ES2617743T3 - Vacunas recombinantes del virus de la lengua azul y sus utilizaciones - Google Patents

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Abstract

Composición que comprende un antígeno del BTV (virus de la lengua azul) y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable; en la que el antígeno del BTV es VP2 o una combinación de VP2 y VP5 del serotipo 1 de BTV; en la que además el antígeno se expresa en lenteja de agua.

Description

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DESCRIPCION
Vacunas recombinantes del virus de la lengua azul y sus utilizaciones CAMPO DE LA INVENClON
[0001] La presente invencion se refiere a composiciones para la lucha contra la infeccion por el virus de la lengua azul (BTV) en animales. La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un antlgeno del BTV, en el que el antlgeno del BTV es VP2 o una combinacion de VP2 y VP5 del serotipo del BTV 1; ademas en la que el antlgeno del BTV se expresa en lenteja de agua.
ANTECEDENTES DE LA INVENClON
[0002] La lengua azul (BT) es una enfermedad viral infecciosa transmitida por artropodos de los rumiantes. El ganado vacuno y las cabras se puede infectar facilmente con el virus de la lengua (BTV) causante, pero sin lesion vascular extensa y, por lo tanto, estas especies generalmente no muestran signos cllnicos pronunciados. En cambio, la enfermedad en ovejas se caracteriza por una inflamacion catarral de las membranas mucosas de la boca, la nariz y la panza, y por la inflamacion de las bandas coronarias y laminas de los cascos. Hay una excoriacion del epitelio, y en ultima instancia, la necrosis de la mucosa bucal; la lengua y la boca hinchadas e inflamadas pueden tomar un color azul a partir de lo cual toma nombre la enfermedad (Spreull 1905). La tasa de mortalidad en ovejas se estima en 1-30%.
[0003] El BTV es el virus prototipo del genero Orbivirus (familia Reoviridae) y se compone de al menos 24 serotipos diferentes (Wilson y Mecham 2000). Las diferentes cepas del BTV se han identificado en todo el mundo a lo largo de las zonas tropicales y temperadas. La infeccion por BTV ha aparecido incluso a 45° N en Europa, 50° N en Asia y America del Norte e incluso 35° al sur. El BTV no es contagioso entre los rumiantes, por lo tanto la distribucion del BTV es dependiente de la presencia de especies de vectores artropodos de la especie coides (jejenes mordedores), con diferentes especies de vectores que se producen en diferentes regiones del mundo. Los datos recientes sugieren que la deriva genetica y el efecto fundador contribuyen a la diversificacion de segmentos de genes individuales de cepas del campo del virus (Bonneau, Mullens et al., 2001).
[0004] La infeccion por BTV de los rumiantes es transitoria, mientras que la infeccion del vector de insectos Culicoides es persistente. La duracion de la viremia depende de la especie animal y de la cepa del BTV. Se ha descrito que la viremia puede ser muy transitoria en ovejas y puede durar hasta 41 dlas en individuos infectados con BTV, hasta 42 dlas en cabras, y hasta 100 dlas en ganado vacuno. Dado que la infeccion por BTV del ganado vacuno da lugar a una viremia prolongada, pero no persistente, el ganado vacuno sirve como reservorio del que el virus se puede alimentar por el vector Culicoides y, a continuacion, transmitirse a otros rumiantes (Anderson, Stott et al 1985; MacLachlan 1994; MacLachlan y Pearson 2004). La ecologla de muchas especies de vectores Culicoides es poco conocida y sus lugares de crla estan en gran parte sin caracterizar, y sus tasas de dispersion son desconocidas. Culicoides sonorensis es el principal vector del BTV en America del Norte. Los insectos de Culicoides hembra se infectan persistentemente con BTV y pueden transmitir el virus despues de un perlodo de incubacion extrlnseco de hasta 14 dlas (Mullens, Tabachnick et al., 1995). La hibernacion del BTV en las zonas templadas puede tener lugar a traves de vectores de insectos infectados verticalmente, aunque datos recientes indican que existe una disminucion de la expresion de los genes de la capside externa durante la infeccion por BTV persistente en los estadios larvarios de los vectores de insectos (White, Wilson et al., 2005).
[0005] Los viriones del BTV tienen un diametro de ~ 69 nm con una capa de doble carcasa (capside) que a veces esta rodeada de una "pseudo-envoltura" de lipoprotelna derivada de las membranas celulares de las celulas infectadas. El genoma del BTV incluye 10 segmentos distintos de ARN de doble cadena que codifican colectivamente siete protelnas estructurales (VP1 a VP7) y cuatro no estructurales (NS1, NS2, NS3 y NS3a) (Roy 1996); nueve de los segmentos del genoma son monocistronicos, mientras que el segmento 10 codifica tanto NS3 como NS3A utilizando un segundo codon de inicio en la estructura. El ARN genomico se encapsida en la partlcula del virion icosaedrico por una capside de protelna de doble capa (Verwoerd, Els et al. 1972). El nucleo icosaedrico consiste en dos protelnas principales (VP3 y VP7) y tres protelnas menores (VP1, VP4, VP6) y esta rodeado por la capside externa que consiste en VP2 y VP5 que respectivamente estan codificadas por los segmentos genomicos 2 y 5 (Roy 1996). VP2 es responsable de la union y la entrada del BTV en las celulas, la neutralizacion, la especificidad del serotipo y hemaglutinacion. Las formas multimericas de VP2 (dlmeros y trlmeros) decoran gran parte de la superficie del andamiaje (“scaffold”) de VP5 en la superficie exterior de las partlculas virales (Hassan y Roy 1999). VP2 varla mayoritariamente entre los 24 serotipos del BTV, y los niveles de anticuerpo anti-VP2 se correlacionan con la neutralizacion del virus in vitro e in vivo (Huismans y Erasmus 1981). VP5 tambien varla notablemente entre los diferentes serotipos y cepas del BTV (de Mattos, de Mattos et al 1994; DeMaula, Bonneau et al 2000) y aunque hasta la fecha se han identificado MAb neutralizantes no especlficos de VP5, los datos sugieren que esta protelna tiene un papel en la neutralizacion y la determination del serotipo a traves de su influencia conformacional en VP2 (Huismans y Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al 1990; DeMaula et al, 2000). El VP2 purificado inmunoadsorbido con suero anti-nucleo del BTV para eliminar trazas de VP7 proporciono protection contra la misma infeccion de serotipo del BTV en ovejas (Huismans, van der Walt et al., 1987). Resultados recientes
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demuestran que VP2 y NS1 expresan epltopos reconocidos por linfocitos T citotoxicos (CTL) (Andrew, Whiteley et al. 1995), mientras que es poco probable que VP7 y VP5 tengan epltopos de CTL. Hasta el momento, VP3, VP4, VP6, NS2 y NS3 no han estimulado una respuesta de CTL en ovejas (Lobato, Coupar et al., 1997).
[0006] Lobato y Coupar (Lobato, Coupar et al. 1997) desarrollaron vectores de expresion basados en virus de vacuna que contenlan diversos insertos correspondientes a secuencias de nucleotidos que codifican las protelnas estructurales VP2, VP5 y VP7 del BTV para estudios in vivo e in vitro. Estos vectores de expresion se administraron a conejos y ovejas para evaluar la respuesta inmune con respecto a ELISA y el tltulo de anticuerpos neutralizantes, y se analizo la eficacia protectora de las construcciones de VP2 y VP5 en ovejas. VP2, VP5 y VP2 + VP5 expresados en virus de vacuna eran protectores, teniendo lugar la proteccion mas reproducible en animales inmunizados tanto con VP2 y VP5, sin embargo, la proteccion incluso con esta construccion era variable y no plenamente eficaz. Los esfuerzos para el desarrollo de composiciones de vacunas recombinantes del BTV se pueden encontrar, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos 2007/280960 publicada. Otros han descrito composiciones inmunologicas del BTV que contienen diversos antlgenos del BTV, producidas, por ejemplo, por baculovirus (vease por ejemplo las patentes de Estados Unidos Nos. 5.833.995 y 5.690.938).
[0007] Por lo tanto, serla ventajoso proporcionar composiciones inmunogenicas y de vacunas mejoradas contra BTV, y procedimientos para fabricar y usar dichas composiciones, incluyendo dichas composiciones que proporcionan procedimientos de diagnostico diferencial, ensayos y kits.
[0008] Recientemente, se han investigado plantas como fuente para la produccion de agentes terapeuticos, tales como vacunas, anticuerpos y productos biofarmaceuticos. Sin embargo, la produccion de vacunas, anticuerpos, protelnas y productos biofarmaceuticos a partir de plantas esta lejos de un proceso curativo y existen numerosos obstaculos que estan asociados habitualmente con dicha produccion de vacunas. Las limitaciones a la produccion de vacunas con exito a partir de plantas incluyen el bajo rendimiento del bioproducto o antlgeno expresado (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001, 6, 495-496), inestabilidad de la protelna, inconsistencias en la calidad del producto (Schillberg et al., 2005 Vaccine, 23, 1764-1769), y la capacidad insuficiente para producir productos de tipo viral de tamano e inmunogenicidad esperados (Arntzen et al., Vaccine, 2005, 23, 1753-1756). Para hacer frente a estos problemas, la optimizacion de codones, las estrategias cuidadosas de recogida y purificacion de productos de plantas, el uso de partes de la planta, tales como cloroplastos, para aumentar la absorcion del material, y el reconocimiento subcelular mejorado estan siendo consideradas como posibles estrategias (Koprowski, Vaccine 2005, 23, 1757-1763).
[0009] Teniendo en cuenta la susceptibilidad de los animales a BTV, es esencial un procedimiento de prevencion de la infeccion por BTV y la proteccion de los animales. Por consiguiente, existe la necesidad de una vacuna eficaz contra el BTV.
[0010] Martyn et al. (1994) Virus Research 33 (1), pag. 11-15, describen la expresion de los antlgenos de VP2 y VP5 del serotipo 1 del BTV en la levadura. Sin embargo, estos no provocan una respuesta inmune protectora.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
[0011] Se proporcionan composiciones que comprenden un polipeptido antigenico del BTV y fragmentos y variantes de los mismos. Los antlgenos del BTV y fragmentos y variantes de los mismos descritos en este documento poseen propiedades inmunogenicas y protectoras. Los antlgenos del BTV descritos en este documento pueden ser producidos en una planta o alga.
[0012] Los polipeptidos antigenicos y fragmentos y variantes de los mismos descritos en este documento se pueden formular en vacunas y/o composiciones farmaceuticas. Tales vacunas se pueden usar para vacunar a un animal y proporcionar proteccion frente a al menos una cepa del BTV.
[0013] En el presente documento se describen procedimientos para la fabricacion de los polipeptidos antigenicos en planta o alga. Tambien se describen en el presente documento, para referencia solamente, procedimientos de uso que incluyen administrar a un animal una cantidad eficaz de un polipeptido antigenico o fragmento o variante del mismo para producir una respuesta inmunogena protectora. Despues de la produccion en plantas o algas, el polipeptido antigenico se puede purificar parcial o sustancialmente para su uso como una vacuna.
[0014] En un primer aspecto, la presente invention proporciona una composition que comprende un antlgeno del BTV (virus de la lengua azul) y un portador, excipiente, adyuvante o vehlculo veterinariamente aceptable; en el que el antlgeno del BTV es VP2 o una combination de VP2 y VP5 del serotipo 1 del BTV; ademas en el que el antlgeno del BTV se expresa en la lenteja de agua.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion de acuerdo con el primer aspecto para utilizar en un procedimiento para vacunar un huesped susceptible a BTV.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
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[0015] La siguiente descripcion detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la invencion unicamente a las realizaciones especlficas descritas, puede entenderse mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra una tabla que resume la SEQ ID NO asignada a las secuencias de ADN y protelnas.
La figura 2 representa el plasmido pCG102 que codifica la VP15 del BTV1 (SEQ ID NO: l0) utilizada como control positivo para el cribado.
La figura 3 representa el plasmido pCG100 que codifica la VP2 del BTV1 (SEQ ID NO: 4) utilizada como control positivo para el cribado.
La figura 4 representa el plasmido pCG101 que codifica la VP2-c-myc del BTV1 (SEQ ID NO: 6) utilizada como control positivo para el cribado.
La figura 5 es una transferencia Western de lisados de celulas CHO que indican el anticuerpo 10AE12 de VP5 de AHSV detecta selectivamente la protelna VP5 del BTV1 expresada en pCG102 (SEQ ID NO: 10).
La figura 6 es una transferencia Western de lisados de celulas CHO que indican el anticuerpo anti-c-Myc de raton detecta selectivamente la protelna VP2 del BTV1 expresada en pCG101 marcado con c-Myc (SEQ ID NO: 6), pero no detecta la protelna VP2 del BTV1 expresada en pCG100 no marcada (SEQ ID NO: 4).
Las figuras 7a y 7b son transferencias Western de los lisados de celulas CHO que fueron transfectadas con las construcciones indicadas. Los anticuerpos policlonales de VP2 del BTV1 L167 y L168 detectaron selectivamente la protelna VP2 (SEQ ID NO: 4) expresada en las celulas transfectadas con pCG100.
La figura 8 muestra el alineamiento de secuencias de los polinucleotidos que codifican VP2 del BTV y el porcentaje de identidad de secuencia.
La figura 9 muestra el alineamiento de secuencias de los polinucleotidos que codifican VP5 del BTV y el porcentaje de identidad de secuencia.
La figura 10 representa la identidad y la colocacion de los antlgenos del BTV1 optimizados para la lenteja de agua para 4 construcciones de expresion de la lenteja de agua.
La figura 11 representa el plasmido pMerD01 que contiene VP2 y VP5 localizadas citoplasmicamente en tandem.
La figura 12 representa el plasmido MerD02que contiene VP2 localizada citoplasmicamente con 5'UTR optimizada y VP5 en tandem.
La figura 13 representa el plasmido MerD03, VP2localizada citoplasmicamente sola.
La figura 14 representa el plasmido MerD04, VP2 localizada citoplasmicamente con 5'UTR optimizada sola.
La figura 15 representa transferencias Western representativas de lisados de lenteja de agua que expresan diversas construcciones MerD utilizando el anticuerpo de VP2.
La figura 16 representa transferencias Western representativas de lisados de lenteja de agua que expresan la construccion MerD01 construir utilizando los anticuerpos de VP2 y VP5.
La figura 17 representa una transferencia Western de VP2 de lisados de lenteja de agua que expresan MerD01, MerD02, MerD03 y Mer04.
La figura 18 representa una transferencia Western de anticuerpo monoclonal de VP5 clon # 10AE12 de lisados de lenteja de agua que expresan MerD01 y MerD02.
La figura 19 muestra una imagen representativa utilizada para el analisis por densitometrla de VP2 con Agilent 2100 Bioanalyzer.
La figura 20 representa el tamano promedio de las reacciones locales en los sitios de inyeccion.
La figura 21 representa la temperatura rectal despues de la primera vacunacion contra BTV.
La figura 22 representa la temperatura rectal despues de la segunda vacunacion contra BTV.
La figura 23 representa la temperatura rectal despues de la estimulacion con BTV.
La figura 24 representa los signos cllnicos despues de la estimulacion con BTV.
La figura 25 representa el tltulo de anticuerpos del BTV1 mediante seroneutralizacion.
La figura 26 representa el tltulo promedio de viremia medido por qRT-PCR en cada grupo de tratamiento.
La figura 27 muestra la alineacion de secuencias de protelnas de VP2 del BTV1 y el porcentaje de identidad de secuencia.
La figura 28 muestra la alineacion de secuencias de protelnas de siete secuencias de VP5 del BTV1 y una secuencia de VP5 del BTV2 y el porcentaje de identidad de secuencia.
DESCRIPCION DETALLADA
[0016] En el presente documento se describen composiciones que comprenden un polipeptido del BTV, antlgeno y fragmentos y variantes del mismo que provocan una respuesta inmunogenica en un animal. Los polipeptidos antigenicos o fragmentos o variantes de los mismos se producen en una planta o alga. Los polipeptidos antigenicos o fragmentos o variantes se pueden formular en vacunas o composiciones farmaceuticas y utilizarse para provocar o estimular una respuesta protectora en un animal. En una realization, el antlgeno polipeptldico es un polipeptido VP2 del BTV o una combination de polipeptido VP2 del BTV y polipeptido VP5 del BTV del serotipo 1 del bTv en el que el polipeptido o polipeptidos se expresan en la lenteja de agua.
[0017] Se entiende que los polipeptidos antigenicos descritos en este documento pueden ser polipeptidos de longitud completa o fragmentos activos o variantes activas de los mismos. Por "fragmentos activos" o "variantes activas" se pretende dar a entender que los fragmentos o variantes conservan la naturaleza antigenica del polipeptido. Por lo tanto, la presente descripcion abarca cualquier polipeptido del BTV, antlgeno, epltopo o inmunogeno que provoca una respuesta inmunogenica en un animal. El polipeptido del BTV, antlgeno, epltopo o
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inmunogeno puede ser cualquier polipeptido del BTV, antlgeno, epltopo o inmunogeno, tal como, pero no limitado a, una protelna, peptido o fragmento o variante de los mismos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como un animal ovino, bovino, o caprino.
[0018] La presente descripcion se refiere a vacunas o composiciones bovinas, ovinas o caprinas que pueden comprender una cantidad eficaz de un antlgeno del BTV recombinante y un portador, excipiente, adyuvante, o vehlculo farmaceuticamente o veterinariamente aceptable.
[0019] En algunas realizaciones, las vacunas comprenden ademas adyuvantes, tales como emulsiones de aceite en agua (O/W) que se describen en la patente US 7.371.395.
[0020] En otras realizaciones, los adyuvantes incluyen EMULSIGEN®, hidroxido de aluminio y saponina, CpG, o combinaciones de los mismos.
[0021] La respuesta en el animal puede ser una respuesta inmune protectora.
[0022] Por "animal" se entienden mamlferos, aves y similares. El animal o huesped incluye mamlferos y humanos. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballo), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domesticos, gatos salvajes, otros grandes felinos, y otros felinos, incluyendo guepardos y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, ganado bovino), porcinos (por ejemplo, cerdos), caprina (por ejemplo, cabra), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisan, loro, pinzones, halcon, cuervo, avestruz, emu y casuario), primates (por ejemplo, prosimios, tarsio, mono, gibon, simio), y pescado. El termino "animal" tambien incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo embrionario y etapas fetales.
[0023] El termino "plantas", tal como se utiliza en el presente documento, incluye plantas dicotiledoneas (dicot) y plantas monocotiledoneas (monocot). Las plantas dicotiledoneas incluyen, pero no se limitan a, legumbres, tales como guisantes, alfalfa y soja, zanahoria, apio, tomate, patata, tabaco, pimiento, semilla de aceite de colza, remolacha, col, coliflor, brocoli, lechuga, cacahuete y similares. Las plantas monocotiledoneas incluyen, pero no se limitan a, cereales, tales como trigo, cebada, sorgo y mijo, centeno, triticale, malz, arroz o avena, cana de azucar, lenteja de agua, hierbas y similares. El termino "planta" incluye tambien las plantas sin flores, incluyendo, pero no se limitan a, helechos, colas de caballo, musgo terrestre, musgo, hepaticas, antoceros, algas. El termino "algas" y "alga" tal como se utiliza en este documento incluye cualquier cepa de alga capaz de producir un polipeptido o fragmento o variante del mismo. Las algas pueden incluir algas roja, marron y verde, gametofitos, y similares. Las algas pueden ser microalgas. Las microalgas pueden ser Thraustochytriaceae, por ejemplo, Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides, y Japonochytrium.
[0024] A menos que se explique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto ordinario en la tecnica a la que pertenece esta descripcion. Los terminos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0025] Hay que senalar que en esta descripcion y en particular en las reivindicaciones y/o parrafos, terminos, tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos; por ejemplo, puede significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y terminos, tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados expllcitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la tecnica anterior o que afecten una caracterlstica basica o novedosa de la invencion.
[0026] Los polipeptidos antigenicos de la invencion son capaces de proteger contra BTV. Es decir, son capaces de estimular una respuesta inmune en un animal. Por "antlgeno" o "inmunogeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmune especlfica en un animal huesped. El antlgeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogenicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentacion a un animal huesped; un polipeptido, un epltopo, un hapteno o cualquier combination de los mismos. Alternativamente, el inmunogeno o antlgeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0027] El termino "protelna, polipeptido o peptido inmunogenico", tal como se utiliza en el presente documento incluye polipeptidos que son inmunologicamente activos en el sentido de que, una vez administrados al huesped, son capaces de provocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la protelna. Preferiblemente, el fragmento de protelna es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunologica que la protelna total. Por lo tanto, un fragmento de protelna segun la descripcion comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epltopo o determinante antigenico. Una protelna o polipeptido “inmunogenico”, tal como se utiliza en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la protelna, analogos de la misma, o
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fragmentos inmunogenicos de la misma. Por "fragmento inmunogenico" se entiende un fragmento de una protelna que incluye uno o mas epltopos y de este modo provoca la respuesta inmunologica descrita anteriormente. Tales fragmentos se pueden identificar usando cualquier numero de tecnicas de mapeo de epltopos bien conocidas en el sector. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epltopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, sintetizando simultaneamente grandes numeros de peptidos sobre soportes solidos, correspondiendo los peptidos a porciones de la molecula de protelna, y haciendo reaccionar los peptidos con anticuerpos mientras los peptidos aun estan unidos a los soportes. Tales tecnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos. N° 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epltopos conformacionales se identifican facilmente mediante la determinacion de la conformacion espacial de aminoacidos, tal como mediante, por ejemplo, cristalografla de rayos X y resonancia magnetica nuclear de 2 dimensiones. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.
[0028] Tal como se ha descrito, la description abarca fragmentos activos y variantes activas del polipeptido antigenico. Por lo tanto, el termino "protelna, polipeptido o peptido inmunogenico" contempla ademas deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipeptido funcione para producir una respuesta inmunologica tal como se define en el presente documento. El termino "variacion conservativa" se refiere a la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro residuo biologicamente similar, o la sustitucion de un nucleotido en una secuencia de acido nucleico de tal manera que el residuo de aminoacido codificado no cambia o es otro residuo biologicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas seran generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos. Por ejemplo, los aminoacidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) acidos: aspartato y glutamato; (2) basicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leuquina, isoleuquina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga: glicina, asparagina, glutamina, cistelna, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina se clasifican a veces como aminoacidos aromaticos. Ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitucion de un residuo hidrofobo, tal como isoleuquina, valina, leuquina o metionina, por otro residuo hidrofobo, o la sustitucion de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitucion de arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitucion conservativa similar de un aminoacido por un aminoacido estructuralmente relacionado que no tendra un efecto importante sobre la actividad biologica. Las protelnas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos que la molecula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoacidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la protelna estan, por lo tanto, dentro de la definition del polipeptido de referencia. Todos los polipeptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El termino "variation conservativa" tambien incluye el uso de un aminoacido sustituido en lugar de un aminoacido original no sustituido siempre que los anticuerpos generados para el polipeptido sustituido inmunorreaccionen tambien con el polipeptido no sustituido.
[0029] El termino "epitopo" se refiere al sitio en un antlgeno o hapteno al que responden celulas B y/o celulas T especlficas. El termino tambien se usa indistintamente con "determinante antigenico" o "sitio determinante antigenico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epltopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la union de otro anticuerpo a un antlgeno diana.
[0030] Una "respuesta inmunologica" a una composition o vacuna es el desarrollo en el huesped de una respuesta celular y/o inmune mediada por anticuerpos a una composicion o vacuna de interes. Habitualmente, una "respuesta inmunologica" incluye, pero no se limita a, uno o mas de los siguientes efectos: la production de anticuerpos, celulas B, celulas T auxiliares y/o celulas T citotoxicas, dirigidas especlficamente a un antlgeno o antlgenos incluidos en la composicion o vacuna de interes. Preferiblemente, el huesped mostrara una respuesta inmunologica terapeutica o de protection, de manera que se vera reforzada la resistencia a una nueva infection y/o se reducira la gravedad cllnica de la enfermedad. Dicha proteccion se demostrara mediante una reduction o falta de slntomas normalmente mostrados por un huesped infectado, un tiempo de recuperation mas rapido y/o un tltulo viral disminuido en el huesped infectado.
[0031] Los antlgenos sinteticos tambien se incluyen dentro de la definicion, por ejemplo, poliepltopos, epltopos flanqueantes y otros antlgenos recombinantes o derivados sinteticamente. Vease, por ejemplo, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Los fragmentos inmunogenicos incluiran generalmente al menos aproximadamente 3 aminoacidos, al menos aproximadamente 5 aminoacidos, al menos aproximadamente 10-15 aminoacidos, o aproximadamente 15 a 25 aminoacidos o mas aminoacidos, de la molecula. No hay un llmite superior crltico para la longitud del fragmento, que puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de la protelna, o incluso una protelna de fusion que comprende al menos un epltopo de la protelna.
[0032] Por consiguiente, una estructura minima de un polinucleotido que expresa un epitopo es que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleotidos que codifican un epitopo o determinante antigenico de un polipeptido del BTV. Un polinucleotido que codifica un fragmento de un polipeptido del BTV pueden comprender o consistir esencialmente en o consistir en un minimo de 15 nucleotidos, aproximadamente 30-45 nucleotidos, aproximadamente 45-75, o al menos 57, 87 o 150 nucleotidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipeptido. Los procedimientos de determinacion de epltopos, tales como, la generation de bibliotecas de
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peptidos solapantes (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al, 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee. R. et al, 1989; Geysen., 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) se pueden utilizar en la practica de la invencion.
[0033] El termino "acido nucleico" o "polinucleotido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un hlbrido de los mismos. El termino tambien abarca hlbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleotidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acidos nucleicos y cebadores. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos y analogos de nucleotidos metilados, uracilo, otros azucares y grupos de union, tales como fluororribosa y tiolato, y ramificaciones de nucleotidos. La secuencia de nucleotidos se puede modificar adicionalmente despues de la polimerizacion, tal como mediante conjugacion, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definicion son las modicaciones en los extremos, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales con un analogo, y la introduccion de medios para unir el polinucleotido a protelnas, iones metalicos, componentes de marcaje, otros polinucleotidos o soporte solido. Los polinucleotidos se pueden obtener mediante slntesis qulmica o derivados de un microorganismo.
[0034] El termino "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleotido asociado con una funcion biologica. De este modo, los genes incluyen intrones y exones como en una secuencia genomica, o solo las secuencias de codificacion como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresion. Por ejemplo, el gen tambien se refiere a un fragmento de acido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una protelna especlfica, y que incluye secuencias reguladoras.
[0035] La presente invencion comprende ademas una hebra complementaria a un polinucleotido que codifica un antlgeno del BTV, epltopo o inmunogeno. La hebra complementaria puede ser polimerica y de cualquier longitud y puede contener desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos y analogos en cualquier combinacion.
[0036] Los terminos "protelna", "peptido", "polipeptido" y "fragmento de polipeptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a pollmeros de residuos de aminoacidos de cualquier longitud. El pollmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados o analogos de aminoacidos, y puede estar interrumpido por grupos qulmicos distintos de aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un pollmero de aminoacidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervencion; por ejemplo la formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente marcador o bioactivo.
[0037] Un componente biologico "aislado" (tal como un acido nucleico o protelna u organulo) se refiere a un componente que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biologicos en la celula del organismo en el que el componente se produce naturalmente, por ejemplo, otro ADN y ARN cromosomico y extracromosomico, protelnas y organulos. Los acidos nucleicos y protelnas que se han "aislado" incluyen acidos nucleicos y protelnas purificados mediante procedimientos de purificacion estandar. El termino tambien abarca acidos nucleicos y protelnas preparados mediante tecnologla recombinante, as! como la slntesis qulmica.
[0038] El termino "purificado", tal como se utiliza en el presente documento, no requiere una pureza absoluta; mas bien, se entiende como un termino relativo. De este modo, por ejemplo, una preparacion de polipeptido purificado es aquella en la que el polipeptido esta mas enriquecido que el polipeptido en su medio natural. Es decir, el polipeptido esta separado de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" se entiende que el polipeptido representa varias realizaciones en las que al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 98%, o mas de los componentes o materiales celulares se han eliminado. Del mismo modo, el polipeptido puede estar parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entiende que se eliminan al menos el 60% de los componentes o materiales celulares. Lo mismo se aplica a polinucleotidos. Los polipeptidos descritos en este documento se pueden purificar mediante cualquiera de los medios conocidos en la tecnica.
[0039] Tal como se ha indicado anteriormente, los polipeptidos antigenicos o fragmentos o variantes de los mismos son polipeptidos antigenicos del BTV que se producen en plantas o algas. Los fragmentos y variantes de los polinucleotidos descritos y polipeptidos codificados por los mismos tambien estan abarcados por la presente descripcion. Por "fragmento" se entiende una parte del polinucleotido o una parte de la secuencia de aminoacidos antigenica codificada por el mismo. Los fragmentos de un polinucleotido pueden codificar fragmentos de protelna que retienen la actividad biologica de la protelna nativa y, por lo tanto, tienen actividad inmunogenica tal como se senala en otra parte en este documento. Los fragmentos de la secuencia de polipeptido conservan la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en un animal.
[0040] "Variantes" pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para polinucleotidos, una variante comprende una delecion y/o adicion de uno o mas nucleotidos en uno o mas sitios dentro del polinucleotido nativo y/o una sustitucion de uno o mas nucleotidos en uno o mas sitios en el polinucleotido nativo. Tal como se utiliza en el presente documento, un polinucleotido o polipeptido "nativo" comprende una secuencia de nucleotidos o de
