BR112012023046B1 - vacinas de vírus de febre aftosa recombinantes e seus respectivos usos - Google Patents

Abstract

vacinas de vírus de febre aftosa recombinantes e seus respectivos usos. a presente invenção engloba as vacinas ou composições de fmdv. a vacina ou composição pode ser uma composição de vacina contendo antígenos fmdv. a presente invenção também engloba vetores recombinantes que codificam e expressam antígenos fmdv, epítopos ou imunogênicos, que podem ser utilizados para proteger animais contra fmdv, em particular, ovinos, bovinos, caprinos ou suínos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições para o combate ao Vírus da Febre Aftosa (FMDV), que causa infecção em animais. A presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um antigeno de FMDV, métodos de vacinação contra o vírus da febre aftosa e kits para sua utilização, com os referidos métodos e composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A febre aftosa (FA) é uma das doenças mais virulentas e contagiosas que afetam os animais de fazenda. Esta doença é endêmica em vários países do mundo, especialmente na África, Ásia e América do Sul. Além disso, surtos epidêmicos podem ocorrer periodicamente. A presença da doença em um país pode ter severas consequências econômicas resultantes da perda de perda de produtividade, de peso e produção de leite em rebanhos infectados e dos embargos comerciais impostos sobre esses países. As medidas tomadas contra essa doença consistem na aplicação rigorosa das restrições à importação, controles de higiene e quarentena, abate de animais doentes e programas de vacinação com vacinas inativadas ou como uma medida preventiva, a nível nacional ou regional ou periodicamente, quando ocorre um surto epidêmico.

A FA é caracterizada pelo seu curto período de incubação, a sua natureza altamente contagiosa, a formação de úlceras na boca e nos pés e, por vezes, a morte de animais jovens. A FA afeta um número de espécies de animais, em particular no gado bovino, porcos, ovelhas e cabras. O agente responsável por esta doença é um ácido ribonucleico (RNA) de vírus pertencente ao gênero Aphthovirus da família Pi corna vi ri dae (Cooper et al., Intervirology, 1978,. 10, 165-180). Atualmente, pelo menos sete tipos de febre aftosa e do vírus da doença (FMDV) são conhecidos: os tipos europeus (A, O e C), os tipos africanos (SAT1, SAT2 e SAT3) e um tipo asiático (Ásia 1). Numerosos subtipos foram também relatados (Kleid et al Science (1981), 214, 1125-1129).

O FMDV é um vírus nu icosaédrico de aproximadamente 25 nm de diâmetro, contendo uma única molécula de RNA de cadeia simples que consiste em cerca de 8500 nucleotideos, com uma polaridade positiva. Esta molécula de RNA compreende um único quadro de leitura aberta (ORF), que codifica uma única poliproteina que contém, inter alia, o precursor da capsideo também conhecido como proteína PI ou P88. A proteína P1 é miristilada na sua extremidade aminoterminal. Durante o processo de maturação, a proteína PI é clivada pela protease 3C em três proteínas conhecidas como VPO, VP1 e VP3 (ou ID, 1AB e 1C, respectivamente; Belsham GJ, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261 ) . No virion, a proteína VPO é depois clivada em duas proteínas, VP4 e VP2 (ou 1A e IB, respectivamente). 0 mecanismo para a conversão das proteínas VPO em VP4 e VP2 e para a formação de virions maduros não é conhecido. As proteínas VP1, VP2 e VP3 têm um peso molecular de cerca de 26.000 Da, enquanto que a proteína VP4 é menor em cerca de 8000 Da.

A simples combinação de proteínas da capsideo ou protômero forma a molécula 5S, que é o constituinte primário do capsideo FMDV. Este protômero é então complexado a um pentâmero para formar a molécula de 12S. Os resultados de virions a partir da encapsidação de uma molécula de RNA genômico de montagem de 12 pentâmeros 12S, constituindo assim as partículas de 146S. O capsideo viral pode também ser formado, sem a presença de uma molécula de RNA dentro dele (daqui em diante capsideo vazio). O capsideo vazio é também designado como partículas 70S. A formação de capsídeos vazios pode ocorrer naturalmente durante a replicação viral ou pode ser produzida artificialmente, por tratamento químico.

Muitas hipóteses, rotas de pesquisa e propostas foram desenvolvidas em uma tentativa de se projetar vacinas eficazes contra a febre aftosa. Atualmente, as únicas vacinas no mercado compreendem um vírus inativado. Preocupações sobre a segurança da vacina FMDV existem, assim como focos de febre aftosa na Europa têm sido associados com as deficiências na produção de vacinas (King, AMQ et al, (1981) Nature 293: 479-480). As vacinas inativadas não conferem imunidade de longo prazo, o que requer injeções de reforço dadas a cada ano ou mais frequentemente em caso de surtos epidêmicos. Além disso, há riscos ligados à inativação incompleta e/ou para o escape do vírus durante a produção de vacinas inativadas (King, AMQ, ibid) . Um objetivo na arte tem sido a construção de imunógenos conformacionalmente corretos sem o genoma FMDV infectante, para se fazer vacinas eficazes e seguras.

O vírus vaccinia tem sido usado com sucesso para a imunização contra a varíola, que culminou com a erradicação da variola em todo o mundo em 1980. Assim, um novo papel para poxvirus tornou-se importante, o de um vetor geneticamente útil para a expressão de genes estranhos (Panicali e Paoletti, 1982;. Paoletti et al, 1984). Os genes que codificam os antigenos heterólogos têm sido expressos em vacinia, muitas vezes resultando em imunidade protetora contra o teste pelo agente patogênico correspondente (revisto em Tartaglia et al., 1990). Uma linhagem altamente atenuada de vacinas, designada MVA, também tem sido utilizada como um vetor para vacinas baseadas em poxvirus. A utilização de MVA é descrita na Patente norte-americana No. US 5,185,146.

Sistemas de vetores de vacina adicionais envolvem a utilização de vírus avipox, que são naturalmente poxvirus hospedeiro-restritos. Ambos fowlpoxvirus (FPV;. Taylor et al 1988a, b) e canarypoxvirus (CPV;. Taylor et al, 1991 e 1992) foram manipulados para expressar produtos de genes estranhos. O fowlpox vírus (FPV) é o vírus protótipo do gênero Avipox da família Poxvirus. O vírus causa uma doença economicamente importante das aves de criação que tem sido bem controlada desde os anos 1920 com a utilização de vacinas vivas atenuadas. A replicação dos vírus avipox está limitada a espécies aviárias (Matthews, 1982) e não existem relatos na literatura de vírus avipox causando uma infecção produtiva em qualquer espécie não aviária, incluindo o homem. Esta restrição de hospedeiro proporciona uma barreira de segurança inerente contra a transmissão do vírus a outras espécies e torna o uso de vetores de vírus avipox para vacinas baseadas em aplicações veterinárias e humanas uma proposta atrativa.

Outros vetores de poxvirus atenuados foram preparados por modificações genéticas de linhagens de tipo selvagem de vírus. O vetor NYVAC, derivado por deleção de virulência específica e faixa de genes de hospedeiros da linhagem Copenhagem de vaccinia (Tartaglia et al., 1992) tem mostrado ser útil como um vetor recombinante para provocar uma resposta imune protetora contra um antígeno estrangeiro expresso. Outro vetor poxvirus obtido por engenharia é ALVAC, derivado de vírus canarypox (ver Patente US No. 5,756,103). O ALVAC se replica não produtivamente em hospedeiros não-aviários, uma característica que faz melhorar o seu perfil de segurança (Taylor et al., 1991 & 1992) . O ALVAC foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste pela American Type Culture Collection sob o número de acesso VR-2547. Ainda outro vetor de poxvirus obtido por engenharia é o TROVAC, derivado de vírus fowlpox (ver Patente US No. 5,766,599).

Poxvirus recombinantes podem ser construídos em dois passos conhecidos na técnica e análogos aos métodos para criar recombinantes sintéticos de poxvirus, tais como os vírus vacínia e vírus avipox descritos nas Patentes US N^os US 4,769,330; 4,722,848; 4,603,112; 5,11 0,587; 5,174,993; 5,494,807 e 5,505,941, cujas descrições são aqui incorporadas por referência. Assim, pode ser apreciado que as disposições de um poxvirus recombinante de vírus da febre aftosa e composições e produtos dos mesmos, particularmente FMDV recombinantes baseados em ALVAC ou TROVAC e composições e produtos deles, especialmente recombinantes que contenham os genes de Pl e/ou do gene da protease 3C de FMDV e composições e produtos destes, seriam um avanço altamente desejável em relação ao estado atual da tecnologia.

Recentemente, as plantas têm sido investigadas como uma fonte para a produção de agentes terapêuticos, tais como vacinas, anticorpos e biofármacos. No entanto, a produção de vacinas, anticorpos, proteínas e biofármacos a partir de plantas está longe de ser um processo usual e existem numerosos obstáculos que estão normalmente associados com a produção de tais vacinas. Limitações para vacinas de plantas que podem ser produzidas com êxito incluem baixo rendimento do bioproduto ou antígeno expresso (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001, 6, 4958

496) , instabilidade de proteínas, inconsistências na qualidade do produto (Schillberg et al., Vaccine 2005, 23, 1764-1769) e capacidade insuficiente para produzir produtos do tipo viral de tamanho e imunogenicidade esperados (Arntzen et al., Vaccine 2005, 23, 1753-1756). A fim de resolver estes problemas, a otimização de códons, abordagens cuidadosas para coleta e purificação de produtos vegetais, utilização de partes de plantas, tais como cloroplastos para aumentar a absorção do material e melhor 10 orientação subcelular estão sendo estudados como possíveis estratégias (Koprowski, Vaccine 2005, 23, 1757-1763).

Considerando-se a susceptibilidade de animais (incluindo os seres humanos, embora raramente) a FMDV, um método de prevenção da infecção por FMDV e para proteger os 15 animais é essencial. Sendo assim, existe uma necessidade para uma vacina eficaz contra o vírus da febre aftosa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As composições que compreendem um polipeptídeo antigênico de FMDV e fragmentos e suas variantes são 20 fornecidas. Os antígenos FMDV e fragmentos e variantes do mesmo possuem propriedades imunogênicas e protetoras. Os antígenos FMDV podem ser produzidos em uma planta ou em algas.

Os polipeptídeos antigênicos e fragmentos e variantes destes podem ser formulados em vacinas e/ou composições farmacêuticas. Estas vacinas podem ser usadas para vacinar um animal e proporcionar proteção contra pelo menos uma linhagem de vírus da febre aftosa.

Os métodos da invenção incluem métodos para a produção dos polipeptídeos antigênicos em planta de lentilha. Métodos também incluem métodos de utilização, incluindo a administração a um animal de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo antigênico ou seu fragmento ou variante para produzir uma resposta protetora imunogênica. Após a produção do polipeptídeo antigênico na lentilha de água, este pode ser parcial ou substancialmente purificado para sua utilização como uma vacina.

Kits compreendendo pelo menos um polipeptídeo antigênico ou um seu fragmento ou variante e instruções de utilização são também fornecidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada que se segue, dada a título de exemplo, não se destina a limitar o invento apenas às formas de realização específicas descritas e pode ser melhor compreendida em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:

A Figura 1 mostra uma tabela que resume as sequências de DNA e proteínas, apresentadas como uma lista no apêndice do presente pedido.

A Figura 2 representa uma sequência FMDV nativa e otimizada que foi expressa em lentilha. O polipeptideo expresso é clivado em suas proteínas individuais pela protease 3C que se dobra, após a tradução, auto-cliva ao liberar-se do polipeptideo e, finalmente, realiza clivagens internas dentro do polipeptideo Pl.

A Figura 3 mostra a identidade e localização dos antígenos de lentilha otimizados FMDV para os 4 MerE das construções de expressão em lentilha;

A Figura 4 é um alinhamento de sequências de FMDV otimizado para expressão em lentilha (SEQ ID NO: 2) e vírus da febre aftosa otimizados para expressão em células de mamíferos (SEQ ID NO: 1) . A identidade de sequência é indicada;

A Figura 5 mostra o plasmídeo pHM-1119-1, que contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o vírus da febre aftosa em mamíferos otimizado P1-3C (SEQ ID NO: D ;

A Figura 6 representa o promotor pMerEOl, plasmídeo forte + Pl +2 A/2B1 (A24) + 3C (A12);

A Figura 7 descreve o Promotor forte pMerE02 + Pl;

A Figura 8 apresenta o promotor pMerE03 plasmídeo forte + Pl +2 A/2B1 (A24) + promotor fraco 3C (A12);

A Figura 9 representa o promotor pMerE04, plasmideo forte + Pl +2 A/2B1 (A24) + promotor fraco 3C (A12) com 5'UTR otimizado;

A Figura 10 ilustra um representante de dot blot de RNA utilizado para pesquisar linhas celulares recombinantes de lentilha para a expressão de genes que codificam antigenos FMDV;

A Figura 11 descreve um representante quantitativo de resultados de PCR para linhas de células que expressam, em lentilha, as construções FMDV;

A Figura 12 representa o Western blot para linhas celulares de lentilha abrigando e expressando MerEOl e MerE02;

A Figura 13 mostra micrografias eletrônicas dos vírus FMDV inventivos como partículas (VLP);

A Figura 14 descreve uma micrografia eletrônica de aglomerados de vírus da febre aftosa VLP;

A Figura 15 descreve uma análise WB de MerEOl e MerE03, extrato bruto (5pg TSP/faixa), usando soro de cobaia. Para MerEOl, a banda VP1 (VP3) sugere a expressão de ambos P1 e processamento 3C e PI adicional. Para MerE03, nem PI nem VP1 (VP3) foram observados, sugerindo a expressão de 3C e degradação de Pl;

A Figura 16 apresenta um diagrama esquemático de partículas virais de febre aftosa;

A Figura 17 apresenta OD de concentrações decrescentes de extratos a partir de vários antígenos de lentilha que expressam FMDV, como medidos por ELISA;

A	Figura 18 apresenta	mapa	do	plasmídeo	MerFOl	com
tabela	de resumo da função;
A	Figura 19 apresenta	mapa	do	plasmídeo	MerF02	com
tabela	de resumo da função;
A	Figura 20 apresenta	mapa	do	plasmídeo	MerF03	com
tabela	de resumo da função;
A	Figura 21 apresenta	mapa	do	plasmídeo	MerF04	com
tabela	de resumo da função;
A	Figura 22 apresenta	mapa	do	plasmídeo	MerF05	com

tabela de resumo da função;

A Figura FIG. 23 apresenta mapa do plasmídeo MerF06 com tabela de resumo da função.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Composições que compreendem um polipeptídeo de FMDV, antígeno, e fragmentos e suas variantes, que provocam uma resposta imunogênica num animal, são fornecidas na presente invenção. Os polipeptídeos antigênicos ou seus fragmentos ou as suas variantes são produzidos em uma planta ou em algas. Os polipeptídeos antigênicos ou seus fragmentos ou variantes podem ser formulados em vacinas ou composições farmacêuticas e utilizados para induzir ou estimular uma resposta protetora num animal. Numa modalidade, o antigeno é um polipeptideo Pl FMDV ou fragmento de polipeptideo ou 3C ativo ou um seu variante.

Reconhece-se que os polipeptideos antigênicos da presente invenção podem ser polipeptideos de comprimento completo ou fragmentos ativos ou as suas variantes. Por fragmentos ativos ou variantes ativas deve-se entender que os fragmentos ou variantes mantêm o caráter antigênico do polipeptideo. Assim, a presente invenção abrange qualquer polipeptideo, antigeno de epitopo ou imunógeno de FMDV que desperta uma resposta imunogênica num animal. O polipeptideo, antigeno epitopo ou imunógeno FMDV pode ser qualquer antigeno, polipeptideo ou epitopo imunogênico de FMDV, tal como, mas não limitado a, um seu peptideo, proteína ou fragmento ou variante, que provoca, induz ou estimula uma resposta de um animal, tal como um ovino, bovino, caprino ou suíno.

Polipeptideos antigênicos particulares incluem FMDV PI e 3C. FMDV é um virus sem envelope icosaédrico de aproximadamente 25 nm de diâmetro, contendo uma única molécula de RNA de cadeia simples que consiste de cerca de 8500 nucleotídeos, com uma polaridade positiva. Esta molécula de RNA compreende um único quadro de leitura aberta (ORF), que codifica uma única poliproteína que contém, inter alia, o precursor da capsideo também conhecido como proteína Pl ou P88. A proteína PI é miristilada na sua extremidade amino-terminal. Durante o processo de maturação, a proteína PI é clivada pela protease 3C em três proteínas conhecidas como VPO, VP1 e VP3 (ou ID, 1AB e 1C, respectivamente; Belsham GJ, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261 ) . No virion, a proteína VPO é depois clivado em duas proteínas, VP4 e VP2 (ou 1A e IB, respectivamente) . 0 mecanismo para a conversão das proteínas VPO em VP4 e VP2 e para a formação de virions maduros não é conhecido. As proteínas VP1, VP2 e VP3 têm um peso molecular de cerca de 26000 Da, enquanto que a proteína VP4 é menor em cerca de 8000 Da. Sequências de FMDV são também descritas nas patentes norte-americanas US 7,527,960 e US 7,531,182, documentos que são aqui incorporadas na sua totalidade.

A combinação simples de proteínas de capsideo ou protômero formam a molécula 5S, que é o constituinte primária do capsideo FMDV. Este protômero é então complexado a um pentâmero para formar a molécula de 12S. Os resultados de virions a partir da encapsidação de uma molécula de RNA genômico de montagem de 12 pentâmeros 12S, constituiem assim as partículas de 146S. O capsideo viral pode também ser formado, sem a presença de uma molécula de RNA dentro dele (daqui em diante capsideo vazio). O capsideo vazio é também designado como partículas 70S. A formação de capsídeos vazios pode ocorrer naturalmente durante a replicação viral ou estes podem ser produzidos artificialmente, por tratamento químico.

A presente invenção refere-se a espécies bovina, ovina, caprina ou porcinas, com vacinas ou composições em que se pode incluir uma quantidade eficaz de um antígeno de FMDV recombinante e um veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, excipiente ou carreador.

