JPH0795952B2 - ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子含有細胞 - Google Patents

ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子含有細胞

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JPH0795952B2
JPH0795952B2 JP62500738A JP50073887A JPH0795952B2 JP H0795952 B2 JPH0795952 B2 JP H0795952B2 JP 62500738 A JP62500738 A JP 62500738A JP 50073887 A JP50073887 A JP 50073887A JP H0795952 B2 JPH0795952 B2 JP H0795952B2
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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の参照 本発明は、1986年１月８日付で出願された米国特許出願
番号第817,226号の一部継続出願である1986年３月28日
付で出願された米国特許出願番号第845,662号を更に一
部継続出願した発明に対応する。これらの各先行米国特
許出願の開示内容は参照により本明細書中に含めるもの
とする。
発明の背景 本発明の技術分野 微生物および高等生物細胞に新規な遺伝子能力を付与す
ることが可能となったので、新たな可能性の大道が開か
れてきた。１つの分野で、細胞毒の影響を及ぼす種々の
作用的物質が関心をもたれている。例えば、農業で使用
される多くの化合物は、害虫、雑草などの駆除に使用さ
れる。多くの場合、これらの化合物の滞留時間は比較的
長く、また長く引き延ばされる。
保存すべき種と抹殺すべき種とを区別することが望まし
い場合が少なくない。例えば、雑草を選択的に駆除して
作物に与える悪影響を最少限に止めることが望ましい場
合がしばしばある。大抵の場合、広範囲に亘る除草剤の
多くは作物に顕著な悪影響を及ぼすため、それらの使用
は基本的に発芽前に限られているか、そうでなくても発
芽後の適用には充分な注意を払わなければならない。
したがって、細胞毒作用物質のような抑圧に抵抗性をも
つよう成育細胞を改良することには大いに興味があると
ころである。
関連先行文献の記載事項 米国特許第4,535,060号明細書は、細菌aroA遺伝子の利
用を記載しており、グリホゼート感受性細胞にグリホゼ
ート耐性を与えている。Hsu及びCamperのCan.J.Microbi
ol.（1976）22:537〜543は、土壌を多く含む培養物から
イオキニシル分解物を単離することを記載しているHsu
およびClemsonのDissert.Abstr.Itrn.B36（1976）No.8,
3708は、3,5−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニト
リル系除草剤の微生物分解を記載している。Ingranおよ
びPullinのPestic.Sci.（1974）５:287〜291は、３種の
土壌中におけるブロモキシニルの永続性を記載してい
る。SmithのAbstrp.Meeting Weed Soc.Am.（1971）pp.1
6〜17は、リジャイナ（Regina:カナダの州部）重質クレ
ー中でのブロモキシニルの分解を記載している。Smith
およびFletcherのHort.Res.（1964）４:60〜62は、3,5
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリル類および
土壌微生物について報告している。
本発明の概要 本発明においては、ニトリラーゼ（nitrilase）、該ニ
トリラーゼをコードする核酸配列、ニトリラーゼ遺伝子
が外来となっている所望の宿主によって認識される調節
遺伝子の転写および翻訳調節下にあって該ニトリラーゼ
をコードする遺伝子を含有する構築物、該構築物を含有
する宿主細胞、該構築物を含有する生物、生物の一部も
しくは調製物が提供される。ブロモキシニル（bromoxyn
il）及び／又はイオキシニル（ioxynil）特異性ニトリ
ラーゼは、ブロモキシニル含有地域および関連除草剤か
ら毒性を除去し、そのような除草剤の細胞毒から宿主を
保護する上で有用である。前記構築物は、該構築物含有
宿主細胞と非含有宿主細胞とを区別する上で有用であ
る。
本発明の具体的説明 本発明は、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリル特に、
3,5−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリル又は3,5
−ジヨード−４−ヒドロキシベンゾニトリルの加水分解
に関連して、新規なDNA配列、新規な構築物、形質転換
細胞、形質転換植物、ペプチドを提供する。本発明は、
前記ニトリルを加水分解し得る酵素の生成に係り、これ
によって前記ニトリルの除草活性を解毒し、且つ該除草
剤に感受性の細胞もしくは宿主を保護し、該除草剤で汚
染された環境から毒素を排除せんとするものである。
関心のある構造遺伝子は、単細胞微生物、特にベンゾニ
トリルを窒素源とし得ることが判っている細菌、ベンゾ
ニトリルを唯一の窒素源とし得る細菌から得ることがで
きる。以下の記述においてベンゾニトリル又はニトリラ
ーゼという場合、ベンゾニトリルとはハロゲン化ｐ−ヒ
ドロキシベンゾニトリル特に3,5−ジヨード−４−ヒド
ロキシベンゾニトリル又は3,5−ジブロモ−４−ヒドロ
キシベンゾニトリルを指し、ニトリラーゼとはこのよう
なハロゲン化ベンゾニトリルを窒素源として特に唯一の
窒素源として使用することのできるニトリラーゼを指
す。
本発明酵素は種々の方法で得ることができるが、有利に
はブロモキシニル又はイオキシニルを含有する環境で天
然に存在する細菌から得ることができる。なかでも腸内
細菌、とくにクレブシエラ（Klebsiella）属の種がよ
い。クレブシエラ・ニューモーニア（Klebsiella pneu
monie）特に変種オゼネ（ozaenae）を利用することがで
きる。土壌から分離するよりもむしろ、生物体を土壌中
又は増加する高濃度のベンゾニトリルと減少量の他の窒
素源とを含む他の培地で成長せると、ベンゾニトリルを
唯一の窒素源として利用しながら生存し続ける生物体が
得られる。
ニトリラーゼ含有細菌の源にかかわらず、ニトリラーゼ
がベンゾニトリルの解毒に有効であるようにするため、
スクリーニングはしなければならない。更に、ニトリラ
ーゼは、ベンゾニトリル類似物すなわちハロゲンを欠い
ているもの、他の置換基を有しているもの等々よりも、
ベンゾニトリルそのものに特異的でなければならない。
したがって、本発明のニトリラーゼは本明細書にいうベ
ンゾニトリルに特異的であり、前記類似物に対しては比
較的不活性であるか又は実質的に活性でない。窒素源と
してのベンゾニトリルと対比して、比較濃度の通常の窒
素源例えばアンモニアの存在下では細菌の増殖速度が顕
著に低下しないこと、すなわち細菌の増殖が約10％以下
低減しないことが望ましい。そして非特異的なベンゾニ
トリルが認められない方がよい。
１つ又はそれ以上の宿主菌株が決まったなら、ニトリラ
ーゼのコード配列を同定する技術を用いる。遺伝子は染
色体又はプラスミド上に存在する。ゲノムは断片化する
ことができ、特に制限エンドヌクレアーゼを用いてその
ようにすることができ、この場合１つ又は複数のエンド
ヌクレアーゼを用いて約5kbから50Kbに亘る断片が形成
される。これらの断片を都合の良い細菌令えば大腸菌内
で適当なベクターにクローン化し、得られる形質転換体
をニトリラーゼ活性についてスクリーニングする。宿主
生物はネガティブなバックグランドとなる。
１つ又はそれ以上のクローンがニトリラーゼ活性を有す