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aminoacidos de origen natural, respectivamente. Las variantes de un polinucleotido particular de la presente invencion (es decir, el polinucleotido de referencia) tambien se pueden evaluar por comparacion del porcentaje de la identidad de secuencia entre el polipeptido codificado por un polinucleotido variante y el polipeptido codificado por el polinucleotido de referencia. Protelna "variante" se entiende que significa una protelna derivada de la protelna nativa por delecion o adicion de uno o mas aminoacidos en uno o mas sitios en la protelna nativa y/o sustitucion de uno o mas aminoacidos en uno o mas sitios en la protelna nativa. Las protelnas variantes abarcadas por la presente invencion son biologicamente activas, es decir, tienen la capacidad de provocar una respuesta inmune.
[0041] En el presente documento se describen polipeptidos del BTV de ovino, bovino o caprino. Tambien se describen en el presente documento polipeptidos que tienen secuencias que se exponen en las SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25, y variantes o fragmentos de las mismas.
[0042] Ademas, los homologos de los polipeptidos del BTV de ovino, bovino o caprino pretenden estar dentro del alcance de la presente descripcion. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "homologos" incluye ortologos analogos y paralogos. El termino "analogos" se refiere a dos polinucleotidos o polipeptidos que tienen la misma funcion o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El termino "ortologos" se refiere a dos polinucleotidos o polipeptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral comun por especiacion. Normalmente, los ortologos codifican polipeptidos que tienen las mismas funciones o similares. El termino "paralogos" se refiere a dos polinucleotidos o polipeptidos que estan relacionados por duplicacion dentro de un genoma. Los paralogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los analogos, ortologos y paralogos de un polipeptido del BTV de tipo salvaje pueden diferir del polipeptido del BTV de tipo salvaje en modificaciones posteriores a la traduccion, en diferencias en la secuencia de aminoacidos, o en ambas. En particular, los homologos mostraran generalmente al menos el 80-85%, 85-90%, 90-95%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de las secuencias de polipeptidos o polinucleotidos del BTV de tipo salvajer, y mostraran una funcion similar. Las variantes incluyen variantes alelicas. El termino "variante alelica" se refiere a un polinucleotido o un polipeptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoacidos de una protelna y que existen dentro de una poblacion natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Dichas variaciones alelicas naturales pueden dar lugar habitualmente al 1-5% de diferencia en un polinucleotido o un polipeptido. Las variantes alelicas pueden identificarse mediante secuenciacion de la secuencia de acido nucleico de interes en un numero de diferentes especies, que se puede llevar a cabo facilmente utilizando sondas de hibridacion para identificar el mismo locus genetico de genes en estas especies. Cualquiera y todas de dichas variaciones de acido nucleico y polimorfismos de aminoacidos resultantes o variaciones que son el resultado de una variacion alelica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interes, pretenden estar dentro del alcance de la invencion.
[0043] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "derivado" o "variante" se refiere a un polipeptido, o un acido nucleico que codifica un polipeptido, que tiene uno o mas variaciones conservativas de aminoacidos u otras modificaciones menores, tales que (1) el polipeptido correspondiente tiene una funcion sustancialmente equivalente en comparacion con el polipeptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipeptido es inmunorreactivo con el polipeptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipeptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoacidos primarias del polipeptido del BTV que pueden dar lugar a peptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparacion con el polipeptido homologo sin modificar. Dichas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser espontaneas. El termino "variante" contempla ademas deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipeptido funcione para producir una respuesta inmunologica, tal como se define en el presente documento.
[0044] El termino "variacion conservativa" indica el reemplazo de un residuo de aminoacido por otro residuo biologicamente similar, o la sustitucion de un nucleotido en una secuencia de acido nucleico, de tal manera que el residuo de aminoacido codificado no cambia o es otro residuo biologicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas seran generalmente conservativas en la naturaleza, tal como se describe anteriormente.
[0045] Los polinucleotidos de la descripcion incluyen secuencias que estan degeneradas como resultado del codigo genetico, por ejemplo, el uso de codones optimizado para un huesped especlfico. Tal comose utiliza en este documento, "optimizado" se refiere a un polinucleotido que se manipula geneticamente para aumentar su expresion en una especie dada. Para proporcionar polinucleotidos optimizados que codifican polipeptidos del BTV, la secuencia de ADN del gen de la protelna del BTV se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie en particular; 2) comprender un contenido de A + T o G + C en la composicion de bases de nucleotidos al que sustancialmente se encuentra en dicha especie; 3) formar una secuencia de inicio de dicha especie; o 4) eliminar las secuencias que provocan la desestabilizacion, poliadenilacion inapropiada, degradacion y termination de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de expresion de la protelna del BTV en dichas especies se puede lograr mediante la utilization de la frecuencia de distribution del uso del codon en eucariotas y procariotas, o en una especie en particular. El termino "frecuencia de uso de codon preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una celula huesped especlfica en el uso de codones de nucleotidos para especificar un aminoacido determinado. Existen 20 aminoacidos naturales, la mayorla de los cuales estan especificados por mas de un codon. Por lo tanto, todas las
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secuencias degeneradas de nucleotidos estan incluidas en la descripcion, siempre que la secuencia de aminoacidos del polipeptido del BTV codificada por la secuencia de nucleotidos se invariable funcionalmente.
[0046] La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos puede establecerse mediante blast de emparejamiento de NCBI (Centro Nacional de Informacion Biotecnologica) y matriz blosum62, utilizando los parametros estandar (vease, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor del "Centro Nacional para Informacion sobre Biotecnologla" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.), as! como en Altschul et al.; y por lo tanto, este documento habla de utilizar el algoritmo o BLAST o la matriz BLOSUM62 y BLASTX mediante el termino "blast”).
[0047] La "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse al numero de posiciones con nucleotidos o aminoacidos identicos dividido por el numero de nucleotidos o aminoacidos en la mas corta de las dos secuencias en las que la alineacion de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamano de ventana de 20 nucleotidos, una longitud de palabra de 4 nucleotidos, y una penalizacion de hueco de 4, y el analisis asistido por ordenador y la interpretacion de los datos de secuencia que incluye alineacion pueden realizarse convenientemente utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad de secuencia u homologla con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN estan dentro del alcance de la invencion y pueden derivarse de secuencias de ADN, al considerar que la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.
[0048] La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoacidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleotidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
[0049] Los siguientes documentos proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homologla relativa de secuencias, y adicionalmente o alternativamente con respecto a lo anterior, las ensenanzas de estas referencias pueden utilizarse para determinar el porcentaje de homologla o identidad: Needleman SB y Wunsch CD; Smith TF y Waterman MS; Smith TF, Waterman MS y Sadler JR; Feng DF y Dolittle RF; Higgins DG y Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ; y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies O. Y, sin experimentacion indebida, el experto en la materia puede consultar con muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homologla.
[0050] Las reacciones de hibridacion pueden llevarse a cabo en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reaccion de hibridacion son bien conocidos. Vease, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edicion (Sambrook et al, 1989).
[0051] La descripcion abarca ademas los polinucleotidos del BTV contenidos en una molecula vector o un vector de expresion y estan unidos operativamente a un elemento promotor y, opcionalmente, a un potenciador.
[0052] Un "vector" se refiere a un plasmido o virus de ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleotido heterologo para liberar a una celula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleotido heterologo puede comprender una secuencia de interes para los fines de prevencion o terapia, y opcionalmente puede estar en la forma de un casete de expresion. Tal como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replication en la celula o sujeto diana final. El termino incluye vectores de donation y vectores virales.
[0053] El termino "recombinante" significa un polinucleotido de origen semisintetico o sintetico que, o bien no se produce en la naturaleza o esta ligado a otro polinucleotido en una disposition no encontrada en la naturaleza.
[0054] "Heterologo" significa derivado de una entidad geneticamente distinta del resto de la entidad a la que se esta comparando. Por ejemplo, un polinucleotido puede colocarse mediante tecnicas de ingenierla genetica en un plasmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleotido heterologo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterologo.
[0055] Se describen en el presente documento vacunas o composiciones farmaceuticas o composiciones inmunologicas ovinas, bovinas y caprinas que pueden comprender una cantidad eficaz de un antlgeno del BTV recombinante y un portador, excipiente o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.
[0056] La materia descrita en el presente documento se dirige, en parte, a composiciones y procedimientos relacionados con el antlgeno del BTV preparado en un sistema de expresion de planta o alga que era altamente inmunogenica y protegla animales contra la estimulacion a partir de cepas del BTV.
Composiciones
[0057] Se describe en el presente documento una vacuna o composition del BTV que puede comprender una
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cantidad eficaz de un antlgeno del BTV recombinante y un portador, excipiente o vehlcuio farmaceutica o veterinariamente aceptable. El antlgeno del BTV recombinante puede expresarse en una planta o alga.
[0058] En una realizacion, la materia que se describe en el presente documento se refiere a una composicion que comprende un antlgeno del BTV producido por un sistema de expresion de lenteja de agua y material vegetal de lenteja de agua, incluyendo el genero Lemna, y un portador, excipiente o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.
[0059] El antlgeno del BTV recombinante puede expresarse en algas. Las algas se pueden seleccionar de Schizochytrium. El antlgeno del BTV recombinante puede expresarse en un sistema de expresion de protelnas de Schizochytrium, tal como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 7.001.772 y la publication de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2008/0022422.
[0060] Se describen en el presente documento protelnas producidas por un sistema de expresion de planta o alga que comprende un antlgeno del BTV y material de la planta o alga.
[0061] En una realizacion, la materia que se describe en el presente documento se refiere a una vacuna o composicion que comprende un antlgeno del BTV producido por un sistema de expresion de lenteja de agua y el material vegetal de la lenteja de agua.
[0062] Se describe en el presente documento un cultivo de planta o planta transformada de forma estable que
expresa un antlgeno del BTV en el que el cultivo de planta o planta es la lenteja de agua.
[0063] La presente description abarca cualquier polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV que provoca una respuesta inmunogenica en un animal, tal como ovino, bovino, o caprina. El polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV puede ser cualquier polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV, tal como, pero no limitado a, una protelna, peptido o fragmento de los mismos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como ovino, bovino, o caprino.
[0064] Tal como se describe en el presente documento, en el que la composicion o vacuna inmunologica del BTV es
una composicion o vacuna inmunologica recombinante, la composicion o vacuna que comprende un vector
recombinante y un excipiente, portador o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable; el vector
recombinante puede ser un vector de expresion de planta que puede comprender un polinucleotido que codifica un polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno. El polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV puede ser VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, NS1, VP7, NS2, VP6, NS3, NS3a, o cualquier fragmento de los mismos.
[0065] Tal como se describe en el presente documento, el polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV se puede derivar de un ovino, bovino o caprino infectado con una cepa del BTV. El antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV puede ser una ARN polimerasa (VP1), una protelna de la capside externa (VP2, VP5), una protelna de la capside interna (VP3), una enzima “capping” (VP4), una protelna que forma tubulos (NS1), una protelna de la superficie externa del nucleo (VP7), una protelna de la matriz (NS2), una helicasa (VP6), y glicoprotelnas (NS3 y NS3a). La tabla 1 (modificada de Wilson y Mecham 2000) a continuation resume los genes del BTV y su funcion de la protelna.
Tabla 1. Genes del virus de la lengua azul y las protelnas codificadas con la ubicacion, propiedades y funcion de las protelnas____________________________________________________________________________________
Segmento de genoma
Protelna Ubicacion Propiedades y funcion
L1 (3954 pb) (150 kDa)
VP1 Dentro del subnucleo en el e|e de orden 5 ARN polimerasa dependiente de ARN
L2 (2926 pb) (111 kDa)
VP2 Capside externa (trlmero) Capside externa, antlgeno especlfico de serotipo, protelna de union a celulas de mamlfero, epltopos neutralizantes
L3 (2770 pb) (103 kDa)
VP3 Capa de la capside del subnucleo (T = 2 simetrla) Cubierta de la capside de protelna mas interna, capa de la capside del sub-nucleo, autoensamblaje, mantiene simetrla icosaedrica, union a ARN, interacciona con protelnas menores internas
M4 (2011 pb) (76 kDa)
VP4 Dentro del subnucleo en el eje de orden 5 (dlmero) Enzima “capping”, guanililtransferasa
M5 (1638 pb) (59 kDa)
VP5 Capside externa (trlmero) protelna interna de capside externa, puede afectar las caracterlsticas del serotipo del virus
M6 (1769 pb) (64 kDa)
NS1 Citoplasma Forma tubulos en el citoplasma de la celula
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S7 (1156 pb) (38 kDa)
VP7 Nucleo externo (T = 13 simetrla, trlmero) protelna de la superficie del nucleo externo, antlgeno especlfico de serogrupo principal inmuno-dominante, protelna de union para celulas de insectos vectores, reacciona con anticuerpos “neutralizantes del nucleo"
S8 (1124 pb ) (41 kDa)
NS2 citoplasma, cuerpos de inclusion virales (VIB) protelnas de la matriz de cuerpos de inclusion virales importantes, union a ARN de cadena simple, fosforilada, se puede asociar con la capside externa
S9 (1046 pb) (36 kDa)
VP6 Dentro del subnucleo en el eje de orden 5 (dlmero) union a ARN de cadena simple y cadena doble, helicasa, NTPasa
S10 (822 pb) (24 kDa)
NS3, NS3a Membranas celulares glicoprotelnas, protelnas de membrana, implicadas en la salida de celulas
[0066] En el que la composition o vacuna inmunologica del BTV es una composition inmunologica o de vacuna recombinante, la composicion o vacuna que comprende un vector recombinante y un excipiente, portador o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable; el vector recombinante puede ser un vector de expresion de planta que puede comprender un polinucleotido que codifica un polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV. El polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV puede ser un polipeptido de la capside externa BTV (VP2, VP5).
[0067] En una realization, el antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV es VP2 o VP2 y VP5. En otra realization, el VP2 puede modificarse de manera que se localiza en el citoplasma cuando se expresa en la lenteja de agua. En otra realizacion, el VP2 puede tener un 5'UTR optimizado para la expresion en lenteja de agua.
[0068] En otra realizacion adicional, el antlgeno del BTV pueden derivar del BTV1. En una realizacion, las secuencias del BTV1 se optimizan para expresarse en la lenteja de agua.
[0069] En otra realizacion, el VP2 o VP5 se alslan a partir de un aislado frances.
[0070] La presente description se refiere a una composicion o vacuna del BTV que puede comprender una cantidad eficaz de un antlgeno del BTV recombinante y un portador, excipiente, adyuvante, o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable. En una realizacion, el antlgeno del BTV puede ser VP2 o VP5 del BTV.
[0071] Tal como se describe en el presente documento, el antlgeno del BTV recombinante se puede expresar en una planta o alga. En otra realizacion, la planta es una planta de lenteja de agua, incluyendo una planta de Lemna. En aun otra realizacion, la planta es Lemna minor. En una realizacion, el antlgeno del BTV recombinante puede expresarse en un sistema de expresion de protelnas privado de Lemna minor, ventajosamente sistemaSM LEX de Biolex.
[0072] En otra realizacion, el portador, excipiente, adyuvante o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsion de agua en aceite. En aun otra realizacion, la emulsion de agua en aceite puede ser una emulsion triple agua/aceite/agua (W/O/W). En aun otra realizacion, los adyuvantes incluyen EMULSIGEN®, hidroxido de aluminio y saponina, CpG, o combinaciones de los mismos.
[0073] La descripcion abarca ademas los polinucleotidos del BTV contenidos en una molecula de vector o un vector de expresion y unidos operativamente a un elemento promotor y, opcionalmente, a un potenciador.
[0074] Se describen en el presente documento polipeptidos del BTV que tienen una secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, o 25, y la variante o fragmento del mismo.
[0075] En otro aspecto, la presente invention proporciona un polipeptido que tiene al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipeptido antigenico de la invencion, en particular con los polipeptidos que tienen una secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 4, 6 o 10.
[0076] Se describen en el presente documento fragmentos y variantes de los polipeptidos del BTV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25), que facilmente se pueden preparar por un experto en la tecnica usando tecnicas de biologla molecular bien conocidas.
[0077] Las variantes son polipeptidos homologos tienen una secuencia de aminoacidos de al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoacidos tal como se establece en la
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SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25.
[0078] Un fragmento inmunogenico de un polipeptido del BTV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoacidos consecutivos, al menos 21 aminoacidos, al menos 23 aminoacidos, al menos 25 aminoacidos, o al menos 30 aminoacidos de un polipeptido del BTV que tiene una secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25, o variantes del mismo. Un fragmento de un polipeptido del BTV incluye un epltopo antigenico especlfico que se encuentra en un polipeptido del BTV de longitud completa.
[0079] Se describe en el presente documento un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, tal como un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25. Tambien se describe en el presente documento un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipeptido que tiene una secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25, o una variante conservadora, una variante alelica, un homologo o un fragmento inmunogenico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoacidos consecutivos de uno de estos polipeptidos, o una combinacion de estos polipeptidos.
[0080] Se describe en el presente documento un polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, o 9, o una variante del mismo. En aun otro aspecto, la presente invencion proporciona un polinucleotido que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleotido que tiene una secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, o 9, o una variante del mismo.
[0081] Los polinucleotidos de la descripcion pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificacion adicionales dentro de la misma unidad de transcripcion, elementos de control, tales como promotores, sitios de union a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion, unidades de transcripcion adicionales bajo el control del mismo promotor o un promotor diferente, secuencias que permiten la clonacion, expresion, recombinacion homologa y transformacion de una celula huesped, y cualquier constructo que pueda ser deseables para proporcionar realizaciones de esta descripcion.
[0082] Los elementos para la expresion de un polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV estan presentes en un vector. De forma minima, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en un codon de inicio (ATG), un codon de terminacion y un promotor, y opcionalmente tambien una secuencia de poliadenilacion para ciertos vectores, tales como plasmido, y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos de los virus dela viruela. Cuando el polinucleotido codifica un fragmento de poliprotelna, por ejemplo, un peptido del BTV, ventajosamente, en el vector, un ATG se coloca en 5' del marco de lectura y un codon de terminacion se coloca en 3'. Otros elementos para el control de la expresion pueden estar presentes, tales como secuencias potenciadoras, secuencias de estabilizacion, tales como secuencias de intrones y secuencias senal, que permiten la secrecion de la protelna.
[0083] La presente descripcion tambien se refiere a preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresion, por ejemplo, composiciones terapeuticas. Las preparaciones pueden comprender uno o mas vectores, por ejemplo, vectores de expresion, tales como vectores de expresion in vivo, que comprenden y expresan uno o mas polipeptidos, antlgenos, epltopos o inmunogenos del BTV. El vector puede contener y expresar un polinucleotido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleotido que codifica (y ventajosamente expresa) un antlgeno, epitopo o inmunogeno del BTV, en un portador, excipiente o vehiculo farmaceutica o veterinariamente aceptable. De este modo, el otro vector o vectores en la preparacion comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleotido que codifica, y bajo circunstancias apropiadas, el vector expresa una o mas proteinas de un polipeptido, antlgeno, epitopo o inmunogeno del BTV, o un fragmento del mismo.
[0084] El vector o vectores en la preparacion pueden comprender, o consistir esencialmente en, o consistir en un polinucleotido o polinucleotidos que codifican una o mas proteinas o fragmento o fragmentos de las mismas de un polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV, expresando el vector o vectores el polinucleotido o polinucleotidos. La preparacion puede comprender uno, dos, o mas vectores que comprenden polinucleotidos que codifican y expresan, ventajosamente in vivo, un polipeptido del BTV, antigeno, proteina de fusion o un epitopo del mismo. La descripcion tambien esta dirigida a mezclas de vectores que comprenden polinucleotidos que codifican y expresan diferentes polipeptidos, antigenos, epitopos o inmunogenos del BTV, por ejemplo, un polipeptido, antigeno, epltopo o inmunogeno del BTV de diferentes especies animales, tales como, pero no limitado a, ovino, bovino, o caprino.
[0085] El vector de expresion puede ser un vector plasmido o un vector de plasmido de ADN, en particular un vector de expresion in vivo. En un ejemplo especlfico no limitativo, el plasmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Lucas et al, 1997; Hartikka et al, 1996, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.846.946 y 6.451.769) se puede
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utilizar como una vector para la insercion de una secuencia de polinucleotidos. El plasmido pVR1020 se deriva de pVR1012 y contiene la secuencia de senal tPA humanoa. La senal tPA humana puede comprender desde el aminoacido M(1) al aminoacido S(23) de la secuencia que tiene el numero de acceso de Genbank HUMTPA14. En otro ejemplo especlfico no limitativo, el plasmido utilizado como vector para la insercion de una secuencia de polinucleotidos puede contener la secuencia de peptido senal de IGF1 equino desde el aminoacido M(24) al aminoacido A(48) de la secuencia que tiene numero de acceso de GenBank U28070. Informacion adicional sobre plasmidos de ADN que pueden consultarse o emplearse en la practica se encuentran, por ejemplo, en las patentea de Estados Unidos N° 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y 6.221.362.
[0086] El termino plasmido cubre cualquier unidad de transcripcion de ADN que comprende un polinucleotido de acuerdo con la invencion y los elementos necesarios para su expresion in vivo en una celula o celulas del huesped o diana deseada; y, en este sentido, cabe indicar que un plasmido circular, superenrollado o no superenrollado, as! como una forma lineal, pretenden estar dentro del alcance de la descripcion.
[0087] Cada plasmido comprende o consiste esencialmente en, ademas del polinucleotido que codifica un antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV, opcionalmente fusionado con una secuencia de peptido heterologo, variante, analogo o fragmento, unido operativamente a un promotor o bajo el control de una promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en celulas eucariotas. El promotor fuerte puede ser, pero no limitado a, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente con otro origen, tal como la rata o conejillo de indias, el Super promotor (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995.). El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real que puede o no estar asociada con la parte del potenciador. Se puede hacer referencia a los documentos EP-A-260 148, EP-A-323 597, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, as! como a la solicitud de PCT No WO87/03905. El promotor CMV-IE es ventajosamente un CMV-iE humano (Boshart et al., 1985) o CMV-IE murino.
[0088] En terminos mas generales, el promotor tiene origen viral, vegetal o celular. Un promotor fuerte viral distinto del CMV-IE que puede emplearse utilmente en la practica de la invencion es el promotor temprano/tardlo del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor fuerte celular que puede emplearse utilmente en la practica de la invencion es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989).
[0089] Se puede utilizar cualquiera de los promotores constitutivos, regulables o dependientes de estlmulo. Por ejemplo, los promotores constitutivos pueden incluir el promotor de la manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. Alternativamente, puede ser ventajoso usar promotores de genes de choque termico, promotores de genes inducibles por sequla, promotores de genes de inducibles por patogenos, promotores de genes inducibles por lesion y promotores de genes inducibles por luz/oscuridad. Puede ser util el uso de promotores que son controlados por los reguladores de crecimiento de plantas, tales como el acido absclsico, auxinas, citoquininas y acido giberelico. Los promotores tambien pueden elegirse de manera que den una expresion especlfica de tejido (por ejemplo, promotores especlficos de ralces, hojas y flores).
[0090] Los plasmidos pueden comprender otros elementos de control de la expresion. Es particularmente ventajoso incorporar una secuencia o secuencias de estabilizacion, por ejemplo, una secuencia o secuencias de intrones, por ejemplo, intron de la alcohol de deshidrogenasa de malz (Callis et al Genes & Dev.1 (10): 1183-1200, diciembre de 1987), el primer intron del hCMV-IE (Solicitud PCT No. WO1989/01036), el intron II del gen de la b-globina de conejo (van Ooyen et al., 1979). Los plasmidos pueden comprender 3'UTR. La 3 'UTR puede ser, pero no limitado a, la 3'UTR de la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium (Nopaline synthasa: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al J. Mol Appl Genet, 1982; Bevan, NAR, 1984, 12 (22): 8711-8721).
[0091] En cuanto a la senal de poliadenilacion (poliA) para los plasmidos y vectores virales distintos de los virus de la viruela, se puede utilizar mas la senal de poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (vease el documento US 5.122.458), o la senal de poli(A) del gen de la b-globina de conejo o la senal de poli(A) del virus SV40.
[0092] Una "celula huesped" se refiere a una celula procariota o eucariota que ha sido alterada geneticamente, o es capaz de ser alterada geneticamente mediante la administracion de un polinucleotido exogeno, tal como un plasmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a celulas geneticamente modificadas, el termino se refiere tanto a la celula originalmente alterada como a la progenie de la misma.
[0093] En una realizacion, el antlgeno del BTV recombinante se expresa en una planta transgenica. En otra realizacion, la planta transgenica es una planta Lemna. En aun otra realizacion, la planta transgenica es Lemna minor (lenteja de agua). En aun otra realizacion, el antlgeno del BTV recombinante puede expresarse en el sistema de expresion de protelnas de Lemna minor (lenteja de agua), el sistemaSM LEX de Biolex. Los detalles del sistema de expresion de protelna de Lemna minor (lenteja de agua) se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 6.815.184, 7.022.309, 7.160.717, 7.176.024, 6.040.498, y 7.161.064. En aun otra realizacion, el alga transgenico es Schizochytrium. Los detalles del sistema de expresion de protelnas de algas se pueden
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encontrar, por ejemplo, en los documentos US 7.001.772, US 2008/0022422.
Procedimientos para la expresion de polipeptidos del BTV en lenteja de agua o microalgas
[0094] De este modo, en algunas realizaciones de la invention, los polipeptidos antigenicos del BTV, o variantes de los mismos, se expresan en la lenteja de agua. Estos procedimientos comprenden el uso de casetes de expresion que se introducen en una planta de lenteja de agua utilizando cualquier procedimiento de transformation adecuado conocido en la tecnica. Los polinucleotidos dentro de estos casetes de expresion pueden modificarse para mejorar la expresion del polipeptido antigenico BTV, o un fragmento o variante del mismo, en la lenteja de agua o microalga, tal como se indica a continuation.
Casetes para la expresion en lenteja de polipeptidos del BTV antigenicos
[0095] La lenteja de agua transgenica que expresa un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, se obtiene mediante la transformacion de la lenteja de agua con un casete de expresion que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV antigenico, o un fragmento o variante del mismo. De esta manera, un polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, se construye dentro de un casete de expresion y se introduce en una planta de lenteja de agua mediante cualquier procedimiento de transformacion adecuado conocido en la tecnica.
[0096] La planta de lenteja de agua que se transforma con un casete de expresion que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, tambien ha sido transformada con un casete de expresion que proporciona la expresion de otro polipeptido heterologo de interes, por ejemplo, otro polipeptido del BTV, fragmento, o variante del mismo. El casete de expresion que proporciona la expresion de otro polipeptido heterologo de interes puede ser proporcionado en el mismo polinucleotido (por ejemplo, en el mismo vector de transformacion) para la introduction en una planta de lenteja de agua, o en un polinucleotido diferente (por ejemplo, en diferentes vectores de transformacion) para la introduccion en la planta de lenteja de agua al mismo tiempo o en momentos diferentes, mediante el mismo o diferentes procedimientos de introduccion, por ejemplo, mediante los mismos o diferentes procedimientos de transformacion.
