90% ou menos que 85% ou menos que 80% 5 ou menos que 75% ou menos que 70% ou menos que 65% ou menos que 60% idêntico em sua seqüência de aminoácidos em relação a uma cadeia leve λ ou κ de anticorpo nativa. Os polipeptídeos A5 variantes incluem especificamente, sem limitação, polipeptídeos A5 em que a cauda única no terminal N da seqüência de A5 é parcialmente ou completamente removida.
A porcentagem de identidade das seqüências de aminoácidos
pode ser determinada utilizando o programa de comparação de seqüências NCBI-BLAST2 (Altschul e outros, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). O programa de comparação de seqüências NCBI-BLAST2 pode ser adquirido a partir do http://www.ncbi.nlm.nih.gov ou obtido de outra maneira no Na15 tional Institute of Health, Bethesda, MD. O NCBI-BLAST2 utiliza vários parâmetros de busca, em que todos estes parâmetros de busca são ajustados em valores pré-estabelecidos incluindo, por exemplo, não mascarado = sim, fita = todo, ocorrências esperadas = 10, comprimento mínimo com complexidade baixa = 15/5, valore multi-pass = 0,01, constante para multi-pass = 25, 20 "dropoff" para o alinhamento com adição de espaços final = 25 e matriz de classificação = BLOSUM62.
O termo "seqüência VpreB" é utilizado aqui para se referir à seqüência de "VpreB", como definido anteriormente aqui ou a um fragmento da mesma.
O termo "seqüência de A5" é utilizado aqui para se referir à se
qüência de "A5", como definido anteriormente aqui ou a um fragmento da mesma.
O termo "seqüência de cadeia leve substituta", como definido aqui, significa qualquer seqüência de polipeptídeo que compreende uma "seqüência VpreB" e/ou uma "seqüência de A5", como definido anteriormente aqui. A "seqüência de cadeia leve substituta", como definido aqui, inclui especificamente, sem limitação, a seqüência de VpreBI humana da SEQ ID NO 1, as seqüências de VpreB2 de camundongo das SEQ ID NOS: 2 e 3 e a seqüência de VpreB3 humana da SEQ ID NO: 4 e suas várias isoformas, incluindo variações de processamento e variações formadas através de modificações pós-tradução, homólogos das mesmas em outras espécies de ma5 míferos, bem como fragmentos e variações das mesmas. O termo "seqüência de cadeia leve substituta" inclui adicionalmente, sem limitação, a seqüência de A5 humana da SEQ ID NO: 5, a seqüência similar a A5 humana da SEQ ID NO: 6 e suas isoformas, incluindo variações de processamento e variações formadas através de modificações pós-tradução, homólogos das 10 mesmas em outras espécies de mamíferos, bem como fragmentos e variações das mesmas. O termo "seqüência de cadeia leve substituta" inclui adicionalmente uma seqüência que compreende ambas as seqüências de VpreB e A5 como definido anteriormente aqui.
Para a estrutura tridimensional do receptor pré-célula B (preBCR), incluindo a estrutura da cadeia leve substituta (SCL) e seus componentes vide, por exemplo, Lanig e outros, Mol. Immunol. 40(17): 1263-72 (2004).
A "seqüência de cadeia leve substituta" pode ser opcionalmente conjugada a uma seqüência de aminoácidos heterogênea ou qualquer outro 20 componente heterogêneo, para formar uma "cadeia leve substituto constructo" descrita aqui. Assim, o termo "cadeia leve substituto constructo" é utilizado no sentido mais amplo e inclui quaisquer e todos os componentes heterogêneos adicionais, incluindo uma seqüência de aminoácidos heterogênea, um ácido nucleico e outras moléculas conjugadas com uma seqüência de 25 cadeia leve substituta, em que "conjugação" é definida abaixo. Um "constructo de cadeia leve substituta" é também referida aqui como um "SURROBODY®" e os dois termos são utilizados de forma intercambiável.
No contexto dos polipeptídeos da presente invenção, o termo "seqüência de aminoácidos heterogênea", relativo a uma primeira seqüência de aminoácidos, é utilizado para se referir a uma seqüência de aminoácidos que não está naturalmente associada com a primeira seqüência de aminoácidos, pelo menos não na forma que está presente nos constructos de cadeia leve substituta apresentadas aqui. Assim, uma "seqüência de aminoácidos heterogênea" relativa a uma VpreB é qualquer seqüência de aminoácidos não associada com a VpreB nativa em seu ambiente nativo, incluindo, sem limitação, seqüências de A5 que são diferentes daquelas seqüências de 5 A5 que, junto com a VpreB, formam a cadeia leve substituta em células B em desenvolvimento, tais como variações de seqüências de aminoácidos, por exemplo, seqüências de A5 truncadas e/ou derivatizadas. Uma "seqüência de aminoácidos heterogênea" relativa a uma VpreB inclui ainda seqüências de Λ5 associadas covalentemente a, por exemplo, fundidas a, VpreB, inclu10 indo a seqüência nativa A5, uma vez que em seu ambiente nativo, as seqüências de VpreB e A5 não estão associadas de forma covalente, por exemplo, fundidas, uma com a outra. As seqüências de aminoácidos heterogêneas incluem ainda, sem limitação, seqüências de anticorpos, incluindo seqüências de anticporos e de cadeia pesada e fragmentos das mesmas, 15 tais como, por exemplo, seqüências da região variável de cadeias leve e pesada do anticorpo e seqüências da região constante de cadeias leve e pesada do anticorpo.
Os termos "conjugar", "conjugado(a)" e "conjugação" referem-se a quaisquer e todas as formas de ligação covalente ou não-covalente e in20 cluem, sem limitação, a fusão genética ou química direta, o acoplamento através de um Iigante ou de um agente de reticulação e a associação nãocovalente, por exemplo, através de forças de Van der Waals ou através do uso de um zíper de leucina.
O termo "fusão" é utilizado aqui para se referir à combinação de 25 seqüências de aminoácidos de origem diferente em uma cadeia de polipeptídeo através da combinação em quadro de suas seqüências de nucleotídeos codificadoras. O termo "fusão" abrange explicitamente fusões internas, isto é, inserção de seqüências de origem diferente dentro de uma cadeia de polipeptídeo, em adição à fusão com um de seus terminais.
Como utilizado aqui, o termo "alvo" é uma substância que intera
ge com um polipeptídeo apresentado aqui. Os alvos, como definido aqui, incluem especificamente antígenos com os quais os constructos contendo VpreB da presente invenção interagem. Preferencialmente, a interação ocorre através de ligação direta.
Como utilizado aqui, todos os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" se referem a uma seqüência de aminoácidos primária que são Ii5 gados através de "ligações peptídicas" covalentes. Em geral, um peptídeo consiste em alguns aminoácidos, tipicamente de aproximadamente 2 até aproximadamente 50 aminoácidos e é mais curto que uma proteína. O termo "polipeptídeo", como definido aqui, abrange peptídeos e proteínas.
O termo "aminoácido" ou "resíduo de aminoácido" refere-se tipi10 camente a um aminoácido que possui sua definição reconhecida na técnica tal como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gin); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lie): Ieucina (Leu); Iisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina 15 (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Vai), embora aminoácidos modificados, sintéticos ou raros também possam ser utilizados quando desejado. Assim, os aminoácidos modificados e não usuais listados em 37 CFR 1.822(b)(4) estão especificamente incluídos dentro desta definição e são expressamente incorporados aqui como referência. 20 Os aminoácidos podem ser subdivididos em vários subgrupos. Assim, os aminoácidos podem ser agrupados por possuírem uma cadeia lateral não polar (por exemplo, Ala, Cys, lie, Leu, Met1 Phe, Pro, Vai); uma cadeia lateral carregada negativamente (por exemplo, Asp, Glu); uma cadeia lateral carregada positivamente (por exemplo, Arg, His, Lys); ou uma cadeia lateral polar 25 não carregada (por exemplo, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp e Tyr). Os aminoácidos também podem ser agrupados como aminoácidos pequenos (Gly, Ala), aminoácidos nucleofílicos (Ser, His, Thr, Cys), aminoácidos hidrofóbicos (Vai, Leu, lie, Met, Pro), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, Asp, Glu), amidas (Asp, Glu) e aminoácidos básicos (Lys, Arg).
O termo "polinucleotídeo(s)" refere-se a ácidos nucleicos tais
como moléculas de DNA e moléculas de RNA e análogos das mesmas (por exemplo, DNA ou RNA gerado utilizando análogos de nucleotídeos ou utilizando química de ácidos nucleicos). Quando desejado, os polinucleotídeos podem ser produzidos de forma sintética, por exemplo, utilizando química de ácidos nucleicos reconhecida na técnica ou enzimaticamente utilizando, por exemplo, uma polimerase e, se desejado, podem ser modificados. As modi5 ficações típicas incluem metilação, biotinilação e outras modificações conhecidas na técnica. Em adição, a molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita duplo e, quando desejado, pode estar ligada a um grupamento que pode ser detectado.
O termo "variante" em relação a um polipeptídeo de referência 10 refere-se a um polipeptídeo que possui pelo menos uma mutação ou uma modificação de aminoácido (isto é, alteração) quando comparado com um polipeptídeo nativo. As variações geradas pelas "modificações de aminoácidos" podem ser produzidas, por exemplo, através da substituição, da deleção, da inserção e/ou da modificação química de pelo menos um aminoácido 15 na seqüência nativa de aminoácidos.
Uma "modificação de aminoácido" refere-se a uma alteração na seqüência de aminoácidos de uma seqüência de aminoácidos predeterminada. Os exemplos de modificações incluem uma substituição, uma inserção e/ou uma deleção de aminoácido.
Uma "modificação de aminoácido em" uma posição especificada,
refere-se à substituição ou à deleção do resíduo especificado ou à inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. Por inserção "adjacente" a um resíduo especificado entende-se a inserção dentro de um até dois resíduos do mesmo. A inserção pode ser Nterminal ou C-terminal ao resíduo especificado.
Uma "substituição de aminoácido" refere-se à troca de pelo menos um resíduo de aminoácido existente em uma seqüência de aminoácidos predeterminada por outro resíduo de aminoácido "de troca" diferente. O resíduo ou os resíduos de troca podem ser "resíduos de aminoácidos que o30 correm naturalmente" (isto é, codificados pelo código genético) e selecionados do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gin); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lie): Ieucina (Leu); Iisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Vai). A substituição por um ou mais resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente é também abrangi5 da pela definição de uma substituição de aminoácido apresentada aqui.
Um "resíduo de aminoácidos que não ocorre naturalmente" refere-se a um resíduo, sem ser os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente listados acima, que é capaz de se ligar de forma covalente a resíduo(s) de aminoácidos adjacente(s) em uma cadeia polipeptídica. Os exem10 pios de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos tais como os descritos em Ellman e outros Meth. Enzvm. 202:301 336 (1991). Para gerar tais resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, podem ser utilizados os procedimentos de Noren e outros 15 Science 244:182 (1989) e Ellman e outros, supra. Sucintamente, estes procedimentos envolvem a ativação química de um tRNA supressor com um resíduo de aminoácidos que não ocorre naturalmente seguida pela transcrição e pela tradução in vitro do RNA.
Uma "inserção de aminoácido" refere-se à incorporação de pelo 20 menos um aminoácido em uma seqüência de aminoácidos predeterminada. Embora a inserção consista geralmente da inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, o presente pedido de patente considera "inserções peptídicas" maiores, por exemplo, a inserção de aproximadamente três até aproximadamente cinco ou mesmo até aproximadamente dez resíduos de aminoá25 cidos. O(s) resíduo(s) inserido(s) pode(m) ser o(s) que ocorre(m) naturalmente ou que não ocorre(m) naturalmente como descrito anteriormente.
Uma "deleção de aminoácido" refere-se à remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido de uma seqüência de aminoácidos predeterminada.
O termo "mutagênese" refere-se, a não ser que seja especifica
do de outra maneira, a qualquer técnica reconhecida na técnica para a alteração de um polinucleotídeo ou de uma seqüência de polipeptídeo. Os tipos preferidos de mutagênese incluem a mutagênese por PCR propensa a erros, a mutagênese por saturação ou outra mutagênese direcionada ao sítio.
