JPS62201578A - ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 微生物および高等生物の細胞に対し新規な遺伝的能力を
付与する機会は、新たな可能性に対するｌＩ広い道を開
いている。その１つには、それらの細胞毒性作用故に利
用される各種の薬剤に関するものがある。たとえば、農
業で使用される多くの化合物が害虫、雑草などの死滅に
向けられている。

多くの場合、これらの化合物は比較的長い滞留時間を有
し、長期の残留を示す。

多くの場合、保持すべき種類と死滅させるべきａＩ類と
を区別することが望ましい。たとえば、雑草を選択的に
死滅させる一方、作物に対する悪影対し顕著な悪影＃を
及ぼし、したがってその使用は主として発芽前の使用或
いは慎重な発芽後の使用に制限される。

したがって、たとえば細胞毒性剤のようなストレスに対
し耐性にすべく生存細胞を改変させうることに大きな興
味がある。

〔従来の技術〕

米国特許第４，５３５，０６０号明細書は、グリホセー
）　（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ　）感受性細胞に対しグリ
ホセート第２２巻（１９７６）、”第５３７−５４３頁
の論文は、よる論文、Ｄｉｓｓｅｒｔ、　Ａｂｓｔｒ、
　工ｎｔｒｎ０、第８３６巻（１９７６）、第８号、第
３７０８頁は３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベン
ゾニトリルの１群のイエンス、第５巻（１９７４）、第
２８７〜２９１頁は６０〜６２頁は３．５−ジハロゲノ
−４−ヒドロキシベンゾニトリルおよび土壌微生物につ
き報告している。

〔発明の要点〕

ニトリラーゼ、これらニトリラーゼをコードする核酸配
列、ニトリラーゼ遺伝子が外来性である所望の宿主によ
シ認識される調節遺伝子の転写および翻訳調節制御下で
これらのニトリラーゼをコードする遺伝子金言有した構
成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　）、これら構成物を含有
する宿主細胞、並びにこれら構成物を含有する生物およ
び生物部分もしくは生成物が本発明によって提供される
。ブロモキシニル−および／またはイオキシニルＣ；特
異餘ωニトリラーゼは、ブロモキシニルおよび関連の除
草剤を性作用から宿主細胞を保護するための用途を有す
る。構成物は、この構成物を含有する宿主細胞とこの構
成物を含有しない宿主細胞とを区別する用途をも有する
。

〔特定実施例の説明〕

本発明によれば、ハロゲン化されたヒドロキシベンゾニ
トリル類、特に３．５−ジプロモーモＬトリルの除草活
性を解毒すると共にこの除草剤に対し感受性の細胞もし
くは宿主に保ｉｆｉを与え、或いはこの除草剤で汚染さ
れた環境を解毒することができる酵素の産生に関するも
のである。

問題とする構造遺伝子は、窒素源としてベンゾニトリル
を使用しうる、一般に唯一の窒素源としてベンゾニトリ
ルを使用しうることか示されている単細胞微生物、特に
細菌から得ることができる。

以下ベンゾニトリルもしくはニトリラーゼに関し、ベン
ゾニトリルはハロゲンイド−ヒドロキシベンゾニトリル
、特に３，５−シイオド−もしくは３゜５−ジブロモ−
４−ヒドロキシベンゾニトリルであることを意味し、か
つニトリラーゼは窒素源として、特に唯一の窒素源とし
てこの種のハロゲン化ベンゾニトリルを使用しうるニト
リラーぜであキシニルを含有する環境に天然に存在する
細ｌＳ！ｉ類腸内細菌、よシ詳細にはクレブシェラ（Ｋ
ｌｅｂｓｌｅｌｌａ　）の種糸に興味がある。クレブシ
ェラ・ニューモニアきる。土壌から分離することなく生
物を、土壌中またはその他の培地にてベンゾニトリルの
濃度を順次に増大させかつ代替窒素源の量を減少させな
がら唯一の窒素源としてベンゾニトリルを使用すること
によシ生存する生物が得られるまで増殖させることがで
きる。

ニトリラーゼを含有する細菌源にかかわりなく、スクリ
ーニングを行なってニトリラーゼがベンゾニトリルの解
毒に有効であるよう確保せねばならジニトリルに対し特
異的でなければならない。本発明のニトリラーゼはした
がって特定のベンゾニトリルに対し特異的であり、かつ
同族体に対し和↓し 動的不活性であり或いは同族体に対し実質的に活性が低
い。望ましくは、顕著な増殖速度の低下があってはなら
ず、すなわち通常の窒素源（たとえばアンモニア）の存
在下で、匹敵する濃度の窒素源としてのベンゾニトリル
に対比し、約１０チ未満の細菌増殖の低下とすべきであ
る。このような結果は、非特定のベンゾニトリルでは観
察されない。

１種もしくはそれ以上の宿主菌株を同定した後、ニトリ
ラーゼにつきコード配列を同定する技術を用いることが
できる。遺伝子は染色体もしくはプラスミドに存在する
ことができる。ゲノムは特に制限エンドヌクレアーゼを
用いて断片化することができ、この場合１種もしくは複
数のエンドヌクレアーゼを用いて約５　ｋｂ〜５０ｋｂ
の範囲の断片を形成することができる。これらの断片を
便利な細＃１（たとえば大Ｐ＆菌（ｇ、　ｃｏＬＬ　）
　）認硫を適当なベクターでクローン化させることがで
き、かつ得られた形質転換体をニトリラーゼ活性につき
スクリーニングすることができ、この場合宿主生物は陰
性のパックグランドを与えるものとする。

１種もしくはそれ以上のクローンがニトリラーゼ活性を
有すると同定された後、所望されたＤＮＡ断片を含有す
る染色体外要素、即ち、プラスミドまたはウィルスをた
とえば宿主の溶、菌、ＤＮＡの沈澱、並び〈染色体ＤＮ
Ａからのベクター１）ＮＡ、プラスミＰもしくはウィル
スＤＮＡの分離など慣用技術によって分離することがで
きる。次いで、該染色体外要素をエンドヌクレアーゼ制
限によって切断し、かつ所望の断片を種々異なる大きさ
の断片を分離しかつ同定するための種々の技術、たとえ
ば電気泳動、密度勾配遠心分離などによって分離するこ
とができる。

断片の大きさに応じて、一般にその大きさを遺伝子およ
びその横に位置する（　ｆ　ｌａｎｋｉｎｇ　）　調節
領域の大きさく一層近似する大きさまで減寸させるべく
処理する。酵素をコードする配列およびその横に位置す
る調節整殉配列を含む断片を処理するための各種の技術
が存在する。種々異なる反応混合物における種々異なる
制限酵素による部分切断を用いることができ、次いでこ
れら断片上クローン化することによシどの断片がニトリ
ラーゼを発現する能力電画かを決定することができる。