るものと同定された場合、所望のDNA断片を含有する染
色体外要素すなわちプラスミド又はウィルスを、宿主の
溶解、DNAの沈降、染色体DNAからのベクターDNAすなわ
ちプラスミドDNA又はウィルスDNAの分離等々の常套手段
によって単離する。
次いで、染色体外要素をエンドヌクレーゼ制限によって
開裂し、種々のサイズの断片を分離、同定する種々の技
術たとえば電気泳動、密度勾配遠心法等々によって所望
の断片を単離する。
断片の大きさに応じて、遺伝子およびその両側の調節領
域のサイズにもっと近づくよう断片のサイズを小さくす
るように操ることができる。酵素をコードする配列およ
びその調節両側配列を含有する断片の操作には種々の技
術が存在する。種々の反応混合物中で種々の制限酵素を
使用する部分開裂を使用し、各断片をクローン化してど
の断片がニトリラーゼ発現能力を有しているかを決定す
る。
あるいはまた、酵素を単離し、部分的に配列される。ア
ミノ酸配列に基づき、プローブを調製して、遺伝子を有
する断片を同定するものに使用する。この技術を制限酵
素開裂と組み合せることにより、所望の遺伝子を存在さ
せるよう断片をクローン化しスクリーニングすることが
できる。更に、Bal31のようなエキソヌクレアーゼを使
用して断片の片方又は両方端からヌクレオチドを除去
し、余分のヌクレオチドの数を更に減じることができ
る。
あるいはまた、遺伝子を適当な宿主中でクローンし、プ
ローブを用いるスクリーニングによってメッセンジャー
RNAを単離し、適当なin vitro又はin vivo翻訳系例えば
アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞もしくは網状
赤血球等々において同定する。単離したメッセンジャー
を次いで、逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを用いる
相補鎖の形成などの常套手段を用いて、cDNA調製に利用
する。この場合、得られる構造遺伝子は、転写に関連す
る調節領域を欠失している。
ニトリラーゼ発現構造遺伝子を有するDNA配列を、適当
な宿主細胞に導入するため、広範囲の他のDNA配列に結
合させる。コンパニオン配列は、宿主の性質、DNA配列
の宿主の導入方法、およびエピソーム維持もしくは組込
みが所望かどうかに依存している。
原核生物宿主について、DNA配列の形質転換、複合、形
質導入又はトランスフェクションによる原核生物宿主へ
の導入に種々のベクターを使用することができる。DNA
配列は種々のプラスミド例えばpBR322,pACYC184,pMB9,p
RK290等、種々のコスミド例えばpVK100、種々のウィル
ス例えばP22等を含む。
真核生物について、DNAの宿主への導入に種々の技術を
用いることができる。例えば非複製DNA配列、プラスミ
ドもしくはミニクロモソームを含むCa++−沈降DNAの利
用する形質転換、AgrobacteriumにおけるＴ−DNA含有配
列を利用する形質転換，マイクロピペットもしくはエレ
クトロポレーションを利用する微量注入法などである。
競合的複製システムがDNA構成中に存在するか否かに応
じて、DNAがエピソーム要素として複製されるか否か、D
NAが宿主ゲノムに組込まれるか否か、構造遺伝子が宿主
中で発現されるか否かを決定する。エピソーム要素を使
用し得る。例えば、TiあるいはRiのような腫瘍誘発プラ
スミドもしくはその断片、CaMV,TMVのようなウィルスも
しくはその断片などである。これらは宿主に致命的なも
のではなく、構造遺伝子は、その発現が可能となるよう
な状態で前記エピソード要素中に存在する。特に関心が
もたれるものは、複製機能を有するが他の機能例えば発
癌性、有毒性などを欠く断片である。
ニトリラーゼ源から得た断片は適当なクローニングベク
ターを用いてクローン化する。クローニングは適当な単
細胞微生物たとえば大腸菌のような細菌中で行うことが
できる。望ましくはコスミドを使用する。ここでは部分
的又は完全な消化により、ほぼ所望サイズの断片が得ら
れる。例えばコスミドpVK100は適当な制限酵素の作用を
受けて部分的に消化され、プラスミド、染色体もしくは
それらの断片の部分的又は完全消化のいずれかにより得
られた断片に連結する。パッキングをすれば、所望サイ
ズの断片のみを宿主生物にパックし、形質導入すること
が確保される。
宿主生物としてはベンゾニトリル耐性のものが選択され
る。感受性菌株は変異させて、形質導入体の選択基準と
なる適当な遺伝特徴を持たせることができる。微生物に
おいて、形質導入体は他の微生物への接合に用いられ
る。この場合、必要に応じ移動可能なプラスミドを用い
る。ニトリラーゼに対する構造遺伝子を含有する断片の
サイズを更に小さくするのに種々の技術を利用すること
ができる。例えば、コスミドベクターを単離し、種々の
制限酵素たとえばEcoR I,Bgl II,Sma I等々で開裂し、
得られた断片を適当なベクター、有利には先に使用した
コスミドベクター中にクローン化する。コスミドベクタ
ーの代わりに、他の種々のクローニングベクター、なか
でも小さいサイズのもの例えばpACYC177、pACYC184など
を使用することができる。このように、好ましくは約5K
b以下、一般に約4Kb以下、最も好ましくは約2Kb以下の
断片をクローン化して、ベンゾニトリル耐性とする。
望ましくは、断片は約1Kbであり、約5Kb以下であり、好
ましくは約4Kb以下であり、特に少なくとも約1047bpで
あって、更に少なくとも約1100bpの両側領域を含有して
いてもよく、好ましくは約1.5Kb以下である。特に関心
があるのは、クレブシエラ・オゼネからのBgl II〜Sma
I断片であり、特に約1210bpのPst I−Hin c II断片であ
る。
ニトリラーゼ酵素は、任意の都合の良い源、原核生物か
又は真核生物のいずれかによって発現される。このよう
な源としては、例えば、細菌、イースト、糸状菌、植物
細菌などがある。分泌物が得られない場合、細胞を溶解
して酵素単離し、公知方法を利用してニトリラーゼを単
離する。有用な方法としては、クロマトグラフィー、電
気泳動法、アフィニティクロマトグラフィーなどがあ
る。有利には、ブロモキシニルを、適当な官能基たとえ
ばカルボキシル基を介して不溶性支持体に接合させ、ニ
トリラーゼ単離用のパッキングとして利用することがで
きる。
ニトリラーゼ比活性は、HarperのBiochem.J.（1977）16
7:685〜692に記載の条件下で、少なくとも約0.1マイク
ロモルアンモニア/min/mg蛋白質であり、一般には少な
くとも約0.5マイクロモルアンモニア/min/mg蛋白質又は
それよりも高い。
精製酵素をいろいろの方法で使用することができる。ブ
ロモキシニル、イオキシニル又は他の関連ベンゾニトリ
ルのアッセイに直接使用することができる。あるいはま
た、この酵素は、ハプテンもしくは抗原のような関心の
ある分析対象物に又は抗体に接合させて、診断アッセイ
の標識として使用することができる。このようなアッセ
イは米国特許第3,654,090号明細書、同第3,817,837号明
細書、同第3,850,752号明細書に記載されている。接合
方法および分析対象物の濃度測定はこれらの米国特許明
細書に詳しく記載されているので、これら明細書の至適
開示部分を参照により本明細書中に含めるものとする。
ニトリラーゼをコードするDNA配列の利用方法もいろい
ろある。DNA配列は野生型又は変異型ニトリラーゼ単離
用のプローブとして利用できる。あるいはまた、DNA配
列は、組換えによる宿主への組込みに利用でき、宿主を
ベンゾニトリル耐性とすることができる。
植物細胞を用いる場合、構築の一部としての構造遺伝子
を、組換えによる宿主ゲノムの組込みのためマイクロピ
ベット注入により、植物細胞核に導入することができ
る。あるいはまた、エレクトロポレーションを利用し
て、植物宿主へ導入するため構造遺伝子をその中へ導入
することができる。植物宿主によって認識されない調節