"Mutagênese direcionada ao sítio" é uma técnica padronizada na técnica e é realizada utilizando um iniciador de oligonucleotídeo sintético 5 complementar a um DNA de fago de fita simples que será submetido à mutagênese a não ser o pareamento errado limitado, representando a mutação desejada. Sucintamente, o oligonucleotídeo sintético é utilizado como um iniciador para direcionar a síntese de uma fita complementar ao DNA de fago de fita simples e o DNA de fita duplo resultante é transformado em uma bac10 téria hospedeira que carrega o fago. As culturas de bactérias transformadas são plaqueadas na superfície de ágar, permitindo a formação de placas partindo de células isoladas que carregam o fago. Teoricamente, 50% das novas placas conterão o fago que possui, na forma de uma fita simples, a forma mutada; 50% terão a seqüência original. As placas de interesse são se15 lecionadas através da hibridização com iniciador sintético tratado com quinase a uma temperatura que permite a hibridização de um pareamento exato, mas na qual os pareamentos errados com a fita original são suficientes para previnir a hibridização. As placas que se hibridizam com a sonda são então selecionadas, Sequênciadas e cultivadas e o DNA é recuperado.
No contexto da presente invenção, o termo "anticorpo" (Ab) é uti
lizado para se referir a um anticorpo nativo de uma cadeia pesada recombinada de forma clássica derivada da recombinação gênica de V(D)J e uma cadeia leve recombinada de forma clássica também derivada da recombinação gênica de VJ ou um fragmento das mesmas.
Um "anticorpo nativo" é uma glicoproteína heterotetramérica de
aproximadamente 150.000 dáltons, composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada através de ligação(ões) dissulfeto covalente(s), enquanto que o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de 30 isotipos de imunoglobulinas diferentes. Cada cadeia pesada e leve também possui pontes dissulfeto intracadeia espaçadas de forma regular. Cada cadeia pesada possui, em uma extremidade, um domínio variável (Vh) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é 5 alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada, Chothia e outros, J. Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:4592 (1985).
O termo "variável" com referência às cadeias de anticorpo é utili10 zado para se referir a ptécnicas das cadeias de anticorpo que diferem extensivamente em relação à seqüência entre os anticorpos e participam da ligação e da especificidade de cada anticorpo particular por seu antígeno particular. Tal variabilidade fica concentrada em três segmentos chamados de regiões hipervariáveis nos domínios variáveis tanto da cadeia leve quando 15 da cadeia pesada. As ptécnicas mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de Região estrutural (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente), adotando amplamente uma configuração em folha β, conectados através de três regiões hipervariáveis, que 20 forma alças que se conectam e, em alguns casos, fazendo ptécnica da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (vide Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological In25 terest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), páginas 647-669). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.
O termo "região hipervariável" quando utilizado aqui refere-se
aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região de determinação da complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos 30-36 (L1), 46-55 (L2) e 86-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 30-35 (H1), 47-58 (H2) e 93-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; MacCaIIum e outros, J Mol BioL 262(5):732-45 (1996).
O termo "região estrutural" refere-se às ptécnicas reconhecidas
na técnica de uma região variável do anticorpo que existe entre as regiões CDR mais divergentes. Tais regiões estruturais são tipicamente referidas como estruturas 1 até 4 (FR1, FR2, FR3 e FR4) e fornecem um suporte para manter, no espaço tridimensional, as três CDRs encontradas na região vari
ável do anticorpo da cadeia pesada ou leve, de forma que as CDRs possam formar uma superfície de ligação ao antígeno.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser ordenados em classes diferentes. Há cinco classes principais de anticorpos IgA1 IgD, IgE, IgG e IgM
e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2.
Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ e μ, respectivamente.
As "cadeias leves" dos anticorpos de qualquer espécie de verte
brado podem ser ordenadas em uma de dois tipos claramente definidos, chamados de kappa (k) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos de seus domínios constantes. Qualquer referência a uma cadeia leve de anticorpo apresentada aqui inclui ambas as cadeias leves κ e λ.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma ptécnica de um
anticorpo de comprimento completo, geralmente a ligação ao antígeno ou um domínio variável do mesmo. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados aos fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv e (ScFv)2.
Como utilizado aqui o termo "região de ligação ao anticorpo" re
fere-se a uma ou mais ptécnicas de uma imunoglobulina ou região variável do anticorpo capaz de se ligar a um ou mais antígenos. Tipicamente, a região de ligação ao anticorpo é, por exemplo, uma cadeia leve de anticorpo (VL) (ou uma região variável da mesma), uma cadeia pesada de anticorpo (VH) (ou uma região variável da mesma), uma região Fd da cadeia pesada, uma cadeia leve e pesada do anticorpo combinada (ou uma região variável 5 da mesma) tal como a Fab, F(ab’)2, anticorpo de domínio único ou de cadeia isolada (scFv) ou um anticorpo de comprimento completo, por exemplo, uma IgG (por exemplo, um subtipo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4), anticorpo IgAI, lgA2, IgD, IgE ou IgM.
O termo "epitopo" como utilizado aqui, refere-se a uma sequência de pelo menos aproximadamente 3 até 5, preferencialmente pelo menos aproximadamente 5 até 10 ou pelo menos aproximadamente 5 até 15 aminoácidos e tipicamente não mais que aproximadamente 500 ou aproximadamente 1.000 aminoácidos, que definem uma seqüência que por si só ou como ptécnica de uma seqüência maior, se liga a um anticorpo gerado em resposta a tal seqüência. Um epitopo não está limitado a um polipeptídeo que possui uma seqüência idêntica à ptécnica da proteína original da qual é derivada. Na verdade, genomas virais estão em uma condição de modificação constante e exibem graus relativamente altos de variabilidade entre os isolados. Assim o termo "epitopo" abrange seqüências idênticas à seqüência nativa, assim como modificações, tais como deleções, substituições e/ou inserções na seqüência nativa. Geralmente, tais modificações têm natureza conservativa, mas modificações não conservativas também são consideradas. O termo inclui especificamente "mimotopos", isto é, seqüências que não identificam uma seqüência nativa linear contínua ou não necessariamente ocorrem em uma proteína nativa, mas imitam funcionalmente um epitopo em uma proteína nativa. O termo "epitopo" inclui especificamente epitopos lineares e conformacionais.
O termo "vetor" é utilizado para se referir a uma molécula de rDNA capaz de sofrer replicação autônoma em uma célula e a qual um segmento de DNA, por exemplo, gene ou polinucleotídeo, pode ser ligado de forma opercional de forma a realizar a replicação do segmento ligado. Os vetores capazes de direcionar a expressão de genes que codificam um ou mais polipeptídeos são referidos aqui como "vetores de expressão". O termo "seqüências de controle" refere-se a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificadora ligada de forma operacional em um organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são a5 dequadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora e um sítio de ligação a ribossomos. É sabido que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.
O ácido nucleico está "ligado de forma operacional" quando é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou um líder secretor está ligado de forma operacional ao DNA para um polipeptídeo se este for expresso na forma de uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou um intensificador está ligado de forma operacional a uma sequência codificadora se este afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação a ribossomos está ligado de forma operacional a uma seqüência codificadora se este estiver posicionado de forma que facilite a tradução. Geralmente, "ligado de forma operacional" significa que as seqüências de DNA que estão ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase para leitura. Entretanto, os intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada através da ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores de oligonucleotídeo sintético ou Iigantes são utilizados de acordo com a prática convencional.
Uma "biblioteca de exibição em fagos" é uma biblioteca de ex25 pressão de proteínas que expressa uma coleção de seqüências de proteínas clonadas na forma de fusões com uma proteína de revestimento de fago. Assim, a expressão "biblioteca de exibição em fagos" refere-se aqui a uma coleção de fago (por exemplo, fago filamentoso) em que o fago expressa uma proteína externa (tipicamente heteróloga). A proteína externa está livre 30 para interagir com (se ligar a) outros grupamentos com os quais o fago é colocado em contato. Cada fago que exibe uma proteína externa é um "membro" da biblioteca de exibição em fagos. O termo "fago filamentoso" refere-se a uma partícula viral capaz de exibir um polipeptídeo heterogêneo em sua superfície e inclui, sem limitação, f1, fd, Pf1 e M13. O fago filamentoso pode conter um marcador que pode ser selecionado tal como tetraciclina (por exemplo, "fd-tet"). Vários siste5 mas de exibição em fagos filamentosos são bem conhecidos pelos peritos na técnica (vide, por exemplo, Zachere outros Gene 9: 127-140 (1980), Smith e outros Science 228: 1315-1317 (1985); e Parmley e Smith Gene 73: 305-318(1988)).
O termo "panning" é utilizado para se referir aos vários ciclos de processo de seleção na identificação e no isolamento de fagos que carregam compostos, tais como anticorpos, com altas afinidade e especificidade a um alvo.
B. Descrição Detalhada As técnicas para a realização dos métodos da presente invenção são bem conhecidas na técnica e são descritas em livros texto de laboratório padronizados, incluindo, por exemplo, Ausubel e outros, Current Protocols of Molecular Bioloqy. John Wiley e Sons (1997); Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, Terceira Edição, J. Sambrook e D. W. Russell, eds., Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 0’Brian e outros, Analvtical Chemistrv of Bacillus Thurinqiensis, Hickle e Fitch, eds., Am. Chem. Soc., 1990; Bacillus thurinqiensis: bioloqy. ecoloqy and safetv. T.R. Glare e M. 0’Callaghan, eds., John Wiley, 2000; Antibodv Phaqe Displav. Methods and Protocols. Humana Press, 2001; e Antibodies, G. Subramanian, ed., Kluwer Academic, 2004. A mutagênese pode, por exernpio, ser realizada utilizando a mutagênese direcionada ao sítio (Kunkel e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492 (1985)). Os métodos de amplificação através da PCR são descritos nas Patentes U.S. N— 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159 e 4.965.188 e em vários livros texto incluindo "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, ed., Stockton Press, New York (1989); e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis e outros, eds., Academic Press, San Diego, Calif.
(1990). A presente invenção está relacionada o constructos e bibliotecas que compreendem seqüências de cadeia leve substituta de anticorpos.
Constructos de cadeia leve substituta
Como discutido anteriormente, as pré-células B foram identifica5 das na medula óssea como linfócitos que produzem cadeias pesadas μ, mas, ao invés das cadeias leves completamente desenvolvidas, expressam um conjunto de genes específicos à linhagem B chamados de VpreB(1-3) e A5, respectivamente. Os polipeptídeos de VpreB e A5 formam juntos uma estrutura similar à cadeia leve de Ig associada de forma não-covalente, que é 10 chamada de cadeia leve substituta. A cadeia leve substituta, embora não seja uma cadeia de anticorpo, se associa naturalmente com todas as cadeias pesadas de anticorpo e foi mostrado que os complexos de cadeia leve substituta-cadeia pesada de anticorpo se ligam a antígenos próprios.
Em um aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos que 15 compreendem seqüências de VpreB e/ou de A5 e que possuem a capacidade de se ligar a um alvo. O alvo pode ser qualquer peptídeo ou polipeptídeo que é um parceiro de ligação para os polipeptídeos que contêm a seqüência de VpreB e/ou de A5 da presente invenção. Os alvos incluem especificamente todos os tipos de alvos geralmente referidos como "antígenos" no contex20 to da ligação ao anticorpo.
Assim, os polipeptídeos da presente invenção incluem, sem limitação, conjugados de seqüências de VpreB com seqüências de aminoácidos heterogêneas, contanto que mantenham a capacidade de se ligar a um alvo desejado. A ligação da seqüência de VpreB com a seqüência de aminoáci25 dos heterogênea pode ser covalente ou não-covalente e pode ocorrer diretamente ou através de um ligante, incluindo Iigantes peptídicos.
Os exemplos específicos dos constructos de polipeptídeos apresentadas aqui incluem polipeptídeos em que uma seqüência de VpreB, tal como uma seqüência de VpreBI, de VpreB2 ou de VpreB3, incluindo frag30 mentos e variações das seqüências nativas, é conjugada a uma seqüência de A5, incluindo fragmentos e variações da seqüência nativa. As fusões representativas deste tipo são ilustradas nas figuras 2 e 11 e descritas nos exemplos.
