JP2023541400A - Ｄｎａ修飾酵素並びにその活性断片及びバリアント並びにその使用方法 - Google Patents

Ｄｎａ修飾酵素並びにその活性断片及びバリアント並びにその使用方法 Download PDF

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Abstract

核酸の標的編集のための新規なデアミナーゼポリペプチドを含む、組成物及び方法が提供される。組成物は、デアミナーゼポリペプチドを含む。本発明のＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む、融合タンパク質もまた提供される。融合タンパク質は、任意選択でガイドＲＮＡと複合体化した、デアミナーゼに融合されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む。組成物はまた、デアミナーゼ又は融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。デアミナーゼ又は融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、ベクター及び宿主細胞もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１１日出願の米国仮特許出願第６３／０７７，０８９号及び２０２１年２月８日出願の米国仮特許出願第６３／１４６，８４０号の優先権を主張する。各仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにＡＳＣＩＩ形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコピーはＬ１０３４３８＿１２３０ＷＯ＿０１０８＿１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１，０７１，２４６バイトの大きさであり、２０２１年９月９日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて電子提出されている。
本発明は、分子生物学及び遺伝子編集の分野に関する。
標的ゲノム編集又は修飾は、急速に基礎研究及び応用研究の重要な手段になりつつある。初期の方法は、ヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮを操作することを伴い、特定の各標的配列に特異的な操作されたプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを有するキメラヌクレアーゼの作製を必要としていた。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、例えばクラスター化された規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ細菌系のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、特定の標的配列と特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡとヌクレアーゼとを複合体化することにより、特定の配列を標的化することができる。標的特異的なガイドＲＮＡの作製は、各標的配列についてキメラヌクレアーゼを作製するよりも低コストで効率的である。このようなＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを用いて、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される配列特異的二本鎖切断の導入を通じてゲノムを編集し、特定のゲノム位置に変異を導入することができる。
それに加え、ＲＧＮは、標的ＤＮＡ編集アプローチに有用である。核酸配列の標的編集（例えば特定の修飾をゲノムＤＮＡの中に導入することを可能にする標的切断）によって遺伝子機能と遺伝子発現を研究するための非常に微妙なアプローチが可能になる。ＲＧＮはまた、標的塩基編集のための、デアミナーゼなどのＤＮＡ修飾酵素と組み合わせてＲＧＮのＲＮＡ誘導型活性を使用するキメラタンパク質を作製するために使用され得る。標的編集を活用してヒトにおける遺伝子疾患を標的にすること、又は農業で有益な変異を作物のゲノムに導入することもできる。ゲノム編集ツールの開発により、遺伝子編集に基づく哺乳動物用治療薬及び農業バイオテクノロジーへの新たなアプローチが提供される。
標的ＤＮＡ分子を修飾するための組成物及び方法が提供される。組成物は、目的の標的ＤＮＡ分子の修飾に使用される。提供される組成物は、デアミナーゼポリペプチドを含む。核酸分子結合ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチド）及びデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質、並びにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質とリボ核酸とを含むリボ核タンパク質複合体も提供される。提供される組成物はまた、デアミナーゼポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸分子と、核酸分子を含むベクター及び宿主細胞とを含む。本明細書に開示の方法は、目的の標的ＤＮＡ分子内での目的の標的配列の結合、及び目的の標的ＤＮＡ分子の修飾に関する。
本明細書に記載の本発明の多くの変形例及び他の実施形態は、前述の説明に示された教示の利益を有するものであり、これらの発明が属する分野の当業者に想起されるであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、変形例及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されていることが理解されるべきである。本明細書では特定の用語を使用するが、限定を目的としてではなく、包括的かつ説明的な意味でのみ、それらを使用する。
Ｉ．概要
本開示は、新規なアデニンデアミナーゼと、ＤＮＡ結合ポリペプチドなどの核酸分子結合ポリペプチド及び新規なデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質とを提供する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ランダム化されたバックグラウンド配列への結合よりも高い頻度で標的配列に結合するという点で、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、若しくはＴＡＬＥＮであるか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡとも呼ばれる）に結合し、次に鎖ハイブリダイゼーションを介して標的核酸配列に結合するＣａｓ９ポリペプチドドメインなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。
本明細書に開示のデアミナーゼポリペプチドは、例えばアデニンなどの核酸塩基を脱アミノ化することができる。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化は、それぞれの残基に点変異を生じさせることができ、これを本明細書では「核酸編集」又は「塩基編集」と呼ぶ。したがって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドとデアミナーゼを含む融合タンパク質は、核酸配列の標的編集に使用することができる。
そのような融合タンパク質は、インビトロでのＤＮＡの標的編集、例えば遺伝子修飾細胞の作製に有用である。これらの遺伝子修飾細胞は、植物細胞であっても動物細胞であってもよい。このような融合タンパク質は、標的変異を導入すること、例えば生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で哺乳動物細胞における遺伝子欠損を修正すること（例えば対象から得られてその後同じ対象又は別の対象に再導入される細胞において）と、標的変異を導入すること（例えば哺乳動物対象の疾患関連遺伝子における遺伝子欠損を修正すること、又はその遺伝子の中に不活性化変異を導入すること）とにも有用であり得る。このような融合タンパク質はまた、植物細胞における標的変異の導入、例えば、有益な又は農学的に価値のある形質又はアレル（対立遺伝子）の導入に有用であり得る。
「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって互いに連結された複数のアミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸長になる。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、個別のタンパク質、又はタンパク質の集団を意味することができる。１つのタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドの中の１個以上のアミノ酸を修飾することが、例えば化学的特徴部（炭化水素基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、機能化、又はそれ以外の修飾などのためのリンカーなど）を付加することによって可能である。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、天然に存在するタンパク質又はペプチドの単なる断片であり得る。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、天然に存在すること、組換えであること、又は合成であること、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書で提供されるタンパク質のいずれも、当技術分野で公知の任意の方法で作製することができる。例えば、本明細書で提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している組換えタンパク質の発現及び精製を介して作製することができる。組換えタンパク質の発現及び精製のための方法は周知であり、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））によって記載されるものを含む。その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ＩＩ．デアミナーゼ
「デアミナーゼ」という用語は、脱アミノ化反応を触媒する酵素を指す。本発明のデアミナーゼは核酸塩基デアミナーゼであり、「デアミナーゼ」及び「核酸塩基デアミナーゼ」という用語は本明細書において互換的に用いられる。デアミナーゼは、天然に存在するデアミナーゼ酵素又はその活性断片若しくはバリアントであり得る。デアミナーゼは、ｓｓＤＮＡ若しくはｓｓＲＮＡなどの一本鎖核酸、又はｄｓＤＮＡ若しくはｄｓＲＮＡなどの二本鎖核酸に対して活性であり得る。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはｓｓＤＮＡのみを脱アミノ化可能であり、ｄｓＤＮＡには作用しない。
本開示の方法及び組成物は、アデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはＡＤＡＴファミリーデアミナーゼ又はそのバリアントである。アデニン、アデノシン、又はデオキシアデノシンの脱アミノ化によりイノシンが生じ、これはポリメラーゼによってグアニンとして処理される。これまでのところ、ＤＮＡ中のアデニンを脱アミノ化する天然に存在するアデニンデアミナーゼは知られていない。哺乳動物細胞において、ｔＲＮＡに作用するアデニンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）タンパク質を、ＤＮＡ分子に作用するように進化させ最適化するために、いくつかの方法が採用されてきた（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｋｏｂｌａｎ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６，８４３－８４６；Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，２０２０，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０５６２－８。各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。そのような方法の１つは、Ａ：Ｔ＞Ｇ：Ｃ変換を通じて抗生物質耐性を活性化する能力を持つ細胞だけが生き残ることができる細菌選択アッセイを用いる。
本発明は、細菌デアミナーゼの進化及び最適化を通じて作製された新規なアデニンデアミナーゼポリペプチドに関する。新規なアデニンデアミナーゼは本明細書に開示され、配列番号１～１０及び３９９～４４１として示される。本発明のデアミナーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の編集のために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼは、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ分子の編集のために使用され得る。本明細書に記載のアデニンデアミナーゼは、デアミナーゼ単独として、又は融合タンパク質中の成分として有用である。ＤＮＡ標的化ポリペプチド及びアデニンデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質は、本明細書において「Ａ塩基エディタ」、「アデニン塩基エディタ」、又は「ＡＢＥ」と呼ばれ、核酸配列の標的編集のために使用することができる。
「塩基エディタ」は、ＲＧＮなどのＤＮＡ標的化ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質である。アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）は、ＲＧＮなどのＤＮＡ標的化タンパク質とアデニンデアミナーゼとを含む。ＡＢＥは、ＤＮＡ標的分子においてアデニンを脱アミノ化してイノシンに変換することによって機能する（Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２０１７）。イノシンは、ポリメラーゼによってグアニンとして認識され、イノシンの反対側の相補的ＤＮＡ鎖上にシトシンを組み込むことを可能にする。脱アミノ化後の一連の複製の後、ゲノムにＡ：ＴからＧ：Ｃへの塩基対変化が生じる。いくつかの実施形態では、本開示のアデニンデアミナーゼ又はその活性バリアント若しくは断片は、ＤＮＡ分子にＡ＞Ｎ変異を導入する。ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、又はＴである。更なる実施形態では、それらは、ＤＮＡ分子にＡ＞Ｇ変異を導入する。
デアミナーゼがＤＮＡ結合ポリペプチドとの融合を介して核酸分子の特定の領域に標的化されている実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドが結合する標的配列内又はそれに隣接するアデニンの変異率は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、又はＤＮＡシークエンシングを含む当技術分野で公知の任意の方法を用いて測定することができる。
標的ＤＮＡ分子に所望のＡ＞Ｇ変異を導入する効率を高めるために、デアミナーゼ活性を保持する本開示の新規なデアミナーゼ又はその活性バリアント若しくは断片を、デアミナーゼ－ＤＮＡ結合ポリペプチド融合体の一部として細胞に導入してもよく、及び／又はＤＮＡ結合ポリペプチド－デアミナーゼ融合体と共発現させてもよい。本開示のデアミナーゼは、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかのアミノ酸配列、又はデアミナーゼ活性を保持するそのバリアント若しくは断片を有する。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、デアミナーゼは、配列番号４０７に対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、又は少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、又は少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、デアミナーゼは、配列番号３９９に対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、又は少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、又は少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは配列番号３９９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、デアミナーゼは、配列番号４０５に対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、又は少なくとも約９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、又は少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは配列番号４０５のアミノ酸配列を含む。
ＩＩＩ．核酸分子結合ポリペプチド
本開示のいくつかの態様は、核酸分子結合ポリペプチドとデアミナーゼポリペプチドとを含む、融合タンパク質を提供する。ＲＮＡ分子への結合及びＲＮＡ分子の標的編集が本発明によって企図されるが、いくつかの実施形態では、融合タンパク質の核酸分子結合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、インビトロ、生体外、又は生体内（in vivo）でのＤＮＡの標的編集に有用である。これらの新規な融合タンパク質は、哺乳動物細胞において活性であり、ＤＮＡ分子の標的編集に有用である。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２種の異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２つ以上の異なるドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びデアミナーゼを含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、核酸、例えばＲＮＡとの複合体であるか、又はこれと会合している。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合ポリペプチド」という用語は、ＤＮＡに結合可能な任意のポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド部分は、二本鎖ＤＮＡに結合する。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的にＤＮＡに結合する。本明細書で使用される場合、「配列特異的」又は「配列特異的に」という用語は、特定のヌクレオチド配列との選択的相互作用を指す。
２つのポリヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合、実質的に相補的であるとみなすことができる。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドがストリンジェントな条件下で特定の標的配列に結合する場合、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的にその配列に結合するとみなされる。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、２つのポリヌクレオチド配列（又はポリペプチドがその特異的標的配列に結合する）が、他の配列に対してよりも検出可能に高い程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）で互いに結合する条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、様々な状況において異なる。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的にはｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が、短い配列（例えば、１０～５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約３０℃、長い配列（例えば、５０ヌクレオチド超）の場合は少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって実現することもできる。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３７℃での３０～３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いるハイブリダイゼーション、及び５０～５５℃での１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、３７℃での４０～４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、及び５５～６０℃での０．５Ｘ～１ＸＳＳＣでの洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃での５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、及び６０～６５℃での０．１×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。任意選択で、洗浄緩衝液は、約０．１％～約１％のＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの持続時間は概ね約２４時間未満であり、通常は約４～約１２時間である。洗浄時間の持続時間は、少なくとも平衡に達するのに十分な長さである。
Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致した配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨ下で）である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７－２８４の式、すなわちＴｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ホルム）－５００／Ｌ（式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、Ｌは塩基対でのハイブリッドの長さである）で概算できる。概ね、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列及びその相補体の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、非常にストリンジェントな条件では、融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件では、融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件では、融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。当業者であれば、上記の式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、並びに所望のＴｍを用いてハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動がもともと説明されることを理解するであろう。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）にみられる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
ある特定の実施形態では、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ＲＧＤＢＰ）である。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド」及び「ＲＧＤＢＰ」は、関連するＲＮＡ分子と標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを介してＤＮＡに結合可能なポリペプチドを指す。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子中のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の切断を触媒する酵素を指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、核酸分子内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断可能であるエンドヌクレアーゼであるが、一方、ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、核酸分子のいずれかの末端（５’又は３’）でヌクレオチドを切断可能であるエキソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）又はそのバリアントからなる群から選択され、そのヌクレアーゼ活性は低減又は阻害されている。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」又は「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、長さが１２～４０ｂｐである二本鎖ＤＮＡ内の認識部位に結合するエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼの非限定的な例としては、保存アミノ酸モチーフＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号４９）を含むＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに属するものがある。「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」という用語は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質」又は「ＴＡＬＥＮ」という用語は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」又は「ＲＧＮ」という用語は、ヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを指す。ＲＧＮは、ガイドＲＮＡがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的配列に指向させ結合させるため、「ＲＮＡ誘導型」とみなされ、いくつかの実施形態では、標的配列に一本鎖又は二本鎖切断を導入する。ＲＧＮは、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られていた）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＣａｓＭＩＮＩ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、又はＳｐｙ－ｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮであり得る。いくつかの実施形態では、以下に記載されるように、本明細書で提供されるＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。
本発明によれば、例えばｄＣａｓ９などの、ヌクレアーゼ不活性型又は「失活型」になるように変異されたＲＧＮタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド又はヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ又はヌクレアーゼ失活型ＲＧＮと呼ぶことができる。更に、他の公知のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）に好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインを決定することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１９／０３６７９４９号（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＲＧＮ ＡＰＧ０８２９０．１のヌクレアーゼ不活性型バリアント）。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載のデアミナーゼに融合されたＲＧＮを含む。上記の融合タンパク質の実施形態では、デアミナーゼは、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼから選択される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上記の融合タンパク質の実施形態では、ＲＧＮは、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られていた）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＣａｓＭＩＮＩ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮから選択される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。Ｃａｓ９ニッカーゼは、国際公開第２０２０１８１１９５号（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＣａｓ９ニッカーゼであってもよい。
「ＲＧＮポリペプチド」という用語は、本明細書においてニッカーゼと呼ばれる、標的ヌクレオチド配列の一本鎖のみを切断するＲＧＮポリペプチドを包含する。このようなＲＧＮは、単一の機能的ヌクレアーゼドメインを有する。ＲＧＮニッカーゼは、天然に存在するニッカーゼであってもよいし、１つ以上のヌクレアーゼドメイン内で変異した二本鎖核酸分子の両方の鎖を、これらの変異ドメインのヌクレアーゼ活性が低下又は消失されるように自然に切断してニッカーゼになるＲＧＮタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮは、ＲＧＮが核酸二重鎖の非塩基編集標的鎖（ＰＡＭを含み、ｇＲＮＡと塩基対を形成する鎖）のみを切断可能であるようにする変異（例えば、Ｄ１０Ａ変異）を含む。このＤ１０Ａ変異は、ＲＧＮのスプリットＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの第１のアスパラギン酸残基を変異させる。本出願は、記載されるＲＧＮのいくつかのＤ１０Ａニッカーゼバリアント又は相同ニッカーゼバリアントを開示する（実施例４を参照）。ｎＡＰＧ０７４３３．１及びｎＡＰＧ０８２９０．１（それぞれ配列番号４２及び６１として示される）は、それぞれ配列番号４１及び６０として示されるＡＰＧ０７４３３．１及びＡＰＧ０８２９０．１のニッカーゼバリアントであり、国際公開第２０１９／２３６５６６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ｎＡＰＧ００９６９（配列番号５２として示される）及びｎＡＰＧ０９７４８（配列番号５４として示される）は、それぞれＡＰＧ００９６９及びＡＰＧ０９７４８のニッカーゼバリアントであり、国際公開第２０２０／１３９７８３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ｎＡＰＧ０６６４６（配列番号５３として示される）及びｎＡＰＧ０９８８２（配列番号５５として示される）は、それぞれＡＰＧ０６６４６及びＡＰＧ０９８８２のニッカーゼバリアントであり、国際公開第２０２１／０３０３４４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ｎＡＰＧ０３８５０、ｎＡＰＧ０７５５３、ｎＡＰＧ０５５８８６、及びｎＡＰＧ０１６０４は、それぞれ配列番号５６～５９として示され、ＡＰＧ０３８５０、ＡＰＧ０７５５３、ＡＰＧ０５５８８６、及びＡＰＧ０１６０４のニッカーゼバリアントであり、係属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第２０２１／０２８８４３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。様々なＲＧＮニッカーゼ、それらのバリアント、及びそれらの配列は、国際公開第２０２０１８１１９５号に開示されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。１つの例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９変異体である（例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（５）：１１７３－８３（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮは、ＲＧＮが核酸二重鎖の塩基編集非標的鎖（ＰＡＭを含まず、ｇＲＮＡと塩基対を形成していない鎖）のみを切断可能であるようにする変異（例えば、Ｈ８４０Ａ変異）を含む。Ｈ８４０Ａ変異は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの第１のヒスチジンを変異させる。Ｈ８４０Ａ変異又は等価変異を含むニッカーゼＲＧＮは、不活性化型ＨＮＨドメインを有する。Ｈ８４０Ａ変異を有するニッカーゼＲＧＮは、非標的鎖を切断する。Ｄ１０Ａ変異又は等価変異を含むニッカーゼは、不活性化型ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを有し、標的鎖を切断する。Ｄ１０Ａニッカーゼは、ＤＮＡの非標的鎖、すなわち塩基編集が望まれる鎖を切断することができない。
他の追加の例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインとしては、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、及びＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異ドメインが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１（９）：８３３－８３８（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ニッカーゼに変異した更なる好適なＲＧＮタンパク質は、本開示及び当技術分野における知識に基づいて当業者に明らかであり（例えば、国際公開第２０１９／２３６５６６号、同第２０２０１８１１９５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているＲＧＮなど）、本開示の範囲内である。好ましい実施形態では、標的鎖に対してニッカーゼ活性を有するＲＧＮは標的鎖にニック（切れ目）を入れるが、相補的な非標的鎖はデアミナーゼによって修飾される。細胞のＤＮＡ修復機構は、修飾された非標的鎖を鋳型として用いてニックの入った標的鎖を修復し、それによってＤＮＡに変異を導入することができる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼ活性を保持するＲＧＮニッカーゼは、配列番号４２、又は配列番号５２～５９、６１、３９７及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
アミノ酸配列に変異を導入するための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ＰＣＲ媒介変異誘発及び部位特異的変異誘発を使用して、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ失活型ＲＧＮを作製することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号及び同第９，７９０，４９０号を参照のこと。各出願公開は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、ゲノム内の単一部位を標的化操作することを可能にし、治療及び研究用途の遺伝子標的化の状況において有用である。哺乳動物を含む様々な生物において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、非相同末端結合又は相同組換えのいずれかを刺激することによってゲノム操作に使用されてきた。ＲＧＮは、クラスター化された規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムの一部としてガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって標的配列に向けられたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、又はその活性バリアント若しくは断片を含む。
更に、配列番号４１若しくは６０として示されるアミノ酸配列を含むが、配列番号４１若しくは６０のアミノ酸残基５９０～５９７を欠くＲＧＮポリペプチド（及びＲＧＮポリペプチドをコードする核酸分子）、又はその活性バリアント若しくは断片が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＲＧＮポリペプチドは、配列番号３６６、３６８、３９７、若しくは３９８として示されるアミノ酸配列、又はその活性バリアント若しくは断片を含む。
本開示のいくつかの態様は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼポリペプチド、具体的にはアデニンデアミナーゼポリペプチドとを含む、融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。更なる実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアント若しくは断片である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス１又はクラス２のシステムに分類される。クラス２のシステムは、単一のエフェクターヌクレアーゼから構成され、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型を含む。クラス１及び２のシステムは、複数のタイプ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ型）に細分化され、いくつかの型は、複数のサブタイプ（例えば、ＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型、ＩＩ－Ｃ型、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型）に更に細分化される。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアント若しくは断片である。本明細書で使用される場合、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」又は「Ｃａｓ９」という用語は、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とし、２つのヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）を含み、その各々が二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖の切断に関与するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を指す。いくつかの実施形態では、本発明は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）又はＳｐＣａｓ９ニッカーゼに融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質を提供し、その配列は、それぞれ配列番号５５５及び５５６として示され、米国特許第１０，０００，７７２号及び同第８，６９７，３５９号に記載されている。各特許文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）又はＳｔＣａｓ９ニッカーゼに融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質を提供し、その配列は、それぞれ配列番号５５７及び５５８として示され、米国特許第１０，１１３，１６７号に記載されている。この特許文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Streptococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）又はＳａＣａｓ９ニッカーゼに融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質を提供し、その配列は、それぞれ配列番号５５９及び５６０として示され、米国特許第９，７５２，１３２号に開示されている。この特許文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアント若しくは断片である。本明細書で使用される場合、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」、又は「Ｃａｓ１２」は、ｄｓＤＮＡを切断し、単一のＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン又はスプリットＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨドメインを欠くＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を指す（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ ２０１５，Ｃｅｌｌ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ ２０１７，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ．２０１６．１８４；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ ２０１８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ４２９４）。Ｃａｓ１２ａはＣｐｆ１とも呼ばれ、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないが、Ｃａｓ１２ｂなどの他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることに留意されたい。ほとんどのＶ型エフェクターは、多くの場合ＰＡＭを必要とせずにｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を標的化することもできる（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ ２０１８；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）。「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」という用語は、スプリットＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む固有のＲＧＮ、例えば、２０１９年１２月３０日に出願された米国仮出願第６２／９５５，０１４号及び２０２０年７月２９日に出願された同第６３／０５８，１６９号、並びに２０２０年１２月２８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第２０２０／０６７１３８号（各出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものを包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｃａｓ１２ａ（ＦｎＣａｓ１２ａ）（その配列は配列番号５６１として示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，４９０号に開示されている）、又は米国特許第９，７９０，４９０号内に開示されているＦｎＣａｓ１２ａのヌクレアーゼ不活性型変異体のいずれかに融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアント若しくは断片である。本明細書で使用される場合、「ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」、又は「Ｃａｓ１３」は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、ＲＮＡを切断する２つのＨＥＰＮドメインを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を指す。
「ガイドＲＮＡ」という用語は、標的配列とハイブリダイズし、関連するＲＧＮを標的ヌクレオチド配列に配列特異的に指向させ結合させるために、標的ヌクレオチド配列と十分な相補性を有するヌクレオチド配列を指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＧＮの場合、それぞれのガイドＲＮＡは、ＲＧＮに結合し、特定の標的ヌクレオチド配列に結合するようにＲＧＮを誘導することができ、ＲＧＮがニッカーゼ又はヌクレアーゼ活性を有する場合、標的ヌクレオチド配列も切断する、１つ以上のＲＮＡ分子（概ね、１つ又は２つ）である。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、いくつかの実施形態では、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、スペーサー配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。「スペーサー配列」は、目的の標的ヌクレオチド配列と直接ハイブリダイズするヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、目的の標的配列と完全に又は部分的に相補的であるように操作される。様々な実施形態では、スペーサー配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、又はそれ以上を含む。例えば、スペーサー配列は、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、約１０～約２６ヌクレオチド長又は約１２～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１０～２６ヌクレオチド長又は１２～３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、スペーサー配列は、約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、スペーサー配列は、３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列された場合、５０％～９９％以上であり、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、スペーサー配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列された場合、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である。特定の実施形態では、スペーサー配列は二次構造を含まず、このことは、当技術分野で知られている任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズム、例えば、これらに限定されないが、ｍＦｏｌｄ（例えば、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：１３３－１４８）を参照のこと）及びＲＮＡｆｏｌｄ（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４を参照のこと）を用いて予測することができる。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、それ自体で、又はハイブリダイズしたｔｒａｃｒＲＮＡと協調して、ＲＧＮ分子によって認識される構造を形成するヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、又はそれ以上を含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、８ヌクレオチド～３０ヌクレオチド、又はそれ以上を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列された場合、５０％～９９％以上であり、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列された場合、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を更に含む。トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、本明細書においてアンチ反復領域と呼ばれる、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する領域を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、二次構造（例えば、ステムループ）を有する領域を更に含むか、又はその対応するｃｒＲＮＡとハイブリダイズする際に二次構造を形成する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全に又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡの領域は、分子の５’末端にあり、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端は二次構造を含む。二次構造のこの領域は、概して、アンチ反復配列に隣接して見られるネクサスヘアピンを含むいくつかのヘアピン構造を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端には、多くの場合、構造及び数が異なり得る末端ヘアピンが存在するが、多くの場合、３’末端に、ＧＣリッチＲｈｏ非依存性転写ターミネータヘアピンと、それに続くＵのストリングとを含む。例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９，Ｂｒｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（２０１６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９０９０２、及び米国特許出願公開第２０１７／０２７５６４８号を参照のこと。各文献は参照により本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全に又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチ反復領域は、約６ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、又はそれ以上を含む。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチ反復配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列との間の塩基対形成領域は、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチ反復配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列との間の塩基対形成領域は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全に又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチ反復領域は、約１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全に又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチ反復領域は、１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡアンチ反復配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列された場合、５０％～９９％以上であり、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡアンチ反復配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列された場合、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である。