或いは、酵素を分離しかつ部分配列決定すると有する断
片を同定することもできる。この手法を制限酵素切断と
組合せることにより、断片をクローン化しかつ所望の遺
伝子の存在につきスクリーニングすることができる。さ
らに、たとえばＢａｔ３１のようなエキソヌクレアーゼ
を使用して断片の１端部または両端からヌクレオチドを
除去し、さらに余分なヌクレオチドの個数を減少させる
こともできる。

或いは、遺伝子を過当な宿主にクローン化させかつメツ
センジャーＲ，ＮＡをプローブでのスクリーニングによ
シ或いは適当なインビトロもしくはインビボの翻訳系（
たとえばアフリカ産蛙の卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓｏｏ
ｃｙｔｅｓ　）または堤状赤血球分解物など）での同定
によって分離することができる。次いで、この分離した
メツセンジャーを用いて、逆転写酵素およびＤＮＡポリ
メラーゼでの相補的連鎖の形成を含む慣用技術によｐｃ
ＤＮＡを作成することができる。この場合、得られる構
造遺伝子は、転写に関連する調節領域を欠如する。

ニトリラーゼを発現する構造遺伝子を含んだＤＮＡ配列
を広範な種類の他されたＤＮＡ配列と結合して、適当な
宿主細胞中へ導入することができる。相手方の配列は宿
主の性質、宿主中へされたＤＮＡ配列の導入方法、およ
びエビソームの維持もしくは組込戸が望ましいかどうか
に依存する。

原核細胞宿主については形質転換、接合（ｃｏｎｊｕｇ
ａ−ｔｉｏｎ）％形質導入もしくはトランスフェクショ
ンによｊ９ＤＮＡ配列を原核細胞宿主中へ導入するため
に使用しうる多くの種類のベクターが存在する。

ＤＮＡ配列は多くの種類のプラスミド、たとえばｐＢＲ
，３２２，ｐＡＣＹＣ１８４，Ｉ）ＭＢ９．　ｐＨ，に
２９０など；コスミド、たとえばｐＶＫｌｏｏ　；また
はウィルス、たとえばＰ２２などを包含する。

真核細胞宿主については多くの種類の技術を用いて宿主
中へされたＤＮＡ４人を行なうことができ、たとえば非
複製ＤＮＡ配列、プラスミドもしくはミニクロモソーム
を包含するＣａ″−沈澱ＤＮＡによる形質転換、アゲロ
バクチリム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）における
Ｔ−ＤＮＡ含有配列による形質転換、マイクロピペット
による微量注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　）、
ｍｐｅｔｅｎｔ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅ
ｍ）が存在するかどうかに応じて、ＤＮＡがエピソーム
要素として複製されるか、或いはＤＮＡが宿主ゲノム中
に組込まれて構造遺伝子が宿主中で発現されうるかどう
かを決ばＴｔもしくはＲ，ｉ）またはその断片或いはウ
ィルス（たとえばＣａＭＶ、　ＴＭＶ　）またはその断
片のように宿主に対し到死的でないエピソーム要素を使
用することができ、この場合構造遺伝子はこの構造遺伝
子の発現を可能にするようにこの種のエピソーム要素中
に存在する。複製機能を有し、かつたとえば腫瘍形成、
溶菌（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　）力などの他の機能を持た
ない断片に特に興味がある。

ニトリラーゼ源から得られた断片を、適当なりローン化
ベクターを用いてクローン化することが望ましくは、部
分もしくは完全な切断がほぼ所望の大きさを有する断片
を形成するようなコスミドを使用することができる。た
とえば、コスミドｐＶＫ１００は、適当な制限酵素によ
多部分切断しかつプラスミド、染色体またはその断片の
部分切断もしくは完全切断から得られた断片に結合させ
る燐シ 宿主生物は、ベンゾニトリル耐性にう◆選択することか
できる。形質導入体の選択を可能にする適当な遺伝子特
性を与えるべく、受容体菌株を改質することができる。

微生物の場合、形質導入体を用いて他の微生物に接合さ
せることができ、その際必要に応じ移動性（ｍｏｂｉｌ
ｉｚｉｎｇ）シラスミドを使用する。種々の技術を用い
て、さらクニトリラーゼ用の構造遺伝子を含有する断片
の大きさを減寸することもできる。たとえばコスミドベ
クターを分離し、各種の制限エンドヌクレアーゼ（たと
えばＥｃｏＲｌ、　川ＩＩＬ　８ｍａＩなど）によって
切断し、かつ得られた断片を適当なベクター、便利には
ｔｍ使用したコスミドベクターＴ′クローン化させるこ
とができる。コスミドベクターの代シに、たとえばｐＡ
ｃＹｃ１１７およびｐＡＣＹＣ１８４のような各種の小
さいり・占ヒゲベクターを使用することができる。たと
えば、好ましくは約５ｋｂ未満、一般に約４ｋｂ未満、
よシ好ましくは約２ｋｂ未溝の断片をクローン化させ、
かつベンゾニトリル耐性を与えることができる。

望ましくは、断片は約１ｋｂかつ約５ｋｂ未満、好まし
くは約４ｋｂ未満、特に少なくとも約１（１４）７　ｂ
ｐ。

特に少なくとも約１１００ｂＰの横に位置する領域を含
み、好ましくは約１．５　ｋｂ未満である。クレブシェ
ラ・オザエナからの旦（Ｑ　ＩＩ　−８ｍａ　Ｉ断片、
特に約１２１０　ｂｐのＰｓｔ　ｌ−毘匹■断片Ｋ特に
興味がある。

ニトリラーゼ酵素は、任意の便利な原核もしくは真核細
胞原料、たとえば細菌、酵母、糸状菌類、とができる。

有用な方毅謎クロマトグラフィー、基（たとえばカルボ
キシル基）を介し不溶性支持体に結合させて、これをニ
トリラーゼを分離するための充填剤として使用すること
ができる。

ニトリラーゼ比活性は、ハーバ−（Ｈａｒｐｅｒ　）　
Ｉｃ第６８５−６９２頁に記載されたような条件下で少
なくとも約０．１μモルアンモニア（ＮＨ３）　／　ｍ
ｉｎ　／キ蛋白、一般に少なくとも約０．５もしくはそ
れ以上できる。これはブロモキシニル、イオキシニルマ
タはその他の関連するベンゾニトリルにつき分析する際
に直接使用することができる。或いは、この酵素は、興
味ある分析物（たとえばハプテンもしくは抗原）に対し
或いは抗体に対し結合させることによシ、診断分析にお
ける標識として使用することもでき、この種の分析につ
いては米国特許第３．６５４，０９０号、第３，８１７
，８３７号および第３，８５０，７５２号明細書に記載
されている。結合方法並びに分析物の濃度測定は上記特
許明細書に極めて詳細に記載されており、その開示の適
切な部分を参考のためここに引用する。