Em uma fusão direta, tipicamente o terminal C de uma seqüência de VpreB (por exemplo, uma seqüência de VpreBI, de VpreB2 ou de VpreB3) é fundida como terminal N de uma seqüência de A5. Embora seja possível fundir o comprimento total de uma seqüência nativa de VpreB a uma seqüência de A5 de comprimento completo (vide, por exemplo, o primeiro diagrama na figura 3), tipicamente a fusão ocorre no ou em torno do sítio análogo à CDR3 em cada um dos dois polipeptídeos. Tais sítios análogos à CDR3 para VpreBI e A5 são ilustrados na figura 1 e um constructo de fusão representativo é ilustrado na figura 2. Nesta modalidade, a fusão pode ocorrer dentro ou em uma localização dentro de aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos em cada lado da região análoga à CDR3. Em uma modalidade preferida, a fusão ocorre aproximadamente entre os resíduos de aminoácidos 116-126 da seqüência da VpreBI humana nativa (SEQ ID NO: 1) e aproximadamente entre os resíduos de aminoácidos 82 e 93 da seqüência da A5 humana nativa (SEQ ID NO: 5).
É também possível fundir a seqüência de VpreB com a região de CDR3 de uma cadeia leve A do anticorpo, como mostrado na figura 2. Constructos adicionais, em que apenas uma de VpreB e A5 está truncada são mostradas na figura 3. Constructos similares podem ser preparados utilizando anticorpo κ cadeia leve seqüências.
Estruturas de fusão direta adicionais são ilustradas do lado direito da figura 11. A estrutura denominada de "fusão de SLC 1" é um tetrâmero, composto de dois dímeros, em que a fusão de uma seqüência V-preB1 trun25 cada (que não possui a "cauda" característica no terminal C da VpreBI nativa) com uma seqüência de A5 truncada similarmente está associada de forma não-covalente a uma cadeia pesada de anticorpo. A estrutura denominada de "fusão de SLC 2" é um tetrâmero, composto de dois dímeros, em que a fusão de uma seqüência de VpreBI truncada (que não possui a "cauda" 30 característica no terminal C da VpreBI nativa) com uma região constante de cadeia leve do anticorpo está associada de forma não-covalente a uma cadeia pesada de anticorpo. A estrutura denominada de "fusão de SLC 3" é um tetrâmero, composto de dois dímeros, em que a fusão de uma cadeia leve de região variável do anticorpo com uma seqüência de A5 truncada (que não possui a "cauda" característica no terminal N da A5 nativa) está associada de forma não-covalente a uma cadeia pesada de anticorpo.
Como citado anteriormente, em adição às fusões diretas, os
constructos de polipeptídeos da presente invenção incluem associações não-covalentes de uma seqüência de VpreB (incluindo fragmentos e variações de uma seqüência nativa) a uma seqüência heterogênea, tal como uma seqüência de A5 (incluindo fragmentos e variações da seqüência nativa) e/ou 10 uma seqüência de anticorpo. Assim, por exemplo, uma seqüência de VpreB de comprimento completo pode estar associada de forma não-covalente a uma seqüência de A5 truncada. Alternativamente, uma seqüência de VpreB truncada pode estar associada de forma não-covalente a uma seqüência de A5 de comprimento completo.
Os constructos de cadeia leve substituta que compreendem se
qüências de VpreBI e de A5 associadas de forma não-covalente, em associação não-covalente com uma cadeia pesada de anticorpo, são mostradas do lado esquerdo da figura 11. Como as várias ilustrações mostram, as estruturas podem incluir, por exemplo, seqüências de VpreBI e de A5 de compri20 mento completo, uma seqüência de VpreBI de comprimento completo associada a uma seqüência de A5 truncada ("Lambda 5dT"), uma seqüência VreB1 truncada associada a uma seqüência de A5 de comprimento completo ("VpreB dT") e uma seqüência de VpreBI truncada associada a uma seqüência de A5 truncada ("Curta").
Embora a figura 11 ilustre certos constructos específicas, um
versado comum na técnica considerará que uma variedade de outros constructos pode ser produzida e utilizada de uma maneira similar. Por exemplo, as estruturas podem ser assimétricas, compreendendo seqüências de cadeia leve substituta diferentes em cada ramo e/ou possuindo estruturas tri30 méricas ou pentaméricas, ao contrário das estruturas ilustradas na figura 11. É também possível incluir funcionalidades diferentes em várias ptécnicas dos constructos de cadeia leve substituta da presente invenção, produzindo assim constructos multiespecíficos e/ou multivalentes.
Se desejado, os constructos da presente invenção podem ser engenheiradas, por exemplo, através da incorporação ou da ligação de seqüências ou motivos de seqüências conhecidos das regiões de CDR1, C5 DR2 e/ou CDR3 de anticorpos, incluindo anticorpos terapêuticos conhecidos nas regiões análogas à CDR1, CDR2 e/ou CDR3 das seqüências de cadeia leve substituta. Isto permite a criação de moléculas que não são anticorpos, mas exibirão especificidades e afinidades de ligação muito similares àquelas de um anticorpo terapêutico conhecido.
Todos os constructos de cadeia leve substituta apresentada aqui
podem estar associados a seqüências de anticorpos. Por exemplo, como mostrado na figura 5, uma fusão de VpreB-A5 pode estar ligada a uma seqüência de região variável de cadeia pesada de anticorpo através de um Iigante peptídico. Em uma outra modalidade, uma fusão de VpreB-A5 está as15 sociada de forma não-covalente a uma cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento da mesma incluindo uma seqüência da região variável para formar um complexo dimérico. Ainda em uma outra modalidade, as seqüências de VpreB e A5 estão associadas de forma não-covalente a cada outra e uma cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento da mesma incluindo uma se20 quência da região variável, formando assim um complexo trimérico. Os exemplos de constructos que compreendem uma cadeia pesada de anticorpo são ilustrados na figura 11.
Embora os constructos da presente invenção sejam ilustrados como referência a certas modalidades, um versado comum entenderá que 25 várias modalidades adicionais obtidas através de várias permutações de cadeia leve substituta e seqüências de anticorpos são possíveis e estão dentro do âmbito da presente invenção. A presente invenção inclui todas os constructos que compreendem seqüências de cadeia leve substituta e que possuem a capacidade de se ligar a um alvo desejado. Em certa modalidade, os 30 constructos também possuem a capacidade de se associar a seqüências de região variável de cadeia pesada de anticorpo.
Os constructos da presente invenção podem ser utilizados para construir bibliotecas de seqüências de cadeia leve substituta, que podem ser utilizadas para várias finalidades, similarmente a bibliotecas de anticorpos, incluindo a seleção de constructos com as especificidades e as afinidades de ligação desejadas.
Quando as seqüências de cadeia leve substituta de VpreB e A5
estão associadas de forma não-covalente uma com as outras, as extremidades livres de um ou de ambos os componentes (isto é, a extremidade Cterminal da seqüência de VpreB e/ou a extremidade N-terminal da seqüência de A5) estão disponíeis para a incorporação de uma diversidade adicional na 10 biblioteca de tais seqüências. Por exemplo, uma biblioteca de peptídeos aleatórios pode ser anexada ou substituída em uma destas extremidades livres e "peneiradas" em relação à ligação específica a um alvo particular. Através da combinação da cadeia leve substituta identificada como possuindo a especificidade de ligação desejada com uma cadeia pesada ou um fragmento 15 de cadeia pesada de um anticorpo para o mesmo alvo, pode ser criada uma molécula que possui a capacidade de se ligar ao alvo cognato em dois locais distintos. Esta ligação em tandem ou efeito "quelante", reforça intensamente a ligação a um alvo isolado, similar aos efeitos de avidez observados em imunoglobulinas diméricas. É também possível utilizar componentes que se 20 ligam a alvos diferentes. Assim, por exemplo, o componente de cadeia leve substituta com a especificidade de ligação desejada pode ser combinado com uma cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento pesado que se liga a um alvo diferente. Por exemplo, o componente de cadeia leve substituta pode se ligar a um antígeno de tumor enquanto que a cadeia pesada de anti25 corpo ou o fragmento de cadeia pesada pode se ligar a células efetoras. Desta maneira, uma entidade única com direcionamento e atividade antitumor pode ser criada. Em uma modalidade particular, o apêndice ou o polipeptídeo que conecta as seqüências de VpreB e A5 pode ser um anticorpo ou fragmentos de anticorpo, tal como um Fab ou um fragmento de scFv. A 30 incorporação de uma seqüência de anticorpo não criará apenas um efeito "quelante", mas também pode gerar biespecificidade em uma única molécula, sem a necessidade de um segundo ramo independente, tal como o encontrado em anticorpos biespecíficos. As duas especificidades podem ser para ptécnicas diferentes do mesmo alvo, para alvos muito diferentes ou para um complexo de alvo anticorpo. Similarmente, constructos multiespecíficos podem ser produzidas com qualquer tipo de molécula, sem ser anticor5 pos ou fragmentos de anticorpos, incluindo peptídeos, proteínas, enzimas e similares. Por exemplo, o componente de cadeia leve substituta com a especificidade desejada pode ser combinado com qualquer peptídeo ou proteína terapêutica.
Preparação de constructos de cadeia leve substituta Os constructos de cadeia leve substituta da presente invenção
podem ser preparados através de métodos conhecidos na técnica, incluindo técnicas bem conhecidas da tecnologia de DNA recombinante.
O ácido nucleico que codifica cadeia leve substituta, por exemplo, polipeptídeos VpreB e λ5, pode ser isolado partindo de fontes naturais, 15 por exemplo, células B em desenvolvimento e/ou obtido através de métodos sintéticos ou semissintéticos. Uma vez que o DNA foi identificado e isolado ou produzido de outra maneira, este pode ser ligado em um vetor que pode ser replicado para clonagem adicional ou para expressão.
Os vetores de clonagem e de expressão que podem ser utiliza20 dos para a expressão das seqüências codificadoras dos polipeptídeos apresentados aqui são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um 25 promotor e uma seqüência de término da transcrição. As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou para a expressão do DNA que codifica os constructos de cadeia leve substituta nos vetores apresentados aqui são células de procariotos, de levedura ou de eucariotos superiores (mamífero), as células de mamífero sendo preferidas.
Os exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos
adequadas incluem, sem limitação, a linhagem renal CV1 de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linhagem renal embrionário humano 293 (células 293) subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham e outros, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células renais de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/DHFR (CHO, Urlaub e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980));
5 células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células renais de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células renais de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de "buffalo rat" (BRL 3A, ATCC CRL 10 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather e outros, Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
Para uso em células de mamífero, as funções de controle sobre
os vetores de expressão são frequentemente fornecidas por material viral. Assim, promotores comumente utilizados podem ser derivados dos genomas de polioma, Adenovírus2, retrovírus, citomegalovírus e Vírus de Símio 40 (SV40). Outros promotores, tal como o promotor da β-actina, são originados 20 de fontes heterólogas. Os exemplos de promotores adequados incluem, sem limitação, os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 (Fiers e outros, Nature, 273: 113 (1978)), o promotor inicial imediato do citomegalovírus humano (Greenaway e outros, Gene, 18: 355-360 (1982)) e promotor e/ou seqüências de controle normalmente associadas à seqüência gênica desejada, 25 contanto que tais seqüências de controle sejam compatíveis com o sistema de célula hospedeira.
A transcrição de um DNA que codifica um polipeptídeo heterólogo desejado por eucariotos superiores é aumentada através da inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. O intensificador é um elemento do 30 DNA que atua em cis, geralmenta de aproximadamente 10 até 300 pb, que atua sobre o promotor para aumentar sua atividade de início da transcrição. Os intensificadores são relativamente independentes da orientação e da posição, mas preferencialmente ficam localizados a montante da seqüência promotora presente no vetor de expressão. O intensificador poderia ser originado da mesma fonte que o promotor, tal como, por exemplo, de um vírus de célula eucariótica, por exemplo, o intensificador do SV40 do lado tardio 5 da origem de replicação (pb 100-270), o intensificador do promotor inical de citomegalovírus, o intensificador de polioma do lado tardio da origem de replicação e intensificadores de adenovírus.
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras de mamíferos também contêm sítios de poliadenilação, tais como os derivados de vírus tal como, por exemplo, o SV40 (inicial e tardio) ou o HBV.