様々な実施形態では、全長ｔｒａｃｒＲＮＡは、約６０ヌクレオチド～約２１０を超えるヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、全長ｔｒａｃｒＲＮＡは、６０ヌクレオチド～２１０を超えるヌクレオチドを含む。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、又はそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、及び約１００ヌクレオチド長を含む、約１００～約２１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、及び１１０ヌクレオチド長を含む、１００～１１０ヌクレオチド長である。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成して、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的配列に指向させ結合させる。ガイドＲＮＡがＲＧＮと複合体を形成する場合、結合したＲＧＮは、標的配列に一本鎖又は二本鎖切断を導入する。標的配列の切断後、この切断が修復され得る結果、修復プロセス中に標的配列のＤＮＡ配列が修飾される。本明細書では、デアミナーゼに連結されたヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼのいずれかであるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの変異体バリアントを使用して、宿主細胞のＤＮＡ中の標的配列を修飾するための方法が提供される。ヌクレアーゼ活性が不活性化されるか、又は著しく低減されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの変異体バリアントは、標的配列に結合可能であるが、標的配列を必ずしも切断しないので、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと呼ばれ得る。二本鎖核酸分子の一本鎖のみを切断可能なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、本明細書においてニッカーゼと呼ばれる。
標的ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドによって結合され、ＲＧＤＢＰと関連するガイドＲＮＡとハイブリダイズする。次いで、標的配列は、ＲＧＤＢＰが、ニッカーゼとしての活性を包含するヌクレアーゼ活性を有する（すなわち、ＲＧＮである）場合、続いて切断することができる。
ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡであっても、二重ガイドＲＮＡシステムであってもよい。単一ガイドＲＮＡは、単一分子のＲＮＡ上にｃｒＲＮＡと任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡとを含むが、二重ガイドＲＮＡシステムは、２つの異なるＲＮＡ分子上に存在するｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部分と、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全に又は部分的に相補的であり得るｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部とを介して互いにハイブリダイズした状態で含んでいる。ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡであるいくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及び任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカーヌクレオチド配列によって分離される。
概して、リンカーヌクレオチド配列は、リンカーヌクレオチド配列のヌクレオチド内の、又はリンカーヌクレオチド配列のヌクレオチドを含む二次構造の形成を避けるために、相補的塩基を含まない配列である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間のリンカーヌクレオチド配列は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、又はそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間のリンカーヌクレオチド配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡのリンカーヌクレオチド配列は、少なくとも４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡのリンカーヌクレオチド配列は、４ヌクレオチド長である。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として標的細胞、細胞小器官、又は胚に導入され得る。ガイドＲＮＡは、インビトロで転写されても化学合成されてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、細胞、細胞小器官、又は胚に導入される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモータ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ）に作動可能に連結される。プロモータは、天然のプロモータであってもよく、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に異種であってもよい。
様々な実施形態では、ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるように、リボ核タンパク質複合体として標的細胞、細胞小器官、又は胚に導入され得、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチドに結合する。
ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡが標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることにより、関連するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを目的の特定の標的ヌクレオチド配列に向ける。標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方の組み合わせを含み得、一本鎖又は二本鎖であり得る。標的ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ（すなわち、染色体ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、又はＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ）であり得る。標的ヌクレオチド配列は、インビトロ又は細胞内でＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドによって結合され得る（いくつかの実施形態では、切断され得る）。ＲＧＤＢＰが標的とする染色体配列は、核、色素体、又はミトコンドリアの染色体配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は標的ゲノムに固有である。
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している。ＰＡＭは、概ね、標的ヌクレオチド配列から約１～約１０ヌクレオチド以内（標的ヌクレオチド配列から約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０ヌクレオチドを含む）である。特定の実施形態では、ＰＡＭは、標的ヌクレオチド配列から１～１０ヌクレオチド以内（標的ヌクレオチド配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを含む）である。ＰＡＭは、標的配列の５’側又は３’側であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは標的配列の３’側である。概ね、ＰＡＭは、約２～６ヌクレオチドのコンセンサス配列であるが、特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上のヌクレオチド長である。
ＰＡＭは標的ヌクレオチド配列に近接している必要があるため、標的化することができる所与のＲＧＤＢＰ又はＲＧＮを配列決定するＰＡＭは制限される。その対応するＰＡＭ配列を認識すると、ＲＧＮは、特定の切断部位で標的ヌクレオチド配列を切断することができる。本明細書で使用される場合、切断部位は、標的ヌクレオチド配列内の２つの特定のヌクレオチドから構成され、その間でヌクレオチド配列がＲＧＮによって切断される。切断部位は、ＰＡＭから５’又は３’方向のいずれかに向かって１番目と２番目、２番目と３番目、３番目と４番目、４番目と５番目、５番目と６番目、７番目と８番目、又は８番目と９番目のヌクレオチドを含むことができる。ＲＧＮは標的ヌクレオチド配列を切断して付着末端にすることができるため、いくつかの実施形態では、切断部位はポリヌクレオチドのプラス（＋）鎖上のＰＡＭから２ヌクレオチドの距離及びポリヌクレオチドのマイナス（－）鎖上のＰＡＭから２ヌクレオチドの距離に基づいて画定される。
ＲＧＤＢＰ及びＲＧＮを使用して、融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は低分子ペイロードを特定のゲノム位置に送達することができる。
ＤＮＡ結合ポリペプチドがメガヌクレアーゼを含む実施形態では、標的配列は、４塩基対で分離された一対の逆位９塩基対「ハーフサイト」を含むことができる。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトに接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’オーバーハングを生成する。ＤＮＡ結合ポリペプチドがコンパクトＴＡＬＥＮを含む実施形態では、認識配列は、Ｉ－ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列と、それに続く４～１６塩基対長の非特異的スペーサーと、それに続くＴＡＬエフェクタードメインによって認識される１６～２２ｂｐ長の第２の配列（この配列は典型的には５’Ｔ塩基を有する）とを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドがジンクフィンガーを含む実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、２～１０塩基対によって分離された一対の９塩基対「ハーフサイト」を含む１８ｂｐ認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端又は可変長（多くの場合４塩基対）の５’オーバーハングを生成する。
ＩＶ．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼＲＧＮ）は、本発明のデアミナーゼに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態は、本発明のデアミナーゼに融合されたＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ又はニッカーゼＲＧＮ）は、いくつかの実施形態では特定のゲノム遺伝子座である核酸分子（すなわち、標的核酸分子）の特定の位置を標的として、所望の配列の発現を変化させることができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が標的配列に結合すると、核酸塩基が脱アミノ化し、ある核酸塩基から別の核酸塩基に変換される。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質が標的配列に結合すると、標的配列に隣接する核酸塩基が脱アミノ化される。本開示の組成物及び方法を使用して脱アミノ化及び変異される標的配列に隣接する核酸塩基は、標的核酸分子内の標的配列（ｇＲＮＡによって結合される）の５’又は３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対であり得る。本開示のいくつかの態様は、（ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼＲＧＮポリペプチド）と、（ｉｉ）デアミナーゼポリペプチドと、任意選択で（ｉｉｉ）第２のデアミナーゼとを含む、融合タンパク質を提供する。第２のデアミナーゼは、第１のデアミナーゼと同じデアミナーゼであってもよく、異なるデアミナーゼであってもよい。いくつかの実施形態では、第１及び第２のデアミナーゼの両方が本発明のアデニンデアミナーゼである。
本開示は、様々な構成の融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、デアミナーゼポリペプチドは、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＧＮポリペプチド）のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼポリペプチドは、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＧＮポリペプチド）のＣ末端に融合される。
いくつかの実施形態では、デアミナーゼ及びＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド）は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。デアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド）との間のリンカーは、融合タンパク質の編集ウィンドウを決定し、それによりデアミナーゼ特異性を高め、オフターゲット変異を減少させることができる。特定の用途のためのデアミナーゼ活性に最適な長さと剛性とを達成するために、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（Ｇ）ｎの形の非常に柔軟なリンカーから（ＥＡＡＡＫ）ｎ及び（ＸＰ）ｎの形のより剛性のリンカーまで、様々なリンカー長さと柔軟性とが採用され得る。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの分子又は部分、例えば、ヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインとを連結する化学基又は分子を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとデアミナーゼとを結合する。いくつかの実施形態では、リンカーは、失活型又は不活性型ＲＧＮとデアミナーゼとを結合する。更なる実施形態では、リンカーは２つのデアミナーゼを結合する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、又は他の部分の間に配置されるかこれらに隣接し、共有結合により各々連結して、ひいては両者を連結する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１個のアミノ酸又は複数のアミノ酸（例えば、ペプチド又はタンパク質）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、又は化学部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３～１００アミノ酸長、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００アミノ酸長である。より長い又はより短いリンカーも企図される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質又はそのコード配列の全体的なサイズ又は長さを減少させるために、より短いリンカーが好ましい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、若しくは（ＸＰ）ｎモチーフ、又はこれらの任意の組み合わせを含み、式中、ｎは独立して１～３０の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０であるか、又は２つ以上のリンカー若しくは２つ以上のリンカーモチーフが存在する場合、これらの任意の組み合わせである。更なる好適なリンカーモチーフ及びリンカー構成は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態では、好適なリンカーモチーフ及び構成としては、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－６９（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる））に記載されているものが挙げられる。更なる好適なリンカー配列は、当業者に明らかである。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、配列番号４５又は４４２として示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される例示的な融合タンパク質の全般的なアーキテクチャは、構造：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；又は［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［ＣＯＯＨ］を含み、構造中、ＤＢＰはＤＮＡ結合ポリペプチドであり、ＮＨ２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、３つ以上のデアミナーゼポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される例示的な融合タンパク質の全般的なアーキテクチャは、構造：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；又は［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］を含み、構造中、ＮＨ２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、３つ以上のデアミナーゼポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、構造：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；又は［ＮＨ２］－［ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］を含む。「ヌクレアーゼ不活性型ＲＧＮ」は、ヌクレアーゼ不活性型であるように変異された任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む任意のＲＧＮを表すことが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、３つ以上のデアミナーゼポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、構造：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；又は［ＮＨ２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］を含む。「ＲＧＮニッカーゼ」は、ニッカーゼとして活性であるように変異された任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む任意のＲＧＮを表すことが理解されるべきである。
いくつかの実施形態は、上記の全般的なアーキテクチャにおいて使用される「－」は、任意選択のリンカー配列の存在を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。いくつかの実施形態では、任意選択のリンカー配列のうちの少なくとも１つが存在する。
存在し得る他の例示的な特徴部は、局在化配列、例えば、核局在化配列、細胞質局在化配列、輸送配列、例えば、核外輸送配列、又は他の局在化配列、並びに融合タンパク質の可溶化、精製、若しくは検出に有用な配列タグである。本明細書で提供される好適な局在化シグナル配列及びタンパク質タグの配列としては、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグ又はＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシン－タグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えばＳｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、及びＳＢＰタグが挙げられるが、これらに限定されない。更なる好適な配列は、当業者に明らかである。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、融合タンパク質の細胞取り込みを促進する少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含む。細胞透過性ドメインは、当技術分野で公知であり、概して、一連の正荷電アミノ酸残基（すなわち、ポリカチオン性細胞透過性ドメイン）、交互に配置された（alternating）極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基（すなわち、両親媒性細胞透過性ドメイン）、又は疎水性アミノ酸残基（すなわち、疎水性細胞透過性ドメイン）を含む（例えば、Ｍｉｌｌｅｔｔｉ Ｆ．（２０１２）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １７：８５０－８６０を参照のこと）。細胞透過性ドメインの非限定的な例は、ヒト免疫不全ウイルス１由来のトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるデアミナーゼ又は融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）を更に含む。核局在化シグナル、色素体局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、二重標的局在化シグナル、及び／又は細胞透過性ドメインを、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシル末端（Ｃ末端）、又は内部位置に配置してもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質又はデアミナーゼのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質又はデアミナーゼのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のデアミナーゼのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のデアミナーゼのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＧＮポリペプチド）のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＧＮポリペプチド）のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のデアミナーゼポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のデアミナーゼポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、１つ以上のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、リンカーなしで融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、本明細書において提供又は参照されるＮＬＳ配列のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４３又は配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質又はデアミナーゼは、そのＮ末端に配列番号４３、そのＣ末端に配列番号４６を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、デアミナーゼの全長配列、例えば、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれか１つを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、デアミナーゼの全長配列を含まず、その断片のみを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合）ドメインとデアミナーゼドメインとを更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、デアミナーゼは、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。このような融合タンパク質の例は、本明細書中の実施例の項に記載されている。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１つのデアミナーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、直接又はペプチドリンカーを介して作動可能に連結された少なくとも２つのデアミナーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は１つのデアミナーゼポリペプチドを含み、第２のデアミナーゼポリペプチドは融合タンパク質と共発現する。
また、本明細書では、デアミナーゼ及びＲＧＤＢＰを含む融合タンパク質と、単一ガイド又は二重ガイドＲＮＡ（集合的にｇＲＮＡとも呼ばれる）のいずれかであるガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質複合体が提供される。
Ｖ．デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチド
本開示は、本開示のデアミナーゼポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（配列番号１１～２０及び４４３～４８５）を提供する。本開示は更に、デアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮ）とを含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。本開示は更に、デアミナーゼドメインとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。このようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＧＮ又はＲＧＮバリアントであり得る。タンパク質バリアントは、ヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼであり得る。ＲＧＮは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアント若しくは断片であり得る。配列番号４１及び４２は、それぞれ、ＲＧＮ及びニッカーゼＲＧＮバリアントの非限定的な例である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼの例は当技術分野において周知であり、類似の対応する変異は、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ不活性型でもある変異体バリアントを作製することができる。
本発明の実施形態は、本明細書に記載のＲＧＤＢＰとデアミナーゼ（配列番号１～１０及び３９９～４４１、又はそのバリアント）とを含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、目的のヌクレオチド配列への標的化のためにＲＧＤＢＰが必要とするガイドＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び融合タンパク質は、同じポリヌクレオチドによってコードされる。
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに、本開示を限定することを意図するものではないが、そのようなＤＮＡポリヌクレオチドが企図される。当業者が認識することとして、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）並びにリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができる。このようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドには、天然に存在する分子及び合成の類似体の両方が含まれる。本明細書に開示のポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態、ステムループ構造、環状形態（例えば、環状ＲＮＡを含む）などを含むがこれらに限定されない全ての形態の配列も包含する。
本発明の一実施形態は、配列番号１１～２０及び４４３～４８５のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む核酸分子であって、アデニンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼをコードする、核酸分子である。核酸分子は、異種プロモータ又はターミネータを更に含んでもよい。核酸分子は、融合タンパク質をコードし得、コードされたデアミナーゼは、ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び任意選択で第２のデアミナーゼに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、核酸分子は融合タンパク質をコードし、コードされたデアミナーゼは、ＲＧＮ、及び任意選択で第２のデアミナーゼに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、目的の生物における発現のためにコドン最適化されている。「コドン最適化された」コード配列は、そのコドン使用頻度が特定の宿主細胞の好ましいコドン使用頻度又は転写条件を模倣するように設計された、ポリヌクレオチドコード配列である。特定の宿主細胞又は生物における発現は、翻訳されたアミノ酸配列が変化しないような核酸レベルでの１つ以上のコドンの変更の結果として強化される。核酸分子は、全体的又は部分的にコドン最適化されてもよい。広範囲の生物の優先度情報を提供するコドン表及び他の参考文献は、当技術分野で入手可能である（例えば、植物で優先されるコドン使用の考察について、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１－１１を参照のこと）。植物で優先される遺伝子を合成する方法は当技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号及び同第５，４３６，３９１号、並びにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、インビトロでの発現のための、又は目的の細胞、細胞小器官、胚、若しくは生物での発現のための発現カセット内で提供される。このカセットは、ポリヌクレオチドの発現を可能にする、本明細書で提供されるデアミナーゼ、並びに／又はデアミナーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び任意選択で第２のデアミナーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに／又はｇＲＮＡに作動可能に連結された５’及び３’制御配列を含んでもよい。このカセットは、生物に共形質転換される少なくとも１つの更なる遺伝子又は遺伝子要素を更に含んでもよい。更なる遺伝子又は要素が含まれる場合、それらの成分は作動可能に連結される。「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、プロモータと目的のコード領域（例えば、デアミナーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び／又はｇＲＮＡをコードする領域）との間の作動可能な連結は、目的のコード領域の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結された要素は、連続していてもいなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の結合を指すのに使用される場合、作動可能に連結されるとは、コード領域が同じリーディングフレーム内にあることを意図する。いくつかの実施形態では、更なる遺伝子又は要素を複数の発現カセットで提供することもできる。例えば、本開示のデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、単独で又は融合タンパク質の構成要素としてのいずれかで１つの発現カセット上に存在してもよく、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が別個の発現カセット上に存在してもよい。別の例は、第１の発現カセットに単独で本開示のデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列、デアミナーゼを含む融合タンパク質をコードする第２の発現カセット、及び第３の発現カセットにｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を有し得る。このような発現カセットは、制御領域の転写制御下におかれるポリヌクレオチドを挿入するための複数の制限部位及び／又は組換え部位を備える。選択マーカー遺伝子を含む発現カセットが存在する場合もある。
発現カセットは、転写の５’→３’方向に、転写（及びいくつかの実施形態で翻訳）開始領域（すなわちプロモータ）、本発明のデアミナーゼをコードするポリヌクレオチド、並びに目的の生物で機能する転写（及びいくつかの実施形態では翻訳）終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。本発明のプロモータは、宿主細胞においてコード配列の発現を指向又は駆動可能である。制御領域（例えば、プロモータ、転写制御領域、及び翻訳終結領域）は、宿主細胞に対して、又は互いに内因性であっても異種であってもよい。本明細書で使用される場合、配列に関する「異種」は、外来性の種に由来する配列であるか、又は同じ種に由来する場合、人為的な介入により、組成及び／又はゲノム遺伝子座中のその天然の形態から実質的に修飾されている。本明細書で使用される場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に連結されたコード配列を含む。
便利な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）のＴｉプラスミドから入手可能であり、例えばオクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終結領域である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１－６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１－１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１－１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１－７９０３；及びＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７－９６３９も参照のこと。
更なる制御シグナルとしては、転写開始部位、オペレータ、アクチベータ、エンハンサ、他の制御エレメント、リボソーム結合部位、開始コドン、終結シグナルなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，０３９，５２３号及び同第４，８５３，３３１号；欧州特許第０４８０７６２（Ａ２）号；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ １１」）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、並びにそれらに引用されている参考文献を参照のこと。
発現カセットを調製する際、適切な配向の、また必要に応じて適切なリーディングフレームのＤＮＡ配列を提供するように様々なＤＮＡ断片を操作してもよい。この目的に向けて、アダプター又はリンカーを用いてＤＮＡ断片を結合してもよいし、好都合な制限部位の提供、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などのための他の操作が関与してもよい。この目的のため、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位及び転換が関与してもよい。
本発明の実施には多くのプロモータを使用できる。プロモータは、所望の結果に基づき選択できる。核酸は、目的の生物における発現のために構成的プロモータ、誘導性プロモータ、成長段階特異的プロモータ、細胞型特異的プロモータ、組織優先的プロモータ、組織特異的プロモータ、又は他のプロモータと組み合わせることができる。例えば、国際公開第９９／４３８３８号及び米国特許第８，５７５，４２５号；同第７，７９０，８４６号；同第８，１４７，８５６号；同第８，５８６８３２号；同第７，７７２，３６９号；同第７，５３４，９３９号；同第６，０７２，０５０号；同第５，６５９，０２６号；同第５，６０８，１４９号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６０４，１２１号；同第５，５６９，５９７号；同第５，４６６，７８５号；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；同第５，６０８，１４２号；及び同第６，１７７，６１１号（参照により本明細書に組み込まれる）に示されるプロモータを参照のこと。
植物での発現の場合、構成的プロモータとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０－８１２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３－１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９－６３２及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１－５８８）；並びにＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３－２７３０）も挙げられる。
誘導性プロモータの例は、低酸素又は低温ストレスにより誘導されるＡｄｈ１プロモータ、熱ストレスにより誘導されるＨｓｐ７０プロモータ、いずれも光により誘導されるＰＰＤＫプロモータ及びＰＥＰカルボキシラーゼプロモータである。化学的に誘導可能なプロモータ、例えば、より安全に誘導されるＩｎ２－２プロモータ（米国特許第５，３６４，７８０号）、オーキシン誘導性でタペータム特異的でありカルスでも活性なＡｘｉｇ１プロモータ（国際出願ＵＳ第０１／２２１６９号）、ステロイド応答性プロモータ（例えば、エストロゲン誘導性であるＥＲＥプロモータ、並びにＳｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１－１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７－２５７の糖質コルチコイド誘導性プロモータを参照のこと）、並びにテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモータ（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９－２３７及び米国特許第５，８１４，６１８号及び同第５，７８９，１５６号を参照のこと）も有用である。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、組織特異的又は組織優先的プロモータを利用して特定の組織内での発現構築物の発現を標的化する。ある特定の実施形態では、組織特異的又は組織優先的プロモータは植物組織において活性である。植物の発達制御下にあるプロモータの例としては、特定の組織、例えば葉、根、果実、種子、又は花で優先的に転写を開始するプロモータが挙げられる。「組織特異的」プロモータは、特定の組織でのみ転写を開始するプロモータである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの相互作用するレベルの遺伝子制御の結果である。したがって、相同の又は密接に関連する植物種由来のプロモータを、特定の組織における導入遺伝子の効率的かつ信頼性の高い発現を達成するために、使用することが好ましい場合がある。いくつかの実施形態では、発現は、組織優先的プロモータを含む。「組織優先的」プロモータは、転写を特定の組織で優先的に開始するが、必ずしも全面的に特定の組織の中で、又は特定の組織の中だけで転写を開始するのではないプロモータである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデアミナーゼをコードする核酸分子は、細胞型特異的プロモータを含む。「細胞型特異的」プロモータは、１つ以上の器官内の特定の細胞型での発現を主に駆動するプロモータである。植物で機能する細胞型特異的プロモータが主に活性であり得る植物細胞のいくつかの例としては、例えば、ＢＥＴＬ細胞、根、葉、茎細胞の維管束細胞、及び幹細胞が挙げられる。核酸分子は、細胞型優先的プロモータも含み得る。「細胞型優先的」プロモータは、大部分は１つ以上の器官内の特定の細胞型での発現を主に駆動するが、必ずしも全面的に特定の細胞型の中で、又は特定の細胞型の中だけで発現を駆動するのではないプロモータである。植物で機能する細胞型優先的プロモータが優先的に活性であり得る植物細胞のいくつかの例としては、例えば、ＢＥＴＬ細胞、根、葉、茎細胞の維管束細胞、及び幹細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードする核酸配列は、例えばインビトロでのｍＲＮＡ合成のために、ファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモータ配列に作動可能に連結される。このような実施形態では、インビトロで転写されたＲＮＡを本明細書に記載の方法に用いるために精製してもよい。例えば、プロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３、若しくはＳＰ６プロモータ配列、又はＴ７、Ｔ３、若しくはＳＰ６プロモータ配列の変形であってもよい。そのような実施形態では、発現したタンパク質及び／又はＲＮＡを本明細書に記載のゲノム修飾の方法に用いるために精製してもよい。
ある特定の実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル及び植物で機能するその他のシグナル）及び／又は少なくとも１つの転写終結配列に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書の他の場所に記載するように、デアミナーゼ又は融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、及び／又はタンパク質を特定の細胞内位置に輸送可能な少なくとも１つのシグナルペプチドをコードする配列に連結される。
いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、１つ又は複数のベクター中に存在する。「ベクター」は、核酸を宿主細胞に移入、送達、又は導入するためのポリヌクレオチド組成物を指す。好適なベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、更なる発現制御配列（例えば、エンハンサ配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含む。更なる情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３又は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞又は組織の選択に利用される。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、並びに除草剤化合物、例えば、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、及び２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）への耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＲＧＮなどのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする配列を含む発現カセット又はベクターは、ｇＲＮＡをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする配列は、目的の生物又は宿主細胞においてｇＲＮＡを発現させるために少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。例えば、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識されるプロモータ配列に作動可能に連結されてもよい。好適なＰｏｌ ＩＩＩプロモータの例としては、哺乳動物のＵ６、Ｕ３、Ｈ１、及び７ＳＬ ＲＮＡプロモータ、並びにイネＵ６及びＵ３プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
記載のように、デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を用いて、目的の生物を形質転換できる。形質転換の方法は、ヌクレオチド構築物を目的の生物に導入することを伴う。「導入する」とは、宿主細胞の内部に到達できるようにヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入することを意味する。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を宿主生物に導入するための特定の方法を必要とせず、ヌクレオチド構築物が宿主生物の少なくとも１つの細胞の内部に到達できることだけを必要とする。宿主細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。特定の実施形態では、真核宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、又は昆虫細胞である。ヌクレオチド構築物を植物及び他の宿主細胞に導入するための方法は当技術分野で公知であり、安定形質転換法、一過性形質転換法、及びウイルス媒介法が挙げられるが、これらに限定されない。
この方法により、植物、例えば、植物全体、並びに植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚、及びその子孫などの形質転換された生物が得られる。植物細胞は、分化していても未分化であってもよい（例えば、カルス、懸濁培養細胞、原形質体、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。
「トランスジェニック生物」又は「形質転換生物」又は「安定に形質転換された」生物又は細胞又は組織は、本発明のデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドが組み込まれた又は統合された生物を指す。他の外因性又は内因性の核酸配列又はＤＮＡ断片も宿主細胞の中に組み込まれ得ることが認識されている。アグロバクテリウム及びバイオリスティックを介した形質転換は、依然として植物細胞の形質転換に主に採用されている２つの手法である。しかし、宿主細胞の形質転換を、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、マイクロプロジェクション、バイオリスティック又はパーティクルガン法、電気穿孔、シリカ／カーボンファイバー、超音波媒介、ＰＥＧ媒介、リン酸カルシウム共沈殿、ポリカチオンＤＭＳＯ技術、ＤＥＡＥデキストラン法、及びウイルス媒介、リポソーム媒介などにより実行してもよい。デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのウイルス媒介導入としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス媒介性の導入及び発現、並びにカリモウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス）、ジェミニウイルス（例えば、ビーンゴールデンイエローモザイクウイルス又はトウモロコシ縞葉枯病ウイルス）、及びＲＮＡ植物ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス）の使用が挙げられる。