Em algumas formas de realização, as vacinas ainda compreendem adjuvantes, tais como as emulsões de óleo-emágua (O/A), descritas na Patente US 7,371,395.

Em ainda outras formas de realização, os adjuvantes incluem EMULSIGEN, hidróxido de alumínio, saponina e CpG ou combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, a resposta do animal é uma resposta imune protetora.

Por animal pretende-se englobar mamíferos, aves e semelhantes. O animal ou hospedeiro inclui mamíferos e humanos. O animal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de equinos (por exemplo, cavalo), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais), felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes felinos e outros felinos, incluindo leopardos e lince), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, o gado), suínos (por exemplo, porco), caprinos (por exemplo, cabra), aves (por exemplo, galinha, pato, ganso, peru, codornas, faisão, papagaio, tentilhões, falcão, corvo, avestruz, ema e casuar), primatas (por exemplo, prosimios, tarsieres, macaco gibão, macaco) e peixes. O termo animal também inclui um animal em todas as fases de desenvolvimento, incluindo estágios embrionários e fetais.

O termo plantas, como aqui utilizado, inclui ambas as plantas e vegetais dicotiledôneas (dicot) e monocotiledôneas (monocot). Plantas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas a, legumes e vegetais tais como alfalfa, ervilha, soja, cenoura, aipo, tomate, batata, tabaco, pimenta, colza, beterraba, couve, couve-flor, brócolis, alface, amendoim e semelhantes. Plantas monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas a, cereais, tais como trigo, cevada, sorgo, milho-miúdo, centeio, triticale, milho, arroz, aveia, cana de açúcar, membros da família de microalgas, gramíneas e semelhantes. O termo planta também inclui plantas sem floração, incluindo, mas não limitadas a, samambaias, cavalinhas, musgos, musgos hepáticos, antóceros, algas, por exemplo, algas vermelhas, marrom e verde, gametófitos e afins.

O termo algas ou alga, tal como aqui utilizado, inclui qualquer linhagem de algas, que sejam capazes de produzir um polipeptideo ou fragmento ou variante sua. As algas podem ser microalgas. As microalgas podem ser Thraustochytriaceae, por exemplo, Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides e Japonochytrium.

A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por um técnico no assunto ao qual pertence esta invenção. Os termos singulares a, um e o incluem referentes plurais a menos que contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra ou destina-se a incluir e a menos que o contexto indique claramente o contrário.

Note-se que no presente relatório descritivo e particularmente nas reivindicações e/ou anexos, os termos tais como compreende, composto, compreendendo e semelhantes podem ter o significado que lhe é atribuído na lei de Patentes norte-americana, por exemplo, eles podem significar incluir, inclui, incluindo e similares e em que os termos tais como consistindo essencialmente de e consiste essencialmente de têm o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes norte-americana, por exemplo,

elementos	que	permitem	a inclusão	de elementos	não
explicitamente	citados,	mas excluem	elementos que	se
encontram	no	estado da	técnica ou	que afetam	uma

característica básica ou nova da invenção.

Os polipeptidos antigênicos da presente invenção são capazes de proteger contra o FMDV. Isto é, eles são capazes de estimular uma resposta imune num animal. Por antígeno ou imunógeno designa-se uma substância que induz uma resposta imune específica de um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo, uma subunidade ou a parte de um organismo, um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas, uma parte ou um fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune contra a apresentação de um animal hospedeiro, um polipeptídeo, um epitopo, um hapteno ou qualquer combinação destes. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

O termo proteína imunogênica, polipeptídeo ou peptídeo, tal como aqui utilizado, inclui os polipeptídeos que são imunologicamente ativos no sentido de que, uma vez administrados ao hospedeiro, sejam capazes de evocar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular dirigida contra a proteína. De preferência, o fragmento de proteína é tal que tem substancialmente a mesma atividade imunológica como a proteína total. Assim, um fragmento de proteína de acordo com a presente invenção compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de pelo menos um epitopo ou determinante antigênico. Uma proteína ou um polipeptídeo imunogênico, tal como aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento completo da proteína, os seus análogos ou seus fragmentos imunogênicos. Por fragmento imunogênico entende-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epitopos e assim induz a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando-se qualquer das técnicas de mapeamento de epitopos bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por exemplo, os epitopos lineares podem ser determinados por, por exemplo, sintetizar-se concorrentemente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondentes a porções da molécula de proteína e de se reagir os peptídeos com os anticorpos, enquanto os peptídeos são ainda ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na arte e estão descritas em, e.g., Patente US No. 4,708,871; Geysen et al, 1984;. Geysen et al, 1986. Do mesmo modo, os epitopos conformacionais são prontamente identificados por determinação da conformação espacial de aminoácidos tais como, por exemplo, por cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Métodos especialmente aplicáveis a proteínas de T. parva são completamente descritos no documento PCT/US2004/022605 aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Como discutido, a invenção engloba fragmentos ativos e variantes do polipeptídeo antigênico. Assim, o termo proteína imunogênica, polipeptídeo ou peptídeo contempla ainda deleções, adições e substituições na sequência, desde que as funções do polipeptídeo para produzir uma resposta imunológica, tal como definido no presente documento, sejam mantidas. O termo variação conservadora denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar ou a substituição de um nucleotídeo numa sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificado não seja alterado ou o caso em que este é um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições especialmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa, i.e., aquelas substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos estão geralmente divididos em quatro famílias: (1) acídicos - aspartato e glutamato, (2) básicos - lisina, arginina, histidina, (3) não-polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) polares 5 não carregados - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são por vezes classificadas como aminoácidos aromáticos. Exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrófobo tal como isoleucina, 10 valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina e semelhantes ou uma substituição 15 conservadora semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado que não terá um efeito importante sobre a atividade biológica. Proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas possuindo pequenas 20 substituições de aminoácidos que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína se encontram, portanto, dentro da definição do polipeptideo de referência. Todos os polipeptidos produzidos por estas modificações estão aqui incluídos. O termo variação conservadora também inclui a utilização de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido não substituído de origem desde que anticorpos criados para o polipeptídeo substituído também imunorreajam com o polipeptídeo não substituído.

O termo epítopo refere-se ao local num antigeno ou hapteno ao qual as células B específicas e/ou células T respondem. O termo é também utilizado alternadamente com determinante antigênico ou local determinante antigênico. Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados num imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigeno alvo.

Uma resposta imunológica a uma composição ou vacina é o desenvolvimento, no hospedeiro, de uma resposta celular imune e/ou mediada por anticorpo a uma composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma resposta imunológica inclui mas não se limita a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares e/ou células T citotóxicas, dirigidas especificamente para um antigeno ou antígenos incluído na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro irá exibir uma resposta terapêutica ou imunológica protetora de tal modo que a resistência à infecção nova será aumentada e/ou a gravidade clínica da doença será reduzida. Essa proteção pode ser demonstrada por qualquer uma dentre redução ou falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou de uma concentração viral reduzida no hospedeiro infectado.

Antigenos sintéticos estão também incluídos no âmbito da definição, por exemplo, poliepitopos, epitopos flanqueadores e outros antigenos recombinantes ou derivados sinteticamente. Ver, por exemplo, Bergmann et al, 1993; Bergmann et al, 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al, 1998. Fragmentos imunogênicos, para os fins da presente invenção, incluem, normalmente, pelo menos cerca de 3 aminoácidos, pelo menos cerca de 5 aminoácidos, pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos ou cerca de 15 a 25 aminoácidos ou mais aminoácidos, por molécula. Não existe um limite superior crítico para o comprimento do fragmento, que pode compreender quase o comprimento total da sequência da proteína ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um epítopo da proteína.

Sendo assim, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo que expressa um epitopo é a que compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de, nucleotídeos que codificam para um determinante antigênico ou epítopo de um polipeptídeo de FMDV. Um polinucleotideo que codifica um fragmento de um polipeptídeo de FMDV pode compreender ou consistir essencialmente em ou consistir de, um mínimo de 15 nucleotídeos, cerca de 30 a 45 nucleotídeos, cerca de 45 a 75 ou pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos ou contíguos da sequência que codifica o polipeptídeo. Procedimentos de determinação de epitopo, tais como, geração de bibliotecas peptídicas sobrepostas (Hemmer et al, 1998.), Pepscan (Geysen et ai, 1984, Geysen et al, 1985; Van der Zee R. et al, 1989; Geysen, 1990, multipino RTM - Kits de síntese peptídica de Chiron) e algoritmos (De Groot et al, 1999; PCT/US2004/022605) podem ser usados na prática da presente invenção.

O termo ácido nucleico e o termo polinucleotideo refere-se a um RNA ou DNA, que é linear ou ramificado, de cadeia simples ou dupla ou um híbrido dos mesmos. O termo compreende igualmente um RNA/DNA de híbridos. Os seguintes itens são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um fragmento de gene ou gene, exons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotideo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotideos metilados e análogos de nucleotídeo, uracilas, açúcares e outros grupos de ligação tais como fluororibose e tiolato e ramificações de nucleotideos. A sequência de nucleotideos pode ser adicionalmente modificada após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações nesta definição são tampões, a substituição de um ou mais dos nucleotideos que ocorrem naturalmente com um análogo e a introdução de meios para ligar o polinucleotideo em 10 proteínas, os ions metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suporte sólido. Os polinucleotídeos podem ser obtidos por síntese química ou serem derivados de um microrganismo.

O termo gene é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotideo associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem introns e exons como na sequência genômica ou apenas as sequências de codificação, como no cDNA e/ou as sequências reguladoras necessárias para a sua expressão. Por exemplo, o gene 20 também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa o mRNA ou RNA funcional ou codifica para uma proteína específica e que inclui sequências reguladoras.

A invenção compreende ainda uma cadeia complementar a um polinucleotideo que codifica um antígeno FMDV ou epitopo imunogênico. A cadeia complementar pode ser polimérica e de qualquer comprimento e pode conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotideos e análogos, em qualquer combinação.

Os termos proteína, peptídeo, polipeptídeo e fragmento de polipeptídeo são aqui utilizados indiferentemente para se referir a polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, que pode compreender os aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos e que pode ser interrompido por outras porções químicas de aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção, , por exemplo, pela formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação com manipulação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra modificação ou, uma conjugação com um componente bioativo ou rotulagem.

Um componente de isolado biológico (tal como um ácido nucleico ou proteína ou organela) refere-se a um componente que tenha sido substancialmente separado ou purificado longe de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outros DNA cromossômicos e extra-cromossômicos e RNA, proteínas e organelas. Os ácidos nucleicos e proteínas que têm sido isolados, incluem os ácidos nucleicos e proteínas purificados por métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparadas por tecnologia recombinante, bem como por síntese química.

O termo purificado, como aqui utilizado, não requer uma pureza absoluta, mas sim, é concebido como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de polipeptídeo purificado é uma em que o polipeptídeo é mais enriquecido do que o polipeptídeo que está no seu ambiente natural ou em que o polipeptídeo é separado dos componentes celulares. Por substancialmente purificada deve-se entender que o polipeptídeo representa diversas formas de realização em que, pelo menos, 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% ou mais dos componentes celulares ou materiais tenham sido removidos. Do mesmo modo, o polipeptídeo pode ser parcialmente purificado. Por parcialmente purificado pretende-se que menos de 60% dos componentes celulares ou material sejam removidos. O mesmo aplica-se a polinucleotídeos. Os polipeptídeos aqui descritos podem ser purificados por qualquer dos meios conhecidos na arte.

Como notado acima, os polipeptídeos antigênicos ou seus fragmentos ou as suas variantes são polipeptídeos antigênicos FMDV que são produzidos em lentilha. Fragmentos e variantes dos polinucleotídeos e polipeptideos codificados divulgados assim também são abrangidos pela presente invenção. Por fragmento entende-se uma porção do polinucleotideo ou uma porção da sequência de aminoácido antigênico codificado desse modo. Fragmentos de um polinucleotideo podem codificar fragmentos proteicos que conservam a atividade biológica da proteína nativa e, consequentemente, têm uma atividade imunogênica tal como referida neste documento. Fragmentos da sequência de polipeptídeo retêm a capacidade de induzir uma resposta imune protetora num animal.

termo variantes pretende significar sequências substancialmente semelhantes. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais dentro do polinucleotideo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais em que o polinucleotideo de origem. Tal como aqui utilizado, um polinucleotideo nativo compreende um polipeptídeo ou sequência de nucleotídeos de ocorrência natural ou uma sequência de aminoácidos, respectivamente. As variantes de um polinucleotideo específico da presente invenção (isto é, o polinucleotideo de referência), podem também ser avaliadas pela comparação da percentagem de identidade de sequência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotideo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotideo de referência. 0 termo variante de proteínas, pretende significar uma proteína derivada da proteína nativa por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais em a proteína nativa. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, têm a capacidade de induzir uma resposta imune.

Em um aspecto, o presente invento proporciona polipeptídeos FMDV de ovinos, bovinos, caprinos ou suínos. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que possui uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29 e variantes ou um seu fragmento.

Além disso, os polipeptídeos homólogos de FMDV de ovinos, bovinos, caprinos ou suínos devem ser entendidos como dentro do âmbito da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo homólogos inclui ortólogos, análogos e parálogos. O termo análogos refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que têm a mesma função ou função semelhante, mas que tenham evoluído separadamente em organismos não relacionados. O termo ortólogos refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos provenientes de espécies diferentes, mas que tenham evoluído de um gene ancestral comum por especiação. Normalmente, ortólogos codificam polipeptídeos tendo as mesmas funções ou funções semelhantes. O termo parálogos refere-se a dois polinucleotídeos ou polipeptídeos que são relacionados por duplicação dentro de um genoma. Parálogos geralmente têm funções diferentes, mas essas funções podem ser relacionadas. Análogos, ortólogos, parálogos e unidades de polipeptídeo de um tipo selvagem FMDV podem diferir do polipeptídeo de tipo selvagem de FMDV por modificações póstraducionais, por diferenças de sequências de aminoácidos ou por ambas. Em particular, os homólogos do invento exibem, em geral, pelo menos, 80 a 85%, 85 a 90%, 90 a 95% ou 95%, 96%, 97%, 98%, de identidade de sequência de 99%, com a totalidade ou parte do FMDV do tipo selvagem ou sequências de polinucleotídeos e exibem uma função semelhante. As variantes incluem variantes alélicas. Uma variante alélica refere-se a um polinucleotideo ou um polipeptídeo que contém polimorfismos que conduzem a mudanças nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie ou variedade de vírus). Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em de 1 a 5% na variação de um polinucleotideo ou um polipeptídeo. As variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciação da sequência de ácido nucleico de interesse em várias espécies diferentes, que podem ser facilmente levadas a cabo por utilização de sondas de hibridação para identificar o mesmo locus genético nessas espécies. Qualquer e todas essas variações de ácido nucleico e de aminoácidos resultantes, polimorfismos ou variações que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse, devem ser entendidas como estando dentro do âmbito da invenção.

Tal como aqui utilizado, o termo derivado ou variante refere-se a um polipeptídeo ou a um ácido nucleico codificando um polipeptídeo, que tem uma ou mais variações de aminoácidos conservativas ou outras modificações menores, tais que: (1) o polipeptídeo correspondente tenha função substancialmente equivalente quando comparado com o polipeptídeo de tipo selvagem ou (2) um anticorpo criado . contra o polipeptídeo é imunorreativo com o polipeptídeo de tipo selvagem. Estas variantes ou derivados incluem polipeptídeos com pequenas modificações polipeptídicas de FMDV das principais sequências de aminoácidos que podem resultar em peptídeos que possuem atividade substancialmente equivalente em comparação com a contraparte não modificada do polipeptídeo. Tais modificações podem ser deliberadas, como por mutagênese dirigida ao local ou podem ser espontâneas. O termo variante contempla ainda deleções, adições e substituições para a sequência, desde que as funções de polipeptideo para produzir uma resposta imunológica sejam mantidas, tal como definido no presente documento.

Uma variação conservadora denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar ou a substituição de um nucleotídeo numa sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácidos codificado não é alterado ou é um outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, são especialmente preferidas substituições que são geralmente conservadoras em sua natureza, como descrito acima.

Os polinucleotídeos da presente invenção incluem sequências que são degeneradas como resultado do código genético, por exemplo, com o uso de códons otimizados para uma função específica. Como usado aqui, o termo otimizado refere-se a um polinucleotídeo que é geneticamente modificado para aumentar a sua expressão em uma dada espécie. Para proporcionar polinucleotídeos que codificam para polipeptideos otimizados FMDV, a sequência de DNA do gene da proteína do vírus da febre aftosa pode ser modificado para: 1) compreender os códons preferidos por genes altamente expressos de uma espécie em particular, 2) compreende um teor A + T ou G+ C em base nucleotidica da composição que substancialmente é o encontrado na referida espécie, 3) formar uma sequência de iniciação da referida espécie ou 4) eliminar as sequências que causam desestabilização, poliadenilação inadequada de degradação e cessação de RNA ou que formam ganchos de estrutura secundária ou sítios de splice de RNA. A expressão aumentada de FMDV proteína na referida espécie pode ser alcançada através da utilização da frequência de utilização de códons de distribuição em eucariotos e procariotos ou em uma espécie particular. A frequência de utilização de códons preferenciais refere-se à preferência exibida por uma célula hospedeira específica na utilização de códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um códon. Portanto, todas as sequências nucleotídicas degeneradas estão incluídas na presente invenção, desde que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado por FMDV na sequência de nucleotídeos esteja funcionalmente inalterada.

A identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos pode ser estabelecida pelos dados disponibilizados pelo

NCBI (National

Center for

Biotechnology Information) que são emparelhados com a matriz BLOSUM62, usando os parâmetros de referência (ver, por exemplo, o algoritmo BLAST ou BLASTX disponível no servidor do Centro National Center for Biotechnology Information” (NCBI, Bethesda, Maryland, EUA), bem como em Altschul et al, e, portanto, o presente documento se reporta ao uso do algoritmo BLAST ou o ou BLASTX e BLOSUM62 matriz pelo termo blasts”).