Uma origem de replicação pode ser fornecida através do constructo do vetor para incluir uma origem exógena, de forma que pode ser derivada do SV40 ou outra fonte viral (por exemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) ou pode ser fornecida pela célula hospedeira.
Os vetores de expressão contêm geralmente um marcador que
pode ser selecionado que codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou para o crescimento de uma célula hospedeira transformada com o vetor. Os exemplos de marcadores que podem ser selecionados adequados para células de mamífero incluem dihidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK) e neomicina.
Os vetores de expressão de mamíferos adequados são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Assim, por exemplo, os constructos de cadeia leve substituta da presente invenção podem ser produzidos em células hospedeiras de mamíferos utilizando um vetor de 25 expressão pCI (Promega), que carrega a região intensificadora/promotora imediata inicial do citomegalovírus (CMV) humano para promover a expressão constitutiva de um inserto de DNA. O vetor pode conter um gene da neomicina fosfotransferase como um marcador que pode ser selecionado.
Os constructos de cadeia leve substituta da presente invenção também podem ser produzidos em células hospedeiras bacterianas. Os eIementos de controle para uso em sistemas bacterianos incluem promotores, contendo opcionalmente seqüências operadoras e sítios de ligação a ribossomos. Os promotores adequados incluem, sem limitação, os promotores de galactose (gal), Iactose (lac), maltose, triptofano (trp), β-lactamase, promotores de bacteriófagos λ e T7. Em adição, podem ser utilizados promotores sintéticos, tal como o promotor Tac. Os promotores para uso em sistemas 5 bacterianos também contêm geralmente uma seqüência de Shine-Dalgarno (SD) ligada de forma operacional ao DNA que codifica a molécula de Fab. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas.
As seqüências codificadoras das cadeias individuais dentro de 10 um constructo multicadeias que compreende seqüências de anticorpos de cadeia leve substitutas podem estar presentes no mesmo vetor de expressão, sob o controle de seqüências reguladoras separadas ou em vetores de expressão separados, utilizados para co-transfectar células hospedeiras desejadas, incluindo hospedeiros eucarióticos e procarióticos. Assim, vários 15 genes podem ser coexpressos utilizando os vetores Duet® disponíveis comercialmente na Novagen.
As células hospedeiras transformadas podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios disponíveis comercialmente para a cultura de células hospedeiras de mamíferos incluem Ham’s F10 (Sigma), Meio 20 Essencial Mínimo (Minimal Essential Medium ((MEM)), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma). Em adição, qualquer um dos meios descritos em Ham e outros, Meth. Enz. 58:44 (1979) e Barnes e outros, Anal. Biochem. 102:255 (1980) pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. As condições de cultura, 25 tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e são incluídas nas instruções do fabricante ou serão de outra maneira evidentes para o versado comum na técnica.
Ainda, os meios adequados para a cultura de células hospedeiras de mamíferos, bacterianas (por exemplo, E. coli) ou outras também são descritos em livros textos padronizados, tal como, por exemplo, Sambrook e outros, supra ou Ausubel e outros, supra. A purificação pode ser realizada através de métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida, as moléculas de anticorpo substitutas são purificadas em uma forma marcada com 6xHis, utilizando o sistema de purificação Ni-NTA (Invitrogen).
As bibliotecas compreendem seqüências de cadeia leve substi
tuta
A presente invenção está adicionalmente relacionada a várias bibliotecas de seqüências de cadeia leve substituta e constructos que compreendem tais seqüências. Assim, tais bibliotecas podem compreender, con10 sistir essencialmente de ou consistir de display de seqüências de cadeia leve substituta, tais como os constructos que contêm VpreB e/ou A5 da presente invenção, incluindo, sem limitação, aquelas descritas especificamente acima, ilustradas nas figuras e/ou descritas nos Exemplos.
As bibliotecas da presente invenção estão preferencialmente na forma de um display. Os sistemas para exibição de proteínas heterólogas, incluindo anticorpos e outros polipeptídeos, são bem conhecidos na técnica. Foram exibidos na superfície de fago filamentoso os fragmentos de anticorpos que codificam os genes de anticorpos (Hoogenboom e Winter J. MoL Biol., 222:381 388 (1992); McCafferty e outros, Nature 348(6301):552 554 (1990); Griffiths e outros EMBO J., 13(14):3245-3260 (1994)). Para uma revisão das técnicas para a seleção e para a verificação de bibliotecas de anticorpos vide, por exemplo, Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23(9):1105-1116 (2005). Em adição, há sistemas conhecidos na técnica para a exibição de proteínas heterólogas e fragmentos das mesmas na superfície de Escherichia coli (Agterberg e outros, Gene 88:37-45 (1990); Charbit e outros, Gene 70:181-189 (1988); Francisco e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:2713- 2717 (1992)) e levedura, tal como Saccharomyees cerevisiae (Boder e Wittrup, Nat. Biotechnol. 15:553-557 (1997); Kieke e outros, Protein Eng. 10:1303-1310 (1997)). Outras técnicas de exibição conhecidas incluem exibição de ribossomos ou de mRNA (Mattheakis e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9022-9026 (1994); Hanes e Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4937-4942 (1997)), exibição de DNA (Yonezawa e outros, NucL Acid Res. 31(19):e118 (2003)); exibição em células microbianas, tal como exibição bacteriana (Georgiou e outros, Nature Biotech. 15:29-34 (1997)), exibição em células de mamífero, exibição em esporos (Isticato e outros, J. Bacteriol. 183:6294-6301 (2001); Cheng e outros, Appl. Environ. Microbiol.
5 71:3337-3341 (2005) e pedido de patente provisório copendente N- de Série 60/865.574, depositado em 13 de novembro de 2006), exibição viral, tal como exibição em retrovírus (Urban e outros, Nucieic Aeids Res. 33:e35 (2005), exibição baseada na ligação de proteína-DNA (Odegrip e outros, Proc. Acad. Natl. Sei. USA 101:2806-2810 (2004); Reiersen e outros, Nucleic 10 Aeids Res. 33:e10 (2005)) e exibição em microesferas (Sepp e outros, FEBS Lett. 532:455-458 (2002)).
Para a finalidade da presente invenção, as bibliotecas que contêm cadeias leves substitutas podem ser vantajosamente exibidas utilizando qualquer técnica de exibição, incluindo exibição em fagos e exibição em esporos.
Na exibição em fagos, a proteína heteróloga, tal como um polipeptídeo de cadeia leve substituta, é ligada a uma proteína do revestimento de uma partícula de fago, enquanto a seqüência de DNA da qual esta foi expressa é empacotada dentro do revestimento do fago. Detalhes dos métodos 20 de exibição em fagos podem ser encontrados, por exemplo, em McCafferty e outros, Nature 348, 552-553 (1990)), que descrevem a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos in vitro, partindo de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulinas de doadores nãoimunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticor25 po são clonados em quadro dentro do gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e exibidos na forma de fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Devido ao fato de que a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, seleções baseadas nas proprie30 dades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe tais propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição em fagos pode ser realizada em uma variedade de formatos; para a revisão dos mesmos vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell1 David J., Current Opinion in Structural Bioiogy 3, 564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V de cadeia pesada podem ser desco5 bertas através da exibição em fagos. Clarkson e outros, Nature 352, 624-628
(1991) isolaram um arranjo diverso de cadeias pesadas e cadeias leves antioxazolona partindo de uma biblioteca combinatória aleatória pequena de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de cadeias pesada e leve provenientes de doadores humanos 10 não imunizados pode ser construído e recuperado de forma específica a um arranjo diverso de antígenos (incluindo antígenos próprios) seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks e outros, J. Mol. Biol. 222, 581- 597 (1991) ou Griffith e outros, EMBO J. 12, 725-734 (1993). Estas e outras técnicas conhecidas na técnica, podem ser adaptadas para a exibição de 15 qualquer polipeptídeo, incluindo polipeptídeos e outros constructos que compreendem seqüências de cadeia leve substituta. Assim, por exemplo, a cadeia leve substituta pode ser suplementada com uma coleção de cadeias pesadas provenientes de uma fonte naturalmente diversa, tal como linfócitos ou uma coleção gerada de forma sintética criada inteiramente através de 20 técnicas de biologia molecular. Estas coleções podem ser clonadas, expressas e selecionadas através de métodos conhecidos na técnica. O SURROBODY® resultante selecionado pode ser utilizado diretamente, expresso na forma de uma molécula multimérica ou pode ser adicionalmente otimizado através da otimização da cadeia pesada ou da otimização da cadeia leve 25 substituta, por exemplo, utilizando mutagênese aleatória ou específica ao sítio não-aleatória ou regional.
Os sistemas de exibição em esporos se baseiam na ligação das seqüências que serão exibidas com uma proteína de revestimento, tal como uma proteína de revestimento de esporos de Bacillus subtilis. O protoplasto 30 do esporo (núcleo) é circundado pela parede celular, o córtex e o revestimento do esporo. Dependendo da espécie, também pode estar presente um exósporo. A parede do núcleo é composta do mesmo tipo de peptidoglicana que a parede celular vegetativa. A exibição em esporos, incluindo um sistema de exibição na superfície utilizando um componente do revestimento do esporo de Bacillus subtilis (CorB) e exibição em esporos de Bacillus thuringiensis (Bt), são descritos em Isticato e outros, J. Bacteriol. 183:6294-6301 5 (2001); Cheng e outros, Appl. Environ. Mierobioi 71:3337-3341 (2005), cujas descrições inteiras são expressamente incorporadas aqui como referência. Várias técnicas de exibição em esporos também são descritas nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nes 20020150594; 20030165538; 20040180348; 20040171065; e 20040254364, as divulgações inteiras são 10 expressamente incorporadas aqui como referência.
Uma vantagem dos sistemas de exibição em esporos é a superfície de partícula e o tamanho de partícula homogêneos de natureza nãoeucariótica, que é esperado que fornecem uma base não reativa. Em adição, o tamanho de partícula dos esporos é suficiente para possibilitar a seleção 15 por citometria de fluxo que permite o isolamento clonal que pode ser selecionado, com base nas interações.
Aumentando a estabilidade de esporos, é possível realizar vários tratamentos e modificações químicas, enzimáticas e/ou ambientais pósesporulação. Assim, é possível estabilizar estruturas helicoidais estruturais 20 com tratamento químico utilizando trifluoroetanol (TFE), quando tais estruturas são exibidas. Em adição, são possíveis tratamentos com estresse oxidativo, tais como tratamentos com Espécies de Oxigênio Reativas (por exemplo, peróxido) ou Espécies de Nitrogênio Reativas (por exemplo, ácido nitroso). É também possível expor populações definidas ou em estado natural de 25 polipeptídeos exibidos em esporos a tratamentos enzimáticos, tal como exposição proteolítica, outros processos enzimáticos, fosforilação etc. Outros tratamentos possíveis incluem, sem limitação, nitrosilação através de tratamento com peroxinitrita, proteólise através de tratamento com protease recombinante, purificada ou do soro, irradiação, coincubação com chaperonas 30 conhecidas, tais como proteínas de choque térmico (tanto bacterianas quanto de mamíferos), tratamento com proteínas de dobramento, tais como proteína dissulfeto isomerase, prolil isomerase etc., liofilização e tratamentos similares à preservação, tal como tratamento com timerosol. Estes tratamentos podem ser realizados através de métodos bem conhecidos na técnica.
Técnicas similares podem ser utilizadas em todos os sistemas de exibição em esporos, incluindo exibições em que a ligação é feita a uma 5 proteína de revestimento de esporo, incluindo, por exemplo, os sistemas de exibição em esporos divulgados em
Usos de seqüências de cadeia leve substituta. constructos e bibliotecas contendo as mesmas
As bibliotecas da presente invenção podem ser utilizados para identificar seqüências de cadeia leve substituta e constructos de cadeia leve substituta, tais como fusões que compreendem seqüências de cadeia leve substituta, com propriedades desejadas. Por exemplo, a verificação in vitro ou in vivo das bibliotecas apresentadas aqui pode fornecer polipeptídeos que compreendem seqüências de cadeia leve substituta que se ligam a alvos desejados com altas especificidade e afinidade de ligação. Assim, as bibliotecas apresentadas aqui podem ser utilizadas para identificar moléculas com finalidades terapêuticas e de diagnóstico, tais como polipeptídeos que compreendem seqüências de cadeia leve substituta que se ligam a marcadores de tumores ou outros alvos moleculares de intervenção terapêutica. Em adição, através das técnicas descritas anteriormente, bibliotecas altamente diversas de polipeptídeos de cadeias leves substitutas podem ser engenheiradas, incluindo bibliotecas que compreendem uma coleção de polipeptídeos que se ligam ao mesmo alvo, bibliotecas de polipeptídeos que se ligam a alvos diferentes, bibliotecas de polipeptídeos com várias especificidades e similares.