形質転換プロトコル、並びにポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の対象となる宿主細胞（例えば、単子葉植物又は子葉植物細胞）の型に応じて変更してもよい。形質転換の方法は当技術分野で知られており、米国特許第８，５７５，４２５号；同第７，６９２，０６８号；同第８，８０２，９３４号；同第７，５４１，５１７号（各文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。Ｒａｋｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ，Ｍ．（２００２）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．７：８４９－８５８；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：５；Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９：３０８－３４５；Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１－１２；Ｂａｔｅｓ，Ｇ．Ｗ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１１：３５９－３６６；Ｂｉｎｎｓ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ（１９８８）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４２：５７５－６０６；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２：２７５－２８１；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．（１９９５）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５：１３－２７；Ｔｚｆｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：３７５－３８３；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ ５７：３７３７－３７４６；Ｚｕｐａｎ ａｎｄ Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７：１０４１－１０４７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：５も参照のこと。
形質転換により、細胞の中に核酸を安定に、又は一過性に組み込むことができる。「安定な形質転換」は、宿主細胞に導入されたヌクレオチド構築物が宿主細胞のゲノムに統合され、その子孫によって遺伝させることが可能であることを意味するものと意図される。「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入され、宿主細胞のゲノムに統合されないことを意味するものと意図される。
葉緑体の形質転換のための方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６－８５３０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３－９１７；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１－６０６を参照のこと。この方法は、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクルガン送達と、相同組換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。それに加え、色素体の形質転換は、核にコードされた色素体指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現により、色素体を運ぶサイレントな導入遺伝子をトランス活性化することによって達成できる。このようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１－７３０５に報告されている。
形質転換された細胞を、従来の方法に従ってトランスジェニック生物、例えば植物に成長させてもよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４を参照のこと。次に、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株又は異なる株でいずれでも受粉させ、デアミナーゼ又は融合タンパク質ポリヌクレオチドを有するハイブリッドを同定してもよい。デアミナーゼ又は融合タンパク質ポリヌクレオチドが安定に維持され、遺伝されることを確実にするために２世代以上を成長させ、デアミナーゼ又は融合タンパク質ポリヌクレオチドの存在を確実にするために種子を回収してもよい。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、本発明の発現カセットがそのゲノムに安定して組み込まれた、形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）を提供する。
いくつかの実施形態では、形質転換された細胞は生物に導入される。これらの細胞はその生物に由来してもよく、これらの細胞は生体外アプローチで形質転換される。
本明細書で提供される配列を、単子葉植物及び双子葉植物を含むがこれらに限定されない任意の植物種の形質転換に用いてもよい。目的の植物の例としては、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナ、ブラシカ属（Brassica）、アルファルファ、ライムギ、雑穀（millet）、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、カカオ（cocoa）、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞用植物、並びに針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。
野菜としては、トマト、レタス、サヤインゲン、ライマメ、エンドウマメ、並びにキュウリ属に属する、例えば、キュウリ、カンタロープ、及びマスクメロンが挙げられるが、これらに限定されない。観賞用植物としては、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の植物は、作物植物（例えば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど）である。
本明細書で使用される場合、植物という用語は、植物細胞、植物原形質体、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物の一部（例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯など）でインタクトである植物細胞を包含する。穀物は、種の栽培又は繁殖以外の目的で商業栽培者により生産された成熟種子を意味するものと意図される。再生植物の子孫、バリアント、及び変異体も、これらの部分が導入ポリヌクレオチドを含むという条件で、本発明の範囲内に含まれる。更に、本明細書に開示の配列を保持する加工された植物製品又は副産物（例えば、大豆粕が挙げられる）も提供される。
いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、魚、鳥、及び爬虫類）、真菌、アメーバ、藻類、及び酵母が挙げられるが、これらに限定されない任意の真核生物種を形質転換するために使用される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、古細菌及び細菌（例えば、バシラス属（Bacillus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、リゾビウム属（Rhizobium）、エシェリヒア属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、ビブリオ属（Vibrio）、エルシニア属（Yersinia）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、及びラクトバシラス属（Lactobacillus））が挙げられるが、これらに限定されない任意の原核生物種を形質転換するために使用される。
いくつかの実施形態では、従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入法を用いて、哺乳動物細胞又は標的組織に核酸を導入する。このような方法を用いて、本発明のデアミナーゼ又は融合タンパク質をコードする核酸と、任意選択でｇＲＮＡとを、培養中の細胞又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、裸の（ｎａｋｅｄ）核酸、及び送達媒体（例えば、リポソーム）と複合体化された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームゲノム又は統合されたゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。非限定的な例としては、カリモウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス）、ジェミニウイルス（例えば、ビーンゴールデンイエローモザイクウイルス又はトウモロコシ縞葉枯病ウイルス）、及びＲＮＡ植物ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス）を利用するベクターが挙げられる。遺伝子療法手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８－８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｉｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照のこと。
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤増強取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際公開第９１／１７４２４号：国際公開第９１／１６０２４号のものが挙げられる。送達は、細胞に対して（例えば、インビトロ又は生体外投与）であっても標的組織に対して（例えば、生体内投与）であってもよい。免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４０４－４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、及び同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接（生体内）投与してもよいし、それらを用いて細胞をインビトロで処理し、修飾細胞を任意選択で患者に（生体外）投与してもよい。従来のウイルスに基づくシステムには、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。更に、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が確認された。
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入又は感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価を生じる。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列をパッケージする容量を有するシス作用性の長い末端反復配列で構成されている。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、次に、それを用いて治療用遺伝子を標的細胞に統合し、永続的に導入遺伝子を発現させる。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクター、及びその組み合わせが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）；国際出願ＵＳ第９４／０５７００号を参照のこと）。
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用してもよい。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いると、高い力価及び発現レベルが得られた。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に作製可能である。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを用いて標的核酸を、例えば核酸及びペプチドのインビトロ産生において、生体内及び生体外遺伝子療法手順のために、細胞に形質導入してもよい（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号；Ｋａｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は多数の刊行物に記載されており、これには米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）が挙げられる。パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染可能なウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞と、レトロウイルスをパッケージするΨＪ２細胞又はＰＡ３１７細胞とが挙げられる。
遺伝子療法で用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする細胞株を作製することにより生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びその後の宿主への統合に必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、ポリヌクレオチドが発現されるための発現カセットで置き換えられる。失われるウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば遺伝子療法で用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノムへの統合に必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージされる。
また、細胞株を、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させてもよい。ヘルパーウイルスプロモータは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列がないため、大量にはパッケージされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。細胞への核酸の送達のための更なる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２００３００８７８１７号を参照のこと。
いくつかの実施形態では、宿主細胞に本明細書に記載の１つ以上のベクターを一過性又は非一過性にトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、対象で自然に起こるのと同様にして細胞にトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。
いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物細胞（例えば、哺乳動物、昆虫、魚、鳥、及び爬虫類）である。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、造血系由来の細胞、例えば免疫細胞（すなわち、自然免疫系又は適応免疫系の細胞）（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない）、多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、対象から採取された細胞、例えば細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞株は原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞株は真核細胞である。更なる実施形態では、細胞又は細胞株は、昆虫、鳥類、植物、又は真菌類に由来する。いくつかの実施形態では、細胞又は細胞株は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ハムスター、ラット、ネコ、又はイヌであり得る。組織培養のための多種多様な細胞株が当技術分野で公知である。細胞株の例としては、限定されないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈｌ、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ－３、ＴＦｌ、ＣＴＬＬ－２、ＣＩＲ、Ｒａｔ６、ＣＶＩ、ＲＰＴＥ、ＡｌＯ、Ｔ２４、１８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕｌ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ｌｕｒｋａｔ、１４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌｌ、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－Ｉ細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔｌ／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋｌ、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３５０１０、ＣＯＲＬ２３／ Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔｌ、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａｌｃｌｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、ｌｕｒｋａｔ、ｌＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧｌ、ＫＹＯｌ、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－ｌ０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ ６、ＭＴＤ－ｌＡ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－ｌＡ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰｌ細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びこれらのトランスジェニックな変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々の供給源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターでトランスフェクトされた細胞を用いて、１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞株を設ける。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質及び任意選択でｇＲＮＡ、又は本発明のリボ核タンパク質複合体で一過性にトランスフェクトされ、融合タンパク質又はリボ核タンパク質複合体の活性により修飾された細胞を用いて、修飾を含むが他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞株を設ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターで一過性若しくは非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はそのような細胞に由来する細胞株を、１つ以上の試験化合物を評価するのに用いる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターを用いて非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を作製する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は昆虫である。更なる実施形態では、昆虫は、蚊又はダニなどの害虫である。いくつかの実施形態では、昆虫は、コーンルートワーム又はフォールアーミーワームなどの植物害虫である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、トリ、例えばニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、又はアヒルである。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、類人猿、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、又はイヌなどの哺乳動物である。
ＶＩ．ポリペプチド及びポリヌクレオチドのバリアント及び断片
本開示は、ＤＮＡ分子に対して活性である新規なアデニンデアミナーゼ（そのアミノ酸配列は配列番号１～１０及び３９９～４４１として示される）、その活性バリアント又は断片、及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
バリアント又は断片の活性は、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較して変化していてもよいが、バリアント及び断片は、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能性を保持している必要がある。例えば、バリアント又は断片は、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較して増した活性、減少した活性、異なる活性範囲、又は他の任意の活性の変化を有し得る。
アデニンデアミナーゼ活性を有する本発明のデアミナーゼの断片及びバリアントは、それらがＤＮＡ結合ポリペプチド又はその断片を更に含む融合タンパク質の一部である場合、上記の活性を保持する。
「断片」という用語は、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部を指す。「断片」又は「生物学的に活性な部分」には、生物学的活性（すなわち、核酸に対するデアミナーゼ活性）を保持するのに十分な数の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれる。「断片」又は「生物学的に活性な部分」には、生物学的活性を保持するのに十分な数の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドが含まれる。本明細書に開示のデアミナーゼの断片には、代替の下流開始部位を使用することにより、全長配列よりも短いものが含まれる。いくつかの実施形態では、デアミナーゼの生物学的に活性な部分は、例えば、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかの、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０又はそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである。このような生物学的に活性な部分を組換え技術によって調製し、活性について評価してもよい。
概して、「バリアント」は、実質的に同様の配列を意味するものと意図される。ポリヌクレオチドの場合、バリアントは、天然のポリヌクレオチド内の１つ以上の内部部位に１個以上のヌクレオチドの欠失及び／若しくは付加、並びに／又は天然のポリヌクレオチド内の１つ以上の部位に１個以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用される場合、「天然の」又は「野生型」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合、保存的バリアントは、遺伝暗号の縮重により、目的の遺伝子の天然のアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらなどの天然に存在するアレルバリアントは、分子生物学の周知の技術（例えば以下に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術）を用いて同定することができる。バリアントポリヌクレオチドには、合成的に誘導されたポリヌクレオチド、例えば、部位指向的変異誘発を用いて作製されたが目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドを依然としてコードするものも含まれる。概ね、本明細書に開示の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定される、その特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。
本明細書に開示の特定のポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）のバリアントは、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性を比較して評価することもできる。任意の２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラム及びパラメータを用いて計算可能である。本明細書に開示の任意の所与のポリヌクレオチド対は、それらがコードする２つのポリペプチドが共有するパーセント配列同一性を比較して評価される場合、２つのコードされるポリペプチド間のパーセント配列同一性は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性である。
特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むアデニンデアミナーゼをコードする。
本発明のアデニンデアミナーゼの生物学的に活性なバリアントは、わずか１～１５個のアミノ酸残基、わずか１～１０個、例えば、６～１０個、わずか５個、わずか４個、わずか３個、わずか２個、又はわずか１個のアミノ酸残基が異なってもよい。特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端の短縮を含み、ポリペプチドのＮ又はＣ末端のいずれかから少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、又はそれ以上のアミノ酸の欠失を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、又はそれ以上のアミノ酸の欠失を含み得る内部欠失を含む。
本明細書で提供されるデアミナーゼを修飾し、バリアントタンパク質及びポリヌクレオチドを作製できることが認識されている。人によって設計された変化は、部位指向的変異誘発技術を適用することによって導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列に構造的及び／又は機能的に関連する未知又は未同定の天然のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドも、本発明の範囲内にあると同定され得る。アデニンデアミナーゼとしてのポリペプチドの機能を変化させない保存的アミノ酸置換を、非保存領域で行ってもよい。いくつかの実施形態では、デアミナーゼのアデニンデアミナーゼ活性を改善する修飾が行われる。
バリアントポリヌクレオチド及びタンパク質は、変異誘発及び組換え誘発技術、例えば、ＤＮＡシャッフリングから得られる配列及びタンパク質も包含する。このような手順を用いて、本明細書に開示の１つ以上の異なるデアミナーゼ（例えば、配列番号１～１０及び３９９～４４１）を操作して所望の特性を有する新たなアデニンデアミナーゼを作製する。このようにして、実質的な配列同一性を有し、インビトロ又は生体内で相同的に組み換えられ得る配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集合から、組換えポリヌクレオチドのライブラリーを作製する。例えば、この手法を用いて、目的のドメインをコードする配列モチーフを本明細書で提供されるデアミナーゼ配列と他の後で同定されたデアミナーゼ遺伝子との間でシャッフルし、目的の特性が改善された、例えば、酵素の場合Ｋｍが増加したタンパク質をコードする新たな遺伝子を得てもよい。このようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７－１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９－３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６－４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６－３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４－４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８－２９１；並びに米国特許第５，６０５，７９３号及び同第５，８３７，４５８号を参照のこと。「シャッフルされた」核酸は、本明細書に記載の任意のシャッフリング手順などのシャッフリング手順で作製される核酸である。シャッフルされた核酸は、２種以上の核酸（又は文字列）を例えば人工的、任意選択で再帰的な方法で組み換える（物理的又は事実上）ことにより作製される。概して、シャッフリングプロセスでは１以上のスクリーニング工程を用いて目的の核酸を同定する。このスクリーニング工程は、任意の組換え工程の前又は後に行うことができる。シャッフリングのいくつかの（全てではない）実施形態では、選択の前に複数回の組換えを行い、スクリーニングされるプールの多様性を高めることが望ましい。組換え及び選択のプロセス全体を任意選択で再帰的に繰り返す。状況に応じて、シャッフリングは、組換え及び選択の全体的なプロセスを指す場合もあれば、あるいは単に、全体的なプロセスのうちの組換え部分を指す場合もある。
本明細書で使用される場合、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたり最大に対応するようアラインメントした場合に同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して用いられる場合、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが多く、この場合、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に置換されており、したがって、その分子の機能的特性は変化しないと認識されている。配列が保存的置換で異なる場合、置換の保存的性質に合わせて修正されるようにパーセント配列同一性を上方に調整してもよい。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調節を行なうための手段は当業者に周知である。典型的には、この手段は、保存的置換を完全不一致ではなく部分不一致としてスコアリングし、それにより配列同一性のパーセンテージを上げることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１が与えられ、非保存的置換にはスコア０が与えられる場合、保存的置換には０～１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実施されたように計算される。
本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」とは、最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウにわたり比較することにより求められる値を意味し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出する。
特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性／類似性の値は、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を用いて得られる値（以下のパラメータを用いる：ヌクレオチド配列の％同一性及び％類似性については、ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ５０、Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用；アミノ酸配列の％同一性及び％類似性については、ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ８、Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）、又はこれと同等な任意のプログラムを用いて得られる値を指す。「同等なプログラム」では、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０により生成された対応するアラインメントと比較した場合に、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムが意図される。
２つの配列が「最適にアラインメントされる」のは、類似性スコアに関して、所定のアミノ酸置換マトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップ存在ペナルティ、及びギャップ延長ペナルティを用い、そのペアの配列に関して可能な最高スコアに到達するようにアラインメントされたときである。アミノ酸置換マトリックスと、２つの配列の間の類似性を定量化するのにそれを利用することは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」（「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，」Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３（ｅｄ．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ）中），ｐｐ．３４５－３５２．Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９に記載されている。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスは、配列アラインメントプロトコルにおけるデフォルトのスコアリング置換マトリックスとして使用されることが多い。ギャップ存在ペナルティは、アラインメントされた配列の１つに単一のアミノ酸ギャップを導入する場合に課され、ギャップ延長ペナルティは、既に設けられているギャップの中に各々の追加の空のアミノ酸位置を導入する場合に課される。アラインメントは、アラインメントが開始され、終了する各配列のアミノ酸位置によって画定され、任意選択で、可能な最も高いスコアに到達するように一方又は両方の配列に１つ又は複数のギャップを挿入することで画定される。最適なアラインメント及びスコアリングは手作業で実現することができるが、このプロセスはコンピュータに実装されたアラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公衆に利用可能になったギャップ付きＢＬＡＳＴ ２．０を用いると容易になる。複数のアラインメントを含む最適なアラインメントは、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから利用可能であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２により記載されているＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを用いて準備してもよい。
参照配列と最適にアラインメントされたアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基は、アラインメントにおいて残基が対をなす参照配列中の位置に「対応する」。「位置」は、Ｎ末端に対するその位置に基づいて、参照配列中の各アミノ酸を順次同定する番号で表される。最適なアラインメントを決定する場合に考慮すべき欠失、挿入、短縮、融合などのため、概して、Ｎ末端から単純に数えることによって求められる試験配列のアミノ酸残基の番号は必ずしも参照配列内のその対応する位置の番号と同じではない。例えば、アラインメントされた試験配列に欠失がある場合、その欠失部位には参照配列中の位置に対応するアミノ酸はない。アラインメントされた参照配列内に挿入がある場合、その挿入は、参照配列内のいずれのアミノ酸位置にも対応しない。短縮又は融合の場合、参照配列又アラインメントされた配列のいずれかに、対応する配列内のいずれのアミノ酸にも対応しない一連のアミノ酸が存在し得る。
ＶＩＩ．抗体
本発明の、デアミナーゼ、デアミナーゼ（配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれか１つとして示されるアミノ酸配列を有するもの又はその活性バリアント若しくは断片を含む）を含む融合タンパク質又はリボ核タンパク質に対する抗体も包含される。抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；及び米国特許第４，１９６，２６５号を参照のこと）。これらの抗体は、本明細書に記載の、デアミナーゼ、又はデアミナーゼを含む融合タンパク質若しくはリボ核タンパク質の検出及び単離のためのキットで用いることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド又はリボ核タンパク質（例えば、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかに対して少なくとも８５％の同一性の配列を含むポリペプチドを含む）に特異的に結合する抗体を含む、キットを提供する。
ＶＩＩＩ．目的の標的配列に結合及び／又はこれを修飾するためのシステム及びリボ核タンパク質複合体並びにその作製方法
本開示は、核酸配列を標的化し、標的核酸配列を修飾するシステムを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＧＮなどのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド及びｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体を目的の核酸配列に標的化することに関与する。ＲＧＤＢＰに融合されたデアミナーゼポリペプチドは、標的核酸配列をＡ＞Ｎから修飾することに関与する。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはＡ＞Ｇに変換する。ガイドＲＮＡは、目的の標的配列にハイブリダイズし、更にＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと複合体を形成し、それによりＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを標的配列に指向させる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、融合タンパク質の１つのドメインであり、第２のドメインは、本明細書に記載のデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓ９などのＲＧＮである。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドの他の例としては、国際公開第２０１９／２３６５６６号及び同第２０２０／１３９７８３号に記載のものなどのＲＧＮが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、又はその活性バリアント若しくは断片である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、又はその活性バリアント若しくは断片である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はメガヌクレアーゼポリペプチドは、ＲＮＡガイドを必要としない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインのヌクレアーゼ活性は、部分的又は完全に不活性化されている。更なる実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４１）などのＲＧＮのアミノ酸配列、又はニッカーゼｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４２）若しくは実施例に記載の他のニッカーゼＲＧＮバリアント（配列番号５２～５９、６１、３９７、及び３９８）などのその活性バリアント若しくは断片を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される目的の標的配列に結合及び／又はこれを修飾するためのシステムは、少なくとも１種のタンパク質に結合した少なくとも１分子のＲＮＡであるリボ核タンパク質複合体である。本明細書で提供されるリボ核タンパク質複合体は、ＲＮＡ成分として少なくとも１つのガイドＲＮＡと、タンパク質成分として本発明のデアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質とを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、融合タンパク質及びガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドで形質転換され、融合タンパク質及びガイドＲＮＡの発現を可能にする条件下で培養された細胞又は生物から精製される。
様々な実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかと、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質複合体が提供される。例えば、本明細書では、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼとの融合タンパク質を含む、リボ核タンパク質複合体が提供される。別の例では、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼとの融合タンパク質を含む、リボ核タンパク質複合体が提供される。更に別の例では、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼとの融合タンパク質を含む、リボ核タンパク質複合体が提供される。上記のリボ核タンパク質複合体のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られていた）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＣａｓＭＩＮＩ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮから選択される、ＲＧＮを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合された、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合された、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合された、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、配列番号４０７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、配列番号３９９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、配列番号４０５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼを含む。Ｃａｓ９ニッカーゼは、国際公開第２０２０１８１１９５号（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＣａｓ９ニッカーゼであってもよい。本明細書に記載の様々な実施形態では、リボ核タンパク質複合体はまた、本明細書に記載のｇＲＮＡを含んでもよい。
デアミナーゼ、融合タンパク質、又は融合タンパク質リボ核タンパク質複合体を作製するための方法が提供される。そのような方法は、デアミナーゼ又は融合タンパク質（及びいくつかの実施形態ではガイドＲＮＡ）が発現される条件下で、デアミナーゼ、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（及びいくつかの実施形態ではガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列）を含む細胞を培養することを含む。次いで、デアミナーゼ、融合タンパク質、又は融合リボ核タンパク質を、培養細胞の溶解物から精製してもよい。
生体試料の溶解物からデアミナーゼ、融合タンパク質、又は融合リボ核タンパク質複合体を精製する方法は、当技術分野で知られている（例えば、サイズ排除及び／又はアフィニティークロマトグラフィー、２Ｄ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー、免疫沈降）。特定の方法では、デアミナーゼ又は融合タンパク質は組換えにより作製され、その精製を助ける精製用タグを含む。これには、限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。概して、タグ付きデアミナーゼ、融合タンパク質、又は融合リボ核タンパク質複合体は、免疫沈降又は当技術分野で知られている他の類似の方法を用いて精製される。
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド、又はその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出されるように、ポリペプチドに通常付随する、又はポリペプチドと相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない。したがって、単離された又は精製されたポリペプチドは、組換え技術によって生成される場合、他の細胞物質若しくは培養培地を実質的に含まず、又は化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、３０重量％未満、２０重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、又は１重量％未満（乾燥重量で）の夾雑タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質又はその生物学的に活性な部分を組換えにより作製する場合、最適な培養培地は、３０重量％未満、２０重量％未満、１０％重量未満、５％重量未満、又は１重量％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体又は目的のタンパク質以外の化学物質に相当する。
目的の標的配列に結合及び／又はそれを切断するために本明細書で提供される特定の方法は、リボ核タンパク質複合体の使用を伴う。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、インビトロで構築される。リボ核タンパク質複合体のインビトロでの構築は、ＲＧＤＢＰポリペプチド又はそれを含む融合タンパク質がガイドＲＮＡに結合することを可能にする条件下で、ＲＧＤＢＰポリペプチド又はそれを含む融合タンパク質をガイドＲＮＡと接触させる当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。本明細書で使用される場合、「接触」、「接触させる」、「接触した」は、所望の反応を行うのに適した条件下で所望の反応の成分を一緒に配置することを指す。標的ＤＮＡ分子を修飾するための記載の方法のいくつかの実施形態では、接触工程はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、接触工程は生体内で行われる。いくつかの実施形態では、接触工程は、対象（例えば、ヒト対象又は非ヒト動物対象）において行われる。いくつかの実施形態では、接触工程は、細胞、例えば、ヒト又は非ヒト動物細胞において行われる。ＲＧＤＢＰポリペプチド又はそれを含む融合タンパク質は、生体試料、細胞溶解物、又は培養培地から精製されてもよいし、インビトロでの翻訳により作製されてもよいし、化学的に合成されてもよい。ガイドＲＮＡは、生体試料、細胞溶解物、又は培養培地から精製されてもよいし、インビトロで転写されてもよいし、化学的に合成されてもよい。ＲＧＤＢＰポリペプチド又はそれとガイドＲＮＡを含む融合タンパク質を溶液（例えば、緩衝生理食塩水溶液）中で接触させてリボ核タンパク質複合体をインビトロで構築してもよい。
ＩＸ．標的配列の修飾方法
本開示は、目的の標的核酸分子（例えば、標的ＤＮＡ分子）を修飾するための方法を提供する。この方法は、ＤＮＡ結合ポリペプチドと、少なくとも１つの本発明のデアミナーゼ又はそれをコードするポリヌクレオチドとを含む融合タンパク質を、標的配列、又は標的配列を含む細胞、細胞小器官、若しくは胚に送達することを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡ又はそれをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも１つの本発明のデアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質とを含むシステムを、標的配列、又は標的配列を含む細胞、細胞小器官、若しくは胚に送達することを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１～１０及び３９９～４４１のアミノ酸配列のいずれか１つ、又はその活性バリアント若しくは断片を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＤＮＡ分子を、（ａ）デアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼＣａｓ９ドメインなど）を含む融合タンパク質、並びに（ｂ）（ａ）の融合タンパク質をＤＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列に標的化するｇＲＮＡと接触させることを含み、ＤＮＡ分子は、核酸塩基の脱アミノ化に有効な量及び適した条件下で、融合タンパク質及びｇＲＮＡと接触する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子は、疾患又は障害に関連する配列を含み、核酸塩基の脱アミノ化により、疾患又は障害に関連しない配列が得られる。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は動物に影響を及ぼす。更なる実施形態では、疾患又は障害は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ラット、マウス、又はハムスターなどの哺乳動物に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、作物植物のアレルに存在し、目的の形質の特定のアレルは、農業的価値の低い植物をもたらす。核酸塩基の脱アミノ化により、その形質を改善するアレルが得られ、その植物の農業的価値が上昇する。