A identidade no que diz respeito a sequências pode referir-se ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos, dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências, em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinada de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman), por exemplo, utilizando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de cadeia de 4 nucleidos e uma restrição de lacuna de 4 e com auxílio de um computador para análise e interpretação dos dados de sequências, a inclusão do alinhamento pode ser convenientemente realizada utilizando-se programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Quando as sequências de RNA são referidas como sendo semelhantes ou possuindo um grau de identidade de sequência ou de homologia com as sequências de DNA, a timidina (T) na sequência de DNA que é considerada igual a uma uracila (U) na sequência de RNA. Assim, as sequências de RNA estão dentro do âmbito da invenção e podem ser derivadas a partir de sequências de DNA, por timidina (T) na sequência de DNA sendo considerada igual a uma uracila (U), em sequências de RNA.

A similaridade de sequência ou sequência de identidade de duas sequências de aminoácidos ou a identidade de sequências entre duas sequências de nucleotideos pode ser determinada usando-se o pacote de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Os documentos a seguir fornecem algoritmos para comparar a identidade ou homologia relativa de sequências e adicionalmente ou em alternativa, com respeito ao anteriormente mencionado, os ensinamentos nestas referências podem ser usados para a determinação de homologia ou percentagem de identidade: Needleman SB e Wunsch CD, Smith TF e Waterman MS; Smith TF, Waterman MS e Sadler JR; Feng DF e Dolittle RF, Higgins DG e Sharp PM, Thompson JD, Higgins DG e Gibson TJ e Devereux J, P e Smithies Haeberlie O. E, sem experimentação indevida, o técnico no assunto pode consultar muitos outros programas ou referências para determinação de porcentagem de homologia.

As reações de hibridação podem ser realizadas sob condições de diferentes de rigor. Condições de rigor que causam o aumento de uma reação de hibridização são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al, 1989).

invento abrange ainda os polinucleotideos FMDV contidos numa molécula de vetor ou de um vetor de expressão e operacionalmente ligado a um elemento promotor e, opcionalmente, de um intensificador.

Um vetor refere-se a um DNA recombinante ou RNA de plasmideo ou vírus que compreende um polinucleotídeo heterólogo para ser entregue a uma célula alvo, quer in vitro quer in vivo. O polinucleotídeo heterólogo pode incluir uma sequência de interesse para fins de prevenção ou terapia e pode opcionalmente estar sob a forma de um cassete de expressão. Como aqui utilizado, um vetor não precisa ser capaz de replicação na célula-alvo final ou sujeito. O termo inclui vetores de clonagem e vetores virais.

termo recombinante designa um polinucleotídeo semi-sintético ou sintético que ou não ocorre na natureza ou está ligado a um outro polinucleotídeo num arranjo não encontrado na natureza.

O termo heterólogo significa um derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade à qual está sendo comparado. Por exemplo, um polinucleotideo pode ser colocado por meio de técnicas de engenharia genética num plasmideo ou vetor derivado de uma fonte diferente e é um polinucleotideo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo.

A presente invenção refere-se a vacinas ou composições farmacêuticas ou imunológicas para ovinos, bovinos, caprinos e suínos que podem compreender uma quantidade eficaz de um antígenos recombinantes FMDV e um transportador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, excipiente ou veículo.

assunto descrito neste documento está dirigido, em parte, para composições e métodos relacionados com o antígerio de FMDV preparados numa unidade ou sistema de expressão de alga para animais que é altamente imunogênica e que protege os mesmos contra linhagens FMDV homólogas e heterólogas.

Composições

A presente invenção refere-se a uma vacina contra o vírus da febre aftosa ou a uma composição que pode compreender uma quantidade eficaz de um antígeno de FMDV recombinante e um veículo, um excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Numa modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa recombinante é expresso numa planta ou alga.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a uma composição que compreende um antigeno de FMDV produzido por um sistema de expressão de lentilha de água e material de planta de lentilha de água, incluindo o gênero Lemna e um transportador, excipiente ou veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável. Numa outra forma de realização, a matéria aqui descrita é dirigida a uma proteína opcionalmente glicosilada produzida por um sistema de expressão que compreende um antigeno de lentilha FMDV.

Numa modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa recombinante é expresso em algas. Ainda numa outra modalidade, as algas são selecionadas a partir de Schizochytrium. Numa modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa recombinante pode ser expresso num sistema de expressão de proteína Schizochytrium, conforme descrito, por exemplo, nos documentos de patente norte-americanos US 7,001,772, US 2008/0022422, US N° 61/160,618 e nos pedidos de patente provisionais norte-americanos simultaneamente depositados em 28 de dezembro de 200 9 por Martek Corp

BioScience (MD, EUA).

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada dirige-se a uma proteína produzida por um sistema de expressão de plantas ou algas que compreende um antígeno de FMDV e material da planta ou alga.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a uma vacina ou composição que compreende um antígeno de FMDV produzido por um sistema de expressão de lentilha.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a uma vacina ou composição que compreende um antígeno de FMDV produzido por um sistema de expressão de lentilha de água e material de planta de lentilha.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada dirige-se a uma planta estavelmente transformada ou cultura de plantas que expressam um antígeno de FMDV em que a planta ou cultura vegetal é selecionada a partir de lentilha.

A presente invenção engloba qualquer polipeptídeo FMDV, antígeno de epitopo ou imunógeno que desperta uma resposta imunogênica num animal, tal como um ovino, bovinos, caprinos ou suínos. 0 polipeptídeo FMDV, antígeno epitopo ou imunógeno pode ser qualquer antígeno de FMDV, polipeptídeo ou epitopo imunogênico, tal como, mas não limitado a, um seu peptideo, proteína ou fragmento, que provoca, induz ou estimula uma resposta em um animal, tal como ovinos, bovinos, caprinos ou suínos.

Numa forma de realização em que a composição imunológica ou vacina FMDV é uma composição de vacina recombinante ou imunológica, a composição ou vacina compreendendo um vetor recombinante e um excipiente, transportador ou veículo farmacêutico ou veterinário aceitável, em que o vetor recombinante é vetor de expressão de plantas que pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, antigeno, epítopo ou imunógeno. O antigeno de FMDV, polipeptídeo ou epítopo imunogênico, pode ser VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, NS1, VP7, NS2, VP6, NS3, NS3a, Pl, VPO, 3C ou qualquer seu fragmento.

Numa outra modalidade, o antigeno é FMDV Pl, VPO, VP3,

VP1, VP2, VP4, 2A,	2B	ou 3C.
Numa forma	de	realização	em que a	composição
imunológica FMDV	ou	vacina é uma	composição	de	vacina
recombinante ou	imunológica, a	composição	ou	vacina

compreende um vetor recombinante e um excipiente, transportador ou veículo farmacêutico ou veterinário aceitável, o vetor recombinante é um vetor de expressão de plantas que pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de FMDV, antigeno, epítopo ou imunógeno. O antigeno de FMDV, polipeptideo ou epitopo imunogênico, pode ser um polipeptideo de FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B ou 3C. Numa modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais antigeno do vírus da febre aftosa (FMDV) é um cDNA que codifica a região de FMDV Pl e um cDNA que codifica a protease 3C de FMDV.

Numa modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa pode ser um polipeptideo P1-3C. Numa outra modalidade, o antigeno pode ser FMDV PI sozinho ou P1-2A/2B1. Em ainda outra modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa pode ser VP0-VP3. Numa outra modalidade, o antigeno pode ser FMDV VP4-VP2. Em ainda outra modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa pode ser 3C ou pode ser 3C com uma 5’UTR otimizada para expressão na lentilha. Numa forma de realização, ambos os polipeptideos P1-2A/2B1 e 3C podem ser expressos em lentilha utilizando uma construção simples e a

expressão	pode	ser regulada	por uma	ou	mais dentre
sequências	de promotor.
Numa	outra	modalidade, o	antigeno	pode	ser FMDV 01
Manisa, 01	BFS	or Campos, A24	Cruzeiro,	Asia	1 Shamir, A

Iran'96, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

A presente invenção refere-se a uma vacina contra o vírus da febre aftosa, que pode compreender uma quantidade eficaz de um antigeno de FMDV recombinante e um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Numa modalidade, o antigeno do virus da febre aftosa pode ser FMDV Pl, VPO, VP3, VP1, VP2, VP4 ou 3C.

Numa outra modalidade, o antigeno recombinante FMDV é expresso em uma planta ou alga. Em ainda outra modalidade, a planta é uma planta de lentilha de água, incluindo uma unidade de Lemna. Em ainda outra modalidade, a planta é Lemna minor. Numa modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa recombinante pode ser expresso em uma propriedade de sistema de expressão de proteína de Lemna minor, vantajosamente sistema SM Biolex de LEX. Numa outra forma de realização, as algas são selecionadas a partir de Schizochytrium. Numa modalidade, o antigeno do vírus da febre aftosa recombinante pode ser expresso num sistema de expressão de proteína Schizochytrium, conforme descrito, por exemplo, nos documentos de patente US 7,001,772, US 2008/0022422 Al e US 2010/0233760, de titularidade de Martek Corp BioScience (MD, EUA).

Numa outra forma de realização, o transportador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma emulsão de água-em-óleo. Em ainda outra modalidade, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão de óleo-em-água.

O invento abrange ainda os polinucleotideos FMDV contidas numa molécula de vetor ou de um vetor de expressão e operacionalmente ligado a um elemento promotor e, opcionalmente, de um intensificador.

Em um aspecto, o presente invento proporciona polipeptideos de FMDV, particularmente bovinos, ovinos, caprinos ou suínos, os polipeptideos possuindo uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 3 e variantes ou seus fragmentos.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que possui pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou uma identidade de sequência de 99% a um polipeptídeo antigênico do presente invento, particularmente para os polipeptideos possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona fragmentos e variantes dos polipeptideos FMDV identificados acima (SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29), que podem ser prontamente preparados por um técnico no assunto utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular.

As variantes são polipeptideos homólogos possuindo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29.

Um fragmento imunogênico de um polipeptídeo FMDV inclui, pelo menos, 8, 10, 15 ou 20 aminoácidos consecutivos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos ou pelo menos 30 aminoácidos de um polipeptídeo de FMDV tendo uma sequência como descrita nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29 ou suas variantes. Numa outra forma de realização, um fragmento de um polipeptídeo FMDV inclui um epítopo antigênico específico encontrado em um polipeptídeo FMDV de comprimento completo.

Num outro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo de FMDV, tal como um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29. Em ainda outro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29 ou uma variante conservadora, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de um destes polipeptideos ou uma combinação destes polipeptideos.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotideo possuindo uma sequência de nucleotideos como apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 30 a 35 ou uma sua variante. Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um polinucleotideo possuindo pelo menos 70%,

pelo menos 75%,	pelo menos 80%, pelo menos	85%, pelo menos
90%, pelo menos	95%,	pelo menos 95%,	96%,	97%,	98% ou 99%
de identidade	de sequência com um	dos	polinucleotídeos

possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 30 a 35 ou uma sua variante.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências de codificação adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, controlando os elementos tais como promotores, locais de ligação ao ribossomo, 5'UTR, 3'UTR, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob controle das mesmas ou de um promotor diferente, sequências que permitem a expressão de clonagem, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira e qualquer construção, como pode ser desejável de se apresentar nas formas de realização da presente invenção.

Elementos para a expressão de um antigeno de FMDV, polipeptídeo ou epitopo imunogênico são vantajosamente presentes num vetor inventivo. Na forma mínima, esta compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de um códon de iniciação (ATG) , um códon de terminação e um promotor e, opcionalmente, também uma sequência de poliadenilação para determinados vetores, tais como plasmídeos e vetores virais determinados, por exemplo, outros vetores virais de poxvirus. Quando o polinucleotideo codifica um fragmento da poliproteína, e.g. um peptídeo de vírus da febre aftosa, vantajosamente, no vetor, um ATG é colocado em 5' do quadro de leitura e um códon de terminação é colocado em 3'. Outros elementos para a expressão de controle podem estar presentes, tais como sequências potenciadoras e sequências de estabilização, tais como introns e sequências sinal que permitem a secreção da proteína.

A presente invenção também se refere a preparações que compreendem vetores, tais como vetores de expressão, por exemplo, composições terapêuticas. As preparações podem compreender um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, tais como vetores de expressão in vivo, compreendendo e expressando um ou mais polipeptídeos de FMDV, antígenos, epitopos ou imunógenos. Numa forma de realização, o vetor contém e expressa um polinucleotídeo que compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de um polinucleotídeo que codifica para (e vantajosamente expressa) um antígeno de FMDV ou epitopo imunogênico e um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Assim, de acordo com uma modalidade da invenção, o vetor ou outros vetores da preparação compreendem ou consistem essencialmente em ou consistem de um polinucleotídeo que codifica para e em certas circunstâncias o vetor expressa, uma ou mais proteínas de um antígeno de FMDV, polipeptídeo, epitopo ou imunógeno ou um seu fragmento.

De acordo com outra modalidade, o vetor ou vetores na preparação incluem ou consistem essencialmente de ou consistem de um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas ou seus fragmentos que são os mesmos de um antígeno de FMDV, polipeptídeo ou epitopo imunogênico, seu vetor ou vetores de expressão do polinucleotídeo. Numa outra forma de realização, a preparação compreende um, dois ou mais vetores que compreendem os polinucleotideos que codificam e expressam, vantajosamente, in vivo, um polipeptideo de FMDV, antigeno de proteínas de fusão ou um seu epitopo. A invenção é também dirigida a misturas de vetores que compreendem os polinucleotideos que codificam e expressam polipeptídeos diferentes de FMDV, antígenos, epitopos ou imunógenos, por exemplo, um polipeptideo FMDV, epitopos do antigeno ou imunógeno a partir de diferentes espécies animais, tais como, mas não limitadas a, ovinos, bovinos, caprinos ou suínos.

De acordo com ainda outra forma de realização da presente invenção, o vetor de expressão é um vetor plasmídico ou um vetor de DNA plasmídico, em particular um vetor de expressão in vivo. Em específico, como um exemplo não limitativo, o pVR1020 ou plasmídeo 1012 (Vical Inc., Lucas et al, 1997, Hartikka et al, 1996, ver, e.g., Patentes N°s US 5,846,946 e US 6,451,769) pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotídeo. O plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a sequência de sinal de tPA humana. Numa modalidade, o sinal de tPA humano compreende do aminoácidos Μ (1) ao aminoácido S(23) apresentados no Genbank com o número de acesso HUMTPA14. Em outro exemplo específico e não limitative, o plasmideo utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotídeo pode conter a sequência de peptídeo de sinal de equino IGF1 a partir do aminoácido M(24) até o aminoácido A(48) apresentados no Genbank com o número de acesso U28070. Informações adicionais sobre os plasmídeos de DNA que podem ser consultados ou utilizados na prática são encontrados, por exemplo, nos documentos de patente norte-americanos N^os US 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 e 6,221,362.

O plasmideo abrange qualquer unidade de transcrição de DNA que compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo numa célula ou células do hospedeiro desejado ou alvo, e, a este respeito, deve se notar que um plasmideo circular superenrolado ou não-superenrolado, assim como uma forma linear, devem ser. entendidos como dentro do âmbito da invenção.

Cada plasmideo compreende ou contém ou consiste essencialmente de, além do polinucleotídeo codificando um antigeno de FMDV, um epitopo imunogênico opcionalmente fundido com uma sequência de peptídeo heteróloga, variante, análoga ou fragmento operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor.

Em geral, é vantajoso se empregar um promotor funcional forte em células eucarióticas. O promotor forte pode ser, mas não se limita a, o promotor precoce imediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origem humana ou murina ou, opcionalmente, o promotor Super tendo uma outra origem tal como rato ou cobaia, (Ni, M. et al, Plant J. 7, 661-676, 1995). O promotor de CMV-IE pode compreender a parte real do promotor, o que pode ou não estar associado com a parte de potenciador. Pode ser feita referência aos documentos de patente EP-A-260 148, EP-A-323 597, N°s US 5,168,062, 5, 385,839 e 4,968,615, bem como ao pedido PCT No W087/03905. O promotor de CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart et al., 1985) ou CMV-IE de murideo.

Em termos mais gerais, o promotor tem uma origem ou viral ou de planta ou uma origem celular. Um promotor forte viral diferente de CMV-IE, que pode ser utilmente utilizado na prática da presente invenção, é o promotor precoce / tardio do virus SV40 ou o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous. Um promotor forte celular que pode ser utilmente utilizado na prática da presente invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como por exemplo, o promotor da desmina (Kwissa et al, 2000) ou o promotor da actina (Miyazaki et al, 1989).

Qualquer um dos promotores constitutivo, regulável ou estímulo-dependente pode ser utilizado. Por exemplo, promotores constitutivos podem incluir o promotor sintase manopina de Agrobacterium tumefaciens. Alternativamente, pode ser vantajoso se utilizar os promotores de genes de choque térmico, promotores indutiveis seca-genes, promotores indutiveis patógeno-genes, promotores induziveis por ferida de genes e os promotores induziveis de luz/escuro de genes. Pode ser útil utilizar os promotores que são controlados por reguladores de crescimento de plantas, tais como o ácido abscissico, auxinas, citocininas e ácido giberélico. Os promotores podem também ser escolhidos de modo que proporcionem uma expressão específica de tecido (por exemplo, promotores específicos de raiz, folha e florais).

Os plasmídeos podem compreender outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar uma sequência estabilizante, por exemplo, um intron de sequência, por exemplo, desidrogenase de introns de milho ou álcool (Callis et al, Genes & Dev.l (10) :11831200, Dez. 1987), o primeiro intron de hCMV-IE (Pedido PCT No. W01989/01036), o intron II da globina de coelho com gene p-(van Ooyen et al., 1979). Numa outra forma de realização, os plasmídeos podem conter 3'UTR. A UTR 3' pode ser, mas não se limita a, Agrobacterium nopalina sintase (NOS) 3'UTR (nopalina sintase: mapeamento de transcrição e a sequência de DNA em Depicker, A. et al, J. Mol Appl Genet, 1982; Bevan , NAR, 1984, 12 (22): 8711-8721).