[0097] Los casetes de expresion para usar en la transformacion de la lenteja de agua comprenden elementos de control de la expresion que al menos comprenden una region de inicio de la transcription (por ejemplo, un promotor) unida operativamente al polinucleotido de interes, es decir, un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, fragmento, o variante del mismo. "Unido operativamente", tal como se utiliza en el presente documento en referencia a secuencias de nucleotidos, se refiere a multiples secuencias de nucleotidos que se colocan en una relation funcional entre si. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de protelnas, en fase de lectura. Dicho casete de expresion se proporciona con una pluralidad de sitios de restriction para la insertion del polinucleotido o polinucleotidos de interes (por ejemplo, un polinucleotido de interes, dos polinucleotidos de interes, etc.) para estar bajo la regulation transcripcional del promotor y otros elementos de control de la expresion. En realizaciones particulares de la invencion, el polinucleotido a transferir contiene dos o mas casetes de expresion, cada uno de los cuales contiene al menos un polinucleotido de interes.
[0098] Por "elemento de control de la expresion" se entiende una region reguladora de ADN, que comprende normalmente una caja TATA, capaz de dirigir la ARN polimerasa II, o en algunas realizaciones, la ARN polimerasa III, para iniciar la slntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripcion apropiado para una secuencia de codification particular. Un elemento de control de la expresion puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento generalmente colocadas en direction 5' de la caja TATA, que influyen (por ejemplo, aumentan) la velocidad de inicio de la transcripcion. Ademas, un elemento de control de la expresion puede comprender adicionalmente secuencias generalmente posicionadas en direccion 3' de la caja TATA, que influyen (por ejemplo, aumentan) la velocidad de inicio de la transcripcion.
[0099] La region de inicio de la transcripcion (por ejemplo, un promotor) puede ser nativo u homologa o extrano o heterologo para el huesped lenteja de agua, o podrla ser la secuencia natural o una secuencia sintetica. Por extrano, se entiende que la region de inicio transcripcional no se encuentra en el huesped lenteja de agua de tipo natural en el que se introduce la region de inicio transcripcional. Por "promotor funcional" se entiende el promotor que, cuando esta unido operativamente a una secuencia que codifica un polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, es capaz de dirigir la expresion (es decir, transcripcion y traduction) del polipeptido, fragmento, o variante codificado. Los promotores se pueden seleccionar basandose en el resultado deseado. De este modo, los casetes de expresion descritos en este documento pueden comprender promotores constitutivos, inducibles, preferidos de tejido, u otros promotores para la expresion en lenteja de agua.
[0100] Cualquier promotor adecuado conocido en la tecnica se puede emplear en los casetes de expresion de acuerdo con la presente invencion, incluyendo promotores de bacterias, levaduras, hongos, insectos, mamlferos y plantas. Por ejemplo, se puedne utilizar promotores de plantas, incluyendo promotores de lenteja de agua o de microalga. Los promotores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el promotor del virus mosaico de la coliflor 35S,
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los promotores de opina sintetasa (por ejemplo, nos, mas, ocs, etc.), el promotor de ubiquitina, el promotor de la actina, el promotor de subunidad pequena de la ribulosa bifosfato (RuBP) carboxilasa y el promotor de alcohol deshidrogenasa. El promotor de la subunidad pequena de RuBP carboxilasa de lenteja de agua se conoce en la tecnica (Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). Otros promotores de virus que infectan a las plantas o las microalgas son tambien adecuados, incluyendo, pero no limitado a, promotores aislados del virus del mosaico de Dasheen, el virus de Chlorella (por ejemplo, el promotor de adenina metiltransferasa del virus de Chlorella; Mitra et al (1994) Plant Mol Biol. 26:85), virus del bronceado del tomate, virus del cascabel del tabaco, el virus de la necrosis del tabaco, virus de la mancha anular del tabaco, virus de la mancha anular del tomate, virus del mosaico del pepino, virus de munon de cacahuete, virus del mosaico de la alfalfa, badnavirus baciliformes de cana de azucar y similares.
[0101] Los elementos de control de la expresion, incluyendo promotores, pueden elegirse para dar un nivel deseado de regulacion. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser ventajoso utilizar un promotor que confiere expresion constitutiva (por ejemplo, el promotor de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens). Alternativamente, en otras situaciones, puede ser ventajoso usar promotores que se activan en respuesta a estlmulos ambientales especlficos (por ejemplo, promotores de genes de choque termico, promotores de genes inducibles por sequla, promotores de genes inducibles por patogenos, promotores de genes inducible por lesion, y promotores de genes inducibles por luz/oscurida) o reguladores del crecimiento de las plantas (por ejemplo, los promotores de los genes inducidos por el acido absclsico, auxinas, citoquininas y acido giberelico). Como alternativa adicional, los promotores pueden elegirse de manera que dan expresion especlfica de tejido (por ejemplo, ralz, hoja, y promotores especlficos de flores).
[0102] La fuerza general de un promotor dado pueden estar influenciado por la combinacion y la organizacion espacial de las secuencias de nucleotidos que actuan en cis, tales como secuencias de activacion en direccion 5'. Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos de activacion derivadas del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens puede mejorar la transcripcion del promotor de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (vease la patente de Estados Unidos 5.955.646). En la presente description, el casete de expresion puede contener las secuencias de nucleotidos de activacion insertadas en direccion 5' de la secuencia del promotor para aumentar la expresion del polipeptido del BTV antigenico de interes, o un fragmento o variante del mismo. El casete de expresion puede incluir tres secuencias de activacion en direccion 5' derivadas del gen de de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens unidas de forma operativa a un promotor derivado de un gen de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (vease la patente de Estados Unidos 5.955.646).
[0103] El casete de expresion incluye por lo tanto, en la direccion de la transcripcion 5'-3, un elemento de control de la expresion que comprende una region de inicio transcripcional y traduccional, un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV antigenico de interes (o fragmento o variante del mismo), y una region de termination transcripcional y traduccional funcional en plantas. Cualquier secuencia de terminacion adecuada conocida en la tecnica puede usarse de acuerdo con la presente invention. La region de terminacion puede ser nativa con la region de inicio de la transcripcion, puede ser nativa con la secuencia de codification de interes, o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminacion convenientes estan disponibles del plasmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminacion de octopina sintetasa y nopalina sintetasa. Ver tambien Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141; Proudfoot (1991) Cell 64: 671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261; Munroe et al. (1990) Gen 91: 151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 9627. Las secuencias de terminacion de ejemplo adicionales son la secuencia de terminacion de la subunidad pequena de RuBP carboxilasa de guisantes y la secuencia de terminacion del virus mosaico de la coliflor 35S.
[0104] Generalmente, el casete de expresion comprendera un gen marcador seleccionable para la selection de celulas o tejidos de lenteja de agua transformados. Los genes marcadores seleccionables incluyen genes que codifican resistencia a los antibioticos, tales como los que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), as! como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas. Los genes de resistencia a herbicidas generalmente codifican una protelna diana modificada insensible al herbicida o una enzima que degrada o desintoxica el herbicida en la planta antes de que pueda actuar. Ver DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6: 2513; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. 91: 691; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833; Gordon- Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603. Por ejemplo, la resistencia a herbicidas de glifosato o sulfonilurea se ha obtenido utilizando genes que codifican enzimas diana mutantes, 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y acetolactato sintasa (ALS). La resistencia a glufosinato de amonio, boromoxinilo y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) se ha obtenido mediante el uso de genes bacterianos que codifican la fosfinotricina acetiltransferasa, una nitrilasa, o una 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenasa, que desintoxican los respectivos herbicidas.
[0105] Los genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican la neomicina fosfotransferasa II (Fraley et al (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); cianamida hidratasa (Maier- Greiner et al (1991) Proc Natl Acad Sci USA. 88: 4250); aspartato quinasa; dihidrodipicolinato sintasa (Perl et al (1993) Biotechnology 11: 715); gen bar (Toki et al (1992) Plant Physiol 100: 1503; Meagher et al (1996) Crop Sci 36: 1367); triptofano descarboxilasa (Goddijn y otros (1993) Plant Mol Biol 22: 907); neomicina fosfotransferasa (NEO; Southern et al (1982) J. Mol Appl Gen. 1: 327); higromicina fosfotransferasa (hPt o HYG; Shimizu et al (1986) Mol Cell Biol 6: 1074); dihidrofolato reductasa (DHFR; Kwok et al (1986) Proc Natl Acad Sci USA. 83: 4552); fosfinotricina
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acetiltransferasa (DeBlock et al (1987) EMBO J. 6: 2513.); acido 2,2-dicloropropionico deshalogenasa (Buchanan- Wollatron et al (1989) J. Cell Biochem. 13D: 330); acetohidroxiacido sintasa (Patente de Estados Unidos N° 4.761.373 de Anderson y col.; Haughn et al (1988) Mol Gen. Genet 221: 266); 5-enolpiruvil-shikimato-fosfato sintasa (aroA; Comai et al (1985) Nature 317: 741.); haloarilnitrilasa (WO 87/04181 de Stalker, et al.); acetil-coenzima A carboxilasa (Parker et al (1990) Plant Physiol 92: 1220); dihidropteroato sintasa (Suli; Guerineau et al (1990) Plant Mol Biol 15: 127); y polipeptido del fotosistema II de 32 kDa (psbA; Hirschberg et al (1983) Science 222: 1346 (1983).
[0106] Tambien se incluyen genes que codifican resistencia a: gentamicina (por ejemplo, aacC1, Wohlleben et al (1989) Mol Gen. Genet 217: 202-208); cloranfenicol (Herrera-Estrella et al (1983) EMBO J. 2: 987); metotrexato (Herrera-Estrella et al (1983) Nature 303: 209; Meijer et al (1991) PlantMol Biol 16: 807); higromicina (Waldron et al (1985) Plant Mol Biol 5: 103; Zhijian et al (1995) Plant Science 108: 219; Meijer et al (1991) Plant Mol Bio 16: 807); estreptomicina (Jones et al (1987) Mol Gen. Genet 210: 86); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al (1996) Transgenic Res 5: 131); bleomicina (Hille et al (1986) Plant Mol Biol 7:171); sulfonamida (Guerineau et al (1990) Plant Mol Bio 15: 127); bromoxinilo (Stalker, et al (1988) Science 242: 419); 2,4-D (Streber et al (1989) Biotechnology 7: 811); fosfinotricina (DeBlock et al (1987) EMBO J. 6: 2513.); espectinomicina (Bretagne-Sagnard y Chupeau, Transgenic Research 5: 131).
[0107] El gen bar confiere resistencia a herbicidas a los herbicidas de tipo glufosinato, tales como fosfinotricina (PPT) o bialafos, y similares. Tal como se ha indicado anteriormente, otros marcadores seleccionables que podrlan usarse en los vectores de constructos incluyen, pero no se limitan a, el gen pat, tambien para resistencia a bialafos y fosfinotricina, el gen de ALS para la resistencia a imidazolinona, el gen de HPH o HYG para resistencia a la higromicina, el gen de EPSP sintasa para la resistencia a glifosato, el gen de Hm1 para la resistencia a la toxina Hc, y otros agentes selectivos utilizados habitualmente y conocidos para un experto normal en la tecnica. Ver Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555; Brown et al. (1987) Cell 49: 603; Figge et al. (1988) Cell 52: 713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 2549; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480; Labow et al. (1990) Mol. Celda. Biol. 10: 3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19: 4647; Hillenand- Wissman (1989) Topics in Mol. and Estruc. Biol. 10: 143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; y Gill et al. (1988) Nature 334: 721.
[0108] La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitante. Cualquier gen marcador seleccionable puede utilizarse.
Modification de secuencias de nucleotidos para una expresion mejorada en una planta huesped
[0109] Cuando el polipeptido del BTV o fragmento o variante del mismo se expresan dentro de la lenteja de agua, la secuencia de polinucleotido expresada que codifica el polipeptido del BTV o fragmento o variante del mismo se puede modificar para aumentar su expresion en lenteja de agua. Una de dichas modificaciones es la slntesis del polinucleotido usando codones preferidos de las plantas, codones particularmente preferidos de lenteja de agua. Se dispone de procedimientos en la tecnica para sintetizar secuencias de nucleotidos con codones preferidos de las plantas. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.380.831 y 5.436.391.; EP 0 359 472; EP 0 385 962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 15: 3324; lannacome et al. (1997) PlantMol. Biol. 34: 485; y Murray et al. (1989) Nucleic Acids. Res. 17: 477. La slntesis se puede realizar usando cualquier procedimiento conocido para un experto en la tecnica. Los codones preferidos pueden determinarse a partir de los codones de mayor frecuencia en las protelnas expresadas en la lenteja de agua o microalga. Por ejemplo, la frecuencia de uso de codones para Lemna minor se encuentra en la Tabla A, la frecuencia de uso de codones para Schizochytrium se encuentra en la Tabla B.
________________________Tabla A. Lemna minor [gbpln]: 4 CDs (1597 codones)
campos: [triplete] [frecuencia: por miles] ([numero])____________________________
UUU 17,5 (28)
UCU 13,8 (22) UAU 8,8 (14) UGU 5,0 (8)
UUC 36,3 (58)
UCC 17,5 (28) UAC 15,7 (25) UGC 14,4 (23)
UUA 5,6 (9)
UCA 14,4 (23) UAA 0,0 (0) UGA 1,9 (3)
UUG 13,8 (22)
UCG 13,8 (22) UAG 0,6 (1) UGG 16,3 (26)
CUU 15,7 (25)
CCU 11,9 (19) CAU 6,9 (11) CGU 4,4 (7)
CUC 25,7 (41)
CCC 15,7 (25) CAC 16,9 (27) CGC 18,2 (29)
CUA 5,0 (8)
CCA 11,3 (18) CAA 10,0 (16) CGA 6,3 (10)
CUG 21,3 (34)
CCG 14,4 (23) CAG 22,5 (36) CGG 10,6 (17)
AUU 18,8 (30)
ACU 9,4 (15) AAU 13,8 (22) AGU 10,0 (16)
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20
25
30
35
AUC 19,4 (31) AUA 1,9 (3) AUG 20,7 (33)
ACC 17,5 (28) ACA 5,0 (8) ACG 10,0 (16)
AAC 21,9 (35) AAA 15,7 (25) AAG 35,7 (57)
AGC 15,0 (24) AGA 20,7 (33) AGG 17,5 (28)
GUU 15,0 (24) GUC 25,0 (40) GUA 6,3 (10)
GCU 25,0 (40) CGC 22,5 (36) GCA 14,4 (23 )
GAU 20,0 (32) GAC 26,3 (42) GAA 26,3 (42)
GGU 8,1 (13) GGC 21,9 (35) GGA 16,9 (27)
Tabla B Schizochytrium sp. ATCC 20888 [gbpln]: 3 CDS (6473 codones)
campos: [triplete] [frecuencia: por miles] ([numero])
UUU 12,2 (79)
UCU 7,0 (45) UAU 1,1 (7) UGU 0,8 (5)
UUC 19,9 (129)
UCC 23,8 (154) UAC 21,5 (139) UGC 15,3 (99)
UUA 0,0 (0)
UCA 0,5 (3) UAA 0,5 (3) UGA 0,0 (0)
UUG 0,6 (4)
UCG 18,8 (122) UAG 0,0 ( 0) UGG 8,3 (54)
CUU 12.7 (82)
CCU 11,7 (76) CAU 2,3 (15) CGU 7,1 (46)
CUC 61,2 (396)
CCC 23,8 (154) CAC 12,8 (83) CGC 42,9 (278)
CUA 0,0 (0)
CCA 1,5 (10) CAA 2,3 (15) CGA 0,3 (2)
CUG 7,4 (48)
CCG 16,2 (105) CAG 27,7 ( 179) CGG 0,8 (5)
AUU 13,9 (90)
ACU 9,1 (59) AAU 1,9 (12) AGU 1,5 (10)
AUC 33,5 (217)
ACC 29,2 (189) AAC 32,4 (210) AGC 15,6 (101)
AUA 0,0 (0)
ACA 1,5 (10) AAA 2,2 (14) AGA 0,2 (1)
AUG 27,8 (180)
ACG 9,6 (62) AAG 54,5 (353) AGG 0,0 (0)
GUU 8,3 (54)
GCU 24,4 (158) GAU 13,4 (87) GGU 13,0 (84)
GUC 53,0 (343)
CGC 86,0 (557) GAC 45,0 (291) GGC 54,5 (353)
GUA 0,2 (1)
GCA 4,0 (26) GAA 7,3 (47) GGA 3,9 (25)
GUG 14,4 (93)
GCG 15,9 (103) GAG 62,3 (403) GGG 0,5 (3)
[0110] Para los propositos de la presente descripcion, "codones preferidos de lenteja de agua" se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en la lenteja de agua de mas del 17%. "Codones preferidos de Lemna" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en el genero Lemna de mas del 17%. "Codones preferidos de Lemna minor' tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en Lemna minor de mas del 17%, donde la frecuencia de uso de codones en Lemna minor se obtiene de la base de datos de uso de codones (GenBank Release 160.0, 15 junio 2007). "Codones preferidos de microalgas" se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en microalgas de mas del 17%. "Codones preferidos de microalgas" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en la familia Thraustochytriaceae de mas del 17%. "Codones preferidos de Schizochytrium" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso del codon en schizochytrium de mas del 17% en la frecuencia de uso de codones en schizochytrium se obtiene de la base de datos de uso de codones.
[0111] Se reconoce, ademas, que todo o cualquier parte del polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, puede ser optimizada o sintetico. En otras palabras, tambien se pueden usar secuencias completamente optimizadas o parcialmente optimizadas. Por ejemplo, el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de los codones pueden ser codones preferidos de lenteja de agua. Entre el 90 y el 96% de los codones pueden ser codones preferidos de lenteja de agua. La secuencia de codificacion de una secuencia de polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, puede comprender codones utilizados con una frecuencia de al menos 17% en Lemna gibba o al menos 17% en Lemna minor. En una realizacion, el polipeptido del BTV es un polipeptido VP2 o VP5, por ejemplo, el polipeptido VP2 como se expone en SEQ ID NO: 4 o el polipeptido VP5 como se expone en SEQ ID NO: 10, y el casete de expresion comprende una secuencia codificante optimizada para este polipeptido VP2, donde la secuencia codificante comprende codones preferidos de lenteja de agua, por ejemplo, codones preferidos de Lemna minor o Lemna gibba. El casete de expresion puede comprender la SEQ ID NO: 3, que contiene codones preferidos de Lemna minor que codifican el polipeptido VP2 como se expone en SEQ ID NO: 4. El casete de expresion puede comprender la SEQ ID NO: 9, que contiene codones preferidos de Lemna minor que codifican el polipeptido VP5 como se expone en SEQ ID NO: 10.
[0112] Tambien se pueden hacer otras modificaciones al polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, para mejorar su expresion en lenteja de agua. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la eliminacion de secuencias que codifican senales de poliadenilacion espurias, senales de sitio de empalme exon-intron, repeticiones de tipo transposon y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresion genica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a niveles
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promedio para lenteja de agua, tal como se calcula por referenda a genes conocidos expresados en esta planta. Cuando sea posible, el polinucleotido que codifica el polipeptido heterologo de interes puede modificarse para evitar estructuras de ARNm secundario de horquilla predichas.
[0113] Existen diferencias conocidas entre las secuencias de nucleotidos del contexto de inicio de traduccion optimas para los codones de inicio de la traduccion en los animales, las plantas y las algas. "Secuencia de nucleotidos del contexto de inicio de traduccion" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la identidad de los tres nucleotidos directamente 5' del codon de inicio de la traduccion. "Codon de inicio de la traduccion" se refiere al codon que inicia la traduccion del ARNm transcrito a partir de la secuencia de nucleotidos de interes. La composicion de estas secuencias de nucleotidos del contexto de inicio de la traduccion puede influir en la eficiencia del inicio de la traduccion. Vease, por ejemplo, Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154: 89-98; y Joshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. 35: 993-1001. En la presente descripcion, la secuencia de nucleotidos del contexto de inicio de traduccion para el codon de inicio de la traduccion del polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV antigenico de interes, o un fragmento o variante del mismo, se puede modificar para mejorar la expresion en lenteja de agua. La secuencia de nucleotidos se puede modificar de tal manera que los tres nucleotidos directamente en direccion 5' del codon de inicio de la traduccion sean "ACC" o "ACA".
[0114] La expresion de un polipeptido del BTV en lenteja de agua tambien se puede mejorar mediante el uso de secuencias llder 5'. Tales secuencias llder pueden actuar para potenciar la traduccion. Las secuencias llder de traduccion son conocidas en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, secuencias llder de picornavirus, por ejemplo, llder de EMCV (region no codificante 5' de la encefalomiocarditis; Elroy-Stein et al (1989) Proc Natl Acad Sci USA. 86: 6126); secuencias llder de potyvirus, por ejemplo, llder de TEV (virus del grabado del tabaco; Allison et al (1986) Virology 154: 9); protelna de union a la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP; Macajak y Sarnow (1991) Nature 353: 90); llder no traducido del ARNm de protelna de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4; Jobling y Gehrke (1987) Nature 325: 622); llder del virus del mosaico del tabaco (TMV; Callie (1989) Molecular Biology of RnA, 23:56); llder del virus del grabado de la patata (Tomashevskaya et al (1993) J. Gen. Virol 74: 2717-2724); region no traducida 5' de Fed-1 (Dickey (1992) EMBO J. 11: 2311-2317); region no traducida 5' de RbcS (Silverthorne et al (1990) J. Mol Biol Plant 15: 49-58); y llder del virus del moteado clorotico del malz (MCMV; Lommel et al (1991) Virology 81: 382). Vease tambien, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Phisiology 84: 965. La secuencia llder que comprende la secuencia del intron de planta, incluyendo la secuencia del intron del gel de la alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1) del malz, el gen de catalasa de ricino, o el gen PAT1 de la ruta de triptofano de Arabidopsis, tambien se ha demostrado que aumenta la eficacia de la traduccion en plantas (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183-1200; Mascarenhas et al (1990) Plant Mol Biol 15: 913-920).
[0115] La secuencia de nucleotidos correspondiente a los nucleotidos 1222 a 1775 del gen de la alcohol deshidrogenasa 1 del malz (ADH1; GenBank numero de acceso X04049) se puede insertar en direccion 5' del polinucleotido que codifica el polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo, para mejorar la eficiencia de su traduccion. El casete de expresion puede contener el llder del gen de la subunidad pequena 5B de ribulosa-bis-fosfato carboxilasa de Lemna gibba (llder de RbcS; ver Buzby et al (1990) Plant Cell 2: 805-814.).
[0116] Se reconoce que se puede utilizar cualquier modificacion de secuencia de nucleotidos que mejore la expresion descrita anteriormente, incluyendo cualquier modificacion individual o cualquier combinacion posible de modificaciones. La frase "modificada para mejorar la expresion" en lenteja de agua, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleotido que contiene una cualquiera o cualquier combinacion de estas modificaciones.
Plantas transformadas de lenteja de agua y cultivos de nodulos de lenteja de agua o microalgas transformadas
[0117] La presente descripcion proporciona plantas de lenteja de agua transformadas que expresan un polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo. El termino "lenteja de agua" se refiere a los miembros de la familia Lemnaceae. Actualmente esta familia se divide en cinco generos y 38 especies de lenteja de agua de la siguiente manera: genero Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura , L. perpusilla, L. tenera, L. trisulca, L. turionifera, L. valdiviana); genero Spirodela (S. intermedia, S. polyrrhiza, S. punctata); genero Wolffia (Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscopica, Wa. neglecta); genero Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. lingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda, y Wl. neotropica) y el genero Landoltia (L. punctata). Cualquier otro genero o especies de Lemnaceae, si es que existen, son tambien aspectos de la presente invencion. Las especies de Lemna se pueden clasificar utilizando el esquema taxonomico descrito por Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the family of Duckweeds: The family of Lemnaceae- A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).
[0118] Tal como se usa en este documento, "planta" incluye plantas enteras, organos de plantas (por ejemplo, frondas (hojas), tallos, ralces, etc.), semillas, celulas vegetales, y la progenie de las mismas. Las partes de las plantas transgenicas deben entenderse dentro del alcance de la invencion que comprenden, por ejemplo, celulas vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido celular vegetal a partir de los cuales las plantas pueden regenerarse, tejidos, callos vegetales, embriones, as! como flores, ovulos, tallos, frutos, hojas, ralces, puntas de las
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ralces, nodulos y similares originarios de plantas transgenicas o su progenie transformadas previamente con un polinucleotido de interes y por lo tanto que consisten al menos en parte en celulas transgenicas. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "celula vegetal" incluye celulas de semillas, embriones, ovulos, regiones meristematicas, tejido de callo, hojas, frondas, ralces, nodulos, brotes, anteras y polen.
[0119] Tal como se usa en este documento, "nodulo de lenteja de agua" significa tejido de lenteja de agua que comprende celulas de lenteja de agua en las que al menos aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las celulas son celulas diferenciadas. Tal como se usa en el presente documento, "celula diferenciada", significa una celula con al menos una caracterlstica fenotlpica (por ejemplo, una morfologla celular distintiva o la expresion de un acido nucleico o protelna marcadora) que la distingue de celulas no diferenciadas o de celulas que se encuentran en otros tipos de tejidos. Las celulas diferenciadas del cultivo de nodulos de la lenteja de agua descritas en este documento forman una superficie lisa “embaldosada” de celulas interconectadas fusionadas en sus paredes celulares adyacentes, con nodulos que han comenzado a organizarse en primordio foliares dispersos por todo el tejido. La superficie del tejido del cultivo de nodulos tiene celulas epidermicas conectadas entre si a traves de plasmodesmatas.
[0120] El habito de crecimiento de las lentejas de agua es ideal para procedimientos de cultivo. La planta prolifera rapidamente a traves de brotacion vegetativa de nuevas frondas, de manera macroscopica analoga a la propagacion asexual en la levadura. Esta proliferation se produce por brotacion vegetativa a partir de celulas meristematicas. La region meristematica es pequena y se encuentra en la superficie ventral de la fronda. Las celulas meristematicas se encuentran en dos bolsillos, uno a cada lado de la vena media de la fronda. La pequena region de la vena media es tambien el sitio del que procede la ralz y surge el tallo que conecta cada fronda a su fronda madre. El bolsillo meristematico esta protegido por un colgajo de tejido. Las frondas brotan alternativamente de estos bolsillos. Los tiempos de duplication varlan segun la especie y son tan cortos como 20-24 horas (Landolt (1957) Ber. Schweiz Bot. Ges.: 67: 271; Chang et al (1977) Bull Inst Chem Sin Acad. 24:19; Datko y Mudd (1970) Plant Physiol 65:16; Venkataraman et al (1970) Z. Pflanzenphysiol 62: 316). El cultivo intensivo de lenteja de agua da lugar a las mas altas tasas de acumulacion de biomasa por unidad de tiempo (Landolt y Kandeler (1987) The family of Lemnaceae-A Monographic Study Vol 2: Photochemistry, Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich)), con la acumulacion de peso seco que oscila entre 6 y 15% del peso fresco (Tillberg et al (1979) Physiol. Plant. 46: 5; Landolt (1957) Ver. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Stomp, datos no publicados). Se ha descrito que el contenido de protelna de un numero de especies de lenteja de agua que crecen bajo condiciones variables varla en un intervalo de peso en seco de 15 a 45% (Chang et al (1977) Bull Inst Chem Acad Sin 24:19; Chang y Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol 89:91; Porath et al (1979) Aquatic Botany 7: 272; Appenroth et al (1982) Biochem Physiol Pflanz 177: 251). Utilizando estos valores, el nivel de production de protelna por litro de medio en la lenteja de agua esta en el mismo orden de magnitud que los sistemas de expresion de genes de levadura.
[0121] Se describe en el presente documento solo para referencia plantas de microalgas transformadas que expresan un polipeptido del BTV de interes, o un fragmento o variante del mismo. El termino "microalgas" o "microalga" se refiere a los miembros de la familia Thraustochytriaceae. Actualmente esta familia se divide en cuatro generos: Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides, y Japonochytrium.
[0122] Las plantas de lenteja de agua o microalgas transformadas se pueden obtener mediante la introduction de un constructo de expresion que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, en la planta de lenteja de agua o microalga de interes.
[0123] El termino "introduccion" en el contexto de un polinucleotido, por ejemplo, una constructo de expresion que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, pretende significar la presentation a la planta de lenteja de agua o microalga del polinucleotido en tal de manera que el polinucleotido consigue el acceso al interior de una celula de la planta de lenteja de agua o microalga. Cuando se introduce mas de un polinucleotido, estos polinucleotidos pueden ensamblarse como parte de un unico constructo de nucleotidos, o como constructos de nucleotidos separados, y pueden estar situados en los mismos o diferentes vectores de transformation. En consecuencia, estos polinucleotidos pueden introducirse en la celula huesped de la lenteja de agua o microalga de interes en una sola etapa de transformacion, en etapas de transformacion independientes, o, por ejemplo, como parte de un protocolo de reproduction. Las composiciones y procedimientos de la description no dependen de un procedimiento particular para la introduccion de uno o mas polinucleotidos en una planta de lenteja de agua o microalga, solo de que el polinucleotido o polinucleotidos consigan el acceso al interior de al menos una celula de la planta de lenteja de agua o microalga. Los procedimientos para introducir polinucleotidos en plantas o algas son conocidos en la tecnica incluyendo, pero no limitado a, los procedimientos de transformacion transitoria, procedimientos de transformacion estable y procedimientos mediados por virus.
[0124] "Transformacion transitoria" en el contexto de un polinucleotido, tal como un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, pretende significar que un polinucleotido se introduce en la planta de lenteja de agua o microalga y no se integra en el genoma de la planta de lenteja de agua o microalga.
[0125] Por "introduccion de forma estable" o "introducido de forma estable" en el contexto de un polinucleotido (tal
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como un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo) introducido en una planta de lenteja de agua o microalga se entiende que el polinucleotido introducido se incorpora de manera estable en el genoma de la lenteja de agua o microalga, y por lo tanto la planta de lenteja de agua o microalga se transforma de manera estable con el polinucleotido.
[0126] "Transformacion estable" o "transformado de forma estable" se entiende que significa que un polinucleotido, por ejemplo, un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, introducido en una planta de lenteja de agua o microalga se integra en el genoma de la planta o alga y es capaz de heredarse por la progenie de la misma, mas particularmente, por la progenie de multiples generaciones sucesivas. Las generaciones sucesivas pueden incluir la progenie producida vegetativamente (es decir, reproduction asexual), por ejemplo, con la propagation clonal. Las generaciones sucesivas pueden incluir la progenie producida a traves de la reproduccion sexual.