方法がガイドＲＮＡ及び／又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することを含む実施形態では、細胞又は胚を、その後、ガイドＲＮＡ及び／又は融合タンパク質が発現される条件下で培養してもよい。様々な実施形態では、この方法は、標的配列をｇＲＮＡ及び融合タンパク質（本発明のデアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとを含む）を含むリボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、標的配列を含む細胞、細胞小器官、又は胚に本発明のリボ核タンパク質複合体を導入することを含む。本発明のリボ核タンパク質複合体は、本明細書に記載のように、生体試料から精製されたもの、組換えにより作製された後に精製されたもの、又はインビトロで構築されたものであってもよい。標的配列、細胞、細胞小器官、又は胚と接触するリボ核タンパク質複合体がインビトロで構築された実施形態では、この方法は、更に、この複合体をインビトロで構築した後に、標的配列、細胞、細胞小器官、又は胚と接触させることを含むことができる。
精製された又はインビトロで構築された本発明のリボ核タンパク質複合体を、当技術分野で公知の任意の方法（エレクトロポレーションが挙げられるがこれに限定されない）を用いて、細胞、細胞小器官、又は胚に導入することができる。いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと、ガイドＲＮＡをコードするか又はそれを含むポリヌクレオチドとを含む融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、エレクトロポレーション）を用いて、細胞、細胞小器官、又は胚に導入される。
標的配列、又は標的配列を含む細胞、細胞小器官、若しくは胚に送達されるか接触すると、ガイドＲＮＡは、配列特異的に融合タンパク質を標的配列に指向させ結合させる。続いて、融合タンパク質のデアミナーゼドメインを介して標的配列が修飾され得る。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質の標的配列への結合により、標的配列に隣接するヌクレオチドの修飾がもたらされる。デアミナーゼによって修飾される標的配列に隣接する核酸塩基は、標的配列の５’又は３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対であり得る。本発明のデアミナーゼ及びＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、標的ＤＮＡ分子に標的化Ａ＞Ｎ、好ましくは標的化Ａ＞Ｇ変異を導入することができる。
標的ＤＮＡ分子を修飾する記載の方法のいくつかの実施形態では、接触工程はインビトロで行われる。特定の実施形態では、接触工程は生体内で行われる。いくつかの実施形態は、接触工程は、対象（例えば、ヒト対象又は非ヒト動物対象）において行われる。いくつかの実施形態では、接触工程は、細胞、例えば、ヒト又は非ヒト動物細胞において行われる。
融合タンパク質の標的配列への結合を測定する方法は当技術分野で知られており、クロマチン免疫沈降アッセイ、ゲル移動度シフトアッセイ、ＤＮＡプルダウンアッセイ、レポーターアッセイ、マイクロプレート捕捉・検出アッセイが挙げられる。同様に、標的配列の切断又は修飾を測定する方法は当技術分野で知られており、分解産物の検出を容易にするために、適切な標識（例えば、放射性同位体、蛍光物質）を標的配列に付着させて、又は付着させずに、ＰＣＲ、シークエンシング、又はゲル電気泳動を用いて切断を確認するインビトロ又はインビボ切断アッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、ニッキング誘発指数関数的増幅反応（ＮＴＥＸＰＡＲ）アッセイが使用される（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７：４９５１－４９５７を参照のこと）。生体内切断は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７－２５６）を用いて評価してもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、融合タンパク質の一部として、２つ以上のガイドＲＮＡと複合体化されたＲＮＡ結合ＤＮＡ誘導型ドメインの使用を伴う。２つ以上のガイドＲＮＡは、単一の遺伝子の異なる領域を標的としてもよいし、複数の遺伝子を標的としてもよい。この複数の標的化により、融合タンパク質のデアミナーゼドメインが核酸を修飾することが可能となり、それにより、目的の標的核酸分子（例えば、ゲノム）に複数の変異が導入される。
方法がＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、例えばニッカーゼＲＧＮ（すなわち、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖のみを切断可能。例えばｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４２又は配列番号５０～５７）の使用を伴う実施形態では、この方法は、同一又は重複する標的配列を標的化することと、ポリヌクレオチドの異なる鎖を切断する２つの異なるＲＧＮ又はＲＧＮバリアントを導入することとを含んでもよい。例えば、二本鎖ポリヌクレオチドのプラス（＋）鎖のみを切断するＲＧＮニッカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドのマイナス（－）鎖のみを切断する第２のＲＧＮニッカーゼと共に導入することができる。いくつかの実施形態では、２つの異なる融合タンパク質が提供され、各融合タンパク質は、異なるＰＡＭ認識配列を有する異なるＲＧＮを含み、その結果、より多様なヌクレオチド配列が、変異の標的となり得る。
当業者であれば、本開示の方法のいずれかを用いて、単一の標的配列又は複数の標的配列を標的化できることを理解するであろう。したがって、方法は、単一の遺伝子及び／又は複数の遺伝子内の複数の別個の配列を標的化することができる複数の別個のガイドＲＮＡと組み合わせて単一のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質の使用を含む。次いで、融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、標的配列の各々に変異を導入する。また、本明細書には、複数の別個のガイドＲＮＡを複数の別個のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと組み合わせて導入する方法も包含される。このようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、複数のＲＧＮ又はＲＧＮバリアントであり得る。これらのガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡ／融合タンパク質システムは、単一の遺伝子及び／又は複数の遺伝子内の複数の別個の配列を標的化できる。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質は、目的の標的遺伝子又は遺伝子の標的領域において変異を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質を、目的の標的遺伝子又は標的遺伝子の領域の飽和変異誘発のために使用し、続いて、新規の変異及び／又は表現型を同定するためのハイスループット順遺伝学的スクリーニングのために使用してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、コードＤＮＡ配列を含んでいてもいなくてもよい標的ゲノム位置において変異を生成するために使用され得る。上記の標的化変異誘発により生成された細胞株のライブラリーは、遺伝子機能又は遺伝子発現の研究にも有用であり得る。
Ｘ．標的ポリヌクレオチド
一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾するための方法を提供し、これは、生体内でも、生体外でも、インビトロであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物又は植物（微細藻類を含む）由来の細胞又は細胞集団を採取し、その１つ又は複数の細胞を修飾することを含む。培養は、生体外で、任意の段階で行うことができる。その１つ又は複数の細胞を、ヒト、非ヒト動物又は植物（微細藻類を含む）に更に再導入してもよい。
植物育種家は、自然の多様性を利用して、望ましい品質、例えば、収量、品質、均一性、耐久性、及び有害生物への耐性に最も有用な遺伝子を組み合わせる。これらの望ましい品質には、成長、日長の選好性、温度要件、花成又は生殖発育の開始日、脂肪酸含有量、昆虫抵抗性、耐病性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、除草剤抵抗性、様々な環境要因（干ばつ、暑さ、湿気、寒さ、風、及び高塩分などの不利な土壌条件を含む）に対する耐性も含まれる。これらの有用な遺伝子の供給源には、在来又は外来の品種、エアルーム種、野生植物の近縁種、及び誘発変異、例えば、植物材料を変異誘発剤で処理することが含まれる。植物育種家には、本発明を利用することで、変異誘発を誘発するための新たなツールが提供される。したがって、当業者は、本発明を用いて、これまでの変異誘発剤よりも正確に有用な遺伝子の増加を誘発し、それにより植物育種プログラムを促進し改善することができる。
本発明のデアミナーゼ又は融合タンパク質の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、制御ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質の標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、すなわち、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識される短い配列と会合している。ＰＡＭの正確な配列及び長さの要件は、用いられるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドによって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。
本発明の融合タンパク質の標的ポリヌクレオチドは、多数の疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド、並びにシグナル伝達生化学経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナル伝達生化学経路に関連する配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、罹患組織に由来する細胞において、非疾患対照の組織又は細胞と比較して異常なレベル又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生する任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高レベルで発現されるようになる遺伝子であってもよいし、異常に低レベルで発現されるようになる遺伝子であってもよく、その発現の変化は、疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因（例えば、原因変異）に関与する遺伝子に直接関与するか、又は連鎖不均衡にある変異又は遺伝的多様性を有する遺伝子を指す。転写産物又は翻訳産物は、既知であっても未知であってもよく、更には正常レベルであっても異常レベルであってもよい。
本開示の方法及び組成物を用いて標的化できる疾患関連遺伝子の非限定的な例を、表３４に提供する。いくつかの実施形態では、標的化される疾患関連遺伝子は、Ｇ＞Ａ変異を有する、表３４に開示される遺伝子である。疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの更なる例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）からワールドワイドウェブで入手できる。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（５）遺伝子を含む。
本明細書で使用される場合、「嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子」又は「ＣＦＴＲ」という用語は、上皮細胞の頂端膜に位置し、小イオンが膜を通過するのを触媒する、ｃＡＭＰ制御塩化物チャネルを指す。ＣＦＴＲ遺伝子の非限定的な例は、配列番号５１として示される。
本明細書で使用される場合、スペーサー配列及び標的配列に関する「標的」又は「標的化する（標的とする）」という用語は、関連するガイドＲＮＡ内のスペーサー配列が標的配列と十分にハイブリダイズする能力に基づく、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの標的配列への局在化を指す。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はそれをコードする核酸分子であって、ｃｒＲＮＡがＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を含む、ｃｒＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子が提供される。そのようなｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡ、そのようなｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子、そのようなｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含むベクター、及びそのようなｃｒＲＮＡを含むシステムも提供される。そのようなｃｒＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子、そのようなｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡ、そのようなｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子、そのようなｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含むベクター、及びそのようなｃｒＲＮＡを含むシステムを使用して、標的配列に結合、それを切断、及び／又はそれを調節する方法も提供される。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、５６２、及び５６３のいずれか１つに示される配列、又はその相補体を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号６２～６８、８０～８５、１１６～１１９、１２８～１３１、１６３、１６４、１８０、１８１、２０３～２０９、２１９～２２５、２５６～２５８、２７４～２７６、３１０～３１３、及び３３０～３３３のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５３に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号９８～１０４、１４０～１４３、１９７、１９８、２３５～２４１、２９２～２９４、及び３５０～３５３のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５３に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号６８～７１、８６～８９、１２０～１２２、１３２～１３４、１５２～１５６、１６９～１７３、２１３～２１５、２２９～２３１、２５１～２５５、２６９～２７３、３０５～３０９、及び３２５～３２９のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５５に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１０４～１０７、１４４～１４６、１８６～１９０、２４５～２４７、２８７～２９１、及び３４５～３４９のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５５に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号７２、７３、９０、９１、１６１、１６２、１７８、１７９、２６５、２６６、２８３、及び２８４のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１０８、１０９、１９５、１９６、３０１、及び３０２のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号７４、７５、９２、９３、１２３、１２４、１３５、１３６、１６７、１８４、２１６～２１８、２３２～２３４、２５９～２６１、２７７～２７９、３１４～３１７、及び３３４～３３７のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５６に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１１０、１１１、１４７、１４８、２０１、２４８～２５０、２９５～２９７、及び３５４～３５７のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５６に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号７６、９４、２１０～２１２、２２６～２２８、３２２、３４２、５６２、及び５６３のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号４２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１１２、２４２～２４４、３６２、及び５６４のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号４２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号７７、９５、１２５、１３７、１５７～１６０、１７４～１７７、３２３、及び３４３のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５４に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１１３、１４９、１９１～１９４、及び３６３のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５４に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号７８、９６、１２６、１３８、１６８、１８５、２６７、２８５、３１８、３１９、３３８、及び３３９のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５７に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１１４、１５０、２０２、３０３、３５８、及び３５９のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５７に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号７９、９７、１２７、１３９、２６２～２６４、２８０～２８２、３２４、及び３４４のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５８に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１１５、１５１、２９８～３００、及び３６４のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５８に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡのＣＦＴＲ標的配列は、配列番号１６５、１６６、１８２、１８３、２６８、２８６、３２０、３２１、３４０、及び３４１のいずれか１つに示される配列又はその相補体を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５９に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ標的配列を標的化するスペーサー配列を有するｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡは、配列番号１９９、２００、３０４、３６０、及び３６１のいずれか１つに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、関連するＲＧＮポリペプチドは、配列番号５９に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、この方法は、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を本発明のＤＮＡ結合ポリペプチド－デアミナーゼ融合タンパク質と接触させることを含み、該ＤＮＡ分子は、核酸塩基の脱アミノ化に有効な量及び適した条件下で、融合タンパク質と接触する。ある特定の実施形態では、この方法は、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、（ａ）本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質、並びに（ｂ）（ａ）の融合タンパク質をＤＮＡ鎖の標的ヌクレオチド配列に標的化するｇＲＮＡと接触させることを含み、該ＤＮＡ分子は、核酸塩基の脱アミノ化に有効な量及び適した条件下で、融合タンパク質及びｇＲＮＡと接触する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、疾患又は障害に関連する配列を含み、核酸塩基の脱アミノ化により、疾患又は障害に関連しない配列が得られる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、作物植物のアレルに存在し、目的の形質の特定のアレルは、農業学的価値の低い植物をもたらす。核酸塩基の脱アミノ化により、その形質を改善するアレルが得られ、その植物の農業的価値が上昇する。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、疾患又は障害に関連するＧ＞Ａ点変異を含み、変異体Ａ塩基の脱アミノ化により、疾患又は障害に関連しない配列が得られる。いくつかの実施形態では、脱アミノ化により、疾患又は障害に関連する配列における点変異を修正する。
いくつかの実施形態では、疾患又は障害に関連する配列はタンパク質をコードし、脱アミノ化により、疾患又は障害に関連する配列に終止コドンが導入され、コードされたタンパク質が短縮される。いくつかの実施形態では、接触は、疾患若しくは障害に罹患しやすい、罹患している、又は疾患若しくは障害と診断された対象の生体内で実施される。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ゲノムにおける点変異又は単一塩基変異に関連する疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性疾患、がん、代謝性疾患、又はリソソーム蓄積症である。
ＸＩ．医薬組成物及び治療方法
疾患の治療を必要とする対象において疾患を治療する方法が、本明細書で提供される。この方法は、有効量の本開示の融合タンパク質若しくはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のｇＲＮＡ若しくはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示の融合タンパク質システム、本開示のリボ核タンパク質複合体、又はこれらの組成物のいずれか１つにより修飾されたか若しくはそれらを含む細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、治療は、本開示の融合タンパク質、ｇＲＮＡ、又は本開示の融合タンパク質システム、又はそれをコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することによる生体内遺伝子編集を含む。いくつかの実施形態では、治療は生体外遺伝子編集を含み、細胞が、本開示の融合タンパク質、ｇＲＮＡ、又は本開示の融合タンパク質システム、又はそれをコードするポリヌクレオチドで、生体外で遺伝子修飾され、次いで、修飾細胞が対象に投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、後に修飾細胞が投与される対象に由来し、この移植細胞は本明細書では自己由来と呼ばれる。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾細胞は、修飾細胞が投与される対象（すなわちレシピエント）と同じ種内の異なる対象（すなわちドナー）に由来し、この移植細胞は本明細書では同種由来と呼ばれる。本明細書に記載のいくつかの例では、細胞は、培養で増殖させた後、それを必要とする対象に投与されてもよい。
例えば、いくつかの実施形態では、このような疾患（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子に関連する遺伝子欠損）を有する対象に、配列番号３９９及び４０５～４０７のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するデアミナーゼとの融合タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体の有効量を投与することを含む、方法が提供される。本明細書に記載の実施形態では、リボ核タンパク質複合体の投与により、点変異が修正されるか、又は疾患関連ＣＦＴＲ遺伝子に不活性化変異が導入される。点変異の修正、又は疾患関連遺伝子への不活性化変異の導入によって治療することができる他の疾患は、当業者に知られており、本開示はこの点において限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物で治療される疾患は、免疫療法、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞で治療できる疾患である。このような疾患としては、がんが挙げられるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、標的核酸塩基の脱アミノ化により、遺伝子欠損が修正される（例えばＣＦＴＲ遺伝子の修正のために）、又は遺伝子産物に機能喪失をもたらす点変異が修正される。いくつかの実施形態では、遺伝子欠損は、疾患又は障害、例えば、リソソーム蓄積症又は代謝性疾患、例えば、Ｉ型糖尿病などに関連する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の組成物で治療される疾患は、その疾患若しくは障害の治療、又はその疾患若しくは障害に関連する症状の軽減のために変異された配列（すなわち、その配列が疾患若しくは障害の原因であるか、又は疾患若しくは障害に関連する症状の原因である）に関連する。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物で治療される疾患は、原因変異に関連する。本明細書で使用される場合、「原因変異」は、対象における疾患又は障害の重症度又は存在に関与するゲノム中の特定のヌクレオチド若しくは複数のヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。原因変異の修正により、疾患又は障害によって起こる少なくとも１つの症状が改善される。いくつかの実施形態では、原因変異の修正により、疾患又は障害によって起こる少なくとも１つの症状が改善される。いくつかの実施形態では、原因変異は、本明細書に開示のデアミナーゼに融合されたＲＧＤＢＰ（例えば、ＲＧＮ）により認識されるＰＡＭ部位に隣接している。原因変異は、ＲＧＤＢＰ（例えば、ＲＧＮ）及び本開示のデアミナーゼを含む融合ポリペプチドで修正することができる。原因変異に関連する疾患の非限定的な例としては、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、及び鎌状赤血球症が挙げられる。疾患関連遺伝子及び変異の更なる非限定的な例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）からワールドワイドウェブで入手可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて、疾患又は障害に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子又はアレルに不活性化点変異を導入する。例えば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質を用いてがん遺伝子に不活性化点変異を導入する（例えば、増殖性疾患の治療において）方法を本明細書で提供する。不活性化変異は、いくつかの実施形態では、コード配列に未成熟終止コドンを生成し得、これにより短縮型遺伝子産物、例えば、全長タンパク質の機能を欠く短縮型タンパク質が発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法の目的は、ゲノム編集を介して機能不全の遺伝子の機能を回復することである。本明細書で提供される融合タンパク質は、遺伝子編集に基づくインビトロでのヒト治療の場合、例えばヒト細胞培養における疾患関連変異の修正により検証することができる。当業者であれば、本明細書で提供される融合タンパク質、例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質を使用して、任意の単一点Ｇ＞Ａ変異を修正できることを理解するであろう。変異体ＡをＧに脱アミノ化することで、変異の修正が行われる。
本明細書で使用される場合、「治療」若しくは「治療する」又は「緩和する」又は「寛解させる」は互換的に使用される。これらの用語は、有益な又は所望の結果（治療上の利益及び／又は予防上の利益が挙げられるが、これらに限定されない）を得るための手法を指す。治療上の利益とは、治療中の１つ以上の疾患、状態、又は症状における、任意の治療に関係する改善又はそれらに対する効果を意味する。予防上の利益のために、組成物を、特定の疾患、状態、若しくは症状を発症するリスクのある対象、又は疾患の生理学的症状の１つ以上を報告している対象に、疾患、状態、若しくは症状がまだ現れていない場合であっても、投与してもよい。いくつかの実施形態では、治療は、１つ以上の症状が発症した後、及び／又は疾患が診断された後に実施され得る。特定の実施形態では、治療は、例えば、症状の発症を予防若しくは遅延させるため、又は疾患の発症若しくは進行を抑制するために、症状の非存在下で実施してもよい。例えば、治療は、症状の発症前に感受性のある個体に実施してもよい（例えば、症状の履歴を考慮して、及び／又は遺伝的因子若しくは他の感受性因子を考慮して）。治療はまた、症状が消失した後も、例えば、それらの再発を予防又は遅延するために継続してもよい。
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象及び病状、対象の体重及び年齢、病状の重症度、投与方法などのうちの１つ以上に応じて変更してもよく、当業者によって容易に決定できる。具体的な用量は、選択された特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、及びそれを運ぶ送達システムのうちの１つ以上に応じて変更してもよい。
「投与する」という用語は、所望の部位、例えば損傷又は修復部位に導入された活性成分を少なくとも部分的に局在化し、その結果、所望の効果を生じさせる方法又は経路による対象への活性成分の留置を指す。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の単離されたポリペプチド、核酸分子融合タンパク質、リボ核タンパク質複合体、ベクター、医薬組成物、及び／又はｇＲＮＡのいずれかを送達することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、そのような方法によって作製された細胞、及びそのような細胞を含むか又はそのような細胞から産生された生物（動物又は植物など）を更に提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデアミナーゼ、融合タンパク質、及び／又は核酸分子は、ガイド配列と組み合わせて（及び任意選択でそれと複合体を形成して）細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、投与は、ウイルス送達による投与を含む。本明細書に開示の融合タンパク質、リボ核タンパク質複合体、又はベクターをコードする核酸を含むウイルスベクターは、患者に直接投与されてもよく（すなわち、生体内）、又はインビトロで細胞を治療するために使用し得、修飾細胞を任意選択で患者に投与してもよい（すなわち、生体外）。従来のウイルスに基づくシステムとしては、限定されないが、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入又は感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価を生じる。一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用してもよい。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。
いくつかの実施形態では、投与は、エレクトロポレーションによる投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、ナノ粒子送達による投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、リポソーム送達による投与を含む。任意の有効な投与経路を用いて本明細書に記載の有効量の医薬組成物を投与することができる。
いくつかの実施形態では、投与は、核酸の他の非ウイルス送達による投与を含む。例示的な非ウイルス送達方法としては、限定されないが、ＲＮＰ複合体、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤増強取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際公開第１９９１／１７４２４号：国際公開第１９９１／１６０２４号のものが挙げられる。送達は、細胞に対して（例えば、インビトロ又は生体外投与）であっても標的組織に対して（例えば、生体内投与）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、診断、処置、又は治療が望まれる任意の個体を指す。いくつかの実施形態では、対象は動物である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
処置の有効性は、熟練した臨床医により判定できる。しかしながら、治療は、疾患又は障害の徴候又は症状のいずれか又は全てが有益な形で変化した場合（例えば、少なくとも１０％減少した場合）、又は疾患の他の臨床的に認められた症状又はマーカーが改善又は緩和した場合、「有効な治療」とみなされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価された場合、個体が悪化し得ない（例えば、疾患の進行が停止するか、又は少なくとも遅くなる）ことによっても測定できる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られている。治療としては以下が挙げられる：（１）疾患の阻害、例えば、症状の進行の停止若しくは遅延；又は（２）疾患の緩和、例えば、症状の退縮を引き起こすこと；及び（３）症状の発症の可能性の予防若しくは軽減。
本開示のＲＧＮポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のｇＲＮＡ若しくはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のデアミナーゼ若しくはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示の融合タンパク質、本開示のシステム（融合タンパク質を含むものなど）、本開示のリボ核タンパク質複合体、又はＲＧＮポリペプチド若しくはＲＧＮをコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ若しくはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、若しくは該システムのいずれかを含む細胞と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物が提供される。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」は、生物に重大な刺激を引き起こさず、活性成分（すなわち、デアミナーゼ又は融合タンパク質又はそれをコードする核酸分子）の活性及び特性を損なわない物質を指す。担体は、治療される対象への投与に適したものにするために、十分に高純度かつ十分に低毒性である必要がある。担体は不活性であってもよく、医薬的な利点を有してもよい。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体は、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した１つ以上の適合性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、天然に存在しない医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体及び活性成分は、自然では一緒に見られず、したがって、異種である。
本開示の方法で使用される医薬組成物を、好適な担体、賦形剤、及び、好適な移動、送達、認容性などを提供する他の薬剤と共に製剤してもよい。多数の適切な製剤が当業者に知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．２００５）を参照のこと。非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。滅菌希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、並びに等張性調整剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。静脈内投与の場合、特定の担体は、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製され得る。単位用量のそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって防止することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。注射用医薬形態は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によって持続的に吸収させることができる。
本開示のＲＧＮ、ｇＲＮＡ、デアミナーゼ、融合タンパク質、システム（融合タンパク質を含むものなど）又はそれをコードするポリヌクレオチドを含むか、又はそれにより修飾された細胞を対象に投与するいくつかの実施形態では、細胞は、医薬的に許容される担体を有する懸濁液として投与される。当業者が認識していることとして、細胞組成物に使用される医薬的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存能を実質的に妨害する量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、防腐剤、又は他の薬剤を含まない。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性の維持を可能にする浸透圧緩衝液、及び任意選択で、細胞生存能を維持するか又は投与時の生着を増強するための栄養素を含んでもよい。そのような製剤及び懸濁液は当業者に知られており、及び／又は日常的な実験を用いて本明細書に記載の細胞での使用に適合させることができる。
細胞組成物はまた、乳化手順が細胞生存能に悪影響を及ぼさないという条件で、乳化され得るか、又はリポソーム組成物として提示され得る。細胞及び任意の他の活性成分を、本明細書に記載の治療方法に使用するのに適した量で、医薬的に許容されかつ活性成分と適合性のある賦形剤と混合してもよい。
細胞組成物に含まれる更なる薬剤は、その中の成分の医薬的に許容される塩を含んでもよい。医薬的に許容される塩としては、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導してもよい。
本明細書に記載の医薬組成物を投与する好適な経路としては、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、口内、蝸牛内、鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、及び脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、罹患部位（例えば、肺）に局所投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、注射、吸入によって（例えばエアロゾルの）、カテーテルによって、坐剤によって、又はインプラントによって対象に投与される。インプラントは、シラスティック（sialastic）膜などの膜又は繊維を含む多孔質、非多孔質、又はゼラチン状材料である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象への送達のために、例えば、遺伝子編集のために製剤化される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内投与又は皮下投与に適合された組成物として、日常的な手順に従って製剤化される。いくつかの実施形態では、注射による投与のための医薬組成物は、滅菌等張水性緩衝液での溶液である。必要であれば、医薬はまた、可溶化剤、及び注射部位における疼痛緩和のためのリグノカインなどの局所麻酔剤を含むこともできる。概して、成分は、別々に又は一緒に混合してのいずれかで、例えば、活性剤の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器内に乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給される。医薬が点滴によって投与される場合、医薬品グレードの滅菌水又は生理食塩水入りの点滴ボトルを用いて投薬することができる。医薬組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与にも適したリポソーム又は微結晶などの脂質粒子又は小孔内に入っていてもよい。
本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物に関するものであるが、当業者であれば、このような組成物は概して、全ての種類の動物又は生物への投与に適していることを理解するであろう。
塩基編集を用いた原因変異の修飾
本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質に依存する手法で修正できる遺伝性疾患の例は、嚢胞性線維症である。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子（配列番号５１として示される）の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患である。ＣＦＴＲは、上皮細胞の頂端膜に位置し、小イオンが膜を通過するのを触媒する、ｃＡＭＰ制御塩化物チャネルをコードする。この機構の調節不全により、塩及び体液の恒常性が損なわれ、多臓器不全が生じ、最終的に呼吸不全による死亡に至る。
ＣＦＴＲ遺伝子の約２，０００の変異がＣＦの原因であることが判明している。ＣＦＴＲ変異は、ＣＦＴＲタンパク質の合成、輸送、機能、又は安定性のいずれかの機能障害に基づいて６つのクラスに分類されるが、多くのＣＦＴＲ変異体が複数の障害を提示することが認められている。クラスＩ変異により、重度の欠陥タンパク質の産生がもたらされる。それらは主に、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を導入するナンセンス変異又はフレームシフト変異であり、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）崩壊経路（ＮＭＤ）によって分解される不安定なｍＲＮＡをもたらす。単一ヌクレオチド変化によるナンセンス変異は、クラスＩ変異の主要なサブセットを含む（Ｍａｒａｎｇｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｐｉｓｔｒｉｔｔｏ，Ｇ，２０１８，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９，３９６，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１８．００３９６；Ｐｒａｎｋｅ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ１０，１２１，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１９．００１２１。いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。クラスＩ嚢胞性線維症を有する患者の治療は、機能的ＣＦＴＲタンパク質が生成されないので困難であり得る。注目すべきことに、これらのナンセンス変異のかなりの割合は、ＡからＧへの塩基エディタによって対処できる可能性がある（参照により本明細書に組み込まれるＧｅｕｒｔｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ，２０２０，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２６，５０３－５１０ ｅ５０７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０２０．０１．０１９）。
Ｇｅｕｒｔｓらは、ＲＧＮ、すなわちＳｐｙＣａｓ９又はｘＳｐｙＣａｓ９バリアントのいずれかに作動可能に連結されたアデニンデアミナーゼを含む融合タンパク質を用いて、嚢胞性線維症患者のクラスＩ変異を有する培養肺上皮細胞で正確な塩基編集を行った最初のグループであった。ＳｐｙＣａｓ９は５’－ｎＧＧ－３’ＰＡＭを認識するが、ｘＳｐｙＣａｓ９バリアントは短縮された５’－ｎＧ－３’を認識した。著者らは、塩基編集技術の主な制限は、使用するＣａｓタンパク質のＰＡＭ要件であると述べている。著者らは、ＣＦＴＲ遺伝子において同定されたナンセンス変異の多くが、ＲＧＮ ＳｐｙＣａｓ９を含む融合タンパク質に必要な標的ウィンドウ内にないことを見出している。ＰＡＭは、ＲＧＮによって認識される標的ＤＮＡ配列上の短いモチーフ（概ね１～４ヌクレオチド）である。ＰＡＭ配列は各ＲＧＮタンパク質に固有であり、その結果、ＲＧＮは、好適なＰＡＭの周囲のゲノム空間にのみ到達することができる。更に、塩基エディタの塩基編集ウィンドウは限られており、多くの場合、標的配列内のヌクレオチドの一部分のみに限定される。目的のヌクレオチドがＰＡＭに近すぎる場合、ＲＧＮはヌクレオチドへの到達を遮断する。ヌクレオチドがＰＡＭから遠すぎる場合、ＲＧＮにつながったデアミナーゼはヌクレオチドに達することができない。また、Ｒループによって露出されたｓｓＤＮＡの量も、デアミナーゼの到達可能性を制限する。本発明は、ＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質であって、ＲＧＮがＣＦＴＲ遺伝子のクラスＩ変異に近接するＰＡＭを認識し、デアミナーゼが標的化された原因変異をうまく修飾することができる、ＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質を含む。
当該技術分野で公知のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質に対する別の制限は、融合タンパク質をコードするベクター構築物が生体内送達の方法には大きすぎることである。これらの融合タンパク質のＡＡＶ送達はＳｐｙＣａｓ９ベースの融合タンパク質の選択肢ではない。これは、そのサイズが効率的なＡＡＶパッケージングの限界を超えるためである。本明細書に記載の融合タンパク質のＲＧＮ成分は、サイズがより小さいため、ＡＡＶベクター送達戦略の実行可能な候補である。本発明はまた、本明細書に記載のＲＧＮに特異的であり、本発明の融合タンパク質を、これまで到達不可能であったＣＦＴＲ遺伝子におけるナンセンス変異の標的部位に誘導する、ガイドＲＮＡを開示する。本発明はまた、生体内ＡＡＶベクター送達による標的塩基編集のために上記の融合タンパク質を使用する方法を教示する。
理想的には、本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質及び該融合タンパク質をＣＦＴＲ遺伝子に標的化するための対応するガイドＲＮＡのコード配列は全て、単一のＡＡＶベクターにパッケージされ得る。概ねＡＡＶベクターの許容されるサイズ限界は４．７ｋｂであるが、パッキング効率を低下させることで、それより大きいサイズも企図され得る。表２８のＲＧＮニッカーゼは、約３．１５～３．４５ｋＢのコード配列長を有する。融合タンパク質及びその対応するガイドＲＮＡの両方の発現カセットが確実にＡＡＶベクターに適合できるようにするための、ＲＧＮの新規な活性欠失バリアントが本明細書に記載される。アミノ酸配列の短縮、ひいては融合タンパク質のＲＧＮのコード配列の短縮に加えて、ＲＧＮとデアミナーゼとを連結するペプチドリンカーも短縮され得る。最終的に、プロモータ、エンハンサ、及び／又はターミネータなどの遺伝子エレメントも、各々が機能的であるために必要とされる最小サイズを決定する欠失分析を介して操作され得る。