Como ocorre com um sinal de poliadenilação (poli A) , para os plasmideos e vetores virais de diferentes poxvirus, a utilização adicional do poli (A) do gene de sinal do hormônio de crescimento bovino (bGH) pode ser feita (ver US 5, 122, 458) ou de poli (A) de sinal do gene de coelho βglobina ou o poli (sinal A) do vírus SV40.

Uma célula hospedeira designa uma célula procariótica ou eucariótica que foi geneticamente modificada ou é capaz de ser geneticamente alterada pela administração de um polinucleotideo exógeno, tal como um plasmídeo recombinante ou vetor. Ao referir-se a células geneticamente modificadas, o termo refere-se tanto a uma célula originalmente alterada quanto a uma progenia da mesma.

Numa modalidade, o antígeno do vírus da febre aftosa recombinante é expresso numa planta transgênica ou alga. Numa outra forma de realização, a planta transgênica é uma planta de Lemna. Em ainda outra modalidade, a planta transgênica é Lemna minor (lentilha). Em ainda outra modalidade, o antígeno do vírus da febre aftosa recombinante pode ser expresso no sistema de expressão de

Lemna minor (lentilha), com o sistema de proteína system LEX de Biolex^SM. Detalhes do sistema de expressão de Lemna minor (lentilha) para proteína podem ser encontrados, por exemplo, nos documentos de patente norte-americanos US N°s 6,815,184, 7,022,309, 7,160,717, 7,176,024, 6,040,498 e 7,161,064, cujas descrições são incorporadas por referência na sua totalidade. Em ainda outra modalidade, a alga transgênica é Schizochytrium. Detalhes do sistema de expressão da proteína de algas podem ser encontrados, por exemplo, nos documentos de patente norte-americanos US N°s 7,001,772, US 2008/0022422 ou US 61/160,618, cujas descrições são incorporadas por referência na sua totalidade. 0 antigeno de FMDV nos modos de realização pode ser qualquer polipeptídeo aqui divulgado ou um polipeptídeo codificado por qualquer polinucleotideo aqui descrito.

Métodos para expressar polipeptídeos FMDV em lentilha d'água ou microalgas

Em algumas formas de realização da invenção, os polipeptídeos antigênicos FMDV ou fragmentos ou variantes dos mesmos, são expressos em lentilha ou microalgas. Estes métodos compreendem o uso de cassetes de expressão que são introduzidos em uma planta de lentilha ou microalga utilizando qualquer método de transformação adequado conhecido na arte. Polinucleotídeos dentro destes cassetes de expressão podem ser modificados para a expressão melhorada do polipeptídeo FMDV antigênico ou fragmento ou variante do mesmo, na lentilha ou na microalga, como se segue.

Cassetes para expressão de polipeptídeos FMDV antigênicos em lentilha d'água ou microalgas

A lentilha transgênica ou uma microalga antigênica que expressa o polipeptídeo FMDV ou fragmento ou variante do mesmo, é obtida através da transformação da lentilha ou da microalga com um cassete de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo. Desta maneira, um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo antigênico FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo, é construído dentro de um cassete de expressão e introduzido numa planta ou cultura de lentilha ou microalga por qualquer método de transformação adequado conhecido na arte.

Em algumas formas de realização, a planta de lentilha ou microalga que é transformada com um cassete de expressão compreendendo o polinucleotideo que codifica o polipeptídeo antigênico FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo, foi também transformada com um cassete de expressão que proporciona a expressão de um outro polipeptídeo heterólogo de interesse, por exemplo, um outro fragmento antigênico FMDV, polipeptideo ou seu variante. O cassete de expressão para a expressão proporciona um outro polipeptideo heterólogo de interesse e pode ser fornecido no mesmo polinucleotideo (por exemplo, no mesmo vetor de transformação) para introdução numa planta de lentilha ou microalga ou num polinucleotideo diferente (por exemplo, em vetores de transformação diferentes) para utilização na planta de lentilha ou microalga ao mesmo tempo ou em tempos diferentes, pelo mesmo método ou por diferentes métodos de introdução, por exemplo, pelos métodos de transformação iguais ou diferentes.

Os cassetes de expressão para utilização na transformação de lentilha ou de microalga compreendem elementos de controle da expressão que compreendem pelo menos uma região de iniciação da transcrição (por exemplo, um promotor) operacionalmente ligado ao polinucleotideo de interesse ou seja, um polinucleotideo que codifica um polipeptideo antigênico FMDV, fragmento ou sua variante. O termo ligado operativamente, como aqui utilizado com referência a sequências de nucleotideos, refere-se a várias sequências de nucleotideos que são colocadas numa relação funcional umas com as outras. Geralmente, as sequências de DNA operativamente ligadas são contíguas e, quando necessário, unem duas regiões codificantes de proteínas no quadro de leitura. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção do polinucleotideo ou polinucleotídeos de interesse (por exemplo, um polinucleotideo de interesse, dois polinucleotídeos de interesse, etc) estando sob a regulação transcricional do promotor e de outros elementos de controle de expressão. Em formas de realização particulares da presente invenção, o polinucleotideo a ser transferido contém dois ou mais cassetes de expressão, cada um dos quais contém pelo menos um polinucleotideo de interesse.

Por elemento de controle de expressão entende-se uma região de regulação de DNA, normalmente constituída por uma caixa TATA, capaz de dirigir a RNA polimerase II ou, em algumas formas de realização, a RNA polimerase III, para iniciar a síntese de RNA no local apropriado para a iniciação de transcrição de codificação de sequência especifica. Um elemento de controle de expressão pode compreender adicionalmente outras sequências de reconhecimento geralmente posicionadas antes ou próxima de 5' da caixa TATA, que influenciam (por exemplo, aumentam) a taxa de iniciação da transcrição. Além disso, um elemento de controle de expressão pode compreender adicionalmente sequências posteriores, geralmente posicionadas perto de 3' com relação para à caixa TATA, que influenciam (por exemplo, aumentam) a taxa de iniciação da transcrição.

A região de iniciação da transcrição (por exemplo, um promotor) pode ser nativa ou homóloga ou estranha ou heteróloga para o hospedeiro de lentilha ou microalga ou pode ser a sequência natural ou uma sequência sintética. Por estranho, deve ser entendido que a região de iniciação da transcrição não é encontrada na lentilha de tipo selvagem ou na microalga em que a região de iniciação da transcrição é introduzida. Por promotor funcional deve ser entendido um promotor que, quando ligado operativamente a uma sequência que codifica um polipeptídeo antigênico FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo, é capaz de dirigir a expressão (isto é, transcrição e tradução) do fragmento codificado, polipeptídeo ou variante. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Assim, òs cassetes de expressão da presente invenção podem compreender promotores constitutivos, indutiveis, tecido-preferenciais ou outros, para a expressão em lentilha.

Qualquer promotor adequado conhecido na técnica pode ser utilizado nos cassetes de expressão de acordo com a presente invenção, incluindo leveduras, bactérias, fungos, insetos, mamíferos e os promotores de plantas. Por exemplo, os promotores de plantas, incluindo promotores de lentilha ou microalga, podem ser utilizados. Os exemplos de promotores incluem, mas não estão limitados a, promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S, promotores da sintetase opina (por exemplo, n, MAS, OCS, etc) , promotor da ubiquitina, promotor de actina, promotor da subunidade pequena de ribulose bisfosfato (RuBP) carboxilase e o promotor de álcool desidrogenase. O promotor da subunidade pequena de lentilha RuBP carboxilase é conhecido na arte (Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. Biol. 15:49). Outros promotores de vírus que infectam as plantas ou de microalgas são também adequados, incluindo, mas não se limitando a, promotores isolados a partir do vírus do mosaico Dasheen, vírus Chlorella (por exemplo, o promotor do vírus Chlorella adenina metiltransferase, Mitra et al (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), vírus de spotted wilt tomate, virus do tabaco, vírus da necrose do tabaco, vírus da mancha anel de tabaco, vírus da mancha anel de tomate, vírus do mosaico de pepino, vírus coto de amendoim, vírus do mosaico da alfafa, Badnavirus de cana baciliforme e similares.

Elementos de controle da expressão, incluindo promotores, podem ser escolhidos para se obter um nível desejado de regulação. Por exemplo, em alguns casos, pode ser vantajoso utilizar um promotor, que confere expressão constitutiva (por exemplo, o promotor de manopina sintase de Agrobacterium tumefaciens). Alternativamente, em outras situações, pode ser vantajosa a utilização de promotores que são ativados em resposta a determinados estímulos ambientais (por exemplo, os promotores de genes de choque térmico, promotores indutíveis de genes de seca, promotores indutíveis de genes de patógeno, promotores induzíveis por de genes ferida leves/indutíveis de escuro) ou promotores de genes reguladores do crescimento de plantas (por exemplo, os promotores dos genes induzidos por ácido abscíssico, auxinas, citocininas e ácido giberélico). Como uma alternativa adicional, os promotores podem ser escolhidos dentre os que dão expressão específica de tecido (por exemplo, promotores específicos de raiz, folha e floral).

A resistência global de um dado promotor pode ser influenciada pela combinação e organização espacial de atuação cis de sequências nucleotídicas tais como as sequências ativadoras anteriorese. Por exemplo, a ativação de sequências de nucleotideos derivadas do gene da sintetase de Agrobacterium tumefaciens octopina pode aumentar a transcrição a partir do promotor da sintase de Agrobacterium tumefaciens manopina (ver Patente US

5,955,646, de Gelvin et al.). Na presente invenção, o cassete de expressão pode conter as sequências de nucleotideos inseridas de ativação anteriores da sequência do promotor para aumentar a expressão do polipeptideo antigênico FMDV de interesse ou um seu fragmento ou variante. Numa forma de realização, o cassete de expressão compreende três sequências de ativação anteriores derivadas do gene da sintetase de Agrobacterium tumefaciens octopina operativamente ligado a um promotor derivado de um gene de sintase de Agrobacterium tumefaciens manopina (ver Patente US 5,955,646, aqui incorporada por referência).

O cassete de expressão inclui, assim, na direcção 5’3' da transcrição, um elemento de controle de expressão que compreende uma região de iniciação da transcrição e tradução, de um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo antigênico FMDV de interesse (ou um seu fragmento ou variante) e uma transcrição e região de terminação da tradução funcional em plantas. Qualquer sequência de terminação adequada conhecida na arte pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser natural com a sequência de codificação de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como a sintetase de octopina e regiões de terminação nopalina sintetase. Ver também Guerineau et al (1991) Mol. Genet. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Develop. 5:141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261; Munroe et al. (1990) Gene 91:151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. Sequências de terminação adicionais exemplares são a sequência de terminação da subunidade pequena da couve-flor de ervilha RuBP carboxilase e o vírus do mosaico com sequência de terminação 35S.

Geralmente, o cassete de expressão irá compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas ou tecidos de lentilha. Os genes marcadores selecionáveis incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como os que codificam a neomicinafos.fotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Genes de resistência a herbicidas codificam para uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes que ele possa agir. Ver Deblock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; Deblock et al (1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:833;

Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603. Por exemplo, as resistências ao glifosato ou herbicidas de sulfonilureia foram obtidas usando-se genes que codificam para as enzimas alvo mutantes, 5-enolpiruvilshiquimato-3 fosfato-sintase (EPSPS) e acetolactato sintase (ALS). A resistência ao glufosinato de amônio, boromoxinil e 2,4 diclorofenoxiacetato-(2,4-D) , foi obtida através de genes bacterianos que codificam para a fosfinotricinaacetiltransferase, uma nitrilase ou uma mono-oxigenase 2,4 diclorofenoxiacetato, que as desintoxicam dos respectivos herbicidas.

Para os fins da presente invenção, genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam para a neomicina-fosfotransferase II (Fraley et al (1986) CRC Critical Comm, on Plant Science 4:01.); Cianamida hidratase (Maier-Greiner et al (1991) Proc Natl Acad Sei EUA 88:4250); aspartato quinase; dihidrodipicolinato sintase (Perl et al (1993.) BioTechnology 11:715); gene bar (Toki et al (1992.) Plant Physiol. 100:1503;. Meagher et al (1996) Crop Sci. 36:1367);. triptofano decarboxilase (Goddijn et al (1993.) Plant Mol. Biol Biol 22:907), neomicina-fosfotransferase (NEO;. Southern et al (1982) J. Mol. Appl Gen. 1:327); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG; Célula Shimizu et al (1986) Mol Biol 6:1074), diidrofolato redutase (DHFR,. Kwok et al (1986) Proc Natl Acad Sci EUA 83:4552); fosfinotricina-acetiltransferase (Deblock et al (1987) EMBO

J. 6:2513); dehalogenase de ácido 2,2-dicloropropiônico (Buchanan-Wollatron et al (1989). J. Cell Biochem 13E: 330); acetohidroxiácido sintase (Patente US No. 4.761.373 por Anderson et ai; Haughn et al (1988) Mol. Gen. Genet 221:266); 5-enolpiruvil-chiquimato-fosfato sintase (aroA; Comai et al (1985) Nature 317:741.); haloarilnitrilase (WO

87/04181, de Stalker et al.), acetil-coenzima A carboxilase (Parker et al (1990) Plant Physiol 92:1220 );

dihidropteroato sintase (Suli; Guerineau et al (1990) Mol Biol 15:127 planta) e polipeptideo de 32 kDa fotossistema II (psbA, Hirschberg et al (1983) Science 222:1346 (1983).

Também estão incluídos os genes que codificam para resistência a: gentamicina (por exemplo, aacCl, Wohlleben et al (1989) Mol. Gen. Genet 217:202-208); Cloranfenicol (Herrera-Estrella et al (1983) EMBO J. 2.: 987), metotrexato (Herrera-Estrella et al (1983.), Nature 303:209

Meijer et al (1991) Plant Mol. Biol Biol 16:807); higromicina (Waldron et al (1985.) Plant Mol. Biol Biol. 5:103;. Zhijian et al (1995) Plant Science 108:219, Meijer et al (1991) Plant Mol. Biol 16:807 Bio), estreptomicina (. Jones et al (1987) Mol. Gen. Genet 210:86); espectinomicina

(Bretagne-Sagnard et	al	(1996)	Transgenic	Res.	5:131);
bleomicina	(Hille et	al	(1986)	Plant Mol	Biol	7:171);
sulfonamida	(Guerineau	et al (1990	) Plant Mol.	Bio	15:127);
bromoxinil	(Stalker et	al	(1988)	Science 242:419)	; 2,4-D

(Streber et al (1989) BioTechnology 7:811), fosfinotricina (desbloqueante et al (1987) EMBO J. 6:2513); espectinomicina (Bretagne-Sagnard e Chupeau, Transgenic Research 5:131).

gene bar confere resistência ao herbicida de tipo 10 glufosinato, como os herbicidas tais como fosfinotricina (PPT) ou bialafos e semelhantes. Como mencionado acima, outros marcadores selecionáveis que podem ser utilizados nas construções de vetores incluem, mas não estão limitadas a, o gene pat, também por bialafos e resistência à 15 fosfinotricina, o gene ALS para resistência à imidazolinona, o gene HPH ou HYG para resistência à higromicina, o gene EPSP sintase para a resistência ao glifosato, o gene HM1 para resistência à Hc-toxina e outros agentes seletivos utilizados de forma rotineira e conhecida 20 de um técnico no assunto. Ver Yarranton (1992) Curr. Opin.

Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63;

Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555;

Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol.. E estruturas. Biol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913; Hlávka et al. (1985) Handbook of

Experimental Pharmacology 78 e Gill et al. (1988) Nature 334:721. Tais divulgações são aqui incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitativa. Qualquer gene marcador 20 selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

Modificação de sequências de nucleotídeos de maior expressão em uma planta hospedeira ou microalga

Nos casos em que o polipeptídeo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo é expresso dentro de lentilha ou microalga, a sequência polinucleotidica que codifica o FMDV e expressa o polipeptídeo ou fragmento ou variante deste pode ser modificada para aumentar a sua expressão na lentilha ou microalga, respectivamente. Uma tal modificação é a síntese do polinucleotideo utilizando códons preferidos de plantas, em particular, os códons de lentilha-preferenciais ou usando códons de microalga preferenciais, tais como códons preferenciais de Schizochytrium. Métodos disponíveis na arte para a síntese de sequências de nucleotídeos com a de plantas preferidas códons. Ver, eg, Patentes US N°s US 5,380,831 e 5,436,391, EP 0 359 472, EP 0 385 962, WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 15:3324; lannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. Biol. 34:485 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477, todos os quais aqui incorporados por referência. A síntese pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido para um perito na arte. Os códons preferenciais podem ser determinados a partir dos códons de mais alta frequência nas proteínas expressas na lentilha ou microalga. Por exemplo, a frequência de utilização de códons para Lemna minor é encontrada na Tabela 1 e a frequência de utilização de códons para Schizochytrium é encontrada na Tabela 2.

