TW202227624A - Ｄｎａ修飾酶及活性片段，及其變異體與使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包括用於核酸之靶向編輯的新穎脫胺酶多肽的組成物及方法。組成物包括脫胺酶多肽。亦提供了包括DNA結合多肽及本發明之脫胺酶的融合蛋白。融合蛋白包含與脫胺酶融合（視情況於複合物中用導引RNA）的RNA導引之核酸酶。組成物亦包含編碼脫胺酶或融合蛋白的核酸分子。亦提供了包括編碼脫胺酶或融合蛋白的核酸分子的載體及宿主細胞。

Description

DNA修飾酶及活性片段，及其變異體與使用方法
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年9月11日提交之第63/077,089號美國臨時申請案及2021年2月8日提交之第63/146,840號美國臨時申請案之優先權，上述每一個專利申請都藉由引用整體地併入本文。 關於序列表之聲明
與本申請案關聯之序列表業已藉由ASCII格式代替紙質拷貝來提供，茲藉由引用併入本說明書。該ASCII拷貝被命名為L103438_1230WO_0108_1_SL.txt，其大小為1,071,246位元組，其創建於2021年9月9日，且以電子方式經由EFS-Web提交。
本發明關於分子生物學及基因編輯領域。
靶向基因組編輯或修飾正迅速成為基礎及應用研究的重要工具。最初的方法涉及例如大範圍核酸酶（meganuclease）、鋅指融合蛋白或TALEN之類的工程核酸酶，這需要產生具有對每一種特定標的序列專一的工程化、可程式化、序列專一的DNA結合域的嵌合核酸酶。RNA導引之核酸酶(RGN)（例如，成簇規律間隔的短迴文重複子（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）（CRISPR）-關聯（Cas）的CRISPR-Cas細菌系統的蛋白）藉由將核酸酶與導引RNA（導引RNA與特定標的序列專一性雜合）複合而允許專一性序列（specific sequence）之靶向。相較於為每一個標的序列產生嵌合核酸酶，產生標的專一性導引RNA的成本更低且更有效。該種RNA導引之核酸酶可用於透過序列專一性的雙股斷裂的引入來編輯基因組，該斷裂經由易錯的非同源末側連結（NHEJ）被修復，以在專一性基因組位址（specific genomic location）引入突變。
另外，RGN有用於靶向DNA編輯措施。允許專一性修飾引入基因組DNA的核酸序列的靶向編輯，舉例而言，靶向剪切使得非常細微差異之措施能夠研究基因功能基因表現。RGN亦可被用於產生嵌合蛋白，嵌合蛋白使用與例如脫胺酶之類的DNA修飾酶組合的RGN的RNA導引之活性，用於靶向鹼基編輯。靶向編輯可被部署，用於靶向人的基因疾病或用於引入農作物基因組中農藝學上有益的突變。基因組編輯工具的發展對基於基因編輯的哺乳動物治療及農業生物技術提供新措施。
提供了用於修飾標的DNA分子的組成物及方法。組成物可用於修飾所關注之標的DNA分子。所提供的組成物包括脫胺酶多肽。亦提供了包括核酸分子結合多肽（比如，DNA結合多肽）及脫胺酶多肽的融合蛋白以及包括包括RNA導引之核酸酶及脫胺酶多肽的融合蛋白及核糖核酸的核糖核蛋白複合物。所提供的組成物亦包含編碼脫胺酶多肽或融合蛋白的核酸分子以及包括核酸分子的載體及宿主細胞。本文所揭露之方法被策畫用於結合所關注之標的DNA分子內的所關注之標的序列及修飾所關注之標的DNA分子。
受益於前述描述中呈現的教導的、本發明所屬領域中具有通常知識者將想到本文中闡述的本發明之許多修改及其他實施方式。因此，應該明白，本發明不限於所揭露的具體實施方式，且修改及其他實施方式預期被包含於所附請求項的範疇內。雖然本文採用特定術語，但此等術語僅以一般性及描述性意義使用，而非出於限制性目的。 I ．概述
此揭露提供新穎的腺嘌呤脫胺酶及包括核酸分子結合多肽（諸如，DNA結合多肽）及新穎脫胺酶多肽的融合蛋白。於某些實施方式中，DNA結合多肽為序列專一性DNA結合多肽，因為DNA結合多肽以比與隨機化背景序列的結合頻率高的頻率與標的序列結合。於一些實施方式中，DNA結合多肽為或取得自大範圍核酸酶（meganuclease）、鋅指融合蛋白或TALEN。於一些實施方式中，融合蛋白包括RNA導引之DNA結合多肽及脫胺酶多肽。於一些實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶，諸如，與導引RNA（亦稱為gRNA）結合的Cas9多肽域，而導引RNA轉而經由股雜合結合標的核酸序列。
本文揭露的脫胺酶多肽可將舉例而言諸如腺嘌呤的核鹼基脫去胺基。脫胺酶將核鹼基脫去胺基可在各自殘基處導致點突變，在本文中被稱為“核酸編輯”或“鹼基編輯”。由此，包括RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及脫胺酶的融合蛋白可用於核酸序列的靶向編輯。
該等融合蛋白有用於DNA的體外靶向編輯，比如，有用於基因修飾細胞的產生。此等基因修飾細胞可為植物細胞或動物細胞。該等融合蛋白亦可有用於靶向突變的引入，比如，有用於在比如從個體獲得的、隨後被重新引入同一或另一個個體的細胞中離體地校正哺乳動物細胞中的基因缺陷；及有用於靶向突變的引入，比如，基因缺陷的校正或哺乳動物個體中的疾病關聯基因中的去活化突變的引入。該等融合蛋白亦可有用於植物細胞中的靶向突變的引入，比如，有用於有益的或農藝學上有價值的性狀或對偶基因的引入。
術語“蛋白質”、“胜肽”及“多肽”在本文中可被互換地使用，且指藉由胜肽（醯胺）鍵被聯結在一起的胺基酸殘基的聚合物。該術語指任何大小、結構或功能的蛋白質、胜肽或多肽。通常情況下，蛋白質、胜肽或多肽將為至少三個胺基酸的長度。蛋白質、胜肽或多肽可指個別蛋白質或蛋白質的集合。舉例而言，藉由添加諸如碳水化合物基團、羥基基團、磷酸鹽基團、法呢基（farnesyl）基團、異法呢基基團、脂肪酸基團、用於共軛、官能化、或其他修飾等等的聯結子的化學實體，蛋白質、胜肽或多肽中的一或更多胺基酸可被修飾。蛋白質、胜肽或多肽亦可為單一分子，或可為多分子複合物。蛋白質、胜肽或多肽可就是天然存在的蛋白質或胜肽的片段。蛋白質、胜肽或多肽可為天然存在的、重組體、合成物、或其任意組合。
本文中提供的任何蛋白質可藉由本領域中已知的任何方法產生。舉例而言，本文提供的任何蛋白質可經由重組體蛋白質表現及純化產生，這特別適合於包括胜肽聯結子的融合蛋白。重組體蛋白質表現及純化的方法被熟知，且包含Green及Sambrook， Molecular Cloning: A Laboratory Manual( 4thed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))描述的那些內容，其全部內容藉由引用併入本文。 II. 脫胺酶
術語“脫胺酶”指催化脫去胺基反應的酶。本發明的脫胺酶為核鹼基脫胺酶，及術語“脫胺酶”及“核鹼基脫胺酶”在本文中被可互換地使用。脫胺酶可為天然存在的脫胺酶酶或其活性片段或變異體。脫胺酶可在諸如ssDNA或ssRNA的單股核酸上或諸如dsDNA或dsRNA的雙股核酸上有活性。於一些實施方式中，脫胺酶只能對ssDNA脫去胺基，而對dsDNA沒有作用。
目前揭露的方法及組成物包括腺嘌呤脫胺酶。於一些實施方式中，脫胺酶為ADAT家族脫胺酶或其變異體。腺嘌呤、腺苷或去氧腺苷的脫去胺基產出肌苷，肌苷藉由聚合酶被處理為鳥嘌呤。迄今為止，尚不知天然存在之對DNA中的腺嘌呤脫去胺基的腺嘌呤脫胺酶。已採用若干方法來演化及最佳化對哺乳動物細胞中的DNA分子有活性、作用於tRNA（ADAT）蛋白上的腺嘌呤脫胺酶（Gaudelli等人, 2017; Koblan, L. W.等人, 2018, Nat Biotechnol 36, 843-846; Richter, M. F.等人, 2020, Nat Biotechnol, doi:10.1038/s41587-020-0562-8, 每一者藉由引用被整體併入本文）。一個該種方法使用細菌選擇測定，其中只有透過A:T＞G:C轉變，有能力活化抗生素抗性的細胞能夠生存。
本發明與透過細菌脫胺酶的演化及最佳化產生的新穎腺嘌呤脫胺酶多肽有關。新穎的腺嘌呤脫胺酶目前被揭露及闡述為SEQ ID NO：1-10及399-441。本發明的脫胺酶可有用於DNA或RNA分子的編輯。於一些實施方式中，本發明的脫胺酶可有用於ssDNA或ssRNA分子的編輯。本文描述的腺嘌呤脫胺酶單獨地用作脫胺酶或用作融合蛋白中的組成。包含DNA靶向多肽及腺嘌呤脫胺酶多肽的融合蛋白在本文中被稱為“基於A的編輯器”、“腺嘌呤鹼基編輯器”或“ABE”，且可有用於核酸序列的靶向編輯。
“鹼基編輯器”為包括DNA靶向多肽（諸如，RGN）及脫胺酶的融合蛋白。腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）包括DNA靶向蛋白（諸如，RGN）及腺嘌呤脫胺酶。ABE透過腺嘌呤的脫去胺基作用於DNA標的分子上的肌苷內（Gaudelli, N. M. 等人，2017）。肌苷藉由聚合酶被辨識為鳥嘌呤，且允許從肌苷橫跨的互補DNA股上的胞嘧啶的併入。經過一輪複製後脫去胺基後，基因組中存在導致的A:T至G:C的鹼基對變化。於一些實施方式中，目前揭露的腺嘌呤脫胺酶或其活性變異體或片段將A＞N突變引入DNA分子中，其中N為C、G或T。於進一步實施方式中，它們將A＞G突變引入DNA分子中。
於脫胺酶已經由與DNA結合多肽的融合被靶向至核酸分子的專一性區域的那些實施方式中，可使用本領域中已知的方法（包含聚合酶連鎖反應（PCR）、限制片段長度多型性（RFLP）或DNA定序）測量DNA結合多肽結合至的標的序列內的或與該標的序列相鄰的腺嘌呤的突變率。
目前揭露的保持脫胺酶活性的新穎脫胺酶或其活性變異體或片段可被引入細胞中作為脫胺酶DNA結合多肽融合的一部分，及/或可與DNA結合多肽脫胺酶融合共表現，以提高將期望A＞G突變引入標的DNA分子中的效率。目前揭露的脫胺酶具有SEQ ID NO：1-10及399-441中任一者的胺基酸序列或其保持脫胺酶活性的變異體或片段。於一些實施方式中，脫胺酶具有與SEQ ID NO：1-10及399-441中任一者的胺基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的胺基酸序列。於特定實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：407、405、399、1-10、400-404、406及408-441中任一者具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：407具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。舉例而言，脫胺酶包括與SEQ ID NO：407具有至少約80%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、至少約96%一致性、至少約97%一致性、至少約98%一致性、至少約99%一致性、至少約99.5%一致性、或至少約99.9%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：407具有至少80%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、至少99%一致性、至少99.5%一致性、或至少99.9%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括SEQ ID NO：407的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：399具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。舉例而言，脫胺酶包括與SEQ ID NO：399具有至少80%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、至少約96%一致性、至少約97%一致性、至少約98%一致性、至少約99%一致性、至少約99.5%一致性、或至少約99.9%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：399具有至少80%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、至少99%一致性、至少99.5%一致性、或至少99.9%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括SEQ ID NO：399的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：405具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。舉例而言，脫胺酶包括與SEQ ID NO：405具有至少約80%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、至少約96%一致性、至少約97%一致性、至少約98%一致性、至少約99%一致性、至少約99.5%一致性、或至少約99.9%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：405具有至少80%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、至少99%一致性、至少99.5%一致性、或至少99.9%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括SEQ ID NO：405的胺基酸序列。 III. 核酸分子結合多肽
本揭露的一些態樣提供包含核酸分子結合多肽及脫胺酶多肽的融合蛋白。 儘管本發明考量了與RNA分子的結合及RNA分子的靶向編輯，但於一些實施方式中，融合蛋白的核酸分子結合多肽為DNA結合多肽。該等融合蛋白有用於DNA在體外、離體地、或活體內的靶向編輯。此等新穎融合蛋白在哺乳動物細胞中有活性及有用於DNA分子的靶向編輯。
如本文中使用的術語“融合蛋白”指包括來自至少二個不同蛋白的蛋白域。融合蛋白可包括一個以上的不同域，舉例而言，DNA結合域及脫胺酶。於一些實施方式中，融合蛋白為與核酸（比如，RNA）的複合物或與核酸（比如，RNA）關聯。
於一些實施方式中，目前揭露的融合蛋白包括DNA結合多肽。如本文中使用的術語“DNA結合多肽”指能夠與DNA結合的任何多肽。於某些實施方式中，目前揭露的融合蛋白的DNA結合多肽部位與雙股DNA結合。於特定實施方式中，DNA結合多肽以序列專一性方式與DNA結合。如本文中使用的術語“序列專一性”或“序列專一性方式”指與專一性核苷酸序列的選擇性相互作用。
當二個序列在嚴格條件下彼此雜合時，可認為二個多核苷酸序列實質上互補。同樣地，如果DNA結合多肽在嚴格條件下與其序列結合，則認為DNA結合多肽以序列專一性方式結合至特定標的序列。“嚴格條件”或“嚴格雜合條件”旨在指二個多核苷酸序列（或多肽結合至其專一性標的序列）將彼此結合至可偵測程度高於其他序列（比如，至少比背景高2倍）的條件。嚴格條件為序列相依的，且在不同環境下將會不同。通常情況下，嚴格條件將是這樣的條件，其中：在pH 7.0至8.3，鹽類濃度小於約1.5 M Na離子，通常情況下約0.01至1.0 M Na離子濃度（或其它鹽類），且針對短序列（比如，10至50個核苷酸），溫度為至少約30 ℃，而針對長序列（比如，大於50個核苷酸），溫度為至少約60 ℃。藉由添加諸如甲醯胺的去穩定劑亦可達到嚴格條件。範例性的低嚴格條件包含在37℃下以30至35％甲醯胺、1 M NaCl、1％SDS（十二烷基硫酸鈉）的緩衝溶液雜合及在50至55℃下以1X至2X SSC洗滌（20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M檸檬酸三鈉）。範例性的中等嚴格條件包含在37℃下於40至45％甲醯胺、1.0 M NaCl、1％ SDS中雜合及在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗滌。範例性的高嚴格條件包含在37℃下於50％甲醯胺、1 M NaCl、1％ SDS中雜合及在60至65℃下在0.1X SSC中洗滌。視情況，洗滌緩衝液可包括約0.1％至約1％的SDS。雜合持續時間一般而言小於約24小時，通常約4至約12小時。洗滌時間的持續時間至少為足以達到平衡的時間長度。
Tm為50％之互補標的序列與完全匹配之序列雜合之溫度（於所界定之離子強度和pH下）。對於DNA-DNA雜合體，Tm可以由Meinkoth和Wahl (1984) Anal. Biochem. 138：267-284中的等式：Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L大致估計；其中M為單價陽離子的莫耳濃度，％GC為鳥苷和胞嘧啶核苷酸於該DNA中的百分比，％form為甲醯胺於雜合溶液中之百分比，及L為鹼基對中的雜合體之長度。一般而言，嚴格條件被選擇為比在所界定之離子強度和pH下的專一性序列及其補體的熱熔點（Tm）低約5℃。然而，極度嚴格條件可採用在比該熱熔點(TM)低1、2、3或4℃下的雜合及/或洗滌；中等嚴格條件可採用在比該熱熔點（Tm）低6、7、8、9或10℃的溫度下的雜合及/或洗滌；低嚴格條件可採用在比該熱熔點（Tm）低11、12、13、14、15或20℃的溫度下的雜合及/或洗滌。本領域具有通常知識者將明白，使用該等式、雜合及洗滌組成物以及要求的Tm，雜合及/或洗滌溶液的嚴格性的變化被固有地描述了。核酸雜合的廣泛指南可在Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier，New York)；及Ausubel等人eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中得到。參見Sambrook等人(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
於某些實施方式中，序列專一性DNA結合多肽是RNA導引之DNA結合多肽（RGDBP）。如本文中使用的術語“RNA導引之DNA結合多肽”及“RGDBP”指透過關聯RNA分子與標的DNA序列的雜合能夠結合至DNA的多肽。
於一些實施方式中，融合蛋白的DNA結合多肽是核酸酶，諸如，序列專一性核酸酶。如本文中使用的術語“核酸酶”指催化核酸分子中的核苷酸之間的磷酸二酯鍵的剪切的酶。於一些實施方式中，DNA結合多肽是核酸內切酶，其能夠剪切核酸分子內的核苷酸之間的磷酸二酯鍵，而於某些實施方式中，DNA結合多肽是核酸外切酶，其能夠剪切核酸分子的任一末側（5'或3'）處的核苷酸。於一些實施方式中，序列專一性核酸酶從大範圍核酸酶（meganuclease）、鋅指核酸酶、TAL效應子DNA結合域核酸酶融合蛋白（TALEN）及RNA導引之核酸酶（RGN）或其變異體組成的群組選出，其中核酸酶活性被降低或抑制。
如本文中使用的術語“大範圍核酸酶”或“歸巢核酸內切酶”指將雙股DNA內的12至40 bp長度的辨識位點結合的內切酶。大範圍核酸酶的非限制性實例是屬於包括保留胺基酸模體LAGLIDADG（SEQ ID NO：49）的LAGLIDADG家族。術語“大範圍核酸酶”可指二聚或單鏈大範圍核酸酶。
如本文中使用的術語“鋅指核酸酶”或“ZFN”指包括鋅指DNA結合域及核酸酶域的嵌合蛋白。
如本文中使用的術語“TAL效應子DNA結合域核酸酶融合蛋白”或“TALEN”指包括TAL效應子DNA結合域及核酸酶域的嵌合蛋白。
如本文中使用的術語“RNA導引之核酸酶”或“RGN”指具有核酸酶活性的RNA導引之DNA結合多肽。RGN是所考慮「RNA導引」，因為導引RNA與RNA導引之核酸酶形成複合物，以將RNA導引之核酸酶導向至與標的序列結合，並且於一些實施方式中，在該標的序列處引入單股或雙股斷裂。RGN可為CasX、CasY、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、SpCas9、SaCas9、Nme2Cas9、CjCas9、Casl2a（先前稱為Cpfl）、Cas12b、Cas12g、Cas12h、Cas12i、LbCas12a、AsCas12a、CasMINI、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCas12a、AsCas12a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、或Spy-macCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO：41、60、366或368中任一者所示的胺基酸序列的RGN。於一些實施方式中，如下所述，本文中提供的RGN是RGN切口酶。
根據本發明，已經突變而變成滅核酸酶活性（nuclease-inactive）或無核酸酶活性（nuclease-dead）（舉例而言，諸如，dCas9）的RGN蛋白可被稱為RNA導引之DNA結合多肽或滅核酸酶活性RGN或無核酸酶活性RGN。另外，其他已知RNA導引之核酸酶（RGN）的適合的滅核酸酶活性Cas9域可被確定（舉例而言，第2019/0367949號美國專利公開揭露的RGN APG08290.1的滅核酸酶活性變異體，該美國專利揭露的全部內容藉由引用併入本文）。
於一些實施方式中，融合蛋白包括與本文中描述的脫胺酶融合的RGN。在上面描述的融合蛋白的那些實施方式中，脫胺酶從包括與SEQ ID NO：1-10及399-441中任一者具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶選出。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：407具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：399具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶包括與SEQ ID NO：405具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於上面描述的融合蛋白的那些實施方式中，RGN從CasX、CasY、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9, aSpCas9、SaCas9、Nme2Cas9、CjCas9、Casl2a（先前稱為Cpfl）、Cas12b、Cas12g、Cas12h、Cas12i、aLbCas12a、AsCas12a、CasMINI、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCas12a、AsCas12a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO：41、60、366、或368中任一者所示的胺基酸序列的RGN選出。於特定實施方式中，融合蛋白包括與包括與SEQ ID NO：407具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的Cas9切口酶。於一些實施方式中，融合蛋白包括與包括與SEQ ID NO：399具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的Cas9切口酶。於特定實施方式中，融合蛋白包括與包括與SEQ ID NO：405具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的Cas9切口酶。Cas9切口酶可為第WO2020181195號PCT專利公開揭露的任何Cas9切口酶，該PCT專利揭露的全部內容藉由在本文中引用併入本文。
術語“RGN多肽”涵蓋僅剪切標的核苷酸序列的單股的RGN多肽，其在本文中被稱為切口酶。該種RGN具有單一功能核酸酶域。RGN切口酶可為天然存在的切口酶，或可為天然地剪切在一或多個核酸酶域內已經突變藉以使得此等突變域的核酸酶活性被降低或消除的雙股核酸分子的二股的RGN蛋白。於一些實施方式中，融合蛋白的切口酶RGN包括使RGN僅能夠剪切胺基酸雙螺旋的非鹼基編輯的標的股（包括PAM且與gRNA鹼基配對的股）的突變（比如，D10A突變）。此D10A突變使RGN的割裂RuvC核酸酶域中的第一天冬胺酸殘基突變。本申請揭露所描述的RGN的若干D10A切口酶變異體或同源切口酶變異體（參見實例4）。nAPG07433.1及nAPG08290.1（分別如SEQ ID NO：42及61所示的）為分別如SEQ ID NO：41及60所示的APG07433.1及APG08290.1的切口酶變異體，且其被描述於WO 2019/236566中（其全部內容藉由引用而被併入本文）。nAPG00969（如SEQ ID NO：52所示的）及nAPG09748（如SEQ ID NO：54所示的）分別為APG00969及APG09748的切口酶變異體，其描述於WO 2020/139783中（其全部內容藉由引用而被併入本文）。nAPG06646（如SEQ ID NO：53所示）及nAPG09882（如SEQ ID NO：55所示）分別為APG06646及APG09882的切口酶變異體，其描述PCT揭露WO 2021/030344中（其全部內容藉由引用而被併入本文）。nAPG03850、nAPG07553、nAPG055886、及nAPG01604分別如SEQ ID NO：56-59所示，且為APG03850、APG07553、APG055886、及APG01604的切口酶變異體，其被描述於第PCT/US2021/028843號待決PCT申請中（其全部內容藉由引用而被併入本文）。各種RGN切口酶、其變異體及其序列被揭露於第WO2020181195號PCT專利公開中，其全部內容藉由引用而被併入本文。一個範例性的適合的滅核酸酶活性Cas9為D10A/H840A Cas9突變體（比如，參見Qi等人，Cell. 2013; 152(5): 1173-83，其全部內容藉由引用而被併入本文）。
於一些實施方式中，融合蛋白的切口酶RGN包括突變（比如，H840A突變），其使RGN能夠僅剪切核酸雙股螺旋的鹼基編輯的非靶向股（不包括PAM及與gRNA不鹼基配對的股）。H840A突變使HNH核酸酶域的第一組胺酸突變。包括H840A突變或等效突變的切口酶RGN具有滅活性的HNH域。具H840A突變的切口酶RGN剪切非靶向股。包括D10A突變或等效突變的切口酶具有滅活性RuvC核酸酶域且剪切靶向股。D10A切口酶不能剪切DNA的非靶向股，亦即，想要鹼基編輯的股。
其他額外的範例性的適合的滅核酸酶活性Cas9域包含但不限於D10A/D839A/H840A及D10A/D839A/H840A/N863A突變體域（比如，參見Mali等人Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838，其全部內容藉由引用而被併入本文）。基於此揭露及本領域中的知識（舉例而言，諸如第WO 2019/236566號、第WO2020181195號PCT公開中揭露的RGN，此等PCT揭露的全部內容藉由引用而被併入本文），經突變為切口酶的額外適合的RGN蛋白對於本領域中的通常知識者是顯而易見的，且在此揭露的範疇內。於較佳實施方式中，在標的股上具有切口酶活性的RGN對標的股進行切刻，而互補的非標的股藉由脫胺酶被修飾。使用經修飾非標的股作為模板，細胞的DNA修復機械可修復切刻的標的股，從而將突變引入DNA中。
於一些實施方式中，保持切口酶活性的RGN切口酶包括與SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：52-59、61、397、及398中任一者具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.5%一致性的胺基酸序列。
本領域中用於將突變引入胺基酸序列內之任何已知方法（諸如PCR介導的誘變（PCR-mediated mutagenesis）及定點誘變（site-directed mutagenesis））可用於產生切口酶或無核酸酶活性(nickases or nuclease-dead)的RGN。比如參見第2014/0068797號美國揭露及第9,790,490號美國專利；此美國揭露和美國專利中的每一者的全部內容藉由引用而被併入本文。RNA導引之核酸酶（RGN）允許在基因組內的單一位點的靶向操縱，且在基因靶向之背景下有用於治療及研究應用。在各種生物體（包含哺乳動物）中，藉由刺激非同源末側連結或同源重組，RNA導引之核酸酶已被用於基因組工程。RGN包含CRISPR-Cas蛋白，其是藉由導引RNA（gRNA）作為成簇規律間隔的短迴文重複子（CRISPR）RNA導引之核酸酶系統、或其變異體或片段的局部（part）而被導向至標的序列的RNA導引之核酸酶。
本文進一步提供包括如SEQ ID NO：41或60所示的胺基酸序列，但缺少如SEQ ID NO：41或60所示的胺基酸殘基590至597的RGN多肽（及編碼RGN多肽的核酸分子）或其活性變異體或片段。於某些實施方式中，RGN多肽包括如SEQ ID NO：366、368、397、或398所示的胺基酸序列或其活性變異體或片段。
此揭露的一些態樣提供融合蛋白，該融合蛋白包括RNA導引之DNA結合多肽及脫胺酶多肽（具體地說，腺嘌呤脫胺酶多肽）。於一些實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶。於進一步實施方式中，RNA導引之核酸酶為天然存在之CRISPR-Cas蛋白或其活性變異體或片段。CRISPR-Cas系統被分類為1類或2類系統。2類系統包括單一效應子核酸酶，且包含II、V、及VI型。1類及2類系統被細分為型（I、II、III、IV、V、VI型），而且一些型被進一步分為子型（比如，II-A型、II-B型、II-C型、V-A型、V-B型）。
於某些實施方式中，CRISPR-Cas蛋白為天然存在之II型CRISPR-Cas蛋白或其活性變異體或片段。如本文中使用的術語“II型CRISPR-Cas蛋白”、“II型CRISPR-Cas效應子蛋白”或“Cas9”指CRISPR-Cas效應子，其需要反式活化的RNA（tracrRNA）且包括二個核酸酶域（亦即，RuvC及HNH），每一個核酸酶域造成剪切雙股DNA分子的單股。於一些實施方式中，本發明提供一種融合蛋白，其包括目前揭露的與 釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）或SpCas9切口酶融合的脫胺酶，其序列分別如SEQ ID NO：555及556所示，且被描述於第10,000,772號及第8,697,359號美國專利中，此等美國專利中任一者的全部內容藉由引用而被併入本文。於一些實施方式中，本發明提供一種融合蛋白，其包括目前揭露的與 嗜熱鏈球菌Cas9（StCas9）或StCas9切口酶融合的脫胺酶，其序列分別如SEQ ID NO：557及558所示，且被揭露於第10,113,167號美國專利中，該美國專利的全部內容藉由引用而被併入本文。於一些實施方式中，本發明提供一種融合蛋白，其包括目前揭露的與 金黃色葡萄球菌 (Streptococcus aureus)Cas9（SaCas9）或SaCas9切口酶融合的脫胺酶，其序列分別如SEQ ID NO：559及560所示，且被揭露於第9,752,132號美國專利中，該美國專利的全部內容藉由引用而被併入本文。
於一些實施方式中，CRISPR-Cas蛋白是天然存在的V型CRISPR-Cas蛋白或其活性變異體或片段。如本文中使用的術語“V型CRISPR-Cas蛋白”、“V型CRISPR-Cas效應子蛋白”或“Cas12”指剪切dsDNA且包括單RuvC核酸酶域或割裂RuvC核酸酶域並且缺少HNH域的CRISPR-Cas效應子蛋白（Zetsche等人2015, Celldoi:10.1016/j.cell.2015.09.038; Shmakov等人2017, Nat Rev Microbioldoi:10.1038/nrmicro.2016.184; Yan等人2018, Sciencedoi:10.1126/science.aav7271; Harrington等人2018, Sciencedoi:10.1126/science.aav4294）。應該指出，Cas12a亦被稱為Cpf1，且不需要tracrRNA，雖然諸如Cas12b的其他V型CRISPR-Cas蛋白確實需要tracrRNA。大多數V型效應子亦可靶向ssDNA（單股DNA），而常常沒有PAM要求（Zetsche等人2015; Yan等人2018; Harrington等人2018）。術語“V型CRISPR-Cas蛋白”涵蓋包括割裂RuvC核酸酶域的唯一RGN，諸如，2019年12月30日提交的第62/955,014號及2020年7月29日提交的第63/058,169號美國臨時申請案以及2020年12月28日提交的第PCT/US2020/067138號PCT國際申請案揭露的那些，彼等中每一者的全部內容藉由引用而被併入本文。於一些實施方式中，本發明提供一種融合蛋白，該融合蛋白包括目前揭露的與 法朗西斯菌（ Francisella novicida ）Cas12a（FnCas12a）（其序列如SEQ ID NO：561所示且揭露於第9,790,490號美國專利中）或第9,790,490號美國專利中揭露的FnCas12a的任何滅核酸酶活性突變體融合的脫胺酶，該美國專利的全部內容藉由引用而被併入本文。
於一些實施方式中，CRISPR-Cas蛋白是天然存在的VI型CRISPR-Cas蛋白或其活性變異體或片段。如本文中使用的術語“VI型CRISPR-Cas蛋白”、“VI型CRISPR-Cas效應子蛋白”、或“Cas13”指不要求tracrRNA且包括二個剪切RNA的HEPN域的CRISPR-Cas效應子蛋白。
術語“導引RNA”指核苷酸序列，該核苷酸序列與標的核苷酸序列具有足夠互補性，以與標的序列雜合且將關聯RGN之序列專一性結合導向至標的核苷酸序列。關於CRISPR-Cas RGN，分別導引RNA為一或多個RNA分子（一般而言，一或二個），其可與RGN結合且導引RGN來與特定標的核苷酸序列結合，且在RGN具有切口酶或核酸酶活性的那些範例中，還剪切標的核苷酸序列。導引RNA包括CRISPR RNA（crRNA）且於一些實施方式中，包括反式活化CRISPR RNA（tracrRNA）。
CRISPR RNA包括間隔體序列及CRISPR重複序列。“間隔體序列”為與所關注之標的核苷酸序列直接雜合的核苷酸序列。間隔體序列被工程化為與所關注之標的序列完全地或局部地互補。於各種實施方式中，間隔體序列包括約8個核苷酸至約30個核苷酸或更多個核苷酸。舉例而言，間隔體序列之長度可為約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30或更多個核苷酸。於一些實施方式中，間隔體序列之長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或更多個核苷酸。於一些實施方式中，間隔體序列之長度為約10至約26個核苷酸，或長度為約12至約30個核苷酸。於一些實施方式中，間隔體序列之長度為10至26個核苷酸，或長度為12至30個核苷酸。於特定實施方式中，間隔體序列之長度為約30個核苷酸。於特定實施方式中，間隔體序列之長度為30個核苷酸。於一些實施方式中，當使用適合的對準演算法進行最佳對準時，間隔體序列與其對應的標的序列之間之互補性程度在50%與99%之間或更高，包含但不限於約或大於約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更高。於特定實施方式中，當使用適合的對準演算法進行最佳對準時，間隔體序列與其對應的標的序列之間之互補性程度為50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高。於特定實施方式中，間隔體序列不含使用本領域中已知的任何適合的多核苷酸折疊演算法(folding algorithm)可預測之二次結構，多核苷酸折疊演算法包含但不限於mFold（參見，比如，Zuker及Stiegler（1981）Nucleic Acids Res . 9：133-148）及RNAfold（參見，比如，Gruber等人（2008）Cell 106(1)：23-24）。
CRISPR RNA重複序列包括核苷酸序列，該核苷酸序列或者獨自地或者與所雜合tracrRNA配合形成藉由該RGN分子辨識之結構。於各種實施方式中，CRISPR RNA重複序列包括約8個核苷酸至約30個核苷酸或更多個核苷酸。於特定實施方式中，CRISPR RNA重複序列包括8個核苷酸至30個核苷酸或更多個核苷酸。舉例而言，CRISPR重複序列之長度可為約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30或更多個核苷酸。於特定實施方式中，CRISPR重複序列之長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或更多個核苷酸。於一些實施方式中，當使用適合的對準演算法進行最佳對準時，CRISPR重複序列與其對應的tracrRNA序列之間之互補性程度為50%與99%之間或更高，包含但不限於約或大於約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高。於特定實施方式中，當使用適合的對準演算法進行最佳對準時，CRISPR重複序列與其對應的tracrRNA序列之間之互補性程度為50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高。
於一些實施方式中，導引RNA進一步包括tracrRNA分子。反式活化的CRISPR RNA或tracrRNA分子包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括具有與crRNA之CRISPR重複序列雜合之足夠互補性的區域，其在本文中被稱為抗重複子區域（anti-repeat region）。於一些實施方式中，tracrRNA分子進一步包括具二次結構（例如，莖-環）之區域，或在與其對應的crRNA雜合時形成二次結構。於特定實施方式中，tracrRNA的與CRISPR重複序列完全地或局部地互補之區域處於分子的5'末側，且該tracrRNA的3'末側包括二次結構。此二次結構區域一般而言包括被發現與該抗重複序列相鄰、包含融合膜（nexus）髮夾的數個髮夾結構。該tracrRNA的3'末側處常常存在端髮夾，其結構及數量可變，但常常包括富含GC的Rho獨立轉錄終止子髮夾，其後在3'末側處具有一串U。參見，舉例而言，Briner等人（2014） Molecular Cell56：333-339、Briner及Barrangou（2016） Cold Spring Harb Protoc； doi：10.1101/pdb.top090902及第2017/0275648號美國專利公開，上述每一者之全部內容藉由引用而併入本文。
於各種實施方式中，與CRISPR重複序列完全地或局部地互補的tracrRNA的抗重複子區域包含約6個核苷酸至約30個核苷酸或更多個核苷酸。舉例而言，tracrRNA抗重複序列與CRISPR重複序列之間之鹼基配對區域之長度可為約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、或更多個核苷酸。於特定實施方式中，tracrRNA抗重複序列與CRISPR重複序列之間之鹼基配對區域之長度可為6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸。於特定實施方式中，與CRISPR重複序列完全地或局部地互補的tracrRNA的抗重複子區域之長度為約10個核苷酸。於特定實施方式中，與CRISPR重複序列完全地或局部地互補的tracrRNA的抗重複子區域之長度為10個核苷酸。於一些實施方式中，當使用適合的對準演算法進行最佳對準時，CRISPR重複序列與其對應的tracrRNA抗重複序列之間之互補性程度在約50%與約99%之間或更多，包含但不限於約或大於約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更高。於特定實施方式中，當使用適合的對準演算法進行最佳對準時，CRISPR重複序列與其對應的tracrRNA抗重複序列之間之互補性程度為50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高。
於各種實施方式中，整個tracrRNA包括約60個核苷酸至多於約210個核苷酸。於特定實施方式中，整個tracrRNA包括60個核苷酸至多於210個核苷酸。舉例而言，該tracrRNA之長度可為約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210或更多個核苷酸。於特定實施方式中，該tracrRNA之長度為60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、150、160、170、180、190、200、210或更多個核苷酸。於特定實施方式中，tracrRNA之長度為約100至約210個核苷酸，其包含約95、約96、約97、約98、約99、約100、約105、約106、約107、約108、約109及約100個核苷酸。於特定實施方式中，tracrRNA之長度為100至110個核苷酸，其包含95、96、97、98、99、100、105、106、107、108、109、及110個核苷酸。
導引RNA與RNA導引之DNA結合多肽或RNA導引之核酸酶形成複合物，以將RNA導引之核酸酶導向至與標的序列結合。如果導引RNA與RGN複合，則所結合之RGN在標的序列處引入單股或雙股斷裂。在標的序列已被剪切後，斷裂可以被修復，藉以使得標的序列的DNA序列在修復過程期間被修飾。本文提供了使用（被聯結至脫胺酶的、是滅活性核酸酶或切口酶的）RNA導引之核酸酶的突變型變異體修飾宿主細胞的DNA中的標的序列的方法。核酸酶活性被滅或被顯著降低的RNA導引之核酸酶的突變型變異體可被稱為RNA導引之DNA結合多肽，因為該多肽能夠結合至而不一定剪切標的序列。只能剪切雙股核酸分子的單股的RNA導引之核酸酶在本文中被稱為切口酶。
標的核苷酸序列藉由RNA導引之DNA結合多肽結合，並與與RGDBP關聯之導引RNA雜合。如果RGDBP擁有核酸酶活性（亦即，為RGN）（涵蓋為切口酶的活性），則標的序列隨後可被剪切。
導引RNA可為單導引RNA或雙導引RNA系統。單導引RNA包括單RNA分子上之crRNA及視情況而定的tracrRNA，而雙導引RNA系統包括存在於二個相異RNA分子上之crRNA及tracrRNA，其透過crRNA之CRISPR重複序列的至少一部位及tracrRNA的至少一部位而彼此雜合，其可與crRNA的CRISPR重複序列完全地或局部地互補。於其中導引RNA為單導引RNA的那些實施方式中之一些實施方式中，crRNA與視情況而定的tracrRNA藉由聯結子核苷酸序列被分開。
一般來說，為避免二次結構於聯結子核苷酸序列的核苷酸內之形成或避免包括聯結子核苷酸序列之核苷酸之二次結構之形成，聯結子核苷酸序列為不包含互補鹼基之核苷酸序列。於一些實施方式中，crRNA與tracrRNA之間之聯結子核苷酸序列之長度為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12個、或更多個核苷酸。於特定實施方式中，crRNA與tracrRNA之間之聯結子核苷酸序列之長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、或更多個核苷酸。於特定實施方式中，單導引RNA之聯結子核苷酸序列之長度為至少4個核苷酸。於特定實施方式中，單導引RNA之聯結子核苷酸序列之長度為4個核苷酸。
於某些實施方式中，導引RNA可為RNA分子而被引入標的細胞、胞器或胚胎中。導引RNA可以在體外被轉錄或被化學合成。於一些實施方式中，將編碼該導引RNA之核苷酸序列引入細胞、胞器或胚胎中。於一些實施方式中，編碼導引RNA之核苷酸序列可操作地被聯結至啟動子（比如，RNA聚合酶III啟動子）。該啟動子可為天然啟動子或與導引RNA編碼的核苷酸序列異源。
於各種實施方式中，如本文所述，導引RNA可為核糖核蛋白複合物而被引入標的細胞、胞器或胚胎中，其中導引RNA與RNA導引之核酸酶多肽結合。
導引RNA透過導引RNA與標的核苷酸序列之雜合而將關聯RNA導引之核酸酶導向至所關注之特定標的核苷酸序列。標的核苷酸序列可包括DNA、RNA或二者之組合，且可為單股或雙股的。標的核苷酸序列可為基因組DNA（亦即，染色體DNA）、質體DNA、或RNA分子（比如，信使RNA、核醣體RNA、轉移RNA、微RNA、小干擾RNA）。標的核苷酸序列可在體外或在細胞中藉由RNA導引之DNA結合多肽被結合（而於一些實施方式中，被剪切）。藉由RGDBP靶向之染色體序列可為核、質體或粒線體染色體序列。於一些實施方式中，標的核苷酸序列於標的基因組中為唯一的。
於一些實施方式中，標的核苷酸序列與原型間隔體相鄰模體（protospacer adjacent motif）（PAM）相鄰。PAM一般而言在距標的核苷酸序列約1至約10個核苷酸內，包含距標的核苷酸序列約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、或約10個核苷酸。於特定實施方式中，PAM在距標的核苷酸序列1至10個核苷酸內，包含距標的核苷酸序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。PAM可為標的序列之5'或3'。於一些實施方式中，PAM為標的序列之3'。一般而言，PAM是約2-6個核苷酸之共有序列，但於特定實施方式中，PAM之長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多個核苷酸。
PAM限制給定的RGDBP或RGN可靶向哪些序列，因為其PAM需要靠近標的核苷酸序列。在辨識其對應的PAM序列時，RGN可在專一性剪切位點剪切該標的核苷酸序列。如本文所使用的，剪切位點是由標的核苷酸序列內之二個特定核苷酸組成，其之間之核苷酸序列藉由RGN剪切。剪切位點可包括在5'或3'方向上自PAM起之第1和第2、第2和第3、第3和第4、第4和第5、第5和第6、第7和第8、或第8和第9個核苷酸。於一些實施方式中，因為RGN可剪切標的核苷酸序列，導致交錯的末側，所以，於一些實施方式中，基於多核苷酸的正（+）股上的二個核苷酸離開PAM的距離及該多核苷酸的負（-）股上的二個核苷酸離開該PAM的距離來界定該剪切位點。
RGDBP及RGN可被用於將融合多肽、多核苷酸或小分子載荷(payload)遞送至特定基因組位址。
在其中DNA結合多肽包括大範圍核酸酶的那些實施方式中，標的序列可包括藉由四個鹼基對分開的一對反向9鹼基對“半位點”。在單鏈大範圍核酸酶的情況中，蛋白質的N端域接觸第一半位點，及蛋白質的C端域接觸第二半位點。藉由大範圍核酸酶的剪切產生四個鹼基對3'突出部。於其中DNA結合多肽包括緻密(compact)TALEN的那些實施方式中，辨識序列包括藉由I-TevI域辨識的第一CNNNGN序列、其後為長度為非專一性間隔體4-16鹼基對、其後為藉由TAL效應子域（此序列通常情況下具有5' T鹼基）辨識的長度為16-22 bp的第二序列。於其中DNA結合多肽包括鋅指的那些實施方式中，DNA結合域通常情況下辨識包括藉由2-10個鹼基對分開的一對九個鹼基對“半位點”之18-bp辨識序列，且藉由核酸酶的剪切創建可變長度（往往四個鹼基對）的鈍末側或5'突出部。 IV. 融合蛋白
於一些實施方式中，DNA結合多肽（比如，滅核酸酶活性或切口酶RGN）可操作地被聯結至本發明的脫胺酶。於一些實施方式中，與本發明的脫胺酶融合的DNA結合多肽（比如，滅核酸酶活性RGN或切口酶RGN）可被靶向至核酸分子（亦即，標的核酸分子）的特定位址（於一些實施方式中，其為特定基因組位址），以改變期望序列之表現。於一些實施方式中，融合蛋白與標的序列的結合導致核鹼基脫去胺基，導致從一種核鹼基轉變為另一種核鹼基。於一些實施方式中，此融合蛋白與標的序列的結合導致與標的序列相鄰的核鹼基脫去胺基。使用目前揭露的組成物及方法被脫去胺基且被突變的與標的序列相鄰的核鹼基可為來自標的核酸分子內的標的序列（藉由gRNA結合的）的5'或3'末側的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100個鹼基對。此揭露的一些態樣提供融合蛋白，該融合蛋白包括：（i）DNA結合多肽（比如，滅核酸酶活性或切口酶RGN多肽）；（ii）脫胺酶多肽；及視情況而定的（iii）第二脫胺酶。第二脫胺酶可為與第一脫胺酶相同的脫胺酶，或可為不同脫胺酶。於一些實施方式中，第一及第二脫胺酶二者是本發明的腺嘌呤脫胺酶。
本揭露提供各種組態的融合蛋白。於一些實施方式中，脫胺酶多肽與DNA結合多肽（比如，RGN多肽）的N端融合。於一些實施方式中，脫胺酶多肽與DNA結合多肽（比如，RGN多肽）的C端融合。
於一些實施方式中，脫胺酶與DNA結合多肽（比如，RNA導引之DNA結合多肽）經由胜肽聯結子彼此被融合。脫胺酶與DNA結合多肽（比如，RNA導引之DNA結合多肽）之間的聯結子可確定融合蛋白的編輯窗，從而增加脫胺酶專一性及減少脫靶突變。各種聯結子長度及靈活性可被採用，範圍自形式(GGGGS) n 及(G) n的非常靈活聯結子至形式(EAAAK) n 及(XP) n 的較剛性聯結子，以對專一性應用的脫胺酶活性實現最佳長度及剛性。如本文所使用的，術語「聯結子」指聯結二個分子或部分（比如，核酸酶之結合域及剪切域）的化學基團或分子。於一些實施方式中，聯結子連結RNA導引之核酸酶與脫胺酶。於一些實施方式中，聯結子連結無活性或滅活性的RGN與脫胺酶。於進一步實施方式中，聯結子連結二個脫胺酶。通常情況下，聯結子位於二個基團、分子或其他部分之間或在二個基團、分子或其他部分側邊，且經由共價鍵而被連接到每一者，由此連接該二者。於一些實施方式中，聯結子為胺基酸或複數胺基酸（比如，胜肽或蛋白質）。於一些實施方式中，聯結子為有機分子、基團、聚合物或化學部分。於一些實施方式中，聯結子之長度為3-100個胺基酸，舉例而言，長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、或150-200個胺基酸。亦考量了更長或更短的聯結子。於一些實施方式中，較佳地，較短的聯結子降低融合蛋白或其寫碼序列的總尺寸或長度。
於一些實施方式中，聯結子包括(GGGGS) n 、(G) n an (EAAAK) n 、或(XP) n 模體或此等中任一者之組合，其中n獨立地為1與30之間的整數。於一些實施方式中， n獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30或其任意組合（如果存在多於一個聯結子或多於一個聯結子模體）。額外適合的聯結子模體及聯結子組態對於本領域中的通常知識者是明顯的。於一些實施方式中，適合的聯結子模體及組態包含Chen等人, 2013（Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-69，其全部內容藉由引用而被併入本文）描述的聯結子模體及組態。額外適合的聯結子序列對於本領域中的通常知識者是明顯的。於一些實施方式中，聯結子序列包括如SEQ ID NO: 45或442所示的胺基酸序列。
於一些實施方式中，本文提供的範例性融合蛋白的一般構型包括結構：[NH 2]-[脫胺酶]-[DBP]-[COOH]；[NH 2]-[DBP]-[脫胺酶]-[COOH]；[NH 2]-[DBP]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[COOH]；[NH 2]-[脫胺酶]-[DBP]-[脫胺酶]-[COOH]；或[NH 2]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[DBP]-[COOH]，其中DBP為DNA結合多肽，NH 2為融合蛋白的N端，及COOH為融合蛋白的C端。於一些實施方式中，融合蛋白包括多於二個脫胺酶多肽。
於某些實施方式中，本文提供的範例性融合蛋白的一般構型包括結構：[NH 2]-[脫胺酶]-[RGN]-[COOH]；[NH 2]-[RGN]-[脫胺酶]-[COOH]；[NH 2]-[RGN]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[COOH]；[NH 2]-[脫胺酶]-[RGN]-[脫胺酶]-[COOH]；或[NH 2]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[RGN]-[COOH]，其中NH 2為融合蛋白的N端，及COOH為融合蛋白的C端。於一些實施方式中，融合蛋白包括多於二個脫胺酶多肽。
於一些實施方式中，融合蛋白包括結構：[NH 2]-[脫胺酶]-[滅核酸酶活性RGN]-[COOH]；[NH 2]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[滅核酸酶活性RGN]-[COOH]；[NH 2]-[滅核酸酶活性RGN]-[脫胺酶]-[COOH]；[NH 2]-[脫胺酶]-[滅核酸酶活性RGN]-[脫胺酶]-[COOH]；或[NH 2]-[滅核酸酶活性RGN]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[COOH]。應該明白，“滅核酸酶活性RGN”代表包含任意CRISPR-Cas蛋白的任意RGN，其已突變為滅核酸酶活性的。於一些實施方式中，融合蛋白包括多於二個脫胺酶多肽。
於一些實施方式中，融合蛋白包括結構：[NH 2]-[脫胺酶]-[RGN 切口酶]-[COOH]; [NH 2]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[RGN 切口酶]-[COOH]；[NH 2]-[RGN 切口酶]-[脫胺酶]-[COOH]; [NH 2]-[脫胺酶]-[RGN切口酶]-[脫胺酶]-[COOH]；或[NH 2]-[RGN切口酶]-[脫胺酶]-[脫胺酶]-[COOH]。應該明白，“RGN切口酶”代表包含任意CRISPR-Cas蛋白的任意RGN，其已突變為活性的而作為切口酶。
於一些實施方式中，上述一般構型中使用的“-”指示可選聯結子序列的存在。於一些實施方式中，本文提供的融合蛋白不包括聯結子序列。於一些實施方式中，存在至少一個可選聯結子序列。
可存在的其他範例性特徵為定位序列（諸如，核定位序列、細胞質定位序列）、輸出序列（諸如，核輸出序列）、或其他定位序列以及有用於融合蛋白的溶解、純化或偵測的序列示跡物。本文提供的適合的定位訊號序列及蛋白序列示跡物包含但不限於：生物素羧基載物蛋白（biotin carboxylase carrier protein, BCCP）示跡物、myc示跡物、鈣調蛋白示跡物、FLAG示跡物、血球凝集素(HA)示跡物、聚組胺酸示跡物（亦被稱為組胺酸示跡物或His示跡物）、麥芽糖結合蛋白（MBP）示跡物、nus示跡物、麩胱甘肽-S-轉移酶（GST）示跡物、綠色螢光蛋白（GFP）示跡物、硫醇氧化還原蛋白示跡物、S示跡物、Softag（比如，Softag 1、Softag 3）、streptag、生物素接合酶示跡物、FlAsH示跡物、V5示跡物、及SBP示跡物。額外的適合的序列對於本領域中的通常知識者是清楚的。
於某些實施方式中，目前揭露之融合蛋白包括促進融合蛋白之細胞攝取的至少一個細胞穿透域。細胞穿透域為本領域中已知的且一般而言包括：數段帶正電荷的胺基酸殘基（亦即，聚陽離子細胞穿透域）、交替極性的胺基酸殘基及非極性胺基酸殘基（亦即，兩親性細胞穿透域）、或疏水性胺基酸殘基（亦即，疏水性細胞穿透域）（ 參見， 比如，Milletti F.（2012）Drug Discov Today 17：850-860）。細胞穿透域之非限制性實例為來自人免疫缺陷病毒1的反式活化轉錄活化子（TAT）。
於一些實施方式中，本文提供的脫胺酶或融合蛋白進一步包括核定位序列（NLS）。核定位訊號、質體定位訊號、粒線體定位訊號、雙靶向定位訊號、及/或細胞穿透域可被安置於融合蛋白之胺基端（N端）、羧基端（C端）、或內部位址中。