Como um resultado de sua capacidade de se ligarem a qualquer alvo desejado, os constructos de cadeia leve substituta de anticorpo da presente invenção podem ser utilizadas em ensaios analíticos e diagnósticos, para detectar a presença de uma molécula alvo desejada, tal como um antí30 geno de tumor ou qualquer polipeptídeo associado a um estado de doença ou estado de saúde. Em adição, as constructos de cadeia leve substituta da presente invenção podem ser utilizados como agentes terapêuticos, tal como, por exemplo, na terapia para câncer, para direcionamento a antígenos de tumor que foram determinados como estando associados com o desenvolvimento e/ou o espalhamento de câncer.
Detalhes adicionais da invenção são fornecidos nos Exemplos 5 não Iimitantes a seguir.
Exemplo 1
VpreB como uma proteína de domínio de ligação e fusões que contém a mesma
Para produzir um domínio de ligação de VpreB, uma proteína isolada mostrada na figura 5 é criada de forma recombinante. O constructo de proteína do domínio de ligação a SLC é compreendido dos aminoácidos até 121 de VpreBI e dos aminoácidos 87 até 105 de Λ5. Se desejado, para criar capacidades novas e de ligação específica, a molécula é reengenheirada de acordo com evidências estruturais ou da seqüência. Adicionalmente ou alternativamente, uma coleção de variações é criada aleatoriamente, por exemplo, através de PCR propensa a erros ou diretamente através de mutagênese específica a um único ou a vários sítios com uma coleção de aminoácidos. Os clones ou as coleções resulantes são então clonadas em quadro com plll para uso na exibição em fagos ou fagemídeos. Este constructo de fagemídeo é transformado em células TG1. A seguir, uma colônia isolada é propagada em Luria Broth (LB) suplementado com 50 μg/mL de Ampicilina e 2% de glicose até atingir D0600 de ~0,3 e infectada com o fago auxiliador MK307 a 37 0C durante 30 minutos sem agitação. As células são então peletizadas e então ressuspensas em LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e 75 μg/mL de canamicina e foi permitido que crescessem durante a noite com aeração vigorosa a 30 °C. No dia seguinte o sobrenadante contendo a proteína de fusão SLC-HC expressa em fagemídeo é utilizado em Fogo-ELISAs para determinar a ligação ao alvo. Sucintamente, o ELISA envolve o revestimento e o bloqueio de uma placa de ELISA com TNF-α humano, seguidos pela incubação do fago com SLC-HC durante 2 horas a 4 °C, lavagem com PBS-Tween-20 (0,05%) e detecção direta com o anticorpo anti-m13-HRP. Alternativamente, a ligação é avaliada através da amplificação direta ou da eluição do fago ligado e os títulos dos fagos são determinados utilizando células XL-IBlue. Este exemplo descreve uma fusão do domínio de ligação de SLC na forma de um clone isolado, mas esta SLC pode ser recombinada de forma recombinante com outras seqüências heterólogas que reconhecem 5 um alvo comum e verificada na forma de uma biblioteca. Além disso, esta proteína de ligação à SLC pode ser combinada com uma coleção previamente selecionada de cadeias pesadas e verificada diretamente no mesmo alvo de interesse ou um segundo alvo de interesse para criar uma molécula biespecífica. Alternativamente, isto reforçou que a ligação ou a ligação bies10 pecífica pode ser descoberta através da verificação em associação com coleções não selecionadas de cadeias pesadas. Em adição, embora este exemplo se refira às cadeias pesadas de anticorpo, deve ser entendido que uma cadeia pesada completa não é necessária. Fusões de cadeia isolada que compreendem seqüências da região variável da cadeia pesada, na au15 sência de uma região constante de cadeia pesada ou uma região constante de cadeia pesada completa, podem ser produzidas de uma maneira análoga e estão dentro do âmbito deste exemplo.
Exemplo 2
Fusões de VpreB como um parceiro de cadeia pesada variável
(VH)
Uma proteína de fusão VpreB-A5 funcional mostrada no segundo diagrama da figura 5 (denominada de "Proteína de fusão de VpreB - complexo dimérico") é criada de forma recombinante. A proteína de fusão VpreB25 Λ5 é compreendida de uma seqüência de sinal do gene Ill de m13, os aminoácidos 20 até 115 de VpreBI e os aminoácidos 83 até 209 de A5. Este constructo é coexpressa com uma fusão de cadeia pesada variável-CH1 em quadro com plll para uso na exibição em fagos ou em fagemídeos. Como uma seqüência codificadora de VH, a seqüência codificadora de VH do anti30 corpo anti-TNFa, D2E7, é utilizado e CH1 é a região CH1 da IgGI humana. Este constructo de fagemídeo é transformadas em células TG1. A seguir, uma colônia isolada é propagada em Luria Broth (LB) suplementado com 50 pg/mL de ampicilina e 2% de glicose até atingir D0600 de -0,3 e infectada com o fago auxiliador MK307 a 37 graus durante 30 minutos, sem agitação. As células são então peletizadas e então ressuspensas em LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e 75 μg/mL de canamicina é é permitido que cresçam 5 durante a noite com aeração vigorosa a 30 graus. No dia seguinte, o sobrenadante contendo a proteína de fusão SLC-HC expressa em fagemídeo é utilizado em Fogo-ELISAs para determinar a ligação ao alvo. Sucintamente o ELISA envolve o revestimento e o bloqueio de uma placa de ELISA com TNF-α humano, seguidos pela incubação do fago com SLC-HC durante 2 10 horas a 4 graus, lavagem com PBS-Tween-20 (0,05%) e detecção direta com o anticorpo anti-m13-HRP. Alternativamente a ligação pode ser avaliada através da amplificação direta ou da eluição do fago ligado e os títulos dos fagos são determinados utilizando células XL-1 Blue. Este exemplo descreve uma fusão de SLC utilizada como parceiro de ligação com uma fusão de ca15 deia pesada variável-CH1 na forma de um clone isolado, mas esta SLC também pode ser combinada com uma coleção concentrada de regiões variáveis de cadeia pesada que reconhecem um alvo comum e verificada na forma de uma biblioteca. Além disso, esta fusão de SLC pode ser combinada com uma coleção não-selecionada de cadeias pesadas e verificada direta20 mente em um alvo de interesse. Como uma fusão de SLC razoável alternativa, a associação de VH pode ser reforçada através da fusão da região Iambda constante de uma cadeia leve de anticorpo tradicional ao invés do fragmento da proteína A5.
Exemplo 3
VpreB e Iambda5 na forma de um parceiro de cadeia pesada va
riável (VH) associado
A proteína coexpressa VpreB-A5 mostrada no terceiro diagrama da figura 5 (denominada de "VpreB e Iambda 5 - complexo trimérico") é constituída de uma seqüência de sinal do gene Ill de m13 e os aminoácidos 30 correspondentes da VpreBI processada madura prevista (aminoácidos 20 até 146) e Iambda 5 (aminoácidos 31 até 209). Estas são coexpressas com uma fusão de cadeia pesada variável-CH1 em quadro com plll para uso na exibição em fagos ou em fagemídeos. Como uma seqüência codificadora de VH1 a seqüência codificadora de VH do anticorpo anti-TNFa, D2E7, é utilizada e CH1 é a região CH1 da IgGI humana. Este constructo de fagemídeo é transformada em células TG1. A seguir, uma colônia isolada é propagada em Luria Broth (LB) suplementado com 50 μg/mL de ampicilina e 2% de glicose até atingir D0600 de ~0,3 e é então infectada com o fago auxiliador MK307 a 37 graus durante 30 minutos, sem agitação. As células são então peletizadas e então ressuspensas em LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e 75 μ/mL de canamicina é é permitido que cresçam durante a noite com aeração vigorosa a 30 graus. No dia seguinte o sobrenadante contendo os complexos proteicos triméricos de SLC HC expressos em fagemídeos é utilizado em Fogo-ELISAs para determinar a ligação ao alvo. Sucintamente o ELISA envolve o revestimento e o bloqueio de uma placa de ELISA com TNF-α humano, seguidos pela incubação do fago com SLC-HC durante 2 horas a 4 graus, lavagem com PBS-Tween-20 (0,05%) e detecção direta com o anticorpo anti-m13-HRP. Alternativamente a ligação pode ser avaliada através da amplificação direta ou da eluição do fago ligado e os títulos dos fagos são determinados utilizando células XL-1 Blue. Este exemplo descreve a SLC utilizada como parceiro de ligação com uma fusão de cadeia pesada variável-CH1 na forma de um clone isolado, mas esta SLC pode ser combinada com uma coleção concentrada de regiões variáveis de cadeia pesada que reconhecem um alvo comum e verificada na forma de uma biblioteca. Além disso, esta fusão de SLC pode ser combinada com uma coleção nãoselecionada de cadeias pesadas e verificada diretamente em um alvo de interesse.
Exemplo 4
Engenharia de diversidade nas regiões análogas à CDR3 de V
preB1
Uma vez que as regiões análogas à CDR da cadeia leve substituta (SLC) terão funções similares às das CDRs de uma cadeia leve de anticorpo, é importante determinar os pontos de fusão entre a VpreB e a A5. De acordo com uma abordagem, o ponto de fusão mais adequado para uma finalidade particular é determinado partindo do sítio análogo à CDR3 que contém todos os aminoácidos de VpreB e substituindo de forma crescente os aminoácidos de posição em posição da A5 codificada em oligonucleotídeos que podem ser clonados. Esta substituição crescente continua até que o sí5 tio análogo à CDR esteja totalmente composto de uma seqüência de origem de A5. Em algum ponto durante este processo, poderia ser desejável adicionar uma cadeia pesada complementar e permitir/facilitar sua ligação e seu reconhecimento de antígenos. Para aumentar adicionalmente ou possibilitar esta complementação, a diversidade aleatória pode ser utilizada em qual10 quer um dos sítios análogos à CDR, assim como a diversidade baseada na análise do comprimento de CDRs combinadas. Alternativamente ou em adição, as seqüências VA5 do anticorpo podem ser utilizadas para adicionar diversidade, uma vez que seus comprimentos de CDRs se combinam bem com os comprimentos de sítios análogos à CDR de VpreB.
Exemplo 5
Adição de funcionalidades aos componentes de SLC Uma vez que a SLC é compreendida de dois polipeptídeos independentes isto cria oportunidades naturais para anexar ou embutir funcionalidades secundárias. No presente Exemplo, no primeiro caso um scFv antiVEGF é inserido para criar uma proteína de fusão que liga VpreB e A5 (figura 9A). Este scFv que restringe a SLC engenheirado resultante é pareado com a cadeia pesada de um anticorpo anti-TNF-α. O constructo resultante é coexpressa com a cadeia pesada clonada em quadro com plll para uso na exibição em fagos ou em fagemídeos. Este constructo de fagemídeo é transformada em células TG1 e uma colônia isolada é propagada em Luria Broth (LB) suplementado com 50 μg/mL de ampicilina e 2% de glicose até atingir D0600 de ~0,3 e infectada com o fago auxiliador MK307 a 37 0C durante 30 minutos sem agitação. As células são então peletizadas e então ressuspensas em LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e 75 μg/mL de canamicina é é permitido que cresçam durante a noite com aeração vigorosa a 30 °C. No dia seguinte o sobrenadante contendo proteína de fusão SLC-HC expressa em fagemídeo é utilizado em Fogo-ELISAs para determinar a ligação ao alvo. Sucintamente o ELISA envolve o revestimento e o bloqueio de uma placa de ELISA com TNF-α humano ou VEGF humano, seguidos pela incubação do fago com SLC-HC durante 2 horas a 4 °C, lavagem com PBS-Tween-20 (0,05%) e detecção direta com o anticorpo anti-m13-HRP.