Tabela 1. Lemna minor [gbpln]: 4 CDS'S (1597 códons)

Campos: [trio] [frequência: por mil] ([número])

ÜUU 17,5(28) UCU 13,8(22) UAU 8,8(14) UGU 5,0(8) UUC 36, 3(58) UCC 17,5(28) UAC 15,7(25) UGC 14,4(23) UUA 5,6(9) UCA 14,4(23) UAA 0,0(0) UGA 1,9(3)
UUG	13,8(22)	UCG	13,8(22)	UAG 0,6(1) UGG 16,3(26)
GUU	15,7 (25)	CCU	11,9(19)	CAU 6, 9(11) CGU 4,4(7)
CUC	25,7 (41)	CCC	15,7(25)	CAC 16,9(27) CGC 18,2(29)
CUA	5,0(8) CCA 11	,3(18) CAA 10,0(16) CGA 6,3(10)
CUG	21,3(34)	CCG	14,4(23)	CAG 22,5(36) CGG 10,6(17)
AUU	18,8 (30)	ACU	9,4(15)	AAU 13,8(22) AGU 10,0(16)
AUC	19,4 (31)	ACC	17,5(28)	AAC 21,9(35) AGO 15,0(24)
AUA.	1,9(3) ACA 5,	0 (8) AAA 15,7(25) AGA 20,7(33)
AUG	20,7(33)	ACG	10,0(16)	AAG 35,7(57) AGG 17,5(28)
GUU	15,0 (24)	GCU	25,0(40)	GAU 20,0(32) GGU 8,1(13)
GUC	25, 0(40)	GCC	22,5(36)	GAC 26, 3(42) GGC 21,9(35)
GUA	6,3 (10)	GCA 14,4(23)	GAA 26, 3(42) GGA 16,9(27)
GUG	30,7 (49)	GCG	18,2 (29)	GAG 40,1(64) GGG 18,2(29)

Tabela 2. Schizochytriuia sp. ATCC_20888 [gbpln] : 3

CDS's (6473 códons)

Campos: [tripleto] [frequência: por mil] ([número])

	UUU 12,2(79) UUC 19,9(129) UUA 0,0(0)	UCU 7,0(45) UCC 23,8(154) UCA 0,5(3) UCG 18,8(122)	UAU 1,1(7) UAC 21,5(139) UAA 0,5(3) UAG 0,0(0)	UGU 0,8(5) UGC 15,3(99) UGA 0,0(0) UGG 8,3(54)
UUG	0,6(4)
10
	CUU	12,7 (82)	CCU 11,7(76)	CAU 2,3(15)	CGU 7,1(46)
	CUC	61,2(396)	CCC 23,8(154)	CAC 12,8(83)	CGC 42,9(278)
	CUA	0,0(0)	CCA 1,5(10)	CAA 2,3(15)	CGA 0,3(2)
	CUG	7,4 (48)	CCG 16,2(105)	CAG 27,7(179)	CGG 0,8(5)
15
	AUU	13,9(90)	ACU 9,1(59)	AAU 1,9(12)	AGU 1,5(10)
	AUC	33,5(217)	ACC 29,2(189)	AAC 32, 4(210)	AGC 15,6(101)
	AUA	0,0(0)	ACA 1,5(10)	AAA 2,2(14)	AGA 0,2(1)
	AUG	27,8 (180)	ACG 9,6(62)	AAG 54,5(353)	AGG 0,0(0)
20
	GUU	8,3(54)	GCU 24,4(158)	GAU 13,4 (87)	GGU 13,0(84)
	GUC	53,0(343)	GCC 86,0(557)	GAC 45,0(291)	GGC 54,5(353)
	GUA	0,2(1)	GCA 4,0(26)	GAA 7,3(47)	GGA 3,9(25)
	GUG	14,4 (93)	GCG 15,9(103)	GAG 62,3(403)	GGG 0,5(3)
25	Para os fins	da presente	invenção,	o termo códons

preferenciais de lentilha refere-se a códons que possuem uma frequência de utilização de códons na lentilha de maior do que 17%. O termo códons preferenciais de Lemna, como aqui utilizado, refere-se a códons que possuem uma frequência de utilização de códons no gênero Lemna maior do que 17%. O termo códons preferenciais de Lemna minor, como aqui utilizado, refere-se a códons que possuem uma frequência de utilização de códons em Lemna minor de maior

do que	17%, onde a frequência de	utilização	de	códons	em
Lemna	minor é obtido a partir	da base	de	dados	da
utilização de códons (GenBank 160,0, Junho	15,	2007).	0
termo	códons preferenciais de	microalgas	re	fere-se	a

códons que possuem uma frequência de utilização de códons na microalga superior a 17%. O termo códons preferenciais de microalgas, como usado aqui refere-se a códons que possuem uma frequência de utilização de códons na família Thraustochytriaceae de mais de 17%. O termo códons preferenciais de Schizochytrium, como aqui utilizado, refere-se a códons que possuem uma frequência de utilização de códons de Schizochytrium superior a 17%, em que a frequência de utilização de códons de Schizochytrium é obtida a partir da base de dados da utilização de códons.

É ainda reconhecido que toda ou qualquer parte do polinucleotideo que codifica o polipeptídeo antigênico FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo, pode ser otimizada ou sintética. Em outras palavras, sequências completamente otimizadas ou parcialmente otimizadas podem também ser usadas. Por exemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos códons podem ser códons preferenciais ou preferidos de lentilha ou microalgas. Numa modalidade, entre 90 e 96% dos códons são códons preferenciais de lentilha ou de microalgas. A sequência de codificação de uma sequência de polinucleotideo que codifica um polipeptideo antigênico FMDV de interesse ou um seu fragmento ou variante, pode incluir códons utilizados com uma frequência de, pelo menos, 17% em Lemna gibba ou, pelo menos, 17% em Lemna minor. Em outro exemplo de realização, o cassete de expressão compreende a SEQ ID NO: 9, que contém códons preferenciais de Lemna minor que codificam o conjunto de Pl polipeptideo em SEQ ID NO: 10. Numa modalidade relacionada, o polipeptideo é um polipeptideo FMDV P1-3C, por exemplo, o polipeptideo P1-3C, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3 e o cassete de expressão compreende uma sequência de codificação para este polipeptideo otimizado P1-3C, em que a sequência de codificação compreende códons preferidos de lentilha, por exemplo, códons preferenciais de Lemna minor ou códons preferenciais de Lemna gibba. Em um exemplo de realização, o cassete de expressão compreende a SEQ ID NO: 2, que contém códons preferenciais de Lemna minor que codificam ο polipeptideo de FMDV como descrito na SEQ ID NO:3.

Outras modificações podem ser feitas para o polinucleotídeo que codifica o polipeptideo antigênico FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo, para aumentar a sua expressão em lentilha ou microalga. Estas modificações incluem, mas não estão limitadas a, a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de exon-intron do sítio de splicing, transposons, como repetições e outros tais como sequências bem caracterizadas que possam ser deletérias para a expressão do gene. O conteúdo de GC da sequência pode ser ajustado para níveis médios para lentilha, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na planta. Quando possível, o polinucleotídeo que codifica o polipeptideo heterólogo de interesse pode ser modificado para evitar estruturas previstas hairpin de mRNA secundárias.

Há diferenças conhecidas entre as melhores sequências de iniciação de tradução no contexto de nucleotídeos para códons de iniciação de tradução em animais, plantas e algas. O termo tradução de sequência de nucleotídeos em contexto de iniciação tal como é aqui utilizado, refere-se à identidade dos três nucleotídeos diretamente 5’do códon de iniciação da tradução. O termo códon de iniciação de tradução refere-se ao códon que inicia a tradução do mRNA transcrito a partir da sequência de nucleotídeos de interesse. A composição destas sequências de iniciação de tradução de contexto de nucleotídeos pode influenciar a eficiência de iniciação da tradução. Ver, por exemplo, Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154:89-98 e Joshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. Biol. 35:993-1001. Na presente invenção, a tradução de sequência de nucleotídeos para o contexto de iniciação ao códon de iniciação da tradução do polinucleotideo que codifica o polipeptídeo antigênico FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo, podem ser modificada para aumentar a expressão em lentilha. Numa modalidade, a sequência de nucleotídeos é modificada de tal modo que os três nucleotídeos directamente anteriores do códon de iniciação da tradução são ACC. Numa segunda forma de realização, estes nucleotídeos são ACA.

A expressão de um polipeptídeo antigênico FMDV em lentilha ou alga pode também ser aumentada pela utilização de sequências de 5' líder. Tais sequências líder podem atuar para aumentar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, os líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (encefalomiocardite região 5' não codificante, Elroy-Stein et al (1989) Proc Natl Acad Sci EUA 86:6126 potyvirus) ; líderes, por exemplo, líder TEV (Vírus do Tabaco Etch; Allison et al (1986). Virologia 154:9); imunoglobulina humana - proteína de cadeia pesada ligação (PIF; Macajak e Sarnow (1991) Nature 353:90); líder do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa não traduzidas

(AMV RNA	4;	Jobling	e	Gehrke	(1987)	Nature	325:622);	lider
do virus	do	mosaico	de	tabaco	(TMV;	Gallie	(1989) Molecular
Biology	of	RNA,	23:	56); virus	líder	de batata	etch

(Tomashevskaya et al (1993) J. Gen. Virol 74:2717-2724); Fed-1' não traduzida (Dickey (1992) EMBO J. 11:2311-2317); RBCs 5 de região 5' UTR (Silverthorne et al (1990) Plant J. Mol. Biol 15:49-58) e líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV; Lommel et al (1991) Virology 81:382.). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Fisiologia Vegetal 84:965. A sequência de comando compreendendo a sequência de intron de planta, incluindo a sequência do intron do gene da álcool desidrogenase 1 de milho (ADH1) , o gene de catalase de mamona ou o gene Arabidopsis via triptofano PAT1 também tem mostrado um aumento da eficiência de translação em plantas (Callis et al. ( 1987) Genes Dev. 1:1183-1200, Mascarenhas et al (1990) Plant Mol. Biol Biol

15:913-920).

Em algumas formas de realização da presente invenção, a sequência de nucleotideos correspondente aos nucleotideos 1222 a 1775 de gene da álcool-desidrogenase do milho (SEQ ID NO: 4; ADH1; GenBank número de acesso X04049) é inserida de modo anterior ao polinucleotideo que codifica ο polipeptídeo antigênico de FMDV interesse ou um seu fragmento ou variante, para aumentar a eficiência da tradução. Numa outra forma de realização, o cassete de expressão contém o líder do gene da subunidade pequena da ribulose-bis-fosfato carboxilase 5B Lemna gibba (RBCs líder; ver Buzby et al (1990) Plant Cell 2:805-814.).

Reconhece-se que qualquer uma das modificações que aumentam a expressão de sequências de nucleotideos descritas acima pode ser utilizada na presente invenção, incluindo todas as modificações únicas ou qualquer combinação possível de modificações. A frase modificada para expressão melhorada, em lentilha, tal como aqui utilizada, refere-se a uma sequência de polinucleotideo que contém qualquer um ou qualquer combinação de tais modificações.

Microalgas e plantas transformadas de lentilha-d'água e Culturas de lentilha-d'água nodular ou transformadas

A presente invenção proporciona plantas transformadas que expressam um polipeptídeo antigênico FMDV em lentilha de interesse ou fragmento ou variante do mesmo. O termo duckweed refere-se a membros da família de Lemnaceae. Esta família atualmente está dividida em cinco gêneros e 38 espécies de lentilha de água como segue: gênero Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, ecuadoriensis L., L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L.

perpusilla, L. tenera, L. trisulca, L. turionifera, L. valdiviana) ; gênero Spirodêla (S. intermedia, S.

polyrrhiza, S. punctata); gênero Wolffia (Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscópica, Wa. neglecta) ; gênero Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. Ungulata, Wl. repunda, Wl. rotunda e Wl. neotropica) e gênero Landoltia (L. punctata). Quaisquer outros gêneros ou espécies de Lemnaceae, se existirem, são também aspectos do presente invento. Espécies Lemna podem ser classificadas de acordo com o esquema taxonômico descrito por Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae—A Monograph Study (Geobatanischen Instituto ΕΤΗ, Stiftung Rubel, Zurique).

Tal como aqui utilizado, o termo planta inclui plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas de (folhas), caules, raízes, etc), sementes, células vegetais e progenitura da mesma. As partes de plantas transgênicas devem ser entendidas dentro do âmbito da invenção como compreendendo, por exemplo, células vegetais, protoplastos, culturas de plantas de plantas de células de tecido a partir do qual as plantas podem ser regeneradas, tecidos de calos de plantas, embriões bem como as flores, óvulos, hastes, frutos, folhas, raízes, pontas de raízes, nódulos e semelhantes, originárias de plantas transgênicas ou da sua descendência anteriormente transformada com um polinucleotideo de interesse e, sendo assim, que consiste pelo menos em parte das células transgênicas. Conforme aqui utilizado, o termo célula vegetal inclui células de sementes, embriões, óvulos, regiões meristemáticas, tecidos de caules, folhas, fronde, raízes, nódulos, brotos, anteras e pólen.

Como usado aqui, o termo lentilha nodular significa um tecido lentilha compreendendo células de lentilha, onde pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% das células são células diferenciadas. Conforme aqui utilizado, o termo célula diferenciada significa uma célula com pelo menos uma característica fenotípica (por exemplo, um distintivo ou a morfologia das células a expressão de um marcador de ácido nucleico ou proteína) que a distingue de células indiferenciadas a partir de células ou encontradas em outros tipos de tecidos. As células diferenciadas da cultura de lentilha nodular aqui descritas formam uma superfície lisa de azulejos de células interligadas fundidas nas suas paredes celulares adjacentes, com nódulos que começaram a organizar-se num primeiro momento e espalhados por todo o tecido. A superfície do tecido de cultura do nódulo tem células epidérmicas ligadas umas a outras por meio de plasmadesmata.

O hábito de crescimento das lentilhas é ideal para os métodos de cultura. A planta prolifera rapidamente através muda vegetativa de folhas novas, de uma maneira análoga à propagação macroscópica assexuada em leveduras. Esta proliferação ocorre através de brotamento vegetative a partir de células do merístema apical. A região meristemática é pequena e encontra-se sobre a superfície ventral da fronde. Células meristemáticas repousam em duas bolsas, uma em cada lado da nervura central de fronde. A pequena região de nervura central é também o local de onde se origina a raiz e onde o caule surge que conecta cada fronde ao sua fronde mãe. 0 bolso meristemático é protegido por uma aba de tecido. Frondes de broto alternadamente partem desses bolsões. Tempos de duplicação variam de acordo com as espécies e são tão curtos como 20 a 24 horas (Landolt (1957) Ber Schweiz Bot Ges 67:271; Chang et al (1977) Bull Acad Sin Inst Chem 24: 19; Datko e Mudd (1970) Plant Physiol 65:16; Venkataraman et al (1970) Z. Pflanzenphysiol 62:. 316), Intensive culture of duckweed results in the highest rates of biomass accumulation per unit time (Landolt e Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae—A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutos ΕΤΗ, Stiftung Rubel , Zurich)), com a acumulação de peso seco variando de 6 a 15% de peso fresco (Tillberg et al (1979) Plant Physiol 46:5, Landolt (1957) Ber Schweiz Bot Ges 67:271; Stomp, dados não publicados). O teor de proteínas de um número de espécies de lentilha cultivadas sob condições variáveis, tem sido relatada como variando entre 15 e 45% de peso seco (Chang et al (1977) Bull Chem Inst Acad Sin 24:19, Chang e Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol 89:91; Porath et al (1979) 7:272 Aquatic Botany, Appenroth et al (1982) Biochem Physiol Pflanz 177:251). Usando estes valores, o nível de produção de proteína por litro de meio de lentilha de água é da mesma ordem de grandeza que os sistemas de expressão de genes de leveduras.

A presente invenção também proporciona plantas transformadas que expressam um polipeptídeo FMDV de interesse ou fragmento ou variante do mesmo em microalgas. O temo microalgas ou microalga refere-se a membros da família Thraustochytriaceae. Esta família atualmente está dividida em quatro gêneros: Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides e Japonochytrium.

As plantas transformadas de lentilha ou microalgas da invenção podem ser obtidas através da introdução de uma construção de expressão que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo, na planta de lentilha ou microalga de interesse.

termo introdução, no contexto de um polinucleido, por exemplo, uma construção de expressão que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo, deve ser entendido comp significando que se apresenta para a planta ou de lentilha microalga o polinucleotideo de tal maneira que os polinucleotídeos acessam o interior de uma célula da planta de lentilha ou microalga. Quando mais de um polinucleotideo é para ser introduzido, estes polinucleotídeos podem ser montados como parte de uma construção de um único nucleotídeo ou como construções separadas de nucleotídeos e podem estar localizados em vetores de transformação que são os mesmos ou diferentes. Sendo assim, esses polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula hospedeira de lentilha ou microalga de interesse em um evento de transformação simples, em eventos de transformação independentes, ou, por exemplo, como parte de um protocolo de reprodução. As composições e métodos da presente invenção não dependem de um método particular para a introdução de um ou mais polinucleotídeos numa planta de lentilha ou microalga, bastando apenas que o polinucleotideo tenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta de lentilha ou microalga. Métodos para introdução de polinucleotídeos em plantas ou algas são conhecidos na arte, incluindo, mas não limitados a, métodos de transformação transiente, métodos de transformação estável e métodos mediados por vírus.

O termo transformação transitória, no contexto de um polinucleotideo, tal como um polinucleotideo que codifica um polipeptideo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo, deve ser entendico como significando que um polinucleotideo é introduzido na planta de lentilha ou microalga e não se integrando no genoma da planta de lentilha ou microalga.

Por introdução de forma estável ou estavelmente introduzida, no contexto de um polinucleotideo (por exemplo, um polinucleotideo que codifica um polipeptideo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo) para uma planta de lentilha ou microalga deve ser entendido que o polinucleotideo introduzido é estavelmente incorporado no genoma da lentilha ou microalga e, portanto, a planta de lentilha ou microalga está estavelmente transformada com o polinucleotideo.

Os termos transformação estável ou estavelmente transformada pretendem significar que um polinucleotideo, por exemplo, um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo antigênico FMDV ou um seu fragmento ou variante, para uma estação de lentilha ou microalga se integra no genoma da planta ou alga e é capaz de ser herdado pela progênie da mesma, mais particularmente, pela descendência de múltiplas gerações sucessivas. Em algumas formas de realização, as gerações sucessivas incluem a descendência produzida vegetativamente (ou seja, reprodução assexuada), por exemplo, com propagação clonal. Em outras formas de realização, as gerações sucessivas incluem a descendência produzida por reprodução sexuada.

Uma construção de expressão compreendendo um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo pode ser introduzida numa planta de lentilha ou microalga de interesse utilizando qualquer protocolo de transformação conhecidos dos especialistas na arte. Métodos apropriados para a introdução de sequências nucleotidicas em plantas ou células vegetais de lentilha nodular ou de microalgas incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 83:5602 5606), transformação mediada por Agrobacterium (Patentes US Nos 5.563.055 e 5.981.840, ambas as quais são aqui incorporadas por referência), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717 2722), aceleração de partículas balísticas (ver, eg, Patentes N^os 4,945, 050; 5, 879, 918; 5, 886,244 e 5,932,782(cada uma das quais é aqui incorporada por referência) e Tomes et al (1995) Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlim); McCabe et al (1988) Biotechnology 6:923 926). As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, em conformidade com as formas convencionais.