於一些實施方式中， NLS與融合蛋白或脫胺酶的N端融合。於一些實施方式中， NLS與融合蛋白或脫胺酶的C端融合。於一些實施方式中，NLS與融合蛋白的脫胺酶的N端融合。於一些實施方式中，NLS被與融合蛋白的脫胺酶的C端融合。於一些實施方式中，NLS被與融合蛋白的DNA結合多肽（比如，RGN多肽）的N端融合。於一些實施方式中，NLS被與融合蛋白的DNA結合多肽（比如，RGN多肽）的C端融合。於一些實施方式中，NLS被與融合蛋白的脫胺酶多肽的N端融合。於一些實施方式中，NLS被與融合蛋白的脫胺酶多肽的C端融合。於一些實施方式中，NLS經由一或多個聯結子被與融合蛋白融合。於一些實施方式中，NLS不經由聯結子被與融合蛋白融合。於一些實施方式中，NLS包括本文提供的或引用的NLS序列中任一者的胺基酸序列。於一些實施方式中，NLS包括如SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列。於一些實施方式中，融合蛋白或脫胺酶於其N端上包括SEQ ID NO: 43及於其C端上包括SEQ ID NO: 46。
於一些實施方式中，如本文提供的融合蛋白包括脫胺酶的全長序列，比如，SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者。然而，於一些實施方式中，如本文提供的融合蛋白不包括脫胺酶的全長序列，而僅包括其片段。舉例而言，於一些實施方式中，本文提供的融合蛋白進一步包括DNA結合多肽（比如，RNA導引之DNA結合）域及脫胺酶域。
於一些實施方式中，本發明的融合蛋白包括DNA結合多肽（比如，RGN）及脫胺酶，其中脫胺酶具有與SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%一致性的胺基酸序列。此種融合蛋白的實例被描述於本文的實例小節中。
於一些實施方式中，融合蛋白包括一個脫胺酶多肽。於一些實施方式中，融合蛋白包括間接地或經由胜肽聯結子可操作地聯結的至少二個脫胺酶多肽。於一些實施方式中，融合蛋白包括一個脫胺酶多肽, 且第二脫胺酶多肽與融合蛋白共表現。
本文還提供了核糖核蛋白複合物，該核糖核蛋白複合物包括融合蛋白（包括脫胺酶及RGDBP）及導引RNA（為單導引或為雙導引RNA）（亦被統稱為gRNA）。 V. 編碼脫胺酶、融合蛋白及 / 或 gRNA 的核苷酸
本揭露提供編碼目前揭露的脫胺酶多肽的多核苷酸（SEQ ID NO: 11-20及443-485）。本揭露進一步提供編碼融合蛋白的多核苷酸，其包括脫胺酶及DNA結合多肽（舉例而言，大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或TALEN）。本揭露進一步提供編碼融合蛋白的多核苷酸，其包括脫胺酶域及RNA導引之DNA結合多肽。此種RNA導引之DNA結合多肽可為RGN或RGN變異體。蛋白質變異體可為滅核酸酶活性的或為切口酶。RGN可為CRISPR-Cas蛋白或其活性變異體或片段。SEQ ID NO: 41及42分別為RGN及切口酶RGN變異體的非限制性實例。CRISPR-Cas核酸酶的實例為本領域中所習知，且類似的對應突變可創建亦為切口酶或為滅核酸酶活性的突變型變異體。
本發明的實施方式提供一種編碼融合蛋白的多核苷酸，該融合蛋白包括RGDBP及本文描述的脫胺酶（SEQ ID NO: 1-10及399-441，或其變異體）。於一些實施方式中，第二多核苷酸編碼為靶向至所關注之核苷酸序列而藉由RGDBP要求的導引RNA。於一些實施方式中，導引RNA及融合蛋白藉由相同多核苷酸被編碼。
術語「多核苷酸」的使用不旨在將本揭露內容局限於包括DNA之多核苷酸，但可考量此種DNA多核苷酸。本領域中具有通常知識者將認識到多核苷酸可包括核糖核苷酸（RNA）及核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸之組合。此種去氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包含天然存在的分子及合成類似物二者。本文所揭露之多核苷酸亦涵蓋所有形式的序列，包含但不限於單股形式、雙股形式、莖環結構、環狀形式（比如，包含環狀RNA）、等等。
本發明的實施方式為包括與SEQ ID NO: 11-20及443-485中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的序列的核酸分子，其中核酸分子編碼具有腺嘌呤脫胺酶活性的脫胺酶。核酸分子可進一步包括異源啟動子或終止子。核酸分子可編碼融合蛋白及視情況而定的第二脫胺酶，其中經編碼的脫胺酶被可操作地聯結至DNA結合多肽。於一些實施方式中，核酸分子編碼融合蛋白，其中經編碼的脫胺酶可操作地聯結至RGN及視情況而定的第二脫胺酶。
於一些實施方式中，包括編碼本發明的脫胺酶的多核苷酸之核酸分子可針對於所關注之生物體中之表現而被密碼子最佳化。“密碼子最佳化的”寫碼序列為使其密碼子使用頻率設計成模擬較佳密碼子使用頻率或特定宿主細胞之轉錄條件的多核苷酸寫碼序列。由於核酸層次上的一或多個密碼子的改變使得轉譯的胺基酸序列未被改變，所以特定宿主細胞或生物體中之表現被增強。核酸分子可以全部或局部地被密碼子最佳化。密碼子表和提供一大範圍生物體之偏好資訊的其他參考文獻在本領域中是可得的（ 參見， 比如，Campbell及Gowri（1990） Plant Physiol. 92：1-11，有關植物較佳密碼子使用之討論）。本領域中用於合成植物較佳基因的方法是可得的。參見，舉例而言，第5,380,831號和第5,436,391號美國專利及Murray等人（1989） Nucleic Acids Res. 17：477-498，彼等藉由引用而被併入本文。
於一些實施方式中，編碼本文描述之脫胺酶、融合蛋白、及/或gRNA的多核苷酸可在表現卡匣中被提供，以用於在體外表現或在所關注之細胞、胞器、胚胎或生物體中表現。卡匣可包含5'和3'調節序列，該5'和3'調節序列可操作地聯結至編碼本文提供之允許多核苷酸表現之脫胺酶及/或融合蛋白（包括脫胺酶、RNA導引之DNA結合多肽和視情況而定的第二脫胺酶、及/或gRNA）的多核苷酸。卡匣可額外含有至少一種額外基因或基因元素，以共轉化至生物體內。倘若包含額外基因或元素，則該組成被可操作地聯結。術語“可操作地聯結”旨在表達二或多個元素之間之功能性聯結。舉例而言，啟動子與所關注之寫碼區域（比如，對脫胺酶、RNA導引之DNA結合多肽、及/或gRNA寫碼之區域）之間之可操作地聯結為允許所關注之寫碼區域表現之功能性聯結。可操作地聯結之元素可為連續的或非連續的。當用於指二個蛋白質寫碼區域的連結時，藉由可操作地聯結意指該寫碼區域在相同之閱讀框（reading frame）中。於一些實施方式中，額外的（多個）基因或（多個）元素被提供於多個表現卡匣上。舉例而言，單獨地或作為融合蛋白的組成來編碼目前揭露之脫胺酶的核苷酸序列可存在於一個表現卡匣上，而編碼gRNA之核苷酸序列可在各別表現卡匣上。另一個實例可具有在第一表現卡匣上單獨地編碼目前揭露之脫胺酶的核苷酸序列、編碼包括脫胺酶的融合蛋白的第二表現卡匣、及在第三表現卡匣上編碼gRNA的核苷酸序列。此種表現卡匣被提供有複數個限制性位點及/或重組位點，以使多核苷酸的插入受調節區域的轉錄調節。亦可存在包括選擇性標記基因的表現卡匣。
表現卡匣於5'-3'轉錄方向上可包含：轉錄（而於一些實施方式中，轉譯）起始區域（亦即，啟動子）、本發明之脫胺酶編碼多核苷酸、及於所關注之生物體中起作用的轉錄（而於一些實施方式中，轉譯）終止區域（亦即，終止區域）。本發明之啟動子能夠在宿主細胞中導向或驅動寫碼序列之表現。該調節區域（例如，啟動子、轉錄調節區域、及轉譯終止區域）可與宿主細胞或彼此為內源的或異源的。如本文所使用的，關於序列的“異源”為源自外來物種的序列，或者，如果來自相同物種，則為藉由蓄意的人為干預從其在組成物及/或基因組基因座中的天然形式實質上被修飾的序列。如本文中所使用的，嵌合基因包括與轉錄起始區域可操作地聯結的寫碼序列，該轉錄起始區域與寫碼序列是異源的。
合宜的終止區域可從 根癌農桿菌（ A. tumefaciens）的Ti質體獲得，諸如，章魚肉鹼（octopine）合成酶及胭脂鹼（nopaline）合成酶終止區域。亦參見Guerineau等人（1991） Mol. Gen. Genet. 262：141-144；Proudfoot（1991） Cell64：671-674；Sanfacon等人（1991） Genes Dev. 5：141-149；Mogen等人（1990） Plant Cell2：1261-1272；Munroe等人（1990） Gene91：151-158；Ballas等人（1989） Nucleic Acids Res. 17：7891-7903；及Joshi等人（1987） Nucleic Acids Res. 15：9627-9639。
額外調節訊號包含但不限於：轉錄起始初始位點（transcriptional initiation start site）、操作子、活化子、增強子、其他調節元素、核醣體結合位點、起始密碼子、終止訊號等等。參見，舉例而言， 第5,039,523號和第4,853,331號美國專利；EPO 0480762A2；Sambrook等人（1992），Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ed. Maniatis等人（冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）），後稱“Sambrook 11”；Davis等人eds.（1980）Advanced Bacterial Genetics（冷泉港實驗室出版社），冷泉港，紐約，以及其中引用的參考文獻。
在製備表現卡匣時，可操縱各種DNA片段，以便在適宜的取向上及恰當的情況下於適宜閱讀框中對DNA序列進行提供。為此，可以運用轉接子或聯結子來連結DNA片段，或者可涉及其他操縱以對合宜的限制位點、除去多餘的DNA、除去限制位點等進行提供。為此目的，可涉及體外誘變、引子修復、限制、黏合（annealing）、重新置換，比如，轉換和顛換（transversion）。
很多啟動子可用於本發明之實施。可基於期望結局來選擇啟動子。核酸可與構成型、誘導型、生長階段專一性、細胞類型專一性、組織較佳、組織專一性之啟動子或其他啟動子組合，用於所關注之生物體中之表現。參見，舉例而言， WO 99/43838中及第8,575,425號；第7,790,846號；第8,147,856號；第8,586832號；第7,772,369號；第7,534,939號；第6,072,050號；第5,659,026號；第5,608,149號；第5,608,144號；第5,604,121號；第5,569,597號；第5,466,785號；第5,399,680號；第5,268,463號；第5,608,142號；以及第6,177,611號美國專利中所示之啟動子；彼等藉由引用併入本文。
對於在植物中之表現，構成型啟動子亦包含CaMV 35S啟動子（Odell等人（1985） Nature313：810-812）；稻穀肌動蛋白（rice actin）（McElroy等人（1990） Plant Cell2：163-171）；泛素（Christensen等人（1989） Plant Mol. Biol. 12：619-632及Christensen等人（1992） Plant Mol. Biol. 18：675-689）；pEMU（Last等人（1991） Theor. Appl. Genet. 81：581-588）；及MAS（Velten等人（1984） EMBO J. 3：2723-2730）。
誘導型啟動子之實例為：可藉由缺氧或寒逆境誘導的Adh1啟動子、可藉由熱逆境誘導的Hsp70啟動子、可由光誘導的PPDK啟動子及PEP羧化酶（pepcarboxylase）啟動子。同樣有用的為化學誘導之啟動子，諸如，安全劑誘導的In2-2啟動子（第5,364,780號美國專利）、生長素誘導的且是絨氈層專一性的但在癒合組織中亦有活性的Axig1啟動子（PCT US01/22169）、類固醇反應性啟動子（參見，舉例而言，Schena等人（1991） Proc. Natl. Acad. Sci. USA88：10421-10425及McNellis等人（1998） Plant J. 14(2)：247-257中的雌激素誘導的ERE啟動子和糖皮質激素誘導型啟動子）、及四環素誘導型和四環素阻抑型啟動子（參見，舉例而言，Gatz等人（1991） Mol. Gen. Genet. 227：229-237及第5,814,618號和第5,789,156號美國專利），彼等藉由引用併入本文。
於一些實施方式中，可採用組織專一性或組織較佳之啟動子來靶向特定組織內的表現構築體的表現。於某些實施方式中，組織專一性或組織較佳之啟動子在植物組織中是有活性的。在植物中受發育控制之啟動子之實例包含在諸如葉、根、果實、種子或花的某些組織中較佳地起動轉錄之啟動子。“組織專一性”啟動子為僅在某些組織中起動轉錄之啟動子。與基因的構成型表現不同，組織專一性表現是幾種水準的基因調節相互作用的結果。因此，來自同源或密切相關的植物物種之啟動子可較佳地用於在特定組織中實現轉殖基因的有效且可靠的表現。於一些實施方式中，表現包括組織較佳之啟動子。“組織較佳之”啟動子是較佳地在，但不一定完全在或僅在某些組織中起動轉錄之啟動子。
於一些實施方式中，編碼本文描述之脫胺酶的核酸分子包括細胞類型專一性啟動子。“細胞類型專一性”啟動子為主要在一或多個器官的某些細胞類型中驅動表現之啟動子。舉例而言，其中在植物中起作用的細胞類型專一性啟動子可為主要活性之植物細胞的一些實例包含BETL細胞、根、葉中的維管細胞、柄細胞、及幹細胞(stem cell)。核酸分子還可包含細胞類型較佳之啟動子。“細胞類型較佳之”啟動子為主要驅動大部分在，但不一定完全在或僅在一或多個器官中的某些細胞類型中的表現之啟動子。舉例而言，其中在植物中起作用的細胞類型較佳之啟動子可具較佳活性之植物細胞的一些實例包含BETL細胞、根、葉中的維管細胞、柄細胞、及幹細胞。
於一些實施方式中，編碼脫胺酶、融合蛋白、及/或gRNA的核酸序列可與舉例而言藉由用於體外mRNA合成之噬菌體RNA聚合酶辨識之啟動子序列可操作地聯結。於此類實施方式中，體外轉錄的RNA可被純化，以用於本文描述之方法。舉例而言，啟動子序列可為T7、T3或SP6啟動子序列，或T7、T3或SP6啟動子序列的變異體。於此類實施方式中，所表現之蛋白及/或RNA可被純化，以用於本文描述之基因組修飾方法。
於某些實施方式中，編碼脫胺酶、融合蛋白、及/或gRNA的多核苷酸可與多腺苷酸化訊號（例如，SV40 polyA訊號及植物中起作用的其他訊號）及/或至少一個轉錄終止序列聯結。於一些實施方式中，編碼脫胺酶或融合蛋白的序列可與編碼至少一個核定位訊號、至少一個細胞穿透域及/或能夠將蛋白質運輸到特定亞細胞位址的至少一個訊號胜肽的（多個）序列聯結，如本文中別處所描述的。
於一些實施方式中，編碼脫胺酶、融合蛋白、及/或gRNA的多核苷酸可存在於載體或多個載體中。“載體”指用於將核酸轉移、遞送或引入宿主細胞內的多核苷酸組成物。適合的載體包含質體載體、噬菌粒、黏接質體（cosmids）、人工/微型染色體、轉位子、及病毒載體（比如，慢病毒載體、腺關聯性病毒載體、杆狀病毒載體）。於一些實施方式中，載體包括額外的表現控制序列（比如，增強子序列、Kozak序列、多腺苷酸化序列、轉錄終止序列）、選擇性標記序列（比如，抗生素抗性基因）、複製起點等等。額外資訊可在“Current Protocols in Molecular Biology”Ausubel等人、John Wiley & Sons，紐約，2003；或“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”Sambrook & Russell，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd edition, 2001中找到。
於一些實施方式中，載體包括用於經轉化之細胞之選擇的選擇性標記基因。對於經轉化之細胞或組織之選擇採用選擇性標記基因。標記基因包含：編碼抗生素抗性的基因，諸如，編碼新黴素磷酸轉移酶II（NEO）和潮黴素磷酸轉移酶（HPT）的基因；以及對諸如草銨膦(glufosinate ammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮及2,4-二氯苯氧乙酸鹽（2,4-d）的除草性化合物賦予抗性的基因。
於一些實施方式中，包括編碼包括諸如RGN的RNA導引之DNA結合多肽的融合蛋白之序列的表現卡匣或載體進一步包括編碼gRNA之序列。於一些實施方式中，編碼gRNA的（多個）序列與至少一個轉錄控制序列可操作地聯結，用於gRNA於所關注之生物體或宿主細胞中之表現。舉例而言，編碼gRNA之多核苷酸可與藉由RNA聚合酶III（Pol III）辨識之啟動子序列可操作地聯結。適合的Pol III啟動子之實例包含但不限於哺乳動物U6、U3、H1及7SL RNA啟動子及稻穀U6及U3啟動子。
如所指示的，包括編碼脫胺酶、融合蛋白、及/或gRNA的核苷酸序列的表現構築體可用於轉化所關注之生物體。用於轉化之方法涉及將核苷酸構築體引入所關注之生物體內。藉由“引入”旨在將核苷酸構築體引至宿主細胞，藉此使得構築體進入宿主細胞內部。本發明之方法不需要一種將核苷酸構築體引至宿主生物體之特定方法，但核苷酸構築體進入宿主生物體之至少一個細胞內部。宿主細胞可為真核細胞或原核細胞。於特定實施方式中，真核宿主細胞為植物細胞、哺乳動物細胞、或昆蟲細胞。用於將核苷酸構築體引入植物及其他宿主細胞內之方法為本領域中已知，其包含但不限於：穩定轉化方法、瞬時轉化方法及病毒介導方法。
此等方法得到經轉化之生物體，諸如植物，包含：整株植物以及植物器官（比如，葉、莖、根等）、種子、植物細胞、繁殖體、胚胎及其後代。植物細胞可被分化，亦可不被分化（比如，癒合組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉）。
“基因轉殖生物體”或“經轉化之生物體”或“穩定轉化的”生物體或細胞或組織指已併入或整合了編碼本發明之脫胺酶的多核苷酸的生物體。應該認識到，其他外源或內源核酸序列或DNA片段亦可被併入宿主細胞內。 農桿菌及基因槍介導的轉化仍然為用於植物細胞轉化而主要運用的二種措施。然而，宿主細胞之轉化可藉由感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微投影（microprojection）、基因槍或粒子轟擊、電穿孔、二氧化矽/碳纖維、超音波介導的、PEG介導的、磷酸鈣共沉澱、聚陽離子DMSO技術、DEAE葡聚醣（dextran）程序、及病毒介導的、脂質體介導的等等實行。編碼脫胺酶、融合蛋白、及/或gRNA的多核苷酸的病毒介導的引入包含反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、及腺關聯病毒介導的引入及表現，以及花椰菜花葉病毒組(Caulimovirus)（比如，花椰菜嵌紋病毒（cauliflower mosaic virus））、雙生病毒（比如，豆科金黃化嵌紋病毒（bean golden yellow mosaic virus）或玉米斑紋病毒（maize streak virus））、及RNA植物病毒（比如，煙草嵌紋病毒）的使用。
轉化操作流程以及用於將多肽或多核苷酸序列引入植物內的操作流程可隨針對轉化所靶向的宿主細胞的類型（例如，單子葉植物或雙子葉植物細胞）而不同。用於轉化的方法為本領域中已知，且包含第8,575,425號、第7,692,068號、第8,802,934號、第7,541,517號美國專利中闡述的那些方法，此等專利中之每一者都藉由引用併入本文。亦參見Rakoczy-Trojanowska, M.（2002） Cell Mol Biol Lett. 7：849-858；Jones等人（2005） Plant Methods1：5；Rivera等人（2012） Physics of Life Reviews9：308-345；Bartlett等人（2008） Plant Methods4：1-12；Bates, G.W.（1999） Methods in Molecular Biology111：359-366；Binns及Thomashow（1988）， Microbiology42：575-606中之 Annual Reviews；Christou, P.（1992） The Plant Journal2：275-281；Christou, P.（1995） Euphytica85：13-27；Tzfira等人（2004） TRENDS in Genetics20：375-383；Yao等人（2006） Journal of Experimental Botany57:3737-3746；Zupan和Zambryski（1995） Plant Physiology107：1041-1047；Jones等人（2005） Plant Methods1：5。
轉化可導致核酸穩定或瞬時併入細胞內。“穩定轉化”旨在表達引入宿主細胞內的核苷酸構築體整合至該宿主細胞之基因組內，且能夠被其後代遺傳。“瞬時轉化”旨在表達多核苷酸被引入宿主細胞內而不整合至宿主細胞之基因組內。
用於葉綠體轉化之方法為本領域中已知。參見，舉例而言，Svab等人（1990） Proc. Nail. Acad. Sci. USA87：8526-8530；Svab及Maliga (1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA90：913-917；Svab及Maliga（1993） EMBO J. 12：601-606。該方法取決於含有選擇性標記的DNA的粒子槍遞送及透過同源重組將該DNA靶向至該質體基因組。另外，質體轉化可藉由核編碼的及質體導向的RNA聚合酶的組織較佳表現來轉錄活化（transactivation）緘默質體攜帶的轉殖基因來完成。McBride等人（1994）在 Proc. Natl. Acad. Sci. USA91：7301-7305已報導了此系統。
已經被轉化的細胞可按照傳統方式生長成基因轉殖生物體，諸如，植物。參見，舉例而言，McCormick等人（1986） Plant Cell Reports5：81-84。然後，可以使此等植物生長，且用相同轉化品系（transformed strain）或不同品系授粉，且辨別出具有脫胺酶或融合蛋白多核苷酸的所得雜合體。可生長二代或多代，以確保穩定維持並遺傳脫胺酶或融合蛋白多核苷酸，且收穫種子，以確保脫胺酶或融合蛋白多核苷酸的存在。以此方式，本發明提供具有穩定地併入其基因組內的本發明之核苷酸構築體（舉例而言，本發明之表現卡匣）的經轉化之種子（亦稱為“基因轉殖種子”）。
於一些實施方式中，可將已經轉化之細胞引入生物體內。此等細胞可源自生物體，其中細胞以離體措施被轉化。
本文提供之序列可用於任何植物物種之轉化，包含但不限於單子葉植物及雙子葉植物。所關注之植物之實例包括但不限於：玉蜀黍（玉米）、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、稻穀、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、及油菜、芸苔屬物種(Brassica sp.)、苜蓿、黑麥、小米、紅花、花生、甘藷、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、木瓜、腰果、澳洲胡桃、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物以及針葉樹。
蔬菜包含但不限於：番茄、萵苣、綠豆、皇帝豆、豌豆、及諸如胡瓜（cucumber）、網紋甜瓜（cantaloupe）及洋香瓜（musk melon）之黃瓜（Curcumis）屬的成員。觀賞植物包含但不限於：杜鵑花、繡球花、芙蓉、玫瑰、鬱金香、水仙、矮牽牛、康乃馨、猩猩木、及菊花。較佳地，本發明之植物為農作物（舉例而言，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、稻穀、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等）。
如本文所使用的，術語“植物”包含：植物細胞、植物原生質體、植物可再生所自的植物細胞組織培養物、植物癒傷組織、植物塊、及在植物或植物的諸如胚胎、花粉、胚珠、種子、葉子、花、枝、果實、仁、穗、玉米穗軸、殼、莖、根、根尖、花藥等等的局部中是完整的植物細胞。穀物旨在表達出於種植或繁殖物種之外的目的而由商業種植者生產的成熟種子。再生植物的子代、變異體及突變異體包含於本發明之範圍內，前提條件是此等局部包括所引入的多核苷酸。進一步提供了保持了本文中揭露之序列的經處理的植物產品或副產物，舉例而言，包含豆粕。
於一些實施方式中，編碼脫胺酶、融合蛋白及/或gRNA的多核苷酸用於轉化任何真核物種，包含但不限於：動物（例如，哺乳動物、昆蟲、魚類、鳥類、及爬蟲類物）、真菌、變形蟲、藻類、及酵母。於一些實施方式中，編碼脫胺酶、融合蛋白及/或gRNA的多核苷酸用於轉化任何原核物種，包含但不限於：古生菌和細菌（比如， 芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、 克雷伯氏菌屬（Klebsiella spp.）、 鏈黴菌屬（Streptomyces spp.）、 根瘤菌屬（Rhizobium spp.）、 埃希氏菌屬（Escherichia spp.）、 假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、 沙門氏菌屬（Salmonella spp.）、 志賀氏桿菌屬（Shigella spp.）、 弧菌屬（Vibrio spp.）、 耶爾森菌屬（Yersinia spp.）、 支原體菌屬（Mycoplasma spp.）、 農桿菌屬（Agrobacterium）、及 乳酸乳桿菌屬（Lactobacillus spp.）。
於一些實施方式中，傳統的基於病毒和非病毒的基因轉移方法用於將核酸引入哺乳動物細胞或標的組織中。此種方法可用於將編碼本發明的脫胺酶或融合蛋白及可選地gRNA的核酸投予培養中之細胞、或宿主生物體中之細胞。非病毒載體遞送系統包含：DNA質體、RNA（比如，本文描述的載體之轉錄本）、裸核酸、及與諸如脂質體之遞送載劑複合的核酸。病毒載體遞送系統包含DNA及RNA病毒，其在遞送至細胞後具有附加型或整合的基因組。非限制性實例包含採用花椰菜花葉病毒組（比如，花椰菜嵌紋病毒（cauliflower mosaic virus））、雙生病毒（比如，豆科金黃化嵌紋病毒（bean golden yellow mosaic virus）或玉米斑紋病毒（maize streak virus））、及RNA植物病毒（比如，煙草嵌紋病毒）的載體。有關基因治療程序之綜述，參見Anderson， Science256：808- 813 (1992)；Nabel & Feigner， TIBTECH11：211-217 (1993)；Mitani & Caskey， TIBTECH11：162-166 (1993)；Dillon， TIBTECH11：167-175 (1993)；Miller， Nature357：455-460 (1992)；Van Brunt， Biotechnology6(10)：1149-1154 (1988)；Vigne， Restorative Neurology and Neuroscience8：35-36 (1995)；Kremer & Perricaudet， British Medical Bulletin51(1)：31-44 (1995)；Haddada等人，in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler及Bohm（eds）（1995）；及Yu等人， Gene Therapy1：13-26 (1994)。
核酸的非病毒遞送方法包含脂質體轉染、 農桿菌介導的轉化、核轉染、顯微注射、基因槍（biolistics）、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質：核酸共軛物、裸DNA、人工病毒粒子、及DNA的藥劑增強攝取。比如，第5,049,386號、第4,946,787號、及第4,897,355號美國專利中描述了脂質體轉染，且脂質體轉染試劑是市售的（比如，Transfectam ™及Lipofectin™）。適合用於多核苷酸之有效受體辨識脂質體轉染（receptor-recognition lipofection）之陽離子及中性脂質包含Feigner的WO 91/17424；WO 91/16024中的那些陽離子和中性脂質。遞送可為至細胞（比如，在體外或離體地投予）或標的組織（比如，活體內投予）。包含靶向的脂質體諸如免疫脂質複合物的脂質：核酸複合物的製備為本領域中具有通常知識者所熟知（參見，比如，Crystal， Science270：404-410（1995）；Blaese等人， Cancer Gene Ther. 2：291- 297（1995）；Behr等人， Bioconjugate Chem. 5：382-389（1994）；Remy等人， Bioconjugate Chem. 5：647-654（1994）；Gao等人， Gene Therapy2：710-722（1995）；Ahmad等人， Cancer Res. 52：4817-4820（1992）；第4,186,183號、第4,217,344號、第4,235,871號、第4,261,975號、第4,485,054號、第4,501,728號、第4,774,085號、第4,837,028號、及第4,946,787號美國專利）。
使用基於RNA或DNA病毒的系統來遞送核酸利用高度進化的過程將病毒靶向至體內的專一性細胞且將病毒載荷運輸至細胞核。病毒載體可被直接投予患者（活體內），或者其可用於體外處置細胞，並且可視情況將經修飾的細胞投予患者（離體）。傳統的基於病毒的系統可包含用於基因轉移之反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺關聯及單純皰疹病毒載體。用反轉錄病毒、慢病毒、及腺關聯病毒基因轉移方法，在宿主基因組中之整合是可能的，這常常導致所插入的轉殖基因的長期表現。另外，在許多不同細胞類型及標的組織中已經觀察到高轉導功效。
反轉錄病毒的向性（tropism）可藉由併入外來套膜蛋白而被改變，從而擴展標的細胞的潛在標的族群。慢病毒載體為能夠轉導或感染非分裂細胞（non-dividing cell）並且通常情況下產生高病毒力價的反轉錄病毒載體。因此，反轉錄病毒基因轉移系統的選擇將依賴於標的組織。反轉錄病毒載體由順式作用長端重複子構成，該順式作用長端重複子具達到6-10 kb外源序列的包裝能力。最小順式作用LTR足夠用於載體的複製及包裝，然後，使用其將治療基因整合至標的細胞內，以提供永久轉殖基因表現。廣泛使用的反轉錄病毒載體包含：基於鼠白血病病毒（MuLV）、長臂猿白血病病毒（GaLV）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、及其組合的載體（參見，比如，Buchscher等人， J. Viral. 66：2731-2739（1992）；Johann等人， J. Viral. 66：1635-1640（1992）；Sommnerfelt等人， Viral.176：58-59（1990）；Wilson等人， J. Viral. 63：2374-2378（1989）；Miller 等人， J. Viral. 65：2220-2224（1991）；PCT/US94/05700）。
在瞬時表現被偏好的應用中，可使用基於腺病毒的系統。基於腺病毒的載體在許多細胞類型中能夠有非常高的轉導效率，且不需要細胞分裂（cell division）。具這樣的載體，已經獲得了高力價及高表現水準。此載體可在相對簡單的系統中大量產生。腺關聯病毒（“AAV”）載體亦可比如在核酸及胜肽的體外產生中用於轉導具標的核酸之細胞，且用於活體內及離體基因治療程序（參見，比如，West 等人， Virology160：38-47（1987）； 第4,797,368號美國專利；WO 93/24641；Katin， Human Gene Therapy5：793-801（1994）；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94：1351（1994））。重組AAV載體的構築描述於很多出版物中，包含第5,173,414號美國專利；Tratschin等人， Mol. Cell. Biol. 5：3251-3260（1985）；Tratschin等人， Mol. Cell. Biol. 4：2072-2081（1984）；Hermonat & Muzyczka， PNAS81：6466-6470（1984）；及Samulski等人， J. Viral. 63：03822-3828（1989）。包裝細胞通常情況下用於形成能夠感染宿主細胞之病毒顆粒。此種細胞包含包裝腺病毒之293細胞和包裝反轉錄病毒之ψJ2細胞或PA317細胞。
基因治療中使用的病毒載體通常藉由產生將核酸載體包裝於病毒顆粒內的細胞系（cell line）而被產生。該載體通常情況下含有用於包裝且隨後整合至宿主內所需的最小病毒序列，其他病毒序列藉由用於要表現的（多個）多核苷酸的表現卡匣置換。遺失的病毒功能通常情況下藉由該包裝細胞系以反式提供。舉例而言，基因治療中使用的AAV載體通常情況下僅擁有來自包裝及整合至該宿主基因組內所需的AAV基因組的ITR序列。病毒DNA被包裝於細胞系中，該細胞系含有編碼其他AAV基因的輔佐質體（helper plasmid），即，rep和cap，但缺少ITR序列。
亦可用腺病毒作為輔佐體（helper）來感染細胞系。輔佐病毒促進AAV載體的複製及來自輔佐質體之AAV基因的表現。因於缺少ITR序列，未以顯著量包裝輔佐質體。腺病毒的污染可藉由比如熱處置（heat treatment）來降低，腺病毒對熱處置比對AAV更敏感。將核酸遞送至細胞的額外方法為本領域中具有通常知識者已知。參見，舉例而言，US20030087817，其藉由引用併入本文。
於一些實施方式中，用本文描述的一或多個載體暫時地或非暫時地轉染宿主細胞。於一些實施方式中，細胞在其天然存在於個體中時被轉染。於一些實施方式中，被轉染的細胞取自個體。
於一些實施方式中，被轉染的細胞為真核細胞。於一些實施方式中，真核細胞為動物細胞（比如，哺乳動物、昆蟲、魚類、鳥類、及爬蟲類物）。於一些實施方式中，被轉染的細胞為人細胞。於一些實施方式中，被轉染的細胞為造血源之細胞，諸如，免疫細胞（亦即，先天性或適應性免疫系統之細胞），包含但不限於：B細胞、T細胞、自然殺手（NK）細胞、多能幹細胞、經誘導之多能幹細胞、嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞、單核細胞、巨噬細胞、及樹突細胞。
於一些實施方式中，細胞取得自取自個體的細胞，諸如細胞系。於一些實施方式中，細胞或細胞系為原核的。於一些實施方式中，細胞或細胞系為真核的。於進一步實施方式中，細胞或細胞系為取得自昆蟲、禽類、植物、或真菌物種。於一些實施方式中，細胞或細胞系可為哺乳動物，舉例而言，諸如，人、猴、小鼠、牛、豬、山羊、倉鼠、大鼠、貓、或狗。用於組織培養之多種細胞系為本領域中已知。細胞系之實例包含但不限於：C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLaS3、Huhl、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC-3、TFl、CTLL-2、CIR、Rat6、CVI、RPTE、AlO、T24、182、A375、ARH-77、Calul、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388Dl、SEM-K2、WEHI- 231、HB56、TIB55、lurkat、 145.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴腎上皮細胞、BALB/3T3小鼠胚胎纖維母細胞、3T3 Swiss、3T3-Ll、132-d5人胎兒纖維母細胞；10.1小鼠纖維母細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-I細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10Tl/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-Kl、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L235010、CORL23/ R23、COS-7、COV-434、CML Tl、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepalclc7、HL-60、HMEC、HT-29、lurkat、 lY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KGl、KYOl、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-l0A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCKII、MDCKII、MOR/ 0.2R、MONO-MAC 6、MTD-lA、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞系、Peer、PNT-lA/ PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THPl細胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR、及其基因轉殖品種。細胞系可從本領域中具有通常知識者已知的多種來源獲得（參見，比如，美國典型菌種保存中心（American Type Culture Collection）（ATCC）（馬納沙斯，VA.））。
於一些實施方式中，使用用本文描述的一或多個載體轉染的細胞建立包括一或多個載體取得序列（vector-derived sequence）之新細胞系。於一些實施方式中，使用用本發明的融合蛋白及視情況而定的gRNA或用本發明的核糖核蛋白複合物暫時轉染之並透過融合蛋白或核糖核蛋白複合物的活性修飾之細胞建立包括含有修飾但缺少任何其他外源序列之細胞之新細胞系。於一些實施方式中，使用用本文描述的一或多個載體暫時或非暫時轉染的細胞或自此種細胞取得的細胞系來估定一或多個測試化合物。
於一些實施方式中，使用本文描述的一或多個載體來產生非人的基因轉殖動物或基因轉殖植物。於一些實施方式中，基因轉殖動物為昆蟲。於進一步實施方式中，昆蟲為害蟲，諸如，蚊子或蜱。於一些實施方式中，昆蟲為植物害蟲，諸如，玉蜀黍根蟲或秋季行軍蟲（fall armyworm）。於一些實施方式中，基因轉殖動物為鳥類，諸如，雞、火雞、鵝、或鴨。於一些實施方式中，基因轉殖動物為哺乳動物，諸如，人，小鼠、大鼠、倉鼠、猴、猿、兔子、豬、牛、馬、山羊、綿羊、貓、或狗。 VI. 多肽及多核苷酸之變異體及片段
本揭露提供對DNA分子有活性的其核酸序列如SEQ ID NO: 1-10及399-441所示的新穎腺嘌呤脫胺酶、其活性變異體或片段、及編碼其的多核苷酸。
儘管與所關注之多核苷酸或多肽相較下可以改變變異體或片段之活性，但變異體和片段應保持所關注之多核苷酸或多肽的功能。舉例而言，當與所關注之多核苷酸或多肽相較時，變異體或片段可具有增加的活性、降低的活性、不同的活性譜或活性的任何其他改變。
將具有腺嘌呤脫胺酶活性的本發明的脫胺酶的片段及變異體保持該活性，如果其為進一步包括DNA結合多肽或其片段的融合蛋白的局部。
術語“片段”指本發明之多核苷酸或多肽序列之部位。“片段”或“生物活性部位”包含多核苷酸，該多核苷酸包括足夠數量的連續核苷酸，以保持生物活性（亦即，對核酸的脫胺酶活性）。“片段”或“生物活性部位”包含多肽，該多肽包括足夠數量的連續胺基酸殘基，以保持生物活性。本文揭露之脫胺酶的片段包含因於替代的下游初始位點的使用而比全長序列短的那些。於一些實施方式中，脫胺酶之生物活性部位可為包括舉例而言SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者之10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、或更多個連續胺基酸殘基之多肽，或其變異體。此等生物活性部位可藉由重組技術而被製備且針對活性而被評估。
一般來說，「變異體」旨在表達實質上相似的序列。對於多核苷酸，變異體包括於天然多核苷酸內的一或多個內部位點處的一或多個核苷酸的刪除及/或添加及/或於天然多核苷酸中一或多個位點處的一或多個核苷酸的置換。如本文所使用的，「天然」或「野生型」多核苷酸或多肽分別包括天然存在的核苷酸序列或胺基酸序列。對於多核苷酸，保留（conservative）變異體包含因為該基因碼之簡併性（degeneracy）而編碼所關注基因之天然胺基酸序列的那些序列。與舉例而言用下面概述之聚合酶連鎖反應（PCR）及雜合技術一樣，可使用眾所周知的分子生物學技術辨別諸如此等之天然存在的對偶變異體。變異體多核苷酸亦包含合成取得的多核苷酸，諸如藉由使用定點誘變產生的但其仍然編碼所關注之多肽或多核苷酸之那些。一般而言，本文所揭露之特定多核苷酸之變異體與如藉由本文別處描述之序列對準程式及參數所確定之那個特定多核苷酸具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列一致性。
本文所揭露之特定多核苷酸（亦即，參考多核苷酸）之變體亦可藉由比較藉由變異體多核苷酸所編碼之多肽與藉由參考多核苷酸所編碼之多肽之間之序列一致性百分比來評估。可使用本文別處描述之序列對準程式及參數來計算任何二個多肽之間之序列一致性百分比。當藉由二個多肽共有的序列一致性百分比之比較來評估本文所揭露之任何給定的多核苷酸對時(其編碼該二個多肽)，該二個經編碼之多肽之間之序列一致性百分比為至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高之一致性。
於特定實施方式中，本發明揭露之多核苷酸編碼腺嘌呤脫胺酶，該腺嘌呤脫胺酶包括的胺基酸序列與SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者之胺基酸序列具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或更高之一致性。
本發明之腺嘌呤脫胺酶之生物活性變異體可相差少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個（諸如，6-10個）、少至5個、少至4個、少至3個、少至2個、或少至1個胺基酸殘基。於具體實施方式中，多肽包括N端或C端截短，該截短可至少包括從多肽之N端或C端刪除5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60個或更多個胺基酸。於一些實施方式中，多肽包括內部刪除，該內部刪除可至少包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60個或更多個胺基酸的刪除。
應該認識到，可對本文提供之脫胺酶進行修飾，從而創建變異體蛋白及多核苷酸。人設計的變化可透過定點誘變技術的應用而被引入。於一些實施方式中，在結構上及/或功能上與本文所揭露之序列有關的天然的、尚不知的或尚不明的多核苷酸及/或多肽亦可被認為落入本發明之範圍內。可在不改變為腺嘌呤脫胺酶的多肽的功能的非保留區域中進行保留胺基酸置換。於一些實施方式中，可進行改良脫胺酶的腺嘌呤脫胺酶之活性的修飾。
變異體多核苷酸和蛋白質亦涵蓋自諸如DNA混排（DNA shuffling）的誘變及重組程序取得的序列及蛋白質。用此種程序，操縱本文揭露之一或多個不同脫胺酶（比如，SEQ ID NO: 1-10及399-441），以創建擁有期望特性的新腺嘌呤脫胺酶。以這種方式，重組多核苷酸庫是自包括序列區域的有關序列多核苷酸之族群產生的，該序列區域具有實質的序列一致性且可在體外或活體內同源重組。舉例而言，使用這種措施，編碼所關注域之序列模體可在本文提供之脫胺酶序列與其他隨後辨識的脫胺酶基因之間混排，以獲得對具有所關注之改良特性（諸如在酵素的情況中，增加的K m）之蛋白質寫碼的新基因。此種DNA混排之策略為本領域中所知。舉例而言，參見Stemmer（1994） Proc. Natl. Acad. Sci. USA91：10747-10751；Stemmer（1994） Nature370：389-391；Crameri 等人（1997） Nature Biotech. 15：436-438；Moore等人（1997） J. Mol. Biol. 272：336-347；Zhang等人 （ 1997 ）P roc. Natl. Acad. Sci. USA94：4504-4509；Crameri等人（1998） Nature391：288-291；以及第5,605,793號及第5,837,458號美國專利。“混排之”核酸為藉由混排程序（諸如本文闡述之任何混排程序）產生之核酸。混排之核酸為藉由舉例而言以人工方式及視情況而定的遞歸方式（實體或虛擬地）重組二或多個核酸（或字符串）產生的。一般而言，混排過程中使用一或多個篩選步驟來辨別所關注之核酸；這個篩選步驟可在任何重組步驟之前或之後實行。在一些（但不是全部）混排實施方式中，期望在選擇之前實行多輪重組，以增加要篩選之池之多樣性。重組及選擇的整個過程可視情況遞歸地重複。依賴於背景，混排可指重組及選擇之整個過程，或者，作為另一種選擇，可僅指該整個過程之重組部位。
如本文中使用的，在二個多核苷酸或多肽序列的背景中，“序列一致性”或“一致性”涉及到當在指定的比較窗上對準最大對應性時為相同的二個序列中的殘基。當使用與蛋白質有關的序列一致性百分比時，應該認識到，不一致的殘基位置常常藉由保留胺基酸置換而不同，其中胺基酸殘基置換具有類似化學性質（例如，電荷或疏水性）之其他胺基酸殘基，且因此不變更分子的功能性質。當序列在保留置換(conservative substitution)方面不同時，可向上調整序列一致性百分比，以校正置換之保留性質。藉由此種保留置換而不同之序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。用於進行這個調整之手段為本領域中具有通常知識者所熟知。通常情況下，這涉及將保留置換作為局部失配而非完全失配進行評分，從而增加序列一致性百分比。由此，舉例而言，當對一致胺基酸給予1分，而對非保留置換給予零分時，對保留置換給予0與1之間之得分。比如，如在程式PC/GENE（Intelligenetics，Mountain View，California）中所實施的那樣，計算保留置換之得分。
如本文所使用的，“序列一致性百分比”表達藉由在比較窗上比較二個最佳對準序列所確定之值，其中多核苷酸序列於該比較窗中的部位可包括相較於用於二個序列之最佳對準之參考序列（不包括添加或刪除）的添加或刪除（亦即，缺口）。藉由確定在二個序列中出現一致的核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目來求得匹配位置的數目；將匹配位置的數目除以比較窗中之位置總數；及將該結果乘以100，求得序列一致性百分比，來計算該百分比。
除非另有陳述，否則本文提供之序列一致性/相似性值指使用GAP版本10使用以下參數獲得的值：使用GAP權重50及長度權重3的核苷酸序列的％一致性及％相似性，及nwsgapdna.cmp評分矩陣；使用GAP權重8及長度權重2的胺基酸序列的％一致性及％相似性，及BLOSUM62評分矩陣；或其任何等效程式。藉由“等效程式”指：對於所涉及的任何二個序列，當與GAP版本10產生的對應對準相較時，產生具有一致的核苷酸或胺基酸殘基匹配及一致的序列一致性百分比的對準的任何序列比較程式。
當為了進行相似性評分而使用所界定之胺基酸置換矩陣（比如，BLOSUM62）、缺口存在罰分（gap existence penalty）及缺口延伸罰分（gap extension penalty）對準二個序列，以達到那個序列對可能的最高分數時，二個序列被“最佳對準”。胺基酸置換矩陣及其在量化二個序列之間之相似性中的使用為在本領域中所熟知，且被描述於比如Dayhoff等人（1978）“A model of evolutionary change in proteins”中；“Atlas of Protein Sequence and Structure”，Vol. 5, Suppl. 3（ed. M. O. Dayhoff），pp. 345-352；Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D.C.；及Henikoff等人（1992） Proc. Natl. Acad. Sci. USA89：10915-10919中。BLOSUM62矩陣常常用作序列對準操作流程中的預設評分置換矩陣。缺口存在罰分是針對單胺基酸缺口在其中一個對準序列中的引入而施加的，而缺口延伸罰分是針對被插入已經打開的缺口內的每一個額外空胺基酸位置而施加的。對準藉由對準開始和結束處的每一個序列的胺基酸位置界定，且可視情況藉由一個缺口或多個缺口在一個或二個序列中的插入來界定，以便達到最高可能分數。儘管可以手動完成最佳對準和評分，但是該過程可藉由使用電腦實施的對準演算法（比如Altschul等人（1997） Nucleic Acids Res. 25：3389-3402中描述的有缺口BLAST 2.0）而被促進，且在國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）網站（www.ncbi.nlm.nih.gov）向大眾開放。可以使用比如透過www.ncbi.nlm.nih.gov可得的和Altschul等人在（1997） Nucleic Acids Res. 25：3389-3402中描述的PSI-BLAST來準備包含多重對準之最佳對準。
關於與參考序列最佳對準的胺基酸序列，胺基酸殘基“對應於”該參考序列中在該對準中與殘基配對的位置。該“位置”由數字標示，該數字基於其相對於N端的位置依序辨別參考序列中之每一個胺基酸。歸因於在確定最佳對準時必須考慮的刪除、插入、截短、融合等，所以，一般來說，藉由簡單地從N端計數所確定之測試序列中之胺基酸殘基數目不一定與其在該參考序列中之對應位置之數目相同。舉例而言，在所對準之測試序列中存在刪除的情況中，將不存在與刪除位點處之參考序列中之位置對應的胺基酸。當在所對準之參考序列中存在插入時，該插入將不對應於該參考序列中之任何胺基酸位置。在截短或融合的情況中，該參考序列或所對準之序列中可存在不對應於相應序列中的任何胺基酸之胺基酸拉伸段（stretch）。 VII. 抗體
亦涵蓋針對脫胺酶、融合蛋白、或包括本發明之脫胺酶的核糖核蛋白（包含具有SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者所示之胺基酸序列的那些脫胺酶、融合蛋白或核糖核蛋白或其活性變異體或片段）的抗體。產生抗體的方法為在本領域中所熟知（參見，舉例而言，Harlow及Lane（1988）Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）；及第4,196,265號美國專利）。此等抗體可用於套組中，用於脫胺酶或融合蛋白或包括本文描述之脫胺酶的核糖核蛋白之偵測及分離。由此，本揭露提供了包括專一性結合至本文描述的多肽或核糖核蛋白之抗體的套組，該多肽或核糖核蛋白包含舉例而言包括與SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者具有至少85%一致性之序列的多肽。 VIII. 用於結合及 / 或修飾所關注之標的序列的系統和核糖核蛋白複合物及其製作方法
本揭露提供一種靶向至核酸序列且修飾標的核酸序列的系統。於一些實施方式中，諸如RGN的RNA導引之DNA結合多肽及gRNA造成將核糖核蛋白複合物靶向至所關注之核酸序列；融合至RGDBP的脫胺酶多肽造成自A＞N修飾所靶向的核酸序列。於一些實施方式中，脫胺酶轉變A＞G。導引RNA與所關注之標的序列雜合，且亦與RNA導引之DNA結合多肽形成複合物，從而將RNA導引之DNA結合多肽導向至與標的序列結合。RNA導引之DNA結合多肽是融合蛋白的一個域；第二域為本文描述的脫胺酶。於一些實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽為RGN，諸如，Cas9。RNA導引之DNA結合多肽的其他實例包含RGN，諸如，第WO 2019/236566號及第WO 2020/139783號國際專利申請揭露描述的那些。於一些實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽為II型CRISPR-Cas多肽或其活性變異體或片段。於一些實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽為V型CRISPR-Cas多肽或其活性變異體或片段。於一些實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽為VI型CRISPR-Cas多肽。於一些實施方式中，融合蛋白的DNA結合域不要求RNA導引，諸如，鋅指核酸酶、TALEN或大範圍核酸酶多肽。於一些實施方式中，已局部或完全滅DNA結合域的核酸酶活性。於進一步實施方式中，RNA導引之DNA結合多肽包括RGN之胺基酸序列，舉例而言，諸如，APG07433.1（SEQ ID NO: 41）；或其活性變異體或片段，諸如，切口酶nAPG07433.1（SEQ ID NO: 42）或實例（SEQ ID NO: 52-59、61、397、及398）中描述的其他切口酶RGN變異體。
於一些實施方式中，本文提供之用於結合且修飾所關注之標的序列之系統為核糖核蛋白複合物，其是與至少一個蛋白質結合之RNA之至少一個分子。本文提供之核糖核蛋白複合物包括為RNA組成之至少一個導引RNA及包括本發明之脫胺酶和作為蛋白質組成之RNA導引之DNA結合多肽的融合蛋白。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物自已用編碼融合蛋白及導引RNA的多核苷酸轉化且在允許融合蛋白及導引RNA表現的條件下培養的細胞或生物體中純化。
於各種實施方式中，提供了包括本文描述的融合蛋白中任一者及與融合蛋白之DNA結合多肽結合的導引RNA的核糖核蛋白複合物。舉例而言，本文提供的是包括具有脫胺酶的融合蛋白的核糖核蛋白複合物，該脫胺酶包括與SEQ ID NO: 407具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於另一個範例中，提供一種包括具有脫胺酶的融合蛋白的核糖核蛋白複合物，該脫胺酶包括與SEQ ID NO: 399具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於又另一個實例中，提供一種包括具有脫胺酶的融合蛋白的核糖核蛋白複合物，該脫胺酶包括與SEQ ID NO: 405具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。於上面描述的核糖核蛋白複合物的那些實施方式中的一些實施方式中，融合蛋白包括選自以下者之RGN：CasX、CasY、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、aSpCas9、SaCas9、Nme2Cas9、CjCas9、Casl2a（前面稱為Cpfl）、Cas12b、Cas12g、Cas12h、Cas12i、aLbCas12a、AsCas12a、CasMINI、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCas12a、AsCas12a、Cas9-KKH、環狀排列的Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示之胺基酸序列的RGN。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物包括具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列、與包括與SEQ ID NO: 407具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的切口酶。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物包括具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列、與包括與SEQ ID NO: 399具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的切口酶。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物包括具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列、與包括與SEQ ID NO: 405具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的切口酶。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物包括與包括與SEQ ID NO: 407具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的Cas9切口酶。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物包括與包括與SEQ ID NO: 399具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的Cas9切口酶。於一些實施方式中，核糖核蛋白複合物包括與包括與SEQ ID NO: 405具有至少80%序列一致性的胺基酸序列的脫胺酶融合的Cas9切口酶。Cas9切口酶可為第WO2020181195號PCT專利公開揭露的任意Cas9切口酶，其全部內容藉由引用而被併入本文。於本文描述的各種實施方式中，核糖核蛋白複合物亦可含有本文描述的gRNA。