ニトリラーゼをコードするＤＮＡ配列は各種の方法に使
用することができる。こされたＤＮＡ配列は野性型また
は突然変異したニトリラーゼを分離するためのプローブ
として使用することができる。或いは、こされたＤＮＡ
配列は、宿主中へ１組換えにょシ組込んで、この宿主に
対しベンゾニトリル耐性を付与するために使用すること
もできる。

植物細胞を用い、その構成の１部としての構造遺伝子を
、宿主２ツム中への組換えにょシ組込むためにマイクロ
ピペット注入によって植物細胞核四へ導入することがで
きる。或いは、エレクトロポレーションを用いて構造遺
伝子を導プ＝；、植物宿主中へ導入することもできる。

構造遺伝子が植物宿主によって認識されないような調節
信号を有する原料から得られた場合には、適当な調節信
号を導入して発現させる必要がある。ウィルスまたはプ
ラスミド、たとえば腫瘍誘発性ブラスミＰを用いかつこ
れが制限酵素地図化されている場合には、プ・モー４ら
下流に位置する制限部位を遠距離で挿入することができ
る。ＤＮＡ配列Ｅ適当轟ｉも。

な例限部位　　　　　　場合には、たとえばＢａｔ３１
のようなエキソヌクレアーゼによって糧々の時間にわた
り切断して、合成制限二ンｒヌクレアーゼ部位（リンカ
−）を挿入することもできる。

腫瘍訪発性プラスミド（たとえばＴｉもしくはａｉ）を
使用することに特に興味があシ、この場合ニトリラーゼ
遺伝子は植物細胞の染色体中に組込まれる。Ｔｉ−プラ
スミドおよびＲ１−プラスミドの使用に関する説明ハ、
ＰＣＴ　出ｌｌ第ＷＯ３４１０２９１３兄、第０２９１
９号および第０２９２０今冬明細書並びにＥＰＯ出願第
０１１６７１８号明細書並びにマツグ（Ｍａｔｚｋｅ　
）およびチルトｙ　（ｃｈｉｌｔｏｎ）、Ｊ　０Ｍｏｌ
　、　Ａｐｐ。

Ｑｅｎｅｔｉｃｓ　、　Ｗ、１巻（１９８１）、第３９
−４９頁に見を植物宿主によシ認識される開始および糾
粍用の転写および翻訳調節信号の下に整列させる（ｆｌ
ａｎｋ）ような、Ｔ−ＤＮＡ右側端または両端を用いる
ことによシ、発現カセットを植物ゲノム中に組込んで、
種々の分化段階における植物細胞にてニトリラーゼ酵素
を発現させることができる。

植物細胞中で発現させるための種々の構成物を作成する
ことができる。これら構成物は、植物宿転写を行なうに
は、構成的または誘導性のいずれかの各種の転写開始領
域（プロモーＮ域）を用いることができる。

転写開始領域は、ニトリラーゼをコードする構成を与え
、ここで未翻訳５′−領域はＡＴＧを欠失している。

構造遺伝子の３′−末端は１個もしくはそれ以上の停止
コドンを有して、これらを植物宿主で機能する転写＃蔭
領域に結合させ、この１Ｍ領域は開始領域と同じまたは
異なる構造遺伝子に連携することができる。

発現カセットは、転写の方向に開始領域と開始縛させか
つ必要に応じメツセンジャＲ，ＮＡ９る１１１１ｍ領域
とを有することを特徴とする。

転写および翻訳調節領域としては、ニトリラーゼ遺伝子
の構成的発現を可能くするよりなｏｐｉｎｅブ・モール
よＪ↓％使用するのが便利であ、。或いゆ、他。プ。！
−／’＃よび／、蛯。

−ミネーに特に植物宿主における誘導性発現もしくは調
節発現を可能にするプ・モーＸ使用することができる。

Ｔｉ−プラスミドからの使用しうるプ。−ｉ−，５楡域
ゆ、。ｐｉｎｅプ７．−にたとえばオクトピンシンター
ゼプロモーにツノ耐リンシンターゼプロモーデアグロピ
ンシンターゼプロモーｔマノピンシンターゼプロモーへ
どを包含する。他のプ・モー足、ウィルス性プ・モーＲ
たとえばＣａＭＶ領域■プロモーテ喀たは全長（３５−
トカルボキシレート遺伝子、たとえ官スブー＝ット単位
、７アセオリン（すなわち蛋白貯蔵）、β−コングリシ
ニン（セルロース生成）　す（！ｌ”に関連する遺伝子
に関連するプロモーｉ￥包含する。

種々の配列を常法によって互いに結合することができる
。プ・モー６域は、構造遺伝子（たとえばｏｐｉｎｅ遺
伝子）から５′である領域によって同定することができ
、かつ制限地図化および配列決定によって選択しかつ分
離することができる。同様、１．−オネーテ櫨域を構造
遺伝子７１．。３・。

域として分離することができる。これらの配列を適切な
方向性を持ってクローン化させかつ結合させて、植物宿
主でニトリラーゼ遺伝子の構成的発現を行なうことがで
きる。

ニトリラーゼ酵素を発現する機能的遺伝子を導入して作
物植物細胞を改変することにより、ブロモキシニル、イ
オΦシェルまたは類似の除草剤を広範な種類の作物につ
き雑草の完全なまたはほぼ害を与えないような濃度で使
用することができる。

このようにして、肥料および水をよシ効率的に利ニトリ
ラーゼ酵奏を発現する発現カセットはトヒマワリ、甜菜
、芝生などを含む単子葉および双子葉の両者を含む広範
な種類の植物に導入することができる。遺伝子はカルス
、組織、根部、塊茎、胎芽、小植物、種子、葉、苗、花
粉などを包含する細胞または植物部分に存在させること
ができる。

ベンゾニトリル耐性の植物を供給することによ広範な種
類の組成物を用いることができる。たとえば、プロそキ
シニル自身を、たとえばヒマワリ、大豆、トウモロコシ
、綿などの無毒化作物につき雑草の発芽後抑制に使用す
ることができ、或いは他の物質との組合せ組成物として
使用することもできる。

通常の量の殺虫剤を約０．１〜４ノｂ　７ｇ　＋＋、好
マシくは０．２〜２ノｂ７よ〜−のブロモキシニルを供
給する組成物として圃場に施こし、その他の除草剤を約
０．１〜４　ｔｂ　／　ｘ’ψ［の活性成分を供給する
量で施こす。組成物はたとえば洗剤、アジュノセント、
展延剤、粘着剤、安定化剤などの他の添加物をも含む。