Como notado acima, lentilhas ou microalgas estavelmente transformadas podem ser obtidas através de qualquer método de transferência de genes conhecido na arte, tal como um dos métodos de transferência de genes descritos na Patente No. US 6,040,498 ou Pedidos de Patente

N°s US 2003/0115640, 2003/0033630 ou 2002/0088027. Plantas de lentilha ou culturas de lentilhas nodulares ou microalgas podem ser eficientemente transformadas com um cassete de expressão contendo uma sequência de ácido nucleico tal como aqui descrito, por qualquer um de uma série de métodos, incluindo a técnica mediada por Agrobacterium de transferência de genes, bombardeamento balístico ou eletroporação. Dentre os Agrobacterium que podem ser utilizados, detaca-se Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Transformantes estáveis de lentilha ou microalga podem ser isolados através da transformação das células de lentilha ou microalga com tanto a sequência de ácido nucleico de interesse quanto um gene que confere resistência a um agente de seleção, seguido por cultura das células transformadas num meio contendo o agente de seleção. Ver, por exemplo, Patente No.

US 6, 040, 498, o conteúdo da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

As plantas transformadas de forma estável de lentilha ou microalgas utilizadas nestes métodos devem apresentar morfologia normal, serem férteis e ter reprodução sexual e/ou serem capazes de se reproduzir vegetativamente (, ou seja, reprodução assexuada), por exemplo, com propagação clonal. De preferência, as plantas transformadas de lentilha ou microalgas da presente invenção contêm uma única cópia do ácido nucleico transferido que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptideo antigênico FMDV ou um seu fragmento ou variante e o ácido nucleico transferido não tem rearranjos notáveis no seu interior. Reconhece-se que as plantas transformadas de lentilha ou microalgas da presente invenção podem conter o presente ácido nucleico transferido em baixos números de cópias (isto é, não mais do que 12 cópias, não mais do que oito cópias, não mais do que cinco cópias, em alternativa não superior a três cópias, como uma outra alternativa menos de três cópias do ácido nucleico por célula transformada).

Plantas ou microalgas transformadas que expressam um polipeptideo FMDV antigênico ou fragmento ou variante do mesmo, podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão do polipeptideo antigênico FMDV ou fragmento ou variante do mesmo. O polipeptideo FMDV antigênico ou fragmento ou variante do mesmo, pode então ser colhido a partir da planta de lentilha ou das microalgas, do meio de cultura da planta de lentilha ou do meio de cultura de microalgas, se desejado, purificado utilizando qualquer isolamento convencional e método de purificação conhecido na arte, como aqui descrito anteriormente. O polipeptideo FMDV antigênico ou fragmento ou variante do mesmo, pode, então, ser formulado como uma vacina para aplicações terapêuticas, como aqui descrito anteriormente.

Métodos de preparação de um polipeptídeo FMDV

Como descrito aqui integralmente, numa forma de realização, um método de produção de um polipeptídeo de FMDV compreende: (a) a cultura num meio de cultura de lentilhas de água ou numa uma cultura de microalgas e lentilha ou microalga, em que a cultura de lentilha ou microalga é estavelmente transformada para expressar o polipeptídeo e em que o polipeptídeo é expresso a partir de uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que codifica para o referido polipeptídeo e (b) coleta do polipeptídeo antigênico do referido meio de cultura. O termo coleta inclui, mas não está limitado a, a coleta do meio de cultura ou por purificação.

Após a produção do polipeptídeo recombinante na lentilha ou microalgas, qualquer método disponível na arte pode ser utilizado para a purificação de proteínas. Os vários passos incluem a liberação da proteína a partir do material não proteico ou vegetal ou microalga, seguido da purificação da proteína de interesse a partir de outras proteínas. Os passos iniciais do processo de purificação incluem centrifugação, filtração ou uma combinação destes. As proteínas segregadas no espaço extracelular dos tecidos podem ser obtidas usando vácuo ou extração centrífuga. Um processamento mínimo pode também envolver preparação de produtos em bruto. Outros métodos incluem a maceração e extração, a fim de permitir a utilização direta do extrato.

Tais métodos para purificar a proteína de interesse podem explorar as diferenças de tamanho da proteína, propriedades físico-químicas e afinidade de ligação. Tais métodos incluem a cromatografia de afinidade, incluindo procainamida, exclusão de tamanho, de líquido de alta pressão, de fase reversa e cromatografia de troca aniônica, marcadores de afinidade, filtração, etc, em particular, a cromatografia de afinidade de ions de Ni imobilizados pode ser utilizada para purificar a proteína expressa. Ver Favacho et al. (2006) Protein Expression and Purification 46:196-203. Ver também, Zhou et al. (2007) The Protein J 26:29-37; Wang et al. (2006) Vaccine 15:2176-2185; e WO/2Ó09/076778, todos os quais são aqui incorporados por referência. Protetores podem ser utilizados no processo de purificação, tais como protetores osmoticos, antioxidantes, inibidores da oxidação de compostos fenólicos, inibidores da protease e outros semelhantes.

Métodos de Utilização

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método de vacinação de um ovino, bovino, caprino ou de suíno, compreendendo a administração ao ovino, bovino, caprino ou suíno de uma quantidade eficaz de uma vacina que pode compreender uma quantidade eficaz de um antígeno de FMDV recombinante e um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

Numa forma de realização da presente invenção, o método compreende a administração única de uma composição de vacina formulada com uma emulsão de acordo com a invenção. Por exemplo, numa forma de realização, a composição de vacina compreende imunólogos ou antígenosFMDV expressos em lentilha, incluindo polipeptídeos e VLP (partículas semelhantes a vírus). Dados de microscopia eletrônica indicam a lentilha transformada com vetores de expressão de mera que provavelmente produzem FMDV VLP e, assim, as composições imunológicas ou de vacina de acordo com a presente invenção englobam as que compreendem FMDV VLP.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método de vacinação de um ovino, bovino, caprino ou de suíno, compreendendo a administração ao ovino, bovino, caprino, ovino e suíno de antígenos FMDV produzidos em um material de plantas ou algas e da planta do gênero Lemna, ou material de microalga Schizochytrium.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método para induzir uma resposta imune que compreende administrar ao ovino, bovino, caprino ou suíno de uma vacina que compreende antígenos FMDV de ovino, bovino, caprino ou suíno expressos numa planta ou alga, em que uma resposta imune é desencadeada.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método para induzir uma resposta imune que compreende administrar ao ovino, bovino, caprino, suíno ou uma vacina que compreende antígenos FMDV de ovino, bovino, caprino ou suíno expressos numa planta ou alga, num material de planta do gênero Lemna ou material de microalga Schizochytriwn, em que uma resposta imune é desencadeada.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método de preparação de uma planta estavelmente transformada ou cultura de lentilha ou microalga compreendendo, (a) a introdução, na planta ou microalga, de uma construção genética que inclui um gene do antígeno de FMDV e (b) cultivar a planta ou microalga. Os métodos para a transformação de lentilha ou microalga estão disponíveis na arte.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método de preparação de uma vacina ou composição que compreende um antígeno de FMDV isolado produzido por um sistema de expressão de lentilha ou de microalgas e, opcionalmente, a sua combinação com um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada é dirigida a um método de preparação de uma vacina ou composição que compreende a combinação de um antigeno de FMDV produzido por um sistema de expressão de Lemna e material vegetal a partir do gênero Lemna e, opcionalmente, um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou 10 veterinariamente aceitável.

Numa outra forma de realização, a matéria aqui descrita é dirigida para um método de preparação de uma vacina ou composição que compreende a combinação de um antigeno de FMDV produzido por um sistema de expressão de 15 Schizochytrium e material de Schizochytrium e, opcionalmente, um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

A administração pode ser por via subcutânea ou intramuscular. A administração pode ser livre de agulha 20 (por exemplo, Pigjet ou Bioject).

Numa forma de realização da invenção, um regime de prime-boost pode ser utilizado, o qual é composto por pelo menos uma administração primária e pelo menos uma administração de reforço com pelo menos um polipeptídeo comum, antígeno, epitopo ou imunógeno. Tipicamente, a composição imunológica ou de vacina utilizada em ' administração primária tem uma natureza diferente daquelas utilizadas como reforço. No entanto, deve ser notado que a mesma composição pode ser usada como a administração primária e como reforço. Este protocolo de administração é chamado de prime-boost.

Um prime-boost de acordo com o presente invento pode incluir um vetor viral recombinante que é utilizado para expressar uma sequência de codificação de FMDV ou seus fragmentos que codifica um polipeptídeo antigênico ou fragmento ou variante do mesmo. Especificamente, o vetor viral pode expressar um gene de FMDV ou seu fragmento que codifica um polipeptídeo antigênico. O Vetor viral aqui contemplado inclui, mas não se limita a, poxvirus [por exemplo, vírus da vacina ou atenuada do vírus vaccinia, vírus avipox atenuado ou avipox vírus (por exemplo, canarypox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC, TROVAC; ver, por exemplo, US 5,505,941, US 5,494,807), raccoonpox vírus, vírus da varíola suína, etc], adenovirus (por exemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), herpesvirus (por exemplo, o herpesvirus canino, vírus do herpes do peru, vírus da doença de Marek, vírus da laringotraqueíte infecciosa, vírus do herpes felino, laringotraqueite virus (VLT) herpesvirus bovino, suino herpesvirus), baculovirus, retrovirus, etc. Em outra forma de realização, o vetor de expressão pode ser um avipox vetor canarypox, tal como, ALVAC. Em ainda outra modalidade, o vetor de expressão pode ser um vetor avipox fowlpox, tal como, TROVAC. O antigeno de FMDV do invento a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor específico de poxvirus, por exemplo, o promotor de entomopoxvirus Amsacta moorei 42K (Barcena, Lorenzo et al. 2000), promotor de vaccinia 7,5 kDa (Cochran et al., 1985 ), promotor de vaccinia I3L (Riviere et al, 1992), promotor de vaccinia HA (Shida, 1986), promotor de cowpox ATI (Funahashi et al, 1988), promotor de vaccinia H6 (Taylor et al, 1988b; Guo et al, 1989; . Perkus et al, 1989) , inter alia.

Numa outra modalidade, o vetor de expressão pode ser um vetor avipox canarypox, tal como, ALVAC. O antigeno de epitopo ou imunógeno FMDV pode ser FMDV P1-3C. O vetor de vírus da febre aftosa viral pode ser um vírus canarypox como VCP2186, vCP2181, VCP2176 ou ou um vírus fowlpox como VFP2215 (ver US 7,527,960).

Num outro aspecto do protocolo de indução e reforço da presente invenção, uma composição que compreende o antigeno de FMDV do invento é administrada, seguido pela administração da vacina ou composição que compreende um vetor viral recombinante que contém e exprime o antigeno de FMDV in vivo ou uma vacina viral ou composição inativada que compreende o antigeno de FMDV ou uma vacina de DNA de plasmideo ou de composição que contém ou expressa o antigeno de FMDV. Da mesma forma, um protocolo de indução e reforço pode compreender a administração de vacina ou composição que compreende um vetor viral recombinante que contém e expressa um antigeno de FMDV in vivo ou uma vacina inativada viral ou composição que compreende um antigeno de FMDV ou uma vacina de DNA de plasmideo ou de composição que contém ou expressa um antigeno de FMDV, seguido pela administração de uma composição que compreende o antigeno de FMDV do invento. Deve ainda ser notado que tanto as administrações primária e secundária podem compreender a composição que compreende o antigeno de FMDV do invento.

Um protocolo prime-boost compreende pelo menos uma administração de alto risco e de pelo menos um reforço com a administração de pelo menos um polipeptídeo comum e/ou suas variantes ou seus fragmentos. A vacina utilizada na administração primária pode ser de natureza diferente daquelas utilizadas como uma vacina de reforço posterior. A administração primária pode compreender uma ou mais administrações. De modo semelhante, a administração de reforço pode compreender uma ou mais administrações.

O volume da dose de composições para as espécies alvo que são mamíferos, por exemplo, o volume da dose de composições em ovinos, bovinos, caprinos ou suíno, com base em vetores virais, por exemplo, composições baseadas em vetores não-poxvírus-viral, é geralmente entre cerca de 0,1 e cerca de 5,0 ml, entre cerca de 0,1 a cerca de 3,0 ml e entre cerca de 0,5 ml até cerca de 2,5 ml.

A eficácia das vacinas pode ser testada em cerca de 2 a 4 semanas após a última imunização de animais difíceis, como ovinos, bovinos, caprinos ou suínos, com uma linhagem virulenta do vírus da febre aftosa, o vírus da febre aftosa 01, vantajosamente linhagens FMDV 01 Manisa, 01 BFS ou Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran'96, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

Outras linhagens ainda podem incluir: FMDV A10-61, A5

A12, A24/Cruzeiro, C3/Indaial, 01, Cl-Santa Pau, C1-C5

A22/550/Azerbaijan/65, SAT1-SAT3, A, A/TNC/71/94

A/IND/2/68,	A/IND/3/77,
A/IND/16/82,	A/IND/17/77,
A/IND/20/82,	A/IND/22/82,
A/IND/54/79,	A/IND/57/79,
A/IND/86/79,	A/APA/25/84,
A/APS/50/05,	A/APS/55/05,

A/IND/5/68,	A/IND/7/82,
A/IND/17/82,	A/IND/19/76,
A/IND/25/81,	A/IND/26/82,
A/IND/73/79,	A/IND/85/79,
A/APN/41/84,	A/APS/44/05,
A/APS/66/05,	A/APS/68/05,

A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/Asia/l, A/IRN/05, Asia/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, Asia l/HNK/CHA/05 (GenBank accession number EF149010, herein incorporated by reference), Asia I/XJ (Li, ZhiYong et al. Chin Sci Bull, 2007), HK/70 (Chin Sci Bull, 2006, 51(17): 2072-2078), 0/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, 0/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, 0/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001, O/ES/2001, HKN/2002,

O5India, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KEN/1/76/A,	GAM/51/98/A,
A10/Holland,	O/KEN/1/91,	O/IND49/97,	O/IND65/98,
O/IND64/98,	O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97,	O/IND81/99,
O/IND81/98,	O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97,	O/IND74/97,
O/IND70/97,	O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97,	O/IND57/98,
O/IND56/98,	O/IND55/98,	O/IND54/98,	O/IND469/98,
O/IND465/97,	O/IND464/97,	O/IND424/97,	O/IND423/97,
O/IND420/97,	O/IND414/97,	O/IND411/97,	O/IND410/97,
O/IND409/97,	O/IND407/97,	O/IND399/97,	O/IND39/97,
O/IND391/97,	O/IND38/97,	O/IND384/97,	O/IND380/97,
O/IND37/97,	O/IND352/97,	O/IND33/97,	O/IND31/97,
O/IND296/97,	O/IND23/99,	O/IND463/97,	O/IND461/97,
O/IND427/98,	O/IND28/97,	O/IND287/99,	O/IND285/99,
O/IND282/99,	O/IND281/97,	O/IND27/97,	O/IND278/97,
O/IND256/99,	O/IND249/99,	O/IND210/99,	O/IND208/99,

O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, 0/SKR/2000, A22/India/17/77.

Mais detalhes sobre estas linhagens FMDV podem ser encontrados na página eletrônica do European Bioinformatics Information (EMBL-EBI) e todas as sequências nucleotidicas associadas são aqui incorporadas por referência. Os inventores contemplam que todas as linhagens FMDV, ambas aqui listadas e aquelas que ainda não foram identificadas, podem ser expressas de acordo com os ensinamentos da presente descrição para a produção de, por exemplo, composições de vacina eficazes. Ambas as linhagens homólogas e heterólogas são usadas para o ensaio de teste de eficácia das vacinas. O animal pode ser testado por via intradérmica, subcutânea, spray, intra-nasal, intraocular, intra-traqueal e/ou por via oral.

As administrações prime-boost podem ser vantajosamente realizadas com de 2 a 6 semanas de intervalo, por exemplo, cerca de 3 semanas de intervalo. De acordo com uma forma de realização, uma dose de reforço semi-anual ou um reforço anual, vantajosamente utilizando a vacina baseada em vetor viral, também está prevista. Os animais são, vantajosamente, de pelo menos 6 a 8 semanas de idade no momento da primeira administração.

As composições compreendendo os polipeptideos antigênicos recombinantes do invento utilizadas nos protocolos prime-boost estão contidas em um diluente veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceiteavel. Os protocolos da invenção protegem o animal ovino, bovino, caprino ou suíno de FMDV e/ou impedem a progressão da doença em um animal infectado.

As várias administrações são preferencialmente realizadas com de 1 a 6 semanas de intervalo e mais particularmente com cerca de 3 semanas de intervalo. De acordo com um modo preferido, um reforço anual, de preferência usando a composição baseada em vetor viral imunológica da vacina, é também previsto. Os animais são, preferivelmente, de pelo menos um dia de idade no momento da primeira administração.

Deve ser entendido por um técnico no assunto que a presente descrição é dada a título de exemplo e o presente invento não está limitado a ela. A partir da presente divulgação e do conhecimento da técnica, o especialista pode determinar o número de administrações, a via de administração e as doses a utilizar para cada protocolo de injecção, sem qualquer experimentação excessiva.

presente invento contempla, pelo menos, uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica feita de acordo com a invenção. O animal pode ser macho, fêmea, fêmea grávida e recémnascido. Esta administração pode ser através de várias vias incluindo, mas não limitadas a, intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC) de injeção ou através de administração intranasal ou oral. A composição terapêutica de acordo com a invenção também pode ser administrada por um aparelho sem agulha (como, por exemplo, com um Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EUA) ou aparelho Vetjet Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)). Outra abordagem para a administração de composições de plasmideos é a utilização de eletroporação (ver, por exemplo, Tollefsen et al, 2002;. Tollefsen et al, 2003, Babiuk et al, 2002; Pedido PCT No. WO99/01158). Numa outra modalidade, a composição terapêutica é entregue ao animal por pistola de genes ou bombardeamento de partículas de ouro.

Numa forma de realização, a invenção fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para o fornecimento e expressão de um antigeno ou epítopo de FMDV em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é a experimentação de rotina para um técnico no assunto. Numa modalidade, a formulação compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que expresse um antigeno ou epítopo de FMDV e um transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Numa outra forma de realização, o transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfecção ou outros meios de transferência de polinucleotídeos para um animal hospedeiro e/ou melhora a conservação do vetor ou proteína num hospedeiro.