本開示のいくつかの実施形態は、核酸塩基の変化、例えば、Ａ：Ｔ塩基対からＧ：Ｃ塩基対への変化を達成するために、本明細書に記載のデアミナーゼ又はＲＧＮ複合体を使用して核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、核酸の核酸塩基（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列の塩基対）を編集するための方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデアミナーゼ又はＲＧＮ複合体は、標的「Ａ」核酸塩基を脱アミノ化及び切除することによって核酸に点変異を導入するために使用される。いくつかの実施形態では、標的核酸塩基の脱アミノ化及び切除により、遺伝子欠損が修正される、例えば、ＣＦＴＲ遺伝子における点変異が修正される。いくつかの実施形態では、遺伝子欠損は、疾患、障害、又は状態、例えば、嚢胞性線維症に関連する。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号３９９及び４０５～４０７のいずれか１つに示される配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するデアミナーゼとの融合タンパク質を含む塩基編集ＲＧＮ複合体を用いて、遺伝子欠損に関連する遺伝子を修正する、例えば、ＣＦＴＲ遺伝子における点変異を修正する（例えば、増殖性疾患の治療において）方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子中の標的配列は、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、又は５６３である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法の目的は、ゲノム編集を介して機能不全の遺伝子の機能を回復することである。本明細書で提供される塩基エディタタンパク質は、遺伝子編集に基づくインビトロでのヒト治療の場合、例えばヒト細胞培養における疾患関連変異の修正により検証することができる。当業者であれば、核酸結合タンパク質（例えば、ｎＣａｓ９）と核酸塩基修飾ドメイン（例えば、配列番号４０７、３９９、又は４０５に示されるアミノ酸配列を有するデアミナーゼ）とを含む本明細書で提供される融合タンパク質及び／又はＲＧＮ複合体を使用して、ＴからＧへ任意の単一点を修正するか、又はＴ：ＡからＧ：Ｃに対形成を変更できるということを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質又はＲＧＮ複合体によって修正することができる点変異（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子における変異）に関連するか又はそれによって引き起こされる疾患と診断された対象の治療のための方法が本明細書で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、そのような疾患、例えば、嚢胞性線維症を有する対象に、点変異を修正するか又は疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入する本明細書に開示の融合タンパク質又はＲＧＮ複合体の有効量を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、そのような疾患、例えば、上記の点変異に関連するがんを有する対象に、点変異を修正するか又は疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入する本明細書に開示の融合タンパク質、ＲＧＮ複合体、又は医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、嚢胞性線維症を治療する方法は、有効量の本明細書に開示の医薬組成物を投与することによって、嚢胞性線維症の少なくとも１つの症状を軽減させる方法とともに提供される。嚢胞性線維症の症状を治療又は軽減するための医薬組成物の有効量により、嚢胞性線維症の症状を、対照患者と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれ以上、又は約１０～２０％、１５～２５％、２０～４０％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、６０～８０％、７０～９０％、８０～９５％、若しくは９０～９５％軽減（すなわち、治療）することができる。特定の実施形態では、対照患者は、有効量の本明細書に開示の医薬組成物の投与前の同じ患者であり得る。嚢胞性線維症の症状としては、とりわけ、くしゃみ、粘液又は痰を生じる持続性咳嗽、特に運動時の息切れ、再発性肺感染症、鼻づまり、副鼻腔のつまり、悪臭を伴う脂肪便、便秘、吐き気、腹部膨満、食欲不振が挙げられるが、これらに限定されない。嚢胞性線維症の症状を同定及び測定する方法は、当技術分野で知られている。
標的ＤＮＡ分子を修飾するための記載の方法のいくつかの実施形態では、接触工程はインビトロで行われる。特定の実施形態では、接触工程は生体内で行われる。いくつかの実施形態は、接触工程は、対象（例えば、ヒト対象又は非ヒト動物対象）において行われる。いくつかの実施形態では、接触工程は、細胞、例えば、ヒト又は非ヒト動物細胞において行われる。
ＸＩＩ．ポリヌクレオチド遺伝子修飾を含む細胞
本明細書に記載の融合タンパク質と任意選択でｇＲＮＡとにより媒介されるプロセスを用いて、修飾された目的の標的核酸分子を含む、細胞及び生物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかのアミノ酸配列を含むデアミナーゼポリペプチド、又はその活性バリアント若しくは断片を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド）とを含む。更なる実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼと、ＲＧＮ又はそのバリアント、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４１）又はそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４２）とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼと、Ｃａｓ９又はそのバリアント、例えばｄＣａｓ９又はニッカーゼＣａｓ９とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼバリアントを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼバリアントを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ不活性型又はニッカーゼバリアントを含む。
修飾された細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物、植物、昆虫、鳥類細胞）であっても原核細胞であってもよい。本明細書に記載の融合タンパク質を利用するプロセスによって修飾された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、細胞小器官及び胚も提供される。遺伝子修飾された細胞、生物、細胞小器官、及び胚は、修飾されたヌクレオチド配列についてヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。融合タンパク質のデアミナーゼドメインによって導入された変異により、発現の変化（増加若しくは減少）、不活性化、又は変化したタンパク質産物若しくは組込み配列の発現がもたらされ得る。変異により遺伝子の不活性化又は非機能的タンパク質産物の発現のいずれかが起こる場合、遺伝子修飾された細胞、生物、細胞小器官、又は胚は「ノックアウト」と呼ばれる。ノックアウト表現型は、欠失変異（すなわち、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失）の結果であってもよく、挿入変異（すなわち、少なくとも１個のヌクレオチドの挿入）の結果であってもよく、ナンセンス変異（すなわち、終止コドンが導入されるような少なくとも１個のヌクレオチドの置換）の結果であってもよい。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼドメインによって導入された変異により、バリアントタンパク質産物が産生される。発現されたバリアントタンパク質産物は、少なくとも１つのアミノ酸置換及び／又は少なくとも１つのアミノ酸の付加若しくは欠失を有し得る。バリアントタンパク質産物は、野生型タンパク質と比較した場合、修飾された特性又は活性（変化した酵素活性又は基質特異性を含むがこれらに限定されない）を示し得る。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼドメインによって導入された変異により、タンパク質の発現パターンが変化する。非限定的な例として、タンパク質産物の発現を制御する制御領域における変異により、タンパク質産物の過剰発現若しくは下方制御、又は組織若しくは時間的発現パターンの変化が起こり得る。
修飾された細胞を従来の方法に従って植物などの生物に成長させてもよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４を参照のこと。次いで、これらの植物を成長させ、同じ修飾株又は異なる株で受粉させてもよく、得られたハイブリッドは遺伝的修飾を有する。本発明は、遺伝子修飾された種子を提供する。再生植物の子孫、バリアント、及び変異体も、これらの部分が遺伝子修飾を含むという条件で、本発明の範囲内に含まれる。更に、遺伝子修飾を保持する加工された植物製品又は副産物（例えば、大豆粕）も提供される。
本明細書で提供される方法を、任意の植物種、例えば単子葉植物及び双子葉植物（ただしこれらに限定されない）の修飾に用いてもよい目的の植物の例としては、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びアブラナ、ブラシカ属（Brassica）、アルファルファ、ライムギ、雑穀（millet）、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、カカオ、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞用植物、並びに針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。
野菜としては、トマト、レタス、サヤインゲン、ライマメ、エンドウマメ、並びにキュウリ属に属する、例えば、キュウリ、カンタロープ、及びマスクメロンが挙げられるが、これらに限定されない。観賞用植物としては、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、スイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の植物は、作物植物（例えば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科、コショウ、ジャガイモ、綿、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど）である。
本明細書で提供される方法は、古細菌及び細菌（例えば、バシラス属、クレブシエラ属、ストレプトマイセス属、リゾビウム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、サルモネラ属、シゲラ属、ビブリオ属、エルシニア属、マイコプラズマ属、アグロバクテリウム属、ラクトバシラス属）が挙げられるが、これらに限定されない任意の原核生物種を遺伝子修飾するために使用することもできる。
本明細書で提供される方法は、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、魚、鳥、及び爬虫類）、真菌、アメーバ、藻類、及び酵母が挙げられるが、これらに限定されない任意の真核生物種又はそれに由来する細胞を遺伝子修飾するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって修飾される細胞としては、造血系由来の細胞、例えば免疫細胞（すなわち、自然免疫系又は適応免疫系の細胞）（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない）、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞が挙げられる。
修飾された細胞は生物に導入してもよい。これらの細胞は、自家細胞移植の場合、同じ生物（例えばヒト）に由来し得、その場合、細胞を生体外の手法で修飾する。いくつかの実施形態では、細胞は、同種他家細胞移植の場合、同じ種内の別の生物（例えば、別のヒト）に由来する。
ＸＩＩＩ．キット
本開示のいくつかの態様は、本発明のデアミナーゼを含む、キットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、本発明のデアミナーゼ及びＤＮＡ結合ポリペプチド（例えば、ＲＧＮポリペプチドなどのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド、例えばヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメイン）と、任意選択で、ＤＮＡ結合ポリペプチドドメインとデアミナーゼとの間に位置するリンカーと、を含む融合タンパク質を含む、キットを提供する。加えて、いくつかの実施形態では、キットは、融合タンパク質の使用、例えば、インビトロ又は生体内でのＤＮＡ又はＲＮＡ編集に好適な試薬、緩衝液、及び／又は説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸配列の標的編集に好適なｇＲＮＡの設計及び使用に関する説明書を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の本開示の組成物入りの容器と、（ｂ）注射用の医薬的に許容される希釈剤（例えば、滅菌水）入りの第２の容器と、を含む、医薬キットとして提供され得る。医薬的に許容される希釈剤は、本開示の凍結乾燥化合物の再構成又は希釈に使用することができる。任意選択で、このような容器に付随するものは、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形での、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用又は販売の認可を反映する通知であり得る。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例えば、「ポリペプチド」は、１つ以上のポリペプチドを意味する。
本明細書で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、本開示が関係する分野の当業者のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、各々の個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
上述のとおり本発明を、明確な理解を目的として解説及び例示によっていくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲内にてある特定の変更及び修正を実施できることは明らかであろう。
非限定的な実施形態は、以下を含む。
１．配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
２．配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離されたポリペプチド。
３．配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離されたポリペプチド。
４．デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
５．デアミナーゼが、配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４に記載の核酸分子。
６．デアミナーゼが、配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４に記載の核酸分子。
７．デアミナーゼが、配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４に記載の核酸分子。
８．デアミナーゼポリペプチドが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態４に記載の核酸分子。
９．デアミナーゼポリペプチドが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態４に記載の核酸分子。
１０．該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、実施形態４～９のいずれか１つに記載の核酸分子。
１１．医薬的に許容される担体と、実施形態１～３のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態４～１０のいずれか１つに記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
１２．医薬的に許容される担体が、該ポリペプチド又は該核酸分子に対して異種である、実施形態１１に記載の医薬組成物。
１３．医薬的に許容される担体が天然に存在しない、実施形態１１又は１２に記載の医薬組成物。
１４．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
１５．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１４に記載の融合タンパク質。
１６．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態１４に記載の融合タンパク質。
１７．デアミナーゼがアデニンデアミナーゼである、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１９．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２０．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態１９に記載の融合タンパク質。
２１．ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２０に記載の融合タンパク質。
２２．ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２０に記載の融合タンパク質。
２３．ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２４．ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２０に記載の融合タンパク質。
２５．ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、実施形態２０に記載の融合タンパク質。
２６．ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、実施形態２３に記載の融合タンパク質。
２７．少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１４～２６のいずれかに記載の融合タンパク質。
２８．ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
２９．該ヌクレオチド配列が、配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２８に記載の核酸分子。
３０．該ヌクレオチド配列が、配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２８に記載の核酸分子。
３１．該ヌクレオチド配列が、配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態２８に記載の核酸分子。
３２．該ヌクレオチド配列が、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、実施形態２８に記載の核酸分子。
３３．該ヌクレオチド配列が、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、実施形態２８に記載の核酸分子。
３４．デアミナーゼがアデニンデアミナーゼである、実施形態２８～３３のいずれか１つに記載の核酸分子。
３５．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の核酸分子。
３６．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の核酸分子。
３７．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態３６に記載の核酸分子。
３８．ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３７に記載の核酸分子。
３９．ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３７に記載の核酸分子。
４０．ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載の核酸分子。
４１．ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３７に記載の核酸分子。
４２．ＲＧＮが配列番号４１、６０、３６６、又は３６８である、実施形態３７に記載の核酸分子。
４３．ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、実施形態４０に記載の核酸分子。
４４．融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、その５’末端で異種プロモータに作動可能に連結されている、実施形態２８～４３のいずれかに記載の核酸分子。
４５．融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、その３’末端で異種ターミネータに作動可能に連結されている、実施形態２８～４４のいずれかに記載の核酸分子。
４６．融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態２８～４５のいずれかに記載の核酸分子。
４７．融合タンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態２８～４６のいずれかに記載の核酸分子。
４８．融合タンパク質が、原核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態２８～４６のいずれかに記載の核酸分子。
４９．実施形態２８～４８のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
５０．標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、実施形態２８～４８のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
５１．ｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである、実施形態５０に記載のベクター。
５２．ｇＲＮＡが二重ガイドＲＮＡである、実施形態５０に記載のベクター。
５３．実施形態１４～２７のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、細胞。
５４．ガイドＲＮＡを更に含む、実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む、細胞。
５５．実施形態２８～４８のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、細胞。
５６．実施形態４９～５２のいずれか１つの記載のベクターを含む、細胞。
５７．細胞が原核細胞である、実施形態５３～５６のいずれか１つに記載の細胞。
５８．細胞が真核細胞である、実施形態５３～５６のいずれか１つに記載の細胞。
５９．真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態５８に記載の細胞。
６０．哺乳動物細胞がヒト細胞である、実施形態５９に記載の細胞。
６１．ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態６０に記載の細胞。
６２．免疫細胞が幹細胞である、実施形態６１に記載の細胞。
６３．幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態６２に記載の細胞。
６４．真核細胞が昆虫細胞又は鳥類細胞である、実施形態５８に記載の細胞。
６５．真核細胞が真菌細胞である、実施形態５８に記載の細胞。
６６．真核細胞が植物細胞である、実施形態５８に記載の細胞。
６７．実施形態６６に記載の細胞を含む植物。
６８．実施形態６６に記載の細胞を含む種子。
６９．医薬的に許容される担体と、実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態２８～４８のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態４９～５２のいずれか１つに記載のベクター、又は実施形態５９～６３のいずれか１つに記載の細胞とを含む、医薬組成物。
７０．融合タンパク質を作製するための方法であって、実施形態５３～６６のいずれか１つに記載の細胞を、融合タンパク質が発現する条件下で培養することを含む、方法。
７１．融合タンパク質を作製するための方法であって、実施形態２８～４８のいずれかに記載の核酸分子又は実施形態４９～５２のいずれか１つに記載のベクターを細胞に導入することと、該細胞を融合タンパク質が発現する条件下で培養することとを含む、方法。
７２．該融合タンパク質を精製することを更に含む、実施形態７０又は７１に記載の方法。
７３．ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を作製するための方法であって、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の核酸分子と、ガイドＲＮＡをコードする発現カセットを含む核酸分子又は実施形態５０～５２のいずれかに記載のベクターとを細胞に導入することと、該細胞を融合タンパク質及びｇＲＮＡが発現し、ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で培養することとを含む、方法。
７４．該ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することを更に含む、実施形態７３に記載の方法。
７５．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが、該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
７６．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態７５に記載のシステム。
７７．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態７５に記載のシステム。
７８．１つ以上のガイドＲＮＡをコードする該ヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、該ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態７５～７７のいずれか１つに記載のシステム。
７９．標的ＤＮＡ配列が真核生物標的ＤＮＡ配列である、実施形態７５～７８のいずれか１つに記載のシステム。
８０．標的ＤＮＡ配列が、ＲＧＮによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態７５～７９のいずれか１つに記載のシステム。
８１．標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、実施形態７５～８０のいずれか１つに記載のシステム。
８２．細胞が真核細胞である、実施形態８１に記載のシステム。
８３．真核細胞が植物細胞である、実施形態８２に記載のシステム。
８４．真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態８２に記載のシステム。
８５．哺乳動物細胞がヒト細胞である、実施形態８４に記載のシステム。
８６．ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態８５に記載のシステム。
８７．免疫細胞が幹細胞である、実施形態８６に記載のシステム。
８８．幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態８７に記載のシステム。
８９．真核細胞が昆虫細胞である、実施形態８２に記載のシステム。
９０．細胞が原核細胞である、実施形態８１に記載のシステム。
９１．融合タンパク質のＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態７５～９０のいずれか１つに記載のシステム。
９２．融合タンパク質のＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態７５～９０のいずれか１つに記載のシステム。
９３．融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態７５～９０のいずれか１つに記載のシステム。
９４．融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、実施形態７５～９０のいずれか１つに記載のシステム。
９５．融合タンパク質のＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態７５～９０のいずれか１つに記載のシステム。
９６．ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、実施形態９５に記載のシステム。
９７．融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態７５～９６のいずれかに記載のシステム。
９８．融合タンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態７５～９７のいずれかに記載のシステム。
９９．１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、１つのベクター上に位置する、実施形態７５～９８のいずれかに記載のシステム。
１００．医薬的に許容される担体と、実施形態７５～９９のいずれか１つに記載のシステムとを含む、医薬組成物。
１０１．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、実施形態７５～９９のいずれか１つに記載のシステムを、該標的ＤＮＡ分子又は標的ＤＮＡ分子を含む細胞に送達することを含む、方法。
１０２．修飾された該標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｎ変異を含み、ＮがＣ、Ｇ又はＴである、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．修飾された該標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｇ変異を含む、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
ａ）インビトロで、
ｉ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることによりＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
ｂ）該標的ＤＮＡ分子又は該標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、インビトロで構築されたＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
１０５．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１０４に記載の方法。
１０７．修飾された該標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｎ変異を含み、ＮがＣ、Ｇ又はＴである、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．修飾された該標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｇ変異を含む、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．融合タンパク質のＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１０４～１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０．融合タンパク質のＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１０４～１０８のいずれかに記載の方法。
１１１．融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１０４～１０８のいずれかに記載の方法。
１１２．融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、実施形態１０４～１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１３．融合タンパク質のＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態１０４～１０８のいずれかに記載の方法。
１１４．ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態１０４～１１４のいずれかに記載の方法。
１１６．融合タンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１０４～１１５のいずれかに記載の方法。
１１７．該標的ＤＮＡ配列が真核生物標的ＤＮＡ配列である、実施形態１０４～１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．該標的ＤＮＡ配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態１０４～１１７のいずれかに記載の方法。
１１９．標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、実施形態１０４～１１８のいずれかに記載の方法。
１２０．細胞が真核細胞である、実施形態１１９に記載の方法。
１２１．真核細胞が植物細胞である、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１２０に記載の方法。
１２３．哺乳動物細胞がヒト細胞である、実施形態１２２に記載の方法。
１２４．ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態１２３に記載の方法。
１２５．免疫細胞が幹細胞である、実施形態１２４に記載の方法。
１２６．幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１２５に記載の方法。
１２７．真核細胞が昆虫細胞である、実施形態１２０に記載の方法。
１２８．細胞が原核細胞である、実施形態１１９に記載の方法。
１２９．修飾された該ＤＮＡ分子を含む細胞を選択することを更に含む、実施形態１１９～１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．実施形態１２９に記載の方法に従って修飾された標的ＤＮＡ配列を含む、細胞。
１３１．細胞が真核細胞である、実施形態１３０に記載の細胞。
１３２．真核細胞が植物細胞である、実施形態１３１に記載の細胞。
１３３．実施形態１３２に記載の細胞を含む植物。
１３４．実施形態１３２に記載の細胞を含む種子。
１３５．真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１３１に記載の細胞。
１３６．哺乳動物細胞がヒト細胞である、実施形態１３５に記載の細胞。
１３７．ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態１３６に記載の細胞。
１３８．免疫細胞が幹細胞である、実施形態１３７に記載の細胞。
１３９．幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１３８に記載の細胞。
１４０．真核細胞が昆虫細胞である、実施形態１３１に記載の細胞。
１４１．細胞が原核細胞である、実施形態１３０に記載の細胞。
１４２．実施形態１３５～１３９のいずれか１つに記載の細胞と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
１４３．遺伝性疾患の原因変異を修正した遺伝子修飾細胞を作製するための方法であって、該細胞の中に、
ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は細胞における該融合タンパク質の発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は細胞における該ｇＲＮＡの発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、該ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、
を導入することを含み、
これにより、該融合タンパク質及びｇＲＮＡは原因変異のゲノム位置を標的とし、原因変異を除去するようにゲノム配列を修飾する、方法。
１４４．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１４３に記載の方法。
１４５．該デアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１４３に記載の方法。
１４６．融合タンパク質の該ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態１４３～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、実施形態１４６に記載の方法。
１４８．ゲノム修飾が、標的ＤＮＡ配列内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｇ変異を導入することを含む、実施形態１４３～１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．細胞が動物細胞である、実施形態１４３～１４８のいずれかに記載の方法。
１５０．動物細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１４９に記載の方法。
１５１．細胞がイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、又はヒトに由来する、実施形態１５０に記載の方法。
１５２．原因変異の修正が、ナンセンス変異を修正することを含む、実施形態１４３～１５１のいずれか１つに記載の方法。
１５３．遺伝性疾患が表３４に列挙された疾患である、実施形態１４９に記載の方法。
１５４．遺伝性疾患が嚢胞性線維症である、実施形態１４９に記載の方法。
１５５．ｇＲＮＡが、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３のいずれか１つ又はその相補体を標的化するスペーサー配列を更に含む、実施形態１５４に記載の方法。
１５６．ｇＲＮＡが、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つを含む、実施形態１５５に記載の方法。
１５７．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はそれをコードする核酸分子であって、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を標的化するスペーサー配列を含み、該標的配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、５６２、及び５６３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有する、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はそれをコードする核酸分子。
１５８．実施形態１５７に記載のｃｒＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡ。
１５９．二重ガイドＲＮＡである、実施形態１５８に記載のガイドＲＮＡ。
１６０．単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１５８に記載のガイドＲＮＡ。
１６１．該ｓｇＲＮＡが、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１６０に記載のガイドＲＮＡ。
１６２．該ｓｇＲＮＡが、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１６０に記載のガイドＲＮＡ。
１６３．該ｓｇＲＮＡが、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つに記載の配列を有する、実施形態１６０に記載のガイドＲＮＡ。
１６４．実施形態１５８～１６３のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸分子を含む、ベクター。
１６５．ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列を結合させるためのシステムであって、
ａ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドと、
ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）及びアデニンデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとを含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能であり、
１つ以上のガイドＲＮＡが、ＲＧＮポリペプチドを該ＤＮＡ分子の該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させるために、ＲＧＮポリペプチドと複合体を形成可能であり、
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を標的化するスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、該標的配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、５６２、及び５６３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有する、システム。
１６６．１つ以上のガイドＲＮＡをコードする該ヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、該ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態１６５に記載のシステム。
１６７．ＤＮＡ分子の標的ＤＮＡ配列を結合させるためのシステムであって、
ａ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドと、
ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）及びアデニンデアミナーゼを含む融合タンパク質とを含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能であり、
１つ以上のガイドＲＮＡが、該ＲＧＮポリペプチドをＤＮＡ分子の該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させるために、ＲＧＮポリペプチドと複合体を形成可能であり、
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を標的化するスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、該標的配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、５６２、及び５６３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有する、システム。
１６８．１つ以上のガイドＲＮＡをコードする該ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、該ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態１６７に記載のシステム。
１６９．デアミナーゼが、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１６５～１６８のいずれか１つに記載のシステム。
１７０．デアミナーゼが、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１６５～１６８のいずれか１つに記載のシステム。
１７１．デアミナーゼが、配列番号１～１０及び３９９～４４１のいずれか１つに記載の配列を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１６５～１６８のいずれか１つに記載のシステム。
１７２．該ＲＧＮポリペプチド及び１つ以上の該ガイドＲＮＡが、自然では互いに複合体化されていることが見出されない、実施形態１６５～１７１のいずれか１つに記載のシステム。
１７３．実施形態１６５～１７２のいずれか１つに記載のシステムであって、
ａ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～６８、８０～８５、１１６～１１９、１２８～１３１、１６３、１６４、１８０、１８１、２０３～２０９、２１９～２２５、２５６～２５８、２７４～２７６、３１０～３１３、及び３３０～３３３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号６８～７１、８６～８９、１２０～１２２、１３２～１３４、１５２～１５６、１６９～１７３、２１３～２１５、２２９～２３１、２５１～２５５、２６９～２７３、３０５～３０９、及び３２５～３２９のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｃ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７２、７３、９０、９１、１６１、１６２、１７８、１７９、２６５、２６６、２８３、及び２８４のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｄ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７４、７５、９２、９３、１２３、１２４、１３５、１３６、１６７、１８４、２１６～２１８、２３２～２３４、２５９～２６１、２７７～２７９、３１４～３１７、及び３３４～３３７のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｅ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７６、９４、２１０～２１２、２２６～２２８、３２２、３４２、５６２、及び５６３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｆ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７７、９５、１２５、１３７、１５７～１６０、１７４～１７７、３２３、及び３４３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｇ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７８、９６、１２６、１３８、１６８、１８５、２６７、２８５、３１８、３１９、３３８、及び３３９のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｈ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７９、９７、１２７、１３９、２６２～２６４、２８０～２８２、３２４、及び３４４のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、並びに
ｉ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号１６５、１６６、１８２、１８３、２６８、２８６、３２０、３２１、３４０、及び３４１のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する、システム。
１７４．実施形態１６５～１７２のいずれか１つに記載のシステムであって、
ａ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～６８、８０～８５、１１６～１１９、１２８～１３１、１６３、１６４、１８０、１８１、２０３～２０９、２１９～２２５、２５６～２５８、２７４～２７６、３１０～３１３、及び３３０～３３３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号６８～７１、８６～８９、１２０～１２２、１３２～１３４、１５２～１５６、１６９～１７３、２１３～２１５、２２９～２３１、２５１～２５５、２６９～２７３、３０５～３０９、及び３２５～３２９のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｃ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７２、７３、９０、９１、１６１、１６２、１７８、１７９、２６５、２６６、２８３、及び２８４のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｄ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７４、７５、９２、９３、１２３、１２４、１３５、１３６、１６７、１８４、２１６～２１８、２３２～２３４、２５９～２６１、２７７～２７９、３１４～３１７、及び３３４～３３７のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｅ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７６、９４、２１０～２１２、２２６～２２８、３２２、３４２、５６２、及び５６３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｆ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７７、９５、１２５、１３７、１５７～１６０、１７４～１７７、３２３、及び３４３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｇ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７８、９６、１２６、１３８、１６８、１８５、２６７、２８５、３１８、３１９、３３８、及び３３９のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｈ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７９、９７、１２７、１３９、２６２～２６４、２８０～２８２、３２４、及び３４４のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、並びに
ｉ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号１６５、１６６、１８２、１８３、２６８、２８６、３２０、３２１、３４０、及び３４１のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する、システム。
１７５．実施形態１６５～１７２のいずれか１つに記載のシステムであって、