提供用於製造脫胺酶、融合蛋白、或融合蛋白核糖核蛋白複合物的方法。該等方法包括：在脫胺酶或融合蛋白（而於一些實施方式中，導引RNA）被表現之條件下，培養包括編碼脫胺酶、融合蛋白之核苷酸序列之細胞，而且於一些實施方式中，培養包括編碼導引RNA之核苷酸序列之細胞。然後，可自所培養之細胞之溶胞產物中純化脫胺酶、融合蛋白或融合核糖核蛋白。
用於自生物樣本之溶胞產物中純化脫胺酶、融合蛋白、或融合核糖核蛋白複合物的方法為在本領域中所知（比如，尺寸排除及/或親和性層析法、2D-PAGE、HPLC、逆相層析法、免疫沉澱法）。在特定方法中，脫胺酶或融合蛋白為重組產生的且包括純化示跡物以幫助其純化，其包含但不限於：谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、幾丁質結合蛋白（CBP）、麥芽糖結合蛋白、硫醇氧化還原蛋白（TRX）、聚（NANP）、串連親和純化（TAP）示跡物、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu- Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基載物蛋白（BCCP）及鈣調蛋白。一般而言，所標記的脫胺酶、融合蛋白或融合核糖核蛋白複合物是使用免疫沉澱法或本領域中已知的其他類似方法純化。
“分離的”或“純化的”多肽或其生物活性部位基本上或實質上不含如在其天然存在的環境中發現的、正常情況下與該多肽相伴或交互作用的組成。由此，分離的或純化的多肽當藉由重組技術被產生時基本上不含其他細胞物質或培養基，或當被化學合成時基本上不含化學前驅物或其他化學物質。基本上不含細胞物質的蛋白質包含具有少於30％、少於20％、少於10％、少於5％、或少於1％（以乾重計）的污染蛋白質的蛋白質製劑。當重組產生本發明之蛋白質或其生物活性部位時，最佳培養基呈現少於30％、少於20％、少於10％、少於5％、或少於1％（以乾重計）的化學前驅物或所關注之非蛋白質化學物質。
本文所提供之用於結合及/或剪切所關注之標的序列之特定方法涉及使用核糖核蛋白複合物。於一些實施方式中，體外組裝核糖核蛋白複合物。核糖核蛋白複合物的體外組裝可使用本領域中已知的方法實行，其中在允許RGDBP多肽或包括同者的融合蛋白與導引RNA結合的條件下使RGDBP多肽或包括同者的融合蛋白與導引RNA接觸。如本文中所使用的，“接觸（contact、contacting、contacted）”指在適合進行期望反應的條件下，將期望反應之組成放在一起。於所描述的用於修飾標的DNA分子之方法的一些實施方式中，接觸步驟在體外實行。於一些實施方式中，接觸步驟在活體內實行。於一些實施方式中，接觸步驟在個體（比如，人個體或非人的動物個體）內實行。於一些實施方式中，接觸步驟在諸如人或非人的動物細胞的細胞中實行。RGDBP多肽或包括該RGDBP多肽的融合蛋可自生物樣本、細胞溶胞產物或培養基中純化，經由體外轉譯被產生，或被化學合成。導引RNA可自生物樣本、細胞溶胞產物或培養基中純化，在體外被轉錄，或被化學合成。可使RGDBP多肽或包括該RGDBP多肽的融合蛋白及導引RNA在溶液（比如，緩衝食鹽水溶液）中產生接觸以允許核糖核蛋白複合物的體外組裝。 IX. 修飾標的序列之方法
本揭露提供用於修飾所關注之標的核酸分子（比如，標的DNA分子）之方法。該方法包含向標的序列或包括標的序列之細胞、胞器或胚胎遞送包括DNA結合多肽及本發明之至少一個脫胺酶或編碼同者之多核苷酸的融合蛋白。於某些實施方式中，該方法包含向標的序列或包括標的序列之細胞、胞器或胚胎遞送包括至少一個導引RNA或編碼同者之多核苷酸及包括本發明之至少一個脫胺酶及RNA導引之DNA結合多肽或編碼同者之多核苷酸的系統。於一些實施方式中，融合蛋白包括SEQ ID NO: 1-10及399-441的胺基酸序列中任一者或其活性變異體或片段。
於一些實施方式中，該些方法包括使DNA分子與以下接觸：（a）包括脫胺酶及RNA導引之DNA結合多肽的融合蛋白，舉例而言，諸如，滅核酸酶活性或切口酶Cas9域；及（b）將（a）之融合蛋白靶向至DNA分子之標的核苷酸序列的gRNA；其中DNA分子以有效量且在適合核鹼基脫胺化之條件下與該融合蛋白及gRNA接觸。於一些實施方式中，標的DNA分子包括與疾病或病症關聯之序列，且其中核鹼基之脫胺化導致與疾病或病症無關聯之序列。於一些實施方式中，疾病或病症影響動物。於進一步實施方式中，疾病或病症影響哺乳動物，諸如，人、牛、馬、狗、貓、山羊、綿羊、豬、猴、大鼠、小鼠、或倉鼠。於一些實施方式中，標的DNA序列駐留於農作物的對偶基因中，其中所關注之性狀的特定對偶基因（allele）導致具有較低農藝價值的植物。核鹼基的脫胺化導致改良性狀並增加植物的農藝價值的對偶基因。
於其中該方法包括遞送編碼導引RNA及/或融合蛋白的多核苷酸的那些實施方式中，細胞或胚胎可之後在導引RNA及/或融合蛋白被表現的條件下培養。於各種實施方式中，該方法包括使標的序列與包括gRNA及融合蛋白（包括本發明之脫胺酶及RNA導引之DNA結合多肽）的核糖核蛋白複合物接觸。於某些實施方式中，該方法包括將本發明之核糖核蛋白複合物引入包括標的序列之細胞胞器或胚胎內。本發明之核糖核蛋白複合物可為已自生物樣本被純化、重組產生且隨後純化、或如本文所描述的體外組裝的複合物。於其中與標的序列或細胞、胞器或胚胎接觸的核糖核蛋白複合物已經在體外被組裝的那些實施方式中，該方法可進一步包括複合物在與標的序列、細胞、胞器或胚胎接觸之前的體外組裝。
可使用本領域中已知的、包含但不限於電穿孔的任何方法將純化的或體外組裝的本發明之核糖核蛋白複合物引入細胞、胞器或胚胎內。於一些實施方式中，使用使用本領域中已知的任何方法（比如，電穿孔）將包括本發明之脫胺酶及RNA導引之DNA結合多肽的融合蛋白以及編碼或包括導引RNA之多核苷酸引入細胞、胞器或胚胎內。
在遞送至標的序列或包括標的序列的細胞、胞器或胚胎，或與標的序列或包括標的序列的細胞、胞器或胚胎接觸時，導引RNA將融合蛋白導向至以序列專一性方式與標的序列結合。標的序列隨後可經由融合蛋白的脫胺酶域而被修飾。於一些實施方式中，此融合蛋白與標的序列之結合導致與標的序列相鄰的核苷酸的修飾。與標的序列相鄰的、藉由脫胺酶被修飾的核苷酸可為自標的序列的5’或3’末側的，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100個鹼基對。包括本發明之脫胺酶及RNA導引之DNA結合多肽的融合蛋白可將所靶向的A＞N（且較佳地所靶向的A＞G）突變引入所靶向的DNA分子。
於所描述的用於修飾標的DNA分子的方法的一些實施方式中，體外實行接觸步驟。於特定實施方式中，活體內實行接觸步驟。於一些實施方式中，在個體（比如，人個體或非人的動物個體）內實行接觸步驟。於一些實施方式中，在諸如人或非人的動物細胞的細胞內實行接觸步驟。
量測融合蛋白與標的序列之結合的方法為本領域中所知，且包含：染色質免疫沉澱測定法、凝膠遷移率移位測定法、DNA下拉測定法、報導子測定法（reporter assay）、微量盤捕獲及偵測測定法。同樣地，量測標的序列之剪切或修飾之方法為本領域中所知，且包含體外或活體內剪切測定法，其中在為了促進降解產物的偵測而將恰當示跡物（比如，放射性同位素、螢光物質）附接至該標的序列或未將恰當示跡物（例如，放射性同位素、螢光物質）附接至該標的序列的情況下，使用PCR、定序或凝膠電泳來確認剪切。於一些實施方式中，使用切刻的指數擴增反應（nicking triggered exponential amplification reaction）（NTEXPAR）測定法（參見，比如，Zhang等人（2016） Chem. Sci.7：4951-4957）。可使用Surveyor測定法來評估活體內剪切（Guschin等人（2010） Methods Mol Biol649：247-256）。
於一些實施方式中，方法涉及使用與一個以上的導引RNA複合的、為融合蛋白的局部的RNA結合的DNA導引域。一個以上的導引RNA可靶向單基因的不同區域，亦可靶向多個基因。這樣多靶向賦能融合蛋白的脫胺酶域修飾核酸，從而將多個突變引入所關注之標的核酸分子（比如，基因組）中。
於其中該方法涉及使用諸如切口酶RGN（亦即，僅能夠剪切雙股多核苷酸中的單股，舉例而言，nAPG07433.1（SEQ ID NO: 42或SEQ ID NOs: 50-57））的RNA導引之核酸酶（RGN）的那些實施方式中，該方法可包括引入靶向一致的或重疊的標的序列且剪切多核苷酸之不同股的二個不同RGN或RGN變異體。舉例而言，可將僅剪切雙股多核苷酸之正（+）股的RGN切口酶與僅剪切雙股多核苷酸之負（-）股的第二RGN切口酶一起引入。於一些實施方式中，提供二個不同融合蛋白，其中每一個融合蛋白包括具有不同PAM辨識序列的不同RGN，使得可為突變而靶向較大多樣性的核苷酸序列。
本領域中具有通常知識者將理解，目前揭露之任一方法可用於靶向單標的序列或多個標的序列。由此，這些方法包括與多個相異的導引RNA組合地使用包括單RNA導引之DNA結合多肽的融合蛋白，其可靶向單基因及/或多個基因內的多個相異序列。然後，融合蛋白的脫胺酶域將突變引至每一個靶向序列處。本文亦涵蓋其中與多個相異的RNA導引之DNA結合多肽組合地引入多個相異的導引RNA之方法。此等RNA導引之DNA結合多肽可為多個RGN或RGN變異體。此等導引RNA及導引RNA/融合蛋白系統可靶向單基因及/或多個基因內的多個相異序列。
於一些實施方式中，包括RNA導引之DNA結合多肽及本發明之脫胺酶多肽的融合蛋白可用於在所靶向之基因中或所關注之基因的所靶向之區域中產生突變。於一些實施方式中，本發明之融合蛋白可用於所靶向之基因的或所關注之所靶向之基因的區域的飽和突變誘發，隨後是高通量正向基因篩選（high-throughput forward genetic screening），以辨別新突變及/或表現型。於一些實施方式中，本文描述的融合蛋白可用於在所靶向之基因組位址中產生突變，其可包括亦可不包括寫碼DNA序列。藉由上面描述的靶向突變誘發產生的細胞系之庫亦可有用於研究基因功能或基因表現。 X. 標的多核苷酸
於一個態樣中，本發明提供修飾真核細胞中之標的多核苷酸的方法，其可為在活體內、離體地或在體外。於一些實施方式中，該方法包括：自人或非人動物或植物（包括微藻類）取樣細胞或細胞族群；及修飾該細胞或該些細胞。培養可以在任何階段離體地發生。甚至可以將該細胞或該些細胞重新引入、非人動物或植物（包含微藻類）中。
使用自然變異性，植物育種者將關於諸如產量、品質、均勻性、耐寒性以及抗害蟲性的可期望品質的大多數有用基因組合起來。此等可期望品質亦包含生長、日長度偏好、溫度要求、花卉或生殖發育的起始日期、脂肪酸含量、抗蟲性、抗病性、線蟲抗性、真菌抗性、除草劑抗性、對各種環境因素（包含乾旱、熱、濕、冷、風及包括高鹽度的不利土壤條件）的耐受性。此等有用基因的來源包含天然或外來品種、原生種（heirloom variety）、野生植物近源種、及比如以誘變劑處置植物材料的誘導突變。使用本發明，向植物育種者提供誘導突變的新工具。據此，本領域中具有通常知識者可採用本發明以誘導有用基因的增加，同時比先前的誘變劑更精確，且依此加速並改良植物育種計劃。
本發明之脫胺酶或融合蛋白之標的多核苷酸可為對真核細胞是內源或外源的任何多核苷酸。舉例而言，標的多核苷酸可為駐留於真核細胞的細胞核中之多核苷酸。於一些實施方式中，標的多核苷酸為寫碼基因產物（比如，蛋白質）之序列或非寫碼序列（比如，調節多核苷酸或垃圾DNA（junk DNA））。於一些實施方式中，本發明之融合蛋白的標的序列與PAM（原型間隔體相鄰模體）關聯；也就是說，RNA導引之DNA結合多肽辨識的短序列。PAM的精確序列和長度要求隨所使用的RNA導引之DNA結合多肽而不同，但PAM通常情況下是與原型間隔體（也就是說，標的序列）相鄰的2-5個鹼基對序列。
本發明之融合蛋白之標的多核苷酸可包含很多疾病關聯基因及多核苷酸以及傳訊生化路徑關聯基因及多核苷酸。標的多核苷酸之實例包含與傳訊生化路徑關聯之序列，比如，傳訊生化路徑關聯基因或多核苷酸。標的多核苷酸之實例包含疾病關聯基因或多核苷酸。“疾病關聯”基因或多核苷酸指：與非疾病控制的組織或細胞相較下，在自感染疾病之組織取得的細胞中以異常水準或以異常形式產出轉錄或轉譯產物之任何基因或多核苷酸。其可為一種變得以異常高水準表現的基因；其可為一種變得以異常低水準表現的基因，其中改變的表現與疾病的發生及/或進展相關。疾病關聯基因亦指擁有（多個）突變或基因變異的基因，該擁有（多個）突變或基因變異的基因為直接造成疾病病因（例如，因果突變），或為與造成疾病病因（例如，因果突變）的（多個）基因呈連鎖不平衡（linkage disequilibrium）。轉錄或轉譯產物可為已知的或未知的，且可進一步處於正常或異常水準。
使用目前揭露之方法及組成物可靶向之疾病關聯基因的非限制性實例被提供於表34中。於一些實施方式中，所靶向之疾病關聯基因為表34揭露的具有G＞A突變的那些。疾病關聯基因及多核苷酸之額外實例可自在全球資訊網上找到的約翰•霍普金斯大學（馬裡蘭州巴爾的摩）麥庫席克–內森斯遺傳醫學研究所（McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine）和美國國家醫學圖書館（馬里蘭州貝西達）（National Library of Medicine（Bethesda, Md.））的國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）找到。
於一些實施方式中，標的多核苷酸包括囊腫纖維化跨膜傳導調節子（5）基因。
如本文中使用的術語“囊腫纖維化跨膜傳導調節子”或“CFTR”指位於上皮細胞的頂端膜中、催化小離子透過該膜的經cAMP調節之氯離子通道。CFTR基因之非限制性實例如SEQ ID NO: 51所示。
如本文關於間隔體序列及標的序列使用的術語“標的”或“多個標的”指基於所關聯之導引RNA內的間隔體序列與標的序列充分雜合的能力，RNA導引之核酸酶相對於標的序列的定位。
提供了CRISPR RNA（crRNA）或編碼CRISPR RNA（crRNA）的核酸分子，其中crRNA包括靶向CFTR標的序列的間隔體序列。亦提供了包括此等crRNA的導引RNA、編碼包括此等crRNA的導引RNA的一或多個核酸分子、包括編碼包括此等crRNA的導引RNA的一或多個核酸分子的載體、及包括此等crRNA的系統。亦提供了使用此等crRNA或編碼此等crRNA的核酸分子、包括此等crRNA的導引RNA、編碼包括此等crRNA的導引RNA的一或多個核酸分子、包括編碼包括此等crRNA的導引RNA的一或多個核酸分子的載體、及包括此等crRNA的系統來結合至、剪切、及/或調控標的序列的方法。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、562、及563中任一者所示的序列、或其補體。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的單導引RNA（sgRNA）與SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 62-68、80-85、116-119、128-131、163、164、180、181、203-209、219-225、256-258、274-276、310-313、及330-333中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 98-104、140-143、197、198、235-241、292-294、及350-353中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 68-71、86-89、120-122、132-134、152-156、169-173、213-215、229-231、251-255、269-273、305-309、及325-329中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 104-107、144-146、186-190、245-247、287-291、及345-349中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 72、73、90、91、161、162、178、179、265、266、283、及284中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 108、109、195、196、301、及302中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 74、75、92、93、123、124、135、136、167、184、216-218、232-234、259-261、277-279、314-317、及334-337中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 110、111、147、148、201、248-250、295-297、及354-357中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 76、94、210-212、226-228、322、342、562、及563中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 112、242-244、362、及564中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 77、95、125、137、157-160、174-177、323、及343中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 113、149、191-194、及363中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 78、96、126、138、168、185、267、285、318、319、338、及339中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 114、150、202、303、358、及359中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 79、97、127、139、262-264、280-282、324、及344中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 115、151、298-300、及364中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，crRNA或導引RNA的CFTR標的序列具有SEQ ID NO: 165、166、182、183、268、286、320、321、340、及341中任一者所示的序列、或其補體，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，包括具有靶向CFTR標的序列的間隔體序列的crRNA的sgRNA與SEQ ID NO: 199、200、304、360、及361中任一者具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性，且關聯RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的胺基酸序列。
於一些實施方式中，該些方法包括使包括標的DNA序列的DNA分子與本發明的DNA結合多肽脫胺酶融合蛋白接觸，其中DNA分子以有效量且在適於核鹼基脫胺化之條件下與融合蛋白接觸。於某些實施方式中，該些方法包括使包括標的DNA序列之DNA分子接觸：（a）本發明之RGN脫胺酶融合蛋白；及（b）將（a）之融合蛋白靶向至DNA股的標的核苷酸序列的gRNA；其中DNA分子以有效量且在適於核鹼基脫胺化之條件下與融合蛋白以及gRNA接觸。於一些實施方式中，標的DNA序列包括與疾病或病症關聯的序列，且其中核鹼基之脫胺化導致與疾病或病症無關聯之序列。於一些實施方式中，標的DNA序列駐留於農作物的對偶基因中，其中所關注之性狀的特定對偶基因導致具有較低農藝價值的植物。核鹼基的脫胺化導致改良性狀並增加植物的農藝價值的對偶基因。
於一些實施方式中，標的DNA序列包括與疾病或病症關聯之G＞A點突變，且其中突變體A鹼基之脫胺化導致與疾病或病症無關聯的序列。於一些實施方式中，脫胺化校正與疾病或病症關聯之序列中之點突變。於一些實施方式中，與疾病或病症關聯之序列編碼蛋白質，且脫胺化將停止密碼子（stop codon）引入與疾病或病症關聯之序列中，導致編碼蛋白質之截短。於一些實施方式中，接觸在易患有、患有或診斷患有疾病或病症的個體活體內實行。於一些實施方式中，疾病或病症為與基因組中之點突變或單鹼基突變關聯的疾病。於一些實施方式中，該疾病為基因疾病、癌症、代謝疾病或溶酶體貯積病。 XI. 醫藥組成物及醫治方法
本文提供將疾病的醫治於對其需要的個體中進行之方法。該方法包括對需要其之個體投予有效量之目前揭露之融合蛋白或編碼該融合蛋白之多核苷酸、目前揭露之gRNA或編碼該gRNA之多核苷酸、目前揭露之融合蛋白系統、目前揭露之核糖核蛋白複合物、或藉由此等組成物中任一者修飾之或包括此等組成物中任一者之細胞。
於一些實施方式中，醫治包括藉由對需要其之個體投予目前揭露之融合蛋白、gRNA、或目前揭露之融合蛋白系統、或編碼該融合蛋白、gRNA、或目前揭露之融合蛋白系統之（多個）多核苷酸之活體內基因編輯。於一些實施方式中，醫治包括體外基因編輯，其中細胞是以目前揭露之融合蛋白、gRNA、或目前揭露之融合蛋白系統、或編碼該融合蛋白、gRNA、或目前揭露之融合蛋白系統之（多個）多核苷酸而被體外基因修飾，且然後將經修飾細胞投予至個體。於一些實施方式中，經基因修飾細胞源於之後被投予經修飾細胞之個體，且所移植細胞在本文中被稱為自體的。於一些實施方式中，經基因修飾細胞源自與被投予經修飾細胞之個體（亦即，接受者）屬相同物種中之不同個體（亦即，供體），且所移植細胞在本文中被稱為異體的。於本文描述之一些實例中，細胞在將投予對需要其之個體進行之前可先於培養中被擴大。
舉例而言，於一些實施方式中，提供一種方法，該方法包括對具有此種疾病（比如，與CFTR基因關聯之基因缺陷）的個體投予有效量之核糖核蛋白複合物，該核糖核蛋白複合物包括具有與SEQ ID NO: 399、及405-407中任一者所示的序列具有至少80%一致性的胺基酸序列的脫胺酶的融合蛋白。於本文描述之實施方式中，核糖核蛋白複合物的投予校正點突變或將去活化突變引入疾病關聯之CFTR基因中。藉由校正點突變或將去活化突變引入疾病關聯之基因中可醫治的其他疾病將為本領域中之通常知識者所知，且本揭露不限於這個方面。
於一些實施方式中，將要用目前揭露之組成物醫治之疾病為可用免疫療法（諸如，用嵌合抗原受體（CAR）T細胞）醫治之疾病。此等疾病包含但不限於癌症。
於一些實施方式中，標的核鹼基的脫胺化導致基因缺陷的校正（比如，以校正 CFTR基因），或導致引致基因產物功能喪失的點突變的校正。於一些實施方式中，基因缺陷與疾病或病症（比如，溶酶體貯積病症或代謝疾病（舉例而言，諸如，I型糖尿病））關聯。由此，於一些實施方式中，將要用目前揭露之組成物醫治之疾病與被突變之序列（亦即，該序列為對於疾病或病症是因果的或為對於與疾病或病症關聯之症狀是因果的）關聯，以便醫治疾病或病症或與疾病或病症關聯之症狀之降低。
於一些實施方式中，將要用目前揭露之組成物醫治之疾病與因果突變關聯。如本文使用的，「因果突變」指對個體中疾病或病症之嚴重程度或出現有貢獻之基因組中之特別核苷酸、多個核苷酸或核苷酸序列。因果突變之校正引致由疾病或病症導致之至少一個症狀改良。於一些實施方式中，因果突變之校正引致由疾病或病症導致之至少一個症狀改良。於一些實施方式中，因果突變與本文揭露之脫胺酶融合的RGDBP（比如，RGN）所辨識之PAM位點相鄰。因果突變可用包括RGDBP（比如，RGN）及目前揭露之脫胺酶之融合多肽來校正。與因果突變關聯之疾病之非限制性實例包含：囊腫纖維化、賀勒氏（Hurler）症候群、弗裡德裡希共濟失調（Friedreich’s Ataxia）、亨汀頓氏舞蹈症（Huntington’s Disease）、及鐮形細胞疾病。疾病關聯基因及突變之額外非限制性實例可從在全球資訊網上取得的約翰霍普金斯大學（麻省巴爾的摩）麥庫席克–內森斯遺傳醫學研究所（McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)）和美國國家醫學圖書館（麻省貝西達）的國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.) ）取得。
於一些實施方式中，本文提供之方法使用於將去活化點突變引入對與疾病或病症關聯之基因產物編碼之基因或對偶基因內。舉例而言，於一些實施方式中，本文提供運用融合蛋白將去活化點突變引入致癌基因（比如，在增生性疾病的醫治中）內之方法。於一些實施方式中，去活化突變可在寫碼序列中產生過早停止密碼子，此舉導致經截短基因產物（比如，缺少全長蛋白之功能之經截短蛋白）之表現。於一些實施方式中，本文提供之方法之目的為經由基因組編輯來恢復功能不良性基因之功能。本文提供之融合蛋白可對比如藉由在人細胞培養中校正疾病關聯突變之體外基於基因編輯的人療法有效。本領域中之通常知識者應該明白，本文提供之融合蛋白（比如，包括RNA導引之DNA結合多肽及脫胺酶多肽的融合蛋白）可用於校正任何單點G＞A突變。突變體A至G的脫胺化引致突變的校正。
如本文中使用的，“醫治”或“處理”、或“緩和”或“改善”可被互換地使用。此等術語指用於獲得有益或期望結果之措施，該有益結果或期望結果包含但不限於治療性益處及/或預防性益處。藉由治療性益處意味著對醫治中的一或多個疾病、病況或症狀之中的任何治療相關改良或對醫治中的一或多個疾病、病況或症狀之上的效果。對於預防性益處，該組成物可被投予處於特殊疾病、病症或症狀的發展風險中之個體，或被投予報告疾病的一或多個生理症狀之個體，即使該疾病、病症或症狀可能尚未呈現徵兆。於一些實施方式中，一或多個症狀已發展之後及/或疾病已被診斷之後，投予醫治。於特定實施方式中，在不存在症狀的情況下，可投予醫治，比如，以防止或延遲症狀之肇始或抑制疾病的肇始或進展。舉例而言，於症狀肇始之前（比如，考慮到症狀歷史及/或考慮到基因或其他易患因素），對易患單體投予醫治。在症狀被解除之後，亦可繼續醫治，舉例而言，以防止或延遲其預防或復發。
術語“有效量”或“治療有效量”指足以實現有益或期望結果之藥劑量。治療有效量可取決於如下之一或多者而變化：被醫治的個體及疾病病症、個體的重量及年齡、疾病病症之嚴重性、投予方式等等，本領域中之通常知識者可容易地對此做出確定。特定劑量可取決於如下一或多者而變化：所選之特別藥劑、將要遵循的給藥方案、是否與其他化合物組合地投予、投予時機、及其輸送所在的遞送系統。
術語“投予”指藉由導致所引入之活性成分至少局部地定位於期望位點（諸如，受傷或修復的位點）處之方法或途徑，將活性成分置於個體內，藉以使得產生（多個）期望效應。於一些實施方式中，本揭露提供包括遞送本文描述之分離多肽、核酸分子融合蛋白、核糖核蛋白複合物、載體、醫藥組成物及/或gRNA中任一者之方法。於一些實施方式中，本揭露進一步提供藉由此等方法產生之細胞及包括此等細胞或自此等細胞產生之生物體（諸如，動物或植物）。於一些實施方式中，如本文描述的與導引序列組合（及視情況與導引序列複合）的脫胺酶、融合蛋白及/或核酸分子被遞送至細胞。
於一些實施方式中，投予包括藉由病毒遞送之投予。包括編碼本文揭露之融合蛋白、核糖核蛋白複合物、或載體的核酸的病毒載體可被直接投予患者（亦即，活體內），或者其可用於體外處置細胞，且可視情況將經修飾的細胞投予患者（亦即，離體）。傳統的基於病毒的系統可包含但不限於用於基因轉移之反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺關聯及單純皰疹病毒載體。用反轉錄病毒、慢病毒、及腺關聯病毒基因轉移方法，在宿主基因組中之整合是可能的，常常導致所插入的轉殖基因的長期表現。慢病毒載體為能夠轉導或感染非分裂細胞（non-dividing cell）且通常情況下產生高病毒力價的反轉錄病毒載體。於瞬時表現較佳的應用中，可使用基於腺病毒的系統。基於腺病毒的載體在許多細胞類型中能夠有非常高的轉導效率，且不要求細胞分裂（cell division）。
於一些實施方式中，投予包括藉由電穿孔之投予。於一些實施方式中，投予包括藉由奈米粒子遞送之投予。於一些實施方式中，投予包括藉由核糖體遞送之投予。投予的任何有效途徑均可使用於投予本文描述之有效量的藥學組成物。
於一些實施方式中，投予包括藉由核酸之其他非病毒遞送之投予。示例性的非病毒遞送方法包含但不限於RNP複合物、脂質體轉染、核轉染、顯微注射、基因槍（biolistics）、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質核酸共軛物（lipidmucleic acid conjugate）、裸DNA、人工病毒粒子、及DNA的藥劑增強攝取。脂質體轉染被描述於比如第5,049,386號、第4,946,787號、及第4,897,355號美國專利中，且脂質體轉染試劑是市售的（比如，Transfectam ™及Lipofectin™）。適合用於多核苷酸之有效受體辨識脂質體轉染（receptor-recognition lipofection）之陽離子及中性脂質包含Feigner的WO 1991/17424；WO 1991/16024中的那些陽離子和中性脂質。遞送可為至細胞（比如，在體外或離體地投予）或標的組織（比如，活體內投予）。
如本文中使用的，術語“個體”指期望對其進行診斷、醫治或治療之任何單體。於一些實施方式中，個體為動物。於一些實施方式中，個體為哺乳動物。於一些實施方式中，個體為人類。
醫治效能可由熟練的臨床醫師決定。然而，如果疾病或病症之症候或症狀中之任何一者或全部是以有益方式被改變（比如，至少減少10%）、或其他臨床上接受之疾病的症狀或標記被改良或改善，則醫治被認為“有效醫治”。亦可藉由單體未發生如藉由住院估定之惡化、或不需要醫學介入（比如，疾病的進展被停止或至少減慢）來測量效能。測量此等指標之方法為本領域中之通常知識者所知。醫治包含：（1）抑制疾病，比如，遏止或減慢症狀之進展；或（2）減緩疾病，比如，引起症狀消退；及（3）預防或降低症狀發展之可能性。
提供醫藥組成物，該醫藥組成物包括：目前揭露之RGN多肽或編碼該RGN多肽之多核苷酸、目前揭露之gRNA或編碼該gRNA之多核苷酸、目前揭露之脫胺酶或編碼該脫胺酶之多核苷酸、目前揭露之融合蛋白、目前揭露之系統（諸如，包括融合蛋白的那些系統）、目前揭露之核糖核蛋白複合物或包括該RGN多肽或RGN編碼多核苷酸、gRNA或gRNA編碼多核苷酸、融合蛋白編碼多核苷酸、或系統中任一者之細胞及醫藥學上可接受之載劑。
如本文使用的，「醫藥學上可接受之載劑」指不對生物體引起顯著刺激且不消除活性成分（亦即，脫胺酶或融合蛋白或編碼該脫胺酶或融合蛋白之核酸分子）之活性及特性之材料。載劑必須具有足夠高之純度及足夠低之毒性，以使彼等合適投予正被醫治之個體。載劑可為惰性的，其亦可擁有醫藥效益。於一些實施方式中，醫藥學上可接受之載劑包括合適對人或其他脊椎動物投予之一或多個相容固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質。於一些實施方式中，醫藥學上可接受之組成物包括不為天然發生的醫藥學上可接受之載劑。於一些實施方式中，未發現該醫藥學上可接受之載劑在本質上與該活性成分在一起且由此它們為異源的。
目前揭露之方法中使用的醫藥組成物可由提供合適轉移、遞送、耐受性等等之合適載劑、賦形劑、及其他藥劑調配。眾多恰當調配物為本領域中之通常知識者所知。參見，比如，Remington，The Science and Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)。非限制性實例包含:無菌稀釋劑，諸如，注射用水、食鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶劑）；抗菌劑，諸如，苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯(methyl parabens)；抗氧化劑，諸如，抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)；緩衝液，諸如，醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於滲壓性調節之藥劑，諸如，氯化鈉或葡萄糖。靜脈內地投予的特殊載劑為生理食鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。經口或非口服使用的醫藥組成物可被製備為適合供給某個劑量之活性成分之單位劑量的劑型。此等單位劑量之劑型舉例而言包含錠劑、丸劑、膠囊、注射劑（安瓿）、栓劑等。此等組成物亦可含有包含保存劑、潤濕劑、乳化劑、及分散劑的佐劑。必須藉由各種抗菌劑及抗真菌劑（舉例而言，對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、及類似者）確保預防微生物的作用。亦可期望包含等滲劑，舉例而言，糖、氯化鈉及類似物。藉由使用延遲吸收的藥劑（舉例而言，單硬脂酸鋁（aluminum monostearate）及明膠）可引起可注射醫藥劑型之延長吸收。
於包括或修飾是用目前揭露之RGN、gRNA、脫胺酶、融合蛋白、系統（包含包括融合蛋白的那些）或編碼相同者（包含包括融合蛋白的那些）之多核苷酸之細胞被投予個體之一些實施方式中，該等細胞與醫藥學上可接受之載劑一起作為懸浮劑被投予。本領域中具有通常知識者將認識到將被使用於細胞組成物中之醫藥學上可接受之載劑將不包含實質上干擾將被遞送至該個體之細胞之存活率之量的緩衝液、化合物、冷凍保存藥劑、保存劑、或其他藥劑。包括細胞之調配物可包含比如允許細胞膜保持完整性之滲透壓緩衝液，且視情況地，在投予時保持細胞存活率或增強植入的營養劑。該等調配物及懸浮劑為本領域中具有通常知識者所知，且/或使用例行實驗可被調適成與本文描述之細胞一起使用。
細胞組成物亦可被乳化為或呈現為脂質體組成物，前提條件為乳化程序不會不利地影響細胞存活率。細胞及其他活性成分可以與醫藥學上可接受且與活性成分相容之賦形劑、且以適合在本文描述之治療方法中使用的量混合。
包含於細胞組成物中之額外藥劑可包含其內之組成之醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之鹽包含與舉例而言諸如鹽酸或磷酸之無機酸、或與諸如醋酸、酒石酸、苯乙醇酸及類似者之有機酸形成之酸加成鹽（與多肽之自由胺基基團形成）。與自由羧基基團形成之鹽亦可衍生自舉例而言諸如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物之無機鹼、及諸如異丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、組胺酸、普魯卡因及類似者之有機鹼。
投予本文描述之醫藥組成物之適合途徑包含但不限於：外用、 皮下、經皮、皮內、病灶內、關節內、腹膜內、膀胱內、黏膜、牙齦、齒內、耳蝸內、經鼓室(transtympanic)、器官內、硬膜外、鞘內腔、肌內、靜脈內、血管內、骨內、眼周、瘤內、腦內、及腦室內投予。
於一些實施方式中，本文描述之醫藥組成物被局域地投予生病的位點（比如，肺臟）。於一些實施方式中，本文描述之醫藥組成物借助導管、借助塞劑、或借助植入物，藉由注射、吸入（比如，氣溶膠的吸入）被投予個體，該植入物為多孔、無孔或凝膠材料，包含諸如矽橡膠膜（sialastic membrane）的膜或纖維。於一些實施方式中，醫藥組成物為遞送至個體（比如，為基因編輯）而被調配。
於一些實施方式中，醫藥組成物按照例行程序被調配成為靜脈內地或皮下地投予個體（比如，人）而調適的組成物。於一些實施方式中，為藉由注射投予之醫藥組成物為無菌等滲水性緩衝液中的溶液。倘若必要，則醫藥亦可包含助溶劑及諸如林諾卡因（lignocaine）的局部麻醉劑，以減輕注射位點處的疼痛。一般而言，多個成分分別地或者一起混合地在舉例而言諸如指示活化劑之量的安瓿或囊袋（sachette）的氣密式容器中被供給為凍乾粉末或無水濃縮物。倘若醫藥將藉由輸液而被投予，則其可用含有無菌醫藥級水或食鹽水的輸液瓶被分配。倘若醫藥組成物藉由注射被投予，則可提供具有注射用無菌水或食鹽水的安瓿，使得成分可在投予之前被混合。
於一些實施方式中，醫藥組成物可被含於亦適合非口服投予的脂質粒子或囊泡（諸如，脂質體或微晶體）內。
雖然對本文提供之醫藥組成物的描述主要針對適合對人投予的醫藥組成物，但本領域中之通常知識者應該明白，此種組成物一般而言適合投予所有分類的動物或生物體。 使用鹼基編輯修飾因果突變
可使用取決於本發明之RGN脫胺酶融合蛋白的措施而校正的基因遺傳性疾病之實例是囊腫纖維化。囊腫纖維化（CF）為藉由囊腫纖維化跨膜傳導調節子（CFTR）基因（如SEQ ID NO: 51所示）中的突變引起的體染色體隱性疾病。CFTR對位於上皮細胞的頂膜中、催化小離子透過該膜的經cAMP調節之氯離子通道編碼。這種機制的失調引起鹽及流體恆定（salt and fluid homeostasis）的減損，鹽及流體恆定的減損導致多器官功能不良及最終因呼吸衰竭而導致死亡。
已發現 CFTR基因中幾乎2,000個突變引起CF。基於CFTR蛋白合成中之、或運輸中之、或功能中之、或穩定性中之功能缺陷，CFTR突變被劃分為六類，但可以確認，許多CFTR突變體呈現多種缺陷。I類突變引致嚴重缺陷性蛋白產生。它們主要為無意義或框移突變，無意義或框移突變引入過早終止密碼子（PTC），導致藉由mRNA延遲路徑（NMD）降解的不穩定信使RNA (mRNA)。因於單核苷酸變化的無意義突變包括I類突變的主要子集（Marangi, M.及Pistritto, G, 2018, Front Pharmacol9, 396, doi:10.3389/fphar.2018.00396; Pranke, I.,等人, 2019, Front Pharmacol10, 121, doi:10.3389/fphar.2019.00121, 二者藉由引用而被併入本文）。對具有I類囊腫纖維化的患者的醫治可為困難的，因為功能性CFTR蛋白沒有產生。特別是，此等無意義突變的顯著片斷為用A至G鹼基編輯器可潛在地定址的（Geurts, M. H.等人, 2020, Cell Stem Cell26, 503-510 e507, doi:10.1016/j.stem.2020.01.019藉由引用而被併入本文）。
Geurts等人為使用包括與RGN可操作地聯結的腺嘌呤脫胺酶的融合蛋白，也就是說，SpyCas9或xSpyCas9變異體，在來自囊腫纖維化患者的具有I類突變的經培養之肺臟上皮細胞中實行精確鹼基編輯的第一群組。SpyCas9辨識5’-nGG-3’PAM，而xSpyCas9變異體辨識減低的5’-nG-3’。作者陳述鹼基編輯技術的主要限制為正被使用的Cas蛋白之PAM要求。他們發現，對於包括RGN SpyCas9的融合蛋白， CFTR基因中辨別的大多數無意義突變不在所要求之靶向窗中。在RGN辨識的標的DNA序列上，PAM為短模體，一般而言有一至四個核苷酸。PAM序列為每一個RGN蛋白所固有，藉以使得RGN只能取用適合的PAM周圍的基因組空間。另外，鹼基編輯器之鹼基編輯窗往往僅受限於標的序列中的一部分核苷酸。如果所關注之核苷酸太靠近PAM，則RGN阻擋取用(access)核苷酸。如果核苷酸太遠離PAM，則繫至RGN之脫胺酶不能到達核苷酸。而且，藉由R環露出的ssDNA之量限制脫胺酶之可取用性。本發明包含RGN脫胺酶融合蛋白，其中RGN辨識靠近 CFTR基因之I類突變的PAM且脫胺酶能夠成功修飾所靶向之因果突變。
本領域中已知的對RGN脫胺酶融合蛋白的另一個限制為對融合蛋白編碼的載體構築體對於活體內遞送之方法太大。此等融合蛋白之AAV遞送不是對基於SpyCas9之融合蛋白之選項，因為它們的大小超過對有效AAV包裝的限制。本文描述之融合蛋白的RGN組成的大小較小，且因此對於AAV載體遞送策略為存活候選者。本發明亦揭露導引RNA，該導引RNA對本文描述之RGN專一且將本發明之融合蛋白導引至以前不可到達的 CFTR基因中的無意義突變之標的位點。本發明亦教導透過活體內AAV載體遞送將該融合蛋白用於靶向鹼基編輯之方法。
理想的是，本發明之RGN脫胺酶融合蛋白的寫碼序列及用於將融合蛋白靶向至 CFTR基因的對應導引RNA可全部被包裝於單AAV載體內。一般而言，所接受之AAV載體之大小限制為4.7 kb，雖然可考量較大的大小，而代價是減低的包裝效率。表28中的RGN切口酶具有長度為約3.15-3.45 kB的寫碼序列。為確保融合蛋白及其對應導引RNA二者之表現卡匣可裝進AAV載體內，本文描述了RGN的新穎活性刪除變異體。除使胺基酸序列縮短且因此使融合蛋白之RGN的寫碼序列縮短，聯結RGN及脫胺酶之胜肽聯結子亦可被縮短。最後，經由刪除分析以確定對將起作用的每一個要求的最小大小，諸如啟動子、增強子及/或終止子的基因元素亦可被工程化。
本揭露之一些實施方式提供使用本文描述之脫胺酶或RGN複合物編輯核酸以達成核鹼基變化（比如，A:T鹼基對至G:C鹼基對）的方法。於一些實施方式中，該方法是編輯核酸的核鹼基（比如，雙股DNA序列之鹼基對）的方法。於一些實施方式中，藉由使標的“A”核鹼基脫胺化及切除標的“A”核鹼基，本文描述之脫胺酶或RGN複合物用於將點突變引入核酸內。於一些實施方式中，標的核鹼基之脫胺化及切除導致基因缺陷的校正，比如，CFTR基因中的點突變的校正。於一些實施方式中，基因缺陷與疾病、病症或病況（比如，囊腫纖維化）關聯。舉例而言，於一些實施方式中，本文提供運用包括具有脫胺酶之融合蛋白的鹼基編輯RGN複合物來校正與基因缺陷關聯之基因，比如以校正CFTR基因中之點突變（比如，在增生性疾病的醫治中）的方法，該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399、及405-407中任一者所示序列具有至少80%一致性的胺基酸序列。於具體實施方式中，CFTR基因中之標的序列為62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、或563。
於一些實施方式中，本文提供之方法之目的為經由基因組編輯來恢復功能不良性基因之功能。本文提供之鹼基編輯蛋白可對比如藉由在人類細胞培養中校正疾病關聯突變之體外基於基因編輯的人療法有效。本領域中之通常知識者應該明白，本文提供之包括核酸結合蛋白（比如，nCas9）及核鹼基修飾域（比如，具有SEQ ID NO: 407、399、或405所示胺基酸序列之脫胺酶）的融合蛋白及/或RGN複合物可用於校正T至G之任一單點或T:A的配對變化為G:C。
於一些實施方式中，本文提供的是用於醫治被診斷具有與藉由本文描述之融合蛋白或RGN複合物可校正之點突變（比如，CFTR基因中之突變）關聯之或藉由本文描述之融合蛋白或RGN複合物可校正之點突變（比如，CFTR基因中之突變）引起之疾病的個體的方法。舉例而言，於一些實施方式中，提供一種方法，該方法包括對具有此種疾病（比如，囊腫纖維化）之個體投予有效量之本文揭露之融合蛋白或RGN複合物，本文揭露之融合蛋白或RGN複合物校正點突變或將去活化突變引入疾病關聯之基因。於一些實施方式中，提供一種方法，該方法包括對具有此種疾病（比如，與上面描述之點突變關聯之癌症）的個體投予有效量之本文揭露之融合蛋白、RGN複合物、或醫藥組成物，本文揭露之融合蛋白、RGN複合物、或醫藥組成物校正點突變或將去活化突變引入疾病關聯之基因。於具體實施方式中，與醫治囊腫纖維化的方法一起提供藉由投予有效量之本文揭露之醫藥組成物來降低囊腫纖維化之至少一個症狀的方法。當與對照患者相較時，醫治或降低囊腫纖維化的症狀的有效量之醫藥組成物可將囊腫纖維化之症狀（亦即，醫治）降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多；或約10-20%、15-25%、20-40%、30-50%、40-60%、50-70%、60-80%、70-90%、80-95%、或90-95%。於具體實施方式中，對照患者可為投予有效量之本文揭露之醫藥組成物之前的同一個患者。囊腫纖維化之症狀可包含但不限於：打噴嚏、產生黏液或痰的持續咳嗽、尤其是當鍛煉時呼吸短促、復發性肺臟感染、鼻塞、竇道塞（stuffy sinuses）、油脂惡臭糞便、便祕、噁心、腹部隆起（swollen abdomen）、食欲喪失等等。辨別及量測囊腫纖維化之症狀的方法為本領域中已知。
於所描述之用於修飾標的DNA分子之方法的一些實施方式中，接觸步驟在體外實行。於特定實施方式中，接觸步驟在活體內實行。於一些實施方式中，接觸步驟在個體（比如，人個體或非人的動物個體）內實行。於一些實施方式中，接觸步驟在諸如人或非人的動物細胞的細胞中實行。 XII. 包括多核苷酸基因修飾的細胞
本文提供了包括已使用藉由如本文描述的融合蛋白（視情況用gRNA）介導的過程修飾的所關注之標的核酸分子的細胞及生物體。於一些實施方式中，融合蛋白包括包括SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者的胺基酸序列的脫胺酶多肽、或其活性變異體或片段。於一些實施方式中，融合蛋白包括腺嘌呤脫胺酶，該腺嘌呤脫胺酶包括與SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的胺基酸序列。於一些實施方式中，融合蛋白包括脫胺酶及DNA結合多肽（比如，RNA導引之DNA結合多肽）。於進一步實施方式中，融合蛋白包括脫胺酶及RGN或其變異體，舉例而言，諸如APG07433.1（SEQ ID NO: 41）或其切口酶變異體nAPG07433.1（SEQ ID NO: 42）。於一些實施方式中，融合蛋白包括脫胺酶及Cas9或其變異體，舉例而言，諸如dCas9或切口酶Cas9。於一些實施方式中，融合蛋白包括II型CRISPR-Cas多肽的滅核酸酶活性或切口酶變異體。於一些實施方式中，融合蛋白包括V型CRISPR-Cas多肽的滅核酸酶活性或切口酶變異體。於一些實施方式中，融合蛋白包括VI型CRISPR-Cas多肽的滅核酸酶活性或切口酶變異體。
經修飾的細胞可為真核的（比如，哺乳動物、植物、昆蟲、禽類細胞）或原核的。亦提供包括至少一種核苷酸序列的胞器及胚胎，該核苷酸序列已藉由採用如本文描述的融合蛋白的過程被修飾。經基因修飾的細胞、生物體、胞器、及胚胎對於經修飾的核苷酸序列可為異型接合的或同型接合的。藉由融合蛋白的脫胺酶域引入的（多個）突變可導致改變的表現（向上調節或向下調節）、滅活、或改變的蛋白質產物或整合的序列的表現。於其中（多個）突變導致基因滅活或非功能性蛋白質產物表現的那些範例中，經基因修飾的細胞、生物體、胞器或胚胎被稱為“擊出（knock out）”。該擊出表現型可為刪除突變（亦即，至少一個核苷酸的刪除）、插入突變（亦即，至少一個核苷酸的插入）、或無意義突變（亦即，至少一個核苷酸的置換，藉以使得停止密碼子被引入）的結果。
於一些實施方式中，藉由融合蛋白的脫胺酶域引入的（多個）突變導致變異體蛋白質產物的產生。表現的變異體蛋白質產物可具有至少一個胺基酸置換及/或至少一個胺基酸的添加或刪除。當與野生型蛋白質相較時，變異體蛋白質產物可呈現出經修飾的特徵或活性，包含但不限於改變的酶活性或基質專一性。
於一些實施方式中，藉由融合蛋白的脫胺酶域引入的（多個）突變導致改變的蛋白質表現模式。作為非限制性實例，控制蛋白質產物表現的調節區域中的（多個）突變可導致蛋白質產物過度表現或向下調節或改變的組織或時間表現模式。
已經被修飾的細胞可按照傳統方式生長成生物體，諸如，植物。參見，舉例而言，McCormick等人（1986） Plant Cell Reports5：81-84。然後，可使此等植物生長，且用相同修飾品系（modified strain）或不同品系授粉，且所得雜合體具有基因修飾。本發明提供基因修飾種子。再生植物的子代、變異體及突變體亦包含於本發明之範圍內，前提條件是此等局部包括基因修飾。進一步提供了保持了基因修飾的經加工的植物產物或副產物，舉例而言，包含豆粕。
本文提供之方法可用於修飾任何植物物種，包含但不限於單子葉植物及雙子葉植物。所關注之植物之實例包含但不限於：玉蜀黍（玉米）、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、稻穀、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、及油菜、芸苔屬物種、苜蓿、黑麥、小米、紅花、花生、甘藷、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、木瓜、腰果、澳洲胡桃、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物以及針葉樹。
蔬菜包含但不限於：番茄、萵苣、綠豆、皇帝豆、豌豆、及諸如胡瓜、網紋甜瓜及洋香瓜之黃瓜屬的成員。觀賞植物包含但不限於：杜鵑花、繡球花、芙蓉、玫瑰、鬱金香、水仙、矮牽牛、康乃馨、猩猩木及菊花。較佳地，本發明之植物為農作物（舉例而言，玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、稻穀、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等）。
本文提供之方法亦可使用於基因修飾任何原核物種，包含但不限於：古生菌及細菌（比如， 芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬、鏈黴菌屬、根瘤菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏桿菌屬、弧菌屬、耶爾森菌屬、支原體菌屬、農桿菌屬、乳酸乳桿菌屬）。
本文提供之方法可使用於基因修飾任何真核物種或來自於其的細胞，包含但不限於：動物（比如，哺乳動物、昆蟲、魚類、鳥類、及爬蟲類物）、真菌、變形蟲、藻類、及酵母。於一些實施方式中，目前揭露之方法修飾之細胞包含造血源之細胞，諸如，免疫細胞（亦即，先天性或適應性免疫系統之細胞），包含但不限於：B細胞、T細胞、自然殺手（NK）細胞、多能幹細胞、經誘導之多能幹細胞、嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞、單核細胞、巨噬細胞、及樹突細胞。
經修飾之細胞可被引入生物體內。在自體細胞移植的情況中，此等細胞可源自同一個生物體（比如，人），其中該細胞以離體措施被修飾。於一些實施方式中，在異體細胞移植的情況中，該細胞源自同一個物種中之另一個生物體（比如，另一個人）。 XIII. 套組
此揭露的一些態樣提供包括本發明之脫胺酶的套組。於某些實施方式中，本揭露提供包括融合蛋白之套組，該融合蛋白包括本發明之脫胺酶及DNA結合多肽（比如，RNA導引之DNA結合多肽，諸如，RGN多肽，舉例而言，滅核酸酶活性Cas9域）以及視情況而定的位於DNA結合多肽域與脫胺酶之間的聯結子。此外，於一些實施方式中，套組包括合適的試劑、緩衝液、及/或使用融合蛋白比如在體外或活體內進行DNA或RNA編輯之說明。於一些實施方式中，套組包括關於用於核苷酸序列靶向編輯的適合的gRNA之設計及使用的說明。
於一些實施方式中，醫藥組成物可被提供為醫藥套組，該醫藥套組包括（a）含有冷凍乾燥形式的本揭露之組成物的容器及（b）含有醫藥上可接受之注射用稀釋劑（比如，無菌水）的第二容器。醫藥上可接受之稀釋劑可被用於本揭露之冷凍乾燥化合物的復原或稀釋。視情況與（多個）此等容器關聯的可為調節醫藥或生物產物之製造、使用或銷售之政府機構規定形式的通知，該通知反映藉由製造、使用或銷售機構對人投予的批准。
冠詞“一（a）”及“一（an）”在本文中用於指該冠詞的一或多於一個（亦即，至少一個）的語法對象。作為實例，“一多肽”表達一或多個多肽。
說明書中提及的所有出版物及專利申請案暗示本揭露內容所屬領域中具有通常知識者的層次。所有出版物及專利申請案藉由引用併入本文，如同每一個單獨出版物或專利申請案被具體且單獨地指示藉由引用而被併入本文。
雖然為了清楚理解的目的已經作為示例及實例頗詳細地描述了前述發明，但顯然可在所附請求項的範疇內實踐某些改變及修改。 非限制性實施方式包含：
1. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
2. 如實施方式1的分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
3. 如實施方式1的分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
4. 一種核酸分子，包括編碼脫胺酶多肽之多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
5. 如實施方式4的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
6. 如實施方式4的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451, 449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
7. 如實施方式4的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
8. 如實施方式4的核酸分子，其中該脫胺酶多肽具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
9. 如實施方式4的核酸分子，其中該脫胺酶多肽具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
10. 如實施方式4-9中任一實施方式的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的異源啟動子。
11. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式1-3中任一者的多肽或實施方式4-10中任一者的核酸分子。
12. 如實施方式11的醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑與該多肽或該核酸分子異源。
13. 如實施方式11或12的醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑不是天然存在的。
14. 一種融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的脫胺酶。
15. 如實施方式14的融合蛋白，其中該脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性。