これら組成物は流動性粉末、乳化性濃厚物および液体濃
厚物を含め当業界で知られた湿式もしくは乾式組成物の
いずれとすることもできる。

除草溶液は常法にしたがって、たとえば噴霧、潅潰、散
布などによって施こすことができる。

〔実施例〕

以下、実施例によシ本発明をさらに説明するが、これら
のみに限定されない。

実　　験 材料および方法 制限酵素および１話用のＴ４リガーゼは、製造業者の推
奨にしたがって用いた。クローン化および分子分析の標
準法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、　Ｃｏｌｄ８ｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
にしたがって行なった。クローン分析はＩｓｈ　−Ｈｏ
ｒｏｗｉｔｘ等によ、！７　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、第９巻（１９８１）、第２９８９−２９９８頁に
記載されたように行なった。

全てのクローン化実験には大腸菌の菌株ＭＭ２９４を用
いた［　Ｈａｎａｈａｎ　、　Ｍｏｌ　、　Ｂ　ｉｏｌ
、第１６６巻（１９８亀第５５７〜５８０頁］。

使用する場合、抗生物質の量は次の通シとした二〇ｍ（
クロラム７”　ニコ−”　）　２５　ｔｔｆ　／　ｄ　
；　Ｔｃ　（テトラサイクリン）１０μｒ／ｉ；Ａｐ（
−ｅニジリン）３００μｔ／ゴ。

大腸菌におけるプラスミドＤＮＡの形質転換は、Ｍａｎ
ｄｅｌおよびＨｌｇａ、　Ｊ　、　Ｍｏｌ　、　Ｂｉｏ
１％第５３巻（１９７０）、第１５９−１６２頁にした
がって行なっ離動を分離しかクスクリーニングした。こ
の種の一生物はクレブシェラ・ニューモニアの一１ｊｌ
ｓｗｔオザエナとして同定された。上記生物からのブロ
モキシニル特異勿ニトリラーゼの部分精製および特性化
は、見掛は分子量３４ｋＤａノを有する活性酵素を与え
た。

（３，５ｆ　）−とＭｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，Ｏ（０，１
？　）と酵母抽出の液体培地（ＢａｒｎｅｔｔおよびＩ
ｎｇｒａｈａｍに鼾１ｈＡｐｐｌ　、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏ１％第１８巻（１９７５）、第１３１−１４３頁に記
載されている〕にて増殖させた。この培地を以下ＹＥＴ
ｇマルチ炭素培地と呼ぶ。このＹＥＴＥマルチ炭素培地
は０．０５−のブロモキシニルを含有した。この生物は
ブロモキシニルを唯一の（至）し ニーを選択し、かつ１０−のＬ−プ昧で増殖させた。３
橿の１固々のに、オザエナコロニーをもｌブロモキシニ
ルを含有するＬＢプレートから選択し、かつ同じ条件下
で増殖させた。これら同じ４種のに、オザエナコロニー
を同時に、Ｏ，ＯＳ＊のブロモキシニルが補充された１
０１ｎｔのＬ−ブイヨンで増殖させた。培養物を３ＣＩ
’にて充分な密度まで増殖させ、かつプラスミドＤＮＡ
の微量調製物を各培養物からＩ　ｓｈ　−Ｈｏｒｏｗｉ
　ｔｚ等の方法（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ几ｅ３、第９巻（１９８１）　；第２９８９
頁〕によって作成した。未切断のプラスミＩ−”ＤＮＡ
を０．５１アガロースゲルで透気泳動にかけ、かつプラ
スミドのバンドを臭化エチジウム染色によって可視化さ
せた。

準シ のプ、ラスミド種類（寸法６８　Ｋｂ　）を示した。３
種のに、オザエナコロニーは、０．０５１のブロモキシ
ニルの存在下で増殖させた際大きいプラスミド種ａＱ９
０Ｋｂ）を示した。ブロモキシニルの不存在礪シ 下において、プラスミドの両形態が３種のに、オ撲する
と同時に約２２　ＫｂのプラスミドＤＮＡを喪失するこ
とを示している。

４種のコロニー全てをｏ、ｏｓｓのプロモキシニ０．０
５　ＭのＫＰＯ４（ｐＨ７，５）ヒ２．５ｍＭのジチオ
スレイがトール（ＤＴＴ）とを含有する緩衝液に対して
透析し、かつ個々の粗製抽出物をプロモキシェザエナの
粗製抽出物はそれぞれ０．１２４．０．１０５係のグル
コースと０．（１４）９にのブロモキシニルとを含有す
るＭ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ　（１９７２）、Ｅｘｐｅｒ
ｉｒｒｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　８ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　）にて対数増殖中期まで３０Ｃ
で増殖させた。粗製抽出物を菌体破壊、雇遠心分離並び
に０．０５ＭのＫＰＯ４（ｐＨ７，５）と２．６ｍＭ０
ＤＴＴとを含有する緩衝液に対げる上澄液の透析によっ
て舖敷した。基質一度は全ての分析において３ｍＭのブ
ロモキシニルとした。ＮＨ，の放出は）ｔａｐｅｒＢｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、　＠　１６７巻（１９７７）、　
ｇ６ｓｓ　〜の獲得した不透過性をもたらす。しかしな
がら、この生物は、ブロモキシニルを唯一の窒素源とし
て利用するかき暢虐→所定の培地で増殖することができ
ない。

要約して、Ｋ、オザエナのニトリラーゼＩさコーＰされ
たプラスミドであると思われる。この酵素をコードする
遺伝子は、ブロモキシニル選択の不存在下でに、オザエ
ナプラスミドから自然に喪失されｒ：：２２Ｋｂプラス
ミドＤＮＡ断片に存在すると思われる。

Ｏ，ＯＳ＊のブロモキシニル選択下で増殖させたに、オ
ザエナからのプラスミドＤＮＡ　８１１１製し、かつこ
されたＤＮＡを大腸菌の菌株ＭＭ２９４　　（ｔｈｉ　
。

ヱ■Ａ９６．ｅｎｄＩ−、ｈｓｄＲ１７）Ｋ形質転換さ
せた。形質転換体を窒素欠乏（Ｎ″″）の固体アガｏ　
−ス最小培地（１１当りＫＨｚＰＯａ　（１，５？　）
　、　Ｋ冨ＨＰＯ４（３，５ｆ　）　、Ｍｇ５Ｏａ・７
ＨｚＯ（０，１？　）および０．１％グルコースを含有
する）にてＯ，ＯＳ−のプ四モ六シキルを唯一の窒素源
として添加するととくより選択した。５日間の培養後、
１０種のコロニーが選択プレート上に出現した。これら
のコロニーを０．０５％のプロそキシニルを含有するＬ
−寒天プレートに再塗沫し、かつＭＭ２９４におけるチ
アミン栄養要求性マーカーの存在につき試験した。