[0127] Un constructo de expresion que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, se puede introducir en una planta de lenteja de agua o microalga de interes utilizando cualquier protocolo de transformacion conocido por los expertos en la materia. Los procedimientos adecuados para introducir secuencias de nucleotidos en las plantas de lenteja de agua o celulas vegetales o nodulos o microalgas incluyen microinyeccion (Crossway et al (1986) Biotechniques 4: 320-334), electroporation (Riggs et al (1986) Proc Natl Acad Sci USA. 83: 5602-5606), transformacion mediada por Agrobacterium (patente de Estados Unidos Nos. 5.563.055 y 5.981.840, transferencia directa de genes (Paszkowski et al (1984) EMBO J. 3: 27172722), aceleracion de partlculas ballsticas (vease, por ejemplo, patente de Estados Unidos n° 4945050; 5.879.918; 5.886.244; y 5.932.782 (cada una de las cuales se incorpora aqul por referencia); y Tomes et al (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment”, en Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, ed Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al (1988) Biotechnology 6: 923926). Las celulas que han sido transformadas se pueden hacer crecer en plantas de acuerdo con las vlas convencionales.
[0128] Como se senalo anteriormente, la lenteja de agua o microalgas transformadas de forma estable se pueden obtener por cualquier procedimiento de transferencia genica conocido en la tecnica, tal como uno de los procedimientos de transferencia genica descritos en la patente de Estados Unidos N° 6040498 o las solicitudes de patente de Estados Unidos de Nos. de publication 2003/0115640, 2003/0033630 o 2002/0088027. La planta de lenteja de agua o cultivos de nodulos o microalga se pueden transformar de manera eficiente con un casete de expresion que contiene una secuencia de acido nucleico, tal como se describe en el presente documento, mediante cualquiera de un numero de procedimientos que incluyen la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, bombardeo ballstico o electroporacion. El Agrobacterium usado puede ser Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Los transformantes estables de lenteja de agua o de microalga se pueden aislar mediante la transformacion de las celulas de lenteja de agua o de microalga con la secuencia de acido nucleico de interes y un gen que confiere resistencia a un agente de seleccion, seguido por el cultivo de las celulas transformadas en un medio que contiene el agente de selection. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6040498.
[0129] Las plantas de lenteja de agua o microalgas transformadas de manera estable utilizadas en estos procedimientos deben exhibir una morfologla normal y ser fertiles por reproduccion sexual y/o capaces de reproducirse vegetativamente (es decir, reproduccion asexual), por ejemplo, con la propagacion clonal. Preferiblemente, las plantas de lenteja de agua o las microalgas de la presente invention transformadas contienen una sola copia del acido nucleico transferido comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, y el acido nucleico transferido no tiene reordenamientos notables en el mismo. Se entiende que las plantas de lenteja de agua o microalgas transformadas de la description pueden contener el acido nucleico transferido presente en un numero bajo de copias (es decir, no mas de doce ejemplares, no mas de ocho copias, no mas de cinco copias, alternaticamente, no mas de tres copias, como una alternativa adicional, menos de tres copias del acido nucleico por celula transformada).
[0130] Las plantas o microalgas transformadas que expresan un polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, se pueden cultivar en condiciones adecuadas para expresar el polipeptido del BTV antigenico, o un fragmento o variante del mismo. El polipeptido del BTV, o un fragmento o variante del mismo, a continuation, se puede recoger de la planta de lenteja de agua o microalga, el medio de cultivo, o la planta de lenteja de agua o microalgas y el medio de cultivo, y, cuando se desee, se purifica usando cualquier procedimiento de aislamiento y purification convencional conocido en la tecnica, tal como se describe en este documento. El polipeptido del BTV antigenico, o un fragmento o variante del mismo, a continuacion, se puede formular como una vacuna para aplicaciones terapeuticas, tal como se describe en este documento.
Procedimientos de preparacion de un polipeptido del BTV
[0131] Tal como se describe completamente en el presente documento, un procedimiento para producir un polipeptido del BTV comprende: (a) cultivar en un medio de cultivo de lenteja de agua una planta de lenteja de agua o nodulo de lenteja de agua, en el que la planta de lenteja de agua o nodulo de lenteja de agua se transforman de
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manera estable para expresar el polipeptido, y en el que el polipeptido se expresa a partir de una secuencia de nucleotidos que comprende una secuencia codificante para dicho polipeptido; y (b) recoger el polipeptido antigenico de dicha planta de lenteja de agua o nodulo de lenteja de agua. El termino recoger incluye, pero no se limita a, la recogida del medio de cultivo o de purificacion.
[0132] Despues de la produccion del polipeptido recombinante en la lenteja de agua o microalgas, puede utilizarse cualquier procedimiento disponible en la tecnica para la purificacion de protelnas. Las diversas etapas incluyen la liberacion de la protelna del material no proteico o de la planta o microalga, seguido de la purificacion de la protelna de interes de otras protelnas. Las etapas iniciales en el proceso de purificacion incluyen centrifugacion, filtracion o una combinacion de las mismas. Las protelnas secretadas en el espacio extracelular de los tejidos se pueden obtener utilizando vaclo o extraccion centrlfuga. El procesamiento mlnimo tambien podrla implicar la preparacion de productos en bruto. Otros procedimientos incluyen la maceracion y extraccion con el fin de permitir el uso directo del extracto.
[0133] Dichos procedimientos para purificar la protelna de interes pueden explotar las diferencias en el tamano de la protelna, las propiedades flsico-qulmicas y la afinidad de union. Dichos procedimientos incluyen cromatografla, incluyendo afinidad de procainamida, exclusion por tamano, llquida de alta presion, de fase inversa, y cromatografla de intercambio anionico, etiquetas de afinidad, filtracion, etc. En particular, se puede utilizar la cromatografla de afinidad con ion Ni inmovilizado para purificar la protelna expresada. Vease, Favacho et al. (2006) Protein expression and purification 46: 196-203. Ver tambien, Zhou et al. (2007) The protein J 26: 29-37; Wang et al. (2006) Vaccine 15: 2176-2185; y WO/2009/076778. Se pueden utilizar protectores en el proceso de purificacion, tales como agente de penetracion, antioxidantes, inhibidores de la oxidacion fenolica, inhibidores de la proteasa, y similares.
Procedimientos de uso
[0134] Se describe en el presente documento un procedimiento de vacunacion de un ovino, bovino o caprino que comprende administrar al ovino, bovino, o caprino una cantidad eficaz de una vacuna que puede comprender una cantidad eficaz de un polipeptido o antlgeno de BTV recombinante y un portador, excipiente, adyuvante o vehlculo farmaceuticamente o veterinariamente aceptable.
[0135] El procedimiento comprende una unica administracion de una composition de vacuna formulada con una emulsion oral clasica de sal cristalina de acuerdo con la invention. Se describe en el presente documento un procedimiento de vacunacion de un ovino, bovino, o caprino que comprende administrar al ovino, bovino, o caprino el polipeptido o antlgeno de BTV producido en una planta o alga, y material de planta del genero Lemna o material de microalga de Schizochytrium.
[0136] Tambien se describe en el presente documento un procedimiento para provocar una respuesta inmune que comprende administrar al ovino, bovino, o caprino una vacuna que comprende el polipeptido o antlgeno de BTV expresado en una planta o alga, en el que se provoca una respuesta inmune.
[0137] Tambien describe en el presente documento un procedimiento de preparacion de una planta de lenteja de agua transformada de manera estable que comprende, (a) introducir en la planta un constructo genetico que comprende un gen del antlgeno del BTV; y (b) cultivar la planta. Los procedimientos para la transformation de la lenteja de agua estan disponibles en la tecnica.
[0138] Tambien se describe en el presente documento un procedimiento de preparacion de una vacuna o composicion que comprende aislar un antlgeno del BTV producido por un sistema de expresion de lenteja de agua o microalgas y opcionalmente combinando con un portador, excipiente, adyuvante, o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.
[0139] Tambien se describe en el presente documento un procedimiento de preparacion de una vacuna o composicion que comprende combinar un antlgeno del BTV producido por un sistema de expresion de Lemna y material de planta del genero Lemna y opcionalmente un portador, excipiente, adyuvante, o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.
[0140] Tambien se describe en el presente documento un procedimiento de preparacion de una vacuna o composicion que comprende combinar un antlgeno del BTV producido por un sistema de expresion de Schizochytrium y material de Schizochytrium y opcionalmente un portador, excipiente, adyuvante, o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.
[0141] La administracion puede ser por via subcutanea o intramuscular. La administracion puede ser libre de aguja (por ejemplo Pigjet o Bioject).
[0142] Se puede emplear un regimen de sensibilizacion-refuerzo que comprende al menos una administracion primaria y al menos una administracion de refuerzo con al menos un polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno comun. Tlpicamente, la composicion inmunologica o vacuna utilizada en la administracion primaria es de naturaleza
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diferente a la que se utiliza como refuerzo. Sin embargo, cabe indicar que la misma composicion se puede utilizar como la administracion primaria y el refuerzo. Este protocolo de administration se llama "sensibilizacion-refuerzo".
[0143] Una sensibilizacion-refuerzo de acuerdo con la presente description puede incluir un vector viral recombinante utilizado para expresar una secuencia de codification del BTV o fragmentos de la misma. Especlficamente, el vector viral puede expresar un gen del BTV o fragmento del mismo que codifica un polipeptido antigenico. Un vector viral contemplado en este documento incluye, pero no limitado a, virus de la viruela [por ejemplo, virus vaccinia o virus vaccinia atenuado, virus de la viruela aviar o virus de la viruela aviar atenuado (por ejemplo, la viruela del canario, viruela de ave de corral, viruela de la paloma (dovepox), viruela de la paloma (pigeonpox), viruela de la codorniz, ALVAC, TROVAC; vease, por ejemplo, US 5.505.941, US 5,494,8070), virus del mapache, virus de la viruela porcina, etc.], adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes canino, virus del herpes de pavo, virus de la enfermedad de Marek, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus del herpes felino, virus de laringotraqueitis (ILTV), virus del herpes bovino, virus del herpes porcino), baculovirus, retrovirus, etc. El vector de expresion de la viruela aviar puede ser un vector de viruela del canario, tal como, ALVAC. El vector de expresion de la viruela aviar puede ser un vector de la viruela aviar, tal como, TROVAC. El antlgeno del BTV de la descripcion que se expresa puede insertarse bajo el control de un promotor de virus de viruela aviar especlfico, por ejemplo, el promotor 42K Amsacta moorei de entomopoxvirus (Barcena, Lorenzo et al. 2000), el promotor vaccinia 7.5 kDa (Cochran et al., 1985), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al., 1992), el promotor de vaccinia HA (Shida, 1986), el promotor de la viruela vacuna ATI (Funahashi et al., 1988), el promotor de vaccinia H6 (Taylor et al., 1988b; Guo et al, 1989; Perkus et al, 1989), entre otros.
[0144] El vector de expresion de la viruela aviar puede ser un vector de viruela del canario, tal como, ALVAC. El polipeptido, antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV puede ser una VP2 del BTV o VP5 del BTV. El vector viral puede ser vCP2289, que codifica VP2 y VP5 sinteticos con codones optimizados del BTV (vease el documento US 2007/0280960).
[0145] En otro aspecto del protocolo de sensibilizacion-refuerzo, se administra una composicion que comprende el antlgeno del BTV de la invention seguida de la administracion de la vacuna o la composicion que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa el antlgeno del BTV in vivo, o una vacuna viral inactivada o composicion que comprende el antlgeno del BTV, o una vacuna de ADN plasmido o composicion que contiene o expresa el antlgeno del BTV. Del mismo modo, un protocolo de sensibilizacion-refuerzo puede comprender la administracion de una vacuna o composicion que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antlgeno del BTV in vivo, o una vacuna viral inactivada o composicion que comprende un antlgeno del BTV, o una vacuna de ADN de plasmido o composicion que contiene o expresa un antlgeno del BTV, seguido de la administracion de una composicion que comprende el antlgeno del BTV de la invencion. Ademas, cabe indicar que tanto la administracion primaria como secundaria pueden comprender la composicion que comprende el antlgeno del BTV de la presente invencion.
[0146] Un protocolo de sensibilizacion-refuerzo comprende al menos una administracion de sensibilization y al menos una administracion de refuerzo usando al menos un polipeptido comun y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administracion de sensibilizacion puede ser de naturaleza diferente a la que se utiliza como vacuna de refuerzo posterior. La administracion de sensibilizacion puede comprender una o mas administraciones. Del mismo modo, la administracion de refuerzo puede comprender una o mas administraciones.
[0147] El volumen de dosis de composiciones para las especies diana que son mamlferos, por ejemplo, el volumen de dosis de las composiciones para ovinos, bovinos, o caprinos, basados en vectores virales, por ejemplo, las composiciones basadas en vectores virales node virus de viruela, es generalmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5,0 ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3,0 ml, y de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 2,5 ml.
[0148] La eficacia de las vacunas puede analizarse aproximadamente de 2 a 4 semanas despues de la ultima inmunizacion mediante estimulacion de los animales, tales como ovinos, bovinos, o caprinos, con una cepa virulenta del BTV, tal como las cepas BTV-1/2/3/4/8/9/16 o 17. Por ejemplo, la cepa del BTV puede ser el serotipo 17, que originalmente fue aislado de la sangre de las ovejas del condado de Tulare, CA (ver Bonneau, DeMaula et al 2002; DeMaula, Leutenegger et al., 2002). La cepa del BTV tambien puede ser el serotipo 8, una vacuna inactivada que se encuentra actualmente disponible en Merial Limited.
[0149] Otras cepas pueden incluir BTV1 (aislado frances), BTV1 (aislado Australia), BTV1 (aislado Sudafrica), BTV2 (aislado EE.UU.), BTV3 (aislado Sudafrica), BTV4-9, BTV10 (aislado EE.UU.), BTV11 (aislado EE.UU.), BTV 12, BTV 13 (aislado EE.UU.), BTV 14-17, BTV 17 (aislado EE.UU.), BTV18, BTV 19, BTV20 (aislado Australia), BTV21- 24, o BTV de Corcega.
[0150] Tanto las cepas homologas como heterologas se utilizan para la estimulacion para probar la eficacia de la vacuna. El animal puede estimularse por via intradermica, subcutanea, aerosol, por via intranasal, intra-ocular, intra- traqueal, y/o por via oral.
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[0151] Para el BTV, se evaluan bovinos y caprinos para determinar la lesion vascular extendida. Tambien para el BTV, se evaluan ovinos para la inflamacion catarral de las membranas de las mucosas de la boca, nariz y panza, inflamacion de las bandas coronarias y laminas de los cascos, excoriacion del epitelio, necrosis de la mucosa bucal, y lengua y boca hinchada/inflamada/azul. Pueden recogerse hisopos de todos los animales despues de la estimulacion para aislar el virus. La presencia o ausencia de antlgenos virales en los tejidos indicados anteriormente se puede evaluar por reaccion en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa en tiempo real de forma cuantitativa (qRRT-PCR). Las muestras de sangre pueden recogerse antes y despues de la estimulacion y pueden ser analizadas para detectar la presencia de anticuerpos especlficos contra el BTV.
[0152] Las administraciones de sensibilizacion-refuerzo pueden llevarse a cabo ventajosamente con 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, alrededor de 3 semanas de diferencia. De acuerdo con una realization, un refuerzo semi- anual o un refuerzo anual, de forma ventajosa usando la vacuna basada en vector viral, tambien se contempla. Los animales tienen ventajosamente al menos 6 a 8 semanas de vida en el momento de la primera administration.
[0153] Las composiciones que comprenden los polipeptidos antigenicos recombinantes de la invention utilizadas en los protocolos de sensibilizacion-refuerzo estan contenidas en un vehlculo, diluyente, adyuvante o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable. Los protocolos de la description protegen al animal del BTV ovino, bovino, o caprino y/o previenen la progresion de la enfermedad en un animal infectado.
[0154] Las diversas administraciones se realizan preferiblemente con 1 a 6 semanas de diferencia, y mas particularmente con aproximadamente 3 semanas de diferencia. Segun un modo preferido, tambien se contempla un refuerzo anual, preferiblemente usando la composition inmunologica de vacuna basada en vector viral. Los animales tienen preferiblemente al menos de un dla de vida en el momento de la primera administracion.
[0155] Debe entenderse por un experto en la tecnica que la presente descripcion se proporciona a modo de ejemplo y la presente invencion no esta limitada a la misma. A partir de la descripcion de este documento y el conocimiento en la tecnica, el experto en la materia puede determinar el numero de administraciones, la via de administracion, y las dosis a utilizar para cada protocolo de inyeccion, sin ninguna experimentation excesiva.
[0156] Se describe en el presente documento al menos una administracion a un animal de una cantidad eficaz de la composicion terapeutica fabricada de acuerdo con la invencion. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recien nacido. Esta administracion puede ser a traves de diversas rutas incluyendo, pero no limitado a, intramuscular (IM), intradermica (ID) o subcutanea (SC) o mediante administracion intranasal o por via oral. La composicion terapeutica de acuerdo con la invencion tambien se puede administrar mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE.UU.), o aparato Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.). Otra estrategia a la administracion de composiciones de plasmido es usar electroporation (vease, por ejemplo Tollefsen et al, 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al, 2002; solicitud PCT No. WO99/01158). La composicion terapeutica puede liberarse al animal mediante pistola de genes o bombardeo de partlculas de oro.
[0157] La presente descripcion proporciona la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una formulation para la liberation y expresion de un antlgeno o epltopo del BTV en una celula diana. La determination de la cantidad terapeuticamente eficaz es experimentacion rutinaria para un experto en la tecnica. La formulacion puede comprender un vector de expresion que comprende un polinucleotido que expresa un antlgeno o epltopo del BTV y un portador, vehlculo o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable. El portador, vehlculo o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable puede facilitar la transfection u otros medios de transferencia de polinucleotidos a un animal huesped y/o mejora la conservation del vector o protelna en un huesped.
[0158] Se describe en este documento un procedimiento de detection para la diferenciacion entre animales infectados y vacunados (DIVA).
[0159] En la actualidad, existen varias vacunas del BTV disponibles. Merial ofrece vacunas del BTV1 y BTV8 inactivados. Intervet ofrece vacunas del BTV8 inactivado. Pfizer ofrece vacunas del BTV1, BTV4 y BTV8 inactivados. Un procedimiento para distinguir entre animales vacunados con BTV y animales infectados con BTV ha sido descrito recientemente (Anderson, J et al, J. Virol Methods, 1993;.. Silvia C. Barros et al, Veterinary-Microbiology, 2009).
[0160] Se describe en el presente documento que el uso de la vacuna o composicion de la presente invencion permite la deteccion de la infection por BTV en un animal. Se describe en el presente documento que el uso de la vacuna o composicion de la presente invencion permite la deteccion de la infeccion en animales mediante la diferenciacion entre animales infectados y vacunados (DIVA). Se han desarrollado pruebas diagonosticas a base de protelnas no estructurales, tales como NS3-ELISA indirecto y ELISA competitivo utilizando anticuerpo monoclonal contra NS1. Sin embargo, las vacunas inactivadas todavla pueden inducir niveles bajos de anticuerpos contra protelnas no estructurales si las vacunas no se purifican suficientemente. Esta limitation se puede superar por la presente invencion expresando solo protelnas de la capside externa VP2 y VP5.
Artlculo de fabrication
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[0161] Se describe en el presente documento un kit para llevar a cabo un procedimiento para producir o inducir una respuesta inmune que puede comprender uno cualquiera de las composiciones o vacunas inmunologicas recombinantes del BTV, o composiciones o vacunas inmunologicas del BTV inactivado, composiciones o vacunas virales recombinantes del BTV, y las instrucciones para realizar el procedimiento.
[0162] Tambien se describe en el presente documento un kit para llevar a cabo un procedimiento para inducir una respuesta inmunologica o protectora contra BTV en un animal que comprende una composicion o vacuna comprende un antlgeno del BTV de la invencion y una composicion o vacuna inmunologica viral recombinante del BTV, e instrucciones para realizar el procedimiento de liberacion en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmune en el animal.
[0163] Tambien se describe en el presente documento un kit para llevar a cabo un procedimiento para inducir una respuesta inmunologica o protectora contra BTV en un animal que comprende una composicion o vacuna comprende un antlgeno del BTV de la invencion y una composicion o vacuna inmunologica del BTV inactivado, e instrucciones para realizar el procedimiento de liberacion en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmune en el animal.
[0164] Todavla otro aspecto de la presente descripcion se refiere a un kit para la vacunacion de sensibilizacion- refuerzo de acuerdo con la presente invencion como se ha descrito anteriormente. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composicion para la vacunacion de sensibilizacion de acuerdo con la presente invencion, y un segundo vial que contiene una vacuna o composicion para la vacunacion de refuerzo de acuerdo con la presente invencion. El kit puede contener ventajosamente primer y segundo viales adicionales para vacunaciones de sensibilizacion adicionales o vacunaciones de refuerzo adicionales.
[0165] Tambien se describe en el presente documento lo siguiente. Se describe una composicion que comprende un antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo y un portador, excipiente o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable. Se describe la composicion descrita anteriormente en la que el antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo comprende un fragmento inmunogenico que comprende al menos 15 aminoacidos de un antlgeno del BTV ovino, bovino o caprino. Se describen las composiciones anteriores en las que el antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo se produce en la lenteja de agua o microalgas. Se describen las composiciones anteriores en las que el antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo se purifica parcialmente. Se describen las composiciones anteriores en las que el antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo se purifica sustancialmente. Se describen las composiciones anteriores en las que el antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo es un polipeptido del BTV1. Se describen las composiciones anteriores en las que el polipeptido del BTV1 es un polipeptido VP2 o VP5. Se describen las composiciones anteriores en las que el antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25. Se describen las composiciones anteriores en las que el antlgeno del BTV esta codificado por un polinucleotido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, o 9.
[0166] Se describen las composiciones anteriores en las que el portador, excipiente, adyuvante o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable es una emulsion de agua en aceite o una emulsion de aceite en agua. Se describe un procedimiento de vacunacion de un animal susceptible al BTV ovino, bovino, o caprino que comprende administrar las composiciones anteriores al animal. Se describe un procedimiento de vacunacion de un animal susceptible al BTV ovino, bovino o caprino que comprende un regimen de sensibilizacion-refuerzo. Se describe un polipeptido antigenico sustancialmente purificado expresado en la lenteja de agua o microalga, en el que el polipeptido comprende: una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipeptido que tiene la secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO: 4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25. El animal es preferiblemente un ovino, un bovino, o un caprino. Se describe un procedimiento de diagnostico de una infeccion por BTV en un animal. Se describe un kit para la vacunacion de sensibilizacion-refuerzo que comprende al menos dos viales, en el que un primer vial contiene la composicion de la presente invencion, y un segundo vial contiene una composicion para la vacuna de refuerzo que comprende una composicion que comprende un vector viral recombinante, o una composicion que comprende una composicion viral inactivada, o una composicion de plasmido de ADN que contiene o expresa el antlgeno del BTV.
[0167] Los portadores, vehlculos, adyuvantes, o excipientes farmaceutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, un portador, vehlculo, adyuvante, o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable puede ser una solucion de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solucion salina) o un tampon fosfato. Otro portador, vehlculo, adyuvante, o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable que se puede utilizar para los procedimientos de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador, vehlculo, adyuvante, o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinacion de compuestos que faciliten la administracion del vector (o protelna expresada a partir de un vector de la invencion in vitro); ventajosamente, el portador, vehlculo, adyuvante, o excipiente puede facilitar la transfeccion y/o mejorar la conservacion del vector (o protelna). Las dosis y volumenes de las dosis se describen en este documento en la descripcion general y tambien pueden ser determinados por el experto en la materia a partir de esta descripcion lelda en relacion con el conocimiento en la tecnica, sin
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experimentacion indebida.
[0168] Los ilpidos cationicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para plasmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente formula:
CH,
| +■
R,_0 — CH2— CH—CH2 — N — R2—X
I qn OR, CH3
en la que R1 es un radical alifatico de cadena lineal saturado o Insaturado que tlene de 12 a 18 atomos de carbono, R2 es otro radical alifatico que contiene 2 o 3 atomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxiio, por ejempio, el DMRIE. En otra realizacion, el llpido cationico puede estar asociado con un llpido neutro, por ejemplo el DOPE.
[0169] Entre estos llpidos cationicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N, N-dimetil-2,3-bls(tetradecilQxi)-1 - propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un llpido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil- fosfatidil-etanol amina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.
[0170] Ventajosamente, la mezcla de plasmido con el adyuvante se forma extemporaneamente y ventajosamente simultaneamente con la administracion de la preparacion o poco antes de la administracion de la preparacion; por ejemplo, poco antes o antes de la administracion, se forma la mezcla de plasmido-adyuvante, de manera ventajosa a fin de dar tiempo suficiente antes de la administracion de la mezcla para formar un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administracion, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administracion.
[0171] Cuando DOPE esta presente, la relacion molar de DMRIE:DOPE es ventajosamente aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, mas ventajosamente aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.
[0172] El relacion en peso de adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE:plasmido puede ser de entre aproximadamente 50:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 5, y aproximadamente 1:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.
[0173] En otra realizacion, el portador, excipiente, vehlculo o adyuvante farmaceutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsion de agua en aceite. Ejemplos de emulsiones de agua en aceite adecuados incluyen emulsiones vacunales de aceite en agu a base de aceite que son estables y fluidas a 4°C que contienen: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene el antlgeno, preferiblemente del 12 al 25% v/v, del 50 al 94% v/v de una fase oleosa que contiene, en su totalidad o en parte, un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal o acido graso, un poliol o esteres de alcohol), de 0,2 a 20% p/v de tensioactivos, preferiblemente de 3 a 8% p/v, estando el ultimo en total o en parte, o en una mezcla, ya sea de esteres de poliglicerol, siendo dichos esteres de poliglicerol preferiblemente poliglicerol (poli)ricinoleatos, o aceites ricino de polioxietileno o sino aceites de ricino hidrogenado de polioxietileno. Los ejemplos de tensioactivos que se pueden utilizar en una emulsion de agua en aceite incluyen esteres de sorbitan etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitan de polioxietileno (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y esteres de sorbitan (por ejemplo, monooleato de sorbitan (SPAN 80®), disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Ademas, con respecto a una emulsion de agua en aceite, vease tambien la patente de Estados Unidos N° 6.919.084, por ejemplo, el ejemplo 8. La fase acuosa que contiene el antlgeno puede comprender una solucion salina que comprende uno o mas agentes tampon. Un ejemplo de una solucion tampon adecuado es solucion salina tamponada con fosfato. En una realizacion, la emulsion de agua en aceite puede ser una emulsion tripel agua/aceite/agua (W/O/W) (patente de Estados Unidos No. 6.358.500). Ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en la patente de Estados Unidos N° 7.371.395.
[0174] Las composiciones y vacunas inmunologicas de acuerdo con la descripcion pueden comprender o consistir esencialmente en uno o mas portadores, excipientes, vehlculos o adyuvantes farmaceutica o veterinariamente aceptables. Los portadores o adyuvantes adecuados para su uso en la practica de la presente invention son (1) pollmeros de acido acrllico o metacrllico, anhldrido maleico y pollmeros de derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleotidos que tienen una o mas unidades de CpG no metiladas (Klinman et al, 1996; WO98/16247), (3) una emulsion de aceite en agua, tal como la emulsion SPT descrita en la pagina 147 de "Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsion MF59 descrita en la pagina 183 de la misma obra, (4) llpidos cationicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidroxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes tratados en cualquier documento citado e incorporado por referenda en la presente solicitud, o (9) cualquier combination o mezclas de los mismos.
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[0175] La emulsion de aceite en agua (3), que es especialmente adecuado para vectores virales, puede basarse en: aceite de parafina liquido ligero (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoides, tales como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerizacion de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, esteres de acidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tal como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o esteres de alcoholes o acidos grasos ramificados, especialmente esteres de acido isoestearico.
[0176] El aceite se utiliza en combination con emulsionantes para formar una emulsion. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no ionicos, tales como: esteres, por un lado, de sorbitan, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otro lado, acidos oleico, isoestearico, ricinoleico o hidroxiestearico, estando dichos esteres opcionalmente etoxilados, o bloques de copolimero de polioxipropileno- polioxietileno, tales como Pluronic, por ejemplo, L121.