16. 如實施方式14的融合蛋白，其中該脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
17. 如實施方式14-16中任一實施方式的融合蛋白，其中該脫胺酶為腺嘌呤脫胺酶。
18. 如實施方式14-17中任一實施方式的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或TALEN。
19. 如實施方式14-17中任一實施方式的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為RNA導引之DNA結合多肽。
20. 如實施方式19的融合蛋白，其中該RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
21. 如實施方式20的融合蛋白，其中該RGN為II型CRISPR-Cas多肽。
22. 如實施方式20的融合蛋白，其中該RGN為V型CRISPR-Cas多肽。
23. 如實施方式20-22中任一實施方式的融合蛋白，其中該RGN為RGN切口酶。
24. 如實施方式20的融合蛋白，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
25. 如實施方式20的融合蛋白，其中該RGN具有SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者的胺基酸序列。
26. 如實施方式23的融合蛋白，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
27. 如實施方式14-26中任一實施方式的融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包括至少一個核定位訊號（NLS）。
28. 一種核酸分子，包括編碼融合蛋白之多核苷酸，該融合蛋白包括DNA結合多肽及脫胺酶，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
29. 如實施方式28的核酸分子，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少90%序列一致性。
30. 如實施方式28的核酸分子，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少95%序列一致性。
31. 如實施方式28的核酸分子，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有100%序列一致性。
32. 如實施方式28的核酸分子，其中該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
33. 如實施方式28的核酸分子，其中該核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
34. 如實施方式28-33中任一實施方式的核酸分子，其中該脫胺酶為腺嘌呤脫胺酶。
35. 如實施方式28-34中任一實施方式的核酸分子，其中該DNA結合多肽為大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或TALEN。
36. 如實施方式28-34中任一實施方式的核酸分子，其中該DNA結合多肽為RNA導引之DNA結合多肽。
37. 如實施方式36的核酸分子，其中該RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
38. 如實施方式37的核酸分子，其中該RGN為II型CRISPR-Cas多肽。
39. 如實施方式37的核酸分子，其中該RGN為V型CRISPR-Cas多肽。
40. 如實施方式37-39中任一實施方式的核酸分子，其中該RGN為RGN切口酶。
41. 如實施方式37的核酸分子，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
42. 如實施方式37的核酸分子，其中該RGN為SEQ ID NO: 41、60、366、或368。
43. 如實施方式40的核酸分子，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
44. 如實施方式28-43中任一實施方式的核酸分子，其中編碼融合蛋白的多核苷酸於其5'末側處可操作地聯結至異源啟動子。
45. 如實施方式28-44中任一實施方式的核酸分子，其中編碼融合蛋白的多核苷酸於其3'末側處可操作地聯結至異源啟動子。
46. 如實施方式28-45中任一實施方式的核酸分子，其中該融合蛋白包括一或多個核定位訊號。
47. 如實施方式28-46中任一實施方式的核酸分子，其中該融合蛋白針對於真核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
48. 如實施方式28-46中任一實施方式的核酸分子，其中該融合蛋白針對於原核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
49. 一種包括實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子的載體。
50. 一種包括實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子的載體，進一步包括將能夠與標的序列雜合之導引RNA（gRNA）編碼的至少一個核苷酸序列。
51. 如實施方式50的載體，其中該gRNA為單導引RNA。
52. 如實施方式50的載體，其中該gRNA為雙導引RNA。
53. 一種包括實施方式14-27中任一實施方式的融合蛋白的細胞。
54. 一種包括實施方式14-27中任一實施方式的融合蛋白的細胞，其中該細胞進一步包括導引RNA。
55. 一種包括實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子的細胞。
56. 一種包括實施方式49-52中任一實施方式的載體的細胞。
57. 如實施方式53-56中任一實施方式的細胞，其中該細胞為原核細胞。
58. 如實施方式53-56中任一實施方式的細胞，其中該細胞為真核細胞。
59. 如實施方式58的細胞，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
60. 如實施方式59的細胞，其中該哺乳動物細胞為人細胞。
61. 如實施方式60的細胞，其中該人細胞為免疫細胞。
62. 如實施方式61的細胞，其中該免疫細胞為幹細胞。
63. 如實施方式62的細胞，其中該幹細胞為經誘導之多能幹細胞。
64. 如實施方式58的細胞，其中該真核細胞為昆蟲或禽類細胞。
65. 如實施方式58的細胞，其中該真核細胞為為真菌細胞。
66. 如實施方式58的細胞，其中該真核細胞為植物細胞。
67. 一種包括實施方式66的細胞的植物。
68. 一種包括實施方式66的細胞的種子。
69. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式14-27中任一實施方式的融合蛋白、實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子、實施方式49-52中任一實施方式的載體、或實施方式59-63中任一實施方式的細胞。
70. 一種製作融合蛋白的方法，包括在該融合蛋白被表現的條件下，培養實施方式53-56中任一實施方式的細胞。
71. 一種製作融合蛋白的方法，包括將實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子或實施方式49-52中任一實施方式的載體引入細胞內，及在該融合蛋白被表現的條件下，培養該細胞。
72. 如實施方式70或71的方法，進一步包含純化該融合蛋白。
73. 一種製作RGN融合核糖核蛋白複合物的方法，包括將實施方式37-43中任一實施方式的核酸分子及包括對導引RNA編碼的表現卡匣的核酸分子、或實施方式50-52中任一實施方式的載體引入細胞內，及在該融合蛋白及gRNA被表現且形成RGN融合核糖核蛋白複合物的條件下，培養該細胞。
74. 如實施方式73的方法，進一步包含純化該RGN融合核糖核蛋白複合物。
75. 一種修飾包括標的DNA序列的標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA，或編碼一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中該一或多個導引RNA能夠與融合蛋白形成複合物，以便將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾標的DNA分子。
76. 如實施方式75的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
77. 如實施方式75的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
78. 如實施方式75-77中任一實施方式的系統，其中編碼一或多個導引RNA的至少一個該核苷酸序列及編碼融合蛋白的該核苷酸序列可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之啟動子。
79. 如實施方式75-78中任一實施方式的系統，其中該標的DNA序列為真核標的DNA序列。
80. 如實施方式75-79中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列與藉由RGN辨識的原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
81. 如實施方式75-80中任一實施方式的系統，其中該標的DNA分子在細胞內。
82. 如實施方式81的系統，其中該細胞為真核細胞。
83. 如實施方式82的系統，其中該真核細胞為植物細胞。
84. 如實施方式82的系統，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
85. 如實施方式84的系統，其中該哺乳動物細胞為人細胞。
86. 如實施方式85的系統，其中該人細胞為免疫細胞。
87. 如實施方式86的系統，其中該免疫細胞為幹細胞。
88. 如實施方式87的系統，其中該幹細胞為經誘導之多能幹細胞。
89. 如實施方式82的系統，其中該真核細胞為昆蟲細胞。
90. 如實施方式81的系統，其中該細胞為原核細胞。
91. 如實施方式75-90中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白之RGN為II型CRISPR-Cas多肽。
92. 如實施方式75-90中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白之RGN為V型CRISPR-Cas多肽。
93. 如實施方式75-90中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白之RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、或368具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
94. 如實施方式75-90中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白之RGN具有SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者的胺基酸序列。
95. 如實施方式75-90中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白之RGN為RGN切口酶。
96. 如實施方式95的系統，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
97. 如實施方式75-96中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白包括一或多個核定位訊號。
98. 如實施方式75-97中任一實施方式的系統，其中該融合蛋白針對於真核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
99. 如實施方式75-98中任一實施方式的系統，其中編碼一或多個導引RNA之核苷酸序列及編碼融合蛋白之核苷酸序列被定位於一個載體上。
100. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式75-99中任一實施方式的系統。
101. 一種用於修飾包括標的DNA序列之標的DNA分子的方法，該方法包括將根據實施方式75-99中任一實施方式的系統遞送至該標的DNA分子或包括標的DNA分子的細胞。
102. 如實施方式101的方法，其中該經修飾之標的DNA分子包括標的DNA分子內的至少一個核苷酸的A＞N突變，其中N為C、G、或T。
103. 如實施方式102的方法，其中該經修飾之標的DNA分子包括標的DNA分子內的至少一個核苷酸的A＞ G突變。
104. 一種用於修飾包括標的序列之標的DNA分子的方法，包括： a）在適合形成RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下，藉由組合以下者來在體外組裝RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物： i）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中至少一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的細胞與該在體外組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生標的DNA分子的修飾。
105. 如實施方式104的方法，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
106. 如實施方式104的方法，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
107. 如實施方式104-106中任一實施方式的方法，其中該經修飾之標的DNA分子包括標的DNA分子內的至少一個核苷酸的A＞N突變，其中N為C、G、或T。
108. 如實施方式107的方法，其中該經修飾之標的DNA分子包括標的DNA分子內的至少一個核苷酸的A＞ G突變。
109. 如實施方式104-108中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白之RGN為II型CRISPR-Cas多肽。
110. 如實施方式104-108中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白之RGN為V型CRISPR-Cas多肽。
111. 如實施方式104-108中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白之RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、或368具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
112. 如實施方式104-108中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白之RGN具有SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者的胺基酸序列。
113. 如實施方式104-108中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白之RGN為RGN切口酶。
114. 如實施方式113的方法，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
115. 如實施方式104-114中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白包括一或多個核定位訊號。
116. 如實施方式104-114中任一實施方式的方法，其中該融合蛋白針對於真核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
117. 如實施方式104-116中任一實施方式的方法，其中該標的DNA序列為真核標的DNA序列。
118. 如實施方式104-117中任一實施方式的方法，其中該標的DNA序列與原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
119. 如實施方式104-118中任一實施方式的方法，其中該標的DNA分子在細胞內。
120. 如實施方式119的方法，其中該細胞為真核細胞。
121. 如實施方式120的方法，其中該真核細胞為植物細胞。
122. 如實施方式120的方法，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
123. 如實施方式122的方法，其中該哺乳動物細胞為人細胞。
124. 如實施方式123的方法，其中該人細胞為免疫細胞。
125. 如實施方式124的方法，其中該免疫細胞為幹細胞。
126. 如實施方式125的方法，其中該幹細胞為經誘導之多能幹細胞。
127. 如實施方式120的方法，其中該真核細胞為昆蟲細胞。
128. 如實施方式119的方法，其中該細胞為原核細胞。
129. 如實施方式119-128中任一實施方式的方法，進一步包括選擇包括該經修飾之DNA分子的細胞。
130. 一種包括根據實施方式129的方法之經修飾之標的DNA序列的細胞。
131. 如實施方式130的細胞，其中該細胞為真核細胞。
132. 如實施方式131的細胞，其中該真核細胞為植物細胞。
133. 一種包括實施方式132的細胞的植物。
134. 一種包括實施方式132的細胞的種子。
135. 如實施方式131的細胞，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
136. 如實施方式135的細胞，其中該哺乳動物細胞為人細胞。
137. 如實施方式136的細胞，其中該人細胞為免疫細胞。
138. 如實施方式137的細胞，其中該免疫細胞為幹細胞。
139. 如實施方式138的細胞，其中該幹細胞為經誘導之多能幹細胞。
140. 如實施方式131的細胞，其中該真核細胞為昆蟲細胞。
141. 如實施方式130的細胞，其中該細胞為原核細胞。
142. 一種醫藥組成物，包括實施方式135-139中任一實施方式的細胞及醫藥學上可接受之載劑。
143. 一種利用針對基因遺傳性疾病的因果突變中的校正來產生經基因修飾之細胞的方法，該方法包括將以下者引入細胞內： a）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的多核苷酸，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO：407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90％序列一致性的胺基酸序列，其中編碼該融合蛋白的該多核苷酸可操作地聯結至啟動子，以賦能融合蛋白在細胞中的表現；及 b）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA（gRNA）或編碼該gRNA的多核苷酸，其中編碼gRNA的該多核苷酸可操作地聯結至啟動子，以賦能gRNA在細胞中的表現， 藉以，融合蛋白及gRNA靶向因果突變的基因組位址且修飾基因組序列以除去該因果突變。
144. 如實施方式143的方法，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
145. 如實施方式143的方法，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
146. 如實施方式143-145中任一實施方式的方法，其中融合蛋白之該RGN為RGN切口酶。
147. 如實施方式146的方法，其中RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
148. 如實施方式143-147中任一實施方式的方法，其中基因組修飾包括將至少一個核苷酸的A＞G突變引入標的DNA序列內。
149. 如實施方式143-148中任一實施方式的方法，其中該細胞為動物細胞。
150. 如實施方式149的方法，其中該動物細胞為哺乳動物細胞。
151. 如實施方式150的方法，其中該細胞為從狗、貓、小鼠、大鼠、兔、馬、綿羊、山羊、牛、豬或人取得。
152. 如實施方式143-151中任一實施方式的方法，其中因果突變之校正包括校正無意義突變。
153. 如實施方式149的方法，其中基因遺傳疾病為列於表34中之疾病。
154. 如實施方式149的方法，其中基因遺傳疾病為囊腫纖維化。
155. 如實施方式154的方法，其中gRNA進一步包括靶向SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563中任一者的間隔體序列或其補體。
156. 如實施方式155的方法，其中gRNA包括SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者。
157. 一種CRISPR RNA（crRNA）或編碼該CRISPR RNA（crRNA）的核苷酸分子，其中該CRISPR RNA包括靶向囊腫纖維化跨膜傳導調節子（CFTR）基因內的標的DNA序列的間隔體序列，其中該標的序列具有SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、562、及563中任一者所示的序列或其補體。
158. 一種包括實施方式157的crRNA的導引RNA。
159. 如實施方式158的導引RNA，其中該導引RNA為雙導引RNA。
160. 如實施方式158的導引RNA，其中該導引RNA為單導引RNA（sgRNA）。
161. 如實施方式160的導引RNA，其中該sgRNA與SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者具有至少90%序列一致性。
162. 如實施方式160的導引RNA，其中該sgRNA與SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者具有至少95%序列一致性。
163. 如實施方式160的導引RNA，其中該sgRNA具有SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者所示的序列。
164. 一種載體，包括編碼實施方式158-163中任一實施方式的該導引RNA的一或多個核酸分子。
165. 一種用於結合DNA分子的標的DNA序列的系統，該系統包括： a）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA，或包括編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列的一或多個多核苷酸；及 b）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及腺嘌呤脫胺酶的融合蛋白或包括編碼該融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸； 其中該一或多個導引RNA能夠與標的DNA序列雜合， 其中一或多個導引RNA能夠與RGN多肽形成複合物，以便將該RGN多肽導向至與DNA分子的該標的DNA序列結合，及 其中至少一個導引RGN包括CRISPR RNA（crRNA），該CRISPR RNA（crRNA）包括靶向囊腫纖維化跨膜傳導調節子（CFTR）基因內的標的DNA序列的間隔體序列，其中該標的序列具有如SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、562、及563中任一者所示的序列或其補體。
166. 如實施方式165的系統，其中編碼一或多個導引RNA的該核苷酸序列及編碼融合蛋白的該核苷酸序列中至少一者可操作地聯結至與該核苷酸序列異源的啟動子。
167. 一種用於結合DNA分子的標的DNA序列的系統，該系統包括： a）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA，或包括編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列的一或多個多核苷酸；及 b）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及腺嘌呤脫胺酶的融合蛋白； 其中該一或多個導引RNA能夠與標的DNA序列雜合， 其中一或多個導引RNA能夠與RGN多肽形成複合物，以便將該RGN多肽導向至與DNA分子的該標的DNA序列結合，及 其中至少一個導引RGN包括CRISPR RNA（crRNA），該CRISPR RNA（crRNA）包括靶向囊腫纖維化跨膜傳導調節子（CFTR）基因內的標的DNA序列的間隔體序列，其中該標的序列具有如SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、562、及563中任一者所示的序列或其補體。
168. 如實施方式167的系統，其中編碼一或多個導引RNA的該核苷酸序列中至少一者可操作地聯結至與該核苷酸序列異源的啟動子。
169. 如實施方式165-168中任一實施方式的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
170. 如實施方式165-168中任一實施方式的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
171. 如實施方式165-168中任一實施方式的系統，其中該脫胺酶具有具有SEQ ID NO: 1-10及399-441中任一者所示序列的胺基酸序列。
172. 如實施方式165-171中任一實施方式的系統，其中未發現該RGN多肽與該一或多個導引RNA在本質上彼此複合。
173. 如實施方式165-172中任一實施方式的系統，其中 a）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 62-68、80-85、116-119、128-131、163、164、180、181、203-209、219-225、256-258、274-276、310-313、及330-333中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有至少90%序列一致性的序列； b）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 68-71、86-89、120-122、132-134、152-156、169-173、213-215、229-231、251-255、269-273、305-309、及325-329中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有至少90%序列一致性的序列； c）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 72、73、90、91、161、162、178、179、265、266、283、及284中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有至少90%序列一致性的序列； d）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 74、75、92、93、123、124、135、136、167、184、216-218、232-234、259-261、277-279、314-317、及334-337中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有至少90%序列一致性的序列； e）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 76、94、210-212、226-228、322、342、562、及563中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有至少90%序列一致性的序列； f）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 77、95、125、137、157-160、174-177、323、及343中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有至少90%序列一致性的序列； g）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 78、96、126、138、168、185、267、285、318、319、338、及339中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性的序列； h）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 79、97、127、139、262-264、280-282、324、及344中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有至少90%序列一致性的序列；及 i）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 165、166、182、183、268、286、320、321、340、及341中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有至少90%序列一致性的序列。
174. 如實施方式165-172中任一實施方式的系統，其中 a）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 62-68、80-85、116-119、128-131、163、164、180、181、203-209、219-225、256-258、274-276、310-313、及330-333中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有至少95%序列一致性的序列； b）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 68-71、86-89、120-122、132-134、152-156、169-173、213-215、229-231、251-255、269-273、305-309、及325-329中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有至少95%序列一致性的序列； c）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 72、73、90、91、161、162、178、179、265、266、283、及284中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有至少95%序列一致性的序列； d）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 74、75、92、93、123、124、135、136、167、184、216-218、232-234、259-261、277-279、314-317、及334-337中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有至少95%序列一致性的序列； e）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 76、94、210-212、226-228、322、342、562、及563中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有至少95%序列一致性的序列； f）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 77、95、125、137、157-160、174-177、323、及343中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有至少95%序列一致性的序列； g）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 78、96、126、138、168、185、267、285、318、319、338、及339中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性的序列； h）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 79、97、127、139、262-264、280-282、324、及344中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有至少95%序列一致性的序列；及 i）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 165、166、182、183、268、286、320、321、340、及341中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有至少95%序列一致性的序列。
175. 如實施方式165-172中任一實施方式的系統，其中 a）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 62-68、80-85、116-119、128-131、163、164、180、181、203-209、219-225、256-258、274-276、310-313、及330-333中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有100%序列一致性的序列； b）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 68-71、86-89、120-122、132-134、152-156、169-173、213-215、229-231、251-255、269-273、305-309、及325-329中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有100%序列一致性的序列； c）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 72、73、90、91、161、162、178、179、265、266、283、及284中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有100%序列一致性的序列； d）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 74、75、92、93、123、124、135、136、167、184、216-218、232-234、259-261、277-279、314-317、及334-337中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有100%序列一致性的序列； e）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 76、94、210-212、226-228、322、342、562、及563中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有100%序列一致性的序列； f）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 77、95、125、137、157-160、174-177、323、及343中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有100%序列一致性的序列； g）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 78、96、126、138、168、185、267、285、318、319、338、及339中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有100%序列一致性的序列； h）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 79、97、127、139、262-264、280-282、324、及344中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有100%序列一致性的序列；及 i）該標的DNA序列具有如SEQ ID NO: 165、166、182、183、268、286、320、321、340、及341中任一者所示的序列或其補體，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有100%序列一致性的序列。
176. 如實施方式165-175中任一實施方式的系統，其中至少一個導引RNA為雙導引RNA。
177. 如實施方式165-175中任一實施方式的系統，其中至少一個導引RNA為單導引RNA（sgRNA）。
178. 如實施方式177的系統，其中 a）該sgRNA與SEQ ID NO: 98-104、140-143、197、198、235-241、292-294、及350-353中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有至少90%序列一致性的序列； b）該sgRNA與SEQ ID NO: 104-107、144-146、186-190、245-247、287-291、及345-349中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有至少90%序列一致性的序列； c）該sgRNA與SEQ ID NO: 108、109、195、196、301、及302中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有至少90%序列一致性的序列； d）該sgRNA與SEQ ID NO: 110、111、147、148、201、248-250、295-297、及354-357中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有至少90%序列一致性的序列； e）該sgRNA與SEQ ID NO: 112、242-244、362、及564中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有至少90%序列一致性的序列； f）該sgRNA與SEQ ID NO: 113、149、191-194、及363中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有至少90%序列一致性的序列； g）該sgRNA與SEQ ID NO: 114、150、202、303、358、及359中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性的序列； h）該sgRNA與SEQ ID NO: 115、151、298-300、及364中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有至少90%序列一致性的序列；及 i）該sgRNA與SEQ ID NO: 199、200、304、360、及361中任一者具有至少90%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有至少90%序列一致性的序列。
179. 如實施方式177的系統，其中 a）該sgRNA與SEQ ID NO: 98-104、140-143、197、198、235-241、292-294、及350-353中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有至少95%序列一致性的序列； b）該sgRNA與SEQ ID NO: 104-107、144-146、186-190、245-247、287-291、及345-349中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有至少95%序列一致性的序列； c）該sgRNA與SEQ ID NO: 108、109、195、196、301、及302中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有至少95%序列一致性的序列； d）該sgRNA與SEQ ID NO: 110、111、147、148、201、248-250、295-297、及354-357中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有至少95%序列一致性的序列； e）該sgRNA與SEQ ID NO: 112、242-244、362、及564中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有至少95%序列一致性的序列； f）該sgRNA與SEQ ID NO: 113、149、191-194、及363中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有至少95%序列一致性的序列； g）該sgRNA與SEQ ID NO: 114、150、202、303、358、及359中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有至少95%序列一致性的序列； h）該sgRNA與SEQ ID NO: 115、151、298-300、及364中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有至少95%序列一致性的序列；及 i）該sgRNA與SEQ ID NO: 199、200、304、360、及361中任一者具有至少95%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有至少95%序列一致性的序列。
180. 如實施方式177的系統，其中 a）該sgRNA與SEQ ID NO: 98-104、140-143、197、198、235-241、292-294、及350-353中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 53具有100%序列一致性的序列； b）該sgRNA與SEQ ID NO: 104-107、144-146、186-190、245-247、287-291、及345-349中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 55具有100%序列一致性的序列； c）該sgRNA與SEQ ID NO: 108、109、195、196、301、及302中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 52具有100%序列一致性的序列； d）該sgRNA與SEQ ID NO: 110、111、147、148、201、248-250、295-297、及354-357中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 56具有100%序列一致性的序列； e）該sgRNA與SEQ ID NO: 112、242-244、362、及564中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 42具有100%序列一致性的序列； f）該sgRNA與SEQ ID NO: 113、149、191-194、及363中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 54具有100%序列一致性的序列； g）該sgRNA與SEQ ID NO: 114、150、202、303、358、及359中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 57具有100%序列一致性的序列； h）該sgRNA與SEQ ID NO: 115、151、298-300、及364中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 58具有100%序列一致性的序列；及 i）該sgRNA與SEQ ID NO: 199、200、304、360、及361中任一者具有100%序列一致性，且其中該RGN多肽具有與SEQ ID NO: 59具有100%序列一致性的序列。
181. 一種細胞，包括實施方式157的crRNA或核酸分子、實施方式158-163中任一實施方式的導引RNA、實施方式164的載體或實施方式165-180中任一實施方式的系統。
182. 一種醫藥組成物，包括實施方式157的crRNA或核酸分子、實施方式158-163中任一實施方式的導引RNA、實施方式164的載體、實施方式181的細胞、或實施方式165-180中任一實施方式的系統、及醫藥學上可接受之載劑。
183. 一種組成物，包括： a）包括DNA結合多肽及腺嘌呤脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸分子；及 b)與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的第二腺嘌呤脫胺酶；或編碼該脫胺酶的核酸分子。
184. 如實施方式183的組成物，其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
185. 如實施方式183的組成物，其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
186. 如實施方式183-185中任一實施方式的組成物，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
187. 如實施方式183-186中任一實施方式的組成物，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性。
188. 如實施方式183-186中任一實施方式的組成物，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
189. 如實施方式183-188中任一實施方式的組成物，其中該DNA結合多肽為大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或TALEN。
190. 如實施方式183-189中任一實施方式的組成物，其中該DNA結合多肽為RNA導引之DNA結合多肽。
191. 如實施方式190的組成物，其中該RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
192. 如實施方式191的組成物，其中該RGN為RGN切口酶。
193. 一種載體，包括編碼融合蛋白的核酸分子及編碼第二脫胺酶的核酸分子，其中該融合蛋白包括DNA結合多肽及第一腺嘌呤脫胺酶，且其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
194. 如實施方式193的載體，其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
195. 如實施方式193的載體，其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
196. 如實施方式193-195中任一實施方式的載體，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
197. 如實施方式193-195中任一實施方式的載體，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性。
198. 如實施方式193-195中任一實施方式的載體，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
199. 如實施方式193-198中任一實施方式的載體，其中該DNA結合多肽為大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或TALEN。
200. 如實施方式193-198中任一實施方式的載體，其中該DNA結合多肽為RNA導引之DNA結合多肽。
201. 如實施方式200的載體，其中該RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
202. 如實施方式201的載體，其中該RGN為RGN切口酶。
203. 一種包括實施方式193-202中任一實施方式的載體的細胞。
204. 一種細胞，包括： a）包括DNA結合多肽及第一腺嘌呤脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸分子；及 b)與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的第二腺嘌呤脫胺酶；或編碼該第二腺嘌呤脫胺酶的核酸分子。
205. 如實施方式204的細胞，其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
206. 如實施方式204的細胞，其中該第二腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
207. 如實施方式204-206中任一實施方式的細胞，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性。
208. 如實施方式204-206中任一實施方式的細胞，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少95%序列一致性。
209. 如實施方式204-206中任一實施方式的細胞，其中第一腺嘌呤脫胺酶與SEQ ID NO: 407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有100%序列一致性。
210. 如實施方式204-209中任一實施方式的細胞，其中該DNA結合多肽為大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或TALEN。
211. 如實施方式204-209中任一實施方式的細胞，其中該DNA結合多肽為RNA導引之DNA結合多肽。
212. 如實施方式211的細胞，其中該RNA導引之DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
213. 如實施方式212的細胞，其中該RGN為RGN切口酶。
214. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式183-192中任一實施方式的組成物、實施方式193-202中任一實施方式的載體、或實施方式203-213中任一實施方式的細胞。
215. 一種醫治疾病的方法，該方法包括對需要其之個體投予有效量的實施方式69、100、142、及214中任一實施方式的醫藥組成物。
216. 如實施方式215的方法，其中該疾病與因果突變關聯，且該有效量的該醫藥組成物校正該因果突變。
217. 實施方式14-27中任一實施方式的融合蛋白、實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子、實施方式49-52及193-202中任一實施方式的載體、實施方式59-63、135-139、及203-213中任一實施方式的細胞、實施方式75-99中任一實施方式的系統、或實施方式183-192中任一實施方式的組成物對於醫治個體的疾病的用途。
218. 如實施方式217的用途，其中該疾病與因果突變關聯，且該醫治包括校正該因果突變。
219. 實施方式14-27中任一實施方式的融合蛋白、實施方式28-48中任一實施方式的核酸分子、實施方式49-52及193-202中任一實施方式的載體、實施方式59-63、135-139、及203-213中任一實施方式的細胞、實施方式75-99中任一實施方式的系統、或實施方式183-192中任一實施方式的組成物對於製造有用於醫治疾病的藥品的用途。
220. 如實施方式219的用途，其中該疾病與因果突變關聯，且有效量的該藥品校正該因果突變。
221. 一種包括編碼RNA導引之核酸酶（RGN）多肽的多核苷酸的核酸分子，其中該多核苷酸包括編碼RGN多肽的核苷酸序列，該RGN多肽包括與SEQ ID NO：41或60具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，但缺少SEQ ID NO：41或60的胺基酸殘基590至597； 其中當與能夠與該標的DNA序列雜合的導引RNA（gRNA）結合時，該RGN多肽能夠以RNA導引之序列專一性方式結合標的DNA序列。
222. 如實施方式221的核酸分子，其中編碼RGN多肽的該多核苷酸可操作地聯結至與該多核苷酸異源之啟動子。
223. 如實施方式221或222的核酸分子，其中該RGN多肽包括與SEQ ID NO：366或368具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
224. 如實施方式221或222的核酸分子，其中該RGN多肽包括SEQ ID NO：366或368的胺基酸序列。
225. 如實施方式221-223中任一實施方式的核酸分子，其中該RGN多肽為為無核酸酶活性的或起切口酶作用的。
226. 如實施方式225的核酸分子，其中該切口酶具有SEQ ID NO: 397或398所示的胺基酸序列。
227. 如實施方式221-226中任一實施方式的核酸分子，其中該RGN多肽可操作地聯結至鹼基編輯多肽。
228. 一種載體，包括請求項221-227中任一項的核酸分子。
229. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 41或60具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，但缺少SEQ ID NO: 41或60的胺基酸殘基590至597，其中該多肽為RNA導引之核酸酶。
230. 如實施方式229的分離的多肽，其中該RGN多肽包括與SEQ ID NO: 366或368具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
231. 如實施方式230的分離的多肽，其中該RGN多肽包括SEQ ID NO: 366或368的胺基酸序列。
232. 如實施方式229或230的分離的多肽，其中該RGN多肽為為無核酸酶活性的或起切口酶作用的。
233. 如實施方式232的分離的多肽，其中該切口酶具有SEQ ID NO: 397或398所示的胺基酸序列。
234. 如實施方式229-233中任一實施方式的分離的多肽，其中RGN多肽與鹼基編輯多肽可操作地融合。
