ES2795148T3

ES2795148T3 - Vacunas recombinantes contra el virus de la fiebre aftosa y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2795148T3
Application number: ES11709301T
Authority: ES
Inventors: Jean-Christophe Audonnet; Xuan Guo; Bradley J Feilmeier; Karolyn Marie Troupe; Michel Bublot; Kevin Cox
Original assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2031-03-11
Also published as: IL263249B; CN103492410A; JP2013522300A; BR112012023046B1; IL263253A; EP2944322B1; US20110236416A1; EP2545067B1; MA34087B1; EP3093025A1; AU2011224188A1; AU2011224188B2; RU2575599C2; CA2792117C; AR080515A1; BR112012023852A2; US20110236420A1; WO2011112945A2; EP2544716A2; EP2545067A1

Abstract

Composición inmunológica o de vacuna que comprende un antígeno del virus de la fiebre aftosa (FMDV) expresado en lenteja de agua y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, en la que dicho antígeno comprende una partícula similar a virus (VLP), en la que, además, dicho antígeno está codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas recombinantes contra el virus de la fiebre aftosa y usos de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a composiciones para la lucha contra la infección por el virus de la fiebre aftosa (FMDV, por sus siglas en inglés) en animales. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno de FMDV, procedimientos de vacunación contra FMDV y kits para usar con tales procedimientos y composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La fiebre aftosa (FMD) es una de las enfermedades más virulentas y contagiosas que afectan a los animales de granja. Esta enfermedad es endémica en numerosos países del mundo, especialmente en África, Asia y América del Sur. Además, los brotes epidémicos pueden ocurrir periódicamente. La presencia de esta enfermedad en un país puede tener consecuencias económicas muy graves como resultado de la pérdida de productividad, pérdida de peso y producción de leche en rebaños infectados, y de embargos comerciales impuestos a estos países. Las medidas adoptadas contra esta enfermedad consisten en la aplicación estricta de restricciones a la importación, controles de higiene y cuarentena, sacrificio de animales enfermos y programas de vacunación utilizando vacunas inactivadas, ya sea como medida preventiva a nivel nacional o regional, o periódicamente cuando se produce un brote epidémico.

[0003] La fiebre aftosa se caracteriza por su corto período de incubación, su naturaleza altamente contagiosa, la formación de úlceras en la boca y en los pies y, a veces, la muerte de animales jóvenes. La fiebre aftosa afecta a varias especies animales, en particular bovinos, porcinos, ovinos y caprinos. El agente responsable de esta enfermedad es un virus del ácido ribonucleico (ARN) que pertenece al género Aphthovirus de la familia Picornaviridae (Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). En la actualidad, se conocen al menos siete tipos de virus de la fiebre aftosa (FMDV): los tipos europeos (A, O y C), los tipos africanos (SAT1, SAT2 y SAT3) y un tipo asiático (Asia 1). También se han distinguido numerosos subtipos (Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129).

[0004] El virus de la fiebre aftosa es un virus icosaédrico desnudo de aproximadamente 25 nm de diámetro, que contiene una molécula de ARN monocatenario que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF), que codifica una única poliproteína que contiene, entre otras cosas, el precursor de la cápside también conocido como proteína P1 o P88. La proteína P1 está miristilada en su extremo amino terminal. Durante el proceso de maduración, la proteína P1 se escinde por la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C, respectivamente; Belsham GJ, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína VP0 se divide entonces en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B, respectivamente). Se desconoce el mecanismo para la conversión de las proteínas VP0 en VP4 y VP2, y para la formación de viriones maduros. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26,000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeña con aproximadamente 8.000 Da.

[0005] La simple combinación de las proteínas de la cápside forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápside de FMDV. Este protómero se compleja a continuación en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión resulta de la encapsidación de una molécula de ARN genómico mediante el ensamblaje de doce pentámeros 12S, lo que constituye las partículas 146S. La cápside viral también se puede formar sin la presencia de una molécula de ARN en su interior (en lo sucesivo "cápside vacía"). La cápside vacía también se designa como partícula 70S. La formación de cápsides vacías puede ocurrir de forma natural durante la replicación viral o puede ser producida artificialmente mediante tratamiento químico.

[0006] Se han desarrollado muchas hipótesis, rutas de investigación, y propuestas, con la intención de diseñar vacunas eficaces contra la FMD. Actualmente, las únicas vacunas en el mercado comprenden virus inactivados. Existen riesgos acerca de la seguridad de la vacuna contra la FMD, dado que brotes de FMD en Europa se han asociado con defectos en la fabricación de la vacuna (King, A.M.Q. et al., (1981) Nature 293: 479-480). Las vacunas inactivadas no confieren inmunidad a largo plazo, requiriendo de esta manera inyecciones de refuerzo administradas cada año, o con mayor frecuencia en el caso de brotes epidémicos. Además, existen riesgos relacionados con la inactivación incompleta y/o el escape del virus durante la producción de vacunas inactivadas (King, A.M.Q., ibíd). Una meta en la técnica ha sido construir conformacionalmente inmunógenos correctos que carezcan del genoma de FMDV ineficaz para preparar vacunas eficaces y seguras.

[0007] Se ha utilizado satisfactoriamente el virus vaccinia para inmunizar contra el virus de la viruela, lo que culminó en la erradicación a nivel mundial del virus de la viruela en 1980. De esta manera, ha aparecido un nuevo papel importante para los poxvirus, el de un vector manipulado genéticamente para la expresión de genes extraños (Panicali y Paoletti, 1982; Paoletti et al., 1984). Se han expresado genes en vaccinia que codifican antígenos heterólogos, dando como resultado a menudo una inmunidad protectora frente al estímulo debido al patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia et al., 1990). Se ha utilizado también una cepa muy atenuada de vacunas, designada como MVA, como vector para vacunas basadas en poxvirus. El uso de MVA se ha descrito en la patente de los Estados Unidos N° 5.185.146.

[0008] Los sistemas de vectores de vacunas adicionales implican el uso de virus avipox que son poxvirus restringidos de forma natural a un hospedador. El virus de la viruela aviar (FPV; Taylor et al. 1988a, b) y el virus de la viruela del canario (CPV; Taylor et al., 1991 y 1992) se han manipulado para expresar productos génicos extraños. El virus de la viruela aviar (FPV) es el virus prototípico del género Avipox de la familia Poxvirus. El virus produce una enfermedad económicamente importante de las aves de corral que se ha controlado bien desde los años 20 del siglo XX mediante el uso de vacunas atenuadas vivas. La replicación de los virus avipox está limitada a especies de aves (Matthews, 1982), y no existen informes en la bibliografía de un virus avipox que produzca una infección productiva en alguna especie no de ave, incluyendo el hombre. Esta restricción del hospedador proporciona una barrera de seguridad inherente frente a la trasmisión del virus a otras especies y hace que el uso del virus avipox basado en vectores de vacuna en aplicaciones veterinarias y humanas sea una proposición atractiva.

[0009] Se han preparado otros vectores de poxvirus atenuados mediante modificaciones genéticas de cepas de tipo salvaje del virus. El vector NYVAC, derivado por deleción de virulencia específica y los genes de la gama de hospedadores de la cepa Copenhagen de vaccinia (Tartaglia et al., 1992) han demostrado ser útiles como un vector recombinante en la estimulación de una respuesta inmunoprotectora frente a un antígeno extraño expresado. Otro vector de poxvirus manipulado genéticamente es ALVAC, derivado del virus de la viruela del canario (véase la patente de los Estados Unidos N° 5.756.103). ALVAC no se replica de forma productiva en hospedadores no de ave, una característica que se piensa que mejora su perfil de seguridad (Taylor et al., 1991 y 1992). ALVAC se ha depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection con el número de acceso VR-2547. Otro vector adicional de poxvirus manipulado genéticamente es TROVAC, derivado del virus de la viruela aviar (véase la Patente de los Estados Unidos N° 5.766.599).

[0010] Se pueden construir poxvirus recombinantes en dos etapas conocidas en la técnica y análogas a los procedimientos para la creación de recombinantes sintéticos de poxvirus, tales como el virus vaccinia y el virus avipox descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos 4.769.330; 4.722.848; 4.603.112; 5.110.557; 5.174.993; 5.494.807, y 5.505.941, las descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Puede apreciarse de esta manera que la disposición de un poxvirus recombinante de FMDV, y de las composiciones y productos del anterior, particularmente, recombinantes de FMDV basados en ALVAC o TROVAC y composiciones y productos de los anteriores, especialmente dichos recombinantes que contienen los genes PI y/o el gen de la proteasa C3 de FMDV, y las composiciones y productos del anterior, serían un avance muy deseable sobre el estado actual de la tecnología.

[0011] Recientemente, se han investigado plantas como una fuente para la producción de agentes terapéuticos, tales como vacunas, anticuerpos y productos biofarmacéuticos. Sin embargo, la producción de vacunas, anticuerpos, proteínas y productos biofarmacéuticos a partir de plantas está lejos de ser un proceso compensatorio, y existen numerosos obstáculos que comúnmente se asocian con dicha producción de vacunas. Las limitaciones para la producción exitosa de vacunas de plantas incluyen el bajo rendimiento del bioproducto o antígeno expresado (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001, 6, 495-496), inestabilidad de proteínas, inconsistencias en la calidad del producto (Schillberg et al., Vaccine 2005, 23, 1764-1769), y la capacidad insuficiente para producir productos de tipo viral de tamaño e inmunogenicidad esperados (Arntzen et al., Vaccine 2005, 23, 1753-1756). Para abordar estos problemas, la optimización de codones, los enfoques cuidadosos para recoger y purificar productos vegetales, el uso de partes de la planta, tales como los cloroplastos para aumentar la absorción del material y el reconocimiento subcelular mejorado se consideran estrategias potenciales (Koprowski, Vaccine 2005, 23, 1757 1763).

[0012] Teniendo en cuenta la susceptibilidad de los animales (incluyendo seres humanos, aunque raramente) a FMDV, un procedimiento de prevención de la infección de FMDV y la protección de los animales es esencial. En consecuencia, existe la necesidad de una vacuna eficaz contra el virus de la fiebre aftosa.

[0013] Los extractos foliares de plantas de tomate transgénicas que expresan la poliproteína estructural, P1-2A, y proteasa, 3C, del virus de la fiebre aftosa han demostrado producir una respuesta protectora en los conejillos de indias (Pan et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 2007, 121, 83-90).

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0014] La invención es tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

[0015] En una primera realización, la presente invención proporciona una composición inmunológica o de vacuna que comprende un antígeno del virus de la fiebre aftosa (FMDV) expresada en lenteja de agua y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, en la que dicho antígeno comprende una partícula similar a virus (VLP), en la que además dicho antígeno está codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 2.

[0016] En una segunda realización, la presente invención proporciona una composición de acuerdo con la invención para uso en un procedimiento de vacunación de un hospedador susceptible a FMDV ovino, bovino, caprino o porcino.

[0017] En una tercera realización, la presente invención proporciona una planta de lenteja de agua transformada con un plásmido que comprende un fragmento de ADN que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, en donde el plásmido es para la transformación de plantas.

[0018] En una cuarta realización, la presente invención proporciona una planta de lenteja de agua transformada de manera estable con: (a) un plásmido que comprende un fragmento de ADN que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, en la que el plásmido es para transformación de la planta; o (b) un gen que expresa un antígeno de FMDV, en el que el antígeno tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 3.

[0019] Las composiciones que comprenden un polipéptido antigénico de FMDV y fragmentos y variantes del mismo se describen en el presente documento. Los antígenos y fragmentos de FMDV y sus variantes poseen propiedades inmunogénicas y protectoras. Los antígenos de FMDV pueden producirse en una planta o alga.

[0020] Los polipéptidos antigénicos y fragmentos y variantes de los mismos pueden ser formulados en vacunas y/o composiciones farmacéuticas. Dichas vacunas se pueden usar para vacunar a un animal y proporcionar protección contra al menos una cepa de FMDV.

[0021] Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen procedimientos para preparar los polipéptidos antigénicos en una planta de lenteja de agua. Los procedimientos también incluyen procedimientos de uso que incluyen administrar a un animal una cantidad eficaz de un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo para producir una respuesta inmunogénica protectora. Después de la producción en lenteja de agua, el polipéptido antigénico puede purificarse parcial o sustancialmente para su uso como vacuna.

[0022] Los kits que comprenden al menos un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo y las instrucciones de uso también se describen en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0023] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor en conjunción con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 representa una tabla que resume las secuencias de ADN y proteínas, presentadas como una lista en el apéndice de la presente solicitud;

La figura 2 representa la secuencia de FMDV nativa y optimizada que se expresó en lenteja de agua. El polipéptido expresado se escinde en sus proteínas individuales por la proteasa 3C que se pliega después de la traducción, se autoescinde para liberarse del polipéptido y finalmente realiza escisiones internas dentro del polipéptido PI.