これらのコロニーはいずれもチアミンの不存在下では最
小培地で増殖せず、この菌株が大腸菌ＭＭ２９４である
ことを示した。全コロニーは、チアミンと唯一の窒素源
としての０．０５％ブロモキシニルとを補充したＭ９培
地で増殖することができを選択してさらに分析した。９
０Ｋｂのプラスミドを含有する大腸菌ＭＭ２９４の粗製
抽出物をブの比活性が得られた。よシ小さいプラスミド
種類を含有する大腸菌ＭＭ２９４は検出可能なニトリラ
ーゼ活性を示さなかった。大腸菌における大きい方の９
０ＫｂプラスミドをｐＢｒｘｌと命名し、小さい方のプ
ラスミド（６８Ｋｂ）をｐＢｒｘ　１Δと命名した。

プラスミドｐＢｒｘｌを含有する大腸菌の菌株ＭＭ２９
４がブロモキシニル特異的なニトリ２−ゼ反応の結果と
して適切な代謝物を生成することを確認するため、２−
のＭＭ２９４　（ｐＢｒｘ　１　）の培養物をＯ，ＯＳ
＊のブロモキシニルが補充されたＭ９培地にて３０℃で
２４時間増殖させた。培養物の炉液試料をＣ，、ＨＰＬ
Ｃカラムでクロマトグラ鬼かけた。培養物Ｆ液中の添加
ブロモキシニルは全て新たな代謝物ピークに変換された
。この代謝物−一りの正体は、スペクトル分析によｐ３
１５１−ジブロモ−４−ヒドロキシ安息香酸（ＤＢＨＢ
）であると決定された。したがって、大腸菌にてニトリ
ラーゼ発現をコードしたブロモキシニル特異的プラスミ
ドの生成物は、Ｋ、オザエナにつき観察されたものと同
一である。

定するため、プラスミドｐＢｒｘ１をＢａｍＨＩで切断
してそれぞれ５３Ｋｂおよび３７　Ｋｂの２種のバンド
を得た。ＢａｍＨＩ断片を大腸菌シラスミドベクターｐ
ＡＣＹＣ１８４（ＣｈａｎおよびＣｏｈｅｎ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋第１３４巻（１９７Ｂ）
、第１１４１頁〕のＢａｍＨＩ部位に蓮魅させ、かつ大
腸菌の菌株ＭＭ２９４　Ｋ形質転換させた。ｐＡＣＹＣ
１８４のＢａｍＨＩ部位にり四−ｙ化すると、テトラサ
イクリン耐性の遺伝子の挿入失活をもたらす。１０種の
クロラムフェニコール耐性かつテトラサイクリン感受性
のＭＭ２９４　コロニーを選択し、クローン草 分析用ＤＮＡの微量調製物を作成し、かつＤＮＡｔｒＢ
ａｍ　ＨＩで切断した。４種のクローンは３７ＫｂのＢ
ａｍＨＩ断片を含有したのに対し、１種のコロニーはｐ
Ｂｒｘ　１／の大きい方の５３　Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩＤ
ＮＡ断片を保持した。５種のクローンはシラスミドｐＢ
ｒｘ　１Δにも見られるクローン化ＢａｍＨＩ断片を含
有し、これはｐＢｒｘｌかものシラスミＰＤＮＡの２２
Ｋｂが自然欠失した後に残存するＤＮＡ断片に対応する
。１０種のクローンを全て２０μｆ　／ｄのクロラムフ
ェニコールの存在下で２００−のＬ−ブイヨンで増殖さ
せ（プラスミドを選択するため）て粗製抽出物を得、か
つこれをブロモキシニル特異的ｔニトリラーゼ活性につ
き分析した。３７　Ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を含有する４
種のクローンは０．１４０μモル放出ＮＨＩ／ｍｉｎ／
ｆｆ１ｙ蛋白の範囲のニトリラーゼ特異活性を示したの
に対し、他の６１１のり四−ンでは検出しうるニトリラ
ーゼ活性が観察されなかった。このデータは、ブロモキ
シニル特異的、クートリ２−ゼ活性をコードする遺伝子
がシラスミドｐＢｒｘ　１からクローン化した３　７Ｋ
ｂ　　ＢａｍＨＩ断片に位置することを示し、さらにブ
ロモキシニル選択の不存在下で自然に喪失した２２Ｋｂ
ＤＮＡ断片が３７Ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片の内部に存在す
ることを示している。

ベクター　ｐＡＣＸｏ　１８４に対するＢａｍＨＩ断片
の方向性を確認するため、上記４種のクローンからされ
たＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断しかつ０．０７９１アガロ
ースゲルで電気泳動にかけた。シラスミドｐＢｒｘ　１
とｐＢｒｘｌΔとの組合せＥｃｏＲＩ切断物についても
分析した。

ベクター　ｐＡＣＹＣ１８４Ｋ対する３　７　Ｋｂ　Ｂ
ａｍＨτ断片の両方向性を決定し、それぞれプラスミド
ｐＢｒｘ２およびｐＢｒｘ３と命名した。さらに３種の
＆ｏＲＩ断片が、プラスミドｐＢｒｘ　２およびｐＢｒ
ｘ　３から自然欠失ｔｉ、：６２２　ＫｂされたＤＮＡ
断片の内部に存在することが観察された。これらＥｃｏ
ＲＩ断片の寸法はそれぞれ１８Ｋｂ　、３Ｋｂ　および
１．９Ｋｂであった。プロモキγニル特異的ニトリラー
ゼをコドする遺伝子は、ニトリラーゼ構造遺伝子がＥｃ
ｏ　ＩｔＩ制限部位によって二分されなければ、これら
３種のＥｃｏ　ＲＩ断片の１つに存在する筈である。

大８１１１　（ｐＢｒｘ　３　）ブロモキシニル特異的
ニトリラーゼの位置につき検査した。その結果は次の通
りであった。

第　　　１　　　表 イ３ン リゾチーム処理細胞（Ｌ−プｗ−＃）　　　　　０．７
９６全　　細　　胞　（Ｌ−ブ擾禰）　　　　　０．７
７０イタン 全細胞（Ｌ−プ←＋　Ｂｒｘ　１　）　　　　　１　、
２５全　　細　　胞　（Ｍ９　）　　　　　　　　０．
９５０全細胞（Ｍ９　＋　Ｂｒｘｌ）　　　１．４５全
細胞／　ｐＡＣＹＣ１８４（Ｍ９　）　　　　　Ｏａニ
ブラスミド　ｐＢｒｘ　３を含有する大腸菌（ＭＭ　２
９４　）細胞を、上記培地中で３７℃にて５ｍの培養物
として定常期まで増殖させた。培養物は上記の場合２０
ｐｆ／−のクロラムフェニコールと０．（１４）％のブ
ロモキシニル（Ｂｒｘｌ）とを含有した。