235. 一種細胞，包括實施方式221-227中任一實施方式的核酸分子、請求項228的載體、或請求項229-234中任一項的多肽。
236. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
237. 如實施方式236的分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
238. 如實施方式236的分離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO: 407所示的胺基酸序列。
239. 一種核酸分子，包括編碼脫胺酶多肽的多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
240. 如實施方式239的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
241. 如實施方式239的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
242. 如實施方式239的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451具有至少100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
243. 如實施方式239-242中任一實施方式的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的異源啟動子。
244. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式236-238中任一實施方式的多肽或實施方式239-242中任一實施方式的核酸分子。
245. 一種融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的脫胺酶。
246. 如實施方式245的融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 407具有至少95%序列一致性的脫胺酶。
247. 如實施方式245的融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 407具有100%序列一致性的脫胺酶。
248. 如實施方式245-247中任一實施方式的融合蛋白，其中DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
249. 如實施方式248的融合蛋白，其中該RGN多肽為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
250. 如實施方式248-249中任一實施方式的融合蛋白，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN多肽。
251. 如實施方式248-250中任一實施方式的融合蛋白，其中RGN多肽為切口酶。
252. 如實施方式251的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
253. 如實施方式251的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
254. 一種核酸分子，包括編碼包括DNA結合多肽及脫胺酶的融合蛋白的多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
255. 如實施方式254的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
256. 如實施方式254的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
257. 如實施方式254的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 451具有至少100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
258. 如實施方式254-257中任一實施方式的核酸分子，其中該DNA結合多肽為RGN多肽。
259. 如實施方式258的核酸分子，其中該RGN為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
260. 如實施方式258-259中任一實施方式的核酸分子，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN多肽。
261. 如實施方式258-260中任一實施方式的核酸分子，其中RGN多肽為切口酶。
262. 如實施方式261的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
263. 如實施方式262的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
264. 一種載體，包括實施方式254-263中任一實施方式的核酸分子。
265. 如實施方式264的載體，進一步包括編碼能夠與標的序列雜合的導引RNA（gRNA）的至少一個核苷酸序列。
266. 一種核糖核蛋白（RNP）複合物，包括實施方式245-253中任一實施方式的融合蛋白及結合至該融合蛋白的DNA結合多肽的導引RNA。
267. 一種細胞，包括實施方式245-253中任一實施方式的融合蛋白、實施方式254-263中任一實施方式的核酸分子、實施方式264-265中任一實施方式的載體、或實施方式266的RNP複合物。
268. 一種用於修飾包括標的DNA序列的標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中一或多個導引RNA能夠與融合蛋白形成複合物，以便將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾標的DNA分子。
269. 如實施方式268的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
270. 如實施方式268的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407具有100%序列一致性的胺基酸序列。
271. 如實施方式268-270中任一實施方式的系統，其中編碼一或多個導引RNA的至少一個該核苷酸序列及編碼融合蛋白的該核苷酸序列可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之啟動子。
272. 如實施方式268-271中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列與藉由RGN多肽辨識的原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
273. 如實施方式268-272中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的核酸序列或其補體。
274. 如實施方式268-273中任一實施方式的系統，其中gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列。
275. 如實施方式268-274的系統，其中該融合蛋白的RGN多肽為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
276. 如實施方式272-275中任一實施方式的系統，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN。
277. 如實施方式276的系統，其中該RGN多肽為切口酶。
278. 如實施方式277的系統，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
279. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式245-253中任一實施方式的融合蛋白、實施方式254-263中任一實施方式的核酸分子、實施方式264-265中任一實施方式的載體、實施方式266的RNP複合物、實施方式267的細胞、或實施方式268-28中任一實施方式的系統。
280. 一種用於修飾包括標的序列之標的DNA分子的方法，包括： a）在適合形成RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下，藉由組合以下者來組裝RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物： i）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的細胞與該組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生標的DNA分子的修飾。
281. 如實施方式280的方法，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的核酸序列或其補體。
282. 如實施方式280-281中任一實施方式的方法，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列。
283. 如實施方式280-282中任一實施方式的方法，其中該方法是在體外、活體內、或離體地實行的。
284. 一種醫治具有疾病、病症或病況或處於疾病、病症或病況的發展風險中的個體的方法，該方法包括： 對個體投予實施方式245-253中任一實施方式的融合蛋白、實施方式254-263中任一實施方式的核酸分子、實施方式264-265中任一實施方式的載體、實施方式266的RNP複合物、實施方式267的細胞、實施方式268-28中任一實施方式的系統、或實施方式279的醫藥組成物。
285. 如實施方式284的方法，進一步包括投予包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列的gRNA中任一者。
286. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
287. 如實施方式286的分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 405具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
288. 如實施方式286的分離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO: 407所示的胺基酸序列。
289. 一種核酸分子，包括編碼脫胺酶多肽的多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 449具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 405中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
290. 如實施方式289的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 449具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
291. 如實施方式289的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 449具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
292. 如實施方式289的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 449具有至少100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
293. 如實施方式289-292中任一實施方式的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的異源啟動子。
294. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式286-288中任一實施方式的多肽或實施方式289-293中任一實施方式的核酸分子。
295. 一種融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的脫胺酶。
296. 如實施方式295的融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 405具有至少95%序列一致性的脫胺酶。
297. 如實施方式295的融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 405具有100%序列一致性的脫胺酶。
298. 如實施方式295-297中任一實施方式的融合蛋白，其中DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
299. 如實施方式298的融合蛋白，其中該RGN多肽為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
300. 如實施方式298-299中任一實施方式的融合蛋白，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN多肽。
301. 如實施方式298-300中任一實施方式的融合蛋白，其中RGN多肽為切口酶。
302. 如實施方式301的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
303. 如實施方式301的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
304. 一種核酸分子，包括編碼包括DNA結合多肽及脫胺酶的融合蛋白的多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 449具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
305. 如實施方式304的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 449具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
306. 如實施方式304的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 449具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
307. 如實施方式304的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 449具有至少100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
308. 如實施方式304-307中任一實施方式的核酸分子，其中該DNA結合多肽為RGN多肽。
309. 如實施方式308的核酸分子，其中該RGN為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
310. 如實施方式308-309中任一實施方式的核酸分子，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN多肽。
311. 如實施方式308-310中任一實施方式的核酸分子，其中RGN多肽為切口酶。
312. 如實施方式311的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
313. 如實施方式312的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
314. 一種載體，包括實施方式304-313中任一實施方式的核酸分子。
315. 如實施方式314的載體，進一步包括編碼能夠與標的序列雜合的導引RNA（gRNA）的至少一個核苷酸序列。
316. 一種核糖核蛋白（RNP）複合物，包括實施方式295-303中任一實施方式的融合蛋白及結合至該融合蛋白的DNA結合多肽的導引RNA。
317. 一種細胞，包括實施方式295-303中任一實施方式的融合蛋白、實施方式304-313中任一實施方式的核酸分子、實施方式314-315中任一實施方式的載體、或實施方式316的RNP複合物。
318. 一種用於修飾包括標的DNA序列的標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中一或多個導引RNA能夠與融合蛋白形成複合物，以便將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾標的DNA分子。
319. 如實施方式318的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 405具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
320. 如實施方式318的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 405具有100%序列一致性的胺基酸序列。
321. 如實施方式318-320中任一實施方式的系統，其中編碼一或多個導引RNA的至少一個該核苷酸序列及編碼融合蛋白的該核苷酸序列可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之啟動子。
322. 如實施方式318-321中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列與藉由RGN多肽辨識的原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
323. 如實施方式318-322中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的核酸序列或其補體。
324. 如實施方式318-323中任一實施方式的系統，其中gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列。
325. 如實施方式318-324的系統，其中該融合蛋白的RGN多肽為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
326. 如實施方式322-325中任一實施方式的系統，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN。
327. 如實施方式326的系統，其中該RGN多肽為切口酶。
328. 如實施方式327的系統，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
329. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式295-303中任一實施方式的融合蛋白、實施方式304-313中任一實施方式的核酸分子、實施方式314-315中任一實施方式的載體、實施方式316的RNP複合物、實施方式317的細胞、或實施方式318-328中任一實施方式的系統。
330. 一種用於修飾包括標的序列之標的DNA分子的方法，包括： a）在適合形成RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下，藉由組合以下者來組裝RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物： i）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的細胞與該組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生標的DNA分子的修飾。
331. 如實施方式330的方法，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的核酸序列或其補體。
332. 如實施方式330-331中任一實施方式的方法，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列。
333. 如實施方式330-332中任一實施方式的方法，其中該方法是在體外、活體內、或離體地實行的。
334. 一種醫治具有疾病、病症或病況或處於疾病、病症或病況的發展風險中的個體的方法，該方法包括： 對個體投予實施方式295-303中任一實施方式的融合蛋白、實施方式304-313中任一實施方式的核酸分子、實施方式314-315中任一實施方式的載體、實施方式316的RNP複合物、實施方式317的細胞、實施方式318-328中任一實施方式的系統、或實施方式329的醫藥組成物。
335. 如實施方式334的方法，進一步包括投予包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列的gRNA中任一者。
336. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
337. 如實施方式336的分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 399具有至少95%序列一致性的胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
338. 如實施方式336的分離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO: 399所示的胺基酸序列。
339. 一種核酸分子，包括編碼脫胺酶多肽的多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 443具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 399中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
340. 如實施方式339的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 443具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
341. 如實施方式339的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 443具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
342. 如實施方式339的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 443具有至少100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
343. 如實施方式339-342中任一實施方式的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的異源啟動子。
344. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式336-338中任一實施方式的多肽或實施方式339-342中任一實施方式的核酸分子。
345. 一種融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的脫胺酶。
346. 如實施方式345的融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 399具有至少95%序列一致性的脫胺酶。
347. 如實施方式345的融合蛋白，包括DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 399具有100%序列一致性的脫胺酶。
348. 如實施方式345-347中任一實施方式的融合蛋白，其中DNA結合多肽為RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
349. 如實施方式348的融合蛋白，其中該RGN多肽為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
350. 如實施方式348-349中任一實施方式的融合蛋白，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN多肽。
351. 如實施方式348-350中任一實施方式的融合蛋白，其中RGN多肽為切口酶。
352. 如實施方式351的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
353. 如實施方式351的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
354. 一種核酸分子，包括編碼包括DNA結合多肽及脫胺酶的融合蛋白的多核苷酸，其中該脫胺酶藉由核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 443具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
355. 如實施方式354的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 443具有至少90%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
356. 如實施方式354的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 443具有至少95%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
357. 如實施方式354的核酸分子，其中該脫胺酶藉由與SEQ ID NO: 443具有至少100%序列一致性的核苷酸序列被編碼。
358. 如實施方式354-357中任一實施方式的核酸分子，其中該DNA結合多肽為RGN多肽。
359. 如實施方式358的核酸分子，其中該RGN為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
360. 如實施方式358-359中任一實施方式的核酸分子，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN多肽。
361. 如實施方式358-360中任一實施方式的核酸分子，其中RGN多肽為切口酶。
362. 如實施方式361的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
363. 如實施方式362的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有100%序列一致性的胺基酸序列。
364. 一種載體，包括實施方式354-363中任一實施方式的核酸分子。
365. 如實施方式364的載體，進一步包括編碼能夠與標的序列雜合的導引RNA（gRNA）的至少一個核苷酸序列。
366. 一種核糖核蛋白（RNP）複合物，包括實施方式345-353中任一實施方式的融合蛋白及結合至該融合蛋白的DNA結合多肽的導引RNA。
367. 一種細胞，包括實施方式345-353中任一實施方式的融合蛋白、實施方式354-363中任一實施方式的核酸分子、實施方式364-365中任一實施方式的載體、或實施方式366的RNP複合物。
368. 一種用於修飾包括標的DNA序列的標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中一或多個導引RNA能夠與融合蛋白形成複合物，以便將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾標的DNA分子。
369. 如實施方式368的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
370. 如實施方式368的系統，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399具有100%序列一致性的胺基酸序列。
371. 如實施方式368-370中任一實施方式的系統，其中編碼一或多個導引RNA的至少一個該核苷酸序列及編碼融合蛋白的該核苷酸序列可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之啟動子。
372. 如實施方式368-371中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列與藉由RGN多肽辨識的原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
373. 如實施方式368-372中任一實施方式的系統，其中標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的核酸序列或其補體。
374. 如實施方式368-373中任一實施方式的系統，其中gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列。
375. 如實施方式368-374的系統，其中該融合蛋白的RGN多肽為II型CRISPR-Cas多肽或V型CRISPR-Cas多肽。
376. 如實施方式372-375中任一實施方式的系統，其中RGN多肽為Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9-NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9-KKH、環狀排列Cas9、Argonaute（Ago）、SmacCas9、Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示胺基酸序列的RGN。
377. 如實施方式376的系統，其中該RGN多肽為切口酶。
378. 如實施方式377的系統，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
379. 一種醫藥組成物，包括醫藥學上可接受之載劑及實施方式345-353中任一實施方式的融合蛋白、實施方式354-363中任一實施方式的核酸分子、實施方式364-365中任一實施方式的載體、實施方式366的RNP複合物、實施方式367的細胞、或實施方式368-378中任一實施方式的系統。
380. 一種用於修飾包括標的序列之標的DNA分子的方法，包括： a）在適合形成RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下，藉由組合以下者來組裝RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物： i）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的細胞與該組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生標的DNA分子的修飾。
381. 如實施方式380的方法，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的核酸序列或其補體。
382. 如實施方式380-381中任一實施方式的方法，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列。
383. 如實施方式380-382中任一實施方式的方法，其中該方法是在體外、活體內、或離體地實行的。
384. 一種醫治具有疾病、病症或病況或處於疾病、病症或病況的發展風險中的個體的方法，該方法包括： 對個體投予實施方式345-353中任一實施方式的融合蛋白、實施方式354-363中任一實施方式的核酸分子、實施方式364-365中任一實施方式的載體、實施方式366的RNP複合物、實施方式367的細胞、實施方式368-378中任一實施方式的系統、或實施方式379的醫藥組成物。
385. 如實施方式384的方法，進一步包括投予包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的核酸序列的gRNA中任一者。
386. 一種用於對囊腫纖維化之至少一個症狀產生醫治或降低的方法，該方法包括對需要其之個體投予有效量之： a）包括RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及脫胺酶的融合蛋白或編碼該融合蛋白的多核苷酸，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO：407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90％序列一致性的胺基酸序列，其中編碼該融合蛋白的該多核苷酸可操作地聯結至啟動子，以賦能融合蛋白在細胞中的表現；及 b）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA（gRNA）或編碼該gRNA的多核苷酸，其中編碼gRNA的該多核苷酸可操作地聯結至啟動子，以賦能gRNA在細胞中的表現； 藉以，融合蛋白及gRNA靶向因果突變的基因組位址且修飾基因組序列以除去該因果突變。
387. 如實施方式386的方法，其中gRNA包括靶向SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563中任一者的間隔體序列或其補體。
388. 如實施方式386或387的方法，其中gRNA包括SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者。
389. 如請求項386-388中任一項的方法，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
390. 如請求項386-389中任一項的方法，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
提供以下實例為示例而非為限制。 實驗 實例 1 ：鹼基編輯在哺乳動物細胞中之證實
下面的表1顯示的脫胺酶是基於天然存在之脫胺酶產生的，然後，該脫胺酶針對原核細胞中的腺嘌呤脫胺酶活性被突變及選擇。 表 1 ：脫胺酶序列
脫胺酶 SEQ ID NO.
APG09982 1
APG03724 2
APG09949 3
APG08196 4
APG06333 5
APG06489 6
APG08449 7
APG05174 8
APG09102 9
APG05723 10
為確定表1之脫胺酶是否能夠在哺乳動物細胞中實行腺嘌呤鹼基編輯，使每一個脫胺酶與RGN切口酶可操作地融合，以產生融合蛋白。預測將RGN APG07433.1（SEQ ID NO: 41所示的；PCT揭露WO 2019/236566描述的，其藉由引用而被併入本文）的RuvC域去活化的殘基被辨識，且RGN被修飾為切口酶變異體（nAPG07433.1；SEQ ID NO: 42）。RGN的切口酶變異體在本文中被稱為“nRGN”。應該明白，RGN的切口酶變異體可被用於產生本發明之融合蛋白。
脫胺酶及針對於哺乳動物表現而被密碼子最佳化的nRGN核苷酸序列被合成為具有N端核定位示跡物的融合蛋白，且被選殖至pTwist CMV （Twist Biosciences）表現質體內。每一個融合蛋白包括於胺基端處初始於C端末側處可操作地聯結至3X FLAG示跡物（SEQ ID NO: 44）、於C端末側處可操作地聯結至脫胺酶、於C端末側處可操作地聯結至胜肽聯結子（SEQ ID NO: 45）、於C端末側處可操作地聯結至nRGN（舉例而言，nAPG07433.1，其為SEQ ID NO: 42）、最後於C端末側處可操作地聯結至核質蛋白（nucleoplasmin） NLS（SEQ ID NO: 45）之SV40 NLS（SEQ ID NO: 43）。所有融合蛋白包括至少一個NLS及3X FLAG示跡物，如上該。
包括編碼藉由人U6啟動子（SEQ ID NO: 50）表現的sgRNA的表現卡匣的表現質體亦被產生。人基因組標的序列及用於將融合蛋白導引至基因組標的的sgRNA序列被指示於表2中。 表 2 ：導引 RNA 序列
sgRNA ID 標的序列 sgRNA 序列 用於擴增之正向引子 用於擴增之反向引子
SGN000930 21 26 31 32
SGN000186 22 27 33 34
SGN000194 23 28 35 36
SGN000143 24 29 37 38
SGN000139 25 30 39 40
於24孔培養皿中，使用Lipofectamine 2000試劑（Life Technologies），以75-90%匯合率，將500 ng的包括對於表1中描述的每一個脫胺酶包括融合蛋白的寫碼序列的表現卡匣的質體及500 ng的包括編碼表2中顯示的sgRNA的表現卡匣的質體共轉染為HEK293FT細胞。然後，細胞在37° C下被培養72小時。然後，在培養之後，按照製造商的操作流程，使用NucleoSpin 96 Tissue（Macherey-Nagel），萃取基因組DNA。使用表2中的引子，所靶向之基因組位點側翼的基因組區域被PCR擴增，且按照製造商的操作流程，使用ZR-96 DNA清潔與濃縮器（Zymo Research），純化產物。經純化之PCR產物在Illumina MiSeq上進行下一代定序。通常情況下，每擴增子產生100,000個250 bp的配對末側讀數（2×100,000個讀數）。使用CRISPResso（Pinello等人，2016， Nature Biotech34：695-697）分析讀數以計算編輯率。對於專一性腺嘌呤突變的INDEL形成或引入，分析輸出對準。對於包括nAPG07433.1及表1中的脫胺酶及表2中的導引RNA的每一個融合蛋白，表3至7顯示腺嘌呤鹼基編輯。每一個融合蛋白的脫胺酶組成被指示。標的序列內的或靠近標的序列的腺嘌呤的編輯率被指示。舉例而言，“A5”指示標的序列的位置5處的腺嘌呤。每一個核苷酸於標的序列中的位置藉由對最接近PAM的標的序列中的第一核苷酸計數而被確定為位置1，且位置數目在3'方向上隨著離開PAM序列而增加。多個表亦顯示腺嘌呤以什麼速率被改變成哪種核苷酸。舉例而言，表3顯示對於APG09982-nAPG07433.1融合蛋白，位置13處的腺嘌呤以1.2%的比率被突變至鳥嘌呤。 表 3 ：使用導引 SGN000139 的 A＞N 編輯率
脫胺酶   A5 A12 A13 A20 A22
APG09982 C 0 0 0 0.3 0
G 0 0.5 1.2 0 0
T 0 0 0 0 0
APG03724 C 0 0 0 0.3 0
G 0 0.7 0.7 0.1 0
T 0 0 0 0 0
APG09949 C 0 0 0 0.3 0.1
G 0.1 0.6 0.7 0 0
T 0 0 0 0 0
APG08196 C 0 0 0 0.6 0.1
G 0 0.6 0.6 0 0
T 0 0 0 0 0
APG06333 C 0 0 0 0.2 0
G 0 0.5 1 0 0
T 0 0 0 0 0
APG06489 C 0 0 0 0.2 0
G 0 0.6 0.4 0 0
T 0 0 0 0 0
APG08449 C 0 0 0 0.3 0.1
G 0 0.8 0.8 0 0
T 0 0 0 0 0
APG05174 C 0 0 0 0.6 0.1
G 0 0.6 0.7 0 0
T 0 0 0 0 0
APG09102 C 0 0 0 0.1 0
G 0 0.6 0.6 0 0
T 0 0 0 0 0
APG05723 C 0 0 0 0.1 0
G 0 0.4 0.5 0.1 0
T 0 0 0 0 0
所有融合蛋白顯示位置A12及A13處的可偵測A＞G轉變。APG09982及APG06333顯示位置A13處的至少1%編輯。 表 4 ：使用導引 SGN000143 的 A＞N 編輯率
脫胺酶   A1 A4 A6 A9 A11 A14 A19 A30
APG09982 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.1 4.5 1.7 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG03724 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0.1 0.1 1.3 1.1 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG09949 C 0 0 0 0 0 0 0 0.1
G 0 0 0 0.1 0.8 0.7 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG08196 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.4 0.7 0.5 0.1 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG06333 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 1.3 0.8 0.1 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG06489 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0.1 0.6 1.8 0.8 0.1 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG08449 C 0 0 0 0 0 0 0 0.1
G 0 0 0 0 2.4 1.2 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG05174 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 1.5 0.7 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG09102 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 2.6 1.6 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG05723 C 0 0 0 0 0.1 0 0 0
G 0 0 0.1 0.1 1.1 0.5 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
所有融合蛋白顯示位置A11及A14處的A＞G轉變。APG09982顯示A11至G的4.5%轉變及A14至G的1.7%轉變。 表 5 ：使用導引 SGN000186 的 A＞N 編輯率
脫胺酶   A9 A16 A18 A22 A25 A28 A30
APG09982 C 0 0 0 0 0 0 0
G 1.7 4.5 2 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
APG03724 C 0 0 0 0 0.1 0 0
G 0.7 4.1 1.4 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
APG09949 C 0 0 0.1 0 0.1 0 0
G 0.6 3.4 1.1 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0.1 0 0
APG08196 C 0 0 0.1 0 0.1 0 0
G 1 3.3 1.4 0 0 0.1 0
T 0 0 0 0 0.1 0 0
APG06333 C 0 0 0 0 0 0 0
G 1.4 4.2 1.9 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
APG06489 C 0 0 0 0 0 0 0
G 1.7 2.5 1.4 0 0 0 0.1
T 0 0 0 0 0 0 0
APG08449 C 0 0 0.1 0 0.1 0 0
G 1.5 5.3 1.6 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0.1 0 0
APG05174 C 0 0 0.1 0 0 0 0
G 0.9 3.2 1 0 0 0.1 0
T 0 0 0 0 0.1 0 0
APG09102 C 0 0 0 0 0 0 0
G 2.3 6.2 2.1 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
APG05723 C 0 0 0 0 0 0 0
G 1.1 1.9 1.2 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
所有融合蛋白在標的SGN000186中的多個位址處顯示超過1%的鹼基編輯。APG09102在位置A16處顯示6.2%的A＞G轉變；其亦在位置A9及A18顯示超過2%的鹼基編輯。對於所測試的所有融合蛋白，位置A16被最高度地編輯。 表 6 ：使用導引 SGN000194 的 A＞N 編輯率
脫胺酶   A6 A10 A13 A15 A21 A23 A26 A27
APG09982 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0.3 0.6 1.5 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG03724 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0.1 0.3 1 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG09949 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0.2 0.3 1.6 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG08196 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0.1 0.4 0.1 0.9 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG06333 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0.2 0.3 1 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG06489 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0.4 0.2 1.1 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG08449 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0.1 0.3 0.4 1.8 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG05174 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0.1 0.1 0.3 0.9 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG09102 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0.2 0.7 1.6 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
APG05723 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0.1 0.9 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
用SGN00194，所有融合蛋白於位置A15處顯示0.9%-1.8%的A＞G編輯。於位置A21、A23、A26及A27處看到不可偵測編輯。 表 7 ：使用導引 SGN000930 的 A＞N 編輯率
脫胺酶   A2 A4 A5 A8 A9 A10 A14 A15 A16 A20 A21 A23 A24 A26 A27 A29 A30
APG09982 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0 0.3 0.7 0.1 0.2 0.5 0.2 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG03724 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.1 0.1 0.4 0.5 0.2 0.2 0.3 0.1 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG09949 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0 0.1 0.5 0.3 0.3 0.4 0 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG08196 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.1 0 0.2 0.7 0.3 0.2 0.4 0.1 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG06333 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.1 0.1 0 0.3 0.4 0.3 0.9 0.2 0.1 0.1 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG06489 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.3 0.1 0.2 0.8 0.3 0.4 0.6 0 0.1 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG08449 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.1 0.1 0.3 0.6 0.4 0.2 0.4 0.1 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG05174 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0.1 0.2 0.8 0.3 0.4 0.2 0.2 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG09102 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0 0 0.9 0.1 0.1 0.6 0.3 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APG05723 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0.1 0.1 1.2 0.6 0.2 0.5 0 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
關於所測試的所有融合蛋白， A14在SGN000930中為最高度編輯位置。對於A＞G轉變，編輯率的範圍為0.3%-1.2%。 實例 2 ：所靶向之腺嘌呤鹼基編輯之螢光測定
帶有含有引起過早停止密碼子（GFP-STOP, SEQ ID NO: 47）的W58X突變的增強綠螢光蛋白（EGFP）的載體被構築，藉以使得使用腺嘌呤脫胺酶，可使W58密碼子從停止密碼子（TGA）回復至野生型色胺酸（TGG）殘基，以將第三位置A改變至G。A至G的成功轉變導致可被量化的EGFP的表現。能夠表現將脫胺酶RGN融合蛋白靶向至W58X突變（SEQ ID NO: 48）的周圍的區域的導引RNA的第二載體亦被產生。
使用脂質體轉染或電穿孔，這個GFP-STOP報導子載體連同能夠表現脫胺酶nRGN融合蛋白及對應導引RNA的載體被轉染至HEK293T細胞內。關於脂質體轉染，細胞於在生長培養基（DMEM + 10%胎牛血清+ 1%青黴素/鏈黴素）中轉染之前於24孔培養皿中以1x10 5個細胞/孔接種一天。按照製造商的說明，使用Lipofectamine® 3000試劑（Thermo Fisher Scientific），500 ng的GFP-STOP報導子載體、脫胺酶RGN表現載體、及導引RNA表現載體中每一者被轉染。關於電穿孔，按照製造商的說明，使用Neon®轉染系統（Thermo Fisher Scientific），細胞被電穿孔。
除了螢光GFP-STOP報導子的暫時轉染，帶有經染色體整合之GFP-STOP卡匣的穩定細胞系被產生。關於轉染，穩定細胞系一被建構，細胞就於在生長培養基（DMEM + 10%胎牛血清+ 1%青黴素/鏈黴素）中轉染之前於24孔培養皿中以1x10 5個細胞/孔接種一天。按照製造商的說明，使用Lipofectamine® 3000試劑（Thermo Fisher Scientific），500 ng的脫胺酶RGN表現載體及導引RNA表現載體中每一者被轉染。關於電穿孔，按照製造商的說明，使用Neon®轉染系統（Thermo Fisher Scientific），細胞被電穿孔。
在脂質體轉染或電穿孔後之24-48小時，藉由為GFP+細胞之存在而顯微地檢驗細胞，確定GFP之表現。目視檢查之後，可確定GFP+細胞與GFP-細胞之比例。在表現每一個脫胺酶nRGN融合蛋白的哺乳動物細胞中觀察到螢光，這指示融合蛋白被成功靶向至GFP-STOP突變及編輯該突變以恢復GFP蛋白之螢光。
顯微分析之後，細胞於RIPA緩衝液中被溶解，且在螢光板閱讀器（fluorescence plate reader）上分析所得溶胞產物，以確定GFP的螢光強度（表8）。本領域中之通常知識者明瞭，藉由流式細胞分析技術或螢光活化細胞分選技術（fluorescence activated cell sorting），可分析細胞，以確定GFP+細胞與GFP-細胞之比例。 表 8 ： GFP-STOP 測定結果
融合蛋白之脫胺酶 所偵測之 GFP+ 細胞
APG09982 ++
APG03724 ++
APG09949 ++
APG08196 ++
APG06333 +++
APG06489 ++
APG08449 ++
APG05174 +++
APG09102 ++
APG05723 ++
N.D = 未被偵測；+ = 很少的GFP+細胞被偵測；++ =若干GFP+細胞被偵測；+++ = 許多GFP+細胞被偵測 實例 3 ：哺乳動物細胞中之 A 鹼基編輯的示範
下面之表9顯示的脫胺酶是基於天然存在之脫胺酶產生的，然後，該脫胺酶針對原核細胞中的腺嘌呤脫胺酶活性被突變及選擇。 表 9 ：脫胺酶序列
脫胺酶 SEQ ID NO. 脫胺酶 SEQ ID NO.