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada proporciona um método de detecção para a diferenciação entre animais infectados e animais vacinados (DIVA).

É aqui revelado que o uso da vacina ou composição da presente invenção permite a detecção da infecção pelo vírus da febre aftosa em um animal. É aqui revelado que o uso da vacina ou composição da presente invenção permite a detecção da infecção em animais através da diferenciação entre animais infectados e animais vacinados (DIVA). Um método é aqui divulgado para o diagnóstico da infecção do vírus da febre aftosa num animal utilizando um FMDV proteína não estrutural (por exemplo, um 3ABC FMDV ou 3Despecífica ELISA).

Artigo de Fabricação

Numa forma de realização, a matéria aqui divulgada dirige-se a um kit para realização de um método de provocar ou induzir uma resposta imune que pode compreender qualquer uma das composições imunológicas FMDV recombinantes ou vacinas inativadas ou composições imunológicas FMDV ou vacinas FMDV recombinante viral, além das composições ou vacinas e instruções para realizar o método.

Outra forma de realização da invenção é um kit para a realização de um método de indução de uma resposta imunológica protetora contra FMDV ou num animal, compreendendo uma composição ou vacina que compreende um antigeno de FMDV do invento e uma composição imunológica FMDV recombinante viral ou vacina e instruções para a execução o método de entrega de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.

Outra forma de realização da invenção é um kit para a realização de um método de indução de uma resposta imunológica protetora contra FMDV ou num animal, compreendendo uma composição ou vacina que compreende um antigeno de FMDV a invenção e de uma composição imunológica inativada de FMDV ou vacina e instruções para realizar o método de entrega de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.

Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para vacinação prime-boost de acordo com a presente invenção como descrito acima. O kit pode

100 compreender pelo menos dois frascos: um primeiro frasco contendo uma vacina ou composição para a primeira vacinação de acordo com a presente invenção e um segundo frasco contendo uma vacina ou composição de vacina para o reforço de acordo com a presente invenção. 0 kit pode conter vantajosamente frascos adicionais de primeira ou de segunda aplicação para vacinação primearia adicional ou vacinas de reforço adicionais.

As seguintes modalidades são abrangidas pelo invento.

Numa forma de realização, uma composição que compreende um antígeno de FMDV ou de um seu fragmento ou variante e um transportador, excipiente ou veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável é divulgada. Numa outra forma de realização, a composição descrita acima, em que o antígeno de FMDV ou fragmento ou variante do mesmo compreende um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos 15 aminoácidos de antígenos FMDV de ovino, bovino, caprino ou suíno é divulgada. Ainda numa outra modalidade, as composições acima referidas, em que o antígeno de FMDV ou fragmento ou variante do mesmo é produzido em lentilha ou microalgas são divulgados. Numa forma de realização, as composições acima referidas, em que o antígeno de FMDV ou fragmento ou variante do mesmo está parcialmente purificado são divulgadas. Numa forma de realização, as composições

101 acima referidas, em que o antigeno de FMDV ou fragmento ou variante do mesmo são substancialmente purificados são divulgadas.

Numa forma de realização, as composições acima referidas, em que o antigeno de FMDV ou fragmento ou variante do mesmo é um o polipeptídeo FMDV de ovino, bovino, caprino ou suíno são divulgadas. Numa forma de realização, as composições acima referidas em que o polipeptídeo FMDV é um P1-3C polipeptídeo, Pl polipeptídeo, VPO polipeptídeo VP1 polipeptídeo, VP3 polipeptídeo, VP2, VP4 polipeptídeo, 2Ά polipeptídeo, polipeptídeo 2B1 ou polipeptídeo 3C são divulgadas. Numa forma de realização, as composições acima referidas, em que o antigeno de FMDV ou fragmento ou variante do mesmo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26, 29 são divulgadas. Numa forma de realização, as composições acima referidas, em que o antigeno de FMDV é codificado por um polinucleotideo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência como descrita nas SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22 ou 24, 25, 27, 28, 30-35 são divulgadas. Numa forma de realização, as composições acima referidas, em que o veículo, excipiente ou carreador farmacêutico ou veterinariamente aceitável é

102 uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão de óleo-em-água são divulgadas. Numa outra forma de realização, um método de vacinação de um animal susceptível a FMDV que é ovino, bovino, caprino ou suíno, compreendendo a administração das composições acima no animal é divulgado. Numa forma de realização, um método de vacinação de um animal susceptível a FMDV que é ovino, bovino, caprino ou suíno, compreendendo um regime de prime-boost é divulgado. Numa modalidade, um polipeptídeo substancialmente purificado antigênico expresso em lentilha ou microalga, em que o polipeptídeo é composto por: uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo a sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26, 29 é divulgado. Em qualquer modalidade, o animal é de preferência um ovino, um bovino, um porco ou um caprino. Numa forma de realização, um método de diagnóstico da infecção pelo vírus da febre aftosa num animal é divulgado. Em ainda outra forma de realização, um kit para vacinação prime-boost compreendendo, pelo menos, dois frascos, em que há um primeiro frasco contendo a composição da presente invenção e um segundo frasco contendo uma composição para a vacinação de reforço, que compreende uma composição que compreende um vetor viral recombinant e ou uma composição compreendendo uma

103 composição de vírus inativado ou uma composição que contém o DNA de plasmídeo ou expressa o antigeno de FMDV é divulgado.

Os transportadores ou veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos para os técnicos no assunto. Por exemplo, um transportador ou um veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução 0,9% de NaCl (por exemplo, soro fisiológico) ou um tampão de fosfato. O veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável ou outro veículo ou excipientes que podem ser utilizados para os métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, poli-(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. O transportador ou um veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou a proteína expressa a partir de um vetor da invenção in vitro); vantajosamente, o transportador, veículo ou excipiente pode facilitar a

transfecção	e/ou melhorar a preservação do	vetor	(ou
proteína).	As doses e os volumes de dose	são	aqui
discutidos	na descrição geral e também	pode	ser

determinados por um técnico no assunto a partir desta divulgação, em conjugação com o conhecimento na arte, sem

104 qualquer experimentação excessiva.

Os lipidos catiônicos que contêm um sal de amônio quaternário, que são, vantajosamente, mas não exclusivamente, adequados para plasmideos, são vantajosamente aqueles possuindo a seguinte fórmula:

ch₃ I ⁺

R, _ o — CH_Z— CH— CH₂ — N — R₂—X

OR, CH₃ em que RI é um grupo alifático saturado ou insaturado de cadeia linear radical possuindo 12 a 18 átomos de carbono, R2 é um outro grupo alifático contendo 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amino ou hidroxila, por exemplo, o DMRIE. Numa outra forma de realização o lipídeo catiônico pode ser associado a um lipídeo neutro, por exemplo, DOPE.

Entre estes lipidos catiônicos, dá-se preferência a DMRIE(N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2, 3-bis(tetradeciloxi)1-propano-amônio; WO96/34109), vantajosamente associado a um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIEDOPE.

Vantajosamente, a mistura de plasmídeo com o adjuvante é formada extemporaneamente e, vantajosamente,

105 simultaneamente com a administração da preparação ou imediatamente antes da administração da preparação, por exemplo, pouco antes ou logo antes da administração, em que a mistura de plasmídeo-adjuvante é formada, vantajosamente, de modo a dar tempo suficiente antes da administração da mistura, de modo a formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como cerca de 30 minutos antes da administração.

Quando DOPE estiver presente, a razão molar DMRIE: DOPE é vantajosamente de a cerca de 95 a cerca de 5 a cerca de 5: a cerca de 95, mais vantajosamente cerca de 1: a cerca de 1, por exemplo, 1:1.

A razão de DMRIE ou DMRIE-DOPE para adjuvante, em peso de plasmideo, pode ser entre cerca de 50: a cerca de 1 e cerca de 1: a cerca 10, tal como cerca de 10: a cerca 1 e cerca de 1: a cerca 5 e cerca de 1: a cerca 1 e cerca de 1: a cerca 2, por exemplo, de 1:1 e 1:2.

Numa outra forma de realização, o transportador, excipiente, veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável ou pode ser uma emulsão de água-em-óleo. Exemplos de emulsão água-em-óleo à base de óleo incluem a vacinas de água-em-óleo que sejam estáveis e fluidas a 4°C contendo: de 6 a 50 v/v % de uma fase aquosa contendo antígeno, de preferência de 12 a 25 v/v %, de 50 a 94 v/v % de uma fase

106 de óleo contendo, no total ou em parte, um óleo nãometabolizável (por exemplo, óleo mineral, tal como óleo de parafina) e/ou o óleo metabolizável (por exemplo, óleo vegetal ou de ácidos graxos, ésteres de poliol ou de álcool), a partir de 0,2 até 20% p/v de agentes tensioativos, de preferência de 3 a 8 p/v %, sendo este último, no total ou em parte ou de uma mistura ou de ésteres de poliglicerol, os referidos ésteres de poliglicerol sendo de preferência de poliglicerol (poli) ricinoleatos ou óleos rícino de polioxietileno ou outros óleos de rícino de polioxietileno hidrogenado. Exemplos de tensoativos que podem ser utilizados em uma emulsão de água-em-óleo incluem os ésteres de sorbitano etoxilados (por exemplo, monooleato de polioxietileno (20) sorbitano (TWEEN 80®), disponível a partir de APPLICHEM, Inc., Cheshire, CT) e os ésteres de sorbitano (por exemplo, , mono-oleato de sorbitano (SPAN ®80), disponível a partir de Sigma Aldrich, St. Louis, MO) . Além disso, no que diz respeito a uma emulsão de água-em-óleo, ver também a Patente US No. 6,919,084, por exemplo, o Exemplo 8 da mesma, aqui incorporada por referência. Em algumas formas de realização, a fase aquosa contendo antigeno compreende uma solução salina compreendendo um ou mais agentes tamponantes. Um exemplo de uma solução tampão adequada é

107 solução salina tamponada com fosfato. Numa forma de realização vantajosa, a emulsão de água-em-óleo pode ser uma Emulsão tripla óleo/água/ água (0/A/A) (Patente US No. 6,358,500). Exemplos de outras emulsões adequadas são descritos na Patente No. US 7,371,395.

As composições imunológicas e vacinas de acordo com o invento podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes adequados para utilização na prática da presente invenção são: (1) os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e os polímeros derivados de alcenila, (2) as sequências imunoestimulantes (ISS), tais como sequências de oligodesoxirribonucleotídeos com uma ou mais unidades CpG não metiladas (Klinman et al, 1996;. WO98/16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 do Design Vaccine, The Subunit e Adjuvant Approach, publicado por M. Powell, Μ . Newman, Plenum Press 1995 e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) os lipídeos catiônicos que contêm um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado como referência no presente pedido de patente ou (9) todas as combinações ou misturas destes.

108

A emulsão de óleo em água (3), que é especialmente adequada para os vetores virais, pode basear-se em: óleo de parafina líquida leve (do tipo da farmacopeia europeia), óleo de isoprenóides tais como esqualano, esqualeno, óleo resultante a partir da oligomerização de alcenos, por exemplo, isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou de álcoois que têm um grupo alquil de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etila, propileno-glicol, di (caprilato/caprato), glicerol tri (caprilato/caprato) e propileno glicol, dioleato ou ésteres de ramificados, álcoois graxos ou ácidos graxos, ésteres de ácidos, especialmente isoesteárico.

O óleo é usado em combinação com emulsionantes para formar uma emulsão. Os emulsionantes podem ser não iônicos, tais como os ésteres de: de sorbitano, mannida (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicol de poliglicerol, glicerol ou propileno e, por outro lado, oleico, isoesteárico, ricinoleico ou de ácidos hidroxiesteárico, os referidos ésteres sendo opcionalmente etoxilados ou blocos de copolímeros polioxipropileno-polioxietileno, tais como o Pluronic, por exemplo, L121.

Entre o tipo (1) de adjuvantes de polímeros, é dada preferência a polímeros reticulados de ácido acrílico ou metacrílico, especialmente os éteres de polialcenila

109 reticulados de açúcares ou outros poliálcoois. Estes compostos são conhecidos sob o nome de carbômeros (Pharmeuropa, vol. 8, n. 2, Junho de 1996) . Um técnico no assunto pode também referir-se ao documento de Patente No. US 2,909.462, o qual fornece esses polímeros acrílicos reticulados a partir de um composto poli-hidroxila possuindo pelo menos três grupos hidroxila, de preferência não mais do que oito tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila, sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados, que possuem pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são os que contêm de 2 a 4 átomos de carbono, eg vinilas, allilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem também conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA), são especialmente adequados. Eles são reticulados por alil sacarose ou pentaeritritol de alila. Entre eles, é feita referência ao Carbopol 974P, 934P e 971P.

Quanto aos copolímeros derivados de anidrido maleicoalcenila, é dada preferência ao EMA (Monsanto) , que é de cadeia linear ou copolímeros de etileno-anidrido maleico reticulados que são, por exemplo, reticulados por ligação cruzada de éter divinílico. É também feita referência a J.

110

Fields et al., 1960.

No que diz respeito à estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os EMA são de preferência formados por unidades de base com a seguinte fórmula:

Ri R₂

......L-(-ch₂)-c—(ch_:).......

| ^V 'x | ^V 'y

COOH COOH em que:

RI e R2, que podem ser iguais ou diferentes, representam H ou CH3

- X = 0 ou 1, de preferência, x = 1

- Y = 1 ou 2, com x + y = 2.

Para EMA, x=0ey=2e para carbômeros x = y = 1.

Estes polímeros são solúveis em água ou em solução salina fisiológica (20 g/1 de NaCl) e o pH pode ser ajustado para 7,3 a 7,4, por exemplo, por adição de soda (NaOH), para fornecer a solução de adjuvante, em que o vetor de expressão pode ser incorporado. A concentração de polímero na composição final ou imunológica da vacina pode variar entre cerca de 0,01 a cerca de 1,5% p/v, cerca de 0,05 a cerca de 1% p/v e de cerca de 0,1 a cerca de 0,4% p/v.

A citocina ou citocinas (5) pode estar na forma de proteína na composição imunológica ou de vacina ou pode ser

111 co-expressa no hospedeiro com o imunógeno ou imunógenos ou epítopo da mesma. A preferência é dada para a co-expressão da citocina ou citocinas ou pelo mesmo vetor que expressa como o imunógeno ou imunógenos ou epítopo da mesma ou por um vetor separado do mesmo.

A presente invenção compreende a preparação de composições de combinação, tais como, por exemplo, por mistura dos componentes ativos, com vantagem, em conjunto e com um adjuvante, transportador, citoquinas e/ou diluente.

As citocinas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), de granulócitos/macrófagos estimulador de colônias fator (GMCSF) , o interferon α (IFNa), β interferon (ΙΕΝβ), interferon γ (ΙΕΝγ), interleucina-la(IL-1 a), interleucina1β (IL-1 β), interleucina-2 (IL-2), interleucina- 3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), fator de necrose tumoral a (TNF), fator de necrose tumoral β (TNF β) e β fator de crescimento transformante (TGF β). Entendese que as citocinas podem ser coadministradas e/ou administradas sequencialmente com a composição imunológica

112 ou de vacina da presente invenção. Assim, por exemplo, a vacina da presente invenção também pode conter uma molécula de ácido nucleico exógeno que expressa in vivo uma citocina apropriada, por exemplo, uma citocina correspondente a esse hospedeiro a ser vacinado ou em que uma resposta imunológica é para ser desencadeada (por exemplo, uma citocina bovina para a preparação a ser administrada a bovinos).

Vantajosamente, a composição imunológica e/ou a vacina de acordo com a invenção compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta terapêutica de um ou mais polipeptídeos que são expressos em lentilha, como aqui discutido, e, uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir desta descrição, incluindo os documentos aqui incorporados, bem como o conhecimento na arte, sem experimentação indevida.

No caso da composição imunológica e/ou a vacina com base em um polipeptídeos expressa em lentilha, uma dose pode incluir, em cerca de 1 pg a cerca de 2000 mg, vantajosamente de cerca de 50 pg a cerca de 1000 pg e mais vantajosamente entre cerca de 100 pg a cerca de 500 pg do antigeno de FMDV, epítopo ou imunógeno. Os volumes de dose pode ser entre cerca de 0,1 e cerca de 10 ml, com vantagem

113 entre cerca de 0,2 e cerca de 5 ml.

A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS

Construção de inserções de DNA, plasmídeos e vetores virais recombinantes ou das plantas foram realizados utilizando as técnicas padrão de biologia molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Exemplo 1 Geração e triagem de linhas lentilha que expressam FMDV

FMDV PI de lentilha otimizado e as sequências de 3C, foram produzidas e clonadas no plasmídeo parental para gerar os vetores de mera representado nas Figuras de 6 a 9. Quatro construções independentes foram projetadas para o projeto¹ FMDV. A Tabela 3 resume o número de linhas transgênicas que foram geradas e rastreadas e a figura 3 fornece uma representação esquemática da estrutura do gene para as inserções de FMDV. Três linhas expressam o capsídeo Pl + 3C protease (MerEOl, 3, 4), enquanto que a outra expressa o P1 capsídeo sozinho (MerE02). As análises ELISA e Agilent foram utilizadas para quantificar a expressão dos antigenos FMDV. Western blots foram realizados para

114 verificar o tamanho correto da proteína expressa (FIG. 12).

Linhas de lentilha de serótipo expressando FMDV A24 mais elevadas, conforme determinado por análise de mRNA e por western blot, foram cultivadas em vasos de escala para 5 fornecer biomassa para utilização na caracterização e estudos em animais.