[0177] Entre los polimeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a polimeros de acido acnlico o metacrilico reticulados, especialmente reticulado por eteres de polialquenilo de azucares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre carbomero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la tecnica tambien puede hacer referencia a la patente de Estados Unidos N° 2.909.462, que proporciona tales polimeros acrilicos reticulados por un compuesto polihidroxilico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no mas de ocho de tales grupos, estando los atomos de hidrogeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifaticos insaturados, que tienen al menos dos atomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 atomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilenicamente insaturados. Los radicales insaturados tambien pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente adecuados. Se reticulan mediante alil sacarosa o alil pentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971P.
[0178] En cuanto a los copolimeros derivados de anhidrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolimeros de etileno-anhidrido maleico de cadena lineal o reticulados y son, por ejemplo, reticulados por divinil eter. Tambien se hace referencia a J. Fields et al., 1960.
[0179] Con respecto a la estructura, los polimeros de acido acnlico o metacrilico y EMA estan formados preferiblemente por unidades basicas que tienen la siguiente formula:
imagen1
en la que:
- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3
- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1
- y = 1 o 2, con x + y = 2.
Para EMA, x = 0 y y = 2 y para carbomeros x = y = 1.
[0180] Estos polimeros son solubles en agua o solution salina fisiologica (20 g/l de NaCl) y el pH se puede ajustar de 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solucion adyuvante en la que se pueden incorporar el vector o vectores de expresion. La concentration de polimero en la composition inmunologica o de vacuna final puede oscilar entre aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,5% p/v, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1% p/v, y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4% p/v.
[0181] La citoquina o citoquinas (5) pueden estar en forma de proteina en la composicion inmunologica o de vacuna, o puede coexpresarse en el huesped con el inmunogeno o inmunogenos o epitopo epitopos de la misma. Se da preferencia a la coexpresion de la citoquina o citoquinas, ya sea por el mismo vector que expresa el inmunogeno o inmunogenos o el epitopo o epitopos de la misma, o por un vector separado de la misma.
[0182] La description comprende la preparation de dichas composiciones de combinacion; por ejemplo mezclando los componentes activos, de forma ventajosa entre si y con un adyuvante, portador, citoquinas, y/o diluyente.
[0183] Las citoquinas que se pueden utilizar en la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a, el factor estimulador de colonias granulociticas (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos/macrofagos (GM- CSF), interferon a (IFNa), interferon b (IFNb), interferon g, (IFNg), interleuquina-1a (IL-1a), interleuquina-1b (IL-1b),
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interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-9 (IL-9) , la interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL- 11), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de necrosis tumoral b (TNFb), y factor de crecimiento transformante b (TGFb). Se entiende que las citoquinas se pueden coadministrar y/o administrar secuencialmente con la composicion inmunologica o de vacuna de la presente descripcion. De este modo, por ejemplo, la vacuna de la presente descripcion puede contener tambien una molecula de acido nucleico exogena que expresa in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina adaptada a este huesped a ser vacunado o en la que una respuesta inmunologica debe provocarse (por ejemplo, una citoquina bovina para las preparaciones a administrar a bovinos).
[0184] Ventajosamente, la composicion y/o vacuna inmunologica de acuerdo con la invencion comprenden o consisten esencialmente en o consistir en una cantidad eficaz para provocar una respuesta terapeutica de uno o mas polipeptidos tal como se describe en el presente documento; y puede determinarse una cantidad eficaz a partir de esta descripcion, incluyendo los documentos incorporados en la presente memoria, y el conocimiento en la tecnica, sin experimentacion indebida.
[0185] En el caso de la composicion y/o vacuna inmunologica basadas en los polipeptidos expresados, una dosis puede incluir, aproximadamente de 1 mg a aproximadamente 2000 mg, ventajosamente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 1000 mg y mas ventajosamente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de antlgeno, epltopo o inmunogeno del BTV. Los volumenes de dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml, ventajosamente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 5 ml.
[0186] La presente invencion se describira a continuacion adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
[0187] La construccion de insertos de ADN, plasmidos y vectores virales o vegetales recombinantes se llevo a cabo utilizando las tecnicas estandar de biologla molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
Ejemplo 1 Construccion del plasmido de expresion de VP5 del BTV1 pCG102, plasmido de expresion de VP2 del BTV1 pCG100, y plasmido de expresion de VP2 del BTV1 + c-Myc pCG101
[0188] El objetivo de estos experimentos es producir constructos de plasmidos basados en pVR1012 que contienen el gen de VP2 o VP5 del BTV serotipo 1 y verificar la expresion en celulas CHO transfectadas. Los detalles de pVR1012 pueden encontrarse, por ejemplo, en VICAL Inc.; Lucas et al., 1997; Hartikka et al., 1996; patentes de Estados Unidos No. 5.846.946 y 6.451.769. Estos experimentos fueron disenados para producir controles apropiados para optimizar la deteccion/cuantificacion de los antlgenos del BTV expresados en lenteja de agua.
[0189] El ORF de VP2 del BTV1 optimizado para la expresion en mamlferos (SEQ ID NO: 2), el VP2 del BTV1 optimizado para la expresion en mamlferos que contiene la etiqueta c-myc (SEQ ID NO: 5), y el ORF de VP5 del BTV1 VP5 optimizado para la expresion en mamlferos (SEQ ID NO : 8) fueron clonados en el plasmido pVR1012 usando los sitios EcoRV y XbaI del vector e insertados para producir pCG100, pCG101, y pCG102, respectivamente. La expresion in vitro de la protelna VP2 del BTV1 (SeQ ID NO: 4) y la protelna VP5 del BTV1 (SEQ ID NO: 10) se midio despues de la transfeccion transitoria de celulas CHO-K1, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA). Se transfectaron las celulas CHO-K1 al 90% de confluencia en placas de 6 cm de diametro con 5 mg de plasmido y 10 ml de Lipofectamine cada uno, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la transfeccion, las celulas se cultivaron en medio MEM-glutamax (Invitrogen, Carlsbad CA) que contenla 1% de SVF durante 24 horas. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y se concentraron 50 veces por precipitation con TCA de las protelnas. Las celulas se lavaron con PBS, se recogieron por raspado, y se lisaron usando tampon de carga de Laemmli SDS-PAGE. La production de protelnas recombinantes y la secretion fueron analizados sometiendo los extractos de celulas enteras y sobrenadantes de cultivo concentrados (50x) a SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpo policlonal de conejo contra la protelna VP2 (GENOVAC, Freiburg, Alemania) o anticuerpo monoclonal contra la protelna VP5 (10AE12, Ingenasa, Espana).
[0190] El epltopo del anticuerpo monoclonal utilizado para el analisis de la expresion (anticuerpo AHSV10AE12 proporcionado por Ingenasa, Espana) se mapeo dentro de los aminoacidos 85 a 92 de la protelna VP5, una region altamente conservada entre los diferentes orbivirus, tal como el virus de la peste equina (VPE), virus de la lengua azul (BTV) y el virus de la enfermedad hemorragica epizootica (VEHE) (Martlnez-Torrecuadrada et al Virology, 257, 449-459; 1999). Estos resultados del mapeo de epltopos sugirieron que el anticuerpo monoclonal se puede utilizar como un reactivo especlfico de grupo, y nuestros resultados indicaron que esta observation era correcta. El anticuerpo secundario fue IRDye800 anti-raton a una dilution de 1/10000.
[0191] Tal como se muestra en la figura 5, VP5 del BTV1 se detecta especlficamente en la fraction de celulas CHO
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transfectadas con pCG102, pero no el sobrenadante, por el anticuerpo AHSV10AE12. Las figuras 7 y 8 muestran los resultados de transferencia Western para Pab L167 y Pab L168 en la VP2 de diferentes serotipos del BTV. La asignacion de carriles fueron: 1) marcador, 2) pVR1012, 3) pCG100 (VP2 del BTV1), 4) pIV001 (VP2 del BTV2), 5) pIV002 (VP2 del BTV4), 6) pKMR003 (VP2 del BTV8), 7) pCG030 (VP2 del BTV9) y 8) pIV003 (VP2 del BTV16).
Ejemplo 2 Construccion de vectores de expresion de la lenteja de agua para BTV y transformacion de las plantas
[0192] Se expresaron genes de VP2 de BTV (SEQ ID NO: 3) y VP5 de BTV (SEQ ID NO: 9) optimizado de lenteja de agua de un aislado de BTV1 patogeno utilizando el sistema LEX de Biolex™, un sistema de protelnas privado de Lemna minor. Tal como se muestra en las figuras 10, 11, 12, 13 y 14, se produjeron varias variantes, incluyendo los vectores que expresan tanto VP2 como VP5 (MerD01 y MerD02) y vectores que expresan solamente VP2 (MerD03 y MerD04).
[0193] Se generaron llneas transgenicas para el cribado (Tabla 2). Despues de generar las llneas transgenicas, se cribaron para la expresion de BTV en el medio y el tejido. En resumen, las plantas se hicieron crecer durante dos semanas en pequenos recipientes de investigacion y se recogieron los medios y tejido resultantes para el analisis. Para el analisis de los tejidos, se homogeneizo tejido congelado, se centrifugo y se extrajo el sobrenadante para el ensayo.
[0194] Se preparo la extraccion de tejido en bruto de una llnea que contenla antlgenos de BTV. Todas las etapas tuvieron lugar a 4°C. Se mezclaron cien gramos de biomasa congelada (material vegetal recogida del medio) con 200 ml de tampon de extraccion (NaPO4 50 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, pH 7,4) y despues se homogeneizaron en un mezclador Waring con una secuencia de 20 segundos 4 veces y 10-20 segundos de enfriamiento entre las mismas. El homogeneizado se centrifugo a 10.000 xg durante 30 minutos a 4°C, se clarifico por filtracion a traves de un filtro de acetato de celulosa (0,22 pm). El homogeneizado resultante se almaceno a 4°C o en hielo para la prueba inmediata. El homogeneizado restante se congelo en allcuotas a -80°C para su posterior analisis. La protelna total soluble (TSP) se determino usando el ensayo de Bradford con albumina de suero bovino como patron.
[0195] Se seleccionaron cuatro llneas de expresion de BTV1 en lenteja de agua para el escalado despues de la etapa de cribado inicial. Se seleccionaron llneas que expresaban niveles mas altos de VP2, ya que la protelna/antlgeno VP2 se considera que contribuye significativamente al efecto inmuno protector de composiciones de vacuna que contienen dicha protelna/antlgeno. Las llneas que expresan VP2 de forma mas elevada optimizadas en lenteja de agua segun lo determinado por transferencia Western para BTV se cultivaron en vasos a escala para obtener biomasa para su uso en estudios de caracterizacion y animales.
Tabla 2. Generacion y cribado de la llnea celular de lenteja de agua que expresa BTV
Constructo
Descripcion # de llneas generadas # de llneas cribadas
MerD01
VP2 + VP5 188 114
MerD02
VP2 (5'UTR optimizado) + VP5 159 54
MerD03
VP2 299 184
MerD04
VP2 (5'UTR optimizado) 134 56
[0196] Se utilizo transferencia Western para determinar el peso molecular (PM) de los antlgenos de BTV expresados en lenteja de agua. Vease tambien la publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos US2004/261148 para una descripcion detallada de la preparacion de polipeptidos/antlgenos expresados de forma recombinante a partir de lenteja de agua. Brevemente, se homogeneizaron 100 mg de tejido de planta congelado en 1 ml de tampon de extraccion (relacion 1:10, p/v), se centrifugaron y el sobrenadante se extrajo para el ensayo. El tampon de extraccion era NaPO4 50 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, pH 7,4. Se obtuvieron los tampones TWEEN 80 al 1,0%, glicerol al 10% y TWEEN 80 al 1,0%/glicerol al 10% mediante la adicion de las cantidades apropiadas de TWEEN 80 y/o glicerol al tampon de extraccion estandar. La muestra extralda se mezclo en tampon SdS inmediatamente despues de la extraccion y a continuacion seguido por 2 horas de incubacion en hielo, seguido de tampon de SDS, incubacion de 4 horas en hielo, seguido de tampon de SDS, 1x, 2x, y 3x de congelacion-descongelacion, seguido de tampon SDS. Las muestras se separaron a continuacion en geles de Tris-glicina al 4-20% bajo condiciones de reduccion.
[0197] Se determino que el glicerol al 10% debe anadirse al tampon de extraccion cuando se analiza la protelna VP5. Segun los datos, la agregacion de la protelna VP5 era probable y la cuantificacion mediante transferencia Western subestimo probablemente la cantidad de protelna VP5 presente en la muestra (es decir, dado que la protelna no esta bien separada en el gel, los agregados residuales no son detectados). Se utilizo el clon#10AE12 de anticuerpo monoclonal de VP5 en la transferencia Western para la detection de la expresion de VP5. Los resultados Western se muestran en la figura 18.
[0198] El antlgeno VP2 se cuantifico utilizando tanto la desitometrla SDS/PAGE con Coomassie (Tabla 3) como los
procedimientos con Agilent 2100 Bioanalyzer (Tabla 4). Para la densitometrla de Coomassie, la densidad de bandas de antlgeno VP2 en un gel de SDS/PAGE tenido con Coomassie estandar se compare con un patron de albumina de suero bovino (BSA). La densitometrla comparativa da lugar a continuacion a la concentracion de protelna VP2. Los resultados cuantificados de densitometrla SDS/Coomassie se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Constructo
SV Descripcion Concentracion de antlgeno (mg/ml) %TSP
MerD01
53A VP2 + VP5 78,2 3,36
MerD02
3K VP2 (5'UTR optimizado) + VP5 48,1 2,72
MerD03
80A VP2 52,7 2,82
MerD04
11D VP2 (5'UTR optimizado) 65,8 2,82
[0199] Ademas de la densitometrla SDS-PAGE Coomassie, el VP2 del BTV se cuantifico utilizando Agilent 2100 10 Bioanalyzer. Este instrumento es un sistema basado en chips disenado para medir el tamano y cuantificar protelnas. La medicion se llevo a cabo mediante la comparacion del Pm y la intensidad de banda con una escala de protelnas patron suministrada por el fabricante. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Nivel de expresion de llneas de VP2 de BTV1 de lenteja de agua 15
Llnea de lenteja de agua
Concentracion de antlgeno VP2 promedio (mg/ml) Promedio % TSP12
MerD01
69,4 1,78
MerD02
59,0 3,16
MerD03
56,3 3,49
MerD04
60,2 2,67
1La documentacion de Agilent Bioanalyzer 2100 indica +/- 10% de error. 2 Protelna solule total promedio estaba entre 1,8 y 2,1 mg/ml.
[0200] Basandose en estos resultados, las cuatro llneas de BTV-1 de lenteja de agua expresan el antlgeno VP2 en 20 un nivel proximo o por encima de 50 mg/ml diana.
Ejemplo 3 Vacunacion de ovejas
[0201] Las formulaciones/vacunas /a ensayar se muestran en la Tabla 5 a continuacion.
25
Tabla 5
Nombre
Dosis de la vacuna Antlgeno Adyuvante
BTVPUR AlSap1*
1 ml Antlgeno de BTV1 comercial hidroxido de aluminio/saponina1
BTV de lenteja de agua 1
1,2 ml VP2/VP5 de BTV1 en bruto (» 50 mg) hidroxido de aluminio/saponina
BTV de lenteja de agua 2
1,2 ml VP2/VP5 de BTV1 concentrado (» 200 mg) hidroxido de aluminio/saponina
BTV de lenteja de agua 3
1,2 ml VP2/VP5 de BTV1 en bruto (» 50 mg) Emulsigen/CpG2
BTV de lenteja de agua 4
1,2 ml VP2/VP5 de BTV1 concentrado (» 200 mg) Emulsigen/CpG
BTVPUR AlSap1*: vacuna contra BTV comercial que contiene el virus BTV1 inactivado. Hidroxido de aluminio/saponina1: un tipo de adyuvante de sal cristalina. Emulsigen/CpG2: EMULSlGEN® es un adyuvante de aceite en agua comercial
[0202] Se utilizaron treinta y una ovejas hembra y macho entre los 4 y 6 meses de edad en D0 en el experimento de 30 vacunacion. En D2, las 31 ovejas se pesaron individualmente y a continuacion se asignaron aleatoriamente a 5 grupos de 5 ovejas (G1 a G5) y 1 grupo de 6 ovejas (G6). En D0 y D21, los animales del grupo G1 recibieron una dosis de 1 ml de la vacuna comercial BTVPUR AlSap1 y sirvieron como animales de control positivos. Cada animal de los grupos G2, G3, G4 y G5 recibio una dosis de 1,2 ml de la composicion de BTV de lenteja de agua como se describe en la Tabla 6. Los animales del grupo G6 permanecieron sin tratar y sirvieron como animales de control 35 negativos. Las inyecciones de la vacuna se realizaron por via subcutanea en la cara lateral derecha del torax junto al codo en D0, y en la cara lateral izquierda del torax en D21.
5
10
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Tabla 6
Grupo
Numero de ovejas Tratamiento recibido D0 D21 Estimulacion de BTV1* en D42
G1
5 BTVPUR AlSap1 BTVPUR AlSap1 Si
G2
5 BTV de lenteja de agua 1 BTV de lenteja de agua 1 Si
G3
5 BTV de lenteja de agua 2 BTV de lenteja de agua 2 Si
G4
5 BTV de lenteja de agua 3 BTV de lenteja de agua 3 Si
G5
5 BTV de lenteja de agua 4 BTV de lenteja de agua 4 SI
G6
6 Ninguno Ninguno SI
BTV1* material de estimulacion que consiste en globulos rojos (RBC) recogidos en ovejas infectadas y almacenados a -70°C
Ejemplo 4 Titulacion de anticuerpos por neutralizacion de suero
[0203] En el D-29, antes del comienzo del estudio, todas las ovejas eran negativas contra BTV basandose en titulacion por ELISA y por lo tanto se incluyeron. Su estado serologico negativo fue confirmadp el D0 antes de la vacunacion mediante la prueba de SN (seroneutralizacion). Los tltulos de anticuerpo promedio (prueba de SN) para cada grupo de tratamiento durante todo el estudio se muestran en la figura 25.
[0204] Se realizaron analisis de sangre despues de tomar cada temperatura rectal. En el dla 0 (antes de la primera inmunizacion), D21 (antes de la segunda vacunacion), D35, D42 (antes de la estimulacion) y D56, se tomo una muestra de sangre en un tubo seco de todos los animales en la vena yugular. Las muestras de sangre fueron centrifugadas para recoger el suero. Los sueros se dividieron en dos muestras allcuotas y despues inactivaron por calor (30 minutos a 56°C), y se probaron en tres diluciones a partir de 1/3 en placas de microtitulacion. Se incubaron cien microlitros de suero diluido 1 hora a 37°C con 50 microtltulos de una suspension viral de un serotipo de BTV determinado (BTV1) que contiene aproximadamente un 25 TCID50 de virus por pocillo. Se anadiron a continuation cincuenta microlitros de una suspension de celulas VERO que contenlan 500.000 celulas por ml a la mezcla y las placas se incubaron a 37°C durante 7 dlas. La lectura de las placas se baso en el efecto citopatico. Los tltulos sericos, expresados en log10 (PD50%) se calcularon mediante regresion despues transformation angular. Un tltulo de mas de 0,48 se considero positivo.
[0205] Tal como se indica en la figura 25, los tltulos de anticuerpos fueron significativamente mas altos que el control antes y despues de la estimulacion.
Ejemplo 5 Eficacia de las vacunas del BTV producidas por lenteja de agua - Las pruebas cuantitativas de RT-PCR
[0206] En el D42 (antes de la estimulacion), D47, D49, D51, D54, y D56, se tomaron muestras de sangre de todas las ovejas por puncion yugular con el tubo. Con el fin de detectar y cuantificar ARN del virus de la lengua azul en la sangre, se realizo un analisis mediante la prueba de qRT-PCR en estas muestras. Despues de la extraction del ARN utilizando un kit comercial, el ARN se desnaturalizo primero por tratamiento termico. A continuacion, se incubo una allcuota (por duplicado) con la sonda TaqMan MGB, cebadores especlficos del BTV y un reactivo de acuerdo con las instrucciones para la amplification (kit Invitroge Super Script III Platinum One Step). Los cebadores especlficos del BTV fueron disenados para hibridar con la secuencia de acido nucleico dentro de las regiones conservadas del BTV, conservadas en todos los serotipos del BTV conocidos. La senal fluorescente es proporcional a la cantidad de ADN sintetizado. La cuantificacion de acidos nucleido del BTV en las muestras se hizo por comparacion con muestras de ARN estandarizadas. La cantidad de ARN se expreso en Log10 del numero de copias de ARN por ml de sangre.
[0207] Los resultados de qRT-PCR se muestran en la figura 26 y la Tabla 7 a continuacion. Todas las ovejas fueron confirmadas como negativas para ARN viral del BTV antes de la estimulacion (D42). En G6 (grupo de control), todas las ovejas fueron positivas para todos los datos de analisis despues de la estimulacion. Los tltulos individuales de viremia fueron elevados durante todo el periodo despues de la estimulacion, que iban desde 6,60 a 8,59 log10 copias de ARN/ml. Por el contrario, todos los animales vacunados permanecieron negativos para la viremia a lo largo del periodo despues de la estimulacion. La prevention de la viremia se demostro por lo tanto para el 100% de los animales en cada grupo vacunado. La cinetica general de la viremia se redujo significativamente en cada grupo vacunado en comparacion con el grupo control (p = 0,003).
Tabla 7. Viremia despues de la estimulacion con BTV1
Tltulo promedio de viremia
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D42 D49 D51
G1 (BTVPUR AlSap1)
< 3,68 < 3,68 < 3,68
G2 (en bruto, Al/Sap)
< 3,68 < 3,68 < 3,68
G3 (conc., Al/Sap)
< 3,68 < 3,68 < 3,68
G4 (en bruto, oleoso)
< 3,68 < 3,68 < 3,68
G5 (conc., oleoso)
< 3,68 < 3,68 < 3,68
G6 (controles)
< 3,68 7,93 (± 0,3) 8,11 (± 0,3)
Ejemplo 6 Signos clinicos de vacunas de BTV producidas por lenteja de agua
[0208] Se tomb la temperatura rectal de todos los animales en D-2 y D-1 para acostumbrar a los animales a la manipulacibn, pero no fue analizada. La anchura de la inyecci6n (en cm), el numero de sitios y reacciones locales se midieron usando un calibrador. Los signos clinicos se registraron en: D0 (antes de la primera inmunizacibn), D0 (16:00), D1, D2, D7, D14, D21 (antes de la segunda vacunacibn), y D21 (16:00), D22, D23, D28, D35.
[0209] En el dla 42, la cepa de estimulacibn congelada (BTV1) se descongelb por inmersibn parcial en agua tibia y a continuacibn se mantuvo en hielo picado. Todas las ovejas se analizaron con 3 ml de cepa de estimulacibn, se inyectaron por via intradermica en multiples puntos de inyeccibn en la regibn inguinal. Se llevaron a cabo mediciones de la temperatura rectal antes de cualquier otra manipulacibn. Las temperaturas rectales de todos los animales se midieron en el dla 42 antes de la prueba, a continuacibn, todos los dlas de D47 a D56. Los resultados se representan en las figuras 21, 22 y 23. Como se muestra en la figura 23, a partir del D47 en adelante, la termperature rectal promedio en el grupo de control (G6) aumentb significativamente, +0,9°C en promedio entre el D42 (estimulacibn) y D48. Por el contrario, la termperature rectal promedio en todos los grupos vacunados no aumentb y se mantuvo mas o menos estable durante todo el perlodo de seguimiento. La comparacibn estadlstica demostrb que cada grupo vacunado presentb significativamente una hipertermia maxima menor que el grupo de control G6 (p <0,001).
[0210] Del D47 al D56, se llevb a cabo un examen cllnico todos los dlas en todos los animales. Los signos clinicos incluyen: congestibnen oido, ojos, nariz, labios, inflamacibn de los oidos, ojos, boca, nariz, labios y la depresibn, salivacibn, balado, cojera, tos/disnea, diarrea, secrecibn/formacibn de costras nasales, petequias, eritema y peso. El estado general y el comportamiento de los animales fueron evaluados especificamente en una escala cualitativa: una puntuacibn de 0 se asigna al "buen estado", que significa que el animal esta perfectamente sano, mbvil y atento. Una puntuacibn de 1 se asigna a la "apatia", que significa que el animal permanece distante de los demas y se mueve lentamente. Una puntuacibn de 2 se asigna a la "depresibn", que significa que el animal se ha quedado lejos con los signos de atencibn. Una puntuacibn de 3 se asigna a "postracibn", que significa que el animal esta tumbado en decubito lateral y con congelacibn. El peso se indicb como 0 siendo normal, 1 siendo delgada, y 2 siendo debilitante. Se calculb una puntuacibn de hipertermia para cada animal en cada dia de despues de la estimulacibn. La puntuacibn de hipertermia se calculb de la siguiente manera: Temperatura rectal < 40,0°C = puntuacibn de 0; 40,0°C < Temperatura rectal < 41,0°C = puntuacibn de 1; 41,0°C < Temperatura rectal < 42.0°C = puntuacibn de 2; Temperatura rectal > 42,0°C = puntuacibn de 4. Se calculb una puntuacibn clinica diaria mediante la suma de puntuacibn de la hipertermia, la puntuacibn del estado general, la puntuacibn del estado corporal, numero de signos clinicos especificos observados (+1 punto por cada senal observada), y el numero de signos inesperados considerados como relacionados con la estimulacibn (+1 punto por cada senal registrada). Para cada animal, se calculb una Puntuacibn Clinica Global (GCS) sumando las puntuaciones clinicas diarias individuales durante el perlodo despues de la estimulacibn (D47-D56). La puntuacibn clinica diaria promedio se representa en la Figura 24. El resultado mostrb que en el D48, la puntuacibn clinica diaria promedio en G6 (grupo de control) alcanzb su punto maximo y se mantuvo alta (entre 5,8 y 6,5 puntos) hasta D51. La GCS en este grupo oscilb entre 20 y 53 puntos. Sin embargo, en los grupos vacunados, las puntuaciones clinicas diarias promedio quedaron muy baja (<1 punto) a lo largo del estudio, y la GCS individual fue igual a 0 para la mitad de los animales o nunca superaron 5. La comparacibn estadlstica de GCS demostrb una diferencia significativa entre cada grupo vacunado y el grupo control (p <0,01).
[0211] La evaluacibn de la eficacia de las composiciones/vacunas de BTV de lenteja de agua indicb una fuerte proteccibn contra la estimulacibn del BTV para el 100% de los animales vacunados y una prevencibn completa de la viremia despues de la estimulacibn en todos los animales vacunados. La evaluacibn de los signos clinicos mostrb una ausencia de reacciones generales relacionadas con el tratamiento despues de la vacunacibn, una seguridad local satisfactoria despues de la primera y segunda inyecciones, y una respuesta inmune satisfactoria.
Ejemplo 7 Expresion de antigenos de BTV en Schizochytrium
[0212] Los genes de VP2 y VP5 del BTV con codones optimizados se clonan en el vector de expresibn pAB0018 (numero de depbsito ATCC PTA9616). La secuencia de acido nucleico especifica del gen del BTV se optimiza para la expresibn en Schizochytrium sp. Ademas, el vector de expresibn contiene un casete de marcador de seleccibn que confiere resistencia a los transformantes de Schizochytrium, un promotor del gen nativo de Schizochytrium para
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conducir la expresion del transgen, y un terminador.
[0213] Schizochytrium sp. (ATCC 20888) se usa como huesped para la transformacion con el vector de expresion que contiene el gen del BTV utilizando el procedimiento de electroporacion. Se cultivan cryostocks de cepas transgenicas de Schizochytrium en M50-20 (descrito en US 2008/0022422) hasta la confluencia. Los cultivos de Schizochytrium propagados se transfieren a tubos conicos de 50 ml y se centrifugan a 3000 g durante 15 min o 100.000 g durante 1 hora. El sedimento resultante y la fraccion soluble se utilizan para el analisis de expresion y en el estudio de la estimulacion del animal.
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[0215] La presente invencion se describira a continuation mediante parrafos numerados.
1. Una composition que comprede un antlgeno del BTV (virus de la lengua azul) y un portador, excipiente, adyuvante, o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable.
2. La composicion del parrafo 1, en la que el antlgeno del BTV se selecciona del grupo que consiste en VP2 del BTV, VP5 del BTV, o una combinacion de los mismos.
3. La composicion del parrafo 1 o 2, en la que el antlgeno del BTV se expresa en una planta o microalga.
4. La composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-3, en la que el antlgeno del BTV esta parcialmente purificado.
5. La composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-3, en la que el antlgeno del BTV esta purificado sustancialmente.
6. La composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-5, en la que el antlgeno del BTV tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipeptido que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4, 6, o 10.
7. La composicion del parrafo 6, en la que el antlgeno del BTV es VP2 del BTV que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 o 6.
8. La composicion del parrafo 6, en la que el antlgeno del BTV es VP5 del BTV que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.
9. La composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-6, en la que el antlgeno del BTV esta codificado por un polinucleotido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEQ ID NO:
1, 2, 3, 5, 7, 8, o 9.
10. La composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-5, en la que el antlgeno o antlgenos del BTV comprende VP2 del BTV y VP5 del BTV.
11. La composicion del parrafo 10, en la que el VP2 del BTV tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipeptido que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4 o 6 y VP5 del BTV tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipeptido que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 10.
12. La composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-11, en la que el portador, adyuvante, excipiente o vehlculo farmaceutica o veterinariamente aceptable es una sal cristalina o una emulsion de aceite en agua.
13. Un procedimiento de vacunacion de un huesped susceptible para el BTV que comprende al menos una administration de la composicion de acuerdo con uno cualquiera de los parrafos 1 a 12.
14. El procedimiento del parrafo 13, que comprende un protocolo de administracion de sensibilizacion-refuerzo (“prime-boost”).
15. El procedimiento del parrafo 14, en el que dicha administracion de sensibilizacion-refuerzo comprende una administracion de sensibilization de la composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-12, y una administracion de refuerzo de una vacuna o una composicion que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa el antlgeno del BTV in vivo, o una vacuna viral inactivada que comprende el antlgeno del BTV, o una vacuna o composicion de plasmido de ADN que contiene o expresa el antlgeno del BTV.
16. El procedimiento del parrafo 14, en el que la administracion de sensibilizacion-refuerzo comprende una administracion de sensibilizacion de una vacuna o una composicion que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa el antlgeno del BTV in vivo, o una vacuna viral inactivada que comprende el BTV, o una vacuna o composicion de plasmido de ADN que contiene o expresa el antlgeno del BTV, y una administracion de refuerzo de la composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-12.
17. El procedimiento del parrafo 14, en el que la administracion de sensibilizacion-refuerzo comprende una administracion de sensibilizacion de la composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-12, y una administracion de refuerzo de la composicion de uno cualquiera de los parrafos 1-12.
18. El procedimiento de uno cualquiera de los parrafos 13-17, en el que el huesped es ovino, bovino, o caprino.
19. Un polipeptido del BTV sustancialmente purificado expresado en una planta o microalga, en el que el polipeptido comprende:
a) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipeptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4, 6, o 10;
b) una variante conservadora de la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO: 4, 6, o 10;
c) un fragmento inmunogenico que comprende al menos ocho aminoacidos consecutivos de la secuencia de aminoacidos establecida en la sEq ID NO: 4, 6, o 10, que se une especlficamente a un anticuerpo que se une especlficamente a la secuencia de aminoacidos establecida en el SEQ ID NO: 4, 6, o 10.
20. Un plasmido que comprende un fragmento de ADN que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 7, 8, o 9.
21. El plasmido del parrafo 20, en el que el plasmido es para la transformation en plantas.
22. Una planta de lenteja de agua transformada de manera estable o un cultivo transformado con un gen que expresa un antlgeno del BTV o fragmento o variante del mismo.
23. La planta de lenteja de agua o cultivo del parrafo 22, en los que el antlgeno o un fragmento o variante del mismo tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4, 6, o 10.
24. La planta de lenteja de agua o cultivo del parrafo 22, que comprende el plasmido del parrafo 21.
25. Un procedimiento para producir un antlgeno del BTV que comprende: (a) cultivar dentro de un medio de cultivo de lenteja de agua una planta de lenteja de agua o nodulo de lenteja de agua, en el que la planta de lenteja de agua
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o el nodulo de lenteja de agua esta transformado de manera estable para expresar el antlgeno, y en el que el antlgeno se expresa a partir de una secuencia de nucleotidos que comprende una secuencia codificante para el antlgeno; y (b) recoger el antlgeno de la planta de lenteja de agua o nodulo de lenteja de agua.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0216]
<110> Merial Limited Biolex Therapeutics
<120> VACUNA RECOMBINANTE DEL VIRUS DE LA LENGUA AZUL Y SUS UTILIZACIONES
<130> P101195EP
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<160> 32
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<210> 1 <211> 2886 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>