ａ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～６８、８０～８５、１１６～１１９、１２８～１３１、１６３、１６４、１８０、１８１、２０３～２０９、２１９～２２５、２５６～２５８、２７４～２７６、３１０～３１３、及び３３０～３３３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５３に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号６８～７１、８６～８９、１２０～１２２、１３２～１３４、１５２～１５６、１６９～１７３、２１３～２１５、２２９～２３１、２５１～２５５、２６９～２７３、３０５～３０９、及び３２５～３２９のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５５に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｃ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７２、７３、９０、９１、１６１、１６２、１７８、１７９、２６５、２６６、２８３、及び２８４のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５２に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｄ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７４、７５、９２、９３、１２３、１２４、１３５、１３６、１６７、１８４、２１６～２１８、２３２～２３４、２５９～２６１、２７７～２７９、３１４～３１７、及び３３４～３３７のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５６に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｅ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７６、９４、２１０～２１２、２２６～２２８、３２２、３４２、５６２、及び５６３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号４２に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｆ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７７、９５、１２５、１３７、１５７～１６０、１７４～１７７、３２３、及び３４３のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５４に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｇ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７８、９６、１２６、１３８、１６８、１８５、２６７、２８５、３１８、３１９、３３８、及び３３９のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５７に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｈ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号７９、９７、１２７、１３９、２６２～２６４、２８０～２８２、３２４、及び３４４のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５８に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、並びに
ｉ）該標的ＤＮＡ配列が、配列番号１６５、１６６、１８２、１８３、２６８、２８６、３２０、３２１、３４０、及び３４１のいずれか１つに記載の配列又はその相補体を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５９に対して１００％の配列同一性を有する配列を有する、システム。
１７６．少なくとも１つのガイドＲＮＡが、二重ガイドＲＮＡである、実施形態１６５～１７５のいずれか１つに記載のシステム。
１７７．少なくとも１つのガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１６５～１７５のいずれか１つに記載のシステム。
１７８．実施形態１７７に記載のシステムであって、
ａ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号９８～１０４、１４０～１４３、１９７、１９８、２３５～２４１、２９２～２９４、及び３５０～３５３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｂ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１０４～１０７、１４４～１４６、１８６～１９０、２４５～２４７、２８７～２９１、及び３４５～３４９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｃ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１０８、１０９、１９５、１９６、３０１、及び３０２のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｄ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１０、１１１、１４７、１４８、２０１、２４８～２５０、２９５～２９７、及び３５４～３５７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｅ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１２、２４２～２４４、３６２、及び５６４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｆ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１３、１４９、１９１～１９４、及び３６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｇ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１４、１５０、２０２、３０３、３５８、及び３５９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、
ｈ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１５、１５１、２９８～３００、及び３６４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、並びに
ｉ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１９９、２００、３０４、３６０、及び３６１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する、システム。
１７９．実施形態１７７に記載のシステムであって、
ａ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号９８～１０４、１４０～１４３、１９７、１９８、２３５～２４１、２９２～２９４、及び３５０～３５３のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｂ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１０４～１０７、１４４～１４６、１８６～１９０、２４５～２４７、２８７～２９１、及び３４５～３４９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｃ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１０８、１０９、１９５、１９６、３０１、及び３０２のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｄ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１０、１１１、１４７、１４８、２０１、２４８～２５０、２９５～２９７、及び３５４～３５７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｅ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１２、２４２～２４４、３６２、及び５６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号４２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｆ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１３、１４９、１９１～１９４、及び３６３のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｇ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１４、１５０、２０２、３０３、３５８、及び３５９のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、
ｈ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１５、１５１、２９８～３００、及び３６４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、並びに
ｉ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１９９、２００、３０４、３６０、及び３６１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する、システム。
１８０．実施形態１７７に記載のシステムであって、
ａ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号９８～１０４、１４０～１４３、１９７、１９８、２３５～２４１、２９２～２９４、及び３５０～３５３のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５３に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｂ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１０４～１０７、１４４～１４６、１８６～１９０、２４５～２４７、２８７～２９１、及び３４５～３４９のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５５に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｃ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１０８、１０９、１９５、１９６、３０１、及び３０２のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５２に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｄ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１０、１１１、１４７、１４８、２０１、２４８～２５０、２９５～２９７、及び３５４～３５７のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５６に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｅ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１２、２４２～２４４、３６２、及び５６４のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号４２に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｆ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１３、１４９、１９１～１９４、及び３６３のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５４に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｇ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１４、１５０、２０２、３０３、３５８、及び３５９のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５７に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、
ｈ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１１５、１５１、２９８～３００、及び３６４のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５８に対して１００％の配列同一性を有する配列を有し、並びに
ｉ）該ｓｇＲＮＡが、配列番号１９９、２００、３０４、３６０、及び３６１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有し、該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号５９に対して１００％の配列同一性を有する配列を有する、システム。
１８１．実施形態１５７に記載のｃｒＲＮＡ若しくは核酸分子、実施形態１５８～１６３のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ、実施形態１６４に記載のベクター、又は実施形態１６５～１８０のいずれか１つに記載のシステムを含む、細胞。
１８２．実施形態１５７に記載のｃｒＲＮＡ若しくは核酸分子、実施形態１５８～１６３のいずれか１つに記載のガイドＲＮＡ、実施形態１６４に記載のベクター、実施形態１８１に記載の細胞、又は実施形態１６５～１８０のいずれか１つに記載のシステムと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
１８３．
ａ）ＤＮＡ結合ポリペプチド及びアデニンデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードする核酸分子と、
ｂ）配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアデニンデアミナーゼ、又は該デアミナーゼをコードする核酸分子とを含む、組成物。
１８４．該第２のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１８３に記載の組成物。
１８５．該第２のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態１８３に記載の組成物。
１８６．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１８３～１８５のいずれか１つに記載の組成物。
１８７．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１８３～１８６のいずれか１つに記載の組成物。
１８８．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態１８３～１８６のいずれか１つに記載の組成物。
１８９．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態１８３～１８８のいずれか１つに記載の組成物。
１９０．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態１８３～１８９のいずれか１つに記載の組成物。
１９１．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態１９０に記載の組成物。
１９２．ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態１９１に記載の組成物。
１９３．融合タンパク質をコードする核酸分子と、第２のデアミナーゼとをコードする核酸分子を含むベクターであって、該融合タンパク質がＤＮＡ結合ポリペプチド及び第１のアデニンデアミナーゼを含み、該第２のアデニンデアミナーゼが配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、ベクター。
１９４．該第２のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１９３に記載のベクター。
１９５．該第２のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態１９３に記載のベクター。
１９６．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１９３～１９５のいずれか１つに記載のベクター。
１９７．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１９３～１９５のいずれか１つに記載のベクター。
１９８．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態１９３～１９５のいずれか１つに記載のベクター。
１９９．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態１９３～１９８のいずれか１つに記載のベクター。
２００．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態１９３～１９８のいずれか１つに記載のベクター。
２０１．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態２００に記載のベクター。
２０２．ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態２０１に記載のベクター。
２０３．実施形態１９３～２０２のいずれか１つに記載のベクターを含む、細胞。
２０４．
ａ）ＤＮＡ結合ポリペプチド及び第１のアデニンデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードする核酸分子と、
ｂ）配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のアデニンデアミナーゼ、又は第２のアデニンデアミナーゼをコードする核酸分子とを含む、細胞。
２０５．該第２のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２０４に記載の細胞。
２０６．該第２のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態２０４に記載の細胞。
２０７．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２０４～２０６のいずれか１つに記載の細胞。
２０８．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２０４～２０６のいずれか１つに記載の細胞。
２０９．第１のアデニンデアミナーゼが、配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有する、実施形態２０４～２０６のいずれか１つに記載の細胞。
２１０．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態２０４～２０９のいずれか１つに記載の細胞。
２１１．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２０４～２０９のいずれか１つに記載の細胞。
２１２．ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態２１１に記載の細胞。
２１３．ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態２１２に記載の細胞。
２１４．医薬的に許容される担体と、実施形態１８３～１９２のいずれか１つに記載の組成物、実施形態１９３～２０２のいずれか１つに記載のベクター、又は実施形態２０３～２１３のいずれか１つに記載の細胞とを含む、医薬組成物。
２１５．疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の実施形態６９、１００、１４２、及び２１４のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
２１６．該疾患が原因変異に関連し、該有効量の該医薬組成物が該原因変異を修正する、実施形態２１５に記載の方法。
２１７．対象における疾患の治療のための、実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態２８～４８のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態４９～５２及び１９３～２０２のいずれか１つに記載のベクター、実施形態５９～６３、１３５～１３９及び２０３～２１３のいずれか１つに記載の細胞、実施形態７５～９９のいずれか１つに記載のシステム、又は実施形態１８３～１９２のいずれか１つに記載の組成物の使用。
２１８．該疾患が原因変異に関連し、該治療が該原因変異を修正することを含む、実施形態２１７に記載の使用。
２１９．疾患の治療に有用な医薬品の製造のための、実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態２８～４８のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態４９～５２及び１９３～２０２のいずれか１つに記載のベクター、実施形態５９～６３、１３５～１３９及び２０３～２１３のいずれか１つに記載の細胞、実施形態７５～９９のいずれか１つに記載のシステム、又は実施形態１８３～１９２のいずれか１つに記載の組成物の使用。
２２０．該疾患が原因変異に関連し、有効量の該医薬品が該原因変異を修正する、実施形態２１９に記載の使用。
２２１．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチドが、配列番号４１又は６０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号４１又は６０のアミノ酸残基５９０～５９７を欠くＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
該ＲＧＮポリペプチドが、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合する際にＲＮＡに誘導されて配列特異的に該標的ＤＮＡ配列に結合可能である、方法。
２２２．ＲＧＮポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドに対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態２２１に記載の核酸分子。
２２３．該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号３６６又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２２１又は２２２に記載の核酸分子。
２２４．該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号３６６又は３６８のアミノ酸配列を含む、実施形態２２１又は２２２に記載の核酸分子。
２２５．該ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ失活型であるか、又はニッカーゼとして機能する、実施形態２２１～２２３のいずれか１つに記載の核酸分子。
２２６．該ニッカーゼが、配列番号３９７又は３９８に記載のアミノ酸配列を有する、実施形態２２５に記載の核酸分子。
２２７．ＲＧＮポリペプチドが、塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、実施形態２２１～２２６のいずれか１つに記載の核酸分子。
２２８．請求項２２１～２２７のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
２２９．配列番号４１又は６０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号４１又は６０のアミノ酸残基５９０～５９７を欠く単離されたポリペプチドであって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、単離されたポリペプチド。
２３０．該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号３６６又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２２９に記載の単離されたポリペプチド。
２３１．該ＲＧＮポリペプチドが、配列番号３６６又は３６８のアミノ酸配列を含む、実施形態２３０に記載の単離されたポリペプチド。
２３２．該ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ失活型であるか、又はニッカーゼとして機能する、実施形態２２９又は２３０に記載の単離されたポリペプチド。
２３３．該ニッカーゼが、配列番号３９７又は３９８に記載のアミノ酸配列を有する、実施形態２３２に記載の単離されたポリペプチド。
２３４．ＲＧＮポリペプチドが、塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、実施形態２２９～２３３のいずれか１つに記載の単離されたポリペプチド。
２３５．実施形態２２１～２２７のいずれか１つに記載の核酸分子、請求項２２８に記載のベクター、又は請求項２２９～２３４のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む、細胞。
２３６．配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
２３７．配列番号４０７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、デアミナーゼ活性を有する、実施形態２３６に記載の単離されたポリペプチド。
２３８．配列番号４０７に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態２３６に記載の単離されたポリペプチド。
２３９．デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号４０７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
２４０．デアミナーゼが、配列番号４５１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２３９に記載の核酸分子。
２４１．デアミナーゼが、配列番号４５１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２３９に記載の核酸分子。
２４２．デアミナーゼが、配列番号４５１に対して少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２３９に記載の核酸分子。
２４３．該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、実施形態２３９～２４２のいずれか１つに記載の核酸分子。
２４４．医薬的に許容される担体と、実施形態２３６～２３８のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態２３９～２４２のいずれか１つに記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
２４５．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
２４６．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、実施形態２４５に記載の融合タンパク質。
２４７．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０７に対して１００％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、実施形態２４５に記載の融合タンパク質。
２４８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態２４５～２４７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２４９．ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２４８に記載の融合タンパク質。
２５０．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、実施形態２４８又は２４９に記載の融合タンパク質。
２５１．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態２４８～２５０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２５２．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２５１に記載の融合タンパク質。
２５３．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２５１に記載の融合タンパク質。
２５４．ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
２５５．デアミナーゼが、配列番号４５１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２５４に記載の核酸分子。
２５６．デアミナーゼが、配列番号４５１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２５４に記載に記載の核酸分子。
２５７．デアミナーゼが、配列番号４５１に対して少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２５４に記載の核酸分子。
２５８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＧＮポリペプチドである、実施形態２５４～２５７のいずれか１つに記載の核酸分子。
２５９．ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２５８に記載の核酸分子。
２６０．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、実施形態２５８又は２５９に記載の核酸分子。
２６１．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態２５８～２６０のいずれか１つに記載の核酸分子。
２６２．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２６１に記載の核酸分子。
２６３．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２６２に記載の核酸分子。
２６４．実施形態２５４～２６３のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
２６５．標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、実施形態２６４に記載のベクター。
２６６．実施形態２４５～２５３のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
２６７．実施形態２４５～２５３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態２５４～２６３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態２６４若しくは２６５に記載のベクター、又は実施形態２６６に記載のＲＮＰ複合体を含む、細胞。
２６８．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド、及び配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが、該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
２６９．該デアミナーゼが、配列番号４０７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２６８に記載のシステム。
２７０．該デアミナーゼが、配列番号４０７に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２６８に記載のシステム。
２７１．１つ以上のガイドＲＮＡをコードする該ヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、該ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態２６８～２７０のいずれか１つに記載のシステム。
２７２．標的ＤＮＡ配列が、ＲＧＮポリペプチドによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態２６８～２７１のいずれか１つに記載のシステム。
２７３．標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、実施形態２６８～２７２のいずれか１つに記載のシステム。
２７４．ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態２６８～２７３のいずれか１つに記載のシステム。
２７５．融合タンパク質のＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２６８～２７４のいずれか１つに記載のシステム。
２７６．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮである、実施形態２７２～２７５のいずれか１つに記載のシステム。
２７７．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態２７６に記載のシステム。
２７８．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態２７７に記載のシステム。
２７９．医薬的に許容される担体と、実施形態２４５～２５３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態２５４～２６３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態２６４若しくは２６５に記載のベクター、実施形態２６６に記載のＲＮＰ複合体、実施形態２６７に記載の細胞、又は実施形態２６８～２８のいずれか１つに記載のシステムとを含む、医薬組成物。
２８０．標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
ａ）
ｉ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、及び配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることによりＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
ｂ）該標的ＤＮＡ分子又は該標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、構築されたＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
２８１．標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、実施形態２８０に記載の方法。
２８２．ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態２８０又は２８１に記載の方法。
２８３．インビトロ、生体内、又は生体外で行われる、実施形態２８０～２８３のいずれか１つに記載の方法。
２８４．疾患、障害、若しくは状態を有するか、又はそれを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、
実施形態２４５～２５３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態２５４～２６３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態２６４若しくは２６５に記載のベクター、実施形態２６６に記載のＲＮＰ複合体、実施形態２６７に記載の細胞、実施形態２６８～２８のいずれか１つに記載のシステム、又は実施形態２７９に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
２８５．配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含むｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを更に含む、実施形態２８４に記載の方法。
２８６．配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
２８７．配列番号４０５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む実施形態２８６に記載の単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、実施形態２８６に記載の単離されたポリペプチド。
２８８．配列番号４０７に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態２８６に記載の単離されたポリペプチド。
２８９．デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４４９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号４０５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
２９０．デアミナーゼが、配列番号４４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２８９に記載の核酸分子。
２９１．デアミナーゼが、配列番号４４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２８９に記載の核酸分子。
２９２．デアミナーゼが、配列番号４４９に対して少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２８９に記載の核酸分子。
２９３．該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、実施形態２８９～２９２のいずれか１つに記載の核酸分子。
２９４．医薬的に許容される担体と、実施形態２８６～２８８のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態２８９～２９３のいずれか１つに記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
２９５．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
２９６．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、実施形態２９５に記載の融合タンパク質。
２９７．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０５に対して１００％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、実施形態２９５に記載の融合タンパク質。
２９８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態２９５～２９７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
２９９．ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２９８に記載の融合タンパク質。
３００．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、実施形態２９８又は２９９に記載の融合タンパク質。
３０１．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態２９８～３００のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３０２．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３０１に記載の融合タンパク質。
３０３．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３０１に記載の融合タンパク質。
３０４．ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４４９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
３０５．デアミナーゼが、配列番号４４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３０４に記載の核酸分子。
３０６．デアミナーゼが、配列番号４４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３０４に記載の核酸分子。
３０７．デアミナーゼが、配列番号４４９に対して少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３０４に記載の核酸分子。
３０８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＧＮポリペプチドである、実施形態３０４～３０７のいずれか１つに記載の核酸分子。
３０９．ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３０８に記載の核酸分子。
３１０．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、実施形態３０８又は３０９に記載の核酸分子。
３１１．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態３０８～３１０のいずれか１つに記載の核酸分子。
３１２．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３１１に記載の核酸分子。
３１３．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３１２に記載の核酸分子。
３１４．実施形態３０４～３１３のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
３１５．標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、実施形態３１４に記載のベクター。
３１６．実施形態２９５～３０３のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
３１７．実施形態２９５～３０３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態３０４～３１３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３１４若しくは３１５に記載のベクター、又は実施形態３１６に記載のＲＮＰ複合体を含む、細胞。
３１８．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド、及び配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが、該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
３１９．該デアミナーゼが、配列番号４０５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３１８に記載のシステム。
３２０．該デアミナーゼが、配列番号４０５に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３１８に記載のシステム。
３２１．１つ以上のガイドＲＮＡをコードする該ヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、該ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態３１８～３２０のいずれか１つに記載のシステム。
３２２．標的ＤＮＡ配列が、ＲＧＮポリペプチドによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態３１８～３２１のいずれか１つに記載のシステム。
３２３．標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、実施形態３１８～３２２のいずれか１つに記載のシステム。
３２４．ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態３１８～３２３のいずれか１つに記載のシステム。
３２５．融合タンパク質のＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３１８～３２４のいずれか１つに記載のシステム。
３２６．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮである、実施形態３２２～３２５のいずれか１つに記載のシステム。
３２７．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態３２６に記載のシステム。
３２８．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３２７に記載のシステム。
３２９．医薬的に許容される担体と、実施形態２９５～３０３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態３０４～３１３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３１４若しくは３１５に記載のベクター、実施形態３１６に記載のＲＮＰ複合体、実施形態３１７に記載の細胞、又は実施形態３１８～３２８のいずれか１つに記載のシステムとを含む、医薬組成物。
３３０．標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
ａ）
ｉ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、及び配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることによりＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
ｂ）該標的ＤＮＡ分子又は該標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、構築されたＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして該融合タンパク質を標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
３３１．標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、実施形態３３０に記載の方法。
３３２．ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態３３０又は３３１に記載の方法。
３３３．インビトロ、生体内、又は生体外で行われる、実施形態３３０～３３２のいずれか１つに記載の方法。
３３４．疾患、障害、若しくは状態を有するか、又はそれを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、
実施形態２９５～３０３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態３０４～３１３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３１４若しくは３１５に記載のベクター、実施形態３１６に記載のＲＮＰ複合体、実施形態３１７に記載の細胞、実施形態３１８～３２８のいずれか１つに記載のシステム、又は実施形態３２９に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
３３５．配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含むｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを更に含む、実施形態３３４に記載の方法。
３３６．配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
３３７．配列番号３９９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む実施形態３３６に記載の単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、実施形態３３６に記載の単離されたポリペプチド。
３３８．配列番号３９９に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態３３６に記載の単離されたポリペプチド。
３３９．デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４４３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号３９９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
３４０．デアミナーゼが、配列番号４４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３３９に記載の核酸分子。
３４１．デアミナーゼが、配列番号４４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３３９に記載の核酸分子。
３４２．デアミナーゼが、配列番号４４３に対して少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３３９に記載の核酸分子。
３４３．該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、実施形態３３９～３４２のいずれか１つに記載の核酸分子。
３４４．医薬的に許容される担体と、実施形態３３６～３３８のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態３３９～３４２のいずれか１つに記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
３４５．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
３４６．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号３９９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、実施形態３４５に記載の融合タンパク質。
３４７．ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号３９９に対して１００％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、実施形態３４５に記載の融合タンパク質。
３４８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態３４５～３４７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３４９．ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３４８に記載の融合タンパク質。
３５０．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、実施形態３４８又は３４９に記載の融合タンパク質。
３５１．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態３４８～３５０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