La figura 3 representa la identidad y la ubicación de los antígenos de FMDV optimizados con lenteja de agua para las 4 construcciones de expresión en lenteja de agua "MerE";

La figura 4 es un alineamiento de secuencia de FMDV optimizado para la expresión en lenteja de agua (SEQ ID NO: 2) y FMDV optimizado para la expresión en células de mamífero (SEQ ID NO: 1). Se indica la identidad de secuencia;

La figura 5 representa el plásmido pHM-1119-1, que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica el FMDV optimizado para mamíferos P1-3C (SEQ ID NO: 1);

La figura 6 representa el plásmido pMerE01, Promotor fuerte P1 2A/2B1 (A24) 3C (A12);

La figura 7 representa pMerE02, Promotor fuerte P1;

La figura 8 representa el plásmido pMerE03, promotor fuerte P1 2A/2B1 (A24) promotor débil 3C (A12);

La figura 9 representa el plásmido pMerE04, promotor fuerte P1 2A/2B1 (A24) promotor débil 3C (A12) con 5'UTR optimizada;

La figura 10 representa una transferencia de puntos de ARN representativa utilizada para seleccionar líneas celulares de lenteja de agua recombinante para la expresión de genes que codifican antígenos de FMDV;

La figura 11 representa resultados de PCR cuantitativos representativos para líneas celulares de lenteja de agua que expresan construcciones de FMDV;

La figura 12 representa la transferencia Western para líneas celulares de lenteja de agua que albergan y expresan MerE01 y MerE02;

La figura 13 representa micrografías electrónicas de partículas similares a virus (VLP) de FMDV de la invención; La figura 14 representa una micrografía electrónica de grupos de VLP de FMDV;

La figura 15 representa el análisis WB de extracto crudo de MerE01 y MerE03 (5 ug TSP/carril) usando suero de cobaya. Para MerE01, se observaron banda o bandas de VP1 (VP3), lo que sugiere la expresión de P1 y 3C y un procesamiento posterior de P1. Para MerE03, no se observaron PI ni VP1 (VP3), lo que sugiere la expresión de 3^cy la degradación de P1;

La figura 16 presenta un diagrama esquemático de partículas virales de FMD;

La figura 17 presenta DO de concentraciones decrecientes de varios extractos de lenteja de agua que expresan antígenos de FMDV medidas mediante ELISA;

La figura 18 presenta el mapa de plásmido MerF01 con tabla de resumen de características;

La figura 19 presenta el mapa de plásmido MerF02 con la tabla de resumen de características;

La figura 20 presenta el mapa de plásmido MerF03 con tabla de resumen de características;

La figura 21 presenta el mapa de plásmido MerF04 con tabla de resumen de características;

La figura 22 presenta el mapa de plásmido MerF05 con tabla de resumen de características;

La figura 23 presenta el mapa de plásmido MerF06 con la tabla de resumen de características.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0024] En el presente documento se describen composiciones que comprenden un polipéptido de FMDV, antígeno y fragmentos y variantes del mismo que provocan una respuesta inmunogénica en un animal. Los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes de los mismos se producen en una planta o alga. Los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes pueden formularse en vacunas o composiciones farmacéuticas y usarse para provocar o estimular una respuesta protectora en un animal. En una realización, el antígeno polipeptídico es un polipéptido PI o 3C de FMDV o un fragmento activo o variante del mismo.

[0025] Se reconoce que los polipéptidos antigénicos descritos en el presente documento pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos activos o variantes de los mismos. Por "fragmentos activos" o "variantes activas" se entiende que los fragmentos o variantes retienen la naturaleza antigénica del polipéptido. Por lo tanto, en el presente documento se describe cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV que provoque una respuesta inmunogénica en un animal. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMD^vpuede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento o variante de los mismos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como un ovino, bovino, caprino o porcino.

[0026] Los polipéptidos antigénicos de FMDV particulares incluyen PI y 3C. El FMDV es un virus icosaédrico no envuelto de aproximadamente 25 nm de diámetro, que contiene una molécula de ARN monocatenario que consiste en aproximadamente 8500 nucleótidos, con una polaridad positiva. Esta molécula de ARN comprende un único marco de lectura abierto (ORF), que codifica una única poliproteína que contiene, entre otros, el precursor de la cápside, también conocido como proteína PI o P88. La proteína PI está miristilada en su extremo amino terminal. Durante el proceso de maduración, la proteína PI es escindida por la proteasa 3C en tres proteínas conocidas como VP0, VP1 y VP3 (o 1AB, 1D y 1C, respectivamente; Belsham GJ, Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). En el virión, la proteína VP0 se divide entonces en dos proteínas, VP4 y VP2 (o 1A y 1B, respectivamente). Se desconoce el mecanismo para la conversión de las proteínas VP0 en VP4 y VP2, y para la formación de viriones maduros. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 tienen un peso molecular de aproximadamente 26.000 Da, mientras que la proteína VP4 es más pequeña con aproximadamente 8.000 Da. Las secuencias de FMDV también se describen en las patentes de Estados Unidos Nos. Us 7,527,960 y US 7,531,182.

[0027] La simple combinación de las proteínas de la cápside forma el protómero o molécula 5S, que es el constituyente elemental de la cápside de FMDV. Este protómero se compleja a continuación en un pentámero para formar la molécula 12S. El virión resulta de la encapsidación de una molécula de ARN genómica mediante el ensamblaje de doce pentámeros 12S, constituyendo así las partículas 146S. La cápside viral también se puede formar sin la presencia de una molécula de ARN en su interior (en adelante "cápside vacía"). La cápside vacía también se designa como partícula 70S. La formación de cápsides vacías puede tener lugar de forma natural durante la replicación viral o puede ser producida artificialmente mediante tratamiento químico.

[0028] La presente invención se refiere a vacunas o composiciones para especies bovina, ovina, caprina o porcina que pueden comprender una cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante, y un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0029] En algunas realizaciones, las vacunas comprenden, además, adyuvantes, tales como emulsiones de aceiteen-agua (O/W) descritas en la patente US 7.371.395.

[0030] En otras realizaciones, los adyuvantes incluyen EMULSIGEN, hidróxido de aluminio, saponina, y CpG o combinaciones de los mismos.

[0031] En algunas realizaciones, la respuesta en el animal es una respuesta inmunitaria protectora.

[0032] Por "animal" se entienden mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, mono), y pescado. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo etapas embrionaria y fetal.

[0033] El término "plantas", tal como se usa en el presente documento, incluye tanto las plantas dicotiledóneas (dicot) como las plantas monocotiledónea (monocot). Las plantas dicotiledóneas incluyen, entre otras, legumbres, tales como guisantes, alfalfa y soja, zanahoria, apio, tomate, patata, tabaco, pimienta, colza, remolacha, repollo, coliflor, brócoli, lechuga, cacahuete y similares. Las plantas monocotiledóneas incluyen, entre otras, cereales, tales como trigo, cebada, sorgo y mijo, centeno, triticale, maíz, arroz o avena, caña de azúcar, miembros de la familia de las microalgas, pastos y similares. El término "planta" también incluye plantas sin floración que incluyen, pero no se limitan a, helechos, colas de caballo, “pata de lobo”, musgos, hepáticas, antoceros, algas, por ejemplo, algas rojas, marrones y verdes, gametofitos y similares.

[0034] El término "algas" y "alga", tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier cepa de algas capaz de producir un polipéptido o fragmento o variante del mismo. Las algas pueden ser microalgas. Las microalgas pueden ser Thraustochytriaceae, por ejemplo, Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides y Japonochytrium.

[0035] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0036] Cabe indicar que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos, tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que términos, tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no mencionados explícitamente, pero excluyen elementos que se hayan en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

Los polipéptidos antigénicos de la invención son capaces de proteger contra FMDV. Es decir, son capaces de estimular una respuesta inmunitaria en un animal. Por "antígeno" o "inmunógeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

[0037] El término "proteína, polipéptido o péptido inmunogénico", como se usa en el presente documento incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administra al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. En realizaciones, el fragmento de proteína tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína descrito en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier técnica de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales son fácilmente identificados mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen en el documento PCT/US2004/022605.

[0038] Tal como se describe, en el presente documento se describen fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "protéina, polipéptido o péptido inmunogénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

[0039] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0040] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará tanto una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, tal que la resistencia a una nueva infección se verá aumentada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas y/o signos clínicos de la enfermedad normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.

[0041] Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Véase, por ejemplo, Bergmann et al., 1983; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Los fragmentos inmunogénicos descritos en el presente documento incluirán generalmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 5 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos, o aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No existe un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprenda al menos un epítopo de la proteína.

[0042] Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es que comprende o consiste esencialmente o consiste en nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antigénico de un polipéptido de FMDV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido de FMDV puede comprender o consistir esencialmente en un mínimo de 15 nucleótidos, aproximadamente 30-45 nucleótidos, aproximadamente 45 75, o al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipéptido. Se pueden utilizar procedimientos de determinación de epítopos, tales como la generación de bibliotecas de péptidos superpuestos (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Kits de síntesis de péptidos de Chiron) y algoritmos (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605).

[0043] El término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de mareaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son los agentes de bloqueo, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivados de un microorganismo.

[0044] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0045] En el presente documento se decribe una hebra complementaria a un polinucleótido que codifica un antígeno epítopo o inmunógeno de FMDV. La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación.

[0046] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "polipéptido fragmento" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede ser interrumpido por restos químicos distintos de los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.

[0047] Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce naturalmente el componente, por ejemplo, otro de ADN y ARN, proteínas y orgánulos cromosómicos y extracromosómicos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por tecnología recombinante, así como síntesis química.

[0048] El término "purificado" como se usa en el presente documento no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido purificado es una en la que el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido está en su medio natural. En algunos casos, el polipéptido se separa de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" se entiende el polipéptido representa, en varias realizaciones, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, o más de los componentes o materiales celulares se han eliminado. Del mismo modo, un polipéptido puede estar parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entiende que se elimina menos del 60% de los componentes o materiales celulares. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en este documento se pueden purificar por cualquiera de los medios conocidos en la técnica.

[0049] Como se señaló anteriormente, los polipéptidos antigénicos o fragmentos o variantes de los mismos son polipéptidos antigénicos de FMDV que son producidos en lenteja de agua. En el presente documento también se describen fragmentos y variantes de los polinucleótidos y polipéptidos descritos codificados por los mismos. Por "fragmento" se entiende una porción del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos antigénica codificada por el mismo. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y, por lo tanto, tienen actividad inmunogénica como se indica en otra parte del presente documento. Los fragmentos de la secuencia de polipéptidos conservan la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal.

[0050] "Variantes" pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se usa en el presente documento, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. La proteína "variante" pretende significar una proteína derivada de la proteína nativa por deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria.

[0051] En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos de FMDV de origen ovino, bovino, caprino o porcino. En el presente documento se describe un polipéptido que tiene una secuencia, tal como se establece en las SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 o 29, y una variante o fragmento del mismo.

[0052] Además, en el presente documento se decriben homólogos de polipéptidos de FMDV de especie ovina, bovina, caprina, o porcina. Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o funciones similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos generalmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, los ortólogos y los parálogos de un polipéptido de FMDV de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido de FMDV de tipo salvaje por modificaciones postraduccionales, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. En particular, los homólogos de la invención exhibirán generalmente al menos 80-85%, 85-90%, 90-95% o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con toda o parte de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos de FMDV de tipo salvaje, y exhibirán una función similar. Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Dichas variaciones alélicas naturales típicamente pueden dar como resultado una variación de 1 a 5% en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse secuenciando la secuencia de ácido nucleico de interés en varias especies diferentes, lo cual puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético genético en esas especies. En el presente documento se describe cualquiera y todas estas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que sean el resultado de una variación alélica natural y que no alteren la actividad funcional del gen de interés.

[0053] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservativas de aminoácidos u otras modificaciones menores, de manera que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido de FMDV que pueden dar lugar a péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento.

[0054] El término "variación conservativa" indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, tal como se describe anteriormente.

[0055] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Tal como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos de FMDV, la secuencia de ADN del gen de proteína de FMDV se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos con el hallado sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, la poliadenilación inapropiada, la degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. Se puede lograr una mayor expresión de la proteína de FMDV en dichas especies utilizando la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen en la descripción siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de FMDV codificada por la secuencia de nucleótidos no cambie funcionalmente.

[0056] La identidad de secuencia entre dos secuencias de amino ácido puede ser establecida por el “blast” por pares y la matriz blosum62 de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) utilizando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el "Centro Nacional de Información Biotecnológica "(NCBI, Bethesda, Maryland, EE. UU.), así como en Altschul et al.; y por lo tanto, este documento habla del uso del algoritmo o la matriz B^lAST o BLA^sT^xy BLOSUM62 mediante el término "blasts").

[0057] La "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en el que la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización de hueco de 4, y se puede realizar convenientemente el análisis e interpretación asistidos por ordenador de los datos de secuencia, incluyendo la alineación, utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerand la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0058] La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

[0059] Los siguientes documentos proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de secuencias, y adicionalmente o alternativamente con respecto a lo anterior, las enseñanzas de estas referencias pueden utilizarse para determinar el porcentaje de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD; Smith TF y Waterman MS; Smith TF, Waterman MS y Sadler JR; Feng DF y Dolittle RF; Higgins DG y Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ; y Devereux J, Haeberlie P y Smithies O. Y, sin gran experimentación, el experto en la materia puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.

[0060] Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son bien conocidas. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989).

[0061] La presente invención abarca además los polinucleótidos de FMDV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y unidos operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0062] Un "vector" se refiere a un plásmido de ADN o ARN recombinante o virus que comprende un polinucleótido heterólogo para ser liberado a una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para fines de prevención o terapia, y opcionalmente puede estar en forma de un casete de expresión. Como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replicarse en la célula o sujeto diana final. El término incluye vectores de clonación y vectores virales.

[0063] El término "recombinante" significa un polinucleótido semisintético, o de origen sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

[0064] "Heterólogos" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia de codificación nativa y unido operativamente a una secuencia de codificación distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0065] La presente invención se refiere a vacunas o composiciones farmacéuticas o inmunológicas para especies ovina, bovina, caprina y porcina que pueden comprender una cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante y un portador, excipiente, o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0066] La materia descrita en este documento está dirigida en parte, a composiciones y procedimientos relacionados con el antígeno de FMDV preparado en un sistema de expresión de planta o alga que es altamente inmunogénico y protege a los animales contra la estimulación de cepas de FMDV homólogas y heterólogas.