シグナルを有する源から構造遺伝子を得る場合、発現の
ため適当な調節シグナルを導入することが必要な場合が
ある。ウィルス又はプラスミド例えば腫瘍誘発プラスミ
ドを使用してマップ化する場合、プロモーターの下流側
に制限部位を選択し、その中にプロモータから適当な距
離をおいて構造遺伝子を挿入する。DNA配列が適当な制
限部位を提供しない場合、Bal31のようなエキソヌクレ
アーゼを用いて何回も消化し、合成制限エクドヌクレア
ーゼ部位（リンカー）を挿入することができる。
腫瘍誘発プラスミド例えばTi又はRiの使用はとくに関心
がもたれるものであって、ニトリラーゼ遺伝子は植物細
胞染色体に組込まれる。Ti−プラスミドとRi−プラスミ
ドの使用は、PCT国際公開wo84/01913,同wo84/02919,同w
o84/02920,及びEPO出願0116718、並びにMatzkeとChilto
nのJ.Mol.App.Genetics（1981）１:39〜49に記載されて
いる。
Ｔ−DNAの右ボーダー（border）又は両方のボーダーを
使用する場合であって、このボーダーが、植物宿主によ
って認識される開始と終結用の転写および翻訳調節シグ
ナル下に、ニトリラーゼ構築遺伝子を有する発現カセッ
トを配置しているとき、発現カセットが植物ゲノムに組
み込まれて、植物細胞中その種々の分化段階においてニ
トリラーゼ酵素の発現が行なわれる。
種々の構築物が調製できて、植物細胞内での発現がなさ
れる。構築物は、植物宿主中でのニトリラーゼ発現のた
め植物中で機能する発現カセットを提供する。
転写するため、構成性又は誘発性の種々の転写開始領域
（プロモータ領域）を使用する。
ニトリラーゼをコードする構造遺伝子に転写開始領域を
結合させて、開始コドンの上流、通常は開始コドンから
約200塩基以内のところで転写を開始する。ここで非翻
訳５′−領域はATGを欠いている。
構造遺伝子の３′−末端は１つ又はそれ以上のストップ
コドンを有しており、これは植物宿主中で機能する転写
終結領域に結合する。この終結領域は開始領域と同じか
又は異なる構造遺伝子と関連させてもよい。
発現カセットは、転写方向に、開始領域、開始領域の転
写コントロール下での構造遺伝子、転写の終結と適当に
はメッセンジャーRNAのプロセッシングを指令する終結
領域を有することで特徴づけられる。
転写および翻訳調節領域として、有利にはオピン（opin
e）プロモーター及びターミネーター領域を使用する。
これらはニトリラーゼ遺伝子の構成発現を可能にする。
あるいはまた、他のプロモーター及び／又はターミネー
ターを使用することも可能であり、特に植物宿主中で誘
発発現又は調節発現を可能にするプロモーターを使用す
ることができる。Ti−プラスミドから利用できるプロモ
ーター領域は、オピンプロモーター例えばオクトピンシ
ンテターゼプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモ
ーター、アグロピンシンテターゼプロモーター、マンノ
ピンシンテターゼプロモーター等々を有している。その
他のプロモーターとしては、ウィルスプロモーター例え
ばCaMV領域VIプロモーター又は完全長（35S）プロモー
ター、リブロース−1,5−ビスホスフェートカルボキシ
レート遺伝子に関連するプロモーター例えば小さいサブ
ユニット、ファセオリン，蛋白質貯蔵，β−コングリシ
ニン，セルロース形成等に関連する遺伝子を挙げること
ができる。
種々の配列を常法に従い一緒に結合してもよい。プロモ
ーター領域は、構造遺伝たとえばピン遺伝子の５′領域
から制限マッピング、配列決定により同定され、選択さ
れ、単離され得る。同様にターミネーター領域は構造遺
伝子から領域３′として単離される。配列は適当は配向
にクローン化されて結合され、植物宿主中がニトリラー
ゼ遺伝子の構成発現が付与される。
ニトリラーゼ酵素を発現する機能遺伝子を作物植物細胞
に導入すると、広範囲の作物に対して、雑草のほぼ完全
または完全な除去を達成できる濃度でブロモキシニル、
イオキシニル又は類似の除草剤を使用することができ、
該作物に比較的悪影響を与えることはない。このため、
化学肥料、水などを充分に活用することができ、雑草が
もたらす有害効果を排除することができるので、実質的
な経済効果をあげることができる。
ニトリラーゼ酵素を発現する発現カセットは、広範囲の
植物、単子葉およ双子葉植物、例えばトウモロコシ、
麦、大豆、タバコ、綿、トマト、ポテト、Brassica種、
ライス、ピーナッツ、ペチュニア、ヒマワリ、サトウダ
イコン、芝草などに導入することができる。遺伝子は、
癒合組織（仮皮）組織、根、管状部、胎芽、苗木、種、
葉、若木、花粉などの植物部分又は細胞に存在し得る。
植物をベンゾニトリル耐性とすれば、作物成長を助長
し、栄養物の競合体を抑圧するなどして作物を雑草から
保護するのに種々の調合剤、方法を採り得る。例えば、
ブロモキシニルをヒマワル、大豆、コーン、綿などの作
物に害を与えないで雑草の発芽後駆除に使用でき、ある
いはまた他の薬剤を併用することもできる。
殺虫剤の有用量を調合剤の形態でフィールドに散布し、
ブロモキシニルを約0.1〜４b/acre好ましくは0.2〜２
b/acre散布し、他の除草剤をその活性成分として約0.
1〜４b/acreの量散布する。調合剤に他の添加物、例
えば洗剤、助剤、拡散剤、粘着剤、安定剤などを導入し
てもよい。調合剤は湿式調合物でも乾式調合物でもよ
く、流動可能な粉末状、乳化可能な濃縮物、液体濃度な
どこの分野で知られている形態にすることができる。
除草溶液は、通常の方法たとえばスプレイ、潅水、散布
などにより適用できる。
下記の実施例は本発明の説明のためのものであって、本
発明を限定するものではない。
実 験 材料と方法 連結反応に制限酵素とT4リガーゼを、それらの製造業者
の使用説明に従って、使用した。クローニングと分子分
析の標準方法は、Maniatis等の（1982）Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,Ner Yorkに準じた。
クローン分析はIsh−Horowitz等のNucl.Acids Res.（19
81）９:2989〜2998に記載されている方法で行なった。E.coli 株MM294をすべてのクローニング実験に用いた（H
anahan,Mol.Biol.（1983）166:557〜80）。
抗生物質の量（使用した場合）は、cm（クロラムフェニ
コール）25μg/ml、Tc（テトラサイクリン）10μg/ml、
Ap（ペニシリン）300μg/mlであった。E.coli におけるプラスミドDNAの形質転換は、Mandelお
よびHigaのJ.Mol.Biol.（1970）53:159〜162に従った。
ブロモキシニル汚染土壌サンプルからの細菌分離物を単
離し、スクリーニングした。このような微生物はクレブ
シェラ・ニューモーニア（Klebsiella pneumoniae）の
亜種オゼネ（ozaenae）であった。
前記微生物のブロモキシニル特異体とニトリラーゼを部
分精製して特徴付けしたものは、見掛け分子量34kDalの
活性酵素を生産した。
固体Ｌ−アガー上でK.オゼネを繰り返し継代培養したと
ころ、BarnettとIngrahamのJ.Appl.Bacteriol.（1975）
18:131〜143に記載されているように、１リットルあた
りKH2PO4（1.5g）、K2HPO4（3.5g）、MgSO4・7H2O（0.1
g）、イースト抽出物（50mg）、クエン酸塩、グリセロ
ール、コハク酸塩0.1％及び微量元素を含む所定の液体
培地中での成育により、ブロモキシニルを唯一の窒素源
とすることのできない変異体が分離された。前記ば培地
は以下YETE多炭素培地（YETE multi−carbonmedium）と
いう。YETE多炭素培地は0.05％のブロモキシニルを含ん
でいた。この微生物はブロモキシニルを唯一の窒素源と
するものではないが、0.05％のブロモキシニルを含有す
るＬ−ブロス中で最高密度まで増殖する。K.オゼネ変異