３５２．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３５１に記載の融合タンパク質。
３５３．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３５１に記載の融合タンパク質。
３５４．ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、デアミナーゼが、
ａ）配列番号４４３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
ｂ）配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
３５５．デアミナーゼが、配列番号４４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３５４に記載の核酸分子。
３５６．デアミナーゼが、配列番号４４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３５４に記載の核酸分子。
３５７．デアミナーゼが、配列番号４４３に対して少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３５４に記載の核酸分子。
３５８．ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＧＮポリペプチドである、実施形態３５４～３５７のいずれか１つに記載の核酸分子。
３５９．ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３５８に記載の核酸分子。
３６０．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、実施形態３５８又は３５９に記載の核酸分子。
３６１．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態３５８～３６０のいずれか１つに記載の核酸分子。
３６２．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３６１に記載の核酸分子。
３６３．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３６２に記載の核酸分子。
３６４．実施形態３５４～３６３のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
３６５．標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、実施形態３６４に記載のベクター。
３６６．実施形態３４５～３５３のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
３６７．実施形態３４５～３５３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態３５４～３６３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３６４若しくは３６５に記載のベクター、又は実施形態３６６に記載のＲＮＰ複合体を含む、細胞。
３６８．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド、及び配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが、該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
３６９．該デアミナーゼが、配列番号３９９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３６８に記載のシステム。
３７０．該デアミナーゼが、配列番号３９９に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３６８に記載のシステム。
３７１．１つ以上のガイドＲＮＡをコードする該ヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードする該ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、該ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、実施形態３６８～３７０のいずれか１つに記載のシステム。
３７２．標的ＤＮＡ配列が、ＲＧＮポリペプチドによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態３６８～３７１のいずれか１つに記載のシステム。
３７３．標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、実施形態３６８～３７２のいずれか１つに記載のシステム。
３７４．ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態３６８～３７３のいずれか１つに記載のシステム。
３７５．融合タンパク質のＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３６８～３７４のいずれか１つに記載のシステム。
３７６．ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮである、実施形態３７２～３７５のいずれか１つに記載のシステム。
３７７．ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、実施形態３７６に記載のシステム。
３７８．ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態３７７に記載のシステム。
３７９．医薬的に許容される担体と、実施形態３４５～３５３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態３５４～３６３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３６４～３６５のいずれか１つに記載のベクター、実施形態３６６に記載のＲＮＰ複合体、実施形態３６７に記載の細胞、又は実施形態３６８～３７８のいずれか１つに記載のシステムとを含む、医薬組成物。
３８０．標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
ａ）
ｉ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、及び配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることによりＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
ｂ）該標的ＤＮＡ分子又は該標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、構築されたＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
１つ以上のガイドＲＮＡが標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして該融合タンパク質を該標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
３８１．標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、実施形態３８０に記載の方法。
３８２．ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態３８０～３８１のいずれか１つに記載の方法。
３８３．インビトロ、生体内、又は生体外で行われる、実施形態３８０～３８２のいずれか１つに記載の方法。
３８４．疾患、障害、若しくは状態を有するか、又はそれを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、
実施形態３４５～３５３のいずれかに記載の融合タンパク質、実施形態３５４～３６３のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３６４～３６５のいずれか１つに記載のベクター、実施形態３６６に記載のＲＮＰ複合体、実施形態３６７に記載の細胞、実施形態３６８～３７８のいずれか１つに記載のシステム、又は実施形態３７９に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
３８５．配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含むｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを更に含む、実施形態３８４に記載の方法。
３８６．嚢胞性線維症の少なくとも１つの症状を治療又は軽減するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、
ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は細胞における該融合タンパク質の発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は細胞における該ｇＲＮＡの発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、該ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、
を投与することを含み、
これにより、該融合タンパク質及びｇＲＮＡは原因変異のゲノム位置を標的とし、原因変異を除去するようにゲノム配列を修飾する、方法。
３８７．ｇＲＮＡが、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３のいずれか１つ又はその相補体を標的化するスペーサー配列を含む、実施形態３８６に記載の方法。
３８８．ｇＲＮＡが、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つを含む、実施形態３８６又は３８７に記載の方法。
３８９．該ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３８６～３８８のいずれか一項に記載の方法。
３９０．該ＲＧＮが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３８６～３８９のいずれか一項に記載の方法。
以下の実施例は説明のために提供されているものであり、制限限定するためのものではない。
実験
実施例１：哺乳動物細胞における塩基編集の実証
以下の表１に示されるデアミナーゼは、天然に存在するデアミナーゼに基づいて作製され、次いで、原核細胞におけるアデニンデアミナーゼ活性のために変異及び選択したものである。
表１のデアミナーゼが哺乳動物細胞においてアデニン塩基編集を行うことができるかどうかを判定するために、各デアミナーゼをＲＧＮニッカーゼに作動可能に融合させて融合タンパク質を作製した。ＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４１として示され；国際公開第２０１９／２３６５６６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）のＲｕｖＣドメインを不活性化すると予測される残基を同定し、このＲＧＮをニッカーゼバリアント（ｎＡＰＧ０７４３３．１；配列番号４２）に修飾した。ＲＧＮのニッカーゼバリアントは、本明細書では「ｎＲＧＮ」と呼ばれる。ＲＧＮの任意のニッカーゼバリアントを使用して、本発明の融合タンパク質を作製できることが理解されるべきである。
哺乳動物発現のためにコドン最適化されたデアミナーゼ及びｎＲＧＮヌクレオチド配列を、Ｎ末端核局在タグを有する融合タンパク質として合成し、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）発現プラスミドにクローニングした。各融合タンパク質は、アミノ末端から開始して、Ｃ末端で３Ｘ ＦＬＡＧタグ（配列番号４４）に作動可能に連結され、Ｃ末端でデアミナーゼに作動可能に連結され、Ｃ末端でペプチドリンカー（配列番号４５）に作動可能に連結され、Ｃ末端でｎＲＧＮ（例えば、配列番号４２であるｎＡＰＧ０７４３３．１）に作動可能に連結され、最後にＣ末端でヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号４５）に作動可能に連結されたＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号４３）を含む。全ての融合タンパク質は、上記のように、少なくとも１つのＮＬＳと、３Ｘ ＦＬＡＧタグとを含む。
ヒトＵ６プロモータ（配列番号５０）によって発現されるｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む発現プラスミドも作製した。ヒトゲノム標的配列と、融合タンパク質をゲノム標的に誘導するためのｓｇＲＮＡ配列とを表２に示す。
表１に記載の各デアミナーゼの融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミド及び表２に示すｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２４ウェルプレート中の７５～９０％コンフルエントなＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に共トランスフェクトした。次いで、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ９６ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。標的ゲノム部位に隣接するゲノム領域を、表２のプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでの次世代シークエンシングに供した。典型的には、アンプリコン当たり１００，０００個の２５０ｂｐペアエンドリード（２×１００，０００個のリード）が生成される。リードを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，３４：６９５－６９７）を使用して分析して、編集率を計算した。出力アラインメントを、ＩＮＤＥＬ（インデル）形成又は特異的アデニン変異の導入について分析した。表３～表７は、ｎＡＰＧ０７４３３．１及び表１のデアミナーゼ及び表２のガイドＲＮＡを含む各融合タンパク質のアデニン塩基編集を示す。各融合タンパク質のデアミナーゼ成分が示される。標的配列内又は標的配列に近接するアデニンの編集率が示される。「Ａ５」は、例えば、標的配列の５位のアデニンを示す。標的配列中の各ヌクレオチドの位置は、ＰＡＭに最も近い標的配列中の最初のヌクレオチドを１位として番号付けすることによって決定され、位置番号は、ＰＡＭ配列から離れて３’方向に増加する。表はまた、アデニンがどのヌクレオチドに、どの程度の割合で変化したかも示す。例えば、表３は、ＡＰＧ０９９８２－ｎＡＰＧ０７４３３．１融合タンパク質について、１３位のアデニンが１．２％の率でグアニンに変異したことを示す。
全ての融合タンパク質は、Ａ１２位及びＡ１３位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＡＰＧ０９９８２及びＡＰＧ０６３３３は、Ａ１３位で少なくとも１％の編集を示した。
全ての融合タンパク質は、Ａ１１位及びＡ１４位でＡ＞Ｇ変換を示した。ＡＰＧ０９９８２は、Ａ１１のＧへの変換率４．５％、Ａ１４のＧへの変換率１．７％を示した。
全ての融合タンパク質は、標的ＳＧＮ０００１８６の複数の位置で１％を超える塩基編集を示した。ＡＰＧ０９１０２は、Ａ１６位で６．２％のＡ＞Ｇ変換率を示し、Ａ９位及びＡ１８位で２％を超える塩基編集を示した。試験した全ての融合タンパク質で、Ａ１６位が最も編集されていた。
ＳＧＮ００１９４を用いると、全ての融合タンパク質が、Ａ１５位で０．９％～１．８％のＡ＞Ｇ編集を示した。Ａ２１位、Ａ２３位、Ａ２６位、及びＡ２７位では検出可能な編集がみられなかった。
Ａ１４は、全ての融合タンパク質を試験して、ＳＧＮ０００９３０においても最も編集された位置であった。Ａ＞Ｇ変換について、編集率は０．３％～１．２％の範囲であった。
実施例２：標的化アデニン塩基編集のための蛍光アッセイ
未成熟終止コドンを引き起こすＷ５８Ｘ変異を含む高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（ＧＦＰ－ＳＴＯＰ、配列番号４７）を有するベクターを構築し、それによりＷ５８コドンを、アデニンデアミナーゼを用いて３位をＡからＧに変えることで、終止コドン（ＴＧＡ）から野生型トリプトファン（ＴＧＧ）残基に復帰することが可能にあった。ＡからＧへの変換が成功すると、定量化することができるＥＧＦＰが発現する。デアミナーゼ－ＲＧＮ融合タンパク質をＷ５８Ｘ変異（配列番号４８）周辺の領域に標的化するガイドＲＮＡを発現可能な第２のベクターも作製した。
このＧＦＰ－ＳＴＯＰレポーターベクターと、デアミナーゼ－ｎＲＧＮ融合タンパク質及び対応するガイドＲＮＡを発現可能なベクターとを共に、リポフェクション又はエレクトロポレーションのいずれかを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。リポフェクションでは、成長培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中でのトランスフェクションの前日に、細胞を１ｘ１０５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。各々５００ｎｇのＧＦＰ－ＳＴＯＰレポーターベクター、デアミナーゼ－ＲＧＮ発現ベクター、及びガイドＲＮＡ発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。エレクトロポレーションでは、細胞を、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いてエレクトロポレーションした。
蛍光ＧＦＰ－ＳＴＯＰレポーターの一過性トランスフェクションに加えて、染色体に組み込まれたＧＦＰ－ＳＴＯＰカセットを有する安定な細胞株を作製した。安定な株が設けられてから、トランスフェクションでは、成長培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中でのトランスフェクションの前日に、細胞を１ｘ１０５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。各々５００ｎｇのデアミナーゼ－ｎＲＧＮ発現ベクター及びガイドＲＮＡ発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。エレクトロポレーションでは、細胞を、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いてエレクトロポレーションした。
リポフェクション又はエレクトロポレーションの２４～４８時間後、ＧＦＰの発現を、ＧＦＰ＋細胞の存在について細胞を顕微鏡で調査することにより測定した。目視検査の後、ＧＦＰ＋細胞対ＧＦＰ－細胞の割合を決定することができる。各デアミナーゼ－ｎＲＧＮ融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞で蛍光が観察されたことから、融合タンパク質がＧＦＰ－ＳＴＯＰ変異をうまく標的化し、変異を編集してＧＦＰタンパク質の蛍光を回復させたことが示された。
顕微鏡分析の後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、得られた溶解物を蛍光プレートリーダーで分析し、ＧＦＰの蛍光強度を決定した（表８）。当業者であれば、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別によって細胞を分析し、ＧＦＰ＋細胞及びＧＦＰ－細胞の正確な割合を決定することができることを理解するであろう。
Ｎ．Ｄ＝検出されず；＋＝わずかなＧＦＰ＋細胞の検出；＋＋＝いくつかのＧＦＰ＋細胞の検出；＋＋＋＝多くのＧＦＰ＋細胞の検出。
実施例３：哺乳動物細胞におけるＡ塩基編集の実証
以下の表９に示されるデアミナーゼは、天然に存在するデアミナーゼに基づいて作製され、次いで、原核細胞におけるアデニンデアミナーゼ活性のために変異及び選択したものである。
表９のデアミナーゼが哺乳動物細胞においてアデニン塩基編集を行うことができるかどうかを判定するために、各デアミナーゼをＲＧＮニッカーゼに作動可能に融合させて融合タンパク質を作製した。ＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号４１として示され；国際公開第２０１９／２３６５６６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）のＲｕｖＣドメインを不活性化すると予測される残基を同定し、このＲＧＮをニッカーゼバリアント（ｎＡＰＧ０７４３３．１；配列番号４２）に修飾した。ＲＧＮのニッカーゼバリアントは、本明細書では「ｎＲＧＮ」と呼ばれる。ＲＧＮの任意のニッカーゼバリアントを使用して、本発明の融合タンパク質を作製できることが理解されるべきである。
哺乳動物発現のためにコドン最適化されたデアミナーゼ及びｎＲＧＮヌクレオチド配列を、Ｎ末端核局在タグを有する融合タンパク質として合成し、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）発現プラスミドにクローニングした。各融合タンパク質は、アミノ末端から開始して、Ｃ末端で３Ｘ ＦＬＡＧタグ（配列番号４４）に作動可能に連結され、Ｃ末端でデアミナーゼに作動可能に連結され、Ｃ末端でペプチドリンカー（配列番号４４２）に作動可能に連結され、Ｃ末端でｎＲＧＮ（例えば、配列番号４２であるｎＡＰＧ０７４３３．１）に作動可能に連結され、最後にＣ末端でヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号４６）に作動可能に連結されたＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号４３）を含む。哺乳動物発現のためにコドン最適化されたｎＡＰＧ０７４３３．１及びペプチドリンカーヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号４８６及び４８７として記載する。表１０は、作製され、活性について試験された融合タンパク質を示す。全ての融合タンパク質は、上記のように、少なくとも１つのＮＬＳと、３Ｘ ＦＬＡＧタグとを含む。
ｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む発現プラスミドも作製した。ヒトゲノム標的配列と、融合タンパク質をゲノム標的に誘導するためのｓｇＲＮＡ配列とを表１１に示す。
表１０に示される融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミド及び表１１に示すｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２４ウェルプレート中の７５～９０％コンフルエントなＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に共トランスフェクトした。次いで、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ９６ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。標的ゲノム部位に隣接するゲノム領域を、表１１のプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでの次世代シークエンシングに供した。典型的には、アンプリコン当たり１００，０００個の２５０ｂｐペアエンドリード（２×１００，０００個のリード）が生成される。リードを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，３４：６９５－６９７）を使用して分析して、編集率を計算した。出力アラインメントを、インデル形成又は特異的アデニン変異の導入について分析した。
表１２は、表１０の各アデニンデアミナーゼ融合体及び表１２のガイドＲＮＡの全てのアデニン塩基編集を示す。表１３～表２７は、選択した例示的な試料の特異的ヌクレオチド変異プロファイルを示す。標的配列内又は標的配列に近接するアデニンの編集率が示される。「Ａ５」は、例えば、標的配列の５位のアデニンを示す。標的配列中の各ヌクレオチドの位置は、ＰＡＭ（ＡＰＧ０７４３３．１の標的の３’側である）に最も近い標的配列中の最初のヌクレオチドを１位として番号付けすることによって決定され、位置番号は、ＰＡＭ配列から離れて５’方向に増加する。表はまた、アデニンがどのヌクレオチドに、どの程度の率で変化したかも示す。例えば、表１３は、ＬＰＧ５０１４８－ｎＡＰＧ０７４３３．１融合タンパク質について、１３位のアデニンが９．７％の率でグアニンに変異したことを示す。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１２位及びＡ１３位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４８は、Ａ１３位で９％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位、Ａ１１位、及びＡ１４位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４８は、Ａ１１位で１１％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位、Ａ１６位、及びＡ１８位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位及びＡ１６位で２３％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１３位及びＡ１５位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４８は、Ａ１３位及びＡ１５位で１２％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１０位、Ａ１４位、Ａ１５位、Ａ１６位、Ａ２０位、及びＡ２１位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４８は、Ａ１０位、Ａ１４位、Ａ１６位、Ａ２０位、及びＡ２１位で２％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１２位及びＡ１３位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４６は、Ａ１３位で４％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位、Ａ１１位、及びＡ１４位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４６は、Ａ１１位で８％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位、Ａ１６位、及びＡ１８位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４６は、Ａ１６位で１３％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１３位及びＡ１５位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４６は、Ａ１３位及びＡ１５位で３％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１０位、Ａ１４位、Ａ１５位、Ａ１６位、Ａ２０位、及びＡ２１位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４６は、Ａ１４位及びＡ１６位で２％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１２位及びＡ１３位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４０は、Ａ１３位で５％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位、Ａ１１位、及びＡ１４位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４０は、Ａ１１位で１４％の編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ９位、Ａ１６位、及びＡ１８位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４０は、Ａ９位及びＡ１６位で９％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１３位及びＡ１５位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４０は、Ａ１３位及びＡ１５位で６％を超える編集を示した。
ＬＰＧ５０１４０、ＬＰＧ５０１４６、及びＬＰＧ５０１４８は、Ａ１０位、Ａ１４位、Ａ１５位、Ａ１６位、Ａ２０位、及びＡ２１位で検出可能なＡ＞Ｇ変換を示した。ＬＰＧ５０１４０は、Ａ１４位及びＡ１６位で１％を超える編集を示した。
以下の表２８は、２つのプラスミドのリポフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において試験されたいくつかのガイドにおけるＬＰＧ５０１４８－ｎＡＰＧ０７４３３．１の平均編集率を示す。塩基エディタは１つのプラスミド上にコードされ、ガイドＲＮＡは第２のプラスミド上にコードされた。標的における総置換率を使用して、塩基編集率を測定する。
ＬＰＧ５０１４８－ｎＡＰＧ０７４３３．１は、上記ゲノムにわたって様々なガイドで編集を示す。
表２９は、ＬＰＧ５０１４８－ｎＡＰＧ０７４３３．１の各ガイドにおけるアデニン塩基の編集率を示す。アデニン位置のみが以下に示される。アデニン変換率は、適切な場合は複数回の実験の平均である。
ＬＰＧ５０１４８－ｎＡＰＧ０７４３３．１は、使用したガイドＲＮＡに応じて、標的領域中の６位～２１位においてアデニン塩基編集を示す。編集率は、使用するガイドＲＮＡによって異なる。
実施例４：クラスＩ嚢胞性線維症ナンセンス変異の修正
実施例４．１：ＲＧＮ及びガイドＲＮＡの同定
嚢胞性線維症は、概して、ＣＦＴＲ遺伝子（配列番号５１）における有害な変異によって引き起こされる。最も一般的な６つのナンセンス変異は、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、Ｅ６０Ｘ、Ｒ７８５Ｘ、及びＱ４９３Ｘである。これらの終止変異の各々は、本明細書に記載のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質によってコードコドンを回復するように編集され得る。各変異を標的化するために、１）ナンセンス変異に近接するＰＡＭ認識部位を有するＲＧＮ、及び２）ＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質を標的ＤＮＡに最適に標的化するガイドＲＮＡを決定する必要がある。以下の表３０は、６つのナンセンス変異の各々に近接するＰＡＭを有するＲＧＮのニッカーゼバリアントと、各ＲＧＮに使用することができるガイドＲＮＡの数とを示す。表３１には、各ガイドＲＮＡの遺伝子座を記載する。各遺伝子座のＰＡＭ認識部位に下線が付されている。ガイドＲＮＡの標的配列及びガイドＲＮＡ配列自体も示されている。
実施例３の表２８は、ＣＦＴＲを標的化するＳＧＮ００１１０１ ｓｇＲＮＡについての編集データを提供する。
他のガイドＲＮＡの活性についてアッセイするため、表３１のガイドＲＮＡを、本発明のデアミナーゼに作動可能に連結されて融合タンパク質を作製する、表３０に記載の各ＲＧＮの対応するニッカーゼバリアントと共に提供する。各ＲＧＮのヌクレアーゼ不活性型バリアントも同様に試験され得ることが認識される。各ガイド及び融合タンパク質の組み合わせを、１６ＨＢＥ１４ｏ－不死化気管支上皮細胞における標的位置での編集能についてアッセイする。現在、ＣＦＴＲナンセンス変異を含む３つのＨＢＥ細胞株が入手可能である（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。これらの細胞株を使用して、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、及びＲ１１６２Ｘナンセンス変異標的をアッセイし、１６ＨＢＥ１４ｏ－株と比較する。融合タンパク質及びガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として細胞に送達され、これはＶａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ（Ｖａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｊ Ｃｙｓｔ Ｆｉｂｒｏｓ１８，４７６－４８３（参照により本明細書に組み込まれる））に提供されている培養及び形質転換方法に従って１６ＨＢＥ１４ｏ－細胞株にヌクレオフェクトされる。ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡとして、又は１：１若しくは１：１．２のモル比のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖として、ＲＧＮタンパク質と共に提供される。細胞へのＲＮＰのヌクレオフェクションは、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒで行う。次いで、細胞を３７℃で７２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、融合タンパク質及びｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞に送達され、融合タンパク質はｍＲＮＡにコードされている。
Ｅ６０Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、及びＱ４９３Ｘについて入手可能な細胞株が存在しないので、これらの変異を、実施例２に記載のＧＦＰ回復アッセイの変形例を使用してＨＥＫ２９３細胞においてアッセイし、ナンセンス変異を含む変異遺伝子座を、ＧＦＰリーディングフレーム２にクローニングする。
インキュベーション後、ゲノムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ９６ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出する。標的ゲノム部位に隣接するゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製する。次いで、精製されたＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでの次世代シークエンシングに供する。典型的には、アンプリコン当たり１００，０００個の２５０ｂｐペアエンドリード（２×１００，０００個のリード）が生成される。リードを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．２０１６）を使用して分析し、編集率を計算する。出力アラインメントは、目的の塩基編集変異の導入を確認し、望ましくないインデル形成をスクリーニングするために、手作業で精選される。
塩基編集効率に加えて、塩基編集ＣＦＴＲ遺伝子のタンパク質産物を、機能について評価する。２つのナンセンス変異、Ｇｌｕ６０Ｘ及びＧｌｙ５４２Ｘの場合、これらの変異がグアニンからチミンへの転換によって引き起こされるので、アデニンからグアニンへの塩基編集変化は野生型配列を回復しない。融合タンパク質の標的化活性により、Ｇｌｕ６０ＸがＧｌｕ６０Ｇｌｎに変化し、Ｇｌｙ４５２ＸがＧｌｙ５４２Ａｒｇに変化する。これらの変異により完全長タンパク質の作製が可能となる一方で、ＣＦＴＲタンパク質の安定性及び機能性も確認される。
実施例４．２：サイズ減少のためのＲＧＮの操作
理想的には、本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質及び該融合タンパク質をＣＦＴＲ遺伝子に標的化するための対応するガイドＲＮＡのコード配列は全て、単一のＡＡＶベクターにパッケージされる。概ねＡＡＶベクターの許容されるサイズ限界は４．７ｋｂであるが、パッキング効率を低下させることで、それ以上のサイズも企図され得る。表３０のＲＧＮニッカーゼは、約３．１５～３．４５ｋＢのコード配列長を有する。融合タンパク質及びその対応するガイドＲＮＡの両方の発現カセットが確実にＡＡＶベクターに適合できるようにするため、ＲＧＮアミノ酸及びその対応する核酸コード配列の長さを短縮することが望ましい。
密接に関連する相同体とのアラインメントによって、５９０～５９７位において固有の８個のアミノ酸領域が、ＡＰＧ０７４３３．１及びその近い相同体ＡＰＧ０８２９０．１（国際公開第２０１９／２３６５６６号に記載され、本明細書で配列番号６０として示される）において同定された。ＡＰＧ０７４３３．１では配列番号３６５、ＡＰＧ０８２９０．１では配列番号３６７として示されるこの領域を、両方のタンパク質から除去して、バリアントＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１－ｄｅｌ（配列番号３６６）及びＡＰＧ０８２９０．１－ｄｅｌ（配列番号３６８）を得た。これらの欠失バリアント及びそれらの対応する野生型ＲＧＮを、実施例１に記載のものと類似の方法に従って表３２及び表３３に示すガイドＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における編集活性についてアッセイした。標的配列の編集率を以下の表３２及び表３３に示す。
標的ＳＧＮ０００１６９、ＳＧＮ０００１７３、ＳＧＮ０００１８６、ＳＧＮ０００９２７、ＳＧＮ０００９３０、及びＳＧＮ００１１０１では、野生型ＡＰＧ０７４３３．１タンパク質及び操作されたバリアントの編集率は同様であった。標的ＳＧＮ０００１３９、ＳＧＮ０００１４３、及びＳＧＮ０００１９４では、操作されたバリアントを使用した場合、野生型タンパク質と比較して編集率が低下した。ＳＧＮ０００９２９及びＳＧＮ０００９３５を用いると、野生型配列と比較して、操作されたＡＰＧ０７４３３．１バリアントで編集率が増加した。
Ｎ．Ｄ．＝未決定
ＡＰＧ０８２９０．１欠失バリアントは全ての試料において編集を示し、この場合、野生型ＡＰＧ０８２９０．１タンパク質も編集を示した。検出された最も低い編集率は、操作されたタンパク質での０．１３％であった。標的ＳＧＮ０００９２６は、最も高い編集率：９．１７％を示した。
ＡＰＧ０７４３３．１－ｄｅｌ又はＡＰＧ０８２９０．１－ｄｅｌと、本発明のデアミナーゼとを含む融合タンパク質を作製し、実施例１と同様の方法を用いて塩基編集活性についてアッセイする。
融合タンパク質は、配列番号４５として示されたものなどの柔軟なペプチドリンカーによって連結されたＲＧＮ及びデアミナーゼを含む。配列番号４５のリンカーは１６アミノ酸長であり、このサイズは、融合タンパク質のコード配列のサイズ低減のために短縮されてもよい。１６アミノ酸未満のペプチドリンカーを作製し、ＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１－ｄｅｌ又はＡＰＧ０８２９０．１－ｄｅｌと本発明のデアミナーゼとを作動可能に連結し、実施例１と同様の方法を用いて塩基編集活性について試験することができる。ＲＧＮとデアミナーゼとの間のペプチドリンカーにより融合タンパク質の編集ウィンドウを決定することができるため、異なる長さ及び剛性を有する代替リンカーの試験もまた、オフターゲット変異を低減しながら編集効率を改善させることにつながり得る。したがって、最も高い編集率を有する融合タンパク質を実施例４．１と同様の方法に従って次いでアッセイし、各ＣＦＴＲ標的配列についての編集効率を決定する。最も高い編集効率を有する融合タンパク質－ｇＲＮＡの組み合わせを、その位置での編集に好ましいガイドとして選択し、ＡＡＶベクター設計のために使用する。
実施例４．３：ＡＡＶ送達
最も高い編集率を有する検証された融合タンパク質／ｇＲＮＡの組み合わせのコード配列を、ＡＡＶベクターにパッケージする。ＡＡＶ送達は、病原性の欠如、低い免疫原性、高い形質導入率、及び製造までの道のりが明確であるなど、多くの利点を有する。また、肺へのＡＡＶ投与は、安全であり、少なくともある程度、単回及び反復投与の両方で有効であることが示されている（Ｇｕｇｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ１７，１２６５－１２７３）。融合タンパク質／ｇＲＮＡの組合せをＡＡＶベクターにクローニングした後、それをいくつかの異なる血清型にパッケージして、組織特異的感染性を最適化することができる。ＣＦの治療では、塩基編集の標的は肺の前駆体頂端上皮細胞であり、これにより細胞の代謝回転全体を通じて修正を持続させることができる。呼吸器上皮を標的とする場合、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ５又はＡＡＶ６のカプシドを利用し、これは、これらの血清型が、呼吸器上皮細胞において高い感染性を有することが示されているためである（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｖｉｒｏｌ７４，３８５２－３８５８）。
ＡＡＶベクターは、作製されてから、培養中のヒト気道上皮細胞に形質導入される。ＣＦＴＲ Ｇ５４２Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、及びＷ１２８２Ｘナンセンス変異標的を含む３つのＨＢＥ細胞株を用いて、これらの変異の修正について構築物を検証する。１６ＨＢＥ１４ｏ－株を用いて、他のナンセンス変異を修正する構築物を試験する。感染多重度（ＭＯＩ）の範囲を試験する。いずれの場合も、ナンセンス変異の野生型ＣＦＴＲ配列への復帰を評価する。培養２～３日後、ゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲにより標的化部位周辺のアンプリコンを生成し、実施例１に記載の方法と同様にＮＧＳを実施して各遺伝子座における編集率を決定する。気道上皮細胞の使用により、ＡＡＶ導入率及び編集率は、培養細胞システムを用いながら、可能な限り生体内治療と同様であった。異なる血清型を有するＡＡＶを比較して、どの血清型が融合タンパク質／ｇＲＮＡの気道細胞への送達に最適であるかを判定する。これらのシステムのＡＡＶ導入によって達成された編集率を、実施例４．２で見られたＲＮＰ編集率と比較する。
ナンセンス変異Ｒ５５３Ｘ、Ｅ６０Ｘ、及びＱ４９３Ｘについての細胞株は入手不可能であるため、これらの変異を標的化する融合タンパク質／ｇＲＮＡシステムを野生型１６ＨＢＥ１４ｏ－細胞において評価し、目的の位置におけるＡＡＶ導入、塩基エディタ発現、及びオフターゲット編集率についてアッセイする。終止コドン修正率を決定するために、変異遺伝子座を、実施例４．１に記載のＧＦＰ回復アッセイのためにＧＦＰにクローニングする。
ＮＧＳによる編集率の決定と並行して、融合タンパク質／ｇＲＮＡシステムを用いて編集されたＣＦＴＲ変異を有する細胞から総タンパク質溶解物を収集し、ウェスタンブロッティングによって完全長ＣＦＴＲタンパク質の濃度を評価する。機能的ＣＦＴＲが形成されるかどうかを試験するために、フォルスコリン活性化アッセイを、Ｄｅｖｏｒ ｅｔ ａｌ（２０００，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ２７９，Ｃ４６１－４７９（参照により本明細書に組み込まれる））及び／又はＤｏｕｓｍａｉｓ ｅｔ ａｌ（２００２，Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ１１９，５４５－５５９（参照により本明細書に組み込まれる））で記載の方法と類似の方法を用いて実施する。これらの実験では、編集されたＣＦＴＲ変異細胞を、アデニル酸シクラーゼの活性化因子であるフォルスコリンで処理して、ｃＡＭＰの細胞内濃度を上昇させる。次いで、上昇したｃＡＭＰ濃度によりＣＦＴＲが活性化され、Ｃｌ－の流入を、遺伝子コードされた黄色蛍光タンパク質に基づくＣｌ－センサー又はＭＱＡＥなどの塩化物の小分子蛍光指示薬のいずれかによって測定する。Ｇ５４２Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、及びＷ１２８２Ｘ編集細胞株をこのアッセイで試験する。
オフターゲット変異の率を決定するために、各特異的ヌクレアーゼのシード領域及び柔軟なオフターゲットＰＡＭ認識空間に関する情報でカスタマイズしたバイオインフォマティクスアプローチを使用する。これらの情報は、各タンパク質についてバイオインフォマティクスにより決定されており、各タンパク質のオフターゲット活性の可能性をランク付けするために使用される。
バイオインフォマティクスによるオフターゲットの予測を補完するために、修飾されたＳＩＴＥ－ｓｅｑプロトコル（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ１４，６００－６０６（参照により本明細書に組み込まれる））によるオフターゲットの生化学的検出も実施する。簡単に述べると、ヒト気道上皮細胞のゲノムＤＮＡを得る。次いで、このＤＮＡを、いくつかの異なる濃度で、目的のＲＧＮで処理する。任意のＤＮＡ二本鎖切断を標識し、選択的に単離し、ＮＧＳを可能にするアダプター配列を用いてＰＣＲ増幅する。次いで、配列決定リードをゲノムにマッピングし、二本鎖切断部位でリードの「パイルアップ」を同定し、推定オフターゲット位置をマークする。その後の一連の実験において、細胞を目的のＲＧＮ又はＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質で編集し、これらの推定部位を個々に配列決定して、それらが真正のオフターゲットであるかどうかを確認する。クロマチンの状態、ＤＮＡのアクセス可能性、及び他の因子が、生細胞におけるゲノムエディタの効率に影響を与え得るため、生化学的方法は、典型的には、オフターゲットの数を過大評価する。したがって、バイオインフォマティクス方法及び生化学的方法は共に、推定オフターゲット部位を同定するための相補的な方法を提供するが、オフターゲット編集の正確な評価を得るためには、これらの部位をアンプリコンシークエンシングによって検証する必要がある。
推定オフターゲット部位が同定されてから、同じ最適化された融合タンパク質及びガイドを用いて編集した１６ＨＢＥ気道上皮細胞でのアンプリコンシークエンシングにより、これらのシステムについて確立されたオフターゲットプロファイルが患者の肺で予想されるプロファイルと可能な限り一致することが確認される。
本明細書に記載の融合タンパク質が細胞内ＲＮＡの変化を誘導するかどうかを判定するためには、編集後の細胞内トランスクリプトームの慎重な分析が必要である。幸いにも、アデニン塩基編集オフターゲット効果を評価するためのＲＮＡ－ｓｅｑ技術は、日常的になっている（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ ５６９，４３３－４３７；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５７１，２７５－２７８。いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に述べると、実施例４．２で決定された融合タンパク質／ｇＲＮＡシステムで細胞を編集した後、総細胞内ｍＲＮＡを収集し、ＲＮＡ－ｓｅｑに供する。編集細胞のトランスクリプトームを、ＡＢＥ単独でトランスフェクトされた細胞と比較し、ＲＮＡ配列における有意差を同定する。
実施例５：原因疾患変異の修正のための標的化塩基編集
臨床バリアントのデータベースは、ＮＣＢＩ ＣｌｉｎＶａｒデータベースから入手した。データベースは、ＮＣＢＩ ＣｌｉｎＶａｒウェブサイトでワールドワイドウェブサイトを通じて入手可能である。病原性一塩基多型（ＳＮＰ）を、このリストから同定した。ゲノム遺伝子座情報を利用して、各ＳＮＰに重複する領域と各ＳＮＰの周囲の領域とにあるＣＲＩＳＰＲ標的を同定した。原因変異（「Ｃａｓｌ Ｍｕｔ．」）を標的化するために、ＲＧＮ、例えば表３０に列挙されているＲＧＮ又はそのバリアントと組み合わせて塩基編集を利用して修正することのできる選択されたＳＮＰを表３４に示す。以下の表３４には、各疾患の１つの通称のみを掲載してある。「ＲＳ＃」は、ＮＣＢＩウェブサイトのＳＮＰデータベースにおけるＲＳアクセッション番号に対応する。「アレルＩＤ」は、原因アレルのアクセッション番号に対応する。「名前」列は、遺伝子座識別子、遺伝子名、遺伝子の変異の位置、及び変異から生じる変化を含む。
実施例６：植物細胞における遺伝子編集活性の実証
本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質の塩基編集活性を、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：６８８－６９１）から適合させたプロトコルを使用して植物細胞において実証した。簡単に述べると、ＳＶ４０核局在化シグナル（配列番号４３）に作動可能に連結されたＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質を植物細胞中で発現可能な発現カセットと、適切なＰＡＭ配列に隣接する植物ＰＤＳ遺伝子中の１つ以上の部位を標的化するガイドＲＮＡをコードする第２の発現カセットとを含む発現ベクターを、ＰＥＧ媒介形質転換を使用してＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉肉プロトプラストに導入する。形質転換したプロトプラストを暗所で最大３６時間インキュベートする。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロトプラストから単離する。ＲＧＮ標的部位に隣接するゲノム領域をＰＣＲ増幅し、産物を精製し、精製されたＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでの次世代シークエンシングを使用して分析する。典型的には、アンプリコン当たり１００，０００個の２５０ｂｐペアエンドリード（２×１００，０００個のリード）が生成される。リードを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，３４：６９５－６９７）を使用して分析して、編集率を計算する。出力アラインメントを、インデル形成又は特異的アデニン変異の導入について分析する。
実施例７：ｍＲＮＡ送達の試験
異なるフォーマットで塩基エディタが送達可能であるかどうかを判定するため、初代Ｔ細胞を用いてｍＲＮＡ送達を試験した。精製したＣＤ３＋Ｔ細胞又はＰＢＭＣを解凍し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて３日間活性化し、次いでＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニット及びＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップを用いてヌクレオフェクトした。Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ ＣｅｌｌキットをｍＲＮＡ及びＲＮＰ送達の両方に使用した。細胞を、それぞれｍＲＮＡ送達のためのＥＯ－１１５及びＲＮＰ送達のためのＥＨ－１１５プログラムを使用してトランスフェクトした。細胞を、ヌクレオフェクション後４日間、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含むＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞増殖培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＴｉｓｓｕｅゲノムＤＮＡ単離キット（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて採取した。
編集部位を囲むアンプリコンを、表３５において同定されたプライマーを使用したＰＣＲによって生成し、２ｘ２５０ｂｐペアエンドシークエンシングを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒｒａプラットフォームを用いたＮＧＳシーケンシングに供した。推定塩基編集率は、各試料について全体的な置換率を計算することによって決定した。試験した各ガイドの平均値及びサンプル数を以下に示す。