Composiciones

[0067] La presente invención se refiere a una vacuna o composición contra FMDV que puede comprender una cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento, se describe que el antígeno de FMDV recombinante se expresa en una planta o alga.

[0068] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a una composición que comprende un antígeno de FMDV producido por un sistema de expresión de lenteja de agua y material vegetal de lenteja de agua, incluyendo el género Lemna, y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a una proteína opcionalmente aglicosilada producida por un sistema de expresión de lenteja de agua que comprende un antígeno de FMDV.

[0069] En una realización, el antígeno de FMDV recombinante se expresa en las algas. En otra realización, las algas se seleccionan de Schizochytrium. En una realización, el antígeno de FMDV recombinante puede expresarse en un sistema de expresión de proteínas de Schizochytrium, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos US 7.001.772, US 2008/0022422, solicitud provisional US 61/160.618, y las solicitudes provisionales de los Estados Unidos presentadas simultáneamente el 28 de diciembre de 2009 por Martek BioScience Corp. (MD, EE. UU.).

[0070] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a una proteína producida por una sistema de expresión en planta o alga que comprende un antígeno de FMDV y material de la planta o alga.

[0071] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a una vacuna o composición que comprende un antígeno de FMDV producido por un sistema de expresión de la lenteja de agua.

[0072] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a una vacuna o composición que comprende un antígeno de FMDV producido por un sistema de expresión de la lenteja de agua y material vegetal de lenteja de agua.

[0073] En una realización, la materia descrita en el presente documento se refiere a una planta o cultivo de plantas transformadas de forma estable que expresa un antígeno de FMDV en el que la planta o el cultivo de plantas se selecciona de la lenteja de agua.

[0074] En este documento se describe cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV que provoca una respuesta inmunogénica en un animal, tal como un animal ovino, bovino, caprino o porcino. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento del mismo, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal, tal como un animal ovino, bovino, caprino o porcino.

[0075] En una forma de realización en la que la composición inmunológica o vacuna contra FMDV es una composición inmunológica o vacuna recombinante, comprendiendo la composición o vacuna un vector recombinante y un excipiente, portador o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable; el vector recombinante es un vector de expresión en planta que puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, NS1, VP7, NS2, VP6, NS3, NS3a, PI, VP0, 3C o cualquier fragmento del mismo.

[0076] En otra realización, el antígeno de FMDV es PI, VP0, VP3, VP1, VP2, VP4, 2A, 2B, o 3C.

[0077] En una forma de realización en la que la composición inmunológica o vacuna contra FMDV es una composición inmunológica o vacuna recombinante, comprendiendo la composición o vacuna un vector recombinante y un excipiente, portador o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable; el vector recombinante es un vector de expresión de planta que puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser un polipéptido de FMDV VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B o 3C. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos del virus de la fiebre aftosa (FMDV) es un ADNc que codifica la región de PI de FMDV y un ADNc que codifica la proteasa FMDV 3C de FMDV.

[0078] En una realización, el antígeno de FMDV puede ser un polipéptido P1-3C. En otra realización, el antígeno de FMDV puede ser PI solo o P1-2A/2B1. En otra realización, el antígeno de FMDV puede ser VP0-VP3. En otra realización, el antígeno de FMDV puede ser VP4-VP2. En otra realización, el antígeno de FMDV puede ser 3C, o puede ser 3C con una 5'UTR optimizada para la expresión en la lenteja de agua. En una realización, los polipéptidos P1-2A/2B1 y 3C pueden expresarse en lenteja de agua usando una sola construcción y la expresión puede estar regulada por una o más de una secuencia promotora.

[0079] En otra realización, el antígeno de virus de FMDV puede ser O1 Manisa, O1 BFS o Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran’96, A22 Irak, SAT2 Arabia Saudita de FMDV

[0080] La presente invención se refiere a una vacuna contra FMDV que puede comprender una cantidad eficaz de un antígeno de FMDV recombinante y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento se describe que el antígeno de FMDV puede ser PI, VP0, VP3, VP1, VP2, VP4 o 3C de FMDV.

[0081] Además se describe en el presente documento que el antígeno de FMDV recombinante se expresa en una planta o alga. En otra realización, la planta es una planta de lenteja de agua, que incluye una planta Lemna. En otra realización, la planta es Lemna minor. En una realización, el antígeno de FMDV recombinante puede expresarse en un sistema de expresión de proteína Lemna minor patentado, ventajosamente el sistema SM de LEX de Biolex. En el presente documento se describe que las algas se seleccionan de Schizochytrium. En el presente documento se describe que el antígeno de FMDV recombinante puede expresarse en un sistema de expresión de proteína de Schizochytrium, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos US 7.001.772, US 2008/0022422, US 2010/0233760 A1 por Martek BioScience Corp. (MD, EE. UU.).

[0082] En otra realización, el portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. En otra realización, la emulsión de agua en aceite puede ser una emulsión de aceite en agua.

[0083] La invención abarca además los polinucleótidos de FMDV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y unido operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0084] En el presente documento se describen polipéptidos de FMDV, particularmente polipéptidos ovinos, bovinos, caprinos o porcinos que tienen una secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 3 y variantes o fragmentos de los mismos.

[0085] En este documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido antigénico de la invención, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia, tal como se establece en SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 o 29.

[0086] En este documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos de FMDV identificados anteriormente (SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 o 29) que un experto en la técnica puede preparar fácilmente utilizando técnicas bien conocidas de biología molecular.

[0087] Las variantes son polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos, tal como se establece en SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 o 29.

[0088] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido de FMDV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido de FMDV que tiene una secuencia, tal como se establece en SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 o 29, o sus variantes. En otra realización, un fragmento de un polipéptido de FMDV incluye un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido de FMDV de longitud completa.

[0089] Se describe además en el presente documento un polinucleótido que codifica un polipéptido de FMDV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia tal como se establece en las SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26, o 29. Además en el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26 o 29, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.

[0090] Se describe además en el presente documento un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos, tal como se establece en SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24 , 25, 27, 28, 30-35, o una variante del mismo. Además se describe en el presente documento un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22, 24,25, 27, 28, 30-35, o una variante del mismo.

[0091] Los polinucleótidos de la presente invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o uno diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier construcción que sea deseable para proporcionar realizaciones de la presente invención.

[0092] Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV están ventajosamente presentes en un vector de la invención. De manera mínima, comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un codón de iniciación (ATG), un codón de parada y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores, tales como plásmidos y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos de los poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, por ejemplo, un péptido de FMDV, ventajosamente, en el vector, se coloca un ATG en 5' del marco de lectura y se coloca un codón de parada en 3'. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizadoras, tales como secuencias de intrones y señales que permiten la secreción de la proteína.

[0093] También se describen en el presente documento preparaciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión, por ejemplo, composiciones terapéuticas. Las preparaciones pueden comprender uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden y expresan uno o más polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de FMDV. En una realización, el vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleótido que codifica (y ventajosamente expresa) un antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, en un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Por lo tanto, en el presente documento se describe que el otro vector o vectores en la preparación comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polinucleótido que codifica, y en circunstancias apropiadas, el vector expresa una o más proteínas adicionales de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, o un fragmento del mismo.

[0094] De acuerdo con otra realización, el vector o vectores en la preparación comprenden o consisten esencialmente en, o consisten en polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmento o fragmentos de las mismas de un polipéptido de, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, el vector o los vectores que expresan los polinucleótidos. En otra realización, la preparación comprende uno, dos o más vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan, ventajosamente in vivo, un polipéptido, antígeno, proteína de fusión de FMDV o un epítopo del mismo. También se describen en el presente documento mezclas de vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan diferentes polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de FMDV, por ejemplo, un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV de diferentes especies animales tales como, pero no limitado a, animales ovinos, bovinos, caprinos o porcinos.

De acuerdo con una realización adicional de la invención, el vector de expresión es un vector plásmido o un vector de plásmido de ADN, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo específico, no limitativo, el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL, Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7 (10): 1205-17; véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos: 5.846.946 y 6.451.769) se pueden utilizar como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 deriva de pVR1012 y contiene la secuencia señal de tPA humana. En una realización, la señal de tPA humana comprende desde el aminoácido M (1) hasta el aminoácido S (23) en Genbank con el número de acceso HUMTPA14. En otro ejemplo específico, no limitante, el plásmido utilizado como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos puede contener la secuencia del péptido señal de IGF1 equino del aminoácido M (24) al aminoácido A (48) en Genbank bajo la accesión número U28070. Se puede consultar o empelar información adicional sobre los plásmidos de ADN en la práctica, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473; y 6.221.362.

[0095] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido según la presente invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseados; y, en este sentido, se observa que un plásmido circular superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención.

[0096] Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV, opcionalmente fusionado con una secuencia, variante, análogo o fragmento de péptido heterólogo, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. El promotor fuerte puede ser, entre otros, el promotor inmediato inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente que tiene otro origen, tal como la rata o el conejillo de indias, el Super promotor (Ni, M. et al.., Plant J. 7, 661-676, 1995.). El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real, que puede o no estar asociada con la parte potenciadora. Se puede hacer referencia a EP-A-260 148, EP-A-323 597, Patentes de Estados Unidos: 5,168,062, 5,385,839 y 4,968,615, así como a la Solicitud PCT No WO87/03905. El promotor CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart et al., 1985) o CMV-IE murino.

[0097] En términos más generales, el promotor tiene un origen viral, vegetal o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto del CMV-IE que puede emplearse de forma útil en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse de forma útil en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18(22): 2337-44), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989).

[0098] Se puede utilizar cualquiera de los promotores constitutivos, regulables o dependientes de estímulo. Por ejemplo, los promotores constitutivos pueden incluir el promotor de la manonopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. Alternativamente, puede ser ventajoso usar promotores de genes de choque térmico, promotores de genes inducibles por sequía, promotores de genes inducibles por patógenos, promotores de genes inducibles por heridas y promotores de genes inducibles por luz/oscuridad. Puede ser útil utilizar promotores controlados por reguladores del crecimiento de las plantas, tales como el ácido abscísico, las auxinas, las citoquininas y el ácido giberélico. También se pueden elegir promotores que proporcionen una expresión específica de tejido (por ejemplo, promotores específicos de raíz, hoja y flores).

[0099] Los plásmidos pueden comprender otros elementos de control de expresión. Es particularmente ventajoso incorporar secuencia(s) estabilizadora(s), por ejemplo, secuencias de intrones, por ejemplo, intrón de deshidrogenasa de alcohol de maíz (Callis et al. Genes & Dev.1 (10): 1183-1200, diciembre de 1987), el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud PCT No. WO1989/01036), el intrón II del gen de la p-globina de conejo (van Ooyen et al., 1979). En otra realización, los plásmidos pueden comprender 3' UTR. 3' UTR puede ser, pero no limitado a, 3' UTR de agrobacterium nopalina sintasa (Nos) (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12 (22): 8711-8721).

[0100] En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede usarse la señal poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal poli(A) del gen de beta-globina de conejo o la señal poli(A) del virus SV40.

[0101] Una "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma.

[0102] En una realización, el antígeno de FMDV recombinante se expresa en una planta o alga transgénica. En otra realización, la planta transgénica es una planta de Lemna. En otra realización, la planta transgénica es Lemna minor (lenteja de agua). En otra realización, el antígeno de FMDV recombinante puede expresarse en el sistema de expresión de proteínas Lemna minor (lenteja de agua), el sistema LEXSM de Biolex. Los detalles del sistema de expresión de proteínas Lemna minor (lenteja de agua) se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 6.815.184, 7.022.309, 7.160.717, 7.176.024, 6.040.498 y 7.161.064. En otra realización, el alga transgénica es Schizochytrium. Se pueden encontrar detalles del sistema de expresión de proteínas en algas, por ejemplo, en los documentos US 7.001.772, US 2008/0022422, solicitud provisional US 61/160.618. El antígeno de FMDV en las realizaciones puede ser cualquier polipéptido descrito en este documento, o un polipéptido codificado por cualquier polinucleótido descrito en este documento.

Procedimientos para expresar polipéptidos de FMDV en lenteja de agua o microalga

[0103] Por lo tanto, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los polipéptidos de FMDV antigénicos, o fragmentos o variantes de los mismos, se expresan en lenteja de agua o microalga. Estos procedimientos o microalga comprenden el uso de casetes de expresión que se introducen en una planta de lenteja de agua utilizando cualquier procedimiento de transformación adecuado conocido en la técnica. Los polinucleótidos dentro de estos casetes de expresión pueden modificarse para una expresión mejorada del polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, en lenteja de agua o microalga, tal como se indica a continuación.

Casetes para la expresión en lenteja de agua o microalga de polipéptidos antigénicos de FMDV

[0104] La lenteja de agua o microalga transgénicas que expresan un polipéptido antigénico de FMDV, o un fragmento o variante del mismo, se obtienen mediante la transformación de la lenteja de agua o microalga con un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV, o un fragmento o variante del mismo. De esta manera, un polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, se construye dentro de un casete de expresión y se introduce en una planta de lenteja de agua o cultivo de microalga mediante cualquier procedimiento de transformación adecuado conocido en la técnica.