体コロニーを選択し、10mlのＬ−ブロス中で成育させ
た。また、３つの独立したK.オゼネのコロニーをブロモ
キシニル含有LBプレートから選択し、同一条件下で成育
させた。これらの同じ４つのK.オゼネコロニーを、0.05
％ブロキシニル供給Ｌ−ブロス10ml中で同時に成育し
た。30℃で最高密度になるまで培養を続け、ミニプレッ
プ（mini−prep）プラスミドDNAがIsh−Horowitz等のNu
cl.Acids Res.（1981）９:2989の方法により各培養物か
ら調製された。未消化プラスミドDNAを0.5％アガロース
ゲル上で電気泳動すると、プラスミドバンドがエチジウ
ムブロミド染色で可視化された。
K.オゼネ変異体微生物は、ブロモキシニルの存否に拘ら
ず成長する単一プラスミド種（68Kbのサイズ）であるこ
とが判った。３つのK.オゼネコロニーは、0.05％のブロ
モキシニル存在下での成育により、より大きなプラスミ
ド種（90Kb）を示した。ブロモキシニルが存在しない場
合には、３つのK.オゼネコロニーのうち２つに両プラス
ミド型が存在する。このことは、ブロモキシニル選択が
緩和された場合、約22KbのプラスミドDNAの附随的損失
を伴なってより大きなプラスミド種からより小さいもの
へ変換することを示している。
４つのすべてのコロニーを、0.05％のブロモキシニル含
有Ｌ−ブロス200ml中で増殖させた。細胞をフレンチプ
レスで破壊し、0.05MのKPO（pH7.5）と2.5mMのジチオト
レイトール（DTT）とを含むバッファーを用いて高速上
清透析を行なう各粗製抽出物のブロモキシニル特異性ニ
トリラーゼ活性について分析した。K.オゼネ変異体の粗
製抽出物は検出可能なニトリラーゼ活性を示さなかった
が、他のK.オゼネ粗製抽出物はそれぞれ0.124,0.105お
よび0.143マイクロモルNH3/min/mg蛋白質のニトリラー
ゼ特異活性を示した。0.1％グルコースと0.04％ブロモ
キシニルを含有するM9培地（Miller（1972）のExperime
nts in Molecular genetics,Cold Spring Harbor Labor
atory）中で、細胞（200ml）を30℃で対数増殖期まで成
育させた。細胞を破壊し、超遠心し、0.05M KPO4 pH7.5
と2.5mM DTTを含むバッファー中上清を透析すること
で、粗製抽出物を得た。基質濃度はすべてのアッセイに
おいて3mMブロモキシニルであった。NH3の放出はHarper
のBiochem.J.（1977）167:685〜692に従ってモニターし
た。K.オゼネ変異体がブロモキシニル含有Ｌ−ブロス中
で成育するということは、同微生物がこの化合物に対し
て非透過性を獲得したということである。しかしなが
ら、この微生物は唯一窒素源としてブロモキシニルを利
用する所定培地中で成育することができない。
以上より、K.オゼネニトリラーゼはコードされたプラス
ミドであるように思われる。この酵素をコードする遺伝
子は、ブロモキシニル選択が存在しないときにK.オゼネ
プラスミドから自然損失した22KbプラスミドDNAセグメ
ントに存在するものと思われる。
K.オゼネブロモキシニル特異性ニトリラーゼのE.coli中
での発現 0.05％ブロモキシニル選択下で成育するK.オゼネからプ
ラスミドDNAを調製し、該DNAをE.coli株MM294（thi，gy
rA96,end I-,hsdR17）に形質転換した。窒素欠損（N-）
固体アガロース最少培地（１リットルあたりKH2PO4（1.
5g）、K2HPO4（3.5g）、MgSO4・7H2O（0.1g）と0.1％グ
ルコース含有）に唯一窒素源として0.05％ブロモキシニ
ルを添加して、形質転換体を選択した。５日間のインキ
ューベーション後、10のコロニーが選択プレート上に現
われた。これらのコロニーを0.05％ブロモキシニル含有
Ｌ−アガープレート上で再び画像培養し、MM294中チア
ミン栄養要求性マーカーの存在をテストした。チアミン
が存在しない最少培地中で成育したコロニーはいずれも
E.coliMM294菌株を示さなかった。すべてのコロニー
は、チアミンと唯一窒素源としての0.05％ブロモキシニ
ル供給M9培地で成長することができる。ブロモキシニル
を存在させないこの培地では成長は望めない。コロニー
のうち２つを更に分析するため選択した。90Kbプラスミ
ドを含むE.coliMM294の粗製抽出調製物をブロモキシニ
ル特異性ニトリラーゼ活性について分析したところ、0.
216マイクロモルNH3放出/min/mgの比活性が認められ
た。より小さいプラスミド種を含むE.coliMM294は検出
可能なニトリラーゼ活性体を生産しなかった。E.coliの
より大きな90KbプラスミドをpBrx1と記載し、より小さ
いプラスミド（68Kb）はpBrx1Δと記載する。
プラスミドpBrx1を含むE.coliMM294がブロモキシニル特
異性ニトリラーゼ反応の結果としての適当な代謝産物を
生産していることを確認するため、0.05％のブロモキシ
ニル供給M9培地で30℃24時間、MM294（pBrxl）の20ml培
養物を成育させた。培養物の濾液サンプルをC18HPLCカ
ラムを用いてクロマトグラフィーにかけた。培養物濾液
中のすべての導入ブロモキシニルは、新しい代謝産物ピ
ークに換わっていた。代謝産物ピークの同定は、スペク
トル分析によったところ、３′５′−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシ安息香酸（DBHB）であった。このように、E.co
li中ニトリラーゼ発現をコードするブロモキシニル特異
性プラスミドの生成はK.オゼネにみられたものと同じで
ある。
ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ遺伝子のE.coli中で
のクローン化 ブロモキシニル特異性酵素をコードするDNAセグメント
がE.coli中にクローン化できるか否かを調べるため、プ
ラスミドpBrx1をBamH Iで消化したところ、２つのバン
ド53Kbと37Kbとが得られた。BamH IフラグメントをE.co
liプラスミドベクターpACYC184（ChangとCohn,J.Bacter
iol.（1978）134:1141）のBamH I部位に連結させ、E.co
li株MM294に形質転換した。pACYC184のBamH I部位へク
ローニングすると、ラトラサイクリン耐性遺伝子の挿入
失活が起こる。クロラムフェニコール耐性テトラサイク
リン感受性MM294コロニーを選択し、ミニプレップクロ
ーン分析DNA（mini−prep clone analysis DNA）を調製
し、該DNAをBamH Iで消化した。４つのクローンは37Kb
BamH Iフラグメントを有していたが、１つのクローンは
pBrx1のより大きい53Kb BamH I DNAフラグメントを収容
していた。クローン化BamH Iフラグメントを有する５つ
のクローンはまた、pBrx1から22KbのプラスミドDNAを自
然欠失した後のDNAセグメントに対応するプラスミドpBr
x1Δにもみられる。すべての10のクローンを200μg/ml
のクロラムフェニコールの存在下（プラスミドを選択す
るため）200mlのＬ−ブロス中で増殖させ、粗製抽出調
製物を得、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につ
いて分析した。37Kb BamH Iフラグメントを有する４つ
のクローンは0.140マイクロモルNH3放出/min/mg蛋白質
程度のニトリラーゼ特異活性を示したが、他の６つのク
ローンには検出可能なニトリラーゼ活性は認められなか
った。このデータは、ブロモキシニル特異性ニトリラー
ゼ活性をコードする遺伝子がプラスミドpBrx1からクロ
ーン化された37Kb BamH Iフラグメント上に存在するこ
と、ブロモキシニル選択の非存在下自発損失した22Kb D
NAセグメントが37Kb BamH Iフラグメントの内部に存在