各培養物からＩＭｔを集め、ニトリラーゼ緩衝液（０，
１ＭのＫＰＯ，、ｐＨ７，５）で１回洗浄し、かつ菌体
をこの同じ緩衝液０．１ｍＫ再懸濁させた。ｓ　ｏ　ｐ
ｔの試料を、Ｈａｒｐｅｒ＋　Ｂｉｏｃｈａｎ、　Ｊ、
第１６７巻（１９７７）、第６８５−６９２頁にしたが
い基質として３ｍＭのブロモキシニルを用いまたは用い
ずにニトリ２−ゼ活性につき分析した。

察は酵素が培地中のブロモキシニルの不存在下に発現さ
れることであり、これはブロモキシニルの誘専が酵素発
現には必要とされないことを示唆している。

ブロモキシニル　異的ニトリラーゼの精製に、オザエナ
のニトリラーゼの精製をさらに行なって次の結果を得た
： 第２表 （出発物質６ｆの菌体） 粗製ａ１００　ｍｌ　　２１０　ｍｇ　　　１８．１５
　　　０．０８６セ７アデツクス　５６　　ｍｌ　　　
　１９Ｔｎｇ　　　　　１５．５２　　　　　　０．８
２０ａ：Ｉｉ体は０．（１４）％のブロモキシニルとグ
ルコーストラ含０．０５ＭのＫＰＯ４（ｐＨ７，５）お
よび２．５ｍＭの旙〜Ｌ ＤＴＴを含有する緩衝液に対する透析によって作成した
。基質濃度は全ニトリラーゼ分析において３ｍＭとした
。

ｂ：μモルＮＨｓ　／　ｍｉ　ｎ／ｆｒｑＩ。

２．５ａＩＬ”Ｘ　１０ＣＩＩのカラムを０．０５Ｍ　
　ＫＰＯ４ｐＨ７，５と２．５　ｍＭ　ＤＴＴと１　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　　とを含有する緩衝液で平衡化させた。

この試料をカラムに加えかつこのカラムを上記カラム緩
衝液における０、０２Ｍ−０，４０Ｍの直線濃度勾配の
ＮａＣＡ３００ｄで展開させた。１ＭのＮａＣ２を含有
する緩衝液をこの勾配の最後に加えた。５−のフラクシ
ョンで集め、０．０７５ｍの交互のフラクションをニト
リラーゼ活性につき分析した。酵素活性の単一ピークが
０．２２Ｍ塩にて溶出した。投入ニトリラーゼ活性の約
７５％が活性フラクションとして回収された。

ＤＥＡＥカラムからのニトリ２−ゼピークを含むフラク
ションを０．０２ＭのＫＰＯ４（ｐＨ７，５）に対し透
析し、かつ５０Ｍ（６μ？蛋白）の各フラクションを１
１．２５％の変性用レムリゲルに施した。ＤＥＡＥカラ
ムからの活性ピークに相当する蛋白リッチなパンＰは、
分子量３４，０００　のポリペプチドである。活性カラ
ムフラクションに＼工１１他の、ｔ？　リペプチドーは
濃厚星なかった。

これらのデータは、プ四モキシニル特異＠句ニトリ付け
ている。

りｏ−ｙ　ｐＢｒｘ　２をＥｃｏ　ＲＩで完全に切断し
、かつ約１９　Ｋｂの断片を分離した。この断片をＥｃ
ｏ　ＲＩ　切断したｐＡＣＹＣ１８４ベクター（３，９
このプラスミドを常法で分離し、かつＢｇｌ　ＩＩ　　
で切断して約６．７Ｋｂの断片を生成させ、これをｐＡ
ＣＹＣ１８４ベクター中に挿入した。この挿入Ｂｇｌ　
１１で切断して約３．９Ｋｂの断片を生成させ、これを
Ｓａｍ　Ｉ−Ｂａｍ　ＨＩ切断されたｐＡＣＹＣ１７７
（３，７Ｋｂ　）　（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、　
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

第１３４巻（１９７８）、第１１４１−１１５６頁〕Ｋ
挿入した。ペニシリナーゼ耐性を有する得られたプラス
ミドを上記と同様に大腸菌内に形質転換させ、かつ形質
転換体をペニシリン選択培地で選択してプラスミドｐＢ
ｒｘ　８を生成させた。これは３．９Ｋｂ断片に二）！
Ｊラーゼ遺伝子を有する。

ｐＢｒｘ　８をＰｓｔ　　■で部分切断し、かつこれら
断片をＰｓｔ　　Ｉ切断されたｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓ
ｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ、第３３巻（１９８
５）、第１０３　−　１１９頁〕に挿入した。得られた
プラスミドを大腸菌にクローン化させ、かつニトリラー
ゼ活性につきスクリーニングした。１種のクローンは５
．３ＫｂのプラスミドｐＢｒｘ　９を有し、これをして
１２１０ｂｐの断片を得、これはＰｓｔｌからＨｉｎｃ
　ｌの方向へ相対的に均一離間したＣ１ａｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ第７４巻（１９７７）
、第５４６３−５４６８頁〕にしたがって配列決定した
。得られた配列（コーＰされた適尚なアミノ酸を含む）
は次の配列で示される。

ＣＪｋ　　　（５ｋ　　　？ｌＩ　　　Ｃ！ｌ−Ｃ！ｌ
ｘ　　　Ｑ−１ａｍ　　　４ｍ？謂　ミｅ　　Ｅ：　　
２５　　ご芯　赳５　ご；　８霜υ偽　　Ｃ！ｌ＆Ｉ　
　Ｃ５０ロー　　←−ロー　　リ偽　　Ｏ細＜　−ｕ　
＠ＣＪ　ｋ　　　Ｃ！ｌ　＠　　　←＠　　　ＩＪ＠　
　　（ｆ−ＬｌｉｅｌＣＨＩ−ＩＩ　　　←φ　　υ−
鴫ψ　　ＩＪＪ　　　４１　０（ベト８Ｃ；　　覧遣　
１５４コ　−１社＝　８６　と１参　と５２二　ｉ５　
　≧ユ　目ｉｌコ　具５Ｅ：　七；　８：　１＝　８：
　胃：　ご撃　ご；ＣＪＪ　　　ｔｊ＞　　　４４　　
　ＣＪ（！＋　　　υ−〇（←ψ　　０≧Ｃ！＋　−ｕ
ｓ　　　ｕａ　　　Ｃ！ｌ−υ−ト・　　ｕａＩ　　Ｃ
Ｊ−Ｑ＞　　　　［−＋Ｏ４ＣＭ　　　　４真　　　０
鴫　　　Ｑ−ロー　　　Ｏ（８二　　８二　　１：　　
ミニ　？二　　８＝　？ニ　　ミニＣＪ１１．　　　（
＆４Ｃ！Ｉｃ！ｌ　　　１ｊ４ｆ　　　（−ＣＪ４　　
　＜−ＣｆｆＣ！１ｇ：　　ｇ！：　ｇ二　七：　　冒
：　８＝　　仁；　宮！４φ　　ｃｏ　　４−　　υ−
ロロ　　←轄　　Ｏ（ロ（：ｆｆ１．　ＥＰｉａミ３；
昧Ｓミ基二畦りミ１５ミ３ミ扛：　宝：、？；　　　ミ
ド　ミド　ミ、：　　ご＝　　８二　８鵞（Ｊ＋Ｊ　　
　Ｃ３Ｃ！＋　　　！−＋ａ、　　　←←　　←←　　
０閃　　←ψ　　ｃＯ←η韮　■　葺曇　弓＝　滅ｉ　
葺Ｓ　底＞　　３；　　Ｅ’二臼　旧　肛　狂　目５　
韮　肛　慕ミ　遁Ｓ市　ム　弱　葺二　属２　肛　肛　
芭ｌ　關８二　Ｆｓ：　　８Ｃ；　　ご５　ご６　ご４
　ご６　ごｇ　ごδ葺二　３；　韮　拮　お　と５　　
各５　銘　Ｉ醤ミ　■　狂　ζ５　韮　巨３　ヨ；　ｔ
　目ｉ弓二　弓二　ｉａ　■　院　卦　Ｕ’４　８’Ｅ
　　士牙二　狂　本　ＥＥ　　Ｑミ　話１月　１５　目
ｉ５′−および３′−の非コード化ｆｌａｎｋｉｎｇ領
域かＮｐＣＧＮ　４５１のＥｃｏＲＩ部位中へ挿入する
ことにより植物発現カセット中へ導入することが１コ斤 対応　　　　　ｅｒ等によるＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