[0105] En algunas realizaciones, la planta de lenteja de agua o microalga que se transforma con un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, también se ha transformado con un casete de expresión que proporciona la expresión de otro polipéptido heterólogo de interés, por ejemplo, otro polipéptido antigénico de FMDV, fragmento o variante del mismo. El casete de expresión que proporciona la expresión de otro polipéptido heterólogo de interés puede proporcionarse en el mismo polinucleótido (por ejemplo, en el mismo vector de transformación) para su introducción en una planta de lenteja de agua o microalga, o en un polinucleótido diferente (por ejemplo, en vectores de transformación diferentes) para la introducción en una planta de lenteja de agua o microalga al mismo tiempo o en diferentes momentos, mediante el mismo o mediante diferentes procedimientos de introducción, por ejemplo, mediante el mismo procedimiento o mediante diferentes procedimientos de transformación.

[0106] El casete de expresión para uso en la transformación de lenteja de agua o microalga comprenden elementos de control de la expresión que al menos comprenden una región de iniciación transcripcional (por ejemplo, un promotor) unida operativamente al polinucleótido de interés, es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, fragmento o variante del mismo. "Unida operativamente", tal como se usa en el presente documento, en referencia a secuencias de nucleótidos se refiere a múltiples secuencias de nucleótidos que se colocan en una relación funcional entre sí. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, en el marco de lectura. Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del polinucleótido o polinucleótidos de interés (por ejemplo, un polinucleótido de interés, dos polinucleótidos de interés, etc.) para que estén bajo la regulación transcripcional del promotor y otros elementos de control de la expresión. En realizaciones particulares de la invención, el polinucleótido a transferir contiene dos o más casetes de expresión, cada uno de los cuales contiene al menos un polinucleótido de interés.

[0107] Por "elemento de control de expresión" se entiende una región reguladora de ADN, que generalmente comprende una caja TATA, capaz de dirigir la ARN polimerasa II, o en algunas realizaciones, la ARN polimerasa III, para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un elemento de control de expresión puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento generalmente ubicadas en dirección 5' de la caja TATA, que influyen (por ejemplo, mejoran) la velocidad de inicio de la transcripción. Además, un elemento de control de expresión puede comprender adicionalmente secuencias generalmente colocadas en dirección 3' de la caja TATA, que influyen (por ejemplo, mejoran) la velocidad de inicio de la transcripción.

[0108] La región de iniciación de la transcripción (por ejemplo, un promotor) puede ser nativa u homóloga o extraña o heteróloga al huésped lenteja de agua o microalga, o podría ser la secuencia natural o una secuencia sintética. Por extraño, se entiende que la región de inicio de la transcripción no se encuentra en el huésped de lenteja de agua o microalga de tipo salvaje en el que se introduce la región de inicio de la transcripción. Por "promotor funcional" se entiende que el promotor, cuando está operativamente unido a una secuencia que codifica un polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, es capaz de conducir la expresión (es decir, transcripción y traducción) del polipéptido codificado, fragmento o variante. Los promotores pueden seleccionarse en función del resultado deseado. Por lo tanto, los casetes de expresión de la invención pueden comprender promotores constitutivos, inducibles, preferidos por los tejidos u otros promotores para la expresión en lenteja de agua.

[0109] Puede emplearse cualquier promotor adecuado conocido en la técnica en los casetes de expresión de acuerdo con la presente invención, incluyendo promotores bacterianos, de levadura, fúngicos, de insectos, mamíferos y vegetales. Por ejemplo, se pueden usar promotores de plantas, incluidos los promotores de lentejas de agua o microalgas. Los promotores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S, los promotores de la opina sintetasa (por ejemplo, nos, mas, ocs, etc.), el promotor de la ubiquitina, el promotor de la actina, el promotor de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa (RubP) y el promotor de alcohol deshidrogenasa. El promotor de la subunidad pequeña de carboxilasa RubP de lenteja de agua es conocido en la técnica (Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). También son adecuados otros promotores de virus que infectan plantas o microalgas, incluyendo, pero sin limitación, promotores aislados del virus del mosaico Dasheen, promotor del virus Chlorella (por ejemplo, el promotor de adenina metiltransferasa del virus Chlorella; Mitra et al. (1994) Plant Mol. Biol 26:85), virus de marchitez de tomate, virus de sonajero de tabaco, virus de necrosis de tabaco, virus de mancha de anillo de tabaco, virus de mancha de anillo de tomate, virus de mosaico de pepino, virus de muñón de maní, virus de mosaico de alfalfa, badnavirus baciliforme de caña de azúcar y similares.

[0110] Los elementos de control de expresión, incluidos los promotores, se pueden elegir para proporcionar un nivel deseado de regulación. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser ventajoso usar un promotor que confiera expresión constitutiva (por ejemplo, el promotor de la manonopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens). Alternativamente, en otras situaciones, puede ser ventajoso usar promotores que se activen en respuesta a estímulos ambientales específicos (por ejemplo, promotores de genes de choque térmico, promotores de genes inducibles por sequía, promotores de genes inducibles por patógenos, promotores de genes inducibles por heridas y promotores de genes inducibles por la luz/oscuridad) o reguladores del crecimiento de las plantas (por ejemplo, promotores de genes inducidos por ácido abscísico, auxinas, citoquininas y ácido giberélico). Como alternativa adicional, se pueden elegir promotores que proporcionen una expresión específica de tejido (por ejemplo, promotores específicos de raíz, hoja y flores).

[0111] La fuerza global de un promotor determinado puede estar influenciada por la combinación y organización espacial de secuencias de nucleótidos que actúan en cis, tales como secuencias activadoras en dirección 5'. Por ejemplo, la activación de secuencias de nucleótidos derivadas del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens puede mejorar la transcripción del promotor de la manonopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (véase la patente de los Estados Unidos 5.955.646 de Gelvin et al.). En la presente invención, el casete de expresión puede contener secuencias de nucleótidos de activación insertadas en dirección 5' de la secuencia promotora para mejorar la expresión del polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo. En una realización, el casete de expresión incluye tres secuencias activadoras en dirección 5' derivadas del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens operativamente unido a un promotor derivado de un gen de la manonopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (véase la Patente de Estados Unidos 5.955.646).

[0112] El casete de expresión incluye, por lo tanto, en la dirección de transcripción 5'-3', un elemento de control de la expresión que comprende una región de iniciación transcripcional y traduccional, un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV de interés (o fragmento o variante del mismo), y una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. Cualquier secuencia de terminación adecuada conocida en la técnica puede usarse de acuerdo con la presente invención. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de codificación de interés, o puede derivarse de otra fuente. Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintetasa y nopalina sintetasa. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141; Proudfoot (1991) Cell 64: 671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 9627. Secuencias de terminación ejemplares adicionales son la secuencia de terminación de subunidad pequeña de carboxilasa RubP de guisante y la secuencia de terminación de Virus de mosaico de coliflor 35S.

[0113] Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células o tejidos de lenteja de agua transformados. Los genes marcadores seleccionables incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas. Los genes de resistencia a los herbicidas generalmente codifican una proteína diana modificada insensible al herbicida o una enzima que degrada o desintoxica el herbicida en la planta antes de que pueda actuar. Ver DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6: 2513; DeBlock y otros (1989) Plant Physiol. 91: 691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8: 833; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603. Por ejemplo, la resistencia a los herbicidas de glifosato o sulfonilurea se ha obtenido utilizando genes que codifican las enzimas diana mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y acetolactato sintasa (ALS). Se ha obtenido resistencia al glufosinato de amonio, boromoxinilo y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) mediante el uso de genes bacterianos que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, una nitrilasa o una 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenasa, que desintoxica los herbicidas respectivos.

[0114] Para los fines de la presente invención, los genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican la neomicina fosfotransferasa II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4: 1); cianamida hidratasa (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4250); aspartato quinasa; dihidrodipicolinato sintasa (Perl et al. (1993) BioTechnology 11: 715); gen bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100: 1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36: 1367); triptófano descarboxilasa (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 907); neomicina fosfotransferasa (NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1: 327); higromicina fosfotransferasa (H^pT o HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074); dihidrofolato reductasa (^dH^fR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4552); fosfinotricina acetiltransferasa (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6: 2513); ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D: 330); acetohidroxiácido sintasa (Patente de los Estados Unidos No. 4.761.373 de Anderson et al.; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221: 266); 5-enolpiruvil-shikimato-fosfato sintasa (aroA; Comai et al. (1985) Nature 317: 741); haloarilnitrilasa (WO 87/04181 de Stalker et al.); acetil-coenzima A carboxilasa (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92: 1220); dihidropteroato sintasa (sulI; Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); y polipéptido del fotosistema II de 32 kDa (psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222: 1346 (1983).

[0115] También se incluyen genes que codifican resistencia a: gentamicina (por ejemplo, aacCl, Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217: 202-208); cloramfenicol (Herrera-Estrella et al. (1983) ^eM^bO J. 2: 987); metotrexato (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16: 807); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 103; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108: 219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16: 807); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210: 86); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5: 131); bleomicina (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7: 171); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. 15: 127); bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242: 419); 2,4-D (Streber et al. (1989) Biotechnology 7: 811); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6: 2,513); espectinomicina (Bretagne-Sagnard and Chupeau, Transgenic Research 5: 131).

[0116] El gen bar confiere resistencia a herbicida a los herbicidas de tipo glufosinato, tales como fosfinotricina (PPT) o bialafos, y similares. Como se señaló anteriormente, otros marcadores seleccionables que podrían usarse en las construcciones de vectores incluyen, pero no se limitan a, el gen pat, también para resistencia a bialafos y fosfinotricina, el gen de ALS para resistencia a imidazolinona, el gen de HPH o HYG para resistencia a la higromicina, el gen de EPSP sintasa para la resistencia al glifosato, el gen de Hm1 para la resistencia a la toxina Hc y otros agentes selectivos utilizados habitualmente y conocidos por un experto en la materia. Ver Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol 6: 2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555; Brown et al. (1987) Cell 49: 603; Figge et al. (1988) Cell 52: 713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86: 5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19: 4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Biol. 10: 143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; y Gill et al. (1988) Nature 334: 721.

[0117] La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitante. Cualquier gen marcador seleccionable puede usarse en la presente invención.

Modificación de secuencias de nucleótidos para una expresión mejorada en una planta o microalga huésped [0118] Cuando el polipéptido anitgénico de FMDV o fragmento o variante del mismo se expresa dentro de lenteja de agua o microalga, la secuencia polinucleotídica expresada que codifica el polipéptido de FMDV o fragmento o variante del mismo puede modificarse para mejorar su expresión en lenteja de agua o microalga, respectivamente. Una de esas modificaciones es la síntesis del polinucleótido usando codones preferidos de plantas, particularmente codones preferidos de lenteja de agua, o usando codones preferidos de microalga, tales como codones preferidos de Schizochytrium. Los procedimientos están disponibles en la técnica para sintetizar secuencias de nucleótidos con codones preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.380.831 y 5.436.391; EP 0 359 472; EP 0 385 962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15: 3324; Iannacome et al. (1997) Planta Mol. Biol. 34: 485; y Murray et al. (1989) Nucleic Acids. Res. 17: 477. La síntesis se puede lograr usando cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia. Los codones preferidos pueden determinarse a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en lenteja de agua o microalga. Por ejemplo, la frecuencia de uso de codones para Lemna minor se encuentra en la Tabla 1, la frecuencia de uso de codones para Schizochytrium se encuentra en la Tabla 2.

Tabla 1. Lemna minor [gbpln]: 4 CDS (1597 codones)

campos: [triplete] [frecuencia: por mil] ([número])

UUU 17,5 (28) UCU 13,8 (22) UAU 8,8 (14) UGU 5,0 (8)

UUC 36,3 (58) UCC 17,5 (28) UAC 15,7 (25) UGC 14,4 (23)

UUA 5,6 (9) UCA 14,4 (23) UAA 0,0 (0) UGA 1,9 (3)

UUG 13,8 (22) UCG 13,8 (22) UAG 0,6 (1) UGG 16,3 (26)

CUU 15,7 (25) CCU 11,9 (19) CAU 6,9 (11) CGU 4,4 (7)

CUC 25,7 (41) CCC 15,7 (25) CAC 16,9 (27) CGC 18,2 (29)

CUA 5,0 (8) CCA 11,3 (18) CAA 10,0 (16) CGA 6,3 (10)

CUG 21,3 (34) CCG 14,4 (23) CAG 22,5 (36) CGG 10,6 (17)

AUU 18,8 (30) ACU 9,4 (15) AAU 13,8 (22) AGU 10,0 (16)

AUC 19,4 (31) ACC 17,5 (28) AAC 21,9 (35) AGC 15,0 (24)

AUA 1,9 (3) ACA 5,0 (8) AAA 15,7 (25) AGA 20,7 (33)

AUG 20,7 (33) ACG 10,0 (16) AAG 35,7 (57) AGG 17,5 (28)

GUU 15,0 (24) GCU 25,0 (40) GAU 20,0 (32) GGU 8,1 (13)

GUC 25,0 (40) GCC 22,5 (36) GAC 26,3 (42) GGC 21,9 (35)

GUA 6,3 (10) GCA 14,4 (23) GAA 26,3 (42) GGA 16,9 (27)

GUG 30,7 (49) GCG 18,2 (29) GAG 40,1 (64) GGG 18,2 (29)

Tabla 2. Schizochytrium sp. ATCC_20888 [gbpln]: 3 CDS (6473 codones) campos: [triplete] [frecuencia: por mil] ([número])

UUU 12,2 (79) UCU 7,0 (45) UAU 1,1 (7) UGU 0,8 (5)

UUC 19,9 (12) UCC 23,8 (154) UAC 21,5 (139) UGC 15,3 (99)