Claims (211)

  1. 配列番号４０７、３９９、４０５、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
  2. デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号４０７、３９９、４０５、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  3. 前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、請求項２に記載の核酸分子。
  4. 医薬的に許容される担体と、請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２若しくは３に記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
  5. ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０７、３９９、４０５、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
  6. 前記デアミナーゼがアデニンデアミナーゼである、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
  9. 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項９に記載の融合タンパク質。
  12. 前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. 前記ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の融合タンパク質。
  14. 前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  15. 少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項５～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４５１、４４９、４４３、１１～２０、４４４～４４８、４５０、及び４５２～４８５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号４０７、３９９、４０５、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  17. 前記デアミナーゼがアデニンデアミナーゼである、請求項１６に記載の核酸分子。
  18. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項１６又は１７に記載の核酸分子。
  19. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１６又は１７に記載の核酸分子。
  20. 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項１９に記載の核酸分子。
  21. 前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項２０に記載の核酸分子。
  22. 前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項２０に記載の核酸分子。
  23. 前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項２０に記載の核酸分子。
  24. 前記ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の核酸分子。
  25. 前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、請求項２３に記載の核酸分子。
  26. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、その５’末端で異種プロモータに作動可能に連結されている、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  27. 前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、その３’末端で異種ターミネータに作動可能に連結されている、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  28. 前記融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  29. 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１６～２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  30. 前記融合タンパク質が、原核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１６～２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  31. 請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  32. 標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、請求項３１に記載のベクター。
  33. 前記ｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである、請求項３２に記載のベクター。
  34. 前記ｇＲＮＡが二重ガイドＲＮＡである、請求項３２に記載のベクター。
  35. 請求項５～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項３１～３４のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  36. ガイドＲＮＡを更に含む、請求項５～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、細胞。
  37. 融合タンパク質を作製するための方法であって、請求項３５又は３６に記載の細胞を、前記融合タンパク質が発現する条件下で培養することを含む、方法。
  38. 融合タンパク質を作製するための方法であって、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項３１～３４のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入することと、前記細胞を前記融合タンパク質が発現する条件下で培養することとを含む、方法。
  39. 前記融合タンパク質を精製することを更に含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
  40. ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を作製するための方法であって、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子と、ガイドＲＮＡをコードする発現カセットを含む核酸分子又は請求項３１～３４のいずれか一項に記載のベクターとを細胞に導入することと、前記細胞を前記融合タンパク質及び前記ｇＲＮＡが発現し、ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で培養することとを含む、方法。
  41. 前記ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
    ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、３９９、４０５、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、前記融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
  43. 前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列及び前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、請求項４２に記載のシステム。
  44. 前記標的ＤＮＡ配列が真核生物標的ＤＮＡ配列である、請求項４２又は４３に記載のシステム。
  45. 前記標的ＤＮＡ配列が、前記ＲＧＮによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のシステム。
  46. 前記標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のシステム。
  47. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のシステム。
  48. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のシステム。
  49. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のシステム。
  50. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のシステム。
  51. 前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、請求項５０に記載のシステム。
  52. 前記融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項４２～５１のいずれか一項に記載のシステム。
  53. 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項４２～５２のいずれか一項に記載のシステム。
  54. 前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、１つのベクター上に位置する、請求項４２～５３のいずれか一項に記載のシステム。
  55. 医薬的に許容される担体と、請求項５～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３１～３４のいずれか一項に記載のベクター、請求項３５若しくは３６に記載の細胞、又は請求項４２～５４のいずれか一項に記載のシステムとを含む、医薬組成物。
  56. 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、請求項４２～５４のいずれか一項に記載のシステムを、前記標的ＤＮＡ分子又は前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞に送達することを含む、方法。
  57. 標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
    ａ）インビトロで、
    ｉ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
    ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、３９９、４０５、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
    をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることにより前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ分子又は前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、インビトロで構築された前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
  58. 前記修飾された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｎ変異を含み、ＮがＣ、Ｇ又はＴである、請求項５６又は５７に記載の方法。
  59. 前記修飾された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｇ変異を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記融合タンパク質が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項５６～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項５６～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記標的ＤＮＡ配列が真核生物標的ＤＮＡ配列である、請求項５６～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記標的ＤＮＡ配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項５６～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、請求項５６～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記修飾されたＤＮＡ分子を含む細胞を選択することを更に含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 請求項７０に記載の方法に従って修飾された標的ＤＮＡ配列を含む、細胞。
  72. 請求項７１に記載の細胞と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  73. 遺伝性疾患の原因変異を修正した遺伝子修飾細胞を作製するための方法であって、前記細胞の中に、
    ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は前記細胞における前記融合タンパク質の発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
    ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は前記細胞における前記ｇＲＮＡの発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、
    を導入することを含み、
    これにより、前記融合タンパク質及びｇＲＮＡは前記原因変異のゲノム位置を標的とし、前記原因変異を除去するようにゲノム配列を修飾する、方法。
  74. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ゲノム修飾が、前記標的ＤＮＡ配列内の少なくとも１つのヌクレオチドのＡ＞Ｇ変異を導入することを含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記原因変異の前記修正が、ナンセンス変異を修正することを含む、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記遺伝性疾患が表３４に列挙された疾患である、請求項７３に記載の方法。
  79. 前記遺伝性疾患が嚢胞性線維症である、請求項７３に記載の方法。
  80. 疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項５５又は７２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  81. 前記疾患が原因変異に関連し、前記有効量の前記医薬組成物が前記原因変異を修正する、請求項８０に記載の方法。
  82. 対象における疾患の治療のための、請求項５～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３１～３４のいずれか一項に記載のベクター、請求項３５、３６及び７１のいずれか一項に記載の細胞、又は請求項４２～５４のいずれか一項に記載のシステムの使用。
  83. 前記疾患が原因変異に関連し、前記治療が前記原因変異を修正することを含む、請求項８２に記載の使用。
  84. 疾患の治療に有用な医薬品の製造のための、請求項５～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３１～３４のいずれか一項に記載のベクター、請求項３５、３６、及び７１のいずれか一項に記載の細胞、又は請求項４２～５４のいずれか一項に記載のシステムの使用。
  85. 前記疾患が原因変異に関連し、有効量の前記医薬品が前記原因変異を修正する、請求項８４に記載の使用。
  86. ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号４１又は６０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号４１又は６０のアミノ酸残基５９０～５９７を欠くＲＧＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
    前記ＲＧＮポリペプチドが、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合する際にＲＮＡに誘導されて配列特異的に前記標的ＤＮＡ配列に結合可能である、核酸分子。
  87. ＲＧＮポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドに対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、請求項８６に記載の核酸分子。
  88. 前記ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ失活型であるか、又はニッカーゼとして機能する、請求項８６又は８７に記載の核酸分子。
  89. 前記ＲＧＮポリペプチドが、塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  90. 請求項８６～８９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  91. 配列番号４１又は６０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号４１又は６０のアミノ酸残基５９０～５９７を欠く単離されたポリペプチドであって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、単離されたポリペプチド。
  92. 前記ＲＧＮポリペプチドが、配列番号３６６又は３６８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の単離されたポリペプチド。
  93. 前記ＲＧＮポリペプチドがヌクレアーゼ失活型であるか、又はニッカーゼとして機能する、請求項９１又は９２に記載の単離されたポリペプチド。
  94. 前記ＲＧＮポリペプチドが、塩基編集ポリペプチドに作動可能に融合されている、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  95. 請求項８６～８９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項９０に記載のベクター、又は請求項９１～９４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
  96. 配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
  97. 配列番号４０７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載の単離されたポリペプチド。
  98. デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号４０７のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  99. 前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、請求項９８に記載の核酸分子。
  100. 医薬的に許容される担体と、請求項９６若しくは９７に記載のポリペプチド又は請求項９８若しくは９９に記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
  101. ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
  102. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項１０１に記載の融合タンパク質。
  103. 前記ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１０２に記載の融合タンパク質。
  104. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  105. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  106. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１０５に記載の融合タンパク質。
  107. ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４５１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  108. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＧＮポリペプチドである、請求項１０７に記載の核酸分子。
  109. 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１０８に記載の核酸分子。
  110. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、請求項１０７～１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  111. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１０８～１１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  112. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１１に記載の核酸分子。
  113. 請求項１０７～１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  114. 標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、請求項１１３に記載のベクター。
  115. 請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
  116. 請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０７～１１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１１３若しくは１１４に記載のベクター、又は請求項１１５に記載のＲＮＰ複合体を含む、細胞。
  117. 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
    ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド、及び配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、前記融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
  118. 前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列及び前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、請求項１１７に記載のシステム。
  119. 前記標的ＤＮＡ配列が、前記ＲＧＮポリペプチドによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項１１７又は１１８に記載のシステム。
  120. 前記標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、請求項１１７～１１９のいずれか一項に記載のシステム。
  121. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載のシステム。
  122. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載のシステム。
  123. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮである、請求項１１７～１２２のいずれか一項に記載のシステム。
  124. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１２３に記載のシステム。
  125. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１２４に記載のシステム。
  126. 医薬的に許容される担体と、請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１０７～１１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１１３若しくは１１４に記載のベクター、請求項１１５に記載のＲＮＰ複合体、請求項１１６に記載の細胞、又は請求項１１７～１２５のいずれか一項に記載のシステムとを含む、医薬組成物。
  127. 標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
    ａ）
    ｉ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
    ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、及び配列番号４０７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
    をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることにより前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ分子又は前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、構築された前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
  128. 前記標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１２７又は１２８に記載の方法。
  130. インビトロ、生体内、又は生体外で行われる、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 疾患、障害、若しくは状態を有するか、又はそれを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、
    請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１０７～１１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１１３若しくは１１４に記載のベクター、請求項１１５に記載のＲＮＰ複合体、請求項１１６に記載の細胞、請求項１１７～１２５のいずれか一項に記載のシステム、又は請求項１２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  132. 配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含むｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを更に含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. 配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
  134. 配列番号４０５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の単離されたポリペプチド。
  135. デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４４９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号４０５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  136. 前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、請求項１３５に記載の核酸分子。
  137. 医薬的に許容される担体と、請求項１３３若しくは１３４に記載のポリペプチド、又は請求項１３５若しくは１３６に記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
  138. ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
  139. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項１３８に記載の融合タンパク質。
  140. 前記ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１３９に記載の融合タンパク質。
  141. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、請求項１３８～１４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  142. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１３９～１４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  143. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４２に記載の融合タンパク質。
  144. ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４４９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  145. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＧＮポリペプチドである、請求項１４４に記載の核酸分子。
  146. 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１４５に記載の核酸分子。
  147. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、請求項１４４～１４６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  148. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１４５～１４７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  149. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４８に記載の核酸分子。
  150. 請求項１４４～１４９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  151. 標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、請求項１５０に記載のベクター。
  152. 請求項１３８～１４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
  153. 請求項１３８～１４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１４４～１４９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５０若しくは１５１に記載のベクター、又は請求項１５２に記載のＲＮＰ複合体を含む、細胞。
  154. 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
    ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド、及び配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、前記融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
  155. 前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列及び前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、請求項１５４に記載のシステム。
  156. 前記標的ＤＮＡ配列が、前記ＲＧＮポリペプチドによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項１５４又は１５５に記載のシステム。
  157. 前記標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、請求項１５４～１５６のいずれか一項に記載のシステム。
  158. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１５４～１５７のいずれか一項に記載のシステム。
  159. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１５４～１５８のいずれか一項に記載のシステム。
  160. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮである、請求項１５４～１５９のいずれか一項に記載のシステム。
  161. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１６０に記載のシステム。
  162. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１６１に記載のシステム。
  163. 医薬的に許容される担体と、請求項１３８～１４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１４４～１４９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５０若しくは１５１に記載のベクター、請求項１５２に記載のＲＮＰ複合体、請求項１５３に記載の細胞、又は請求項１５４～１６２のいずれか一項に記載のシステムとを含む、医薬組成物。
  164. 標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
    ａ）
    ｉ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
    ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、及び配列番号４０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
    をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることにより前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ分子又は前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、構築された前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
  165. 前記標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１６４又は１６５に記載の方法。
  167. インビトロ、生体内、又は生体外で行われる、請求項１６４～１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. 疾患、障害、若しくは状態を有するか、又はそれを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、
    請求項１３８～１４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１４４～１４９のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１５０若しくは１５１に記載のベクター、請求項１５２に記載のＲＮＰ複合体、請求項１５３に記載の細胞、請求項１５４～１６２のいずれか一項に記載のシステム、又は請求項１６３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  169. 配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含むｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを更に含む、請求項１６８に記載の方法。
  170. 配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、デアミナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
  171. 配列番号３９９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７０に記載の単離されたポリペプチド。
  172. デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４４３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号３９９のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  173. 前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモータを更に含む、請求項１７２に記載の核酸分子。
  174. 医薬的に許容される担体と、請求項１７０若しくは１７１に記載のポリペプチド又は請求項１７２若しくは１７３に記載の核酸分子とを含む、医薬組成物。
  175. ＤＮＡ結合ポリペプチドと、配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するデアミナーゼとを含む、融合タンパク質。
  176. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項１７５に記載の融合タンパク質。
  177. 前記ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１７６に記載の融合タンパク質。
  178. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、請求項１７５～１７７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  179. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１７６～１７８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  180. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１７９に記載の融合タンパク質。
  181. ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記デアミナーゼが、
    ａ）配列番号４４３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は
    ｂ）配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。
  182. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＧＮポリペプチドである、請求項１８１に記載の核酸分子。
  183. 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１８２に記載の核酸分子。
  184. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮポリペプチドである、請求項１８１～１８３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  185. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１８２～１８４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  186. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８５に記載の核酸分子。
  187. 請求項１８１～１８６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  188. 標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、請求項１８７に記載のベクター。
  189. 請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、前記融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合ポリペプチドに結合したガイドＲＮＡとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。
  190. 請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８１～１８６のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８７若しくは１８８に記載のベクター、又は請求項１８９に記載のＲＮＰ複合体を含む、細胞。
  191. 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するためのシステムであって、
    ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド、及び配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列とを含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子を修飾させるために、前記融合タンパク質と複合体を形成可能である、システム。
  192. 前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列及び前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列のうち少なくとも１つが、前記ヌクレオチド配列に対して異種のプロモータに作動可能に連結されている、請求項１９１に記載のシステム。
  193. 前記標的ＤＮＡ配列が、前記ＲＧＮポリペプチドによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項１９１又は１９２に記載のシステム。
  194. 前記標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、請求項１９１～１９３のいずれか一項に記載のシステム。
  195. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１９１～１９４のいずれか一項に記載のシステム。
  196. 前記融合タンパク質の前記ＲＧＮポリペプチドが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１９１～１９５のいずれか一項に記載のシステム。
  197. 前記ＲＧＮポリペプチドが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＧｅｏＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｎ２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ９－ＫＫＨ、円順列変異Ｃａｓ９、アルゴノート（Ａｇｏ）、ＳｍａｃＣａｓ９、Ｓｐｙ－ｍａｃＣａｓ９ドメイン、又は配列番号４１、６０、３６６、若しくは３６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＲＧＮである、請求項１９１～１９６のいずれか一項に記載のシステム。
  198. 前記ＲＧＮポリペプチドがニッカーゼである、請求項１９７に記載のシステム。
  199. 前記ニッカーゼが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１９８に記載のシステム。
  200. 医薬的に許容される担体と、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８１～１８６のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８７若しくは１８８に記載のベクター、請求項１８９に記載のＲＮＰ複合体、請求項１９０に記載の細胞、又は請求項１９１～１９９のいずれか一項に記載のシステムとを含む、医薬組成物。
  201. 標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法であって、
    ａ）
    ｉ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡと、
    ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、及び配列番号３９９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質と、
    をＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で組み合わせることにより前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体を構築することと、
    ｂ）前記標的ＤＮＡ分子又は前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、構築された前記ＲＧＮ－デアミナーゼリボヌクレオチド複合体と接触させることと、を含み、
    前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズして前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ配列に指向させ結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の修飾が生じる、方法。
  202. 前記標的ＤＮＡ配列が、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３からなる群から選択される核酸配列又はその相補体を含む、請求項２０１に記載の方法。
  203. 前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２０１又は２０２に記載の方法。
  204. インビトロ、生体内、又は生体外で行われる、請求項２０１～２０３のいずれか一項に記載の方法。
  205. 疾患、障害、若しくは状態を有するか、又はそれを発症するリスクがある対象を治療する方法であって、
    請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１８１～１８６のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１８７若しくは１８８に記載のベクター、請求項１８９に記載のＲＮＰ複合体、請求項１９０に記載の細胞、請求項１９１～１９９のいずれか一項に記載のシステム、又は請求項２００に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  206. 配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４からなる群から選択される核酸配列を含むｇＲＮＡのいずれか１つを投与することを更に含む、請求項２０５に記載の方法。
  207. 嚢胞性線維症の少なくとも１つの症状を治療又は軽減するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、
    ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、並びに配列番号４０７、４０５、３９９、１～１０、４００～４０４、４０６、及び４０８～４４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するデアミナーゼを含む融合タンパク質、又は前記細胞における前記融合タンパク質の発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
    ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ可能な１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は前記細胞における前記ｇＲＮＡの発現を可能にするためプロモータに作動可能に連結されている、前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、
    を投与することを含み、
    これにより、前記融合タンパク質及びｇＲＮＡは前記原因変異のゲノム位置を標的とし、前記原因変異を除去するようにゲノム配列を修飾する、方法。
  208. 前記ｇＲＮＡが、配列番号６２～９７、１１６～１３９、１５２～１８５、２０３～２３４、２５１～２８６、３０５～３４４、５６２、及び５６３のいずれか１つ又はその相補体を標的化するスペーサー配列を含む、請求項２０７に記載の方法。
  209. 前記ｇＲＮＡが、配列番号９８～１１５、１４０～１５１、１８６～２０２、２３５～２５０、２８７～３０４、３４５～３６４、及び５６４のいずれか１つを含む、請求項２０７又は２０８に記載の方法。
  210. 前記ＲＧＮが、配列番号４１、６０、３６６、及び３６８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２０７～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  211. 前記ＲＧＮが、配列番号４２、５２～５９、６１、３９７、及び３９８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２０７～２０９のいずれか一項に記載の方法。
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