A seguir, é criada uma fusão do scFv anti-VEGF como terminal
C de VpreB e o constructo de complexo proteico tripartido resultante é avaliada similarmente ao ELISA com fagemídeos descrito anteriormente.
Alternativamente, o scFv antiovalbumina é fundido ao terminal amino de A5 e o complexo proteico tripartido é testado em relação à ligação tanto ao TNF-α quanto à ovalbumina.
Finalmente, estes dois constructos de fusão (a VpreB-scFv antiVEGF e a A5-anti-ovalbumina) são combinadas com a cadeia pesada do anticorpo anti-TNF-α para criar uma molécula triespecífica, que é então confirmada no ELISA com fagemídeo como descrito anteriormente.
Na descrição, o scFv contra alvos distintos é incorporado, porém
podem ser combinados Iigantes funcionais ao mesmo alvo para criar "superligantes" em tandem. Estes Iigantes em tandem pode fornecer ligação reforçada ou até mesmo, em alguns casos, a função de ligação cruzada. A ligação cruzada de Fab será benéfica em casos em que anticorpos inteiros for20 necem ligação cruzada indesejável e prolongada. Por exemplo, pode não ser desejável que anticorpos do receptor de insulina de imunoglobulina inteira que atuam como substitutos de insulina requeram 3-4 semanas para a eliminação do soro. Uma vez que a insulina possui geralmente uma meia-vida de minutos, um Fab estaria mais de acordo com esta escala de meia-vida e en25 tão a funcionalidade em tandem poderia ser dirigida apropriadamente por este pedido de patente.
As descrições anteriores descrevem apenas anticorpos como grupos funcionais secundários, mas também podem incorporar similarmente peptídeos relevantes (por exemplo, imitadores de eritropoietina (EPO)), re30 ceptores (por exemplo, TNF-RI), proteínas de ligação (por exemplo, IL-1ra) e qualquer proteína terapêutica, tal como interferons, às constructos anexadas e limitadas para criar moléculas de funções similares. Ainda poderiam ser utilizados os dois sítios para incorporar proteínas heterodiméricas, de forma que as cadeias pesada e leve criem uma molécula similar a Fab secundária.
Finalmente, foram descritos somente casos singulares, mas a 5 incorporação de bibliotecas de anticorpos em fagos distintas de forma combinatória e bibliotecas de diversidade de peptídeos também é incluída aqui, para verificar anticorpos candidatos de SLC contra seus alvos direcionados e desejados.
Exemplo 6
Expressão de constructos de cadeia leve substituta (SURRO
BODY®) em células de mamífero
As seqüências codificadoras dos componentes de cadeia leve substituta das estruturas mostradas na figura 11 na forma de "trímeros" (também referidas como "variações de SURROBODY®") foram cotransfectadas com uma cadeia pesada de anticorpo IgGI de comprimento completo em células CHO-K1 (ATCC CCL-61) para produzir de forma transitório constructos de cadeia leve substituta para análise bioquímica. Especificamente, a VpreBI e a A5 humanas de comprimento completo foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pCI (Promega, Madison Wl). Estes constructos continham seus sinais de secreção previstos nativos. No caso da VpreBI, o peptídeo sinal previsto é constituído pelos aminoácidos 1-20 da SEQ ID NO: 1, para a A5 a seqüência de sinal prevista é constituída dos aminoácidos 1- da SEQ ID NO: 5. Para ambas destas proteínas, foram deletadas ptécnicas de suas caudas não estruturais previstas. Para a VpreBI esta incluía os aminoácidos 122-146 C-terminais da SEQ ID NO: 1 e para a Iambda 5 esta incluía os aminoácidos 30-86 N-terminais da SEQ ID NO: 5.
A seqüência da seqüência de A5 truncada no "trímero" apresentado na figura 11 como "Lambda 5 dT" é mostrada como a SEQ ID NO: 7. A seqüência da seqüência de VpreBI truncada no "trímero" apresentado na figura 11 como "VpreB dT" é mostrada como a SEQ ID NO: 8.
Cada uma das quatro possibilidades de cadeias leves substitutas combinatórias foi co-transfectada com uma cadeia pesada anti-infIuenza humana conhecida, contendo uma marcação (tag) de hexa-histidina (His6) C-terminal (SEQ ID NO: 9) e expressa de acordo com as sugestões do fabricante (Invitrogen, Carlsbad CA) em meio com baixo conteúdo de soro. Após 3 dias, os sobrenadantes foram coletados, filtrados e purificados por croma5 tografia com quelato de níquel (Qiagen, Alemanha). As proteínas purificadas foram então verificadas através da análise de western blot com soro de coelho antipeptídeo (VpreB e Λ5) ou anticorpos anti-histidina (Serotec, Raleigh NC). A detecção de proteínas foi visualizada após anti-HRP de coelho (VpreB e A5) ou anti-HRP de camundongo (cadeia pesada) e do desenvolvi10 mento colorimétrico com o substrato TMB. (figura 12, faixas 1 -4)
Adicionalmente, fusões de cadeias leves substitutas (vide a figura 11) foram criadas através da engenharia de uma proteína quimérica composta do gene VpreBI e o gene Λ5 ou o domínio Iambda constante da cadeia leve. Especificamente, foi produzida uma proteína fundida de forma re15 combinante que continha os aminoácidos 1-87 da VpreB (SEQ ID NO: 1) com os aminoácidos 121-209 da proteína Λ5 (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 10). Adicionalmente, foi feita uma segunda fusão que continha os aminoácidos 1-87 da VpreB (SEQ ID NO: 1) com o aminoácido 121 C-terminal da região constante da cadeia leve λ do anticorpo (SEQ ID NO: 11). Cada fusão 20 de cadeia leve substituta foi expressa de forma transitória, coletada, purificada e verificada através da análise de western blot, essencialmente como descrito anteriormente. De forma notável, como ambas as fusões continham
o epitopo para o soro anti-peptídeo anti-VpreB1, este foi utilizado para a análise de western blot. (figura 12, faixas 5-6)
Exemplo 7
Expressão de constructos de cadeia leve substituta (SURROBODY®) em E. coli
Uma vez que as proteínas recombinantes são frequentemente expressas de forma benéfica em bactérias, foi testada a capacidade de produzir constructos de cadeia leve substituta solúveis em sistemas procarióticos. Para se dedicar a isto, as fusões de cadeia leve substituta denominadas de "dímeros" na figura 11 foram clonadas em sistemas de expressão/secreção de E. coli. Foi utilizado um sistema de expressão que pode ser reprimido por plac, em que as proteínas de mamíferos maduras foram expressas e secretadas no periplasma através da fusão recombinante com seqüências líderes procarióticas. Especificamente, as fusões de cadeia leve 5 substituta foram direcionadas para o periplasma através da fusão da seqüência codificadora da proteína madura com o terminal C da seqüência codificadora líder glll de m13 (SEQ ID NOs: 12 e 13). A cadeia pesada foi expressa através da fusão da região variável da cadeia pesada de IgGI e do domínio da região constante de cadeia pesada de um anticorpo anti10 influenza ao terminal C da seqüência líder pelB (SEQ ID NO: 14). Os plasmídeos que expressam ambas as proteínas foram transformados em células de E. coli HB2151 (Stratagene) e expressos durante a noite em meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina e 200 micromolares de IPTG a 30 graus. As células foram coletadas e os Iisados periplasmáticos foram preparados, 15 seguindo métodos conhecidos na técnica. Os Iisados periplasmáticos foram testados diretamente através da análise de western blot ou purificados como descrito anteriormente (figura 13, painel A).
Uma vez que a cadeia leve substituta é tradicionalmente um componente do receptor de pré-células B ligado à membrana, esta é nor20 malmente encontrada pareada com uma cadeia pesada de classe IgM. Para as finalidades utilitárias próprias, desejava-se comparar a capacidade de parear uma fusão de cadeia leve substituta com uma região do domínio 1 pesado constante com base em IgM versus IgG. Para verificar isto, um domínio
1 pesado constante μ foi substituído (SEQ ID NO: 15) pela região do domínio 25 pesado constante gamma do anticorpo anti-influenza descrito anteriormente. Foi observado, partindo da análise de western blot dos Iisados periplasmáticos que o domínio pesado constante com base em IgG (γ) era mais expresso e purificado em níveis maiores que o sistema à base do domínio pesado constante baseado em μ (figura 13, painel B).
Exemplo 8
Expressão de constructos de cadeia leve substituta (SURRO
BODY®) em fagemídeo m13 Uma vez que as proteínas recombinantes não são apenas expressas de forma proveitosa em bactérias, mas também individualmente e em coleções de bibliotecas diversas na superfície de partículas de vírus bacterianos era desejado produzir constructos de cadeia leve substituta solúveis na superfície de fagemídeos m13. Para se dedicar a isto, fusões de cadeia leve substituta ("dímeros" na figura 11) foram clonadas em sistemas de expressão/secreção de E. coli. Para todos os sistemas, foi utilizado um sistema de expressão que pode ser reprimida por pLac descrito anteriormente. Entretanto, neste caso um epitopo E-tag (GAPVPYPDPLEPR) (SEQ ID NO: 16) foi anexado às fusões de cadeia leve substituta, assim como a uma proteína de controle de cadeia leve. As seqüências da fusão genelll VpreBIIambda5-E tag (Fusão 1) e da fusão genelll VpreBI-CI-E tag (Fusão 2) são mostradas como as SEQ ID NOs: 12 e 13, respectivamente. Para ancorar os constructos de cadeia pesada ao fagemídeo m13, os constructos de cadeia pesada foram clonadas de forma recombinante, as cadeias pesadas variáveis e as regiões do domínio 1 pesado constante gamma em quadro com o produto do gene Ill de m13. Especificamente, as proteínas recombinantes continham um peptídeo de hexa-histidina intermediário, o epitopo do peptídeo para o anticorpo anti-c-myc (GEQKLISLEEDL) (SEQ ID NO: 17) e um códon de término âmbar.
Foi verificada a fidelidade da expressão de proteína e da formação de complexos, respectivamente, através de ELISA de captura antihistidina e anti-E.
A expressão de anticorpos e de "surrobodies" em fagemídeos foi 25 realizada através de métodos padronizados bem conhecidos na técnica. Essencialmente, as células TG-1 transformadas com plasmídeos de expressão foram crescidas até mid Iog (DO 600 de -0,3) em meio 2-YT suplementado com 100 pg/mL de ampicilina e repressão com 2% de glicose e então infectadas com o fago auxiliador m13K07 e então crescidas durante a noite em 30 meio 2-YT suplementado com 100 pg de ampicilina, 70 pg/mL de canamicina e 200 micromolares de IPTG. Os sobrenadantes ou os precipitados contendo fagos e o fago ressuspenso em PBS foram utilizados para o ELISA de captura em fagos. 0 ELISA de captura em fagos foi realizado através do revestimento de placas para microtitulação com anticorpos anti-histidina (Serotec) ou anti-E (Abcam) e então da detecção da ligação com anticorpos antiperoxidase de m13 (Pharmacia), seguida pela visualização colorimétrica 5 com o substrato TMB. Nestes casos, foi observada a captura específica do fago através de ambos os métodos, sustentando a fusão de expressão de proteínas com alta fidelidade ao fago através da associação de cadeias pesadas e de cadeias leves substitutas estáveis. Os resultados são mostrados na figura 14.
Exemplo 9
Ligação ao antígeno de constructos de cadeia leve substituta expressas em células de mamífero
Como parecia que as variações de cadeias leves substitutas formavam complexos facilmente detectáveis após a cromatografia com que15 lato de níquel, sua capacidade de se ligar ao antígeno original do parceiro de ligação da cadeia pesada cognata foi testada. A expressão transitória e a purificação foram realizadas como descrito anteriormente. A ligação ao antígeno foi testada por ELISA. Sucintamente, poços de microtitulação foram revestidos com preparações do vírus H5N1 Vietnam 12-3/04 inativado 20 (USFDA - CBER, padrão de antígeno), bloqueados e então incubados com proteínas purificadas diluídas em série quantificadas. Após a lavagem, os complexos foram detectados com anticorpos conjutados com peroxidase anti-Fc humano. Finalmente, a ligação foi visualizada de forma colorimétrica e quantificada com o desenvolvimento do substrato TMB (vide a figura 15).