UUA 0,0 (0) UCA 0,5 (3) UAA 0,5 (3) UGA 0,0 (0)

UUG 0,6 (4) UCG 18,8 (122) UAG 0,0 (0) UGG 8,3 (54)

CUU 12,7 (82) CCU 11,7 (76) CAU 2,3 (15) CGU 7,1 (46)

CUC 61,2 (396) CCC 23,8 (154) CAC 12,8 (83) CGC 42,9 (278)

CUA 0,0 (0) CCA 1,5 (10) CAA 2,3 (15) CGA 0,3 (2)

CUG 7,4 (48) CCG 16,2 (105) CAG 27,7 (179) CGG 0,8 (5)

AUU 13,9 (90) ACU 9,1 (59) AAU 1,9 (12) AGU 1,5 (10)

AUC 33,5 (217) ACC 29,2 (189) AAC 32,4 (210) AGC 15,6 (101)

AUA 0,0 (0) ACA 1,5 (10) AAA 2,2 (14) AGA 0,2 (1)

AUG 27,8 (180) ACG 9,6 (62) AAG 54,5 (353) AGG 0,0 (0)

GUU 8,3 (54) GCU 24,4 (158) GAU 13,4 (87) GGU 13,0 (84) GUC 53,0 (343) GCC 86,0 (557) GAC 45,0 (291) GGC 54,5 (353)

GUA 0,2 (1) GCA 4,0 (26) GAA 7,3 (47) GGA 3,9 (25)

GUG 14,4 (93) GCG 15,9 (103) GAG 62,3 (403) GGG 0,5 (3)

[0119] Para los propósitos de la presente invención, "codones preferidos de lenteja de agua" se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en la lenteja de agua de más de 17%. Los "codones preferidos de Lemna", tal como se usan en el presente documento, se refieren a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en el género Lemna superior al 17%. Los "codones preferidos de Lemna minoi" como se usan en el presente documento, se refieren a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en Lemna minor mayor del 17% donde la frecuencia de uso de codones en Lemna minor se obtiene de la Base de datos de uso de codones (GenBank Release 160.0, 15 junio 2007). "Codones preferidos de microalgas" se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en microalgas de más del 17%. "Codones preferidos de microalgas", como se usa en el presente documento, se refiere a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en la familia Thraustochytriaceae de más del 17%. Los "codones preferidos de Schizochytrium", como se usan en el presente documento, se refieren a codones que tienen una frecuencia de uso de codones en schizochytrium mayor del 17% donde la frecuencia de uso de codones en schizochytrium se obtiene de la Base de Datos de Uso de Codones.

[0120] Se reconoce además que todo o parte del polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, puede ser optimizado o sintético. En otras palabras, también se pueden usar secuencias completamente optimizadas o parcialmente optimizadas. Por ejemplo, el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los codones pueden ser codones preferidos de lenteja de agua o preferidos de microalgas. En una realización, entre el 90 y el 96% de los codones son codones preferidos de lenteja de agua o preferidos de microalgas. La secuencia de codificación de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, puede comprender codones utilizados con una frecuencia de al menos 17% en Lemna gibba o al menos 17% en Lemna minor. En otra realización, el casete de expresión comprende SEQ ID NO: 9, que contiene codones preferidos de Lemna minor que codifican el polipéptido PI establecido en SEQ ID NO: 10. En una realización relacionada, el polipéptido de FMDV es un polipéptido P1-3C, por ejemplo, el polipéptido P1-3C, tal como se establece en SEQ ID NO: 3, y el casete de expresión comprende una secuencia de codificación optimizada para este polipéptido P1-3C, donde la secuencia de codificación comprende codones preferidos de lenteja de agua, por ejemplo, codones preferidos de Lemna minor o preferidos de Lemna gibba. En una de tales realizaciones, el casete de expresión comprende SEQ ID NO: 2, que contiene codones preferidos de Lemna minor que codifican el polipéptido de FMDV, tal como se establece en SEQ ID NO: 3.

[0121] También se pueden realizar otras modificaciones en el polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, para mejorar su expresión en lenteja de agua o microalga. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposones y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a los niveles promedio para la lenteja de agua, tal como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en esta planta. Cuando sea posible, el polinucleótido que codifica el polipéptido heterólogo de interés puede modificarse para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas.

[0122] Existen diferencias conocidas entre las secuencias de nucleótidos en el contexto de iniciación de la traducción óptima para los codones de iniciación de la traducción en los animales, las plantas y las algas. La "secuencia de nucleótidos en el contexto de iniciación de la traducción", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la identidad de los tres nucleótidos directamente en 5' del codón de iniciación de la traducción. El "codón de iniciación de la traducción" se refiere al codón que inicia la traducción del ARNm transcrito a partir de la secuencia de nucleótidos de interés. La composición de estas secuencias de nucleótidos en el contexto de iniciación de la traducción puede influir en la eficacia del inicio de la traducción. Ver, por ejemplo, Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154: 89-98; y Joshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. 35: 993-1001. En la presente invención, la secuencia de nucleótidos en el contexto de iniciación de la traducción para el codón de iniciación de la traducción del polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, puede modificarse para mejorar la expresión en la lenteja de agua. En una realización, la secuencia de nucleótidos se modifica de manera que los tres nucleótidos directamente en dirección 5' del codón de iniciación de la traducción son "ACC". En una segunda realización, estos nucleótidos son "ACA".

[0123] La expresión de un polipéptido antigénico de FMDV en lenteja de agua o alga también se puede mejorar mediante el uso de secuencias líder 5'. Dichas secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región no codificante 5' de Encefalomiocarditis; Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 6126 ); líderes de potyvirus, por ejemplo, líder de TEV (virus del grabado del tabaco; Allison et al. (1986) Virology 154: 9); proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP; Macajak y Sarnow (1991) Nature 353: 90); líder no traducido del ARNm de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (ARN de AMV 4; Jobling y Gehrke (1987) Nature 325: 622); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV; Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56); líder del virus del grabado de patata (Tomashevskaya et al. (1993) J. Gen. Virol. 74: 2717 2724); 'región no traducida 5' de Fed-1 (Dickey (1992) EM^bO J. 11: 2311-2317); 'región no traducida 5' de RbcS (Silverthorne et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15: 49-58); y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV; Lommel et al. (1991) Virology 81: 382). Ver también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84: 965. La secuencia líder que comprende la secuencia de intrones de la planta, incluida la secuencia de intrones del gen de la alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (ADH1), el gen de la catalasa de ricino o el gen PAT1 de la vía del triptófano de Arabidopsis, también se ha demostrado que aumentan la eficiencia de la traducción en las plantas (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183-1200; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 913-920).

[0124] En el presente documento se describe que se inserta una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1222-1775 del gen de alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (SEQ ID NO: 4; ADH1; Número de acceso de GenBank X04049) en dirección 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico de FMDV de interés, o fragmento o variante del mismo, para aumentar la eficiencia de su traducción. En una realización, el casete de expresión contiene el líder del gen de subunidad 5B pequeña de ribulosa-bis-fosfato carboxilasa de Lemna gibba (líder RbcS; ver Buzby et al. (1990) Plant Cell 2: 805-814).

[0125] Se reconoce que se puede utilizar cualquier modificación de secuencia de nucleótidos que mejora la expresión descritas anteriormente en la presente invención, incluyendo cualquier modificación individual o cualquier combinación posible de modificaciones. La frase "modificado para una expresión mejorada" en la lenteja de agua, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que contiene una cualquiera o cualquier combinación de estas modificaciones.

Plantas de lenteja de agua transformadas y cultivos de nodulos de lenteja de agua o microalgas transformadas

[0126] La presente invención proporciona plantas de lenteja de agua transformadas que expresan un polipéptido antigénico de FMDV de interés, o un fragmento o variante del mismo. El término "lenteja de agua" se refiere a los miembros de la familia Lemnaceae. Esta familia actualmente se divide en cinco géneros y 38 especies de lenteja de agua de la siguiente manera: género Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L. perpusilla, L. tenera, L. trisulca, L. turionifera, L. valdiviana); género Spirodela (S. intermedia, S. polyrrhiza, S. punctata); género Wolffia (Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscopica, Wa. neglecta); género Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. lingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda y Wl. neotropica) y el género Landoltia (L. punctata). Cualquier otro género o especie de Lemnaceae, si existe, también son aspectos de la presente invención. Las especies de Lemna pueden clasificarse utilizando el esquema taxonómico descrito por Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).

[0127] Tal como se usa en el presente documento, "planta" incluye plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, frondas (hojas), tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales y progenie de las mismas. Debe entenderse que partes de plantas transgénicas están dentro del alcance de la invención para comprender, por ejemplo, células vegetales, protoplastos de plantas, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, tejidos, callos de plantas, embriones, así como flores, óvulos, tallos, frutos, hojas, raíces, puntas de raíz, nódulos y similares que se originan en plantas transgénicas o su progenie previamente transformadas con un polinucleótido de interés y que, por lo tanto, consisten al menos, en parte, en células transgénicas. Tal como se usa en el presente documento, el término "célula vegetal" incluye células de semillas, embriones, óvulos, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, frondas, raíces, nódulos, brotes, anteras y polen.

[0128] Tal como se usa en el presente documento, "nódulo de lenteja de agua" significa tejido de lenteja de agua que comprende células de lenteja de agua donde al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o el 100% de las células son células diferenciadas. Tal como se usa en el presente documento, "célula diferenciada" significa una célula con al menos una característica fenotípica (por ejemplo, una morfología celular distintiva o la expresión de un ácido nucleico o proteína marcadora) que la distingue de las células no diferenciadas o de las células que se encuentran en otros tipos de tejidos.. Las células diferenciadas del cultivo de nódulos de lenteja de agua descritas en el presente documento forman una superficie lisa en mosaico de células interconectadas fusionadas en sus paredes celulares adyacentes, con nódulos que han comenzado a organizarse en fronda de primordio dispersos por todo el tejido. La superficie del tejido del cultivo de nódulos tiene células epidérmicas conectadas entre sí a través de plasmadesmata.

[0129] El hábito de crecimiento de las lentejas de agua es ideal para los procedimientos de cultivo. La planta prolifera rápidamente a través de la brotación vegetativa de nuevas frondas, de manera macroscópica análoga a la propagación asexual en la levadura. Esta proliferación ocurre por brotación vegetativa a partir de células meristemáticas. La región meristemática es pequeña y se encuentra en la superficie ventral de la fronda. Las células meristemáticas se encuentran en dos bolsillos, uno a cada lado de la vena media. La pequeña región de la vena media también es el sitio desde el cual se origina la raíz y surge el tallo que conecta cada fronda con su fronda madre. El bolsillo meristemático está protegido por una aleta de tejido. Las frondas brotan alternativamente de estos bolsillos. Los tiempos de duplicación varían según la especie y son cortos de hasta 20-24 horas (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24: 19; Datko y Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 316). El cultivo intensivo de lenteja de agua da como resultado las tasas más altas de acumulación de biomasa por unidad de tiempo (Landolt y Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae-A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Instittes ETH, Stiftung Rubel , Zurich)), con una acumulación de peso seco que oscila entre el 6 y el 15% del peso fresco (Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46: 5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Stomp, datos no publicados). Se ha descrito que el contenido de proteínas de varias especies de lenteja de agua cultivadas en condiciones variables varía entre 15 y 45% del peso seco (Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang y Chui ( 1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7: 272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177: 251). Usando estos valores, el nivel de producción de proteínas por litro de medio en la lenteja de agua es del mismo orden de magnitud que los sistemas de expresión génica de levadura.

[0130] En este documento se describen plantas de microalgas transformadas que expresan un polipéptido de FMDV de interés, o un fragmento o variante del mismo. El término "microalgas" o "microalga" se refiere a miembros de la familia Thraustochytriaceae. Esta familia actualmente se divide en cuatro géneros: Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides y Japonochytrium.

[0131] Las plantas de lenteja de agua o microalgas transformadas descritas en este documento se pueden obtener mediante la introducción de un constructo de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, o un fragmento o variante del mismo, en la planta de lenteja de agua o microalga de interés.

[0132] El término "introducir" en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo, una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, pretende significar presentar en la planta de lenteja de agua o microalga el polinucleótido en tal manera que el polinucleótido obtenga acceso al interior de una célula de la planta de lenteja de agua o microalga. Cuando se introduce más de un polinucleótido, estos polinucleótidos pueden ensamblarse como parte de una construcción de un solo nucleótido, o como construcciones de nucleótidos separados, y pueden ubicarse en el mismo o diferentes vectores de transformación. Por consiguiente, estos polinucleótidos pueden introducirse en la célula huésped de lenteja de agua o microalga de interés en un solo evento de transformación, en eventos de transformación separados o, por ejemplo, como parte de un protocolo de reproducción. Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento no dependen de un procedimiento particular para introducir uno o más polinucleótidos en una planta de lenteja de agua o microalga, solo que el polinucleótido o polinucleótidos obtengan acceso al interior de al menos una célula de la planta de lenteja de agua o microalga. Los procedimientos para introducir polinucleótidos en plantas o algas son conocidos en la técnica, incluidos, pero no limitados a, procedimientos de transformación transitoria, procedimientos de transformación estables y procedimientos mediados por virus.

[0133] "Transformación transitoria" en el contexto de un polinucleótido, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, significa que se introduce un polinucleótido en la planta de lenteja de agua o microalga y no se integra en el genoma de la planta de lenteja de agua o microalga.

[0134] Por "introducción estable" o "introducido de forma estable" en el contexto de un polinucleótido (tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo) introducido en una planta de lenteja de agua o microalga se entiende que el polinucleótido se introduce de forma estable en el genoma de lenteja de agua o microalga, y por lo tanto la planta de lenteja de agua o microalga se transforma de manera estable con el polinucleótido.