することを示している。
ベクターpACYC184に対するBamH Iフラグメントの配向を
調べるため、上記４つのクローンのDNAをEcoR Iで消化
し、0.07％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。プラ
スミドpBrx1とpBrx1ΔのEcoR I消化物を集め、これから
も分析した。
ベクターpACYC184に対する37Kb BamH7フラグメントの両
配向を求め、それぞれプラスミドpBrx2,pBrx3とした。
３つのEcoR Iフラグメントが、プラスミドpBrx2とpBrx3
から自然欠失した22Kb DNAセグメントの内部に存在する
ことがまた観察された。これらEcoR Iフラグメントのサ
イズはそれぞれ18Kb,3Kbおよび1.9Kbである。ブロモキ
シニル特異性ニトリラーゼをコードする遺伝子は、ニト
リラーゼ構造遺伝子がEcoR I制限部位によって二分され
ない限り、これら３つのEcoR Iフラグメントの１つの中
に位置している。E.coli （pBrx3）のブロモキシニル特異性ニトリラーゼ
の位置を調べた。その結果を次に示す。
（ａ）プラスミドpBrx3を含むE.coli（MM294）細胞を例
示の培地中37℃で定常増殖期まで成育させ、5ml培養物
とした。培養物は、その旨記載してある場合には、20μ
g/mlのクロラムフェニコールと0.04％のブロモキシニル
（Brx1）を含んでいた。各培地から1mlを採取し、ニト
リラーゼバッファー（0.1M KPO4,pH7.5）を用いて一度
洗浄し、同じバッファー液0.1mlに細胞を再懸濁させ
た。HarperのBiochem.J.（1977）167:685〜692に準拠し
て、3mMブロモキシニルを基質として使用するか又は使
用しないで、50μサンプルのニリラーゼ活性を分析し
た。
（ｂ）単位：μmoleNH3/min/mg。
蛋白質は1.4O.D.600＝109細胞/ml＝150μｇとして求め
た。
これらのデータは、ニトリラーゼ酵素の細胞位置が細胞
周辺腔にあることを示している。酵素が培地中ブロモキ
シニル非存在下で発現されるという第２の観察結果は、
ブロモキシニル誘導に酵素発現が必要でないことを表わ
している。
ブロモキシニル特異性ニトリラーゼの精製 K.オゼネニトリラーゼを更に精製すると、次の結果が得
られた。
（ａ）0.04％ブロモキシニルとグルコースを含有するM9
培地中30℃で対数増殖期まで細胞を成育させた。粗製抽
出物は、細胞破壊、超遠心、および0.05M KPO4 pH7.5と
2.5mM DTTを含むバッファー中での透析により調製し
た。基質濃度はすべてのニトリラーゼアッセイにおいて
3mMであった。
（ｂ）単位：μmoleNH3/min/ng 0.05％KPO4 pH7.5、2.5mM DTTおよび1mM EDTA含有バッ
ファーで2.5cm2×10cmカラムを平衡化させた。サンプル
を入れ、前記カラムバッファー中0.02M〜0.40M線状勾配
の300ml NaClで展開した。1M NaCl含有バッファーを前
記勾配の最後に入れた。5ml画分を集め、各フラクショ
ンの0.075mlアリコットをニトリラーゼ活性について分
析した。酵素活性の単一ピークが0.22M塩で溶出した。
最初のニトリラーゼ活性の約75％が活性画分で回収され
た。DEAEカラムからのニトリラーゼピークを有する画分
を、0.02M KPO4 pH7.5と、11.25％の変性Laemmliゲルに
適用された各画分50μ（６μｇの蛋白質）とを用いて
透析した、DEAEカラムからの活性ピークに対応する蛋白
質主バンドは分子量34,000のポリペプチドである。その
他のポリペプチドは活性カラム分画によって顕現化でき
なかった。これらのデータは、ブロモキシニル特異性ニ
トリラーゼが分子量約34,000のポリペプチドで、単一遺
伝子の生産物である可能性が高いことを示している。
クローンpBrx2をEcoR Iで完全に消化し、約19Kbのフラ
グメントを分離した。このフラグメントをEcoR I消化pA
CYC184ベクター（3.9Kb）に挿入し、前記したように、
E.coliに形質転換されるプラスミドpBrx5を得た。この
プラスミドを情報に従い単離し、Bgl IIで消化して、pA
CYC184ベクターに挿入されたままの約6.7Kbフラグメン
トを得た。この単離されたプラスミドpBrx7を次いでSma
IおよびBgl IIで消化し、Sma I−BamH I消化pACYC177
（3.7Kd）（ChangとCohenのJ.Bacteriol.（1978）134:1
141〜1156）に挿入される約3.9Kbのフラグメントを得
た。ペニシリン耐性の形成されたプラスミドを前記した
ようにE.coliに形質転換し、ペニシリン選択培地上で形
質転換体を選択し、プラスミドpBrx8を得た。これを3.9
Kbフラグメントにニトリラーゼ遺伝子を担持している。
pBrx8をPst Iで部分的に消化し、そのフラグメントをPs
t I消化pUC18（Yanisch−Perron等のGene（1985）33:10
3〜119）に挿入した。得られたプラスミドをE.coliにク
ローン化し、ニトリラーゼ活性についてスクリーニング
した。１つのクローンは5.3KbのプラスミドpBrx9を有し
ていたが、これを単離し更にPst IおよびHinc IIで消化
すると、Pst I〜Hinc II方向に、比較的等間隔をあけて
Cla I，Sal I,Sca IおよびSph I制限部位を有する1210b
pのフラグメントが得られた。Pst I−Hinc IIフラグメ
ントをSanger等のProc.Natl.Acad.Sci.USA（1977）74:5
463〜5468の方法に準じて配列決定した。この配列を
（コードされた適当なアミノ酸と共に）次に示す。
側方の５′−及び３′−非コーディング領域を実質的に
持たないPst I−Hinc IIフラグメントはEcoR Iリンカー
と連結してEcoR Iで消化し得、その状態でpCGN451のEco
R I部位への挿入により植物発現カセットに導入でき
る。
pCGN451は、前記遺伝子の３′末端にEcoR Iリンカーを
介して融合された約1,566bpの５′非コーディング領域
と約1,349bpの３′非コーディングDNAとを含むオクトピ
ンカセットを含む。pTi配位（coordinae）は、Barker
他、Plant Molecular Biology（1983）２:335で規定さ
れているように、３′領域の場合が11,207〜12,823、
５′領域の場合が13,643〜15,208である。５′フラグメ
ントは下記の方法で得た。BamH I−EcoＲフラグメント
としてコーディング領域の５′末端を含むサブクローニ
ング処理した小さいフラグメントをプラスミドpCGN407
としてpBR322内でクローニングした。BamH I−EcoR Iフ
ラグメントはコーディング領域にXmn I部位を１つ有
し、pBR322はXmn I部位を２つ有する。pCGN407をXmn I
で消化し、Bal31ヌクレアーゼで切除し、EcoR Iリンカ
ーをこれらのフラグメントに付加した。EcoR I及びBamH
I消化の後前記フラグメントをサイズ分別（size fract
ionation）し、得られたフラクションをクローニング処
理して配列した。一例として、コーディング領域全体及
び10pbの５′非翻訳配列を除去し、５′非転写領域と、
mRNAキャップ部位と、16bpの５′非翻訳領域（BamH I部
位への）はそのまま残した。この小さいフラグメントは
７％アクリルアミドゲルでのサイズ分別によって得、約
130bpの長さのフラグメントを溶離した。このサイズ分
別したDNAをM13mp9内に連結し、幾つかのクローンを配
列して、その配列をオクトピンシンターゼ遺伝子の既知
の配列と比較した。M13構築体はP14と称し、このプラス
ミドをBamH I及びEcoR Iで消化して小フラグメントを
得、これをpTiA6（GarfinKel及びNester,J.Bacteriol.