<22 3> ADN de tipo natural de VP2 del BTV <400> 1

atggatgagc taggcatccc agtttataag agaggatttc ccgaacatct gcttcgtggt 60

tatgagttta taatagatgt tggaactaag atagaaagtg ttggtggacg tcatgatgta 120

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<212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> VP2
del BTV con codones optimizados para la expresion en mamiferos
<400> 2 atggacgagc
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tcgtgcactg ggagtacaga ctgaaccaca gcaccagaga gatcacctac 1320
gcccagggca
acccctgcga cctgtacccc gaggatgacg acgtgatcgt gaccaagttc 1380
gacgacgtgg
cctacggcca gatgatcaac gagatgatca atggcggctg gaaccaggaa 1440
cagttcaaga
tgcacaagat tctgaagagc gagggcaacg tgctgaccat cgacttcgag 1500
aaggacgcca
agctgaccac caacgagggc gtgaccatgc ccgagtactt caacaagtgg 1560
atcattgccc
ccatgttcaa tgccaagctg cggatcaagc acgaggaaat cgcccagaga 1620
cagagcgacg
accccatggt gaagagaacc ctgagcccca tcaccgccga ccccatcgag 1680
ctgcagagac
tgaccctggc cagattctac gacatcagac cagctctgcg cgggcaggct 1740
ctgagcagac
agcaggccca gagcacctac gacgaagaga tcagcaagag acaggactac 1800
gccgagatcc
tgaagagaag aggcatcgtg cagatcccca agaagccctg ccccaccgtc 1860
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
accgcccagt
acaccctgga aagatacgcc ctgttcatca tcagcatcct gcagcagcac
gtggtgcggg
actgcgacga ggaagccgtg tacgagcacc ccaaggccga ccacgagctg
gaaatcttcg
gcgagagcat cgtggacatc tctcaggtga tcatcctggc cttcgacctg
atcttcgaga
gaaggcggag agtgcgggac gtgtacgaga gcagacacat cattgccaga
atcagaagaa
tgcggggcaa agaacggctg aacgtgatcg ccgagttctt ccccacctac
ggcggcctgc
tgaacggcct gaacagcgcc accgtggtgc agaacatcat gtacctgaac
tttctgcccc
tgtacttcct ggtgggcgac aacatgatct acagccacag acagtggagc
atccccctgc
tgctgtacac ccacgaagtg atggtggtgc ctctggaagt gggaagctac
aacgacagat
gcggcctgat cgcctacctg gaatacatgg tgttcttccc tagcaaggcc
atcagattca
gcaagctgaa cgaggcccag cccaagatcg ccagagagat gctgaagtac
tacgccaaca
ccaccgtgta cgacggcggc gtgaactaca acgtggtgac caccaagcag
ctgctgtacg
agacatacct ggccagcctg tgcggcggca tcagcgacgg catcgtgtgg
tatctgccca
tcacccaccc caacaagtgc atcgtggcca tcgaggtgtc cgacgagaga
gtgcccgcca
gcatcagggc cggcagaatc agactgagat tccccctgag cgccagacac
ctgaagggcg
tggtgatcat tcagatcgac gaagagggcg agttcaccgt gtactccgag
ggcatcgtgt
cccacagagt gtgcaagaag aacctgctga agtatatgtg cgacatcatt
ctgctgaagt
tcagcggcca cgtgttcggc aacgacgaga tgctgaccaa gctgctgaac
gtgtga
<210> 3 <211> 2886 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> VP2 agua
del BTV con codones optimizados para la expresion e
<400> 3 atggacgagc
tggggatccc cgtgtacaag cgcgggttcc ccgagcacct gctccgcggc
tacgagttca
tcatcgacgt gggcaccaag atcgagtccg tgggcgggag gcacgacgtg
accaagatcc
cggagatgaa cgcctacgac atcaagcagg agtccatccg gacggccctc
tggtacaacc
ccatccggaa cgacggcttc gtgctcccgc gggtcctgga catcaccctc
cgggggtacg
acgagcgccg ggccgtggtc gagtccaccc gccacaagag cttccacacg
aacgaccaat
gggtgcagtg gatgatgaag gactcgatgg atgcgcagcc cctgaaggtc
gggctggacg
atcaatcccg caacgtggcc cacagcctcc acaactgcgt cgtgaagatc
gacagcaaga
aagcggacac gatgtcgtac cacgtcgagc cgatcgagga cgcctccaag
gggtgcctcc
acacccgcac gatgatgtgg aaccacctgg tccgcatcga gaccttccac
gcggcccagg
aggtcgcgta caccctcaag ccgacctacg acatcgtggt ccacgcggag
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
E11
27-0
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
cgcagagacc
gggcagaagg
ctcgtgatcc
atctgcaaca
tgcaagatcc
gaggcctccc
ccggagaggc
atcctcctga
tacccgtgtc
atgatgcgca
cgcgagcagg
ggcatcaaga
gcgcagggta
gacgacgtcg
cagttcaaga
aaggacgcca
atcatcgccc
cagtcggacg
ctgcagcggc
ctgagccgcc
gccgagatcc
accgcccagt
gtcgtccgcg
gagatcttcg
atcttcgagc
atccgccgga
ggcgggctgc
ttcctgccgc
atcccgctgc
aacgaccgct
atcagattct
tacgcgaaca
ctcctgtacg
tatctgccga
gctcccagcc
tgaccatgaa
gcgggaagat
ggtggatcca
tcagcaccat
tctccatccg
tgaagatctt
tgatcgccgc
tcaggggtac
gctggtacga
aaaagtacat
tcgtccactg
acccctgcga
cctacggcca
tgcacaaaat
agctgaccac
ccatgttcaa
accccatggt
tcaccctggc
agcaggccca
tcaagcggag
acaccctcga
actgcgacga
gggagtccat
ggcgcagacg
tgcggggcaa
tcaatggcct
tctacttcct
tcctgtacac
gcggcctcat
ccaagctcaa
cgaccgtgta
agacgtacct
tcacccaccc
gttcagaccc
tcacaacagc
ccccgaggtc
gagccgccac
cggccgcaag
cttccaggag
cgaacaccgg
gtccgacacg
gctcatcgcc
ctggtccgtc
ctacggccgc
ggaataccgg
cctctatccg
gatgatcaac
cctgaagagc
gaacgagggg
cgccaagctc
taagaggacc
ccgcttctac
gagcacctac
ggggatcgtg
gcgctacgcg
ggaggccgtt
cgtggacatc
cgtgcgcgac
ggagagactc
gaactccgct
ggtcggcgac
ccacgaggtg
cgcctacctc
cgaggcccag
cgacggcggg
cgccagcctc
caacaagtgc
ggcgaccaga
tacgacaaga
atccgcgacg
gaccccggcg
gtcctggaca
gcgatcgaca
aaccagcggc
ttcaacacga
agcgagacca
cgcccgacct
gtcaacctgt
ctgaaccact
gaggacgacg
gagatgatca
gaggggaacg
gtgaccatgc
cgcatcaagc
ctctcgccca
gacatccgcc
gacgaggaga
cagatcccca
ctcttcatca
tacgagcacc
tcccaggtca
gtctacgaga
aacgtgatcg
accgtcgtgc
aacatgatct
atggtcgtgc
gagtacatgg
ccgaagatcg
gtgaactaca
tgcggcggga
atcgtcgcca
cgctgatcaa
tggtcgaggg
atatcgcctc
agatcaaggc
gggagaaaga
acaagttccg
gcgacgagga
gagtgtggtg
agctcgggga
acacgcccta
tcgacttcgt
ccacccgcga
acgtcatcgt
acggcgggtg
ttctcaccat
ccgagtactt
acgaggaaat
tcaccgccga
ctgctctccg
tctccaagcg
agaagccctg
tcagcatcct
cgaaggcgga
tcatcctcgc
gccggcacat
ccgagttctt
agaacatcat
actcccaccg
cgctcgaggt
tcttcttccc
ctcgggagat
acgtcgtgac
tctcggacgg
tcgaggtgtc
cttcggcagg
gctcgcgcac
cctggacgag
ctacgagctg
gcccgaggac
ccagcacgac
cagattctac
gtccaacccc
cgtttactcg
cgagaagacc
cgcggagccc
gatcacctac
gaccaagttc
gaaccaggag
cgacttcgag
caacaagtgg
cgcccagcgc
ccccatcgag
cggccaggcc
ccaggactac
cccgacggtg
gcagcagcac
ccacgagctg
gttcgacctg
catcgcccgc
cccgacttac
gtacctcaac
ccagtggtcc
gggctcctat
ttccaaggcc
gctcaagtac
cacgaagcag
tatcgtgtgg
cgacgagcgg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
gtgcccgcct cgatcagagc cggccgcatc cgcctccgct tccccctgag cgcccgccac ctcaagggcg tcgtgatcat ccagatcgac gaggaggggg agttcacggt gtactcggag ggcatcgtgt cccaccgggt gtgcaagaag aacctgctca agtacatgtg cgacatcatc ctgctcaagt tctcgggcca cgtcttcggc aacgacgaga tgctgaccaa gctcctgaac gtgtaa
<210> 4
<211> 961
<212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<223>
Protei na VP2 del BTV
<400>
4
Met
Asp Glu Leu Gly Ile Pro Val Tyr Lys Arg Gly Phe Pro Glu His
1
5 10 15
Leu
Leu
Arg Gly Tyr Glu Phe Ile Ile Asp Val Gly Thr Lys Ile Glu
20 25 30
Ser
Val Gly Gly Arg His Asp Val Thr Lys Ile Pro Glu Met Asn Ala
35 40 45
Tyr
Asp Ile Lys Gln Glu Ser Ile Arg Thr Ala Leu Trp Tyr Asn Pro
50 55 60
Ile
Arg Asn Asp Gly Phe Val Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Thr Leu
65
70 75 80
Arg
Gly Tyr Asp Glu Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Thr Arg His Lys
85 90 95
Ser
Phe Hi s Thr Asn Asp Gln Trp Val Gln Trp Met Met Lys Asp
Ser
100 105 110
Met
Asp Ala Gln Pro Leu Lys Val Gly Leu Asp Asp Gln Ser Arg Asn
115 120 125
Val
Ala His Ser Leu His Asn Cys Val Val Lys Ile Asp Ser Lys Lys
130 135 140
Ala
Asp Thr Met Ser Tyr His Val Glu Pro Ile Glu Asp Ala Ser Lys
145
150 155 160
Gly
Cys Leu His Thr Arg Thr Met Met Trp Asn His Leu Val Arg Ile
165 170 175
Glu
Thr Phe His Ala Ala Gln Glu Val Ala Tyr Thr Leu Lys Pro Thr
180 185 190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tyr
Asp Ile Val Val His Ala Glu Arg Arg Asp Arg Ser Gln Pro Phe
195 200 205
Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
210
215 220
Thr
Met Asn His Asn Ser Tyr Asp Lys Met Val Glu Gly Leu Ala His
225
230 235 240
Leu
Val Ile Arg Gly Lys Ile Pro Glu Val Ile Arg Asp Asp Ile Ala
245 250 255
Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
260 265 270
Gly
Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Ser Thr Ile
Gly
275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Ser Leu
290 295 300
Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
305
310 315 320
Pro
Glu Arg Leu Lys Ile Phe Glu His Arg Asn Gln Arg Arg Asp Glu
325 330 335
Asp
Arg Phe Tyr Ile Leu Leu Met Ile Ala Ala Ser Asp Thr Phe Asn
340 345 350
Thr
Arg Val Trp Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Cys Leu Arg Gly Thr Leu
355 360 365
Ile
Ala Ser Glu Thr Lys Leu Gly Asp Val Tyr Ser Met Met Arg Ser
370 375 380
T rp
Tyr Asp Trp Ser Val Arg Pro Thr Tyr Thr Pro Tyr Glu Lys Thr
385
390 395 400
Arg
Glu Gln Glu Lys Tyr Ile Tyr Gly Arg Val Asn Leu Phe Asp Phe
405 410 415
Val
Ala Glu Pro Gly Ile Lys Ile Val His Trp Glu Tyr Arg Leu Asn
420 425 430
Hi s
Ser Thr Arg Glu Ile Thr Tyr Ala Gln Gly Asn Pro Cys Asp Leu
435 440 445
Tyr
Pro Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Thr Lys Phe Asp Asp Val Ala
450 455 460
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tyr
Gly Gln Met Ile Asn Glu Met Ile Asn Gly Gly Q_ L. 1- Asn Gln Glu
465
470 475 480
Gln
Phe Lys Met His Lys Ile Leu Lys Ser Glu Gly Asn Val Leu Thr
485 490 495
Ile
Asp Phe Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Thr Asn Glu Gly Val Thr
500 505 510
Met
Pro Glu Tyr Phe Asn Lys Trp Ile Ile Ala Pro Met Phe Asn Ala
515 520 525
Lys
Leu Arg Ile Lys His Glu Glu Ile Ala Gln Arg Gln Ser Asp Asp
530 535 540
Pro
Met Val Lys Arg Thr Leu Ser Pro Ile Thr Ala Asp Pro Ile Glu
545
550 555 560
Leu
Gln Arg Leu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Asp Ile Arg Pro Ala
Leu
565 570 575
Arg
Gly Gln Ala Leu Ser Arg Gln Gln Ala Gln Ser Thr Tyr Asp Glu
580 585 590
Glu
Ile Ser Lys Arg Gln Asp Tyr Ala Glu Ile Leu Lys Arg Arg Gly
595 600 605
Ile
Val Gln Ile Pro Lys Lys Pro Cys Pro Thr Val Thr Ala Gln Tyr
610 615 620
Thr
Leu Glu Arg Tyr Ala Leu Phe Ile Ile Ser Ile Leu Gln Gln His
625
630 635 640
Val
Val
Arg Asp Cys Asp Glu Glu Ala Val Tyr Glu His Pro Lys Ala
645 650 655
Asp
Hi s Glu Leu Glu Ile Phe Gly Glu Ser Ile Val Asp Ile Ser Gln
660 665 670
Val
Ile Ile Leu Ala Phe Asp Leu Ile Phe Glu Arg Arg Arg Arg
Val
675 680 685
Arg
Asp Val Tyr Glu Ser Arg His Ile Ile Ala Arg Ile Arg Arg Met
690 695 700
Arg
Gly Lys Glu Arg Leu Asn Val Ile Ala Glu Phe Phe Pro Thr Tyr
705
710 715 720
Gly
Gly
Leu Leu Asn Gly Leu Asn Ser Ala Thr Val Val Gln Asn Ile
725 730 735
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Met
S_ 1- Leu Asn Phe Leu Pro Leu Tyr Phe Leu Val Gly Asp Asn
Met
740 745 750
Ile
Tyr Ser His Arg Gln Trp Ser Ile Pro Leu Leu Leu Tyr Thr His
755 760 765
Glu
Val Met Val Val Pro Leu Glu Val Gly Ser Tyr Asn Asp Arg Cys
770 775 780
Gly
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr Met Val Phe Phe Pro Ser Lys Ala
785
790 795 800
Ile
Arg Phe Ser Lys Leu Asn Glu Ala Gln Pro Lys Ile Ala Arg Glu
805 810 815
Met
Leu Lys Tyr Tyr Ala Asn Thr Thr Val Tyr Asp Gly Gly Val Asn
820 825 830
S_ 1-
Asn Val Val Thr Thr Lys Gln Leu Leu Tyr Glu Thr Tyr Leu Ala
835 840 845
Ser
Leu cys Gly Gly Ile Ser Asp Gly Ile Val Trp Tyr Leu Pro Ile
850 855 860
Thr
Hi s Pro Asn Lys Cys Ile Val Ala Ile Glu Val Ser Asp Glu Arg
865
870 875 880
Val
Pro Ala Ser Ile Arg Ala Gly Arg Ile Arg Leu Arg Phe Pro Leu
885 890 895
Ser
Ala Arg His Leu Lys Gly Val Val Ile Ile Gln Ile Asp Glu Glu
900 905 910
Gly
Glu Phe Thr Val Tyr Ser Glu Gly Ile Val Ser His Arg Val Cys
915 920 925
Lys
Lys
Asn Leu Leu Lys Tyr Met Cys Asp Ile Ile Leu Leu Lys Phe
930 935 940
Ser
Gly His Val Phe Gly Asn Asp Glu Met Leu Thr Lys Leu Leu Asn
945
950 955 960
Val
<210> 5
<211> 2916
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<223> VP2 del BTV con codones optimizados para la expresion en mamiferos con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
E11
27-0
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
c-myc unido
<400> 5
atggacgagc
tacgagttca
accaagatcc
tggtacaacc
aggggctacg
aacgaccagt
ggcctggacg
gacagcaaga
ggctgcctgc
gccgcccagg
cggagagaca
ggccagaaag
ctggtgatca
atctgcaaca
tgcaagatcc
gaggccagcc
cctgagagac
atcctgctga
tacccctgcc
atgatgcggt
agagagcagg
ggcatcaaga
gcccagggca
gacgacgtgg
cagttcaaga
aaggacgcca
atcattgccc
cagagcgacg
ctgcagagac
ctgagcagac
gccgagatcc
accgcccagt
gtggtgcggg
tgggcatccc
tcatcgacgt
ccgagatgaa
ccatcagaaa
acgagagaag
gggtgcagtg
accagagcag
aagccgacac
acaccagaac
aagtggccta
gaagccagcc
tgaccatgaa
gaggcaagat
gatggattca
tgagcaccat
tgagcatcag
tgaagatctt
tgatcgccgc
tgagaggcac
cttggtacga
aaaagtacat
tcgtgcactg
acccctgcga
cctacggcca
tgcacaagat
agctgaccac
ccatgttcaa
accccatggt
tgaccctggc
agcaggccca
tgaagagaag
acaccctgga
actgcgacga
cgtgtacaag
gggcaccaag
cgcctacgac
cgacggcttc
agccgtggtg
gatgatgaag
aaacgtggcc
catgagctac
catgatgtgg
caccctgaag
cttcagaccc
ccacaacagc
ccctgaagtg
gagccggcac
cggcagaaag
attccaggaa
cgagcacaga
cagcgacacc
cctgatcgcc
ttggagcgtg
ctacggccgc
ggagtacaga
cctgtacccc
gatgatcaac
tctgaagagc
caacgagggc
tgccaagctg
gaagagaacc
cagattctac
gagcacctac
aggcatcgtg
aagatacgcc
ggaagccgtg
agaggcttcc
atcgagagcg
atcaagcagg
gtgctgccca
gagagcacca
gacagcatgg
cacagcctgc
cacgtggagc
aaccacctgg
cccacctatg
ggcgaccaga
tacgacaaga
atccgggacg
gaccccggcg
gtgctggaca
gccatcgaca
aaccagcggc
ttcaacacca
agcgagacaa
cggcccacct
gtgaacctgt
ctgaaccaca
gaggatgacg
gagatgatca
gagggcaacg
gtgaccatgc
cggatcaagc
ctgagcccca
gacatcagac
gacgaagaga
cagatcccca
ctgttcatca
tacgagcacc
ccgagcacct
tgggcggcag
aaagcatcag
gagtgctgga
gacacaagag
acgcccagcc
acaactgcgt
ccatcgagga
tgcggatcga
acatcgtggt
ccctgatcaa
tggtggaagg
acattgccag
agatcaaggc
gagagaaaga
acaagttcag
gggacgagga
gagtgtggtg
agctgggcga
acacccccta
tcgacttcgt
gcaccagaga
acgtgatcgt
atggcggctg
tgctgaccat
ccgagtactt
acgaggaaat
tcaccgccga
cagctctgcg
tcagcaagag
agaagccctg
tcagcatcct
ccaaggccga
gctgcgcggc
acacgacgtg
aaccgccctg
catcaccctg
cttccacacc
cctgaaagtg
ggtgaagatc
cgccagcaag
gacattccac
gcacgccgag
cttcggcaga
cctggcccac
cctggacgag
ctacgagctg
gcccgaggac
acagcacgac
cagattctac
gagcaacccc
cgtgtacagc
cgagaaaacc
ggccgagccc
gatcacctac
gaccaagttc
gaaccaggaa
cgacttcgag
caacaagtgg
cgcccagaga
ccccatcgag
cgggcaggct
acaggactac
ccccaccgtc
gcagcagcac
ccacgagctg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
E11
27-0
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2916
gaaatcttcg
gcgagagcat cgtggacatc tctcaggtga tcatcctggc cttcgacctg
atcttcgaga
gaaggcggag agtgcgggac gtgtacgaga gcagacacat cattgccaga
atcagaagaa
tgcggggcaa agaacggctg aacgtgatcg ccgagttctt ccccacctac
ggcggcctgc
tgaacggcct gaacagcgcc accgtggtgc agaacatcat gtacctgaac
tttctgcccc
tgtacttcct ggtgggcgac aacatgatct acagccacag acagtggagc
atccccctgc
tgctgtacac ccacgaagtg atggtggtgc ctctggaagt gggaagctac
aacgacagat
gcggcctgat cgcctacctg gaatacatgg tgttcttccc tagcaaggcc
atcagattca
gcaagctgaa cgaggcccag cccaagatcg ccagagagat gctgaagtac
tacgccaaca
ccaccgtgta cgacggcggc gtgaactaca acgtggtgac caccaagcag
ctgctgtacg
agacatacct ggccagcctg tgcggcggca tcagcgacgg catcgtgtgg
tatctgccca
tcacccaccc caacaagtgc atcgtggcca tcgaggtgtc cgacgagaga
gtgcccgcca
gcatcagggc cggcagaatc agactgagat tccccctgag cgccagacac
ctgaagggcg
tggtgatcat tcagatcgac gaagagggcg agttcaccgt gtactccgag
ggcatcgtgt
cccacagagt gtgcaagaag aacctgctga agtatatgtg cgacatcatt
ctgctgaagt
tcagcggcca cgtgttcggc aacgacgaga tgctgaccaa gctgctgaac
gtggagcaga
agctgatcag cgaggaggac ctgtga
<210> 6 <211> 971 <212> PRT <213> secuencia artificial
<220> <22 3> Proteina VP2 del BTV + c-myc
<400> 6
Met Asp Glu Leu Gly Ile Pro Val Tyr Lys Arg
Gly Phe Pro Glu His
1 5 10 15
Leu
Leu
Arg Gly S_ 1- Glu Phe Ile Ile Asp Val Gly Thr Lys Ile Glu
20 25 30
Ser
Val Gly Gly Arg His Asp Val Thr Lys Ile Pro Glu Met Asn Ala
35 40 45
Tyr
Asp Ile Lys Gln Glu Ser Ile Arg Thr Ala Leu Trp Tyr Asn Pro
50 55 60
Ile
Arg Asn Asp Gly Phe Val Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Thr Leu
65
70 75 80
Arg
Gly Tyr Asp Glu Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Thr Arg His Lys
85 90 95
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ser
Phe Hi s Thr Asn Asp Gln Q_ L. 1- Val Gln Q_ L. 1- Met Met Lys Asp
Ser
100 105 110
Met
Asp Ala Gln Pro Leu Lys Val Gly Leu Asp Asp Gln Ser Arg Asn
115 120 125
Val
Ala His Ser Leu His Asn Cys Val Val Lys Ile Asp Ser Lys Lys
130 135 140
Al a
Asp Thr Met Ser Tyr His Val Glu Pro Ile Glu Asp Ala Ser Lys
145
150 155 160
Gly
Cys Leu His Thr Arg Thr Met Met Trp Asn His Leu Val Arg Ile
165 170 175
Glu
Thr Phe His Ala Ala Gln Glu Val Ala Tyr Thr Leu Lys Pro Thr
180 185 190
Tyr
Asp Ile Val Val His Ala Glu Arg Arg Asp Arg Ser Gln Pro Phe
195 200 205
Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
210 215 220
Thr
Met Asn His Asn Ser Tyr Asp Lys Met Val Glu Gly Leu Ala His
225
230 235 240
Leu
Val Ile Arg Gly Lys Ile Pro Glu Val Ile Arg Asp Asp Ile Ala
245 250 255
Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
260 265 270
Gly
Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Ser Thr Ile
Gly
275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Ser Leu
290
295 300
Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
305
310 315 320
Pro
Glu Arg Leu Lys Ile Phe Glu His Arg Asn Gln Arg Arg Asp Glu
325 330 335
Asp
Arg Phe Tyr Ile Leu Leu Met Ile Ala Ala Ser Asp Thr Phe Asn
340 345 350
Thr
Arg Val Trp Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Cys Leu Arg Gly Thr Leu
355 360 365
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ile
Ala Ser Glu Thr Lys Leu Gly Asp Val Tyr Ser Met Met Arg Ser
370 375 380
T rp
Tyr Asp Trp Ser Val Arg Pro Thr Tyr Thr Pro Tyr Glu Lys Thr
385
390 395 400
Arg
Glu Gln Glu Lys Tyr Ile Tyr Gly Arg Val Asn Leu Phe Asp Phe
405 410 415
Val
Ala Glu Pro Gly Ile Lys Ile Val His Trp Glu Tyr Arg Leu Asn
420 425 430
Hi s
Ser Thr Arg Glu Ile Thr Tyr Ala Gln Gly Asn Pro Cys Asp Leu
435 440 445
Tyr
Pro Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Thr Lys Phe Asp Asp Val Ala
450 455 460
Tyr
Gly Gln Met Ile Asn Glu Met Ile Asn Gly Gly Trp Asn Gln Glu
465
470 475 480
Gln
Phe Lys Met His Lys Ile Leu Lys Ser Glu Gly Asn Val Leu Thr
485 490 495
Ile
Asp Phe Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Thr Asn Glu Gly Val Thr
500 505 510
Met
Pro Glu Tyr Phe Asn Lys Trp Ile Ile Ala Pro Met Phe Asn Ala
515 520 525
Lys
Leu Arg Ile Lys His Glu Glu Ile Ala Gln Arg Gln Ser Asp Asp
530 535 540
Pro
Met Val Lys Arg Thr Leu Ser Pro Ile Thr Ala Asp Pro Ile Glu
545
550 555 560
Leu
Gln Arg Leu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Asp Ile Arg Pro Ala
Leu
565 570 575
Arg
Gly Gln Ala Leu Ser Arg Gln Gln Ala Gln Ser Thr Tyr Asp Glu
580 585 590
Glu
Ile Ser Lys Arg Gln Asp Tyr Ala Glu Ile Leu Lys Arg Arg Gly
595 600 605
Ile
Val Gln Ile Pro Lys Lys Pro Cys Pro Thr Val Thr Ala Gln Tyr
610 615 620
Thr
Leu Glu Arg Tyr Ala Leu Phe Ile Ile Ser Ile Leu Gln Gln His
625
630 635 640
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Val
Val
Arg Asp Cys Asp Glu Glu Ala Val Tyr Glu His Pro Lys Ala
645 650 655
Asp
Hi s Glu Leu Glu Ile Phe Gly Glu Ser Ile Val Asp Ile Ser Gln
660 665 670
Val
Ile Ile Leu Ala Phe Asp Leu Ile Phe Glu Arg Arg Arg Arg
Val
675 680 685
Arg
Asp Val Tyr Glu Ser Arg His Ile Ile Ala Arg Ile Arg Arg Met
690 695 700
Arg
Gly Lys Glu Arg Leu Asn Val Ile Ala Glu Phe Phe Pro Thr Tyr
705
710 715 720
Gly
Gly
Leu Leu Asn Gly Leu Asn Ser Ala Thr Val Val Gln Asn Ile
725 730 735
Met
Tyr Leu Asn Phe Leu Pro Leu Tyr Phe Leu Val Gly Asp Asn
Met
740 745 750
Ile
Tyr Ser His Arg Gln Trp Ser Ile Pro Leu Leu Leu Tyr Thr His
755 760 765
Glu
Val Met Val Val Pro Leu Glu Val Gly Ser Tyr Asn Asp Arg Cys
770 775 780
Gly
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr Met Val Phe Phe Pro Ser Lys Ala
785
790 795 800
Ile
Arg Phe Ser Lys Leu Asn Glu Ala Gln Pro Lys Ile Ala Arg Glu
805 810 815
Met
Leu Lys Tyr Tyr Ala Asn Thr Thr Val Tyr Asp Gly Gly Val Asn
820 825 830
S_ 1-
Asn Val Val Thr Thr Lys Gln Leu Leu Tyr Glu Thr Tyr Leu Ala
835 840 845
Ser
Leu Cys Gly Gly Ile Ser Asp Gly Ile Val Trp Tyr Leu Pro Ile
850 855 860
Thr
His Pro Asn Lys Cys Ile Val Ala Ile Glu Val Ser Asp Glu Arg
865
870 875 880
Val
Pro Ala Ser Ile Arg Ala Gly Arg Ile Arg Leu Arg Phe Pro Leu
885 890 895
Ser
Ala Arg His Leu Lys Gly Val Val Ile Ile Gln Ile Asp Glu Glu
900 905 910
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
E11
27-0
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320