Adicionalmente, os sobrenadantes de transfecções transitórias
foram similarmente testados não-diluídos em relação à ligação ao antígeno e mostrados na figura 16. Após a lavagem, os complexos de cadeias leves substitutas foram detectados tanto com soro anti-peptídeo anti-VpreB1 quanto com anticorpos secudários conjugados com peroxidase anti-coelho ou an30 ticorpos conjugados com peroxidase anti-Fc humano e então visualizados de forma colorimétrica e quantificados com o desenvolvimento do substrato TMB. Exemplo 10
Ligação ao antíqeno de constructos de cadeia leve substituta expressas em E. coli
Devido ao fato de que as fusões de cadeia leve substituta pareciam formar complexos estáveis, era desejado estabelecer se tais fusões pareadas com uma cadeia pesada e anticorpo anti-influenza se ligariam ao vírus cognato do anticorpo. Para testar a ligação, os Iisados periplasmáticos foram preparados como descrito anteriormente. Os Iisados foram então submetidos à ligação ao antígeno em ELISA, essencialmente como descrito anteriormente, exceto que a ligação foi detectada com um anticorpo monoclonal para um epitopo de hexa-histidina anexado no terminal C da cadeia pesada ou para uma E-tag anexada no terminal C da fusão de cadeia leve substituta por anticorpos purificados por afinidade policlonais. A detecção do epitopo foi realizada por anticorpos conjugados com peroxidase anti camundongo ou anti-coelho. Finalmente, a ligação foi visualizada de forma colorimétrica e quantificada com o desenvolvimento do substrato TMB. Os resultados são mostrados na figura 17.
Exemplo 11
Ligação ao antígeno de constructos exibidos em fagos de cadeias leves substitutas
Devido ao fato de que era possível produzir variações de cadeias leves substitutas em sistemas heterólogos e uma vez que as coleções exibidas em fagos são desejáveis para a descoberta e a engenharia de proteínas futuras, era desejado determinar se as variações e/ou as fusões de 25 cadeias leves substitutas eram facilmente exibidas na superfície do fago m13 na forma de complexos associados com o gene NI. As variações (SEQ ID NOs: 18-22) e as fusões descritas anteriormente (SEQ ID NOs: 12 e 13) foram coexpressas com qualquer uma de duas cadeias pesadas de anticorpo anti-influenza (SEQ ID NOs: 19 e 14) como descrito anteriormente e a Ii30 gação seguiu essencialmente as condições também descritas anteriormente. Sucintamente, poços para microtitulação foram revestidos com o vírus H5N1 Vietnam 1203/04 e foi permitido que os fagemídeos se ligassem e então foram lavados e detectados diretamente através de anticorpos conjugados com peroxidase anti-m13. A ligação foi determinada de forma quantitativa após a formação do produto do substrato colorimétrico com TMB. Os resultados são mostrados nas figuras 18 e 19.
Exemplo 12
Constructos. seleção e ELISA clonal de bibliotecas de constructos de cadeia leve substituta em fagos
Uma abordagem iterativa utilizando bibliotecas combinatórias de anticorpos foi empregada para gerar e testar constructos de cadeia leve 10 substituta que se ligam ao antígeno. Sucintamente, foram criadas bibliotecas combinatórias de anticorpos preparadas partindo da medula óssea de sobreviventes ao influenza aviário H5N1. Estas bibliotecas foram verificadas contra a proteína hemaglutinina do vírus H5N1 para dois ciclos de seleção. A seguir, o plasmídeo de fagemídeo foi amplificado e purificado. As regiões 15 variáveis de cadeia pesada foram isoladas pela digestão de restrição desta preparação de plasmídeo e clonadas em quadro com o domínio 1 pesado constante para formar uma fusão recombinante com a proteína de revestimento do gene Ill de m13 para a exibição em fagemídeo. De maneira importante, foram utilizados dois plasmídeos receptores que coexpressavam uma 20 fusão de cadeia leve substituta compreendida de VpreBI e Iambda 5 (Fusão de SLC 1) (SEQ ID NO: 10) ou VpreBI e um domínio de Iambda constante (SEQ ID NO: 11) proveniente da cadeia leve Iambda clássica (Fusão de SLC 2). A biblioteca de fusão 1 produziu 3,84x107 transformantes independentes, enquanto que a biblioteca de fusão 2 produziu 7,8x107 transformantes. Am25 bas as bibliotecas foram verificadas independentemente ao longo de dois ciclos e ambas exibiam enriquecimento significativo em relação ao básico (Fusão 1 = 5x, Fusão 2 = 20x) que aumentava em um segundo ciclo de "panning" (Fusão 1 = 97x, Fusão 2 = 48x).
Para testar através de ELISA a ligação ao antígeno clonal, os fagos de ambos os ciclos e de ambas as bibliotecas foram transferidos para a cepa de E. coli HB2151 para produzir proteínas de fusão com surrobody solúveis. Sucintamente, os clones de HB2151 foram crescidos e induzidos a produzir surrobodias solúveis. Especificamente, as colônias foram cultivadas durante a noite em meio 2-YT suplementado com 100 pg/mL de ampicilina e 200 micromolares de IPTG durante a noite a 30 graus, os Iisados periplasmáticos, como descrito anteriormente. Os Iisados periplasmáticos resultan5 tes foram testados por ELISA, essencialmente como apresentado anteriormente.
O número de transformantes e a porcentagem de clones positivos para as duas fusões, nos ciclos 1 e 2 de "panning" são mostrados na figura 20 e os dados da análise clonal para os Ciclos 1 e 2 dos clones das bibliotecas de Fusão 1 e de Fusão 2 são mostrados nas figuras 21 e 22.
Exemplo 13
Fusões de cadeia leve substituta para aumentar a meia-vida no
soro
A meia-vida de um fragmento de anticorpo in vivo é consideravelmente estendida quando este faz ptécnica de uma fusão com uma cadeia pesada intacta e completa que inclui todos os domínios constantes de cadeia pesada, não apenas os necessários para formar uma ligação estável ao fragmento do antígeno. No caso de IgG isto significa a inclusão de domínios CH1, CH2 e CH3. Emn particular está bem estabelecido que CH2 e CH3 conferem a maior ptécnica deste efeito in vivo. Na verdade, a fusão destes domínios CH2 e CH3 com proteínas heterólogas é tipicamente suficiente para aumentar as potências e PK/PD destas moléculas quiméricas comparadas com as moléculas originais. Similarmente fusões funcionais com qualquer uma ou com ambas VpreB e Λ5 se beneficiam através desta associação com os domínios constantes da cadeia pesada.
Para o tratamento de diabetes do tipo II, a administração do peptídeo 1 similar ao glucagon (ou GLP-1) beneficia os indivíduos através da indução da secreção de insulina dependente de glicose no pâncreas, melhorando assim o contrate de glicose em tais pacientes. Entretanto, um peptídeo 30 GLP-1 de vida longa é uma meta desejável. Uma vez que as caudas das cadeias leves substitutas são distintas e acessíveis, esta meta poderia ser realizada através da fusao de forma recombinante da porção de GLP-1 ativo com o terminal C da cauda de VpreBI (SEQ ID NOs: 23 e 24) ou com a cauda N-terminal de Λ5 (SEQ ID NOs: 25 e 26). No caso de uma fusão com A5, esta pode ser expressa na presença ou na ausência de VpreBI e até mesmo na presença ou na ausência do domínio pesado variável, como a5 presentado na figura 11. As fusões com VpreBI podem ser similarmente produzidas na presença ou na ausência de A5 e possivelmente com ou sem o domínio da cadeia pesada de CH1. Similarmente, outras fusões benéficas com fator de crescimento, citocina, receptor e enzima podem ser criadas. Em todos estes casos a ligação não é uma necessidade da cadeia leve 10 substituta ou de componentes de SURROBODY®, mas ao invés disso, pode ser conferida inteiramente ou em grande ptécnica pelo elemento fundido com a cadeia leve substituta heteróloga.
Embora, na descrição precedente, a invenção seja ilustrada com referência a certas modalidades esta não é tão limitada. De fato, várias modificações da invenção em adição àqueles mostrados descritos aqui se tornarão aparente aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e estão dentro do escopo das reivindicações em anexo.
Exemplo 14
Determinação da afinidade de Constructos de cadeia leve substituta que se ligam à Hemaqlutinina
Para determinar as afinidades de constructos de fusão de cadeias leves substitutas (SURROBODIES®, vide a figura 11) vários surrobodies foram superexpressos e purificados em E. coli e comparados com os Fabs originais dos quais as cadeias pesadas foram primeiramente identificadas. 25 As afinidades foram determinadas por Bio-Layer Interferometry em um BioForte Octet essencialmente como a seguir. Em primeiro lugar, 100 μg de proteína hemaglutinina purificada foram biotinilados em um excesso molar de 20:1 utilizando biotina Pierce No-Weigh PE04 (cat# 21329) de acordo com as instruções do fabricante, incubados à temperatura ambiente durante 30 1-3 horas com mistura intermitente e então incubados durante a noite a 4C. O excesso de biotina foi removido através da coluna de centrifugação por exclusão de tamanho e trocado para PBS. A seguir, os constructos de cadeia leve substituta e os Fabs de ligação à HA foram purificados por FPLC utilizando cromatografia por afinidade com Ni2+, dessalinizados para remover o excesso de imidazol, concentrados e quantificados por ELISAs quantitativos de cadeias leves (Bethel Labs, cat# E80-1 15-k e E80-116-λ) que são re5 alizados de acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, as afinidades foram determinadas através da análise de uma faixa de concentrações de amostras que são tipicamente 15 nM-500 nM em diluições em série de 2 vezes. As amostras foram incubadas com biossensores revestidos com a proteína HA durante até 15 minutos, então incubadas no diluente de amostra 10 durante até 1 hora. Todas estas etapas foram realizadas com rotação de placas das amostras a 1500 RPM. A associação foi medida durante a incubação de Fab com os biossensores revestidos com HA e a dissociação é medida na incubação no diluente de amostra após a ligação. As afinidades são mostradas na Tabela a seguir
15
Clone Fusão 1 Fusão 1 Fab VpreBI -Lambda5 VpreBI-Iambda constante F5 250-400 pM 150-270 pM 1 pM B11 31-180 pM Não determinado 13 pM Todas as referências citadas ao longo de todo o relatório descritivo e as referências citadas aqui, são expressamente incorporadas aqui como referência em sua totalidade.
Claims (88)
1. Polipeptídeo que compreende uma seqüência de VpreB e/ou uma seqüência de A5 conjugada com uma seqüência de aminoácidos heterogênea,, em que o dito polipeptídeo é capaz de se ligar a um alvo.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma seqüência de VpreB.
3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, em que a dita seqüência de VpreB é selecionada do grupo que consiste em uma seqüência nativa de VpreBI1 uma seqüência nativa de VpreB2, uma seqüência nativa de VpreB3 e fragmentos e variações das mesmas.
4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a dita seqüência nativa de VpreB é selecionada do grupo que consiste em VpreBI humana da SEQ ID NO: 1, VpreB2 de camundongo das SEQ ID NOS: 2 e 3, VpreB3 humana da SEQ ID NO: 4 e fragmentos e variações das mesmas.
5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, em que a dita seqüência de aminoácidos heterogênea compreende uma seqüência de A5.
6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, em que a dita seqüência de aminoácidos heterogênea compreende toda ou ptécnica de uma A5 humana da SEQ ID NO: 5 ou de um polipeptídeo similar à A5 humana da SEQ ID NO: 6.
7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, em que a dita seqüência de A5 é fundida com a dita seqüência de VpreB.
8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2 que compreende uma fusão de uma seqüência de VpreB com uma seqüência de aminoácidos heterogênea.
9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, em que a dita seqüência de aminoácidos heterogênea é uma seqüência de A5.
10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, em que a dita seqüência de VpreB é selecionada do grupo que consiste em VpreBI humana da SEQ ID NO: 1, VpreB2 de camundongo das SEQ ID NOS:2 e 3 e VpreB3 humana da SEQ ID NO: 4 e fragmentos e variações das mesmas.