Tabela 3: geração e seleção de linha adicional de vírus da febre aftosa MerE linhas

Constrato	Descrição	# de linhas geradas	# de linhas rastreadas
MerEOl	P1-3C	16	16
MerE02	PI sozinho (5' UTR otimizado)	100	100
MerE03	P1-2A + 3C	20	20
MerE04	P1-2A + 30(5' UTR otimizado)	8	8

Triagem. 144 linhas transgênicas FMDV foram desenvolvidas. Depois de as linhas 144 que expressam FMDV foram desenvolvidas, elas foram testadas para determinar os níveis relativos de expressão no tecido do FMDV. Níveis de mRNA de FMDV foram medidos através de RNA dot blot (Figura 15 10) e em tempo real de RTPCR (Figura 11) . Os níveis de proteínas FMDV foram medidos utilizando Western blot e

ELISA. Linhas de lentilha que expressam FMDV foram rastreadas por meio de RNA dot blot utilizando uma região

P1 rotulada para sondar a mancha. Linhas de alta expressão

115 foram confirmadas por PCR em tempo real e houve uma concordância razoável entre os métodos de quantificação de mRNA. Os resultados indicam que o vírus da febre aftosa P1 é altamente expresso na lentilha.

Métodos. As plantas de lentilha foram cultivadas por duas semanas em pequenos recipientes de investigação e o tecido resultante foi recolhido e congelados em N₂ líquido. 0 RNA total foi extraído a partir de 100 mg de amostras de tecidos congelados utilizando o kit RNeasy da Qiagen de 96 poços de extração de RNA (Qiagen, Valencia, CA, # 74181) . O RNA foi quantificado, transferido com vácuo para membranas de nylon e sondado com um fragmento do gene da região de PI da sequência do gene FMDV. A extração de tecidos em bruto a partir de linhas que contêm antígenos FMDV foi preparada. Todas as etapas foram realizadas a 4 °C. Cem gramas de biomassa congelada foi misturada com 200 ml de tampão de extração (NaPOí 50 mM, NaCl 0,3 M, EDTA a 10 mM, pH 7,4) e, em seguida, homogeneizados num misturador Waring Blender com uma rajada 20 segundo por 4 vezes e de 10 a 20 segundos de resfriamento no meio. O homogenato foi centrifugado a 10.000 xg durante 30 min a 4 °C, clarificado por passagem através de um pano de queijo para remover quaisquer detritos grandes e, finalmente, filtrado de acetato de celulose (0,22 pm) . O homogenato resultante foi armazenado

116 a 4 °C ou em gelo para o ensaio imediato. 0 homogeneizado restante foi congelado em alíquotas a -80 °C para análise posterior. A proteína solúvel total (TSP) foi determinada utilizando o ensaio de Bradford com albumina de soro bovino como padrão. A análise de nível de proteína foi realizada por linhas de lentilha expressando Pl. As amostras duplicadas foram lidas a partir de duas extrações separadas (total de quatro medições).

Resultados de RNA. Uma ampla faixa de níveis de expressão de RNA foi observada entre as várias linhas de FMDV transgênicos (Figura 11). A expressão a partir de RNA de linhas transgênicas que apresentam os sinais mais fortes de hibridação foi então confirmada por PCR em tempo real. A expressão relativa destas linhas mostrou ser comparável entre o dot-blot e os métodos de PCR. As linhas superiores foram então selecionadas para caracterização adicional por western blot (Figura 12) .

Resultados de proteína. Os resultados ELISA encontramse resumidos na Tabela 4 e os resultados da densitometria e Agilent estão resumidos na Tabela 5. A Figura 12 representa os resultados de WB, com setas indicando as faixas de FMDV. Faixa 1 (ambos os géis) - marcador. Faixa 2 (dois géis) sacarose purificada FMDV A24 vírus inativado. Faixa 3 (ambos os géis) - lisado tipo selvagem de lentilha. Faixas

117 a 6 de linhas expressando MerEOl, lisados, lentilha (três linhas - 6, 8 e 10) . Faixas 4 a 12 Linhas expressando MerE02, lisados, lentilha (nove linhas - 2, 3, 16, 20, 23, 24, 25, 26 e 31). Linhas expressando MerEOl, lentilha, as linhas 6 e 10 parecem produzir uma proteína adequadamente clivada (esta linha contém a protease 3C). As linhas expressando MerE02, lentilha (sem protease) parecem produzir quantidades significativas de proteína de PI não clivada, bem como espécies agregadas com pesos moleculares 10 maiores.

Tabela 4: Resultados de ELISA para quantificação das linhas MerEOl.

Linhagem de lentilha	Concentração de antigeno	média (gg/ml)	TSP médio (mg/ml)	% TSP
MerE01-6	11,35 -	16,84	5,0	0,23 - 0,34
MerE01-10	0,79 -	3,4	5,0	0,02 - 0,07

Tabela 5: Níveis de expressão de linhas MerEOl lentilha-FMDV.

Linhagem de lentilha	Concentração média de antigeno (pgr/ml)1	Média %TSP2
MerE02-2	54,6 ±4,3	2,35
MerE02-3	36,8 ±6,6	1,70
MerE02-26	91,6 ±9,0	3, 95

¹Banda de fundo WT no mesmopeso molecular (cerca de a 100 kDa) menos do que 5 pg/ml.

²Média de proteína solúvel total entre 2,1 e 2,3 mg/ml

118 por análise de Agilent.

Os inventores observaram a expressão da protease 3C exercia efeitos tóxicos na lentilha recombinante, causando redução do crescimento e da produção de antigeno em comparação com, por exemplo, uma lentilha recombinante expressando apenas o polipeptídeo Pl. Assim, as construções novas foram produzidos, algumas das quais compreendendo um cassete de expressão 3C conduzido por um promotor indutível. Desimpedida dos efeitos tóxicos de expressão 3C, a lentilha de água cresceu e expressou níveis consistentes de Pl. Em seguida, depois da cultura atingir uma densidade ótima, a expressão de3C foi induzida de modo que podia clivar os grupos estabelecidos de Pl em subunidades diferentes. As subunidades foram então capazes de se agrupar protômeros, pentâmeros e, finalmente, partículas virais de febre aftosa (esquematizado na Figura 16).

Estas novas construções de FMDV com expressão em lentilha incluídas de MerFOl (SEQ ID NO: 30) incorporam Pl - 3C expresso e são conduzidas pelo promotor Super em vetor de expressão de gene único padrão (EC1.0, análoga à abordagem adotada para produzir MerEOl). MerF02 (SEQ ID NO: 31) utiliza um promotor NPR em Lemna gibba (promotor ABA induzível) para expressar Pl - 3C e MerF03 (SEQ ID NO: 32) expressa P1-2A e 3C com promotores separados num único

119 vetor: Pl - 2A, com expressão dirigida por promotor Super 3C e expressão dirigida por promotor R-histonas em Lemna minor. MerF04 (SEQ ID NO: 33) expressa P1-2A acionado por promotor Super 3C e expressão conduzida por promotor NPR em Lemna gibba. MerF05 (SEQ ID NO: 34) expressa P1-2A (promotor SpUbq) e 3C (promotor de histona-R em Lemna minor) e MerF06 (SEQ ID NO: 35) expressa P1-2A (promotor SpUbq) e 3C (promotor NPR em Lemna gibba).

Preparação de antigenos. Um extrato em bruto foi produzido usando um misturador Waring Blender ou batedor de grânulo (proporção de 1:4 de biomassa para tampão PBS, pH 7,2) e os lisados foram clarificados por centrifugação (~ 10K xg) . Para produzir o concentrado, o lisado clarificado foi filtrado através de um filtro estéril de 0,22 pm. Este material foi então concentrado usando filtros Centricon de 30 kDa (5-10x) e submetido a caracterização in vitro ou em estudo em animal.

Exemplo 2 - Expressão dos antigenos FMDV em Schizochytrium

Códons otimizados FMDV Pl e 3C são genes clonados no vetor de expressão pAB0018 (depósito ATCC η. PTA9616). A sequência de ácido nucleico específica de gene FMDV é otimizada para a expressão em Schizochytrium sp. Além disso, o vetor de expressão contém uma seleção de

120 resistência de cassete marcador que confere aos transformantes Schizochytrium um promotor do gene nativo Schizochytrium para dirigir a expressão do transgene e um terminador.

Schizochytrium sp. (ATCC 20888) é usado como um hospedeiro para a transformação com o vetor de expressão contendo o gene FDMV usando o método de eletroporação. Crio-estoques de linhagens transgênicas de Schizochytrium são cultivados em M50-20 (descrito em US 2008/0022422), até à confluência. As culturas de Schizochytrium propagadas são transferidas para tubos cônicos de 50 mL e centrifugadas a 3000 g durante 15 minutos ou 100.000 g durante 1 hora. O sedimento resultante e a fração solúvel são utilizados para análise de expressão e no estudo de teste dos animais.

Exemplo	3 - Vacinação	de	suínos	avaliação	de
segurança
Três (3)	grupos de cinco	(5)	animais	foram vacinados
nos dias 0 e	21 (DO e D21),	de	acordo com o desenho	do

estudo (Tabela 6) . Detalhes do adjuvante TS6 (emulsões) podem ser encontrados nas Patentes números US 7,608,279 B2, e US 7,371,395 B2 (todas de Merial Limited).

Avaliação da Segurança. Não há reações adversas gerais/sistêmicas que pudessem ser observadas após a vacinação, embora transitória, aumentos de temperatura

121 retal de leve a moderados foram observados em todos os grupos. Localmente, houve reações de leve a moderadas, que foram observadas para os grupos de lentilha. As vacinas foram globalmente aceitáveis para todos os grupos.

Tabela 6 - Vacinação de suínos - projeto de estudo

Grupo	Antigeno	Diluição	Adjuva nte
G1	MerEOl	não diluído	TS6
G2	MerEOl	diluição 1/10	TS6
G3	-	Controle	-

Exemplo 4 - Vacinação de gado

Dezassete (17) unidades gado livre de FMDV, mas não previamente imunizados contra FMDV, foram usados para este estudo (desenho do estudo resumido na Tabela 7). Em D-l, os animais foram divididos em três grupos de 5 animais e um grupo de dois animais. A vacinação foi realizada em DO, por via subcutânea, no lado esquerdo do pescoço. 0 teste foi administrado no D21 e as observações finais foram feitas em D29. Vacinas testadas que expressam FMDV A24 P1-3C, foram formuladas em adjuvante TS6 como descrito acima. Frascos separados de antígenos e adjuvantes foram armazenados a 5 °C antes da administração. Os conteúdos dos frascos foram reconstituídos extemporaneamente por mistura do antigeno com o adjuvante de acordo com o mesmo. 0 volume de uma dose de vacina reconstituída foi de 2 mL. A linhagem de teste

122 foi o vírus da febre aftosa tipo A24 preparado para obter 10 000 de ID50 por 0,2 mL. A linhagem de teste foi diluída em Hanks MEM com 2% de soro fetal bovino com antibióticos.

Tabela 7 - Resumo da vacinação em gado

Grupo	Antígeno	Dose	#Gado
A	FMDV expresso em lentilha	2 ml	5
B	FMDV expresso em vacina experimental recombinante 1	2 ml	5
C	FMDV expresso em vacina experimental recombinante 2	2 ml	5
Controle	NA	NA	2

No D21, os animais foram tranquilizados pela administração de xilazina (0,03 a 0,10 mg por kg de peso corporal IV (0,15 a 0,5 ml por 100 kg de peso corporal IV) e testados com 10 000 de vírus de ID50 por via intradérmíca, em dois locais da língua, 0,1 ml por local. O bemestar geral dos animais foi avaliado diariamente, a partir de Dl a D21. Qualquer observação clínica e tratamentos administrados (nome comercial, ingrediente ativo, data de aplicação, volume, rota) foram anotados.

Os resultados de necropsia (Número de pé, com pelo menos uma vesícula, min = 0, max = 4) para os animais foram os seguintes: lentilha (4, 3, 2, 1, 1), vacina recombinante experimental 1 (0, 0, 1 , 1, 1), vacina recombinante experimental 2 (3, 4, 4, 4, 4) e controles (4, 4). O estudo de teste foi validado na medidas em que os 2 gados de

123 controle mostraram sinais clínicos de febre aftosa, e além disso os animais com a vacina experimental 2 também mostraram sinais claros de febre aftosa e podem servir como controle negativo. Mesmo considerando que o gado no grupo de lentilha não foi bem protegido, o sintoma clínico foi facilitado em dois bovinos. Houve dois animais do grupo de vacina experimental 1 que foram considerados protegidos, o resultado foi coerente com outros relatórios que utilizam um sistema de expressão semelhante e sugerem que VLP intactos eram imunogênicos e foram capazes de fornecer proteção contra FMDV virulento.

É provável que a vacina em lentilha seja melhorada por meio de: 1) o aumento da percentagem de VLP intacto e 2) melhoria das estratégias de concentração/purificação, de modo a que o antígeno vai ser mais acessível para o sistema imune de forma a alcançar uma maior proteção.

Exemplo 5 - caracterização de antígenos FMDV por ELISA sanduíche

A caracterização in vitro de FMDV expresso em lentilha foi realizada com um ELISA de sanduíche utilizando FA24 005E9G (anticorpo monoclonal contra FMDV A24) e M3 biotinilado, um anticorpo 12S-específico de llama de cadeia de domínio único.

Os resultados (Figura 17) indicaram uma densidade

124 óptica a 450nm/630nm positiva para lx de extrato bruto, extrato bruto de 5x, lOx e concentrada, que estava em boa concordância com FMDV A24 inativado como controle positivo, enquanto que o extrato bruto preparado a partir de tipo selvagem de lentilha permaneceu indetectável. A concentração de ELISA foi determinada como o logaritmo decimal por mililitro da diluição para a qual 50% da OD máxima foi obtida. A tabela 8 demonstra que o ELISA para titulação 5x foi superior a lx o extrato, no entanto, o 10 equivalente a 10 vezes o extrato, extrato bruto concentrado e 5x lentilha foi utilizado no estudo de teste de gado.

Tabela 8. Resumo da concentração ELISA

	Amostra	Concentração logl0GD50/ml
FMDV A24	inativado		5,46
MerEOl 1:	< - extrato bruto		2,79
MerEOl concentrado	5x - extrato	bruto	3,34
MerEOl concentrado	lOx - extrato	bruto	3,21
Lentilha bruto	selvagem lx -	extrato	Negativo

Tendo assim descrito em detalhes as formas de realização preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não é para ser limitada aos detalhes específicos estabelecidos na descrição acima, considerando que muitas

125 outras variações aparentes destes são possíveis sem se afastar do espírito ou do âmbito da presente invenção.

Todos os documentos citados ou referenciados na presente invenção e todos os documentos citados ou referenciados neste documento (documentos aqui citados) e todos os documentos citados ou referenciados em documentos aqui citados, juntamente com as instruções de qualquer fabricante, descrições, especificações de produtos e folhetos de produtos de quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento aqui incorporado por referência são aqui incorporados por referência e podem ser utilizados na prática da invenção.

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Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende (a) partículas semelhantes a vírus intactas compreendendo um antígeno de FMDV de Vírus da Febre Aftosa, em que o antígeno de FMDV compreende um polipeptídeo que possui sequências de aminoácidos tal como determinadas nas SEQ ID Nos: 20, 23 e 26; e (b) um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação caracterizada pelo fato de que o antígeno de

   FMDV selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ

   ID

   NO:

   (FMDV P1-3C)

   SEQ ID

   NO: 10 (FMDV P1), SEQ ID NO:

   (FMDV

   VP0), SEQ ID

   NO: 23 (FMDV VP1), SEQ ID NO: 20 (FMDV

   VP3)

   SEQ ID NO: 26 (FMDV

   VP2) e SEQ

   ID

   NO: 29 (FMDV VP4).
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada pelo fato de que o antígeno de FMDV é expresso em uma planta ou microalga.
4. 4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o antígeno de FMDV é parcialmente purificado.
5. 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o antígeno de FMDV é substancialmente purificado.

   Petição 870200008707, de 17/01/2020, pág. 151/161

   2/5
6. 6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende (a) partículas semelhantes a vírus intactas compreendendo um antígeno de FMDV de Vírus da Febre Aftosa, em que o antígeno de FMDV é codificado por um polinucleotídeo que possui a sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 2; e (b) um veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
7. 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o veículo, excipiente ou carreador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável é uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão de óleo-em-água.
8. 8. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para a vacinação de um hospedeiro susceptível a FMDV ovino, bovino, caprino ou suíno.
9. 9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende um protocolo de administração com pré-ativação (prime-boost).
10. 10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida administração prime-boost compreende a administração principal da composição como

    Petição 870200008707, de 17/01/2020, pág. 152/161

    3/5 definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, e uma administração de reforço de uma vacina ou composição que compreende um vetor viral recombinante que contém e expressa o antígeno de FMDV in vivo, ou uma vacina viral inativada que compreende o antígeno de FMDV ou uma vacina de DNA de plasmídeo ou composição que contém ou expressa o antígeno de FMDV.
11. 11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a administração prime-boost compreende uma administração principal de uma vacina ou composição que compreende um vetor viral recombinante que contém e expressa o antígeno de FMDV in vivo, ou uma vacina viral inativada que compreende o FMDV, ou uma vacina de DNA de plasmídeo ou composição que contém ou expressa o antígeno de FMDV, e uma administração de reforço da composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a administração prime-boost compreende uma administração principal da composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 e uma administração de reforço da composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.

    Petição 870200008707, de 17/01/2020, pág. 153/161

    4/5
13. 13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é ovino, bovino, caprino ou suíno.
14. 14. Polipeptídeo de FMDV expresso em uma planta ou microalga substancialmente purificado e, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende:

    a) uma sequência de aminoácidos que possui a sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29;

    b) uma variante conservadora da sequência de aminoácidos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 ou 29.
15. 15. Plasmídeo caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento de DNA que possui a sequência como descrita nas SEQ ID NO: 1, 2, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 28 ou 30 a 35.
16. 16. Plasmídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o plasmídeo é para transformação de plantas.
17. 17. Célula hospedeira microbiana caracterizada pelo fato de que é transformada com o plasmídeo como definido na reivindicação 16.
18. 18. Método de produção de um antígeno de FMDV caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a cultura,

    Petição 870200008707, de 17/01/2020, pág. 154/161

    5/5 num meio de cultura de lentilhas de água, de uma cultura ou de uma cultura de planta de lentilha com nódulo, em que a cultura de planta de lentilhas ou a cultura de planta de lentilha com nódulo é transformada de forma estável para expressar o antígeno, e em que o antígeno é expresso a partir de uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência que codifica o antígeno, e (b) a coleta do antígeno a partir da biomassa da cultura.