[0135] "Transformación estable" o "transformado de forma establemente" pretende significar que un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, introducido en una planta de lenteja de agua o microalga se integra en el genoma del planta o alga y es capaz de ser heredado por su progenie, más particularmente, por la progenie de múltiples generaciones sucesivas. En algunas realizaciones, las generaciones sucesivas incluyen la progenie producida vegetativamente (es decir, reproducción asexual), por ejemplo, con propagación clonal. En otras realizaciones, las generaciones sucesivas incluyen la progenie producida a través de la reproducción sexual.

[0136] Una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico FMDV, o un fragmento o variante del mismo, se puede introducir en una planta de lenteja de agua o microalga de interés utilizando cualquier protocolo de transformación conocido por los expertos en la materia. Los procedimientos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en plantas de lenteja de agua o células vegetales o nódulos o microalgas incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), aceleración de partículas balísticas (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos.

4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; y 5.932.782; y Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926). Las células que se han transformado pueden crecer en plantas de acuerdo con las formas convencionales.

[0137] Como se señaló anteriormente, la lenteja de agua o microalgas transformadas de forma estable se pueden obtener mediante cualquier procedimiento de transferencia génica conocido en la técnica, tal como uno de los procedimientos de transferencia génica descrito en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.498 o solicitudes de patente de Nos. de publicación 2003/0115640,2003/0033630 o 2002/0088027. Las plantas o cultivos de nódulos de lenteja de agua o microalgas se pueden transformar de manera eficiente con un casete de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico, tal como se describe en este documento, mediante cualquiera de varios procedimientos que incluyen transferencia de genes mediada por Agrobacterium, bombardeo balístico o electroporación. La Agrobacterium utilizada puede ser Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Los transformantes de lenteja de agua o microalga estables pueden aislarse transformando las células de lenteja de agua o microalga con la secuencia de ácido nucleico de interés y un gen que confiere resistencia a un agente de selección, seguido del cultivo de las células transformadas en un medio que contiene el agente de selección. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.040.498.

[0138] Las plantas de lenteja de agua o microalgas transformadas de manera estable utilizadas en estos procedimientos deben exhibir morfología normal y ser fértiles mediante reproducción sexual y/o capaces de reproducirse vegetativamente (es decir, reproducción asexual), por ejemplo, con propagación clonal. Preferiblemente, las plantas de lenteja de agua o las microalgas transformadas descritas en el presente documento contienen una única copia del ácido nucleico transferido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, y el ácido nucleico transferido no tiene reordenamientos notables en el mismo. Se entiende que las plantas de lenteja de agua o las microalgas transformadas descritas en este documento pueden contener el ácido nucleico transferido presente en números de copia bajos (es decir, no más de doce copias, no más de ocho copias, no más de cinco copias, alternativamente, no más de tres copias, como alternativa adicional, menos de tres copias del ácido nucleico por célula transformada).

[0139] Las plantas o microalgas transformadas que expresan un polipéptido antigénico de FMDV, o un fragmento o variante del mismo, pueden cultivarse en condiciones adecuadas para expresar el polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo. El polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, puede recogerse de la planta de lenteja de agua o microalgas, el medio de cultivo o la planta de lenteja de agua o microalgas y el medio de cultivo, y, cuando se desee, purificarse usando cualquier procedimiento convencional de aislamiento y purificación conocido en la técnica, tal como se describe en otra parte de este documento. El polipéptido antigénico de FMDV, o fragmento o variante del mismo, puede formularse como una vacuna para aplicaciones terapéuticas, tal como se describe en otra parte del presente documento.

Procedimientos de preparación de un polipéptido de FMDV

[0140] Tal como se describe completamente en el presente documento, en una realización, un procedimiento para producir un polipéptido de FMDV comprende: (a) cultivar dentro de un medio de cultivo de lenteja de agua o microalgas un cultivo de lenteja de agua o microalga, en el que el cultivo de lenteja de agua o microalga se transforma de manera estable para expresar el polipéptido, y en el que el polipéptido se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificante para dicho polipéptido; y (b) recoger el polipéptido antigénico de dicho medio de cultivo. El término recoger incluye, pero no se limita a, recoger del medio de cultivo o purificación.

[0141] Después de la producción del polipéptido recombinante en lenteja de agua o microalgas, puede usarse cualquier procedimiento disponible en la técnica para la purificación de proteínas. Las diversas etapas incluyen liberar la proteína del material no proteico o vegetal o microalga, seguido de la purificación de la proteína de interés de otras proteínas. Las etapas iniciales en el proceso de purificación incluyen centrifugación, filtración o una combinación de los mismos. Las proteínas secretadas dentro del espacio extracelular de los tejidos pueden obtenerse mediante vacío o extracción centrífuga. El procesamiento mínimo también podría implicar la preparación de productos crudos. Otros procedimientos incluyen maceración y extracción para permitir el uso directo del extracto.

[0142] Tales procedimientos para purificar la proteína de interés pueden explotar las diferencias en el tamaño de la proteína, las propiedades fisicoquímicas y la afinidad de unión. Dichos procedimientos incluyen cromatografía, que incluye afinidad con procainamida, exclusión por tamaño, líquido a alta presión, fase inversa y cromatografía de intercambio aniónico, etiquetas de afinidad, filtración, etc. Ver, Favacho et al. (2006) Protein expression and purification 46: 196-203. Ver también, Zhou et al. (2007) The Protein J 26: 29-37; Wang et al. (2006) Vaccine 15: 2176-2185; y WO/2009/076778. Se pueden usar protectores en el proceso de purificación, tales como osmótica, antioxidantes, inhibidores de oxidación fenólica, inhibidores de proteasas y similares.

Procedimientos de uso

[0143] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para vacunar un animal ovino, bovino, caprino o porcino que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino o porcino una cantidad eficaz de una vacuna que puede comprender un cantidad efectiva de un antígeno de FMDV recombinante y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0144] En una realización de la presente invención, el procedimiento comprende una administración única de una composición de vacuna formulada con una emulsión según la invención. Por ejemplo, en una realización, la composición inmunológica o de vacuna comprende antígenos de FMDV expresados en lenteja de agua, que incluyen polipéptidos y VLP (partículas similares a virus). La microscopía electrónica indica que la lenteja de agua transformada con vectores de expresión de MerE probablemente produce VLP de FMDV, por lo que las composiciones inmunológicas o de vacuna de acuerdo con la presente invención abarcan aquellas que comprenden VLP de FMDV.

[0145] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para vacunar un animal ovino, bovino, caprino o porcino que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino o porcino un antígeno de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino producido en una planta o alga, y material vegetal del género Lemna o material de microalga de schizochytrium.

[0146] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para provocar una respuesta inmune que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino o porcino una vacuna que comprende un antígeno de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino expresado en una planta o alga, en el que se produce una respuesta inmunitaria.

[0147] En una realización, la materia descrita en el presente documento está dirigida a un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria que comprende administrar al animal ovino, bovino, caprino o porcino una vacuna que comprende un antígeno de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino producido en una planta o alga, y material vegetal del género Lemna o material de microalga de schizochytrium, en el que se provoca una respuesta inmunitaria.

[0148] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para preparar una planta de lenteja de agua o cultivo de microalga transformados de manera estable que comprende: (a) introducir en la planta o microalga una construcción genética que comprende un gen de antígeno de FMDV; y (b) cultivar la planta o microalga. Los procedimientos para la transformación de lenteja de agua o microalga están disponibles en la técnica.

[0149] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para preparar una vacuna o composición que comprende aislar un antígeno de FMDV producido por un sistema de expresión de lenteja de agua o microalgas y opcionalmente combinarlo con un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0150] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para preparar una vacuna o composición que comprende combinar un antígeno de FMDV producido por un sistema de expresión de Lemna y material vegetal del género Lemna y opcionalmente un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0151] En otra realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un procedimiento para preparar una vacuna o composición que comprende combinar un antígeno de FMDV producido por un sistema de expresión de Schizochytrium y material de Schizochytrium y opcionalmente un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0152] La administración puede ser subcutánea o intramuscular. La administración puede estar libre de agujas (por ejemplo, Pigjet o Bioject).

[0153] En una realización de la presente invención, puede emplearse un régimen de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. Habitualmente, la composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración de sensibilización es de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo. Sin embargo, se observa que se puede usar la misma composición como administración de sensibilización y el refuerzo. Este protocolo de administración se llama "sensibilización-refuerzo".

[0154] Una sensibilización-refuerzo de acuerdo con la presente invención puede incluir un vector viral recombinante que se utiliza para expresar una secuencia de codificación de FMDV o fragmentos de la misma que codifica un polipéptido antigénico o fragmento o variante del mismo. Específicamente, el vector viral puede expresar un gen de FMDV o fragmento del mismo que codifica un polipéptido antigénico. El vector viral contemplado en el presente documento incluye, pero no se limita a, poxvirus [por ejemplo, virus vaccinia o virus vaccinia atenuado, virus avipox o virus avipox atenuado (por ejemplo, viruela canaria, viruela aviar, viruela paloma, viruela de pichón, viruela de codorniz, ALVAC, TRo Va C; ver, por ejemplo, patentes de Estados Unidos: 5,505,941 y 5,494,807), virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.], adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), virus del herpes (por ejemplo, Virus del herpes canino, virus del herpes del pavo, virus de la enfermedad de Marek, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus del herpes felino, virus de la laringototitis (ILTV), virus del herpes bovino, virus del herpes porcino), baculovirus, retrovirus, etc. En otra realización, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de viruela canaria, tal como ALVAC. En otra realización más, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de viruela aviar, tal como, TROVAC. El antígeno de FMDV de la descripción que se va a expresar se inserta bajo el control de un promotor específico de poxvirus, por ejemplo, el promotor de entomopoxvirus 42K de Amsacta moorei (Barcena, Lorenzo et al., 2000), el promotor de vaccinia 7,5 kDa (Cochran et al., 1985), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al., 1992), el promotor de vaccinia HA (Shida, 1986), el promotor de viruela de vaca ATI (Funahashi et al., 1988), el promotor de vaccinia H6 (Taylor et al., 1988; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), entre otros.

[0155] En otra realización, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de viruela del canario, tal como, ALVAC. El antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV puede ser FMDV P1-3C. El vector viral de FMDV puede ser un virus de la viruela del canario como vCP2186, vCP2181 o vCP2176, o un virus de la viruela aviar como vFP2215 (véase la Patente de Estados Unidos 7.527.960).

[0156] En otro aspecto del protocolo de sensibilización-refuerzo de la invención, se administra una composición que comprende el antígeno de FMDV de la invención, seguido de la administración de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno de FMDV in vivo, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno de FMDV. Del mismo modo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno de FMDV in vivo, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno de FMDV, seguido de la administración de una composición que comprende el antígeno de FMDV de la invención. Se observa además que tanto la administración primaria como la secundaria pueden comprender la composición que comprende el antígeno de FMDV de la invención.

[0157] Un protocolo de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración de sensibilización puede ser de naturaleza diferente de las utilizadas como una vacuna de refuerzo posterior. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0158] El volumen de dosis de composiciones para especies diana que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de composiciones ovinas, bovinas, caprinas o porcinas, basadas en vectores virales, por ejemplo, composiciones basadas en vectores virales sin virus de poxvirus, es generalmente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5,0 ml, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 3,0 ml y entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 2,5 ml.

[0159] La eficacia de las vacunas puede ser probada aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante estimulación de los animales, tales como ovinos, bovinos, caprinos o porcinos, con una cepa virulenta de FMDV, ventajosamente las cepas de FMDV O1 Manisa, O1 BFS o Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Irán '96, A22 Iraq, SAT2 Arabia Saudita.

[0160] Todavía otras cepas pueden incluir cepas de FMDV A10-61, A5, A12, A24/Cruzeiro, C3/Indaial, O1, C1-Santa Pau, C1-C5, A22/550/Azerbaiyán/65, SAT1-SAT3, A , A/TNC/71/94, A/IND/2/68, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/25/81, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/57/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05 , A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/Asia/1, A/IRN/05, Asia/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, Asia 1/HNK/CHA/05 (número de acceso GenBank EF149010, incorporado aquí como referencia), Asia I/XJ (Li, ZhiYong et al. Chin Sci Bull, 2007), HK/70 (Chin Sci Bull, 2006, 51 (17): 2072-2078), O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001 , O/ES/2001, HKN/2002, O5India, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KE N/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/Holanda, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IND210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/India/17/77.

[0161] Otros detalles de estas cepas de FMDV se pueden encontrar en las páginas web de European Bioinformatics Information (EMBL-EBI). Los inventores contemplan que todas las cepas de FMDV, ambas enumeradas aquí, y aquellas aún por identificar, podrían expresarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente descripción para producir, por ejemplo, composiciones de vacuna eficaces. Tanto las cepas homólogas como las heterólogas se usan como estimulación para evaluar la eficacia de las vacunas. El animal puede ser estimulado por vía intradérmica, subcutánea, pulverización, intranasal, intraocular, intratraqueal y/u oral.

[0162] Las administraciones de sensibilización-refuerzo pueden llevarse a cabo ventajosamente de 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, aproximadamente 3 semanas de diferencia. De acuerdo con una realización, también se prevé un refuerzo semestral o un refuerzo anual, que utiliza ventajosamente la vacuna a base de vector viral. Los animales tienen ventajosamente al menos 6 a 8 semanas de vida en el momento de la primera administración.