LPG50140 399    LPG50162 421
LPG50141 400    LPG50163 422
LPG50142 401    LPG50164 423
LPG50143 402    LPG50165 424
LPG50144 403    LPG50166 425
LPG50145 404    LPG50167 426
LPG50146 405    LPG50168 427
LPG50147 406    LPG50169 428
LPG50148 407    LPG50170 429
LPG50149 408    LPG50171 430
LPG50150 409    LPG50172 431
LPG50151 410    LPG50173 432
LPG50152 411    LPG50174 433
LPG50153 412    LPG50175 434
LPG50154 413    LPG50176 435
LPG50155 414    LPG50177 436
LPG50156 415    LPG50178 437
LPG50157 416    LPG50179 438
LPG50158 417    LPG50180 439
LPG50159 418    LPG50181 440
LPG50160 419    LPG50182 441
LPG50161 420         
為確定表9之脫胺酶是否能夠在哺乳動物細胞中實行腺嘌呤鹼基編輯，使每一個脫胺酶與RGN切口酶可操作地融合，以產生融合蛋白。預測將RGN APG07433.1（SEQ ID NO: 41所示的；PCT揭露WO 2019/236566描述的，其藉由引用而被併入本文）的RuvC域去活化的殘基被辨識，且RGN被修飾為切口酶變異體（nAPG07433.1；SEQ ID NO: 42）。RGN的切口酶變異體在本文中被稱為“nRGN”。應該明白，RGN的切口酶變異體可被用於產生本發明之融合蛋白。
脫胺酶及針對於哺乳動物表現而被密碼子最佳化的nRGN核苷酸序列被合成為具有N端核定位示跡物的融合蛋白，且被選殖至pTwist CMV （Twist Biosciences）表現質體內。每一個融合蛋白包括於胺基端處初始於C端末側處可操作地聯結至3X FLAG示跡物（SEQ ID NO: 44）、於C端末側處可操作地聯結至脫胺酶、於C端末側處可操作地聯結至胜肽聯結子（SEQ ID NO: 442）、於C端末側處可操作地聯結至nRGN（舉例而言，nAPG07433.1，其為SEQ ID NO: 42）、最後於C端末側處可操作地聯結至核質蛋白（nucleoplasmin） NLS（SEQ ID NO: 46）之SV40 NLS（SEQ ID NO: 43）。nAPG07433.1及針對於哺乳動物表現而被密碼子最佳化的胜肽聯結子核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 486及487所示。表10顯示被產生且被測試活性的融合蛋白。所有融合蛋白包括至少一個NLS及3X FLAG示跡物，如上該。 表 10 ：具有 N 端 SV40 NLS 、 3X FLAG 示跡物及 C 端核質蛋白 NLS 的融合蛋白序列
融合蛋白 SEQ ID
LPG50140-nAPG07433.1 488
LPG50141-nAPG07433.1 489
LPG50142-nAPG07433.1 490
LPG50143-nAPG07433.1 491
LPG50144-nAPG07433.1 492
LPG50145-nAPG07433.1 493
LPG50146-nAPG07433.1 494
LPG50147-nAPG07433.1 495
LPG50148-nAPG07433.1 496
LPG50149-nAPG07433.1 497
LPG50150-nAPG07433.1 498
LPG50151-nAPG07433.1 499
LPG50152-nAPG07433.1 500
LPG50153-nAPG07433.1 501
LPG50154-nAPG07433.1 502
LPG50155-nAPG07433.1 503
LPG50156-nAPG07433.1 504
LPG50157-nAPG07433.1 505
LPG50158-nAPG07433.1 506
LPG50159-nAPG07433.1 507
LPG50160-nAPG07433.1 508
LPG50161-nAPG07433.1 509
LPG50162-nAPG07433.1 510
LPG50163-nAPG07433.1 511
LPG50164-nAPG07433.1 512
LPG50165-nAPG07433.1 513
LPG50166-nAPG07433.1 514
LPG50167-nAPG07433.1 515
LPG50168-nAPG07433.1 516
LPG50169-nAPG07433.1 517
LPG50170-nAPG07433.1 518
LPG50171-nAPG07433.1 519
LPG50172-nAPG07433.1 520
LPG50173-nAPG07433.1 521
LPG50174-nAPG07433.1 522
LPG50175-nAPG07433.1 523
LPG50176-nAPG07433.1 524
LPG50177-nAPG07433.1 525
LPG50178-nAPG07433.1 526
LPG50179-nAPG07433.1 527
LPG50180-nAPG07433.1 528
LPG50181-nAPG07433.1 529
LPG50182-nAPG07433.1 530
包括針對sgRNA而編碼的表現卡匣的表現質體亦被產生。人基因組標的序列及用於將融合蛋白導引至基因組標的的sgRNA序列被指示於表11中。 表 11 ：導引 RNA 序列
sgRNA ID 標的序列 sgRNA 序列 用於擴增之正向引子 用於擴增之反向引子
SGN000139 537 531 543 549
SGN000143 538 532 544 550
SGN000186 539 533 545 551
SGN000194 540 534 546 552
SGN000930 541 535 547 553
SGN001681 542 536 548 554
於24孔培養皿中，使用Lipofectamine 2000試劑（Life Technologies），以75-90%匯合率，將500 ng的包括對於表10中顯示的融合蛋白包括寫碼序列的表現卡匣的質體及500 ng的包括針對表11中顯示的sgRNA編碼的表現卡匣的質體共轉染為HEK293FT細胞。然後，細胞在37° C下被培養72小時。然後，在培養之後，按照製造商的操作流程，使用NucleoSpin 96 Tissue（Macherey-Nagel），萃取基因組DNA。使用表11中的引子，所靶向之基因組位點側翼的基因組區域被PCR擴增，且按照製造商的操作流程，使用ZR-96 DNA清潔與濃縮器（Zymo Research），純化產物。經純化之PCR產物在Illumina MiSeq上進行下一代定序。通常情況下，每擴增子產生100,000個250 bp的配對末側讀數（2×100,000個讀數）。使用CRISPResso（Pinello等人，2016， Nature Biotech34：695-697）分析讀數以計算編輯率。對於專一性腺嘌呤突變的INDEL形成或引入，分析輸出對準。
對於表10中的每一個腺嘌呤脫胺酶及表12中的導引RNA，表12顯示所有腺嘌呤鹼基編輯。表13-27顯示用於選擇示例性樣本的專一性核苷酸突變概況。標的序列內的或靠近標的序列的腺嘌呤的編輯率被指示。舉例而言，“A5”指示標的序列的位置5處的腺嘌呤。每一個核苷酸於標的序列中的位置藉由對最接近PAM的標的序列（其為APG07433.1的標的的3'）中的第一核苷酸計數而被確定為位置1，且位置數目在5'方向上隨著離開PAM序列而增加。多個表亦顯示腺嘌呤以什麼速率被改變成哪種核苷酸。舉例而言，表13顯示對於LPG50148-nAPG07433.1融合蛋白，位置13處的腺嘌呤以9.7%的比率被突變至鳥嘌呤。 表 12 ：每一個腺嘌呤脫胺酶的鹼基編輯率的估計值
脫胺酶 SGN % 突變的讀數 脫胺酶 SGN % 突變的讀數
LPG50140 SGN001681 30.01%    LPG50161 SGN000930 0%
LPG50140 SGN000139 6.91%    LPG50162 SGN001681 21.73%
LPG50140 SGN000143 16.09%    LPG50162 SGN000139 2%
LPG50140 SGN000186 18.76%    LPG50162 SGN000143 5%
LPG50140 SGN000194 9.77%    LPG50162 SGN000186 14%
LPG50140 SGN000930 3.51%    LPG50162 SGN000194 6%
LPG50141 SGN001681 21.37%    LPG50162 SGN000930 5%
LPG50141 SGN000139 2.43%    LPG50163 SGN001681 12.80%
LPG50141 SGN000143 6.93%    LPG50163 SGN000139 0%
LPG50141 SGN000186 9.79%    LPG50163 SGN000143 2%
LPG50141 SGN000194 4.45%    LPG50163 SGN000186 10%
LPG50141 SGN000930 5.29%    LPG50163 SGN000194 4%
LPG50142 SGN001681 34.19%    LPG50163 SGN000930 3%
LPG50142 SGN000139 3.10%    LPG50164 SGN001681 4.28%
LPG50142 SGN000143 8.67%    LPG50164 SGN000139 0%
LPG50142 SGN000186 14.12%    LPG50164 SGN000143 3.36%
LPG50142 SGN000194 10.04%    LPG50164 SGN000186 7.38%
LPG50142 SGN000930 6.78%    LPG50164 SGN000194 2.73%
LPG50143 SGN001681 20.62%    LPG50164 SGN000930 1.47%
LPG50143 SGN000139 1.99%    LPG50165 SGN001681 25.66%
LPG50143 SGN000143 6.09%    LPG50165 SGN000139 2%
LPG50143 SGN000186 10.58%    LPG50165 SGN000143 5.11%
LPG50143 SGN000194 5.60%    LPG50165 SGN000186 9.88%
LPG50143 SGN000930 3.98%    LPG50165 SGN000194 3.97%
LPG50144 SGN001681 28.26%    LPG50165 SGN000930 3.18%
LPG50144 SGN000139 3.55%    LPG50166 SGN000139 2%
LPG50144 SGN000143 5.77%    LPG50166 SGN000143 4%
LPG50144 SGN000186 12.22%    LPG50166 SGN000186 8%
LPG50144 SGN000194 6.40%    LPG50166 SGN000194 2%
LPG50144 SGN000930 5.81%    LPG50166 SGN000930 4%
LPG50145 SGN001681 29.23%    LPG50167 SGN001681 20.56%
LPG50145 SGN000139 2.53%    LPG50167 SGN000139 2%
LPG50145 SGN000143 3.75%    LPG50167 SGN000143 4%
LPG50145 SGN000186 9.93%    LPG50167 SGN000186 8%
LPG50145 SGN000194 3.98%    LPG50167 SGN000194 5%
LPG50145 SGN000930 3.84%    LPG50167 SGN000930 4%
LPG50146 SGN001681 32.53%    LPG50168 SGN001681 13.81%
LPG50146 SGN000139 5.95%    LPG50168 SGN000139 2%
LPG50146 SGN000143 11.30%    LPG50168 SGN000143 3%
LPG50146 SGN000186 17.78%    LPG50168 SGN000186 7%
LPG50146 SGN000194 7.38%    LPG50168 SGN000194 2%
LPG50146 SGN000930 7.13%    LPG50168 SGN000930 3%
LPG50147 SGN001681 49.10%    LPG50169 SGN001681 25.73%
LPG50147 SGN000139 3.26%    LPG50169 SGN000139 4%
LPG50147 SGN000143 8.59%    LPG50169 SGN000143 8%
LPG50147 SGN000186 12.61%    LPG50169 SGN000186 13%
LPG50147 SGN000194 8.80%    LPG50169 SGN000194 9%
LPG50147 SGN000930 4.96%    LPG50169 SGN000930 8%
LPG50148 SGN001681 49.39%    LPG50170 SGN001681 12.87%
LPG50148 SGN000139 10.80%    LPG50170 SGN000139 1.50%
LPG50148 SGN000143 12.49%    LPG50170 SGN000143 3.14%
LPG50148 SGN000186 32.65%    LPG50170 SGN000186 12.16%
LPG50148 SGN000194 16.60%    LPG50170 SGN000194 2.76%
LPG50148 SGN000930 7.61%    LPG50170 SGN000930 4.10%
LPG50149 SGN001681 27.62%    LPG50171 SGN001681 27.16%
LPG50149 SGN000139 2.83%    LPG50171 SGN000139 1.75%
LPG50149 SGN000143 9.33%    LPG50171 SGN000143 6.14%
LPG50149 SGN000186 22.12%    LPG50171 SGN000186 12.65%
LPG50149 SGN000194 7.94%    LPG50171 SGN000194 5.60%
LPG50149 SGN000930 7.06%    LPG50171 SGN000930 4.55%
LPG50150 SGN001681 28.46%    LPG50172 SGN001681 1.78%
LPG50150 SGN000139 3.06%    LPG50172 SGN000139 0%
LPG50150 SGN000143 6.00%    LPG50172 SGN000143 0%
LPG50150 SGN000186 23.67%    LPG50172 SGN000186 0%
LPG50150 SGN000194 9.47%    LPG50172 SGN000194 0%
LPG50150 SGN000930 5.41%    LPG50172 SGN000930 0%
LPG50151 SGN001681 3.01%    LPG50173 SGN001681 12.64%
LPG50151 SGN000139 0%    LPG50173 SGN000139 1.00%
LPG50151 SGN000143 1.53%    LPG50173 SGN000143 3.23%
LPG50151 SGN000186 7.76%    LPG50173 SGN000186 7.88%
LPG50151 SGN000194 1.43%    LPG50173 SGN000194 2.66%
LPG50151 SGN000930 0%    LPG50173 SGN000930 1.77%
LPG50152 SGN001681 26.06%    LPG50174 SGN001681 14.11%
LPG50152 SGN000139 2%    LPG50174 SGN000139 0%
LPG50152 SGN000143 3%    LPG50174 SGN000143 3%
LPG50152 SGN000186 18%    LPG50174 SGN000186 8%
LPG50152 SGN000194 3%    LPG50174 SGN000194 2%
LPG50152 SGN000930 6%    LPG50174 SGN000930 3%
LPG50153 SGN001681 1.12%    LPG50175 SGN001681 22.29%
LPG50153 SGN000139 0%    LPG50175 SGN000139 4%
LPG50153 SGN000143 0%    LPG50175 SGN000143 9%
LPG50153 SGN000186 0%    LPG50175 SGN000186 14%
LPG50153 SGN000194 1%    LPG50175 SGN000194 13%
LPG50153 SGN000930 0%    LPG50175 SGN000930 5%
LPG50154 SGN001681 2.26%    LPG50176 SGN001681 9.52%
LPG50154 SGN000139 0%    LPG50176 SGN000139 0%
LPG50154 SGN000143 0%    LPG50176 SGN000143 2%
LPG50154 SGN000186 0%    LPG50176 SGN000186 7%
LPG50154 SGN000194 1%    LPG50176 SGN000194 2%
LPG50154 SGN000930 0%    LPG50176 SGN000930 0%
LPG50155 SGN001681 14.91%    LPG50177 SGN001681 7.98%
LPG50155 SGN000139 2%    LPG50177 SGN000139 2%
LPG50155 SGN000143 4%    LPG50177 SGN000143 4%
LPG50155 SGN000186 17%    LPG50177 SGN000186 11%
LPG50155 SGN000194 7%    LPG50177 SGN000194 3%
LPG50155 SGN000930 5%    LPG50177 SGN000930 9%
LPG50156 SGN001681 11.19%    LPG50178 SGN000139 2.00%
LPG50156 SGN000139 3.79%    LPG50178 SGN000143 6.19%
LPG50156 SGN000143 6.44%    LPG50178 SGN000186 12.94%
LPG50156 SGN000186 12.69%    LPG50178 SGN000194 5.51%
LPG50156 SGN000194 6.87%    LPG50178 SGN000930 3.95%
LPG50156 SGN000930 4.10%    LPG50179 SGN001681 23.35%
LPG50157 SGN001681 20.66%    LPG50179 SGN000139 2.00%
LPG50157 SGN000139 3.37%    LPG50179 SGN000143 5.08%
LPG50157 SGN000143 6.91%    LPG50179 SGN000186 12.50%
LPG50157 SGN000186 12.15%    LPG50179 SGN000194 4.49%
LPG50157 SGN000194 9.98%    LPG50179 SGN000930 4.62%
LPG50157 SGN000930 5.55%    LPG50180 SGN001681 1.80%
LPG50158 SGN001681 1.56%    LPG50180 SGN000139 0%
LPG50158 SGN000139 0%    LPG50180 SGN000143 0%
LPG50158 SGN000143 1.15%    LPG50180 SGN000186 0%
LPG50158 SGN000186 4.91%    LPG50180 SGN000194 0%
LPG50158 SGN000194 1.73%    LPG50180 SGN000930 0%
LPG50158 SGN000930 0%    LPG50181 SGN001681 7.93%
LPG50159 SGN001681 5.85%    LPG50181 SGN000139 2.88%
LPG50159 SGN000139 0%    LPG50181 SGN000143 3.78%
LPG50159 SGN000143 2.78%    LPG50181 SGN000186 12.56%
LPG50159 SGN000186 6.99%    LPG50181 SGN000194 3.39%
LPG50159 SGN000194 4.40%    LPG50181 SGN000930 1.20%
LPG50159 SGN000930 2.60%    LPG50182 SGN001681 16.49%
LPG50160 SGN001681 22.20%    LPG50182 SGN000139 1.00%
LPG50160 SGN000139 4%    LPG50182 SGN000143 5%
LPG50160 SGN000143 8%    LPG50182 SGN000186 9%
LPG50160 SGN000186 16%    LPG50182 SGN000194 6%
LPG50160 SGN000194 5%    LPG50182 SGN000930 3%
LPG50160 SGN000930 6%            
LPG50161 SGN001681 1.47%            
LPG50161 SGN000139 0%            
LPG50161 SGN000143 0%            
LPG50161 SGN000186 0%            
LPG50161 SGN000194 0%            
表 13 ：使用脫胺酶 LPG50148 及導引 SGN000139 的 A＞N 編輯率
    SGN000139
    A5 A12 A13 A20 A22
LPG50148 C 0 0 0 0.1 0
G 0 2.2 9.7 0.2 0
T 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A12及A13處的可偵測的A＞G轉變。LPG50148顯示位置A13處超過9%的編輯。 表 14 ：使用脫胺酶 LPG50148 及導引 SGN000143 的 A＞N 編輯率
    SGN000143
    A1 A4 A6 A9 A11 A14 A19 A30
LPG50148 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0.1 1.2 11 6.7 0.1 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A9、A11及A14處可偵測的A＞G轉變。LPG50148顯示位置A11處超過11%的編輯。 表 15 ：使用脫胺酶 LPG50148 及導引 SGN000186 的 A＞N 編輯率
    SGN000186
    A9 A16 A18 A22 A25 A28 A30
LPG50148 C 0 0 0 0 0.4 0 0
G 23.7 29.2 4.1 0.2 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A9、A16及A18處可偵測的A＞G轉變。LPG50148顯示位置A9及A16處超過23%的編輯。 表 16 ：使用脫胺酶 LPG50148 及導引 SGN000194 的 A＞N 編輯率
    SGN000194
    A6 A10 A13 A15 A21 A23 A26 A27
LPG50148 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0.3 5.3 13 14 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A13及A15處可偵測的A＞G轉變。LPG50148顯示位置A13及A15處超過12%的編輯。 表 17 ：使用脫胺酶 LPG50148 及導引 SGN000930 的 A＞N 編輯率
    SGN000930
    A2 A4 A5 A8 A9 A10 A14 A15 A16 A20 A21 A23 A24 A26 A27 A29 A30
LPG50148 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0.2 2 2.2 1.1 2.2 2.2 2.5 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A10、A14、A15、A16、A20及A21處可偵測的A＞G轉變。LPG50148顯示位置A10、A14、A16、A20及A21處超過2%的編輯。 表 18 ：使用脫胺酶 LPG50146 及導引 SGN000139 的 A＞N 編輯率
    SGN000139
    A5 A12 A13 A20 A22
LPG50146 C 0 0 0 0.4 0.1
G 0 2.1 4.1 0 0
T 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A12及A13處可偵測的A＞G轉變。LPG50146顯示位置A13處超過4%的編輯。 表 19 ：使用脫胺酶 LPG50146 及導引 SGN000143 的 A＞N 編輯率
    SGN000143
    A1 A4 A6 A9 A11 A14 A19 A30
LPG50146 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.8 8.4 5 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A9、A11及A14處可偵測的A＞G轉變。LPG50146顯示位置A11處超過8%的編輯。 表 20 ：使用脫胺酶 LPG50146 及導引 SGN000186 的 A＞N 編輯率
    SGN000186
    A9 A16 A18 A22 A25 A28 A30
LPG50146 C 0 0 0 0 0.2 0 0
G 7.4 13.4 3.1 0.1 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A9、A16及A18處可偵測的A＞G轉變。LPG50146顯示位置A16處超過13%的編輯。 表 21 ：使用脫胺酶 LPG50146 及導引 SGN000194 的 A＞N 編輯率
    SGN000194
    A6 A10 A13 A15 A21 A23 A26 A27
LPG50146 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 1.8 3.2 4.5 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A13及A15處可偵測的A＞G轉變。LPG50146顯示位置A13及A15處超過3%的編輯。 表 22 ：使用脫胺酶 LPG50146 及導引 SGN000930 的 A＞N 編輯率
    SGN000930
    A2 A4 A5 A8 A9 A10 A14 A15 A16 A20 A21 A23 A24 A26 A27 A29 A30
LPG50146 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0.1 0.1 0.7 2.9 2.6 2.4 1 0.8 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A10、A14、A15、A16、A20及A21處可偵測的A＞G轉變。LPG50146顯示位置A14及A16處超過2%的編輯。 表 23 ：使用脫胺酶 LPG50140 及導引 SGN000139 的 A＞N 編輯率
    SGN000139
    A5 A12 A13 A20 A22
LPG50140 C 0 0 0 0.4 0
G 0 0.5 5.5 0 0
T 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A12及A13處可偵測的A＞G轉變。LPG50140顯示位置A13處超過5%的編輯。 表 24 ：使用脫胺酶 LPG50140 及導引 SGN000143 的 A＞N 編輯率
    SGN000143
    A1 A4 A6 A9 A11 A14 A19 A30
LPG50140 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 1.2 14 5.6 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A9、A11及A14處可偵測的A＞G轉變。LPG50140顯示位置A11處超過14%的編輯。 表 25 ：使用脫胺酶 LPG50140 及導引 SGN000186 的 A＞N 編輯率
    SGN000186
    A9 A16 A18 A22 A25 A28 A30
LPG50140 C 0 0 0 0 0.2 0 0
G 9.4 15 1.7 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A9、A16及A18處可偵測的A＞G轉變。LPG50140顯示位置A9及A16處超過9%的編輯。 表 26 ：使用脫胺酶 LPG50140 及導引 SGN000194 的 A＞N 編輯率
    SGN000194
    A6 A10 A13 A15 A21 A23 A26 A27
LPG50140 C 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 6.7 7.8 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A13及A15處可偵測的A＞G轉變。LPG50140顯示位置A13及A15處超過6%的編輯。 表 27 ：使用脫胺酶 LPG50140 及導引 SGN000930 的 A＞N 編輯率
    SGN000930
    A2 A4 A5 A8 A9 A10 A14 A15 A16 A20 A21 A23 A24 A26 A27 A29 A30
LPG50140 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 0 0 0 0 0.4 1.4 0.6 1.1 0.4 0.5 0 0 0 0 0 0
T 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LPG50140、LPG50146、及LPG50148顯示位置A10、A14、A15、A16、A20及A21處可偵測的A＞G轉變。LPG50140顯示位置A14及A16處超過1%的編輯。
下面的表28顯示藉由二個質體的脂質體轉染於HEK293T細胞中的若干測試的導引處對LPG50148-nAPG07433.1的平均編輯率。鹼基編輯器被編碼於一個質體上，及導引RNA被編碼於第二質體上。標的中的總置換率被用於量測鹼基編輯率。 表 28 ： LPG50148-nAPG07433.1 的平均編輯率
基因 SGN 平均 % 置換率 N
基因A SGN000139 10.8 1
基因A SGN000143 29.65 2
基因B SGN000487 34.68 2
基因B SGN000488 39.94 1
基因B SGN001061 9.18 2
基因B SGN001062 32.77 1
基因B SGN001270 8.34 3
基因B SGN001946 5.1 1
基因B SGN001947 16.43 1
基因B SGN001948 0.46 1
基因B SGN001949 1.44 1
基因B SGN001950 10.96 1
基因B SGN001951 5.38 1
基因B SGN001952 6.29 1
基因B SGN001953 5.28 1
基因B SGN001954 7.95 1
基因B SGN001955 7.83 1
基因B SGN001956 4.78 1
基因B SGN001959 1.43 1
基因B SGN001960 17.4 1
基因B SGN001961 1.46 1
基因B SGN001962 1.62 1
基因B SGN001963 11.31 1
基因B SGN001964 2.03 1
基因B SGN001965 9.3 1
基因B SGN001966 1.51 1
CFTR SGN001101 17.06 1
基因D SGN001196 14.58 1
基因D SGN001199 42.05 1
基因E SGN001681 48.85 1
基因F SGN000169 55.13 2
基因F SGN000173 47.13 1
基因G SGN000412 16.58 1
基因G SGN000414 14.5 2
基因G SGN001259 24.16 1
基因G SGN001274 10.45 2
基因G SGN001275 5.25 1
基因H SGN000186 32.65 1
基因I SGN000754 30.76 1
基因I SGN000909 21.57 2
基因I SGN000927 3.8 1
基因I SGN000928 28.77 1
基因I SGN000929 17.58 2
基因I SGN000949 26.43 1
基因I SGN001268 16.64 2
基因I SGN001269 6.42 1
基因I SGN001967 1.45 1
基因I SGN001968 5.61 1
基因I SGN001973 5.14 1
基因I SGN001975 0.16 1
基因I SGN001976 0.62 1
基因I SGN001977 0.65 1
基因I SGN001978 3.09 1
基因I SGN001981 2.34 1
LPG50148-nAPG07433.1於橫跨基因組的許多不同導引處顯示編輯。
表29顯示自LPG50148-nAPG07433.1的每一個導引中的腺嘌呤鹼基的編輯率。下面僅顯示腺嘌呤位置。腺嘌呤轉變率為適宜時多個實驗的平均值。 表 29 ：哺乳動物細胞中的 A 核苷酸對前 10 個導引的編輯率
Figure 02_image001
LPG50148-nAPG07433.1顯示標的區域中的位置6至21中依賴所使用的導引RNA的腺嘌呤鹼基編輯。編輯率依所使用的導引RNA而變化。 實例 4 ： I 類囊腫纖維化無意義突變之校正 實例 4.1 ： RGN 及導引 RNA 之辨別
囊腫纖維化一般而言藉由 CFTR基因（SEQ ID NO: 51）中的有害突變引起。大多數常見的無意義突變中之六個無意義突變為G542X、W1282X、R553X、R1162X、E60X、R785X、及Q493X。此等停止突變中每一者可藉由本文描述的RGN脫胺酶融合蛋白被編輯，以恢復寫碼密碼子。為靶向每一個突變，以下必須被確定：1）具有靠近無意義突變的PAM辨識位點的RGN；及2）將RGN脫胺酶融合蛋白最佳地靶向至標的DNA的導引RNA。下面的表30顯示擁有靠近六個無意義突變中每一者的PAM的RGN的切口酶變異體及可用於每一個RGN的導引RNA的數目。表31描述每一個導引RNA之基因的基因座。每一個基因的基因座的PAM辨識位點被加底線。導引RNA的標的序列及導引RNA序列本身亦被指示。 表 30 ：用於 CFTR 中無意義突變的 RGN 切口酶及導引 RNA 的數目
RGN 切口酶 RGN 切口酶的SEQ ID NO. E60X G542X Q493X R1162X R553X W1282X
nAPG00969 52 2 2 2
nAPG07433.1 42 1 3 1
nAPG06646 53 6 4 2 3 7 4
nAPG09748 54 1 1 4 1
nAPG09882 55 4 3 5 5 3 5
nAPG03850 56 2 2 1 3 3 4
nAPG07553 57 1 1 1 1 1 2
nAPG05586 58 1 1 3 1
nAPG01604 59 2 1 2
表 31 ：用於 CFTR 中之無意義突變的導引 RNA
Figure 02_image003
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
實例3中之表28提供靶向CFTR的SGN001101 sgRNA的編輯資料。
為測定其他導引RNA之活性，表31之導引RNA被提供表30描述的、可操作地聯結至本發明之脫胺酶以產生融合蛋白的每一個RGN的對應切口酶變異體。應該認識到，亦可相似地測試每一個RGN之滅核酸酶活性變異體。關於在16HBE14o-永生化支氣管上皮細胞中的標的位址處的編輯能力，測定每一個導引及融合蛋白組合。目前，含有CFTR無意義突變的三個HBE細胞系是可得的（Cystic Fibrosis Foundation, Lexington, MA）。此等細胞系用於測定G542X、W1282X、及R1162X無意義突變標的及被與16HBE14o-系相較。融合蛋白及導引RNA作為核糖核蛋白（RNP）被遞送至細胞，按照Valley等人（Valley等人2019. J Cyst Fibros18, 476-483, 其藉由引用而被併入本文）提供的培養及轉化方法，其被核轉染為16HBE14o-細胞系。導引RNA被提供為單導引RNA或與RGN蛋白被提供為1:1或1:1.2莫耳比的tracrRNA:crRNA雙鏈體（duplex）。於Lonza 4D-Nucleofector上實行RNP至細胞內的核轉染。然後，細胞於37° C下被培養72小時。於一些實施方式中，融合蛋白及gRNA為作RNA分子被遞送至細胞，而且融合蛋白於mRNA中被編碼。
因為沒有對E60X、R553X、及Q493X可用的細胞系，所以使用實例2中描述的GFP恢復測定的修飾，於HEK293細胞中測定此等突變，其中含有無意義突變的突變體基因座被選殖至GFP閱讀框2內。
然後，在培養之後，按照製造商的操作流程，使用NucleoSpin 96 Tissue（Macherey-Nagel），萃取基因組DNA。所靶向之基因組位點側翼的基因組區域被PCR擴增，且按照製造商的操作流程，使用ZR-96 DNA清潔與濃縮器（Zymo Research）而純化產物。經純化之PCR產物在Illumina MiSeq上發送而進行下一代定序。通常情況下，每擴增子產生100,000個250 bp的配對末側讀數（2×100,000個讀數）。使用CRISPResso（Pinello等人，2016）分析讀數，以計算編輯率。手動施治(hand-curated)輸出對準，以確認所關注之鹼基編輯突變之引入，且亦篩除不期望的INDEL形成。
除了鹼基編輯的效率，鹼基編輯 CFTR基因的蛋白產物針對功能而被評估。關於無意義突變中之二者（Glu60X及Gly542X），腺嘌呤至鳥嘌呤的鹼基編輯變化不恢復野生型序列，因為此等突變藉由鳥嘌呤至胸嘧啶顛換（transversion）引起。融合蛋白的靶向活性使Glu60X變化為Glu60Gln及使Gly452X變化為Gly542Arg。儘管此等突變確實允許製作全長蛋白，但CFTR蛋白之穩定性及功能性亦被確認。 實例 4.2 ：減小大小的工程化 RGN
理想的是，本發明之RGN脫胺酶融合蛋白的寫碼序列及用於將融合蛋白靶向至 CFTR基因的對應導引RNA可全部被包裝於單AAV載體內。一般而言，所接受之AAV載體之大小限制為4.7 kb，但是可考量較大的大小，但代價是減低的包裝效率。表30中的RGN切口酶具有長度為約3.15-3.45 kB的寫碼序列。為確保融合蛋白及其對應導引RNA二者之表現卡匣可裝進AAV載體內，期望縮短RGN胺基酸及其對應核酸寫碼序列之長度。
通過與密切有關的同源物對準，位置590-597處的唯一8胺基酸區域在APG07433.1及其密切同源物APG08290.1中被辨別（WO 2019/236566中所述的及本文中如SEQ ID NO: 60所示的）。如APG07433.1的SEQ ID NO: 365及APG08290.1的SEQ ID NO: 367所示的此區域被自二個蛋白移除，得到變異體RGN APG07433.1-del（SEQ ID NO: 366）及APG08290.1-del（SEQ ID NO: 368）。按照與實例1中描述的方法相似的方法，使用表32及33中指示的導引RNA，此等刪除變異體及其對應野生型RGN針對在HEK293T細胞中的編輯活性而被測定。標的序列的編輯率被顯示於下面的表32及33中。 表 32 ： APG07433.1 蛋白刪除變異體的編輯率
導引 RNA 標的 (SEQ ID NO.) sgRNA (SEQ ID NO.) APG07433.1 APG07433.1-del
SGN000139 369 383 11.09% 1.00%
SGN000143 370 384 2.68% 0.71%
SGN000169 371 385 13.37% 15.48%
SGN000173 372 386 13.65% 15.37%
SGN000186 373 387 14.72% 15.16%
SGN000194 374 388 11.91% 7.66%
SGN000927 376 390 9.53% 11.47%
SGN000929 378 392 6.14% 13.10%
SGN000930 379 393 7.52% 9.51%
SGN000935 381 395 11.08% 15.99%
SGN001101 382 396 6.16% 6.75%
關於標的SGN000169、SGN000173、SGN000186、SGN000927、SGN000930、及SGN001101，野生型APG07433.1蛋白與經工程化之變異體的編輯率相似。關於標的SGN000139、SGN000143、及SGN000194，與野生型蛋白相較，當使用經工程化之變異體時，編輯率被降低。在SGN000929及SGN000935情況中，與野生型序列相較，用經工程化之APG07433.1變異體，編輯率升高。 表 33 ： APG08290.1 蛋白刪除變異體的編輯率
sgRNA ID 標的 (SEQ ID NO.) sgRNA (SEQ ID NO.) APG08290.1 APG08290.1-del
SGN000926 375 389 N.D. 6.47%
SGN000929 378 392 1.83% 0.61%
SGN000930 379 393 9.93% 6.47%
SGN000928 377 391 N.D. 0.13%
SGN000931 380 394 0% 0%
N.D. =未定
APG08290.1刪除變異體顯示野生型APG08290.1蛋白亦顯示編輯的所有樣本中的編輯。用經工程化之蛋白，所偵測的最低編輯率為0.13%。標的SGN000926顯示最高編輯率：9.17%。
使用與實例1相似的方法，包括APG07433.1-del或APG08290.1-del及本發明之脫胺酶的融合蛋白被產生且針對於鹼基編輯活性被測定。
融合蛋白包括RGN及藉由諸如SEQ ID NO: 45所示的可撓性胜肽聯結子聯結的脫胺酶。SEQ ID NO: 45的聯結子的長度為16個胺基酸；此大小可被減小，以減小融合蛋白的寫碼序列的大小。使用與實例1相似的方法，小於16個胺基酸的胜肽聯結子可被產生，且可操作地聯結RGN APG07433.1-del或APG08290.1-del及本發明之脫胺酶，且針對於鹼基編輯活性被測試。因為RGN與脫胺酶之間的胜肽聯結子可確定融合蛋白之編輯窗，所以對具有不同長度及剛性之替選聯結子的測試亦可引致編輯效率改良，同時減少脫靶突變。因此，然後，按照與實例4.1相似的方法，測定具最高編輯率之融合蛋白，以針對於 CFTR標的序列中每一者確定編輯效率。具最高編輯效率之融合蛋白gRNA組合被選為於那個位址進行編輯之較佳導引且被用於AAV載體設計。 實例 4.3 ： AAV 遞送
具最高編輯率之有效融合蛋白/gRNA組合的寫碼序列被包裝至AAV載體內。AAV遞送具有很多優點，包含缺少致病性、低免疫原性、高轉導率、及限定的製造路徑。而且，肺臟的AAV給藥已顯示是安全的，且至少在某種程度上，在單給藥及重複給藥二者的情況中是有效的（Guggino等人, 2017, Expert Opin Biol Ther17, 1265-1273）。在融合蛋白/ gRNA組合被選殖至AAV載體內後，其可被包裝至若干不同血清型內，以最佳化組織專一性感染力。關於CF之醫治，鹼基編輯之標的為肺臟之頂端上皮祖細胞（progenitor apical epithelium cell），其允許校正在細胞更新始終持續。為靶向呼吸上皮，採用血清型AAV1、AAV5或AAV6的殻體，因此等血清型已在呼吸上皮細胞中顯示具有高感染力（Zabner et al., 2000, J Virol74, 3852-3858）。
AAV載體一被產生，它們就在培養中被轉導至人氣道上皮細胞內。含有CFTR G542X、R1162X、及W1282X無意義突變標的之三個HBE細胞系被用於使構築體有效用於那些突變之校正。16HBE14o-系被用於測試校正其他無意義突變之構築體。測試感染倍數（multiplicities of infection, MOI）的範圍。在任一情況中，無意義突變至野生型CFTR序列的返原(reversion)被估定。培養2-3天后，基因組DNA被收穫，靶向位點周圍的擴增子藉由PCR被產生，及NGS以與實例1中描述的方法相似的方法被實行，以確定每一個基因座處之編輯率。因為氣道上皮細胞被使用，所以在使用經培育之細胞系統時，AAV引入及編輯率盡可能與活體內醫治相似。將具有不同血清型之AAV相較，以確定哪個血清型針對於將融合蛋白/gRNA遞送至氣道細胞內最佳。將藉由此等系統之AAV引入達成之編輯率與實例4.2中觀察到的RNP編輯率相較。
因為無意義突變R553X、E60X、及Q493X的細胞系不可得，所以靶向此等突變之融合蛋白/gRNA系統在野生型16HBE14o-細胞中被評估，以測定所關注之位址處的AAV引入、鹼基編輯器表現、及脫靶編輯率。為確定停止密碼子校正率，針對於GFP恢復測定，突變體基因座被選殖至GFP內，如實例4.1中所描述的。
與藉由NGS確定編輯率並行，來自帶有用融合蛋白/gRNA系統編輯的CFTR突變的細胞的總蛋白溶胞產物被收集，且全長CFTR蛋白之水準藉由西方印漬術被估定。為測試功能性CFTR蛋白是否被形成，使用與Devor等人（2000, Am J Physiol Cell Physiol 279, C461-479, 藉由引用而被併入本文incoporated by reference herein）及/或Dousmais等人（2002, J Gen Physiol 119, 545-559, 藉由引用而被併入本文）描述的方法相似的方法，實行毛喉素（forskolin）活化測定。於此等實驗中，用毛喉素（腺苷酸環化酶之活化子）處置經編輯之CFTR突變體細胞，以增加cAMP之細胞內水準。然後，上升的cAMP水準活化CFTR，及Cl -的流入量藉由基於基因編碼黃色螢光蛋白的Cl -感測器或諸如MQAE的氯化物的小分子螢光指示器量測。於此測定中，測試經G542X、R1162X、及W1282X編輯之細胞系。
為確定脫靶突變率，使用用關於種子區域及每一個專一性核酸酶之可撓性脫靶PAM辨識空間之資訊客制化的生物資訊措施。此多則等資訊已在生物資訊學上針對於每一個蛋白被確定，且被用於對每一個蛋白的脫靶活性之概度排序。
為補足脫靶之生物資訊預測，亦實行經由經修飾之SITE-seq操作流程（Cameron等人, 2017, Nat Methods 14, 600-606, 藉由引用而被併入本文）的脫靶之生物化學刪除。簡言之，獲得來自人氣道上皮細胞的基因組DNA。然後，用若干不同濃度的所關注之RGN處置此DNA。用允許NGS的轉接子序列，任何DNA雙股斷裂被示蹤、被選擇性地分離、及被PCR擴增。然後，將定序讀數映射至基因組，且讀數之“堆積（pileups）”於雙股斷裂的位點處被辨別，其標記推定的脫靶位址。在一組後續實驗中，用所關注之RGN或RGN脫胺酶融合蛋白編輯細胞，且此等推定位點被個別地定序，以確認它們是否是真實脫靶。由於染色質背景、 DNA可取用性(accessibility)、及其他因素可衝擊基因組編輯器於活細胞中的效率，所以生物化學方法通常情況下高估脫靶的數目。因此，生物資訊及生物化學方法二者一起提供互補方法來辨別推定的脫靶位點，但此等位點必須藉由擴增子定序而被驗證，以擷取脫靶編輯之準確估定。
推定之脫靶位點一被辨別，用同樣最佳化之融合蛋白及（多個）導引編輯之16HBE氣道上皮細胞上的擴增子定序就確保對此等系統建構的脫靶概況盡可能密切地與所期望的患者肺臟中的概況匹配。
為確定本文描述之融合蛋白是否誘導細胞RNA中的變化，編輯之後對細胞總轉錄本的仔細分析是必要的。幸運的是，估定腺嘌呤鹼基編輯脫靶作用之RNA-seq技術已變成常規技術（Grunewald等人, 2017, Nature569, 433-437；Zhou等人, Nature571, 275-278, 二者藉由引用而被併入本文）。簡言之，用在實例4.2確定的融合蛋白/gRNA系統編輯細胞之後，總細胞mRNA被收集，且經受RNA-seq。將來自經編輯之細胞之總轉錄本與單獨用ABE轉染的細胞相較，且辨別RNA序列中之顯著不同。 實例 5 ：用於因果疾病突變之校正的靶向鹼基編輯
臨床變異體資料庫自透過全球資訊網在NCBI ClinVar網站上可得的NCBI ClinVar資料庫獲得。自此清單中辨別致病性單核苷酸多型性（SNP）。使用基因組基因座資訊，辨別與每一個SNP重疊且圍繞每一個SNP之區域中的CRISPR標的。與RGN（舉例而言諸如表30所列的RGN或其變異體）組合地使用鹼基編輯可校正從而靶向因果突變（“Casl Mut.”）的SNP中之選擇被列於表34中。在下面的表34中，僅列出每一種疾病的一個別名。“RS#”對應於NCBI網站上的SNP資料庫中的RS寄存編號。“AlleleID”對應於因果對偶基因寄存編號。“名稱”欄含有基因的基因座辨別符、基因名稱、基因中之突變位址、及突變導致的變化。 表 34 ：鹼基編輯的疾病標的
RS# AlleleID 名稱 GeneSymbol
36053993 20333 NM_001128425.1(MUTYH):c.1187G＞A (p.Gly396Asp) MUTYH
41293455 32714 NM_007294.3(BRCA1):c.4327C＞T (p.Arg1443Ter) BRCA1
62625308 32710 NM_007294.3(BRCA1):c.3607C＞T (p.Arg1203Ter) BRCA1
41293465 70268 NM_007294.3(BRCA1):c.5503C＞T (p.Arg1835Ter) BRCA1
80357123 70147 NM_007294.3(BRCA1):c.5251C＞T (p.Arg1751Ter) BRCA1
137929307 171217 NM_000527.4(LDLR):c.1775G＞A (p.Gly592Glu) LDLR
80356898 45982 NM_007294.3(BRCA1):c.1687C＞T (p.Gln563Ter) BRCA1
28936415 22745 NM_000303.2(PMM2):c.422G＞A (p.Arg141His) PMM2
11555217 34125 NM_001360.2(DHCR7):c.452G＞A (p.Trp151Ter) DHCR7
55770810 70063 NM_007294.3(BRCA1):c.5095C＞T (p.Arg1699Trp) BRCA1
28934906 26850 NM_004992.3(MECP2):c.473C＞T (p.Thr158Met) MECP2
28929474 33006 NM_001127701.1(SERPINA1):c.1096G＞A (p.Glu366Lys) SERPINA1
371898076 52045 NM_000257.4(MYH7):c.1988G＞A (p.Arg663His) MYH7
5030858 15616 NM_000277.3(PAH):c.1222C＞T (p.Arg408Trp) PAH
80356945 69207 NM_007294.3(BRCA1):c.2338C＞T (p.Gln780Ter) BRCA1
1800553 22927 NM_000350.2(ABCA4):c.5882G＞A (p.Gly1961Glu) ABCA4
80356962 70247 NM_007294.3(BRCA1):c.5444G＞A (p.Trp1815Ter) BRCA1
104894396 32041 NM_004004.6(GJB2):c.71G＞A (p.Trp24Ter) GJB2
113994095 28535 NM_002693.2(POLG):c.1399G＞A (p.Ala467Thr) POLG
61749721 26868 NM_004992.3(MECP2):c.763C＞T (p.Arg255Ter) MECP2
137852700 23943 NM_000310.3(PPT1):c.451C＞T (p.Arg151Ter) PPT1
75527207 22159 NM_000492.3(CFTR):c.1652G＞A (p.Gly551Asp) CFTR
78655421 22148 NM_000492.3(CFTR):c.350G＞A (p.Arg117His) CFTR
80356885 69888 NM_007294.3(BRCA1):c.4524G＞A (p.Trp1508Ter) BRCA1
113994098 28541 NM_002693.2(POLG):c.2542G＞A (p.Gly848Ser) POLG
61750240 26854 NM_004992.3(MECP2):c.808C＞T (p.Arg270Ter) MECP2
61751362 26858 NM_001110792.1(MECP2):c.916C＞T (p.Arg306Ter) MECP2
80357260 69792 NM_007294.3(BRCA1):c.4183C＞T (p.Gln1395Ter) BRCA1
80359071 67203 NM_000059.3(BRCA2):c.8243G＞A (p.Gly2748Asp) BRCA2
62625307 69596 NM_007294.3(BRCA1):c.3598C＞T (p.Gln1200Ter) BRCA1
76992529 28465 NM_000371.3(TTR):c.424G＞A (p.Val142Ile) TTR
77010898 22168 NM_000492.3(CFTR):c.3846G＞A (p.Trp1282Ter) CFTR
80359003 67069 NM_000059.3(BRCA2):c.7757G＞A (p.Trp2586Ter) BRCA2
61750420 22555 NM_000466.2(PEX1):c.2528G＞A (p.Gly843Asp) PEX1
80357284 46214 NM_007294.3(BRCA1):c.5346G＞A (p.Trp1782Ter) BRCA1
200411226 174776 NM_000256.3(MYBPC3):c.1484G＞A (p.Arg495Gln) MYBPC3
5030857 98638 NM_000277.3(PAH):c.1208C＞T (p.Ala403Val) PAH
28935468 26863 NM_004992.3(MECP2):c.916C＞T (p.Arg306Cys) MECP2
62642937 15667 NM_000277.3(PAH):c.1139C＞T (p.Thr380Met) PAH
80356989 69812 NM_007294.3(BRCA1):c.4222C＞T (p.Gln1408Ter) BRCA1
28942080 18735 NM_000527.4(LDLR):c.1567G＞A (p.Val523Met) LDLR
121908039 18778 NM_000527.4(LDLR):c.551G＞A (p.Cys184Tyr) LDLR
267607213 18780 NM_000527.4(LDLR):c.131G＞A (p.Trp44Ter) LDLR
3218716 52071 NM_000257.3(MYH7):c.2389G＞A (p.Ala797Thr) MYH7
104895097 17588 NM_000243.2(MEFV):c.2282G＞A (p.Arg761His) MEFV
397516074 51962 NM_000256.3(MYBPC3):c.772G＞A (p.Glu258Lys) MYBPC3
119455955 17682 NM_000391.3(TPP1):c.622C＞T (p.Arg208Ter) TPP1
75184679 16301 NM_024570.3(RNASEH2B):c.529G＞A (p.Ala177Thr) RNASEH2B
80338901 26909 NM_000137.2(FAH):c.1062+5G＞A FAH
119450941 17501 NM_000026.3(ADSL):c.1277G＞A (p.Arg426His) ADSL
121965019 26947 NM_000203.4(IDUA):c.1205G＞A (p.Trp402Ter) IDUA
141659620 21858 NM_003119.3(SPG7):c.1045G＞A (p.Gly349Ser) SPG7
41276738 15335 NM_000552.4(VWF):c.2561G＞A (p.Arg854Gln) VWF
80338940 32068 NM_004004.5(GJB2):c.-23+1G＞A GJB2
80357292 46268 NM_007294.3(BRCA1):c.962G＞A (p.Trp321Ter) BRCA1
121913627 29130 NM_000257.3(MYH7):c.1816G＞A (p.Val606Met) MYH7
137854601 24416 NM_198056.2(SCN5A):c.5350G＞A (p.Glu1784Lys) SCN5A
80338933 17521 NM_024577.3(SH3TC2):c.2860C＞T (p.Arg954Ter) SH3TC2
80338948 32048 NM_004004.5(GJB2):c.427C＞T (p.Arg143Trp) GJB2
80356903 69645 NM_007294.3(BRCA1):c.3718C＞T (p.Gln1240Ter) BRCA1
80356969 70213 NM_007294.3(BRCA1):c.5353C＞T (p.Gln1785Ter) BRCA1
80357010 45971 NM_007294.3(BRCA1):c.1480C＞T (p.Gln494Ter) BRCA1
116987552 17337 NM_005609.3(PYGM):c.148C＞T (p.Arg50Ter) PYGM
121913625 29128 NM_000257.4(MYH7):c.1357C＞T (p.Arg453Cys) MYH7
387907267 45725 NM_000256.3(MYBPC3):c.2827C＞T (p.Arg943Ter) MYBPC3
28934897 26968 NM_000431.3(MVK):c.1129G＞A (p.Val377Ile) MVK
76713772 22151 NM_000492.3(CFTR):c.1585-1G＞A CFTR
137852959 19587 NM_153638.3(PANK2):c.1561G＞A (p.Gly521Arg) PANK2
199682486 101428 NM_013339.4(ALG6):c.257+5G＞A ALG6
397507389 46666 NM_000059.3(BRCA2):c.7618-1G＞A BRCA2
769370816 228176 NM_000527.4(LDLR):c.1618G＞A (p.Ala540Thr) LDLR
36211715 29159 NM_000257.4(MYH7):c.2609G＞A (p.Arg870His) MYH7
76434661 53916 NM_004004.5(GJB2):c.416G＞A (p.Ser139Asn) GJB2
104894368 29104 NM_000432.3(MYL2):c.64G＞A (p.Glu22Lys) MYL2
104894635 20146 NM_000199.3(SGSH):c.734G＞A (p.Arg245His) SGSH
121913628 29131 NM_000257.3(MYH7):c.2770G＞A (p.Glu924Lys) MYH7
193922390 45304 NM_000257.4(MYH7):c.5135G＞A (p.Arg1712Gln) MYH7
397515757 51454 NM_000138.4(FBN1):c.1468+5G＞A FBN1
11549407 30441 NM_000518.5(HBB):c.118C＞T (p.Gln40Ter) HBB
61751374 22933 NM_000350.2(ABCA4):c.3113C＞T (p.Ala1038Val) ABCA4
121434420 21793 NM_004572.3(PKP2):c.235C＞T (p.Arg79Ter) PKP2
137853007 20631 NM_007194.4(CHEK2):c.433C＞T (p.Arg145Trp) CHEK2
1137887 18083 NM_000051.3(ATM):c.2250G＞A (p.Lys750=) ATM
28934872 27436 NM_000548.3(TSC2):c.1832G＞A (p.Arg611Gln) TSC2
80224560 47062 NM_000492.3(CFTR):c.2657+5G＞A CFTR
80359004 46672 NM_000059.3(BRCA2):c.7758G＞A (p.Trp2586Ter) BRCA2
121434274 18627 NM_000016.5(ACADM):c.799G＞A (p.Gly267Arg) ACADM
121908529 38436 NM_000030.2(AGXT):c.508G＞A (p.Gly170Arg) AGXT
121918007 28709 NM_000478.4(ALPL):c.571G＞A (p.Glu191Lys) ALPL
121918243 16464 NM_015506.2(MMACHC):c.482G＞A (p.Arg161Gln) MMACHC
397518423 94255 NM_005026.4(PIK3CD):c.3061G＞A (p.Glu1021Lys) PIK3CD
587781629 150997 NM_000059.3(BRCA2):c.1909+1G＞A BRCA2
765696008 228162 NM_000527.4(LDLR):c.1187-10G＞A LDLR
3218713 29127 NM_000257.3(MYH7):c.746G＞A (p.Arg249Gln) MYH7
5030855 15646 NM_000277.3(PAH):c.1066-11G＞A PAH
55851803 69067 NM_007294.3(BRCA1):c.191G＞A (p.Cys64Tyr) BRCA1
62508698 15619 NM_000277.1(PAH):c.838G＞A (p.Glu280Lys) PAH
62516152 108520 NM_000277.3(PAH):c.688G＞A (p.Val230Ile) PAH
62644499 15656 NM_000277.3(PAH):c.1243G＞A (p.Asp415Asn) PAH
80338815 18090 NM_000487.5(ARSA):c.465+1G＞A ARSA
121908987 21885 NM_016203.3(PRKAG2):c.905G＞A (p.Arg302Gln) PRKAG2
121964962 15156 NM_000071.2(CBS):c.919G＞A (p.Gly307Ser) CBS
5030851 15628 NM_000277.3(PAH):c.842C＞T (p.Pro281Leu) PAH
63750871 24273 NM_000535.6(PMS2):c.400C＞T (p.Arg134Ter) PMS2
80338853 21822 NM_001360.2(DHCR7):c.278C＞T (p.Thr93Met) DHCR7
80356893 68976 NM_007294.3(BRCA1):c.1612C＞T (p.Gln538Ter) BRCA1
80357131 46031 NM_007294.3(BRCA1):c.2563C＞T (p.Gln855Ter) BRCA1
80357223 69350 NM_007294.3(BRCA1):c.2800C＞T (p.Gln934Ter) BRCA1
80357318 46112 NM_007294.3(BRCA1):c.3937C＞T (p.Gln1313Ter) BRCA1
104886457 27086 NM_000136.2(FANCC):c.1642C＞T (p.Arg548Ter) FANCC
137852944 19147 NM_138694.3(PKHD1):c.107C＞T (p.Thr36Met) PKHD1
180177083 132139 NM_024675.3(PALB2):c.196C＞T (p.Gln66Ter) PALB2
180177110 152117 NM_024675.3(PALB2):c.2257C＞T (p.Arg753Ter) PALB2
199475575 108459 NM_000277.3(PAH):c.526C＞T (p.Arg176Ter) PAH
387906843 39241 NM_002878.3(RAD51D):c.556C＞T (p.Arg186Ter) RAD51D
529008617 152318 NM_001128425.1(MUTYH):c.1214C＞T (p.Pro405Leu) MUTYH
587780021 133177 NM_000465.3(BARD1):c.1690C＞T (p.Gln564Ter) BARD1
34637584 16979 NM_198578.3(LRRK2):c.6055G＞A (p.Gly2019Ser) LRRK2