第２巻（１９８３）、第３３５頁の定義にしたがい３′
領域につき１１．２０７〜１２．８２３　であり、かつ
５′領域につき１３．６４３〜１５，２０８である。５
１断片を次のようにして得た：コード化領域の５′末端
をμ＋ｍ　ＨＩ　−Ｅｃｏ　ＲＩ断片として含有する小
さいサブクローン化断片を、プラスｈ−ノ ミドｐｃＧＮ４０７としてｐＢＲ３２２Ｊ／：クローン
化させた。このＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ断片はコｈｅ
化領域にＸｍｎＩ　　部位を有する一方、ｐＢ１３２２
は２個のＸｍｎ　Ｉ　　部位を有する。ｐｃＧＮ４０７
をＸｍｎＩで切断し、Ｂａｌ　３１ヌクレアーゼで再切
断し、さし、各フラクションをクローン化させかつ配列
決定した。１つの場合、全コード化および５１非翻訳配
列の１０ｂｐが除去されて、５１非転写領域とｍＲＮＡ
キャップ部位と５′非翻訳領域の１６　ｂｐ（ＢａｍＨ
Ｉ部位まで）とを完全のまま残した。この小さい断片を
７％アクリルアミＦデルでの大きさによ配列をオクトピ
ンシンターゼ遺伝子の公知配列と比較した。Ｍｔ３ｄ成
物をｐ工４と命名し、この小疎断片を生成させ、これを
ｐＴｉＡ６　（ＧａｒｆｉｎｋｅｌおよびＮｅ５ｔｅｒ
、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、第１４４巻（１９８０
）、第７３２頁〕からの上流５′配列を有するＸｈｏＩ
〜をｐｕｃｓ誘導体のＸｈｏ　Ｉ部位にクローン化させ
、これをｐＣＧＮ　４２６と命名した。このプラスミド
は、ＤＮＡポリメラーゼエで充填された唯一のＥｃｏＲ
Ｉ部位を有し、かつＸｈｏＩＩＪンカーをｐＵＣ８の唯
一のＨｉｎｃＩ［部位に挿入した際ＨｉｎｃＩｌ制限エ
ンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ汚染によりＰｓｉ　　
■　およびＨｉｎｄｌ［１部位を喪失している点で、ｐ
ＵＣ８とは相違している。得られたプラスミドｐｃＧＮ
４５１は、蛋白コード化配列を挿入するた５′非翻訳配
列の１６ｂｐと 含有する）と３１領域（これは コード化領域の２６７　ｂｐと停止コドンと３′非翻訳
ＤＮＡの１９６　ｂｐとポリＡ部位と３′非転写配列の
１１５３ｂｐとを含有する）との間に有する。

オクトビンシンセターゼ（ＯＣＳ）カセットを含有する
Ｘｈｏｌ　断片を、テトラサイクリン耐性およびカナマ
イシン耐性の遺伝子を有するプラスミ第１９巻（１９８
２）、第２５９頁〕からのＫａｎ’遺伝子を導入するこ
とによりｐＨ０７９（Ｈｏｈｎ。

Ｇｅｎｅ　、第１１巻（１９８０）、第２９１頁〕から
耀依した。ｐｃＧＮ５１７をＳａｌ　Ｉで切断し、かつ
Ｘｈｏ　Ｉ断片を唯一のＳａｌ　Ｉ部位に挿入した。

さらＫＸｈｏＩ断片を第２のプラスミドｐＣＧＮ５２９
中へ挿入した。ｐＣＧＮ　５２９は、Ｔｉ５［Ｒｏｔｈ
ｓｔｅｉｎ等、１９８１、Ｍｏｖａｂｌｅ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＥｌｅｍｅｎｔｓ　＊　ｍ　９９頁、Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−Ｎｅｓｔ
ｅｒ　＋　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　ｒ第１４４巻（
１９８０）、第７１０頁〕からの２．４ＫｂのＢｇｌ　
Ｉ［断片をＴｉ５のＫａｎ　　遺伝子によるｐＡＣＹＣ
１８４のＨｉｎｄ　ｌ［［−μ＋ｍＨＩ断片の置換後に
残存するＢａｍＨＩ部位中へ挿入することによＦ）ｐＡ
ＣＹＣ１８４がら作成した。

Ｅｃｏ　ＲＩ　＝　）リラーゼ遺伝子がＯＣＳカセット
の唯一のＥｃｏ　ＲＩ部位に挿入されているＯＣＳカセ
ットを含有するＸｈｏ　Ｉ断片をｐＣＧＮ５１７および
ｐＣＧＮ　５２９に埼大して２種のプラスミドｐＮ１お
よびｐＮ２をそれぞれ生成させ、これらをそれぞれＡ、
ツメファシェンス（Ａ、　ｔｗｅｆａｃｉｅｎｓ　）ま
たはＡ、リゾゲネノス（Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）
に導入すべく使用して、Ｔｉ−もしくはＲｉ−プラスミ
ドのＴ−ＤＮＡに組込んだ。各シラスミド中への組込み
はＣｏｍａｉ等、プラスミド、第１０巻（１９８３）、
第２１−成できる。プラスミドｐＲＫ２０７３、ｐＮＩ
も、シ＜はｐＮ２を含有する大腸菌宿主およびＡ・ツメ
フアシエンスＡ　７２２　（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　、　
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　。