（1980）144:732）からの上流５′配列を含むXho I〜Ba
mH Iフラグメントと、３′配列を含むEcoR I〜Xho Iフ
ラグメントとに連結した。得られたXho Iフラグメント
をpCGN426と称するpUC8誘導体のXho I部位内にクローニ
ングした。このプラスミドはDNAポリメラーゼＩで補充
された単一EcoR I部位を有し、勝つXho IリンカーをpUC
8の唯一のHinc II部位に挿入した時にHinc II制限エン
ドヌクレアーゼのヌクレアーゼ感染によってPst I及びH
ind III部位を失ったという点でpUC8と異なる。このよ
うにして得られるプラスミドpCGN451は、タンパク質コ
ーティング配列を５′非コーティング領域（Ｔ−DNAの
右端を含む1,5550bpの５′非転写配列と、mRNAキャップ
部位と、16bpの５′非翻訳配列とを含む）と、３′領域
（267bpのコーディング領域と、ストップコドン（stop
codon）と、196bpの３′非転写配列とを含む）との間に
挿入するための単一のEcoR I部位を有する。
オクトピンシンテターゼ（ocs）カセットを含むXho Iフ
ラグメントをプラスミドpCGN517内に挿入した。このプ
ラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子及びカナマイシ
ン耐性遺伝子を有する。pCGN517は、pUC4KからのKanr遺
伝子（Vieira,Gene（1982）19:259）を唯一のPst I部位
に導入することによって、pHC79（Hohn,Gene（1980）1
1:291）から形成した。このpCGN517を、唯一のSal I部
位に挿入したSal I及びXho Iフラグメントで消化した。Xho Iフラグメントは第２のプラスミドpCGN529内にも挿
入した。このpCGN529は、Tn5（Rthstein他,1981,Movabl
e Genetic Elements,p.99,Cold Spring Harbor Laborat
ories,Cold Spring Harbor,NY）からのKanr遺伝子の挿
入によってpACY184から形成する。BamH I部位に挿入し
たpRiA4T−LDNA（White及びNester,J.Bacteriol.（198
0）144:710）からの2.4kbのBgl IIフラグメントは、pAC
YC184のHind III−BamH IフラグメントをTn5のKanr遺伝
子で置換した後でそのまま残る。Eco R Iニトリラーゼ遺伝子がocsカセットの唯一のEcoR
Iに挿入されたocsカセットを含むXho Iフラグメントをp
CGN517及びpCGN529に挿入して２つのプラスミドpN1及び
pN2を得る。これらのプラスミドは、Ｔ−DNAにTi−又は
Ri−プラスミドを組込むべく、夫々A.tumefaciens又は
A.rhizogenesへの導入に使用される。夫々のプラスミド
への組込みは、Comai他,Plasmid（1983）10:21〜30に記
述されているように、３−ウエイメイティング（３−wa
y mating）によって実施し得る。プラスミドpRK2073、p
N1もしくはpN2及びA.tumefaciens A722（Garfinkel,J.B
aceriol.（1980）144:732）もしくはA.rhizogenes A4T
（White,同上（1980））144:710）を含むE.coli宿主を
一晩培養したものを一晩培養し、適当な培養体を混合し
て、150μg/mlカナマイシンを含むABプレート上に伸ば
す。独立コロニーを２回画線培養する。Agrobacte−riu
mDNA全体のサザン分析によって正確な組込みを確認す
る。エンドヌクレアーゼで消化したDNAをニックトラン
スレーション処理したpBrx8でプローブした。
ブロモキシニル特異的ニトリラーゼ遺伝子を胆汁組織中
に発現させる 2.6kbフラグメント上にニトリラーゼ遺伝子を担持する
プラスミドpBrx9をBamH Iで消化し、Bal31で処理して
５′側方領域の一部分を除去した。BamH Iリンカーを付
加して再閉鎖を完了した。その結果得られたプラスミド
はアンピシリン耐性を与えた。このプラスミドを前述の
ごとくＥ．coliに形質転換し、これらの形質転換体をア
ンピシリン選択媒質で選択処理して5.2kbプラスミドpBr
x16及びpBrx17を得た。これらのプラスミドは2.6kbフラ
グメント上にニトリラーゼ遺伝子を有する。pBrx16をBa
mH Iで消化し、且つHinc IIで部分的に消化すると1.2kb
ニトリラーゼ遺伝子フラグメントが得られた。Bam H I−Sma Iで消化したpCGN46にBamH I−Hinc IIフラ
グメントを挿入して、ニトリラーゼ遺伝子フラグメント
を含む6.6kbプラスミドpBrx22を得た。
PCGN46（Comai他,Nature（1985）317:741〜744）はマン
ノピンシンターゼ（MAS）発現カセットであり、MASプロ
モータ及びocs３′領域を含む。pCGN46の構築は下記の
方法で達成した。マンノピンシンターゼプロモータ領域
（PMAS）を含むＴ−R DNA（Barker他,Plant Mol.Biol.
（1983）２:325）の一部分を担持するほぼ5.5kbpのＥ．
coliフラグメント（Eco13又はEcoＣ）をpVK232と称する
ベクター内でクローニングした。pVK232をEcoR Iで消化
した後、Eco13をpACYC184のEcoR I部位に挿入してプラ
スミドpCGN14を得た。pCGN14をSph I及びCla Iにより消
化（夫々前述のbarker他の配列の部位21562及び20128
で）してPMAS領域を除去し、pCGN40を得るべくSph I及
びAcc Iで消化しておいたpUC19（Pharmacia,Inc.）に前
記PMAS領域を挿入した。このPMAS領域は内部にCla I認
識部位を含み、この部位は消化に耐えるようにメチル化
される。
pCGN40をEcoR V及びEcoR Iで消化した。EcoR V部位はＴ
−DNA内にあり、EcoR I部位はpUC19のポリリンカー内に
ある。その結果PMAS領域を持つフラグメントが得られ
た。オクトピンシンターゼカセットを含むpCGN451をSma
I及びEcoR Iで消化し、オクトピンシンターゼ５′領域
を除去しておいたより大きい大フラグメントを分離し
た。オクトピンシンターゼ５′領域に代えてEcoR V−Ec
oR I PMAS領域をpCGN451に導入し、転写開始及び終了領
域をポリリンカーで分離してpCGN46を得た。
1.2kbニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含むプラスミ
ドpBrx22を前述のごとくＥ．coliに形質転換した。この
プラスミドを従来の方法で分離し、Xho Iで消化して、M
ASプロモータと、25塩基対分のバクテリ５′非翻訳配列
を含むブロモキシニル遺伝子と、ocs３′領域とを含む
4.1kbフラグメントを得た。この4.1kbフラグメントをSa
l Iで消化したプラスミドpCGN783に挿入してほぼ31kbの
プラスミドpBrx28を得た。
pCGN783の構築 pCGN167の構築 pCGN167を構築すべく、Alu Iでの消化によりCaMVのAlu
Iフラグメント（bp7144〜7735）（Gardner他,Nucl.Acid
s Res.（1981）９:2871〜2888）を得、M13mp7のHinc II
部位にクローニングして（Vieira Gene（1982）19:25
9）C614を形成した。C614をEcoR Iで消化して、35Sプロ
モータを含むEcoR IフラグメントをC614から形成し、こ
れをPUC8（Vierra他,Gene（1982）19:259）のEcoR I部
位にクローニングしてpCGN146を形成した。
前記プロモータ領域をトリミングすべく、Bgl II部位
（bp7670）をBgl II及びBal31で処理し、次いでBal II
リンカーをBal31処理したDNAに結合してpCGN147を形成
した。
pCGN528（後述）をBgl IIで消化し且つpCGN147からのBa
mH I−Bgl IIプロモータフラグメントを挿入することに
よって、プロモータ領域と選択可能なマーカー（ATG′
２つのKAN）と３′領域とを含むpCGN148aを形成した。
前記フラグメントをpCGN528のBgl II部位にクローニン
グして、bgl II部位がpCGN528のカナマイシン遺伝子の
近くになるようにした。
この構築体pCGN528に使用されるシャトルベクターは下
記の方法で形成した。カナマイシン遺伝子（Jorgenson
他,Mol.Gen.（1979）177:65）を有するTn5を含むプラス
ミドをHind III−BamH Iで消化し、且つカナマイシン遺
伝子を含むHind III−BamH IフラグメントをpACYC184の
テトラサイクリン遺伝子（Chang＆Cohen,J.Bacteriol.