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80358809 66611 NM_000059.3(BRCA2):c.581G＞A (p.Trp194Ter) BRCA2
80359011 46678 NM_000059.3(BRCA2):c.7857G＞A (p.Trp2619Ter) BRCA2
104894503 27495 NM_001018005.1(TPM1):c.523G＞A (p.Asp175Asn) TPM1
121908641 21368 NM_000050.4(ASS1):c.1168G＞A (p.Gly390Arg) ASS1
121918593 28009 NM_000540.2(RYR1):c.7300G＞A (p.Gly2434Arg) RYR1
140108514 100191 NM_003494.3(DYSF):c.2643+1G＞A DYSF
145138923 98271 NM_000048.3(ASL):c.35G＞A (p.Arg12Gln) ASL
150726175 45795 NM_022787.3(NMNAT1):c.769G＞A (p.Glu257Lys) NMNAT1
267607578 45138 NM_170707.3(LMNA):c.1412G＞A (p.Arg471His) LMNA
376607329 48992 NM_002834.4(PTPN11):c.794G＞A (p.Arg265Gln) PTPN11
587776934 48407 NM_005027.3(PIK3R2):c.1117G＞A (p.Gly373Arg) PIK3R2
62508588 15630 NM_000277.1(PAH):c.728G＞A (p.Arg243Gln) PAH
62637014 20604 NM_014336.4(AIPL1):c.834G＞A (p.Trp278Ter) AIPL1
80356860 46194 NM_007294.3(BRCA1):c.5117G＞A (p.Gly1706Glu) BRCA1
80357268 70265 NM_007294.3(BRCA1):c.5497G＞A (p.Val1833Met) BRCA1
80357418 70077 NM_007294.3(BRCA1):c.5136G＞A (p.Trp1712Ter) BRCA1
80358145 46229 NM_007294.3(BRCA1):c.5467+1G＞A BRCA1
121918166 15994 NM_000275.2(OCA2):c.1327G＞A (p.Val443Ile) OCA2
140342925 150591 NM_001128425.1(MUTYH):c.734G＞A (p.Arg245His) MUTYH
148660051 195093 NM_206933.2(USH2A):c.10073G＞A (p.Cys3358Tyr) USH2A
193922672 45341 NM_004572.3(PKP2):c.1613G＞A (p.Trp538Ter) PKP2
267607144 20039 NM_021625.4(TRPV4):c.806G＞A (p.Arg269His) TRPV4
397516083 51977 NM_000256.3(MYBPC3):c.927-9G＞A MYBPC3
397516357 52565 NM_000363.4(TNNI3):c.557G＞A (p.Arg186Gln) TNNI3
587782958 165560 NM_000256.3(MYBPC3):c.3190+5G＞A MYBPC3
28934907 26853 NM_004992.3(MECP2):c.316C＞T (p.Arg106Trp) MECP2
28934908 26862 NM_004992.3(MECP2):c.419C＞T (p.Ala140Val) MECP2
28940893 18091 NM_000487.5(ARSA):c.1283C＞T (p.Pro428Leu) ARSA
63751422 96795 NM_000535.5(PMS2):c.1927C＞T (p.Gln643Ter) PMS2
74315366 27817 NM_003000.2(SDHB):c.268C＞T (p.Arg90Ter) SDHB
80338856 34127 NM_001360.2(DHCR7):c.724C＞T (p.Arg242Cys) DHCR7
80357038 69707 NM_007294.3(BRCA1):c.3895C＞T (p.Gln1299Ter) BRCA1
80357136 69535 NM_007294.3(BRCA1):c.3403C＞T (p.Gln1135Ter) BRCA1
80357208 69682 NM_007294.3(BRCA1):c.3817C＞T (p.Gln1273Ter) BRCA1
80357234 69166 NM_007294.3(BRCA1):c.220C＞T (p.Gln74Ter) BRCA1
80357262 69729 NM_007294.3(BRCA1):c.3967C＞T (p.Gln1323Ter) BRCA1
80357305 69822 NM_007294.3(BRCA1):c.4258C＞T (p.Gln1420Ter) BRCA1
80357350 69232 NM_007294.3(BRCA1):c.241C＞T (p.Gln81Ter) BRCA1
104894636 20147 NM_000199.3(SGSH):c.220C＞T (p.Arg74Cys) SGSH
111401431 44742 NM_000138.4(FBN1):c.4588C＞T (p.Arg1530Cys) FBN1
121918624 27928 NM_006920.5(SCN1A):c.664C＞T (p.Arg222Ter) SCN1A
137852981 19794 NM_014795.3(ZEB2):c.2083C＞T (p.Arg695Ter) ZEB2
137854476 31491 NM_000138.4(FBN1):c.1585C＞T (p.Arg529Ter) FBN1
137854480 31500 NM_000138.4(FBN1):c.718C＞T (p.Arg240Cys) FBN1
180177100 133574 NM_024675.3(PALB2):c.1240C＞T (p.Arg414Ter) PALB2
193922109 44392 NM_000053.3(ATP7B):c.3955C＞T (p.Arg1319Ter) ATP7B
200640585 96857 NM_000535.6(PMS2):c.943C＞T (p.Arg315Ter) PMS2
201431517 48426 NM_139242.3(MTFMT):c.626C＞T (p.Ser209Leu) MTFMT
397516037 51905 NM_000256.3(MYBPC3):c.3697C＞T (p.Gln1233Ter) MYBPC3
587780104 133350 NM_002878.3(RAD51D):c.694C＞T (p.Arg232Ter) RAD51D
765123255 181726 NM_001128425.1(MUTYH):c.325C＞T (p.Arg109Trp) MUTYH
63751657 95331 NM_000249.3(MLH1):c.1731G＞A (p.Ser577=) MLH1
75549581 22162 NM_000492.3(CFTR):c.1675G＞A (p.Ala559Thr) CFTR
80338851 16303 NM_194318.3(B3GLCT):c.660+1G＞A B3GLCT
80358544 46368 NM_000059.3(BRCA2):c.2979G＞A (p.Trp993Ter) BRCA2
111033178 52388 NM_000260.3(MYO7A):c.3719G＞A (p.Arg1240Gln) MYO7A
121908188 19535 NM_020451.2(SELENON):c.943G＞A (p.Gly315Ser) SELENON
139770721 180483 NM_000051.3(ATM):c.6095G＞A (p.Arg2032Lys) ATM
199476315 40542 NM_001018005.1(TPM1):c.574G＞A (p.Glu192Lys) TPM1
267607004 15310 NM_001134363.2(RBM20):c.1907G＞A (p.Arg636His) RBM20
267608122 94980 NM_000179.2(MSH6):c.4001G＞A (p.Arg1334Gln) MSH6
377349459 150947 NM_000051.3(ATM):c.7913G＞A (p.Trp2638Ter) ATM
387906303 18745 NM_000527.4(LDLR):c.670G＞A (p.Asp224Asn) LDLR
587779227 94719 NM_000179.2(MSH6):c.2057G＞A (p.Gly686Asp) MSH6
587780290 134019 NM_000070.2(CAPN3):c.2243G＞A (p.Arg748Gln) CAPN3
727504317 49251 NM_002755.3(MAP2K1):c.199G＞A (p.Asp67Asn) MAP2K1
5030869 25402 NM_000402.4(G6PD):c.1093G＞A (p.Ala365Thr) G6PD
9332964 18390 NM_000348.3(SRD5A2):c.680G＞A (p.Arg227Gln) SRD5A2
36211723 45266 NM_000256.3(MYBPC3):c.2308G＞A (p.Asp770Asn) MYBPC3
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80358079 70118 NM_007294.3(BRCA1):c.5194-12G＞A BRCA1
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397516089 51992 NM_000257.4(MYH7):c.1106G＞A (p.Arg369Gln) MYH7
397516248 52239 NM_000257.4(MYH7):c.5401G＞A (p.Glu1801Lys) MYH7
397516349 52554 NM_000363.4(TNNI3):c.434G＞A (p.Arg145Gln) TNNI3
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80338794 20654 NM_012434.4(SLC17A5):c.115C＞T (p.Arg39Cys) SLC17A5
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121909398 17403 NM_201548.4(CERKL):c.769C＞T (p.Arg257Ter) CERKL
121913637 29143 NM_000257.4(MYH7):c.2155C＞T (p.Arg719Trp) MYH7
200495564 50200 NM_001128425.1(MUTYH):c.733C＞T (p.Arg245Cys) MUTYH
267607203 20760 NM_194456.1(KRIT1):c.1363C＞T (p.Gln455Ter) KRIT1
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587778617 96774 NM_000535.5(PMS2):c.1261C＞T (p.Arg421Ter) PMS2
587783057 166274 NM_001128425.1(MUTYH):c.1171C＞T (p.Gln391Ter) MUTYH
730880099 178699 NM_000138.4(FBN1):c.1633C＞T (p.Arg545Cys) FBN1
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28937873 20571 NM_014249.3(NR2E3):c.932G＞A (p.Arg311Gln) NR2E3
59332535 77828 NM_170707.3(LMNA):c.746G＞A (p.Arg249Gln) LMNA
62645748 48213 NM_201253.2(CRB1):c.2843G＞A (p.Cys948Tyr) CRB1
63750828 96748 NM_000251.2(MSH2):c.998G＞A (p.Cys333Tyr) MSH2
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80359101 67273 NM_000059.3(BRCA2):c.8489G＞A (p.Trp2830Ter) BRCA2
80359148 131733 NM_000059.3(BRCA2):c.8969G＞A (p.Trp2990Ter) BRCA2
80359149 67384 NM_000059.3(BRCA2):c.8970G＞A (p.Trp2990Ter) BRCA2
80359211 46791 NM_000059.3(BRCA2):c.9380G＞A (p.Trp3127Ter) BRCA2
111033565 26915 NM_002769.4(PRSS1):c.365G＞A (p.Arg122His) PRSS1
113994205 19482 NM_004937.2(CTNS):c.414G＞A (p.Trp138Ter) CTNS
116840778 23322 NM_033337.2(CAV3):c.80G＞A (p.Arg27Gln) CAV3;SSUH2
118192158 76835 NM_000540.2(RYR1):c.14818G＞A (p.Ala4940Thr) RYR1
121434278 18633 NM_000016.5(ACADM):c.583G＞A (p.Gly195Arg) ACADM
121434346 17058 NM_001003841.2(SLC6A19):c.517G＞A (p.Asp173Asn) SLC6A19
121908011 18814 NM_000372.4(TYR):c.1147G＞A (p.Asp383Asn) TYR
121908638 21365 NM_000050.4(ASS1):c.539G＞A (p.Ser180Asn) ASS1
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75822236 19350 NM_000157.3(GBA):c.1604G＞A (p.Arg535His) GBA
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80338892 27366 NM_199292.2(TH):c.698G＞A (p.Arg233His) TH
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104894365 27628 NM_004985.4(KRAS):c.40G＞A (p.Val14Ile) KRAS
104894639 20153 NM_000199.3(SGSH):c.1339G＞A (p.Glu447Lys) SGSH
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119455954 17681 NM_000391.3(TPP1):c.1094G＞A (p.Cys365Tyr) TPP1
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151344623 24127 NM_001287174.1(ABCC8):c.3992-9G＞A ABCC8
193922204 44739 NM_000138.4(FBN1):c.4460-8G＞A FBN1
193922219 51564 NM_000138.4(FBN1):c.5788+5G＞A FBN1
193922680 33370 NM_005159.4(ACTC1):c.301G＞A (p.Glu101Lys) ACTC1
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397516202 52163 NM_000257.3(MYH7):c.4135G＞A (p.Ala1379Thr) MYH7
397516209 52176 NM_000257.4(MYH7):c.428G＞A (p.Arg143Gln) MYH7
397517159 49176 NM_005633.3(SOS1):c.2536G＞A (p.Glu846Lys) SOS1
587776576 18532 NM_024426.5(WT1):c.1447+5G＞A WT1
727503246 175600 NM_000257.4(MYH7):c.4066G＞A (p.Glu1356Lys) MYH7
730881687 181107 NM_007194.4(CHEK2):c.793-1G＞A CHEK2
748170941 181727 NM_001128425.1(MUTYH):c.309G＞A (p.Trp103Ter) MUTYH
140583 260073 NM_000138.4(FBN1):c.2581C＞T (p.Arg861Ter) FBN1
2754158 175617 NM_000257.3(MYH7):c.2572C＞T (p.Arg858Cys) MYH7
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61750200 22937 NM_000350.2(ABCA4):c.634C＞T (p.Arg212Cys) ABCA4
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118203682 58105 NM_000368.4(TSC1):c.2356C＞T (p.Arg786Ter) TSC1
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150518260 51200 NM_000232.4(SGCB):c.341C＞T (p.Ser114Phe) SGCB
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201587138 176561 NM_144612.6(LOXHD1):c.4480C＞T (p.Arg1494Ter) LOXHD1
367543286 70502 NM_002609.3(PDGFRB):c.1681C＞T (p.Arg561Cys) PDGFRB
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374950566 181683 NM_001128425.1(MUTYH):c.884C＞T (p.Pro295Leu) MUTYH
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397515992 51839 NM_000256.3(MYBPC3):c.2905C＞T (p.Gln969Ter) MYBPC3
397516456 52796 NM_000364.3(TNNT2):c.304C＞T (p.Arg102Trp) TNNT2
587780082 133292 NM_001128425.1(MUTYH):c.1012C＞T (p.Gln338Ter) MUTYH
587782705 152480 NM_000546.5(TP53):c.455C＞T (p.Pro152Leu) TP53
727503974 177432 NM_172107.3(KCNQ2):c.821C＞T (p.Thr274Met) KCNQ2
730881864 180279 NM_002485.4(NBN):c.2140C＞T (p.Arg714Ter) NBN
767215758 188057 NM_002485.4(NBN):c.1030C＞T (p.Gln344Ter) NBN
45517259 27442 NM_000548.3(TSC2):c.2714G＞A (p.Arg905Gln) TSC2
61195471 57234 NM_170707.3(LMNA):c.607G＞A (p.Glu203Lys) LMNA
61753185 18815 NM_000372.4(TYR):c.230G＞A (p.Arg77Gln) TYR
63749869 28021 NM_000540.2(RYR1):c.14582G＞A (p.Arg4861His) RYR1
63749939 32145 NM_000249.3(MLH1):c.200G＞A (p.Gly67Glu) MLH1
63750119 150580 NM_000179.2(MSH6):c.3725G＞A (p.Arg1242His) MSH6
72554308 26053 NM_000531.5(OTC):c.119G＞A (p.Arg40His) OTC
79891110 32671 NM_000719.6(CACNA1C):c.1216G＞A (p.Gly406Arg) CACNA1C
80338707 22758 NM_000303.2(PMM2):c.691G＞A (p.Val231Met) PMM2
80338802 32652 NM_000070.2(CAPN3):c.2306G＞A (p.Arg769Gln) CAPN3
80356700 32571 NM_000083.2(CLCN1):c.689G＞A (p.Gly230Glu) CLCN1
80359803 67339 NM_000059.3(BRCA2):c.8754G＞A (p.Glu2918=) BRCA2
81002809 67078 NM_000059.3(BRCA2):c.7805+1G＞A BRCA2
104886142 35796 NM_000495.4(COL4A5):c.1871G＞A (p.Gly624Asp) COL4A5
104894423 17048 NM_000231.2(SGCG):c.787G＞A (p.Glu263Lys) SGCG
104894525 22747 NM_000303.2(PMM2):c.385G＞A (p.Val129Met) PMM2
113994049 20984 NM_003907.3(EIF2B5):c.338G＞A (p.Arg113His) EIF2B5
121434372 17127 NM_000159.3(GCDH):c.1198G＞A (p.Val400Met) GCDH
121908099 19299 NM_000784.3(CYP27A1):c.1214G＞A (p.Arg405Gln) CYP27A1
121908192 23730 NM_005262.2(GFER):c.581G＞A (p.Arg194His) GFER
121908753 22237 NM_000492.3(CFTR):c.1055G＞A (p.Arg352Gln) CFTR
121918013 28716 NM_000478.4(ALPL):c.346G＞A (p.Ala116Thr) ALPL
139729994 68418 NM_000492.3(CFTR):c.3468G＞A (p.Leu1156=) CFTR
142637046 98272 NM_000048.3(ASL):c.446+1G＞A ASL
142761835 177782 NM_002225.3(IVD):c.367G＞A (p.Gly123Arg) IVD
146015592 46845 NM_000060.4(BTD):c.470G＞A (p.Arg157His) BTD
150877497 226470 NM_003494.3(DYSF):c.3113G＞A (p.Arg1038Gln) DYSF
199472815 67686 NM_000218.2(KCNQ1):c.1781G＞A (p.Arg594Gln) KCNQ1
199474738 79199 NM_001042492.2(NF1):c.1885G＞A (p.Gly629Arg) NF1
199476112 24747 NC_012920.1:m.11778G＞A MT-ND4
199476317 40544 NM_001018005.1(TPM1):c.688G＞A (p.Asp230Asn) TPM1
201540674 51186 RTEL1:c.2402G＞A (p.Arg801His) RTEL1
267606640 16147 NM_000642.2(AGL):c.3980G＞A (p.Trp1327Ter) AGL
386834233 76679 NM_183050.3(BCKDHB):c.832G＞A (p.Gly278Ser) BCKDHB
397515355 19301 NM_000784.3(CYP27A1):c.1263+1G＞A CYP27A1
397515404 48194 NM_020822.2(KCNT1):c.1421G＞A (p.Arg474His) KCNT1
398123787 100221 NM_003494.3(DYSF):c.4253G＞A (p.Gly1418Asp) DYSF
398124641 44139 NM_024531.4(SLC52A2):c.916G＞A (p.Gly306Arg) SLC52A2
587776783 132342 NM_000321.2(RB1):c.1215+1G＞A RB1
587776889 39757 NM_015506.2(MMACHC):c.609G＞A (p.Trp203Ter) MMACHC
587777721 165903 NM_014191.3(SCN8A):c.4850G＞A (p.Arg1617Gln) SCN8A
587779818 132798 NM_000051.3(ATM):c.170G＞A (p.Trp57Ter) ATM
587780537 136457 NM_004360.4(CDH1):c.715G＞A (p.Gly239Arg) CDH1
587783050 166264 NM_004360.5(CDH1):c.1137G＞A (p.Thr379=) CDH1
751995154 200340 NM_000018.4(ACADVL):c.1376G＞A (p.Arg459Gln) ACADVL
781404312 186796 NM_000051.3(ATM):c.3G＞A (p.Met1Ile) ATM
786202112 184694 NM_001042492.2(NF1):c.5609G＞A (p.Arg1870Gln) NF1
794727152 191718 NM_021007.2(SCN2A):c.2558G＞A (p.Arg853Gln) SCN2A
796051858 18086 NM_000051.3(ATM):c.496+5G＞A ATM
796052505 201880 NM_000816.3(GABRG2):c.316G＞A (p.Ala106Thr) GABRG2
863223408 210238 NM_000020.2(ACVRL1):c.1451G＞A (p.Arg484Gln) ACVRL1
863225082 188114 NM_006245.3(PPP2R5D):c.592G＞A (p.Glu198Lys) PPP2R5D
875989911 228151 NM_000527.4(LDLR):c.938G＞A (p.Cys313Tyr) LDLR
5030852 15638 NM_000277.3(PAH):c.842+1G＞A PAH
5030859 15651 NM_000277.3(PAH):c.1223G＞A (p.Arg408Gln) PAH
28930068 32662 NM_000069.2(CACNA1S):c.3716G＞A (p.Arg1239His) CACNA1S
56264519 55267 NM_024022.2(TMPRSS3):c.1276G＞A (p.Ala426Thr) TMPRSS3
61750641 105317 NM_000350.2(ABCA4):c.6089G＞A (p.Arg2030Gln) ABCA4
61751276 104715 NM_000329.2(RPE65):c.11+5G＞A RPE65
62507336 108472 NM_000277.3(PAH):c.561G＞A (p.Trp187Ter) PAH
62508613 108291 NM_000277.2(PAH):c.1199+17G＞A PAH
72645357 32351 NM_000088.3(COL1A1):c.994G＞A (p.Gly332Arg) COL1A1
80338777 32664 NM_000069.2(CACNA1S):c.1583G＞A (p.Arg528His) CACNA1S
80356908 68776 NM_007294.3(BRCA1):c.1058G＞A (p.Trp353Ter) BRCA1
80357093 69031 NM_007294.3(BRCA1):c.182G＞A (p.Cys61Tyr) BRCA1
80357219 70211 NM_007294.3(BRCA1):c.5345G＞A (p.Trp1782Ter) BRCA1
104886460 99352 NM_001005741.2(GBA):c.115+1G＞A GBA
104894129 27501 NM_003289.3(TPM2):c.349G＞A (p.Glu117Lys) TPM2
104894401 32056 NM_004004.5(GJB2):c.428G＞A (p.Arg143Gln) GJB2
104895085 17592 NM_000243.2(MEFV):c.1958G＞A (p.Arg653His) MEFV
111033299 53902 NM_004004.5(GJB2):c.283G＞A (p.Val95Met) GJB2
113994139 33347 NM_139276.2(STAT3):c.1909G＞A (p.Val637Met) STAT3
120074135 18010 NM_000271.4(NPC1):c.2848G＞A (p.Val950Met) NPC1
121909334 23512 NM_007126.4(VCP):c.572G＞A (p.Arg191Gln) VCP
121918491 28307 NM_000141.4(FGFR2):c.1032G＞A (p.Ala344=) FGFR2
137852314 25406 NM_000402.4(G6PD):c.577G＞A (p.Gly193Ser) G6PD
137852327 25425 NM_000402.4(G6PD):c.961G＞A (p.Val321Met) G6PD
137853285 166061 NM_000053.3(ATP7B):c.2128G＞A (p.Gly710Ser) ATP7B
138213197 133488 NM_006361.5(HOXB13):c.251G＞A (p.Gly84Glu) HOXB13
148311934 44907 NM_000162.5(GCK):c.676G＞A (p.Val226Met) GCK
199473684 25807 NM_000169.2(GLA):c.639+919G＞A GLA
200482683 131950 NM_014625.3(NPHS2):c.868G＞A (p.Val290Met) NPHS2
371418985 232124 NM_007194.4(CHEK2):c.1232G＞A (p.Trp411Ter) CHEK2
387907281 45778 NM_152296.4(ATP1A3):c.2443G＞A (p.Glu815Lys) ATP1A3
397509284 70248 NM_007294.3(BRCA1):c.5445G＞A (p.Trp1815Ter) BRCA1
397514495 152034 NM_000546.5(TP53):c.542G＞A (p.Arg181His) TP53
397514581 48359 NM_172107.3(KCNQ2):c.638G＞A (p.Arg213Gln) KCNQ2
397516101 52008 NM_000257.4(MYH7):c.1358G＞A (p.Arg453His) MYH7
397516264 52270 NM_000257.3(MYH7):c.715G＞A (p.Asp239Asn) MYH7
398122822 48057 NM_001111.5(ADAR):c.3019G＞A (p.Gly1007Arg) ADAR
587777446 141325 NM_022168.4(IFIH1):c.2336G＞A (p.Arg779His) IFIH1
587782962 165566 NM_000257.4(MYH7):c.3158G＞A (p.Arg1053Gln) MYH7
606231435 170985 NM_152296.4(ATP1A3):c.2267G＞A (p.Arg756His) ATP1A3
727504247 172354 NM_001001430.2(TNNT2):c.860G＞A (p.Trp287Ter) TNNT2
730881833 179933 NM_001128425.1(MUTYH):c.857G＞A (p.Gly286Glu) MUTYH
762307622 232266 NM_001128425.1(MUTYH):c.467G＞A (p.Trp156Ter) MUTYH
777759523 17038 NM_199242.2(UNC13D):c.1389+1G＞A UNC13D
794728625 197538 NM_130799.2(MEN1):c.784-9G＞A MEN1
1060499814 389282 NM_024675.3(PALB2):c.108+1G＞A PALB2
25403 51465 NM_000138.4(FBN1):c.184C＞T (p.Arg62Cys) FBN1
28931591 32539 NM_000744.6(CHRNA4):c.851C＞T (p.Ser284Leu) CHRNA4
28942108 18015 NM_000271.4(NPC1):c.2932C＞T (p.Arg978Cys) NPC1
61750152 105192 NM_000350.2(ABCA4):c.4577C＞T (p.Thr1526Met) ABCA4
61750654 105349 NM_000350.2(ABCA4):c.6445C＞T (p.Arg2149Ter) ABCA4
61751404 105219 NM_000350.2(ABCA4):c.4918C＞T (p.Arg1640Trp) ABCA4
61751408 22921 NM_000350.2(ABCA4):c.6079C＞T (p.Leu2027Phe) ABCA4
63751466 24276 NM_000535.5(PMS2):c.2404C＞T (p.Arg802Ter) PMS2
72552255 44374 NM_000053.3(ATP7B):c.2930C＞T (p.Thr977Met) ATP7B
74315369 27822 NM_003000.2(SDHB):c.79C＞T (p.Arg27Ter) SDHB
80338680 16726 NM_000528.3(MAN2B1):c.2248C＞T (p.Arg750Trp) MAN2B1
80356952 68980 NM_007294.3(BRCA1):c.1630C＞T (p.Gln544Ter) BRCA1
80357011 69802 NM_007294.3(BRCA1):c.4186C＞T (p.Gln1396Ter) BRCA1
80357296 69580 NM_007294.3(BRCA1):c.3544C＞T (p.Gln1182Ter) BRCA1
80357367 70140 NM_007294.3(BRCA1):c.5239C＞T (p.Gln1747Ter) BRCA1
80357377 69340 NM_007294.3(BRCA1):c.2761C＞T (p.Gln921Ter) BRCA1
80357471 69016 NM_007294.3(BRCA1):c.178C＞T (p.Gln60Ter) BRCA1
80357497 69389 NM_007294.3(BRCA1):c.2923C＞T (p.Gln975Ter) BRCA1
104893950 18137 NM_005670.3(EPM2A):c.721C＞T (p.Arg241Ter) EPM2A
104894787 26252 NM_004006.2(DMD):c.10108C＞T (p.Arg3370Ter) DMD
111231312 51536 NM_000138.4(FBN1):c.4615C＞T (p.Arg1539Ter) FBN1
112645512 178700 NM_000138.4(FBN1):c.1285C＞T (p.Arg429Ter) FBN1
113001196 51577 NM_000138.4(FBN1):c.6658C＞T (p.Arg2220Ter) FBN1
113249837 51552 NM_000138.4(FBN1):c.5368C＞T (p.Arg1790Ter) FBN1
113812345 51455 NM_000138.4(FBN1):c.1546C＞T (p.Arg516Ter) FBN1
116100695 16552 NM_000298.5(PKLR):c.1456C＞T (p.Arg486Trp) PKLR
118203631 58047 NM_000368.4(TSC1):c.2074C＞T (p.Arg692Ter) TSC1
118203963 16148 NM_025137.3(SPG11):c.6100C＞T (p.Arg2034Ter) SPG11
118204437 15739 NM_000512.4(GALNS):c.1156C＞T (p.Arg386Cys) GALNS
121434526 33315 NM_001613.3(ACTA2):c.445C＞T (p.Arg149Cys) ACTA2
121908547 20943 NM_000334.4(SCN4A):c.3938C＞T (p.Thr1313Met) SCN4A
121912504 29459 NM_000238.3(KCNH2):c.1682C＞T (p.Ala561Val) KCNH2
121913120 31271 NM_000143.3(FH):c.301C＞T (p.Arg101Ter) FH
121913122 31274 NM_000143.3(FH):c.1027C＞T (p.Arg343Ter) FH
121917783 27083 NM_000136.2(FANCC):c.553C＞T (p.Arg185Ter) FANCC
121918775 79496 NM_006920.4(SCN1A):c.2803C＞T (p.Arg935Cys) SCN1A
121964972 15170 NM_000071.2(CBS):c.1058C＞T (p.Thr353Met) CBS
128627256 26327 NM_004006.2(DMD):c.8713C＞T (p.Arg2905Ter) DMD
137854613 24413 NM_198056.2(SCN5A):c.4867C＞T (p.Arg1623Ter) SCN5A
137886232 39244 NM_002878.3(RAD51D):c.757C＞T (p.Arg253Ter) RAD51D
138996609 181608 NM_003000.2(SDHB):c.688C＞T (p.Arg230Cys) SDHB
144500145 202960 NM_002693.2(POLG):c.2554C＞T (p.Arg852Cys) POLG
180177111 132156 NM_024675.3(PALB2):c.2323C＞T (p.Gln775Ter) PALB2
185492864 99918 NM_001918.3(DBT):c.901C＞T (p.Arg301Cys) DBT
193922185 44706 NM_000138.4(FBN1):c.1948C＞T (p.Arg650Cys) FBN1
199472944 38732 NM_000238.3(KCNH2):c.1841C＞T (p.Ala614Val) KCNH2
199472990 78275 NM_000238.3(KCNH2):c.2254C＞T (p.Arg752Trp) KCNH2
199473161 78626 NM_198056.2(SCN5A):c.2440C＞T (p.Arg814Trp) SCN5A
199473524 78188 NM_000238.3(KCNH2):c.1838C＞T (p.Thr613Met) KCNH2
273898674 69115 NM_007294.3(BRCA1):c.2059C＞T (p.Gln687Ter) BRCA1
368796923 151096 NM_032043.2(BRIP1):c.1240C＞T (p.Gln414Ter) BRIP1
376128990 215031 NM_052845.3(MMAB):c.571C＞T (p.Arg191Trp) MMAB
397509283 70244 NM_007294.3(BRCA1):c.5431C＞T (p.Gln1811Ter) BRCA1
397515812 51535 NM_000138.4(FBN1):c.4567C＞T (p.Arg1523Ter) FBN1
397516005 51860 NM_000256.3(MYBPC3):c.3181C＞T (p.Gln1061Ter) MYBPC3
397516042 51914 NM_000256.3(MYBPC3):c.3811C＞T (p.Arg1271Ter) MYBPC3
397516127 52044 NM_000257.3(MYH7):c.1987C＞T (p.Arg663Cys) MYH7
397516201 52162 NM_000257.4(MYH7):c.4130C＞T (p.Thr1377Met) MYH7
397516435 52758 NM_000546.5(TP53):c.586C＞T (p.Arg196Ter) TP53
397517689 56466 NM_001267550.2(TTN):c.71602C＞T (p.Arg23868Ter) TTN
398123585 99539 NM_001165963.1(SCN1A):c.1837C＞T (p.Arg613Ter) SCN1A
549794342 360820 NM_001271208.1(NEB):c.24094C＞T (p.Arg8032Ter) NEB
574660186 178478 NM_001267550.2(TTN):c.67495C＞T (p.Arg22499Ter) TTN
575822089 227149 NM_001163435.2(TBCK):c.376C＞T (p.Arg126Ter) TBCK
587778618 138806 NM_000535.7(PMS2):c.1687C＞T (p.Arg563Ter) PMS2
587779343 96837 NM_000535.5(PMS2):c.697C＞T (p.Gln233Ter) PMS2
587780088 133302 NM_001128425.1(MUTYH):c.55C＞T (p.Arg19Ter) MUTYH
587781269 150486 NM_007194.4(CHEK2):c.283C＞T (p.Arg95Ter) CHEK2
587781756 151166 NM_002878.3(RAD51D):c.451C＞T (p.Gln151Ter) RAD51D
672601370 171771 NM_001244008.1(KIF1A):c.946C＞T (p.Arg316Trp) KIF1A
727505006 176130 NM_000138.4(FBN1):c.3373C＞T (p.Arg1125Ter) FBN1
794728165 197808 NM_000138.4(FBN1):c.1090C＞T (p.Arg364Ter) FBN1
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794728283 197585 NM_000138.4(FBN1):c.8038C＞T (p.Arg2680Cys) FBN1
879255678 247653 NM_144997.5(FLCN):c.1429C＞T (p.Arg477Ter) FLCN
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1553547838 512805 NM_001172509.1(SATB2):c.1375C＞T (p.Arg459Ter) SATB2
45507199 59122 NM_000548.3(TSC2):c.5228G＞A (p.Arg1743Gln) TSC2
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61672878 29534 NM_170707.3(LMNA):c.1130G＞A (p.Arg377His) LMNA
61750173 24396 NM_000180.3(GUCY2D):c.2513G＞A (p.Arg838His) GUCY2D
61753180 18833 NM_000372.4(TYR):c.140G＞A (p.Gly47Asp) TYR
61754375 18835 NM_000372.4(TYR):c.896G＞A (p.Arg299His) TYR
62636275 20778 NM_201253.2(CRB1):c.3307G＞A (p.Gly1103Arg) CRB1
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63751632 95404 NM_000249.3(MLH1):c.1896G＞A (p.Glu632=) MLH1
74315205 19565 NM_006005.3(WFS1):c.2590G＞A (p.Glu864Lys) WFS1
74503330 22256 NM_000492.3(CFTR):c.3752G＞A (p.Ser1251Asn) CFTR
80282562 57854 NM_000492.3(CFTR):c.532G＞A (p.Gly178Arg) CFTR
80356702 32581 NM_000083.2(CLCN1):c.950G＞A (p.Arg317Gln) CLCN1
80358543 131539 NM_000059.3(BRCA2):c.2978G＞A (p.Trp993Ter) BRCA2
80358810 46556 NM_000059.3(BRCA2):c.582G＞A (p.Trp194Ter) BRCA2
80358997 67062 NM_000059.3(BRCA2):c.7721G＞A (p.Trp2574Ter) BRCA2
80359205 67482 NM_000059.3(BRCA2):c.9317G＞A (p.Trp3106Ter) BRCA2
81002873 67120 NM_000059.3(BRCA2):c.7976+1G＞A BRCA2
104894317 18840 NM_000372.4(TYR):c.1336G＞A (p.Gly446Ser) TYR
104894590 16599 NM_000263.3(NAGLU):c.2021G＞A (p.Arg674His) NAGLU
111033270 19955 NM_022124.5(CDH23):c.5237G＞A (p.Arg1746Gln) CDH23
111436401 226974 NM_000540.2(RYR1):c.10347+1G＞A RYR1
112406105 200333 NM_000018.4(ACADVL):c.1097G＞A (p.Arg366His) ACADVL
113560320 15440 NM_017841.2(SDHAF2):c.232G＞A (p.Gly78Arg) SDHAF2
113690956 16661 NM_000018.2(ACADVL):c.1182+1G＞A ACADVL
113994171 33871 NM_000018.3(ACADVL):c.1679-6G＞A ACADVL
113994207 19490 NM_004937.2(CTNS):c.589G＞A (p.Gly197Arg) CTNS
114925667 260377 NM_024818.4(UBA5):c.1111G＞A (p.Ala371Thr) UBA5
118192122 76888 NM_000540.2(RYR1):c.7361G＞A (p.Arg2454His) RYR1
118192176 28015 NM_000540.2(RYR1):c.6502G＞A (p.Val2168Met) RYR1
118203982 16396 NM_001080.3(ALDH5A1):c.612G＞A (p.Trp204Ter) ALDH5A1
119462987 18289 NM_007171.3(POMT1):c.2005G＞A (p.Ala669Thr) POMT1
120074190 18179 NM_000218.2(KCNQ1):c.1766G＞A (p.Gly589Asp) KCNQ1
121434544 32653 NM_000070.2(CAPN3):c.1715G＞A (p.Arg572Gln) CAPN3
121434548 32661 NM_000070.2(CAPN3):c.1469G＞A (p.Arg490Gln) CAPN3;POMT1
121908153 19416 NM_001243133.1(NLRP3):c.907G＞A (p.Asp303Asn) NLRP3
121908185 19531 NM_020451.2(SELENON):c.1397G＞A (p.Arg466Gln) SELENON
121908419 20395 NM_014384.2(ACAD8):c.1129G＞A (p.Gly377Ser) ACAD8
121908759 44497 NM_000492.3(CFTR):c.1865G＞A (p.Gly622Asp) CFTR
121908889 21460 NM_003060.3(SLC22A5):c.506G＞A (p.Arg169Gln) SLC22A5
121909013 22181 NM_000492.3(CFTR):c.1651G＞A (p.Gly551Ser) CFTR
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121909092 22321 NM_001005360.2(DNM2):c.1102G＞A (p.Glu368Lys) DNM2
121918009 28711 NM_000478.5(ALPL):c.1001G＞A (p.Gly334Asp) ALPL
121918592 28008 NM_000540.2(RYR1):c.1021G＞A (p.Gly341Arg) RYR1
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141554661 208401 NM_004287.4(GOSR2):c.336+1G＞A GOSR2
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199472687 77968 NM_000218.2(KCNQ1):c.421G＞A (p.Val141Met) KCNQ1
201016593 245339 NM_000527.4(LDLR):c.11G＞A (p.Trp4Ter) LDLR
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267607914 96367 NM_000251.2(MSH2):c.212-1G＞A MSH2
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370950728 186993 NM_000152.3(GAA):c.655G＞A (p.Gly219Arg) GAA
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398122711 97208 NM_000059.3(BRCA2):c.8633-1G＞A BRCA2
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587777057 77012 NM_020988.2(GNAO1):c.607G＞A (p.Gly203Arg) GNAO1
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587780639 139490 NM_000051.3(ATM):c.7788G＞A (p.Glu2596=) ATM
587781894 151348 NM_000051.3(ATM):c.9023G＞A (p.Arg3008His) ATM
587782719 152505 NM_000051.3(ATM):c.8122G＞A (p.Asp2708Asn) ATM
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730882035 180121 NM_000551.3(VHL):c.482G＞A (p.Arg161Gln) VHL
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756039188 243266 NM_000527.4(LDLR):c.12G＞A (p.Trp4Ter) LDLR
796053216 202741 NM_014191.3(SCN8A):c.4423G＞A (p.Gly1475Arg) SCN8A
876661242 231905 NM_000059.3(BRCA2):c.9381G＞A (p.Trp3127Ter) BRCA2
879254600 245669 NM_000527.4(LDLR):c.626G＞A (p.Cys209Tyr) LDLR
1057519632 362622 NM_003718.4(CDK13):c.2149G＞A (p.Gly717Arg) CDK13
10250779 15457 NM_000290.3(PGAM2):c.233G＞A (p.Trp78Ter) PGAM2
28928905 29469 NM_000238.3(KCNH2):c.1468G＞A (p.Ala490Thr) KCNH2
28931593 32066 NM_004004.5(GJB2):c.224G＞A (p.Arg75Gln) GJB2
28937318 24429 NM_198056.2(SCN5A):c.1100G＞A (p.Arg367His) SCN5A
61749397 15329 NM_000552.4(VWF):c.3946G＞A (p.Val1316Met) VWF
61751403 105220 NM_000350.2(ABCA4):c.4919G＞A (p.Arg1640Gln) ABCA4
62514907 15633 NM_000277.3(PAH):c.442-1G＞A PAH
62514956 98659 NM_000277.3(PAH):c.912+1G＞A PAH
62516146 108608 NM_000277.1(PAH):c.842+5G＞A PAH
62642939 98657 NM_000277.2(PAH):c.890G＞A (p.Arg297His) PAH
62644503 108560 NM_000277.3(PAH):c.755G＞A (p.Arg252Gln) PAH
63749856 21618 NM_001171.5(ABCC6):c.3904G＞A (p.Gly1302Arg) ABCC6
63750783 30442 NM_000518.5(HBB):c.47G＞A (p.Trp16Ter) HBB
66555264 414003 NM_000088.3(COL1A1):c.1821+1G＞A COL1A1
72645321 414022 NM_000088.3(COL1A1):c.769G＞A (p.Gly257Arg) COL1A1
74315368 27820 NM_003000.2(SDHB):c.725G＞A (p.Arg242His) SDHB
74315471 18113 NM_000487.5(ARSA):c.739G＞A (p.Gly247Arg) ARSA
78973108 19367 NM_001005741.2(GBA):c.887G＞A (p.Arg296Gln) GBA
80338735 33917 NM_000156.5(GAMT):c.327G＞A (p.Lys109=) GAMT
80338857 34128 NM_001360.2(DHCR7):c.725G＞A (p.Arg242His) DHCR7
80338864 21831 NM_001360.2(DHCR7):c.1342G＞A (p.Glu448Lys) DHCR7
80338944 32040 NM_004004.5(GJB2):c.231G＞A (p.Trp77Ter) GJB2
80356914 70276 NM_007294.3(BRCA1):c.5511G＞A (p.Trp1837Ter) BRCA1
80357212 70255 NM_007294.3(BRCA1):c.5467G＞A (p.Ala1823Thr) BRCA1
80357307 70275 NM_007294.3(BRCA1):c.5510G＞A (p.Trp1837Ter) BRCA1
80358252 18013 NM_000271.4(NPC1):c.530G＞A (p.Cys177Tyr) NPC1
104894103 19470 NM_175073.2(APTX):c.837G＞A (p.Trp279Ter) APTX
104894415 20583 NM_006783.4(GJB6):c.31G＞A (p.Gly11Arg) GJB6
104894519 21096 NM_004862.3(LITAF):c.334G＞A (p.Gly112Ser) LITAF
104894727 27461 NM_000363.4(TNNI3):c.586G＞A (p.Asp196Asn) TNNI3
104894828 25754 NM_000169.2(GLA):c.902G＞A (p.Arg301Gln) GLA
111683277 175150 NM_000256.3(MYBPC3):c.3190+1G＞A MYBPC3
111984349 258823 NM_000138.4(FBN1):c.7828G＞A (p.Glu2610Lys) FBN1
113403872 16550 NM_000298.5(PKLR):c.1529G＞A (p.Arg510Gln) PKLR
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121908216 23534 NM_001127221.1(CACNA1A):c.4982G＞A (p.Arg1661His) CACNA1A
121908551 20948 NM_000334.4(SCN4A):c.3877G＞A (p.Val1293Ile) SCN4A
121908552 20949 NM_000334.4(SCN4A):c.1333G＞A (p.Val445Met) SCN4A
121908557 20958 NM_000334.4(SCN4A):c.2024G＞A (p.Arg675Gln) SCN4A
121908716 16996 NM_000022.2(ADA):c.632G＞A (p.Arg211His) ADA
121908723 17007 NM_000022.3(ADA):c.646G＞A (p.Gly216Arg) ADA
121909768 21834 NM_001360.2(DHCR7):c.1055G＞A (p.Arg352Gln) DHCR7
121913039 31702 NM_001953.4(TYMP):c.622G＞A (p.Val208Met) TYMP
137853050 22116 NM_006009.3(TUBA1A):c.1265G＞A (p.Arg422His) TUBA1A
137853283 166064 NM_000053.3(ATP7B):c.2336G＞A (p.Trp779Ter) ATP7B
137854612 24434 NM_198056.2(SCN5A):c.4222G＞A (p.Gly1408Arg) SCN5A
139751448 187031 NM_000271.4(NPC1):c.1211G＞A (p.Arg404Gln) NPC1
150038620 187049 NM_004646.3(NPHS1):c.2335-1G＞A NPHS1
180177122 132185 NM_024675.3(PALB2):c.2718G＞A (p.Trp906Ter) PALB2
181087667 40103 NM_007055.3(POLR3A):c.2617-1G＞A POLR3A
193922110 44393 NM_000053.3(ATP7B):c.4058G＞A (p.Trp1353Ter) ATP7B
199473565 78528 NM_198056.2(SCN5A):c.1066G＞A (p.Asp356Asn) SCN5A
199474703 40437 NM_000258.2(MYL3):c.281G＞A (p.Arg94His) MYL3
199971687 216058 NM_052845.3(MMAB):c.291-1G＞A MMAB
201188361 40345 NM_014714.3(IFT140):c.634G＞A (p.Gly212Arg) IFT140
202160208 75126 NM_013334.3(GMPPB):c.860G＞A (p.Arg287Gln) GMPPB
281875334 38553 NM_001101.3(ACTB):c.587G＞A (p.Arg196His) ACTB
386134249 45185 NM_000244.3(MEN1):c.1277G＞A (p.Cys426Tyr) MEN1
387906623 38652 NM_000138.4(FBN1):c.5284G＞A (p.Gly1762Ser) FBN1
387906905 39430 NM_021625.4(TRPV4):c.947G＞A (p.Arg316His) TRPV4
397507479 48850 NM_004333.5(BRAF):c.1595G＞A (p.Cys532Tyr) BRAF
397514494 48018 NM_021625.4(TRPV4):c.557G＞A (p.Arg186Gln) TRPV4
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397516031 51898 NM_000256.3(MYBPC3):c.3627+1G＞A MYBPC3
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483352809 65656 NM_006087.3(TUBB4A):c.745G＞A (p.Asp249Asn) TUBB4A
515726205 40114 NM_001031726.3(C19orf12):c.205G＞A (p.Gly69Arg) C19orf12
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574673404 182906 NM_002485.4(NBN):c.37+1G＞A NBN
587780345 134590 NM_000162.3(GCK):c.544G＞A (p.Val182Met) GCK
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730880850 29166 NM_000257.3(MYH7):c.732+1G＞A MYH7
730882175 181517 NM_002238.3(KCNH1):c.1405G＞A (p.Gly469Arg) KCNH1
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753288303 216044 NM_000255.3(MMUT):c.1280G＞A (p.Gly427Asp) MMUT
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794728208 197723 NM_000138.4(FBN1):c.3712G＞A (p.Asp1238Asn) FBN1
796756333 410338 NM_024422.4(DSC2):c.943-1G＞A DSC2
797044872 205316 NM_004977.2(KCNC3):c.1268G＞A (p.Arg423His) KCNC3
797045586 207083 NM_032682.5(FOXP1):c.1541G＞A (p.Arg514His) FOXP1
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1057517585 358911 NM_024675.3(PALB2):c.3G＞A (p.Met1Ile) PALB2
1555582065 431537 NM_014233.3(UBTF):c.628G＞A (p.Glu210Lys) UBTF
140630 197685 NM_000138.4(FBN1):c.4930C＞T (p.Arg1644Ter) FBN1
28940869 19031 NM_017739.3(POMGNT1):c.1324C＞T (p.Arg442Cys) POMGNT1
34451549 30497 NM_000518.5(HBB):c.316-197C＞T HBB
41556519 31832 NM_000400.3(ERCC2):c.2047C＞T (p.Arg683Trp) ERCC2
45611033 175462 NM_000257.4(MYH7):c.3133C＞T (p.Arg1045Cys) MYH7
55832599 151478 NM_000546.5(TP53):c.799C＞T (p.Arg267Trp) TP53
59616921 18036 NM_000226.3(KRT9):c.487C＞T (p.Arg163Trp) KRT9