Gly Glu Phe Thr Val Tyr Ser Glu Gly Ile Val Ser His Arg Val Cys 915 920 925

Lys Lys Asn Leu Leu Lys Tyr Met Cys Asp Ile Ile Leu Leu Lys Phe 930 935 940

Ser Gly His Val Phe Gly Asn Asp Glu Met Leu Thr Lys Leu Leu Asn 945 950 955 960

Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 965 970

<210> 7

<211> 1581
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<22 3> ADN de tipo natural de VP5 del BTV
<400> 7
atgggtaaag
tcatacggtc cttaagccga tttggcaaga aggtgggcaa cgcgttaacc
tctaataccg
caaaaaagat ctatagtaca atcggaaaag cggcggaacg attcgctgag
agtgagatag
gttcagcggc gatcgatgga ttggtacagg ggagcgtaca ttcaatcata
acgggcgaat
cttacggcga atctgtgaaa caagctgtgt tgttaaatgt gttggggagt
ggtgaggaaa
ttcctgatcc gctaagccca ggagagcggg ggatacaagc taagttgaaa
gagttagagg
atgagcaacg taatgaatta gttcgcttga aatataatga taagattaag
gagaaatttg
gaaaagagct tgaggaggtg tacaatttta tgaatgggga ggcgaatgct
gagattgaag
atgagaagca gtttgatata ttgaacaagg cggtgacctc gtataacaaa
atccttacgg
aagaagatct acagatgcgc cggctagcta cggcgttaca gaaagagatc
ggagaaagaa
cacatgcgga gacggtcatg gtaaaagaat accgagataa aattgacgct
ttaaaaaatg
cgattgaggt agaaagagat ggcatgcaag aggaggcaat acaggagatt
gcggggatga
ccgcagatgt gttagaggcg gcatcggagg aggttccgct gattggtgcg
gggatggcta
cggctgtagc gacaggaaga gctatagaag gagcgtataa actcaaaaag
gtgattaacg
ctctaagcgg gatcgatcta acgcatttgc gcaccccgaa aatcgaacct
agtgttgttt
caactattct tgagtaccgc acaaaggaaa ttcctgataa cgctctagct
gttagtgttc
tatcaaaaaa tcgcgcgatt caagaaaacc acaaagaact gatgcatatc
aagaatgaga
tattacctag gtttaagaaa gcgatggatg aagaaaagga aatatgtggg
atagaagaca
aagtgatcca cccgaaggtc atgatgaagt tcaagattcc gagagctcaa
cagccgcaga
ttcatgtata cagtgctcca tgggattctg atgatgtgtt cttctttcat
tgtatctcgc
accatcatgc aaatgagtcg ttctttttag gtttcgattt gagcattgat
ttagttcatt
atgaagatct taccgcccat tggcatgcat tgggagcagc tcaagcagcg
gcgggacgta
cgttgactga agcgtataga gaatttttaa atttggcgat ctcaaatgca
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

ttcggcacgc aaatgcacac gagaaggttg gttaggtcaa aaacggtaca tccaatttat 1380

ttaggttcct tgcattacga tatttccttt tcggatctgc gtggaaacgc tcagagaata 1440

gtttatgatg atgagctgca aatgcacata ctccgtgggc cgatacactt tcaaagacgt 1500

gcaatactgg gagctttgaa atttggatgt aaggttttgg gggaccgttt agacgtacca 1560

ctcttcttac gaaatgcttg a 1581

<210> 8 <211> 1581
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<223> VP5 del BTV con codones optimizados para la expresion en mamiferos

<400> 8

atgggcaagg tgatcagaag cctgagcaga ttcggcaaga aggtgggcaa cgctctgacc 60

agcaacaccg ccaagaagat ctacagcacc atcggcaagg ctgccgaaag attcgccgag 120

agcgagatcg gcagcgccgc catcgacggc ctggtgcagg gaagcgtgca cagcatcatc 180

accggagaga gctacggaga gagcgtcaag caggccgtgc tgctgaacgt gctgggcagc 240

ggcgaggaga tccccgaccc cctgagccct ggcgagaggg gcatccaggc caagctgaaa 300

gaactggaag atgagcagag gaacgagctg gtgcggctga agtacaacga caagatcaag 360

gagaagttcg gcaaggaact ggaagaggtc tacaacttca tgaacggcga ggccaacgcc 420

gagatcgagg acgagaagca gttcgacatc ctgaacaagg ccgtgaccag ctacaacaag 480

atcctgaccg aggaggacct gcagatgaga aggctggcca ccgccctgca gaaggagatc 540

ggcgagagga cccacgccga gacagtgatg gtgaaggagt acagggacaa gatcgacgcc 600

ctgaagaacg ccatcgaggt ggagagggac ggcatgcagg aggaggccat tcaggaaatc 660

gccggcatga ccgccgacgt gctggaggct gccagcgagg aggtgcccct gatcggagct 720

ggaatggcta ccgctgtggc caccggcaga gccatcgagg gcgcctacaa gctgaagaag 780

gtgatcaacg ctctctccgg catcgacctg acccacctga ggacccccaa gatcgagccc 840

agcgtggtgt ccaccatcct ggagtacagg accaaggaga tccctgacaa cgccctggcc 900

gtgagcgtgc tgtccaagaa cagagccatt caggaaaacc acaaagaact gatgcacatc 960

aagaacgaga tcctgcccag gttcaaaaag gccatggacg aggagaagga gatctgcggc 1020

atcgaggaca aggtgatcca ccccaaggtg atgatgaagt tcaagatccc cagggcccag 1080

cagccccaga tccacgtgta cagcgccccc tgggacagcg acgacgtgtt cttcttccac 1140

tgcatcagcc accaccacgc caacgagtct ttcttcctgg gcttcgacct gtccatcgac 1200

ctggtgcact acgaggacct gaccgcccac tggcacgccc tgggagccgc tcaggccgct 1260

gctggcagaa ccctgaccga ggcctacaga gagttcctga acctggccat cagcaacgcc 1320

ttcggcaccc agatgcacac caggcggctg gtgcggagca agaccgtgca ccccatctac 1380

ctgggcagcc tgcactacga catcagcttc agcgacctga gaggcaacgc ccagaggatc 1440
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
gtgtacgacg acgagctgca gatgcacatc ctgaggggcc ccatccactt ccagagaagg gccatcctgg gcgccctgaa gttcggctgc aaggtgctgg gcgacaggct ggacgtgccc ctgttcctga ggaacgcctg a
<210> 9
<211> 1581
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<223> VP5 del BTV con codones optimizados para la expresion en agua
<400> 9
atggggaagg tgatccgctc cctctcccgc ttcggcaaga aggtcggcaa cgccctcacg tccaacaccg ccaagaagat ctactcgacg atcggcaagg ccgcggagcg cttcgccgag agcgagatcg ggtccgccgc gatcgacggg ctcgtccagg gcagcgtcca ctcgatcatc acgggcgagt cctacggcga gtcggtcaag caggccgtgc tgctcaacgt cctggggtcc ggcgaggaga tcccggaccc tctctcgccg ggcgagaggg gcatccaggc gaagctcaag gaactcgagg acgagcagag aaatgagctg gtgcgcctga agtacaacga caagatcaag gagaaattcg ggaaggaact cgaggaagtg tacaacttca tgaacggcga ggccaacgcg gagatcgagg atgagaagca gttcgacatc ctgaacaagg cggtgaccag ctacaacaag atcctcacgg aggaagacct gcaaatgcgc agactcgcca ccgccctgca gaaggagatc ggggagcgga ctcacgccga gaccgtgatg gtgaaggagt atcgcgacaa gatcgacgcg ctgaagaacg ccatcgaggt cgagagggac gggatgcagg aggaggccat ccaggagatc gccgggatga ccgcggacgt gctcgaggcc gcgagcgagg aggtgcccct gatcggcgcc gggatggcca ccgccgtcgc caccgggcgc gctatcgagg gcgcctacaa gctgaagaag gtcatcaacg cgctcagcgg catcgacctc acccacctca gaaccccgaa gatcgagccg tccgtggtct cgaccatcct cgagtaccgg accaaggaga tccccgacaa cgccctggcc gttagcgtcc tgtcgaagaa ccgggccatc caggagaacc acaaggagct gatgcacatc aagaacgaga tcctcccccg gttcaagaag gccatggacg aggagaagga gatctgcggc atcgaggaca aagtgatcca cccgaaggtc atgatgaagt tcaagatccc ccgcgctcag cagccccaga tccacgtcta ctccgcgccc tgggactccg acgacgtctt cttcttccac tgcatctccc accaccacgc caacgagtcc ttcttcctcg gcttcgacct gtccatcgac ctggtccact acgaggacct caccgcgcac tggcacgctc tgggtgccgc gcaggccgct gccgggcgga ccctcaccga ggcctaccgc gagttcctca acctggccat cagcaacgcg ttcggcacgc agatgcacac gcggcgcctg gtgaggagca aaacggtgca cccgatctac ctgggcagcc tccactacga catcagcttc tccgacctgc gcgggaacgc ccagcggatc gtgtacgacg acgagctgca gatgcacatc ctccgcggcc ccatccactt ccagcgccgc
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
gccatcctcg gggccctcaa gttcgggtgc aaggtgctcg gtgaccgcct cgacgtgccc ctgttcctcc gcaacgccta a
<210> 10 <211> 526
<212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<223> Proteina VP5 del BTV
<400> 10
Met
Gly Lys Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn
Ala Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys
Ala Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp
Gly Leu Val Gln Gly Ser Val Hi s Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
50
55 60
Tyr
Gly Glu Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Val Leu Gly Ser
65
70 75 80
Gly
Glu Glu Ile Pro Asp Pro Leu Ser Pro Gly Glu Arg Gly Ile Gln
85 90 95
Ala
Lys Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
100 105 110
Leu
Lys Tyr Asn Asp Lys Ile Lys Glu Lys Phe Gly Lys Glu Leu Glu
115 120 125
Glu
Val Tyr Asn Phe Met Asn Gly Glu Ala Asn Ala Glu Ile Glu Asp
130 135 140
Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
Leu Thr Glu Glu Asp Leu Gln Met Arg Arg Leu Ala Thr Ala Leu
165 170 175
Gln
Lys Glu Ile Gly Glu Arg Thr His Ala Glu Thr Val Met Val Lys
180 185 190
Glu
Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
210 215 220
Al a
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Thr Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290 295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys
Phe Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala
Pro Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370 375 380
Hi s
His Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu
Val His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala
Gln Ala Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
420 425 430
Leu
Asn Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg
Leu Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His
Tyr Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val
Tyr Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
485 490 495
Phe Gln
Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu Gly
Asp Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
<210>
11
<211> '
961
<212>
PRT
<213> :
secuencia artificial
<220>
<223>
Protei na VP2 del BTV ACB05467
<400>
11
Met Asp
Glu Leu Gly Ile Pro Val Tyr Lys Arg Gly Phe Pro Glu His
1
5 10 15
Leu Leu
Arg Gly Tyr Glu Phe Ile Ile Asp Val Gly Thr Lys Ile Glu
20 25 30
Ser Val
Gly Gly Arg His Asp Val Thr Lys Ile Pro Glu Met Asn Ala
35 40 45
Tyr Asp
Ile Lys Gln Glu Ser Ile Arg Thr Ala Leu Trp Tyr Asn Pro
50
55 60
Ile Arg
Asn Asp Gly Phe Val Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Thr Leu
65
70 75 80
Arg Gly Tyr
Asp Glu Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Thr Arg His Lys
85 90 95
Ser Phe
Hi s Thr Asn Asp Gln Trp Val Gln Trp Met Met Lys Asp Ser
100 105 110
Met Asp
Ala Gln Pro Leu Lys Val Gly Leu Asp Asp Gln Ser Arg Asn
115 120 125
Val Ala
His Ser Leu His Asn cys Val Val Lys Ile Asp Ser Lys Lys
130
135 140
Ala Asp
Thr Met Ser Tyr His Val Glu Pro Ile Glu Asp Ala Ser Lys
145
150 155 160
Gly Cys
Leu His Thr Arg Thr Met Met Trp Asn His Leu Val Arg Ile
165 170 175
Glu Thr
Phe His Ala Ala Gln Glu Val Ala Tyr Thr Leu Lys Pro Thr
180 185 190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tyr
Asp Ile Val Val His Ala Glu Arg Arg Asp Arg Ser Gln Pro Phe
195 200 205
Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
210
215 220
Thr
Met Asn His Asn Ser Tyr Asp Lys Met Val Glu Gly Leu Ala His
225
230 235 240
Leu
Val Ile Arg Gly Lys Ile Pro Glu Val Ile Arg Asp Asp Ile Ala
245 250 255
Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
260 265 270
Gly
Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Ser Thr Ile
Gly
275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Ser Leu
290 295 300
Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
305
310 315 320
Pro
Glu Arg Leu Lys Ile Phe Glu His Arg Asn Gln Arg Arg Asp Glu
325 330 335
Asp
Arg Phe Tyr Ile Leu Leu Met Ile Ala Ala Ser Asp Thr Phe Asn
340 345 350
Thr
Arg Val Trp Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Cys Leu Arg Gly Thr Leu
355 360 365
Ile
Ala Ser Glu Thr Lys Leu Gly Asp Val Tyr Ser Met Met Arg Ser
370 375 380
T rp
Tyr Asp Trp Ser Val Arg Pro Thr Tyr Thr Pro Tyr Glu Lys Thr
385
390 395 400
Arg
Glu Gln Glu Lys Tyr Ile Tyr Gly Arg Val Asn Leu Phe Asp Phe
405 410 415
Val
Ala Glu Pro Gly Ile Lys Ile Val His Trp Glu Tyr Arg Leu Asn
420 425 430
Hi s
Ser Thr Arg Glu Ile Thr Tyr Ala Gln Gly Asn Pro Cys Asp Leu
435 440 445
Tyr
Pro Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Thr Lys Phe Asp Asp Val Ala
450 455 460
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tyr
Gly Gln Met Ile Asn Glu Met Ile Asn Gly Gly Q_ L. 1- Asn Gln Glu
465
470 475 480
Gln
Phe Lys Met His Lys Ile Leu Lys Ser Glu Gly Asn Val Leu Thr
485 490 495
Ile
Asp Phe Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Thr Asn Glu Gly Val Thr
500 505 510
Met
Pro Glu Tyr Phe Asn Lys Trp Ile Ile Ala Pro Met Phe Asn Ala
515 520 525
Lys
Leu Arg Ile Lys His Glu Glu Ile Ala Gln Arg Gln Ser Asp Asp
530 535 540
Pro
Met Val Lys Arg Thr Leu Ser Pro Ile Thr Ala Asp Pro Ile Glu
545
550 555 560
Leu
Gln Arg Leu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Asp Ile Arg Pro Ala
Leu
565 570 575
Arg
Gly Gln Ala Leu Ser Arg Gln Gln Ala Gln Ser Thr Tyr Asp Glu
580 585 590
Glu
Ile Ser Lys Arg Gln Asp Tyr Ala Glu Ile Leu Lys Arg Arg Gly
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Ile
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Thr
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Val
Val
Arg Asp Cys Asp Glu Glu Ala Val Tyr Glu His Pro Lys Ala
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Asp
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Val
Ile Ile Leu Ala Phe Asp Leu Ile Phe Glu Arg Arg Arg Arg
Val
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Arg
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Arg
Gly Lys Glu Arg Leu Asn Val Ile Ala Glu Phe Phe Pro Thr Tyr
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Gly
Gly
Leu Leu Asn Gly Leu Asn Ser Ala Thr Val Val Gln Asp Ile
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15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Met
S_ 1- Leu Asn Phe Leu Pro Leu Tyr Phe Leu Val Gly Asp Asn
Met
740 745 750
Ile
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Glu
Val Met Val Val Pro Leu Glu Val Gly Ser Tyr Asn Asp Arg Cys
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Gly
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr Met Val Phe Phe Pro Ser Lys Ala
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Ile
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Met
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S_ 1-
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Thr
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Lys
Lys
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Ser
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950 955 960
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65
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Leu
Leu
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65
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Ser
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Val
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Thr
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Leu
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Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
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Gly
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Gly
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Leu
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Leu
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Val
Val
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Hi s Glu Leu Glu Ile Phe Gly Glu Ser Ile Val Asp Ile Ser Gln
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Val
Ile Ile Leu Ala Phe Asp Leu Ile Phe Glu Arg Arg Arg Arg
Val
675 680 685
Arg
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Gly
Gly
Leu Leu Asn Gly Leu Asn Ser Ala Thr Val Val Gln Asp Ile
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Gly
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Leu
Leu
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65
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Ser
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Gly
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Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
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Gly
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Ile
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Thr
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Val
Val
Arg Asp Cys Asp Glu Glu Ala Val Tyr Glu His Pro Lys Ala
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Val
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Val
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Arg
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Arg
Gly Lys Glu Arg Leu Asn Val Ile Ala Glu Phe Phe Pro Thr Tyr
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Gly
Gly
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65

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Val

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<211> 961
<212> PRT
<213> secuencia artificial <220>

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Al a
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145
150 155 160
Gly
Cys Leu Hi s Thr Arg Thr Met Met Trp Asn His Leu Val Arg Ile
165 170 175
Glu
Thr Phe Hi s Ala Ala Gln Glu Val Ala Tyr Thr Leu Lys Pro Thr
180 185 190
Tyr
Asp Ile Val Val His Ala Glu Arg Arg Asp Arg Ser Gln Pro Phe
195 200 205
Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
210 215 220
Thr
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225
230 235 240
Leu
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245 250 255
Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
260 265 270
Gly
Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Ser Thr Ile
Gly
275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Ser Leu
290
295 300
Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
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310 315 320
Pro
Glu Arg Leu Lys Ile Phe Glu His Arg Asn Gln Arg Arg Asp Glu
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Asp
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Ile
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Arg
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Gln
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Ile
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500 505 510
Met
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515 520 525
Lys
Leu Arg Ile Lys His Glu Glu Ile Ala Gln Arg Gln Ser Asp Asp
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Pro
Met Val Lys Arg Thr Leu Ser Pro Ile Thr Ala Asp Pro Ile Glu
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Leu
Gln Arg Leu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Asp Ile Arg Pro Ala
Leu
565 570 575
Arg
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580 585 590
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Ile
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Val
Arg Asp Cys Asp Glu Glu Ala Val Tyr Glu His Pro Lys Ala
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Asp
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Val
Ile Ile Leu Ala Phe Asp Leu Ile Phe Glu Arg Arg Arg Arg
Val
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690 695 700
Arg
Gly Lys Glu Arg Leu Asn Val Ile Ala Glu Phe Phe Pro Thr Tyr
705
710 715 720
Gly
Gly
Leu Leu Asn Gly Leu Asn Ser Ala Thr Val Val Gln Asn Ile
725 730 735
Met
Tyr Leu Asn Phe Leu Pro Leu Tyr Phe Leu Val Gly Asp Asn
Met
740 745 750
Ile
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755 760 765
Glu
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770 775 780
Gly
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr Met Val Phe Phe Pro Ser Lys Ala
785
790 795 800
Ile
Arg Phe Ser Lys Leu Asn Glu Ala Gln Pro Lys Ile Ala Arg Glu
805 810 815
Met
Leu Lys Tyr Tyr Ala Asn Thr Thr Val Tyr Asp Gly Gly Val Asn
820 825 830
S_ 1-
Asn Val Val Thr Thr Lys Gln Leu Leu Tyr Glu Thr Tyr Leu Ala
835 840 845
Ser
Leu Cys Gly Gly Ile Ser Asp Gly Ile Val Trp Tyr Leu Pro Ile
850 855 860
Thr
Hi s Pro Asn Lys Cys Ile Val Ala Ile Glu Val Ser Asp Glu Arg
865
870 875 880
Val
Pro Ala Ser Ile Arg Ala Gly Arg Ile Arg Leu Arg Phe Pro Leu
885 890 895
Ser
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900 905 910
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Glu Phe Thr Val Tyr Ser Glu Gly Ile Val Ser His Arg Val Cys
915 920 925
Lys
Lys
Asn Leu Leu Lys Tyr Met Cys Asp Ile Ile Leu Leu Lys Phe
930 935 940
Ser
Gly His Val Phe Gly Asn Asp Glu Met Leu Thr Lys Leu Leu Asn
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Val