[0163] Las composiciones que comprenden los polipéptidos antigénicos recombinantes de la invención utilizados en los protocolos de sensibilización-refuerzo están contenidos en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutico o veterinariamente aceptable. Los protocolos de la invención protegen al animal del FMDV ovino, bovino, caprino o porcino y/o evitan la progresión de la enfermedad en un animal infectado.

[0164] Las diversas administraciones se llevan a cabo preferiblemente con de 1 a 6 semanas de diferencia, y más particularmente, aproximadamente 3 semanas de diferencia. De acuerdo con un modo preferido, también se prevé un refuerzo anual, que utiliza ventajosamente la composición de vacuna inmunológica a base de vector viral. Los animales tienen preferiblemente al menos un día de vida en el momento de la primera administración.

[0165] Se debe entender por un experto en la técnica que la presente descripción se proporciona a modo de ejemplo y la presente descripción no se limita a los mismos. A partir de la descripción en el presente documento y del conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar el número de administraciones, la ruta de administración y las dosis que se utilizarán para cada protocolo de inyección, sin ninguna experimentación indebida.

[0166] La presente invención contempla al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica fabricada de acuerdo con la invención. El animal puede ser macho, hembra, hembra preñada y recién nacido. Esta administración puede realizarse a través de varias vías, que incluyen, entre otras, inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal u oral. La composición terapéutica según la invención también puede administrarse mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE. UU.), Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE. UU.)). Otro enfoque para administrar composiciones de plásmidos es usar electroporación (véase, por ejemplo, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; Solicitud PCT No. WO99/01158). En otra realización, la composición terapéutica se administra al animal mediante pistola genética o bombardeo con partículas de oro.

[0167] En una realización, la descripción proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y expresión de un antígeno o epítopo de FMDV en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente efectiva es una experimentación de rutina para un experto en la materia. En una realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un antígeno o epítopo de FMDV y un portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, el portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección u otros medios de transferencia de polinucleótidos a un animal huésped y/o mejora la conservación del vector o proteína en un huésped.

[0168] En una realización, la materia aquí descrita proporciona un procedimiento de detección para la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA).

[0169] Se describe en el presente documento que el uso de la vacuna o composición de la presente invención permite la detección de infección por FMDV en un animal. Se describe en el presente documento que el uso de la vacuna o composición de la presente invención permite la detección de la infección en animales mediante la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA). En el presente documento se describe un procedimiento para diagnosticar la infección por FMDV en un animal usando una proteína no estructural de FMDV (por ejemplo, un ELISA específico de 3ABC o 3D de FMDV).

Artículo de fabricación

[0170] En una realización, la materia descrita en el presente documento se dirige a un kit para realizar un procedimiento para provocar o inducir una respuesta inmune que puede comprender cualquiera de las composiciones o vacunas inmunológicas de FMDV recombinantes, o composiciones o vacunas inmunológicas de FMDV inactivada, composiciones virales o vacunas de FMDV recombinante e instrucciones para realizar el procedimiento.

[0171] En este documento se describe un kit para realizar un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria o protectora contra FMDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno de FMDV de la invención y una composición o vacuna inmunológica viral de FMDV recombinante, e instrucciones para realizar el procedimiento de suministro en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0172] En este documento se describe un kit para realizar un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria o protectora contra FMDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno de FMDV de la invención y una composición o vacuna inmunológica de FMDV inactivada, e instrucciones para realizar el procedimiento de suministro en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0173] En este documento se describe un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo según la presente invención, tal como se describe anteriormente. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de sensibilización según la presente invención, y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de refuerzo según la presente invención. El kit puede contener ventajosamente un primer o segundo viales adicionales para vacunas de sensibilización adicionales o vacunas de refuerzo adicionales.

[0174] Las siguientes realizaciones se describen en este documento. En una realización, se describe una composición que comprende un antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, se describe la composición descrita anteriormente en la que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo comprende un fragmento inmunogénico que comprende al menos 15 aminoácidos de un antígeno de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino. En otra realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo se produce en lenteja de agua o microalgas. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo está parcialmente purificado. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo está sustancialmente purificado.

[0175] En una realización, se describen composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo es un polipéptido de FMDV ovino, bovino, caprino o porcino. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el polipéptido de FMDV es un polipéptido P1-3C, polipéptido PI, polipéptido VP0, polipéptido VP1, polipéptido VP3, polipéptido VP2, polipéptido ^vP4, polipéptido 2A, polipéptido 2B1 o polipéptido 3C. En una realización, se describen composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV o fragmento o variante del mismo tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia, tal como se establece en las SEQ ID NOs: 3, 10, 12, 17, 20, 23, 26, 29. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el antígeno de FMDV está codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia, tal como se establece en las SEQ ID No: 1, 2, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21, 22 o 24, 25, 27, 28, 30-35. En una realización, se describen las composiciones anteriores en las que el portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable es una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua. En otra realización, se describe un procedimiento para vacunar un animal susceptible a FMDV ovino, bovino, caprino o porcino que comprende administrar las composiciones anteriores al animal. En una realización, se describe un procedimiento para vacunar un animal susceptible a FMDV ovino, bovino, caprino o porcino que comprende un régimen de sensibilización-refuerzo. En una realización, se describe un polipéptido antigénico sustancialmente purificado expresado en lenteja de agua o microalga, en el que el polipéptido comprende: una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 3, 10, 12 , 17, 20, 23, 26, 29. En cualquier realización, el animal es preferiblemente un ovino, un bovino, un porcino o un caprino. En una realización, se describe un procedimiento para diagnosticar una infección por FMDV en un animal. En otra realización, se describe un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo que comprende al menos dos viales, en el que un primer vial contiene la composición de la presente invención, y un segundo vial contiene una composición para la vacunación de refuerzo que comprende una composición que comprende un vector viral recombinante, o una composición que comprende una composición viral inactivada, o una composición de plásmido de ADN que contiene o expresa el antígeno de FMDV.

[0176] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden usar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector inventivo in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o excipiente pueden facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se discuten en el presente documento en la descripción general y también pueden ser determinados por el experto en la materia a partir de esta descripción leída junto con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0177] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:

en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo DOPE.

[0178] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

[0179] Ventajosamente, la mezcla de plásmido con el adyuvante se forma de manera extemporánea y ventajosamente simultáneamente con la administración de la preparación o poco antes de la administración de la preparación; por ejemplo, poco antes o antes de la administración, se forma la mezcla de plásmido-adyuvante, ventajosamente para dar tiempo suficiente antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0180] Cuando DOPE está presente, la relación molar de DMRIE:DOPE es ventajosamente de aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, más ventajosamente de aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.

[0181] La relación en peso de adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE:plásmido puede ser de entre aproximadamente 50:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y de aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.

[0182] En otra realización, el portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuados incluyen emulsiones de agua-en-aceite vacunales de base aceite que son estables y fluidas a 4°C que contienen: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene antígeno, preferiblemente de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de una fase aceite que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral, tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ácido graso, un poliol o ésteres de alcohol), de 0,2 a 20% p/v de tensioactivos, preferiblemente de 3 a 8% p/v, estando el último en total o en parte, o en una mezcla, ya sea de ésteres de poliglicerol, siendo dichos ésteres de poliglicerol preferiblemente (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino polioxietilenados u otros aceites de ricino polioxietilenados hidrogenados. Ejemplos de tensioactivos que pueden usarse en una emulsión de agua-en-aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®), disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua-en-aceite, véase también el documento US 6.919.084, por ejemplo, el ejmplo 8 de la misma, incorporado en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, la fase acuosa que contiene antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tamponantes. Un ejemplo de una solución tampón adecuada es solución salina tamponada con fosfato. En una realización ventajosa, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una emulsión triple de agua/aceite/agua (W/O/W) (documento US 6.358.500). Ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en US 7.371.395.

[0183] Las composiciones y vacunas inmunológicas descritas en el presente documento pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados con alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al, 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma obra, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) cualquier combinación o mezclas de los mismos.

[0184] La emulsión de aceite en agua (3), que es especialmente apropiada para vectores virales, puede basarse en: aceite de parafina líquido ligero (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tal como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes grasos o ácidos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

[0185] El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por una parte, sorbitán, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímero de polioxipropilenopolioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121.

[0186] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la técnica también puede hacer referencia al documento US 2909462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de tales grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre CARBOPOL ® (BF Goodrich, Ohio, EE.Uu .) son especialmente adecuados. Se reticulan por alil sacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a CAr Bo OL® 974P, 934P y 971P.

[0187] En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por divinil éter. Se hace referencia también a J. Fields et al., 1960.

[0188] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados preferiblemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3

- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

- y = 1 o 2, con x y = 2.

[0189] Para EMA, x = 0 e y = 2 y para carbómeros x = y = 1.

[0190] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH se puede ajustar a de 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se puede incorporar el vector o vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede oscilar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,5% p/v, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1% p/v, y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4% p/v.

[0191] La citoquina o citoquinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición inmunológica o de vacuna o pueden coexpresarse en el huésped con el inmunógeno o inmunógenos o epítopo o epítopos de los mismos. Se da preferencia a la coexpresión de la citoquina o citoquinas, ya sea por el mismo vector que el que expresa el inmunógeno o inmunógenos o epítopo epítopos del mismo, o por un vector separado del mismo.

[0192] La presente invención comprende la preparación de tales composiciones de combinación; por ejemplo mezclando los componentes activos, de forma ventajosa, entre sí y con un adyuvante, portador, citoquina, y/o diluyente.

[0193] Las citoquinas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNa), interferón b (IFN-b), interferón g (IFN-g), interleuquina-1a (IL-1a), interleuquina-1 b (IL-1 b), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-9 (IL-9) , interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL-11), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de necrosis tumoral b (TNF-b), ácido polinosínico y policitidílico, oligodesoxinucleótidos de citidina-fosfato-guanosina (CpG ODN) y factor de crecimiento transformante b (TGF-b). Se entiende que las citoquinas se pueden coadministrar y/o administrar secuencialmente con la composición inmunológica o de vacuna de la presente invención. Así, por ejemplo, la vacuna de la presente invención puede también contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina emparejada a este huésped a vacunar o en el que debe provocarse una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina bovina para las preparaciones a administrar a bovinos).

[0194] Ventajosamente, la composición inmunológica y/o vacuna de acuerdo con la invención comprenden o consisten esencialmente en o consisten en una cantidad eficaz para provocar una respuesta terapéutica de uno o más polipéptidos expresados en lenteja de agua, tal como se describe en el presente documento; y, se puede determinar una cantidad efectiva a partir de esta divulgación, incluidos los documentos incorporados en el presente documento, y el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0195] En el caso de la composición inmunológica y/o vacuna basada en polipéptidos expresados en lenteja de agua, una dosis puede incluir, de aproximadamente de 1 gg a aproximadamente 2000 gg, ventajosamente de aproximadamente 50 gg a aproximadamente 1000 gg y más ventajosamente de aproximadamente 100 gg a aproximadamente 500 gg de antígeno, epítopo o inmunógeno de FMDV. Los volúmenes de dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml, ventajosamente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 5 ml.

[0196] La invención se describirá a continuación adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

[0197] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales o vegetales recombinantes se llevó a cabo usando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

Ejemplo 1 Generación y cribado de líneas de lenteja de agua que expresan FMDV

[0198] Se produjeron secuencias de FMDV P1 y 3C optimizadas de lenteja de agua y se clonaron en el plásmido parental para generar los vectores MerE representados en las Figs. 6-9. Se diseñaron cuatro construcciones independientes para el proyecto FMDV. La Tabla 3 resume el número de líneas transgénicas que se generaron y cribaron y la figura 3 proporciona una representación esquemática de la estructura génica para los insertos de FMDV. Tres líneas expresan la cápside PI proteasa 3C (MerE01, 3, 4), mientras que la otra expresa el antígeno de la cápside PI solo (MerE02). Los análisis ELISA y Agilent se utilizaron para cuantificar la expresión de los antígenos de FMDV. Se realizaron transferencias Western para verificar el tamaño correcto de las proteínas expresadas (figura 12). Las líneas de lenteja de agua que expresan el serotipo A24 de FMDV más alto, según lo determinado mediante análisis de ARNm y transferencia Western, se cultivaron en recipientes a escala para proporcionar biomasa para su uso en caracterización y estudios en animales.

Tabla 3: Generación de líneas y cribado adicional de líneas “MerE" de FMDV

[0199] Cribado. Se desarrollaron 144 líneas transgénicas de FMDV. Después de desarrollar las 144 líneas de expresión de FMDV, se cribaron para determinar los niveles relativos de expresión de FMDV en el tejido. Los niveles de ARNm de FMDV se midieron mediante transferencia de puntos de ARN (figura 10) y rtPCR en tiempo real (figura 11) . Los niveles de proteínas de FMDV se midieron usando transferencia Western y ELISA. Las líneas de lenteja de agua que expresan FMDV se cribaron mediante transferencia de puntos de ARN usando una región PI marcada para sondar la transferencia. Las líneas de alta expresión se confirmaron mediante rtPCR en tiempo real, y hubo una concordancia razonable entre los procedimientos de cuantificación de ARNm. Los resultados indican que P1 de FMDV está altamente expresada en la lenteja de agua.