60399023 29651 NM_000526.4(KRT14):c.373C＞T (p.Arg125Cys) KRT14
61749409 104973 NM_000350.2(ABCA4):c.1804C＞T (p.Arg602Trp) ABCA4
61749423 105003 NM_000350.2(ABCA4):c.2041C＞T (p.Arg681Ter) ABCA4
61750645 105327 NM_000350.2(ABCA4):c.6229C＞T (p.Arg2077Trp) ABCA4
61751383 22946 NM_000350.2(ABCA4):c.6088C＞T (p.Arg2030Ter) ABCA4
61752871 28154 NM_000329.2(RPE65):c.271C＞T (p.Arg91Trp) RPE65
61757582 21827 NM_001360.2(DHCR7):c.1210C＞T (p.Arg404Cys) DHCR7
61816761 31358 NM_002016.1(FLG):c.1501C＞T (p.Arg501Ter) FLG
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72653170 32386 NM_000088.3(COL1A1):c.3040C＞T (p.Arg1014Cys) COL1A1
74315348 20408 NM_014625.3(NPHS2):c.871C＞T (p.Arg291Trp) NPHS2
74315391 22425 NM_172107.3(KCNQ2):c.619C＞T (p.Arg207Trp) KCNQ2
74315442 23435 NM_000100.3(CSTB):c.202C＞T (p.Arg68Ter) CSTB
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80359818 31157 NM_006516.3(SLC2A1):c.376C＞T (p.Arg126Cys) SLC2A1
80359826 201142 NM_006516.3(SLC2A1):c.988C＞T (p.Arg330Ter) SLC2A1
104894003 33314 NM_001101.4(ACTB):c.547C＞T (p.Arg183Trp) ACTB
104894261 31727 NM_130799.2(MEN1):c.1579C＞T (p.Arg527Ter) MEN1
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104894797 26321 NM_004006.2(DMD):c.9568C＞T (p.Arg3190Ter) DMD
111033297 53892 NM_004004.5(GJB2):c.169C＞T (p.Gln57Ter) GJB2
111033538 17382 NM_032601.3(MCEE):c.139C＞T (p.Arg47Ter) MCEE
111687884 51571 NM_000138.4(FBN1):c.643C＞T (p.Arg215Ter) FBN1
112901682 76366 NM_001141945.2(ACTA2):c.115C＞T (p.Arg39Cys) ACTA2
114368325 38634 NM_000782.4(CYP24A1):c.1186C＞T (p.Arg396Trp) CYP24A1
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118203434 58253 NM_000368.4(TSC1):c.733C＞T (p.Arg245Ter) TSC1
118203542 57958 NM_000368.4(TSC1):c.1525C＞T (p.Arg509Ter) TSC1
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121917784 27085 NM_000136.2(FANCC):c.37C＞T (p.Gln13Ter) FANCC
121918167 15995 NM_000275.2(OCA2):c.2228C＞T (p.Pro743Leu) OCA2
121918244 16869 NM_001023570.3(IQCB1):c.1381C＞T (p.Arg461Ter) IQCB1
121918257 16926 NM_000255.3(MMUT):c.322C＞T (p.Arg108Cys) MMUT
122445105 26774 NM_000489.4(ATRX):c.736C＞T (p.Arg246Cys) ATRX
122445108 26781 NM_000489.4(ATRX):c.109C＞T (p.Arg37Ter) ATRX
122453121 26733 NM_004484.3(GPC3):c.1159C＞T (p.Arg387Ter) GPC3
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137853229 21102 NM_004260.3(RECQL4):c.2269C＞T (p.Gln757Ter) RECQL4
138049878 171163 NM_000257.4(MYH7):c.2608C＞T (p.Arg870Cys) MYH7
138119149 39897 NM_020745.3(AARS2):c.1774C＞T (p.Arg592Trp) AARS2
139675596 40180 NM_023073.3(CPLANE1):c.7477C＞T (p.Arg2493Ter) CPLANE1
140511594 39892 NM_024753.4(TTC21B):c.626C＞T (p.Pro209Leu) TTC21B
143343083 169011 NM_004004.5(GJB2):c.298C＞T (p.His100Tyr) GJB2
148865119 210450 NM_000071.2(CBS):c.146C＞T (p.Pro49Leu) CBS
180177091 132277 NM_024675.3(PALB2):c.751C＞T (p.Gln251Ter) PALB2
199422209 33004 NM_001127701.1(SERPINA1):c.1178C＞T (p.Pro393Leu) SERPINA1
199473556 78702 NM_198056.2(SCN5A):c.361C＞T (p.Arg121Trp) SCN5A
200075782 39327 NM_003560.3(PLA2G6):c.109C＞T (p.Arg37Ter) PLA2G6
200287925 151917 NM_002485.4(NBN):c.127C＞T (p.Arg43Ter) NBN
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200440128 205749 NM_012160.4(FBXL4):c.64C＞T (p.Arg22Ter) FBXL4
201632198 55279 NM_024022.2(TMPRSS3):c.325C＞T (p.Arg109Trp) TMPRSS3
267606919 21912 NM_004646.3(NPHS1):c.3478C＞T (p.Arg1160Ter) NPHS1
267607143 20038 NM_021625.4(TRPV4):c.943C＞T (p.Arg315Trp) TRPV4
267607258 46918 NM_002437.5(MPV17):c.293C＞T (p.Pro98Leu) MPV17
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387906799 39125 NM_001244008.1(KIF1A):c.296C＞T (p.Thr99Met) KIF1A
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397507215 46080 NM_007294.3(BRCA1):c.3352C＞T (p.Gln1118Ter) BRCA1
397507447 47625 NM_024312.4(GNPTAB):c.1123C＞T (p.Arg375Ter) GNPTAB
397509002 69322 NM_007294.3(BRCA1):c.2713C＞T (p.Gln905Ter) BRCA1
397509151 69806 NM_007294.3(BRCA1):c.4201C＞T (p.Gln1401Ter) BRCA1
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397514477 40113 NM_001031726.3(C19orf12):c.32C＞T (p.Thr11Met) C19orf12
397515848 51592 NM_000138.4(FBN1):c.7180C＞T (p.Arg2394Ter) FBN1
397516463 52805 NM_001001430.2(TNNT2):c.388C＞T (p.Arg130Cys) TNNT2
398123061 76995 NM_012160.4(FBXL4):c.1444C＞T (p.Arg482Trp) FBXL4
398123168 98367 NM_000143.3(FH):c.952C＞T (p.His318Tyr) FH
398123832 100328 NM_004006.2(DMD):c.10171C＞T (p.Arg3391Ter) DMD
398123929 100476 NM_004006.2(DMD):c.3151C＞T (p.Arg1051Ter) DMD
398124478 102281 NM_138694.3(PKHD1):c.2341C＞T (p.Arg781Ter) PKHD1
536907995 137626 NM_007194.4(CHEK2):c.58C＞T (p.Gln20Ter) CHEK2
587776407 153707 NM_024675.3(PALB2):c.451C＞T (p.Gln151Ter) PALB2
587776935 48413 NM_005465.4(AKT3):c.1393C＞T (p.Arg465Trp) AKT3
587780062 133253 NM_000535.5(PMS2):c.823C＞T (p.Gln275Ter) PMS2
587780226 133611 NM_032043.2(BRIP1):c.1315C＞T (p.Arg439Ter) BRIP1
587781948 151416 NM_000465.3(BARD1):c.1921C＞T (p.Arg641Ter) BARD1
587783685 168920 NM_003482.3(KMT2D):c.12592C＞T (p.Arg4198Ter) KMT2D
587784339 169779 NM_003560.3(PLA2G6):c.1903C＞T (p.Arg635Ter) PLA2G6
724159971 172085 NM_152778.2(MFSD8):c.1444C＞T (p.Arg482Ter) MFSD8
727503504 176073 NM_000363.4(TNNI3):c.508C＞T (p.Arg170Trp) TNNI3
727503513 172503 NM_001001430.2(TNNT2):c.280C＞T (p.Arg94Cys) TNNT2
727504136 177069 NM_001165963.1(SCN1A):c.3733C＞T (p.Arg1245Ter) SCN1A
730881422 179951 NM_000465.3(BARD1):c.1996C＞T (p.Gln666Ter) BARD1
730882029 180988 NM_000546.5(TP53):c.1024C＞T (p.Arg342Ter) TP53
747604569 185305 NM_032043.2(BRIP1):c.484C＞T (p.Arg162Ter) BRIP1
750621215 184806 NM_002878.3(RAD51D):c.898C＞T (p.Arg300Ter) RAD51D
753330544 195505 NM_206933.2(USH2A):c.13316C＞T (p.Thr4439Ile) USH2A
761494650 185659 NM_007194.4(CHEK2):c.85C＞T (p.Gln29Ter) CHEK2
763091520 197655 NM_000138.4(FBN1):c.6169C＞T (p.Arg2057Ter) FBN1
768933093 226933 NM_024685.4(BBS10):c.145C＞T (p.Arg49Trp) BBS10
773770609 264863 NM_177550.4(SLC13A5):c.997C＞T (p.Arg333Ter) SLC13A5
778989252 236615 NM_007194.4(CHEK2):c.1315C＞T (p.Gln439Ter) CHEK2
786202064 184902 NM_007294.3(BRCA1):c.4834C＞T (p.Gln1612Ter) BRCA1
786203821 184272 NM_024675.3(PALB2):c.940C＞T (p.Gln314Ter) PALB2
794726710 187772 NM_001165963.1(SCN1A):c.3637C＞T (p.Arg1213Ter) SCN1A
794726730 187817 NM_001165963.1(SCN1A):c.2134C＞T (p.Arg712Ter) SCN1A
794728195 197755 NM_000138.4(FBN1):c.2645C＞T (p.Ala882Val) FBN1
796051885 199890 NM_003239.4(TGFB3):c.898C＞T (p.Arg300Trp) TGFB3
797044883 205286 NM_019066.4(MAGEL2):c.1912C＞T (p.Gln638Ter) MAGEL2
869312892 226683 NM_139276.2(STAT3):c.2147C＞T (p.Thr716Met) STAT3
876658461 232175 NM_003000.2(SDHB):c.640C＞T (p.Gln214Ter) SDHB
886037684 248861 NM_177438.2(DICER1):c.2062C＞T (p.R688*) DICER1
886038001 249129 NM_007294.3(BRCA1):c.2599C＞T (p.Gln867Ter) BRCA1
886039480 260102 NM_024675.3(PALB2):c.2368C＞T (p.Gln790Ter) PALB2
886040218 261660 NM_007294.3(BRCA1):c.4225C＞T (p.Gln1409Ter) BRCA1
886041222 264422 NM_000280.4(PAX6):c.781C＞T (p.Arg261Ter) PAX6
1057521083 366251 NM_015265.3(SATB2):c.1165C＞T (p.Arg389Cys) SATB2
實例 6 ：基因編輯活性在植物細胞中之證實
使用自Li等人, 2013 ( Nat. Biotech.31:688-691)調適的操作流程，在植物細胞中證實本發明之RGN脫胺酶融合蛋白之鹼基編輯活性。簡言之，使用PEG介導的轉化，將包括能夠在植物細胞中表現可操作地聯結至SV40 核定位訊號（SEQ ID NO: 43）的RGN脫胺酶融合蛋白的表現卡匣及編碼靶向植物PDS基因中位於恰當PAM序列側翼的一或多個位點的導引RNA的第二表現卡匣的表現載體引入 本塞姆氏煙草（ Nicotiana benthamiana）葉肉原生質體（mesophyll protoplast）內。經轉化之原生質體在黑暗中被培養至多36小時。使用DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)，使基因組DNA與原生質體分離。位於RGN標的位點側翼之基因組區域被PCR擴增，產物被純化，及在Illumina MiSeq上使用下一代定序，分析經純化之PCR產物。通常情況下，每擴增子產生100,000個250 bp的配對末側讀數（2×100,000個讀數）。使用CRISPResso（Pinello等人，2016，Nature Biotech 34：695-697）分析讀數以計算編輯率。對於專一性腺嘌呤突變的INDEL形成或引入，分析輸出對準。 實例 7 ：測試 mRNA 遞送
為確定鹼基編輯器是否能夠以不同格式遞送，用初代T細胞測試mRNA遞送。使用CD3/CD28 beads（ThermoFisher），經純化之CD3+ T細胞或PBMC被解凍、被活化3天，然後，使用Lonza 4D-Nucleofector X單元及Nucleocuvette帶被核轉染。P3 Primary Cell套組被用於mRNA及RNP遞送二者。為mRNA及RNP遞送，細胞分別使用EO-115及EH-115程式被轉染。在含有IL-2、IL-7、及IL-15（Miltenyi Biotec）的CTS OpTimizer T細胞擴展培養基（ThermoFisher）中，細胞被培養4天(後核轉染後，使用Nucleospin Tissue基因組DNA分離套組（Machery Nagel）被收穫前)。
圍繞編輯位點的擴增子藉由PCR使用表35中辨別的引子而被產生，且使用Illumina Nexterra平臺，使用2x250bp的配對末側定序，經受NGS定序。藉由對每一個樣本計數總體置換率，確定所估計的鹼基編輯率。所測試的每一個導引的樣本的平均及數目顯示於下面。 表 35 ： LPG50148-nAPG07433.1 經由 mRNA 遞送的平均編輯率
SGN 平均編輯率 % N
SGN002352 7.84 2
SGN002364 29.79 2
SGN002367 0.1 2
SGN001061 0.37 1
SGN001062 71.81 1
SGN001064 3.99 1
SGN002254 8.92 2
SGN002255 5.26 2
SGN002256 8.32 2
SGN002290 2.88 2
SGN002293 9.68 2
SGN002299 27.05 2
SGN002132 29.11 2
SGN002137 7.77 2
SGN002139 6.00 2
SGN001770 1.22 2
SGN001773 0.49 2
SGN002212 29.63 2
SGN002216 2.58 2
SGN002218 36.13 2
SGN002230 14.32 2
SGN002231 33.18 2
SGN000753 6.84 2
SGN000754 26.41 1
SGN001856 0.5 2
SGN002248 9.91 2
SGN002249 40.19 2
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Claims (211)

  1. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407、399、405、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
  2. 一種核酸分子，包括編碼一脫胺酶多肽之一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407、399、405、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的一異源啟動子。
  4. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項1所述的多肽或請求項2或請求項3所述的核酸分子。
  5. 一種融合蛋白，包括一DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 407、399、405、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的一脫胺酶。
  6. 如請求項5所述的融合蛋白，其中該脫胺酶為一腺嘌呤脫胺酶。
  7. 如請求項5或請求項6所述的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為一大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或一TALEN。
  8. 如請求項5或請求項6所述的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為ㄧRNA導引之DNA結合多肽。
  9. 如請求項8所述的融合蛋白，其中該RNA導引之DNA結合多肽為一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
  10. 如請求項9所述的融合蛋白，其中該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽。
  11. 如請求項9所述的融合蛋白，其中該RGN為一V型CRISPR-Cas多肽。
  12. 如請求項9至請求項11中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN為一RGN切口酶。
  13. 如請求項9所述的融合蛋白，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  14. 如請求項12所述的融合蛋白，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
  15. 如請求項5至請求項14中任一項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包括至少一個核定位訊號（NLS）。
  16. 一種核酸分子，包括編碼一融合蛋白之一多核苷酸，該融合蛋白包括一DNA結合多肽及一脫胺酶，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451、449、443、11-20、444-448、450、及452-485中任一者具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407、399、405、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  17. 如請求項16所述的核酸分子，其中該脫胺酶為一腺嘌呤脫胺酶。
  18. 如請求項16或請求項17所述的核酸分子，其中該DNA結合多肽為一大範圍核酸酶、鋅指融合蛋白或一TALEN。
  19. 如請求項16或請求項17所述的核酸分子，其中該DNA結合多肽為一RNA導引之DNA結合多肽。
  20. 如請求項19所述的核酸分子，其中該RNA導引之DNA結合多肽為一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
  21. 如請求項20所述的核酸分子，其中該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽。
  22. 如請求項20所述的核酸分子，其中該RGN為一V型CRISPR-Cas多肽。
  23. 如請求項20所述的核酸分子，其中該RGN為一RGN切口酶。
  24. 如請求項20所述的核酸分子，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  25. 如請求項23所述的核酸分子，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
  26. 如請求項16至請求項25中任一項所述的核酸分子，其中編碼該融合蛋白的多核苷酸於其5'末側處可操作地聯結至一異源啟動子。
  27. 如請求項16至請求項26中任一項所述的核酸分子，其中編碼該融合蛋白的該多核苷酸於其3'末側處可操作地聯結至一異源終止子。
  28. 如請求項16至請求項27中任一項所述的核酸分子，其中該融合蛋白包括一或多個核定位訊號。
  29. 如請求項16至請求項28中任一項所述的核酸分子，其中該融合蛋白針對於一真核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
  30. 如請求項16至請求項28中任一項所述的核酸分子，其中該融合蛋白針對於一原核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
  31. 一種包括請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子的載體。
  32. 如請求項31所述的載體，進一步包括將能夠與一標的序列雜合之一導引RNA（gRNA）編碼的至少一個核苷酸序列。
  33. 如請求項32所述的載體，其中該gRNA為一單導引RNA。
  34. 如請求項32所述的載體，其中該gRNA為一雙導引RNA。
  35. 一種包括請求項5至請求項15中任一項所述的融合蛋白、請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子、或請求項31至請求項34中任一項所述的的載體的細胞。
  36. 一種包括請求項5至請求項15中任一項所述的融合蛋白的細胞，其中該細胞進一步包括一導引RNA。
  37. 一種製作一融合蛋白的方法，包括在該融合蛋白被表現的條件下，培養請求項35或請求項36所述的細胞。
  38. 一種製作一融合蛋白的方法，包括將請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子或請求項31至請求項34中任一項所述的一載體引入一細胞內，及在該融合蛋白被表現的條件下，培養該細胞。
  39. 如請求項37或請求項38所述的方法，進一步包含純化該融合蛋白。
  40. 一種製作一RGN融合核糖核蛋白複合物的方法，包括將請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子及包括對一導引RNA編碼的一表現卡匣的一核酸分子、或請求項31至請求項34中任一項所述的載體引入一細胞內，及在該融合蛋白及gRNA被表現且形成一RGN融合核糖核蛋白複合物的條件下，培養該細胞。
  41. 如請求項40所述的方法，進一步包含純化該RGN融合核糖核蛋白複合物。
  42. 一種修飾包括一標的DNA序列的一標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及一脫胺酶的一融合蛋白或編碼該融合蛋白的一核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、399、405、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA，或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中該一或多個導引RNA能夠與該融合蛋白形成一複合物，以將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾該標的DNA分子。
  43. 如請求項42所述的系統，其中編碼該一或多個導引RNA該核苷酸序列及編碼該融合蛋白的該核苷酸序列的至少一個可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之一啟動子。
  44. 如請求項42或請求項43所述的系統，其中該標的DNA序列為一真核標的DNA序列。
  45. 如請求項42至請求項44中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列與藉由該RGN辨識的一原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
  46. 如請求項42至請求項45中任一項所述的系統，其中該標的DNA分子在一細胞內。
  47. 如請求項42至請求項46中任一項所述的系統，其中該融合蛋白之該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽。
  48. 如請求項42至請求項46中任一項所述的系統，其中該融合蛋白之該RGN為一V型CRISPR-Cas多肽。
  49. 如請求項42至請求項46中任一項所述的系統，其中該融合蛋白之該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、或368具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  50. 如請求項42至請求項46中任一項所述的系統，其中該融合蛋白之該RGN為一RGN切口酶。
  51. 如請求項50所述的系統，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
  52. 如請求項42至請求項51中任一項所述的系統，其中該融合蛋白包括一或多個核定位訊號。
  53. 如請求項42至請求項52中任一項所述的系統，其中該融合蛋白針對於一真核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
  54. 如請求項42至請求項53中任一項所述的系統，其中編碼該一或多個導引RNA之核苷酸序列及編碼一融合蛋白之該核苷酸序列被定位於一個載體上。
  55. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項5至請求項15中任一項所述的融合蛋白、請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子、請求項31至請求項34中任一項所述的載體、請求項35或請求項36所述的細胞、或請求項42至請求項54中任一項所述的系統。
  56. 一種用於修飾包括一標的DNA序列之一標的DNA分子的方法，該方法包括將根據請求項42至請求項54中任一項所述的一系統遞送至該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的一細胞。
  57. 一種用於修飾包括一標的序列之一標的DNA分子的方法，包括： a）藉由組合以下者來在體外將一RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物在適合形成該RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下進行組裝： i）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的一融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407、399、405、1-10、400-404、406、及408-441中至少一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的一細胞與該在體外組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生該標的DNA分子的修飾。
  58. 如請求項56或請求項57所述的方法，其中該經修飾之標的DNA分子包括該標的DNA分子內的至少一個核苷酸的一A＞N突變，其中N為C、G、或T。
  59. 如請求項58所述的方法，其中該經修飾之標的DNA分子包括該標的DNA分子內的至少一個核苷酸的一A＞ G突變。
  60. 如請求項56至請求項59中任一項所述的方法，其中該融合蛋白之該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽。
  61. 如請求項56至請求項59中任一項所述的方法，其中該融合蛋白之該RGN為一V型CRISPR-Cas多肽。
  62. 如請求項56至請求項59中任一項所述的方法，其中該融合蛋白之該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、或368具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  63. 如請求項56至請求項59中任一項所述的方法，其中該融合蛋白之該RGN為一RGN切口酶。
  64. 如請求項63所述的方法，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
  65. 如請求項56至請求項64中任一項所述的方法，其中該融合蛋白包括一或多個核定位訊號。
  66. 如請求項56至請求項65中任一項所述的方法，其中該融合蛋白針對於一真核細胞中之表現而被密碼子最佳化。
  67. 如請求項56至請求項66中任一項所述的方法，其中該標的DNA序列為一真核標的DNA序列。
  68. 如請求項56至請求項67中任一項所述的方法，其中該標的DNA序列與一原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
  69. 如請求項56至請求項68中任一項所述的方法，其中該標的DNA分子在一細胞內。
  70. 如請求項69所述的方法，進一步包括選擇包括該經修飾之DNA分子的一細胞。
  71. 一種包括如請求項70所述的方法之一經修飾之標的DNA序列的細胞。
  72. 一種醫藥組成物，包括請求項71所述的細胞及一醫藥學上可接受之載劑。
  73. 一種利用針對一基因遺傳性疾病的一因果突變中的一校正來產生一經基因修飾之細胞的方法，該方法包括將以下者引入該細胞內： a）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及一脫胺酶的一融合蛋白或編碼該融合蛋白的一多核苷酸，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO：407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90％序列一致性的一胺基酸序列，其中編碼該融合蛋白的該多核苷酸可操作地聯結至一啟動子，以賦能該融合蛋白在該細胞中的表現；及 b）能夠與一標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA（gRNA）或編碼該gRNA的該多核苷酸，其中編碼gRNA的該多核苷酸可操作地聯結至一啟動子，以賦能該gRNA在該細胞中的表現； 藉以，該融合蛋白及gRNA靶向該因果突變的該基因組位址且修飾該基因組序列以除去該因果突變。
  74. 如請求項73所述的方法，其中該融合蛋白之該RGN為一RGN切口酶。
  75. 如請求項74所述的方法，其中該RGN切口酶為SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者。
  76. 如請求項73至請求項75中任一項所述的方法，其中該基因組修飾包括將至少一個核苷酸的一A＞G突變引入該標的DNA序列內。
  77. 如請求項73至請求項76中任一項所述的方法，其中該因果突變之該校正包括校正一無意義突變。
  78. 如請求項73所述的方法，其中該基因遺傳疾病為列於表34中之一疾病。
  79. 如請求項73所述的方法，其中該基因遺傳疾病為囊腫纖維化。
  80. 一種醫治一疾病的方法，該方法包括向對其需要之一個體投予請求項55或請求項72所述的一醫藥組成物之一有效量。
  81. 如請求項80所述的方法，其中該疾病與一因果突變關聯，且該醫藥組成物之該有效量校正該因果突變。
  82. 如請求項5至請求項15中任一項所述的融合蛋白、請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子、請求項31至請求項34中任一項所述的載體、請求項35、請求項36及請求項71中任一項所述的細胞、或請求項42至請求項54中任一項所述的系統對於一個體的一疾病之該醫治的用途。
  83. 如請求項82所述的用途，其中該疾病與一因果突變關聯，且該醫治包括校正該因果突變。
  84. 請求項5至請求項15中任一項所述的融合蛋白、請求項16至請求項30中任一項所述的核酸分子、請求項31至請求項34中任一項所述的載體、請求項35、請求項36及請求項71中任一項所述的細胞、或請求項42至請求項54中任一項所述的系統對於醫治一疾病有用的一藥品之該製造的用途。
  85. 如請求項84所述的方法，其中該疾病與一因果突變關聯，且一有效量之該藥品校正該因果突變。
  86. 一種包括編碼一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽的一多核苷酸的核酸分子，其中該多核苷酸包括編碼一RGN多肽的一核苷酸序列，該RGN多肽包括與SEQ ID NO：41或60具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列，但缺少SEQ ID NO：41或60的胺基酸殘基590至597； 其中當與能夠與該標的DNA序列雜合的一導引RNA（gRNA）結合時，該RGN多肽能夠以一RNA導引之序列專一性方式結合一標的DNA序列。
  87. 如請求項86所述的核酸分子，其中編碼一RGN多肽的該多核苷酸可操作地聯結至與該多核苷酸異源之一啟動子。
  88. 如請求項86或請求項87所述的核酸分子，其中該RGN多肽為為無核酸酶活性的或起一切口酶作用。
  89. 如請求項86至請求項88中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽可操作地融合至一鹼基編輯多肽。
  90. 一種載體，包括請求項86至請求項89中任一項所述的核酸分子。
  91. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 41或60具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列，但缺少SEQ ID NO: 41或60的胺基酸殘基590至597，其中該多肽為一RNA導引之核酸酶。
  92. 如請求項91所述的分離的多肽，其中該RGN多肽包括與SEQ ID NO: 366或368具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  93. 如請求項91或請求項92所述的分離的多肽，其中該RGN多肽為為無核酸酶活性的或起一切口酶作用。
  94. 如請求項91至請求項93中任一項所述的分離的多肽，其中該RGN多肽與一鹼基編輯多肽可操作地融合。
  95. 一種包括請求項86至請求項89中任一項所述的核酸分子、請求項90所述的載體、或請求項91至請求項94中任一項所述的多肽的細胞。
  96. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
  97. 如請求項96所述的分離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO: 407所示的一胺基酸序列。
  98. 一種核酸分子，包括編碼一脫胺酶多肽的一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  99. 如請求項98所述的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的一異源啟動子。
  100. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項96至請求項97中任一項所述的多肽或請求項98至請求項99中任一項所述的核酸分子。
  101. 一種融合蛋白，包括一DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的一脫胺酶。
  102. 如請求項101所述的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
  103. 如請求項102所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  104. 如請求項101至請求項103中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN多肽。
  105. 如請求項102至請求項104中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一切口酶。
  106. 如請求項105所述的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  107. 一種核酸分子，包括編碼包括一DNA結合多肽及一脫胺酶的一融合蛋白的一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 451具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  108. 如請求項107所述的核酸分子，其中該DNA結合多肽為一RGN多肽。
  109. 如請求項108所述的核酸分子，其中該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  110. 如請求項107至請求項109中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示之一胺基酸序列的一RGN多肽。
  111. 如請求項108至請求項110中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽為一切口酶。
  112. 如請求項111所述的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  113. 一種包括請求項107至請求項112中任一項所述的核酸分子之載體。
  114. 如請求項113所述的載體，進一步包括編碼能夠與一標的序列雜合的一導引RNA（gRNA）的至少一個核苷酸序列。
  115. 一種核糖核蛋白（RNP）複合物，包括請求項101至請求項106中任一項所述的融合蛋白及結合至該融合蛋白的該DNA結合多肽的一導引RNA。
  116. 一種包括請求項101至請求項106中任一項所述的融合蛋白、請求項107至請求項112中任一項所述的核酸分子、請求項113至請求項114中任一項所述的載體、或請求項115所述的RNP複合物之細胞。
  117. 一種用於修飾包括一標的DNA序列的一標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及一脫胺酶的一融合蛋白或編碼該融合蛋白的一核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中該一或多個導引RNA能夠與該融合蛋白形成一複合物，以便將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾該標的DNA分子。
  118. 如請求項117所述的系統，其中編碼該一或多個導引RNA的該核苷酸序列及編碼該融合蛋白的該核苷酸序列的至少其中之一可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之一啟動子。
  119. 如請求項117至請求項118中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列與藉由該RGN多肽辨識的一原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
  120. 如請求項117至請求項119中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的一核酸序列或其補體。
  121. 如請求項117至請求項120中任一項所述的系統，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列。
  122. 如請求項117至請求項121中任一項所述的系統，其中該融合蛋白的該RGN多肽為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  123. 如請求項117至請求項122中任一項所述的系統，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN。
  124. 如請求項123所述的系統，其中該RGN多肽為一切口酶。
  125. 如請求項124所述的系統，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  126. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項101至請求項106中任一項所述的融合蛋白、請求項107至請求項112中任一項所述的核酸分子、請求項113至請求項114中任一項所述的載體、請求項115所述的RNP複合物、請求項116所述的細胞、或請求項117至請求項125中任一項所述的系統。
  127. 一種用於修飾包括一標的序列之一標的DNA分子的方法，包括： a）藉由組合以下者來將一RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物在適合形成該RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下進行組裝： i）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的一融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 407具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的一細胞與該組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生該標的DNA分子的修飾。
  128. 如請求項127所述的方法，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的一核酸序列或其補體。
  129. 如請求項127至請求項128中任一項所述的方法，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列。
  130. 如請求項127至請求項129中任一項所述的方法，其中該方法是在體外、活體內、或離體地實行的。
  131. 一種醫治具有一疾病、病症或病況或處於該疾病、病症或病況的發展風險中的一個體的方法，該方法包括： 對該個體投予請求項101至請求項106中任一項所述的融合蛋白、請求項107至請求項112中任一項所述的核酸分子、請求項113至請求項114中任一項所述的載體、請求項115所述的RNP複合物、請求項116所述的細胞、請求項117至請求項125中任一項所述的系統、或請求項126所述的醫藥組成物。
  132. 如請求項131所述的方法，進一步包括投予包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列的一gRNA中任一者。
  133. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
  134. 如請求項133所述的分離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO: 405所示的一胺基酸序列。
  135. 一種核酸分子，包括編碼一脫胺酶多肽的一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 449具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 405中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  136. 如請求項135所述的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的一異源啟動子。
  137. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項133至請求項134中任一項所述的多肽、或請求項135至請求項136中任一項所述的核酸分子。
  138. 一種融合蛋白，包括一DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的一脫胺酶。
  139. 如請求項138所述的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
  140. 如請求項139所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  141. 如請求項138至請求項140中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN多肽。
  142. 如請求項139至請求項141中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一切口酶。
  143. 如請求項142所述的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  144. 一種核酸分子，包括編碼包括一DNA結合多肽及一脫胺酶的一融合蛋白的一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 449具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  145. 如請求項144所述的核酸分子，其中該DNA結合多肽為一RGN多肽。
  146. 如請求項145所述的核酸分子，其中該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  147. 如請求項144至請求項146中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN多肽。
  148. 如請求項145至請求項147中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽為一切口酶。
  149. 如請求項148所述的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  150. 一種包括請求項144至請求項149中任一項所述的核酸分子之載體。
  151. 如請求項150所述的載體，進一步包括編碼能夠與一標的序列雜合的一導引RNA（gRNA）的至少一個核苷酸序列。
  152. 一種核糖核蛋白（RNP）複合物，包括請求項138至請求項141中任一項所述的融合蛋白及結合至該融合蛋白的該DNA結合多肽的一導引RNA。
  153. 一種包括請求項138至請求項143中任一項所述的融合蛋白、請求項144至請求項149中任一項所述的核酸分子、請求項150至請求項151中任一項所述的載體、或請求項152所述的RNP複合物之細胞。
  154. 一種用於修飾包括一標的DNA序列的一標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及一脫胺酶的一融合蛋白或編碼該融合蛋白的一核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中該一或多個導引RNA能夠與該融合蛋白形成一複合物，以將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾該標的DNA分子。
  155. 如請求項154所述的系統，其中編碼該一或多個導引RNA的該核苷酸序列及編碼該融合蛋白的該核苷酸序列之至少其中之一可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之一啟動子。
  156. 如請求項154至請求項155中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列與藉由該RGN多肽辨識的一原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
  157. 如請求項154至請求項156中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的一核酸序列或其補體。
  158. 如請求項154至請求項157中任一項所述的系統，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列。
  159. 如請求項154至請求項158中任一項所述的系統，其中該融合蛋白的該RGN多肽為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  160. 如請求項154至請求項159中任一項所述的系統，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN。
  161. 如請求項160所述的系統，其中該RGN多肽為一切口酶。
  162. 如請求項161所述的系統，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  163. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項138至請求項143中任一項所述的融合蛋白、請求項144至請求項149中任一項所述的核酸分子、請求項150至請求項151中任一項所述的載體、請求項152所述的RNP複合物、請求項153所述的細胞、或請求項154至請求項162中任一項所述的系統。
  164. 一種用於修飾包括一標的序列之一標的DNA分子的方法，包括： a）藉由組合以下者來將一RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物在適合形成該RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下進行組裝： i）能夠與標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的一融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 405具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的一細胞與該組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生該標的DNA分子的修飾。
  165. 如請求項164所述的方法，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的一核酸序列或其補體。
  166. 如請求項164至請求項165中任一項所述的方法，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列。
  167. 如請求項164至請求項166中任一項所述的方法，其中該方法是在體外、活體內、或離體地實行的。
  168. 一種醫治具有一疾病、病症或病況或處於該疾病、病症或病況的發展風險中的一個體的方法，該方法包括： 對該個體投予請求項138至請求項143中任一項所述的融合蛋白、請求項144至請求項149中任一項所述的核酸分子、請求項150至請求項151中任一項所述的載體、請求項152所述的RNP複合物、請求項153所述的細胞、請求項154至請求項162中任一項所述的系統、或請求項163所述的醫藥組成物。
  169. 如請求項168所述的方法，進一步包括投予包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列的一gRNA中任一者。
  170. 一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列，其中該多肽具有脫胺酶活性。
  171. 如請求項170所述的分離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO: 399所示的一胺基酸序列。
  172. 一種核酸分子，包括編碼一脫胺酶多肽的一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 443具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 399中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  173. 如請求項172所述的核酸分子，其中該核酸分子進一步包括可操作地聯結至該多核苷酸的一異源啟動子。
  174. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項170至請求項171中任一項所述的多肽或請求項172至請求項173中任一項所述的核酸分子。
  175. 一種融合蛋白，包括一DNA結合多肽及與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的一脫胺酶。
  176. 如請求項175所述的融合蛋白，其中該DNA結合多肽為一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽。
  177. 如請求項176所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  178. 如請求項175至請求項177中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN多肽。
  179. 如請求項176至請求項178中任一項所述的融合蛋白，其中該RGN多肽為一切口酶。
  180. 如請求項179所述的融合蛋白，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  181. 一種核酸分子，包括編碼包括一DNA結合多肽及一脫胺酶的一融合蛋白的一多核苷酸，其中該脫胺酶藉由一核苷酸序列被編碼，該核苷酸序列： a）與SEQ ID NO: 443具有至少80%序列一致性，或 b）編碼與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  182. 如請求項181所述的核酸分子，其中該DNA結合多肽為一RGN多肽。
  183. 如請求項182所述的核酸分子，其中該RGN為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  184. 如請求項181至請求項183中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN多肽。
  185. 如請求項182至請求項184中任一項所述的核酸分子，其中該RGN多肽為一切口酶。
  186. 如請求項185所述的核酸分子，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  187. 一種載體，包括請求項181至請求項186中任一項所述的核酸分子。
  188. 如請求項187所述的載體，進一步包括編碼能夠與一標的序列雜合的一導引RNA（gRNA）的至少一個核苷酸序列。
  189. 一種核糖核蛋白（RNP）複合物，包括請求項175至請求項180中任一項所述的融合蛋白及結合至該融合蛋白的該DNA結合多肽的一導引RNA。
  190. 一種包括請求項175至請求項180中任一項所述的融合蛋白、請求項181至請求項186中任一項所述的核酸分子、請求項187至請求項188中任一項所述的載體、或請求項189所述的RNP複合物之細胞。
  191. 一種用於修飾包括一標的DNA序列的一標的DNA分子的系統，該系統包括： a）包括一RNA導引之核酸酶（RGN）多肽及一脫胺酶的一融合蛋白或編碼該融合蛋白的一核苷酸序列，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA或編碼該一或多個導引RNA（gRNA）的一或多個核苷酸序列；及 其中該一或多個導引RNA能夠與該融合蛋白形成一複合物，以便將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合且修飾該標的DNA分子。
  192. 如請求項191所述的系統，其中編碼該一或多個導引RNA的該核苷酸序列及編碼該融合蛋白的該核苷酸序列之至少其中之一可操作地聯結至與該核苷酸序列異源之一啟動子。
  193. 如請求項191至請求項192中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列與藉由該RGN多肽辨識的一原型間隔體相鄰模體（PAM）相鄰地被定位。
  194. 如請求項191至請求項193中任一項所述的系統，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的一核酸序列或其補體。
  195. 如請求項191至請求項194中任一項所述的系統，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列。
  196. 如請求項191至請求項195中任一項所述的系統，其中該融合蛋白的該RGN多肽為一II型CRISPR-Cas多肽或一V型CRISPR-Cas多肽。
  197. 如請求項191至請求項196中任一項所述的系統，其中該RGN多肽為一Cas9、一CasX、一CasY、一Cpfl、一C2cl、一C2c2、一C2c3、一GeoCas9、一CjCas9、一Casl2a、一Casl2b、一Casl2g、一Casl2h、一Casl2i、一Casl3b、一Casl3c、一Casl3d、一Casl4、一Csn2、一xCas9、一SpCas9-NG、一LbCasl2a、一AsCasl2a、一Cas9-KKH、一環狀排列Cas9、一Argonaute（Ago）、一SmacCas9、一Spy-macCas9域、或具有SEQ ID NO: 41、60、366、或368中任一者所示一胺基酸序列的一RGN。
  198. 如請求項197所述的系統，其中該RGN多肽為一切口酶。
  199. 如請求項198所述的系統，其中該切口酶具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少95%序列一致性的一胺基酸序列。
  200. 一種醫藥組成物，包括一醫藥學上可接受之載劑及請求項175至請求項180中任一項所述的融合蛋白、請求項181至請求項186中任一項所述的核酸分子、請求項187至請求項188中任一項所述的載體、請求項189所述的RNP複合物、請求項190所述的細胞、或請求項191至請求項199中任一項所述的系統。
  201. 一種用於修飾包括一標的序列之一標的DNA分子的方法，包括： a）藉由組合以下者來將一RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物在適合形成該RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物的條件下進行組裝： i）能夠與該標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA；及 ii）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及至少一個脫胺酶的一融合蛋白，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO: 399具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列；及 b）使該標的DNA分子或包括該標的DNA分子的一細胞與該組裝的RGN脫胺酶核糖核苷酸複合物接觸； 其中該一或多個導引RNA與該標的DNA序列雜合，從而將該融合蛋白導向至與該標的DNA序列結合，且發生該標的DNA分子的修飾。
  202. 如請求項201所述的方法，其中該標的DNA序列包括從SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563組成之群組選出的一核酸序列或其補體。
  203. 如請求項201至請求項202中任一項所述的方法，其中該gRNA序列包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列。
  204. 如請求項201至請求項203中任一項所述的方法，其中該方法是在體外、活體內、或離體地實行的。
  205. 一種醫治具有一疾病、病症或病況或處於該疾病、病症或病況的發展風險中的一個體的方法，該方法包括： 對該個體投予請求項175至請求項180中任一項所述的融合蛋白、請求項181至請求項186中任一項所述的核酸分子、請求項187至請求項188中任一項所述的載體、請求項189所述的RNP複合物、請求項190所述的細胞、請求項191至請求項199中任一項所述的系統、或請求項200所述的醫藥組成物。
  206. 如請求項205所述的方法，進一步包括投予包括從SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564組成之群組選出的一核酸序列的一gRNA中任一者。
  207. 一種用於對囊腫纖維化之至少一個症狀產生一醫治或降低的方法，該方法包括向對其需要之一個體投予一有效量之： a）包括一RNA導引之核酸酶多肽（RGN）及一脫胺酶的一融合蛋白或編碼該融合蛋白的一多核苷酸，其中該脫胺酶具有與SEQ ID NO：407、405、399、1-10、400-404、406、及408-441中任一者具有至少90％序列一致性的一胺基酸序列，其中編碼該融合蛋白的該多核苷酸可操作地聯結至一啟動子，以賦能該融合蛋白在該細胞中之表現；及 b）能夠與一標的DNA序列雜合的一或多個導引RNA（gRNA）或編碼該gRNA的一多核苷酸，其中編碼該gRNA的該多核苷酸可操作地聯結至一啟動子，以賦能該gRNA在該細胞中之表現； 藉以，該融合蛋白及該gRNA靶向該因果突變的該基因組位址且修飾該基因組序列以除去該因果突變。
  208. 如請求項207所述的方法，其中該gRNA包括靶向SEQ ID NO: 62-97、116-139、152-185、203-234、251-286、305-344、562、及563中任一者的一間隔體序列或其補體。
  209. 如請求項207或請求項208所述的方法，其中該gRNA包括SEQ ID NO: 98-115、140-151、186-202、235-250、287-304、345-364、及564中任一者。
  210. 如請求項207至請求項209中任一者所述的方法，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 41、60、366、及368中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
  211. 如請求項207至請求項209中任一者所述的方法，其中該RGN具有與SEQ ID NO: 42、52-59、61、397、及398中任一者具有至少90%序列一致性的一胺基酸序列。
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