<210> 15

<211> 961
<212> PRT
<213> secuencia artificial <220>
<223> VP2 del BTV con ACR58459
<400> 15
Met
Asp Glu Leu Gly Ile Pro Val Tyr Lys Arg Gly Phe Pro Glu His
1
5 10 15
Leu
Leu
Arg Gly Tyr Glu Phe Ile Ile Asp Val Gly Thr Lys Ile Glu
20 25 30
Ser
Val Gly Gly Arg His Asp Val Thr Lys Ile Pro Glu Met Asn Ala
35 40 45
Tyr
Asp Ile Lys Gln Glu Ser Ile Arg Thr Ala Leu Trp Tyr Asn Pro
50 55 60
Ile
Arg Asn Asp Gly Phe Val Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Thr Leu
65
70 75 80
Arg
Gly Tyr Asp Glu Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Thr Arg His Lys
85 90 95
Ser
Phe Hi s Thr Asn Asp Gln Trp Val Gln Trp Met Met Lys Asp
Ser
100 105 110
Met
Asp Ala Gln Pro Leu Lys Val Gly Leu Asp Asp Gln Ser Arg Asn
115 120 125
Val
Ala His Ser Leu His Asn Cys Val Val Lys Ile Asp Ser Lys Lys
130 135 140
Ala
Asp Thr Met Ser Tyr His Val Glu Pro Ile Glu Asp Ala Ser Lys
145
150 155 160
Gly
Cys Leu His Thr Arg Thr Met Met Trp Asn His Leu Val Arg Ile
165 170 175
Glu
Thr Phe His Ala Ala Gln Glu Val Ala Tyr Thr Leu Lys Pro Thr
180 185 190
Tyr
Asp Ile Val Val His Ala Glu Arg Arg Asp Arg Ser Gln Pro Phe
195 200 205
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
210 215 220
Al a
Met Asn His Asn Ser Tyr Asp Lys Met Val Glu Gly Leu Thr His
225
230 235 240
Leu
Val Ile Arg Gly Lys Thr Pro Glu Val Ile Arg Asp Asp Ile Ala
245 250 255
Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
260 265 270
Gly
Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Ser Thr Ile
Gly
275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu
290 295 300
Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
305
310 315 320
Pro
Glu Arg Leu Lys Ile Phe Glu His Arg Asn Gln Arg Arg Asp Glu
325 330 335
Asp
Arg Phe Tyr Ile Leu Leu Met Ile Ala Ala Ser Asp Thr Phe Asn
340 345 350
Thr
Arg Val Trp Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Cys Leu Arg Gly Thr Leu
355 360 365
Ile
Ala Ser Glu Thr Lys Leu Gly Asp Val Tyr Ser Met Met Arg Ser
370 375 380
T rp
Tyr Asp Trp Ser Val Arg Pro Thr Tyr Thr Pro Tyr Glu Lys Thr
385
390 395 400
Arg
Glu Gln Glu Lys Tyr Ile Tyr Gly Arg Val Asn Leu Phe Asp Phe
405 410 415
Val
Ala Glu Pro Gly Ile Lys Ile Val His Trp Glu Tyr Arg Leu Asn
420 425 430
Hi s
Ser Thr Arg Glu Ile Thr Tyr Ala Gln Gly Asn Pro Cys Asp Leu
435 440 445
Tyr
Pro Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Thr Lys Phe Asp Asp Val Ala
450 455 460
Tyr
Gly Gln Met Ile Asn Glu Met Ile Asn Gly Gly Trp Asn Gln Glu
465
470 475 480
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gln
Phe Lys Met Hi s Lys Ile Leu
485
Ile
Asp Phe Glu Lys Asp Ala Lys
500
Met
Pro Glu Tyr Phe Asn Lys Trp
515 520
Lys
Leu Arg Ile Lys His Glu Glu
530 535
Pro
Met Val Lys Arg Thr Leu Ser
545
550
Leu
Gln Arg Leu Thr Leu Ala Arg
565
Arg
Gly Gln Ala Leu Ser Arg Gln
580
Glu
Ile Ser Lys Gln Arg Asp Tyr
595 600
Ile
Val Gln Ile Pro Lys Lys Pro
610 615
Thr
Leu Glu Arg Tyr Ala Leu Phe
625
630
Val
Ala Arg Asp Cys Asp Glu Glu
645
Asp
Tyr Glu Leu Glu Ile Phe Gly
660
Val
Ile Val Leu Val Phe Asp Leu
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Arg
Asp Val Tyr Glu Ser Arg Tyr
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Arg
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Gly
Ser Leu Leu Asn Gly Leu Asn
725
Met
Tyr Leu Asn Phe Leu Pro Leu
740
Lys
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490
495
Leu
Thr Thr Asn Glu Gly Val Thr
505
510
Ile
Ile
Ala Pro Met Phe Asn Ala
525
Ile
Ala Gln Arg Gln Ser Asp Asp
540
Pro
Ile Thr Ala Asp Pro Ile Glu
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Phe
Tyr Asp Ile Arg Pro Ala Leu
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Gln
Ala Gln Ser Thr Tyr Asp Glu
585
590
Ala
Glu Ile Leu Lys Arg Arg Gly
605
Cys
Pro Thr Val Thr Ala Gln Tyr
620
Ile
Ile
Asn Ile Leu Gln Gln His
635 640
Ala
Ile Tyr Glu His Pro Lys
Ala
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Glu
Ser Ile Val Asp Ile Ser Gln
665
670
Ile
Phe Glu Arg Arg Arg Arg Val
685
Ile
Ile
Ala Arg Ile Arg Arg Met
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Ile
Ala Glu Phe Phe Pro Thr Tyr
715 720
Ser
Ala Thr Val Val Gln Asp Ile
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Tyr
Phe Leu Ala Gly Asp Asn Met
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15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ile Tyr
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Glu Val
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Gly Leu
Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr Met Val Phe Phe Pro Ser Lys Ala
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Ile Arg
Leu Ser Lys Leu Asn Glu Ala Gln Pro Lys Ile Ala Arg Glu
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Ser Leu
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855 860
Thr His
Pro Asn Lys Cys Ile Val Ala Ile Glu Val Ser Asp Glu Arg
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870 875 880
Val Pro
Ala Ser Ile Arg Ala Gly Arg Ile Arg Leu Arg Phe Pro Leu
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Ser Ala
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Gly Glu
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Lys Lys
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935 940
Ser Gly His
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950 955 960
Val
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16
<211> '
961
<212>
PRT
<213> :
secuencia artificial
<220>
<223>
VP2 del BTV con CAA39322
<400>
16
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20
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30
35
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45
50
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65
1
5 10 15
Leu
Leu
Arg Gly Tyr Glu Phe Thr Ile Asp Val Gly Thr Lys Ile Glu
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Ser
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Tyr
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65
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Arg
Gly Tyr Asp Glu Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Thr Arg His Lys
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Ser
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Ser
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Gly
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Glu
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Tyr
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Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
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Hi s
Met Asn His Asn Ser Tyr Asp Lys Met Val Glu Gly Leu Thr His
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230 235 240
Leu
Val Met Arg Gly Lys Met Pro Glu Val Ile Arg Asp Asp Ile Ala
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Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
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Gly
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Gly
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10
15
20
25
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275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu
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Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
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310 315 320
Pro
Glu Arg Leu Lys Ile Phe Glu His Gly Asn Gln Arg Arg Asp Glu
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Asp
Arg Phe Tyr Ile Leu Leu Met Ile Ala Ala Ser Asp Thr Phe Asn
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Thr
Arg Val Trp Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Cys Leu Arg Gly Thr Leu
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Tyr Asp Trp Ser Val Arg Pro Thr Tyr Thr Pro Tyr Glu Lys Thr
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Val
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Hi s
Ser Thr Arg Glu Ile Thr Tyr Ala Gln Gly Asn Pro Cys Asp Leu
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Tyr
Pro Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Thr Lys Phe Asp Asp Val Ala
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Tyr
Gly Gln Met Ile Asn Glu Met Ile Asn Gly Gly Trp Asn Gln Glu
465
470 475 480
Gln
Phe Lys Met His Lys Ile Leu Lys Thr Glu Gly Asn Val Leu Thr
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Ile
Asp Phe Glu Lys Asp Ala Lys Leu Thr Thr Asn Glu Gly Val Thr
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Met
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Asn
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Pro
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15
20
25
30
35
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50
55
60
65
545
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Leu
Gln Arg Leu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Asp Ile Arg Pro Ala
Leu
565 570 575
Arg
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Glu
Ile Ser Lys Lys Ala Gly Tyr Ala Glu Val Leu Lys Arg Arg Gly
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Ile
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Val
Ala Arg Asp Cys Asp Glu Glu Ala Ile Tyr Glu His Pro Lys Ala
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Asp
Hi s Glu Leu Glu Ile Phe Gly Glu Ser Ile Val Asp Ile Ser Gln
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Val
Ile Val Leu Val Phe Asp Leu Ile Phe Glu Arg Arg Arg Arg
Val
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Arg
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Gly
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Met
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Ile
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Glu
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Gly
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr Met Val Phe Phe Pro Ser Lys Ala
785
790 795 800
Ile
Arg Leu Ser Lys Leu Asn Glu Ala His Ala Lys Ile Ala Arg Glu
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Met
Leu Lys Tyr Tyr Ala Asn Thr Thr Val Tyr Asp Gly Gly Asp Asn
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10
15
20
25
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35
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Val Pro
Ala Ser Val Arg Ala Gly Arg Ile Arg Leu Arg Phe Pro Leu
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Ser Ala
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Gly Arg
Phe Thr Val Tyr Ser Glu Gly Ile Val Ser His Arg Val Cys
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Lys Lys
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950 955 960
Val
<210>
17
<211>
961
<212>
PRT
<213>
secuencia artificial
<220>
<223>
VP2 del BTV con CAE51088
<400>
17
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5
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20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Arg
Gly Tyr Asp Glu Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Thr Arg His Lys
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Ser
Phe Hi s Thr Asn Asp Gln Trp Val Gln Trp Met Met Lys Asp
Ser
100 105 110
Met
Asp Ala Gln Pro Leu Lys Val Gly Leu Asp Asp Gln Ser Arg Asn
115 120 125
Val
Ala His Ser Leu His Asn Cys Val Val Lys Ile Asp Ser Lys Lys
130 135 140
Al a
Asp Thr Met Ser Tyr His Val Glu Pro Ile Glu Asp Ala Ser Lys
145
150 155 160
Gly
Cys Leu His Thr Arg Thr Met Met Trp Asn His Leu Val Arg Ile
165 170 175
Glu
Thr Phe His Ala Ala Gln Glu Val Ala Tyr Thr Leu Lys Pro Thr
180 185 190
Tyr
Asp Ile Val Val His Ala Glu Arg Arg Asp Arg Ser Gln Pro Phe
195 200 205
Arg
Pro Gly Asp Gln Thr Leu Ile Asn Phe Gly Arg Gly Gln Lys Val
210
215 220
Ala
Met Asn His Asn Ser Tyr Asp Lys Met Val Glu Gly Leu Thr His
225
230 235 240
Leu
Val Ile Arg Gly Lys Thr Pro Glu Val Ile Arg Asp Asp Ile Ala
245 250 255
Ser
Leu Asp Glu Ile Cys Asn Arg Trp Ile Gln Ser Arg His Asp Pro
260 265 270
Gly
Glu Ile Lys Ala Tyr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Ser Thr Ile
Gly
275 280 285
Arg
Lys Val Leu Asp Arg Glu Lys Glu Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu
290
295 300
Ser
Ile Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Lys Phe Arg Gln His Asp
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310 315 320
Pro
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Asp
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25
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Ile
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Arg
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Val
Ala Glu Pro Gly Ile Lys Ile Val His Trp Glu Tyr Arg Leu Asn
420 425 430
Hi s
Ser Thr Arg Glu Ile Thr Tyr Ala Gln Gly Asn Pro Cys Asp Leu
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Tyr
Pro Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Thr Lys Phe Asp Asp Val Ala
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Tyr
Gly Gln Met Ile Asn Glu Met Ile Asn Gly Gly Trp Asn Gln Glu
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Gln
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Ile
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Lys
Leu Arg Ile Lys His Glu Glu Ile Ala Gln Arg Gln Ser Asp Asp
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705
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Gly
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Glu
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Gly
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Tyr
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Ser
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Val
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Ile
Ile
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Ala
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Ala
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Ile
Ile
Ala Arg Ile Arg Arg Met
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Ile
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Ser
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Leu
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15
20
25
30
35
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65
Ser Ala
Arg His Leu Lys Gly Val Val Ile Ile Gln Ile Asp Arg Gly
900 905 910
Gly Arg
Phe Thr Val Tyr Ser Glu Gly Ile Val Ser His Arg Val Cys
915 920 925
Lys Lys
Asn Leu Leu Lys Tyr Met Cys Asp Ile Ile Leu Leu Lys Phe
930
935 940
Ser Gly His
Val Phe Gly Asn Asp Glu Met Leu Thr Lys Leu Leu Asn
945
950 955 960
Val
<210>
18
<211>
526
<212>
PRT
<213> :
secuencia artificial
<220>
<223>
VP5 del BTV con ACB59233
<400>
18
Met Gly Lys
Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn Ala
Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys Ala
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Asp Gly
Leu Val Gln Gly Ser Val His Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
50
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Tyr Gly Glu
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Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Al a
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Thr Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290 295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys
Phe Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala
Pro Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370 375 380
Hi s
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390 395 400
Leu
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Ala
Gln Ala Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
420 425 430
Leu Asn
Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg Leu
Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His Tyr
Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val Tyr
Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe Gln
Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu Gly Asp Arg
Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
<210>
19
<211>
526
<212>
PRT
<213>
secuencia artificial
<220>
<223> '
VP5 del BTV con ACB59234
<400>
19
Met Gly Lys
Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn Ala
Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys Ala
Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp Gly
Leu Val Gln Gly Ser Val His Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
50
55 60
Tyr Gly Glu
Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Val Leu Gly Ser
65
70 75 80
Gly Glu
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85 90 95
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Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
100 105 110
Leu Lys
Tyr Asn Asp Lys Ile Lys Glu Lys Phe Gly Lys Glu Leu Glu
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
Val S_ 1- Asn Phe Met Asn Gly Glu Ala Asn Ala Glu Ile Glu Asp
130 135 140
Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Arg Ala Gly Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
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Gln
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Glu
Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Al a
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Thr Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290 295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys
Phe Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala
Pro Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Ser Phe His Cys Ile Ser His
370 375 380
Hi s
His Ala Asn Glu Ser Phe Phe Ile Gly Phe Glu Ser Ser Ile Asp
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5
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15
20
25
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35
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45
50
55
60
65
Leu Val
His S_ > 1- Glu Asp Leu Thr Ala His Gly His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala Gln
Ala Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
420 425 430
Leu Asn
Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg Leu
Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His Tyr
Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val Tyr
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Phe Gln
Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
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Leu Gly Asp Arg
Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
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20
<211>
526
<212>
PRT
<213>
secuencia artificial
<220>
<223> '
VP5 del BTV con ACR58462
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20
Met Gly Lys
Val Ile Arg Ser Leu Asn Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn Ala
Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys Ala
Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp Gly
Leu Val Gln Gly Ser Val His Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
50
55 60
Tyr Gly Glu
Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Val Leu Gly Ser
65
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Gly Glu
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Ala Lys
Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
100 105 110
Leu
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Glu
Val Tyr Asn Phe Met Asn Gly Glu Ala Asn Ala Glu Ile Glu Asp
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Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
Leu Thr Glu Glu Asp Leu Gln Met Arg Arg Leu Ala Thr Ala Leu
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Gln
Lys Glu Ile Gly Glu Arg Thr Hi s Ala Glu Thr Val Met Val Lys
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Glu
Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Al a
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Ala Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290 295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys
Phe Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala
Pro Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
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10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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65
370
375
380
Hi s
His Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu
Val His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala
Gln Thr Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
420 425 430
Leu
Asn Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg
Leu Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His
Tyr Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val
Tyr Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe
Gln Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu
Gly Asp Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
<210> ;
21
<211>
526
<212>
PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> VP5 del BTV con CAE52973
<400> 21
Met
Gly Lys Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn
Ala Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile S_ 1- Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys
Ala Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp
Gly Leu Val Gln Gly Ser Val His Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
50
55 60
Tyr
Gly Glu Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Val Leu Gly Ser
65
70 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gly
Glu Glu Ile Pro Asp Pro Leu Ser Pro Gly Glu Arg Gly Ile Gln
85 90 95
Al a
Lys Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
100 105 110
Leu
Lys Tyr Asn Asp Lys Ile Lys Glu Lys Phe Gly Lys Glu Leu Glu
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Glu
Val Tyr Asn Phe Met Asn Gly Glu Ala Asn Ala Glu Ile Glu Asp
130 135 140
Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
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Gln
Lys Glu Ile Gly Glu Arg Thr Hi s Ala Glu Thr Val Met Val Lys
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Glu
Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Ala
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly
Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Thr Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290
295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Lys Phe
Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala Pro
Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370
375 380
His His
Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu Val
His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala Gln
Thr Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
420 425 430
Leu Asn
Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg Leu
Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His Tyr
Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val Tyr
Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe Gln
Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu Gly Asp
Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
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<210> ;
22
<211>
526
<212>
PRT
<213> :
secuencia artificial
<220>
<223>
VP5 del BTV con CAE52974
<400>
22
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Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn Ala
Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys Ala
Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp Gly
Leu Val Gln Gly Ser Val His Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
50 55 60
Tyr
Gly Glu Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Met Leu Gly Asn
65
70 75 80
Gly
Glu Glu Ile Pro Asp Pro Leu Ser Pro Gly Glu Arg Gly Ile Gln
85 90 95
Al a
Lys Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
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Leu
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Glu
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Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
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Gln
Lys Glu Ile Gly Glu Arg Thr Hi s Ala Glu Thr Val Met Val Lys
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Glu
Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Ala
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly
Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
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Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
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Leu
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Tyr
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Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
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310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
325
330
335
Glu Ile
Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys Phe
Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala Pro
Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370
375 380
His His
Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu Val
His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
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Ala Gln
Thr Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
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Leu Asn
Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
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Arg Leu
Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His Tyr
Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val Tyr
Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe Gln
Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu Gly
Asp Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
<210> ;
23
<211>
526
<212>
PRT
<213> :
secuencia artificial
<220>
<223> '
VP5 del BTV con CAE52979
<400>
23
Met Gly Lys
Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn Ala
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Lys
Ala Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp
Gly Leu Val Gln Gly Ser Val Hi s Ser Ile Leu Thr Gly Glu Ser
50
55 60
Tyr
Gly Glu Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Val Leu Gly Ser
65
70 75 80
Gly
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Al a
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100 105 110
Leu
Lys Tyr Asn Asp Lys Ile Lys Glu Lys Phe Gly Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Glu
Val Tyr Glu Phe Met Asn Gly Ala Ala Lys Ala Glu Val Glu Asp
130 135 140
Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
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165 170 175
Gln
Lys Glu Ile Gly Glu Arg Thr His Ala Glu Thr Val Met Val Lys
180 185 190
Glu
Tyr Arg Asn Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Ile
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Ala
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly
Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Thr Lys Asp Ile Pro Asp Ser Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290 295 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ser Lys
Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Val His Ile
305
310 315 320
Gln Asp
Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu Lys
325 330 335
Glu Ile
Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Arg Phe
Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala Pro
Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370
375 380
His His
Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu Val
His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala Gln
Met Ala Met Gly Arg Thr Leu Ser Glu Ala Tyr Lys Glu Phe
420 425 430
Leu Asn
Met Ala Ile Ser Asn Ser Tyr Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg Leu
Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His Tyr
Asp Ile Ser Phe Pro Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Lys Ile
465
470 475 480
Val Tyr
Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe Gln
Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu Gly
Asp Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
<210> ;
24
<211>
526
<212>
PRT
<213> :
secuencia artificial
<220>
<223>
VP5 del BTV con CAE52991
<400>
24
Met Gly Lys
Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
5
10
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25
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35
40
45
50
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1
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Ser
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20 25 30
Lys
Ala Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp
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50
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65
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Gly
Glu Glu Leu Pro Asp Pro Leu Ser Pro Gly Glu Arg Gly Met Gln
85 90 95
Val
Lys Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
100 105 110
Leu
Lys Tyr Asn Asp Lys Ile Lys Glu Lys Phe Gly Lys Glu Leu Glu
115 120 125
Glu
Ile Tyr Glu Phe Met Asn Gly Glu Ala Lys Val Glu Ala Glu Asp
130 135 140
Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
Leu Thr Glu Glu Asp Leu Gln Met Arg Arg Leu Ala Thr Ala Leu
165 170 175
Gln
Lys Glu Val Ser Glu Arg Thr His Ala Glu Thr Val Met Val Lys
180 185 190
Glu
Tyr Arg Asn Lys Ile Asp Ala Leu Lys Ser Ala Ile Glu Ile
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Ala
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly
Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
275 280 285
Tyr
Arg Thr Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Ile Leu
290 295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asp Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Thr Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys
Phe Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Ala
Pro Trp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370 375 380
Hi s
His Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu
Val His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala
Gln Met Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Lys Glu Phe
420 425 430
Leu
Asn Met Ala Ile Ser Asn Val Leu Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg
Leu Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Met
450
455 460
His
Tyr Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val
Tyr Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe
Gln Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu
Gly Asp Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
<210> 25
<211> 526
<212> PRT
<213> secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> VP5 del BTV con CAE53011
<400> 25
Met
Gly Lys Val Ile Arg Ser Leu Ser Arg Phe Gly Lys Lys Val Gly
1
5 10 15
Asn
Ala Leu Thr Ser Asn Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Lys
Ala Ala Glu Arg Phe Ala Glu Ser Glu Ile Gly Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Asp
Gly Leu Val Gln Gly Ser Val Hi s Ser Ile Ile Thr Gly Glu Ser
50
55 60
Tyr
Gly Glu Ser Val Lys Gln Ala Val Leu Leu Asn Val Leu Gly Ser
65
70 75 80
Gly
Glu Glu Ile Pro Asp Pro Leu Ser Pro Gly Glu Arg Gly Ile Gln
85 90 95
Al a
Lys Leu Lys Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Asn Glu Leu Val Arg
100 105 110
Leu
Lys Tyr Asn Asp Lys Ile Lys Glu Lys Phe Gly Lys Glu Leu Glu
115 120 125
Glu
Val Tyr Asn Phe Met Asn Gly Glu Ala Asn Ala Glu Ile Glu Asp
130 135 140
Glu
Lys Gln Phe Asp Ile Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Tyr Asn Lys
145
150 155 160
Ile
Leu Thr Glu Glu Asp Leu Gln Met Arg Arg Leu Ala Thr Ala Leu
165 170 175
Gln
Lys Glu Ile Gly Glu Arg Thr His Ala Glu Thr Val Met Val Lys
180 185 190
Glu
Tyr Arg Asp Lys Ile Asp Ala Leu Lys Asn Ala Ile Glu Val
Glu
195 200 205
Arg
Asp Gly Met Gln Glu Glu Ala Ile Gln Glu Ile Ala Gly Met Thr
210
215 220
Ala
Asp Val Leu Glu Ala Ala Ser Glu Glu Val Pro Leu Ile Gly
Ala
225
230 235 240
Gly
Met Ala Thr Ala Val Ala Thr Gly Arg Ala Ile Glu Gly Ala Tyr
245 250 255
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Lys
Leu Lys Lys Val Ile Asn Ala Leu Ser Gly Ile Asp Leu Thr His
260 265 270
Leu
Arg Thr Pro Lys Ile Glu Pro Ser Val Val Ser Thr Ile Leu Glu
275 280 285
Tyr
Arg Ala Lys Glu Ile Pro Asp Asn Ala Leu Ala Val Ser Val Leu
290 295 300
Ser
Lys Asn Arg Ala Ile Gln Glu Asn His Lys Glu Leu Met His Ile
305
310 315 320
Lys
Asn Glu Ile Leu Pro Arg Phe Lys Lys Ala Met Asp Glu Glu
Lys
325 330 335
Glu
Ile Cys Gly Ile Glu Asp Lys Val Ile His Pro Lys Val Met Met
340 345 350
Lys
Phe Lys Ile Pro Arg Ala Gln Gln Pro Gln Ile His Val Tyr Ser
355 360 365
Al a
Pro T rp Asp Ser Asp Asp Val Phe Phe Phe His Cys Ile Ser His
370 375 380
Hi s
His Ala Asn Glu Ser Phe Phe Leu Gly Phe Asp Leu Ser Ile Asp
385
390 395 400
Leu
Val His Tyr Glu Asp Leu Thr Ala His Trp His Ala Leu Gly Ala
405 410 415
Ala
Gln Thr Ala Ala Gly Arg Thr Leu Thr Glu Ala Tyr Arg Glu Phe
420 425 430
Leu
Asn Leu Ala Ile Ser Asn Ala Phe Gly Thr Gln Met His Thr Arg
435 440 445
Arg
Leu Val Arg Ser Lys Thr Val His Pro Ile Tyr Leu Gly Ser Leu
450
455 460
His
Tyr Asp Ile Ser Phe Ser Asp Leu Arg Gly Asn Ala Gln Arg Ile
465
470 475 480
Val
Tyr Asp Asp Glu Leu Gln Met His Ile Leu Arg Gly Pro Ile His
485 490 495
Phe
Gln Arg Arg Ala Ile Leu Gly Ala Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val
500 505 510
Leu
Gly Asp Arg Leu Asp Val Pro Leu Phe Leu Arg Asn Ala
515 520 525
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
21
60
63
60
120
180
213
60
120
180
240
300
360
392
<210> 26 <211> 21 <212> ADN
<213> secuencia artificial <220>

<223> secuencia lider de alfa amilasa <400> 26
atgcaggtcc tgaacacgat g

<210> 27

<211> 63
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>

<223> secuencia lider de RbcS (RbcS (SSU5B) de lemna gibba) <400> 27
gaaactcccg aggtgagcaa ggatccggag gcg
<210> 28 <211> 213
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<22 3> promotor Aocs <400> 28
ctgaaagcga cgttggatgt taacatctac aagcgcttac gtttttggtg gacccttgag tcaagatgga tcattaattt ccaccttcac atattgtacg gctaagagcg aatttggcct

<210> 29

<211> 392
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>

<22 3> promotor AmasPmas <400> 29
gcgagctggt caatcccatt gcttttgaag gggagatttt tcaaatcagt gcgcaagacg ttctactaat ttggtcgttt atttcggcgt cgggtattct gtttctattc caactttttc agatacgctg acacgccaag cctcgctagt agaacggaat gcgcgtgacg ctcgcggtga tagccttgct tcctattata tcttccccca
tcgagcgcga agaagagaaa gagggaaagc
aaattgcctt ttcttatcga ccatgtacgt gaaactggta gctgttgtgg gcctgtggtc ctacgatggg gggcatcgca ccggtgagta gta
cagctcaaca ttgatctctt tctcgatcga tgacgtaagt atccgagtca gtttttattt gtaggacatg gcaaccgggc ctgaatttcg ttgatccgca gccattaacg acttttgaat caaaagtgta ccaaacaacg ctttacagca cgccatttcg ccttttcaga aatggataaa aa
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
976
60
120
180
240
300
360
420
ADN
secuencia artificial
promotor LmUBQ (ubiquitina de Lemna minor)
<210> 30
<211> 976
<212>
<213>
<220>
<223>
<400> 30
cgatctgcac
cctcagaact
acggcaaatt
aagggcaaaa
cccaccgacg
cggtgggtga
tttctggcat
aatatttaat
aatgttggta
tttttttaat
aagaatgaaa
tcgaatattc
atttctacat
acttcttctt
aataagatga
tatcgccgaa
ttgcctcgtc
aaaaaaaaaa
ggccggacga
actccgcaaa
agaggcagtg
aacgctccct
tgctcgctat
ctagcgttta
taacaaatga
tcaaaaatta
taatttctaa
tattacaaat
ccatccgatt
tattctcgtt
tttgtgggaa
aaaatgggtt
acctaacaaa
tttctc
aaaaaaaact
gagaagcgct
acccgaaaaa
cgatcgagag
ctagaacctg
ttatcgcaag
acctcaccgc
atcagtcatt
tttaggaaaa
ttttggaaaa
taggggtttt
ggtagttgaa
tttgtcgcca
tactcttatt
tattcgagat
ggcggtacgc
ttgagaagag
cgatcgaaac
taaacaaaat
tctacctgaa
gagatgcggc
agagttagag
ccagtgctca
tttctttaat
attaattaca
ggaaagaaaa
tgcgtaattt
aggggccgaa
agaaggtggg
cttagtacaa
ttctacgtca
tcctctcccc
ctgactaatc
gttttttttt
tggtgaactt
tgtaacatcg
tcatacgata
ttcatcagta
aactaactcg
ccgcgaaatt
ccaacataaa
caacgatcac
tcgtcggcgc
gagagagaag
agatcttctt
catccttctt
ttttaattcc
cgaataatcg
attttagggg
attatattta
aggcctcggg
caattatgtt
aagaaaagag
tgtgtgactc
cgacctataa
ttggtttatg
cgatgaacag
atttctttta
tccagcactg
ttgagcaaag
tgatctaaga
ttgagtggcc
accctagaat
accccttcca
gagaaggtgc
aaaaggcgag
gaaagatctt
cggcggcgga
ctcatatttg
cggagagggc
gatttttccc
tatggagggc
ataaagaaag
gtttctagag
tcatgcctta
tatatgcata
gcttaggaaa
atagagacct
attcgttgag
tgccgcagtg
tatccttcac
ctattaccgt
atcgatctat
atgttgcaac
ctgtttctcg

<210> 31

<211> 542
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>

<223> Intron de ADH1 <400> 31
gtccgccttg tttctcctct gtctcttgat taattttggg gaaagctagc ttcgtccaca gcgctgatct tgtatgctat cctgcaatcg tcccatgaaa aggctagtaa tctttctcga gtggtccatc cgacagtctg gctgaacaca cttccctgtt ctttaatgaa agacgtcatt ttgcaaggag gcgtttcttt ctttgaattt
5
10
15
20
25
30
35
480
540
542
60
120
180
240
300
360
420
480
535
gacgtaaggc ctttgctgct ccacacatgt ccattcgaat tttaccgtgt ttagcaaggg cgaaaagttt gcatcttgat gatttagctt gactatgcga ttgctttcct ggacccgtgc ag
<210> 32
<211> 535
<212> ADN
<213> secuencia artificial <220>
<223> Intron de LmUBQ (Ubi intron 1)
<400> 32
gtatgcgtct ttcctccttg tgattcgatc tttctgttgg ctagatctgg tctattgatc tgctctattg atctggtcta tttatcgctg catcgggatc tattgatccg tatgttgatt tgggatccgt aggttggttt ggatcggaga ctgcgatttg attcttgtga tttcgcttgg atttcggaaa tcggtgtggt tgaagtcgtg cgatctttta gatctgctcc tttttttatt tgctatttta tatttacgtt gtttatgatc gcggattatt ttgattcgtt tattcgagat ccatgccgtt taactcgttc tttgtgctcc gatctttgcg atacgtcggt cgttctagat ccgttcacta ggttagtttt aagttctttg agcttgattt atatggattt gctgttttcc aggaaaaatt tatgcgcgat tcttacgccc gtttccccat tttactttag gtcgtgaatt cttttgatct gagaatgatg aatctgacat gtaccttccg gtttgtaatt tgcag

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    1. Composicion que comprende un antlgeno del BTV (virus de la lengua azul) y un portador, excipiente, adyuvante o vehlcuio farmaceutica o veterinariamente aceptable; en la que el antlgeno del BTV es VP2 o una combinacion de VP2 y VP5 del serotipo 1 de BTV; en la que ademas el antlgeno se expresa en lenteja de agua.
  2. 2. Composicion, segun la reivindicacion 1, en la que el antlgeno VP2 del BTV tiene al menos un 80% de identidad en la secuencia con un polipeptido que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4 o 6; y en la que el antlgeno VP5 del BTV tiene al menos un 80% de identidad en la secuencia con un polipeptido que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 10.
  3. 3. Composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el antlgeno VP2 del BTV es codificado por un polinucleotido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 5; en la que ademas el antlgeno VP2 del BTV es codificado por un polinucleotido que tiene al menos un 70% de identidad en la secuencia con la secuencia establecida en la SEQ ID NO. 7, 8 o 9.
  4. 4. Composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para utilizar en un procedimiento para la vacunacion de un huesped susceptible para el BTV.
  5. 5. Composicion para utilizar, segun la reivindicacion 4, que comprende un protocolo de administracion de sensibilizacion-refuerzo.
  6. 6. Composicion para utilizar, segun la reivindicacion 5, en la que dicha administracion de sensibilizacion-refuerzo comprende (a) una administracion de sensibilizacion de la composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones 13, y una administracion de refuerzo de una vacuna o composicion que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa el antlgeno del BTV in vivo, o una vacuna viral inactivada que comprende el antlgeno del BTV, o una vacuna o composicion de plasmido de ADN que contiene o expresa el antlgeno del BTV; o (b) una administracion de sensibilizacion de una vacuna o composicion que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa el antlgeno del BTV in vivo; o una vacuna viral inactivada que comprende el antlgeno del BTV, o una vacuna o composicion de plasmido de ADN que contiene o expresa el antlgeno del BTV, y una administracion de refuerzo de la composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3; o (c) una administracion de sensibilizacion de la composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y una administracion de refuerzo de la composicion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
    Figura 1
    SEQ ID NO
    Tipo Description
    1
    ADN ADN de VP2 del BTV1 antes de la optimization de codones
    2
    ADN ADN de VP2 del BTV1 optimizado para la expresion en mamlferos (en pCG100)
    3
    ADN ADN de VP2 del BTV1 optimizado para la expresion en lenteja de agua (en MerD01-04)
    4
    Protelna Protelna VP2 del BTV1
    5
    ADN ADN de VP2 del BTV1 (optimizado para la expresion en mamlferos) + c-myc (en pCG101)
    6
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 + c-myc
    7
    ADN ADN de VP5 del BTV1 antes de la optimizacion de codones
    8
    ADN ADN de VP5 del BTV1 optimizado para la expresion en mamlferos (en pCG102)
    9
    ADN ADN de VP5 del BTV1 optimizado para la expresion en lenteja de agua (en MerD01-04)
    10
    Protelna Protelna VP5 del BTV1
    11
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACB05467
    12
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACF37215
    13
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACF37216
    14
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACJ65032
    15
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACR58459
    16
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAA39322
    17
    Protelna Protelna VP2 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAE51088
    18
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACB59233
    19
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACB59234
    20
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank ACR58462
    21
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAE52973
    22
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAE52974
    23
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAE52979
    24
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAE52991
    25
    Protelna Protelna VP5 del BTV1 con No. de acceso de GenBank CAE53011
    26
    ADN Secuencia llder de alfa amilasa
    27
    ADN Llder de RbcS (secuencia llder de Lemna gibba RbcS (SSU5B))
    28
    ADN Promotor Aocs
    29
    ADN Promotor AmasPmas
    30
    ADN Promotor LmUBQ (ubiquitina Lemna minor)
    31
    ADN intron ADH1
    32
    ADN Intron LmUBQ (Intron 1 Ubi)
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