[0200] Procedimientos. Las plantas de lenteja de agua se cultivaron durante dos semanas en pequeños recipientes de investigación y el tejido resultante se recogió y se congeló en N2 líquido. Se extrajo el ARN total de 100 mg de muestras de tejido congelado usando el kit de extracción de ARN Qiagen RNeasy de 96 pocillos (Qiagen, Valencia, CA, # 74181). El ARN se cuantificó, se transfirió al vacío a membranas de nylon y se sondeó con un fragmento de gen de la región PI de la secuencia del gen de FMDV. Se preparó una extracción de tejido crudo de líneas que contenían antígenos de FMDV. Todas las etapas se realizaron a 4 °C. Cien gramos de biomasa congelada se mezclaron con 200 ml de tampón de extracción (NaPO450 mM , NaCl 0,3 M, EDTA 10 mm, pH 7,4) y, a continuación, se homogeneizaron en un mezclador Waring con una ráfaga de 20 segundos durante 4 veces y 10-20 segundos de enfriamiento entremedias. El homogeneizado se centrifugó a 10.000 xg durante 30 minutos a 4 °C, se aclaró pasando a través de una tela de queso para eliminar cualquier residuo grande y finalmente un filtro de acetato de celulosa (0,22 pm). El homogeneizado resultante se almacenó a 4 °C o en hielo para pruebas inmediatas. El homogeneizado restante se congeló en partes alícuotas a -80 °C para su posterior análisis. La proteína soluble total (TSP) se determinó usando el ensayo de Bradford con albúmina de suero bovino como patrón. El análisis de nivel de proteína se realizó para líneas de lenteja de agua que expresan P1. Se leyeron muestras duplicadas de dos extracciones separadas (un total de 4 mediciones).

[0201] Resultados de ARN. Se observó una amplia gama de niveles de expresión de ARN entre las diversas líneas transgénicas de FMDV (figura 11). La expresión de ARN a partir de líneas transgénicas que muestran las señales de hibridación más fuertes se confirmó a continuación mediante rtPCR en tiempo real. Se demostró que la expresión relativa de estas líneas era comparable entre los procedimientos de transferencia de puntos y PCR. Las líneas superiores se seleccionaron a continuación para una caracterización adicional de la transferencia Western (figura 12) .

[0202] Resultados de proteínas. Los resultados de ELISA se resumen en la Tabla 4 y los resultados de densitometría y Agilent se resumen en la Tabla 5. La figura 12 representa los resultados de WB, con flechas que indican las bandas de FMDV. Carril 1 (ambos geles) - marcador, 2 (ambos geles) - virus de FMDV A24 inactivado purificado con sacarosa, 3 (ambos geles) - lisado de tipo salvaje de lenteja de agua. Carriles 4-6 de lisados de lenteja de agua que expresan MerE01 (tres líneas: 6, 8 y 10). Carriles 4-12 Lisados de lenteja de agua que expresan MerE02 (nueve líneas: 2, 3, 16, 20, 23, 24, 25, 26 y 31). Las líneas 6 y 10 de lenteja de agua que expresan MerE01 parecen producir una proteína adecuadamente escindida (esta línea contiene la proteasa 3C). Las líneas de lenteja de agua que expresan MerE02 (que carecen de la proteasa) parecen producir cantidades significativas de la proteína PI sin escindir, así como especies agregadas de mayor PM.

Tabla 4: Resultados de cuantificación de ELISA para las líneas MerE01.

Tabla 5: Nivel de expresión de líneas MerE01 de FMDV de lenteja de agua

[0203] Los inventores observaron que la expresión de la proteasa 3C ejercía efectos tóxicos sobre la lenteja de agua recombinante, causando un crecimiento y producción de antígeno reducidos, en comparación con, por ejemplo, la lenteja de agua recombinante que expresa solo el polipéptido P1. Por lo tanto, se produjeron nuevas construcciones, algunas de las cuales comprendían un casete de expresión de 3C conducido por un promotor inducible. Sin obstáculos por los efectos tóxicos de la expresión de 3C, la lenteja de agua creció y expresó niveles robustos de P1. A continuación, después de que el cultivo alcanzó una densidad óptima, se indujo la expresión de 3C para que pudiera dividir los grupos de PI establecidos en las distintas subunidades. Las subunidades pudieron entonces ensamblarse en protómeros, pentámeros y, finalmente, las partículas virales de la fiebre aftosa (esquematizadas en la figura 16).

[0204] Estas nuevas construcciones de expresión de lenteja de agua de FMDV incluyeron MerF01 (SEQ ID NO: 30), que incorporó PI-3C expresado impulsado por el Super Promotor en el vector de expresión de gen único estándar (EC1.0, análogo al enfoque adoptado para producir MerE01). MerF02 (SEQ ID NO: 31) utilizó el promotor NPR de Lemna gibba (promotor inducible ABA) para expresar PI - 3C y MerF03 (SEQ ID NO: 32) expresó P1-2A y 3C con promotores separados en un solo vector: expresión de PI - 2A dirigida por Super Promotor y expresó 3C dirigida por el promotor de R-histona Lemna minor. MerF04 (SEQ ID NO: 33) expresó P1-2A dirigido por el Super promotor y expresó 3C dirigido por el promotor NPR de Lemna gibba. MerF05 (SEQ ID NO: 34) expresó P1-2A (promotor SpUbq) y 3C (promotor de R-histona de Lemna minor), y MerF06 (SEQ ID NO: 35) expresó P1-2A (promotor SpUbq) y 3C (promotor NPR de Lemna gibba).

[0205] Preparación de antígenos. El extracto crudo se produjo usando un mezclador Waring o un batidor de bolas (relación 1:4 de biomasa a tampón, PBS pH 7,2), y los lisados se aclararon por centrifugación (~10K xg). Para producir el concentrado, el lisado aclarado se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm. Este material se concentró a continuación usando filtros centricón de 30 KDa (5-10x), y se sometió a caracterización in vitro o estudio en animales.

Ejemplo 2 - Expresión de antígenos de FMDV en Schizochytrium

[0206] Los genes de P1 y 3C de FMDV optimizados en codones se clonan en el vector de expresión pAB0018 (depósito ATCC no. PTA9616). La secuencia específica de ácido nucleico del gen de FMDV está optimizada para la expresión en Schizochytrium sp. Además, el vector de expresión contiene un casete marcador de selección que confiere resistencia a los transformantes de Schizochytrium, un promotor del gen nativo de Schizochytrium para impulsar la expresión del transgen y un terminador.

[0207] Se usa Schizochytrium sp. (ATCC 20888) como huésped para la transformación con el vector de expresión que contiene el gen de FDMV usando el procedimiento de electroporación. Las crioreservas de cepas transgénicas de Schizochytrium se cultivan en tubos M50-20 (descrito en US 2008/0022422) hasta la confluencia. Los cultivos de Schizochytrium propagados se transfieren a tubos cónicos de 50 ml y se centrifugan a 3000 g durante 15 minutos o 100.000 g durante 1 hora. El sedimento resultante y la fracción soluble se usan para el análisis de expresión y en el estudio de estimulación con animales.

Ejemplo 3 - Vacunación de cerdos - evaluación de seguridad

[0208] Tres (3) grupos de cinco (5) de los cerdos se vacunaron en los días 0 y 21 (D0 y D21) de acuerdo con el diseño del estudio (Tabla 6). Los detalles del adyuvante TS6 (emulsiones) se pueden encontrar en los números de patente de Estados Unidos US 7,608,279 B2 y uS 7,371,395 B2 (ambos a Merial Limited).

[0209] Evaluación de seguridad. No se observaron reacciones adversas generales/sistémicas después de la vacunación, aunque se observaron aumentos transitorios, de leves a moderados, de la temperatura rectal en todos los grupos. Localmente, se observaron reacciones leves a moderadas para los grupos de lenteja de agua. Las vacunas fueron globalmente aceptables para todos los grupos.

Tabla 6 - Vacunación de cerdos - diseño del estudio

Ejemplo 4 - Vacunación del ganado

[0210] Diecisiete (17) animales bovinos convencionales, libres de FMDV, pero no inmunizados previamente contra FMDV, se usaron para este estudio (el diseño del estudio se resume en la Tabla 7). En D-1, el ganado bovino se asignó a tres grupos de 5 animales y 1 grupo de 2 animales. La vacunación se realizó en D0, por vía subcutánea en el lado izquierdo del cuello. La estimulación se administró en D21, y las observaciones finales se realizaron en D29. Las vacunas probadas que expresan FMDV A24 P1-3C se formularon en adyuvante TS6, tal como se describió anteriormente. Se almacenaron viales separados de antígenos y adyuvante a 5 °C antes de la administración. El contenido de los viales se reconstituyó de forma extemporánea mezclando el antígeno con el adyuvante en consecuencia. El volumen de una dosis de las vacunas reconstituidas fue de 2 ml. La cepa de estimulación fue el virus de la fiebre aftosa tipo A24 preparada para obtener 10000 ID50 por 0,2 ml. La cepa de estimulación se diluyó en suero bovino fetal al 2 % en Hanks MEM con antibióticos.

Tabla 7: resumen de la vacuna en ganado

[0211] En D21, todos los animales fueron tranquilizados mediante la administración de Xilazina (0,03 - 0,10 mg por kg BW IV (0,15 - 0,5 ml por 100 kg BW IV) y estimulados con 10 000 ID⁵⁰de virus por vía intradérmica, en dos ubicaciones de la lengua, 0,1 ml por ubicación. El bienestar general de los animales se verificó diariamente de D1 a D21. Cualquier observación clínica y tratamientos administrados (nombre comercial, principio activo, fecha de preferencia, volumen, ruta) fueron anotados

[0212] Los resultados de la necropsia (número de pies con al menos 1 vesícula, min = 0, max = 4) para los animales fueron los siguientes: lenteja de agua (4, 3, 2, 1, 1), vacuna experimental recombinante 1 (0, 0, 1, 1, 1), vacuna experimental recombinante 2 (3, 4, 4, 4, 4) y los controles (4, 4). El estudio de estimulación fue validado ya que los 2 bovinos de control mostraron signos clínicos de fiebre aftosa, además, la vacuna experimental 2 también exhibió signos claros de fiebre aftosa y puede servir como control negativo. Aunque el ganado en el grupo de lenteja de agua no estaba bien protegido, el síntoma clínico se alivió en dos bovinos. Se consideró que dos bovinos en el grupo de la vacuna experimental 1 estaban protegidos, el resultado fue consistente con otros informes que usaban un sistema de expresión similar y sugirieron que la VLP intacta era inmunogénica y podía proporcionar protección contra el virus el FMDV virulento.

[0213] Es probable que la vacuna de la lenteja de agua mejore 1) aumentando el porcentaje de VLP intacta, y 2) mejorando las estrategias de concentración/purificación, de modo que el antígeno sea más accesible para el sistema inmunitario para lograr una mayor protección.

Ejemplo 5 - Caracterización de antígenos de FMDV mediante ELISA sandwich

[0214] La caracterización in vitro de FMDV expresado en lenteja de agua se realizó con un ELISA sándwich usando FA24 005E9G (anticuerpo monoclonal contra FMDV A24) y M3 biotinilado, un anticuerpo de dominio de cadena simple de llama específico de 12S.

[0215] Los resultados (Figura 17) indicaron que la densidad óptica positiva a 450 nm/630 nm para 1x extracto crudo, 5x y 10x extracto crudo concentrado, estaba en buen acuerdo con el FMDV A24 inactivado como control positivo, mientras que el extracto crudo preparado a partir de lenteja de agua de tipo salvaje permaneció indetectable. El título de ELISA se determinó como el logaritmo decimal por mililitro de la dilución para el cual se obtuvo el 50% de la DO máxima. La Tabla 8 demostró que el título de ELISA para 5x fue mayor que el extracto 1x, sin embargo, equivalente al extracto 10x, se utilizó 5x extracto crudo concentrado de lenteja de agua en el estudio de estimulaci de ganado.

Tabla 8. Resumen del título de ELISA

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición inmunológica o de vacuna que comprende un antígeno del virus de la fiebre aftosa (FMDV) expresado en lenteja de agua y un portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, en la que dicho antígeno comprende una partícula similar a virus (VLP), en la que, además, dicho antígeno está codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 2.

2. Composición, según la reivindicación 1, en la que el antígeno de FMDV está codificada por un polinucleótido que tiene la secuencia, tal como se establece en la SEQ ID NO: 2.

3. Composición, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable es una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el antígeno de FMDV está purificado al menos al 60%.

5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el antígeno de FMDV está purificado al menos al 90%.

6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un adyuvante.

7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para usar en un procedimiento de vacunación de un hospedador susceptible a FMDV ovino, bovino, caprino o porcino.

8. Composición para usar, según la reivindicación 7, en la que dicha vacunación comprende un protocolo de administración de sensibilización-refuerzo.

9. Composición para usar, según la reivindicación 8, en la que:

(a) la administración de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y una administración de refuerzo de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno de FMDV in vivo, o una vacuna viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno de FMDV; o

(b) la administración de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno de FMDV in vivo, o una vacuna viral inactivada que comprende un antígeno de FMDV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno de FMDV, y una administración de refuerzo de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6; o

(c) la administración de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y una administración de refuerzo de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

10. Planta de lenteja de agua transformada con un plásmido que comprende un fragmento de ADN que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 2, en la que el plásmido es para la transformación de la planta, y en la que la planta de lenteja de agua transformada expresa un antígeno codificado por dicho fragmento de ADN que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 2.

11. Planta de lenteja de agua transformada de manera estable transformada con:

(a) un plásmido que comprende un fragmento de ADN que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, en el que el plásmido es para la transformación de la planta, en el que la planta de lenteja de agua transformada expresa un antígeno codificado por dicho fragmento de ADN; o

(b) un gen que expresa un antígeno de FMDV, en el que el antígeno tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia, tal como se establece en SEQ ID NO: 3.