（1978）134,1141〜1156）内Hind III−BamH I部位に挿
入することによってpCGN525を形成した。pTiA6（Thomas
how他,Cell（1980）19:729〜739）のBamH Iフラグメン
ト19をpCGN525のBamH I部位に挿入することによってpCG
N526を形成した。Xho Iでの消化及び再連結によってpCG
N526から小さいXho Iフラグメントを欠失させることに
よりpCGN528を得た。
pMB9KanXXIからのBamH Iカナマイシン遺伝子フラグメン
トをpCGN148aのBamH I部位にクローニングすることによ
ってpCGN149aを形成した。
pMB9KanXXIはXho I部位の無い、但しAgrobacterium内で
の効果的選択が可能であるようにTn903からの機能カナ
マイシン遺伝子を含むpUC4K変種である（Vieira＆Messi
ng,Gene（1982）19:259:268）。
pCGN149aをBgl II及びSph Iで消化した。pCGN149aのこ
のBgl II及びSph I小フラグメントをBamH I及びSph Iで
の消化により分離したM1（後述）のBamH I−Sph Iフラ
グメントにより置換した。その結果pCGN167が得られ
る。これは、全長に及ぶCaMVプロモータと、1ATG−カナ
マイシン遺伝子と、３′末端とバクテリアTn903型カナ
マイシン遺伝子とを含む構築体である。M1はpCGN550か
らのEcoR Iフラグメント（pCGN587の構築参照）であ
り、これをM13mp9のEcoR Iクローニング部位にクローニ
ングして、1ATG−カナマイシン遺伝子のPst I部位がM13
mp9のポリリンカー領域に近くなるようにした。
709（1ATG−３′領域）の構築 pCGN566はpUC13−cm（K.Buckley,Ph.D.論文,UC−San Di
ego,1985年）のEcoR I−Hind III部位に挿入されたpUC1
8（Yanisch−Perron,同上）のEcoR I−Hind IIIリンカ
ーを含む。ORF1及び２（Barker他（1983），同上）を含
むpNW31c−8,29−１（Thomashow他（1980）,Cell 19:72
9）のHind III−Bgl IIフラグメントをpCGN566のHind I
II−Bgl II部位にサブクローニングしてpCGN703を形成
した。
pTiA6（pT115955の塩基2365〜2920に対応する（Baraker
他,1983,同上）からの転写体７の３′領域を含むpCGN70
3のSau3AフラグメントをpUC18（Yanisch−Perron他（19
85），同上）のBamH I部位にサブクローニングしてpCGN
709を形成した。
pCGN766cの構成（35sプロモーター−３′領域） CaMV−35Sプロモーターと、1ATG−カナマイシン遺伝子
と、pTiA6のBamH Iフラグメント19とを含むpCGN167（構
成については後段参照）のHind III−BamH Iフラグメン
トを、pUC19（上記Norrander et al.（1983）；上記Yan
isch−Perron et al.（1985））のBamH I−Hind III部
位にクローニングし、pCGN976を創出した。
pCGN976の0.7kb Hind III−EcoR Iフラグメント（35Sプ
ロモーター）並びにpCGN709の0.5kb EcoR I−Sal Iフラ
グメント（トランスクリプト7:3′、pCGN709の構成につ
いては上段参照）をpCGN566のHind III−Sal I部位に挿
入することによって35Sプロモーター並びにトランスク
リプト７からの３′領域を発生させ、pCGN766cを創出し
た。
最終的なpCGN783の構成 pCGN766cの0.7kb Hind III−EcoR Iフラグメント（CaMV
−35Sプロモーター）とpCGN726cの1.5kb EcoR I−Sal I
フラグメント（１−ATG−KAN−３′領域）とを、pUC119
（J.Vieira,Rutgers University,N.J.）のHind III−Sa
l I部位へと連結して、pCGN778を生成した。
pCGN778の2.2kb領域の、CaMV−35Sプロモーター（１−A
TG−KAN−３′領域）を含むHind III−Sal Iフラグメン
トでpCGN739のHind III−Sal Iポリリンカー領域を置換
して、pCGN783を生成した。
pBrx17をBamH1で消化し、かつ一部Hinc IIで消化して1.
2kbニトリラーゼ遺伝子フラグメントを得た。BamH1−Hi
nc IIフラグメントをBamH1−Sma Iで消化したpCGN566に
挿入して、ニトリラーゼ遺伝子フラグメントを含む3.7k
bプラスミドpBrx25を創出した。
pCGN566は次のように構成した。pUC13（CmR）（Ken Buc
kley博士論文,U.C.,San Diego）をEcoR I及びHind III
で消化し、pUC18及びcpUC19から得たポリリンカーを線
形化したpUC13にそれぞれ挿入して、クロラムフェニコ
ール耐性標識を有するpCGN566を得た。
1.2kbニトラーゼ遺伝子フラグメントを含むプラスミドp
Brx25を、先に述べたように形質転換してE. coliにし
た。プラスミドを通常方法で単離し、かつBamH1及びEco
R Iで消化して、再び1.2kbニトリラーゼ遺伝子フラグメ
ントを得た。BamH1及びEcoR IフラグメントをBamH1及び
EcoR Iで消化したpCGN46に挿入して、ニトリラーゼ遺伝
子フラグメントを含む6.6kbプラスミドpBrx27を創出し
た。
pBrx27を、先に述べたように形質転換してE. coliにし
た。このプラスミドを通常方法で単離し、かつXho Iで
消化して、MASプロモーターと、翻訳された配列中に細
菌の５′位の11塩基対を含むブロムオキシニル遺伝子
と、ocs３′領域とを含む4.1kbフラグメントを得た。4.