第１４４巻（１９８０）、第７３２頁〕もしくはＡ−リ
ゾゲノスＡ　４　Ｔ　（ｗｈｉｔｅ　、上記、第１４４
巻（１９８０）、第７１０頁〕の夜間培養物を１晩培養
し、かつ適当な培養物を混合しかつ１５０ｐｆ／−のカ
ナマイシンを含有するＡＢプレートに展延させた。単一
コロニーを２回再塗沫した。

正確な組込みは、全アグロバクテリウムＤＮＡのサザン
分析によって証明される。エンドヌクレアーゼ切断され
たＤＮＡは、ニック翻訳されたｐＢｒｘ　８で証明され
る。

タバコ植物を無菌栽培した〔２５℃、白色光（１６時間
）　；ＭＳ　（Ｌｒｎｙ／ｌのＩＡＡ、　０．１５ｔｎ
ｇ／ｌのカイネチン〕。主若枝移植物を介して維持され
た３週令の植物を組織供与体として使用した。

若い葉（頂部から第４番目まで）を選択し、直径２鵡の
葉円盤を抜き取り、かつぺ）　１７皿（直径３ｃＩＩ＋
）内のｌｙ／ｌのＩＡＡを含む１ｍｌのＭＳ培地に入れ
た。これら円盤を暗所内で１晩保った後、／Ｍｔ）をこ
れら培養物に添加した。共栽培を暗所中にて１８−２４
時間行なった。葉スライス物から７グロｌｔクテリウム
を除去し、その際ホルモンを含まずかつ３５０　ｑ／　
ｔのセ７オタキシン（ｃｅｆｏｔａｘｉｎｅ　）　（ベ
ーリンガーマンハイム社〕を含有するＭＳ培地で３回洗
浄した。葉スライス物を直径９ａＩ−のペトリ皿におけ
るホルモンを含有しない１０ｄのＭＳ培地に移した。フ
ィトアガー（ｐｈｙｔａｇａｒ）（ギプコ社、０．６％
　　；セフオタキシン、３５０Ｉｌｔ／ｌ）のペトリ皿
をパラフィルムで封止し、かつ組織供与体植物と同じ条
件下に保った。

根部が２〜４週間までに出現し、これを同一培地にキ／
ノのＩＡＡおよび２ｎｙ／ノのカイネチンにて同一条件
下に置いた。その後２〜５週間で、再生する若枝が見ら
れた。

植物向の６枚の葉段階にて鉢植え植物に対しブロモキシ
ニル溶液壇スプレー竺て噴霧し句ち た。各４インチのポットは１本の植物を含み、２．５−
のスプレーを施こした。これら植物を２５Ｃかつ相対湿
度７０俤の成長室内で６０時間の光照射の下で成長させ
た。成長を、０．５ｃ＊よ）長い新たな葉を計数するこ
とにより噴霧後９８已に＃たコゴ評価した。

上記手順にしたがい、ブロモキシニル耐性を有する植物
が得られ、これをブロモキシニルの存在下に圃場で使用
しｇの成長に対し顕著な悪影響を毫でなかった。

本発明は、特に特定のベンゾニトリル除草剤に対し植物
を除草剤耐性にすることによる植物の改により、この酵
素を産生させることができる。監視しうる活性を有する
酵素は、各種の分析物或いはベンゾニトリル基質につき
分析する際の広範な種類の用途を有する。さらに、これ
ら酵素およびる。

以上、理解をよシ明瞭にするため本発明を実施例につき
詳細に説明したが、本発明の範囲内で多くの改変をなし
うろことが了解されよう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約
   ０．１μモルＮＨ＿３／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白の比活性を有
   する純度の約３４ｋｄの実質的に純粋な細菌ニトリラー
   ゼ。 （２）３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニ
   トリルに対し特異的なニトリラーゼを発現する外来遺伝
   子を有する細菌宿主。 （３）約３４ｋＤａｌのニトリラーゼを含み、基質とし
   てのブロモキシニルに対し少なくとも約 ０．１μモルＮＨ＿３／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白の比活性を有
   する組成物。 （４）ニトリラーゼが細菌ニトリラーゼである特許請求
   の範囲第３項記載の組成物。 （５）細菌ニトリラーゼが￥クレブシエラ￥から得られ
   るニトリラーゼである特許請求の範囲第４項記載の組成
   物。 （６）少なくとも約０．５μモルＮＨ＿２／ｍｉｎ／ｍ
   ｇ蛋白の比活性を有する特許請求の範囲第３項記載の組
   成物。 （７）３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニ
   トリルに対し特異的なニトリラーゼを発現する外来遺伝
   子を有する細菌宿主。 （８）細菌宿主が大腸菌である特許請求の範囲第７項記
   載の細菌宿主。 （９）植物細胞にて機能し得る調節領域の転写および翻
   訳調節制御下でブロモキシニルおよび／またはイオキシ
   ニルに特異的なニトリラーゼをコードする構造遺伝子を
   含む発現カセット。 （１０）ニトリラーゼが細菌ニトリラーゼである特許請
   求の範囲第９項記載の発現カセット。 （１１）カセットが少なくとも１個のＴ−ＤＮＡ端を有
   する特許請求の範囲第９項または第１０項記載の発現カ
   セット。 （１２）転写開始領域がｏｐｉｎｅをコードする遺伝子
   からのものである特許請求の範囲第９項乃至第１１項の
   いずれかに記載の発現カセット。 （１３）特許請求の範囲第９項記載の発現カセットを含
   み、大腸菌およびＡ・ツメフアシエンスの少なくとも１
   種にて複製しうるプラスミド。 （１４）発現カセットが少なくとも１個のＴ−ＤＮＡ端
   を有する特許請求の範囲第１３項記載のプラスミド。 （１５）￥クレブシエラ￥中で見い出されるブロモキシ
   ニルおよび／またはイオキシニルに特異的な細菌ニトリ
   ラーゼに対する野性型の転写開始領域以外の転写調節領
   域に結合しその制御下にあり、明細書中に実質的に記載
   されたＤＮＡ配列。 （１６）転写調節領域が植物中にて機能し特許請求の範
   囲第１５項記載のＤＮＡ配列。 （１７）転写調節領域が細菌にて機能し得る特許請求の
   範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。 （１８）３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾ
   ニトリルに対し特異的なニトリラーゼ酵素をコードする
   オープンな読み取り枠を有し、その５′末端に野性型以
   外の転写開始領域を有するＤＮＡ配列。 （１９）ニトリラーゼ酵素が細菌ニトリラーゼ酵素であ
   る特許請求の範囲第１８項記載のＤＮＡ配列。 （２０）クレブシエラからのＤＮＡ配列と実質的に相同
   である特許請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ配列。 （２１）特許請求の範囲第９項乃至第１２項のいずれか
   に記載の発現カセットを含む植物細胞。 （２２）特許請求の範囲第２１項記載の植物細胞を含有
   する植物。