11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10, em que a di ta seqüência de A5 é uma seqüência de uma A5 humana da SEQ ID NO: 5, um polipeptídeo similar à A5 da SEQ D NO:6 ou um fragmento ou uma variação dos mesmos.
12.Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, em que a dita fusão ocorre na ou ao redor das regiões análogas à CDR3 da dita seqüência de VpreB e A5, respectivamente.
13.Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, em que a dita seqüência de aminoácidos heterogênea compreende uma seqüência de região variável de cadeia leve de anticorpo.
14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que a dita seqüência de região variável de cadeia leve de anticorpo é fundida com a dita seqüência de VpreB em um sítio análogo a uma região de CDR3 de cadeia leve de anticorpo.
15.Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que a região de CDR3 da dita seqüência de região variável de cadeia leve de anticorpo é fundida com a dita seqüência de VpreB em um sítio análogo à dita região de CDR3.
16.Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 15,, em que a dita cadeia leve de anticorpo é uma cadeia A.
17. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 15, em que a dita cadeia leve de anticorpo é uma cadeia κ.
18. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13, em que a dita seqüência de aminoácidos heteróloga compreende ainda uma seqüência da região constante de cadeia leve do anticorpo.
19. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 18, em que a dita região constante seqüência é a região constante inteira de uma cadeia leve de anticorpo.
20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 que compreende uma seqüência de A5.
21. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 20, em que a dita seqüência de A5 é uma seqüência de uma A5 humana da SEQ ID NO: 5 ou polipeltídeo similar à A5 humana da SEQ ID NO: 6 ou um fragmento ou uma variação dos mesmos.
22. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 21, em que a dita seqüência de aminoácidos heterogênea é uma seqüência de VpreB conjugada com a dita seqüência de A5.
23. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que a dita conjugação é uma fusão das ditas seqüências de A5 e VpreB.
24. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que a dita conjugação é uma ligação covalente entre as ditas seqüências de A5 e VpreB.
25. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 24, em que a dita ligação covalente é formada através da conexão de um peptídeo ou uma seqüência de polipeptídeo.
26. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 que compreende uma seqüência de VpreB e uma seqüência de A5, em que a dita conjugação é uma associação não-covalente e, em que pelo menos uma das ditas seqüências de VpreB e A5 é outra sem ser uma seqüência de VpreB e A5 nativa de comprimento completo, respectivamente.
27. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 26, em que pelo menos uma das ditas seqüências de VpreB e A5 é um fragmento ou uma variação de uma seqüência de VpreB e A5 nativa, respectivamente.
28. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito polipeptídeo é adicionalmente conjugado com uma segunda seqüência de aminoácidos heterogênea.
29. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 28 que compreende uma fusão de uma seqüência de VpreB com uma seqüência de A5, associada de forma covalente a dita segunda seqüência de aminoácidos heterogênea.
30. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, em que a dita segunda seqüência heterogênea de polipeptídeo é uma seqüência de cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável.
31. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 30, em que a dita seqüência de cadeia pesada de anticorpo é conjugada a uma fusão da dita seqüência de VpreB e a dita seqüência de A5 através de um Iigante peptídico.
32. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 30, em que a dita seqüência de cadeia pesada de anticorpo é conjugada a uma fusão da dita seqüência de VpreB e a dita seqüência de A5 através da associação não-covalente, para formar um complexo dimérico.
33. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, em que a seqüência de região variável de cadeia pesada de anticorpo se liga ao mesmo alvo que o dito polipeptídeo.
34. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, em que a dita seqüência de região variável de cadeia pesada de anticorpo se liga a um alvo diferente do alvo ao qual o dito polipeptídeo se liga.
35. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 34, em que o dito polipeptídeo se liga a um antígeno de tumor e a seqüência de anticorpo da região variável se liga às células efetoras.
36. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 26 que compreende ainda uma seqüência de cadeia pesada de anticorpo que compreende uma região variável, associada de forma não-covalente à seqüência de VpreB e seqüências de A5 associadas de forma não-covalente, para formar um complexo trimérico.
37. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 36, em que a dita cadeia pesada de anticorpo compreende seqüências da região variável que se ligam ao mesmo alvo que o dito polipeptídeo.
38. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 36, em que a dita cadeia pesada de anticorpo compreende seqüências da região variável que se ligam a um alvo diferente do alvo ao qual o dito polipeptídeo se liga.
39. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 38, em que o dito polipeptídeo se liga a um antígeno de tumor e a dita seqüência da região variável se liga às células efetoras.
40. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que as regiões análogas à CDR da dita seqüência de VpreB e/ou da dita seqüência de A5 são engenheiradas através do enxerto de seqüências de CDR correspondentes de um anticorpo terapêutico.
41. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o alvo é um antígeno.
42. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o alvo é um antígeno viral.
43. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 42, em que o alvo é um vírus influenza A.
44. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 43, em que o dito polipeptídeo neutraliza o dito vírus influenza A.
45. Biblioteca que compreende um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 até 44.
46. Biblioteca que compreende um conjugado de uma seqüência de VpreB e uma seqüência de A5 associado a uma cadeia pesada de anticorpo.
47. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que o dito conjugado é uma fusão das ditas seqüências de VpreB e A5.
48. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que o dito conjugado é uma associação não-covalente das ditas seqüências de VpreB e A5.
49. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que o dito conjugado é uma ligação covalente das ditas seqüências de VpreB e A5 através de um Iigante peptídico.
50. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que a dita seqüência de região variável de cadeia pesada de anticorpo está associada de forma não-covalente ao dito conjugado.
51. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que a dita seqüência de região variável de cadeia pesada de anticorpo está associada de forma covalente ao dito conjugado.
52. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que a cadeia pesada de anticorpo compreende seqüências da região variável que se ligam ao mesmo alvo que o dito conjugado.
53. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46, em que a dita cadeia pesada de anticorpo compreende seqüências da região variável que se ligam a um alvo diferente do alvo ao qual o dito conjugado se liga.
54. Biblioteca de acordo com a reivindicação 53, em que o dito conjugado se liga a um antígeno de tumor e a dita seqüência da região variável se liga às células efetoras.
55. Biblioteca de acordo com a reivindicação 45 na forma de um mostruário.
56. Biblioteca de acordo com a reivindicação 55, em que o dito mostruário é selecionado do grupo que consiste em exibição em fagos, exibição bacteriana, exibição em leveduras, exibição de ribossomos, exibição de mRNA, exibição de DNA, exibição em células de mamífero, exibição em esporos, exibição viral, exibição baseada na ligação de proteína-DNA e exibição em microesferas.
57. Biblioteca de acordo com a reivindicação 46 na forma de um display.
58. Biblioteca de acordo com a reivindicação 57, em que o dito display é selecionado do grupo que consiste em exibição em fagos, exibição bacteriana, exibição em leveduras, exibição de ribossomos, exibição de mRNA, exibição de DNA, exibição em células de mamífero, exibição em esporos, exibição viral, exibição baseada na ligação de proteína-DNA e exibição em microesferas.
59. Biblioteca que compreende seqüências de cadeia leve substituta.
60. Biblioteca de acordo com a reivindicação 59 na forma de um display.
61. Biblioteca de acordo com a reivindicação 59, em que o dito display é selecionado do grupo que consiste em exibição em fagos, exibição bacteriana, exibição em leveduras, exibição de ribossomos, exibição de mRNA, exibição de DNA, exibição em células de mamífero, exibição em esporos, exibição viral, exibição baseada na ligação de proteína-DNA e exibição em microesferas.
62. Biblioteca de acordo com a reivindicação 45, 46 ou 59 que compreende ainda pelo menos uma funcionalidade adicional anexada ou embutida nos membros da dita biblioteca.
63. Biblioteca de acordo com a reivindicação 62, em que a dita funcionalidade adicional é fornecida por seqüências de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos.
64. Biblioteca de acordo com a reivindicação 63, em que as seqüências de polipeptídeos são seqüências receptoras ou ligantes.
65. Biblioteca de acordo com a reivindicação 63, em que as ditas seqüências de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos são membros de uma biblioteca de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos.
66. Biblioteca de acordo com a reivindicação 65, em que a dita biblioteca de peptídeos é uma biblioteca de seqüências peptídicas aleatórias.
67. Biblioteca de acordo com a reivindicação 66, em que pelo menos ptécnica das ditas seqüências peptídicas possui especificidade de ligação a um antígeno-alvo.
68. Biblioteca de acordo com a reivindicação 62, na forma de um display.
69. Biblioteca de acordo com a reivindicação 68, em que o dito display é selecionado do grupo que consiste em exibição em fagos, exibição bacteriana, exibição em leveduras, exibição de ribossomos, exibição de mRNA, exibição de DNA, exibição em células de mamífero, exibição em esporos, exibição viral, exibição baseada na ligação de proteína-DNA e exibição em microesferas.
70. Biblioteca que compreende uma coleção de seqüências de cadeia leve substituta associada a seqüências de região variável de cadeia pesada de anticorpo.
71. Biblioteca de acordo com a reivindicação 70, em que as ditas seqüências de cadeia leve substituta possuem especificidade de ligação a um ou mais alvos.
72. Biblioteca de acordo com a reivindicação 71, em que as ditas seqüências de cadeia leve substituta possuem especificidade de ligação ao mesmo alvo.
73. Biblioteca de acordo com a reivindicação 71, em que as ditas seqüências de cadeia leve substituta possuem especificidade de ligação a pelo menos dois alvos diferentes.
74. Biblioteca de acordo com a reivindicação 71, em que as ditas seqüências de cadeia leve substituta possuem especificidade de ligação a um grande número de alvos.
75. Biblioteca de acordo com a reivindicação 70, em que as ditas seqüências de cadeia leve substituta compreendem seqüências de VpreB e/ou seqüência de A5.
76. Biblioteca de acordo com a reivindicação 75, em que as ditas seqüências de VpreB são selecionadas do grupo que consiste em VpreBI humana (SEQ ID NO: 1), VpreB2 de camundongo (SEQ ID NOS: 2 e 3) e VpreB3 humana (SEQ ID NO: 4) seqüências e fragmentos e variações das mesmas.
77. Biblioteca de acordo com a reivindicação 75, em que as ditas seqüências de A5 são selecionadas do grupo que consiste em A5 humana da SEQ ID NO: 5, polipeptídeo similar à A5 humana da SEQ ID NO: 6 e fragmentos e variações dos mesmos.
78. Biblioteca de acordo com a reivindicação 75, em que as ditas seqüências de VpreB e A5 estão associadas de forma não-covalente uma com a outra.
79. Biblioteca de acordo com a reivindicação 75, em que as ditas seqüências de VpreB e A5 estão conectadas de forma covalente uma com a outra.
80. Biblioteca de acordo com a reivindicação 79, em que as ditas seqüências de VpreB e A5 estão fundidas diretamente uma com a outra.
81. Biblioteca de acordo com a reivindicação 75 que compreende ainda pelo menos uma funcionalidade adicional anexada a ou embutida nos membros da dita biblioteca.
82. Biblioteca de acordo com a reivindicação 81, em que a dita funcionalidade adicional é fornecida por seqüências de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos.
83. Biblioteca de acordo com a reivindicação 82, em que as seqüências de polipeptídeos são seqüências receptoras ou ligantes.
84. Biblioteca de acordo com a reivindicação 82, em que as ditas seqüências de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos são membros de uma biblioteca de anticorpos, peptídeos ou polipeptídeos.
85. Biblioteca de acordo com a reivindicação 84, em que a dita biblioteca de peptídeos é uma biblioteca de seqüências peptídicas aleatórias.
86. Biblioteca de acordo com a reivindicação 85, em que pelo menos ptécnica das ditas seqüências peptídicas possuem especificidade de ligação a um antígeno-alvo.
87. Biblioteca de acordo com a reivindicação 70 na forma de um display.
88. Biblioteca de acordo com a reivindicação 87, em que o dito display é selecionado do grupo que consiste em exibição em fagos, exibição bacteriana, exibição em leveduras, exibição de ribossomos, exibição de mRNA, exibição de DNA, exibição em células de mamífero, exibição em esporos, exibição viral, exibição baseada na ligação de proteína-DNA e exibição em microesferas.
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