1kbフラグメントをSAl Iで消化したpCGN783に挿入し
て、約31kbのプラスミドpBrx29を得た。
ニトリラーゼ発現の検出 プラスミドpBrx28及びpBrx29を形質転換して、Agrobact
erium tumefaciens株K12にした。（Nester,Ann.Rev.Mic
ro.（1981）35:531;Hoekema et al.,Nature（1983）30
3:179）K12（pBrx28）及びK12（pBrx29）を用いて、リ
ュウキュウベンケイ属植物（Kalanchｅ）にえい瘤（g
alls）を形成した（garfinkel,J.Bacteriol.（1980）14
4:732）。
約1gm（新鮮重量）のえい瘤組織を、0.1MのpH7.5トリス
と、10mMのEDTAと、0.15MのNaClと、0.05％のNP−40
と、25mg/mlのBSAと、1mMのDTTと、0.13ug/mlのロイペ
プチンとを含有する緩衝液中の液体窒素中で擦り砕い
た。複数の試料を、ポリビニルピロリドン（Sigma）0.0
5gの添加後に均質化し、次いで４℃で15分間、15,000g
で遠心分離した。精製ニトリラーゼをウサギに注射する
ことによって調製した抗血清25u、並びにS.aureus（C
albiochem）の10％（w/v）懸濁液250uを各上澄みに添
加し、４℃で16時間培養した。次に試料を遠心分離し、
ペレットを20mMのpH7.5トリス、1mMのEDTA、150mMのNaC
l並びに0.05％のNP−40で２回洗浄した。ペレットを、
0.125MのpH6.8トリス、４％のSDS、20％のグリセロール
並びに10％のBMeを含有する全量100u中に再び懸濁さ
せ、90℃で２分間加熱した。試料全体を10％アクリルア
ミドゲルにおいて電気泳動に掛けた（Laemmli,V.K.,Nat
ure 227:680−685（1970））。分解したポリペプチド
を、Burnetteが述べている（Anal.Biochem.112:195−20
3（1981））のようにしてニトロセルロースフィルター
（Schleicher及びSchuell）に移した。その後ニトロセ
ルロースフィルター（Schleicher及びSchuell）をBLOTT
O（Johnson et al.,Gen.Anal.Technol.１,38−42（198
3））において42℃で１〜３時間培養し、続いて抗ニト
リラーゼ血清の1:50溶液を含むBLOTTOにおいて室温で一
晩培養した。フィルターを、20mMのpH7.5トリス並びに1
50mMのaCl中で10分間、0.05％のTween−20を含有する同
上緩衝液中で20分間、及びTween−20を含有しない同上
緩衝液中で更に10分間洗浄した。次に、106cpm/mlの125
I標識蛋白質Ａ（9u Ci/mg;NEN）を含むBLOTTOをフィル
ターに付加して、室温で２時間の培養を行なった。フィ
ルターを、50mMのpH7.5トリス、1MのNaCl並びに0.4％の
サルコシル中で一晩洗浄した。濯いで乾燥した後フィル
ターを、Dupont Cronex増感血清の使用下に−70℃でKod
ak AR X線フィルムに対し露出した。
A.rhizogenesと共培養（co−cultivate）したタバコ葉
片の形質転換及び再生 タバコを、異種物質を交えずに栽培する（25℃、白色光
（16時間）;MS（IAA 1mg/L、キネチン0.15mg/L））。主
新芽移植（main shoot transplant）によって維持した
３週齢の上記植物を、組織提供体として用いる。（頂か
ら４番目までの）若葉を選択し、これらの若葉から直径
2mmの葉ディスクを打ち抜き、打ち抜いたディスクをペ
トリ皿（直径3cm）内の、IAA 1mg/Lを伴ったMS培地1ml
中に置く。ディスクを一晩完全な闇中に保持した後、こ
れらの培養物に、Agrobacterium（A772xpN1あるいはpN
2）の細胞（植物培養基1ml当たり108〜109個）を付加す
る。共培養を、闇中で18〜24時間実施する。ホルモンが
欠如しており、かつcefotaxine（boehringer−Mannhei
m）350mg/Lを含有するMS培地で３回洗浄することによっ
て、葉片からAgrobacteriumを除去する。葉片を9cmペト
リ皿内の、ホルモンを伴わないMS培地10ml中に移す。Ph
ytagar（Gibco 0.6％;cefotaxine 350mg/L）ペトリ皿を
パラフィルム（parafilm）で密閉し、組織提供体植物と
同一条件下に保持する。２〜４週間後までに根が現れ、
この根を切除して、上記と同じ培地にIAA 2mg/L及びキ
ネチン2mg/Lを加えたものの中に上記同一条件下に置
く。更に２〜５週間後に、再生する新芽が目視できる。
６葉段階の植物にブロモキシニル溶液を、ポットに植え
た植物へ向けての噴霧により付与する。植物を１本ずつ
植えられた各４″ポットは、2.5mlの噴霧液を受容す
る。植物を栽培ケース内で、温度25℃、相対湿度70％、
及び光照射期間60時間で成長させる。0.5cmより長い新
葉を計数することによって、噴霧後９日間の成長を記録
する。
上述のような手続きを辿ることによってブロモキシニル
耐性の植物が取得可能であり、この植物はブロモオキシ
ニルが存在する畑に、該植物自体の成長に重大な悪影響
を及ぼさずに適用することができる。
本発明は、植物を除草剤に耐性に、特にベンゾニトリル
除草剤に特異的に耐性にすることによって該植物の改良
をもたらす。即ち、ニトリラーゼに関してコードする遺
伝子を植物ホストに導入し得、その結果上記遺伝子は発
現して、植物にベンゾニトリル耐性を付与する。そのう
え、遺伝子を適当な細菌ホスト中でクローニングし、そ
れによって酵素を発現させることによって酵素を生成し
得る。モニター可能な活性を有する酵素は、様々な分析
対象（analytes）あるいはベンゾニトリル基質について
のアッセイにおいて幅広く用いることができる。また、
酵素並びに酵素を発現する細菌は、ベンゾニトリル除草
剤を汚染環境から除去するのに用いることも可能であ
る。
本明細書では本発明を、明確に理解されるように具体的
な説明及び実施例に即して詳述したが、請求の範囲各項
の範囲内で幾つかの変更及び変形を実施し得ることは明
らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する3,5−ジハロ
    ゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリル特異性ニトリラ
    ーゼ酵素をコードする読取り枠を有し、その５′末端に
    野生型転写開始領域以外の転写調節領域を有するDNA配
    列。
  2. 【請求項２】3,5−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベン
    ゾニトリル特異性ニトリラーゼ酵素が、ブロモキシニル
    及び／又はイオキシニル特異性細菌ニトリラーゼである
    請求の範囲第１項に記載のDNA配列。
  3. 【請求項３】転写調節領域が植物内で機能する請求の範
    囲第１項又は第２項に記載のDNA配列。
  4. 【請求項４】転写調節領域が細菌内で機能する請求の範
    囲第１項又は第２項に記載のDNA配列。
  5. 【請求項５】植物細胞内で機能する調節領域の転写及び
    翻訳調節下にあって、下記のアミノ酸配列を有するブロ
    モキシニル及び／又はイオキシニル特異性ニトリラーゼ
    をコードする構造遺伝子を有する発現カセット。
  6. 【請求項６】カセットが少なくとも１つのＴ−DNA端を
    有する請求の範囲第５項に記載の発現カセット。
  7. 【請求項７】転写開始領域がオピンをコードする遺伝子
    由来である請求の範囲第５項又は第６項に記載の発現カ
    セット。
  8. 【請求項８】植物細胞内で機能する調節領域の転写及び
    翻訳調節下にあって下記のアミノ酸配列を有するブロモ
    キシニル及び／又はイオキシニル特異性ニトリラーゼを
    コードする構造遺伝子を有する発現カセットを有し、大
    腸菌及びアグロバクテリウム・ツメフアシエンスのうち
    少なくとも一方で複製可能なプラスミド。
  9. 【請求項９】発現カセットが少なくとも１つのＴ−DNA
    端を有する請求の範囲第８項に記載のプラスミド。
  10. 【請求項１０】下記のアミノ酸配列を有する3,5−ジハ
    ロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリル特異性ニトリ
    ラーゼを発現する外来遺伝子を有する細菌宿主。
  11. 【請求項１１】細菌宿主が大腸菌である請求の範囲第10
    項に記載の細菌宿主。
  12. 【請求項１２】植物細胞内で機能する調節機能の転写及
    び翻訳調節下にあって下記のアミノ酸配列を有するブロ
    モキシニル及び／又はイオキシニル特異性ニトリラーゼ
    をコードする構造遺伝子を有する発現カセットを含有す
    る植物細胞。
  13. 【請求項１３】カセットが少なくとも１つのＴ−DNA端
    を有する請求の範囲第12項に記載の植物細胞。
  14. 【請求項１４】転写開始領域がオピンをコードする遺伝
    子由来である請求の範囲第12項又は第13項に記載の植物
    細胞。
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